KR102595683B1 - 변형된 가이드 rna - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자 편집 방법에서 개선된 시험관내 및 생체내 활성을 갖는 변형된 단일 및 이중 가이드 RNA에 관한 것이다.
Description
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본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열목록을 포함하며, 전체적으로 본 명세서에 참고로 통합된다. 2017년 12월 7일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 01155-0004-00PCT_SeqList.txt이며, 크기는 118,877 바이트이다.
본 출원은 2016년 12월 8일자로 출원되고 그 전체가 참고문헌으로 인용된 미국 가출원 제62/431,756호의 우선권의 이점을 주장한다.
본 발명은 외인성 유전 인자를 인식하고 절단하는 원핵 면역계의 일부인 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 유전자 편집 분야에 관한 것이다. CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR-관련 단백질 9(Cas9)라고 불리는 단일 뉴클레아제에 의존하며, DNA에 부위-특이적 파괴를 유도한다. Cas9는 가이드 RNA(gRNA)라 불리는 작은 RNA 분자에 의해 특정 DNA 서열로 유도된다. 가이드 RNA는 trRNA(tracrRNA라고도 함) 및 crisprRNA(crRNA)를 포함한다. trRNA와 crRNA는 단일 가이드 RNA(sgRNA)내에 또는 이중 가이드 RNA(dgRNA)의 2개의 별도 RNA 분자에 포함될 수 있다. trRNA 및 crRNA 또는 sgRNA와 함께 Cas9는 Cas9 리보핵단백질 복합체(RNP)라고 불린다.
올리고뉴클레오타이드 및 특히 RNA는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 절단에 의해 세포 및 혈청에서 때때로 분해된다. 상기 분해를 방지하고, gRNA의 안정성을 개선하며, 유전자 편집 효율을 향상시키기 위한 개선된 방법 및 조성물이 특히 치료 용도에 바람직하다.
요약
일부 구현예에서, 변형된 가이드 RNA를 포함하는 치료적 게놈 편집 도구가 제공된다. 본원에 기술된 변형된 가이드 RNA는 가이드 RNA 및 가이드 RNA/Cas9 복합체의 안정성을 향상시키고, 표적 DNA를 절단하기 위한 Cas9(예를 들어, SpyCas9 및 등가물)의 활성을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 sgRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 dgRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 tracrRNA이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 crRNA이다.
본원에 기재된 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe), 2'-플루오로(2'-F), 뉴클레오타이드간 포스포로티오에이트(PS) 결합, G-C 치환 및 뉴클레오타이드와 그의 등가물 사이의 역전된 무염기성 결합을 포함할 수 있다. 본 발명의 구현예는 하기를 포함한다:
일부 구현예에서, 단일 가이드 RNA(sgRNA)는 5' 말단 변형 및 하기 중 하나 이상에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 것으로 포괄되며: 상부 스템 영역; 헤어핀 1 영역; 및 헤어핀 2 영역, 상기 5' 말단 변형이 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 7개의 뉴클레오타이드 내에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 사례에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 US1 내지 US12에서의 변형 및/또는 H1-1에서의 변형 및/또는 H2-1에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 H1-1 내지 H1-12 및/또는 H2-1 내지 H2-15에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 상부 스템 영역, 헤어핀 1 영역 및 헤어핀 2 영역 각각에 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 1과 헤어핀 2 영역 사이의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 하부 스템 영역에서의 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단 및/또는 3' 말단에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단에서의 3' 단부 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단에서의 5' 단부 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개에 대한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단에서의 3' 단부 변형 및 5' 말단에서의 5' 단부 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개 및 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개의 뉴클레오타이드에 대한 변형을 포함한다. 일부 사례에서, 상기 변형은 뉴클레오타이드를 연결하는 2'-O-Me, 2'-F, 2'-O-moe, 또는 포스포로티오에이트(PS) 결합이다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개 사이 및/또는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개 사이의 PS 결합을 포함한다. 일부 사례에서, sgRNA는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 변형, 예컨대 PS 결합 및 2'-O-Me 변형을 갖는, 5' 말단 및 3' 말단을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 팽출(bulge) 영역에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 팽출 영역의 뉴클레오타이드의 50%가 변형되고, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 연결(nexus) 영역에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 연결 영역내 N15, N16, N17 및/또는 N18에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다. 일부 사례에서, N16, N17 및 N18은 PS 결합으로 연결된다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 적어도 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된다.
일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단 및/또는 5' 말단에서의 변형을 포함한다. 일부 사례에서, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 변형은 2'-O-Me 또는 2'-O-moe를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및 3' 변형은 2'-F를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 변형은 뉴클레오타이드를 연결하는 PS 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 및/또는 3' 변형은 뉴클레오타이드를 연결하는 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-F 및 PS 결합 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 변형을 포함한다. 일부 사례에서, 이들 변형은 PS 결합(즉, 첫 번째 4개 및 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 PS 결합)을 연결한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 적어도 PS 결합이며, 상기 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me, 2'-O-moe 또는 2'-F 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 변형 LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12를 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 팽출 영역의 뉴클레오타이드 각각에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 상부 스템 영역의 뉴클레오타이드 각각에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 1 영역의 뉴클레오타이드 각각에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 2 영역의 뉴클레오타이드 각각에서의 변형을 포함하며, 여기서 상기 변형은 2'-O-Me 또는 2'-F이다.
일부 구현예에서, 하기 위치에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 포괄된다:
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드;
b. 하부 스템 영역의 LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및/또는 LS12;
c. 팽출 영역에서의 B1 및/또는 B2;
d. 상부 스템 영역에서의 각 뉴클레오타이드;
e. 연결 영역에서의 N16, N17 및/또는 N18;
f. 헤어핀 1 영역의 각 뉴클레오타이드;
g. 헤어핀 2 영역의 각 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드.
일부 구현예에서, B3-B6은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 사례에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 N15, N16, N17 및 N18에서의 2'F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 및 H2-15에서의 2'F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단의 3' 단부에서의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'F 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 하기 위치에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 포괄된다:
a. 하부 스템 영역에서의 LS9 및 LS10;
b. 연결 영역 내에서의 N15, N16, N17 및 N18; 및
c. 헤어핀 2 영역에서의 H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14, 및 H2-15.
일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단에서의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막, 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 3개에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1 및/또는 LS6에서의 임의의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 임의의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1~LS6에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS2~LS5에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS1 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드, 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드,
및 선택적으로 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드,
및 선택적으로 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS8, LS10 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. LS7, LS9 및 LS11에서의 2'-O-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드, 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드, 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
d. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드, 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H2-1~H2-8에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-9~H2-15에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
g. 3' 말단에서의 마지막으로부터 두 번째, 마지막으로부터 세 번째 및 마지막으로부터 네 번째 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 및 H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 및 H1-11에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; 및 H2-14에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
h. 3' 말단에서의 마지막으로부터 두 번째, 및 마지막으로부터 네 번째 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및
i. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막으로부터 세 번째, 및 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드,
및 선택적으로 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하고:
a. LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
b. LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12 및 H2-14에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드, 및 선택적으로
5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하며; 및 선택적으로,
c. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 및 세 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및/또는
d. 3' 말단의 3' 단부에서의 두 번째 내지 마지막, 네 번째 내지 마지막 및/또는 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는 sgRNA가 포괄된다.
일부 구현예에서, 표 4의 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 228~353 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 표 4의 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 228~332 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 표 4의 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 240을 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 표 4의 변형을 포함하여 SEQ ID NO: 240을 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 242를 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 358을 포함하는 sgRNA가 포괄된다. 추가의 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 어느 하나의 핵산에 대하여 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 sgRNA가 포괄되며, 표 4의 참조 서열 식별자의 뉴클레오타이드에 상응하는 sgRNA의 각각의 뉴클레오타이드에서의 변형은 표 4의 참조 서열 식별자에 제시된 변형과 동일하거나 동등하며, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 1 영역의 뉴클레오타이드를 연결하는 적어도 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 2 영역의 뉴클레오타이드를 연결하는 적어도 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 상부 스템 영역의 뉴클레오타이드를 연결하는 적어도 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 S. 파이오제네스(S. pyogenes) Cas9와 리보핵단백질 복합체를 형성한다.
도 1은 Cas9 mRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)와 함께 변형된 crRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 트랜스티레틴(TTR) 유전자의 차세대 서열(NGS)에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 2는 비변형된 crRNA(CR000686) 및 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 3은 Cas9 mRNA 및 친계 서열에서 발견되지 않는 G-C 쌍을 갖는 crRNA 및 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 4는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 표준 편차는 값을 따른다.
도 5는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 6은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 별표는 기술적인 이유로 이 실험에서 활성을 나타내지 않은 이중 가이드를 나타낸다. 이 이중 가이드는 편집 활성을 보여준 도 9의 실험에서 다시 시험되었다.
도 7은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA 및 비변형된 crRNA(CR000686)에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 8은 Cas9 mRNA 및 crRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 및 친계 서열에서 발견되지 않는 G-U 미스매치 또는 G-C 쌍을 갖는 trRNA 페어링 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 9는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 표준 편차는 값을 따른다.
도 10은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 11은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 인자 VII(FVII) 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR(도 12a) 또는 FVII(도 12b)의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA 및 비변형된 crRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR(도 13a) 또는 FVII(도 13b)의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 14a, 14b, 14c 및 14d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 14a), 인터류킨 6(IL-6, 14b), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 14c) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α, 14d) 수준을 나타낸다.
도 15a, 15b 및 15c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 15a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 15b는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. 도 15c는 도 15a의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 도 15d는 G000209 sgRNA(SEQ ID NO: 228)에 대한 변형을 요약한다. 도 15e는 G000267 sgRNA(SEQ ID NO: 234)에 대한 변형을 요약한다. 도 15d 및 15e에서, 볼드체의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 변형된 것이다.
도 16a, 16b, 16c 및 16d는 Cas9 mRNA 및 sgRNAs를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 16a), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파, 16b), 인터류킨 6(IL-6, 16c) 및 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 16d) 수준을 나타낸다.
도 17a, 17b, 17c 및 17d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 17a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 17b는 도 17a의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 도 17c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. 도 17d는 도 17b의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 18a, 18b 및 18c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 18a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 18b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 18c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. MPK = 킬로그램 당 밀리그램; BLOD = 검출 레벨 이하.
도 19a, 19b, 19c 및 19d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 19a), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 19b), 인터류킨 6(IL-6, 19c) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α, 19d) 수준을 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 FVII 유전자좌(도 20a) 및 TTR 유전자좌(도 20b)의 간내 편집을 나타낸다.
도 21a, 도 21b 및 도 21c는 주석된 sgRNA(SEQ ID NO: 341)(도 21a), 비-주석된 dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1) 및 TR000002(SEQ ID NO: 188)(도 21b), 및 주석된 dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1) 및 TR000002(SEQ ID NO: 188)(도 21c)의 도식을 나타낸다.
도 22a, 22b 및 22c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 생체내 결과를 나타낸다. 도 22a는 간내 TTR 유전자좌의 총 편집 백분율을 나타낸다. 도 22b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 22c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다.
도 23a, 23b 및 23c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 생체내 결과를 나타낸다. 도 23a는 간내 TTR 유전자좌의 총 편집 백분율을 나타낸다. 도 23b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 23c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다.
도 24a, 24b 및 24c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 일차 마우스 간세포내 편집을 나타낸다. 도 24a는 TTR 유전자좌의 총 편집의 편집 백분율을 나타낸다. 도 24b는 EC50을 계산하기 위해 사용된 mRNA 용량의 함수로서 편집 백분율의 정규화된 변환을 나타낸다. 도 24c는 시험된 LNP에 대한 EC50 값을 나타낸다.
도 2는 비변형된 crRNA(CR000686) 및 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 3은 Cas9 mRNA 및 친계 서열에서 발견되지 않는 G-C 쌍을 갖는 crRNA 및 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 4는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 표준 편차는 값을 따른다.
도 5는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 6은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 별표는 기술적인 이유로 이 실험에서 활성을 나타내지 않은 이중 가이드를 나타낸다. 이 이중 가이드는 편집 활성을 보여준 도 9의 실험에서 다시 시험되었다.
도 7은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA 및 비변형된 crRNA(CR000686)에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 8은 Cas9 mRNA 및 crRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 및 친계 서열에서 발견되지 않는 G-U 미스매치 또는 G-C 쌍을 갖는 trRNA 페어링 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 9는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다. 표준 편차는 값을 따른다.
도 10은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 TTR 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 11은 Cas9 mRNA와 함께 변형된 sgRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후 마우스 인자 VII(FVII) 유전자의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR(도 12a) 또는 FVII(도 12b)의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 Cas9 mRNA와 함께 변형된 trRNA 및 비변형된 crRNA에 의한 Neuro2A 세포의 형질감염 후, 마우스 TTR(도 13a) 또는 FVII(도 13b)의 NGS에 의해 측정된 퍼센트 편집을 나타낸다.
도 14a, 14b, 14c 및 14d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 14a), 인터류킨 6(IL-6, 14b), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 14c) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α, 14d) 수준을 나타낸다.
도 15a, 15b 및 15c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 15a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 15b는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. 도 15c는 도 15a의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 도 15d는 G000209 sgRNA(SEQ ID NO: 228)에 대한 변형을 요약한다. 도 15e는 G000267 sgRNA(SEQ ID NO: 234)에 대한 변형을 요약한다. 도 15d 및 15e에서, 볼드체의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 변형된 것이다.
도 16a, 16b, 16c 및 16d는 Cas9 mRNA 및 sgRNAs를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 16a), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파, 16b), 인터류킨 6(IL-6, 16c) 및 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 16d) 수준을 나타낸다.
도 17a, 17b, 17c 및 17d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 17a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 17b는 도 17a의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 도 17c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. 도 17d는 도 17b의 결과에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
도 18a, 18b 및 18c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후의 생체내 결과를 나타낸다. 도 18a는 간내 총 편집의 백분율을 나타낸다. 도 18b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 18c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다. MPK = 킬로그램 당 밀리그램; BLOD = 검출 레벨 이하.
도 19a, 19b, 19c 및 19d는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 혈청내 인터페론 알파(IFN-알파, 19a), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1, 19b), 인터류킨 6(IL-6, 19c) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF-α, 19d) 수준을 나타낸다.
도 20a 및 도 20b는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후 FVII 유전자좌(도 20a) 및 TTR 유전자좌(도 20b)의 간내 편집을 나타낸다.
도 21a, 도 21b 및 도 21c는 주석된 sgRNA(SEQ ID NO: 341)(도 21a), 비-주석된 dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1) 및 TR000002(SEQ ID NO: 188)(도 21b), 및 주석된 dgRNA CR000686(SEQ ID NO: 1) 및 TR000002(SEQ ID NO: 188)(도 21c)의 도식을 나타낸다.
도 22a, 22b 및 22c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 생체내 결과를 나타낸다. 도 22a는 간내 TTR 유전자좌의 총 편집 백분율을 나타낸다. 도 22b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 22c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다.
도 23a, 23b 및 23c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 생체내 결과를 나타낸다. 도 23a는 간내 TTR 유전자좌의 총 편집 백분율을 나타낸다. 도 23b는 간 편집 데이터를 요약한다. 도 23c는 혈청 TTR 수준을 나타낸다.
도 24a, 24b 및 24c는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 LNP의 투여 후 일차 마우스 간세포내 편집을 나타낸다. 도 24a는 TTR 유전자좌의 총 편집의 편집 백분율을 나타낸다. 도 24b는 EC50을 계산하기 위해 사용된 mRNA 용량의 함수로서 편집 백분율의 정규화된 변환을 나타낸다. 도 24c는 시험된 LNP에 대한 EC50 값을 나타낸다.
유전자 편집 방법에 사용하기 위한 이중 및 단일 가이드 RNA를 포함하는 변형된 가이드 RNA가 본원에 제공된다. 변형된 가이드는 보다 안정적이며, 그의 변형되지 않은 대조군과 비교하여 개선된 시험관내 및 생체내 효능을 보여준다. 조작되고 시험된 가이드 RNA의 서열을 표 4에 나타낸다.
"가이드 RNA"및 "gRNA"는 sgRNA, trRNA(tracrRNA로도 공지됨) 또는 crRNA(또한 CRISPR RNA로도 공지됨)를 집합적으로 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. crRNA와 trRNA는 하나의 RNA 분자(단일 가이드 RNA [sgRNA]) 또는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA [dgRNA])와 연관될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다.
trRNA 서열은 자연-발생적일 수 있거나, 또는 trRNA 서열은 자연-발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "편집 효율" 또는 "편집 백분율" 또는 "퍼센트 편집"은 뉴클레오타이드를 Cas RNP에 의해 절단한 후 서열 판독치의 총 수에 대해 관심 표적 영역으로 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 갖는 서열 판독치의 총 수이다 .
본 명세서에 사용된 바와 같이 "헤어핀"은 핵산 가닥이 접혀서 동일한 가닥의 다른 부문과 염기쌍을 형성할 때 생성되는 핵산 루프를 기술한다. 헤어핀은 루프 또는 U-형상을 포함하는 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀은 RNA 루프로 구성될 수 있다. 헤어핀은 분자의 접힘 또는 주름과 함께, 단일 핵산 분자가 서로 결합하는 2개의 상보적 서열로 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀은 스템 또는 스템 루프 구조를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 " 영역"은 보존된 핵산 그룹을 기술한다. 영역은 또한 "모듈(module)" 또는 "도메인(domain)"으로도 칭할 수 있다. gRNA의 영역은 예를 들어 Briner AE 등, 분자 세포 56:333-339 (2014)에 기술된 바와 같이 RNP의 엔도뉴클레아제 활성을 지시하는, 특정 기능을 수행할 수 있다. gRNA의 영역은 표 1~3에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "리보핵단백질"(RNP) 또는 "RNP 복합체"는 gRNA를, 예를 들어, Cas 단백질과 같은 뉴클레아제와 함께 기술한다. 일부 구현예에서, RNP는 Cas9 및 gRNA를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "스템 루프"는 페어링되지않은 핵산의 루프에서 끝나는 염기쌍 "스템"을 형성하는 뉴클레오타이드의 2차 구조를 기술한다. 동일한 핵산 가닥의 2개의 영역이 반대 방향으로 판독될 때 서열 상 적어도 부분적으로 상보적인 경우 스템이 형성될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "루프(loop)"는 스템을 캡핑할 수 있는 염기쌍이 아닌(즉, 상보적이 아닌) 뉴클레오타이드 영역을 기술한다. "테트라루프(tetraloop)"는 4개의 뉴클레오타이드 루프를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, sgRNA의 상부 스템은 테트라루프를 포함할 수 있다.
dgRNA를 포함하는 특정 구현예에서, 본 명세서에 사용된 바와 같이 "스템" 영역은 crRNA 및 trRNA의 특정 영역(예를 들어, 각 RNA의 하부 및 상부 스템 영역) 사이에 염기쌍 영역을 형성하는 뉴클레오타이드의 2차 구조를 기술한다. dgRNA의 "스템" 영역은 당업계에서 "깃대(flagpole)" 영역으로 지칭될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "치료"는 대상체의 질환 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포함하며, 질환의 억제, 그의 진행 저지, 질환의 하나 이상의 증상 완화, 질환의 치료, 또는 질환의 하나 이상의 증상의 재발 방지를 포함한다.
1. 변형의 유형
A. 2'-O-메틸 변형
변형된 당류는 뉴클레오타이드 당 고리의 퍼커링(puckering), 상보적 가닥에 대한 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도에 영향을 미치는 물리적 특성, 듀플렉스 형성 및 뉴클레아제와의 상호작용을 제어하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 당 고리 상의 치환은 이러한 당류의 확인과 퍼커링을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형은 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있지만, 실시예에 나타낸 바와 같이 올리고뉴클레오타이드의 주어진 위치에서의 임의의 변형의 효과는 실험적으로 결정될 필요가 있다.
용어들 "mA", "mC", "mU" 또는 "mG"는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드로서 리보뉴클레오타이드의 변형은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
B. 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형
일부 구현예에서, 변형은 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe)일 수 있다. 2'-O-moe 리보뉴클레오타이드로서의 리보뉴클레오타이드의 변형은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
용어들 "moeA", "moeC", "moeU" 또는 "moeG"는 2'-O-moe로 변형된 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
C. 2'-플루오로 변형
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리 상의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본원에서, 용어들 "fA", "fC", "fU" 또는 "fG"는 2'-F로 치환된 뉴클레오타이드를 나타내는데 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 하기와 같이 나타낼 수 있다:
D. 포스포로티오에이트 변형
포스포로티오에이트(PS) 연결 또는 결합은 포스포디에스테르 결합에서, 예를 들어 뉴클레오타이드 염기 사이의 결합에서 하나의 비 브릿징 포스페이트 산소에 대해 황이 치환된 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트를 사용하여 올리고뉴클레오타이드를 생성하는 경우, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 S-올리고제라 칭할 수도 있다.
PS 변형을 나타내기 위해 "*"가 사용될 수 있다. 본원에서, 용어 A*, C*, U* 또는 G*는 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내는데 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*", "mC*", "mU*" 또는 "mG*"는 2'-O-Me로 치환된, 및 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내는데 사용될 수 있다. 유사하게, 용어들 "fA*", "fC*", "fU*" 또는 "fG*"는 2'-F로 치환된, 및 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내는데 사용될 수 있다. PS 연결 또는 결합의 등가물은 본원에 기재된 구현예에 의해 포괄된다.
하기 다이어그램은 포스포디에스테르 결합 대신에 PS 결합을 생성하는 비브릿징 포스페이트 산소로의 S-의 치환을 나타낸다:
E. G-C 치환
일부 구현예에서, gRNA는 화학적 변형을 포함하지 않는 서열 치환으로 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 친계 gRNA 서열에서 발견되지 않는 G-C 쌍(예를 들어, 하부 및/또는 상부 스템 영역에서)으로 조작된다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 친계 gRNA 서열에서 발견되지 않는 G-U 미스매치("GU 워블" 또는 미스매치 쌍)로 조작된다.
F. 역전된 무염기성 변형
무염기성 뉴클레오타이드는 질소 염기가 없는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 하기 구조식은 염기가 없는 무염기성(아퓨린산으로도 알려져 있음) 부위가 있는 올리고뉴클레오타이드를 묘사한 것이다:
역전된 염기는 정상 5'→ 3'연결(즉, 5'→ 5' 연결 또는 3'→ 3' 연결)로부터 역전된 연결기를 지칭한다. 예를 들어, 하기이다:
무염기성 뉴클레오타이드는 역전된 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기성 뉴클레오타이드는 5'→ 5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 무염기성 뉴클레오타이드는 3'→ 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드 중 어느 한쪽의 역전된 무염기성 뉴클레오타이드는 또한 역전된 무염기성 말단 캡으로 불릴 수 있다. 본원에서, 용어 "invd"는 역전된 무염기성 뉴클레오타이드 연결을 나타낸다.
상기 변형 및 그의 등가물은 본 명세서에 기재된 구현예의 범위 내에 포함된다.
2. 가이드 RNA 조성물
가이드 RNA를 포함하는 조성물이 포괄된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 crRNA 및 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 sgRNA로서 하나의 RNA 분자상의 crRNA 및 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 dgRNA로서 2개의 RNA 분자상의 crRNA 및 trRNA를 포함한다. dgRNA에서 두 RNA 분자는 염기 페어링을 통해 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 5' 말단 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 5' 말단 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 말단 영역은 sgRNA에 대해서는 Briner AE 등, 분자 세포 56:333-339 (2014)에 기술된 바와 같이(그러나 모든 가이드 RNA에 적용 가능함) "스페이서" 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단 영역은 5' 단부 변형을 포함한다. 스페이서 영역을 갖거나 갖지 않는 5' 말단 영역은 crRNA, trRNA, sgRNA 및/또는 dgRNA와 연관될 수 있다. 스페이서 영역은 때때로 본원에서, 그리고 기타에 의해 "가이드 영역", "가이드 도메인" 또는 "표적화 도메인"으로 지칭된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 영역/도메인이 절단을 위한 뉴클레아제를 지향하는 핵산 서열을 지칭한다. 일부 구현예에서, spyCas9 단백질은 스페이서 영역에 존재하는 뉴클레오타이드에 의해 표적 핵산 분자의 표적 서열로 가이드 영역/도메인에 의해 지향될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 스페이서 영역을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 가이드 RNA는 표 4에 제시된 서열 중 임의의 서열을 포함하거나 그 서열로 구성된다. 그러나, 서열이 가이드/스페이서 영역을 나타내는 경우, 조성물은 이 영역을 포함할 수 있거나, 또는 아님을 인식해야 한다. 또한, 표 4에 제시된 임의의 서열의 변형을 포함하고, 그곳에서 서열 번호에 의해 식별되는 가이드 RNA가 포괄된다. 즉, 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있지만, 제시된 변형 패턴은 표 4의 가이드 서열의 변형 패턴과 동일하거나 유사하다. 변형 패턴은 gRNA의 변형의 상대 위치 및 동일성 또는 gRNA의 영역을 포함한다(예를 들어, 5' 말단 영역, 하부 스템 영역, 팽출 영역, 상부 스템 영역, 연결 영역, 헤어핀 1 영역, 헤어핀 2 영역, 3' 말단 영역). 일부 구현예에서, 상기 변형 패턴은 표 4의 서열 컬럼에 또는 서열의 하나 이상의 영역에 대해 제시된 서열 중 임의의 서열의 변형의 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%를 함유한다. 일부 구현예에서, 변형 패턴은 표 4의 서열 컬럼에 제시된 서열 중 임의의 서열의 변형 패턴과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 변형 패턴은 표 4에 제시된 서열의 하나 이상의 영역, 예를 들어, 5' 말단 영역, 하부 스템 영역, 팽출 영역, 상부 스템 영역, 연결 영역, 헤어핀 1 영역, 헤어핀 2 영역 및/또는 3' 말단 영역과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 동일하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 변형 패턴이 5' 말단 영역상의 서열의 변형 패턴과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%가 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 하부 스템에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 팽출 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%가 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 상부 스템 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 연결 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 헤어핀 1 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 헤어핀 2 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴이 3' 말단 영역에 대하여 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일한 가이드 RNA가 포괄된다. 일부 구현예에서, 변형 패턴은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오타이드에서 표 4의 서열의 변형 패턴, 또는 상기 서열의 영역(예를 들어, 5' 말단, 하부 스템, 팽출, 상부 스템, 연결, 헤어핀 1, 헤어핀 2, 3' 말단)의 변형 패턴과 상이하다. 일부 구현예에서, gRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오타이드에서 표 4의 서열의 변형과 상이한 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 뉴클레오타이드에서 표 4의 서열의 영역(예를 들어, 5' 말단, 하부 스템, 팽출, 상부 스템, 연결, 헤어핀 1, 헤어핀 2, 3' 말단)의 변형과 상이한 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 5' 단부 변형, 3' 단부 변형 또는 5' 및 3' 단부 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 및/또는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부 변형은 적어도 하나의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe), 및/또는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함한다. 단부 변형은 포스포로티오에이트(PS), 2'-O-메틸(2'-O-Me), 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe), 및/또는 2'-플루오르(2'-F) 변형을 포함할 수 있다. 동등한 단부 변형은 또한 본원에 기재된 구현예에 의해 포괄된다. 일부 구현예에서, gRNA는 gRNA의 하나 이상의 영역의 변형과 함께 단부 변형을 포함한다.
A. sgRNA의 조성
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 Cas9와 같은 뉴클레아제를 표적 DNA 서열로 향하게 하는 crRNA 및 trRNA를 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 하나의 RNA 분자 상에 결합될 수 있다(단일 가이드 RNA 또는 sgRNA).
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 228~332에 기재된 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 구성된 sgRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329의 변형된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329의 변형된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA가 제공되며, 상기 sgRNA는 표적 서열에 상보적인 5' "스페이서" 서열("가이드 서열")을 추가로 포함하며, 절단을 위한 그의 표적에 Cas9를 향하게 한다. 일부 사례에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 임의의 하나의 핵산에 대하여 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70%의 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 sgRNA를 포함하며, 상기 변형 패턴은 상기 기준 서열 식별자에 나타난 변형 패턴과 동일하다.
1. sgRNA의 도메인
Briner AE 등, 분자 세포 56:333-339 (2014)는 표적화를 담당하는 "스페이서" 도메인, "하부 스템", "팽출" "상부 스템"(테트라루프를 포함할 수 있음), "연결", 및 "헤어핀 1" 및 "헤어핀 2" 도메인을 포함하는, 본 명세서에서 "도메인"으로 지칭되는 sgRNA의 기능적 도메인을 기술한다. Briner 등 334 페이지, 도 1a를 참고한다.
표 1 및 도 21a는 본 명세서에서 사용된 바와 같은 sgRNA의 도메인의 설명을 제공한다. 표 1에서, 영역들간의 "n"은 뉴클레오타이드의 가변 수, 예를 들어 0 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 초과를 나타낸다. 일부 구현예에서, n은 0이다. 일부 구현예에서, n은 1이다.
a)
5' 말단 영역
일부 구현예에서, sgRNA는 표 1에 나타낸 바와 같이 5' 말단에서의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA의 5' 말단은 Cas 단백질을 표적 뉴클레오타이드 서열로 향하게 하는 기능을 하는 스페이서 또는 가이드 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 스페이서 또는 가이드 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 스페이서 및, Cas 단백질을 표적 뉴클레오타이드 영역으로 향하게 하는 기능을 하지 않는 추가의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 영역은 sgRNA의 5' 말단에서의 첫 번째 1~10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 17개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 18개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 19개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 영역의 선택은 편집을 위해 관심 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, sgRNA는 관심 유전자의 표적 서열에 상보적인 가이드 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 유전자 내의 표적 서열은 sgRNA의 가이드 영역에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자에서 sgRNA의 가이드 영역과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, sgRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미스매치를 함유할 수 있으며, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, sgRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은, 가이드 서열이 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 1~6개의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 가이드 서열이 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 미스매치를 함유할 수 있다. 5' 말단은 가이드 영역으로 간주되지 않는(즉, cas9 단백질을 표적 핵산으로 향하게 하는 기능을 하지 않는) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
b)
하부 스템
일부 구현예에서, sgRNA는 선형으로 볼 때, 팽출 및 상부 스템 영역에 의해 분리되는 하부 스템(LS) 영역을 포함한다. 표 1을 참조한다.
일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 1 내지 12개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 예를 들어, 일 구현예에서, 하부 스템 영역은 LS1~LS12를 포함한다. 일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 하부 스템 영역이 표 1 및 도 21a의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 하부 스템의 핵산 서열의 상보성은 sgRNA 내의 스템의 2차 구조를 유도한다(예를 들어, 상기 영역은 서로 염기쌍을 형성할 수 있다). 일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 반대 방향으로 판독될 때 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
c)
팽출
일부 구현예에서, sgRNA는 6개의 뉴클레오타이드 B1~B6을 포함하는 팽출 영역을 포함한다. 선형으로 볼 때 팽출 영역은 두 영역으로 분리된다. 표 1을 참조한다. 일부 구현예에서, 팽출 영역은 6개의 뉴클레오타이드를 포함하며, 첫 번째 2개의 뉴클레오타이드는 상부 스템 영역 다음에 팽출의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 뒤 따른다. 일부 구현예에서, 팽출 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 팽출 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 팽출 영역이 표 1 및 도 21a의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 팽출의 존재는 sgRNA 내의 상부 및 하부 스템 모듈 사이의 방향 꼬임을 초래한다.
d)
상부 스템
일부 구현예에서, sgRNA는 12개의 뉴클레오타이드를 포함하는 상부 스템 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상부 스템 영역은 루프 서열을 포함한다. 일부 사례에서, 루프는 테트라루프(4개의 뉴클레오타이드로 구성된 루프)이다.
일부 구현예에서, 상부 스템 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상부 스템 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 상부 스템 영역이 표 1 및 도 21a의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 상부 스템 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 상부 스템의 핵산 서열의 상보성은 sgRNA 내의 스템의 2차 구조를 유도한다(예를 들어, 상기 영역은 서로 염기쌍을 형성할 수 있다). 일부 구현예에서, 상부 스템 영역은 반대 방향으로 판독될 때 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
e)
연결
일부 구현예에서, sgRNA는 하부 스템 영역과 헤어핀 1 영역 사이에 위치하는 연결 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결은 18개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 바와 같이 뉴클레오타이드 N1 내지 N18을 포함한다.
일부 구현예에서, 연결 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 연결 영역이 표 1 및 도 21a의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 연결 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열의 상보성은 sgRNA 내의 스템 및/또는 스템 루프의 2차 구조를 유도한다(예를 들어, 연결 영역의 특정 뉴클레오타이드는 서로 염기쌍을 형성할 수 있다). 일부 구현예에서, 연결 영역은 반대 방향으로 판독될 때 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
f)
헤어핀
일부 구현예에서, sgRNA는 하나 이상의 헤어핀 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 연결 영역의 다운스트림(예를 들어, 3'→)이다. 일부 구현예에서, 연결 영역의 바로 다운스트림에 있는 뉴클레오타이드의 영역은 "헤어핀 1" 또는 "H1"로 일컬어진다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 3' 내지 헤어핀 1의 영역은 "헤어핀 2" 또는 "H2"로 일컬어진다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 헤어핀 1 및 헤어핀 2를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 1 또는 헤어핀 2만을 포함한다.
일부 구현예에서, 헤어핀 1 영역은 연결 영역의 바로 다운스트림에 12개의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어핀 1 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 바와 같이 뉴클레오타이드 H1-1 내지 H1-12를 포함한다.
일부 구현예에서, 헤어핀 2 영역은 헤어핀 1 영역의 다운스트림에 15개의 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어핀 2 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 바와 같이 뉴클레오타이드 H2-1 내지 H2-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드는 헤어핀 1 영역과 헤어핀 2 영역 사이에 존재한다. 헤어핀 1과 헤어핀 2 영역 사이의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 변형되거나 비변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤어핀 1 및 헤어핀 2는 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 표 1 및 도 21a에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 헤어핀 영역이 표 1 및 도 21a의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 반대 방향으로 판독될 때(예를 들어, 헤어핀의 최상부 또는 루프가 비페어링된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우) 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 뉴클레오타이드 "n"(여기서, "n"은 1 내지 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 및 2의 정수임)에 의한 헤어핀 1의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA의 헤어핀 1 영역은 2개의 뉴클레오타이드로 치환된다.
g)
3' 말단 영역
일부 구현예에서, sgRNA는 헤어핀 영역(들) 이후의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 예를 들어, 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
2. sgRNA의 변형
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA를 포함한다: 5' 말단의 뉴클레오타이드; 하부 스템 영역; 팽출 영역; 상부 스템 영역; 연결 영역; 헤어핀 1 영역; 헤어핀 2 영역; 및 3' 말단의 뉴클레오타이드.
일부 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 그의 5' 단부의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드의 1, 2, 3 또는 4개에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-F를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-moe를 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 단부의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드의 1, 2, 3 또는 4개에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 단부의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드의 1, 2, 3 또는 4개에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-F 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12가 2'-O-Me로 변형된 sgRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA의 팽출 영역 내의 뉴클레오타이드 각각은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, sgRNA의 상부 스템 영역 내의 뉴클레오타이드 각각은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, sgRNA의 연결 영역의 N16, N17 및 N18은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, sgRNA의 헤어핀 1 영역 내의 뉴클레오타이드 각각은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, sgRNA의 헤어핀 2 영역 내의 뉴클레오타이드 각각은 2'-O-Me로 변형된다.
일부 구현예에서, sgRNA는 하기 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다: 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12; 팽출 영역에서의 B1 및 B2; sgRNA의 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 연결 영역 내의 N16, N17 및 N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드.
일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LS9 및 LS10은 2'-F로 변형된다. 일부 구현예에서, N15, N16, N17 및 N18은 2'-F로 변형된다. 일부 구현예에서, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, HS-14 및 H2-15는 2'-F로 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드는 2'-F로 변형된다.
일부 구현예에서, 하기 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 핵산을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다: 하부 스템 영역내의 LS9 및 LS10; 연결 영역 내의 N15, N16, N17 및 N18; 및 헤어핀 2 영역내의 H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, HS-14 및 H2-15. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단에서의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산, 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 3개에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS1 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS1~LS6에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "n"에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS2~LS5에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; LS1 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "n"에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "n"에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS8, LS10 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS7, LS9 및 LS11에서의 2'-O-F 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-1~H2-8에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H2-9~H2-15에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 3' 말단의 마지막으로부터 두 번째, 마지막으로부터 세 번째 및 마지막으로부터 네 번째에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 및 H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 및 H1-11에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; 및 H2-14에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 3' 말단의 마지막 뉴클레오타이드로부터 두 번째, 및 마지막으로부터 네 번째에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 마지막으로부터 세 번째 및 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 뉴클레오타이드 LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13, 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형; LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12, 및 H2-14에서의 2'-F 변형을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 3' 말단의 마지막 및 마지막 뉴클레오타이드로부터 세 번째에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 3' 말단의 두 번째 내지 마지막 및 세 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228~232 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 sgRNA가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 sgRNA가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 임의의 하나의 서열과 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 sgRNA가 본원에 개시되며, 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 나타난 변형 패턴과 동일하다. 일부 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 단부 변형, 및 상부 스템 영역; 헤어핀 1 영역; 및 헤어핀 2 영역 중 하나 이상에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA가 제공되며, 상기 5' 단부 변형은 5' 말단의 첫 번째 7개의 뉴클레오타이드 내에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 단부 변형, 및 상부 스템 영역; 헤어핀 1 영역; 및 헤어핀 2 영역 중 하나 이상에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA가 제공되며, 상기 5' 단부 변형은 RNA의 5' 말단의 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합이 5' 말단 뉴클레오타이드를 연결한다.
일부 구현예에서, 5' 단부 변형, 및 상부 스템 영역; 헤어핀 1 영역; 및 헤어핀 2 영역 중 하나 이상에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA가 제공되며, 상기 5' 단부 변형은 5' 말단의 첫 번째 7개의 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 228~332의 변형된 sgRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329의 변형된 sgRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 구성된 sgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329의 변형된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA를 포함하며, 상기 sgRNA는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적이며, 절단을 위해 Cas9를 그의 표적으로 향하게 하는 5' 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드에 대해 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 포함하며, 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 나타난 변형 패턴과 동일하다. 즉, 뉴클레오타이드 A, U, C 및 G는 서열에 제시된 것과 비교하여 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 상이할 수 있지만, 변형은 변함없이 남아 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA를 포함한다: 5' 말단의 뉴클레오타이드; 하부 스템 영역; 팽출 영역; 상부 스템 영역; 연결 영역; 헤어핀 1 영역; 헤어핀 2 영역; 및 3' 말단의 뉴클레오타이드.
일부 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의: 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 하부 스템의 LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12; 팽출 영역에서의 B1 및 B2; 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 연결 영역 내의 N16, N17 및 N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 하나의 뉴클레오타이드; 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 제공된다. 일 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 사이의 3개의 PS 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 하부 스템의 LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12; 팽출 영역에서의 B1~B6; 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 연결 영역 내의 N16, N17 및 N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 하나의 뉴클레오타이드; 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 제공된다. 일 구현예에서, sgRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 사이의 3개의 PS 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 하부 스템의 LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 연결 영역내의 15-N18; 헤어핀 2 영역의 H2-9~HS-15; 3' 말단 영역의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막, 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, 하부 스템의 각 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 연결 영역의 15-N18; 헤어핀 2 영역의 H2-9~HS-15; 및 3' 말단 영역의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막, 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13, H2-15 및 3' 말단의 마지막 및 세 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및 LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12, H2-14, 및 3' 말단의 두 번째 내지 마지막, 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 제공된다.
하기 구현예 각각이 포괄된다:
구현예 01. 하기 영역 중 하나 이상에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단;
b. 하부 스템 영역;
c. 팽출 영역;
d. 상부 스템 영역;
e. 연결 영역;
f. 헤어핀 1 영역;
g. 헤어핀 2 영역; 및
h. 3' 말단.
구현예 02. 구현예 1에 있어서, 상기 변형이 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, sgRNA.
구현예 03. 구현예 1에 있어서, 상기 변형이 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, sgRNA.
구현예 04. 구현예 1에 있어서, 상기 변형이 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는, sgRNA.
구현예 05. 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 마지막 3개 또는 4개의 뉴클레오타이드가 변형된, sgRNA.
구현예 06. 구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된, sgRNA.
구현예 07. 구현예 5에 있어서, 상기 변형이 2'-O-Me를 포함하는, sgRNA.
구현예 08. 구현예 5에 있어서, 상기 변형이 2'-F를 포함하는, sgRNA.
구현예 09. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me 변형을 포함하는, sgRNA.
구현예 10. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-F 변형을 포함하는, sgRNA.
구현예 11. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12가 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 14. 구현예 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 연결 영역의 N16, N17 및 N18이 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 15. 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 16. 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 17. 하기 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형 핵산을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드;
b. 하부 스템 영역의 LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12;
c. 팽출 영역의 B1 및 B2;
d. 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드;
e. 연결 영역 내의 N16, N17 및 N18;
f. 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드;
g. 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드.
구현예 18. 구현예 17에 있어서, B3~B6이 2'-O-Me로 변형된, sgRNA.
구현예 19. 구현예 17에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 20. 구현예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, LS9 및 LS10이 2'-F로 변형된, sgRNA.
구현예 21. 구현예 1 내지 10 및 20 중 어느 하나에 있어서, N15, N16, N17 및 N18이 2'-F로 변형된, sgRNA.
구현예 22. 구현예 1 내지 10 및 20 내지 21 중 어느 하나에 있어서, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 및 H2-15가 2'-F로 변형된, sgRNA.
구현예 23. 구현예 1 내지 10 및 21 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 3' 말단의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드가 2'-F로 변형된, sgRNA.
구현예 24. 하기 위치에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 하부 스템 영역의 LS9와 LS10;
b. 연결 영역 내의 N15, N16, N17 및 N18; 및
c. 헤어핀 2 영역의 H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14, 및 H2-15.
구현예 25. 구현예 24에 있어서, 3' 말단의 두 번째 내지 마지막, 세 번째 내지 마지막 및 네 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 26. 구현예 24 또는 25에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 27. 구현예 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 3개에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 28. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 29. 구현예 28에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 30. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1~LS6에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 31. 구현예 30에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 32. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS2~LS5에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS1 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 34. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 36: 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 37. 구현예 36에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 38. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS8, LS10 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. LS7, LS9 및 LS11에서 2'-O-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 39. 구현예 32에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 40. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드
c. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
g. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 41. 구현예 40에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 42. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 및 LS12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. LS9 및 LS10에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
d. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1~H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 43. 구현예 43에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 44. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. H1-1~H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
e. H2-1~H2-8에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-9~H2-15에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
g. 3' 말단의 마지막으로부터 두 번째, 마지막으로부터 세 번째, 및 마지막으로부터 네 번째 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및
h. 3' 말단의 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 45. 구현예 44에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 46. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. US1~US12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
c. H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 및 H1-12에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
d. H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 및 H1-11에서 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
e. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
f. H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; 및 H2-14에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드;
g. H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
h. 3' 말단의 마지막으로부터 두 번째, 및 마지막으로부터 네 번째 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및
i. 3' 말단의 마지막으로부터 세 번째, 및 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 47. 구현예 46에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 48. 하기를 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA):
a. LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13, 및 H2-15에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
b. LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12, 및 H2-14에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드.
구현예 49. 구현예 48에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 50. 구현예 48 내지 49 중 어느 하나의 구현예에 있어서,
a. 3' 말단에서의 마지막 및 세 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드; 및
b. 3' 말단의 두 번째 내지 마지막 및 세 번째 내지 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, sgRNA.
구현예 51. SEQ ID NO: 228~332 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 sgRNA.
구현예 52. SEQ ID NO: 235~240, 265~285 및 309~329 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 sgRNA.
구현예 53. SEQ ID NO: 235~240, 265~285, 및 309~329 중 임의의 하나의 핵산에 대해 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 sgRNA로서, 상기 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 제시된 변형 패턴과 동일한, sgRNA.
구현예 54. 구현예 51 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, sgRNA.
B. dgRNA의 조성
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 Cas9와 같은 뉴클레아제를 표적 DNA 서열에 향하게 하는 crRNA 및 trRNA를 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA 또는 dgRNA) 상에 연관되어 있다.
표 2 및 도 21c는 본 명세서에서 사용된 바와 같은 crRNA의 도메인에 대한 설명을 제공한다. 5' 말단 영역은 crRNA의 5' 말단에 또는 그 부근에 스페이서 영역을 포함할 수 있고, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 Cas9를 DNA 내의 표적 영역으로 향하게 하는 기능을 수행할 수 있다. 표 2에서, 영역들간의 "n"은 0 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 가변성 수를 나타낸다. 일부 구현예에서, n은 0이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 임의의 dgRNA는 임의의 도메인 사이에 "n"을 포함할 수 있다.
표 3 및 도 21c는 본 명세서에 기재된 바와 같이 trRNA의 도메인에 대한 설명을 제공한다. 표 3에서, 영역들간의 "n"은 0 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 뉴클레오타이드의 가변성 수를 나타낸다. 일부 구현예에서, n은 0이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 임의의 dgRNA는 임의의 도메인 사이에 "n"을 포함할 수 있다.
1. dgRNA의 도메인
Briner 2014에 기술된 바와 같이, dgRNA는 표적화를 담당하는 스페이서, 하부 스템, 팽출, 상부 스템, 연결부 및 헤어핀 도메인을 포함하여 본원에서 "도메인"으로 지칭되는 특정 기능성 도메인에 기초하여 개발될 수 있다. dgRNA에서, crRNA는 gRNA의 일부 성분을 포함하고, trRNA는 gRNA의 일부 성분을 포함한다.
crRNA의 영역은 표 2 및 도 21c에 제공된다. trRNA의 영역은 표 3 및 도 21c에 제공된다. 도 21c는 예시적인 dgRNA의 개략도를 도시한다.
a)
5' 말단 영역
일부 구현예에서, dgRNA는 표 2-3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이, crRNA 및 trRNA의 5' 말단에 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, crRNA의 5' 말단은 Cas 단백질을 표적 뉴클레오타이드로 향하게 하는 기능을 하는 스페이서 또는 가이드 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 스페이서 또는 가이드 영역을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 스페이서 및, Cas 단백질을 표적 뉴클레오타이드 영역으로 향하게 하는 기능을 하지 않는 추가의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 영역은 crRNA의 5' 말단에서의 첫 번째 1~10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 17개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 18개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 19개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 영역의 선택은 편집을 위해 관심 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, crRNA는 관심 유전자의 표적 서열에 상보적인 가이드 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 유전자 내의 표적 서열은 crRNA의 가이드 영역에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 유전자에서 crRNA의 가이드 영역과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, crRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, crRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 미스매치를 함유할 수 있으며, 여기서 표적 서열의 총 길이는 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, crRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은, 가이드 서열이 적어도 약 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 1~6개의 미스매치를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA의 가이드 영역 및 관심 유전자의 표적 영역은 가이드 서열이 약 20개의 뉴클레오타이드를 포함하는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 미스매치를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단을 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 부분적으로 dgRNA의 상부 스템을 형성하는 5' 말단을 포함한다. trRNA의 5' 말단은 표적 유전자의 영역에 상보적이지 않다.
b)
하부 스템
일부 구현예에서, dgRNA는 하부 스템(LS) 영역을 포함한다. 하부 스템 영역은 도 21c에 도시된 바와 같이 결합하는 crRNA 하부 스템 영역 및 trRNA 하부 스템 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 하부 스템 영역은 상기 trRNA의 하부 스템 영역에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, crRNA의 하부 스템 영역은 trRNA의 하부 스템 영역에 완전하게 상보적이다.
일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA의 하부 스템 영역은 각각 6개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA의 하부 스템 영역은 각각 표 2 및 표 3 및 도 21c에 나타낸 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하부 스템 영역은 표 2 및 표 3 및 도 21c에 나타낸 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 하부 스템 영역이 표 2 및 표 3 및 도 21c의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다. 일부 구현예에서, crRNA의 하부 스템의 뉴클레오타이드의 수는 trRNA의 하부 스템의 뉴클레오타이드의 수와 상이하다.
c)
팽출
일부 구현예에서, dgRNA는 팽출(B) 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 하나의 팽출 영역을 포함하고, 상기 trRNA는 하나의 팽출 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 팽출 영역은 1~4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA의 팽출 영역은 2개의 뉴클레오타이드를 포함하고, trRNA의 팽출 영역은 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, crRNA 팽출 영역은 상기 crRNA의 하부 스템 영역과 상기 상부 스템 영역 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 팽출 영역은 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA의 팽출 영역은 표 2 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 B1 및 B2를 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA 팽출 영역은 trRNA의 상부 스템 영역과 하부 스템 영역 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, trRNA의 팽출 영역은 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 팽출 영역은 표 3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 B1 내지 B4를 포함한다.
일부 구현예에서, 팽출의 존재는 dgRNA에서 상부 및 하부 스템 모듈 사이의 방향 꼬임을 초래한다. crRNA 팽출 및 trRNA 팽출은 부분적으로 상보적일 수 있다. crRNA 팽출 및 trRNA 팽출에는 상보체가 없을 수 있다.
일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA의 팽출 영역은 표 2 및 3 및 도 21c에 나타낸 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 팽출 영역이 표 2 및 표 3 및 도 21c의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 팽출 내의 뉴클레오타이드의 수는 상기 trRNA의 팽출 내의 뉴클레오타이드의 수와 상이하다.
d)
상부 스템
일부 구현예에서, dgRNA는 상부 스템(US) 영역을 포함한다. 상부 스템 영역은 도 21c에 도시된 바와 같이 결합하는 crRNA 상부 스템 영역 및 trRNA 상부 스템 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA의 상부 스템 영역은 trRNA의 상부 스템 영역에 적어도 부분적으로 상보적이다. 일부 구현예에서, crRNA의 상부 스템 영역은 trRNA의 상부 스템 영역에 완전하게 상보적이다.
일부 구현예에서, 상기 crRNA의 상부 스템 영역은 14개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 상부 스템 영역은 11개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA 및 trRNA의 상부 스템 영역 각각은 표 2 및 3 및 도 21c에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA 및 trRNA의 상부 스템 영역은 표 2 및 3 및 도 21c에 나타낸 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 상부 스템 영역이 표 2 및 표 3 및 도 21c의 개략도에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, crRNA의 상부 스템은 표 2 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 US1 내지 US14를 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA의 상부 스템은 표 3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 US1 내지 US11을 포함한다.
e)
연결부
일부 구현예에서, dgRNA는 연결 영역을 포함하는 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 연결부는 trRNA의 하부 스템 영역과 헤어핀 1 영역 사이에 있다. 일부 구현예에서, 연결부는 trRNA의 하부 스템의 바로 다운스트림에 위치한다. 일부 구현예에서, 연결부는 18개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 연결 영역은 표 3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 N1-N18을 포함한다. 일부 구현예에서, 연결 영역은 표 3 및 도 21c에 도시된 것보다 적은 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 연결 부위는 표 3 및 도 21c에 나타낸 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 연결 영역이 표 3 및 도 21c에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 연결 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 서열의 상보성은 sgRNA 내의 스템 및/또는 스템 루프의 2차 구조를 유도한다(예를 들어, 연결 영역의 특정 뉴클레오타이드는 서로 염기쌍을 형성할 수 있다). 일부 구현예에서, 연결 영역은 반대 방향으로 판독될 때 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
f)
헤어핀
일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 영역은 연결 영역의 다운스트림에 있다. 일부 구현예에서, 연결 영역의 바로 다운스트림에 있는 뉴클레오타이드 영역은 "헤어핀 1"로 일컬어진다. 일부 구현예에서, 헤어핀 1 영역의 바로 다운스트림에 있는 뉴클레오타이드 영역은 "헤어핀 2"로 일컬어진다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 헤어핀 1 및 헤어핀 2를 포함한다. 일부 사례에서, 헤어핀 1 및 헤어핀 2는 하나 이상의 뉴클레오타이드 "n"에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, n = 1이다. 일부 구현예에서, trRNA는 헤어핀 1 또는 헤어핀 2만을 포함한다.
trRNA의 헤어핀 1 영역을 2개의 뉴클레오타이드로 치환하는 것은 Cas RNP의 편집 활성을 허용하는 것으로 밝혀졌다(US20150376586, 도 16 참조). 일부 구현예에서, trRNA는 뉴클레오타이드 "n"으로 헤어핀 1을 치환하는 것을 포함하며, 여기서, "n"은 1 내지 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 및 2의 정수이다. 일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 1 영역은 2개의 뉴클레오타이드로 치환된다.
일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 1은 연결 영역의 바로 다운스트림에 있는 12개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 1 영역은 표 3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 H1-1 내지 H1-12를 포함한다.
일부 구현예에서, 비-헤어핀 뉴클레오타이드는 trRNA의 헤어핀 1 및 헤어핀 2 영역 사이에 존재한다. 일부 구현예에서, 1 내지 2개의 비-헤어핀 뉴클레오타이드는 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 존재한다.
일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 2는 (3' 내지) 헤어핀 1 이후의 15개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 2 영역은 표 3 및 도 21c에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 H2-1 내지 H2-15를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 2 영역은 표 3에 나타낸 바와 같이 뉴클레오타이드 H2-1 내지 H2-15를 포함하고, 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "n"은 1 또는 2이다.
일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 영역은 표 3 및 도 21c에 도시된 것보다 많은 뉴클레오타이드를 포함한다. 헤어핀 영역이 표 3 및 도 21c에 도시된 것보다 더 적은 또는 더 많은 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 숙련가에게 명백한 변형 패턴이 유지되어야 한다.
일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 반대 방향으로 판독될 때 핵산 서열에서 상보적인 뉴클레오타이드를 갖는다. 일부 구현예에서, 헤어핀 영역은 반대 방향으로 판독될 때(예를 들어, 헤어핀의 최상부 또는 루프가 비페어링된 뉴클레오타이드를 포함하는 경우) 서로 완전하게 상보적이지 않을 수 있다.
일부 구현예에서, trRNA는 뉴클레오타이드 "n"으로 헤어핀 1을 치환하는 것을 포함하며, 여기서, "n"은 1 내지 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 및 2의 정수이다. 일부 구현예에서, trRNA의 헤어핀 1 영역은 2개의 뉴클레오타이드로 치환된다.
g)
3' 말단
일부 구현예에서, dgRNA는 (3' 내지) 헤어핀 영역(들)에 이후의 추가의 뉴클레오타이드를 포함하는 3' 말단 영역을 포함하는 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 또는 20개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 4개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역은 헤어핀의 2차 구조와 연관되지 않은 1, 2 또는 3개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
2. dgRNA의 변형
일부 구현예에서, dgRNA는 변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, dgRNA는 비변형된 crRNA 및 변형된 trRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, dgRNA의 crRNA 및 trRNA는 모두 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이 gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자(이중 가이드 또는 dgRNA)에 존재한다. 표 2, 표 3 및 도 21c를 참고한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 a) SEQ ID NO: 1~187의 crRNA 서열 중 임의의 하나; 및 b) SEQ ID NO: 188~227에 기재된 trRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하는, 또는 이들로 이루어진 dgRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 1~187의 변형된 crRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하는 dgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, 188~227의 변형된 trRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하는 dgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 및 104~130의 변형된 crRNA 서열 중 임의의 하나를 포함하는 dgRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 및 104~130의 변형된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 dgRNA를 포함하며, 여기서 상기 crRNA는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 5' 스페이서 서열을 추가로 포함하며, Cas9를 절단을 위한 그의 표적으로 향하게 한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1~187에 기재된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 및 104~130에 기재된 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어진 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 및 104~130에 기재된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 crRNA 및 스페이서 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 188~277에 기재된 서열 중 임의의 하나를 포함하거나 이들로 이루어진 trRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1~187 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA를 포함하며, 상기 변형 패턴은 상기 기준 서열 식별자에 나타난 변형 패턴과 동일하다. 즉, 뉴클레오타이드 A, U, C 및 G는 서열내에 도시된 것과 비교하여 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 상이할 수 있지만, 변형은 변함없이 남아 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 188~277 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드에 대해 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 동일성을 갖는 뉴클레오타이드를 포함하는 trRNA를 포함하며, 상기 변형 패턴은 상기 기준 서열 식별자에 나타난 변형 패턴과 동일하다. 즉, 뉴클레오타이드 A, U, C 및 G는 서열내에 도시된 것과 비교하여 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 상이할 수 있지만, 각각의 뉴클레오타이드 상의 변형은 변함없이 남아 있다.
3. 변형을 갖는 crRNA, trRNA 및 dgRNA
일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단, 하부 스템, 팽출, 상부 스템 및 3' 말단 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 2'-F를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드를 연결하는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합이다.
일부 구현예에서, 변형은 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상부 스템의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 US-1 내지 US-14는 각각 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 LS1 및 LS6은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 LS5는 2'-O-Me로 변형된다.
일부 구현예에서, 상부 스템의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드 및 하부 스템에서의 LS1 및 LS6을 포함하는 crRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에서의 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상부 스템, 하부 스템의 LS1, LS5 및 LS6의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에서의 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하부 스템의 LS1, LS2 및 LS6에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA는 팽출 영역의 각각의 B1 및 B2에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하부 스템의 LS1, LS2 및 LS6 및 팽출 영역의 각각의 B1 및 B2에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 crRNA는 하부 스템 영역의 뉴클레오타이드 LS1 및 LS6; 팽출 영역 내의 각각의 핵산; 및 상부 스템 영역 내의 각각의 핵산에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 LS5 뉴클레오타이드는 또한 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA의 LS2, LS3 및 LS4는 변형되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, crRNA는 하부 스템 영역의 LS1, LS2 및 LS6, 및 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 하부 스템 영역의 LS1, LS2 및 LS6에서, 및 팽출 영역의 B2 및 B2에서의 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 하부 스템 영역의 LS1~LS6, 및 팽출 영역 내의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 trRNA를 포함한다: 5' 말단, 상부 스템 영역; 팽출 영역; 하부 스템 영역; 연결 영역; 헤어핀 1 영역; 헤어핀 1과 헤어핀 2 영역 사이의 개재 영역; 헤어핀 2 영역; 및 3' 말단 영역.
일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 2'-F를 포함한다.
일부 구현예에서, 변형은 하나 이상의 뉴클레오타이드를 연결하는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합이다.
일부 구현예에서, 변형은 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA는 상부 스템의 각각의 핵산; 팽출 영역의 B1 및 B2; 하부 스템 영역의 LS1 및 LS2; 상기 연결 영역 내의 N3, N4, N5, N15, N16, N17 및 N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 영역 사이의 하나의 뉴클레오타이드; 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA는 상부 스템의 각각의 핵산; 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 하부 스템 영역의 LS1, LS2, LS5 및 LS6; 연결 영역의 N3~N5, N10~N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 헤어핀 1과 헤어핀 2 영역 사이의 하나의 뉴클레오타이드; 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 crRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-O-Me 또는 2'-O-moe 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA는 연결 영역의 N15 내지 N18에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA는 하부 스템 영역의 LS4 및 LS5에서, 및 연결 영역의 N13~N18에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 및/또는 3' 말단 영역, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단 변형에 하나 이상의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, trRNA는 하부 스템의 LS1, LS3 및 LS5에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 하부 스템의 LS2, LS4 및 LS6에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 것은 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 crispr RNA(crRNA)이다: 5' 말단의 첫 번째 5개의 뉴클레오타이드; 하부 스템 영역; 팽출 영역; 상부 스템 영역; 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-F를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, LS1 및 LS6은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me로 변형된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형 핵산을 포함하는 crispr RNA(crRNA)를 포함한다: 하부 스템 영역에서 LS1 및 LS6; 및 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, LS1, LS2 및 LS6은 2'-F로 변형된다. 일부 구현예에서, 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-F로 변형된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 것은 하기 뉴클레오타이드: 하부 스템 영역의 LS1, LS2 및 LS6; 및 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-F 변형된 핵산을 포함하는 crispr RNA(crRNA)이다. 일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산, 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 1~187 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 crRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 104~130 및 161~187 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 crRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 104~130 및 161~187의 임의의 하나의 핵산에 대하여 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 변형 패턴을 갖는 핵산을 포함하는 crRNA가 제공되며, 상기 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 제시된 변형 패턴과 동일하다. 일부 구현예에서, crRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
또한, 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 tracr RNA(trRNA)가 포괄된다: 5' 말단의 첫 번째 5개의 뉴클레오타이드; 상부 스템 영역; 팽출 영역; 하부 스템 영역; 연결 영역; 헤어핀 1 영역; 헤어핀 2 영역; 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-F를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-F 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 팽출 영역 내의 B1 및 B2는 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 연결 영역의 N3, N4, N5, N15, N16, N17 및 N18은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me로 변형된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형 핵산을 포함하는 tracr RNA(trRNA)를 포함한다: 상부 스템의 각각의 뉴클레오타이드; 팽출 영역 내의 B1 및 B2; 연결 영역 내의 N3, N4, N5, N15, N16, N17 및 N18; 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 및 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, N15, N16, N17 및 N18은 2'-F로 변형된다. 일부 구현예에서, LS1, LS3 및 LS5는 2'-F로 변형되고, LS2, LS4 및 LS6은 2'-O-Me로 변형된다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, SEQ ID NO: 188~227 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는 trRNA가 제공된다. 일부 구현예에서, SEQ ID NO: 188~227 중 임의의 하나의 핵산에 대하여 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 trRNA가 제공되며, 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 제시된 변형 패턴과 동일하다. 일부 구현예에서, trRNA는 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함한다.
일부 사례에서, crRNA 및 trRNA를 포함하는 이중 가이드가 제공되며, 상기 crRNA는 SEQ ID NO: 1~187 중 임의의 하나의 핵산을 포함하며, trRNA는 SEQ ID NO: 188~227 중 임의의 하나의 핵산을 포함한다.
본원에 개시된 crRNA 및 본원에 개시된 trRNA를 포함하는 이중 가이드가 본원에 개시된 crRNA 및 비변형된 trRNA를 포함하는 이중 가이드와 같이 포괄된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 비변형된 crRNA 및 변형된 trRNA를 포함하는 이중 가이드가 제공된다.
일부 구현예에서, 및 하기가 포괄된다:
구현예 55. 하기 영역 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형을 포함하는 crispr RNA(crRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 5개의 뉴클레오타이드;
b. 하부 스템 영역;
c. 팽출 영역;
d. 상부 스템 영역; 및
e. 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드.
구현예 56. 구현예 55에 있어서, 상기 변형이 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, crRNA.
구현예 57. 구현예 55에 있어서, 상기 변형이 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, crRNA.
구현예 58. 구현예 55에 있어서, 상기 변형이 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는, crRNA.
구현예 59. 구현예 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된, crRNA.
구현예 60. 구현예 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된, crRNA.
구현예 61. 구현예 59에 있어서, 상기 변형이 2'-O-Me를 포함하는, crRNA.
구현예 62. 구현예 59에 있어서, 상기 변형이 2'-F를 포함하는, crRNA.
구현예 63. 구현예 55 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-Me 변형을 포함하는, crRNA.
구현예 64. 구현예 55 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-F 변형을 포함하는, crRNA.
구현예 65. 구현예 55 내지 60 중 어느 하나에 있어서, LS1 및 LS6이 2'-O-Me로 변형된, crRNA.
구현예 66. 구현예 55 내지 60 및 65 중 어느 하나에 있어서, 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, crRNA.
구현예 67. 하기에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crispr RNA(crRNA):
a. 하부 스템 영역의 LS1과 LS6; 및
b. 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드.
구현예 68. 구현예 67에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 69. 구현예 67 또는 68에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 70. 구현예 55 내지 60 중 어느 하나에 있어서, LS1, LS2 및 LS6이 2'-F로 변형된, crRNA.
구현예 71. 구현예 55 내지 60 및 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-F로 변형된, crRNA.
구현예 72. 하기에서의 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 crispr RNA(crRNA):
a. 하부 스템 영역의 LS1, LS2 및 LS6; 및
b. 팽출 영역의 각각의 뉴클레오타이드.
구현예 73. 구현예 70 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 74. 구현예 72 또는 73에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3'-말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 75. SEQ ID NO: 1 내지 187 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 crRNA.
구현예 76: SEQ ID NO: 19 내지 31, 53 내지 73, 104 내지 130 및 161 내지 187 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 crRNA.
구현예 77. SEQ ID NO: 19~31, 53~73, 104~130, 및 161~187 중 임의의 하나의 핵산에 대해 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 crRNA로서, 변형 패턴이 기준 서열 식별자에 도시된 변형 패턴과 동일한, crRNA.
구현예 78. 구현예 75 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 79. 하기 영역 중 하나 이상내에 하나 이상의 변형을 포함하는 tracr RNA(trRNA):
a. 5' 말단의 첫 번째 5개의 뉴클레오타이드;
b. 상부 스템 영역;
c. 팽출 영역;
d. 하부 스템 영역;
e. 연결 영역;
f. 헤어핀 1 영역;
g. 헤어핀 2 영역; 및
h. 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드.
구현예 80. 구현예 79에 있어서, 상기 변형이 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, trRNA.
구현예 81. 구현예 79에 있어서, 상기 변형이 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, trRNA.
구현예 82. 구현예 79에 있어서, 상기 변형이 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는, trRNA.
구현예 83. 구현예 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결되는, trRNA.
구현예 84. 구현예 79 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된, trRNA.
구현예 85. 구현예 84에 있어서, 상기 변형이 2'-O-Me를 포함하는, trRNA.
구현예 86. 구현예 84에 있어서, 상기 변형이 2'-F를 포함하는, trRNA.
구현예 87. 구현예 79 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me 변형을 포함하는, trRNA.
구현예 88. 구현예 79 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-F 변형을 포함하는, trRNA.
구현예 89. 구현예 79 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 90. 구현예 79 내지 84 및 89 중 어느 하나에 있어서, 팽출 영역 내의 B1 및 B2가 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 91. 구현예 79 내지 84 및 89 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 연결 영역의 N3, N4, N5, N15, N16, N17 및 N18이 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 92. 구현예 79 내지 84 및 89 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 93. 구현예 79 내지 84 및 89 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 94. 하기에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 tracr RNA(trRNA):
a. 상부 스템의 각각의 뉴클레오타이드;
b. 팽출 영역내의 B1 및 B2;
c. 연결 영역의 N3, N4, N5, N15, N16, N17 및 N18;
d. 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드; 및
e. 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드.
구현예 95. 구현예 94에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, trRNA.
구현예 96. 구현예 94 또는 95에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3'-말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 핵산을 추가로 포함하는, crRNA.
구현예 97. 구현예 79 내지 84 중 어느 하나에 있어서, N15, N16, N17 및 N18이 2'-F로 변형된, trRNA.
구현예 98. 구현예 79 내지 84 및 97 중 어느 하나에 있어서, LS1, LS3 및 LS5가 2'-F로 변형되고, LS2, LS4 및 LS6이 2'-O-Me로 변형된, trRNA.
구현예 99. 구현예 87 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, trRNA.
구현예 100. 구현예 98 또는 99에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드 및 3'-말단의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 추가로 포함하는, trRNA.
구현예 101. SEQ ID NO: 188~227 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 trRNA.
구현예 102. SEQ ID NO: 188~227 중 어느 하나의 핵산에 대해 적어도 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 또는 70% 동일성을 갖는 핵산을 포함하는 trRNA로서, 상기 변형 패턴은 기준 서열 식별자에 제시된 변형 패턴과 동일한, trRNA.
구현예 103. 구현예 101 또는 102에 있어서, 5' 말단의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는, trRNA.
구현예 104. crRNA 및 trRNA를 포함하는 이중 가이드로서, 상기 crRNA는 SEQ ID NO: 1~187 중 임의의 하나의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 trRNA는 SEQ ID NO: 188~227 중 임의의 하나의 핵산을 포함하는, 이중 가이드.
구현예 105. 구현예 55 내지 78 중 어느 하나의 crRNA 및 구현예 79 내지 103 중 어느 하나의 trRNA를 포함하는, 이중 가이드.
구현예 106. 구현예 55 내지 78 중 어느 하나의 crRNA 및 비변형된 trRNA를 포함하는 이중 가이드.
구현예 107. 비변형된 crRNA 및 구현예 79 내지 103 중 어느 하나의 trRNA를 포함하는 이중 가이드.
C. 말단 뉴클레오타이드에 대한 변형
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 임의의 가이드 RNA의 5'또는 3' 말단 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA 또는 둘 모두 crRNA 및 trRNA를 포함하는 가이드 RNA의 3' 말단 영역의 단부(즉, 마지막) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 3' 말단 영역의 단부(즉, 마지막) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드는 1개 초과의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역의 단부(즉, 마지막) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역의 단부(즉, 마지막) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개가 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단 영역의 단부(즉, 마지막) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 3개가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 PS 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, 5' 말단 영역의 5' 단부, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, 또는 둘 다 crRNA 및 trRNA의 첫 번째 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 뉴클레오타이드가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 3' 말단 영역의 첫 번째 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드는 하나 초과의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부의 말단(즉, 첫 번째) 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 단부의 말단 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개가 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 5' 단부의 말단 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 중 적어도 3개가 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 PS 결합을 포함한다.
일부 구현예에서, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA 또는 둘다 crRNA 및 trRNA와 같은 가이드 RNA의 5' 및 3' 말단(예를 들어, 단부) 모두가 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예컨대 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA 또는 둘다 crRNA 및 trRNA의 5' 말단만이 변형된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예컨대 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA 또는 둘다 crRNA 및 trRNA의 3' 말단만이 변형된다.
일부 구현예에서, gRNA는 gRNA의 5' 단부의 첫 번째 7개의 뉴클레오타이드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 3' 단부의 7개의 말단 뉴클레오타이드 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7에서의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 중 2, 3 또는 4개 및/또는 3' 단부의 말단 4개의 뉴클레오타이드 중 2, 3 또는 4개가 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 단부의 첫 번째 4개의 뉴클레오타이드 중 2, 3 또는 4개는 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결된다.
일부 구현예에서, 5' 말단 및/또는 3' 말단에 대한 변형은 뉴클레오타이드에 대한 2'-O-메틸(2'-O-Me) 또는 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'-O-moe) 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드에 대한 2'-플루오로(2'-F) 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-플루오로(2'-F), 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예들에서, 동등한 변형이 포괄된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA 또는 둘다 crRNA 및 trRNA는 5' 말단에서의 첫 번째 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 뉴클레오타이드 사이의 하나 이상의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, 또는 둘 다 crRNA 및 trRNA는 3' 말단의 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 사이의 하나 이상의 PS 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, 또는 둘 다 crRNA 및 trRNA는 5' 말단 및 3' 말단 양측에서 마지막 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 뉴클레오타이드 사이의 하나 이상의 PS 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, PS 결합에 추가하여, 5' 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 2'-O-Me, 2'-O-moe 또는 2'-F 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, 예를 들어 sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, 또는 둘 다 crRNA 및 trRNA는 5' 및 3' 말단에서의 변형된 뉴클레오타이드 및 표 1-3 및 도 21a 또는 도 21c에 기재된 하나 이상의 다른 영역에서의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 crRNA, trRNA 또는 둘 다 crRNA 및 trRNA는 5' 또는 3' 단부에 존재하지 않는 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형의 특정 패턴은 이하 및 표 4에 설명되어 있다.
3. gRNA 및 Cas 단백질의 전달
일부 구현예에서, 적어도 하나의 gRNA 이외에, 본원에서 제공된 조성물은 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 Cas 단백질이다. 일부 구현예에서, gRNA는 Cas 단백질과 함께 Cas RNP로 일컬어진다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 연쇄상구균 파이오제네스 Cas9 단백질, 예를 들어 S. 파이오제네스 Cas9로부터 유래된다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 S. 파이오제네스로부터 유래되지는 않으나 S. 파이오제네스 Cas9와 동일한 방식으로 기능하여 S. 파이오제네스 Cas9에 특이적인 gRNA가 비-S. 파이오제네스 Cas9를 그의 표적 부위에 향하게 할 것이다. 일부 구현예에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도한다. S. 파이오제네스 Cas9 단백질의 등가물은 본원에 기재된 구현예에 포괄된다.
Cas9는 그의 변형 및 변이체를 포함한다. 불활성인, RuvC 또는 HNH 중 하나의 촉매 도메인을 갖는 Cas9의 변형된 버전은 "니카아제(nickases)"라고 일컬어진다. 니카아제는 상기 표적 DNA 상의 하나의 가닥만을 절단하여, 단일-가닥 절단을 생성한다. 단일-가닥 절단은 또한 "닉(nick)"으로 공지될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 니카아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 상기 표적 DNA에서 이중 가닥 절단보다는 닉을 유도하는 니카아제 Cas9를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 단 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인만을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전하게 또는 부분적으로 결실되도록 Cas 단백질이 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 감소된 활성을 갖는 RuvC 도메인을 갖는 니카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 니카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 갖는 니카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 니카아제 Cas가 사용된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경시키기 위해 치환된다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인내에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 파이오제네스 Cas9 단백질에 기초한) D10A를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (S. 파이오제네스 Cas9 단백질에 기초한) E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNP 복합체는 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥 각각에 상보적인 니카아제 및 한 쌍의 가이드 RNA를 포함한다. 이 구현예에서, 가이드 RNA는 니카아제를 표적 서열로 유도하고, 표적 서열의 반대편 가닥 상에 닉을 생성함으로써 이중가닥 절단(DSB)를 도입한다(즉, 이중 닉킹). 일부 구현예에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 향상시키고 오프-타겟 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 니카아제 Cas는 DNA의 반대편 가닥을 표적으로 하는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 상기 표적 DNA에서 이중 닉을 생성한다. 일부 구현예에서, 니카아제 Cas는 근접하여 선택되는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 상기 표적 DNA에서 이중 닉을 생성한다.
일부 구현예에서, 단백질의 하나의 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 일부에 의해 대체되는 키메라 Cas 단백질이 사용된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 변형된 뉴클레아제일 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 이종성 기능적 도메인에 연결된 촉매적으로 불활성인 Cas9를 포함하는 융합 단백질을 포함한다(예를 들어, WO2014152432 참고). 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 S. 파이오제네스로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 Cas9를 불활성화시키는 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 이종성 기능적 도메인은 유전자 발현, 히스톤 또는 DNA를 변형시키는 도메인이다. 일부 구현예에서, 이종성 기능적 도메인은 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인이다.
A. PAM
일부 구현예에서, 표적 서열은 PAM에 인접할 수 있다. 일부 구현예에서, PAM은 표적 서열의 3' 단부에 인접하거나 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오타이드 내에 있을 수 있다. PAM의 길이 및 서열은 사용된 Cas 단백질에 의존할 수 있다. 예를 들어, PAM은 Ran 등, Nature 520:186-191 (2015)의 도 1에 개시된 것을 포함하여 특이적 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그에 대한 공통 또는 특정 PAM 서열로부터 선택될 수 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 편입된다. 일부 구현예에서, PAM은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 PAM 서열은 NGG, NAG, NGA, NGAG, NGCG, NNGRRT, TTN, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, 및 NNNNGATT(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드로 정의되고, W는 A 또는 T로 정의되며, R은 A 또는 G로 정의됨)를 포함한다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 NGG일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 NGGNG일 수 있다. 일부 구현예에서, PAM 서열은 NNAAAAW일 수 있다.
B. 변형된 gRNA의 전달
지질 나노입자(LNPs)는 뉴클레오타이드 및 단백질 전달대상물의 전달을 위한 공지된 수단이며, 본원에 개시된 gRNA, mRNA, Cas9 및 RNP의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 핵산, 단백질, 또는 핵산을 단백질과 함께 전달한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이, gRNA 중 임의의 하나를 대상체에 전달하는 방법을 포함하며, 상기 gRNA는 LNP와 연관된다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP는 또한 Cas9, 또는 Cas9를 코딩하는 mRNA와 연관된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개시된 gRNA 및 LNP 중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 Cas9, 또는 Cas9를 코딩하는 mRNA를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-(((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트, 또한 소위 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 4.5의 양이온성 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P)의 몰 비를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA와 관련된 LNP는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다.
전기천공은 전달대상물의 전달을 위한 공지된 수단이고, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 임의의 gRNA의 전달을 위해 임의의 전기천공 방법론이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA 및 Cas9, 또는 Cas9를 코딩하는 mRNA 중 임의의 하나를 전달하기 위해 전기천공이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 생체외 세포에 전달하는 방법을 포함하며, 상기 gRNA는 LNP와 연관되거나, LNP와 연관되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 또한 Cas9, 또는 Cas9를 코딩하는 mRNA와 연관된다.
4. 유전자 조절 방법
일부 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 제형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA 및 LNP 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 제형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA, Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 코딩하는 mRNA 및 LNP 중 임의의 하나를 포함하는 약제학적 제형을 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 제형은 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 gRNA 또는 약제학적 제형 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 환자를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 Cas 단백질 또는 Cas mRNA 및 임의의 하나 이상의 gRNA를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는 표적 DNA를 변형시키는 방법 또는 용도를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 Cas 단백질 또는 Cas mRNA 및 임의의 하나 이상의 gRNA를 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 표적 유전자의 조절 방법 또는 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 조절은 표적 유전자의 편집이다. 일부 구현예에서, 조절은 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현 변화이다.
일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 유전자 편집을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 유전자 내에서 이중-가닥 절단을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 DSB의 비-상동성 말단 결합 동안 삽입결실(indel) 돌연변이의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 유전자에서 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 구현예에서, 표적 유전자에서 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실은 비-기능성 단백질을 초래하는 틀이동 돌연변이 또는 조기 정지 코돈을 유발시킨다. 일부 구현예에서, 표적 유전자에서 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실은 표적 유전자 발현의 녹다운 또는 제거를 유발시킨다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 DSB의 상동성 지향된 회복을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 템플레이트를 세포에 전달하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 템플레이트의 적어도 일부는 Cas 단백질에 의해 유도된 이중가닥 절단 부위 또는 그 부근의 표적 DNA에 편입된다.
일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 유전자 조절을 초래한다. 일부 구현예에서, 유전자 조절은 유전자 발현의 증가 또는 감소, DNA의 메틸화 상태 변화, 또는 히스톤 서브유닛의 변형이다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 증가시키거나 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 임의의 gRNA는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 유용할 수 있다.
A. 유전자 조절 측정
변형된 gRNA의 효능은 시험관내 및 생체내에서 시험될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 하나 이상의 gRNA를 포함하며, gRNA는 Cas9와 함께 세포에 제공될 때 유전자 조절을 초래한다. 일부 구현예에서, gRNA의 효능은 시험관내 또는 생체내 검정으로 측정될 수 있다.
1. Cas 효능의 시험관내 측정
일부 구현예에서, 변형된 sgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성은 비변형된 sgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성과 비교된다.
일부 구현예에서, 변형된 trRNA를 포함하는 dgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성은 비변형된 trRNA를 포함하는 dgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성과 비교된다.
일부 구현예에서, 변형된 crRNA를 포함하는 dgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성은 비변형된 crRNA를 포함하는 dgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성과 비교된다.
일부 구현예에서, 변형된 crRNA 및 변형된 trRNA를 포함하는 dgRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성은 비변형된 crRNA 및 비변형된 trRNA를 포함하는 Cas RNP의 활성과 비교된다.
일부 구현예에서, 표적 단백질 발현을 증가 또는 감소시키는데 있어서의 gRNA의 효율은 표적 단백질의 양을 측정함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 포함하며, 상기 gRNA는 표적화된 유전자로부터 생산된 단백질의 양을 증가 또는 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 단백질 발현 조절 방법을 포함하며, 상기 gRNA는 표적 단백질을 코딩하는 유전자에 Cas9를 향하게 하고, 표적 단백질 발현은 그 유전자에 Cas9를 표적으로 삼지 않는 gRNA 대조군과 비교하여 증가되거나 감소된다.
일부 구현예에서, 특이적 gRNA로 편집하는 효율은 Cas9 및 gRNA(sgRNA 또는, crRNA 및 trRNA를 포함하는 dgRNA)의 전달 후에 게놈내 상기 표적 위치에 존재하는 편집에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 특이적 gRNA로 편집하는 효율은 차세대 서열분석에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 관심의 표적 영역의 편집 백분율이 결정된다. 일부 구현예에서, 총 서열 판독 수에 대한, 관심의 표적 영역으로 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 갖는 총 서열 판독 수는 gRNA 및 Cas9의 전달 후에 측정된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 변형된 gRNA 중 임의의 하나를 세포에 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는 유전자 편집의 효율성을 증가시키는 방법을 포함하며, 유전자 편집의 백분율은 유사하게 변형되지 않는 대조군 gRNA와 비교하여 증가된다.
일부 구현예에서, 특이적 gRNA로 편집하는 효율은 성공적인 유전자 편집에 의해 도입된 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실의 존재에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 gRNA 중 임의의 하나를 세포에 투여 또는 전달하는 단계를 포함하는, 유전자내 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실을 생성하는 방법을 포함하며, 상기 뉴클레오타이드는 유사하게 변형되지 않는 대조군 gRNA와 비교하여 삽입 또는 결실된다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA의 활성은 생화학적 검정에서 시험된다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA의 활성은 무세포 절단 검정에서 시험된다. 일부 구현예에서, Cas9 및 gRNA의 활성은 Neuro2A 세포에서 시험된다.
일부 구현예에서, 변형된 crRNA 및/또는 trRNA를 포함하는 Cas9 및 sgRNA 또는 dgRNA는 비변형된 sgRNA 또는 비변형된 crRNA 및 trRNA를 포함하는 dgRNA와 비교하여, 유사하거나, 더 크거나, 또는 감소된 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, Cas9 및 변형된 sgRNA 또는 변형된 crRNA 및/또는 trRNA를 포함하는 dgRNA는 비변형된 sgRNA 또는 비변형된 crRNA 및 trRNA를 포함하는 dgRNA와 비교하여 향상된 활성을 나타낸다.
2. Cas 효능의 생체내 측정
일부 구현예에서, 변형된 gRNA의 활성은 변형된 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 LNP의 생체내 투여 후에 측정된다.
일부 구현예에서, 본원에서 제공된 gRNA 또는 조성물의 생체내 효능은 gRNA 및 Cas9의 투여 후 조직(예를 들어, 간 조직)으로부터 추출된 DNA에서 측정된 효능을 편집함으로써 결정된다.
3. 면역계 활성화의 생체내 측정
본 명세서에 개시된 바와 같이 gRNA에 대한 변형은 gRNA의 생체내 투약에 대한 대상체의 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체의 면역 반응의 활성화는 (예를 들어, LNP로 제형화된) Cas9 mRNA 또는 단백질과 함께 trRNA 및 crRNA를 포함하는 sgRNA 또는 dgRNA의 생체내 투약 후 사이토카인의 혈청 농도에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 인터페론-알파(IFN-알파), 인터류킨 6(IL-6), 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파)이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함하는 gRNA 전달에 대한 대상체의 면역 반응을 감소시키는 방법을 포함하며, 상기 gRNA는 투여 후 대상체의 면역계에 의한 감소된 반응을 생성한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 유사하게 변형되지 않는 대조군 gRNA와 비교하여, 투여 후 대상체의 면역계의 활성화를 감소시키는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 gRNA(예를 들어, sgRNA 또는 dgRNA)와 함께 Cas RNP 또는 Cas9 mRNA를 투여하면, 비변형된 sgRNA의 투여에 비해 면역 사이토카인의 낮은 혈청 농도가 생성된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같이 gRNA 중 임의의 하나를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 면역 사이토카인의 혈청 농도를 감소시키는 방법을 포함하며, 상기 gRNA는 유사하게 변형되지 않는 대조군 gRNA와 비교하여 대상체의 혈청에서 보다 낮은 농도의 면역 사이토카인을 생성한다.
본 설명 및 예시적인 구현예들은 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구항에 사용된 양, 백분율 또는 비율 및 다른 수치를 표현하는 모든 숫자는 모든 사례에 대해 "약"이 그들이 이미 그렇게 변형되지 않은 범위까지 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반되게 나타내지 않는 한, 하기의 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 대수적 파라미터는 얻어야 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구범위의 균등론의 적용을 제한하려는 시도는 아니며, 각각의 대수적 파라미터는 보고된 유효숫자의 수를 고려하여, 및 통상적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 명시적으로 및 명백하게 지시대상으로 제한되지 않는한 복수의 지시대상을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 그의 문법적 변이체는 목록에 있는 항목의 인용이 열거된 항목으로 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않도록, 비제한적인 것으로 의도된다.
실시예
하기 실시예는 특정 개시된 구현예를 설명하기 위해 제공되며, 어떠한 방식 으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1 - 물질 및 방법
A. 합성 가이드 RNA(gRNA)
이중(dgRNA, 즉, crRNA 및 trRNA) 및 단일 가이드(sgRNA) 포맷의 gRNA는 표 4에 제공된 바와 같이, 변형된 뉴클레오타이드 및 결합을 갖는 상업적 벤더에 의해 화학적으로 합성되었다.
B. Cas9 mRNA의 시험관내 전사("IVT")
선형화된 플라스미드 DNA 템플레이트 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 N1-메틸 슈도-U를 함유하는 캡핑된 및 폴리아데닐화된 Cas9 mRNA를 생성시켰다. T7 프로모터 및 100 뉴클레오타이드(nt) 폴리(A/T) 영역을 함유하는 플라스미드 DNA를 XbaI에 의해 선형화시키고, 상업적 제조자로부터 수득하였다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응물을 37℃에서 4시간 동안 하기 조건에서 인큐베이션하였다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; GTP, ATP, CTP 및 N1-메틸 유사-UTP(Trilink) 각각 2 mM; 10 mM ARCA(Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제(NEB); 1 U/μL 뮤린 RNase 억제제(NEB); 0.004 U/μL 무기 E. 콜리 파이로포스파타제(NEB); 및 1x 반응 완충제. 4시간 인큐베이션 후, TURBO DNase(ThermoFisher)를 0.01 U/μL의 최종 농도로 첨가하고, 반응물을 추가로 30분 동안 인큐베이션하여 DNA 템플레이트를 제거하였다. MegaClear 전사 클린-업 키트(Transcription Clean-up kit)(ThermoFisher)와 같은 실리카 결합 칼럼을 포함한 표준 프로토콜을 사용하여, 또는 LiCl에 이어, NaOAc를 포함한 EtOH를 사용한 침전 단계를 사용하여, 효소 및 뉴클레오타이드로부터 Cas9 mRNA를 정제하였다. 전사체 농도는 260 nm에서의 흡광도(Nanodrop)를 측정하여 결정하였으며, 전사체는 Bioanlayzer(Agilent)에 의한 모세관 전기영동으로 분석하였다.
C. Neuro2A 세포내 Cas9 mRNA 및 gRNA 형질감염
마우스 세포주 Neuro2A를 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하고, 형질감염 24시간 전에 96-웰 플레이트에 15,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 형질감염 당일, 배지가 세포로부터 흡인되어, 새로운 배지로 교체하였다. 리포펙타민-2000(Invitrogen)을 Opti-MEM(Invitrogen)에서 1:50(v/v)로 희석시켰다. Cas9 mRNA 및 단일 가이드 RNA를 Opti-MEM에서 별도로 희석시켰다. 이중 가이드 형식의 경우, crRNA 및 trRNA를 Opti-MEM에서 1:1 몰비로 함께 희석시켰다. Cas9 mRNA와 gRNA를 둘다, 희석된 리포펙타민-2000과 1:1(v/v)로 별도로 혼합하여, 2개의 리포플렉스를 생성시켰다. 인큐베이션 5분 후, 리포플렉스를 100 ng Cas9 mRNA/웰의 최종 농도와 0.4μL 총 리포펙션 시약을 위해 계속하여 세포에 첨가했다. 25 nM 및 2.5 nM, 16.7 nM 및 1.67 nM, 10 nM 및 1 nM, 8.3 nM 및 0.83 nM, 및 3 nM 및 0.3 nM을 포함하는, 각각의 실험에 대해 2가지 용량 수준에서 가이드를 시험하였다. 이중 가이드의 경우, 이 농도는 예를 들어, 25nM crRNA 및 25nM trRNA가 25nM 총 이중 가이드를 생성하도록 등몰 양의 crRNA 및 trRNA를 포함한다. 형질감염 24시간 후에 세포를 용해시키고, 용해물을 PCR 반응에 직접 사용하여 NGS에 의한 편집을 위해 분석하였다.
1xNLS를 갖는 Cas9 mRNA(SEQ ID NO: 359):
2xNLS 및 HA 태그를 갖는 Cas9 mRNA(SEQ ID NO: 360):
D. 일차 간 간세포
일차 마우스 간 간세포(PMH)(Gibco)를 제조자의 프로토콜(Invitrogen, 프로토콜 11.28.2012)에 따라 배양하였다. 간단히 말해서, 세포를 해동시키고, 보충제(Gibco, Cat. CM7000)로 간세포 해동 배지에 재현탁시킨 다음, 10분 동안 100 g에서 원심분리시켰다. 상청액을 버리고, 펠릿화된 세포를 간세포 플레이팅 배지 + 보충 팩(Invitrogen, Cat.A1217601 및 CM3000)에 재현탁시켰다. 세포를 카운팅하고, 15,000 세포/웰의 밀도로 Bio-coat 콜라겐 I 코팅 96-웰 플레이트(ThermoFisher, Cat. 877272)에 플레이팅하고, 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 5시간 동안 인큐베이션하여 단일층을 형성시켰다. 5시간 후, 플레이팅 배지를 제거하고, LNP 제형화된 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA + 3% 마우스 혈청을 함유하는 보충된 간세포 배양 배지(Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM4000)로 대체하였다. LNP는 웰 당 100 ng Cas9 mRNA 및 약 30nM 가이드 RNA의 개시 용량 수준으로부터 희석되어, 웰 당 0.1 ng mRNA 및 0.03 nM 가이드까지 연속 희석을 수행하였다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 분위기 하에서 대략 48시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 용해 및 NGS 분석을 본 명세서에 기재된 바에 따라 수행하였다.
E. 지질 나노입자("LNP") 제형
LNP는 약 4.5의 양이온성 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비로 제형화하였다. 지질 나노입자 성분을 하기의 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다: 45 mol-%(12.7 mM) 양이온성 지질(예를 들어, (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트, 또한 소위 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트); 44 mol-% (12.4 mM) 헬퍼 지질(예를 들어, 콜레스테롤); 9 mol-%(2.53 mM) 중성 지질(예를 들어, DSPC); 및 2 mol-%(.563 mM) PEG(예를 들어, PEG2k-DMG). RNA 전달대상물을 25 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에서 제조하여, 약 0.45 mg/mL의 RNA 전달대상물의 농도를 수득하였다.
제조사의 프로토콜에 따라, 정밀 나노시스템 NanoAssemblrTM 벤치톱 기기를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 LNP를 형성하였다. 차동 유량을 사용하여 혼합하는 동안 유기 용매에 대한 수성 용매의 2:1 비를 유지하였다.
LNP 제형화 절차 A: 혼합 후, LNP를 수집하고, 포스페이트 완충 식염수(PBS, 대략 1:1)로 희석한 다음, 나머지 완충액을 PBS(100-배 초과 샘플 용적)로 4℃에서 10 kDa Slide-a-Lyzer™ G2 투석 카세트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 밤새 완만한 교반하에 교환시켰다. LNP는 10 kDa Amicon 스핀 필터(4℃에서 4000 g에서 원심분리)를 사용하여 농축시켜, 원하는 농도를 얻었다. 이어서, 수득된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 수득한 여과물을 2~8℃에서 저장하였다.
LNP 제형화 절차 B: 혼합 후, LNP를 수집하고, pH 7.5의 50mM 트리스에서 희석한 다음(대략 1:1), LNP를 pH 7.5의 50 mM 트리스(샘플 용적의 100배 초과)로 4℃에서 10 kDa Slide-a-Lyzer™ G2 투석 카세트(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 밤새 완만한 교반하에 교환시켰다. LNP는 10 kDa Amicon 스핀 필터(4℃에서 4000 g에서 원심분리)를 사용하여 농축시켜, 원하는 농도의 2배를 달성하였다. 상기 농축 LNP는 pH 7.5(2X TSS)에서 50 mM Tris, 90 mM NaCl, 10% 수크로스와 1:1로 혼합하였다. 이어서, 수득된 혼합물을 0.2 μM 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 수득한 여과물을 -80℃에서 저장하였다.
LNP 제형화 절차 C: RNA 전달대상물을 25 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화나트륨(pH 5)에서 제조하여 대략 0.45 mg/mL의 RNA 전달대상물 농도를 얻었다. 혼합 후, LNP를 물에서 3:1의 비율로 수집하였다. LNP를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 물과 1:1로 혼합하였다. 그런 다음, 제조자의 프로토콜을 사용하여, PD-10 컬럼(GE Healthcare) 상에서 1X TSS(50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% 수크로스 pH 7.5)로 완충액-교환하였다. LNP는 10 kDa Amicon 스핀 필터(4℃에서 4000 g에서 원심분리)를 사용하여 농축시켜, 원하는 농도를 달성하였다. 이어서, 수득된 혼합물을 0.2 μM 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 생성된 여과물을 -80℃에서 저장하였다.
F. 차세대 서열분석("NGS") 및 표적 절단 효율에 대한 분석
게놈의 표적 위치에서의 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하기 위해 심화 서열분석(deep sequencing)을 이용하였다.
PCR 프라이머를 표적 부위(예를 들어, TTR, FVII) 주위에 설계하고, 관심있는 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 하기 표 5에 제시되어 있다.
서열분석에 필요한 화학을 추가하기 위해 제조자의 프로토콜(Illumina)에 따라 추가의 PCR을 수행하였다. Illumina MiSeq 기기 상에서 앰플리콘을 서열분석하였다. 낮은 품질 점수를 갖는 것들을 제거한 후에 인간 참조 게놈(예를 들어, hg38)에 판독을 정렬하였다. 판독을 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)으로 맵핑하였으며, 이 경우 관심있는 표적 영역과 겹치는 판독을 선택하였으며, 삽입, 치환 또는 결실을 포함하는 판독 수와 비교하여 야생형 판독 수를 계산하였다.
편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "퍼센트 편집")은 야생형을 포함하는, 총 서열 판독 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 총 서열 판독 수로서 정의된다.
G. 생체내 LNP 전달
6~10주령의 CD-1 암컷 마우스를 각각의 연구에 사용하였다. 그룹 평균 체중에 기반하여 투여 용액을 제조하기 위해 동물을 체중에 따라 동물들을 칭량하고 그룹화하였다. 동물 당 0.2 mL(체중 kg 당 약 10 mL)의 용적으로 측면 꼬리 정맥을 통해 LNP를 투여했다. 투여 후 약 6시간 후에 동물을 부작용에 대해 관찰하였다. 투여 후 24시간에 체중을 측정하고, 이소플루란 마취하에 심장 천자를 통한 방혈에 의해 여러 시점에서 동물들을 안락사시켰다. 혈액을 혈청 분리기 튜브 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 혈장용 완충된 시트르산 나트륨을 함유하는 튜브에 수집하였다. 생체내 편집과 관련된 연구를 위해, DNA 추출 및 분석을 위해 각각의 동물로부터의 중앙 엽에서 간 조직을 수집하였다.
H. 사이토카인 유도 분석
이 분석을 위해, 혈청 사이토카인 측정을 위해 꼬리 정맥 닉에 의해 대략 50~100 μL의 혈액을 수집하였다. 혈액을 실온에서 대략 2시간 동안 응고시킨 다음, 1000 xg에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 채취하였다. IL-6, TNF-α, IFN-α 및 MCP-1을 측정하는 Luminex 기반 자기 비드 멀티플렉스 분석(Affymetrix ProcartaPlus, 카탈로그 번호 Exp040-00000-801)을 샘플에 수집된 사이토카인 분석에 사용하였다. 키트 시약 및 표준은 제조사의 프로토콜에 따라 제조되었다. 희석된 항체 코팅된 자기 비드 25 μL를 함유하는 웰에 마우스 혈청 25 μL를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 세정하였다. 희석된 바이오틴 항체(50 μL)를 상기 비드에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드를 다시 세정하여 각 웰에 50 μl의 희석된 스트렙타비딘-PE를 첨가한 후에, 30분 동안 인큐베이션하였다. 비드를 다시 한번 세정한 다음, 100μL의 세척 완충액에 현탁시키고, Bio-Plex 200 기기(Bio-Rad)에서 판독하였다. 5개의 파라미터 로지스틱 곡선 적합을 사용하여 표준 곡선에서 계산된 사이토카인 농도를 갖는 Bioplex 매니저 ver 6.1 분석 패키지를 사용하여 데이터를 분석하였다.
I. 게놈 DNA 단리
생체내 연구를 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 비드 기반 추출 키트, MagMAX-96 DNA 다중 샘플 키트(ThermoFisher, Cat #4413020)를 사용하여 10 mg의 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하였으며, 이는 조직을 세포용해 완충액에서 균질화하는 것을 포함한다(약 400 μL/10 mg 조직). 모든 DNA 샘플을 본 명세서에 기술된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS 분석을 위해 100 ng/μL 농도로 정규화하였다.
J. 트랜스티레틴(TTR) ELISA 분석
혈액을 수집하고, 혈청을 지시된 바와 같이 분리하였다. 마우스 전알부민(트랜스티레틴)ELISA 키트(Aviva System Biology, Cat. OKIA00111)를 사용하여 총 TTR 혈청 수준을 결정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 키트 시약 및 표준을 제조하였다. 마우스 혈청을 1x 검정 희석제로 10,000-배의 최종 희석으로 희석하였다. 이는 순차적인 50-배 희석으로 2회 수행하여, 2500-배 희석함으로써 실시하였다. 10,000-배의 총 샘플 희석을 위해 최종 4-배 희석 단계를 수행하였다. 표준 곡선 희석(각각 100 μL) 및 희석된 혈청 샘플을 포획 항체로 미리 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 후 세척하였다. 효소-항체 콘주게이트(웰당 100 μL)를 20-분 인큐베이션을 위해 첨가하였다. 미결합된 항체 콘주게이트를 제거하고, 발색 기질액을 첨가하기 전에 플레이트를 다시 세척하였다. 플레이트를 10분 배양한 후, 100 μl의 정지 용액, 예를 들어 황산(대략 0.3 M)을 첨가하였다. 플레이트를 450 nm의 흡광도에서 SpectraMax M5 플레이트 리더로 판독하였다. 혈청 TTR 수준은 4가지 파라미터 로지스틱 곡선을 사용하여 SoftMax Pro 소프트웨어 버전 6.4.2에 의해 계산하였다. 최종 혈청 값은 검정 희석을 위해 조정하였다.
실시예 2 - 엔지니어링 변형된 gRNA 및 시험관내 시험
변형된 gRNA는 표 4에 나타낸 바와 같이 이중 가이드 포맷(dgRNA)으로 설계되었다. 따라서, 변형된 crRNA 및 trRNA 모두가 설계되었으며, 화학적으로 합성되어 dgRNA를 형성하는 변형된 및 비변형된 성분의 페어링을 허용하였다. 이들 쌍을 도면에 나타낸 농도로 Neuro2A 세포에 형질감염시켰고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 편집 효율(예를 들어, 퍼센트 편집)을 NGS로 측정하였다.
마우스 TTR 유전자를 표적으로 하는 표 4의 특정 변형된 crRNA를 Cas9 mRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)로 형질감염시켰다. 시험된 가이드는 SEQ ID NO: 1~18을 포함한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 변형된 crRNA 중 일부(비변형된 trRNA와 함께)는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 다른 변형된 crRNA는 활성을 감소시켰다.
이와 병행하여, 표 4의 변형된 trRNA를 마우스 TTR 유전자의 동일한 서열을 표적으로 하는 비변형된 crRNA(CR000686)와 함께 Cas9 mRNA로 형질감염시켰다. 시험된 가이드는 SEQ ID NO: 188~200 및 204를 포함한다. 도 2에 도시된 바와 같이, (비변형된 crRNA와 함께) 변형된 trRNAs는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 변형된 trRNAs 중 일부는 활성을 감소시켰다.
화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 치환하는 것 이외에, 시험된 일부 crRNA 및 trRNA 쌍은 서열 치환으로 조작되어, 예를 들어, 친계 서열에서 G-C 쌍이 발견되지 않았다. 시험된 가이드는 SEQ ID NO: 15 및 201; 16 및 202; 1 및 188을 포함한다. 도 3에 도시된 바와 같이, 이러한 한쌍의 쌍(서열 16 및 202)은 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 초래하는 반면, 쌍 중 2개는 활성을 감소시켰다.
다음으로, 표 4의 변형된 crRNA 및 변형된 trRNA의 페어링을 시험하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 변형된 trRNA를 갖는 변형된 crRNA의 쌍 중 일부는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 일부 쌍은 활성을 감소시켰다. 도 4에서, 열 제목은 실험에 사용된 다른 trRNA를 나타내고, 행 제목은 사용된 다른 crRNA를 나타낸다. 실험에 사용된 조합을 결정하기 위해서는, 열을 행과 매칭시킨다. TR000002 및 CR000686은 비변형된 대조군이다(오른쪽 하단 셀 참고).
dgRNA 디자인에 기초하여, 표 4 및 도 15d에 나타낸 바와 같이, 변형된 crRNA 및 trRNA의 일부의 양태를 특징으로 하는 상응하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 조작하였다. 이들 sgRNAs, SEQ ID NO: 228~234는 또한 Neuro2A 세포에서 시험하였으며, 도 5에 나타낸 바와 같이, 각각의 변형된 sgRNA는 단지 5' 및 3' 말단 변형만을 포함하는 대조군(G0000209; SEQ ID NO: 228)과 비교할만한 활성을 나타낸다.
표 4 및 도 6에 도시된 추가의 dgRNA 가이드에 대해 유사한 세트의 실험을 수행하였다. 시험된 가이드는 SEQ ID NO: 32 내지 47, 및 1을 포함하였다. 또한, 마우스 TTR 유전자를 표적으로 하는 변형된 crRNA를 Cas9 mRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)로 형질감염하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, (비변형된 trRNA와 함께) 변형된 crRNA 중 일부는 비변형된 대조군(CR000686)과 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 다른 변형된 crRNA는 활성을 감소시켰다.
이와 병행하여, 도 7에 나타낸 바와 같이, 표 4의 변형된 trRNA를 마우스 TTR 유전자의 동일한 서열을 표적으로 하는 비변형된 crRNA(CR000686)와 함께 Cas9 mRNA로 형질감염시켰다. 시험된 가이드는 SEQ ID NO: 205~222 및 1을 포함하였다. 도 7에 도시된 바와 같이, (비변형된 crRNA와 함께) 변형된 trRNAs는 비변형된 대조군(TR000002)과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 변형된 trRNA의 일부는 활성을 감소시켰다.
화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 치환하는 것 이외에, 표 4에서 시험된 crRNA 및 trRNA 페어링의 일부는 서열 치환으로 조작되었는데, 예를 들어, G-C 페어링 또는 GU 미스매치("GU 워블")가 친계 서열에서 발견되지 않았다. 도 8에 도시된 바와 같이, 변형 및 페어링의 일부는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 변형(예를 들어, "GU 워블" 또는 미스매치 페어링)의 일부는 활성을 감소시켰다. 도 8은 SEQ ID NO: 48~52 및 1에 나타낸 crRNA 가이드를 갖는 SEQ ID NO: 223~227 및 188에 나타낸 trRNA 가이드를 사용한 결과를 나타낸다.
다음으로, 표 4의 변형된 crRNA 및 변형된 trRNA의 선택 페어링을 도 9에 나타낸 바와 같이 시험하였다. 변형된 trRNA를 갖는 변형된 crRNA의 페어링 중 일부는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 페어링의 일부는 활성을 감소시켰다. 도 9에서 열 제목은 실험에 사용된 다른 trRNA를 나타내고, 행 제목은 사용된 다른 crRNA를 나타낸다. 실험에 사용된 조합을 결정하기 위해서는, 열을 행과 매칭시킨다. 비변형된 대조군은 TR000002 및 CR000686이다.
표 4의 변형된 gRNA(dgRNA 및 sgRNA)의 일부를 순수하게 생화학적 검정법(즉, 무세포 절단 검정법)에서도 시험하였다. 흥미롭게도, Neuro2A 세포에서 크게 불활성인 변형된 gRNA의 많은 것들이 생화학적 검정에서 활성이었는데, 이는 상기 생화학적 검정이 세포에서 변형된 gRNA 활성을 예측하지 못할 수 있음을 나타낸다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 3. 다른 표적에 대한 변형된 gRNA의 추가 시험
특정 변형이 gRNA 활성에 영향을 미친다는 것을 확립한 후, (1) 동일한 유전자에서의 별개의 서열 또는 (2) 상이한 유전자에서의 서열을 표적으로 할 때, 이들 변형이 활성에 영향을 미치는지 여부를 다음에 시험하였다. 따라서, 실시예 2에서 시험한 특정 변형 패턴을 갖는, 마우스 TTR 유전자의 또 다른 서열 뿐만 아니라 마우스 인자-VII(FVII) 유전자의 서열을 표적으로 하는 gRNA를 조작하고 합성하였다(표 4 참조). 이들 gRNA를 도면에 나타낸 농도로 Neuro2A 세포에 형질감염시키고, 실시예 1에서 설명한 바와 같이 편집 효율(예를 들어, 퍼센트 편집)을 NGS로 측정하였다.
마우스 TTR 유전자(실시예 2에서 표적화된 것과 상이한 서열) 또는 마우스 FVII 유전자를 표적으로 하는 표 4의 변형된 crRNA를 Cas9 mRNA 및 비변형된 trRNA(TR000002)로 형질감염시켰다. 시험된 가이드는 도 12a 및 12b에 도시된 가이드를 포함하였다. (비변형된 trRNA와 함께) 변형된 crRNA의 일부는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 다른 변형된 crRNA는 활성을 감소시켰다.
이와 병행하여, 표 4의 변형된 trRNA를 마우스 TTR 유전자의 동일한 서열(CR000705; 실시예 2에서 표적화된 것과 상이한 서열) 또는 마우스 FVII 유전자와 동일한 서열(CR000657)을 표적으로 하는 비변형된 crRNA와 함께 Cas9 mRNA로 형질감염시켰다. 도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, (비변형된 crRNA와 함께) 많은 변형된 trRNA는 비변형된 대조군과 비교하여 유사한 또는 향상된 활성을 부여하는 반면, 변형된 trRNA의 일부는 활성을 감소시켰다. 이 데이터는 특정 변형 패턴이 상이한 서열에 대해 유사한 효과를 갖는 경향이 있음을 보여준다.
상기 기재된 dgRNA 디자인에 기초하여, 상응하는 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 변형된 crRNA 및 trRNA의 일부의 양태를 특징으로 조작하였다. 표 4를 참고한다. 이들 sgRNA는 또한 Neuro2A 세포에서 시험하였다. 결과를 도 10(마우스 TTR) 및 도 11(마우스 FVII)에 나타내었다. 이 실험은 다른 유전자를 표적으로 할 때에도 일부 변형 패턴이 유사한 효과를 나타냄을 보여준다.
실시예 4.
생체내에서
변형된 gRNA의 시험
시험관내 시험에 이어, 변형이 생체내 편집에 대해 어떠한 이점을 부여했는지 여부를 결정하기 위해 변형된 sgRNA를 6개의 별개의 연구에서 동물에게 전달하였다.
LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 (표적 TTR 또는 FVII를 표적으로 하는) 화학적으로 변형된 sgRNA와 함께 IVT Cas9 mRNA로 제형화하였다. mRNA:sgRNA의 비는 RNA 성분의 중량으로 약 1:1이었다. 달리 지시되지 않는 한, 본 실시예에 기재된 연구에서 사용된 Cas9 mRNA는 SEQ ID NO: 360의 서열을 가졌으며, LNP는 상기 기재된 LNP 제형화 절차 A를 사용하여 제형화되었다.
한 실험에서, 마우스(그룹당 n=5)에 2 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하고, 혈장 사이토카인 분석을 위해 투여 4시간 후에 혈액을 수집하였다. 검시 투여 7일 후, 편집 효율 및 혈청 TTR 분석 각각에 대한 NGS 측정을 위해 간 및 혈액을 수집하였다. 이 실험에서 각각의 sgRNA는 TTR 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하고, sgRNA 간의 유일한 차이는 각각에 대한 변형이다(도 14a~d 및 15a~e, 표 4 SEQ ID NO: 228~234 참조). G000209(시험된 2개의 롯트)는 변형이 적은 대조군으로 사용되었으며, sgRNA의 5' 및 3' 말단 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드에서의 및 그 사이의 유일한 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 각각 갖는다.(도 15d 참고).
도 14a~d에 도시된 결과는, 보다 많이 변형된 sgRNA가 덜 변형된 G000209 대조군과 비교하여, 분석된 각각의 사이토카인에 대한 반응을 덜 유도하는 경향이 있다는 것을 보여준다. 보다 많이 변형된 sgRNA는 처리된 동물의 간에서 더 큰 편집 효율을 부여했으며, 퍼센트 편집은 덜 변형된 대조군(G000209 로트)에 대한 약 44~47%와 비교하여, 2개의 많이 변형된 sgRNA(예를 들어, G000263 및 G000267)에 대하여 약 60%에 도달하였다(도 15a). 중요하게는, TTR 수준의 혈청 녹다운이 덜 변형된 대조군과 비교하거나 현저히 더 컸으므로 편집 효율은 표현형 변화와 상관 관계가 있었다(예를 들어, 도 15a~15b의 G000263 및 G000267 대 G000209 로트 참고). 단부-변형된 G000209와 고도로-변형된 G000267 사이의 차이점은 도 15d 및 15e에 요약되어 있다(2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드는 볼드체로 표시되고, *는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다).
또 다른 생체내 연구에서, 마우스 TTR 유전자에서 별개의 서열을 표적으로 하는 3개의 sgRNA를 시험하였다. 마우스(그룹당 n=5)에게 2 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하였다. 혈장 사이토카인 분석을 위해 투여 4시간 후에 혈액을 수집하였다. 검시 투여 7일 후, 편집 효율 및 혈청 TTR 분석 각각에 대한 NGS 측정을 위해 간 및 혈액을 수집하였다. 이 실험에서, 각각의 sgRNA는 TTR 유전자에서 동일한 서열(이전의 생체내 연구에서 표적화된 것과 상이한 서열), 및 이전 생체내 연구(G000282(SEQ ID NO: 242))에서 G000267과 동일한 변형 패턴을 갖는 제3 sgRNA을 표적으로 하며, 하나의 sgRNA는 완전히 비변형되고(G000201(SEQ ID NO: 243)), 또 다른 sgRNA는 sgRNA의 5' 및 3' 말단 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드에서 및 사이의 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 갖는 유일한 단부 변형을 갖는다(G000211(SEQ ID NO: 241)).
도 16a~16d에 나타낸 바와 같이, 각각의 sgRNA는 시험된 각각의 사이토카인에 대해 용량 의존 방식으로 유사한 반응을 수득하였다. 편집 효율을 위해, 비변형된 sgRNA(G000201(SEQ ID NO: 243))는 생체내 편집이 거의 없었던 반면, 많이 변형된 sgRNA(G000282(SEQ ID NO: 242))는 2 mg/kg의 용량으로 약 60%에 달하는 수준을 부여하였으며, 이는 덜 변형된 sgRNA(G000211(SEQ ID NO: 241))로 달성된 수준보다 유의하게 더 컸다(도 17a 및 b). 이전의 생체내 연구와 마찬가지로, 편집 수준은 혈청 TTR 녹다운의 양과 상관 관계가 있었다(도 17c 및 d).
제2 생체내 연구와 유사한 연구는 (2개의 이전의 생체내 연구에서 표적화된 것과 상이한 서열을 표적으로 하는) 마우스 TTR 유전자에서 상이한 TTR 서열을 표적으로 하는 또 다른 3개의 sgRNA 세트로 수행하였다. 마우스(그룹당 n=5)에게 2 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하였다. 혈장 사이토카인 분석을 위해 투여 4시간 후에 혈액을 수집하였다. 검시 투여 7일 후, 편집 효율 및 혈청 TTR 분석 각각에 대한 NGS 측정을 위해 간 및 혈액을 수집하였다. 이 실험에서, 각각의 sgRNA는 TTR 유전자에서 동일한 서열(2개의 이전의 생체내 연구에서 표적화된 것과 상이한 서열), 및 2개의 이전의 생체내 연구(G000283(SEQ ID NO: 331))에서 G000267 및 G000282와 동일한 변형 패턴을 갖는 제3 sgRNA을 표적으로 하며, 하나의 sgRNA는 완전히 비변형되고(G000285(SEQ ID NO: 332)), 또 다른 sgRNA는 sgRNA의 5' 및 3' 단부 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드에서 및 사이의 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 갖는 유일한 단부 변형을 갖는다(G000269(SEQ ID NO: 330)).
이 연구에서, 비변형된 sgRNA(G000285(SEQ ID NO: 332))는 생체내 편집이 거의 없었던 반면, 많이 변형된 sgRNA(G000283(SEQ ID NO: 331))는 2 mg/kg의 용량으로 약 60%에 달하는 수준을 부여하였으며, 이는 덜 변형된 sgRNA(G000269(SEQ ID NO: 330))로 달성된 수준보다 유의하게 더 컸다(도 18a 및 18b). 이전의 생체내 연구와 마찬가지로, 편집 수준은 혈청 TTR 녹다운의 양과 상관 관계가 있었다(도 18c).
제4 생체내 연구에서, 또 다른 유전자(FVII)에 대해 gRNA에 대한 변형의 효과를 평가하였다. 연구간 비교를 위해 제1 생체내 연구에서 시험된 두가지 sgRNA가 포함되었다(G000209 및 G000267). 마우스(그룹당 n=5)에게 2 mg/kg, 1 mg/kg 또는 0.3 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하고, 혈장 사이토카인 분석을 위해 투여 4시간 후에 혈액을 수집하였다. 검시 투여 6일 후, 편집 효율에 대한 NGS 측정을 위해 간을 수집하였다. 이 실험에서, 각각의 sgRNA는 TTR 또는 FVII 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하며, 각각에 대한 하나의 sgRNA는 유일한 단부 변형(FVII에 대한 G000208(SEQ ID NO: 286); TTR에 대한 G000209, 둘다 각각 sgRNA의 5' 및 3' 단부 모두에서 3개의 말단 뉴클레오타이드에서 및 사이의 2'-O-메틸 변형 및 포스포로티오에이트 결합을 가짐)을 가지며, 및 제2 sgRNA는 이전의 생체내 연구(FVII에 대한 G000373(SEQ ID NO: 287); TTR에 대한 G000267(SEQ ID NO: 234))에서 G000267, G000282 및 G000283과 동일한 변형 패턴을 갖는다.
도 19a-19d에 나타낸 바와 같이, 각각의 sgRNA는 시험된 각각의 사이토카인에 대해 용량 의존 방식으로 유사한 반응을 수득하였다. 편집 효율을 위해, FVII(G000373(SEQ ID NO: 287))를 표적으로 하는 더 많이 변형된 sgRNA는 시험된 각 용량에 걸쳐 덜 변형된 버전(G000208(SEQ ID NO: 286))과 비교하여 편집 효율이 증가하였다(도 18a). 이러한 결과는 TTR을 표적으로 하는 sgRNA에 대해서도 관측되었다(도 20a-20b).
또 다른 생체내 연구에서, G000282와 같은 마우스 TTR 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하는 10개의 추가의 sgRNA를 시험하였다. G000282는 또한 비교 목적으로 연구에 포함되었다. 마우스(그룹당 n=5)에게 1 mg/kg 또는 0.5 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하였다. 이 연구에 사용된 LNP는 상기 기재된 LNP 제형 절차 B를 사용하여 제형화되었다. 검시 투여 7일 후, 편집 효율에 대한 NGS 측정 및 혈청 TTR분석을 위해, 간 및 혈액을 각각 수집하였다. 이 연구에서, 각각의 sgRNA는 TTR 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하였다. 시험된 각각의 sgRNA의 변형 패턴은 다양하며, sgRNA의 5' 말단, 3' 말단, 헤어핀 1, 헤어핀 2, 연결부, 하부 스템, 팽출 및 상부 스템에서 2'-OMe, 2'-F 및 PS 변형을 포함하였다. 이 연구의 결과는 % 편집(도 22a), 평균 편집 및 표준 편차(도 22b) 및 혈청 TTR 수준(도 22c)을 포함하여 도 22a~22c에 도시된다. 이들 동일한 sgRNA를 본원에 기재된 방법에 따라 일차 마우스 간세포에서 시험하였다. 이 용량 반응 TTR 편집 연구의 결과는 % 편집(도 24a), 용량 반응 곡선(도 24bB) 및 EC50 값(도 24c)을 포함하여 도 24a~24c에 도시된다.
또 다른 생체내 연구에서, G000282와 같은 마우스 TTR 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하는 13개의 추가의 sgRNA를 시험하였다. G000282는 또한 비교 목적으로 연구에 포함되었다. 마우스(그룹당 n=5)에게 1 mg/kg의 단일 용량의 LNP를 투여하였다. 이 연구에 사용된 LNP는 상기 기재된 LNP 제형 절차 C를 사용하여 제형화되었다. 이 연구에 사용된 Cas9 mRNA는 SEQ ID NO: 359의 서열을 가졌다. 혈액을 혈청 사이토카인 분석을 위해 투여 4시간 후에 수집하였다. 검시 투여 7일 후, 편집 효율에 대한 NGS 측정 및 혈청 TTR 분석을 위해, 간 및 혈액을 각각 수집하였다. 이 연구에서, 각각의 sgRNA는 TTR 유전자에서 동일한 서열을 표적으로 하였다. 시험된 sgRNA는 sgRNA의 5' 말단, 3' 말단, 헤어핀 1, 헤어핀 2, 및 상부 스템에서 추가의 2'-OMe 및 PS 변형을 포함한다. 이 연구의 결과는 % 편집(도 23a), 평균 % 편집(도 23b) 및 혈청 TTR 수준(도 23c)을 포함하여, 도 23a~23c에 도시된다.
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<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 318
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 319
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 319
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 320
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 320
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 321
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 321
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 322
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 322
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 323
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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oligonucleotide"
<400> 323
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 324
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 324
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 325
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<221> source
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oligonucleotide"
<400> 325
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 326
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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oligonucleotide"
<400> 326
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 327
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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oligonucleotide"
<400> 327
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 328
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
oligonucleotide"
<400> 328
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 329
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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oligonucleotide"
<400> 329
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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polynucleotide"
<400> 330
cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 331
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 331
cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 332
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 332
cccauacucc uacagcacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 333
<211> 24
<212> DNA
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primer"
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agtcaataat cagaatcagc aggt 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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gttttgttcc agagtctatc accg 24
<210> 335
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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attaccagct tagcatcctg tgaa 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
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agcacatgag accttctgtt tctc 24
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<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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primer"
<400> 337
agaaggcact tcttctttat ctaaggt 27
<210> 338
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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primer"
<400> 338
acacgaataa gagcaaatgg gaac 24
<210> 339
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 339
acacggttta tagagcaaga acac 24
<210> 340
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
primer"
<400> 340
gacataggtg tgaccctcac aatc 24
<210> 341
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 341
ccaguccagc gaggcaaagg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 342
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 342
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 343
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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polynucleotide"
<400> 343
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 344
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 344
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 345
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 345
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 346
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 346
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 347
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 347
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 348
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 348
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 349
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 349
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 350
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 350
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 351
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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polynucleotide"
<400> 351
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 352
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 352
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 353
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 353
uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 354
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 354
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 355
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 355
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 356
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<400> 356
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 357
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 357
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 358
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-Me modified nucleotides
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(20)
<223> N = any nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(40)
<223> 2'-O-Me modified nucleotides
<220>
<221> modified_base
<222> (69)..(100)
<223> 2'-O-Me modified nucleotides
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(98)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> misc_feature
<222> (98)..(99)
<223> Phosphorothioate linkage
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(100)
<223> Phosphorothioate linkage
<400> 358
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 359
<211> 4514
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: mRNA transcript"
<400> 359
gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60
auucggaucc auggauaaga aguacucaau cgggcuggau aucggaacua auuccguggg 120
uugggcagug aucacggaug aauacaaagu gccguccaag aaguucaagg uccuggggaa 180
caccgauaga cacagcauca agaaaaaucu caucggagcc cugcuguuug acuccggcga 240
aaccgcagaa gcgacccggc ucaaacguac cgcgaggcga cgcuacaccc ggcggaagaa 300
ucgcaucugc uaucugcaag agaucuuuuc gaacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu 360
cuuccaccgc cuggaagaau cuuuccuggu ggaggaggac aagaagcaug aacggcaucc 420
uaucuuugga aacaucgucg acgaaguggc guaccacgaa aaguacccga ccaucuacca 480
ucugcggaag aaguugguug acucaacuga caaggccgac cucagauuga ucuacuuggc 540
ccucgcccau augaucaaau uccgcggaca cuuccugauc gaaggcgauc ugaacccuga 600
uaacuccgac guggauaagc uuuucauuca acuggugcag accuacaacc aacuguucga 660
agaaaaccca aucaaugcua gcggcgucga ugccaaggcc auccuguccg cccggcuguc 720
gaagucgcgg cgccucgaaa accugaucgc acagcugccg ggagagaaaa agaacggacu 780
uuucggcaac uugaucgcuc ucucacuggg acucacuccc aauuucaagu ccaauuuuga 840
ccuggccgag gacgcgaagc ugcaacucuc aaaggacacc uacgacgacg acuuggacaa 900
uuugcuggca caaauuggcg aucaguacgc ggaucuguuc cuugccgcua agaaccuuuc 960
ggacgcaauc uugcuguccg auauccugcg cgugaacacc gaaauaacca aagcgccgcu 1020
uagcgccucg augauuaagc gguacgacga gcaucaccag gaucucacgc ugcucaaagc 1080
gcucgugaga cagcaacugc cugaaaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa 1140
uggguacgca ggguacaucg auggaggcgc uagccaggaa gaguucuaua aguucaucaa 1200
gccaauccug gaaaagaugg acggaaccga agaacugcug gucaagcuga acagggagga 1260
ucugcuccgg aaacagagaa ccuuugacaa cggauccauu ccccaccaga uccaucuggg 1320
ugagcugcac gccaucuugc ggcgccagga ggacuuuuac ccauuccuca aggacaaccg 1380
ggaaaagauc gagaaaauuc ugacguuccg caucccguau uacgugggcc cacuggcgcg 1440
cggcaauucg cgcuucgcgu ggaugacuag aaaaucagag gaaaccauca cuccuuggaa 1500
uuucgaggaa guuguggaua agggagcuuc ggcacaaagc uucaucgaac gaaugaccaa 1560
cuucgacaag aaucucccaa acgagaaggu gcuuccuaag cacagccucc uuuacgaaua 1620
cuucacuguc uacaacgaac ugacuaaagu gaaauacguu acugaaggaa ugaggaagcc 1680
ggccuuucug uccggagaac agaagaaagc aauugucgau cugcuguuca agaccaaccg 1740
caaggugacc gucaagcagc uuaaagagga cuacuucaag aagaucgagu guuucgacuc 1800
aguggaaauc agcggggugg aggacagauu caacgcuucg cugggaaccu aucaugaucu 1860
ccugaagauc aucaaggaca aggacuuccu ugacaacgag gagaacgagg acauccugga 1920
agauaucguc cugaccuuga cccuuuucga ggaucgcgag augaucgagg agaggcuuaa 1980
gaccuacgcu caucucuucg acgauaaggu caugaaacaa cucaagcgcc gccgguacac 2040
ugguuggggc cgccucuccc gcaagcugau caacgguauu cgcgauaaac agagcgguaa 2100
aacuauccug gauuuccuca aaucggaugg cuucgcuaau cguaacuuca ugcaauugau 2160
ccacgacgac agccugaccu uuaaggagga cauccaaaaa gcacaagugu ccggacaggg 2220
agacucacuc caugaacaca ucgcgaaucu ggccgguucg ccggcgauua agaagggaau 2280
ucugcaaacu gugaaggugg ucgacgagcu ggugaagguc augggacggc acaaaccgga 2340
gaauaucgug auugaaaugg cccgagaaaa ccagacuacc cagaagggcc agaaaaacuc 2400
ccgcgaaagg augaagcgga ucgaagaagg aaucaaggag cugggcagcc agauccugaa 2460
agagcacccg guggaaaaca cgcagcugca gaacgagaag cucuaccugu acuauuugca 2520
aaauggacgg gacauguacg uggaccaaga gcuggacauc aaucgguugu cugauuacga 2580
cguggaccac aucguuccac aguccuuucu gaaggaugac ucgaucgaua acaagguguu 2640
gacucgcagc gacaagaaca gagggaaguc agauaaugug ccaucggagg aggucgugaa 2700
gaagaugaag aauuacuggc ggcagcuccu gaaugcgaag cugauuaccc agagaaaguu 2760
ugacaaucuc acuaaagccg agcgcggcgg acucucagag cuggauaagg cuggauucau 2820
caaacggcag cuggucgaga cucggcagau uaccaagcac guggcgcaga ucuuggacuc 2880
ccgcaugaac acuaaauacg acgagaacga uaagcucauc cgggaaguga aggugauuac 2940
ccugaaaagc aaacuugugu cggacuuucg gaaggacuuu caguuuuaca aagugagaga 3000
aaucaacaac uaccaucacg cgcaugacgc auaccucaac gcuguggucg guaccgcccu 3060
gaucaaaaag uacccuaaac uugaaucgga guuuguguac ggagacuaca aggucuacga 3120
cgugaggaag augauagcca aguccgaaca ggaaaucggg aaagcaacug cgaaauacuu 3180
cuuuuacuca aacaucauga acuuuuucaa gacugaaauu acgcuggcca auggagaaau 3240
caggaagagg ccacugaucg aaacuaacgg agaaacgggc gaaaucgugu gggacaaggg 3300
cagggacuuc gcaacuguuc gcaaagugcu cucuaugccg caagucaaua uugugaagaa 3360
aaccgaagug caaaccggcg gauuuucaaa ggaaucgauc cucccaaaga gaaauagcga 3420
caagcucauu gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc 3480
gacugucgca uacuccgucc ucgugguggc caagguggag aagggaaaga gcaaaaagcu 3540
caaauccguc aaagagcugc uggggauuac caucauggaa cgauccucgu ucgagaagaa 3600
cccgauugau uuccucgagg cgaaggguua caaggaggug aagaaggauc ugaucaucaa 3660
acuccccaag uacucacugu ucgaacugga aaauggucgg aagcgcaugc uggcuucggc 3720
cggagaacuc caaaaaggaa augagcuggc cuugccuagc aaguacguca acuuccucua 3780
ucuugcuucg cacuacgaaa aacucaaagg gucaccggaa gauaacgaac agaagcagcu 3840
uuucguggag cagcacaagc auuaucugga ugaaaucauc gaacaaaucu ccgaguuuuc 3900
aaagcgcgug auccucgccg acgccaaccu cgacaaaguc cugucggccu acaauaagca 3960
uagagauaag ccgaucagag aacaggccga gaacauuauc cacuuguuca cccugacuaa 4020
ccugggagcc ccagccgccu ucaaguacuu cgauacuacu aucgaucgca aaagauacac 4080
guccaccaag gaaguucugg acgcgacccu gauccaccaa agcaucacug gacucuacga 4140
aacuaggauc gaucugucgc agcugggugg cgauggcggu ggaucuccga aaaagaagag 4200
aaagguguaa ugagcuagcc aucacauuua aaagcaucuc agccuaccau gagaauaaga 4260
gaaagaaaau gaagaucaau agcuuauuca ucucuuuuuc uuuuucguug guguaaagcc 4320
aacacccugu cuaaaaaaca uaaauuucuu uaaucauuuu gccucuuuuc ucugugcuuc 4380
aauuaauaaa aaauggaaag aaccucgaga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4500
aaaaaaaaau cuag 4514
<210> 360
<211> 4603
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: mRNA transcript"
<400> 360
gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60
auucggaucc auggauaaga aguacucaau cgggcuggau aucggaacua auuccguggg 120
uugggcagug aucacggaug aauacaaagu gccguccaag aaguucaagg uccuggggaa 180
caccgauaga cacagcauca agaaaaaucu caucggagcc cugcuguuug acuccggcga 240
aaccgcagaa gcgacccggc ucaaacguac cgcgaggcga cgcuacaccc ggcggaagaa 300
ucgcaucugc uaucugcaag agaucuuuuc gaacgaaaug gcaaaggucg acgacagcuu 360
cuuccaccgc cuggaagaau cuuuccuggu ggaggaggac aagaagcaug aacggcaucc 420
uaucuuugga aacaucgucg acgaaguggc guaccacgaa aaguacccga ccaucuacca 480
ucugcggaag aaguugguug acucaacuga caaggccgac cucagauuga ucuacuuggc 540
ccucgcccau augaucaaau uccgcggaca cuuccugauc gaaggcgauc ugaacccuga 600
uaacuccgac guggauaagc uuuucauuca acuggugcag accuacaacc aacuguucga 660
agaaaaccca aucaaugcua gcggcgucga ugccaaggcc auccuguccg cccggcuguc 720
gaagucgcgg cgccucgaaa accugaucgc acagcugccg ggagagaaaa agaacggacu 780
uuucggcaac uugaucgcuc ucucacuggg acucacuccc aauuucaagu ccaauuuuga 840
ccuggccgag gacgcgaagc ugcaacucuc aaaggacacc uacgacgacg acuuggacaa 900
uuugcuggca caaauuggcg aucaguacgc ggaucuguuc cuugccgcua agaaccuuuc 960
ggacgcaauc uugcuguccg auauccugcg cgugaacacc gaaauaacca aagcgccgcu 1020
uagcgccucg augauuaagc gguacgacga gcaucaccag gaucucacgc ugcucaaagc 1080
gcucgugaga cagcaacugc cugaaaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa 1140
uggguacgca ggguacaucg auggaggcgc uagccaggaa gaguucuaua aguucaucaa 1200
gccaauccug gaaaagaugg acggaaccga agaacugcug gucaagcuga acagggagga 1260
ucugcuccgg aaacagagaa ccuuugacaa cggauccauu ccccaccaga uccaucuggg 1320
ugagcugcac gccaucuugc ggcgccagga ggacuuuuac ccauuccuca aggacaaccg 1380
ggaaaagauc gagaaaauuc ugacguuccg caucccguau uacgugggcc cacuggcgcg 1440
cggcaauucg cgcuucgcgu ggaugacuag aaaaucagag gaaaccauca cuccuuggaa 1500
uuucgaggaa guuguggaua agggagcuuc ggcacaaagc uucaucgaac gaaugaccaa 1560
cuucgacaag aaucucccaa acgagaaggu gcuuccuaag cacagccucc uuuacgaaua 1620
cuucacuguc uacaacgaac ugacuaaagu gaaauacguu acugaaggaa ugaggaagcc 1680
ggccuuucug uccggagaac agaagaaagc aauugucgau cugcuguuca agaccaaccg 1740
caaggugacc gucaagcagc uuaaagagga cuacuucaag aagaucgagu guuucgacuc 1800
aguggaaauc agcggggugg aggacagauu caacgcuucg cugggaaccu aucaugaucu 1860
ccugaagauc aucaaggaca aggacuuccu ugacaacgag gagaacgagg acauccugga 1920
agauaucguc cugaccuuga cccuuuucga ggaucgcgag augaucgagg agaggcuuaa 1980
gaccuacgcu caucucuucg acgauaaggu caugaaacaa cucaagcgcc gccgguacac 2040
ugguuggggc cgccucuccc gcaagcugau caacgguauu cgcgauaaac agagcgguaa 2100
aacuauccug gauuuccuca aaucggaugg cuucgcuaau cguaacuuca ugcaauugau 2160
ccacgacgac agccugaccu uuaaggagga cauccaaaaa gcacaagugu ccggacaggg 2220
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ucugcaaacu gugaaggugg ucgacgagcu ggugaagguc augggacggc acaaaccgga 2340
gaauaucgug auugaaaugg cccgagaaaa ccagacuacc cagaagggcc agaaaaacuc 2400
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cgugaggaag augauagcca aguccgaaca ggaaaucggg aaagcaacug cgaaauacuu 3180
cuuuuacuca aacaucauga acuuuuucaa gacugaaauu acgcuggcca auggagaaau 3240
caggaagagg ccacugaucg aaacuaacgg agaaacgggc gaaaucgugu gggacaaggg 3300
cagggacuuc gcaacuguuc gcaaagugcu cucuaugccg caagucaaua uugugaagaa 3360
aaccgaagug caaaccggcg gauuuucaaa ggaaucgauc cucccaaaga gaaauagcga 3420
caagcucauu gcacgcaaga aagacuggga cccgaagaag uacggaggau ucgauucgcc 3480
gacugucgca uacuccgucc ucgugguggc caagguggag aagggaaaga gcaaaaagcu 3540
caaauccguc aaagagcugc uggggauuac caucauggaa cgauccucgu ucgagaagaa 3600
cccgauugau uuccucgagg cgaaggguua caaggaggug aagaaggauc ugaucaucaa 3660
acuccccaag uacucacugu ucgaacugga aaauggucgg aagcgcaugc uggcuucggc 3720
cggagaacuc caaaaaggaa augagcuggc cuugccuagc aaguacguca acuuccucua 3780
ucuugcuucg cacuacgaaa aacucaaagg gucaccggaa gauaacgaac agaagcagcu 3840
uuucguggag cagcacaagc auuaucugga ugaaaucauc gaacaaaucu ccgaguuuuc 3900
aaagcgcgug auccucgccg acgccaaccu cgacaaaguc cugucggccu acaauaagca 3960
uagagauaag ccgaucagag aacaggccga gaacauuauc cacuuguuca cccugacuaa 4020
ccugggagcc ccagccgccu ucaaguacuu cgauacuacu aucgaucgca aaagauacac 4080
guccaccaag gaaguucugg acgcgacccu gauccaccaa agcaucacug gacucuacga 4140
aacuaggauc gaucugucgc agcugggugg cgauggcucg gcuuacccau acgacgugcc 4200
ugacuacgcc ucgcucggau cgggcucccc caaaaagaaa cggaaggugg acggaucccc 4260
gaaaaagaag agaaaggugg acuccggaug agaauuaugc agucuagcca ucacauuuaa 4320
aagcaucuca gccuaccaug agaauaagag aaagaaaaug aagaucaaua gcuuauucau 4380
cucuuuuucu uuuucguugg uguaaagcca acacccuguc uaaaaaacau aaauuucuuu 4440
aaucauuuug ccucuuuucu cugugcuuca auuaauaaaa aauggaaaga accucgagaa 4500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaauc uag 4603
Claims (216)
- 상부 스템 영역, 헤어핀 1 영역 및 헤어핀 2 영역을 포함하고,
(i) (a) 상부 스템 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형 및
(b) 헤어핀 2 영역의 각각의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형; 및
(ii) 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 7개의 뉴클레오타이드 내에 적어도 2개의 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함하는 5' 단부 변형
을 포함하는, 단일 가이드 RNA(sgRNA). - 제1항에 있어서, 헤어핀 1 영역에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형을 포함하는 하부 스템 영역을 추가로 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형을 포함하는 3' 말단 영역을 추가로 포함하며, 선택적으로 3' 말단 영역에서의 하나 이상의 변형이 3' 단부 변형인 sgRNA.
- 제4항에 있어서, 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 적어도 2개가, 선택적으로 2'-O-Me, 2'-F, 또는 2'-O-moe 변형으로 변형된 sgRNA.
- 제4항에 있어서, 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 추가로 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형을 포함하는 팽출(bulge) 영역 및 하나 이상의 변형을 포함하는 연결(nexus) 영역 중 하나 이상을 추가로 포함하는 sgRNA.
- 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 변형이 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드, 및 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트(PS) 결합 중 하나 이상을 포함하는 sgRNA.
- 제4항에 있어서, 적어도 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 변형된 sgRNA.
- 제9항에 있어서, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 4개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트(PS) 결합으로 연결되고, 선택적으로 5' 단부, 3' 단부, 또는 둘 다에서 2'-O-Me 또는 2'-F 변형을 추가로 포함하는 sgRNA.
- 제9항에 있어서, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 4개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me 변형을 포함하는 sgRNA.
- 제9항에 있어서, 5' 말단에서의 첫 4개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 연결되고, 5' 말단에서의 첫 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me, 2'-F 또는 2'-O-moe 변형 중 하나 이상을 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서, (1) sgRNA가 하부 스템 영역을 포함하고, 하부 스템 영역이 5'에서 3'으로 뉴클레오타이드 LS1 내지 LS12를 포함하고, LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 또는 LS12 중 하나 이상이 2'-O-Me로 변형되거나; (2) sgRNA가 팽출(bulge) 영역을 포함하고, 팽출 영역내 각각의 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형되거나; 또는 (3) 팽출 영역내 뉴클레오타이드 중 적어도 50%가 2'-O-Me로 변형된 sgRNA.
- 제1항에 있어서, sgRNA가 연결(nexus) 영역을 포함하고, 연결 영역이 5' 에서 3'으로 뉴클레오타이드 N1 내지 N18을 포함하고, 연결 영역내 N16, N17 또는 N18 중 하나 이상이 2'-O-Me로 변형되거나, 또는 연결 영역내 N15, N16, N17 또는 N18 중 하나 이상이 변형된 sgRNA.
- 제14항에 있어서, 연결 영역내 변형이 2'-O-Me 및 2'F로부터 선택되는 sgRNA.
- 제4항에 있어서,
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 3개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드;
b. 헤어핀 1 영역에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드; 및
c. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드
를 포함하는 sgRNA. - 제16항에 있어서, 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 포스포로티오에이트(PS) 결합 및 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드를 연결하는 3개의 PS 결합을 추가로 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서,
GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 356)를 포함하고,
여기서 *는 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 다음 뉴클레오타이드에 연결된 것을 나타내고, 소문자 "m"은 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된 것을 나타내고, N은 임의의 뉴클레오타이드인 sgRNA. - 제1항에 있어서,
mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO: 358)를 포함하고,
여기서 *는 뉴클레오타이드가 PS 결합으로 다음 뉴클레오타이드에 연결된 것을 나타내고, 소문자 "m"은 뉴클레오타이드가 2'-O-Me로 변형된 것을 나타내고, N은 임의의 뉴클레오타이드인 sgRNA. - 제1항에 있어서, S. 파이오제네스(S. Pyogenes) Cas9와의 리보핵단백질 복합체를 형성하는 sgRNA.
- 제4항에 있어서, 헤어핀 2 영역의 첫 뉴클레오타이드에서 시작하는 각각의 뉴클레오타이드 내지 3' 말단의 마지막 뉴클레오타이드에서의 2'-O-Me 변형을 포함하는 sgRNA.
- 제1항에 있어서, SEQ ID NO: 357의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 sgRNA.
- 제4항에 있어서,
a. 5' 말단의 5' 단부에서의 첫 3개의 뉴클레오타이드;
b. 헤어핀 1 영역의 각각의 뉴클레오타이드;
c. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 뉴클레오타이드; 및
d. 3' 말단의 3' 단부에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드
에서의 2'-O-Me 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA. - 지질 나노입자(LNP)와 연관된, 제1항의 sgRNA를 포함하는 조성물.
- 제1항의 sgRNA 및 뉴클레아제 또는 뉴클레아제를 코딩하는 mRNA를 포함하는 조성물이며, 선택적으로 상기 뉴클레아제는 Cas 단백질이고, 선택적으로 상기 Cas 단백질은 Cas9, 선택적으로 S. 파이오제네스 Cas9이거나, 또는 선택적으로 상기 뉴클레아제는 니카아제 또는 변형된 뉴클레아제이고, 선택적으로 상기 변형된 뉴클레아제는 핵 국재화 신호(NLS)를 포함하는 조성물.
- 세포에 제1항의 sgRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산을 전달하는 것을 포함하는, 표적 DNA를 변형시키는 시험관내 방법.
- 세포에서 표적 DNA를 변형하는 데 사용하기 위한 제1항의 sgRNA를 포함하는 조성물.
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| WO2017004279A2 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same |
| JP7067793B2 (ja) | 2015-10-23 | 2022-05-16 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸塩基編集因子およびその使用 |
| WO2017136794A1 (en) | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
| US10767175B2 (en) * | 2016-06-08 | 2020-09-08 | Agilent Technologies, Inc. | High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs |
| GB2568182A (en) | 2016-08-03 | 2019-05-08 | Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
| EP3497214B1 (en) | 2016-08-09 | 2023-06-28 | President and Fellows of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
| WO2018039438A1 (en) | 2016-08-24 | 2018-03-01 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
| GB2573062A (en) | 2016-10-14 | 2019-10-23 | Harvard College | AAV delivery of nucleobase editors |
| JP7383478B2 (ja) * | 2016-12-22 | 2023-11-20 | インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド | アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物および方法 |
| US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
| BR112019014841A2 (pt) | 2017-01-23 | 2020-04-28 | Regeneron Pharma | rna guia, uso do rna guia, rna antissentido, sirna ou shrna, uso do rna antissentido, do sirna ou do shrna, ácido nucleico isolado, vetor, composição, célula, e, métodos para modificar um gene hsd17b13 em uma célula, para diminuir a expressão de um gene hsd17b13 em uma célula, para modificar uma célula e para tratar um indivíduo que não é portador da variante de hsd17b13 |
| EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
| US11542496B2 (en) | 2017-03-10 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
| US11268082B2 (en) | 2017-03-23 | 2022-03-08 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins |
| EP3610029A1 (en) | 2017-04-11 | 2020-02-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Assays for screening activity of modulators of members of the hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase (hsd17b) family |
| WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
| US11866726B2 (en) | 2017-07-14 | 2024-01-09 | Editas Medicine, Inc. | Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites |
| CN111801345A (zh) | 2017-07-28 | 2020-10-20 | 哈佛大学的校长及成员们 | 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物 |
| EP3585160A2 (en) | 2017-07-31 | 2020-01-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr reporter non-human animals and uses thereof |
| JP7359753B2 (ja) | 2017-07-31 | 2023-10-11 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Ｃａｓトランスジェニックマウスの胚性幹細胞およびマウスならびにその使用 |
| WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
| CN111163633B (zh) | 2017-09-29 | 2022-09-09 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化ttr基因座的非人类动物及其使用方法 |
| NZ762942A (en) | 2017-09-29 | 2024-10-25 | Intellia Therapeutics Inc | Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis |
| SG11202003254SA (en) | 2017-10-11 | 2020-05-28 | Regeneron Pharma | Inhibition of hsd17b13 in the treatment of liver disease in patients expressing the pnpla3 i148m variation |
| EP3697906A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
| WO2019147743A1 (en) * | 2018-01-26 | 2019-08-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
| EP3592140A1 (en) | 2018-03-19 | 2020-01-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems |
| KR20210023831A (ko) | 2018-05-11 | 2021-03-04 | 빔 테라퓨틱스, 인크. | 프로그래밍가능한 염기 편집기 시스템을 이용하여 병원성 아미노산을 치환하는 방법 |
| EP3797160A1 (en) | 2018-05-23 | 2021-03-31 | The Broad Institute Inc. | Base editors and uses thereof |
| TW202020156A (zh) | 2018-07-31 | 2020-06-01 | 美商英特利亞醫療公司 | 用於治療原發性高草酸尿症第1型(ph1)之羥酸氧化酶1(hao1)基因編輯之組合物及方法 |
| US20210348177A1 (en) | 2018-09-05 | 2021-11-11 | The Regents Of The University Of California | Generation of heritably gene-edited plants without tissue culture |
| MX2021003457A (es) | 2018-09-28 | 2021-07-16 | Intellia Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para la edición génica de lactato deshidrogenasa (ldha). |
| JP2022512703A (ja) | 2018-10-16 | 2022-02-07 | インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド | 免疫療法のための組成物および方法 |
| CN113260701A (zh) | 2018-10-18 | 2021-08-13 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 用于表达因子ix的组合物和方法 |
| CN114207130A (zh) | 2018-10-18 | 2022-03-18 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 用于从白蛋白基因座进行转基因表达的组合物和方法 |
| CN113195721A (zh) | 2018-10-18 | 2021-07-30 | 英特利亚治疗股份有限公司 | 治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物和方法 |
| WO2020191248A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Method and compositions for editing nucleotide sequences |
| AU2020256225B2 (en) | 2019-04-03 | 2025-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus |
| CA3133359C (en) | 2019-04-04 | 2023-04-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
| AU2020253532B2 (en) | 2019-04-04 | 2024-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized coagulation factor 12 locus |
| US20230165976A1 (en) | 2019-04-10 | 2023-06-01 | University Of Utah Research Foundation | Htra1 modulation for treatment of amd |
| JPWO2020241679A1 (ko) * | 2019-05-30 | 2020-12-03 | ||
| CN113874510A (zh) | 2019-06-04 | 2021-12-31 | 瑞泽恩制药公司 | 包括具有β滑移突变的人源化TTR基因座的非人动物和使用方法 |
| BR112021022722A2 (pt) | 2019-06-07 | 2022-01-04 | Regeneron Pharma | Animal não humano, célula de animal não humana, genoma de animal não humano, gene de albumina animal não humana humanizada, vetor de alvejamento, método de avaliação da atividade de um reagente, e, método de otimização da atividade de um reagente |
| EP4028063A1 (en) | 2019-09-13 | 2022-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Transcription modulation in animals using crispr/cas systems delivered by lipid nanoparticles |
| KR20220097414A (ko) | 2019-11-08 | 2022-07-07 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | X-연관 연소 망막층간분리 치료법을 위한 crispr 및 aav 전략 |
| WO2021108363A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele |
| KR20220126725A (ko) * | 2019-12-11 | 2022-09-16 | 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. | 유전자 편집을 위한 변형된 가이드 rna |
| CA3174486A1 (en) | 2020-03-04 | 2021-09-10 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Methods and compositions for modulating a genome |
| WO2021195079A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use |
| EP4132591A4 (en) * | 2020-04-09 | 2024-04-24 | Verve Therapeutics, Inc. | BASE EDITING OF PCSK9 AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING DISEASES |
| EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
| CN112111507B (zh) * | 2020-08-10 | 2022-08-23 | 江苏大学 | 一种灰树花CRISPR-Cas9基因编辑系统、方法及应用 |
| KR102493512B1 (ko) * | 2020-10-08 | 2023-02-01 | 주식회사 진코어 | CRISPR/Cas12a 시스템을 위한 엔지니어링 된 crRNA |
| WO2022125982A1 (en) | 2020-12-11 | 2022-06-16 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for reducing mhc class ii in a cell |
| CA3205000A1 (en) | 2020-12-11 | 2022-06-16 | Intellia Therapeutics, Inc. | Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination |
| MX2023007466A (es) | 2020-12-23 | 2023-08-18 | Intellia Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para reducir los hla-a en una célula. |
| TW202242101A (zh) | 2020-12-23 | 2022-11-01 | 美商英特利亞醫療公司 | 用於細胞中基因修飾ciita之組合物及方法 |
| WO2022147133A1 (en) | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Intellia Therapeutics, Inc. | Engineered t cells |
| US12171813B2 (en) | 2021-02-05 | 2024-12-24 | Christiana Care Gene Editing Institute, Inc. | Methods of and compositions for reducing gene expression and/or activity |
| EP4288088A2 (en) | 2021-02-08 | 2023-12-13 | Intellia Therapeutics, Inc. | Lymphocyte activation gene 3 (lag3) compositions and methods for immunotherapy |
| CN117098840A (zh) | 2021-02-08 | 2023-11-21 | 因特利亚治疗公司 | 用于免疫疗法的自然杀伤细胞受体2b4组合物和方法 |
| CN117042794A (zh) | 2021-02-08 | 2023-11-10 | 因特利亚治疗公司 | 用于免疫疗法的t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(tim3)组合物和方法 |
| KR102689529B1 (ko) * | 2021-06-28 | 2024-07-29 | 서울대학교산학협력단 | sgRNA와 dCas9 간의 결합을 조절하여 박테리아에서 유전자 발현을 정량적으로 조절할 수 있는 방법 |
| CN117940153A (zh) | 2021-08-24 | 2024-04-26 | 因特利亚治疗公司 | 用于基于细胞的疗法的程序性细胞死亡蛋白1(pd1)组合物和方法 |
| MX2024002927A (es) | 2021-09-08 | 2024-05-29 | Flagship Pioneering Innovations Vi Llc | Metodos y composiciones para modular un genoma. |
| KR20240083183A (ko) | 2021-09-20 | 2024-06-11 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인히빈 서브유닛 베타 e (inhbe) 조절제 조성물 및 이의 이용 방법 |
| US20230105319A1 (en) * | 2021-09-24 | 2023-04-06 | Crispr Therapeutics Ag | PRODRUG INCORPORATED sgRNA SYNTHESIS |
| WO2023077053A2 (en) | 2021-10-28 | 2023-05-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr/cas-related methods and compositions for knocking out c5 |
| KR20240114295A (ko) * | 2021-11-03 | 2024-07-23 | 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. | 유전자 편집을 위한 변형된 가이드 rna |
| JP2024540723A (ja) | 2021-11-03 | 2024-11-01 | インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド | 免疫療法のためのｃｄ３８組成物及び方法 |
| IL312971A (en) | 2021-12-08 | 2024-07-01 | Regeneron Pharma | Mutant myocilin disease model and uses thereof |
| KR20240135629A (ko) | 2022-02-02 | 2024-09-11 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 폼페병의 치료를 위한 항-TfR:GAA 및 항-CD63:GAA 삽입 |
| CN119487200A (zh) | 2022-04-29 | 2025-02-18 | 瑞泽恩制药公司 | 用于基因治疗方法的组织特异性基因外安全港的鉴定 |
| WO2023235725A2 (en) | 2022-05-31 | 2023-12-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Crispr-based therapeutics for c9orf72 repeat expansion disease |
| CN119421951A (zh) | 2022-05-31 | 2025-02-11 | 瑞泽恩制药公司 | 用于c9orf72重复序列扩增疾病的crispr干扰疗法 |
| AU2023295529A1 (en) | 2022-06-16 | 2024-12-12 | Intellia Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for genetically modifying a cell |
| CN119585419A (zh) | 2022-06-29 | 2025-03-07 | 因特利亚治疗公司 | 工程化t细胞 |
| WO2024026474A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle |
| WO2024073606A1 (en) | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Antibody resistant modified receptors to enhance cell-based therapies |
| US20240182561A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-06-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle |
| US20240173426A1 (en) | 2022-11-14 | 2024-05-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes |
| TW202426646A (zh) | 2022-12-21 | 2024-07-01 | 美商英特利亞醫療公司 | 用於前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶ｋｅｘｉｎ９（ｐｃｓｋ９）編輯之組合物及方法 |
| WO2024138115A1 (en) | 2022-12-23 | 2024-06-27 | Intellia Theraperutics, Inc. | Systems and methods for genomic editing |
| WO2024186890A1 (en) | 2023-03-06 | 2024-09-12 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for hepatitis b virus (hbv) genome editing |
| WO2024186971A1 (en) | 2023-03-07 | 2024-09-12 | Intellia Therapeutics, Inc. | Cish compositions and methods for immunotherapy |
| WO2024227047A2 (en) * | 2023-04-28 | 2024-10-31 | Beam Therapeutics Inc. | Modified guide rna |
| WO2025006963A1 (en) | 2023-06-30 | 2025-01-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for increasing homology-directed repair |
| WO2025024493A1 (en) | 2023-07-25 | 2025-01-30 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Cas endonucleases and related methods |
| US20250092426A1 (en) | 2023-07-25 | 2025-03-20 | Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc | Cas endonucleases and related methods |
| WO2025029654A2 (en) | 2023-07-28 | 2025-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of bgh-sv40l tandem polya to enhance transgene expression during unidirectional gene insertion |
| WO2025029662A1 (en) | 2023-07-28 | 2025-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-tfr: acid sphingomyelinase for treatment of acid sphingomyelinase deficiency |
| WO2025029657A2 (en) | 2023-07-28 | 2025-02-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-tfr:gaa and anti-cd63:gaa insertion for treatment of pompe disease |
| WO2025038637A1 (en) | 2023-08-14 | 2025-02-20 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2) |
| WO2025038648A1 (en) | 2023-08-14 | 2025-02-20 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for genetically modifying transforming growth factor beta receptor type 2 (tgfβr2) |
| WO2025038642A1 (en) | 2023-08-14 | 2025-02-20 | Intellia Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for genetically modifying cd70 |
| WO2025038646A1 (en) | 2023-08-14 | 2025-02-20 | Intellia Therapeutics, Inc. | Cd70 car-t compositions and methods for cell-based therapy |
| WO2025049524A1 (en) | 2023-08-28 | 2025-03-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Cxcr4 antibody-resistant modified receptors |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014152432A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | The General Hospital Corporation | Rna-guided targeting of genetic and epigenomic regulatory proteins to specific genomic loci |
| US20150376586A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-31 | Caribou Biosciences, Inc. | RNA Modification to Engineer Cas9 Activity |
| WO2016089433A1 (en) * | 2014-12-03 | 2016-06-09 | Agilent Technologies, Inc. | Guide rna with chemical modifications |
| WO2016164356A1 (en) | 2015-04-06 | 2016-10-13 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2542015T3 (es) | 2012-12-12 | 2015-07-29 | The Broad Institute, Inc. | Ingeniería de sistemas, métodos y composiciones de guía optimizadas para manipulación de secuencias |
| BR112016003561B8 (pt) * | 2013-08-22 | 2022-11-01 | Du Pont | Método para a produção de uma modificação genética, método para a introdução de um polinucleotídeo de interesse no genoma de uma planta, método para a edição de um segundo gene em um genoma de planta e método para gerar uma planta de milho resistente ao glifosato |
| WO2015200334A1 (en) * | 2014-06-23 | 2015-12-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease-mediated dna assembly |
| WO2017004279A2 (en) * | 2015-06-29 | 2017-01-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions comprising nucleic acids and methods of using the same |
| EP3159407A1 (en) * | 2015-10-23 | 2017-04-26 | Silence Therapeutics (London) Ltd | Guide rnas, methods and uses |
| WO2017136794A1 (en) * | 2016-02-03 | 2017-08-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications |
| EP3436077A1 (en) * | 2016-03-30 | 2019-02-06 | Intellia Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle formulations for crispr/cas components |
| AU2018339089A1 (en) * | 2017-09-29 | 2020-04-09 | Intellia Therapeutics, Inc. | Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing |
| CN117042794A (zh) * | 2021-02-08 | 2023-11-10 | 因特利亚治疗公司 | 用于免疫疗法的t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(tim3)组合物和方法 |
-
2017
- 2017-12-08 KR KR1020197019385A patent/KR102595683B1/ko active Active
- 2017-12-08 EP EP17826016.2A patent/EP3551757A1/en active Pending
- 2017-12-08 AU AU2017374044A patent/AU2017374044B2/en active Active
- 2017-12-08 CA CA3046376A patent/CA3046376A1/en active Pending
- 2017-12-08 JP JP2019530394A patent/JP2019536464A/ja active Pending
- 2017-12-08 CN CN201780085888.5A patent/CN110291198B/zh active Active
- 2017-12-08 SG SG10202106058WA patent/SG10202106058WA/en unknown
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- 2017-12-08 WO PCT/US2017/065306 patent/WO2018107028A1/en active Application Filing
- 2017-12-08 EA EA201991369A patent/EA201991369A1/ru unknown
- 2017-12-08 BR BR112019011509A patent/BR112019011509A2/pt unknown
- 2017-12-08 IL IL267024A patent/IL267024B2/en unknown
- 2017-12-08 TW TW106143268A patent/TWI835719B/zh active
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| US20150376586A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-31 | Caribou Biosciences, Inc. | RNA Modification to Engineer Cas9 Activity |
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