TW202444388A - 經修飾的引導ｒｎａ - Google Patents
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Abstract
本揭露涉及已被修飾以改善性能及穩定性的引導 RNA。在某些實施例中，本揭露的引導 RNA 包括在其 5’ 端處的一或多個修飾及/或在其 3’ 端處的一或多個修飾。
Description
本揭露涉及已被修飾以改善穩定性及改善性能的引導 RNA。
規律間隔重複短迴文序列簇 (CRISPR)/CRISPR 相關蛋白 (Cas) 系統被廣泛用於編輯各種細胞類型之基因體。CRISPR/Cas 系統可分為兩類 (I 類及 II 類)，該兩類又可進一步細分為至少六種不同的類型：I 型、II 型、III 型、IV 型、V 型及 VI 型。在 II 型 CRISPR/Cas 系統中，Cas 蛋白 (諸如 Cas9) 與引導 RNA (gRNA) 分子形成複合物，且與具有原間隔序列相鄰基序 (PAM) 及間隔子之標靶核酸結合。gRNA 分子包括與標靶核酸中之間隔子互補且起到將 Cas 蛋白引導至標靶核酸之作用的序列。Cas 蛋白:gRNA 複合物對標靶核苷酸之識別及結合誘導標靶核酸發生裂解。
已發現 gRNA 分子可在細胞中藉由核酸酶裂解
(例如，核酸內切酶或核酸外切酶裂解) 發生降解，此可能會影響 CRISPR-Cas 系統之功效。因此，此項技術中需要具有改善的穩定性及改善的基因編輯效率之 gRNA 分子。
本揭露內容提供經修飾之引導 RNA 分子。在某些實施例中，該引導 RNA 分子包括：(i) 在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結，(ii) 在該引導 RNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結，或 (iii) 在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結以及在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子進一步包括在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，該引導 RNA 分子包括在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，該引導 RNA 分子包括在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸、以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸或者第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，該引導 RNA 分子包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，該引導 RNA 分子包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包括選自由以下所組成之群組的修飾：(a) 經 2'-氟修飾的核苷酸、(b) 經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、(c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、(d) 鎖核酸 (LNA)、(e) 去氧核糖核苷酸，以及 (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含 LNA。在某些實施例中，在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子的 5' 端處的 (i) 第二個核苷酸、(ii) 第三個核苷酸、(iii) 第四個核苷酸、(iv) 第二個與第三個核苷酸、(v) 第二個與第四個核苷酸、(vi) 第三個與第四個核苷酸或 (v) 第二個、第三個與第四個核苷酸包括選自由以下所組成之群組的修飾：(a) 經 2'-氟修飾的核苷酸、(b) 經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、(c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、(d) 鎖核酸 (LNA)、(e) 去氧核糖核苷酸，以及 (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包括三個連續的經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包括三個連續的經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前四個核苷酸處包括四個連續的經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包括三個連續的經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包括三個連續的 LNA。在某些實施例中，該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包括三個連續的去氧核糖核苷酸。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸包括選自由以下所組成之群組的修飾：(a) 經 2'-氟修飾的核苷酸、(b) 經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、(c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、(d) 鎖核酸 (LNA)、(e) 去氧核糖核苷酸，以及 (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含 LNA。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
在某些實施例中，該引導 RNA 分子的 3' 端處的 (i) 第 n-1 個核苷酸、(ii) 第 n-2 個核苷酸、(iii) 第 n-3 個核苷酸、(iv) 第 n-4 個核苷酸、(v) 第 n 個與第 n-1 個核苷酸、(vi) 第 n 個與第 n-2 個核苷酸、(vii) 第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(viii) 第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(ix) 第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、(x) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、或 (xi) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自包含選自由以下所組成之群組的修飾：(a) 經 2'-氟修飾的核苷酸、(b) 經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、(c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、(d) 鎖核酸 (LNA)、(e) 去氧核糖核苷酸，以及 (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為 LNA。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為去氧核糖核苷酸。
本揭露進一步提供核酸，其包括編碼本文所揭示之引導 RNA 分子的多核苷酸。在某些實施例中，該核酸進一步包括編碼 RNA 引導的核酸酶的多核苷酸。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。在某些實施例中，該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。本揭露提供載體，其包括本文所揭示之核酸。
本揭露提供組成物，其包括本文所揭示之引導 RNA 分子。在某些實施例中，本揭露之組成物包括本文所揭示之載體。在某些實施例中，該組成物進一步包括 RNA 引導的核酸酶。替代地或另外，該組成物進一步包括編碼 RNA 引導的核酸酶的核酸。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白，例如
Cas9、Cas12 及/或 Cas13。在某些實施例中，該組成物包括本文所揭示之核酸，例如，包括編碼引導
RNA 分子的多核苷酸的核酸。
本揭露進一步包括一種核糖核酸蛋白 (RNP) 複合物，其包括本揭露之經修飾的引導 RNA 分子以及 RNA 引導的核酸酶。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。在某些實施例中，該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
本揭露進一步包括一種細胞，其包含本文所揭示之組成物或 RNP 複合物。
本揭露進一步提供一種修飾細胞之方法。在某些實施例中，該方法包括使細胞與本文所揭示之組成物或 RNP 複合物接觸。在某些實施例中，該接觸包括藉由電穿孔將組成物引入細胞中。
本揭露提供治療有需要之個體之方法。在某些實施例中，該方法包括藉由使個體的細胞與本文所揭示之組成物或 RNP
複合物接觸，離體修飾該細胞，以及將經修飾的細胞送回至該個體。
本揭露進一步提供基因編輯系統，其包含一或多個本揭露之經修飾的引導 RNA，本文所揭示之一或多個核酸、一或多個載體、一或多個組成物及/或一或多個 RNP 複合物。
相關申請的交叉引用
本申請案主張 2023 年 4 月 7 日提交的美國臨時申請案第 63/458,017 號之優先權，該申請案之內容以引用方式全文併入本文中。
本揭露涉及經修飾之引導 RNA分子、包括此類經修飾之引導 RNA 的醫藥組成物以及藉由投予經修飾之引導 RNA 分子來修飾細胞的方法。本揭露部分基於以下發現：將二硫代磷酸酯鍵結引入 gRNA 分子中會消除由硫代磷酸酯鍵結產生之對掌性中心，從而產生穩定的 gRNA 分子、在此等經修飾的磷酸位置處不包括非鏡像異構物之 gRNA 組成物以及經更好定義之 gRNA 群體。如圖37、圖 38、圖 57 及圖 58 中所示，與不包括二硫代磷酸酯鍵結之 gRNA 分子相比，在強制降解條件下 (諸如在鹼性應激條件及酸性應激條件下)，在 5' 及/或 3' 端處包括二硫代磷酸酯鍵結之 gRNA 分子導致穩定性增加。另外，如圖61、圖 65 及圖 69 中所示，與不包括二硫代磷酸酯鍵結之 gRNA 分子相比，在 5' 及/或 3' 端處包括二硫代磷酸酯鍵結之 gRNA 分子具有相當或增加的編輯效率。
為清楚起見，但不作為限制，將本發明所揭示之標的之詳細描述分為以下小節：
I. 定義；
II. 經修飾之引導 RNA；
III. RNA 引導的核酸酶；
IV. 組成物；
V. 使用方法；
VI. 基因編輯系統；及
VII. 例示性實施例。
I. 定義
除非另有定義，否則本文所用之全部技術及科學術語具有與一般熟習本揭露之主題所屬技術者通常所瞭解之含義相同的含義。下列參考文獻提供技術人員本揭露中所使用的許多術語的一般定義：Singleton 等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第 2 版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker 編，1988)；The Glossary of Genetics，第 5 版，R. Rieger 等人(編)，Springer Verlag (1991)；以及 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。如本文所用，除非另有說明，否則以下術語具有以下賦予其等之含義。
如本文所用，當「一」或「一種」一詞的使用與請求項及/或說明書中的術語「包含」結合使用時，其可意指「一個」，但亦與「一個或多個」、「至少一個」和「一個或大於一個」的含義一致。
術語「約」或「大約」意指特定值處於本技術領域中具有通常知識者所判定之可接受的誤差範圍內，其部分地取決於如何測量或判定該值，
即，取決於測量系統的局限性。例如，按照本技術領域中的實務，「約」可意指 3 倍或 3 倍以上的標準偏差。可替代地，「約」可意指給定值的至多 20%、最佳至多 10%、更佳至多 5% 並且更佳至多 1% 的範圍。可替代地，特別是關於生物系統或過程，該術語意指數值的一個數量級內，最佳地在數值的 5 倍以內，並且更佳地在數值的 2 倍以內。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有 (having、has)」、「可」、「含有」及其變異體意欲為不排除其他行為或結構之開放式連接詞 (open-ended transitional phrase)、術語、或字。本揭露亦涵蓋「包含」本文所呈現之實施例或元件、「由其組成」及「基本上由其組成」之本文所呈現之實施例或元件，無論是否明確陳述。
術語「偶合」可指兩個或更多個組分藉由相互作用、鍵合、連接、力或繫帶連接或聯合，以便將兩個或更多個組分保持在一起。在某些實施例中，術語「偶合」涵蓋直接或間接結合，其中例如第一組分直接與第二組分結合，或者一個或多個中間分子設置於第一組分與第二組分之間。示例性鍵包含共價鍵、離子鍵、凡得瓦 (van der Waals) 交互作用及技術人員可識別的其他鍵。
如本文所用，術語「檢測 (detect)」或「檢測 (detection)」指示在空間之有限部分，包括但不限於樣品中判定標靶
(例如，核酸標靶) 之存在性 (existence) 及/或存在情況 (presence)。如本文所用，術語「檢測 (detect)」或「檢測 (detection)」可包含判定標靶的化學及/或生物學特性，包括但不限於相互作用的能力，特定而言結合其他化合物的能力，激活另一化合物及技術人員在閱讀本揭露內容後可識別的額外特性的能力。檢測可為定量的或定性的。當檢測指代、涉及或關於標靶或信號的數量或量的測量 (也稱為定量) 時，檢測為「定量的」，包括但不限於經設計用於判定標靶或信號的量或比例的任何分析。當檢測指代、涉及或關於根據相對於另一未量化的標靶或信號的相對豐度來識別目標或信號的質量或種類時，檢測是「定性的」。
如本文所用，術語「域」係指蛋白質或核酸 (例如，gRNA
分子) 之區段。除非另外指示，否則域不需要具有任何特定的功能特性。
如本文所用，術語「編輯效率」係指在所關註標靶區域中插入或缺失核苷酸之序列讀數總數與在藉由 RNA 引導的核酸酶裂解之後的序列讀數總數之比。
如本文可互換使用，術語「引導 RNA」、「gRNA」或「gRNA 分子」係指促進 RNA 引導的核酸酶特異性靶向或歸巢至標靶核酸的核酸。
如本文所用，術語「雜交」係指兩個單股多核苷酸非共價結合以形成穩定的雙股多核苷酸的方法。
如本文所用，術語「受試者」或「個體」係指脊椎動物或無脊椎動物，諸如人類或非人類動物，例如哺乳動物。哺乳動物包括但不限於人類、非人類靈長類動物、農場動物、競賽動物、囓齒動物和寵物。非人類動物個體的非限制性實例包括囓齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、狗、貓、綿羊、豬、山羊、牛、馬、猿及猴。在某些實施例中，受試者或個體為人類。
如本文所用，術語「
活體外」涉及人工環境及在人工環境內發生的過程或反應。
活體外環境例如為試管和細胞培養物，但不以此為限。
如本文所用，術語「
活體內」涉及自然環境 (
例如，動物或細胞) 及在自然環境中發生的過程或反應，諸如胚胎發育、細胞分化、神經管形成等。
如本文所用，「標記」係指允許直接或間接偵測的藥劑。標記包括但不限於螢光組成物、顯色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記。標記之非限制性實例包括綠色螢光蛋白 (「GFP」)、mCherry、dtTomato 或此項技術中已知之其他螢光蛋白 (例如，Shaner
等人, A Guide to Choosing Fluorescent Proteins, Nature Methods 2(12):905-909 (2005) (藉由引用併入本文)，
32P、
14C、
125I、
3H 及
131I、螢光團 (諸如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、玫瑰紅 (Rhodamine/rhodamine) 及其衍生物，丹磺醯 (dansyl)，繖形酮 (umbelliferone)、螢光素酶 (諸如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素純酶) (美國專利第 4,737,456 號)、螢光素、2,3-二氫呔𠯤二酮，以及產生可偵測訊號之酶，例如山葵過氧化酶
(horseradish peroxidase, HRP)、鹼性磷酸酶 (alkaline phosphorus sour enzyme)、β 半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、碳水化合物氧化酶 (諸如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)) 及雜環氧化酶 (諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶)。
術語「核酸」或「多核苷酸」包括任何包含核苷酸聚合物的化合物及/或物質。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基
(即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，去氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中該等鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5’ 至 3’ 表示。術語核酸包括：去氧核糖核酸 (DNA)，包括例如，互補
DNA (cDNA) 及基因體 DNA；核糖核酸 (RNA)，例如傳訊
RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含這些分子中之兩者或更多者的混合聚合物。核酸分子可為線性或環狀的。此外，術語核酸包括有義股及反義股兩者，以及單股及雙股形式。此外，本文所述之核酸可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的實例包括帶有衍生醣、磷酸鹽鍵結或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。
術語「核苷」係指包括嘌呤或嘧啶鹼基
(即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U)) 及糖
(即，去氧核糖或核糖) 的化合物。
「分離的」核酸係指已經與其天然環境的組分分離的核酸分子。分離的核酸包括通常包含核酸分子之細胞中所含之核酸分子，但是核酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。
術語「複數」係指大於一個的數。在某些實施例中，術語「複數個引導 RNA」係指大於一個的引導 RNA 數量。例如，但不作為限制，複數個引導 RNA 包括至少兩個引導 RNA。在某些實施例中，術語「複數種核酸」係指大於一種的核酸數量。例如，但不作為限制，複數種核酸包括至少兩種核酸。
術語「參考分子」或「對照分子」，例如，如本文所用之參考或對照
gRNA 分子，係指與標的分子，例如標的
gRNA 分子比較的分子。例如但不作為限制，標的 gRNA
分子包括與參考分子相比之一或多個修飾，例如，核苷酸修飾。
如本文所用，術語「特異性結合」係指相對於樣品中的其他分子
(例如蛋白質或核酸) 優先結合至標靶分子
(例如蛋白質或核酸)。
如本文中所使用的「治療」(及其語法變異體，諸如「治療過程」或「治療中」)，係指試圖改變受治療個體之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、以及緩解或改善預後。該降低可為併發症、體徵或症狀之嚴重程度或進展至另一等級的可能性的至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 99% 降低。「治療」亦可指抑制癌症之增殖或進展至更高等級至少 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98% 或 99%。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進程。
如本文所用，術語「治療效果」係指由藥理活性物質在個體中引起的局部或全身效果。
如本文所用，術語「治療有效量」及「有效量」係指本揭露之組成物的量，該量以適用於任何醫療之合理效益/風險比在個體之至少細胞亞群中有效產生一些期望的治療效果。
術語「變異」當指給定多肽殘基位置處的變異時，係指彼等殘基處的任何修飾。例如但不作為限制，術語「變異」可指用不同的胺基酸取代給定位置處的胺基酸。
如本文所用，術語「載體」係指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。該術語包括作為自我複製核酸結構之載體以及併入已引入該宿主細胞的基因體中的載體。某些載體能夠指導與該等載體可操作地連接的核酸之表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
II. 經修飾的引導 RNA 分子
本揭露提供包括一或多個修飾的 gRNA。在某些實施例中，與不包括一或多個修飾的 gRNA
(例如，對照或參考 gRNA) 相比，一或多個修飾增加了 gRNA 之穩定性。例如但不作為限制，修飾藉由防止 gRNA 分子被核酸酶
(例如核酸內切酶及/或核酸外切酶) 進行降解來改善所揭示之 gRNA 分子的穩定性。此類增強的穩定性可以提高經修飾之 gRNA 分子的治療功效。此外，修飾可以提供更好的保存期穩定性且產生具有更高品質之 gRNA 組成物，此係因為非鏡像異構物不會存在於此類組成物中。該等修飾亦可提高編輯效率且減少可能的脫靶效應。
在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在降解條件
(例如，鹼性應激條件及/或酸性應激條件) 下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 或更多，例如約
2% 或更多、約 3% 或更多、約 4% 或更多、約 5% 或更多、約 6% 或更多、約 7% 或更多、約 8% 或更多、約 9% 或更多、約 10% 或更多、約 15% 或更多、約 20% 或更多、約 25% 或更多、約 30% 或更多、約 35% 或更多、約 40% 或更多、約 45% 或更多、約 50% 或更多或約 55% 或更多的穩定性增加。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在降解條件
(例如，鹼性應激條件及/或酸性應激條件) 下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 60% 的穩定性增加。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 在酸性應激條件下表現出約 1% 或更多、約 2% 或更多、約 3% 或更多、約 4% 或更多或約 5% 或更多的穩定性增加。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在酸性應激條件下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 5% 的穩定性增加。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 在鹼性應激條件下表現出約 5% 或更多、約 10% 或更多、約 15% 或更多、約 20% 或更多、約 25% 或更多、約 30% 或更多、約 35% 或更多、約 40% 或更多、約 45% 或更多、約 50% 或更多或約 55% 或更多的穩定性增加。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在鹼性應激條件下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 60% 的穩定性增加。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在降解條件
(例如，鹼性應激條件及/或酸性應激條件) 下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 或更多，例如約
2% 或更多、約 3% 或更多、約 4% 或更多、約 5% 或更多、約 6% 或更多、約 7% 或更多、約 8% 或更多、約 9% 或更多、約 10% 或更多、約 15% 或更多、約 20% 或更多、約 25% 或更多、約 30% 或更多、約 35% 或更多、約 40% 或更多、約 45% 或更多、約 50% 或更多或約 55% 或更多的降解減少。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在降解條件
(例如，鹼性應激條件及/或酸性應激條件) 下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 60% 的降解減少。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 在酸性應激條件下表現出約 1% 或更多、約 2% 或更多、約 3% 或更多、約 4% 或更多或約 5% 或更多的降解減少。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在酸性應激條件下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 5% 的降解減少。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 在鹼性應激條件下表現出約 5% 或更多、約 10% 或更多、約 15% 或更多、約 20% 或更多、約 25% 或更多、約 30% 或更多、約 35% 或更多、約 40% 或更多、約 45% 或更多、約 50% 或更多或約 55% 或更多的降解減少。在某些實施例中，與參考 gRNA 相比，在鹼性應激條件下，本揭露之經修飾之 gRNA 表現出約 1% 至約 60% 的降解減少。在某些實施例中，在經受降解條件後約 24 小時、48 小時、3 天、4 天、5 天、6 天或 7 天時觀察到穩定性之增加及/或降解之減少。在某些實施例中，熱應激條件包括使 gRNA
經受高溫，例如，高於約 37℃
之溫度。在某些實施例中，氧化應激條件包括使 gRNA 經受自由基及/或化合物
(例如，H
2O
2)。在某些實施例中，鹼性應激條件包括使 gRNA 經受鹼性
pH，例如，大於約 8，例如，約
11 的 pH。在某些實施例中，酸性應激條件包括使 gRNA 經受酸性 pH，例如，小於約
6，例如，約
5 的 pH。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有與經修飾之 gRNA 相同的核苷酸序列之 gRNA
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有靶向域的 gRNA，該靶向域具有與經修飾之 gRNA 相同的序列
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有與經修飾之 gRNA 相同數量之核苷酸的 gRNA
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括一或多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、十個或更多個、十一個或更多個、十二個或更多個、十三個或更多個、十四個或更多個、或十五個或更多個修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個核苷酸修飾、至少十一個核苷酸修飾、至少十二個核苷酸修飾、至少十三個核苷酸修飾、至少十四個核苷酸修飾或至少十五個核苷酸修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括至少約十一個修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 的長度為約 20 至約 200 個核苷酸，例如約
20 至約 190、約 20 至約 180、約 20 至約 170、約 20 至約 160、約 20 至約 150、約 20 至約 140、約 20 至約 130、約 20 至約 120、約 20 至約 110、約 20 至約 100、約 30 至約 200、約 40 至約 200、約 50 至約 200、約 60 至約 200、約 70 至約 200、約 80 至約 200、約 90 至約 200、約 50 至約 150、約 80 至約 120、或約 90 至約 100 個核苷酸。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 的長度為約 80 至約 120 個核苷酸。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 的長度為約 5、約 10、約 15、約 20、約 25、約 30、約 35、約 40、約 45、約 50、約 55、約 60、約 65、約 70、約 75、約 80、約 85、約 90、約 95、約 100、約 105、約 110、約 115、約 120、約 125、約 130、約 135、約 140、約 145、約 150、約 155、約 160、約 165、約 170、約 175、約 180、約 185、約 190、約 195、約 200 或更多個核苷酸。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 中存在之約 1% 至約 20% 的核苷酸被修飾，例如，本揭露之
gRNA 中存在之約 1% 至約 19%、約 1% 至約 18%、約 1% 至約 17%、約 1% 至約 16%、約 1% 至約 15%、約 1% 至約 14%、約 1% 至約 13%、約 1% 至約 12%、約 1% 至約 11%、約 1% 至約 10%、約 1% 至約 9%、約 1% 至約 8%、約 1% 至約 7%、約 1% 至約 6%、約 1% 至約 5%、約 1% 至約 4%、約 1% 至約 3%、約 1% 至約 2%、約 2% 至約 20%、約 3% 至約 20%、約 4% 至約 20%、約 5% 至約 20%、約 6% 至約 20%、約 7% 至約 20%、約 8% 至約 20%、約 9% 至約 20%、約 10% 至約 20%、約 11% 至約 20%、約 12% 至約 20%、約 13% 至約 20%、約 14% 至約 20% 、約 15% 至約 20%、約 16% 至約 20%、約 17% 至約 20%、約 18% 至約 20%、約 19% 至約 20%、約 5% 至約 15% 或約 10% 至約 15% 的核苷酸被修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 中存在之約 1% 至約 15% 的核苷酸被修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 中存在之約 1% 至約 10% 的核苷酸被修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 中存在之約 1% 至約 6% 的核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 中存在之約 1%、約 2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、約 18%、約 19% 或約 20% 或更多的核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子具有圖1 中所示之結構。例如但不作為限制，本揭露之 gRNA 分子在其 5' 端處包括間隔區 (圖1 中的藍色區域)。本揭露之 gRNA 分子的額外例示性結構提供於Daniel 等人, Frontiers in Genome Editing 2:617910 (2021) 之圖 1A 中，該文獻之內容藉由引用全文併入本文 (間隔區在Daniel 等人之圖 1A 中以藍色及紅色標註)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在 gRNA 分子之間隔區中包括一或多個修飾。在某些實施例中，本發明所揭示之 gRNA 分子的間隔區與標靶核酸之序列互補，例如，至少約
80%、約 85%、約 90%、95%、約 98%、約 99% 或約 100% 互補。在某些實施例中，間隔區包括存在於 gRNA 分子之 5' 端處的前 30 個核苷酸，例如前
29 個核苷酸、前 28 個核苷酸、前 27 個核苷酸、前 26 個核苷酸、前 25 個核苷酸、前 24 個核苷酸、前 23 個核苷酸、前 22 個核苷酸、前 21 個核苷酸、前 20 個核苷酸、前 19 個核苷酸、前 18 個核苷酸、前 17 個核苷酸、前 16 個核苷酸或前 15 個核苷酸。在某些實施例中，間隔區包括存在於 gRNA 分子之 5' 端處的前 20 個核苷酸。在某些實施例中，間隔區中之修飾不會幹擾編輯效率，其可以使用此項技術中已知或本文所述之技術來評估。在某些實施例中，間隔區中之修飾可以提高編輯效率且減少脫靶效應。在某些實施例中，間隔區包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個修飾。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個修飾。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5 或 6 個修飾。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個修飾。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5 或 6 個修飾。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括至少一個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 1、2、3、4 或 5 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 1 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 2 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 3 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 4 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 5 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括至少一個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 1、2 或 3 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 1 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 2 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，間隔區在其 5' 端處的前 3 個核苷酸內包括 3 個化學修飾之核苷酸。在某些實施例中，化學修飾之核苷酸可包括一或多個修飾、兩個或更多個修飾或三個或更多個修飾。在某些實施例中，化學修飾之核苷酸可包括一個修飾，
例如，糖修飾或磷酸主鏈修飾，如下文所述。在某些實施例中，化學修飾之核苷酸可包括兩個修飾，
例如，糖修飾及磷酸主鏈修飾，如下文所述。在某些實施例中，化學修飾之核苷酸可包括三個修飾，
例如，兩個糖修飾及一個磷酸主鏈修飾，如下文所述。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在其 5' 端處包括一或多個修飾。在某些實施例中，如本文所用之關於修飾的術語「5' 端」係指 gRNA 分子之 5' 端處的前 5 個核苷酸。例如但不作為限制，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的一或多個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的第二個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的第三個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的第四個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 5' 端處的第五個核苷酸被修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在其 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括兩個連續核苷酸，例如，在
gRNA 分子之 5' 端的前 5 個核苷酸內的兩個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之第一個與第二個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之第一個與第三個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第二個與第三個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第三個與第四個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第四個與第五個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在三個連續核苷酸，例如，
gRNA 分子之 5' 端的前 5 個核苷酸內的三個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第二個、第三個與第四個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第三個、第四個與第五個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在四個連續核苷酸，例如，gRNA
分子之 5' 端的前 5 個核苷酸內的四個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在五個連續核苷酸，例如，gRNA
分子之 5' 端的前 5 個核苷酸內的五個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在其 3' 端處包括一或多個修飾。在某些實施例中，如本文所用之關於修飾的術語「3' 端」係指 gRNA 分子之 3' 端處的最後 5 個核苷酸 (第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個及第 n-4 個核苷酸)。例如但不作為限制，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的一或多個核苷酸被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的最後一個核苷酸 (第 n 個) 被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的倒數第二個核苷酸 (第 n-1 個) 被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的倒數第三個核苷酸 (第 n-2 個) 被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的倒數第四個核苷酸 (第 n-3 個) 被修飾。在某些實施例中，存在於本揭露之 gRNA 分子之 3' 端處的倒數第五個核苷酸 (第 n-4 個) 被修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在其 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在兩個連續核苷酸，例如，
gRNA 分子之 3' 端的 5 個核苷酸內的兩個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之 3' 端的第 n 個與第 n-1 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n 個與第 n-2 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-4 個與第 n-5 個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在三個連續核苷酸，例如，gRNA
分子之 3' 端的最後 5 個核苷酸內的三個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之 3' 端的第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在四個連續核苷酸，例如，gRNA
分子之 3' 端的 5 個核苷酸內的四個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸被修飾。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在五個連續核苷酸，例如，
gRNA 分子之 3' 端的 5 個核苷酸內的五個連續核苷酸處的修飾。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸被修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在其 5' 端處的一或多個修飾以及在其 3' 端處的一或多個修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在其 5' 端處的兩個或更多個修飾以及在其 3' 端處的兩個或更多個修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在其 5' 端處的三個或更多個修飾以及在其 3' 端處的三個或更多個修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在其 5' 端處的四個或更多個修飾以及在其 3' 端處的四個或更多個修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在其 5' 端處的五個或更多個修飾以及在其 3' 端處的五個或更多個修飾。
本文揭示了可包括於本揭露之 gRNA 分子中的修飾之非限制性實例。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括以下修飾中的一或多個：(i) 磷酸主鏈修飾及 (ii) 糖修飾。
磷酸主鏈修飾
在某些實施例中，gRNA 分子內存在之核苷酸的磷酸基團可被修飾。例如但不作為限制，核苷酸之磷酸基團可以藉由用不同的取代基替換磷酸二酯鍵結中的一或多個氧
(例如橋接氧或非橋接氧) 來修飾。取代基之非限制性實例包括硫 (S)、氮 (N)、氫 (H) 及碳 (C)。在某些實施例中，磷酸二酯鍵結中之一或多個氧用 S 取代。
在某些實施例中，gRNA 分子可用一或多個硫代磷酸酯 (PS) 鍵結進行修飾。在某些實施例中，PS 鍵結或鍵係指其中硫取代核苷酸間磷酸二酯鍵結中之一個非橋接磷酸氧之鍵。在某些實施例中，「*」在本文中用於指示藉由 PS 鍵結連接至相鄰的 3' 核苷酸之核苷酸。在某些實施例中，未經修飾的磷酸二酯鍵結之磷為非掌性的且用硫替換一個非橋接磷酸氧賦予磷掌性。
在某些實施例中，gRNA 分子可用一或多個二硫代磷酸酯 (PS2) 鍵結進行修飾。在某些實施例中，PS2 鍵結或鍵係指其中核苷酸間磷酸二酯鍵結中的兩個非橋接氧被硫替換的鍵。在某些實施例中，「**」在本文中用於指示藉由PS2 鍵結連接至相鄰的 3' 核苷酸之核苷酸。類似於天然存在之磷酸二酯主鏈鍵結，PS2 鍵結在磷處為非掌性的，導致 gRNA 分子在 PS2 鍵結處不為非鏡像異構物。在某些實施例中，二硫代磷酸酯鍵結對核酸酶降解具有抗性，且例如與未經修飾的
gRNA 相比，本揭露之 gRNA 中一或多個二硫代磷酸酯鍵結之存在可以增加 gRNA 之穩定性。
糖修飾
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 中存在的核苷酸之糖基團可以被修飾。例如但不作為限制，本揭露之 gRNA 之核苷酸可以包括對其糖基團
(例如，核糖) 之一或多個修飾。
在某些實施例中，糖基團可以在 2' 羥基 (OH) 處被修飾。在某些實施例中，2' 羥基可以經不同的取代基替換。取代基之非限制性實例包括氫 (H)、鹵素、烷基或烷氧基 (OR，其中 R 可以為烷基、環烷基或烷氧基)。
在某些實施例中，2' 羥基經烷氧基取代。在某些實施例中，2' 羥基經甲氧基取代。在某些實施例中，「m」在本文中用於指示經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(即，經 2'-O-甲基修飾的核苷酸)。
在某些實施例中，2' 羥基之氫 (H) 經甲氧基乙基取代。在某些實施例中，「M」在本文中用於指示經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸
(即，經 2'--(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸)。
在某些實施例中，2' 羥基可以經鹵素取代。鹵素之非限制性實例包括氟 (F)、氯 (Cl)、溴化物 (Br) 及碘 (I)。在某些實施例中，2' 羥基經氟替換。在某些實施例中，「f」在本文中用於指示經 2'-氟修飾的核苷酸
(即，經 2'-氟修飾的核苷酸)。
在某些實施例中，2' 羥基可以經氫 (H) 替換以產生去氧核糖。例如但不作為限制，本揭露之 gRNA 中存在的核苷酸可以具有去氧核糖。在某些實施例中，「d」在本文中用於指示具有去氧核糖之核苷酸。
在某些實施例中，2' 羥基之修飾可包括「鎖核酸」(LNA)，其中 2' 羥基連接至相同核糖之 4' 碳。在某些實施例中，2' 羥基藉由橋
(例如，亞烷基
(例如，亞甲基)、醚或胺基橋) 連接至 4' 碳。在某些實施例中，「LNA」在本文中用於指示作為 LNA 之核苷酸。
例示性經修飾之 gRNA
在某些實施例中，本揭露之
gRNA 可具有至少一個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少兩個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少三個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少四個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少五個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少六個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少七個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少八個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少九個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA
可具有至少十個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 可具有約 1 至約 10 個磷酸主鏈修飾，例如約
1 至約 9、約 1 至約 8、約 1 至約 7、約 1 至約 6、約 1 至約 5、約 1 至約 4、約 1 至約 3、約 1 至約 2、約 2 至約 10、約 3 至約 10、約 4 至約 10、約 5 至約 10、約 6 至約 10、約 7 至約 10、約 8 至約 10、約 9 至約 10、約 2 至約 8、約 2 至約 6、約 3 至約 8、約 3 至約 6 或 3 至 5
個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 可具有約 2 至約 10
個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 可具有約 2 至約 9
個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 可具有約 3 至約 8
個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 可具有約 3 至約 5
個磷酸主鏈修飾，例如，二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括至少一個二硫代磷酸酯鍵結及至少一個硫代磷酸酯鍵結，例如，如表
10 中所示。例如但不作為限制，本揭露之 gRNA 可包括至少兩個二硫代磷酸酯鍵結及至少一個硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括至少三個二硫代磷酸酯鍵結及至少一個硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括至少四個二硫代磷酸酯鍵結及至少一個硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括至少兩個二硫代磷酸酯鍵結及至少兩個硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 可包括至少兩個二硫代磷酸酯鍵結及至少三個硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，gRNA 可具有至少一個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少兩個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少三個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少四個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少五個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少六個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少七個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少八個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少九個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少十個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有約 1 至約 10 個糖修飾，例如約
1 至約 9、約 1 至約 8、約 1 至約 7、約 1 至約 6、約 1 至約 5、約 1 至約 4、約 1 至約 3、約 1 至約 2、約 2 至約 10、約 3 至約 10、約 4 至約 10、約 5 至約 10、約 6 至約 10、約 7 至約 10、約 8 至約 10、約 9 至約 10、約 2 至約 8、約 2 至約 6、約 3 至約 8 或約 3 至約 6 個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有約 2 至約 10 個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有約 3 至約 8 個糖修飾。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可具有約 3 至約 6 個糖修飾。
在某些實施例中，gRNA 可具有至少一個磷酸主鏈修飾
(例如，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個磷酸主鏈修飾) 以及至少一個糖修飾
(例如，至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個糖修飾)。
在某些實施例中，gRNA 可具有至少兩個磷酸主鏈修飾及至少兩個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少三個磷酸主鏈修飾及至少三個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少四個磷酸主鏈修飾及至少四個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少五個磷酸主鏈修飾及至少五個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少五個磷酸主鏈修飾及至少六個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少六個磷酸主鏈修飾及至少六個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少七個磷酸主鏈修飾及至少七個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少八個磷酸主鏈修飾及至少八個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少八個磷酸主鏈修飾及至少九個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少九個磷酸主鏈修飾及至少九個糖修飾。在某些實施例中，gRNA 可具有至少十個磷酸主鏈修飾及至少十個糖修飾。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的至少一個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第二個與第三個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 3' 端處的至少一個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 3' 端 (第「n」個) 核苷酸與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 3' 端處的第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 3' 端處的第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 3' 端處的第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結，以及在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸以及第二個與第三個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第一個與第二個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第三個與第四個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA
分子包括在第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、第 n-2 個與第 n-3 個以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、第 n-2 個與第 n-3 個、第 n-3 個與第 n-4 個以及第 n-4 個與第 n-5 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結以及在第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 進一步包括在第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第三個與第四個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結以及在第一個與第二個核苷酸以及第二個與第三個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 進一步包括在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子包括在第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 進一步包括在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子在其 5' 端處，例如在 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及鎖核酸
(LNA) 中之一或多個。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或鎖核酸 (LNA)。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 5' 端處，例如在 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 5' 端處，例如在 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該 gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 5' 端處，例如在 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該 gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 5' 端處，例如在 5' 端處的前 5 個核苷酸內包括五個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，該 gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個與第五個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 3' 端處，例如在 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或鎖核酸
(LNA) 中之一或多個。例如但不作為限制，gRNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或鎖核酸 (LNA)。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 3' 端處，例如在 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，引導 RNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第 n 個與第 n-1 個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 3' 端處，例如在 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，引導 RNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 3' 端處，例如在 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，引導 RNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸具有去氧核糖。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 在其 3' 端處，例如在 3' 端處的最後 5 個核苷酸內包括五個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或
LNA。例如但不作為限制，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸、LNA 或其組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸。在某些實施例中，引導 RNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子的末端處的第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為 LNA。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸具有去氧核糖。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 5' 端處的一或多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 5' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或鎖核酸 (LNA)，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 5' 端處的兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 5' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸以及第二個與第三個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸以及第二個與第三個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 5' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 5' 端處的三個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個與第三個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 5' 端處的四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 5' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之 5' 端處的第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 3' 端處的一或多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 3' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或鎖核酸 (LNA)，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 3' 端處的兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個、或第 n 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸或 LNA，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間或第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸或第 n 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 3' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基)修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 3' 端處的四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括 (i) 在其 3' 端處的五個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，以及 (ii) 在 gRNA 分子之 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸或 LNA，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，且 gRNA 分子包括在 gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的一或多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的一或多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的一或多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的一或多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的兩個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的兩個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的兩個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的三個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的三個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的一或多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的三個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的三個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的三個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及/或 LNA，(ii) 在 5' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的四個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，(ii) 在 5' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的五個或更多個經 2'-氟修飾的核苷酸、經 2'-O-甲基修飾的核苷酸、經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸、去氧核糖核苷酸及 LNA，以及 (iv) 在 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，(ii) 在 5' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結，(iii) 在 3' 端處的五個或更多個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸，以及 (iv) 在 3' 端處的四個或更多個二硫代磷酸酯鍵結。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的一個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的一個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的一個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的兩個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個與第二個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間以及第二個與第三個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的兩個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的三個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的三個硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間以及第二個與第三個核苷酸之間、或第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間以及第二個與第三個核苷酸之間、或第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 5' 端處的一個硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間或第三個與第四個核苷酸之間)，(iv) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，以及 (v) 在 3' 端處的兩個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的三個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的一個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間或第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個與第三個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的三個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間以及第三個與第四個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的三個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸)，(iv) 在 3' 端處的一個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間或第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間)，以及 (v) 在 3' 端處的一個硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間或第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間、第三個與第四個核苷酸之間以及第四個與第五個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的四個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二個核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間、第三個與第四個核苷酸之間以及第四個與第五個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的五個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 包括：(i) 在 5' 端處的四個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第一個、第二個、第三個與第四個核苷酸)，(ii) 在 5' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第一個與第二核苷酸之間、第二個與第三個核苷酸之間、第三個與第四個核苷酸之間以及第四個與第五個核苷酸之間)，(iii) 在 3' 端處的五個經 2'-O-甲基修飾的核苷酸
(例如，第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸)，以及 (iv) 在 3' 端處的四個二硫代磷酸酯鍵結
(例如，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間以及第 n-4 個與第 n-5 個核苷酸之間)。
在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以根據表 1 及表 10 中所揭示之修飾方案進行修飾。例如但不作為限制，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「A」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「A」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「B」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「C」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「D」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「E」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「F」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「G」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「H」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「I」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「J」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「K」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 1 之修飾方案「L」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「M」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「N」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「O」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「P」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「Q」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「R」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「S」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「T」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「U」進行修飾。在某些實施例中，經修飾之 gRNA 可以根據表 10 之修飾方案「V」進行修飾。
在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有以下的編輯效率：約 1%、約 2%、約 3%、約 4%、約 5%、約 6%、約 7%、約 8%、約 9%、約 10%、約 11%、約 12%、約 13%、約 14%、約 15%、約 16%、約 17%、約 18%、約 19%、約 20%、約 21%、約 22%、約 23%、約 24%、約 25%、約 26%、約 27%、約 28%、約 29%、約 30%、約 31%、約 32%、約 33%、約 34%、約 35%、約 36%、約 37%、約 38%、約 39%、約 40%、約 41%、約 42%、約 43%、約 44%、約 45%、約 46%、約 47%、約 48%、約 49%、約 50%、約 51%、約 52%、約 53%、約 54%、約 55%、約 56%、約 57%、約 58%、約 59%、約 60%、約 61%、約 62%、約 63%、約 64%、約 65%、約 66%、約 67%、約 68%、約 69%、約 70%、約 71%、約 72%、約 73%、約 74%、約 75%、約 76%、約 77%、約 78%、約 79%、約 80%、約 81%、約 82%、約 83%、約 84%、約 85%、約 86%、約 87%、約 88%、約 89%、約 90%、約 91%、約 92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99% 或約 100%。
在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有以下的編輯效率：約 5% 或更高、約 10% 或更高、約 15% 或更高、約 20% 或更高、約 25% 或更高、約 30% 或更高、約 35% 或更高、約 40% 或更高、約 45% 或更高、約 50% 或更高、約 55% 或更高、約 60% 或更高、約 65% 或更高、約 70% 或更高、約 75% 或更高、約 80% 或更高、約 85% 或更高、約 90% 或更高或約 95% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 60% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 65% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 70% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 75% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 80% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 85% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 90% 或更高的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 具有約 95% 或更高的編輯效率。
在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 5% 至約 100% 的編輯效率。例如但不作為限制，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有以下的編輯效率：約 5% 至約 100%、約 10% 至約 100%、約 20% 至約 100%、約 30% 至約 100%、約 40% 至約 100%、約 45% 至約 100%、約 50% 至約 100%、約 55% 至約 100%、約 60% 至約 100%、約 65% 至約 100%、約 70% 至約 100%、約 75% 至約 100%、約 80% 至約 100%、約 85% 至約 100%、約 90% 至約 100% 或約 95% 至約 100%。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 50% 至約 100% 的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 60% 至約 100% 的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 70% 至約 100% 的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 80% 至約 100% 的編輯效率。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可具有約 90% 至約 100% 的編輯效率。
在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率或具有與參考 gRNA 相比改善的編輯效率。例如但不作為限制，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 50% 或更高、約 55% 或更高、約 60% 或更高、約 65% 或更高、約 70% 或更高、約 75% 或更高、約 80% 或更高、約 85% 或更高、約 90% 或更高或約 95% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 50% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 60% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 70% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 80% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 90% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 50% 至約
100%，例如約 55% 至約 100%、約 60% 至約 100%、約 65% 至約 100%、約 70% 至約 100%、約 75% 至約 100%、約 80% 至約 100%、約 85% 至約 100%、約 90% 至約 100%、約 91% 至約 100%、約 92% 至約 100%、約 93% 至約 100%、約 94% 至約 100%、約 95% 至約 100%、約 96% 至約 100%、約 97% 至約 100%、約 98% 至約 100% 或約 99% 至約 100%。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 60% 至約 100%。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 70% 至約 100%。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 80% 至約 100%。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可以保留參考 gRNA 之編輯效率的約 90% 至約 100%。 在某些實施例中，與參考 gRNA
相比，本揭露之經修飾之 gRNA 可表現出編輯效率之增加，例如，編輯效率增加約 1% 或更高、約 2% 或更高、約 3% 或更高、約 4% 或更高、約 5% 或更高、約 6% 或更高、約 7% 或更高、約 8% 或更高、約 9% 或更高或約 10% 或更高。在某些實施例中，本揭露之經修飾之 gRNA 可表現出編輯效率自約 1% 至約 10% 之增加。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有與經修飾之 gRNA 相同的核苷酸序列之 gRNA
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有靶向域的 gRNA，該靶向域具有與經修飾之 gRNA 相同的序列
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。在某些實施例中，參考 gRNA 可為具有與經修飾之 gRNA 相同數量之核苷酸的 gRNA
(例如，沒有與經修飾之 gRNA 相同的修飾)。
III. RNA 引導的核酸酶
多種類型及物種之 RNA 引導的核酸酶可用於本揭露內容。RNA 引導的核酸酶與本文 (例如，第 II 節) 所揭示之一或多個經修飾之
gRNA 組合使用。
在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。Cas 蛋白之非限制性實例揭示於 Makarova 及 Koonin, Methods Mol.Biol.1311:47-75 (2015) 中，該文獻之內容藉由引用全文併入本文。在某些實施例中，Cas 蛋白包括 Cas1、Cas2、Cas3、Cas3-HD、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas12a (Cpf1)、Cas13、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、CsaX、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Csn2、Csb1、Csb2、Csb3、Csx1、Csx3、Csx10、Csx14、Csx15、Csx16、Csx17、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、C2c1、C2c2 及 C2c3。在某些實施例中，該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12a、Cas13 及其組合。在某些實施例中，Cas 蛋白為 Cas9 蛋白。
在某些實施例中，Cas 蛋白為與參考 Cas 蛋白 (例如野生型
Cas 蛋白) 不同的工程化 Cas 蛋白。在某些實施例中，參考 Cas 蛋白為天然存在的 Cas 蛋白。在某些實施例中，與參考 Cas 蛋白
(例如野生型 Cas 蛋白) 相比，Cas 蛋白包括一或多個胺基酸變異。在某些實施例中，工程化 Cas 蛋白保留或基本上保留參考 Cas 蛋白之核酸酶
(例如，核酸內切酶) 活性。在某些實施例中，工程化 Cas 蛋白保留參考 Cas 蛋白之至少約 70%、約 80%、約 90%、約 95% 或約 99% 核酸酶活性。在某些實施例中，工程化 Cas 蛋白不具有裂解活性或不具有顯著的裂解活性。在某些實施例中，Cas 蛋白可以缺乏裂解活性或具有顯著較低的裂解活性，例如，小於參考
Cas 蛋白之裂解活性的 20%、約 10%、約 5% 或約 1%。
在某些實施例中，工程化 Cas 蛋白包括一或多個缺失，該一或多個缺失減小 Cas 蛋白之尺寸，同時至少部分保留 Cas 蛋白之核酸酶活性。在某些實施例中，工程化 Cas 蛋白之減小的尺寸可以允許用於遞送此類工程化 Cas 蛋白之方法具有靈活性。
在某些實施例中，Cas 蛋白與本揭露之 gRNA 分子相互作用，且與 gRNA 分子一致地定位至包括標靶序列
(例如，與 gRNA 分子之序列互補的序列) 及 PAM 序列的標靶核酸。在某些實施例中，Cas 蛋白與標靶核酸相互作用且裂解標靶核酸之能力依賴於 PAM 序列。在某些實施例中，標靶核酸之裂解發生在 PAM 序列的上游。在某些實施例中，標靶核酸之裂解發生在 PAM 序列的下游。來自不同物種 (例如，細菌物種) 之 Cas
分子可以識別不同的 PAM 序列。
在某些實施例中，用於本揭露之 Cas 蛋白可以源自以下物種中之任一者：化膿鏈球菌 (
Streptococcus pyogenes)、肺炎鏈球菌 (
Streptococcus pneumoniae)、嗜熱鏈球菌 (
Streptococcus thermophilus)、無乳鏈球菌 (
Streptococcus agalactiae)、副血鏈球菌 (
Streptococcus parasanguinis)、口腔鏈球菌 (
Streptococcus oralis)、涎鏈球菌 (
Streptococcus salivarius)、獼猴鏈球菌 (
Streptococcus macacae)、壞乳鏈球菌 (
Streptococcus dysgalactiae)、咽峽炎鏈球菌 (
Streptococcus anginosus)、星座鏈球菌 (
Streptococcus constellatus)、假豚鏈球菌 (
Streptococcus pseudoporcinus)、變種鏈球菌 (
Streptococcus mutans)、無害李氏菌 (
Listeria innocua)、蜜蜂螺原體 (
Spiroplasma apis)、蠅類螺原體 (
Spiroplasma syrphidicola)、卡托氏卟啉單胞菌 (
Porphyromonas catoniae)、中間普雷沃菌 (
Prevotella intermedia)、索氏密螺旋體 (
Treponema socranskii)、大芬戈爾德菌 (
Finegoldia magna)、貝氏巴氏桿菌 (
Pasteurella bettyae)、錫蒂亞橄欖形菌 (
Olivibacter sitiensis)、膠黏石面單孢菌 (
Epilithonimonas tenax)、運動海研站菌 (
Mesonia mobilis)、胚芽乳酸桿菌 (
Lactobacillus plantarum)、紅蝽菌科細菌 (
Coriobacteriaceae bacterium)、茂盛歐陸森氏菌 (
Olsenella profusa)、痰嗜血桿菌 (
Haemophilus sputorum)、臘樣芽孢桿菌
(
Bacillus cereus)、米勒海水桿菌
(
Aquimarina muellen)、沼澤金黃桿菌
(
Chryseobacterium palustre)、草溶性擬桿菌
(
Bacteroides graminisolvens)、腦膜炎雙球菌
(
Neisseria meningitidis)、新兇手弗朗西斯菌
(
Francisella novicida)、皮特曼嗜血桿菌
(
Haemophilus pittmaniae)、貝特巴氏桿菌
(
Pasteurella bettyae)、冷水黃桿菌
(
Flavobacterium frigidarium)、土壤黃桿菌
(
Flavobacterium soli) 及/或齒垢螺旋體 (
Treponema denticola)。
在某些實施例中，用於本揭露之 Cas 蛋白引導在標靶核酸之位置處的一或兩條股之裂解。例如但不作為限制，用於本揭露之 Cas 蛋白引導在標靶核酸內之一或兩條股的裂解。替代地，Cas 蛋白引導在來自標靶核酸之約 500 個鹼基對內
(例如，約 400 個、約 300 個、約 200 個、約 100 個、約 80 個、約 60 個、約 40 個、約 20 個、約 10 個或約 5 個鹼基對內) 的一或兩條股的裂解。
在某些實施例中，Cas 蛋白，例如
Cas9，包括功能性 RuvC 及 HNH 核酸酶域，可以裂解標靶核酸序列之兩條股。在某些實施例中，Cas 蛋白，例如
Cas9，包含一個功能性核酸內切酶域，該核酸內切酶域允許 Cas 蛋白僅裂解標靶核酸序列之一條股
(即，切口)。例如但不作為限制，Cas9 切口酶可包括：(i) 非功能性 RuvC 域
(例如，突變型 RuvC 域)，以及 (ii) 功能性 HNH 域
(例如，野生型 HNH 域)。在某些實施例中，Cas9 切口酶可包含：(i) 功能性 RuvC 域
(例如，野生型 RuvC 域)，以及 (ii) 非功能性 HNH 域
(例如，突變型 HNH 域)。在某些實施例中，Cas9 切口酶包含功能性 HNH 樣且包含 D10
處之突變，例如，D10A。在某些實施例中，Cas9 切口酶包含功能性 RuvC 域且包含 H840
處之突變，例如，H840A。在某些實施例中，Cas9 切口酶包含功能性 RuvC 域且包含 N863
處之突變，例如，N863A。
在某些實施例中，編碼 Cas 蛋白之核苷酸序列係密碼子最佳化的。例如但不作為限制，編碼 Cas 蛋白之核苷酸序列可以為密碼子最佳化的，例如，其中至少一個非常見的密碼子或不太常見的密碼子已被常見的密碼子替換，以在特定細胞類型
(例如，哺乳動物細胞)
中最佳化表現。
在某些實施例中，Cas 蛋白為包括一或多個異源蛋白域之融合蛋白。在某些實施例中，Cas
融合蛋白可以包括任何額外的蛋白域，例如，抗原決定基標籤、報導子序列及具有一或多種以下活性之蛋白域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、轉錄活化活性、轉錄抑制活性、轉錄釋放因子活性、組蛋白修飾活性、RNA 裂解活性及核酸結合活性。
在某些實施例中，Cas 蛋白包括一或多個核定位序列以促進 Cas 蛋白在細胞核中呈可偵測之量的累積。核定位序列為此項技術中已知的。例如但不作為限制，Cas 蛋白可以包括在其 N 端及/或 C 端處的核定位序列
(例如，來自 SV40)。
IV. 組成物
本揭露進一步提供包括本文所揭示之一或多個經修飾之 gRNA 的組成物。在某些實施例中，本揭露之組成物可包括本文所揭示之兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、六個或更多個、七個或更多個、八個或更多個、九個或更多個、或十個或更多個經修飾之 gRNA。
在某些實施例中，本揭露之組成物包括包含本文所揭示，例如如第
II 節中所述之一或多個修飾的 gRNA。在某些實施例中，組成物可包括編碼本文所揭示之 gRNA 分子的核酸。替代地或另外，組成物包括 gRNA 分子作為經轉錄或合成的 RNA 分子。
在某些實施例中，本揭露之組成物可進一步包括 RNA 引導的核酸酶。在某些實施例中，組成物包括編碼 RNA 引導的核酸酶之核酸。替代地或另外，組成物包括 RNA 引導的核酸酶作為蛋白質。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白，例如
Cas9 蛋白。
本揭露進一步提供包括一或多種本文所揭示之經修飾的 gRNA 之核酸組成物。在某些實施例中，核酸組成物包括編碼本文所述之 gRNA 分子的多核苷酸。在某些實施例中，核酸組成物可進一步包括編碼 RNA 引導的核酸酶 (例如
Cas 蛋白) 之多核苷酸。在某些實施例中，本揭露之核酸組成物可以包括編碼 gRNA 分子及 RNA 引導的核酸酶之核酸，例如，包括編碼
gRNA 分子之多核苷酸
(例如，偶聯至第一啟動子) 及編碼 RNA 引導的核酸酶之多核苷酸
(例如，偶聯至第二啟動子) 的核酸。在某些實施例中，本揭露之核酸組成物可包括編碼 gRNA 分子之第一核酸及編碼 RNA 引導的核酸酶之第二核酸。
在某些實施例中，編碼一或多個 gRNA 分子及/或一或多個 RNA 引導的核酸酶之核酸組成物可藉由此項技術中已知或如本文所述之方法投予至個體或遞送至細胞中。例如但不作為限制，編碼 gRNA 分子及/或 RNA 引導的核酸酶之核酸可以藉由非基於載體之方法
(例如，藉由使用 DNA 複合物或裸 DNA)、藉由基於載體之方法或其組合遞送至個體或遞送至細胞中。在某些實施例中，載體可為病毒載體。在某些實施例中，病毒為 RNA 病毒或 DNA 病毒。 例示性病毒載體/病毒包括但不限於反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒 (AAV)、牛痘病毒、痘病毒及單純皰疹病毒。在某些實施例中，本揭露之載體包括編碼 gRNA 分子及/或 RNA 引導的核酸酶之多核苷酸序列。在某些實施例中，載體進一步包括編碼核定位的序列，編碼核定位的序列例如在
RNA 引導的核酸酶之 N 端及/或 C 端處與 RNA 引導的核酸酶融合。
本揭露進一步提供包含核糖核酸蛋白 (RNP) 複合物之組成物。在某些實施例中，RNP
複合物包括 gRNA 分子 (例如，作為經轉錄或合成之 RNA) 及 RNA 引導的核酸酶。 在某些實施例中，gRNA 分子在遞送至標靶細胞之前在適合的條件下與 RNA 引導的核酸酶形成 RNP 複合物。
本揭露進一步提供包括本揭露之一或多種組成物的細胞。例如但不作為限制，細胞可包括本揭露之核酸組成物。在某些實施例中，細胞可包括本揭露之 RNP 複合物。可使用所揭示之組成物來修飾多種細胞。例如但不作為限制，細胞可為免疫細胞，例如，T
細胞。在某些實施例中，T 細胞可為 CD8
+T 細胞及/或 CD4
+T 細胞。在某些實施例中，細胞可為幹細胞。在某些實施例中，細胞可為誘導性富潛能幹 (iPS) 細胞。在某些實施例中，細胞可為源自幹細胞或 iPS
之細胞，例如，源自幹細胞或 iPS 之免疫細胞。
在某些實施例中，本揭露之組成物
，例如，本揭露之核酸組成物，可藉由此項技術中已知或如本文所述之方法遞送至標靶細胞中。例如但不作為限制，本揭露之組成物可藉由顯微注射、電穿孔、瞬態細胞壓縮或擠壓、脂質介導之轉染、肽介導之遞送或其組合遞送至細胞中。在某些實施例中，組成物例如包含
RNP 複合物，藉由電穿孔遞送至標靶細胞。
V. 使用方法
本揭露進一步提供使用本文所揭示之 gRNA 的方法。在某些實施例中，本文提供之 gRNA 分子可用於修飾細胞中之標靶核酸。例如但不作為限制，本揭露之
gRNA
分子可用於例如離體或活體內修飾細胞中之標靶核酸。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於減少細胞中標靶核酸之表現的方法中。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於增加細胞中標靶核酸之表現的方法中。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於在緊鄰標靶核酸處引入一或多個核苷酸之插入或缺失的方法中。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於在緊鄰標靶核酸處引入缺失的方法中。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於在緊鄰標靶核酸處引入插入的方法中。在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用於在緊鄰標靶核酸處引入一或多個斷裂
(例如，雙股斷裂或單股斷裂) 的方法中。
在某些實施例中，用於修飾細胞中之標靶核酸的方法包括使細胞與 gRNA 分子接觸，該 gRNA 分子包括對標靶核酸中之序列具有特異性的間隔子
(例如，靶向域)。在某些實施例中，該方法包括使細胞與本文所揭示之組成物
(例如，包含經修飾的 gRNA 分子及 RNA 引導的核酸酶之組成物) 接觸。
本揭露進一步提供用於治療個體之方法。例如但不作為限制，包含本揭露之 gRNA 分子的組成物可用於治療方法中。在某些實施例中，本揭露提供用於治療有需要之個體的 gRNA 分子。在某些實施例中，本揭露提供用於治療患有疾病之個體的 gRNA 分子。在某些實施例中，gRNA 分子包含與標靶核酸
(例如，與待治療之疾病相關的基因) 互補的間隔子。在某些實施例中，該方法包括藉由使細胞與包含有效量之本文所揭示之
gRNA 分子或本文所揭示之 RNP
複合物的組成物接觸 (例如，藉由本文所揭示或此項技術中已知之任何遞送方法進行) 來離體修飾個體之細胞。在某些實施例中，該方法可進一步包括將經修飾的細胞送回至個體。
在某些實施例中，本揭露之 gRNA 分子可用作藥物。在某些實施例中，本揭露提供本文所揭示之 gRNA 分子在藥物之製造或製備中的用途。在某些實施例中，該藥物用於治療疾病。在某些實施例中，該藥物用於治療疾病之方法中，該方法包括向患有疾病之個體投予有效量之藥物。
在某些實施例中，包含本文提供之 gRNA
分子中之任一者的組成物例如可用於上述治療方法中之任一者中。在某些實施例中，包含本文提供之任何 gRNA 分子及/或 RNA 引導的核酸酶之組成物可用於治療方法
(例如，離體修飾細胞)
中。
在某些實施例中，本文所揭示之一或多種組成物
，例如，核酸組成物，可以投予至個體或與來自個體之細胞接觸
，例如，
離體接觸。在某些實施例中，組成物可包括本揭露之 gRNA 及 RNA 引導的核酸酶。替代地，組成物包括本揭露之 gRNA 且不包括 RNA 引導的核酸酶。在某些實施例中，組成物，例如，包括
gRNA 之核酸組成物，與包括 RNA 引導的核酸酶之組成物同時投予。在某些實施例中，組成物，例如，包括
gRNA 之核酸組成物，在包括 RNA 引導的核酸酶之組成物之後投予。在某些實施例中，組成物，例如，包括
gRNA 之核酸組成物，在包括 RNA 引導的核酸酶之組成物之前投予。在某些實施例中，核酸組成物可藉由本文所述之任何遞送方法來遞送，例如，編碼
gRNA 之核酸可以藉由病毒載體遞送。在某些實施例中，包括 RNA 引導的核酸酶之組成物可以藉由電穿孔遞送至細胞。
VI. 基因編輯系統
本揭露亦提供基因編輯系統，其包含本文所揭示之一或多種組成物及/或可用於執行本文所述之方法的材料。
在某些實施例中，本揭露之基因編輯系統可以包含本文所揭示之一或多個經修飾之 gRNA 分子。例如但不作為限制，本揭露之基因編輯系統可以包含第 II 節中所揭示之一或多個 gRNA 分子。
在某些實施例中，本揭露之基因編輯系統之 gRNA 分子包含：(a) 在引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結；(b) 在引導 RNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結；或 (c) 在引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結以及在引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。在某些實施例中，二硫代磷酸酯鍵結存在於 gRNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、以及第三個與第四個核苷酸之間。在某些實施例中，二硫代磷酸酯鍵結存在於 gRNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之間、或第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間。
在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個及/或第三個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個及/或第四個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。在某些實施例中，gRNA 分子的 5' 端處的第一個、第二個、第三個、第四個及/或第五個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。
在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個、第 n-1 個與第 n-2 個或第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸或第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。在某些實施例中，gRNA 分子之第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：經 2'-氟修飾的核苷酸；經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；鎖核酸 (LNA)；去氧核糖核苷酸；以及上述修飾中之兩者或更多者的組合。
在某些實施例中，本揭露之基因編輯系統可包括一或多個經修飾的 gRNA
(例如如第 II 節中所揭示)，及 RNA 引導的核酸酶
(例如如第 III 節中所揭示之 RNA 引導的核酸酶)。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。在某些實施例中，Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
在某些實施例中，本揭露之基因編輯系統包含編碼如本文所述，(例如如第 II 節中所揭示)
之 gRNA 的一或多種核酸。在某些實施例中，一或多種核酸進一步包含編碼 RNA 引導的核酸酶
(例如如第 III 節中所揭示之 RNA 引導的核酸酶) 的多核苷酸。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。在某些實施例中，Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
在某些實施例中，基因編輯系統包含一或多種載體，該一或多種載體包含如本文所述，例如如第
IV 節中所揭示之核酸。
在某些實施例中，基因編輯系統包含一或多種組成物，該一或多種組成物包含本文所揭示，例如如第
II 節中所揭示之 gRNA。在某些實施例中，組成物進一步包含 RNA 引導的核酸酶。在某些實施例中，組成物包含本文所述，例如如第
IV 節中所揭示之核酸。
在某些實施例中，基因編輯系統包含一或多種 RNP 複合物，該一或多種 RNP 複合物包含第 II 節及本文所揭示之 gRNA 以及 RNA 引導的核酸酶。在某些實施例中，RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。在某些實施例中，Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
VII. 示例性實施例
A1. 本發明所揭示之標的提供一種引導 RNA 分子，其包含：
(a) 在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結；
(b) 在該引導 RNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結；或
(c) 在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結以及在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A2. 如 A1 之引導 RNA 分子，其進一步包含在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A3. 如 A1 或 A2 之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A4. 如 A1 至 A3 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸、以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A5. 如 A1 至 A4 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸或者第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A6. 如 A1 至 A5 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A7. 如 A1 至 A6 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
A8. 如 A1 至 A7 中任一項之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：
(a) 經 2’-氟修飾的核苷酸；
(b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸；
(c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；
(d) 鎖核酸 (LNA)；
(e) 去氧核糖核苷酸；以及
(f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
A9. 如 A8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。
A10. 如 A8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A11. 如 A8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
A12. 如 A8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含 LNA。
A13. 如 A8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5' 端處的第一個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
A14. 如 A1 至 A13 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的 5' 端處的 (i) 第二個核苷酸、(ii) 第三個核苷酸、(iii) 第四個核苷酸、(iv) 第二個與第三個核苷酸、(v) 第二個與第四個核苷酸、(vi) 第三個與第四個核苷酸或 (v) 第二個、第三個與第四個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：
(a) 經 2’-氟修飾的核苷酸；
(b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸；
(c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；
(d) 鎖核酸 (LNA)；
(e) 去氧核糖核苷酸；以及
(f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
A15. 如 A1 至 A9 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2'-氟修飾的核苷酸。
A16. 如 A1 至 A8、A10 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A17. 如 A1 至 A8、A10 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子於該引導 RNA 分子的 5' 端處的前四個核苷酸處包含四個連續的經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A18. 如 A1 至 A8、A11 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
A19. 如 A1 至 A8、A12 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的 LNA。
A20. 如 A1 至 A8、A13 及 A14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5' 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的去氧核糖核苷酸。
A21. 如 A1 至 A20 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的 3' 端 (第「n」個) 核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾：
(a) 經 2'-氟修飾的核苷酸；
(b) 經 2'-O-甲基修飾的核苷酸；
(c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；
(d) 鎖核酸 (LNA)；
(e) 去氧核糖核苷酸；以及
(f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
A22. 如 A21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。
A23. 如 A21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A24. 如 A21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
A25. 如 A21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含 LNA。
A26. 如 A21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
A27. 如 A1 至 A26 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的 (i) 第 n-1 個核苷酸、(ii) 第 n-2 個核苷酸、(iii) 第 n-3 個核苷酸、(iv) 第 n-4 個核苷酸、(v) 第 n 個與第 n-1 個核苷酸、(vi) 第 n 個與第 n-2 個核苷酸、(vii) 第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(viii) 第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(ix) 第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、(x) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、或 (xi) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自包含選自由以下所組成之群組的修飾：
(a) 經 2’-氟修飾的核苷酸；
(b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸；
(c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸；
(d) 鎖核酸 (LNA)；
(e) 去氧核糖核苷酸；以及
(f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
A28. 如 A1 至 A22 及 A27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-氟修飾的核苷酸。
A29. 如 A1 至 A21、A23 及 A27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A30. 如 A1 至 A21、A23、A27 及 A29 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
A31. 如 A1 至 A21、A24 及 A27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
A32. 如 A1 至 A21、A25 及 A27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為 LNA。
A33. 如 A1 至 A21、A26 及 A27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為去氧核糖核苷酸。
B. 本發明所揭示之標的提供一種核酸，其包含編碼如 A1 至 A33 中任一項之引導 RNA 分子的多核苷酸。
B1. 如 B 之核酸，其進一步包含編碼 RNA 引導的核酸酶的多核苷酸。
B2. 如 B1 之核酸，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
B3. 如 B2 之核酸，其中該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
C. 本發明所揭示之標的提供一種載體，其包含如 B 至 B3 中任一項之核酸。
D. 本發明所揭示之標的提供一種組成物，其包含如 A1 至 A33 中任一項之引導 RNA 分子。
D1. 如 D 之組成物，其進一步包含 RNA 引導的核酸酶。
D2. 如 D 或 D1 之組成物，其進一步包含編碼該 RNA 引導的核酸酶的核酸。
D3. 如 D1 或 D2 之組成物，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
E. 本發明所揭示之標的提供一種組成物，其包含如 B 至 B3 之核酸。
F. 本發明所揭示之標的提供一種組成物，其包含如 C 之載體。
G. 本發明所揭示之標的提供一種核糖核酸蛋白 (RNP) 複合物，其包含如 A1 至 A33 中任一項之引導 RNA 分子以及 RNA 引導的核酸酶。
G1. 如 G 之 RNP 複合物，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
G2. 如 G1 之 RNP 複合物，其中該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
H. 本發明所揭示之標的提供一種細胞，其包含如 D 至 D3、E 或 F 中任一項之組成物。
I. 本發明所揭示之標的提供一種細胞，其包含如 G 至 G2 中任一項之 RNP 複合物。
J. 本發明所揭示之標的提供一種修飾細胞之方法，其包含使該細胞與如 D 至 D3、E 或 F 中任一項之組成物或如 G 至 G2 中任一項之 RNP 複合物接觸。
J1. 如 J 之方法，其中該接觸包含藉由電穿孔將該組成物引入該細胞中。
K. 本發明所揭示之標的提供一種治療有需要之個體之方法，其包含：
(a) 藉由使該個體的細胞與如 D 至 D3、E 或 F 中任一項之組成物或如 G 至 G2 中任一項之 RNP 複合物接觸，離體修飾該細胞；以及
(b) 將經修飾的細胞送回至該個體。
L. 本發明所揭示之標的提供一種基因編輯系統，其包含：
(a) 一或多個如 A1 至 A33 中任一項之引導 RNA 分子；
(b) 一或多個如 B 至 B3 中任一項之核酸；
(c) 一或多個如 C 之載體；
(d) 一或多個如 D 至 D3、E 或 F 之組成物；及/或
(e) 一或多個如 G 至 G2 中任一項之 RNP 複合物。
實例
藉由參考以下實例將更好地理解本發明所揭示之標的，該等實例係作為本發明所揭示之標的之例示而非作為限制而提供的。
實例 1 ： gRNA 分子之修飾
本實例提供經化學合成以在 gRNA 分子之 5' 端及 3' 端處包括多個修飾的 gRNA 分子。如表 1 中所示，本實例提供修飾策略 A-L。表 1 提供與參考 gRNA 分子相比，對於此等策略中之各種策略的修飾的總結。
核苷酸修飾如下在表 1 中指示：*：硫代磷酸酯 (PS) 鍵結；**：二硫代磷酸酯 (PS2) 鍵結；m：2'-OMe；ln：鎖核酸 (LNA)；f：2'-氟；M：2'-O-MOE；以及 d：去氧核糖核苷酸。例如，mA 代表 2'-O-甲基腺苷，且 dA 代表腺苷去氧核糖核苷酸。表 1
之序列中引用的「N」代表任何核苷酸鹼基，例如、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或胞嘧啶 (C)。表 1 中所揭示之參考 gRNA 稱為參考 gRNA 1、參考 gRNA 2 及參考 gRNA 3，其具有與策略 A-L 之經修飾之 gRNA 相同的核苷酸序列。參考 gRNA 1 及參考 gRNA 3 具有相同的修飾策略，如表 1 中所示。與參考 gRNA 1 及參考 gRNA 3 相比，參考 gRNA 2 在 3' 端處具有 3 個硫代磷酸酯鍵結，且以 rU 終止。
表 1
| gRNA 名稱 | 5' 端處之修飾策略 | 3' 端處之修飾策略 | 序列 |
| 參考 gRNA 1 | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個硫代磷酸酯鍵結 | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| 參考 gRNA 2 | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | • 對第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrU*mU*mU*rU-3' |
| 參考 gRNA 3 | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個硫代磷酸酯鍵結 | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| A | • 用 LNA 替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | • 用 LNA 替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | 5'-lnN*lnN*lnN*rNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUlnU*lnU*lnU-3' |
| B | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU**mU**mU-3' |
| C | • 用經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | • 用經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | 5'-MN*MN*MN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUMU*MU*MU-3' |
| D | • 用經 2'-氟修飾的核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | • 用經 2'-氟修飾的核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | 5'-fN*fN*fN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUfU*fU*fU-3' |
| E | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | 5'-mN*mN*mN*fNfNfNfNfNfNfNfNfNfN fNfNfNfNfNfNfNfGfUfUfUfUfAfGfAfGfCfUfAfGfAfAfAfUfAfGfCfAfAfGfUfUfAfAfAfAfUfAfAfGfGfCfUfAfGfUfCfCfGfUfUfAfUfCfAfAfCfUfUfGfAfAfAfAfAfGfUfGfGfCfAfCfCfGfAfGfUfCfGfGfUfGfCfUmU*mU*mU-3' |
| F | • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | 5'-dN**dN**dN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUdU**dU**dU-3' |
| G | • 移除硫代磷酸酯鍵結 | • 移除硫代磷酸酯鍵結 | 5'-mNmNmNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmUmU mU-3' |
| H | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNr NrNrNrNrNrNrNrNrGrU*rU*rU*rU*rA*rG*rArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArG*rU*rU*rArA*rArA*rUrA*rArGrGrCrUrArG*rU*rCrCrG*rU*rU*rA*rUrCrA*rA*rCrUrUrGrArArArArArGrUrGrG*rCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| I | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | 5'-mN*mN*mN*dNdNdNdNdNdNdNdN dNdNdNdNdNdNdNdNdNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| J | • 移除 2'-O-甲基修飾 | • 移除 2'-O-甲基修飾 | 5'-rN*rN*rN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUrU*rU*rU-3' |
| K | • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | 5'-dN**dN**dN**rNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| L | • 移除所有修飾 | • 相對於參考 gRNA 1 無變化 | 5'-rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrN rNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
合成的經修飾之 gRNA 的身份藉由質譜法來確認，實驗質量與理論質量之間的質量誤差小於 200 ppm。如表 2 及表 3 中所示，實驗質量與計算質量一致，證實了長度及核鹼基組成為正確的。
對合成的經修飾之 gRNA 的純度進行分析。如圖2 及圖 3 中所示，對於根據修飾方案 A-F 進行修飾之 gRNA，觀察到相似的純度概況。此等經修飾之 gRNA 的純度範圍在 80.1% 與 99.5% 之間。圖2 及圖 4 以及表 2 提供了靶向參考標靶 1 且根據修飾方案 A-L 進行修飾之 gRNA 的純度概況，且圖3 及圖 5 以及表 3 提供了靶向參考標靶 2 且根據修飾方案 A-L 進行修飾之 gRNA 的純度概況。如圖2 及圖 3 中所示，gRNA 之序列對具有根據修飾方案 A-F 之修飾的經修飾之 gRNA 的純度及離子對逆相液相層析 (IPRP) 概況具有可忽略的影響。對於靶向此兩個標靶序列且具有根據修飾方案 G-L 之修飾的 gRNA，觀察到類似的結果 (圖4 至 圖 5 以及表 2 及表 3)。此外，觀察到雜質主要為短聚體。
如圖4 中所指出，2'-氟修飾顯著增加了 sgRNA 的疏水性。不受特定理論的束縛，較大的疏水性可以能夠實現寡核苷酸之結合以與蛋白質之某些域相互作用且調節該蛋白質之活性 (
參見Crooke 等人, Nucleic Acids Research 48(10):5235-5253 (2020)，該文獻之內容藉由引用全文併入本文)。
表 2
表 3
| 靶向參考標靶 1 之 gRNA 的修飾策略 | 純度 (a/a%) | 理論質量 (Da) | 實驗平均質量 (Da) | 質量差 (Da) |
| A | 98.7 | 32428.7 | 32426.8 | -1.9 |
| B | 95.8 | 32465.0 | 32464.0 | -1.0 |
| C | 99.5 | 32705.1 | 32705.0 | -0.1 |
| D | 98.7 | 32312.5 | 32312.5 | 0.0 |
| E | 80.1 | 32571.9 | 32572.0 | 0.1 |
| F | 98.5 | 32327.0 | 32326.4 | -0.6 |
| G | 85.3 | 32304.3 | 32304.5 | 0.2 |
| H | 54.2 | 32722.0 | 32720.4 | -1.6 |
| I | 74.0 | 32112.7 | 32112.0 | -0.7 |
| J | 75.1 | 32300.5 | 32300.5 | 0.0 |
| K | 74.0 | 32342.8 | 32342.0 | -0.8 |
| L | 54.7 | 32294.4 | 32294.0 | -0.4 |
| 靶向參考標靶 2 之 gRNA 的修飾策略 | 純度 (a/a%) | 理論質量 (Da) | 實驗平均質量 (Da) | 質量差 (Da) |
| A | 98.8 | 32379.7 | 32374.3 | -5.4 |
| B | 98.6 | 32416.0 | 32415.5 | -0.5 |
| C | 97.9 | 32656.1 | 32656.4 | 0.3 |
| D | 99.0 | 32263.5 | 32263.0 | -0.5 |
| E | 87.9 | 32522.8 | 32523.0 | 0.2 |
| F | 98.2 | 32292.0 | 32291.5 | -0.5 |
| G | 79.8 | 32255.3 | 32255.0 | -0.3 |
| H | 88.0 | 32673.0 | 32673.0 | 0.0 |
| I | 87.6 | 32063.6 | 32063.6 | 0.0 |
| J | 73.7 | 32251.5 | 32251.6 | 0.1 |
| K | 85.1 | 32307.8 | 32307.6 | -0.2 |
| L | 79.1 | 32245.4 | 32245.5 | 0.1 |
上述靶向參考標靶 1 且如表 1 中所示進行修飾之 gRNA 分子的功效如下分析。將細胞鋪板於 Prime-XV (IL-7 (25 ng/ml)、IL-15 (50 ng/ml)、TransAct 1:100) 中 (= 第 0 天)。將 4 mg 之各 sgRNA 重懸於 611-624 μL (取決於 MW) 之 IDT Duplex 緩衝液 (目錄編號 1072570) 中，以獲得 200 μM 溶液。使用 3:1 sgRNA:Cas9 比產生 RNP。對於剔除條件，滴定 1.11、3.33、10 及 30 pmol 的 RNP。對於敲入條件，使用 30 pmol 的 RNP，且加入 2 μg 之參考標靶 1-mNeon 奈米質體。按以下次序加入組分：1 – RNP (sgRNA 及 Cas9，首先在室溫下預孵育 15 min)，2 – 模板 (3 μg)，及 3 – 細胞 (2 百萬個)。刺激後 46 小時，在 P3 緩衝液中在 Lonza 4D 電穿孔儀上對細胞進行電穿孔。電穿孔後，將細胞靜置於 37℃
下 15 min。加入 75 μl 純 Prime-XV，且將細胞轉移至 48 孔盤中不含 TransAct 之 1 ml 完全培養基中。在第 5 天加入 3 ml 完全培養基，然後將細胞轉移至 12 孔盤。在第 5 天取出 0.5 mL 培養物進行 FAC 讀取 (僅 KO 樣品)。在第 6 天取出 0.5 mL 培養物進行 FAC 讀取 (僅 KI 樣品)。隨後在刺激後第 5 天及第 6 天對細胞進行染色，以檢測參考標靶 1 之表現的減少或增加。
圖6 至 圖 12 中所示之經修飾的 gRNA 之編輯效率總結於表 4 及表 5 中。如圖9 及圖 11 以及表 4 中所示，「B」 gRNA 在剔除條件及敲入條件兩者下之表現與參考 gRNA 極相似。gRNA 「D」之表現優於 gRNA 「C」，且 gRNA 「C」之表現優於 gRNA 「A」。在剔除條件及敲入條件兩者下，與參考 gRNA 相比，gRNA 「E」及「F」顯示出極小的活性。
如圖6 至圖 8、圖 10 及圖 12 以及表 5 中所示，與參考 gRNA 相比，gRNA 「G」、「J」及「L」表現出中等程度的剔除活性，但表現出與兩種參考 gRNA 相似的敲入活性。gRNA 「H」及「I」並未導致剔除或敲入活性。此外，與參考 gRNA 相比，gRNA 「K」產生了極少量的剔除或敲入活性。
在經修飾的 gRNA 存在之情況下，測試細胞在剔除條件及敲入條件兩者下的存活率。如圖13 至圖 16 中所示，對於在剔除 (圖13 至圖 14) 條件及敲入 (圖15 至圖 16) 條件下測試之所有經修飾的 gRNA 而言，細胞之存活率極相似。類似地，對於在剔除 (圖13 至圖 14) 條件及敲入 (圖15 至圖 16) 條件下測試之大多數 gRNA 而言，細胞之總數極相似。然而，對於敲入實驗，針對 gRNA 「E」及 gRNA 「F」測得之總細胞更多，此可能係由於此等 gRNA 未能有效切割標靶核酸 (圖15)。
表 4
表 5
| gRNA 名稱 | 平均 KO 活性 (10 pmol) | 平均 KI 活性 (30 pmol) |
| 參考 gRNA 2 | 89% | 50% |
| A | 58% | 29% |
| B | 91% | 47% |
| C | 80% | 35% |
| D | 83% | 43% |
| E | 2% | 0% |
| F | 4% | 1% |
| gRNA 名稱 | 平均 KO 活性 (10 pmol) | 平均 KI 活性 (30 pmol) |
| 參考 gRNA 2 | 77% | 37% |
| 參考 gRNA 3 | 70% | 37% |
| G | 52% | 39% |
| H | 11% | 0% |
| I | 6% | 0% |
| J | 46% | 34% |
| K | 8% | 1% |
| L | 38% | 34% |
如表 4 及表 5 中所總結，與其他所測試的 gRNA 相比，gRNA 「B」、「C」及「D」表現出最大的編輯功效，且與對照組更為相當。
實例 2 ：經修飾之 gRNA 分子的強制降解
此實例顯示了實例 1 中所述之例示性 gRNA 分子在強制條件下之降解。使實例 1 之 gRNA 分子經受強制降解條件，包括酸性應激 (pH 5)、鹼性應激 (pH 11)、氧化應激及熱應激條件。
強制降解條件：
酸性應激 (pH 5) ：酸性緩衝液：20 mM 乙酸鈉，pH 5.0。溫度：40℃。時間點：第 0 天、第 1 天、第 2 天及第 3 天 (gRNA 「A」至「L」)；第 0 天、第 1 天、第 2 天、第 3 天、第 5 天及第 7 天 (gRNA 「M」至「V」)。
鹼性應激 (pH 11) ：鹼性緩衝液：20 mM 碳酸鈉，pH 11.0。溫度：40℃。時間點：第 0 小時、第 8 小時、第 16 小時及第 24 小時 (gRNA 「A」至「L」)；第 0 小時、第 8 小時、第 16 小時、第 24 小時及第 48 小時 (gRNA 「M」至「V」)。
氧化應激 ：0.3% H
2O
2。
溫度：40℃。時間點：第 0 天、第 1 天、第 2 天、第 3 天及第 5 天 (gRNA 「A」至「V」)。
熱應激：Tris-EDTA (TE) 緩衝液，pH 8.0。溫度：40℃。時間點：第 0 天、第 1 天、第 3 天、第 5 天及第 7 天 (gRNA 「A」至「V」)。
樣品製備方法：
酸性應激 (pH 5) 分析：為了製備酸性應激 (pH 5) 溶液，將 164 mg 乙酸鈉加入 100 mL 容量瓶中。將 80 mL LC 級水加入燒瓶中，且用乙酸將 pH 值調整至 5.0。用水使溶液定容。將 10 µL sgRNA 用移液管移入 HPLC 插入管中，且加入 55 µL 酸性應激 (pH 5) 溶液，隨後平緩渦旋 5s。
鹼性應激 (pH 11) 分析：為了製備鹼性應激 (pH 11) 溶液，稱取 212 mg 碳酸鈉且將其置於 100 mL 容量瓶中。將約 80 mL LC 級水加入燒瓶中以溶解碳酸鈉，且用 1N HCl 將 pH 值調整至 11.0。用水使溶液定容。將 10 µL sgRNA 用移液管移入 HPLC 插入管中，且加入 55 µL 鹼性應激 (pH 11) 溶液，隨後平緩渦旋 5s。
熱 ( 液體 ) 分析：將 10 µL sgRNA 用移液管移入 HPLC 插入管中，且加入 55 µL TE 緩衝液 (pH 8)，隨後平緩渦旋 5s。
氧化分析：為了製備氧化溶液，將 0.59 mL 之 3% H
2O
2加入 5 mL 容量瓶中，且以 TE 緩衝液定容，隨後進行混合。將 10 µL sgRNA 用移液管移入 HPLC 插入管中，且加入 55 µL 之 0.35% H
2O
2，隨後平緩渦旋 5s。
HPLC ：如表 6 中所示進行 HPLC。
表 6
| 參數 | 條件 |
| 取樣器溫度 | 40℃ |
| 管柱 | DNAPac RP，4 µm，2.1 × 100 mm |
| 流速 | 0.40 mL/min |
| 管柱溫度 | 70℃ |
| 移動相 | A：於水中之 400 mM HFIP + 16.3 mM TEA B：40% MPA+ 60% 甲醇 |
| 注入體積 | 2 µL |
| UV 波長 | 260 nm |
| 梯度-(min) 0 20 21 23 23.5 30 | MPA： MPB： 90 10 40 60 0 100 0 100 90 10 90 10 |
圖17 顯示了經修飾之 gRNA 在正常條件下的溶析曲線。如圖17 中所示，具有修飾策略 A 至 L 之 gRNA 在時間點 0 (T
0) 時具有範圍在 47%-92% 內的初始純度。此等經修飾之 gRNA 的強制降解研究之結果示於表 7 至表 9 以及圖18 至圖 40 中。
表 7.強制降解下之純度的總結
| gRNA 名稱 | 純度 ( 面積 %) | ||||
| T(0) | 0.3% H 2O 2 ， 40℃ ， T(5d) | pH 8 ， 40℃ ， T(7d) | pH 5 ， 40℃ ， T(3d) | pH 11 ， 40℃ ， T(1d) | |
| 參考 gRNA 3 | 91.4 | 91.2 | 86.0 | 81.9 | 11.2 |
| A | 66.6 | 63.7 | 62.8 | 61.0 | 11.8 |
| B | 89.3 | 78.3 | 82.2 | 81.6 | 23.0 |
| C | 64.6 | 22.4 | 61.0 | 59.9 | 16.6 |
| D | 93.4 | 85.0 | 88.9 | 85.1 | 75.9 |
| E | 67.7 | 61.0 | - | 66.5 | 67.0 |
| F | 63.5 | 61.3 | 60.6 | 59.8 | 52.6 |
| G | 65.3 | 59.4 | 59.5 | 60.2 | 0.8 |
| H | 52.3 | 3.9 | 47.7 | 49.6 | 9.9 |
| I | 66.9 | 64.4 | 63.8 | 64.2 | 9.3 |
| J | 56.3 | 55.2 | 52.3 | 52.9 | 38.2 |
| K | 47.4 | 45.8 | 42.6 | 44.5 | 11.7 |
| L | 47.8 | 47.7 | 45.5 | 45.5 | 7.0 |
圖18 顯示了參考 gRNA 3 在鹼性應激 (pH 11)、酸性應激 (pH 5) 及氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。圖19 顯示了參考 gRNA 3 在鹼性應激 (pH 11)、酸性應激 (pH 5) 及氧化應激 (0.3% H
2O
2)下歷經某些時間段之層析圖的重疊部分。如圖18 至圖 19 中所示，與導致由於快速降解形成短聚體的鹼性應激 (pH 11) 相比，參考 gRNA 3 對酸水解的抗性更強
(例如，抵抗暴露於酸時之降解)。
圖20 顯示了 gRNA A、B 及 C 在酸性應激 (pH 5) 下之層析圖。圖21 顯示了經修飾的 gRNA D、E 及 F 在酸性應激 (pH 5) 下之層析圖。圖22 顯示了經修飾的 gRNA G、H 及 I 在酸性應激 (pH 5) 下之層析圖。圖23 顯示了 gRNA J、K 及 L 在酸性應激 (pH 5) 下之層析圖。如圖20 至圖 23 中所示，gRNA E、F、H、I 及 J 對酸性應激的抗性更強。
圖24 顯示了 gRNA A、B 及 C 在鹼性應激 (pH 11) 下之層析圖。圖25 顯示了經修飾的 gRNA D、E 及 F 在鹼性應激 (pH 11) 下之層析圖。圖26 顯示了經修飾的 gRNA G、H 及 I 在鹼性應激 (pH 11) 下之層析圖。圖27 顯示了經修飾的 gRNA J、K 及 L 在鹼性應激 (pH 11) 下之層析圖。如圖24 至圖 27 中所示，經修飾的 gRNA D、E、F、H、I、J 及 K 對鹼性應激 (pH 11) 具有抗性。
圖28 顯示了 gRNA A、B 及 C 在熱應激下之層析圖。圖29 顯示了經修飾的 gRNA D、F 及 G 在熱應激下之層析圖。圖30 顯示了經修飾的 gRNA H、I 及 J 在熱應激下之層析圖。圖31 顯示了經修飾的 gRNA K 及 L 在熱應激下之層析圖。如圖28 至圖 31 中所示，大多數 gRNA 對熱降解具有抗性。
圖32 顯示了經修飾的 gRNA A、B 及 C 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。圖33 顯示了經修飾的 gRNA D、E 及 F 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。圖34 顯示了經修飾的 gRNA G、H 及 I 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。圖35 顯示了經修飾的 gRNA J、K 及 L 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。圖36 顯示了經修飾的 gRNA A 至 L 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下歷經 5 天時段之層析圖的重疊部分。如圖32 至圖 36 中所示，除了 gRNA C 及 H 之外，gRNA E、G、I、J、K 及 L 對氧化應激的抗性更強。
圖37 顯示了在酸性應激 (pH 5) 期間歷經 3 天時間段之純度的變化。圖38 顯示了在鹼性應激 (pH 11) 期間歷經 24 小時時段之純度的變化。圖39 顯示了在熱應激期間歷經 7 天時段之純度的變化。如圖39.中所示，沒有足夠的 gRNA E 可用於熱應激研究。圖40 顯示了在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下歷經 5 天時間段之純度的變化。
如表 7 中所示，許多經修飾的 gRNA 在強制降解條件下抵抗了降解。例如，與參考 gRNA 相比，gRNA 「D」、「E」、「F」及「J」抵抗了降解條件，包括在鹼性應激 (pH 11) 條件下 (表 7)。
表 8 及表 9 提供了對於經修飾的 gRNA 在酸水解 (表 8) 及熱應激 (表 9) 下之純度變化的總結。斜率表明每天純度下降的情況，截距表明純度降低至 0 之天數，且 R 為線性曲線之相關係數。
表 8
表 9
實例 3 ： gRNA 分子之修飾
| gRNA 名稱 | 線性函數 | 校正係數 R |
| 參考 gRNA 3 | y = -3.165x + 91.6 | 0.998 |
| A | y = -1.692x + 65.588 | 0.967 |
| B | y = -2.708x + 89.262 | 0.986 |
| C | y = -1.376x + 64.214 | 0.962 |
| D | y = -2.702x + 93.073 | 0.998 |
| E | y = -0.125x + 66.970 | 0.965 |
| F | y = -1.416x + 63.684 | 0.970 |
| G | y = -1.828x + 64.972 | 0.951 |
| H | y = -0.65x + 51.575 | 0.990 |
| I | y = -0.533x + 66.437 | 0.986 |
| J | y = -0.450x + 55.455 | 0.966 |
| K | y = -0.754x + 46.876 | 0.964 |
| L | y = -1.335x + 49.32 | 0.986 |
| gRNA 名稱 | 線性函數 | 校正係數 R |
| 參考 gRNA 3 | y = -0.7998x + 91.763 | 0.990 |
| A | y = -0.5379x + 66.753 | 0.991 |
| B | y = -1.0456x + 89.982 | 0.979 |
| C | y = -0.4806x + 64.432 | 0.990 |
| D | y = -0.6165x + 93.653 | 0.978 |
| F | y = -0.4057x + 63.624 | 0.987 |
| G | y = -0.6451x + 65.244 | 0.988 |
| H | y = -0.6665x + 52.715 | 0.981 |
| I | y = -0.4537x + 67.004 | 0.998 |
| J | y = -0.5459x + 56.121 | 0.996 |
| K | y = -0.6445x + 47.372 | 0.980 |
| L | y = -0.2826x + 47.982 | 0.963 |
本實例提供經化學合成以在 gRNA 分子之 5' 端及 3' 端處包括多個修飾的額外 gRNA 分子。如表 10 中所示，本實例提供修飾策略 B 以及 M 至 V。表 10 中所提供之修飾策略 B 為與實例 1 及表 1 所示中之修飾策略 B 相同的策略。表 10 提供了對於此等策略中之各者之修飾的總結，且表 11 提供了對於此等策略中之各者的修飾與參考 gRNA 3 之比較。
核苷酸修飾如下在表 10 中指示：*：硫代磷酸酯 (PS) 鍵結；**：二硫代磷酸酯 (PS2) 鍵結；m：2'-OMe；ln：鎖核酸 (LNA)；f：2'-氟；M：2'-O-MOE；以及 d：去氧核糖核苷酸。表 10
之序列中引用的「N」代表任何核苷酸鹼基，例如、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或胞嘧啶 (C)。
表 10
表 11
| gRNA 名稱 | 5' 端處之修飾策略 | 3' 端處之修飾策略 | 序列 |
| B | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU**mU**mU-3' |
| M | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 針對末端 3 個核苷酸之 3 個去氧核糖核苷酸 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUdU**dU**dU-3' |
| N | • 針對前 3 個連續核苷酸之去氧核糖核苷酸 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-dN**dN**dN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| O | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | • 針對末端 3 個核苷酸之 3 個去氧核糖核苷酸 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUdU**dU**dU-3' |
| P | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU*mU-3' |
| Q | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 個硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN*mN*mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU**mU**mU-3' |
| R | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 在第一個與第二個核苷酸之間的 1 個硫代磷酸酯鍵結 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第二個與第三個以及第三個與第四個之間) | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN*mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU**mU**mU-3' |
| S | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第一個與第二個之間以及第二個與第三個之間) • 在第三個與第四個核苷酸之間的 1 個硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 2 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間以及在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN**mN**mN*rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU**mU**mU-3' |
| T | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 3 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 1 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間) • 1 個硫代磷酸酯鍵結 (在第 n-1 個與第 n-2 個之間) | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCrUmU*mU**mU-3' |
| U | • 對前 4 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 4 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對末端 5 個核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 4 個二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間、第 n-1 個與第 n-2 個之間、第 n-2 個與第 n-3 個之間以及第 n-3 個與第 n-4 個之間) | 5'-mN**mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGmC**mU**mU**mU**mU-3' |
| V | • 對前 3 個連續核苷酸之 2'-O-甲基修飾 • 3 二硫代磷酸酯鍵結 | • 對第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個及第 n-4 個之 2'-O-甲基修飾。 • 二硫代磷酸酯鍵結 (在第 n 個與第 n-1 個之間、第 n-1 個與第 n-2 個之間以及第 n-2 個與第 n-3 個之間) | 5'-mN**mN**mN**rNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrNrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArGrArArArUrArGrCrArArGrUrUrArArArArUrArArGrGrCrUrArGrUrCrCrGrUrUrArUrCrArArCrUrUrGrArArArArArGrUrGrGrCrArCrCrGrArGrUrCrGrGrUrGrCmU**mU**mU**U-3' |
| gRNA 名稱 | 與參考 gRNA 3 相比，在 5' 端處的修飾策略 | 與參考 gRNA 3 相比，在 3' 端處的修飾策略 |
| B | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 |
| M | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 |
| N | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 | • 無變化 |
| O | • 無變化 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 • 用去氧核糖核苷酸替換經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 |
| P | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 無變化 |
| Q | • 無變化 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 |
| R | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換第二個與第三個以及第三個與第四個之間的硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 |
| S | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換第一個與第二個之間以及第二個與第三個之間的硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 |
| T | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換第 n 個與第 n-1 個之間的硫代磷酸酯鍵結 |
| U | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結，且加入額外的二硫代磷酸酯鍵結 (前四個核苷酸具有二硫代磷酸酯鍵結) | • 加入兩個額外的 2'-O-甲基修飾的核苷酸 (在第 n-3 個第 n-4 個處) • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結，且加入兩個額外的二硫代磷酸酯鍵結 (最後四個核苷酸具有二硫代磷酸酯鍵結) |
| V | • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結 | • 在位置 n 處將經 2'-O-甲基修飾的核苷酸替換為 RNA，且將位置 n-3 處的 RNA 替換為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸 • 用二硫代磷酸酯鍵結替換硫代磷酸酯鍵結，且加入額外的二硫代磷酸酯鍵結 |
圖41 及表 12 顯示了參考 gRNA 3 及根據修飾方案 B 及 M 至 V 修飾之 gRNA 的初始純度概況。對於具有根據修飾方案 B 及 M 至 V 之修飾的 gRNA，觀察到類似的純度概況 (表 12 及圖41)。此等經修飾之 gRNA 的強制降解研究之結果示於表 12 及圖41 至圖 59 中。實例 2 中提供了強制降解研究條件的實驗細節。
表 12.強制降解下之純度的總結
| gRNA 名稱 | 純度 ( 面積 %) | ||||
| TT(0) | 00.3% H 2O 2 ， 40℃ ， T(5d) | ppH 8 ， 40℃ ， T(7d) | ppH 5 ， 40℃ ， T(7d) | ppH 11 ， 40℃ ， T(2d) | |
| 參考 gRNA 3 | 91.2 | 86.8 | 86.8 | 72.6 | 18.4 |
| B | 92.5 | 83.8 | 89.7 | 78.8 | 40.6 |
| M | 88.1 | 76.0 | 85.1 | 73.5 | 49.2 |
| N | 82.7 | 79.1 | 79.1 | 69.5 | 44.6 |
| O | 93.4 | 78.4 | 89.8 | 75.7 | 59.5 |
| P | 88.9 | 77.1 | 86.0 | 74.3 | 73.1 |
| Q | 90.4 | 74.1 | 87.3 | 75.2 | 49.8 |
| R | 83.9 | 79.1 | 80.9 | 71.5 | 51.6 |
| S | 92.7 | 79.7 | 89.8 | 76.5 | 40.9 |
| T | 90.3 | 82.7 | 86.9 | 75.2 | 34.7 |
| U | 84.2 | 74.2 | 81.2 | 69.4 | 42.4 |
| V | 93.3 | 78.5 | 89.0 | 77.6 | 64.6 |
圖42 至圖 45 顯示了 gRNA B 及 M 至 V 在酸性應激 (pH 5) 下之層析圖。如圖44 中所示，根據方案「T」修飾之 gRNA 似乎對酸性應激 (pH 5) 條件的抗性最強。此等資料表明，在 gRNA 之 3' 端處包括二硫代磷酸酯鍵結使得在酸性應激條件下之穩定性增加。
圖46 至圖 49 顯示了 gRNA B 及 M 至 V 在鹼性應激 (pH 11) 下之層析圖。如圖47 中所示，根據方案「P」修飾之 gRNA 似乎對鹼性應激 (pH 11) 條件的抗性最強。此等資料表明，在 gRNA 之 5' 端處包括二硫代磷酸酯鍵結使得在鹼性應激條件下之穩定性增加。
圖50 至圖 53 顯示了 gRNA B 及 M 至 V 在熱應激下之層析圖。大多數 gRNA 對熱降解具有抗性。
圖54 至圖 55 顯示了 gRNA B 及 M 至 V 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下之層析圖。大多數 gRNA 易於氧化降解。
圖56 顯示了在熱應激期間歷經 7 天時段之純度的變化。圖57 顯示了在酸性應激 (pH 5) 期間歷經 7 天時間段之純度的變化。圖58 顯示了在鹼性應激 (pH 11) 期間歷經 48 小時時段之純度的變化。圖59 顯示了在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下歷經 5 天時間段之純度的變化。
在三種供體細胞株 (供體 1、供體 2 及供體 3) 中對靶向參考標靶 1 且根據修飾方案 B 及 M 至 V 修飾之 gRNA 的特徵進行進一步的分析。使用 Lonza 4D 系統，用約 3.0 × 10⁷ 個細胞/tfx 在 100 µL 規模下分析此等 gRNA 之編輯效率、細胞擴增及細胞表型。在供體 1 (圖60 及圖 61)、供體 2 (圖64 及圖 65) 及供體 3 (圖68 及圖 69) 中，在中點及結束點處在根據方案「N」修飾之 gRNA 的情況下，觀察到低編輯率。此外，除了使用方案「N」修飾之 gRNA 之外，對於各經修飾的 gRNA，在所有 3 個供體中均觀察到相似的敲入 (KI) 及剔除 (KO) 編輯百分比。如圖61、圖 65 及圖 69 中所示，與參考 gRNA 相比，在根據修飾方案「S」及「T」修飾之 gRNA 的情況下，觀察到提高的編輯效率。特定而言，在研究結束時間點時，對於參考 gRNA，觀察到野生型細胞
(即未由 gRNA 編輯之細胞) 之數量為 22% 至 39%，而對於「S」及「T」修飾的 gRNA，觀察到野生型細胞之數量在 18% 至 36% 之間。此外，在研究結束時間點時，參考 gRNA 3 之 KO 編輯百分比在 51% 至 78% 之間，與之相比，「S」及「T」修飾的 gRNA 之 KO 編輯百分比在 64% 至 82% 之間，且參考 gRNA 3 之 KI 編輯百分比在 16% 至 23% 之間，與之相比，「S」及「T」修飾的 gRNA 之 KI 編輯百分比在 13% 至 28% 之間。此等結果表明，與參考 gRNA 3 相比，「S」及「T」修飾的 gRNA 表現出相當或提高的編輯效率。
對於所有經修飾的 gRNA，在供體 1 (圖62)、供體 2 (圖66) 及供體 3 (圖70) 中，均觀察到相似的細胞擴增速率。
* * * * *
本文中提及之所有出版物、專利及專利申請案均藉由引用全文併入本文，其程度就如同每個單獨的出版物、專利或專利申請案被具體地且單獨地指示為藉由引用併入一樣。倘若出現衝突，則以本申請案 (包括本文中之任何定義) 為準。
圖 1提供本揭露之 gRNA 的例示性結構。
圖 2提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 3提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 4提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 5提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 6顯示與參考 gRNA 相比，不同濃度的本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 7顯示不同濃度的本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 8顯示與使用來自不同供體之細胞的參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 9顯示與參考 gRNA 相比，不同濃度的本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 10顯示與參考 gRNA 相比，不同濃度的本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 11顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 12顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的編輯效率。
圖 13提供與參考 gRNA 相比，在剔除條件下在本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的存在下之細胞存活百分比及細胞總數。
圖 14提供與參考 gRNA 相比，在剔除條件下在本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的存在下之細胞存活百分比及細胞總數。
圖 15提供與參考 gRNA 相比，在敲入條件下在本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的存在下之細胞存活百分比及細胞總數。
圖 16提供與參考 gRNA 相比，在剔除條件下在本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的存在下之細胞存活百分比及細胞總數。
圖 17提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 18提供參考 gRNA 3 在鹼性應激 (pH 11)、酸性應激 (pH 5) 及氧化應激 (0.3% H
2O
2) 條件下之溶析曲線。
圖 19提供參考 gRNA 3 在鹼性應激 (pH 11)、酸性應激 (pH 5) 及氧化應激 (0.3% H
2O
2) 條件下歷經某些時間段之溶析曲線。
圖 20提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 21提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 22提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 23提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 24提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 25提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 26提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 27提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 28提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 29提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 30提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 31提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 32提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 33提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 34提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 35提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 36提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下歷經 5 天時段的溶析曲線。
圖 37提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下歷經 3 天時間段的純度變化。
圖 38提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在鹼性應激 (pH 11) 下歷經 24 小時時間段的純度變化。
圖 39提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在熱應激下歷經 7 天時間段的純度變化。
圖 40提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下歷經 5 天時間段的純度變化。
圖 41提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 的溶析曲線。
圖 42提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 43提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 44提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 45提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的溶析曲線。
圖 46提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 47提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 48提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 49提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的溶析曲線。
圖 50提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 51提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 52提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 53提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在熱應激下的溶析曲線。
圖 54提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 55提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的溶析曲線。
圖 56提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在熱應激下歷經 7 天時間段的純度變化。
圖 57提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在酸性應激 (pH 5) 條件下的純度變化。
圖 58提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA在鹼性應激 (pH 11) 條件下的純度變化。
圖 59提供本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在氧化應激 (0.3% H
2O
2) 下的純度變化。
圖 60顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在中間時間點時的編輯效率。
圖 61顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在結束時間點時的編輯效率。
圖 62顯示供體 1 之細胞在用本揭露之例示性經修飾之 gRNA 轉染 (Tfx) 後在第 5 天及自第 5 天至第 12 天的細胞擴增。
圖 63顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在結束時間點時的表型。
圖 64顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在中間時間點時的編輯效率。
圖 65顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在結束時間點時的編輯效率。
圖 66顯示供體 2 之細胞在用本揭露之例示性經修飾之 gRNA 轉染 (Tfx) 後在第 5 天及自第 5 天至第 12 天的細胞擴增。
圖 67顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在結束時間點時的表型。
圖 68顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在中間時間點時的編輯效率。
圖 69顯示與參考 gRNA 相比，本揭露之例示性經修飾之 gRNA 在結束時間點時的編輯效率。
圖 70顯示供體 3 之細胞在用本揭露之例示性經修飾之 gRNA 轉染 (Tfx) 後在第 5 天及自第 5 天至第 12 天的細胞擴增。
Claims (53)
- 一種引導 RNA 分子，其包含： (a) 在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結； (b) 在該引導 RNA 分子的 3’ 端 (第「n」個) 核苷酸與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結；或 (c) 在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個與第二個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結以及在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 之引導 RNA 分子，其進一步包含在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第二個與第三個核苷酸以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 或 2 之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、以及第三個與第四個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 至 3 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個與第二個核苷酸、第二個與第三個核苷酸、第三個與第四個核苷酸、以及第四個與第五個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 至 4 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸或者第 n 個與第 n-1 個核苷酸以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 至 5 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、以及第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 至 6 中任一項之引導 RNA 分子，其包含在該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、以及第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸之間的二硫代磷酸酯鍵結。
- 如請求項 1 至 7 中任一項之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾： (a) 經 2’-氟修飾的核苷酸； (b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸； (c) 經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸； (d) 鎖核酸 (LNA)； (e) 去氧核糖核苷酸；以及 (f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
- 如請求項 8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。
- 如請求項 8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
- 如請求項 8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含 LNA。
- 如請求項 8 之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的第一個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
- 如請求項 1 至 13 中任一項之引導 RNA 分子，其中在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的 (i) 第二個核苷酸、(ii) 第三個核苷酸、(iii) 第四個核苷酸、(iv) 第二個與第三個核苷酸、(v) 第二個與第四個核苷酸、(vi) 第三個與第四個核苷酸或 (v) 第二個、第三個與第四個核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾： (a) 經 2’-氟修飾的核苷酸； (b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸； (c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸； (d) 鎖核酸 (LNA)； (e) 去氧核糖核苷酸；以及 (f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
- 如請求項 1 至 9 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2’-氟修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 8、10 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2’-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 8、10 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前四個核苷酸處包含四個連續的經 2’-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 8、11 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 8、12 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的 LNA。
- 如請求項 1 至 8、13 及 14 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子在該引導 RNA 分子的 5’ 端處的前三個核苷酸處包含三個連續的去氧核糖核苷酸。
- 如請求項 1 至 20 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的 3’ 端 (第「n」個) 核苷酸包含選自由以下所組成之群組的修飾： (a) 經 2’-氟修飾的核苷酸； (b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸； (c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸； (d) 鎖核酸 (LNA)； (e) 去氧核糖核苷酸；以及 (f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
- 如請求項 21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2'-氟修飾的核苷酸。
- 如請求項 21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2’-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
- 如請求項 21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含 LNA。
- 如請求項 21 之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個核苷酸包含去氧核糖核苷酸。
- 如請求項 1 至 26 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的 (i) 第 n-1 個核苷酸、(ii) 第 n-2 個核苷酸、(iii) 第 n-3 個核苷酸、(iv) 第 n-4 個核苷酸、(v) 第 n 個與第 n-1 個核苷酸、(vi) 第 n 個與第 n-2 個核苷酸、(vii) 第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(viii) 第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸、(ix) 第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、(x) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個與第 n-3 個核苷酸、或 (xi) 第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自包含選自由以下所組成之群組的修飾： (a) 經 2’-氟修飾的核苷酸； (b) 經 2’-O-甲基修飾的核苷酸； (c) 經 2’-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸； (d) 鎖核酸 (LNA)； (e) 去氧核糖核苷酸；以及 (f) (a) 至 (e) 中之兩者或更多者之組合。
- 如請求項 1 至 22 及 27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-氟修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 21、23 及 27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 21、23、27 及 29 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-甲基修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 21、24 及 27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為經 2'-O-(2-甲氧基乙基) 修飾的核苷酸。
- 如請求項 1 至 21、25 及 27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為 LNA。
- 如請求項 1 至 21、26 及 27 中任一項之引導 RNA 分子，其中該引導 RNA 分子的第 n 個與第 n-1 個核苷酸，第 n 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n 個、第 n-1 個與第 n-2 個核苷酸，第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸，或第 n 個、第 n-1 個、第 n-2 個、第 n-3 個與第 n-4 個核苷酸各自為去氧核糖核苷酸。
- 一種核酸，其包含編碼如請求項 1 至 33 中任一項之引導 RNA 分子的多核苷酸。
- 如請求項 34 之核酸，其進一步包含編碼 RNA 引導的核酸酶的多核苷酸。
- 如請求項 35 之核酸，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
- 如請求項 36 之核酸，其中該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
- 一種載體，其包含如請求項 34 至 37 中任一項之核酸。
- 一種組成物，其包含如請求項 1 至 33 中任一項之引導 RNA 分子。
- 如請求項 39 之組成物，其進一步包含 RNA 引導的核酸酶。
- 如請求項 39 之組成物，其進一步包含編碼該 RNA 引導的核酸酶的核酸。
- 如請求項 40 或 41 之組成物，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
- 一種組成物，其包含如請求項 34 至 37 中任一項之核酸。
- 一種組成物，其包含如請求項 38 之載體。
- 一種核糖核酸蛋白 (RNP) 複合物，其包含如請求項 1 至 33 中任一項之引導 RNA 分子以及 RNA 引導的核酸酶。
- 如請求項 45 之 RNP 複合物，其中該 RNA 引導的核酸酶為 Cas 蛋白。
- 如請求項 46 之 RNP 複合物，其中該 Cas 蛋白係選自由以下所組成之群組：Cas9、Cas12、Cas13 及其組合。
- 一種細胞，其包含如請求項 39 至 44 中任一項之組成物。
- 一種細胞，其包含如請求項 45 至 47 中任一項之 RNP 複合物。
- 一種修飾細胞之方法，其包含使該細胞與如請求項 39 至 44 中任一項之組成物或如請求項 45 至 47 中任一項之 RNP 複合物接觸。
- 如請求項 50 之方法，其中該接觸包含藉由電穿孔將該組成物引入該細胞中。
- 一種治療有需要之個體之方法，其包含： (a) 藉由使該個體的細胞與如請求項 39 至 44 中任一項之組成物或如請求項 45 至 47 中任一項之 RNP 複合物接觸，離體修飾該細胞；以及 (b) 將經修飾的細胞送回至該個體。
- 一種基因編輯系統，其包含： (a) 一或多個如請求項 1 至 33 中任一項之引導 RNA 分子； (b) 一或多個如請求項 34 至 37 中任一項之核酸； (c) 一或多個如請求項 38 之載體； (d) 一或多個如請求項 39 至 44 中任一項之組成物；及/或 (e) 一或多個如請求項 45 至 47 中任一項之 RNP 複合物。
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