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JP7383478B2 - アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物および方法 - Google Patents

アルファ１アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物および方法 Download PDF

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Description

本出願は、２０１６年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４３８，２１９号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、当該配列表の全体が参照により本明細書に組み込まれる。前述のＡＳＣＩＩコピーは２０１７年１２月２０日に作成され、名称は２０１７－１２－２０＿０１１５５－０００５－００ＰＣＴ＿ＳＴ２５＿ｖ２．ｔｘｔであり、サイズは９２，１６５バイトである。
アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴもしくはＡ１ＡＴ）または血清トリプシン阻害剤は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子によりコードされるセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピンとも称される）の一タイプである。ＡＡＴは、主として肝細胞により合成および分泌され、肺内の好中球エラスターゼの活性を阻害するように機能する。十分な量の機能的なＡＡＴがないと、好中球エラスターゼは制御されず、肺内で肺胞を損傷する。したがって、ＡＡＴレベルの減少、または正常に機能するＡＡＴのレベルの減少をもたらすＳＥＲＰＩＮＡ１の変異は、肺の病態につながる。さらに、肝臓から出ない誤形成ＡＡＴの産生をもたらすＳＥＲＰＩＮＡ１の変異は、肝細胞内にＡＡＴが蓄積することにより、肝臓の病態につながる。このように、ＳＥＲＰＩＮＡ１変異によって生じた不十分かつ不適切に形成されたＡＡＴは、肺および肝臓の両方の病態につながる。
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子については１００種を超えるアレル多型が説明されている。概して、バリアントは、ＡＡＴの血清レベルに及ぼす効果に従って分類される。例えば、Ｍアレルは、正常な血清ＡＡＴレベルを伴う正常バリアントであり、一方ＺアレルおよびＳアレルは、ＡＡＴレベル減少を伴う突然バリアントである。ＺアレルおよびＳアレルの存在は、異常なＡＴＴの産生につながるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の突然変異によって特徴付けられる遺伝子障害、α１－アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤまたはＡ１ＡＤ）を伴う。
ＡＡＴＤには多くの形態および程度が存在する。「Ｚバリアント」が最も一般的であり、これは肝臓および肺の両方において重度の臨床的疾患を引き起こす。Ｚバリアントは、５番目のエクソンの５’末端における単一のヌクレオチド変化によって特徴付けられ、このヌクレオチド変化がアミノ酸位置３４２（Ｅ３４２Ｋ）におけるグルタミン酸からリジンへのミスセンス変異をもたらす。症状は、Ｚアレルについてホモ接合性（ＺＺ）である患者およびヘテロ接合性（ＭＺまたはＳＺ）である患者の両方において生じる。１つまたは２つのＺアレルが存在することにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１ ｍＲＮＡの不安定性、ならびに肝臓の肝細胞内のＡＡＴタンパク質の重合および凝集がもたらされる。少なくとも１つのＺアレルを有する患者は、肝臓内に凝集したＡＡＴタンパク質が蓄積することにより、肝臓癌の発生率が高まる。肝臓の病態に加えて、少なくとも１つのＺアレルによって特徴付けられるＡＡＴＤは肺病によっても特徴付けられ、これは肺胞内のＡＡＴ減少と、その結果としての好中球エラスターゼの阻害減少とによるものである。重度のＺＺ形態（すなわち、Ｚバリアントのホモ接合発現）の有病率は、北ヨーロッパの集団では１：２，０００であり、米国では１：４，５００である。
肝臓および肺の両方においてＡＡＴＤの負の効果を緩和する必要性が存在する。本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子をノックアウトすることにより、ＡＡＴＤを有する患者における肝臓症状に関連するＡＡＴの突然変異形態の産生を排除する、組成物および方法を提供する。
実施形態０１
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する方法であって、細胞に、配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡを含む組成物を送達することを含む、方法。
実施形態０２
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を送達することを含む、方法。
実施形態０３
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療する方法であって、当該治療を必要とする対象に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を投与することを含み、それによってＡＡＴＤを治療する、方法。
実施形態０４
対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積を低減または防止する方法であって、当該低減または防止を必要とする対象に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を投与することを含み、それによって肝臓内のＡＡＴ蓄積を低減する、方法。
実施形態０５
配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、組成物。
実施形態０６
配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡをコードするベクターを含む、組成物。
実施形態０７
細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）の誘発における使用のための、実施形態５または６に記載の組成物。
実施形態０８
細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の修飾における使用のための、実施形態５または６に記載の組成物。
実施形態０９
対象におけるアルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療における使用のための、実施形態５または６に記載の組成物。
実施形態１０
対象におけるＡＡＴの血清中濃度または肝臓中濃度の低減における使用のための、実施形態５または６に記載の組成物。
実施形態１１
対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積の低減または防止における使用のための、実施形態５または６に記載の組成物。
実施形態１２
当該組成物が、血清および／または肝臓のＡＡＴレベルを低減する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法、または実施形態５～１１のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
実施形態１３
血清および／または肝臓のＡＡＴレベルが、当該組成物を投与する前の血清中および／またはＡＡＴレベルと比較して、少なくとも５０％低減される、実施形態１２に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１４
血清および／またはＡＡＴレベルが、当該組成物を投与する前の血清および／またはＡＡＴレベルと比較して、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低減される、実施形態１２に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１５
当該組成物がＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の編集をもたらす、実施形態１～４または７～１４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１６
当該編集が、編集される集団のパーセンテージ（編集パーセント）として計算される、実施形態１５に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１７
当該編集パーセントが３０から９９％の間である、実施形態１６に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１８
当該編集パーセントが、３０から３５％の間、３５から４０％の間、４０から４５％の間、４５から５０％の間、５０から５５％の間、５５から６０％の間、６０から６５％の間、６５から７０％の間、７０から７５％の間、７５から８０％の間、８０から８５％の間、８５から９０％の間、９０から９５％の間、または９５から９９％の間である、実施形態１７に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１９
当該組成物が少なくとも２回投与または送達される、実施形態１～４または７～１８のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２０
当該組成物が少なくとも３回投与または送達される、実施形態１９に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２１
当該組成物が少なくとも４回投与または送達される、実施形態１９に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２２
当該組成物が５回、６回、７回、８回、９回、または１０回まで投与または送達される、実施形態１９に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２３
当該投与または送達が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日の間隔で発生する、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２４
当該投与または送達が、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、または１５週の間隔で発生する、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２５
当該投与または送達が、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、または１５ヵ月の間隔で発生する、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態２６
当該ガイド配列が配列番号５～１２９から選択される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２７
当該ガイドＲＮＡが、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内に存在する標的配列に対し少なくとも部分的に相補的である、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２８
当該標的配列がヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２、３、４、または５内にある、実施形態２７に記載の方法または組成物。
実施形態２９
当該標的配列がヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２内にある、実施形態２７に記載の方法または組成物。
実施形態３０
当該標的配列がヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン３内にある、実施形態２７に記載の方法または組成物。
実施形態３１
当該標的配列がヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン４内にある、実施形態２７に記載の方法または組成物。
実施形態３２
当該標的配列がヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン５内にある、実施形態２７に記載の方法または組成物。
実施形態３３
当該ガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１のプラス鎖内の標的配列に対し相補的である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態３４
当該ガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１のマイナス鎖内の標的配列に対し相補的である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態３５
第２のガイド配列をさらに含み、当該第１のガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のプラス鎖内の第１の標的配列に対し相補的であり、当該第２のガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１のマイナス鎖内の第２の標的配列に対し相補的である、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態３６
当該ガイドＲＮＡが、当該ガイド配列を含みかつ配列番号１４０のヌクレオチド配列をさらに含むｃｒＲＮＡを含み、当該配列番号１４０のヌクレオチドがその３’末端においてガイド配列の次に続く、実施形態１～３５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態３７
当該ガイドＲＮＡがデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）である、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態３８
当該デュアルガイドＲＮＡが、配列番号１４０のヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡであって、当該配列番号１４０のヌクレオチドがその３’末端において当該ガイド配列の次に続く、ｃｒＲＮＡと、ｔｒＲＮＡと、を含む、実施形態３７に記載の方法または組成物。
実施形態３９
当該ガイドＲＮＡがシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態４０
当該ｓｇＲＮＡが、配列番号１３０のパターンを有するガイド配列を含む、実施形態３９に記載の方法または組成物。
実施形態４１
当該ｓｇＲＮＡが配列番号１３０の配列を含む、実施形態３９に記載の方法または組成物。
実施形態４２
配列番号１３０における各Ｎが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、当該Ｎが当該ガイド配列を形成し、当該ガイド配列がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子へと標的化させる、実施形態４０または４１に記載の方法または組成物。
実施形態４３
当該ｓｇＲＮＡが、配列番号５～１２９のガイド配列のいずれか１つおよび配列番号１４０のヌクレオチドを含む、実施形態３９～４２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態４４
当該ｓｇＲＮＡが、配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態４５
配列番号１３０における各Ｎが、配列番号５～１２９から選択される配列で置き換えられる、実施形態４２に記載の方法または組成物。
実施形態４６
当該ガイドＲＮＡが少なくとも１つの修飾を含む、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態４７
当該少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４６に記載の方法または組成物。
実施形態４８
当該少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、実施形態４６または４７に記載の方法または組成物。
実施形態４９
当該少なくとも１つの修飾が、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５０
当該少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５１
当該少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、実施形態４６～５０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５２
当該少なくとも１つの修飾が、最初の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、実施形態４６～５１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５３
当該少なくとも１つの修飾が、最後の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、実施形態４６～５２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５４
当該少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４６～５３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５５
当該少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４６～５４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５６
当該ガイドＲＮＡが、配列番号１３０の当該修飾ヌクレオチドを含む、実施形態４６～５５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５７
当該組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５８
当該ガイドＲＮＡと、任意選択でＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸とが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態５９
当該ＬＮＰがＣＣＤ脂質を含む、実施形態５８に記載の方法または組成物。
実施形態６０
当該ＣＣＤ脂質が脂質Ａである、実施形態５９に記載の方法または組成物。
実施形態６１
当該ＬＮＰが中性脂質を含む、実施形態５８～６０に記載の方法または組成物。
実施形態６２
当該中性脂質がＤＳＰＣである、実施形態６１に記載の方法または組成物。
実施形態６３
当該ＬＮＰがヘルパー脂質を含む、実施形態５８～６２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態６４
当該ヘルパー脂質がコレステロールである、実施形態６３に記載の方法または組成物。
実施形態６５
当該ＬＮＰがステルス脂質を含む、実施形態５８～６４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態６６
当該ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、実施形態５８～６５に記載の方法または組成物。
実施形態６７
当該組成物がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をさらに含む、実施形態１～６６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態６８
当該組成物がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１～６７のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態６９
当該ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がＣａｓクリベースである、実施形態６７または６８に記載の方法または組成物。
実施形態７０
当該ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がＣａｓ９である、実施形態６９に記載の方法または組成物。
実施形態７１
当該ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が修飾されている、実施形態６７～７０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７２
当該ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がニッカーゼである、実施形態６７～７１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７３
当該修飾されたＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、実施形態７１または７２に記載の方法または組成物。
実施形態７４
当該ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムからのＣａｓである、実施形態６７～７３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７５
当該組成物が薬学的製剤であり、かつ薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態１～７４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態７６
当該組成物が肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）の蓄積を低減または防止する、実施形態１～４または７～７５のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態７７
当該ＡＡＴが誤形成されている、実施形態７６に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態７８
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中に変異をもたらす、実施形態１～４または７～７７のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態７９
ＮＨＥＪが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす、実施形態７８に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８０
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘発する、実施形態８０に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８１
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の少なくとも５０％のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で誘発される、実施形態８０に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８２
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の５０％～６０％、６０％～７０％、７０％もしくは８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で誘発される、実施形態８１に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８３
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも少なくとも５０倍以上ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する、実施形態７９～８２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８４
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも５０倍から１５０倍、１５０倍から５００倍、５００倍から１５００倍、１５００倍から５０００倍、５０００倍から１５０００倍、１５０００倍から３００００倍、または３００００倍から６００００倍、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する、実施形態８３に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８５
当該組成物の投与が対象内のＡＡＴレベルを低減する、実施形態１～４または７～８４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８６
当該ＡＡＴレベルが少なくとも４０％低減される、実施形態８５に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８７
当該ＡＡＴレベルが、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％もしくは８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％低減される、実施形態８６に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８８
当該ＡＡＴレベルが、血清中、血漿中、血液中、脳脊髄液中、または痰中で測定される、実施形態８６または８７に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態８９
当該ＡＡＴレベルが、肝臓中及び／または血清中で測定される、実施形態８６または８７に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９０
当該ＡＡＴレベルが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して測定される、実施形態８５～８９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９１
当該対象がＡＡＴＤを有する、実施形態１～４または７～９０のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９２
当該対象がヒトである、実施形態１～４または７～９１のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９３
当該対象がＡＡＴＤ野生型を有する、実施形態９１または９２に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９４
当該対象が遺伝性ＡＡＴＤを有する、実施形態９１または９２に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９５
当該対象がＡＡＴＤの家族歴を有する、実施形態１～４、７～９２、または９４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９６
当該対象がＡＡＴＤの肝臓症状のみを有する、または主としてＡＡＴＤの肝臓症状を有する、実施形態１～４または７～９５のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９７
当該対象が、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位におけるＺアレルについてヘテロ接合性である、実施形態１～４または７～９６のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態９８
当該対象が、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位において１つのＺアレルおよび１つのＳアレルを有する、実施形態９７に記載の方法。
実施形態９９
当該対象が、ＡＡＴのアミノ酸配列中にＥ３４２Ｋ突然変異を有しないが、野生型ＡＡＴの低減したレベルを有する、実施形態１～４または７～９８のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１００
当該対象の浮腫、腹水、もしくは黄疸が改善、安定化、もしくは緩徐化する、または肝臓移植の必要性が遅延する、実施形態１～４または７～９９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１０１
当該対象が、投与の結果として、イメージング法または肝臓酵素レベルにより測定されるように、変化の改善、安定化、もしくは緩徐化を有する、実施形態１～４または７～９９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１０２
当該組成物または薬学的製剤がウイルスベクターを介して投与される、実施形態１～４または７～１０１のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１０３
当該組成物または薬学的製剤が脂質ナノ粒子を介して投与される、実施形態１～４または７～１０２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１０４
当該対象が、当該組成物または製剤を投与する前に、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の特定の突然変異について試験される、実施形態１～４または７～１０３のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態１０５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１０９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１１９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１２９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号２９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１３９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号３９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１４９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号４９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１５９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号５９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１６９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号６９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１７９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号７９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１８９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号８９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態１９９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号９９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２００
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１００である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２０９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１０９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２１９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１１９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２０
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２０である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２１
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２２
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２３
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２４
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２５
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２６
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２７
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２８
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２２９
配列番号５～１２９から選択される当該配列が配列番号１２９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３０
配列番号１４０または１４１の配列をさらに含む、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３１
配列番号１３０の修飾パターンを含む、実施形態２３０に記載の方法または組成物。
実施形態２３２
当該配列が配列番号１３１～１３９から選択される、実施形態項１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３３
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３１である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３４
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３２である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３５
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３３である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３６
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３４である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３７
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３５である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３８
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３６である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２３９
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３７である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４０
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３８である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４１
配列番号１３１～１３９から選択される当該配列が配列番号１３９である、実施形態１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
実施形態２４２
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が、表２内のそれぞれの配列について示されている修飾を含む、請求項２３２～２４１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
実施形態２４３
ＡＡＴＤを有するヒト対象を治療するための薬剤の調製のための、実施形態５～２４１のいずれかに記載の組成物または製剤の使用。
表７内に提供されるガイド配列によって標的とされるＳＥＲＰＩＮＡ１の遺伝子の領域を含む１４番染色体の概略図を示す。 ｘ軸に示されているガイド配列を投与した後のＡＡＴの編集パーセント（編集％）および分泌ＡＡＴレベルを示す。ＣＴＧ＝ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ。 ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするある特定のガイドＲＮＡのオフターゲット解析を示す。グラフ中、三角はオン標的切断部位の識別情報を表し、白丸は潜在的なオフターゲット部位の識別情報を表す。 ＨＵＨ７細胞におけるＡＡＴ標的化ガイドのウェスタンブロット解析を示す。 ＣＲ００３２０８および対照ガイドＣＲ００１２６３のＥＬＩＳＡデータを示しており、図５ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図５ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図５Ｃはオフターゲット解析を示す。図５Ｃでは、関連する遺伝子ＳＥＲＰＩＮＡ２内で１つの潜在的なオフターゲット部位が同定され、矢印で示されている（図３も参照）。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、両方ともＣＲ００３２０８（配列番号１０７）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 ＣＲ００１４１３および対照ガイドＣＲ００１２６２のＥＬＩＳＡデータを示しており、図６ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図６ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図６Ｃはオフターゲット解析を示す。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、それぞれＣＲ００１４１３（配列番号５１）およびＧＵＵＧＡＧＧＡＡＣＡＧＧＣＣＧＵＵＧＣ（配列番号２７１）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 ＣＲ００１４００および対照ガイドＣＲ００１２６１のＥＬＩＳＡデータを示しており、図７ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図７ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図７Ｃはオフターゲット解析を示す。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、それぞれ配列番号３８およびＡＣＵＣＡＣＡＧＵＧＡＡＡＵＣＣＵＧＧＡ（配列番号２７２）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 ＣＲ００１４２７および対照ガイドＣＲ００１２６２のＥＬＩＳＡデータを示しており、８ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図８ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図８Ｃはオフターゲット解析を示す。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、両方ともＣＲ００１４２７（配列番号６５）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 ＣＲ００１３８６および対照ガイドＣＲ００１２６１のＥＬＩＳＡデータを示しており、図９ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図９ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図９Ｃはオフターゲット解析を示す。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、それぞれＣＲ００１３８６（配列番号２４）およびＧＡＡＧＣＣＧＡＡＣＵＣＡＧＣＣＡＧＧＣ（配列番号２７３）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 ＣＲ００１４０４および対照ガイドＣＲ００１２６１のＥＬＩＳＡデータを示しており、１０ＡはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴ分泌における低減パーセントを示し、図１０ＢはＨＵＨ７細胞内のＡＡＴにおける低減パーセントのウェスタンブロット（ＷＢ）解析を示し、図１０Ｃはオフターゲット解析を示す。図１０Ｃでは、１つのオフターゲット部位が同定され、矢印で示されている（図３も参照）。ヒトガイド配列、およびカニクイザルにおける対応標的配列に対し相補的な配列は、それぞれＣＲ００１４０４（配列番号４２）およびＣＡＡＣＧＵＣＡＣＧＧＡＧＡＵＵＣＣＧＧ（配列番号２７４）である。ヒトガイド配列に対し相補的な標的配列の染色体位置は表１に挙げられていることに留意されたい。 用量反応曲線（「ＤＲＣ」）における様々な濃度の様々なガイドについてのＨｅｐＧ２細胞内でのＡＡＴの編集パーセントを示す。 用量反応曲線（「ＤＲＣ」）における様々な濃度の様々なガイドについてのヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）細胞内でのＡＡＴの編集パーセントを示す。 ＳＥＲＰＩＮＡ１のヒトＰｉＺバリアントのコピーを有するトランスジェニックマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ実験の結果を示す。図１３Ａは、各群にわたるＳＥＲＰＩＮＡ１のＰｉＺバリアントのロバストな編集を示し、ビヒクル対照（ＴＳＳ）ではいかなる編集も検出されなかった。 図１３Ｂはこの同じ実験からのＥＬＩＳＡデータを示す。 一方で図１３Ｃはこの同じ実験からのウェスタンブロットデータを示す。
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいてＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を編集するために有用なガイドＲＮＡ組成物が提供される。ガイドＲＮＡは、デュアルガイドＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡの形式で、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ、例えばＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ）と共に、非野生型ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子配列を有する対象、例えば、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（「ＡＡＴＤ」または「Ａ１ＡＤ」）を有する対象などに投与してもよい。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を標的とするガイド配列を表１内に配列番号５～１２９において示す。本明細書に記載の実験で使用された対照ガイドを配列番号１～４において示す。
上記のガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡを形成するために追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、その３’末端においてガイド配列に続いて以下の例示的なヌクレオチド配列：ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１４０）を有する。ｓｇＲＮＡの場合、上記のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するために追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続いて以下の例示的なヌクレオチド配列：
ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１４１）を５’から３’の方向に有する。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは修飾されている。一部の実施形態において、修飾ｓｇＲＮＡは、表２に挙げられている配列（配列番号１３０～１３９、４０８、および４１０～４２１）のうちのいずれか１つを含む。表２において、「Ｎ」は、任意の天然または非天然のヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、配列番号１３０を含む組成物が包含され、配列番号１３０内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号１３０に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１０を含む組成物が包含され、配列番号４１０内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１０に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１１を含む組成物が包含され、配列番号４１１内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１１に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１２を含む組成物が包含され、配列番号４１２内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１２に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１３を含む組成物が包含され、配列番号４１３内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１３に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１４を含む組成物が包含され、配列番号４１４内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１４に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１５を含む組成物が包含され、配列番号４１５内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１５に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１６を含む組成物が包含され、配列番号４１６内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１６に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１７を含む組成物が包含され、配列番号４１７内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１７に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１８を含む組成物が包含され、配列番号４１８内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１８に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４１９を含む組成物が包含され、配列番号４１９内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４１９に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４２０を含む組成物が包含され、配列番号４２０内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４２０に示される修飾パターンは残存する。
一部の実施形態において、配列番号４２１を含む組成物が包含され、配列番号４２１内の各Ｎは集合的に配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で置き換えられ、配列番号４２１に示される修飾パターンは残存する。
別段の記載がない限り、本明細書において使用される場合、以下の用語および句は以下の意味を有することが意図されている。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、骨格に沿って共に結合している窒素含有複素環の塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含む多量体化合物を指すために本明細書で使用され、「ポリヌクレオチド」および「核酸」としては、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、およびこれらのアナログである重合体が挙げられる。核酸「骨格」は、糖－ホスホジエステル結合、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ；ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはこれらの組合せのうちの１つ以上を含む様々な結合から構成することができる。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシ置換または２’ハロゲン化物置換）を有する同様の化合物とすることができる。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、修飾ウリジン（５－メトキシウリジン、シュードウリジン、またはＮ１－メチルシュードウリジン、またはその他など））；イノシン；プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－またはアザ－プリン、デアザ－またはアザ－ピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン））、２位、６位、または８位に置換基を伴うプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、およびＯ４－アルキル－ピリミジン；米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ９３／１３１２１号）とすることができる。一般的な考察についてはＴｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２）を参照。核酸は、骨格が重合体の位置に窒素含有塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含むことができる（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの糖、塩基、および結合のみを含むことができ、あるいは従来の構成要素および置換基の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、または従来の塩基および１つ以上の塩基アナログの両方を含有する重合体）を含むことができる。核酸には「ロックド核酸」（ＬＮＡ）が含まれ、これは、ＲＮＡ模倣糖立体配座内にロックされた二環式フラノース単位と共に１つ以上のＬＮＡヌクレオチド単量体を含有するアナログであり、相補的なＲＮＡおよびＤＮＡの配列に対するハイブリダイゼーション親和性を強化する（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡおよびＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡではウラシルまたはそのアナログの存在により、またＤＮＡではチミンまたはそのアナログの存在により区別することができる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、または単に「ガイド」は、本明細書では、ｃｒＲＮＡ（別称ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（別称ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組合せのいずれかを指すために互換的に使用される。ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合してもよく、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）で会合することもできる。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」または「ガイド」は各タイプを指す。ｔｒＲＮＡは天然に存在する配列であってもよく、または天然に存在する配列と比較して修飾またはバリエーションを有するｔｒＲＮＡ配列であってもよい。
本明細書で使用される場合「ガイド配列」とは、標的配列に対し相補的であり、かつＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のためにガイドＲＮＡを標的配列へと誘導するように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」と呼ばれる場合もある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）および関連するＣａｓ９ホモログ／オーソログのためのガイドＲＮＡの場合、長さが２０個の塩基対とすることができる。これより短い配列または長い配列（例えば、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド）も、ガイドとして使用することができる。一部の実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に対し相補的である。一部の実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との間の相補性または同一性は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってもよい。一部の実施形態において、ガイド配列および標的領域は、１００％相補的または同一であってもよい。他の実施形態において、ガイド配列および標的領域は、少なくとも１つのミスマッチを含有してもよい。例えば、ガイド配列および標的配列は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含有してもよく、このとき標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の塩基対である。一部の実施形態において、ガイド配列および標的領域は、１つ～４つのミスマッチを含有してもよく、このときガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ガイド配列および標的領域は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含有してもよく、このときガイド配列は２０ヌクレオチドを含む。
Ｃａｓタンパク質のための核酸基質が２本鎖の核酸であることから、Ｃａｓタンパク質のための標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖およびマイナス鎖の両方（すなわち、所与の配列およびその配列の逆相補配列）を含む。よって、ガイド配列が「標的配列に対し相補的」であると述べられている場合、ガイド配列はガイドＲＮＡを標的配列の逆相補配列と結合するように誘導する場合があることを理解されたい。したがって、一部の実施形態において、ガイド配列が標的配列の逆相補配列に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列中のＴに対するＵの置換を除いて、標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）におけるある特定のヌクレオチドと同一である。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡの結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはこのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、かつＲＮＡの配列に依存する。ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）が含まれる。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」（「Ｃａｓタンパク質」とも呼ばれる）は、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、およびこれらの不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）を包含する。Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、そのＣｓｍ１またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、およびクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを、さらに包含する。本明細書で使用される場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合活性を有する１本鎖ポリペプチド（Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼなど）である。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、ＲＮＡガイドされたＤＮＡクリベースまたはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２ Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、およびクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が挙げられる。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａバリアント）、およびｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａバリアント）のタンパク質およびこれらの修飾物が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））はＣａｓ９に対し相同的であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．のＣｐｆ１配列は、その全体が参照により組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．の表Ｓ１およびＳ３を参照。「Ｃａｓ９」は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９、本明細書に挙げられているＣａｓ９バリアント、およびこれらの等価物を包含する。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ，１３（１１）７２２－３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照。
本明細書で使用される場合、第１の配列の第２の配列へのアラインメントにより、全体で第２の配列の位置のＸ％以上が第１の配列に一致することが示される場合、第１の配列は第２の配列「に対し少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは配列ＡＡＧに対し、第２の配列における３つ全ての位置に対する一致が存在することからアラインメントで１００％の同一性をもたらすことになるため、配列ＡＡＧＡは配列ＡＡＧに対し１００％の同一性を有する配列を含む。ＲＮＡとＤＮＡとの間の違い（概して、ウリジンからチミジンへの交換またはその逆）、および修飾ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、関連ヌクレオチド（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジン）が同じ相補物（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てに対するアデノシン；もう１つの例はシトシンおよび５－メチルシトシンであり、これらは両方とも、相補物としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の違いに寄与しない。したがって、例えば、配列５’－ＡＸＧ（Ｘは任意の修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである）は、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に対し完全に相補的であることから、ＡＵＧに対し１００％同一であるとみなされる。例示的なアラインメントアルゴリズムは、当技術分野で周知のスミス－ウォーターマンおよびニードルマン－ウンシュのアルゴリズムである。当業者は、配列の所与の対をアラインメントするのにどのアルゴリズムおよびパラメーター設定の選択が適切であるかを理解し、概して同様の長さである、予測同一性がアミノ酸については＞５０％、またはヌクレオチドについては＞７５％の配列に関しては、ＥＢＩによりｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋのｗｅｂサーバーにて提供されるニードルマン－ウンシュアルゴリズムインターフェイスのデフォルト設定を用いたニードルマン－ウンシュアルゴリズムが概して適切である。
「ｍＲＮＡ」は、ＤＮＡではないポリヌクレオチドであって、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソームおよびアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として作用することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために、本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ（例えば、２’－メトキシリボース残基）を含めたリン酸－糖骨格を含むことができる。一部の実施形態において、ｍＲＮＡリン酸－糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはこれらの組合せから本質的になる。概して、ｍＲＮＡは、大量のチミジン残基を含有しない（例えば、０個の残基、または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個より少ないチミジン残基、または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のチミジン含量）。ｍＲＮＡは、そのウリジンの位置の一部または全てに修飾ウリジンを含有することができる。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＴ」または「Ａ１ＡＴ」は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の遺伝子産物であるアルファ１アンチトリプシンを指す。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＴＤ」または「Ａ１ＡＤ」とは、アルファ１アンチトリプシン欠乏症を指す。ＡＡＴＤは、ＳＥＲＰＩＮＡ１における様々な異なる遺伝子突然変異によって引き起こされる疾患および障害を含む。ＡＡＴＤは、レベルが減少したＡＡＴが発現する疾患、ＡＡＴが発現しない疾患、または突然変異ＡＡＴもしくは機能しないＡＡＴが発現する疾患を指す場合がある。
本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物および方法において有用なガイド配列を表１に示す。
本明細書で使用される場合、「インデル」とは、核酸内の２本鎖切断（ＤＳＢ）の部位にて挿入または欠失されているある数のヌクレオチドからなる挿入／欠失の突然変異を指す。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはこの両方）の発現の減少を指す。タンパク質のノックダウンは、組織もしくは細胞集団（例えば、血清中もしくは細胞培地中の）により分泌されるタンパク質を検出することによるか、または目的の組織もしくは細胞集団からのタンパク質の総細胞量を検出することによるか、のいずれかで測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は公知であり、目的の組織または細胞集団から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングを含む。一部の実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物における発現のいくらかの損失を指す場合があり、例えば、転写されたｍＲＮＡの量の減少、または細胞集団（組織中で見いだされるようなｉｎ ｖｉｖｏ集団を含む）により発現または分泌されたタンパク質の量の減少を指すことがある。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、細胞中の特定のタンパク質における発現の損失を指す。ノックアウトは、組織もしくは細胞集団（例えば、血清中もしくは細胞培地中の）からのタンパク質分泌量を検出することによるか、または組織または細胞集団のタンパク質の総細胞量を検出することによるか、のいずれかで測定することができる。一部の実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の細胞内の（例えば、組織中で見いだされるようなｉｎ ｖｉｖｏ集団を含めた細胞集団内の）ＡＡＴを「ノックアウト」する。一部の実施形態において、ノックアウトは、（例えば、インデルにより創出された）突然変異ＡＡＴタンパク質の形成ではなく、細胞内におけるＡＡＴタンパク質発現の完全な損失である。
本明細書で使用される場合、「突然変異ＡＡＴ」は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の野生型アミノ酸配列（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２６５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７２４９）と比較したＡＡＴのアミノ酸配列の変化を有する、ＳＥＲＰＩＮＡ１の遺伝子産物（すなわち、ＡＡＴタンパク質）を指す。
本明細書で使用される場合、「突然変異ＳＥＲＰＩＮＡ１」または「突然変異ＳＥＲＰＩＮＡ１アレル」は、野生型配列（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５２６５；Ｅｎｓｅｍｂｌ：Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１９７２４９）と比較したＳＥＲＰＩＮＡ１のヌクレオチド配列の変化を有するＳＥＲＰＩＮＡ１配列を指す。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤と共にあるガイドＲＮＡを指す。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤を標的配列へとガイドし、ガイドＲＮＡは標的配列とハイブリダイゼーションし、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤は標的配列を切断する。
本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対し相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用は、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が標的配列中での結合を誘導し、かつ潜在的には（剤の活性に応じて）ニッキングまたは切断を誘導する。
本明細書で使用される場合「治療」は、対象における疾患または障害に対する治療薬の任意の投与または適用を指し、治療には、疾患の阻害、疾患発生の抑止、疾患の１つ以上の症状の軽減、疾患の治癒、または疾患の１つ以上の症状の再発防止が含まれる。例えば、ＡＡＴＤの治療は、ＡＡＴＤの症状緩和を含む場合がある。
本明細書で使用される場合、ＡＡＴの「Ｚ突然バリアント」、「Ｚ形態突然バリアント」、「Ｚバリアント」、「ＰｉＺバリアント」、または「ＺＺ形態」は、ＡＡＴのアミノ酸配列におけるグルタミン酸からリジンへのミスセンス変異（Ｅ３４２Ｋ）につながるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子配列の突然変異を指す。
「約」または「およそ」という用語は、当業者による判定で特定の値に対し許容される誤差を意味し、この誤差は、部分的には、値がどのように測定または決定されるかに依存する。
Ｉ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物であって、当該ガイドＲＮＡが、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をＳＥＲＰＩＮＡ１内の標的ＤＮＡ配列に誘導するガイド配列を含む、組成物を含む。ｇＲＮＡは、表１に示すガイド配列のうちの１つ以上を含んでもよい。表１のガイド配列は、ｃｒＲＮＡおよび／またはｔｒＲＮＡをさらに含んでもよい。本明細書に記載の各組成物および方法実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）上で会合していてもよく、または別々のＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）上にあってもよい。
本明細書に記載の組成物および方法実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは２つのＲＮＡ分子を「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として含んでもよい。ｄｇＲＮＡは、表１に記載のガイド配列のうちのいずれか１つを含むガイド配列を含む第１のＲＮＡ分子（例えば、ｃｒＲＮＡ）と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１および第２のＲＮＡ分子は、共有結合していないが、ｃｒＲＮＡの一部分とｔｒＲＮＡの一部分との間の塩基対合を介してＲＮＡデュプレックスを形成してもよい。
本明細書に記載の組成物および方法実施形態の各々において、ガイドＲＮＡは単一のＲＮＡ分子を「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」として含んでもよい。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡ（またはその一部分）へと共有結合した、表１に記載のガイド配列のうちのいずれか１つを含むｃｒＲＮＡ（またはその一部分）を含む。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合している。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの一部分とｔｒＲＮＡの一部分との間の塩基対合を介してステムループ構造を形成する。
一部の実施形態において、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからの野生型ｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部を含んでもよい。一部の実施形態では、ｔｒＲＮＡは、切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに依存する。一部の実施形態において、ｔｒＲＮＡは、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、または１００個を超えるヌクレオチドを含む、またはそれらからなる。一部の実施形態において、ｔｒＲＮＡは、ある特定の２次構造、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などの２次構造を含んでもよい。
一部の実施形態において、本発明は、配列番号５～１２９のうちのいずれか１つのガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡを含む。
一態様において、本発明は、配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む、ｇＲＮＡを含む。
他の実施形態において、組成物は、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか２つ以上から選択されるガイド配列を含む、少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、組成物は、各々が配列番号５～１２９の核酸のいずれかに対し少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む少なくとも２つのｇＲＮＡを含む。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表２に示す配列（配列番号１３０～１３９、４０８、および４１０～４２１）のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡである。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号１３０～１３９および４０８の核酸のうちのいずれかに対し少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一である配列を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、表２のｓｇＲＮＡ配列に示す配列番号１３０～１３９、４０８、および４１０～４２１における、修飾を有する、または修飾を有しないガイド配列の代わりに、表１に示すガイド配列のうちのいずれか１つを含む。
表２に示され、かつその中で配列番号により同定されている配列のいずれかの修飾を含むガイドＲＮＡが包含される。すなわち、ヌクレオチドは同じであってもよく、または異なっていてもよいが、示される修飾パターンは、表２のｇＲＮＡの修飾パターンと同じまたは同様であると考えられる。修飾パターンには、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡの領域における相対位置および修飾の同一性が含まれる。一部の実施形態において、修飾パターンは、表２の配列カラムに示す配列のうちのいずれか１つの修飾パターンに対し、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％同一である。一部の実施形態において、修飾パターンは、表２の配列またはこのような配列の領域における修飾パターンと０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドにおいて異なる。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、表２の配列の修飾と０個、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のヌクレオチドにおいて異なる修飾を含む。
本発明のガイドＲＮＡ組成物は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の標的配列を認識するように設計される。例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１標的配列は、提供されるＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤により認識および切断される場合がある。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡにより、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的配列に誘導され、ガイドＲＮＡのガイド配列は標的配列とハイブリダイゼーションし、Ｃａｓタンパク質は標的配列を切断する。
一部の実施形態において、１つ以上のガイドＲＮＡの選択は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の標的配列に基づいて決定される。
いかなる特定の理論にも拘泥するものではないが、遺伝子のクリティカルな領域における突然変異は、遺伝子の非クリティカルな領域における突然変異よりも忍容性が低いと考えられるため、ＤＳＢの位置は、結果としてもたらされるタンパク質ノックダウンまたはノックアウトの量またはタイプにおける重要な因子である。一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１内の標的配列に対し相補的なまたは相補性を有するｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の特定の位置に誘導するために使用される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１のエクソン２、３、４、または５内の標的配列に対し相補的であるか相補性を有するガイド配列を有するように設計される。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、ＡＡＴのＮ末端領域をコードするＳＥＲＰＩＮＡ１のエクソン内の標的配列に対し相補的であるか相補性を有するように設計される。
Ｂ．化学修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態において、本発明は、１つ以上の修飾を含むｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。
修飾された糖は、ヌクレオチド糖環のパッカリング（相補鎖、デュプレックス形成、およびヌクレアーゼとの相互作用に関しオリゴヌクレオチドの結合親和性に影響を及ぼす物理的特性）を制御すると考えられている。そのため、糖環上の置換は、このような糖の確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）およびパッカリングを改変する可能性がある。例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾は、オリゴヌクレオチドの結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増大させる可能性があるが、オリゴヌクレオチド内の所与の位置における任意の修飾の効果は、実験に基づいて決定する必要がある。
「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを示すために使用される場合がある。
２’－Ｏ－メチルの修飾は、以下のように表現することができる。
ヌクレオチド糖環に影響を及ぼすことが示されているもう１つの化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチドの結合親和性およびヌクレアーゼ安定性を増大させる可能性がある。
本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆで置換されたヌクレオチドを示すために使用される場合がある。
２’－Ｆの置換は、以下のように表現することができる。
一部の実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）であってもよい。２’－Ｏ－ｍｏｅ－リボヌクレオチドとしてのリボヌクレオチドの修飾は、以下のように表現することができる。
「ｍｏｅＡ」、「ｍｏｅＣ」、「ｍｏｅＵ」、または「ｍｏｅＧ」という用語は、２’－Ｏ－ｍｏｅで修飾されたヌクレオチドを示すために使用される場合がある。
ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合は、硫黄が、ホスホジエステル結合における（例えば、ヌクレオチド塩基間の結合における）１個の非架橋リン酸酸素に対し置換されている結合を指す。ホスホロチオエートがオリゴヌクレオチドの生成に使用される場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ－オリゴとも呼ばれる場合がある。
「＊」は、ＰＳ修飾を表現するために使用される場合がある。本出願において、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語は、ＰＳ結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに結合しているヌクレオチドを示すために使用される場合がある。
本出願において、「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、かつＰＳ結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに結合しているヌクレオチドを示すために使用される場合がある。
下記の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換がホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生成することを示している。
脱塩基ヌクレオチドは、窒素含有塩基を欠いたヌクレオチドを指す。下記の図は、塩基を欠いた脱塩基（別称脱プリン塩基）部位を有するオリゴヌクレオチドを表現するものである。
逆方向塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）は、正常な５’→３’結合から反転されている結合（すなわち、５’→５’結合または３’→３’結合）を有する塩基を指す。例えば、下記の通りである。
脱塩基ヌクレオチドは、逆方向結合で付着することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’→５’結合を介して末端５’ヌクレオチドに付着していてもよく、あるいは脱塩基ヌクレオチドは、３’→３’結合を介して末端３’ヌクレオチドに付着していてもよい。終端５’ヌクレオチドまたは３’ヌクレオチドのいずれかにおける逆方向脱塩基ヌクレオチドは、逆方向脱塩基エンドキャップとも呼ばれる場合がある。
一部の実施形態において、５’終端の５’末端における最初の３個、４個、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、および３’終端の３’末端における最後の３個、４個、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上は修飾されている。一部の実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、２’－Ｏ－ｍｏｅ、逆方向脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性および／もしくは性能を増大させることが当技術分野で周知である他のヌクレオチド修飾である。
一部の実施形態において、５’終端の５’末端における最初の４個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合と連結している。
一部の実施形態において、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、５’終端の５’末端における最初の３個のヌクレオチド、および３’終端の３’末端における最後の３個のヌクレオチドは、逆方向脱塩基ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは修飾ｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号１３０に示される修飾パターンを含み、ここでＮは任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、ここでＮの全体は、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）を標的配列に誘導するガイド配列を含む。一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号４１０～４２１のうちのいずれか１つに示される修飾パターンを含み、ここでＮは任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、ここでＮの全体は、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）を標的配列に誘導するガイド配列を含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１３１～１３９のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡと配列番号４０８のヌクレオチドとを含み、配列番号４０８のヌクレオチドはガイド配列の３’端部上にあり、ガイド配列は配列番号１３０に示されるように修飾されてもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つを含むｓｇＲＮＡと配列番号１４１のヌクレオチドとを含み、配列番号１４１のヌクレオチドはガイド配列の３’端部上にあり、ガイド配列は配列番号１３０に示されるように修飾されてもよい。
一部の実施形態において、本明細書で開示されているガイドＲＮＡは、２０１６年１２月８日に出願された米国特許出願第６２／４３１，７５６号、および２０１７年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ」という表題の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ１７／６５３０６号（これらの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている修飾パターンのうちの１つを含む。
Ｃ．ベクター
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのうちのいずれかを含む、ＤＮＡベクターを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、以下に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、調節配列、およびＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をコードする核酸が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、ｔｒＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡとを含む。一実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのもの（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのリピート配列の全てまたは一部分と隣接しているガイド配列を含む、またはそれからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む、またはそれからなる核酸は、天然には見いだされない核酸をｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡと共に含む、またはそれからなるベクター配列をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのベクター内で連続していない核酸によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、連続した核酸によってコードされる場合がある。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の逆ストランドによってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同じストランドによってコードされる。
Ｄ．リボ核タンパク質複合体
一部の実施形態において、表１または表２からの１つ以上のガイド配列を含む１つ以上のｇＲＮＡと、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）とを含む組成物が包含される。一部の実施形態において、Ｃａｓ９などのＤＮＡ結合剤と一緒のｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤はＣａｓタンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質と一緒のｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。一部の実施形態において、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものである。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものである。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものである。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣｐｆ１である。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムからのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９と一緒のｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。
Ｃａｓヌクレアーゼを包含する実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型システムからのものであってもよい。Ｃａｓヌクレアーゼまたは他のＲＮＰ構成要素が由来する場合がある非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、およびＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからのＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａからのＣｐｆ１タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．からのＣｐｆ１タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６からのＣｐｆ１タンパク質である。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、またＨＮＨドメインは標的ＤＮＡ鎖を切断する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、２つ以上のＲｕｖＣドメインおよび／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。組成物および方法実施形態の各々において、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける２本鎖切断を誘発する。
不活性である１つの触媒ドメイン（ＲｕｖＣまたはＨＮＨのいずれか）を有するＣａｓ９の修飾バージョンは、「ニッカーゼ」と称される。ニッカーゼは、標的ＤＮＡ上の１本の鎖のみを切断するため、１本鎖切断を創出する。１本鎖切断は、「ニック」としても知られている場合がある。一部の実施形態において、組成物および方法はニッカーゼを含む。一部の実施形態において、組成物および方法は、標的ＤＮＡにおいて２本鎖切断ではなくニックを誘発するニッカーゼＣａｓ９を含む。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、１つの機能的なヌクレアーゼドメインのみを含有するように修飾されてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが突然変異して、または完全もしくは部分的に欠失して、その核酸切断活性を低減するように修飾されてもよい。一部の実施形態において、活性が低減したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態において、不活性のＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態において、活性が低減したＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。一部の実施形態において、不活性のＨＮＨドメインを有するニッカーゼＣａｓが使用される。
一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低減または改変するために置換される。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含んでもよい。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含んでもよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、およびＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ （２０１５）を参照。
一部の実施形態において、本明細書に記載のＲＮＰ複合体は、ニッカーゼと、標的配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖に対しそれぞれ相補的である一対のガイドＲＮＡとを含む。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の逆ストランド上にニックを生成すること（すなわち、ダブルニッキング）によってＤＳＢを導入する。一部の実施形態において、ダブルニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減する場合がある。一部の実施形態において、ニッカーゼＣａｓは、標的ＤＮＡ内でダブルニックを生成するために、ＤＮＡの逆ストランドを標的とする２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用される。一部の実施形態において、ニッカーゼＣａｓは、標的ＤＮＡ内でダブルニックを生成するために、極めて近接するように選択された２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用される。
一部の実施形態において、タンパク質の１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部で置き換えられているキメラＣａｓタンパク質が使用される。一部の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼからのドメインで置き換えられていてもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、修飾ヌクレアーゼであってもよい。
他の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものであってもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体の構成要素であってもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３タンパク質であってもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものであってもよい。一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ切断活性を有してもよい。
Ｅ．ｇＲＮＡの効力の決定
一部の実施形態において、ＲＮＰの他の構成要素と共に発現したときのｇＲＮＡの効力が決定される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓと共に発現される。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、既に安定的にＣａｓを発現する細胞株中で発現される。
Ｃａｓ ＲＮＰシステムの使用は、ＤＮＡ中で２本鎖切断をもたらすことができる。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、切断末端の再ライゲーションを介しＤＮＡ中の２本鎖切断（ＤＳＢ）が修復されるプロセスであり、これにより挿入／欠失（インデル）突然変異の形態でエラーが発生する可能性がある。ＤＳＢのＤＮＡ末端はしばしば酵素処理に供されており、その結果、末端が再結合する前に、一方または両方の鎖でヌクレオチドの付加または除去がもたらされる。再結合の前のこのような付加または除去は、ＤＮＡ配列中のＮＨＥＪ修復部位における挿入または欠失（インデル）突然変異の存在をもたらす。インデルによる多くの突然変異は、リーディングフレームを改変するか、または未成熟終止コドンを導入するため、機能しないタンパク質をもたらす。
一部の実施形態において、特定のｇＲＮＡの効力は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに基づいて決定される。一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、Ｃａｓ９を安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９）である。一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ＨＵＨ７ヒト肝細胞癌細胞である。一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ｓｋ－Ｈｅｐヒト肝細胞腺癌細胞である。一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ヒト初代肝細胞である。一部の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、ＨｅｐＧ２細胞である。
一部の実施形態において、特定のガイド配列の効力は、ｇＲＮＡ選択プロセスに対する複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデルにわたって決定される。一部の実施形態において、選択されたｇＲＮＡを用いた細胞株のデータ比較が実施される。一部の実施形態において、複数の細胞モデルにおけるクロススクリーニングが実施される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの効力は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の編集パーセントによって測定される。一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１の編集パーセントは、対照遺伝子（例えば、ｇＲＮＡを標的としていない遺伝子）の編集パーセントと比較される。一部の実施形態において、対照遺伝子は、表１に示す対照１、２、３、または４である。一部の実施形態において、編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集パーセント」）は、挿入／欠失（「インデル」）または置換を伴う配列リードの総数を配列リードの総数（野生型を含む）で割ったものとして定義される。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、約１００％の編集パーセントを有する。一部の実施形態において、編集パーセントは、例えば、５から１０％の間、１０から１５％の間、１５から２０％の間、２０から２５％の間、３０から３５％の間、３５から４０％の間、４０から４５％の間、４５から５０％の間、５０から５５％の間、５５から６０％の間、６０から６５％の間、６５から７０％の間、７０から７５％の間、７５から８０％の間、８０から８５％の間、８５から９０％の間、９０から９５％の間、または９５から９９％の間である。
一部の実施形態において、本明細書に記載の方法および組成物は、オフターゲット切断における低減を有するガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態において、検出可能なオフターゲット切断は存在しない。一部の実施形態において、ヌクレオチドの欠失または挿入は、オフターゲット部位内よりも少なくとも５０倍以上ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する。一部の実施形態において、ヌクレオチドの欠失または挿入は、オフターゲット部位内よりも５０倍から１５０倍、１５０倍から５００倍、５００倍から１５００倍、１５００倍から５０００倍、５０００倍から１５０００倍、１５０００倍から３００００倍、または３００００倍から６００００倍、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの効力は、ＡＡＴの分泌によって測定される。一部の実施形態において、ＡＡＴの分泌は、培地と共に酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いて測定される。一部の実施形態において、ＡＡＴの分泌は、編集の測定に使用されるのと同じｉｎ ｖｉｔｒｏシステムで測定される。一部の実施形態において、ＡＡＴの分泌は、ヒト初代肝細胞で測定される。一部の実施形態において、ＡＡＴの分泌は、ＨＵＨ７細胞で測定される。
一部の実施形態において、細胞内のＡＡＴの量は、ｇＲＮＡの効力を測定する。一部の実施形態において、細胞内のＡＡＴの量は、ウェスタンブロットを用いて測定される。一部の実施形態において、使用する細胞はＨＵＨ７細胞である。一部の実施形態において、ＡＡＴの量は、細胞数の変化を制御するために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子の１つ）と比較される。
ＩＩ．ＡＡＴＤの治療
一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する方法であって、配列番号５～１２９のうちのいずれか１つ以上のガイド配列を含むガイドＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢを誘発するために投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与されてもよい。一部の実施形態において、投与されるガイドＲＮＡは、本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物のうちの１つ以上である。
一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾する方法であって、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾するために投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）をコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与されてもよい。
一部の実施形態において、ＡＡＴＤを治療する方法であって、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上は、ＡＡＴＤを治療するために投与される。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）をコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与されてもよい。
一部の実施形態において、対象の血清、肝臓、肝臓組織、肝臓細胞、および／または肝細胞内のＡＡＴの蓄積を低減または防止する方法であって、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡ、または配列番号１３０～１３９のｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上は、肝臓、肝臓組織、肝臓細胞、および／または肝細胞内のＡＡＴの蓄積を低減または防止するために投与される。ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９など）をコードするｍＲＮＡもしくはベクターと共に投与されてもよい。
一部の実施形態において、表１または表２のガイド配列をＣａｓタンパク質と共に含むｇＲＮＡはＤＳＢを誘発し、かつ修復中の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）はＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の突然変異をもたらす。一部の実施形態において、ＮＨＥＪは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のフレームシフト突然変異またはナンセンス突然変異を誘発するヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす。
一部の実施形態において、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）本発明のガイドＲＮＡの投与は、対象により産生された突然変異アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）のレベルを低減するため、肝臓内のＡＡＴの蓄積および凝集を防止する。
一部の実施形態において、対象は哺乳類である。一部の実施形態において、対象はヒトである。一部の実施形態において、対象は、ウシ、ブタ、サル、ヒツジ、イヌ、ネコ、魚類、または家禽類である。
一部の実施形態において、表１または表２におけるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含む（例えば、本明細書で提供される組成物中で）ガイドＲＮＡの使用は、ＡＡＴＤを有するヒト対象を治療するための薬剤の調製のために提供される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、および製剤は、静脈内投与される。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ、組成物、および製剤は、肝循環に投与される。
一部の実施形態において、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）本発明のガイドＲＮＡの単回投与は、突然変異タンパク質の発現をノックダウンするのに十分である。一部の実施形態において、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）本発明のガイドＲＮＡの単回投与は、突然変異タンパク質の発現をノックダウンまたはノックアウトするのに十分である。他の実施形態において、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）本発明のガイドＲＮＡの２回以上の投与は、累積効果を介して編集を最大化するのに有益である場合がある。
一部の実施形態において、本発明の組成物を用いた治療の効力は、送達後１年、２年、３年、４年、５年、または１０年において見られる。
一部の実施形態において、治療は、肝疾患の進行を遅くする、または停止する。一部の実施形態において、治療は、肝疾患の基準を改善する。一部の実施形態において、肝疾患は、対象における肝臓構造、肝臓機能、または症状の変化により測定される。
一部の実施形態において、治療の効力は、対象における肝臓移植を遅延させるまたは回避する能力により測定される。一部の実施形態において、治療の効力は、対象の生存期間の増加により測定される。
一部の実施形態において、治療の効力は、血液中の肝臓酵素の低減により測定される。一部の実施形態において、肝臓酵素は、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）またはアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）である。
一部の実施形態において、治療の効力は、生検結果に基づいた、肝臓内の瘢痕組織の進行の緩徐化または瘢痕組織の減少により測定される。
一部の実施形態において、治療の効力は、疲労、脱力感、掻痒、食欲不振、食欲不振、体重減少、悪心、または腹部膨満感などの患者の報告結果を用いて測定される。一部の実施形態において、治療の効力は、浮腫、腹水、または黄疸の減少により測定される。一部の実施形態において、治療の効力は、門脈圧亢進の減少により測定される。一部の実施形態において、治療の効力は、肝臓癌の比率の減少により測定される。
一部の実施形態において、治療の効力は、イメージング法を用いて測定される。一部の実施形態において、イメージング法は、超音波、コンピューター断層撮影、磁気共鳴画像、またはエラストグラフィーである。
一部の実施形態において、血清および／または肝臓のＡＡＴレベルは、組成物を投与する前の血清および／または肝臓のＡＡＴレベルと比較して、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低減される。
一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１の編集パーセントは、３０から９９％の間である。一部の実施形態において、編集パーセントは、３０から３５％の間、３５から４０％の間、４０から４５％の間、４５から５０％の間、５０から５５％の間、５５から６０％の間、６０から６５％の間、６５から７０％の間、７０から７５％の間、７５から８０％の間、８０から８５％の間、８５から９０％の間、９０から９５％の間、または９５から９９％の間である。
Ａ．併用療法
一部の実施形態において、本発明は、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）表１に開示されているガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのうちのいずれか１つ、または表２におけるｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を、ＡＡＴＤの肺の症状を緩和するのに好適な増強療法と共に含む、併用療法を含む。一部の実施形態において、肺疾患のための増強療法は、Ｔｕｒｎｅｒ，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１３ Ｄｅｃ；２７（６）：５４７－５８に記載のような、ヒト血漿から精製されたＡＡＴを用いた静脈内の療法である。一部の実施形態において、増強療法は、Ｐｒｏｌａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｚｅｍａｉｒａ（登録商標）、Ａｒａｌａｓｔ（登録商標）、またはＫａｍａｄａ（登録商標）を用いた療法である。
一部の実施形態において、併用療法は、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）表１に開示されているガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのうちのいずれか１つ、または表２におけるｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上を、ＡＴＴまたは突然変異ＡＴＴを標的とするｓｉＲＮＡと共に含む。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、野生型ＡＡＴまたは突然変異ＡＡＴの発現をさらに低減または排除する能力を有する任意のｓｉＲＮＡである。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、（例えば、本明細書で提供される組成物中にある）表１に開示されているガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むｇＲＮＡのうちのいずれか１つ、または表２におけるｓｇＲＮＡのうちのいずれか１つ以上の後に投与される。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、本明細書で提供されるｇＲＮＡのうちのいずれかを用いた治療の後に定期的に投与される。
Ｂ．ｇＲＮＡの送達
一部の実施形態において、（単独の、または１つ以上のベクター上でコードされた）本明細書に記載のガイドＲＮＡ組成物は、脂質ナノ粒子中に製剤される、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、２０１７年３月３０日に出願された「ＬＩＰＩＤ ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ」という表題の国際特許ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４９７３号を参照（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。対象にヌクレオチドを送達する能力を有することが当業者に公知である任意の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、本明細書に記載のガイドＲＮＡと共に、さらにＣａｓもしくはＣａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓもしくはＣａｓ９タンパク質それ自体のようなＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤と共に、利用されてもよい。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているｇＲＮＡであって、ＬＮＰと会合しているｇＲＮＡのうちのいずれか１つを対象に送達する方法を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはさらに、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとも会合している。
一部の実施形態において、本発明は、開示されているｇＲＮＡのうちのいずれか１つとＬＮＰとを含む組成物を含む。一部の実施形態において、組成物はさらに、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態において、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、ＣＣＤ脂質などの脂質、例えば、脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、別名３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート））、脂質Ｂ（（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノエート）、別名（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノエート））、脂質Ｃ（２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート））、または脂質Ｄ（－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノエート）を含む。一部の実施形態において、ＬＮＰは、約４．５のカチオン性脂質アミンのＲＮＡリン酸に対するモル比率（Ｎ：Ｐ）を含む。
一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、ＡＡＴＤ治療のための薬剤を調製するために使用するためのものである。一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、ＡＡＴＤを有する対象におけるＡＡＴの蓄積および凝集の低減または防止のための薬剤を調製するために使用するためのものである。一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、血清および／または肝臓のＡＡＴ濃度低減のための薬剤を調製するために使用するためのものである。一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、対象、例えば、哺乳類（例えば、ヒトなどの霊長類）におけるＡＡＴＤの治療で使用するためのものである。一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、ＡＡＴＤを有する対象、例えば、哺乳類（例えば、ヒトなどの霊長類）におけるＡＡＴの蓄積および凝集の低減または防止で使用するためのものである。一部の実施形態において、本明細書で開示されているｇＲＮＡと会合したＬＮＰは、対象、例えば、哺乳類（例えば、ヒトなどの霊長類）における血清のＡＡＴ濃度の低減で使用するためのものである。
エレクトロポレーションもカーゴの送達のための周知の手段であり、任意のエレクトロポレーション方法論が、本明細書で開示されているｇＲＮＡのうちのいずれか１つの送達に使用されてもよい。一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、本明細書で開示されているｇＲＮＡのうちのいずれか１つと、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを送達するために使用されてもよい。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているｇＲＮＡのうちのいずれか１つをｅｘ ｖｉｖｏ細胞に送達する方法であって、ｇＲＮＡがＬＮＰと会合している、またはＬＮＰと会合していない、方法を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ／ＬＮＰまたはｇＲＮＡはさらに、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ剤をコードするｍＲＮＡとも会合している。
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのいずれかをコードするＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターを含む。ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のガイド配列のうちのいずれか１つ以上をコードするＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸としては、プロモーター、エンハンサー、調節配列、およびＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（これは、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼとすることができる）をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（これは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質とすることができる）をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤（これは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質とすることができる）をコードするｍＲＮＡとを含む。一実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのもの（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）である。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡ（これは、ｓｇＲＮＡであってもよい）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのリピート配列の全てまたは一部分と隣接しているガイド配列を含む、またはそれからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを含む、またはそれからなる核酸は、天然には見いだされない核酸をｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡと共に含む、またはそれからなるベクター配列をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、１つのベクター内で連続していない核酸によってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、連続した核酸によってコードされてもよい。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の逆ストランドによってコードされる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同じストランドによってコードされる。
一部の実施形態において、ベクターは環状であってもよい。別の実施形態において、ベクターは直鎖状であってもよい。一部の実施形態において、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシドの中に封入されていてもよい。非限定的な例示的なベクターとしては、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、および発現ベクターが挙げられる。
一部の実施形態において、ベクターはウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、その野生型対応物から遺伝子組換えされてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを容易にするために、またはベクターの１つ以上の特性を変化させるように１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含んでもよい。このような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組込み、複製、転写、および翻訳が挙げられ得る。一部の実施形態において、ウイルスが大きなサイズの外来配列をパッケージングする能力を有するように、ウイルスゲノムの一部を欠失させてもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、強化された形質導入効率を有する場合がある。一部の実施形態において、宿主内でウイルスにより誘発される免疫応答が低減されてもよい。一部の実施形態において、ウイルス配列の宿主ゲノムの中への組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグラーゼ）を、ウイルスが非組込み型になるように突然変異させてもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターは複製欠損型であってもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ベクター上でのコード配列の発現を推進するための外来の転写制御配列または翻訳制御配列を含んでもよい。一部の実施形態において、ウイルスはヘルパー依存的であってもよい。例えば、ウイルスは、ベクターをウイルス粒子へと増幅およびパッケージングするのに要するウイルス構成要素（例えば、ウイルスタンパク質）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とする場合がある。このような場合、１つ以上のヘルパー構成要素（ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む）は、本明細書に記載のベクターシステムと共に宿主細胞の中へと導入され得る。他の実施形態において、ウイルスはヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、いかなるヘルパーウイルスも伴うことなくベクターの増幅およびパッケージングする能力を有する場合がある。一部の実施形態において、本明細書に記載のベクターシステムは、ウイルスの増幅およびパッケージングに必要となるウイルス構成要素のコードもする場合がある。
ウイルスベクターの非限定的な例示としては、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存的アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが挙げられる。一部の実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターであってもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶＬＫ０３である。他の実施形態において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターであってもよい。
一部の実施形態において、レンチウイルスは非組込み型であってもよい。一部の実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターであってもよい。一部の実施形態において、アデノウイルスは、高クローニング能力または「ガットレス」アデノウイルスである場合があり、そのパッケージング能力を増大させるために５’および３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）およびパッケージングシグナル（「Ｉ」）を除いた全てのウイルスコード領域がウイルスから欠失している。また他の実施形態において、ウイルスベクターはＨＳＶ－１ベクターであってもよい。一部の実施形態において、ＨＳＶ－１系ベクターはヘルパー依存的であり、他の実施形態において、当該ベクターはヘルパー非依存的である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのための構造的構成要素を有するヘルパーウイルスを要するが、非必須のウイルス機能を除去する３０ｋｂ欠失ＨＳＶ－１ベクターは、ヘルパーウイルスを要しない。追加的な実施形態において、ウイルスベクターはバクテリオファージＴ４であってもよい。一部の実施形態において、バクテリオファージＴ４は、当該ウイルスの頭部を空にした場合、任意の直鎖状または環状のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる場合がある。さらなる実施形態において、ウイルスベクターはバキュロウイルスベクターであってもよい。またさらなる実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスのベクターを使用する実施形態において、本明細書で開示されているようなベクターシステムの全ての構成要素を送達するには、２つ以上のベクターの使用が必要となる場合がある。例えば、１つのＡＡＶベクターはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする配列を含有し、一方で第２のＡＡＶベクターは１つ以上のガイド配列を含有する場合がある。
一部の実施形態において、ベクターは、細胞内での１つ以上のコード配列の発現を推進する能力を有す場合がある。一部の実施形態において、細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞であってもよい。一部の実施形態において、細胞は、真核細胞、例えば、酵母、植物、昆虫、または哺乳類の細胞であってもよい。一部の実施形態において、真核細胞は哺乳類細胞であってもよい。一部の実施形態において、真核細胞はげっ歯類細胞であってもよい。一部の実施形態において、真核細胞はヒト細胞であってもよい。異なるタイプの細胞内で発現を推進するのに好適な細胞が当技術分野において公知である。一部の実施形態において、プロモーターは野生型であってもよい。他の実施形態において、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾されてもよい。また他の実施形態において、プロモーターは、切断されてもなおその機能を保持する場合がある。例えば、プロモーターは、ベクターをウイルスの中へと適切にパッケージングするのに好適である正常なサイズまたは低減したサイズを有する場合がある。
一部の実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態において、ベクターによりコードされたヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であってもよい。一部の実施形態において、ベクターシステムは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含んでもよい。他の実施形態において、ベクターシステムは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の２つ以上のコピーを含んでもよい。一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写制御配列または翻訳制御配列に対し動作可能に結合していてもよい。一部の実施形態において、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つのプロモーターに対し動作可能に結合していてもよい。
一部の実施形態において、プロモーターは、構成的、誘発性、または組織特異的であってもよい。一部の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な構成的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、サルウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主後期プロモーター（ＭＬＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、これらの機能的断片、または前述のいずれかの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターはＣＭＶプロモーターであってもよい。一部の実施形態において、プロモーターは切断されたＣＭＶプロモーターであってもよい。他の実施形態において、プロモーターはＥＦ１ａプロモーターであってもよい。一部の実施形態において、プロモーターは誘発的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な誘発的プロモーターとしては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより誘発可能なプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、誘発的プロモーターは、基底の（誘発されていない）発現レベルが低いプロモーター、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）であってもよい。
一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓内の発現に特異的なプロモーターであってもよい。
ベクターはさらに、本明細書に記載のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態において、ベクターは、ガイドＲＮＡの２つ以上のコピーを含む。２つ以上のガイドＲＮＡを有する実施形態において、これらのガイドＲＮＡは、異なる標的配列を標的化するように同一ではなくてもよく、または同じ標的を標的化するように同一であってもよい。ベクターが２つ以上のガイドＲＮＡを含む一部の実施形態において、各ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドされたＤＮＡヌクレアーゼを有する複合体（Ｃａｓ ＲＮＰ複合体など）の中に他の異なる特性、例えば、活性または安定性などを有してもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写制御配列または翻訳制御配列（プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなど）に対し動用可能に結合していてもよい。一実施形態において、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター（例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３）またはｔＲＮＡキメラであってもよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９；Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照。一部の実施形態において、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識される場合がある。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに対し動作可能に結合していてもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターに対し動用可能に結合していてもよい。２つ以上のガイドＲＮＡを用いた実施形態において、発現の推進に使用されるプロモーターは、同じであっても異なっていてもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドと、ガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとは、同じベクター上で提供されてもよい。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドとは、同じプロモーターにより推進されてもよい。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一の転写物に転写されてもよい。例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するために単一の転写物から処理されてもよい。代替的に、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に転写されてもよい。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、同じベクター上の対応するプロモーターによって推進されてもよい。また他の実施形態において、ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードされてもよい。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む同じベクター上に位置してもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの発現、およびＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤の発現は、自らの対応するプロモーターにより推進されてもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤の発現を推進するプロモーターと同じプロモーターにより推進されてもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質転写物などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤は、単一の転写物内に収容されてもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質転写物などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあってもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは転写物の５’ＵＴＲ内にあってもよい。他の実施形態において、ガイドＲＮＡは転写物の３’ＵＴＲ内にあってもよい。一部の実施形態において、転写物の細胞内半減期は、ガイドＲＮＡを転写物の３’ＵＴＲ内に含有して、それによって３’ＵＴＲの長さを短くすることにより、低減されてもよい。追加的な実施形態において、ガイドＲＮＡは、転写物のイントロン内にあってもよい。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡが転写物から適切にスプライシングされるように、好適なスプライス部位を、内部にガイドＲＮＡが位置するイントロンに付加してもよい。一部の実施形態において、一時的に極めて近接した同じベクターからのＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤およびガイドＲＮＡの発現は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＰ複合体のより効率的な形成を容易にする場合がある。
一部の実施形態において、組成物はベクターシステムを含む。一部の実施形態において、ベクターシステムは１つの単一ベクターを含んでもよい。他の実施形態において、ベクターシステムは２つのベクターを含んでもよい。追加的な実施形態において、ベクターシステムは３つのベクターを含んでもよい。多重化のために異なるガイドＲＮＡが使用される場合、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用される場合、ベクターシステムは４つ以上のベクターを含んでもよい。
一部の実施形態において、ベクターシステムは、標的細胞に送達された後にのみ発現を開始するための誘発的プロモーターを含むことができる。非限定的な例示的な誘発的プロモーターとしては、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールにより誘発可能なプロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、誘発的プロモーターは、基底の（誘発されていない）発現レベルが低いプロモーター、例えば、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などであってもよい。
追加的な実施形態において、ベクターシステムは、特異的な組織に送達された後にのみ発現を開始するための組織特異的プロモーターを含んでもよい。
ベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞により送達されてもよい。また、ベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によっても送達されてもよい。本明細書に記載のＬＮＰおよびＬＮＰ製剤はいずれも、ガイドを単独で、またはｃａｓヌクレアーゼもしくはｃａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと一緒に送達するために好適である。一部の実施形態において、ＲＮＡ構成要素および脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物であって、脂質構成要素がアミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、およびステルス脂質を含み、かつＮ／Ｐ比率が約１～１０である、ＬＮＰ組成物が包含される。
一部の場合において、脂質構成要素は、脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、およびＰＥＧ－ＤＭＧを含み、Ｎ／Ｐ比率は約１～１０である。一部の実施形態において、脂質構成要素は、約４０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質、約５～１５ｍｏｌ％の中性脂質、および約１．５～１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、脂質構成要素の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比率は約３～１０である。一部の実施形態において、脂質構成要素は、約５０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質、約８～１０ｍｏｌ％の中性脂質、および約２．５～４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、脂質構成要素の残部はヘルパー脂質であり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比率は約３～８である。一部の場合において、脂質構成要素は、約５０～６０ｍｏｌ％のアミン脂質、約５～１５ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、および約２．５～４ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、脂質構成要素の残部はコレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比率は約３～８である。一部の場合において、脂質構成要素は、４８～５３ｍｏｌ％の脂質Ａ、約８～１０ｍｏｌ％のＤＳＰＣ、および約１．５～１０ｍｏｌ％のＰＥＧ脂質を含み、脂質構成要素の残部はコレステロールであり、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比率は約３～８±０．２である。
一部の実施形態において、ベクターは全身的に送達されてもよい。一部の実施形態において、ベクターは肝循環に送達されてもよい。
一部の実施形態において、ベクターは全身的に送達されてもよい。一部の実施形態において、ベクターは肝循環に送達されてもよい。
ＩＩＩ．ある特定の実施形態の列挙
一部の実施形態において、本発明は、配列番号５～１２９から選択されるガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む組成物を含む。一部の場合において、配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。
ガイドＲＮＡは、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内に存在する標的配列に対し、少なくとも部分的に相補的であってもよい。
ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２、３、４、または５内にある標的配列に誘導する場合がある。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２内にある標的配列に誘導する。一部の場合において、エクソン２を標的とするガイドＲＮＡは、ＣＲ００１３７０、ＣＲ００１３７３、ＣＲ００１３７４、ＣＲ００１３７６、ＣＲ００１３７９、ＣＲ００１３８０、ＣＲ００１３８６、ＣＲ００１３８６、ＣＲ００３１９６、ＣＲ００１３９１、ＣＲ００３１９８、ＣＲ００１３９５、ＣＲ００１３９７、ＣＲ００１４００、ＣＲ００１４０４、ＣＲ００１４０５、ＣＲ００３２０８、ＣＲ００１４０９、ＣＲ００１４１３、ＣＲ００１４２１、ＣＲ００１４２２、およびＣＲ００１４２７から選択される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン３内にある標的配列に誘導する。一部の場合において、エクソン３を標的とするガイドＲＮＡは、ＣＲ００１４５０、ＣＲ００３２１４、ＣＲ００１４５３、ＣＲ００１４５４、およびＣＲ００３２１７から選択される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン４内にある標的配列に誘導する。一部の場合において、エクソン４を標的とするガイドＲＮＡは、ＣＲ００３２２５およびＣＲ００３２２６から選択される。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ヌクレアーゼを、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン５内にある標的配列に誘導する。一部の場合において、エクソン５を標的とするガイドＲＮＡは、ＣＲ００１４７５およびＣＲ００１４７６から選択される。
一部の場合において、ガイドＲＮＡはデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）である。ガイドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもまたよい。
一部の実施形態において、本発明は、本明細書で開示されているガイド配列のうちのいずれか１つを含み、配列番号１４０のヌクレオチド配列をさらに含むｃｒＲＮＡであって、配列番号１４０のヌクレオチドはガイド配列の３’末端において続く、ｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、デュアルガイドＲＮＡはｔｒＲＮＡをさらに含む。
一部の実施形態において、本発明は、配列番号１３０～１３９または４０８から選択される配列を含むｓｇＲＮＡを含む。
一部の場合において、ｓｇＲＮＡは、配列番号１３０～１３９または４０８から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む。
本発明は、配列番号１３０のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡを含み、配列中、Ｎは、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、Ｎは、Ｃａｓ９をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子へと標的化させるガイド配列を集合的に形成する。
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、配列番号５～１２９のうちのいずれか１つから選択されるガイド配列を含む。
一部の実施形態において、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つおよび配列番号４０８のヌクレオチドを含むｓｇＲＮＡが提供される。
一部の実施形態において、ガイド配列は、ベクター上でコードされる。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１のプラス鎖内の標的配列に対し相補的なガイド配列を含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＡ１のマイナス鎖内の標的配列に対し相補的なガイド配列を含む。
一部の実施形態において、ガイド配列を含むガイドＲＮＡは第２のガイド配列をさらに含み、第１のガイド配列は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のプラス鎖内の第１の標的配列に対し相補的であり、第２のガイド配列は、ＳＥＲＰＩＮＡ１のマイナス鎖内の第２の標的配列に対し相補的である。
本発明のガイドＲＮＡは修飾されてもよい。一部の実施形態において、修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態において、修飾は、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾は、逆方向脱塩基ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、修飾は、５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上にある。一部の実施形態において、修飾は、３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上にある。
一部の実施形態において、修飾は、最初の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合を含む。一部の実施形態において、修飾は、最後の４個のヌクレオチド間のＰＳ結合を含む。ＰＳ修飾ガイドは、５’末端における最初の３個のヌクレオチドおよび３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む。
一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号４０８の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、記載されたガイドＲＮＡのうちのいずれかと、薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む、組成物または製剤が提供される。
一部の実施形態において、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合した、本明細書に記載のガイドＲＮＡを含む組成物が提供される。
当該組成物は、ヌクレアーゼタンパク質またはヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡさらにを含んでもよい。
一部の実施形態において、当該ヌクレアーゼはＣａｓである。一部の実施形態において、当該ＣａｓはＣａｓ９である。一部の実施形態において、当該ＣａｓはＣｐｆ１である。一部の実施形態において、当該ヌクレアーゼはニッカーゼである。一部の実施形態において、当該ヌクレアーゼは修飾されている。一部の実施形態において、修飾ヌクレアーゼは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。
一部の実施形態において、Ｃａｓは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものである。
一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する方法であって、本明細書に記載のガイドＲＮＡ、組成物、または製剤のうちのいずれか１つ以上を投与することを含む、方法が提供される。
一部の実施形態において、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾する方法であって、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸と、本明細書に記載のガイドＲＮＡ、組成物、または製剤のうちのいずれか１つ以上とを送達することを含む、方法が提供される。
一部の実施形態において、ＡＡＴＤを治療する方法であって、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸と、本明細書に記載のガイドＲＮＡ、組成物、または製剤のうちのいずれか１つ以上とを投与することを含み、それによってＡＡＴＤを治療する、方法が提供される。
一部の実施形態において、対象の肝臓内のＡＡＴ蓄積を低減または防止する方法であって、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸と、本明細書に記載のガイドＲＮＡ、組成物、または製剤のうちのいずれか１つ以上とを投与することを含み、それによって肝臓内のＡＡＴ蓄積を低減する、方法が提供される。
一部の実施形態において、肝臓細胞内でＡＴＴが低減または防止される。一部の実施形態において、肝臓細胞は肝細胞である。
一部の方法および使用実施形態において、対象はＡＡＴＤを有する。
一部の実施形態において、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢ修復中に突然変異をもたらす。一部の場合において、ＮＨＥＪはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす。一部の実施形態において、ヌクレオチドの欠失または挿入は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のフレームシフト突然変異またはナンセンス突然変異を誘発する。
一部の実施形態において、投与は、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）レベルを低減する。ＡＡＴのレベルは、血清中、血漿中、血液中、脳脊髄液中、または痰中で測定されてもよい。ＡＡＴレベルは、肝臓組織内で測定されてもよい。
一部の方法および使用実施形態において、対象はヒトである。ヒト対象は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を有する場合がある。当該対象は、ＡＡＴＤの家族歴を有する場合がある。当該対象は、ＡＡＴＤの肝臓症状および肺症状の両方を有する場合がある。当該対象は、ＡＡＴＤの肝臓症状のみ有する場合があり、または主に肝臓症状を有する場合がある。
一部の実施形態において、対象は、Ｅ３４２Ｋ突然変異を有するＡＡＴを発現する。一部の実施形態において、対象は、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位に少なくとも１つのＺアレルを有する。一部の実施形態において、対象は、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位に少なくとも１つのＳアレルを有する。一部の実施形態において、対象は、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位におけるＺアレルについてホモ接合性である。一部の実施形態において、対象は、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位におけるＺアレルについてヘテロ接合性である。一部の実施形態において、対象は、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位に１つのＺアレルおよび１つのＳアレルを有する。
対象は、ＡＡＴのアミノ酸配列中にＥ３４２Ｋ突然変異を有しない場合があるが、それでも低減したレベルの野生型ＡＡＴを有する場合がある。
一部の実施形態において、投与後、対象は、浮腫、腹水、もしくは黄疸の改善、安定化、もしくは緩徐化、または肝臓移植の必要性の遅延を有する場合がある。一部の実施形態において、投与後、対象は、投与の結果として、イメージング法または肝臓酵素レベルにより測定されるように、変化の改善、安定化、もしくは緩徐を有する。
本明細書に記載のガイド、組成物、または薬学的製剤のいずれかは、ウイルスベクターを介して投与されてもよい。
本明細書に記載のガイド、組成物、または薬学的製剤のいずれかは、脂質ナノ粒子を介して投与されてもよい。
一部の実施形態において、対象は、ガイド、組成物、または製剤を投与する前に、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の突然特定の変異について試験される。
一部の実施形態において、ＡＡＴＤを有するヒト対象を治療するための薬剤の調製のための、本明細書に記載のガイド、組成物、または製剤のいずれかの使用が包含される。
本記載および例示的な実施形態は、限定的なものとして解釈されるべきではない。本明細書および付属の請求項の目的において、別段の指示がない限り、本明細書および請求項で使用される量、パーセンテージ、または割合を表現する全ての数字、および他の数値は、全ての場合において「約」という用語により修飾されているものと（既にそのように修飾されていない限りにおいて）理解されるべきである。よって、反対の指示がない限り、以下の明細書および添付の請求項に示される数値的パラメーターは、取得が求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低限でも、また特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定する試みとしてではなく、各数値的パラメーターは少なくとも、報告された有効数字に照らして、そして通常の丸め技法を適用することにより、解釈されるべきである。
本明細書および付属の請求項で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、および「ｔｈｅ（その）」、ならびにいかなる語のいかなる単数形用法も、明示的かつ明白に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことが留意される。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語およびその文法的変形は、非限定的であるように意図されており、リスト内の項目の列挙は、挙げられた項目に対し置き換えることができる、または追加することができる他の同様の項目を除外するものではない。
以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するために提供されるものであり、いかなる形でも本開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１－材料および方法
１．ヌクレアーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含有するキャッピングおよびポリアデニル化されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、線状化プラスミドＤＮＡ鋳型およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成した。以下の条件：２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、および１×反応バッファーを用いて、Ｔ７プロモーターおよび１００ｎｔのポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩと共に３７℃にて２時間インキュベートすることにより線状化した。反応物を６５℃にて２０分間加熱することにより、ＸｂａＩを不活性化した。線状化したプラスミドをシリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて酵素およびバッファー塩から精製し、アガロースゲルにより解析して線状化を確認した。以下の条件：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、およびＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１×反応バッファー、を用いて、Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを精製するためのＩＶＴ反応物を３７℃にて４時間インキュベートした。４時間のインキュベート後、ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を添加して最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を取り出した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ転写クリーンアップキットを製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って用いて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを酵素およびヌクレオチドから精製した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定することにより転写物濃度を決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動法により、転写物を解析した。
実施例２および３に記載の実験については、配列番号４２２を含むプラスミドＤＮＡ鋳型を使用してＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを生成した。実施例４および５に記載の実験については、配列番号４２３を含むプラスミドＤＮＡ鋳型を使用してＩＶＴ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを生成した。
実施例２および３で使用したＩＶＴ ｍＲＮＡの生成に使用したＤＮＡ配列（配列番号４２２）：
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２．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ガイドの設計とカニクイザル相同性を有するヒトＳＥＲＰＩＮＡ１ガイドの設計
目的の領域内でＰＡＭを同定するために、ヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）および目的のユーザー定義ゲノム領域（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１タンパク質コードエクソン）を用いて、最初のガイド選択をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施した。同定した各ＰＡＮに対し、解析を実施し統計値を報告した。当技術分野で公知である、ある数の基準（例えば、ＧＣ含量、予測オン標的活性、および潜在的オフターゲット活性）に基づいて、ｇＲＮＡ分子をさらに選択および順位付けした。
ＳＥＲＰＩＮＡ１（ＥＮＳＧ０００００１９７２４９．１３）に対し、エクソン２および３内のタンパク質コード領域を標的とする合計８８種のガイドＲＮＡを設計した。これらの８８種のガイドおよび４種の対照ガイド（二連で）を９６ウェル形式で定置した。これと並行して、ＳＥＲＰＩＮＡ１のエクソン２から５を標的とする、カニクイザルにおいて１００％相同性の５１種のガイドＲＮＡおよび４種の対照（二連で）を９６ウェル形式で定置した。ガイドＲＮＡにおけるガイド配列および対応するゲノム座標を下記（表１）に示す。
３．Ｃａｓ９ ｍＲＮＡおよびガイドＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達
Ｓｐｙ Ｃａｓ９を構成的に発現するヒト胚腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３（「ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９」）を、１０％のウシ胎児血清および５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を追加したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの２０時間前に、細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングした（トランスフェクション時７０％コンフルエント）。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．１３７７８１５０）を用いて細胞をトランスフェクションした。個別のｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含有するリポプレックスを用いて細胞にトランスフェクションした。
ヒト肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ、Ｃａｔ．ＪＣＲＢ０４０３）を、１０％のウシ胎児血清を追加したＤＭＥＭ培地中で培養した。トランスフェクションの２０時間前に、細胞を１５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングした（トランスフェクション時約７０％コンフルエント）。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミンＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．ＬＭＲＮＡ００３）を用いて細胞をトランスフェクションした。Ｓｐｙ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ）を含有するリポプレックス、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを用いて細胞を順次トランスフェクションし、次に個別のｃｒＲＮＡ（２５ｎＭ）、トレーサーＲＮＡ（２５ｎＭ）、ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（０．３μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含有する別々のリポプレックスによってトランスフェクションした。
製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、プロトコル１１．２８．２０１２）に従って、ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号Ｈｕ８２４９）を培養した。簡潔に述べると、サプリメントを含む肝細胞解凍培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．ＣＭ７５００）中に細胞を解凍および再懸濁し、次に遠心処理した。上清を廃棄し、ペレット状の細胞を肝細胞プレーティング培地およびサプリメントのパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ａ１２１７６０１およびＣＭ３０００）内で懸濁させた。細胞を計数し、３３，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔコラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．８７７２７２）にプレーティングした。プレーティングした細胞を、３７℃および５％のＣＯ２雰囲気にて組織培養インキュベーター内で５時間の間、定着および接着させた。インキュベート後、細胞の単層形成をチェックし、細胞を肝細胞培地および血清を含まないサプリメントのパック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ａ１２１７６０１およびＣＭ４０００）で１回洗浄した。これと並行して、個別のｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡに対し、同等量の試薬を混合し９５℃にて２分間インキュベートし室温に冷却することにより、プレアニーリングした。プレアニーリングしたｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡからなるデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）をＳｐｙ Ｃａｓ９タンパク質を用いてインキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．１３７７８１５０）を用いて細胞をトランスフェクションした。Ｓｐｙ Ｃａｓ９（１０ｎＭ）、個別のｃｒＲＮＡ（１０ｎＭ）、トレーサーＲＮＡ（１０ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（１．０μＬ／ウェル）、およびＯｐｔｉＭｅｍを含有するＲＮＰを用いて細胞をトランスフェクションした。
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｃａｔ．ＨＢ－８０６５）を、１０％のウシ胎児血清を追加したＤＭＥＭ培地中で培養した。実施例４にさらに記載するように、ＬＮＰを用いてインキュベートする２４時間前に、細胞を計数し、９６ウェルプレートにおいて１５，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔコラーゲンＩをコーティングした９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．８７７２７２）にプレーティングした。
４．ゲノムＤＮＡ単離
ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９、ＨＵＨ７、およびＰＨＨトランスフェクション細胞をトランスフェクション後２４時間または４８時間時に採取した。製造業者のプロトコルに従って、５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃａｌＡｍｐ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｃａｔ．ＱＥ０９０５０）を使用して、ｇＤＮＡを９６ウェルプレートの各ウェルから抽出した。本明細書に記載のように、全てのＤＮＡ試料をＰＣＲにかけ、続いてＮＧＳ解析にかけた。
５．次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）およびオン標的切断効率の解析
ゲノム内の標的位置における編集の効率を定量的に決定するため、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入および欠失の存在を同定した。
目的の遺伝子（例えば、ＳＥＲＰＩＮＡ１）内の標的部位の周りでＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム区域を増幅した。プライマー配列を表３に示す。
製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施して、シークエンシングに化学作用を加えた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上でアンプリコンをシークエンシングした。品質スコアが低いリードを除去した後、リードをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対しアラインメントした。リードを含む結果ファイルを参照ゲノムにマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なるリードを選択し、野生型リード数に対する挿入、置換、または欠失を含有するリード数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集パーセント」）は、挿入／欠失（「インデル」）または置換を伴う配列リードの総数を配列リードの総数（野生型を含む）で割ったものとして定義される。
６．アルファ１アンチトリプシン（「ＡＡＴ」）ＥＬＩＳＡ
肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７を、先に説明したように、表１からの選択ガイドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから６日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次に、１０％のＦＢＳを含む２００μＬの標準ＤＭＥＭ培地で置き換えた。４時間後、培地を採取し、－２０℃にて保管した。製造業者のプロトコルに従って、接着細胞上でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（「ＣＴＧ」）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ．Ｇ７５７０）を完了した。ＡＡＴ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ．ＤＹ１２６８）を用いて総ＡＡＴレベルを決定した。製造業者のプロトコルに従って、キット試薬および標準物質を調製した。ＥＬＩＳＡを実行する前に、凍結培地を室温にて解凍し、１０００ｒｐｍにて１分間遠心処理してペレット状デブリにし、次に氷上に定置した。ＥＬＩＳＡに対して、３０μＬの培地を７０μＬの１×アッセイ希釈剤で希釈した。製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ手順を完了した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー上でプレートを読み取った。ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアｖｅｒ．６．４．２により、標準曲線から作製された４パラメーターロジスティック曲線適合を用いてＡＡＴレベルを計算した。各ウェルに対する細胞数を、ＣＴＧアッセイから得られた値に基づいたプレート平均との比較により推定した。最終ＡＡＴレベル（ｐｇ／ｍｌ）を細胞数に対して調整した。
７．ウェスタンブロットによるＡＡＴタンパク質解析
肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７を、先に説明したように、表１からの選択ガイドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから６日後、培地を除去し、細胞を５０μＬ／ウェルのＲＩＰＡバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｔ．ＢＰ－１１５）および新たに加えたプロテアーゼ阻害剤混合物（完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．１１６９７４９８００１）、１ｍＭのＤＴＴ、および２５０Ｕ／ｍｌのベンゾナーゼ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．７１２０６－３）からなる）で溶解した。細胞を氷の上に３０分間保ち、このときにＮａＣｌ（１Ｍの最終濃度）を添加した。細胞溶解物を十分に混合し、氷の上で３０分間保持した。全細胞抽出物（「ＷＣＥ」）をＰＣＲプレートに移し、遠心処理してペレット状デブリにした。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ．５００－０００１）を使用してライセートのタンパク質含量を評価した。製造業者のプロトコルに従ってＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ手順を完了した。使用前に抽出物を－２０℃にて保管した。ウェスタンブロットを実施してＡＡＴタンパク質レベルを評価した。溶解物をレムリーバッファーと混合し、９５℃にて１０分間変性させた。製造業者のプロトコルに従って、４～１２％のビス－トリスゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上のＮｕＰａｇｅシステムを用いてウェスタンブロットを実行し、次に０．４５μｍのニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｃａｔ．１６２０１１５）の上へと湿式で移行させた。移行後、膜を水で十分にすすぎ、ポンソーＳ溶液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｔ．ＳＴ－１８０）で染色して、完全かつ一様な移行を確認した。室温にてラボロッカー上でＴＢＳ中５％のドライミルクを３０分間用いて、ブロットをブロックした。ブロットをＴＢＳＴですすぎ、ウサギα－ＡＡＴポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．ＨＰＡ００１２９２）をＴＢＳＴ中１：１０００にて用いてプローブした。ローディング対照としてのＧＡＰＤＨ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．ＮＢ６００５０２）をＴＢＳＴ中１：２５００にて使用し、同時にＡＡＴ一次抗体と共にインキュベートした。ブロットをバッグ内に密閉し、４℃にて一晩ラボロッカー上に保った。インキュベート後、ブロットをＴＢＳＴ中で３回、各５分間すすぎ、マウスおよびウサギに対する二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ．ＰＩ３５５１８およびＰＩＳＡ５３５５７１）でプローブした（それぞれＴＢＳＴ中１：２５，０００で室温にて３０分間）。インキュベート後、ブロットをＴＢＳＴ中で３回、各５分間すすぎ、ＰＢＳを用いて２回すすいだ。Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いてブロットを視覚化および解析した。
８．脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の製剤
４．５のＮ：Ｐ比率（アミン：ＲＮＡリン酸）（Ｎ：Ｐ）でＬＮＰを製剤した。以下のモル比で、脂質ナノ粒子構成要素を１００％のエタノールに溶解した：４５ｍｏｌ％のカチオン性脂質（脂質Ａ）；４４ｍｏｌ％のコレステロール；９ｍｏｌ％のＤＳＰＣ；および２ｍｏｌ％のＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ。ＲＮＡカーゴ（ｍＲＮＡ：ｓｇＲＮＡ（重量／重量）が１：１）をｐＨ４．５にて２５Ｍｍの酢酸ナトリウムバッファー内で溶解し、およそ０．４５ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＮＡカーゴを得た。製造業者のプロトコルに従ってＰｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏｓｙｓｔｅｍｓのＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ装置を用いた脂質およびＲＮＡの溶液のマイクロ流体混合を行うことにより、ＬＮＰを形成した。水中でＬＮＰを３：１の比率にて収集した。ＬＮＰを室温にて１時間インキュベートした。残りのバッファーを、４℃にて一晩、１０ｋＤａのＳｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて穏やかに撹拌しながら、ｐＨ７．５の５０ｍＭのトリス（試料体積の１００倍過剰）へと交換した。翌日、Ａｍｉｃｏｎフィルター（４０００ｇ、４℃）を用いてＬＮＰを濃縮し、所望の濃度の２倍にした。次に、２Ｘ ＴＳＳ（５０ｍＭのトリス、９０ｍＭの塩化ナトリウム、１０％ ｗ／ｖのスクロース、ｐＨ７．５）を用いてＬＮＰを１：１混合した。次に、０．２μＭのフィルターを用いて得られた混合物を濾過した。得られた濾液を２～８℃にて保管した。
実施例２－スクリーニングおよびガイドの適格性
１．複数の細胞タイプにおけるＳＥＲＰＩＮＡ１ガイドのクロススクリーニング
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１およびカニクイザルにおいて相同性を有するものを標的とするガイドを、実施例１に記載のようにＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９およびＨＵＨ７の細胞株、さらにヒト初代肝細胞の中へとトランスフェクションした。各細胞タイプにわたって、各ガイド配列を含むｃｒＲＮＡに対し編集パーセントを決定し、次にガイド配列を最高編集％に基づいて順位付けした。３種の細胞株全てにおける表１のガイド配列に対するスクリーニングデータを以下に挙げる（表４、５、および６）。
表４は、Ｓｐｙ Ｃａｓ９タンパク質を構成的に過剰発現するヒト腎臓腺癌細胞株ＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９におけるＳＥＲＰＩＮＡ１および対照ｃｒＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％に対する平均および標準偏差を示している。
表５は、ヒト肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７におけるＳｐｙ Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを用いてコトランスフェクションした試験対象のＳＥＲＰＩＮＡ１および対照ｃｒＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％の平均および標準偏差を示している。
表６は、ヒト初代肝細胞におけるＳｐｙ Ｃａｓ９タンパク質を用いてトランスフェクションした試験対象のＳＥＲＰＩＮＡ１および対照ｃｒＲＮＡについての編集％、挿入（Ｉｎｓ）％、および欠失（Ｄｅｌ）％の平均および標準偏差を示している。
さらなる解析のために、各細胞株からの選択されたガイド配列を使用して３０種のｃｒＲＮＡのパネルを創出した（表７）。選択されたＳＥＲＰＩＮＡ１ガイドの染色体位置をエクソン２～５に対し重ねている概略図を図１に提示する。編集パーセントおよびＡＡＴ分泌レベルを図２に示す。
２．ＳＥＲＰＩＮＡ１ガイドのオフターゲット解析
オリゴ挿入ベースアッセイ（例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，１８７－１９７；２０１５を参照）を使用して、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするＣａｓ９により
切断される潜在的可能性があるオフターゲットゲノム部位を決定した。表７の３０種のガイド（および既知のオフターゲットプロファイルを有する２種の対照ガイド）を、上述のようにＨＥＫ２９３－Ｃａｓ９細胞においてスクリーニングし、オフターゲット結果を図３にプロットした。当該アッセイは、ｃｒＲＮＡのいくつかに対する潜在的なオフターゲット部位を同定し、検出可能なオフターゲットを有しない他のものを同定した。
実施例３．表現型解析
１．分泌アルファ１アンチトリプシンのＥＬＩＳＡ解析
実施例１に記載のように、肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７を表１からの選択ガイドを用いて四連でトランスフェクションした。トランスフェクションから２日後、四連のうちの１つをゲノムＤＮＡおよびＮＧＳシークエンシングによる解析のために採取した。対照ガイドを含めた全てのガイドは、７０％を超える編集パーセントを有し、いくつかは９５％に達した。トランスフェクションから６日後、先述のようなＥＬＩＳＡによる分泌ＡＡＴの解析のための培地採取向けに四連のうちの１つを用意した。全てのＡＡＴ ｃｒＲＮＡは、培地へと分泌されるＡＡＴのレベルを、対照ガイドとの比較で５～１０倍の因数によって低減した。各ガイドに対する編集％および細胞外ＡＡＴの低減についてのデータを表７に示す。
２．細胞内アルファ１アンチトリプシンのウェスタン解析
実施例１に記載のように、肝細胞癌細胞株ＨＵＨ７を、表１からのガイドを含むｃｒＲＮＡを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞のプールを、さらなる解析のために組織培養で保持し継代させた。トランスフェクションから１１日後、細胞を採取し、全細胞抽出物（ＷＣＥ）を調製し、先述のようにウェスタンブロットによる解析にかけた。
細胞を継代させたら、本明細書に記載のようにＮＧＳシークエンシング用に試料を収集し処理した。２日目、２３日目、３２日目、および４０日目からの選択試料を、経時的な編集％のために比較した（表８）。この結果は、ＨＵＨ７細胞成長に関し、ＡＡＴ編集に関連する増殖の変化が見られなかったことを示唆するものである。
ウェスタンブロットにより、ＡＡＴタンパク質の低減についてＷＣＥを解析した。全長のＡＡＴタンパク質は４１８アミノ酸を有するが、このタンパク質は分泌される前に重度にグリコシル化される。非グリコシル化ＡＡＴは４６ｋＤの予測分子量を有し、この分子量におけるバンドが、様々なＡＡＴタンパク質種に対応する５２ｋＤおよび５６ｋＤのバンドと共に、ウェスタンブロットの対照レーンで観察された（図４）。
Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｅｒ ５．２ソフトウェアを用いて、ＡＡＴタンパク質の低減パーセントを計算した。ＤＡＰＤＨをローディング対照として使用し、ＡＡＴと同時にプローブした。各試料内のＧＡＰＤＨについてのデンシメトリー値の、ＡＡＴについての３つのバンド全てを包含する総領域に対する比率を計算した。対照レーンに対して比率を正規化した後に、ＡＡＴタンパク質の低減パーセントを決定した。結果を表７に示す。

３．選択ガイドに対するｉｎ ｖｉｔｒｏデータの統合
本明細書に記載のデータを解析することにより、個々のガイドに対して焦点を合わせたデータパッケージを創出した。分泌ＡＡＴ（ＥＬＩＳＡ）の低減の比較、外来バンドの産生に対する総ＡＡＴタンパク質の低減（ウェスタンブロット）、およびオフターゲット解析を通じてリード候補を特徴付け、かつ順位付けした。カニクイザルに対する相同性（配列中の任意のミスマッチ（ｍｍ）を含む）も表した。図５から図１０を参照。
実施例４．ヒト初代肝細胞（ＰＨＨ）およびＨｅｐＧ２細胞への脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡおよび修飾ｓｇＲＮＡの脂質ナノ粒子製剤を、ＰＨＨおよびＨｅｐＧ２細胞に対し用量反応曲線において試験した。実施例１に記載のように（ただし、３３，０００細胞／ウェルのところを１５，０００ＰＨＨ細胞／ウェルにて）、ＰＨＨおよびＨｅｐＧ２細胞をプレーティングした。ＬＮＰを用いた処置の前に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２にて２４時間インキュベートした。実施例１に記載のように、当該実験で使用するＬＮＰを調製した。各ＬＮＰは、図１１および図１２で指定されているｓｇＲＮＡと、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとを含有した。ＬＮＰを、６％のカニクイザル血清を含有する肝細胞維持培地中で３７℃にて５分間インキュベートした。インキュベート後、１００ｎｇのｍＲＮＡにて開始する２倍用量反応曲線においてＬＮＰを細胞に８ポイントにおいて添加した。実施例１に記載のように、ＮＧＳ解析のために治療から７２時間後に細胞を溶解した。両方の細胞タイプにおけるガイド配列に対する用量反応曲線データを図１１および図１２に示す。これらのデータは、製剤が、両方のＨｅｐＧ２細胞の編集に加えて、ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ標的として意図されているヒト初代肝細胞の編集にも有効であることを示すものである。
実施例５．ｉｎ ｖｉｖｏでの
ヒトＰｉＺバリアントに対する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の送達および編集
実施例４で試験した６種のＬＮＰ製剤のうちの５種と、マウスＴＴＲ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを含む対照ＬＮＰとを、ヒトＰｉＺバリアントのコピーを有するトランスジェニックマウスに投与した。ＰｉＺトランスジェニックマウスについては以前に説明されており（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ ＪＡ，Ｒｏｇｅｒｓ ＢＢ，Ｓｉｆｅｒｓ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｉＺ ａｌｐｈａ １－ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｌｉｖｅｒ ｄａｍａｇｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９８９；８３：１１８３－１１９０を参照）、ヒトＰｉＺバリアントのコンカテマー化されたコピーを７つ～８つを、当該コンカテマーに対しヘテロ接合性のマウスにおいて保有すると考えられている（データは示さず）。
本研究では、１５～３９週齢にわたるＰｉＺマウス（オスおよびメスの混合）を使用した。ＬＮＰを、側尾静脈を経由して動物当たり０．２ｍＬの体積で（各群につきｎ＝５）、４ｍｇ／ｋｇの用量（ｋｇ当たり４ｍｇの総ＲＮＡ含量）にて投与した。動物を、ＬＮＰ投与から２週間後に安楽死させた。血清解析のため、ＬＮＰ投与の前および剖検時に血液を採取した。剖検時に各動物から肝臓組織を採取してタンパク質およびＤＮＡを抽出し、次にタンパク質の定量化（ＰｉＺタンパク質の血清レベルおよび組織レベルのためのＥＬＩＳＡ解析およびウェスタンブロット解析）を行い、実施例１に記載の試薬および方法を用いてＮＧＳ解析を行った。下記の表９は、各試験対象ＬＮＰ中に製剤されたｓｇＲＮＡを示している。
Ｇ０００２８２（＊＝ＰＳ結合；「ｍ」＝２’－Ｏ－Ｍｅヌクレオチド）：
ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＡ＊ＣＡＧＣＣＡＣＧＵＣＵＡＣＡＧＣＡＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵ
ｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍ
ＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号４２４）
図１３Ａに示されているように、各群においてＳＥＲＰＩＮＡ１（またはマウス対照に対するＴＴＲ）のＰｉＺバリアントのロバストな編集が検出された一方で、ビヒクル対照では編集が検出されなかった（ＴＳＳ＝トリス／塩化ナトリウム／スクロースバッファー）。また、実験群内の一部の動物においても編集は検出されず、その後に行った遺伝子型判定解析（データは示さず）からは、これらの動物がＰｉＺ導入遺伝子に対し陰性であり、そのため検出可能な編集、ＰｉＺタンパク質発現、または血清へのＰｉＺ分泌のノックダウンを生じることは予想されないであろうことが明らかになった。このことは、タンパク質発現解析（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット；図１３Ｂおよび１３Ｃを参照）によってさらに確認された。
加えて、ＰｉＺバリアントの編集は、治療されたマウスにおける血清レベルのノックダウンと関連していた。さらに、編集は、ウェスタンブロットにより示されるように（図１３Ｃ）、肝臓組織内のＰｉＺタンパク質のノックダウンとも関連していた。これらのデータは、当該製剤が、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰｉＺアレルの発現および分泌をノックダウンするのに有効であることを実証するものである。

以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を記載する。
［発明１］
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する方法であって、細胞に、配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡを含む組成物を送達することを含む、方法。
［発明２］
ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を送達することを含む、方法。
［発明３］
アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡと、を含む組成物を投与することを含み、それによってＡＡＴＤを治療する、方法。
［発明４］
対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積を低減または防止する方法であって、前記低減または防止を必要とする対象に、（ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、もしくは９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含む組成物を投与することを含み、それによって肝臓内のＡＡＴ蓄積を低減する、方法。
［発明５］
配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡを含む、組成物。
［発明６］
配列番号５～１２９から選択されるガイド配列、または配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡをコードするベクターを含む、組成物。
［発明７］
細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）の誘発における使用のための、発明５または６に記載の組成物。
［発明８］
細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の修飾における使用のための、発明５または６に記載の組成物。
［発明９］
対象におけるアルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療における使用のための、発明５または６に記載の組成物。
［発明１０］
対象におけるＡＡＴの血清中濃度または肝臓中濃度の低減における使用のための、発明５または６に記載の組成物。
［発明１１］
対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積の低減または防止における使用のための、発明５または６に記載の組成物。
［発明１２］
前記組成物が、血清および／または肝臓のＡＡＴレベルを低減する、発明１～４のいずれか１つに記載の方法、または発明５～１１のいずれか１つに記載の使用のための組成物。
［発明１３］
前記血清および／または肝臓のＡＡＴレベルが、前記組成物を投与する前の血清中および／またはＡＡＴレベルと比較して、少なくとも４０％低減される、発明１２に記載の方法または使用のための組成物。
［発明１４］
前記血清および／または肝臓のＡＡＴレベルが、前記組成物を投与する前の血清中および／またはＡＡＴレベルと比較して、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～９５％、９５～９８％、９８～９９％、または９９～１００％低減される、発明１２に記載の方法または使用のための組成物。
［発明１５］
前記組成物が前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の編集をもたらす、発明１～４または７～１４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１６］
前記編集が、編集された集団のパーセンテージ（編集パーセント）として計算される、発明１５に記載の方法または使用のための組成物。
［発明１７］
前記編集パーセントが３０から９０％の間である、発明１６に記載の方法または使用のための組成物。
［発明１８］
前記編集パーセントが、３０から３５％の間、３５から４０％の間、４０から４５％の間、４５から５０％の間、５０から５５％の間、５５から６０％の間、６０から６５％の間、６５から７０％の間、７０から７５％の間、７５から８０％の間、８０から８５％の間、８５から９０％の間、９０から９５％の間、または９５から９９％の間である、発明１７に記載の方法または使用のための組成物。
［発明１９］
前記組成物が少なくとも２回投与または送達される、発明１～４または７～１８のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明２０］
前記組成物が少なくとも３回投与または送達される、発明１９に記載の方法または使用のための組成物。
［発明２１］
前記組成物が少なくとも４回投与または送達される、発明１９に記載の方法または使用のための組成物。
［発明２２］
前記組成物が最高５回、６回、７回、８回、９回、または１０回投与または送達される、発明１９に記載の方法または使用のための組成物。
［発明２３］
前記投与または送達が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、または１５日の間隔で発生する、発明１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明２４］
前記投与または送達が、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、１３週、１４週、または１５週の間隔で発生する、発明１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明２５］
前記投与または送達が、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、８ヵ月、９ヵ月、１０ヵ月、１１ヵ月、１２ヵ月、１３ヵ月、１４ヵ月、または１５ヵ月の間隔で発生する、発明１９～２２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明２６］
前記ガイド配列が配列番号５～１２９から選択される、発明１～２５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２７］
前記ガイドＲＮＡが、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内に存在する標的配列に対し少なくとも部分的に相補的である、発明１～２６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２８］
前記標的配列が前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２、３、４、または５内にある、発明２７に記載の方法または組成物。
［発明２９］
前記標的配列が前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン２内にある、発明２７に記載の方法または組成物。
［発明３０］
前記標的配列が前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン３内にある、発明２７に記載の方法または組成物。
［発明３１］
前記標的配列が前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン４内にある、発明２７に記載の方法または組成物。
［発明３２］
前記標的配列が前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のエクソン５内にある、発明２７に記載の方法または組成物。
［発明３３］
前記ガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１のプラス鎖内の標的配列に対し相補的である、発明１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明３４］
前記ガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１のマイナス鎖内の標的配列に対し相補的である、発明１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明３５］
第２のガイド配列をさらに含み、前記第１のガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のプラス鎖内の第１の標的配列に対し相補的であり、前記第２のガイド配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のマイナス鎖内の第２の標的配列に対し相補的である、発明１～３２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明３６］
前記ガイドＲＮＡが、前記ガイド配列を含みかつ配列番号１４０のヌクレオチド配列をさらに含むｃｒＲＮＡを含み、前記配列番号１４０のヌクレオチドがその３’末端において前記ガイド配列に続く、発明１～３５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明３７］
前記ガイドＲＮＡがデュアルガイド（ｄｇＲＮＡ）である、発明１～３６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明３８］
前記デュアルガイドＲＮＡが、配列番号１４０のヌクレオチド配列を含むｃｒＲＮＡであって、前記配列番号１４０のヌクレオチドがその３’末端において前記ガイド配列に続く、ｃｒＲＮＡと、ｔｒＲＮＡとを含む、発明３７に記載の方法または組成物。
［発明３９］
前記ガイドＲＮＡがシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、発明１～３６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明４０］
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号１３０の修飾を有するガイド配列を含む、発明３９に記載の方法または組成物。
［発明４１］
前記ｓｇＲＮＡが配列番号１３０を含む、発明３９に記載の方法または組成物。
［発明４２］
配列番号１３０における各Ｎが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、前記Ｎが前記ガイド配列を形成し、かつ前記ガイド配列がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子へと標的化させる、発明４０または４１に記載の方法または組成物。
［発明４３］
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５～１２９のガイド配列のうちのいずれか１つおよび配列番号１４０のヌクレオチドを含む、発明３９～４２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明４４］
前記ｓｇＲＮＡが、配列番号５～１２９から選択される配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、または９０％同一であるガイド配列を含む、発明３９～４３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明４５］
配列番号１３０における各Ｎが、配列番号５～１２９から選択されるガイド配列で集合的に置き換えられる、発明４２に記載の方法または組成物。
［発明４６］
前記ガイドＲＮＡが少なくとも１つの修飾を含む、発明１～４５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明４７］
前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む、発明４６に記載の方法または組成物。
［発明４８］
前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、発明４６または４７に記載の方法または組成物。
［発明４９］
前記少なくとも１つの修飾が、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む、発明４６～４８のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５０］
前記少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、発明４６～４９のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５１］
前記少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、発明４６～５０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５２］
前記少なくとも１つの修飾が、最初の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、発明４６～５１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５３］
前記少なくとも１つの修飾が、最後の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合を含む、発明４６～５２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５４］
前記少なくとも１つの修飾が、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおいて２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、発明４６～５３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５５］
前記少なくとも１つの修飾が、３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおいて２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含む、発明４６～５４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５６］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１３０の前記修飾ヌクレオチドを含む、発明４６～５５のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５７］
前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、発明１～５６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５８］
前記ガイドＲＮＡと、任意選択でＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸とが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、発明１～５７のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明５９］
前記ＬＮＰがＣＣＤ脂質を含む、発明５８に記載の方法または組成物。
［発明６０］
前記ＣＣＤ脂質が脂質Ａである、発明５９に記載の方法または組成物。
［発明６１］
前記ＬＮＰが中性脂質を含む、発明５８～６０に記載の方法または組成物。
［発明６２］
前記中性脂質がＤＳＰＣである、発明６１に記載の方法または組成物。
［発明６３］
前記ＬＮＰがヘルパー脂質を含む、発明５８～６２のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明６４］
前記ヘルパー脂質がコレステロールである、発明６３に記載の方法または組成物。
［発明６５］
前記ＬＮＰがステルス脂質を含む、発明５８～６４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明６６］
前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、発明５８～６５に記載の方法または組成物。
［発明６７］
前記組成物がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をさらに含む、発明１～６６のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明６８］
前記組成物がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、発明１～６７のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明６９］
前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がＣａｓクリベースである、発明６７または６８に記載の方法または組成物。
［発明７０］
前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がＣａｓ９である、発明６９に記載の方法または組成物。
［発明７１］
前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が修飾されている、発明６７～７０のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明７２］
前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がニッカーゼである、発明６７～７１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明７３］
前記修飾されたＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む、発明７１または７２に記載の方法または組成物。
［発明７４］
前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤が、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムからのＣａｓである、発明６７～７３のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明７５］
前記組成物が薬学的製剤であり、かつ薬学的に許容される担体をさらに含む、発明１～７４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明７６］
前記組成物が肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）の蓄積を低減または防止する、発明１～４または７～７５のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明７７］
前記ＡＡＴが誤形成されている、発明７６に記載の方法または使用のための組成物。
［発明７８］
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中に突然変異をもたらす、発明１～４または７～７７のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明７９］
ＮＨＥＪが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす、発明７８に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８０］
前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘発する、発明７９に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８１］
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の少なくとも５０％のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で誘発される、発明８０に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８２］
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の５０％～６０％、６０％～７０％、７０％もしくは８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％のＳＥＲＦＩＮＡ１遺伝子内で誘発される、発明８１に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８３］
前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも少なくとも５０倍以上ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する、発明７９～８２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明８４］
前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも５０倍から１５０倍、１５０倍から５００倍、５００倍から１５００倍、１５００倍から５０００倍、５０００倍から１５０００倍、１５０００倍から３００００倍、または３００００倍から６００００倍、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内で発生する、発明８３に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８５］
前記組成物の投与が前記対象におけるＡＡＴレベルを低減する、発明１～４または７～８４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明８６］
前記ＡＡＴレベルが少なくとも４０％低減される、発明８５に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８７］
前記ＡＡＴレベルが、４０％～５０％、５０％～６０％、６０％～７０％、７０％もしくは８０％、８０％～９０％、９０～９５％、９５％～９９％、または９９％～１００％低減される、発明８６に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８８］
前記ＡＡＴレベルが、血清中、血漿中、血液中、脳脊髄液中、または痰中で測定される、発明８６または８７に記載の方法または使用のための組成物。
［発明８９］
前記ＡＡＴレベルが、肝臓中及び／または血清中で測定される、発明８６または８７に記載の方法または使用のための組成物。
［発明９０］
前記ＡＡＴレベルが、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を介して測定される、発明８５～８９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９１］
前記対象がＡＡＴＤを有する、発明１～４または７～９０のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９２］
前記対象がヒトである、発明１～４または７～９１のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９３］
前記対象がＡＡＴＤ野生型を有する、発明９１または９２に記載の方法または使用のための組成物。
［発明９４］
前記対象が遺伝性ＡＡＴＤを有する、発明９１または９２に記載の方法または使用のための組成物。
［発明９５］
前記対象がＡＡＴＤの家族歴を有する、発明１～４または７～９２、または９４のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９６］
前記対象がＡＡＴＤの肝臓症状のみを有する、または主としてＡＡＴＤの肝臓症状を有する、発明１～４または７～９５のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９７］
前記対象が、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位におけるＺアレルについてヘテロ接合性である、発明１～４または７～９６のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明９８］
前記対象が、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１座位において１つのＺアレルおよび１つのＳアレルを有する、発明９７に記載の方法。
［発明９９］
前記対象が、ＡＡＴのアミノ酸配列中にＥ３４２Ｋ変異を有しないが、野生型ＡＡＴのレベル低減を有する、発明１～４または７～９８のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１００］
前記対象が浮腫、腹水、もしくは黄疸の改善、安定化、もしくは緩徐化を有し、または肝臓移植の必要性が遅延する、発明１～４または７～９９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１０１］
前記対象が、投与の結果として、イメージング法または肝臓酵素レベルにより測定されるように、変化の改善、安定化、もしくは緩徐を有する、発明１～４または７～９９のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１０２］
前記組成物または薬学的製剤がウイルスベクターを介して投与される、発明１～４または７～１０１のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１０３］
前記組成物または薬学的製剤が脂質ナノ粒子を介して投与される、発明１～４または７～１０２のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１０４］
前記対象が、前記組成物または製剤を投与する前に、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の特定の突然変異について試験される、発明１～４または７～１０３のいずれか１つに記載の方法または使用のための組成物。
［発明１０５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１０６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１０７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１０８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１０９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１１９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１２９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号２９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１３９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号３９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１４９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号４９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１５９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号５９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１６９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号６９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１７９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号７９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１８９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号８９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明１９９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号９９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２００］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１００である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２０９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１０９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２１９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１１９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２０］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２０である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２１］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２２］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２３］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２４］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２５］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２６］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２７］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２８］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２２９］
配列番号５～１２９から選択される前記配列が配列番号１２９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３０］
配列番号１４０または１４１の配列をさらに含む、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３１］
配列番号１３０の修飾パターンを含む、発明２３０に記載の方法または組成物。
［発明２３２］
前記配列が配列番号１３１～１３９から選択される、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３３］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３１である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３４］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３２である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３５］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３３である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３６］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３４である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３７］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３５である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３８］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３６である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２３９］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３７である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２４０］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３８である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２４１］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が配列番号１３９である、発明１～１０４のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２４２］
配列番号１３１～１３９から選択される前記配列が、表２内の前記それぞれの配列について示されている前記修飾を含む、発明２３２～２４１のいずれか１つに記載の方法または組成物。
［発明２４３］
ＡＡＴＤを有するヒト対象を治療するための医薬の前記調製のための、発明５～２４２のいずれか１つに記載の組成物または製剤の使用。

Claims (32)

  1. （ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号４２のガイド配列、または配列番号４２の配列と少なくとも９０％同一であるガイド配列を含むガイドＲＮＡと、を含み、該ガイドＲＮＡが、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／または３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、対象におけるアルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療における使用のための組成物。
  2. （ｉ）ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸と、（ｉｉ）配列番号４２のガイド配列、または配列番号４２の配列と少なくとも９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡと、を含み、該ガイドＲＮＡが、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／または３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積の低減または防止における使用のための組成物。
  3. ガイドＲＮＡを含む組成物であって、前記ガイドＲＮＡが、配列番号４２のガイド配列、または配列番号４２の配列と少なくとも９０％同一であるガイド配列を含み、該ガイドＲＮＡが、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／または３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、前記組成物。
  4. 細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）の誘発、
    細胞または対象におけるＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の修飾、
    対象におけるアルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）の治療、
    対象におけるＡＡＴの血清中濃度または肝臓中濃度の低減、および
    対象における肝臓内のアルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）蓄積の低減または防止
    から選択される少なくとも１つにおける使用のための、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ガイドＲＮＡが、前記ガイド配列の３’末端に配列番号１４１の配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
  6. 前記ガイドＲＮＡが、下記配列：
    ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ＣＣＵＣＡＣＧＧＡＧＡＵＵＣＣＧＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１３８；ここで、「＊」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示し、小文字の「ｍ」は２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを示す。）
    を含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号１３０の修飾を有するガイド配列、または配列番号１３０を含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 配列番号１３０における各Ｎが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、前記Ｎが前記ガイド配列を形成し、かつ前記ガイド配列がＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子へと標的化させるものであり、任意選択で、配列番号１３０における各Ｎが、配列番号４２のガイド配列で集合的に置き換えられる、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ｓｇＲＮＡが、配列番号４２のガイド配列、および該配列番号４２の配列の３’末端に配列番号１４１のヌクレオチドを含む、請求項７または８に記載の組成物。
  10. 前記ガイドＲＮＡが少なくとも１つの更なる修飾を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記少なくとも１つの更なる修飾が、
    ａ）２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、
    ｂ）ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、
    ｃ）２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、
    ｄ）５’末端における最初の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾、
    ｅ）３’末端における最後の５個のヌクレオチドのうちの１つ以上における修飾、
    ｆ）最初の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合、
    ｇ）最後の４つのヌクレオチド間のＰＳ結合、および
    ｈ）前記ａ）～ｇ）のうちの２つ以上の組み合わせ
    から選択される、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記少なくとも１つの修飾が、最初の４つのヌクレオチド間および／または最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号１３０（ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（ここで、「＊」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示し、小文字の「ｍ」は２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを示す。））の前記修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の組成物。
  14. 前記ガイドＲＮＡと、任意選択でＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードする核酸とが、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）と会合している、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。
  15. 前記ＬＮＰが、
    （ｉ）ＣＣＤ脂質、任選選択で脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート）、
    （ｉｉ）中性脂質、任選選択でジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）
    （ｉｉｉ）ヘルパー脂質、任選選択でコレステロール、および
    （ｉｖ）ステルス脂質、任選選択で１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）
    から選択される少なくとも１種を含む、請求項１４に記載の組成物。
  16. 前記組成物が、ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤、またはＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がＣａｓクリベースである、請求項１５に記載の組成物。
  18. 前記ＣａｓクリベースがＣａｓ９である、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記ＲＮＡガイドされたＤＮＡ結合剤がニッカーゼもしくは修飾されている、請求項１６に記載の組成物。
  20. 前記組成物が薬学的製剤であり、かつ薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記組成物が、前記細胞または前記対象におけるＡＡＴレベルを低減する、請求項１、２および４～２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記ＡＡＴレベルが、前記組成物を前記細胞または前記対象に送達する前のＡＡＴレベルと比較して、少なくとも４０％低減される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記組成物が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の編集をもたらし、場合により、当該編集が、編集される集団のパーセンテージ（編集パーセント）として計算され、場合により、当該編集パーセントが３０から９９％の間である、請求項１、２および４～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中に突然変異をもたらすものであり、任意選択で、ＮＨＥＪが、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のＤＳＢの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらすものであり、任意選択で、前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘発する、請求項１、２および４～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記対象がヒトである、請求項１、２および４～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記対象が、
    ＡＡＴＤ野生型、任意選択でＡＡＴＤ野生型または遺伝性ＡＡＴＤ；
    ＡＡＴＤの家族歴；および
    ＡＡＴＤの肝臓症状のみ、または主にＡＡＴＤの肝臓症状
    から選択される少なくとも１つを有する、請求項１、２および４～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記対象が、ＳＥＲＰＩＮＡ１座位におけるＺアレルについてヘテロ接合性であり、任意選択で、前記対象が、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１座位において１つのＺアレルおよび１つのＳアレルを有する、および／または、前記対象が、ＡＡＴのアミノ酸配列中にＥ３４２Ｋ変異を有しないが、野生型ＡＡＴのレベル低減を有する、請求項１、２および４～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記対象が浮腫、腹水、もしくは黄疸の改善、安定化、もしくは緩徐化を有し、または肝臓移植の必要性が遅延する、請求項１、２および４～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記組成物または薬学的製剤が脂質ナノ粒子を介して送達される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の組成物。
  30. 前記細胞が肝臓細胞であり、任意選択で前記肝臓細胞が肝細胞である、請求項１、２および４～２９のいずれか１項に記載の組成物。
  31. ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の２本鎖切断（ＤＳＢ）を誘発する、またはＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、配列番号４２のガイド配列、または配列番号４２の配列と少なくとも９０％同一であるガイド配列を含む、ガイドＲＮＡを含む組成物を送達することを含み、該ガイドＲＮＡが、５’末端における最初の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、および／または３’末端における最後の３個のヌクレオチドにおける２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、前記方法。
  32. 前記ガイドＲＮＡが、配列番号４２の配列の３’末端に配列番号１４１の配列を含む、または、
    前記ガイドＲＮＡが、下記配列：
    ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＡ＊ＣＣＵＣＡＣＧＧＡＧＡＵＵＣＣＧＧＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号１３８；ここで、「＊」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示し、小文字の「ｍ」は２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを示す。）
    を含む、
    請求項３１に記載の方法。
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