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KR20240123832A - 지질 나노입자 제형에 사용하기 위한 지질 - Google Patents

지질 나노입자 제형에 사용하기 위한 지질 Download PDF

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KR20240123832A
KR20240123832A KR1020247023909A KR20247023909A KR20240123832A KR 20240123832 A KR20240123832 A KR 20240123832A KR 1020247023909 A KR1020247023909 A KR 1020247023909A KR 20247023909 A KR20247023909 A KR 20247023909A KR 20240123832 A KR20240123832 A KR 20240123832A
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KR
South Korea
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compound
alkyl
mmol
independently
lipid
Prior art date
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Pending
Application number
KR1020247023909A
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English (en)
Inventor
제이슨 사무엘 탄
스티브 아른스
줄리아 가테뇨
폴리나 블라고예비치
신야오 두
스티븐 엠. 안셀
Original Assignee
아퀴타스 테라퓨틱스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아퀴타스 테라퓨틱스 인크. filed Critical 아퀴타스 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

하기 구조식을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체가 제공된다:

여기서, R3, L1, L2, G1, G2 및 G3 은 본 명세서에 정의된 바와 같다. 치료제 전달을 위한 지질 나노입자 제형의 성분으로서의 화합물의 용도, 화합물을 포함하는 조성물, 및 이의 용도 및 제조 방법이 또한 제공된다.

Description

지질 나노입자 제형에 사용하기 위한 지질
본 발명의 구체예는 일반적으로 시험관내 및 생체내 둘 다에서 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 메신저 RNA)과 같은 치료제의 전달을 위한 지질 나노입자를 형성하기 위해 중성 지질, 콜레스테롤 및 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)과 같은 다른 지질 성분과 조합하여 사용될 수 있는 신규한 지질에 관한 것이다.
생물학적 시스템에서 원하는 반응에 영향을 미치는 핵산 전달과 관련된 많은 도전이 있다. 핵산 기반 치료법은 엄청난 잠재력을 가지고 있지만 이러한 잠재력을 실현하기 위해서는 세포 또는 유기체 내의 적절한 부위에 핵산을 보다 효과적으로 전달해야 할 필요성이 여전히 남아 있다. 치료 핵산은 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzyme, 플라스미드, 면역 자극 핵산, 안타고미르(antagomir), 안티미르(antimir), 모방체, 슈퍼미르(supermir) 및 압타머를 포함한다. mRNA 또는 플라스미드와 같은 일부 핵산은 예를 들어 단백질 또는 효소 결핍과 관련된 질병의 치료에 유용한 특정 세포 산물의 발현을 달성하는데 사용될 수 있다. 번역 가능한 뉴클레오티드 전달의 치료적 적용은 시스템에 고유한지 여부에 관계없이 임의의 선택된 단백질 서열을 생산하는 작제물이 합성될 수 있기 때문에 매우 광범위하다. 핵산의 발현 산물은 단백질의 기존 수준을 증가시키거나, 누락되었거나 기능이 없는 버전의 단백질을 대체하거나, 세포 또는 유기체에 새로운 단백질 및 관련된 기능성을 도입할 수 있다.
miRNA 억제제와 같은 일부 핵산은 예를 들어 단백질 또는 효소 결핍과 관련된 질병의 치료에 유용한 miRNA에 의해 조절되는 특정 세포 산물의 발현을 달성하는데 사용될 수 있다. miRNA 억제의 치료적 적용은 mRNA 산물의 발현을 조절하는 하나 이상의 miRNA를 억제하는 작제물이 합성될 수 있기 때문에 매우 광범위하다. 내인성 miRNA의 억제는 특정 miRNA 또는 miRNA 그룹과 관련된 질병을 치료하기 위한 수단으로 이의 다운스트림 표적 내인성 단백질 발현을 증가시키고, 세포 또는 유기체의 적절한 기능을 복원할 수 있다.
다른 핵산은 특정 mRNA의 세포내 수준을 하향조절할 수 있으며, 결과적으로 RNA 간섭(RNAi) 또는 안티센스 RNA의 상보적 결합과 같은 과정을 통해 상응하는 단백질의 합성을 하향조절할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 RNAi의 치료적 적용은 또한 매우 광범위한데, 올리고뉴클레오티드 작제물이 표적 mRNA에 대한 임의의 뉴클레오타이드 서열로 합성될 수 있기 때문이다. 표적에는 정상 세포의 mRNA, 암과 같은 질병 상태와 관련된 mRNA, 바이러스와 같은 감염원의 mRNA가 포함될 수 있다. 현재까지, 안티센스 올리고뉴클레오티드 작제물은 시험관내 및 생체내 모델 둘다에서 동족 mRNA의 분해를 통해 표적 단백질을 특이적으로 하향조절하는 능력을 보여주었다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드 작제물은 현재 임상 연구에서 평가되고 있다.
그러나 현재 치료적 측면에서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 데에는 두 가지 문제가 있다. 첫째, 유리 RNA는 혈장에서 뉴클레아제 분해에 민감하다. 둘째, 유리 RNA는 관련 번역 기계가 있는 세포내 구획에 접근하는 능력이 제한되어 있다. 중성 지질, 콜레스테롤, PEG, 페길화된 지질 및 올리고뉴클레오티드와 같은 다른 지질 성분과 함께 제형화된 지질로부터 형성된 지질 나노입자는 혈장에서 RNA의 분해를 차단하고 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 촉진하는 데 사용되었다.
올리고뉴클레오티드 전달을 위한 개선된 지질 및 지질 나노입자에 대한 필요성이 여전히 남아 있다. 바람직하게는, 이들 지질 나노입자는 최적의 약물:지질 비율을 제공하고, 혈청 내 분해 및 제거로부터 핵산을 보호하며, 전신 또는 국소 전달에 적합하고, 핵산의 세포내 전달을 제공할 것이다. 또한, 이들 지질-핵산 입자는 내약성이 좋아야 하고, 적절한 치료 지수를 제공하여 유효 용량의 핵산으로 환자를 치료하는 것이 환자에 대한 허용할 수 없는 독성 및/또는 위험과 관련되지 않도록 해야 한다. 본 발명은 이들 및 관련된 이점을 제공한다.
간단히 말해, 본 발명의 구체예는 단독으로, 또는 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드(예를 들어 모든 스테롤 포함) 및/또는 이들의 유사체, 및/또는 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)과 같은 다른 지질 성분과 조합하여 사용되어 치료제의 전달을 위한 지질 나노입자를 형성할 수 있는 이의 입체이성질체, 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물 또는 호변이성질체(tautomer)를 포함하는 지질 화합물을 제공한다. 일부 경우에, 지질 나노입자는 안티센스 및/또는 메신저 RNA와 같은 핵산을 전달하는 데 사용된다. 감염성 개체 및/또는 단백질 부족으로 인해 발생하는 것과 같은 다양한 질병 또는 상태의 치료를 위해 이러한 지질 나노입자를 사용하는 방법도 제공된다.
일 구체예에서, 하기 구조식 (I)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체, 전구약물 또는 입체이성질체가 제공되며
여기서, R3, L1, L2, G1, G2 및 G3 는 본 명세서에 정의된 바와 같다:
전술한 구조식 (I)의 화합물 중 하나 이상 및 치료제를 포함하는 약학 조성물도 제공된다. 또한 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물을 포함하는 지질 나노입자(LNP)가 제공된다. 일부 구체예에서, 약학 조성물 및/또는 LNP는 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및 고분자 결합 지질로부터 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함한다. 개시된 조성물은 치료제 전달을 위한 지질 나노입자의 형성에 유용하다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게 치료제를 투여하는 방법을 제공하되, 이 방법은 구조식 (I)의 화합물 및 치료제를 포함하는 지질 나노입자의 조성물을 제조하는 단계 및 환자에게 이 조성물을 전달하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 치료제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 방법은 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물 및 치료제를 포함하는 LNP를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 다음의 상세한 설명을 참조하면 명백해질 것이다.
하기 설명에서, 본 발명의 다양한 구체예의 철저한 이해를 제공하기 위해 특정의 구체적인 세부사항이 설명된다. 그러나, 당업자는 본 발명의 구체예가 이러한 세부사항 없이도 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 구체예는 부분적으로 핵산과 같은 활성제 또는 치료제를 포유동물의 세포 내로 생체내 전달하기 위한 지질 나노입자에 사용될 때 이점을 제공하는 신규한 지질의 발견에 기초한다. 특히, 본 발명의 구체예는 이전에 기술된 핵산-지질 나노입자 조성물과 비교하여 생체내에서 핵산의 증가된 활성 및 조성물의 개선된 내약성을 제공하여 치료 지수의 상당한 증가를 초래하는 본 명세서에 기술된 하나 이상의 신규한 지질을 포함하는 핵산-지질 나노입자 조성물을 제공한다. 예를 들어, 구체예는 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 mRNA 및/또는 다른 올리고뉴클레오티드의 시험관내 및 생체내 전달을 위한 개선된 조성물의 제형화를 가능하게 하는 신규한 지질을 제공한다. 일부 구체예에서, 이들 개선된 지질 나노입자 조성물은 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현에 유용하다. 다른 구체예에서, 이들 개선된 지질 나노입자 조성물은 하나의 특정 miRNA 또는 표적 mRNA 또는 여러 mRNA를 조절하는 하나의 miRNA 그룹을 표적으로 하는 miRNA 억제제를 전달함으로써 내인성 단백질 발현의 상향조절에 유용하다. 다른 구체예에서, 이들 개선된 지질 나노입자 조성물은 표적 유전자의 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준을 하향조절(예를 들어, 침묵화)하는 데 유용하다. 일부 다른 구체예에서, 지질 나노입자는 또한 트랜스진의 발현을 위한 mRNA 및 플라스미드의 전달에 유용하다. 또 다른 구체예에서, 지질 나노입자 조성물은 단백질의 발현으로부터 발생하는 약리학적 효과, 예를 들어 적합한 에리트로포이에틴 mRNA의 전달을 통한 적혈구 생산의 증가, 또는 적합한 항원 또는 항체를 인코딩하는 mRNA의 전달을 통한 감염에 대한 보호를 유도하는 데 유용하다.
본 발명의 구체예의 지질 나노입자 및 조성물은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 핵산과 같은 캡슐화된 또는 결합된(예를 들어, 복합된) 치료제의 세포로의 전달을 포함하는 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체예는 적합한 치료제를 캡슐화하거나 이와 결합된 지질 나노입자와 대상체를 접촉시킴으로써 이를 필요로 하는 대상체의 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하되, 지질 나노입자는 본 명세서에 기술된 신규한 지질 중 하나 이상을 포함한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 지질 나노입자의 구체예는 예를 들어 mRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 플라스미드 DNA, microRNA(miRNA), miRNA 억제제(안타고미르/안티미르), 메신저-RNA 간섭 상보적 RNA(micRNA), DNA, 다가 RNA, 다이서 기질 RNA, 상보적 DNA(cDNA) 등을 포함하여 핵산의 전달에 특히 유용하다. 따라서, 본 발명 구체예의 지질 나노입자 및 조성물은 세포를 본 명세서에 기술된 하나 이상의 신규한 지질을 포함하는 지질 나노입자와 접촉시킴으로써 시험관내 및 생체내 둘 다에서 원하는 단백질의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 원하는 단백질(예를 들어, 원하는 단백질을 인코딩하는 메신저 RNA 또는 플라스미드)을 생산하기 위해 발현되는 핵산을 캡슐화하거나 이와 결합되거나 mRNA의 발현을 종결시키는 과정(예를 들어, miRNA 억제제)을 억제한다. 대안으로, 본 발명의 구체예의 지질 나노입자 및 조성물은 세포를 하나 이상의 신규한 지질(예를 들어, 본 명세서에 기재된 구조식 (I)의 화합물)을 포함하는 지질 나노입자와 접촉시킴으로써 시험관내 및 생체내 둘 다에서 표적 유전자 및 단백질의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있으며, 여기서 지질 나노입자는 표적 유전자 발현을 감소시키는 핵산(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(siRNA))을 캡슐화하거나 이와 결합된다. 본 발명의 구체예의 지질 나노입자 및 조성물은 또한 상이한 핵산(예를 들어, mRNA 및 플라스미드 DNA)의 공동 전달을 위해 별도로 또는 조합하여 사용될 수 있으며, 예를 들어, 다양한 핵산(예: 적합한 유전자 변형 효소를 인코딩하는 mRNA 및 숙주 게놈에 혼입하기 위한 DNA 세그먼트(들))의 공존(colocalization)을 요구하는 효과를 제공하는 데 유용할 수 있다.
본 발명의 구체예에 사용하기 위한 핵산은 임의의 이용 가능한 기술에 따라 제조될 수 있다. mRNA의 경우, 주요 제조 방법은 현재 긴 서열 특이적인 mRNA를 생성하는 가장 효율적인 방법을 나타내는 효소 합성(시험관내 전사라고도 함)이지만 이에 제한되지 않는다. 시험관내 전사는 목적 유전자를 인코딩하는 다운스트림 서열에 연결된 업스트림 박테리오파지 프로모터 서열(예를 들어, T7, T3 및 SP6 콜라이파지를 포함하되 이에 제한되지 않음)로 구성된 조작된 DNA 주형으로부터 RNA 분자의 주형 지정 합성 과정을 설명한다. 주형 DNA는 플라스미드 DNA 및 중합효소 연쇄 반응 증폭을 포함하되 이에 제한되지 않는 당업계에 잘 알려진 적절한 기술을 사용하여 다양한 소스로부터 시험관내 전사를 위해 제조될 수 있다(Linpinsel, J.L and Conn, G.L., General protocols for preparation of plasmid DNA template and Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P., and Williams, L.D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), New York, N.Y. Humana Press, 2012, 참조).
RNA의 전사는 생성된 mRNA 전사체의 잠재적 분해를 최소화하면서 중합효소 활성을 지원하는 조건 하에서 상응하는 RNA 중합효소와 아데노신, 구아노신, 우리딘 및 시티딘 리보뉴클레오시드 삼인산(rNTP)의 존재 하에 선형화된 DNA 주형을 사용하여 시험관내에서 일어난다. 시험관내 전사는 RiboMax Large Scale RNA Production System(Promega), MegaScript Transcription 키트(Life Technologies)를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 시판 키트와 RNA 중합효소 및 rNTP를 비롯한 시판 시약을 사용하여 수행될 수 있다. mRNA의 시험관내 전사를 위한 방법론은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Losick, R., 1972, In vitro transcription, Ann Rev Biochem v.41 409-46; Kamakaka, R. T. and Kraus, W. L. 2001. In Vitro Transcription. Current Protocols in Cell Biology. 2:11.6:11.6.1-11.6.17; Beckert, B. And Masquida, B.,(2010) Synthesis of RNA by In Vitro Transcription in RNA in Methods in Molecular Biology v. 703 (Neilson, H. Ed), New York, N.Y. Humana Press, 2010; Brunelle, J.L. and Green, R., 2013, Chapter Five - In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA, Methods in Enzymology v. 530, 101-114 참조; 이들 모두는 참조로 본 명세서에 포함됨).
그런 다음 원하는 시험관내 전사된 mRNA는 전사 또는 관련 반응(혼입되지 않은 rNTP, 단백질 효소, 염, 짧은 RNA 올리고 등 포함)의 원하지 않는 구성 요소로부터 정제된다. mRNA 전사체를 분리하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 잘 알려진 절차에는 1가 양이온 또는 염화리튬이 있는 상태에서 알코올(에탄올, 이소프로판올)을 사용한 페놀/클로로포름 추출 또는 침전이 포함된다. 사용될 수 있는 정제 절차의 추가적인 비제한적인 예는 크기 배제 크로마토그래피(Lukavsky, P.J. and Puglisi, J.D., 2004, Large-scale preparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleotides, RNA v.10, 889-893), 실리카 기반 친화성 크로마토그래피 및 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P., and Williams, L.D. in RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE in Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), New York, N.Y. Humana Press, 2012)을 포함한다. 정제는 SV Total Isolation System(Promega) 및 In Vitro Transcription Cleanup and Concentration Kit(Norgen Biotek)을 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 시판 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
더욱이, 역전사를 통해 다량의 mRNA가 생성될 수 있지만, 산물에는 전체 길이의 mRNA 제제에서 제거해야 할 수 있는 원치 않는 중합효소 활성과 관련된 다수의 비정상 RNA 불순물이 포함될 수 있다. 여기에는 실패한 전사 개시로 인해 생성된 짧은 RNA 뿐만 아니라 RNA 의존성 RNA 중합효소 활성에 의해 생성된 이중 가닥 RNA(dsRNA), RNA 주형에서 RNA 프라이밍된 전사 및 자기-상보적인 3' 확장이 포함된다. dsRNA 구조를 가진 이러한 오염물은 특정 핵산 구조를 인식하고 강력한 면역 반응을 유도하는 기능을 하는 진핵 세포의 다양한 선천적 면역 센서와의 상호 작용을 통해 원치 않는 면역 자극 활동을 유발할 수 있다는 것이 입증되었다. 이는 선천성 세포 면역 반응 동안 단백질 합성이 감소하기 때문에 mRNA 번역을 극적으로 감소시킬 수 있다. 따라서, 이러한 dsRNA 오염물을 제거하기 위한 추가 기술이 개발되었으며 확장 가능한 HPLC 정제를 포함하여 당업계에 알려져 있으나 이에 제한되지 않는다(예를 들어 Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. And Weissman, D., 2011, Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-encoding mRNA, Nucl Acid Res, v. 39 e142; Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H., and Kariko, K., HPLC Purification of in vitro transcribed long RNA in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013 참조). HPLC 정제된 mRNA는 특히 프라이머리 세포에서 그리고 생체내에서 훨씬 더 높은 수준으로 번역되는 것으로 보고되었다.
시험관내에서 전사된 mRNA의 특정 특성을 변경하고 이의 유용성을 향상시키는 데 사용되는 상당히 다양한 변형이 당업계에에 설명되어 있다. 여기에는 mRNA의 5' 및 3' 말단에 대한 변형이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 내인성 진핵세포 mRNA는 일반적으로 성숙한 분자의 5'-말단에 캡 구조를 포함하고 있으며 이는 mRNA 캡 결합 단백질(CBP)의 결합을 중재하는 데 중요한 역할을 하며, 이는 차례로 세포 내 mRNA 안정성과 mRNA 번역 효율성을 향상시키는 역할을 한다. 캡핑된 mRNA 전사체를 사용하면 최고 수준의 단백질 발현이 달성된다. 5'-캡은 5'-최다 뉴클레오티드와 구아닌 뉴클레오티드 사이에 5'-5'-삼인산 결합을 포함한다. 접합된 구아닌 뉴클레오티드는 N7 위치에서 메틸화된다. 추가 변형에는 2'-히드록실기의 최종 및 끝에서 두 번째 5'-뉴클레오티드의 메틸화가 포함된다.
다양한 개별 캡 구조를 사용하여 시험관내에서 전사된 합성 mRNA의 5'-캡을 생성할 수 있다. 합성 mRNA의 5'-캡핑은 화학적 캡 유사체와 공동-전사적으로 수행될 수 있다(즉, 시험관내 전사 중 캡핑). 예를 들어, ARCA(Anti-Reverse Cap Analog) 캡은 하나의 구아닌이 3'-O-메틸기 뿐만 아니라 N7 메틸기를 포함하는 5'-5'-삼인산 구아닌-구아닌 결합을 포함한다. 그러나 전사체의 최대 20%는 이 공동-전사 과정에 캡이 없는 상태로 남아 있으며 합성 유사체는 실제 mRNA의 5' 캡 구조와 동일하지 않아 번역 가능성과 세포 안정성이 잠재적으로 감소한다. 대안으로, 합성 mRNA 분자는 전사 후 효소적으로 캡핑될 수도 있다. 이는 캡 결합 단백질의 결합을 향상시키고, 반감기를 증가시키며, 5' 엔도뉴클레아제에 대한 감수성을 감소시키고, 및/또는 5' 디캡핑하는 내인성 5'-캡을 구조적으로 또는 기능적으로 더 밀접하게 모방하는 보다 확실한 5'-캡 구조를 생성할 수 있다. 수많은 5'-캡 유사체가 개발되었고, 당업계에 알려져 있으며, mRNA 안정성과 번역성을 향상시킨다(예를 들어, Grudzien-Nogalska, E., Kowalska, J., Su, W., Kuhn, A.N., Slepenkov, S.V., Darynkiewicz, E., Sahin, U., Jemielity, J., and Rhoads, R.E., Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013 참조).
3'-말단에는 일반적으로 RNA 프로세싱 중에 아데닌 뉴클레오티드의 긴 사슬(폴리-A 꼬리)이 mRNA 분자에 추가된다. 전사 직후, 전사체의 3'-말단이 절단되어 폴리-A 중합효소가 폴리아데닐화라고 불리는 과정에서 RNA에 아데닌 뉴클레오티드 사슬을 추가하는 3' 히드록실기를 유리시킨다. 폴리-A 꼬리는 mRNA의 번역 효율성과 안정성을 모두 향상시키는 것으로 광범위하게 나타났다(Bernstein, P. and Ross, J., 1989, Poly (A), poly (A) binding protein and the regulation of mRNA stability, Trends Bio Sci v. 14 373-377; Guhaniyogi, J. And Brewer, G., 2001, Regulation of mRNA stability in mammalian cells, Gene, v. 265, 11-23; Dreyfus, M. And Regnier, P., 2002, The poly (A) tail of mRNAs: Bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria, Cell, v.111, 611-613 참조).
시험관내에서 전사된 mRNA의 폴리(A) 꼬리달기(tailing)는 폴리(T) 트랙을 DNA 주형으로 클로닝하거나 폴리(A) 중합효소를 사용한 전사 후 부가를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 접근법을 사용하여 달성될 수 있다. 첫 번째의 경우는 폴리(T) 트랙의 크기에 따라 정의된 길이의 폴리(A) 꼬리를 갖는 mRNA의 시험관내 전사를 허용하지만 주형에 대한 추가 조작이 필요하다. 후자의 경우는 RNA의 3' 말단에 아데닌 잔기의 결합을 촉매하는 폴리(A) 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사된 mRNA에 폴리(A) 꼬리를 효소적으로 추가하는 것과 관련되어 있어 DNA 주형을 추가로 조작할 필요가 없다. 이질적인 길이의 폴리(A) 꼬리를 갖는 mRNA가 생성된다. 5'-캡핑 및 3'-폴리(A) 꼬리달기는 폴리(A) 중합효소 꼬리달기 키트(EpiCenter), mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra 키트 및 폴리(A) 꼬리달기 키트(Life Technologies)를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 시판 키트와 다양한 ARCA 캡, Poly(A) 중합효소 등의 시판 시약을 사용하여 수행할 수 있다.
5' 캡 및 3' 폴리아데닐화 외에도 시험관내 전사체의 다른 변형이 번역 효율성 및 안정성과 관련된 이점을 제공하는 것으로 보고되었다. 병원성 DNA 및 RNA가 진핵생물 내의 다양한 센서에 의해 인식될 수 있고 강력한 선천성 면역 반응을 유발할 수 있다는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 병원성 DNA와 자가 DNA 및 RNA를 구별하는 능력은 적어도 부분적으로는 구조와 뉴클레오시드 변형에 기반을 두고 있는 것으로 나타났다. 왜냐하면 천연 공급원의 대부분의 핵산은 변형된 뉴클레오시드를 포함하고 있기 때문이다. 대조적으로, 시험관내에서 합성된 RNA에는 이러한 변형이 부족하여 면역자극성이 있게 되어 위에서 설명한 대로 효과적인 mRNA 번역을 억제할 수 있다. 시험관내에서 전사된 mRNA에 변형된 뉴클레오시드를 도입하면 RNA 센서의 인식 및 활성화를 방지하여 이러한 바람직하지 않은 면역자극 활성을 완화하고 번역 능력을 향상시킬 수 있다(예를 들어, Kariko, K. And Weissman, D. 2007, Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development, Curr Opin Drug Discov Devel, v.10 523-532; Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013); Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A., Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., Weissman, D., 2008, Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Mol Ther v.16, 1833-1840 참조). 변형된 RNA의 합성에 사용되는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 일반적인 방법 및 절차를 사용하여 모니터링하고 활용할 수 있도록 제조될 수 있다. 단독으로 또는 다른 변형된 뉴클레오시드와 어느 정도 조합하여 시험관내 전사된 mRNA에 혼입될 수 있는 매우 다양한 뉴클레오시드 변형이 이용 가능하다(예를 들어 US2012/0251618 참조). 뉴클레오시드 변형 mRNA의 시험관내 합성은 면역 센서를 활성화하는 능력이 감소하고 번역 능력이 향상되는 것으로 보고되었다.
번역가능성 및 안정성 측면에서 이점을 제공하기 위해 변형될 수 있는 mRNA의 다른 구성성분에는 5' 및 3' 미번역 영역(UTR)이 포함된다. UTR(바람직한 5' 및 3' UTR을 세포 또는 바이러스 RNA로부터 얻을 수 있음)의 최적화는 둘 다 또는 독립적으로 시험관내에서 전사된 mRNA의 mRNA 안정성 및 번역 효율을 증가시키는 것으로 나타났다(예를 들어, Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation in Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013 참조).
mRNA 외에, 다른 핵산 페이로드가 본 발명의 구체예에 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 제조 방법에는 화학적 합성 및 긴 전구체의 효소적, 화학적 절단, 위에서 설명한 시험관내 전사 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. DNA 및 RNA 뉴클레오티드를 합성하는 방법이 널리 사용되고 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Gait, M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: IRL Press, 1984; and Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005 참조; 둘 다 참조로 본 명세서에 포함된다).
플라스미드 DNA의 경우, 본 발명의 구체예와 함께 사용하기 위한 제제는 일반적으로 목적 플라스미드를 함유하는 박테리아의 액체 배양물에서 시험관내 플라스미드 DNA의 확장 및 분리를 활용하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 항생제(페니실린, 카나마이신 등)에 대한 내성을 인코딩하는 목적 플라스미드에 유전자가 존재하면 목적 플라스미드를 함유한 박테리아가 항생제 함유 배양물에서 선택적으로 성장할 수 있다. 플라스미드 DNA를 분리하는 방법이 널리 사용되고 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Heilig, J., Elbing, K. L. and Brent, R (2001) Large-Scale Preparation of Plasmid DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 41:II:1.7:1.7.1-1.7.16; Rozkov, A., Larsson, B., Gillstrφm, S., Bjφrnestedt, R. and Schmidt, S. R. (2008), Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol. Bioeng., 99: 557-566; 및 US6197553B1 참조). 플라스미드 분리는 Plasmid Plus(Qiagen), GenJET Plasmid MaxiPrep(Thermo) 및 PureYield MaxiPrep(Promega) 키트를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 시판 키트와 시판 시약을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 지질의 다양한 예시적인 구체예, 지질 나노입자 및 이를 포함하는 조성물, 및 유전자 및 단백질 발현을 조절하기 위한 핵산과 같은 활성제(예를 들어, 치료제)를 전달하기 위한 그들의 용도가 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 달리 명시하지 않는 한 그들에게 부여된 의미를 갖는다.
문맥상 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, "포함하다(comprise)"라는 단어와 그 변형형, 예를 들어 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"은 개방적이고 포괄적인 의미, 즉 "포함하나 이에 제한되지 않는"으로 해석되어야 한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 "일 구체예" 또는 "하나의 구체예"에 대한 참조는 해당 구체예와 관련하여 설명된 특정한 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 구체예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에 나타나는 "일 구체예에서" 또는 "하나의 구체예에서"라는 문구가 반드시 모두 동일한 구체예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특징, 구조 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 명세서 및 청구범위에 사용된 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
"원하는 단백질의 발현을 유도하다"라는 문구는 원하는 단백질의 발현을 증가시키는 핵산의 능력을 지칭한다. 단백질 발현 정도를 조사하기 위해, 시험 샘플(예: 원하는 단백질을 발현하는 배양물 중 세포 샘플) 또는 시험 포유동물(예: 인간과 같은 포유동물 또는 설치류(예: 마우스) 또는 비인간 영장류(예를 들어, 원숭이) 모델과 같은 동물 모델)을 핵산(예를 들어, 본 발명의 지질과 조합된 핵산)과 접촉시킨다. 시험 샘플 또는 시험 동물에서 원하는 단백질의 발현은 핵산과 접촉되거나 투여되지 않은 대조군 샘플(예: 원하는 단백질을 발현하는 배양물 중 세포 샘플) 또는 대조군 포유동물(예: 인간과 같은 포유동물 또는 설치류(예: 마우스) 또는 인간이 아닌 영장류(예: 원숭이) 모델과 같은 동물 모델)에서의 원하는 단백질의 발현과 비교된다. 원하는 단백질이 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물에 존재하는 경우, 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물에서의 원하는 단백질의 발현은 1.0의 값으로 할당될 수 있다. 특정 구체예에서, 원하는 단백질의 발현을 유도하는 것은 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물에서의 원하는 단백질 발현 수준에 대한 시험 샘플 또는 시험 포유동물에서의 원하는 단백질 발현의 비율이 1 초과, 예를 들어 약 1.1, 1.5, 2.0. 5.0 또는 10.0일 때 달성된다. 원하는 단백질이 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물에 존재하지 않는 경우, 시험 샘플 또는 시험 포유동물에서 측정 가능한 수준의 원하는 단백질이 검출되면 원하는 단백질의 발현을 유도하는 것이 달성된다. 당업자는 예를 들어 샘플 내 단백질 발현 수준을 결정하기 위한 적절한 분석, 예를 들어, 닷 블롯, 노던 블롯, 인 시츄 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능 및 표현형 분석 또는 적절한 조건에서 형광 또는 발광을 생성할 수 있는 리포터 단백질 기반 분석을 이해할 것이다.
"표적 유전자의 발현을 억제하는"이라는 문구는 표적 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키거나 억제하는 핵산의 능력을 지칭한다. 유전자 침묵의 정도를 조사하려면, 시험 샘플(예: 표적 유전자를 발현하는 배양물 중 세포 샘플) 또는 시험 포유동물(예: 인간과 같은 포유동물, 설치류(예: 마우스) 또는 인간이 아닌 영장류(예: 원숭이) 모델과 같은 동물 모델)은 표적 유전자의 발현을 침묵시키거나 감소시키거나 억제하는 핵산과 접촉된다. 시험 샘플 또는 시험 동물에서의 표적 유전자의 발현은 핵산과 접촉되거나 투여되지 않은 대조군 샘플(예: 표적 유전자를 발현하는 배양물 중 세포 샘플) 또는 대조군 포유동물(예: 인간과 같은 포유동물, 설치류(예: 마우스) 또는 인간이 아닌 영장류(예: 원숭이) 모델과 같은 동물 모델)에서의 표적 유전자의 발현과 비교된다. 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물에서의 표적 유전자의 발현은 100% 값으로 할당될 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 유전자 발현의 침묵, 억제 또는 감소는 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물의 표적 유전자 발현 수준에 대한 시험 샘플 또는 시험 포유동물의 표적 유전자 발현 수준이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 0%일 때 달성된다. 즉, 핵산은 핵산과 접촉되거나 투여되지 않은 대조군 샘플 또는 대조군 포유동물의 표적 유전자 발현 수준과 비교하여 시험 샘플 또는 시험 포유동물에서 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 표적 유전자의 발현을 침묵, 억제 또는 감소할 수 있다. 표적 유전자 발현 수준을 결정하기 위한 적합한 분석에는 당업자에게 공지된 기술, 예를 들어 닷 블롯, 노던 블롯, 인 시츄 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 분석을 이용한 단백질 또는 mRNA 수준의 검사를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
치료 핵산과 같은 활성제 또는 치료제의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 원하는 효과, 예를 들어 핵산의 부재 하에서 검출된 정상적인 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현의 증가 또는 억제를 생성하기에 충분한 양이다. 표적 서열의 발현 증가는 핵산의 부재 하에서 존재하지 않는 발현 산물의 경우 측정 가능한 수준이 검출될 때 달성된다. 발현 산물이 핵산과 접촉되기 전 어느 정도 수준으로 존재하는 경우, 발현의 증가는 대조군과 비교하여 mRNA와 같은 핵산을 사용하여 얻은 값의 배수 증가가 약 1.05, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.75, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 5000, 10000 이상일 때 달성된다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현 억제는 대조군 대비 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산으로 얻은 값이 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 0%인 경우 달성된다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하기 위한 적합한 분석에는 예를 들어 닷 블롯, 노던 블롯, 인 시츄 혼성화, ELISA, 면역침전, 효소 기능, 적합한 리포터 단백질의 형광 또는 발광뿐만 아니라 당업자에게 공지된 표현형 분석과 같이 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA 수준을 검사하는 것이 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 적어도 2개의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 함유하는 중합체를 지칭하며, DNA, RNA 및 이들의 하이브리드를 포함한다. DNA는 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, cDNA, PCR 산물 또는 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 메신저 RNA(mRNA), 안티센스 RNA, miRNA, micRNA, 다가 RNA, 다이서 기질 RNA 또는 바이러스 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산은 합성, 자연적으로 발생 및 비-자연적으로 발생하며, 레퍼런스 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예에는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드 및 펩타이드-핵산(PNA)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 레퍼런스 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 표시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 명시적으로 표시된 서열뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 오르토로그, 단일 뉴클레오티드 다형성 및 상보적 서열을 암시적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 디옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8:91-98 (1994)). "뉴클레오티드"는 당 디옥시리보스(DNA) 또는 리보스(RNA), 염기 및 인산염 그룹을 포함한다. 뉴클레오티드는 인산기를 통해 서로 연결된다. "염기"에는 퓨린과 피리미딘이 포함되며, 여기에는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신 및 천연 유사체, 및 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응기를 배치하는 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체가 추가로 포함된다.
용어 "유전자"는 폴리펩타이드 또는 전구체 폴리펩타이드의 생산에 필요한 부분 길이 또는 전체 길이의 코딩 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA) 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 "유전자 산물"은 RNA 전사체 또는 폴리펩타이드와 같은 유전자의 산물을 지칭한다.
용어 "지질"은 지방산의 에스테르를 포함하나 이에 제한되지 않는 유기 화합물 그룹을 지칭하며 일반적으로 물에는 잘 녹지 않지만 많은 유기 용매에는 녹는 것을 특징으로 한다. 이들은 일반적으로 적어도 세 가지 클래스로 나뉜다: (1) 왁스뿐만 아니라 지방과 오일을 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질과 당지질을 포함하는 "복합 지질"; (3) 스테로이드와 같은 "파생 지질".
"스테로이드"는 하기 탄소 골격을 포함하는 화합물이다:
스테로이드의 비제한적인 예에는 콜레스테롤 등이 포함된다.
"양이온성 지질"은 양으로 하전될 수 있는 지질을 지칭한다. 예시적인 양이온성 지질은 양전하를 띠는 하나 이상의 아민기(들)를 포함한다. 바람직한 양이온성 지질은 pH에 따라 양으로 하전되거나 중성의 형태로 존재할 수 있도록 이온화 가능하다. 양이온성 지질의 이온화는 다양한 pH 조건에서 지질 나노입자의 표면 전하에 영향을 미친다. 이러한 전하 상태는 혈장 단백질 흡수, 혈액 제거 및 조직 분포(Semple, S.C., et al., Adv. Drug Deliv Rev 32:3-17 (1998)) 뿐만 아니라 핵산의 세포내 전달에 중요한 엔도좀분해성 비이중층 구조를 형성하는 능력 (Hafez, I.M., et al., Gene Ther 8:1188-1196 (2001))에도 영향을 미칠 수 있다.
용어 "고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)"은 지질 부분과 고분자 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 고분자 결합 지질의 예는 페길화된 지질이다. 용어 "페길화된 지질"은 지질 부분과 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 지칭한다. 페길화된 지질은 당업계에 공지되어 있으며 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(1-(monomethoxy-polyethyleneglycol)-2,3-dimyristoylglycerol, PEG-DMG) 등을 포함한다.
용어 "중성 지질"은 선택된 pH에서 하전되지 않거나 중성의 쯔위터이온 형태로 존재하는 임의의 다수의 지질 종을 지칭한다. 생리학적 pH에서 이러한 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)과 같은 포스포티딜콜린; 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)과 같은 포스파티딜에탄올아민; 스핑고미엘린(SM); 세라마이드; 스테롤과 같은 스테로이드; 및 이들의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 중성 지질은 합성되거나 자연적으로 유래될 수 있다.
용어 "하전된 지질"은 유용한 생리학적 범위(예: pH ~3 내지 pH ~9) 내에서 pH와 관계없이 양전하 또는 음전하 형태로 존재하는 다양한 지질 종을 지칭한다. 하전된 지질은 합성되거나 자연적으로 유래될 수 있다. 하전된 지질의 예는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 스테롤 헤미숙시네이트, 디알킬 트리메틸암모늄-프로판(예: DOTAP, DOTMA), 디알킬 디메틸아미노프로판, 에틸 포스포콜린, 디메틸아미노에탄 카르바모일 스테롤(예: DC-Chol)을 포함한다.
용어 "지질 나노입자"는 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물 또는 다른 명시된 양이온성 지질을 포함하는 나노미터 정도의 적어도 하나의 치수(예를 들어, 1-1,000 nm)를 갖는 입자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 목적 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관, 종양 등)에 핵산(예를 들어, mRNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있는 제형에 포함된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 지질 나노입자는 핵산을 포함한다. 이러한 지질 나노입자는 전형적으로 구조식 (I)의 화합물 및 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산과 같은 활성제 또는 치료제는 지질 나노입자의 지질 부분 또는 지질 나노입자의 지질 부분의 일부 또는 전부에 의해 둘러싸이는 수성 공간에 캡슐화될 수 있으며, 이로써 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유발되는 효소 분해 또는 기타 바람직하지 않은 영향(예: 불리한 면역 반응)으로부터 이를 보호한다.
다양한 구체예에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 40 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 150 nm, 약 60 nm 내지 약 130 nm, 약 70 nm 내지 약 110 nm, 약 70 nm 내지 약 100 nm, 약 80 nm 내지 약 100 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 또는 150 nm의 평균 직경을 가지며 실질적으로 독성이 없다. 특정 구체예에서, 지질 나노입자에 존재할 때 핵산은 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 내성을 갖는다. 핵산을 포함하는 지질 나노입자 및 이의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2004/0142025, 2007/0042031 및 PCT 공개 번호 WO 2017/004143, WO 2015/199952, WO 2013/016058 및 WO 2013/086373에 개시되어 있으며, 그 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "캡슐화된 지질"은 전체 캡슐화, 부분 캡슐화 또는 둘 모두를 갖는 핵산(예를 들어, mRNA)과 같은 활성제 또는 치료제를 제공하는 지질 나노입자를 지칭한다. 구체예에서, 핵산(예를 들어, mRNA)은 지질 나노입자에 완전히 캡슐화된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "수용액"은 물을 포함하는 조성물을 지칭한다.
핵산-지질 나노입자와 관련된 "혈청 안정성"은 유리 DNA 또는 RNA를 유의적으로 분해하는 혈청 또는 뉴클레아제 분석에 노출된 후에도 뉴클레오티드가 유의적으로 분해되지 않음을 의미한다. 적합한 분석에는 예를 들어 표준 혈청 분석, DNAse 분석 또는 RNAse 분석이 포함된다.
본 명세서에 사용된 "전신 전달"은 유기체 내에서 활성제의 광범위한 노출을 초래할 수 있는 치료 산물의 전달을 지칭한다. 일부 투여 기술은 특정 제제의 전신 전달로 이어질 수 있지만 다른 약물은 그렇지 않을 수 있다. 전신 전달은 유용한, 바람직하게는 치료적 함량의 제제가 신체의 대부분 부위에 노출되는 것을 의미한다. 지질 나노입자의 전신 전달은 예를 들어 정맥내, 동맥내, 피하 및 복강내 전달을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 지질 나노입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의한다.
본 명세서에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내의 표적 부위에 활성 물질을 직접 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 제제는 종양과 같은 질병 부위, 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사함으로써 국소적으로 전달될 수 있다. 국소 전달에는 국소 적용이나 근육내, 피하 또는 피내 주사와 같은 국소 주사 기술도 포함될 수 있다. 국소 전달은 전신 약리학적 효과를 배제하지 않는다.
"알킬"은 예를 들어 1 내지 24개의 탄소 원자(C1-C24 알킬), 4 내지 20개의 탄소 원자(C4-C20 알킬), 6 내지 16개의 탄소 원자(C6-C16 알킬), 6 내지 9개의 탄소 원자(C6-C9 알킬), 1 내지 15개의 탄소 원자(C1-C15 알킬), 1 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12 알킬), 1 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8 알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6 알킬)를 가지면서 포화되고, 단일 결합, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 1 메틸에틸(이소 프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t 부틸), 3-메틸헥실, 2-메틸헥실 등에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된 탄소와 수소 원자만으로 구성된 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼을 지칭한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬기는 임의로 치환된다.
"알콕시"는 화학식 -ORa의 라디칼을 지칭하며, 여기서 Ra 는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알콕시기는 임의로 치환된다.
"알킬아미닐"은 화학식 -NHRa 또는 -NRaRa의 라디칼을 지칭하며, 여기서 각각의 Ra는 독립적으로 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬 라디칼이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬아미닐기는 임의로 치환된다.
"알케닐"은 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하고, 예를 들어 2 내지 24개의 탄소 원자(C2-C24 알케닐), 4 내지 20개의 탄소 원자(C4-C20 알케닐), 6 내지 16개의 탄소 원자(C6-C16 알케닐), 6 내지 9개의 탄소 원자(C6-C9 알케닐), 2 내지 15개의 탄소 원자(C2-C15 알케닐), 2 내지 12개의 탄소 원자(C2-C12 알케닐), 2 내지 8개의 탄소 원자(C2-C8 알케닐) 또는 2 내지 6개의 탄소 원자(C2-C6 알케닐)를 가지며, 단일 결합, 예를 들어, 에테닐, 프로프-1-에닐, 부트-1-에닐, 펜트-1-에닐, 펜타-1,4-디에닐 등에 의해 분자의 나머지 부분에 부착된 탄소와 수소 원자로만 구성된 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬 라디칼을 지칭한다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알케닐기는 임의로 치환된다.
"알킬렌" 또는 "알킬렌 사슬"은 탄소와 수소로만 구성되고, 포화되며, 예를 들어, 1 내지 24개의 탄소 원자(C1-C24 알킬렌), 2 내지 24개의 탄소 원자(C2-C24 알킬렌), 1 내지 15개의 탄소 원자(C1-C15 알킬렌), 1 내지 12개의 탄소 원자(C1-C12 알킬렌), 1 내지 8개의 탄소 원자(C1-C8 알킬렌), 1 내지 6개의 탄소 원자(C1-C6 알킬렌), 2 내지 4개의 탄소 원자(C2-C4 알킬렌), 1 내지 2개의 탄소 원자(C1-C2 알킬렌), 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌 등을 가지며, 분자의 나머지 부분을 라디칼 그룹에 연결하는 선형 또는 분지형 2가 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬렌 사슬은 단일 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 부착되고 단일 결합을 통해 라디칼 그룹에 부착된다. 알킬렌 사슬이 분자의 나머지 부분과 라디칼 그룹에 부착되는 지점은 사슬 내 탄소 1개 또는 임의의 탄소 2개를 통해 이루어질 수 있다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알킬렌 사슬은 임의로 치환될 수 있다.
"알케닐렌" 또는 "알케닐렌 사슬"은 탄소와 수소로만 구성되고, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하며, 예를 들어, 2 내지 24개의 탄소 원자(C2-C24 알케닐렌), 2 내지 15개의 탄소 원자(C2-C15 알케닐렌), 2 내지 12개의 탄소 원자(C2-C12 알케닐렌), 2 내지 8개의 탄소 원자(C2-C8 알케닐렌), 2 내지 6개의 탄소 원자(C2-C6 알케닐렌) 또는 2 내지 4개의 탄소 원자(C2-C4 알케닐렌), 예를 들어 에테닐렌, 프로페닐렌, n-부테닐렌 등을 가지며, 분자의 나머지 부분을 라디칼 그룹에 연결하는 선형 또는 분지형 2가 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알케닐렌 사슬은 단일 또는 이중 결합을 통해 분자의 나머지 부분에 부착되고 단일 또는 이중 결합을 통해 라디칼 그룹에 부착된다. 알케닐렌 사슬이 분자의 나머지 부분과 라디칼 그룹에 부착되는 지점은 사슬 내의 탄소 1개 또는 임의의 탄소 2개를 통해 이루어질 수 있다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 알케닐렌 사슬은 임의로 치환될 수 있다.
"아릴"은 수소, 6 내지 18개의 탄소 원자 및 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 카보사이클릭(carbocyclic) 고리계 라디칼을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 아릴 라디칼은 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템이다. 아릴 라디칼은 아세안트릴렌, 아세나프틸렌, 아세페난트릴렌, 안트라센, 아줄렌, 벤젠, 크리센, 플루오란텐, 플루오렌, as-인다센, s-인다센, 인단, 인덴, 나프탈렌, 페날렌, 페난트렌, 플레이아덴, 피렌 및 트리페닐렌으로부터 유래된 아릴 라디칼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "아릴" 또는 접두사 "ar-"(예: "아르알킬")는 임의로 치환된 아릴 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.
"아르알킬"은 화학식 -Rb-Rc의 라디칼을 지칭하며, 여기서 Rb는 위에 정의된 알킬렌 또는 알케닐렌이고, Rc는 위에 정의된 하나 이상의 아릴 라디칼, 예를 들어 벤질, 디페닐메틸 등이다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 아르알킬기는 임의로 치환된다.
"헤테로사이클릭 고리"는 2 내지 12개의 탄소 원자와 질소, 산소 및 황으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자로 구성된 안정한 3-원 내지 18-원의 비방향족 고리 라디칼을 지칭한다. 명세서에 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 헤테로사이클릴 라디칼은 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있고; 헤테로사이클릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며; 질소 원자는 임의로 4차화될 수 있고; 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 이러한 헤테로사이클릴 라디칼의 예시는 디옥솔라닐, 티에닐[1,3]디티아닐, 데카히드로이소퀴놀릴, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 옥타히드로인돌릴, 옥타히드로이소인돌릴, 2-옥소피페라지닐, 2-옥소피페리디닐, 2-옥소피롤리디닐, 옥사졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 4-피페리도닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 퀴누클리디닐, 티아졸리디닐, 테트라히드로푸릴, 트리티아닐, 테트라히드로피라닐, 티오모르폴리닐, 티아모르폴리닐, 1-옥소-티오모르폴리닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로사이클릴기는 임의로 치환될 수 있다.
"헤테로아릴"은 수소 원자, 1 내지 13개의 고리 탄소 원자, 질소, 산소 및 황으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 6개의 고리 헤테로원자 및 헤테로원자를 포함하는 적어도 하나의 방향족 고리를 포함하는 5-원 내지 14-원 고리 시스템 라디칼을 지칭한다. 본 발명의 구체예의 목적을 위해, 헤테로아릴 라디칼은 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭, 바이사이클릭, 트리사이클릭 또는 테트라사이클릭 고리 시스템일 수 있고; 헤테로아릴 라디칼의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며; 질소 원자는 임의로 4차화될 수 있다. 예시는 아제피닐, 아크리디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤진돌릴, 벤조디옥솔릴, 벤조푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조티아디아졸릴, 벤조[b][1,4]디옥세피닐, 1,4-벤조디옥사닐, 벤조나프토푸라닐, 벤조옥사졸릴, 벤조디옥솔릴, 벤조디옥시닐, 벤조피라닐, 벤조피라노닐, 벤조푸라닐, 벤조푸라노닐, 벤조티에닐(벤조티오페닐), 벤조트리아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 디벤조푸라닐, 디벤조티오페닐, 푸라닐, 푸라노닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 이소인돌릴, 인돌리닐, 이소인돌리닐, 이소퀴놀릴, 인돌리지닐, 이속사졸릴, 나프티리디닐, 옥사디아졸릴, 2-옥소아제피닐, 옥사졸릴, 옥시라닐, 1-옥시도피리디닐, 1-옥시도피리미디닐, 1-옥시도피라지닐, 1-옥시도피리다지닐, 1-페닐-1H-피롤릴, 페나지닐, 페노티아지닐, 페녹사진기닐, 프탈라지닐, 프테리디닐, 퓨리닐, 피롤릴, 피라졸릴, 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 퀴누클리디닐, 이소퀴놀리닐, 테트라히드로퀴놀리닐, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 트리아지닐 및 티오페닐(즉, 티에닐)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 명세서에서 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 헤테로아릴기는 임의로 치환된다.
본 명세서에 사용된 용어 "치환된"은 임의의 상기 기(예를 들어, 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, 아릴 및 아르알킬)를 의미하며, 여기서, 적어도 하나의 수소 원자는 다음과 같으나 이에 제한되지 않는 비수소 원자에 대한 결합에 의해 대체된다: F, Cl, Br, I 등의 할로겐 원자; 옥소기(=O); 히드록실기(-OH); C1-C12 알킬기; 시클로알킬기; -(C=O)OR'; -O(C=O)R'; -C(=O)R'; -OR'; -S(O)xR'; -S-SR'; -C(=O)SR'; -SC(=O)R'; -NR'R'; -NR'C(=O)R'; -C(=O)NR'R'; -NR'C(=O)NR'R'; -OC(=O)NR'R'; -NR'C(=O)OR'; -NR'S(O)xNR'R'; -NR'S(O)xR'; 및 -S(O)xNR'R', 여기서, R'는 각 경우에 독립적으로 H, C1-C15 알킬 또는 시클로알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다. 일부 구체예에서, 치환기는 C1-C12 알킬기이다. 다른 구체예에서, 치환기는 플루오로와 같은 할로기이다. 다른 구체예에서, 치환기는 옥소(=O)기이다. 다른 구체예에서, 치환기는 히드록실기이다. 다른 구체예에서, 치환기는 알콕시기(-OR')이다. 다른 구체예에서, 치환기는 카르복실기이다. 다른 구체예에서, 치환기는 아민기(-NR'R')이다.
"임의의" 또는 "임의로"(예를 들어, 임의로 치환된)는 이후에 설명되는 상황의 사건이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있으며, 설명에는 해당 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함된다는 의미한다. 예를 들어, "임의로 치환된 알킬"은 알킬 라디칼이 치환될 수도 있고 치환되지 않을 수도 있다는 것을 의미하며, 설명에는 치환된 알킬 라디칼과 치환이 없는 알킬 라디칼이 모두 포함된다는 의미이다.
용어 "전구약물"은 생리학적 조건 하에서 또는 가용매분해(solvolysis)에 의해 구조식 (I)의 생물학적 활성 화합물로 전환될 수 있는 화합물을 나타내는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "전구약물"은 약학적으로 허용가능한 구조식 (I)의 화합물의 대사 전구체를 지칭한다. 전구약물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 때 불활성일 수 있지만 생체내에서 구조식 (I)의 활성 화합물로 전환된다. 전구약물은 전형적으로 생체내에서 신속하게 변형되어 예를 들어 혈액 내 가수분해에 의해 구조식 (I)의 모 화합물을 생성한다. 전구약물 화합물은 종종 포유동물 유기체에서 용해도, 조직 적합성 또는 지연 방출의 이점을 제공한다(Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), pp. 7-9, 21-24 (Elsevier, Amsterdam) 참조). 전구약물에 대한 논의는 Higuchi, T., et al., A.C.S. Symposium Series, Vol. 14, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987에서 제공된다.
용어 "전구약물"은 또한 이러한 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여될 때 구조식 (I)의 활성 화합물을 생체내에서 방출하는 임의의 공유 결합된 담체를 포함하는 것을 의미한다. 구조식 (I)의 화합물의 전구약물은 구조식 (I)의 화합물에 존재하는 작용기를 일상적인 조작이나 생체내에서 구조식 (I)의 모 화합물로 절단되는 방식으로 변형함으로써 제조될 수 있다. 전구약물은 구조식 (I)의 화합물을 포함하되, 히드록시기, 아미노기 또는 머캅토기는 구조식 (I)의 화합물의 전구약물이 포유동물 대상체에게 투여될 때 절단되어 각각 유리 히드록시기, 유리 아미노기 또는 유리 머캅토기를 형성하는 임의의 기에 결합된다. 전구약물의 예에는 구조식 (I)의 화합물 등에서 아민 작용기의 알코올 또는 아미드 유도체의 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체가 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 구체예는 또한 하나 이상의 원자를 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체함으로써 동위원소 표지된 구조식 (I)의 화합물의 모든 약학적으로 허용가능한 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 개시된 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예에는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 플루오린, 염소 및 요오드의 동위원소, 예컨대 각각 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I, 및 125I를 포함한다. 이러한 방사성표지된 화합물은 예를 들어 작용 부위 또는 방식을 특성화하거나 약리학적으로 중요한 작용 부위에 대한 결합 친화성을 특성화함으로써 화합물의 유효성을 결정하거나 측정하는 데 도움이 될 수 있다. 예를 들어 방사성 동위원소를 포함하는 구조식 (I) 또는 (II)의 특정 동위원소 표지된 화합물은 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 유용하다. 방사성 동위원소인 삼중수소, 즉, 3H 및 탄소-14, 즉, 14C는 혼입이 용이하고 검출이 용이하다는 점에서 이러한 목적에 특히 유용하다.
중수소, 즉 2H와 같은 더 무거운 동위원소로의 대체는 더 큰 대사 안정성, 예를 들어 생체내 반감기 증가 또는 복용량 요구량 감소로 인한 특정 치료 이점을 제공할 수 있으므로 일부 상황에서는 선호될 수 있다.
11C, 18F, 15O 및 13N과 같은 양전자 방출 동위원소로 대체하는 것은 기질 수용체 점유를 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영술(PET) 연구에 유용할 수 있다. 동위원소 표지된 구조식 (I)의 화합물은 일반적으로 당업자에게 공지된 통상적인 기술에 의해 또는 이전에 사용된 비표지 시약 대신 적절한 동위원소 표지 시약을 사용하여 아래에 설명된 제조 및 실시예에 설명된 것과 유사한 공정에 의해 제조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 구체예는 또한 개시된 화합물의 생체내 대사 산물을 포함하는 것을 의미한다. 이러한 산물은 주로 효소 과정으로 인해 투여된 화합물의 산화, 환원, 가수분해, 아미드화, 에스테르화 등으로 인해 발생할 수 있다. 따라서, 본 발명의 구체예는 대사 산물을 생성하기에 충분한 기간 동안 본 발명의 화합물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 의해 생산된 화합물을 포함한다. 이러한 산물은 일반적으로 래트, 마우스, 기니아 피그, 원숭이와 같은 동물 또는 인간에게 검출 가능한 용량으로 방사성표지된 구조식 (I)의 화합물을 투여하고, 대사가 일어날 수 있도록 충분한 시간을 허용하며 소변, 혈액 또는 기타 생물학적 샘플에서 이의 전환 산물을 분리하여 확인된다.
"안정한 화합물" 및 "안정한 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도까지의 분리 및 효과적인 치료제로의 제형화를 견딜 수 있을 만큼 충분히 견고한 화합물을 나타내는 것을 의미한다.
"포유동물"은 인간과 실험실 동물 및 가정용 애완동물(예를 들어, 고양이, 개, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 토끼)과 같은 가축 동물과 야생 동물 등과 같은 비-가정 동물을 모두 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에서 사용하기 위해 허용되는 것으로서, 미국 식품의약국의 승인을 받은 임의의 보조제, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 방부제, 염료/착색제, 향미 강화제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 안정제, 등장화제, 용매 또는 유화제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 산 및 염기 부가염을 모두 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 산 부가염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은, 유리 염기의 생물학적 유효성 및 특성을 유지하고, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같으나 이에 제한되지 않은 무기산 및 아세트산, 2,2-디클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤젠술폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 장뇌산, 캄포-10-술폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 시클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-디설폰산, 에탄술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 포름산, 푸마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 이소부티르산, 젖산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 뮤신산, 나프탈렌-1,5-디술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 1-히드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 세바스산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 티오시안산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 운데실렌산 등과 같으나 이에 제한되지 않는 유기산과 함께 형성되는 염을 지칭한다.
"약학적으로 허용가능한 염기 부가염"은 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은, 유리산의 생물학적 유효성 및 특성을 유지하는 염을 지칭한다. 이들 염은 유리산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조된다. 무기 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 무기염은 암모늄, 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘 염이다. 유기 염기로부터 유도된 염에는 1차, 2차 및 3차 아민, 자연적으로 발생하는 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 암모니아, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 디에탄올아민, 에탄올아민, 데아놀, 2-디메틸아미노에탄올, 2-디에틸아미노에탄올, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트리에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등의 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 유기 염기는 이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메틸아민, 디시클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
종종 결정화는 구조식 (I)의 화합물의 용매화물을 생성한다. 본 명세서에 사용된 용어 "용매화물"은 구조식 (I)의 화합물의 하나 이상의 분자와 하나 이상의 용매 분자를 포함하는 집합체를 지칭한다. 용매는 물일 수 있고, 이 경우 용매화물은 수화물일 수 있다. 대안으로, 용매는 유기 용매일 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 1수화물, 2수화물, 반수화물, 3수화물, 3수화물, 4수화물 등을 포함하는 수화물뿐만 아니라 상응하는 용매화된 형태로 존재할 수 있다. 일부 구체예에서, 구조식 (I)의 화합물은 진정한 용매화물로서 존재할 수 있는 반면, 다른 경우에 구조식 (I)의 화합물은 단지 부정성 물을 보유하거나 물과 일부 부정성 용매의 혼합물일 수 있다.
"약학 조성물"은 구조식 (I)의 화합물 및 생물학적 활성 화합물을 포유동물, 예를 들어 인간에게 전달하기 위해 당업계에서 일반적으로 허용되는 매체의 제형을 지칭한다. 이러한 매체에는 약학적으로 허용가능한 모든 담체, 희석제 또는 부형제가 포함된다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량"은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 때 포유동물, 바람직하게는 인간에서 치료를 실시하기에 충분한 구조식 (I)의 화합물의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 발명의 구체예의 지질 나노입자의 양은 화합물, 상태 및 이의 중증도, 투여 방식 및 치료할 포유동물의 연령에 따라 달라질 것이나, 이는 그 자신의 지식 및 본 개시내용을 고려하여 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "치료하는" 또는 "치료"는 목적 질병 또는 상태를 갖는 포유동물, 바람직하게는 인간의 목적 질병 또는 상태의 치료를 포괄하며, 다음을 포함한다:
(i) 포유동물에서 질병 또는 상태가 발생하는 것을 예방하는 것, 특히 포유동물이 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있지만 아직 질병이 있는 것으로 진단되지 않은 경우;
(ii) 질병 또는 상태를 억제하는 것, 즉 발병을 저지하는 것;
(iii) 질병 또는 상태의 완화, 즉 질병 또는 상태의 퇴행 유발; 또는
(iv) 질병 또는 상태로 인한 증상 완화, 즉 근본적인 질병 또는 상태를 해결하지 않고 통증을 완화하는 것. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "질병" 및 "상태"는 상호교환적으로 사용될 수 있거나 특정 질병 또는 상태가 알려진 원인 물질을 갖지 않을 수 있다는 점에서(병인이 아직 밝혀지지 않았으므로) 다를 수 있고, 따라서, 아직 질병으로 인식되지는 않지만 바람직하지 않은 상태나 증후군으로만 인식되며, 여기서, 다소 구체적인 증상 세트는 임상의에 의해 확인되었다.
구조식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있으므로 거울상이성질체, 부분입체이성질체 및 절대 입체화학 측면에서 아미노산의 경우 (R)- 또는 (S)- 또는 (D)- 또는 (L)-로서 정의될 수 있는 기타 입체이성질체 형태를 생성할 수 있다. 본 발명의 구체예는 그러한 모든 가능한 이성질체뿐만 아니라 이들의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하는 것을 의미한다. 광학 활성 (+) 및 (-), (R)- 및 (S)-, 또는 (D)- 및 (L)- 이성질체는 키랄 신톤 또는 키랄 시약을 사용하여 제조되거나, 크로마토그래피, 분별 결정화 등의 기존 기술을 사용하여 분리될 수 있다. 개별 거울상 이성질체의 제조/분리를 위한 통상적인 기술에는 적합한 광학적으로 순수한 전구체로부터의 키랄 합성 또는 예를 들어 키랄 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 라세미체(또는 염 또는 유도체의 라세미체)를 분할하는 것이 포함된다. 본 명세서에 기술된 화합물이 올레핀성 이중 결합 또는 기타 기하학적 비대칭 중심을 함유하는 경우, 달리 명시하지 않는 한, 화합물은 E 및 Z 기하 이성질체를 모두 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, 모든 호변이성질체(tautomer) 형태도 포함되도록 의도되었다.
"입체이성질체"는 동일한 결합으로 결합된 동일한 원자로 구성되지만 서로 교환할 수 없는 서로 다른 3차원 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 본 발명은 다양한 입체이성질체 및 이의 혼합물을 고려하며, "거울상이성질체"를 포함하는데, 이는 분자가 서로 겹쳐질 수 없는 거울상인 2개의 입체이성질체를 지칭한다.
"호변이성질체(tautomer)"는 분자의 한 원자에서 동일한 분자의 다른 원자로의 양성자 이동을 지칭한다. 본 발명은 임의의 상기 화합물의 호변이성질체를 포함한다.
화합물
일 양태에서, 본 발명은 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및/또는 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)과 같은 다른 지질 성분과 결합하여 올리고뉴클레오티드를 갖는 지질 나노입자를 형성할 수 있는 신규한 지질 화합물을 제공한다. 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 이들 지질 나노입자는 혈청 내 분해로부터 올리고뉴클레오티드를 보호하고 시험관내 및 생체내에서 세포에 올리고뉴클레오티드의 효과적인 전달을 제공하는 것으로 생각된다.
일 구체예에서, 화합물은 하기 구조식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
여기서, L1 은 -NRaC(=O)R1 또는 -C(=O)NRbRc 이고;
L2 는 -NRdC(=O)R2 또는 -C(=O)NReRf 이며;
G1 및 G2 는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
G3 은 C1-C24 알킬렌 또는 C2-C24 알케닐렌이며;
Ra, Rb, Rd 및 Re 는 각각 독립적으로 H, C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이고;
Rc 및 Rf 는 각각 독립적으로 C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이며;
R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
R3 는 H, -OH, CN, -N(R4)R5; -C(=O)N(R4)R5; -N(R4)C(=O)R5; -N(R4)C(=O)OR5;-C(=O)OR6, -OC(=O)R6, -OR7, 헤테로아릴 또는 아릴이며;
R4 및 R5 는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐이거나, R4 및 R5는, 그들이 결합된 질소 또는 탄소 원자와 함께, 5 내지 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R6 는 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐 또는 아르알킬이며;
R7 은 히드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된 C1-C12 알킬이고; 및
여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, 아릴 및 아르알킬은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환되거나 치환되지 않는다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐, 아릴 또는 아르알킬은 하나 이상의 플루오린 및/또는 하나 이상의 옥소 및/또는 하나 이상의 NH2 및/또는 하나 이상의 알킬아미닐로 치환된다.
일 구체예에서, 화합물은 구조식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체를 갖는다:
L1 은 -NRaC(=O)R1 또는 -C(=O)NRbRc 이고;
L2 는 -NRdC(=O)R2 또는 -C(=O)NReRf 이며;
G1 및 G2 는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
G3 는 C1-C24 알킬렌 또는 C2-C24 알케닐렌이며;
Ra, Rb, Rd 및 Re 는 각각 독립적으로 H, C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이고;
Rc 및 Rf 는 각각 독립적으로 C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이며;
R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
R3 는 H, -OH, CN, -N(R4)R5; -C(=O)N(R4)R5; -N(R4)C(=O)R5; -C(=O)OR6,
-OC(=O)R6, 또는 아릴이며;
R4 및 R5 는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬이거나, R4 및 R5 는, 그들이 결합된 질소 또는 탄소 원자와 함께, 5 내지 7-원의 헤테로사이클릭 고리를 형성하고,
R6 은 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐 또는 아르알킬이며; 및
여기서, 각 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐, 아릴 및 아르알킬은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환 또는 비치환된다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐, 아릴 및 아르알킬은 하나 이상의 플루오린 및/또는 하나 이상의 옥소 및/또는 하나 이상의 NH2 및/또는 하나 이상의 알킬아미닐로 치환된다.
특정 구체예에서, G3 는 치환되지 않는다. 일부 구체예에서, G3 는 하나 이상의 플루오린 원자로 치환된다. 보다 특정의 구체예에서, G3 는 예를 들어, C1-C12 알킬렌이다. 일부 구체예에서, G3 는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 또는 C8 알킬렌이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, G3 는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 또는 n-옥틸이다.
특정 구체예에서, G1 및/또는 G2 는 치환되지 않는다. 일부 구체예에서, G1 및/또는 G2 는 하나 이상의 플루오린 원자로 치환된다. 보다 특정의 구체예에서, G1 및/또는 G2 는 C1-C12 알킬렌이다. 일부 구체에에서, G1 및/또는 G2 는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, 또는 C8 알킬렌이다.
전술한 구체예 중 일부에서, 화합물은 하기 구조식 (IA)를 갖는다:
여기서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수, 예를 들어 2 내지 6의 정수, 예를 들어 4 또는 5이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 5의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 6의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 7의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 9의 정수이다.
전술한 구체예 중 일부에서, L1 은 -C(=O)NRbRc 이고, L2 는 -C(=O)NReRf 이다. 전술한 구체예 중 일부에서, L1 은 -NRaC(=O)R1 이고, L2 는 -NRdC(=O)R2 이다.
전술한 구체예 중 다른 구체예에서, 화합물은 하기 구조식 (IB) 또는 (IC) 중 하나를 갖는다:
또는
전술한 구체예 중 일부에서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 10, 2 내지 8, 4 내지 10 또는 4 내지 7의 정수이다. 예를 들어, 일부 구체예에서 y는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 구체예에서, z는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 5의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 6의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 7의 정수이다. 일부 특정 구체예에서, y 및 z는 각각 9의 정수이다. 일부 구체예에서, y와 z는 동일한 반면, 다른 구체예에서는 y와 z는 상이하다.
전술한 일부 구체예에서, R1 또는 R2, 또는 둘 다는 분지형 C6-C24 알킬이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, R1 및 R2는 각각 독립적으로 하기 구조식을 갖는다:
여기서, R7a 및 R7b 는, 각각의 경우에, 독립적으로 다음 중 하나이다: (a) H 또는 C1-C12 알킬, 또는 (b) R7a 는 H 또는 C1-C12 알킬, 및 R7b 는 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R7b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며; 및 a는 2 내지 12의 정수이고, 여기서 R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2 는 각각 독립적으로 선형 또는 분지형이고 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다. 예를 들어, 일부 구체예에서 a는 5 내지 9 또는 8 내지 12의 정수이다.
전술한 구체예 중 일부에서, R7a 의 적어도 하나의 경우 H이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, R7a 는 각각의 경우 H이다. 전술한 구체예 중 다른 상이한 구체예에서, R7b 의 적어도 하나의 경우 C1-C8 알킬이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸이다.
상이한 구체예에서, R1 또는 R2, 또는 둘다 하기 구조 중 하나를 갖는다:
상이한 구체예에서, R1 또는 R2, 또는 둘다 하기 구조 중 하나를 갖는다:
전술한 구체예 중 일부에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 각각 독립적으로 C3-C12 알킬 또는 C3-C16 알킬이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-헥실 (-(CH2)5CH3), n-옥틸 (-(CH2)7CH3), n-데카닐 (-(CH2)9CH3), n-도데실 (-(CH2)11CH3), (-(CH2)14CH3), (-(CH2)15CH3)로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-헥실 (-(CH2)5CH3)이고, 다른 구체예에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-옥틸 (-(CH2)7CH3)이다. 일부 구체예의 다른 예에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-데카닐 (-(CH2)9CH3)이다. 다른 구체예에서, Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-도데실 (-(CH2)11CH3)이다.
일부 구체예에서, Ra 및 Rd 는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알케닐이고, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C18 알킬 또는 C6-C18 알케닐이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, Ra 및 Rd 는 n-헥실 (-(CH2)5CH3)이고, R1 및 R2 는 도데카펜틸 (-(CH2)14CH3)이다. 일부 구체예의 다른 예에서, Ra 및 Rd 는 n-헥실이고, R1 및 R2 는 (6Z, 9Z)-헵타데카-6,9-디엔(-(CH2)7CHCHCH2CHCH(CH2)4CH3)이다. 일부 구체예의 또 다른 예에서, Ra 및 Rd 는 n-헥실이고, R1 및 R2 는 7-펜타데칸(-CH((CH2)5CH3)((CH2)7CH3))이다.
일부 구체예에서, R3 는 H이다.
다른 구체예에서, R3 는 -OH이다.
일부 상이한 구체예에서, R3 는 -C(=O)OR6 이고, 예를 들어, 이들 구체예 중 일부에서, R6 는 C1-C18 알킬이다. 일부 구체예의 다른 예에서, R6 는 C1-C12 분지형 알킬이다. 일부 구체예의 또 다른 예에서, R6 는 C1-C6 알킬이다. 일부 구체예의 다른 예에서, R6 는 C1-C2 알킬이다. 특정 구체예에서, R6 은 에틸이다. 일부 특정 구체예에서, R6 는 5-메틸 도데실이다.
다른 구체예에서, R3 은 -N(R4)R5 이다. 예를 들어, 이들 구체예 중 일부에서, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 임의로 히드록실로 치환된 C1-C12 알킬이다. 일부 구체예의 다른 예에서, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 임의로 히드록실로 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 구체예의 또 다른 예에서, R4 및 R5 는 각각 독립적으로 임의로 히드록실로 치환된 C1-C2 알킬이다. 일부 특정 구체예에서, R4 및 R5 는 각각 메틸이다. 일부 특정 구체예에서, R4 및 R5 는 각각 n-헥실이다.
다른 구체예에서, R3 는 -C(=O)N(R4)R5 이거나, R3 는 -N(R4)C(=O)R5 이다. 이들 구체예 중 일부에서, R4 또는 R5 중 하나는 H이고, R4 또는 R5 중 다른 하나는 C1-C12 알킬이다. 일부 구체예에서, R4 또는 R5 중 하나는 H이고, R4 또는 R5 중 다른 하나는 히드록실로 치환된 C1-C12 알킬이다. 다른 구체예에서, R4 및 R5 둘 다 C1-C12 알킬 또는 C1-C6 알킬이다. 일부 구체예에서, R4 및 R5 둘 다 C1-C12 알킬 또는 히드록실로 치환된 C1-C6 알킬이다. 일부 특정 구체예에서, R4 또는 R5 중 하나는 H이고, R4 또는 R5 중 다른 하나는 n-데실이다. 일부 특정 구체예에서, R4 또는 R5 중 하나는 H이고, R4 또는 R5 중 다른 하나는 n-트리데실이다.
일부 구체예에서, R3 는 아릴이다. 일부 구체에에서, R3 는 치환된 아릴이다. 일부 구체예에서, R3 는 페닐이다.
다른 구체예에서, R3 는 -N(R4)R5 이고, R4 및 R5 중 하나는 C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐이다. 예를 들어, 일부 구체예에서, R3 은 -N(R4)R5 이고, R4 는 H이며, R5 는 C3-C6 시클로알케닐이다.
상이한 구체예에서, R3 는 -OR7 이고, R7 은 OH 또는 OCH3로 치환된 C1-C6 알킬이다.
다른 구체예에서, R3 는 -N(R4)C(=O)OR5 이되, R4 는 H이고, R5 는 C1-C6 알킬이다.
또 다른 구체예에서, R3은 헤테로아릴, 예를 들어 이미다졸릴이다.
일부 보다 구체적인 구체예에서, R3은 하기 구조 중 하나를 갖는다:
일부 보다 구체적인 구체예에서, R3 는 H이거나 하기 구조 중 하나를 갖는다:
다양한 다른 구체예에서, 화합물은 아래 표 1에 제시된 구조 중 하나를 갖는다.
대표 화합물
No. 구조
I-1
I-2
I-3
I-4
I-5
I-6
I-7
I-8
I-9
I-10
I-11
I-12
I-13
I-14
I-15
I-16
I-17
I-18
I-19
I-20
I-21
I-22
I-23
I-24
I-25
I-26
I-27
I-28
I-29
I-30
I-31
I-32
I-33
I-34
I-35
I-36
I-37
I-38
I-39
I-40
I-41
I-42
I-43
I-44
I-45
I-46
I-47
I-48
I-49
I-50
I-51
I-52
I-53
I-54
I-55
I-56
I-57
I-58
I-59
I-60
I-61
I-62
I-63
I-64
I-65
I-66
I-67
I-68
I-69
I-70
I-71
I-72
I-73
I-74
I-75
I-76
I-77
I-78
I-79
I-80
I-81
I-82
I-83
I-84
I-85
표 1의 화합물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 본 명세서의 하기에 기술된 일반적인 방법에 따라 제조되고 시험되었다.
상기 제시된 구조식 (I)의 화합물 및 상기 제시된 화합물 구조식 (I)의 임의의 특정 치환기 및/또는 변수의 임의의 구체예는 구조식 (I)의 화합물의 다른 구체예 및/또는 치환기 및/또는 변수와 독립적으로 조합되어 위에 구체적으로 제시되지 않은 본 발명의 구체예를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 특정 구체예 및/또는 청구범위에서 임의의 특정 R 기, L 기, G 기 또는 변수 a, x, y 또는 z에 대해 치환기 및/또는 변수의 목록이 나열되는 경우, 각각의 개별 치환기 및/또는 변수는 특정 구체예 및/또는 청구범위에서 삭제될 수 있으며 치환기 및/또는 변수의 나머지 목록은 본 발명의 구체예의 범위 내에 있는 것으로 간주될 것으로 이해된다.
본 설명에서, 도시된 화학식의 치환기 및/또는 변수의 조합은 그러한 기여로 인해 안정한 화합물이 생성되는 경우에만 허용되는 것으로 이해된다.
일부 구체예에서, 구조식 (I)의 화합물을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 구조식 (I)의 화합물을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 조성물이 제공된다. 지질 나노입자는 중성 지질, 스테로이드 및 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)로부터 선택된 부형제를 임의로 포함한다.
일부 구체예에서, 임의의 하나 이상의 구조식 (I)의 화합물 및 치료제를 포함하는 지질 나노입자가 제공된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 지질 나노입자는 임의의 구조식 (I)의 화합물, 치료제 및 중성 지질, 스테로이드 및 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 포함한다. 다른 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 담체도 지질 나노입자의 다양한 구체예에 포함된다.
일부 구체예에서, 중성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 중성 지질은 DSPC이다. 다양한 구체예에서, 화합물 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1이다.
다양한 구체예에서, 지질 나노입자는 스테로이드 또는 스테로이드 유사체를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 일부 이들 구체예에서, 화합물 대 콜레스테롤의 몰비는 약 5:1 내지 1:1 또는 약 2:1 내지 1:1이다.
다양한 구체예에서, 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)은 페길화된 지질이다. 예를 들어, 일부 구체예는 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)과 같은 페길화된 디아실글리세롤(PEG-DAG), 페길화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)와 같은 PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEG-S-DAG), 페길화된 세라마이드(PEG-cer) 또는 ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데카녹시)프로필)카바메이트 또는 2,3-디(테트라데카녹시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트와 같은 PEG 디알콕시프로필카바메이트를 포함한다. 다양한 구체예에서, 화합물 대 페길화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 20:1 또는 약 100:1 내지 10:1이다.
일부 구체예에서, 조성물은 하기 구조식 (II)를 갖는 페길화된 지질 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체를 포함한다:
여기서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 여기서, 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 임의로 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 차단되며; 및
w는 30 내지 60의 평균값을 갖는다.
일부 구체예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 선형 알킬이다. 일부 구체예에서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 함유하는 선형 알킬이다. 일부 구체예에서, w는 30 내지 60의 평균값을 갖는다. 일부 구체예에서, w는 43 내지 53의 평균값을 갖는다. 다른 구체예에서, 평균 w는 약 45이다. 다른 상이한 구체예에서, 평균 w는 약 49이다.
상기 지질, 지질 나노입자 및 조성물에 대한 제조 방법은 본 명세서에 하기에 기술되어 있고/있거나 당업계에 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2015/199952, WO 2017/004143 및 WO 2017/075531에 공지되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
전술한 조성물의 일부 구체예에서, 치료제는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 핵산은 안티센스 및 메신저 RNA로부터 선택된다.
다른 상이한 구체예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 환자에게 치료제를 투여하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 임의의 전술한 조성물을 제조 또는 제공하는 단계 및 환자에게 이 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
투여 목적으로, 구조식 (I)의 화합물(전형적으로 치료제와 조합된 지질 나노입자의 형태로서)은 미정제 화학물질로서 투여될 수 있거나 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 구체예의 약학 조성물은 구조식 (I)의 화합물(예를 들어, LNP의 성분으로서) 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 구조식 (I)의 화합물은 예를 들어 목적하는 특정 질병 또는 상태를 치료하기 위해 지질 나노입자를 형성하고 치료제를 전달하는데 효과적인 양으로 조성물에 존재한다. 적절한 농도 및 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
본 발명의 구체예의 조성물 및/또는 LNP의 투여는 유사한 유용성을 제공하기 위해 허용되는 임의의 제제 투여 방식을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 구체예의 약학 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제, 예컨대, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 현탁액, 좌약, 주사제, 흡입제, 젤, 미소구체 및 에어로졸로 제형화될 수 있다. 이러한 약학 조성물을 투여하는 전형적인 경로에는 경구, 국소, 경피, 흡입, 복막, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강내 경로가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용된 용어 복막은 피하 주사, 정맥내, 근육내, 피내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 환자에게 조성물을 투여할 때 그 안에 함유된 유효 성분이 생물학적으로 이용 가능하도록 제형화된다. 대상체 또는 환자에게 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취한다. 예를 들어, 정제는 단일 투여 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 구조식 (I) 화합물의 용기는 복수의 투여 단위를 담을 수 있다. 이러한 투여형을 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이며; 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)을 참조. 투여될 조성물은 본 발명의 구체예의 교시에 따라 목적하는 질병 또는 상태의 치료를 위해 임의의 경우에 치료적 유효량의 구조식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 함유할 것이다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일 양태에서, 담체(들)는 미립자이므로, 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 담체(들)는 액체일 수 있으며, 조성물은 예를 들어 경구 시럽, 주사 가능한 액체 또는 예를 들어 흡입 투여에 유용한 에어로졸일 수 있다.
경구 투여용으로 의도된 경우, 약학 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고, 여기서 반고체, 반액체, 현탁액 및 젤 형태는 본 명세서에 고체 또는 액체로 간주되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여용 고체 조성물로서, 약학 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 전형적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 것이다. 또한 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 트라가칸스 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 유당 또는 덱스트린과 같은 부형제; 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔, 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 스테아르산마그네슘 또는 스테로텍스(Sterotex)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소 등의 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 향미제; 및 착색제.
약학 조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐 형태인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 액체, 예를 들어 엘릭서, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 두 가지 예로서 경구 투여용이거나 주사 전달용일 수 있다. 경구 투여용으로 의도된 경우, 바람직한 조성물은 본 화합물 또는 LNP 이외에 감미제, 보존제, 염료/착색제 및 향미 강화제 중 하나 이상을 함유한다. 주사 투여용 조성물에는 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정제 및 등장제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
용액, 현탁액 또는 다른 유사한 형태이건 간에, 본 발명의 구체예의 액체 약학 조성물은 다음 보조제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알코올, 메틸파라벤 등의 항균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세트산염, 시트르산염 또는 인산염과 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 포도당과 같은 장성 조절제; 수크로스 또는 트레할로스와 같은 동결 방지제로 작용하는 제제. 복막 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱으로 만들어진 다회 용량 바이알에 담을 수 있다. 생리 식염수가 바람직한 보조제이다. 주사용 약학 조성물은 바람직하게는 멸균된다.
복막 또는 경구 투여용으로 의도된 본 발명 구체예의 액체 약학 조성물은 적합한 LNP를 얻도록 구조식 (I)의 화합물의 양을 함유해야 한다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 젤 베이스를 적절하게 포함할 수 있다. 베이스는 예를 들어 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 미네랄 오일, 물 및 알코올과 같은 희석제, 유화제 및 안정제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 증점제는 국소 투여용 약학 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도된 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온삼투 장치를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 예를 들어 직장에서 녹아 약물을 방출하는 좌제의 형태로 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유성 베이스를 함유할 수 있다. 이러한 베이스에는 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 유효 성분 주위에 코팅 껍질을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 껍질을 형성하는 물질은 일반적으로 불활성이며, 예를 들어 설탕, 셸락 및 기타 장용성 코팅제 중에서 선택될 수 있다. 대안으로, 유효 성분을 젤라틴 캡슐에 넣을 수도 있다.
고체 또는 액체 형태의 본 발명 구체예의 약학 조성물은 구조식 (I)의 화합물에 결합하여 화합물의 전달을 돕는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적합한 제제에는 단클론성 또는 다클론성 항체 또는 단백질이 포함된다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 구성될 수 있다. 용어 에어로졸은 콜로이드성 시스템부터 가압 패키지로 구성된 시스템까지 다양한 시스템을 나타내는 데 사용된다. 전달은 액화 가스나 압축 가스 또는 유효 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템을 통해 이루어질 수 있다. 구조식 (I)의 화합물의 에어로졸은 유효 성분(들)을 전달하기 위해 단일상, 2상, 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸 전달에는 함께 키트를 형성할 수 있는 필수 용기, 활성제, 밸브, 하위 용기 등이 포함된다. 당업자는 과도한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
본 발명의 구체예의 약학 조성물은 약학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사로 투여되도록 의도된 약학 조성물은 본 발명의 지질 나노입자를 멸균 증류수 또는 다른 담체와 결합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 촉진하기 위해 계면활성제를 첨가할 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 화합물의 용해 또는 균질한 현탁을 촉진하기 위해 구조식 (I)의 화합물과 비공유적으로 상호작용하는 화합물이다.
본 발명의 구체예의 조성물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 치료적 유효량으로 투여되며, 사용된 특정 치료제의 활성을 포함한 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다: 치료제의 대사 안정성 및 작용 기간; 환자의 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 투여 방식 및 시간; 배설 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 상태의 중증도; 및 치료를 받고 있는 대상체.
본 발명의 구체예의 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 이전에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본 발명의 구체예의 조성물 및 하나 이상의 추가 활성제의 단일 제약 투여 제형의 투여뿐만 아니라, 본 발명의 조성물 및 각각의 활성제를 그 자체의 별도의 제약 투여 제형으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 구체예의 조성물 및 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투여 조성물로 환자에게 함께 투여되거나, 각각의 제제는 별도의 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투여 제형이 사용되는 경우, 구조식 (I)의 화합물 및 하나 이상의 추가 활성제는 본질적으로 동시에, 즉 동시에 투여되거나, 별도로 시차를 둔 시간에, 즉 순차적으로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 이러한 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
상기 화합물 및 조성물의 제조 방법은 본 명세서에 하기에 기재되어 있고/있거나 당업계에 공지되어 있다.
당업자는 본 명세서에 기술된 공정에서 중간체 화합물의 작용기가 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있음을 이해할 것이다. 이러한 작용기에는 히드록시, 아미노, 머캅토 및 카르복실산이 포함된다. 히드록시에 대한 적합한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴(예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라히드로피라닐, 벤질 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 대한 적합한 보호기는 t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등을 포함한다. 머캅토에 대한 적합한 보호기는 -C(O)-R"(여기서, R"은 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카르복실산에 대한 적합한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있고 본 명세서에 기술된 표준 기술에 따라 추가되거나 제거될 수 있다. 보호기의 사용은 Green, T.W. and P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley에 구체적으로 기술되어 있다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸-클로라이드 수지와 같은 고분자 수지일 수 있다.
또한, 당업자는 본 발명의 화합물의 보호된 유도체가 그 자체로 약리학적 활성을 갖지 않을 수 있지만, 이들은 포유동물에게 투여된 후 체내에서 대사되어 약리학적 활성을 갖는 구조식 (I)의 화합물을 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 이러한 유도체는 "전구약물"로 기술될 수 있다. 구조식 (I)의 화합물의 모든 전구약물은 본 발명의 구체예의 범위 내에 포함된다.
또한, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 구조식 (I)의 모든 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절한 무기 또는 유기 염기 또는 산으로 처리함으로써 약학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있다. 구조식 (I)의 화합물의 염은 표준 기술에 의해 유리 염기 또는 산 형태로 전환될 수 있다.
구조식 (I)의 화합물 및 이를 포함하는 지질 나노입자는 당업자에게 공지되거나 유도가능한 방법, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2015/199952, WO 2017/004143 및 WO 2017/075531에 개시된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
하기 일반 반응식은 구조식 (I)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체를 제조하는 예시적인 방법을 설명한다:
여기서, R3, L1, L2, G1, G2, 및 G3 은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
당업자는 유사한 방법에 의해 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 조합함으로써 이들 화합물을 제조할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 당업자는 적절한 출발 성분을 사용하고 필요에 따라 합성 매개변수를 변형함으로써 하기에 구체적으로 예시되지 않은 구조식 (I)의 다른 화합물을 하기에 기술된 것과 유사한 방식으로 제조할 수 있을 것으로 이해된다. 일반적으로, 출발 성분은 Sigma Aldrich, Lancaster Synesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI 및 Fluorochem USA 등과 같은 공급원으로부터 얻거나, 당업자에게 공지된 공급원(예를 들어, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition(Wiley, 2000년 12월) 참조)에 따라 합성되거나, 본 발명에 기술된 대로 제조될 수 있다
일반 반응식 1
구조식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 A-5)의 구체예는 일반 반응식 1("방법 A")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 각 경우에 독립적으로 Rb, Rc, Re 또는 Rf 를 나타내고, 각각의 n은 독립적으로 2 내지 12의 정수이다. 일반 반응식 1을 참조하면, 구조 A-1의 화합물은 상업적인 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조할 수 있다. A-1, A-2 및 DMAP의 혼합물을 DCC로 처리하여 브로마이드 A-3을 생성한다. 브로마이드 A-3, 염기(예: N,N-디이소프로필에틸아민) 및 N,N-디메틸디아민 A-4의 혼합물을 임의의 필요한 후처리 및/또는 정제 단계 후 A-5를 생성하기에 충분한 온도 및 시간으로 가열한다.
일반 반응식 2
구조식 (I)의 화합물(예를 들어, 화합물 B-8)의 구체예는 일반 반응식 2("방법 B")에 따라 제조될 수 있으며, 여기서 R은 각 경우에 독립적으로 Ra 또는 Rd 을 나타내고, L 은 각 경우에 독립적으로 R1 또는 R2를 나타내며, n은 독립적으로 2 내지 12의 정수이다. 일반 반응식 2를 참조하면, 구조 B-1의 화합물은 상업적인 공급원으로부터 구입하거나 당업자에게 친숙한 방법에 따라 제조할 수 있다. B-2의 질소를 B-1로 알킬화하여 디올 산물 B-3을 얻은 다음, HBr 용액을 천천히 첨가한 후 환류하여 브로마이드 B-4로 전환한다. 용매 중 알킬아민 B-5, N,N-디이소프로필에틸아민 및 소듐 아이오다이드의 존재하에 생성된 브로마이드 B-4를 필요한 후처리 및/또는 정제 단계 후에 B-6을 생성하기에 충분한 온도 및 시간으로 가열한다. 카르복실산 B-7의 용액에 옥살릴 클로라이드를 적가한다. 그 다음, B-6의 용액을 혼합물에 첨가하고 교반하여 필요한 후처리 및/또는 정제 단계 후에 B-8을 생성한다.
구조식 (I)의 화합물을 제조하기 위한 다양한 대체 전략이 당업자에게 이용가능하다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, R3 부분은 히드록실과 같은 치환기를 포함할 수 있고, 치환기를 차폐하기 위해 적절한 보호기가 필요할 수 있거나, R5 가 분자의 나머지 부분에 부가된 후에 치환기가 부가될 수 있다. 필요에 따라 보호기를 사용하는 것과 상기 일반 반응식 1에 대한 다른 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다. 하기 실시예는 제한이 아닌 설명의 목적으로 제공된다.
실시예 1: 지질 나노입자 조성물을 이용한 루시퍼라제 mRNA 생체내 평가
구조식 (I)의 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질은 50:10:38.5:1.5 또는 47.5:10:40.7:1.8의 몰비로 에탄올에 용해된다. 지질 나노입자(LNP)는 총 지질 대 mRNA 중량비가 약 10:1 내지 40:1로 제조된다. 간략하게, mRNA는 10 내지 50mM 시트레이트 아세테이트 완충액(pH 4) 또는 10 내지 25mM 아세테이트 완충액(pH 4)에 0.2 mg/mL로 희석된다. 주사기 펌프는 에탄올성 지질 용액과 mRNA 수용액을 약 1:5 내지 1:3(vol/vol)의 비율로 혼합하는데 사용되며 총 유속은 15 mL/min 이상이다. 이어서, 에탄올을 제거하고 투석을 통해 외부 완충액을 PBS로 교체한다. 마지막으로, 지질 나노입자는 0.2 ㎛ 기공 멸균 필터를 통해 여과된다.
연구는 기관 동물 관리 위원회(ACC)와 캐나다 동물 관리 협의회(CCAC)가 수립한 지침에 따라 6~8주령 암컷 C57BL/6 마우스(Charles River), 8~10주령 CD-1(Harlan) 마우스(Charles River)에서 수행된다. 다양한 용량의 mRNA-지질 나노입자가 꼬리 정맥 주사에 의해 전신 투여되고 동물은 투여 후 특정 시점(예: 4시간)에 안락사된다. 간과 비장은 사전에 무게를 측정한 튜브에 수집하고 무게를 측정한 후 즉시 액체 질소에 급속 냉동하고 분석을 위해 처리할 때까지 -80 ℃에서 보관한다.
간의 경우 분석을 위해 2 mL FastPrep 튜브(MP Biomedicals, Solon OH)에서 약 50 mg을 절개한다. ¼" 세라믹 구체(MP Biomedicals)를 각 튜브에 첨가하고 실온으로 평형화된 500μL의 Glo Lysis Buffer - GLB(Promega, Madison WI)를 간 조직에 첨가한다. 간 조직을 FastPrep24 기기(MP Biomedicals)를 사용하여 2Х6.0m/s에서 15초 동안 균질화한다. 균질화물은 GLB에서 1:4 희석 전 5분 동안 실온에서 배양되고 SteadyGlo Luciferase 분석 시스템(Promega)을 사용하여 평가된다. 구체적으로, 희석된 조직 균질액 50μL를 SteadyGlo 기질 50μL와 반응시키고, 10초 동안 흔든 후 5분간 배양한 후 CentroXS³LB 960 발광측정기(Berthold Technologies, Germany)를 사용하여 정량한다. 분석된 단백질의 양은 BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 결정된다. 그런 다음 상대 발광 단위(RLU)를 분석된 총 μg 단백질로 정규화한다. RLU를 ng 루시퍼라제로 변환하기 위해 QuantiLum Recombinant Luciferase(Promega)를 사용하여 표준 곡선을 생성한다.
Trilink Biotechnologies의 FLuc mRNA(L-6107)는 원래 반딧불이인 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)에서 분리된 루시퍼라제 단백질을 발현한다. FLuc는 일반적으로 포유동물 세포 배양에서 유전자 발현과 세포 생존력을 측정하는데 사용된다. 기질인 루시페린이 있을 때 생물발광을 방출한다. 이 캡핑되고 폴리아데닐화된 mRNA는 5-메틸시티딘 및 슈도우리딘으로 완전히 치환된다.
실시예 2: 지질 나노입자 조성물을 이용한 면역글로불린 G(IgG) mRNA 생체내 평가
구조식 (I)의 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질은 50:10:38.5:1.5 또는 47.5:10:40.7:1.8의 몰비로 에탄올에 용해된다. 지질 나노입자(LNP)는 총 지질 대 mRNA 중량비가 약 10:1 내지 40:1로 제조된다. 간략하게, mRNA는 10 내지 50mM 시트레이트 아세테이트 완충액(pH 4) 또는 10 내지 25mM 아세테이트 완충액(pH 4)에 0.2 mg/ mL로 희석된다. 주사기 펌프는 에탄올성 지질 용액과 mRNA 수용액을 약 1:5 ~ 1:3(vol/vol)의 비율로 혼합하는 데 사용되며 총 유속은 15 mL/min 이상이다. 그런 다음 에탄올을 제거하고 투석을 통해 외부 완충액을 PBS로 교체한다. 마지막으로, 지질 나노입자는 0.2 ㎛ 기공 멸균 필터를 통해 여과된다.
연구는 기관 동물 관리 위원회(ACC) 및 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)가 확립한 지침에 따라 6-8주령 CD-1/ICR 마우스(Envigo)에서 수행된다. 다양한 용량의 mRNA-지질 나노입자가 꼬리 정맥 주사에 의해 전신 투여되고 동물은 투여 후 특정 시점(예: 24시간)에 안락사된다. 전혈을 수집하고, 이어서 전혈 튜브를 2000 x g에서 10분간 4 ℃에서 원심분리하여 혈청을 분리하고 분석에 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관한다.
면역글로불린 G(IgG) ELISA(Life Diagnostics Human IgG ELISA 키트)의 경우 혈청 샘플을 1x 희석액으로 100~15000배로 희석한다. 100 μL의 희석된 혈청을 인간 IgG 표준과 함께 항-인간 IgG 코팅된 96-웰 플레이트에 이중으로 분배하고 45분 동안 25 ℃에서 150rpm의 플레이트 진탕기에서 인큐베이션한다. 플레이트 와셔(400 μL/웰)를 사용하여 웰을 1x 세척 용액으로 5회 세척한다. 100 μL의 HRP 접합체를 각 웰에 첨가하고 위와 동일한 조건에서 플레이트 진탕기에서 인큐베이션한다. 플레이트 와셔(400 μL/웰)를 사용하여 웰을 1x 세척 용액으로 5회 다시 세척한다. 100 μL의 TMB 시약을 각 웰에 첨가하고 위와 동일한 조건에서 플레이트 진탕기에서 인큐베이션한다. 각 웰에 중단 용액 100μL를 추가하여 반응을 중단시킨다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm(A450)에서 흡광도를 판독한다. 마우스 혈청 내 인간 IgG의 양은 인간 IgG 농도에 대한 분석 표준에 대한 A450 값을 플로팅하여 결정된다.
실시예 3: 제형화된 지질의 pK a 결정
다른 곳에 설명된 바와 같이, 제형화된 지질의 pKa는 핵산 전달에 대한 LNP의 효율성과 상관관계가 있다(Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010) 참조). 일부 구체예에서, pKa의 바람직한 범위는 ~5 내지 ~7이다. 각 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 분석을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. 0.4mM 총 지질 농도로 PBS 중에 구조식 (I)/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5 또는 47.5:10:40.7:1.8 mol%)의 화합물을 포함하는 지질 나노입자는 실시예 1에 설명된 인라인 공정을 사용하여 제조된다. TNS는 증류수에 용해된 100μM 스톡 용액으로 제조된다. 소포(Vesicle)는 10mM HEPES, 10mM MES, 10mM 암모늄 아세테이트 및 130mM NaCl을 포함하는 완충 용액 2 mL에서 24μM 지질로 희석되며, 여기서 pH 범위는 2.5 내지 11이다. TNS 용액의 분취량을 첨가하여 1 μM의 최종 농도를 제공하고 와류 혼합 후 형광 강도를 실온에서 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광 광도계에서 측정한다. S자형 최적 적합 분석이 형광 데이터에 적용되고 pKa는 최대 형광 강도의 절반을 발생시키는 pH로 측정된다.
실시예 4: 생체내 루시퍼라제/IgG mRNA 발현 설치류 모델을 사용하여 다양한 양이온성 지질을 함유한 지질 나노입자 제형의 효능 결정
표 2에 제시된 개시내용의 대표적인 화합물은 다음 몰비를 사용하여 제형화되었다: 50% 양이온성 지질 / 10% 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) / 38.5% 콜레스테롤 / 1.5% PEG 지질 2-[2-(ω-메톡시(폴리에틸렌글리콜2000)에톡시]-N,N-디테트라데실아세트아미드) 또는 47.5% 양이온성 지질 / 10% DSPC / 40.7% 콜레스테롤 / 1.8% PEG 지질. 실시예 1에 기술된 바와 같이 꼬리 정맥 주사를 통해 투여 후 4시간 동안 간에서 루시퍼라제 발현을 측정하거나 실시예 2에 기술된 바와 같이 마우스 혈청 내 인간 IgG의 양을 측정함으로써 상대 활성을 결정하였다. 활성을 1.0, 0.5 또는 0.3 mg mRNA/kg의 용량에서 비교하고 실시예 1에 기술된 바와 같이, 투여 후 4시간에 측정된 ng 루시퍼라제/g 간으로 표현하거나, 실시예 2에 기술된 바와 같이, 투여 후 24시간에 측정한 μg IgG/ mL 혈청으로 표현하였다. 표 2의 화합물 번호는 표 1의 화합물 번호를 지칭한다.
신규한 양이온성 지질 및 관련된 활성
Cmp. No. pKa Liver Luc
@ 0.3 mg/kg (ng/g) 		Liver Luc
@ 1.0 mg/kg (ng/g) 		Serum IgG
@ 0.3 mg/kg (ug/mL) 		Serum IgG
@ 1.0 mg/kg (ug/mL)
I-3 6.87 227 ± 138*
* Determined at 0.5 mg/kg		 - - -
I-6 6.19 20084 ± 5967 78367 ± 15904 - -
I-7 6.43 16595 ± 836 81021 ± 24105 - -
I-8 6.02 8743 ± 2153 37220 ± 15377 - -
I-9 6.83 4337 ± 1394 21023 ± 12693 - -
I-10 6.77 10779 ± 2473 22622 ± 8189 - -
I-11 6.67 - - 8.22 ± 0.84 47.68 ± 5.26
I-14 6.59 2738 ± 728 5735 ± 2364 - -
I-18 6.02 7115 ± 2087 14879 ± 1595 - -
I-20 6.27 879 ± 365*
* Determined at 0.5 mg/kg		 - - -
I-21 6.54 29492 ± 4887 43216 ± 25636 48.78 ± 6.88 220.38 ± 62.57
I-22 6.47 12829 ± 3326 38933 ± 23162 31.00 ± 9.33 99.12 ± 18.03
I-23 6.48 15876 ± 7588 34202 ± 19178 43.34 ± 7.70 103.91 ± 31.29
I-24 6.24 9106 ± 1760 38913 ± 14318 27.46 ± 9.22 112.31 ± 14.51
I-25 6.28 20276 ± 3044 64656 ± 24090 - -
I-27 6.56 21 ± 6*
* Determined at 0.5 mg/kg		 - - -
I-28 6.22 6602 ± 2609 13298 ± 4040 - -
I-30 6.16 6567 ± 1534 19625 ± 2173 - -
I-37 6.39 - - 1.75 ± 0.58 10.05 ± 2.32
I-38 6.48 - - 4.71 ± 0.46 45.87 ± 2.33
I-40 6.17 - - 16.72 ± 5.38 101.96 ± 4.12
I-41 6.60 - - 4.78 ± 1.65 -
I-42 6.66 - - 3.13 ± 0.27 12.42 ± 3.81
I-43 6.02 - - 2.45 ± 0.66 9.97 ± 1.17
I-44 6.69 - - 0.59 ± 0.11 1.86 ± 0.27
I-45 5.96 - - 3.03 ± 0.66 13.00 ± 2.05
I-46 5.91 10201 ± 2440 52937 ± 8101 - -
I-48 6.63 - - 1.02 ± 0.20 3.40 ± 0.87
I-50 6.73 - - 1.32 ± 0.28 11.05 ± 2.19
I-55 6.22 8244 ± 1599 30106 ± 13756 - -
I-57 6.24 476 ± 134 1456 ± 518 - -
I-58 6.19 18664 ± 5438 73794 ± 14083 - -
I-59 6.27 10786 ± 1924 43489 ± 5698 - -
I-60 6.38 2176 ± 162 9178 ± 2483 - -
I-65 6.33 3172 ± 658 24740 ± 6297 - -
I-66 6.49 - - 32.06 ± 5.07 253.37 ± 52.48
I-67 6.18 - - 7.19 ± 1.41 62.94 ± 13.88
I-68 6.41 - - 12.30 ± 2.41 121.93 ± 34.85
I-70 6.17 7516 ± 1487 33238 ± 9902 - -
I-73 6.32 - - 27.72 ± 6.23 213.39 ± 18.85
I-74 6.53 - - 50.16 ± 6.58 292.44 ± 40.55
I-75 6.48 - - 84.87 ± 12.19 343.06 ± 42.39
I-77 6.71 - - 17.45 ± 2.05 -
I-82 6.47 - - 24.36 ± 4.39 239.26 ± 39.80
I-83 6.12 - - 12.94 ± 2.03 142.26 ± 26.31
I-85 6.81 - - 10.74 ± 2.79 -
실시예 5: 6,6'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디옥틸헥산아미드)(화합물 I-1)
6-브로모-N,N-디옥틸헥산아미드(중간체 A)의 합성
DCM(25 mL) 및 DMF(0.1 mL) 중의 6-브로모헥산산(2.93g, 15 mmol)의 용액에 옥살릴 클로라이드(45 mmol, 5.7g, 3.93 mL)를 실온에서 Ar하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 20 mL의 DCM에 용해시키고, 실온에서 DCM(20 mL) 중의 디옥틸아민(1.1 당량, 16.5 mmol, 3.98 g, 4.98 mL), 트리에틸아민(90 mmol, 9.09 g, 12.5 mL) 및 DMAP(10 mg)의 용액에 천천히 첨가하였다. 첨가가 완료되었을 때, 혼합물을 2.5시간 동안 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 묽은 HCl에 용해시키고 여과하였다. 여과물을 DCM으로 3회 추출하였다. 염수로 세척하고 NaSO4로 건조시킨 후 추출물을 증발시켜 노란색 오일을 얻었다. 오일을 크로마토그래피(헥산 및 에틸 아세테이트(1:0 내지 4:1))로 정제하였다. 원하는 산물을 연황색 오일(5.09g, 12.2 mmol, 81%)로 얻었다.
I-1의 합성
6-브로모-N,N-디옥틸헥산아미드(1.19 mmol, 500 mg), 무수 아세토니트릴(15 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.89 mmol, 244 mg, 0.33 mL)의 혼합물에 메틸아민(0.32 mL, 0.63 mmol, THF 중 2M)을 첨가하였다. 혼합물을 밀봉된 압력 플라스크에서 80 ℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc/Et3N, 95:5:0 내지 80:20:1)로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(183 mg, 0.26 mmol, 44%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.27 ppm) δ: 3.32-3.25 (m, 4H), 3.23-3.16 (m, 4H), 2.34-2.26 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 1.66 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.57-1.44 (m, 12H), 1.38-1.19 (m, 44H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C45H91N3O2 [M+H]+ Calc. 706.7; Found 706.8.
실시예 6: 6,6'-(옥틸아잔디일)비스(N,N-디옥틸헥산아미드)(화합물 I-4)
I-4의 합성
6-브로모-N,N-디옥틸헥산아미드(1.6 당량, 1.19 mmol, 500 mg), 무수 아세토니트릴(15 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(1.89 mmol, 244 mg, 0.33 mL)의 혼합물에 옥틸아민(0.123 mL, 0.74 mmol)에 첨가하였다. 혼합물을 밀봉된 압력 플라스크에서 80 ℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc/Et3N, 95:5:0 내지 80:20:1)로 정제하고, 용출 용매 혼합물로서 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(173 mg, 0.22 mmol, 36%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.33-3.25 (m, 4H), 3.23-3.16 (m, 4H), 3.08-2.86 (br. 3H), 2.5-2.32 (br, 3H), 2.29 (t, 7.6 Hz, 4H), 1.85-1.70 (br, 2H), 1.67 (quintet, 7 Hz, 4H), 1.57-1.38 (m, 12H), 1.38-1.17 (m, 54H), 0.92-0.86 (m, 15H). ESI-MS: MW for C52H105N3O2 [M+H]+ Calc. 804.8; Found 805.0.
실시예 7: 6,6'-(헥실라잔디일)비스(N,N-디옥틸헥산아미드)(화합물 I-5)
실시예 6의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-5를 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(155 mg, 0.20 mmol, 34%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.27 ppm) δ: 3.33-3.25 (m, 4H), 3.24-3.15 (m, 4H), 3.10-2.80 (br. 2H), 2.58-2.32 (br, 4H), 2.29 (t, 7.4 Hz, 4H), 1.88-1.69 (br, 2H), 1.66 (quintet, 7.4 Hz, 4H), 1.57-1.39 (m, 12H), 1.39-1.17 (m, 50H), 0.92-0.86 (m, 15H).
실시예 8: 8,8'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디옥틸옥탄아미드)(화합물 I-7)
실시예 5의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-7을 제조하여 연황색 오일로서 원하는 산물을 얻었다(230 mg, 0.30 mmol, 59%).
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.27 ppm) δ: 3.32-3.25 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.31-2.25 (m, 8H), 2.20 (s, 3H), 1.64 (quintet, 7.3 Hz, 4H), 1.57-1.41 (m, 12H), 1.38-1.19 (m, 52H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C49H99N3O2 [M+H]+ Calc. 762.8; Found 762.9.
실시예 9: 10,10'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디옥틸데칸아미드)(화합물 I-8)
실시예 5의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-8을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(205 mg, 0.25 mmol, 64%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.27 ppm) δ: 3.33-3.25 (m, 4H), 3.23-3.16 (m, 4H), 2.31-2.25 (q-like, 8H), 2.20 (s, 3H), 1.63 (quintet, 7.3 Hz, 4H), 1.57-1.41 (m, 12H), 1.38-1.19 (m, 60H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C53H107N3O2 [M+H]+ Calc. 818.8; Found 819.0.
실시예 10: 8,8'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-6)
8-브로모-N,N-디데실옥탄아미드(중간체 D)의 합성
DCM(20 mL) 및 DMF(d 0.944; 0.1 mL)에 용해된 8-브로모옥탄산(1 당량, 10.78 mmol, 2.41g) 용액에 Ar 하에서 실온에서 옥살릴 클로라이드(2.5 당량, 27 mmol, 3.42g, 2.35 mL)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 혼합물을 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 15 mL의 DCM에 용해시키고 실온에서 디데실아민(1.1 당량, 3.53g, 11.86 mmol), 트리에틸아민(53.9 mmol, 7.5 mL) 및 DMAP(10 mg)의 DCM(20 mL) 용액에 천천히 첨가하였다. 첨가가 완료되었을 때, 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 헥산(100 mL)에 녹이고 감압 하에 실리카겔 컬럼에 로딩하였다. 그런 다음 컬럼을 헥산과 에틸 아세테이트의 혼합물(100:0 내지 90:10)로 감압 하에서 세척하였다. 원하는 산물을 황색 오일, 4.81 g, 9.6 mmol, 89%로 얻었다.
I-6의 합성
8-브로모-N,N-디데실옥탄아미드(0.8 mmol, 400 mg), CH3CN(15 mL) 및 DIPEA(0.26 mL)와 메틸아민(EtOH 중 33wt%, 0.062 mL, ca 0.5 mmol)의 혼합물을 압력 플라스크에 넣고 74 ℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc/Et3N, 95:5:0 내지 80:20:1)로 정제하고, 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0~5% MeOH를 사용하여 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(167 mg, 0.19 mmol, 48%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.30-2.24 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.63 (quintet, 7.1 Hz, 4H), 1.57-1.38 (m, 12H), 1.38-1.19 (m, 68H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C57H115N3O2 [M+H]+ Calc. 874.9; Found 875.1.
실시예 11: 6,6'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(화합물 I-10)
실시예 5의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-10을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(249 mg, 0.30 mmol, 58%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.32-3.24 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.33-2.25 (m, 8H), 2.19 (s, 3H), 1.65 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.57-1.41 (m, 12H), 1.38-1.08 (m, 60H), 0.91-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C53H107N3O2 [M+H]+ Calc. 818.8; Found 819.0.
실시예 12: 6,6'-(메틸아잔디일)비스(N,N-디도데실헥산아미드)(화합물 I-11)
실시예 5의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-11을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(313 mg, 0.34 mmol, 68%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.32-3.24 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.33-2.25 (m, 8H), 2.19 (s, 3H), 1.65 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.57-1.43 (m, 12H), 1.37-1.10 (m, 76H), 0.91-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C61H123N3O2 [M+H]+ Calc. 931.0; Found 931.2.
실시예 13: 6,6'-((2-히드록시에틸)아잔디일)비스(N,N-디옥틸헥산아미드)(화합물 I-3)
I-3의 합성
무수 THF 15 mL 중의 2-아미노에탄올(1.25 mmol, 77 mg), 6-브로모-N,N-디옥틸헥산아미드(중간체 A, 1.9 당량, 1g, 2.39 mmol), 탄산칼륨(1.9 당량, 330 mg) , 2.39 mmol), 탄산세슘(0.3 당량, 234 mg, 0.72 mmol) 및 요오드화나트륨(3 mg)의 혼합물을 압력 플라스크에서 77 ℃(오일조)에서 6일 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시켰다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc/Et3N, 95:5:0 내지 80:20:1)로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(233 mg, 0.31 mmol, 26%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.52 (t, 5.3 Hz, 2H), 3.23-3.25 (m, 4H), 3.24-3.15 (m, 4H), 3.10-2.96 (br. 1H), 2.57 (t, 5.3 Hz, 2H), 2.50-2.41 (m, 4H), 2.28 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.65 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.60-1.42 (m, 12H, overlap with water), 1.38-1.19 (m, 44H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C46H93N3O3 [M+H]+ Calc. 736.7; Found 736.8.
실시예 14: 6,6'-((6-히드록시헥실)아잔디일)비스(N,N-디옥틸헥산아미드)(화합물 I-16)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-16을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(63 mg)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.68-3.62 (m, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 3.07 -2.91 (br, 6H), 2.31 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.93-1.73 (br., 6H), 1.68 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.63-1.46 (m, 10H, overlap with water), 1.46-1.35 (m, 8H), 1.35-1.10 (m, 40H), 0.92-0.86 (m, 12H). The product exists partially in its HCl salt form. ESI-MS: MW for C50H101N3O3 [M+H]+ Calc. 792.8; Found 792.9.
실시예 15: 6,6'-((2-히드록시에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(화합물 I-19)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-19를 제조하여 원하는 산물을 연황색 오일(154 mg, 0.18 mmol, 35%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.51 (t, 5.2, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 3.08-2.92 (br, 1H), 2.56 (t, 5.3 Hz, 2H), 2.45 (t, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.64 (quintet, 7.5 Hz, 4H), 1.59-1.40 (m, 12H, overlapped with water peak), 1.36-1.10 (m, 60H), 0.91-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C54H109N3O3 [M+H]+ Calc. 848.9; Found 849.0.
실시예 16: 8,8'-((6-히드록시헥실)아잔디일)비스(N,N-디옥틸옥탄아미드)(화합물 I-17)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-17을 제조하여 원하는 산물을 연황색 오일(546 mg, 0.64 mmol, 54%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.65 (t, 6.4 Hz, 2H), 3.33-3.25 m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.40-2.34 (m, 6H), 2.28 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.75-1.59 (m, 6H), 1.58-1.46 (m, 8H), 1.46-1.36 (m, 8H), 1.36-1.10 (m, 54H), 0.92-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C54H109N3O3 [M+H]+ Calc. 848.9; Found 849.0.
실시예 17: 10,10'-((6-히드록시헥실)아잔디일)비스(N,N-디옥틸데칸아미드)(화합물 I-18)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-18을 제조하여 원하는 산물을 연황색 오일(251 mg, 0.28 mmol, 52%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.67-3.63 (m, 2H), 3.33-3.25 m, 4H), 3.24-3.16 (m, 4H), 2.41-2.35 (m, 6H), 2.28 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.68-1.59 (m, 6H), 1.59-1.47 (m, 8H, overlapped with water peak), 1.47-1.37 (m, 8H), 1.37-1.10 (m, 62H), 0.92-0.86 (m, 12H).
실시예 18: 10,10'-((2-히드록시에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(화합물 I-20)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-20을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(248 mg, 0.26 mmol, 49%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.51 (t, 5.4, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 3.08-2.92 (br, 1H), 2.56 (t, 5.4 Hz, 2H), 2.43 (t, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.64 (quintet, 7.5 Hz, 4H), 1.59-1.36 (m, 12H, overlapped with water peak), 1.36-1.10 (m, 76H), 0.91-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C62H125N3O3 [M+H]+ Calc. 961.0; Found 961.1.
실시예 19: 8,8'-((5-히드록시펜틸)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-21)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-21을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(166 mg, 0.18 mmol, 35%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.64 (t, 6.5 Hz, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.41-2.34 (m, 6H), 2.27 (t, 7.5 Hz, 4H), 2.05 (br. s, 1H), 1.67-1.57 (m, 6H), 1.54-1.36 (m, 16H), 1.36-1.10 (m, 68H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C61H123N3O3 [M+H]+ Calc. 947.0; Found 947.2.
실시예 20: 8,8'-((4-히드록시부틸)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-23)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-23을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(209 mg, 0.22 mmol, 45%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 6.64 (br. s, 1H), 3.57-3.50 (m, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.44-2.39 (m, 6H), 2.26 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.67-1.57 (m, 8H), 1.54-1.37 (m, 12H), 1.36-1.10 (m, 68H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C60H121N3O3 [M+H]+ Calc. 932.9; Found 933.1.
실시예 21: 8,8'-((6-히드록시헥실)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-24)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-24를 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(229 mg, 0.24 mmol, 48%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3, at 7.26 ppm) δ: 3.67-3.59 (m, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.39-2.33 (m, 6H), 2.26 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.73-1.68 (br. 1H), 1.68-1.38 (m, est. 20H), 1.38-1.10 (m, 72H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C62H125N3O3 [M+H]+ Calc. 961.0; Found 961.1.
실시예 22: 8,8'-((2-히드록시에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-22)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-22를 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(165 mg, 0.18 mmol, 35%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.51 (t, 5.4, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 3.07-2.98 (br, 1H), 2.56 (t, 5.4 Hz, 2H), 2.42 (t, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.68-1.59 (m, 4H), 1.59-1.36 (m, 12H, overlapped with water peak), 1.36-1.10 (m, 68H), 0.91-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C58H117N3O3 [M+H]+ Calc. 904.9; Found 905.1.
실시예 23: 10,10'-((4-히드록시부틸)아잔디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(화합물 I-25)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-25를 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(202 mg, 0.21 mmol, 42%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3, at 7.26 ppm) δ: 6.66 (br. s, 1H), 3.58-3.50 (m, 2H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.44-2.39 (m, 6H), 2.26 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.70-1.58 (m, 8H), 1.55-1.38 (m, 12H), 1.37-1.14 (m, 76H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C64H129N3O3 [M+H]+ Calc. 989.0; Found 989.1.
실시예 24: N,N'-((메틸아잔디일)비스(헥산-6,1-디일))비스(N,2-디헥실데칸아미드)(화합물 I-15)
6,6'-(메틸아잔디일)비스(헥산-1-올)(중간체 E)의 합성
6-클로로-1-헥산올(22.8 mmol, 3.11g, 3.04 mL), 무수 에탄올(60 mL), 탄산칼륨(2 당량, 24 mmol, 3.32g), 탄산세슘( 당량, 500 mg) 및 요오드화나트륨(40 mg)의 혼합물에 메틸아민(2 mmol, 1.49 mL, 무수 에탄올 중 33 중량%)을 첨가하였다. 혼합물을 밀봉된 압력 플라스크(오일조: 68 ℃)에서 16시간 동안 가열하였다. 반응을 TLC로 모니터링하였다. 더 많은 메틸아민(0.1 mL), NaI(300 mg) 및 탄산칼륨(1g)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 가열을 재개하고 추가 4일 후에 6-클로로-1-헥산올(1.5 mL) 및 NaI(220 mg)를 추가로 첨가하였다. 첨가 3일 동안 76 ℃에서 가열을 계속하였다. 마지막으로, 혼합물을 냉각하고 여과하였다. 여과물을 농축하고, 잔류물을 DCM에 취하고 여과하였다. 여과물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 이는 4.86g의 갈색 점성 오일을 제공하였다. 오일을 DCM(100 mL)에 녹이고 감압 하에 짧은 실리카겔 컬럼에 로딩하였다. 컬럼은 DCM, 메탄올 및 농축 암모니아 용액(100:0:0 ~ 85:15:1)의 혼합물로 용출되었다. 원하는 산물을 함유하는 분획을 합치고 농축하였다. 잔류물을 DCM에 용해시키고 여과하였다. 여과물을 농축 건조하여 갈색 점성 오일로서 원하는 산물을 얻었다(1.40 g, 6.05 mmol, 50%). 산물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
N 1 -헥실-N 6 -(6-(헥실아미노)헥실)-N 6 -메틸헥산-1,6-디아민(중간체 G)의 합성
브롬화수소산(6 mL, 물 중 48 중량% 용액)을 5분에 걸쳐 교반하면서 중간체 E(1.40g, 6.05 mmol)에 천천히 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 105 ℃(오일조)에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 약간 냉각시킨 후, 톨루엔(50 mL)을 천천히 첨가하였다. 반응물을 가열하여 역류시키고, 물을 공비적으로 제거하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 후 압력 플라스크로 옮기고 감압 하에 농축 건조시켰다(갈색 오일 2.62g, 5.97 mmol, 98%). TLC(CHCl3/MeOH = 9:1)는 6-브로모-N-(6-브로모헥실)-N-메틸헥산-1-아민(중간체 F)의 주요 지점을 보여주었다. 산물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
6-브로모-N-(6-브로모헥실)-N-메틸헥산-1-아민(중간체 F, 2.62 g, 5.97 mmol), 헥실아민(10 당량, 120 mmol, 12.14g), N,N-디이소프로필에틸아민 및 아세토니트릴(30 mL)에 녹인 요오드화나트륨(20 mg)(6.0 mmol, 1.04 mL)의 혼합물을 밀봉하고, 76 ℃(오일조)에서 24시간 동안 가열하였다. 이어서, 혼합물을 약 75 ℃(약 9mmHg)에서 농축하여 용매 및 과량의 헥실아민을 제거하였다. 잔류물(황색 오일/고체)을 DCM에 녹이고 여과하였다. TLC에서는 헥실아민이 완전히 제거되지 않은 것으로 나타났다. 여과물을 감압 하에 농축하여 황색 폼 4.33g을 얻었다. 잔류물을 NaOH 용액(물 10 mL 중의 수산화나트륨 1.44g)에 용해시킨 다음, 감압 하에 75 ℃에서 1.5시간 동안 농축시켰다. 잔류물을 DCM에 취하고 여과하였다. 여과액을 감압 하에서 건조될 때까지 농축하여 엷은 페이스트(2.671g, >100%)를 얻었다. 산물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
I-15의 합성
DCM(15 mL) 및 DMF(중간 크기 바늘에서 3방울)에 용해된 2-헥실데칸산(4 mmol, 1.03g)의 용액에 옥살릴 클로라이드(1.5 당량, 6 mmol, 762 mg, 0.524 mL)을 실온에서 적가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 혼합물을 감압 하에 실온에서 농축시켰다. 잔류물(밝은 노란색 페이스트)을 8 mL의 DCM에 용해시키고 조 중간체 G(0.67g), 트리에틸아민(3 당량, 3.1 mmol, 308 mg, 0.42 mL) 및 DMAP(5 mg)의 DCM(5 mL) 용액에 실온에서 약 5분 동안 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축하고 세척하여 갈색 오일(약 543 mg)을 얻었다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 6% MeOH)로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(426 mg, 0.49 mmol, 33%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 3.34-3.27 (m, 4H), 3.26-3.18 (m, 4H), 2.53-2.45 (m, 2H), 2.34-2.25 (m, 4H), 2.18 (t, 4.7 Hz, 3H), 1.65-1.36 (m, 20H), 1.36-1.10 (m, 60H), 0.92-0.84 (m, 18H). ESI-MS: MW for C57H115N3O2 [M+H]+ Calc. 874.9; Found 875.3.
실시예 25: N,N'-((메틸아잔디일)비스(헥산-6,1-디일))비스(N-헥실팔미트아미드)(화합물 I-9)
I-9의 합성
DCM(15 mL) 및 DMF(소형 바늘로 2방울)에 용해된 팔미트산(2.5 mmol, 0.64g) 용액에 옥살릴 클로라이드(1.5 당량, 3.75 mmol, 484 mg, 0.33 mL)를 실온에서 적가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 혼합물을 감압 하에 실온에서 농축시켰다. 잔류물(밝은 노란색 페이스트)을 8 mL의 DCM에 용해시키고 미정제 중간체 G(300 mg), 트리에틸아민(0.4 mL) 및 DCM(5 mL) 중 DMAP(5 mg)의 용액에 실온에서 약 5분간 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하고 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축하고 세척하여 노란색 오일/고체를 얻었고 이를 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 다시 여과하고 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축하고 세척하여 노란색 오일(약 244 mg)을 얻었다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH)로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(200 mg, 0.22 mmol, 34%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.32-3.25 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.33-2.24 (m, 8H), 2.18 (t, 4.2 Hz, 3H), 1.67-1.56 (m, 4H), 1.56-1.36 (m, 12H), 1.36-1.10 (m, 68H), 0.92-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C57H115N3O2 [M+H]+ Calc. 874.9; Found 875.1.
실시예 26: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-N,N'-((메틸아잔디일)비스(헥산-6,1-디일))비스(N-헥실옥타데카-9,12-디엔아미드)(화합물 I- 14)
I-14의 합성
DCM(12 mL) 및 DMF(소형 바늘로 2방울)에 용해된 리놀레산(2.5 mmol, 0.70g) 용액에 옥살릴 클로라이드(1.5 당량, 3.75 mmol, 484 mg, 0.33 mL)를 실온에서 적가하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음으로, 혼합물을 감압 하에 실온에서 농축시켰다. 잔류물(밝은 노란색 페이스트)을 8 mL의 DCM에 용해시키고 미정제 중간체 G(300 mg), 트리에틸아민(0.4 mL) 및 DCM(5 mL) 중 DMAP(5 mg)의 용액에 실온에서 약 5분간 첨가하였다. 첨가 후, 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 후 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하고 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일/고체를 얻었고 이를 헥산에 녹이고 다시 여과하여 고체를 제거하였다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH)로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(160 mg, 0.17 mmol, 25%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.42-5.29 (m, 8H), 3.32-3.24 (m, 4H), 3.22-3.15 (m, 4H), 2.77 (t, 6.4 Hz, 4H), 2.33-2.24 (m, 8H), 2.19 (t, 4.0 Hz, 3H), 2.05 (q, 6.8 Hz, 8H), 1.67-1.56 (m, 4H), 1.56-1.40 (m, 12H), 1.40-1.10 (m, 46H), 0.92-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C61H115N3O2 [M+H]+ Calc. 922.9; Found 923.1.
실시예 27: N,N-디데실-8-((8-(헥사데실아미노)-8-옥소옥틸)(메틸)아미노)옥탄아미드(화합물 I-12)
8-브로모-N-헥사데실옥탄아미드의 합성
20 mL의 DCM 중의 8-브로모헥산산(1.0 당량, 2.53 g, 11.36 mmol), 4-디메틸아미노피리딘(0.3 당량, 3.41 mmol, 416 mg) 및 N-히드록시숙신이미드(1.0 당량, 11.36 mmol, 1.31g)의 혼합물에 DCC(1.05 당량, 11.93 mmol, 2.46g)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 헥사데실아민(1 당량, 11.36 mmol, 2.743g)이 함유된 플라스크로 여과하고 DCM(약 20 mL)으로 세척하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 흰색 고체를 얻었다. 고체를 DCM(100 mL)에 녹이고 초음파 처리하여 약간 탁한 용액을 얻었다. 탁한 용액을 감압 하에 짧은 실리카겔 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 감압 하에 DCM과 MeOH의 혼합물(100:0 내지 98.75:1.25)을 사용하여 용출시켰다. 원하는 산물(4.50g, 10.1 mmol, 89%)을 흰색 고체로 얻었다.
N-헥사데실-8-(메틸아미노)옥탄아미드의 합성
10 mL의 EtOH 중의 메틸아민(1 mL, 8 mmol, 무수 에탄올 중 33중량%), 8-브로모-N-헥사데실옥탄아미드(1 당량, 288 mg, 0.61m mL) 및 K2CO3(1 mmol, 138 mg)의 혼합물을 압력 병에 밀봉하고 85 ℃(오일조)에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 농축한 후, 잔류물을 DCM, MeOH 및 Et3N(90:10:0.5)의 혼합물에 녹이고 여과하였다. 여과액을 농축하고 세척하여 흰색 고체(228 mg, 0.57 mmol, 89%)를 얻었으며, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
I-12의 합성
미정제 N-헥사데실-8-(메틸아미노)옥탄아미드(228 mg), 무수 아세토니트릴(15 mL), N,N-디이소프로필에틸아민(0.33 mL) 및 중간체 D(327 mg, 0.65 mmol)의 혼합물을 압력 플라스크에서 74 ℃(오일조)에서 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과액을 농축하고 세척하여 무색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(192 mg, 0.23 mmol, 40%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3, at 7.26 ppm) δ: 5.45 (s, 1H), 3.30-3.16 (m, 6H), 2.30-2.24 (m, 6H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (t, 7.6 Hz, 2H), 1.67-1.57 (m, 4H), 1.54-1.37 (m, 10H), 1.37-1.16 (m, 66H), 0.91-0.86 (m, 9H). ESI-MS: MW for C53H107N3O2 [M+H]+ Calc. 818.8; Found 819.0.
실시예 28: 8,8'-((8-(데실아미노)-8-옥소옥틸)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-33)
I-13의 합성
압력 플라스크에 있는 중간체 D(1.9 당량, 2.0g, 3.98 mmol), 무수 아세토니트릴(25 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(2.08 mL)의 혼합물에 벤질아민(2.09 mmol, 224 mg, 0.23 mL)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 75 ℃(오일조)에서 밤새 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하였다. 미정제 산물을 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/EtOAc/Et3N, 90:10:0 내지 80:20:1)로 정제하였다. 원하는 산물을 함유하는 분획을 농축하여 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하기에 충분히 순수한 갈색 오일(1.43g)을 얻었다. 분석 및 테스트를 위해 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0~5% MeOH를 사용하여 실리카겔에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피를 통해 소량의 산물을 추가로 정제하였다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3, at 7.26 pp) δ: 7.33-7.18 (m, 5H), 3.52 (s, 2H), 3.31-3.24 (m, 4H), 3.22-3.14 (m, 4H), 2.41-2.33 (m, 4H), 2.29-2.21 (m, s4H), 1.61 (quintet, 7.3 Hz, 4H), 1.56-1.38 (m, 12H), 1.38-1.10 (m, 68H), 0.90-0.85 (m, 12H).
8,8'-아잔디일비스(N,N-디데실옥탄아미드)(중간체 H)의 합성
메탄올(15 mL) 중 I-13(1.18g, 1.24 mmol), 10% Pd/C(39 mg)의 혼합물을 수소 하에 실온에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 Celiteⓒ 패드를 통해 여과하고 MeOH로 세척하였다. 여과물을 농축시켰고(1.092g 무색 오일/고체) 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
8-브로모-N-데실옥탄아미드(중간체 J)의 합성
20 mL의 DCM 중의 8-브로모헥산산(1.0 당량, 2.53 g 11.36 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.3 당량, 3.41 mmol, 416 mg)의 혼합물에 N-히드록시숙신이미드(1.0 당량, 11.36 mmol, 1.31g)를 첨가하고, 이어서 DCC(1.05 당량, 11.93 mmol, 2.46g)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 데실아민(1 당량, 11.36 mmol, 1.79g, 2.27 mL)이 들어 있는 플라스크로 여과하고 고체를 추가 DCM(3 mL x 2)으로 세척하였다. 여과물과 데실아민의 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 DCM에 녹이고 실리카겔 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 DCM과 MeOH의 혼합물(100:0 내지 97.5:2.5)로 용출시켰다. 원하는 산물을 백색 고체(3.447g, 9.51 mmol, 84%)로 얻었다.
I-33의 합성
압력 플라스크 내(15 mL) 8,8'-아잔디일비스(N,N-디데실록탄아미드)(중간체 H, 300 mg, 0.35 mmol), 8-브로모-N-데실옥탄아미드(중간체 J, 1 당량, 0.35 mmol, 127 mg), 무수 아세토니트릴, N,N-디이소프로필에틸아민(0.12 mL) 및 NaI(44 mg)의 혼합물을 밤새 73 ℃(오일조)에서 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(212 mg, 0.19 mmol, 53%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3, at 7.26 pp) δ: 5.62 (br. t, 5 Hz, 1H), 3.31-3.24 (m, 4H), 3.24-3.16 (m, 6H), 2.40-2.31 (m, 6H), 2.30-2.23 (m, 4H), 2.15 (t, 7.6 Hz, 2H), 1.67-1.57 (m, 6H), 1.55-1.36 (m, 16H), 1.36-1.10 (m, 88H), 0.90-0.85 (m, 15H). ESI-MS: MW for C74H148N4O3 [M+H]+ Calc. 1142.2; Found 1142.2.
실시예 29: 8,8'-((6-(디헥실아미노)-6-옥소헥실)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-32)
I-32의 합성
압력 플라스크에 들어 있는 6-브로모-N,N-디헥실헥산아미드(1 당량, 0.35 mmol, 127 mg; 중간체 D와 유사한 방식으로 6-브로모헥산산과 디헥실아민으로부터 제조됨), 무수 아세토니트릴(15 mL), N,N-디이소프로필에틸아민(0.12 mL), 8,8'-아잔디일비스(N,N-디데실록탄아미드)(중간체 H, 300 mg, 0.35 mmol) 및 NaI(44 mg)의 혼합물을 밤새 80 ℃(오일조)에서 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 약간 노란색의 오일(228 mg, 0.20 mmol, 57%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.31-3.24 (m, 6H), 3.22-3.15 (m, 6H), 2.40-2.33 (m, 6H), 2.30-2.24 (m, 6H), 1.69-1.58 (m, 6H), 1.54-1.36 (m, 18H), 1.36-1.10 (m, 82H), 0.92-0.85 (m, 18H). ESI-MS: MW for C74H148N4O3 [M+H]+ Calc. 1142.2; Found 1142.2.
실시예 30: 8,8'-((5-(데실아미노)-5-옥소펜틸)아잔디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-30)
5-브로모-N-데실펜탄아미드의 합성
20 mL의 DCM 중의 5-브로모발레르산(1.0 당량, 2.06g 11.36 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(0.3 당량, 3.41 mmol, 416 mg)의 혼합물에 N-히드록시숙신이미드(1.0 당량, 11.36 mmol, 1.31g)를 첨가하고, 이어서 DCC(1.05 당량, 11.93 mmol, 2.46 g)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 데실아민(1 당량, 11.36 mmol, 1.79g, 2.27 mL)이 들어 있는 플라스크로 여과하고 고체를 추가 DCM(3 mL x 2)으로 세척하였다. 여과물과 데실아민의 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날 혼합물을 농축하였다. 잔류물을 DCM에 녹이고 실리카겔 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 DCM과 MeOH의 혼합물(100:0 내지 98:2)로 용출시켰다. 원하는 산물을 백색 고체(2.758g, 8.62 mmol, 76%)로 얻었다.
I-30의 합성
압력 플라스크 내의 8,8'-아잔디일비스(N,N-디데실옥탄아미드)(중간체 H, 246 mg, 0.27 mmol), 5-브로모-N-데실펜탄아미드(130 mg), 무수 아세토니트릴(12 mL), N,N-디이소프로필에틸아민(0.10 mL) 및 NaI(40 mg)의 혼합물을 밤새 73 ℃(오일조)에서 가열하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트, MeOH 및 Et3N(80:20:2:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(60 mg)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 5.75 (br. t, 5 Hz, 1H), 3.33-3.13 (m, 10H), 2.41-2.32 (m, 6H), 2.27 (t, 7.6 Hz, 4H), 2.17 (t, 7.6 Hz, 2H), 1.67-1.57 (m, 6H), 1.55-1.35 (m, 16H), 1.35-1.16 (m, 82H), 0.90-0.85 (m, 15H).
실시예 31: 6,6'-((8-(데실아미노)-8-옥소옥틸)아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(화합물 I-29)
I-29의 합성
압력 플라스크 내의 6,6'-아잔디일비스(N,N-디데실헥산아미드)(300 mg, 0.37 mmol; 중간체 H와 유사한 방식으로 제조됨), 8-브로모-N-데실옥탄아미드(1 당량, 0.37 mmol, 135 mg), 무수 아세토니트릴(15 mL), N,N-디이소프로필에틸아민(0.12 mL) 및 NaI(70 mg)의 혼합물을 밤새 73 ℃(오일조)에서 가열하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트, MeOH 및 Et3N(80:20:2:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 용출 용매 혼합물로서 미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH를 사용하여 실리카겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(254 mg, 갈색 오일, 0.23 mmol, 63%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 5.62 (br. t, 5 Hz, 1H), 3.34-3.16 (m, 10H), 2.40-2.33 (m, 6H), 2.27 (t, 7.6 Hz, 4H), 2.15 (t, 7.6 Hz, 2H), 1.68-1.57 (m, 6H), 1.56-1.36 (m, 16H), 1.36-1.10 (m, 80H), 0.90-0.85 (m, 15H). ESI-MS: MW for C70H140N4O3 [M+H]+ Calc. 1086.1; Found 1086.3.
실시예 32: 6,6'-((2-(디헥실아미노)에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(화합물 I-31)
6,6'-((2-클로로에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)의 합성
2 mL의 CHCl3 중의 I-19(333 mg, 0.39 mmol)의 얼음 냉각 용액에 Ar 하에서 10 mL의 클로로포름에 녹인 염화티오닐(200 mg) 용액을 적가하였다. SOCl2의 첨가가 완료된 후(10분), 얼음조를 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 다음날 감압하에 CHC13 및 SOCl2를 제거하면 갈색 오일이 생성되었다. 잔류 오일을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(ca (80:20:1))의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일(282 mg, 0.325 mmol, 83%)을 얻었다. 산물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
I-31의 합성
아세토니트릴(10 mL) 중의 6,6'-((2-클로로에틸)아잔디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(282 mg, 0.33 mmol), 디헥실아민(5 당량, 1.6 mmol, 1.066g), N,N-디이소프로필에틸아민(2 당량, 0.66 mmol, 85 mg, 0.11 mL; MW129.25, d 0.742) 및 요오드화나트륨(60 mg)의 혼합물을 밀봉하고 76 ℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트, MeOH 및 Et3N(80:20:1:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 노란색 오일을 실온에서 DCM 중 Et3N 및 염화아세틸 용액으로 처리하여 미반응 디헥실아민을 아미드로 옮겼다. DCM을 제거한 후, 미정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트/Et3N, 9:1 내지 80:20:1;(미량의 Et3N을 포함하는 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH)에 의해 정제하였다. 원하는 산물을 무색 오일(256 mg, 무색 오일, 0.25 mmol, 76%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.31-3.24 (m, 4H), 3.23-3.15 (m, 4H), 2.50 (s, 4H), 2.45-2.36 (m, 8H), 2.27 (t, 7.6 Hz, 4H), 1.64 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.59-1.36 (m, 16H), 1.36-1.10 (m, 72H), 0.92-0.84 (m, 18H). ESI-MS: MW for C66H134N4O2 [M+H]+ Calc. 1016.1; Found 1016.2.
실시예 33: 10,10'-((2-(디메틸아미노)에틸) 아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(화합물 I-28)
10,10'-((2-클로로에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)의 합성
2 mL의 CHC13 중의 I-20 (293 mg, 0.30 mmol)의 얼음 냉각 용액 하에서 10 mL의 클로로포름에 녹인 염화티오닐(1.17 mmol, 139 mg, 0.085 mL) 용액을 적가하였다. SOCl2의 첨가가 완료된 후(10분), 얼음조를 제거하고 반응 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 다음날 감압하에 CHC13 및 SOCl2를 제거하면 갈색오일이 생성되었다. 잔류 오일을 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N (ca (80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드를 동일한 용매 혼합물로 세척하였다. 여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일(278 mg, 0.28 mmol, 95%)을 얻었다. 산물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
I-28의 합성
압력 플라스크에 10,10'-((2-클로로에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(278 mg, 0.28 mmol), 디메틸아민(THF 중 2M, 10 mL) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.66 mmol)의 혼합물을 밀봉하고 75 ℃에서 24시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 잔류물을 헥산, 에틸 아세테이트, MeOH 및 Et3N(80:20:1:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드는 동일한 용매 혼합물로 세척하였다.여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH)에 의해 정제하였다. 원하는 산물은 무색 오일(244 mg, 약간 노란색 오일, 0.25 mmol, 76%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.31-3.25 (m, 4H), 3.22-3.15 m, 4H), 2.56-2.551 (m, 2H), 2.43-2.33 (m, 6H), 2.26 (t, 7.6 Hz, 4H), 2.23 (s, 6H), 1.67-1.59 (m, 4H), 1.56-1.45 (m, 8H), 1.45-1.36 (m, 4H), 1.36-1.15 (m, 76H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C64H130N4O2 [M+H]+ Calc. 988.0; Found 988.1.
실시예 34: 2-부틸옥틸 6-(비스(6-(디옥틸아미노)-6-옥소헥실)아미노)헥사노에이트(화합물 I-34)
I-34의 합성
압력 플라스크에 들어 있는 2-부틸옥틸-6-아미노헥사노에이트(0.76 mmol, 228 mg; 2-부틸-1-옥탄올 및 6-아미노카프록산으로부터 제조됨; 순도 80% 미만), 6-브로모-N,N-디옥틸헥산아미드(중간체 A, 1.44 mmol, 603 mg), 무수 아세토니트릴(15 mL) 및 N,N- 디이소프로필에틸아민(0.4 mL)의 혼합물을 밀봉하고 80 ℃에서 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축한 후, 잔류물은 헥산, 에틸 아세테이트 및 Et3N(80:20:1)의 혼합물에 녹이고 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 패드는 동일한 용매 혼합물로 세척하였다.여과물을 농축하고 세척하여 노란색 오일을 얻었다. 미정제 산물을 실리카 겔 상에서 플래시 건조 컬럼 크로마토그래피(미량의 Et3N과 함께 클로로포름 중 0 내지 5% MeOH)에 의해 정제하였다. 원하는 산물은 무색 오일(172 mg, 무색 오일, 0.18 mmol, 25%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.97 (d, 5.8 Hz, 2H), 3.33-3.24 (m, 4H), 3.24-3.15 (m, 4H), 3.02-2.91 (br., 1H), 2.42 (m, 5H), 2.33-2.25 (m, 6H), 1.86-1.74 (br. 1H), 1.70-1.36 (m, 20H), 1.36-1.16 (m, 62H), 0.91-0.85 (m, 18H).
실시예 35: 6,6'-((4-히드록시부틸)아잔디일)비스(N,N-비스(2-에틸헥실)헥산아미드)(화합물 I-27)
I-27의 합성
비스-(2-에틸헥실)아민(7.5g) 및6-브로모헥사노일 클로라이드(6.1g)의 용액을 디클로로메탄(60 mL)에 넣고 트리에틸아민(6 mL)으로 처리하고 두 시간동안 교반하였다. 용액을 묽은 염산으로 세척하였다. 유기 분획물을 무수 황산 마그네슘으로 건조하고 여과한 후 용매를 제거하였다. 미정제 산물을 디클로로메탄을 사용하여 실리카겔 컬럼을 통과하여 극성 불순물을 제거하였다. THF 중의 결과물(3g)의 용액을 4-아미노부탄-1-올(0.22g) 및 N,N- 디이소프로필에틸아민(1 mL)으로 처리하였다. 반응물을 3일동안 역류시킨 다음 묽은 염산 및 디클로로메탄으로 분리하였다. 유기 분획물에서 용매를 제거하고 잔류물을 메탄올/디클로로메탄 구배를 사용하여 실리카겔(55g) 컬럼에 통과시켜 I-27(1.6g)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm): 3.57-4.49 (m, 2H), 3.33-3.18 (m, 4H) 3.12 (d, 7.4 Hz, 4H), 2.47-2.26 (m, 10H), 1.74-1.12 (m, 52H), 0.93-0.81 (m, 24H). ESI-MS: MW for C48H97N3O3 [M+H]+ Calc. 764.8; Found 764.8.
실시예 36: 8,8'-((2-히드록시에틸)아자네디일)비스(N,N- 디도데실옥탄아미드)(화합물 I-37)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-37을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(148 mg, 0.15 mmol, 32%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.51 (t, 5.0 Hz, 2H), 3.30-3.25 (m, 4H), 3.22-3.16 (m, 4H), 2.56 (t, 5.3 Hz, 2H), 2.42 (t, 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, 7.6 Hz, 4H), 1.68-1.38 (m, 16H), 1.36-1.15 (84H), 0.90-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C66H133N3O3 [M+H]+ Calc. 1017.0; Found 1017.1.
실시예 37: 6,6'-((6-히드록시헥실)아자네디일)비스(N,N- 디도데실헥산아미드)(화합물 I-38)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-38을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(259 mg, 0.25 mmol, 51%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.67-3.61 (m, 2H), 3.28 (t, 7.6 Hz, 4H), 3.19 (t, 7.7 Hz, 4H), 2.41-2.35 (m, 6H), 2.27 (t, 7.5 Hz, 4H), 1.64 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.60-1.40 (m, 16H), 1.40-1.10 (m, 80H), 0.90-0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C66H133N3O3 [M+H]+ Calc. 1017.0; Found 1017.4.
실시예 38: N,N-디데실-8-((8-(헥사디데실(메틸)아미노)-8-옥소옥틸)(메틸)아미노)옥탄아미드(화합물 I-39)
실시예 27의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-39를 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(152 mg, 0.18 mmol, 46%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.36-3.16 (m, 6H), 2.96, 2.90 (2 sets of singlet, 3H), 2.31-2.24 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.68-1.58 (m, 4H), 1.56-1.38 (m, 10H), 1.38-1.18 (m, 66H), 0.91-0.86 (m, 9H). ESI-MS: MW for C54H109N3O3 [M+H]+ Calc. 832.8; Found 832.8.
실시예 39: 8,8'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디도데실옥탄아미드)(화합물 I-40)
실시예 10의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-40을 제조하여 원하는 산물을 무색 오일(235 mg, 0.24 mmol, 53%)로 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.28 (t, 7.6 Hz, 4H), 3.19 (t, 7.7 Hz, 4H), 2.30-2.24 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.63 (quintet, 7.6 Hz, 4H), 1.57-1.43 (m, 12H), 1.37-1.10 (m, 84H), 0.90-0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C65H131N3O2 [M+H]+ Calc. 987.0; Found 987.4.
실시예 40: 8,8'-((3-히드록시프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-41)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-41을 제조하여 원하는 산물(100 mg, 22%)을 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.78 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.23 - 3.15 (m, 4H), 2.64 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.44 - 2.36 (m, 4H), 2.31 - 2.22 (m, 4H), 1.65 (dp, J = 22.1, 6.3 Hz, 6H), 1.58 - 1.40 (m, 12H), 1.38 - 1.18 (m, 70H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.0 Hz, 12H). ESI-MS: MW for C59H119N3O3 [M+H]+ Calc. 918.9; Found 919.3.
실시예 41: 8,8'-((2-(2-히드록시에톡시)에틸)아자네디일)비스(N,N- 디데실옥탄아미드)(화합물 I-42)
I-42의 합성
중간체 D(1.2 mmol, 600 mg), 2-(2-아미노에톡시)에탄-1-올(0.74 mmol, 78 mg), 및 DIEA(3.0 mmol, 0.52 mL)의 혼합물을 ACN(7 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-42(200 mg, 35%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.68 (m, 3.0 Hz, 2H), 3.63 - 3.57 (m, 4H), 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.23 - 3.14 (m, 4H), 2.62 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.49 - 2.41 (m, 4H), 2.30 - 2.22 (m, 4H), 1.61 (m, 4H), 1.48 (m, 12H), 1.38 - 1.23 (m, 68H), 0.88 (m, 12H). ESI-MS: MW for C60H121N3O4 [M+H]+ Calc. 948.9; Found 949.4.
실시예 42: 8,8'-((5-하이드록시-4,4-디메틸펜틸)아자네디일)비스(N,N- 디데실옥탄아미드)(화합물 I-43)
I-43의 합성
중간체 D(1.2 mmol, 600 mg), 5-아미노-4,4- 디메틸펜탄-1-올(0.74 mmol, 97 mg), 및 DIEA(3.0 mmol, 0.52 mL)의 혼합물을 ACN(7 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 60% EtOAc )에 의해 정제하여 화합물I-43 (280 mg, 48%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.31 - 3.23 (m, 6H), 3.22 - 3.12 (m, 4H), 2.41 - 2.30 (m, 6H), 2.30 - 2.22 (m, 4H), 1.71 - 1.58 (m, 4H), 1.56 - 1.46 (m, 5H), 1.44 - 1.36 (m, 3H), 1.36 - 1.17 (t, 74H), 0.98 - 0.81 (m, 18H). ESI-MS: MW for C63H127N3O3 [M+H]+ Calc. 975.0; Found 975.4.
실시예 43: 8,8'-((3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로필)아자네디일)비스(N,N- 디데실옥탄아미드)(화합물 I-44)
I-44의 합성
중간체 D(1.2 mmol, 600 mg), 3-(2-메틸-1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(0.74 mmol, 103 mg), 및 DIEA(3.0 mmol, 0.52 mL)의 혼합물을 ACN(7 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하였다. 자동 플래시 크로마토그래피(c18컬럼, 물에 1% Et3N과 함께 50% 내지 100% MeOH 첨가)로 두번째 정제를 하여 화합물 I-44 (60 mg, 10%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6.90 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 3.87 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.34 - 3.24 (m, 4H), 3.23 - 3.11 (m, 4H), 2.43 - 2.34 (m, 8H), 2.31 - 2.23 (m, 4H), 1.89 - 1.77 (m, 3H), 1.67 - 1.59 (m, 4H), 1.58 - 1.45 (m, 8H), 1.45 - 1.18 (m, 72H), 0.94 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C63H123N5O2 [M+H]+ Calc. 983.0; Found 983.4.
실시예 44: 8,8'-((7-히드록시헵틸)아자네디일)비스(N,N- 디데실옥탄아미드)(화합물 I-45)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-45를 제조하여 원하는 산물(320 mg, 55%)을 얻었다.
1HNMR (400 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 6.90 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 3.87 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.33 - 3.22 (m, 4H), 3.23 - 3.13 (m, 4H), 2.42 - 2.34 (m, 8H), 2.33 - 2.20 (m, 4H), 1.90 - 1.76 (m, 2H), 1.66 - 1.59 (m, 4H), 1.57 - 1.45 (m, 8H), 1.45 - 1.13 (m, 71H), 0.88 (m, 12H). ESI-MS: MW for C63H127N3O3 [M+H]+ Calc. 975.0; Found 975.4.
실시예 45: 8,8'-((2-(2-메톡시에톡시)에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-46)
I-46의 합성
중간체 D(1.2 mmol, 600 mg), 2-(2- 메톡시에톡시)에탄-1-아민(0.74 mmol, 89 mg), 및 DIEA(3.0 mmol, 0.52 mL)의 혼합물을 ACN(7 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-46(333 mg, 58%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.59 - 3.51 (m, 4H), 3.40 (s, 3H), 3.33 - 3.26 (m, 4H), 3.25 - 3.18 (m, 4H), 2.67 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.48 - 2.39 (m, 4H), 2.33 - 2.25 (m, 4H), 1.68 - 1.61 (m, 4H), 1.59 - 1.48 (m, 8H), 1.48 - 1.40 (m, 3H), 1.37 - 1.24 (m, 69H), 0.95 - 0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C61H123N3O4 [M+H]+ Calc. 963.0; Found 963.4.
실시예 46: 8,8'-((8-히드록시옥틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드) (화합물 I-47)
실시예 13의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-47을 제조하여 원하는 산물(320 mg, 54%)을 얻었다.
1HNMR (600 MHz, CDCl3 at 7.26 ppm) δ: 3.65 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.32 - 3.27 (m, 4H), 3.23 - 3.18 (m, 4H), 2.41 - 2.34 (m, 6H), 2.32 - 2.25 (m, 4H), 1.68 - 1.62 (m, 4H), 1.60 - 1.48 (m, 10H), 1.47 - 1.39 (m, 6H), 1.38 - 1.23 (m, 76H), 0.96 - 0.84 (m, 12H). ESI-MS: MW for C64H129N3O3 [M+H]+ Calc. 989.0; Found 989.5.
실시예 47: 8,8'-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-48)
I-48의 합성
중간체 D(1.2 mmol, 600 mg), 3-(1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(0.74 mmol, 93 mg), 및 DIEA(3.0 mmol, 0.52 mL)의 혼합물을 ACN(7 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-48 (82 mg, 14%)을 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 7.48 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.00 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.30 (t, J = 7.7 Hz, 4H), 3.21 (t, J = 7.8 Hz, 4H), 2.41 - 2.34 (m, 6H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 1.92 - 1.87 (m, 2H), 1.69 - 1.61 (m, 4H), 1.59 - 1.47 (m, 8H), 1.41 - 1.22 (m, 74H), 0.93 - 0.87 (m, 12H). ESI-MS: MW for C62H121N5O2 [M+H]+ Calc. 969.0; Found 969.1.
실시예 48: 8,8'-((2,2-디플루오로-3- 히드록시프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-49)
I-49의 합성
중간체 D(1.0 mmol, 500 mg), 3-아미노-2,2-디플루오로프로판-1-올(0.62 mmol, 69 mg), 및DIEA(3.0 mmol, 0.43 mL)의 혼합물을 ACN(6mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 6% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-49(55 mg, 12%)을 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 4.87 (s, 1H), 3.88 (t, J = 12.1 Hz, 2H), 3.33 - 3.27 (m, 4H), 3.24 - 3.18 (m, 4H), 2.96 (t, J = 12.7 Hz, 2H), 2.56 - 2.51 (m, 4H), 2.32 - 2.26 (m, 4H), 1.68 - 1.61 (m, 6H), 1.59 - 1.42 (m, 12H), 1.39 - 1.23 (m, 70H), 0.93 - 0.87 (m, 12H). ESI-MS: MW for C59H117F2N3O3 [M+H]+ Calc. 954.9; Found 955.1.
실시예 49: 8,8'-((3-((2-(메틸아미노)-3,4- 디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-50)
터트-부틸 (3-(비스(8-(디데실아미노)-8-옥소옥틸)아미노)프로필)카바메이트의 합성
중간체 D(1.60 mmol, 800 mg), 터트-부틸(3-aminopropyl)카바메이트(0.99 mmol, 173 mg), 및 DIEA(4.0 mmol, 0.7 mL)을ACN(10 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 터트-부틸(3-(비스(8-(디데실아미노)-8-옥소옥틸)아미노)프로필)카바메이트(388 mg, 48%)을 얻었다.
8,8'-((3-아미노프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)의 합성
터트-부틸(3-(비스(8-(디데실아미노)-8-옥소옥틸)아미노)프로필)카바메이트(0.38 mmol, 385 mg) 및 TFA (1.0 mL)의 혼합물을 DCM(2.0 mL)에 넣고 실온에서 90분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 EtOAc 및 포화 중탄산 나트륨 용액(sat. NaHCO3)사이에서 화합물 8,8'-((3-aminopropyl)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(385 mg, 정량적)으로 분획하였고, 추가 정제를 하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
3-메톡시-4-(메틸아미노)사이클로부트-3-엔-1,2-다이온의 합성
3,4-디메톡시사이클로부트-3-엔-1,2-다이온 (7.0 mmol, 1 g) 및 2M 메틸아민의 혼합물을 THF(7.7 mmol, 3.9 mL)에 녹인 후 디에틸 에테르(100 mL)에 넣고 실온에서 19시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하고 디에틸 에테르로 세척했다. 미정제 고체를 뜨거운 EtOAc에서 가루형태로 분산시킨 후, 5 ℃로 냉각한 다음 여과하고 차가운 EtOAc로 세척하여 3-메톡시-4-(메틸아미노)사이클로부트-3-엔-1,2-다이온(700 mg, 71%)을 얻었다.
I-50의 합성
8,8'-((3-아미노프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(0.11 mmol, 100 mg) 및 3-메톡시-4-(메틸아미노)사이클로부트-3-엔-1,2-다이온(0.11 mmol, 15 mg)의 혼합물을 에탄올(5 mL)에 넣고 실온에서 19시간 교반한 다음 50 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 60% EtOAc, 이어서 DCM중 2% MeOH)에 의해 정제하였다. 자동 플래쉬 크로마토그래피(DCM중 1% 내지 10% MeOH)로 두 번째 정제를 하여 화합물 I-50(32 mg, 28%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.22 (bs, 0.5H), 7.60 (bs, 0.5H), 3.70 (bs, 2H), 3.33 - 3.23 (m, 7H), 3.23 - 3.14 (m, 4H), 2.96 (bs, 2H), 2.80 (bs, 4H), 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.98 (bs, 2H), 1.66 - 1.45 (m, 16H), 1.40 - 1.20 (m, 67H). 0.92 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C64H123N5O4 [M+H]+ Calc. 1027.0; Found 1027.1.
실시예 50: 8,8'-((2-플루오로-3- 히드록시프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-51)
I-51의 합성
중간체 D(1.0 mmol, 500 mg), 3-아미노-2-플루오로프로판-1-올 히드로클로라이드(0.62 mmol, 80 mg), 및 DIEA(3.1 mmol, 0.54 mL)의 혼합물을 ACN(6 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열한 후, 55 ℃에서 72시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-51(45 mg, 10%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.60 (dt, J = 46.8, 4.8 Hz, 1H), 3.92 - 3.80 (m, 2H), 3.35 - 3.24 (m, 4H), 3.24 - 3.12 (m, 4H), 2.85 - 2.72 (m, 2H), 2.53 - 2.37 (m, 4H), 2.31 - 2.23 (m, 4H), 1.67 - 1.40 (m, 20H), 1.38 - 1.19 (m, 66H), 0.94 - 0.82 (m, 12H). ESI-MS: MW for C59H118FN3O3 [M+H]+ Calc. 936.9; Found 937.0.
실시예 51: 8,8'-((3,3,3-트리플루오로-2-(히드록시메틸)프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-52)
I-52의 합성
중간체 D(1.0 mmol, 500 mg), 2-(아미노메틸)-3,3,3-트리플루오로프로판-1-올(0.62 mmol, 111 mg), 및 DIEA(2.4 mmol, 0.43 mL)의 혼합물을 ACN(6 mL)에 넣고 72 ℃에서 48시간 동안 가열한 후, 55 ℃에서 72시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-52(100 mg, 20%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.88 (s, 1H), 4.01 - 3.92 (m, 1H), 3.89 - 3.78 (m, 1H), 3.33 - 3.24 (m, 4H), 3.23 - 3.15 (m, 4H), 2.91 - 2.73 (m, 2H), 2.69 - 2.50 (m, 3H), 2.34 - 2.21 (m, 6H), 1.69 - 1.39 (m, 20H), 1.38 - 1.21 (m, 68H), 0.95 - 0.84 (m, 12H). ESI-MS: MW for C60H118F3N3O3 [M+H]+ Calc. 986.9; Found 987.0.
실시예 52: 8,8'-((5-메톡시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(화합물 I-53)
I-53의 합성
중간체 D(0.80 mmol, 400 mg), 5-메톡시펜탄-1-아민(0.50 mmol, 58 mg), 및 DIEA(2.0 mmol, 0.35 mL)의 혼합물을 ACN(6 mL)에 넣고 72 ℃에서 24시간 동안 가열한 후, 55 ℃에서 72시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-53 (210 mg, 55%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.36 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H), 3.30 - 3.25 (m, 4H), 3.22 - 3.16 (m, 4H), 2.41 - 2.32 (m, 6H), 2.31 - 2.22 (m, 4H), 1.67 - 1.37 (m, 23H), 1.36 - 1.19 (m, 69H), 0.91 - 0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C62H125N3O3 [M+H]+ Calc. 961.0; Found 961.1.
실시예 53: N,N-디데실-8-((8-(디옥틸아미노)-8-옥소옥틱)(메틸)아미노)옥탄아미드(화합물 I-55)
8-(메틸아미노)-N,N-디옥틸옥탄아미드의 합성
8-브로모-N,N-디옥틸옥탄아미드(5.8 mmol, 2.6 g) 및 8M 메틸아민의 혼합물을 EtOH(30 mL)에 녹여 ACN(6 mL)에 넣고 70 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지 10% EtOAc, 이어서 DCM중 1% 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 8-(메틸아미노)-N,N-디옥틸옥탄아미드(1.91 g, 83%)을 얻었다.
I-55의 합성
8-(메틸아미노)-N,N-디옥틸옥탄아미드(3.4 mmol, 1.3 g), 중간체 D(3.4 mmol, 1.7 g), 및 DIEA(13.8 mmol, 2.4 mL)의 혼합물을 ACN(120 mL)에 넣고 70 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-55(1.38 g, 50%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.34 - 3.26 (m, 4H), 3.25 - 3.17 (m, 4H), 2.34 - 2.25 (m, 8H), 2.21 (s, 3H), 1.70 - 1.61 (m, 6H), 1.60 - 1.41 (m, 12H), 1.39 - 1.23 (m, 59H), 0.95 - 0.85 (m, 12H). ESI-MS: MW for C53H107N3O2 [M+H]+ Calc. 818.8; Found 819.0.
실시예 54: 터트-부틸(3-(비스(10-(디덱실아미노)-10-옥소데실)아미노)프로필)카바메이트(화합물 I-56)
I-56의 합성
10-브로모-N,N-디데실데칸아미드(실시예 5의 일반적인 절차에 따라 제조된, 1.5 mmol, 800 mg), 터트-부틸(3-아미노프로필)카바메이트(0.93 mmol, 162 mg), 및 DIEA(4.5 mmol, 0.78 mL)의 혼합물을 ACN(10 mL)에 넣고 70 ℃에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 65% EtOAc)에 의해 정제하여 I-56(555 mg, 69%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.72 (bs, 1H), 3.32 - 3.24 (m, 4H), 3.23 - 3.14 (m, 6H), 2.44 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.31 - 2.23 (m, 4H), 2.31 - 2.23 (m, 4H), 1.67 - 1.58 (m, 9H), 1.57 - 1.47 (m, 3H), 1.47 - 1.37 (m, 12H), 1.35 - 1.19 (m, 77H), 0.92 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C68H136N4O4 [M+H]+ Calc. 1074.1; Found 1074.2.
실시예 55: 10,10'-((3-(1H-이미다졸-1-일)프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(화합물 I-57)
I-57의 합성
10-브로모-N,N-디데실데칸아미드(실시예 5의 일반적인 절차에 따라서 제조된, 1.1 mmol, 600 mg), 3-(1H-이미다졸-1-일)프로판-1-아민(0.68 mmol, 88 mg), 및 DIEA(3.3 mmol, 0.57 mL)을 ACN(7 mL)에 넣고 70 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 100% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-57(45 mg, 8%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.52 (bs, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 4.00 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.32 - 3.24 (m, 4H), 3.22 - 3.15 (m, 4H), 2.38 (bs, 6H), 2.31 - 2.21 (m, 4H), 1.90 (bs, 2H), 1.73 - 1.57 (m, 8H), 1.57 - 1.45 (m, 8H), 1.43 - 1.16 (m, 81H), 0.95 - 0.81 (m, 12H). ESI-MS: MW for C66H129N5O2 [M+H]+ Calc. 1025.0; Found 1025.1.
실시예 56: 8,8'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디노닐옥탄아미드)(화합물 I-58)
실시예 5의 일반적인 절차에 따라 화합물 I-58을 제조하여 원하는 산물(1.78 g, 59%)을 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.33 - 3.27 (m, 4H), 3.24 - 3.18 (m, 4H), 2.33 - 2.26 (m, 8H), 2.21 (s, 3H), 1.69 - 1.61 (m, 7H), 1.59 - 1.42 (m, 12H), 1.39 - 1.21 (m, 61H), 0.94 - 0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C53H107N3O2 [M+H]+ Calc. 818.8; Found 819.0.
실시예 57: 터트-부틸(3-(비스(10-(디덱실아미노)-10-옥소데실)아미노)프로필)카바메이트(화합물 I-59)
N,N-디데실-8-(메틸아미노)옥탄아미드의 합성
중간체 D(6.3 mmol, 2.8 g) 및 8M 메틸아민을 EtOH(30 mL)에 녹여 ACN(12 mL)에 넣고 70 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지 100% EtOAc, 이어서DCM 중 1% 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 N,N-디데실-8-(메틸아미노)옥탄아미드 (2.24 g, 79%)를 얻었다.
I-59의 합성
N,N-디데실-8-(메틸아미노)옥탄아미드(3.3 mmol, 1.5 g), 8-브로모-N,N-디노닐옥탄아미드(실시예 5의 일반적인 절차에 따라 제조된, 3.3 mmol, 1.6 g), 및 DIEA(13.2 mmol, 2.3 mL)을 ACN(10 mL)에 넣고 70 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 5% 내지 60% EtOAc)에 의해 정제하여 화합물 I-59(1.5g, 53%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.34 - 3.26 (m, 4H), 3.25 - 3.17 (m, 4H), 2.34 - 2.24 (m, 8H), 2.21 (s, 3H), 1.75 - 1.59 (m, 4H), 1.61 - 1.41 (m, 12H), 1.38 - 1.23 (m, 66H), 0.95 - 0.86 (m, 12H). ESI-MS: MW for C55H111N3O2 [M+H]+ Calc. 846.9; Found 847.1.
실시예 58: 10,10'-((3-((2-(메틸아미노)-3,4-디옥소사이클로부트-1-엔-1-일)아미노)프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(화합물 I-60)
중간체 K의 합성
I-56(0.42 mmol, 455 mg) 및 TFA(2.0 mL)를 DCM(1.0 mL)에 넣고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 EtOAc 및 포화 중탄산 나트륨 용액(sat. NaHCO3)사이에서 10,10'-((3-아미노프로필)아자네디일)비스(N,N-디데실데칸아미드)(중간체 K, 369 mg, 90%)로 분획하였고, 추가 정제를 하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
I-60의 합성
중간체 K(0.1 mmol, 100 mg) 및 3-메톡시-4-(메틸아미노)사이클로부트-3-엔-1,2-다이온(실시예 43의 일반적인 절차에 따라 제조된, 0.5 mmol, 75 mg)을 EtOH(1.0 mL)에 넣고 80 ℃에서 5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 크로마토그래피(헥산 중 1% Et3N과 함께 50% 내지 100% EtOAc, 이어서DCM 중 2% 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 I-60(27 mg, 25%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.15 - 6.86 (bs, 1H), 3.68 (bs, 2H), 3.33 - 3.18 (m, 11H), 2.58 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 2.46 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.30 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.05 - 1.73 (m, 6H), 1.71 - 1.41 (m, 18H), 1.38 - 1.20 (m, 79H), 0.96 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C68H131N5O4 [M+H]+ Calc. 1083.0; Found 1083.1.
실시예 59: 화합물 I-61 내지I-68에 대한 합성 경로
Int 1-1 및 Int 1-2 제조에 대한 일반적인 절차
K2CO3(1.0 당량)을 ACN(7 mL/mmol)에 넣은 용액에 8-아미노옥탄올(1.0 당량)을 실온에서 N2하에 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 적절한 브로마이드(1.0 당량)을 적가한 후 반응 혼합물을 실온에서 N2 하에 밤새 교반하였다. 이어서, 현탁액을 여과한 후 남은 용액을 농축하였다. 고체 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH 중 3% NH3, 100:0 내지 80:20)로 정제하였다.
Int 1-3 및 Int 1-4 제조에 대한 일반적인 절차
8-아미노옥탄올(1.0 당량)을 ACN(7 mL/mm)에 넣은 용액에 적정량의 브로마이드(1.0 당량)를 첨가하고 반응 혼합물을 밤새 N2 하에 역류시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하여 미정제 산물을 얻었다. 미정제 산물은 컬럼 크로마토그래피(DCM/MeOH 중 3% NH3, 100:0 내지 80:20)로 정제하였다.
Int 2-1 to Int 2-4 제조에 대한 일반적인 절차
산(0.9 당량)을 DCM(2.5 mL/mmol)에 넣은 용액에 N-히드록시숙시니마이드(0.9 당량), 4-디메틸아미노피리딘(0.9 당량) 및 디클로헥실카보디이마이드(0.9 당량)를 실온에서 N2 하에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 완전히 전환될 때까지 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과하고, 여과액을 Int 1-1 또는 Int 1-2, Int 1-3, 또는 Int 1-4 (1.0 당량)을 DCM(2.3 mL/mmol)에 넣은 용액에 실온에서 적가하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 실온에서 N2 하에 교반하였다. 이어서, 유기상을 HCl(aq., 1　mol/L), Na2CO3(aq.)로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 유기상을 농축하였다. 옅은 노란색 고체를 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc, 100:0 내지 0:100)로 정제하였다.
Int 3-1 & Int 3-2 제조에 대한 일반적인 절차
Int 2-1 또는 Int 2-2(1.0 당량)을 DCM(10-15 mL/mmol)에 넣은 용액에 PCC(5.0 당량)를 소량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 N2 하에 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 감압 하에 농축하고, 얻어진 미정제 산물을 크로마토그래피(Hex/EtOAc, 100:0 내지 80:20)로 정제하였다.
Int 4-1 & Int 4-2 제조에 대한 일반적인 절차
Int 2-3 또는 Int 2-4 (1.0 당량)을 디에틸 에테르(8.0 mL/mmol)에 넣은 용액에 PBr3(2-3 당량)을 0 ℃, N2 하에 적가하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 천천히 실온까지 데우고 반응이 완료될 때까지 실온에서 N2 하에 교반하였다. 이어서, 얼음으로 식힌 물을 투명한 용액이 될 때까지 서서히 첨가하였다. 수성상을 에틸 아세테이트로 세 번 추출하고, Na2SO4로 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc, 100:0 내지 90:10)로 정제하였다.
화합물 I-61, I-62, I-63 및 I-64 제조에 대한 일반적인 절차
Int 3-1 또는 Int 3-2(1.0 당량)을 MeOH(10 mL/mmol)에 넣은 용액에 적정량의1차 아민(0.35 당량)을 첨가하였다. 반응 용액을 실온에서 N2하에 30분 동안 교반하였다. 이어서, Na(CNBH3)(4.0 당량), 및 AcOH 한 방울을 추가하고 반응 혼합물을 실온에서 N2 하에 2 내지 3일 동안 교반하였다. 반응이 완성된 후에, DCM(100 mL/ mmol) 및 Na2CO3 (aq.)(200 mL/mmol)로 희석하고, 실온에서 30분동안 교반한 후 분리하고 유기상을 Na2SO4로 건조시켰다. 미정제 산물을 크로마토그래피(DCM/MeOH 중 3% NH3, 100:0 내지 80:20)로 정제하였다.
화합물 I-65, I-66, I-67 및 I-68 제조에 대한 일반적인 절차
Int 4-1 또는 Int 4-2(1.5 당량)을 ACN(5.5 mL/mmol)에 넣은 용액에 DIPEA (3.8 당량) 및 원하는 알킬화 시약(1.0 당량)을 첨가하였다. 반응은 80 ℃에서 24시간 동안 밀폐된 튜브에서 수행하였다. 이어서, Int 4-1 또는 Int 4-2(0.5 당량)이 더 추가된 ACN(2.0 mL/ mmol)에 반응 혼합물을 첨가하고, 80 ℃에서 24시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 실온에서 식힌 후 감압 농축하였다. 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(EtOAc 중 Hex/1% NEt3, 95:5 내지 0:100)로 정제하였다.
N,N '-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스( N -헥실헥산아미드)(I-61)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-헥실헥산아미드)(I-61)를 Int 3-1(500 mg, 1.5 mmol) 및 메틸아민(2 M 의MeOH, 0.26 mL, 0.52 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(250 mg, 0.38 mmol, 73　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.28 (dd, J = 7.8, 7.4 Hz, 4H), 3.19 (dd, J = 7.5 Hz, 4H), 2.34 (s, 3H), 2.30 - 2.17 (m, 7H), 1.63 (dt, J = 14.8, 7.6 Hz, 6H), 1.52 (td, J = 14.4, 7.4 Hz, 12H), 1.39 - 1.19 (m, 40H), 0.92 - 0.87 (m, 12H)., ESI-MS: MW for C41H83N3O2 [M+H]+ calc. 650.66, found 650.85.
N,N '-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스( N -헥실헥산아미드)(I-62)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-헥실헥산아미드)(I-62)를 Int 3-1(500 mg, 1.5 mmol) 및 5-아미노펜탄-1-올(54 mg, 0.52 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(242 mg, 0.34 mmol, 66　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.27 (dd, J = 10.8, 4.4 Hz, 4H), 3.22 - 3.16 (m, 4H), 2.45 (s, 1H), 2.29 - 2.24 (m, 4H), 1.81 (s, 1H), 1.62 (dt, J = 16.1, 7.7 Hz, 7H), 1.50 (dd, J = 14.4, 7.2 Hz, 15H), 1.40 - 1.19 (m, 42H), 0.93 - 0.85 (m, 12H), ESI-MS: MW for C45H91N3O3 [M+H]+ calc. 722.72, found 722.80.
N,N '-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스( N -옥틸옥탄아미드)(I-63)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-옥틸옥탄아미드)(I-63)를 Int 3-2(450 mg, 1.2 mmol) 및 메틸아민(2 M in MeOH, 0.21 mL, 0.42 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(180 mg, 0.24 mmol, 65　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.30 - 3.24 (m, 4H), 3.22 - 3.14 (m, 4H), 2.63 - 2.59 (m, 3H), 2.47 (t, J = 17.2 Hz, 3H), 2.30 - 2.23 (m, 4H), 1.75 - 1.57 (m, 8H), 1.57 - 1.42 (m, 9H), 1.29 (m, 52H), 0.91 - 0.84 (m, 12H), ESI-MS: MW for C49H99N3O2 [M+H]+ calc. 762.78, found 762.81.
N,N '-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스( N -옥틸옥탄아미드)(I-64)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-옥틸옥탄아미드)(I-64)를 Int 3-2 (450 mg, 1.2 mmol) 및 5-아미노펜탄-1-올 (43.3 mg, 0.42 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일로 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.27 (dd, J = 10.9, 4.4 Hz, 4H), 3.21 - 3.17 (m, 4H), 2.41 (s, 1H), 2.28 - 2.25 (m, 4H), 1.67 - 1.57 (m, 10H), 1.57 - 1.46 (m, 11H), 1.46 - 1.35 (m, 6H), 1.35 - 1.21 (m, 55H), 0.91 - 0.85 (m, 12H), ESI-MS: MW for C53H107N3O3 [M+H]+ calc. 834.84, found 834.70.
N,N '-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스( N -옥틸옥탄아미드)(I-65)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-옥틸옥탄아미드)(I-65)를 Int 4-1(493 mg, 1.1 mmol) 및 메틸아민(2 M in MeOH, 0.19 mL, 0.385 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(232 mg, 0.27 mmol, 66　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.30 - 3.24 (m, 4H), 3.22 - 3.15 (m, 4H), 2.33 - 2.23 (m, 7H), 2.20 (s, 3H), 1.73 - 1.58 (m, 10H), 1.58 - 1.40 (m, 12H), 1.37 - 1.20 (m, 71H), 0.92 - 0.84 (m, 12H), ESI-MS: MW for C57H115N3O2 [M+H]+ calc. 874.91, found 875.60.
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-데실데칸아미드)(I-66)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-데실데칸아미드)(I-66)를 Int 4-1(493 mg, 1.1 mmol) 및 5-아미노펜탄-1-올(40 mg, 0.385 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(247 mg, 0.26 mmol, 65　%)로 얻었다. 산물은 오일(76.8 mg, 0.08 mmol, 28　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.65 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.22 - 3.12 (m, 4H), 2.52 (s, 1H), 2.30 - 2.22 (m, 4H), 1.62 (dt, J = 15.0, 7.5 Hz, 12H), 1.57 - 1.43 (m, 14H), 1.34 - 1.21 (m, 70H), 0.91 - 0.84 (m, 12H), ESI-MS: MW for C61H123N3O3 [M+H]+ calc. 946.97, found 946.73.
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-도데실도데칸아미드)(I-67)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-도데실도데칸아미드) (I-67)를 Int 4-2(700 mg, 1.25 mmol) 및 메틸아민(2 M in MeOH, 0.21 mL, 0.425 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(510 mg, 0.52 mmol, 84　%)로 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.29 - 3.25 (m, 4H), 3.21 - 3.16 (m, 4H), 2.28 (dt, J = 15.4, 8.4 Hz, 8H), 2.19 (t, J = 2.8 Hz, 3H), 1.67 - 1.58 (m, 15H), 1.57 - 1.40 (m, 12H), 1.35 - 1.20 (m, 87H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 12H), ESI-MS: MW for C65H131N3O2 [M+H]+ calc. 987.03, found 986.87.
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-도데실도데칸아미드)(I-68)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(N-도데실도데칸아미드)(I-68)를 Int 4-2 (700 mg, 1.25 mmol) 및5-아미노펜탄-1-올(44 mg, 0.425 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(471 mg, 0.45 mmol, 72　%)로 얻었다.
1H NMR (600 MHz, CDCl3) δ 3.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.27 (dd, J = 10.7, 4.5 Hz, 4H), 3.22 - 3.15 (m, 4H), 2.43 - 2.33 (m, 6H), 2.29 - 2.23 (m, 4H), 1.69 (s, 4H), 1.65 - 1.34 (m, 24H), 1.34 - 1.19 (m, 88H), 0.91 - 0.84 (m, 12H), ESI-MS: MW for C69H139N3O3 [M+H]+ calc. 1059.09, found 1058.89.
실시예 60: 화합물 I-69 및 I-71에 대한 합성 경로
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실데칸아미드) (I-69)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실데칸아미드)(I-69)을 실시예 59의 Int 6(0.408 g, 1.06 mmol) 및 메틸아민(THF 중 2M, 0.181 mL, 0.36 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(210 mg, 0.27 mmol, 26%)로 얻어졌다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.23 - 3.14 (m, 4H), 2.75 - 2.37 (m, 7H), 2.26 (t, J = 8.3 Hz, 4H), 1.71 - 1.58 (m, 8H), 1.50 (dq, J = 14.4, 7.2, 6.8 Hz, 8H), 1.37 - 1.18 (m, 52H), 0.92 - 0.82 (m, 12H). ESI-MS: MW for C49H99N3O2 [M+H]+ calc. 762.78, found 762.88.
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실데칸아미드) (I-71)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실데칸아미드)(I-71)를 Int 6(458 mg, 1.20 mmol) 및 5-아미노-1-펜탄올(22 mg, 0.40 mmol)의 실시예 59의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(250 mg, 0.30 mmol, 25%)로 얻어졌다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3-d) δ 5.52 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.66 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 6.6 Hz, 4H), 3.02 - 2.94 (m, 2H), 2.77 (m, 5H), 2.04 - 1.89 (m, 4H), 1.67 - 1.13 (m, 86H), 0.94 - 0.78 (m, 13H). ESI-MS: MW for C53H107N3O3 [M+H]+ calc. 834.84, found 834.98.
실시예 61: 화합물 I-70 및 I-72에 대한 합성 경로
터트-부틸(8-히드록시옥틸)카바메이트(Int 7)의 합성
8-아미노-1-옥탄올(10 g, 68.9 mmol)을 DCM (100 mL)에 넣은 용액에 트리에틸아민(13.9 g, 137.74 mmol)을 N2하에 실온에서 첨가하였다. 이어서, 보크-무수물(16.5 g, 75.75 mmol)을 0 ℃에서 10분 동안 적가하여 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 이어서, 물(200 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 20분간 교반하였다. 유기층이 분리되었고, 수성층은 DCM (100 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과한 후 감압 하에 농축하여 미정제 산물을 얻었다. 얻은 미정제 산물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc 100:0 내지 55:45)로 정제하여 고체 상태의 Int7(15.2　g, 61.94 mmol, 90　%)을 얻었다. ESI-MS: MW for C13H27NO3Na [M+Na]+ calc. 268.35, found 268.31.
8-(메틸아미노)옥탄-1-올(Int 8)의 합성
건조 THF(100 mL)에 LAH(10.12 g, 266.80 mmol)의 교반 현탁액을 0 ℃, N2하에 넣고, 건조 THF(50 mL)에 Int 7(15 g, 61.13 mmol) 용액을 30분 동안 적가하여 첨가하고 결과 현탁액을 16시간 동안 역류시켰다. 이어서 반응 혼합물은 0 ℃로 식히고 물(10 mL)을 적가하여 첨부하였다. 이후, NaOH(15%, 10 mL)용액과 물(10 mL)을 적가하여 첨가하였다. 생성된 케이크 용액에, MgSO4를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과를 통해 제거하고 여과액을 염수(brine)로 세척하고 Na2SO4로 건조시켰다. 유기층을 감압 하에 증발시켜서 미정제 8-(메틸아미노)옥탄-1-올(Int 8)(7.2 g, 45.20 mmol, 74%)을 확보하였다. ESI-MS: MW for C9H21NO [M+H]+ calc. 160.28; found 160.21.
2-헥실-N-(8-히드록시옥틸)-N-메틸테칸아미드(Int 9)의 합성
Int 9을 실시예 59의 Int 8(2.6　g, 16.38 mmol) 및2-헥실데카노익산(3.78 g, 14.7 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 무색 오일(2.2　g, 5.53 mmol, 34%)로 얻었다. ESI-MS: MW for C25H51NO2 [M+H]+ calc. 398.70; found 398.41.
2-헥실-N-메틸-N-(8-옥소옥틸)데칸아미드(Int 10)의 합성
실시예 59의 일반적인 절차에 따라서, Int 9(2.05　g, 5.16 mmol)를 Int 10으로 전환하였다. 산물은 무색 오일(1.38　g, 3.49 mmol, 67.5%)로 얻었다. ESI-MS: MW for C25H49NO2 [M+H]+ calc. 396.68; found 396.45.
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실-N-메틸데칸아미드)(I-70)의 합성
N,N'-((메틸아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실-N-메틸데칸아미드)(I-70)을 실시예 59의 Int 10(500 mg, 1.26 mmol) 및 메틸아민(MeOH 중 2M, 13.4 mg, 0.225 mL, 0.43 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(200 mg, 0.25 mmol, 20　%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.40 - 3.34 (m, 2H), 3.31 - 3.24 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.92 (s, 2H), 2.68 - 2.22 (m, 8H), 1.78 - 1.46 (m, 16H), 1.45 - 1.36 (m, 4H), 1.27 (m, 53H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 12H). ESI-MS: MW for C51H103N3O2 [M+H]+ calc. 790.81; found 790.73.
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실-N-메틸데칸아미드)(I-72)의 합성
N,N'-(((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(옥탄-8,1-디일))비스(2-헥실-N-메틸데칸아미드)(I-72)을 실시예 59의 Int-10(500 mg, 1.26 mmol) 및 5-아미노-1-펜탄올(44.4 mg, 0.43 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(235 mg, 0.27 mmol, 22　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.41 - 3.34 (m, 2H), 3.32 - 3.25 (m, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.92 (s, 3H), 2.64 - 2.51 (m, 2H), 2.49 - 2.34 (m, 6H), 1.74 (bs, 6H), 1.65 - 1.53 (m, 8H), 1.43 (m, 14H), 1.26 (m, 56H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 12H). ESI-MS: MW for C55H111N3O3 [M+H]+ calc. 862.87; found 862.69.
실시예 62: 화합물 I-75 내지 I-78에 대한 합성 경로
Int 11-1, Int 11-2,및Int 11-3 제조에 대한 일반적인 절차
적정량의 카복실산(1.0 당량)을 DCM(2 mL/mmol)에 넣은 용액에 촉매 작용을 하는 양의 DMF 및 옥살릴 클로라이드(3.0 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 완전히 전환될 때까지 실온에서 N2 하에 교반하였다. 이어서, 과량의 옥살릴 클로라이드 및 DCM을 진공하에서 증발시켰다. 이렇게 생성된 아실 클로라이드를 건조된 DCM(1 mL/ mmol)에 넣고 디데실아민(1.1 당량), NEt3 (6.0 당량), 및 DMAP(cat.)을 건조된 DCM(3 mL/mmol)에 넣은 용액을 천천히 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 실온에서 N2하에 16시간 동안 교반하였다. 감압 농축 후에, 잔류물을 H2O(10 mL/mmol) 및 에틸 아세테이트(10 mL/mmol)로 분획하였다. 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 결합된 유기상을 Na2SO4로 건조시키고, 감압하에 농축하였다. 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(헥산/에틸 아세테이트, 100:0 내지 80:20)로 정제하였다.
화합물 I-77, I-78, I-75 및 I-76 제조에 대한 일반적인 절차
Int 11-1, Int 11-2 또는 Int 11-3(1.5 당량)을 ACN (5.5 mL/mmol)에 넣은 용액에 DIPEA(3.8 당량) 및 원하는 알킬화 시약(1.0 당량)을 첨가하였다. 반응은 80 ℃에서 24시간 동안 밀폐된 튜브에서 수행하였다. 더 추가된 브로마이드(Int 11-1, Int 11-2 or Int 11-3)(0.5 당량, CAN 중)(2.0 mL/mmol)에 반응 혼합물을 첨가하고, 80 ℃에서 24시간 동안 더 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온에서 식힌 후 감압 농축하였다. 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(Hex/ EtOAc 중 1% NEt3, 95:5 내지 0:100)로 정제하였다.
6,6'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(I-77)의 합성
6,6'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실헥산아미드)(I-77)를 Int 11-1(700 mg, 1.47 mmol) 및 5-아미노펜탄-1-올(0.053 g, 0.51 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(471 mg, (0.45 mmol, 72　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.23 - 3.14 (m, 4H), 2.44 - 2.34 (m, 6H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 1.79 - 1.39 (m, 26H), 1.26 (m, 59H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.1 Hz, 12H). ESI-MS: MW for C57H115N3O3 [M+H]+ calc. 890.90, found 890.81.
7,7'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디데실헵탄아미드)(I-75)의 합성
7,7'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디데실헵탄아미드)(I-75)를 Int 11-2(800 mg, 1.63 mmol) 및 메틸아민(0.37 mL, 0.74 mmol, MeOH 중 2M)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(368 mg, 0.43 mmol, 43　%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.30 - 3.24 (m, 4H), 3.21 - 3.15 (m, 4H), 2.27 (dd, J = 15.1, 7.5 Hz, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.72 - 1.58 (m, 10H), 1.57 - 1.41 (m, 13H), 1.38 - 1.18 (m, 67H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.1 Hz, 12H), ESI-MS: MW for C55H111N3O2 [M+H]+ calc. 846.88, found 846.51.
8,8'-((2-(디메틸아미노)에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(I-77)의 합성
8,8'-((2-(디메틸아미노)에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드)(I-77)을 Int 11-3(800 mg, 1.59 mmol) 및 N,N-디메틸에틸디아민(0.07 mL, 0.7 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(197 mg, 0.21 mmol, 30　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.31 - 3.23 (m, 4H), 3.23 - 3.13 (m, 4H), 2.63 - 2.51 (m, 2H), 2.49 - 2.35 (m, 6H), 2.31 - 2.20 (m, 10H), 1.84 (s, 3H), 1.67 - 1.58 (m, 4H), 1.57 - 1.39 (m, 12H), 1.28 (mi, 71H), 0.88 (td, J = 6.8, 3.1 Hz, 12H), ESI-MS: MW for C60H122N4O2 [M+H]+ calc. 931.97, found 931.98.
8,8'-((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드) (I-78)의 합성
8,8'-((2-(피롤리딘-1-일)에틸)아자네디일)비스(N,N-디데실옥탄아미드) (I-78)를 Int 11-3(700 mg, 1.39 mmol) 및 1-(2-아미노에틸)피롤리딘(0.08 mL, 0.7 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노락색오일(260 mg, 0.27 mmol, 39　%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.32 - 3.23 (m, 4H), 3.22 - 3.12 (m, 4H), 2.64 - 2.47 (m, 7H), 2.45 - 2.36 (m, 4H), 2.30 - 2.23 (m, 4H), 1.84 - 1.68 (m, 9H), 1.67 - 1.58 (m, 4H), 1.57 - 1.37 (m, 12H), 1.26 (mi, 71H), 0.88 (td, J = 6.7, 3.0 Hz, 12H), ESI-MS: MW for C62H124N4O2 [M+H]+ calc. 957.98, found 957.92.
실시예 63: 화합물 I-73 및 I-74에 대한 합성 경로
Int 12-1, Int 12-2, 및 Int 12-3 제조에 대한 일반적인 절차
Int 11-3(1 당량) 및 적절한 아민(5 당량)을 아세토니트릴(10 mL/mmol)에 넣은 용액을 밤새 역류하도록 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc 95:5 내지 0:100 이어서 DCM/MeOH 중 3% NH3 100:0 내지90:10)로 정제하였다.
I-73 & I-74 제조에 대한 일반적인 절차
Int 12-1 또는 Int 12-2(1 당량), Int 4-1(1.2 당량), 및 DIPEA(4 당량)를 ACN(10 mL/mmol)에 넣은 혼합물을 밤새 역류하도록 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하고, 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc 중 1% NEt3 100:0 내지 35:65)로 정제하였다.
N-데실-N-(8-((8-(디데실아미노)-8옥소옥틸) (메틸) 아미노) 옥틸)데칸아미드(I-73)의 합성
N-데실-N-(8-((8-(디데실아미노)-8 옥소옥틸) (메틸) 아미노) 옥틸)데칸아미드(I-73)를 Int 12-1(0.4 g, 0.88 mmol) 및 Int 4-1(0.53 g, 1.06 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(0.38 g, 0.43 mmol 49.3%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.34 - 3.23 (m, 4H), 3.22 - 3.11 (m, 4H), 2.34 - 2.22 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.67 - 1.58 (m, 4H), 1.50 (m, 12H), 1.37 - 1.18 (m, 68H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 12H). ESI-MS: MW for C57H115N3O2 [M+H]+ calc. 874.91, found 874.56.
N-데실-N-(8-((8-(디데실아미노)-8-옥소옥틸)(5-히드록시펜틸)아미노)옥틸)데칸아미드(I-74)의 합성
N-데실-N-(8-((8-(디데실아미노)-8-옥소옥틸)(5-히드록시펜틸)아미노)옥틸)데칸아미드(I-74)를 Int 12-2(0.4 g, 0.76 mmol) 및 Int 4-1(0.46 g, 0.91 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(0.4 g, 0.42 mmol 55.5%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.32 - 3.24 (m, 4H), 3.22 - 3.13 (m, 4H), 2.45 - 2.32 (m, 6H), 2.32 - 2.22 (m, 4H), 1.78 - 1.56 (m, 11H), 1.56 - 1.36 (m, 16H), 1.36 - 1.18 (m, 68H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 13H). ESI-MS: MW for C61H123N3O3 [M+H]+ calc. 946.97, found 946.73.
실시예 64: 화합물 I-73 & I-74에 대한 합성 경로
터트-부틸 데실카바메이트(Int 13)의 합성
데칸-1-아민(10 g, 63.57 mmol)을 DCM (100 mL)에 넣은 용액에 트리에틸아민(12.9 g, 127.14 mmol)을 N2하에 실온에서 첨가하였다. 이어서, 보크-무수물(15.3 g, 69.93 mmol)을 0 ℃에서 10분 동안 적가하여 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하였다. 물(200 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 20분간 교반하였다. 유기층이 분리되었고, 수성층은 DCM(100 mL x 2)로 추출하였다. 결합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과한 후 감압 하에 농축하여 미정제 산물을 얻었다. 얻은 미정제 산물을 컬럼 크로마토그래피(Hex/EtOAc 100:0 내지 75:25)로 정제하였다. 고체상태(16　g, 62.15 mmol, 97%)의 터트-부틸 데실카바메이트 Int 13을 얻었다. ESI-MS: MW for C15H31NO2 [M+Na]+ calc. 280.22; found 280.26.
N-메틸데실아민(Int 14)의 합성
건조 THF(100 mL)에 LAH(5.9 g, 155.40 mmol)의 교반 현탁액을 0 ℃, N2 하에 넣고, 건조 THF(50 mL)에 Int 13(10 g, 38.85 mmol) 용액을 30분 동안 적가하여 첨가하였다. 결과 현탁액을 16시간 동안 역류시키고 이어서 0 ℃로 식히고 물(10 mL)을 적가하여 첨부하였다. 이후, NaOH(15%, 10 mL)용액과 물(10 mL)을 적가하여 첨가하였다. 생성된 케이크 용액에, MgSO4를 첨가하고, 혼합물을 30분 동안 실온에서 교반하였다. 침전물을 여과를 통해 제거하고 여과액을 염수(brine)로 세척하고 Na2SO4로 건조시켰다. 유기층을 감압으로 증발시켜서 미정제 Int 14(5.5 g 32.10 mmol, 82.6%)를 확보하였다. ESI-MS: MW for C11H25N [M+H]+ calc. 172.21; found 172.25.
8-브로모-N-데실-N-메틸옥탄아미드(Int 15)의 합성
단계 1: 1-브로모옥타노익산 (3.5 g, 15.69 mmol)을 DCM(50 mL)에 넣은 용액에 DMF (3 방울) 첨가한 후 옥살릴 클로라이드(4 mL, 47.06 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축하여 추가 정제없이 다음 단계에서 사용되는 8-브로모옥타노일 클로라이드를 얻었다.
단계 2: N-메틸데실아민(3 g, 17.25 mmol), 트리에틸아민(13.2 mL, 94.12 mmol) 및 DMAP(cat.)을 DCM(50 mL)에 넣은 용액에 8-브로모옥타노일 클로라이드(~15.69 mmol)를 DCM(20 mL)에 넣은 용액을 첨가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 농축하고 남은 잔류물을 EtOAc 및 염수로 분획하였다. 유기층이 분리되었고, 수성층은 다시 EtOAc로 추출하였다. 결합된 유기층을 Na2SO4로 건조하고, 여과한 후, 농축하였다. 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지 35% EtOAc)를 통한 정제로 옅은-노란 오일(4.8 g, 12.75 mmol, 81%, 2 단계)의 Int 15를 얻었다. ESI-MS: MW for C19H38BrNO [M+H]+ calc. 376.22; found 376.23.
I-79 & I-80 제조에 대한 일반적인 절차
Int 12-1 또는 Int 12-3(1 당량), Int 15(1.2 당량), 및 DIPEA(4 당량)를 ACN (10 mL/ mmol)에 넣은 혼합물을 역류하기 위해 밤새 열을 가하였다. 이어서 반응 혼합물을 감압하에 농축하였고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(Hex/EtOAc 중 1% NEt3 95:5 내지 35:65)로 정제하였다.
N,N-디데실-8-((8-(데실(메틸)아미노)-8-옥소옥틸)(메틸)아미노)옥탄아미드(I-79)의 합성
N,N-디데실-8-((8-(데실(메틸)아미노)-8-옥소옥틸)(메틸)아미노)옥탄아미드(I-79)를 Int 12-1(0.5 g, 1.10 mmol), 및 Int 15(0.5 g, 1.33 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 준비하였다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.38 - 3.14 (m, 6H), 2.92 (d, J = 23.1 Hz, 3H), 2.33 - 2.22 (m, 8H), 2.18 (s, 3H), 1.67 - 1.59 (m, 4H), 1.57 - 1.40 (m, 10H), 1.37 - 1.21 (m, 55H), 0.87 (q, J = 3.8 Hz, 9H). ESI-MS: MW for C48H97N3O2 [M+H]+ calc. 748.77; found 748.68.
N,N-디데실-8-((8-(데실(메틸)아미노)-8-옥소옥틸)(2-히드록시에틸)아미노)옥탄아미드(I-80)의 합성
N,N-디데실-8-((8-(데실(메틸)아미노)-8-옥소옥틸)(2-히드록시에틸)아미노)옥탄아미드(I-80)를 Int12-3 (0.5 g, 1.03 mmol) 및 Int-15 (0.47 g, 1.24 mmol)의 일반적인 절차에 따라서 제조하였다. 산물은 옅은-노란색오일(0.260 g, 0.33 mmol 32.4%)로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.51 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.37 - 3.15 (m, 7H), 2.93 (d, J = 23.4 Hz, 3H), 2.56 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 2.47 - 2.37 (m, 4H), 2.33 - 2.22 (m, 4H), 1.62 (s, 5H), 1.57 - 1.38 (m, 11H), 1.36 - 1.17 (m, 58H), 0.92 - 0.83 (m, 9H). ESI-MS: MW for C49H99N3O3 [M+H]+ calc. 778.78; found 778.85.
실시예 65: 8,8'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디노닐옥탄아미드)(화합물 I-81)
8,8'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디노닐옥탄아미드)(I-81)의 합성
8-브로모-N,N-디노닐옥탄아미드(실시예 5의 일반적인 절차에 따라서 준비된, 0.7 mmol, 330 mg), 5-아미노펜탄-1-올(0.42 mmol, 43 mg), DIEA(1.3 mmol, 0.23 mL) 및 요오드화 칼륨(0.7 mmol, 116 mg)의 혼합물을 ACN(4 mL)에 넣고 75 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지 65% EtOAc)로 정제하여 화합물 I-81 (88 mg, 28%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.63 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.32 - 3.24 (m, 4H), 3.23 - 3.15 (m, 4H), 2.41 - 2.32 (m, 6H), 2.31 - 2.22 (m, 4H), 1.69 - 1.34 (m, 24H), 1.35 - 1.19 (m, 61H), 0.92 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C57H115N3O3 [M+H]+ Calc. 890.9; Found 891.0.
실시예 66: 8,8'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드)(화합물 I-82)
디에틸 2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로네이트의 합성
디에틸 2-플루오로말로네이트(56.1 mmol, 10.0 g), 1,6-디브로모헥산(168 mmol, 26 mL), 및 소듐 메톡시드(61.7 mmol, 3.3 g)의 혼합물을 EtOH(110 m,L)에 넣고 실온에서 24시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 DCM 및 물로 분획하였다. 유기상을 분리하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하였다. 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 0% 내지 25% EtOAc)을 통한 정제로 디에틸 2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로네이트(11.7 g, 61%)을 얻었다.
2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로닉산의 합성
디에틸 2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로네이트(5.9 mmol, 2.0 g) 및 KOH (11.8 mmol, 660 mg)를 MeOH(20 mL), THF(2 mL), 및 물(4 mL)에 넣은 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 0.1M NaOH(20 mL)로 희석하였다. 수상층을 DCM(3 x 10 mL)로 세척하고, 1M HCl로 산성화하고, 이어서 EtOAc(2 x 20 mL)로 추출하였다. 결합된 EtOAc 층을 Na2SO4로 건조하고, 여과하고 농축하여 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되는 2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로닉산(1.57 g, 94%)을 얻었다.
8-브로모-2-플루오로옥탄산의 합성
2-(6-브로모헥실)-2-플루오로말로닉산(4.1 mmol, 1.2 g) 및 DMAP(cat.)의 혼합물을 DMF(3 mL)에 넣고 180 ℃에서 12분동안 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc 및 1M HCl로 분획하였다. 유기층을 분리하여, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고 농축하여 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되는 8-브로모-2-플루오로옥탄산(960 mg, 98%)을 얻었다.
8-브로모-2-플루오로옥타노일 클라이드의 합성
8-브로모-2-플루오로옥탄산(4.0 mmol, 960 mg), 옥살릴 클로라이드(12 mmol, 1.0 mL), 및 DMF(cat.)의 혼합물을 DCM(10 mL)에 넣고 실온에서 20분동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하여 추가 정제 없이 다음 단계에서 사용되는 8-브로모-2-플루오로옥타노일 클로라이드를 얻었다.
8-브로모-N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드의 합성
디데실아민(4.0 mmol, 1.2 g), 트리에틸아민(24 mmol, 3.4 mL), 및 DMAP (cat.)의 혼합물을 DCM(10 mL)에 넣고 미정제 8-브로모-2-플루오로옥타노일 클로라이드(4.0 mmol)를 DCM(5 mL)에 넣은 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 반응물을 농축하고 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지 25% EtOAc)로 정제하여 8-브로모-N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드(1.2 g, 58% 2단계 이상)을 얻었다.
8,8'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드)(I-82)의 합성
8-브로모-N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드(0.56 mmol, 290 mg), 5-아미노펜탄올(0.34 mmol, 35 mg), 및 DIEA(1.0 mmol, 0.18 mL), 요오드화 칼륨 (0.56 mmol, 93 mg)의 혼합물을 ACN(4 mL)에 넣고 75 ℃에서 19시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중5% 내지 100% EtOAc)로 정제하여 화합물 I-82 (158 mg, 57%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.03 (ddd, J = 49.4, 8.5, 4.3 Hz, 2H), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.37 - 3.25 (m, 6H), 3.25 - 3.12 (m, 2H), 2.43 - 2.33 (m, 6H), 1.97 - 1.68 (m, 6H), 1.64 - 1.34 (m, 26H), 1.33 - 1.22 (m, 62H), 0.93 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C61H121F2N3O3 [M+H]+ Calc. 982.9; Found 983.0.
실시예 67: 8,8'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드) (화합물 I-83)
8,8'-(메틸아자네디일)비스(N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드)(I-83)의 합성
8-브로모-N,N-디데실-2-플루오로옥탄아미드(실시예 66의 일반적인 절차에 따라서 제조된, 0.58 mmol, 300 mg), 8M 메틸아민을 EtOH(0.36 mmol, 0.045 mL)에 넣은, 그리고 DIEA(1.1 mmol, 0.19 mL)의 혼합물을 ACN(4 mL)에 넣고 75 ℃에서 48시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축하고 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(헥산 중 5% 내지65% EtOAc)로 정제하여 화합물 I-83 (160 mg, 61%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.14 - 4.93 (m, 2H), 3.40 - 3.24 (m, 6H), 3.24 - 3.10 (m, 2H), 2.33 - 2.25 (m, 4H), 2.19 (s, 3H), 1.99 - 1.71 (m, 4H), 1.62 - 1.17 (m, 80H), 0.92 - 0.84 (m, 12H). ESI-MS: MW for C57H113F2N3O2 [M+H]+ Calc. 910.9; Found 911.0.
실시예 68: 2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실아세트아미드)(화합물 I-84)
디에틸 2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)디아세테이트의 합성
에틸 2-브로모아세테이트(14.2 mmol, 2.38g, 1.57 mL), 5-아미노펜탄-1-올(7.3 mmol, 0.75 g), DIEA(26.0 mmol, 2.5 mL)의 혼합물을 ACN(10 mL)에 넣고 압력 플라스크에서 90 ℃, 1.5 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 물 및 EtOAc로 분획하였다. 진공 상태에서 EtOAc를 제거한 후 얻은, 미정제 산물을 SiO2 컬럼(농도구배; 헥산: Et3N=99:1로부터 EtOAc : Et3N=99:1까지)에서 정제하여 1.6g의 순수한 디에틸 2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)디아세테이트 (수득률: 82%)을 얻었다.
2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)디아세트산의 합성
디에틸2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)디아세테이트(1.6 g, 5.8 mmol)를 10 mL의 EtOH에 용해시키고, 15 mL의 1M KOH 수용액을 첨가하였다. 반응 산물을 실온에서 1시간동안 교반하였다. 그 다음에, 진공상태에서 EtOH를 제거하고 잔류물의 pH를 4로 조정하였다. 진공상태에서 물을 제거한 후 추가 단계 없이 다음 단계에서 사용할 미정제 산물을 얻었다.
2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실아세트아미드)(I-84)의 합성
미정제 2,2'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)디아세트산, Int-PB2(0.26 mmol), THF(20 mL), DMF(2 mL), 디데실아민(0.42 g, 1.4 mmol), DIEA(0.25 mL, 2.6 mmol) 및 HATU(0.34 g, 0.68 mmol)를 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 미정제 산물을 자동 플래시 크로마토그래피(1% Et3N과 함께 헥산 중 5% 내지 75% EtOAc)로 정제하여 I-84 (85 mg, 42%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.62 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.50 (bs, 4H), 3.31 - 3.18 (m, 8H), 2.83 - 2.64 (m, 2H), 1.74 - 1.37 (m, 18H), 1.36 - 1.14 (m, 62H), 0.95 - 0.80 (m, 12H). ESI-MS: MW for C49H99N3O3 [M+H]+ Calc. 778.8; Found 778.8.
실시예 69: 4,4'-((5-히드록시펜틸)아자네디일)비스(N,N-디데실부탄아미드)(화합물 I-85)
화합물 I-85를 실시예 68의 일반적인 절차에 따라서 제조하여 원하는 산물(445 mg, 76%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.67 - 3.60 (m, 2H), 3.33 - 3.24 (m, 4H), 3.24 - 3.14 (m, 4H), 2.52 - 2.25 (m, 10H), 1.86 - 1.69 (m, 4H), 1.69 - 1.35 (m, 10H), 1.35 - 1.18 (m, 60H), 0.93 - 0.83 (m, 12H). ESI-MS: MW for C53H107N3O3 [M+H]+ Calc. 834.8; Found 834.9.
본 출원이 우선권을 주장하는 미국 가출원 제63/290,398호(2021년 12월 16일 출원)는 본 출원의 전체 내용을 참조하여 본 문서에 통합되어 있다.

Claims (61)

  1. 하기 구조식 (I)을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체:

    여기서, L1 은 -NRaC(=O)R1 또는 -C(=O)NRbRc 이고;
    L2 는 -NRdC(=O)R2 또는 -C(=O)NReRf 이며;
    G1 및 G2 는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
    G3 는 C1-C24 알킬렌 또는 C2-C24 알케닐렌이며;
    Ra, Rb, Rd 및 Re 는 각각 독립적으로 H, C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이고;
    Rc 및 Rf 는 각각 독립적으로 C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이며;
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
    R3 는 H, -OH, CN, -N(R4)R5; -C(=O)N(R4)R5; -N(R4)C(=O)R5; -N(R4)C(=O)OR5;-C(=O)OR6, -OC(=O)R6, -OR7, 헤테로아릴 또는 아릴이며;
    R4 및 R5 는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐이거나, R4 및 R5 는, 그들이 결합된 질소 또는 탄소 원자와 함께, 5 내지 7-원의 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    R6 는 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐 또는 아르알킬이며;
    R7 은 C1-C12 히드록실 또는 알콕시로 임의로 치환된 알킬이고; 및
    여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, 아릴 및 아르알킬은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환 또는 비치환된다.
  2. 제1항에 있어서,
    L1 은 -NRaC(=O)R1 또는 -C(=O)NRbRc 이고;
    L2 는 -NRdC(=O)R2 또는 -C(=O)NReRf 이며;
    G1 및 G2 는 각각 독립적으로 C2-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
    G3 는 C1-C24 알킬렌 또는 C2-C24 알케닐렌이며;
    Ra, Rb, Rd 및 Re 는 각각 독립적으로 H, C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이고;
    Rc 및 Rf 는 각각 독립적으로 C1-C16 알킬 또는 C2-C16 알케닐이며;
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고;
    R3 는 H, -OH, CN, -N(R4)R5; -C(=O)N(R4)R5; -N(R4)C(=O)R5; -C(=O)OR6, -OC(=O)R6 또는 아릴이며;
    R4 및 R5 는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C12 알킬이거나, R4 및 R5 는, 그들이 결합된 질소 또는 탄소 원자와 함께, 5-원 내지 7-원 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
    R6 는 H, C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐 또는 아르알킬이며; 및
    여기서, 각각의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, 아릴 및 아르알킬은 달리 명시되지 않는 한 독립적으로 치환 또는 비치환된 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 알킬, 알케닐, 알킬렌, 알케닐렌, C3-C6 시클로알킬 또는 C3-C6 시클로알케닐, 아릴 또는 아르알킬은 하나 이상의 플루오린 및/또는 하나 이상의 옥소 및/또는 하나 이상의 NH2 및/또는 하나 이상의 알킬아미닐로 치환된 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    G3 는 치환되지 않는 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    G3 는 C1-C12 알킬렌인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    G3 는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 또는 C8 알킬렌인 화합물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    G1, G2 및/또는 G3 는 하나 이상의 플루오린 원자로 치환된 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 구조식 (IA)를 갖는 화합물:

    여기서, y 및 z는 각각 독립적으로 2 내지 12의 정수이다.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    L1 은 -C(=O)NRbRc 이고, L2 는 -C(=O)NReRf 이거나,
    L1 은 -NRaC(=O)R1 이고, L2 는 -NRdC(=O)R2 인 화합물.
  10. 제9항에 있어서,
    하기 구조식 (IB) 또는 (IC) 중 하나를 갖는 화합물:
    또는
  11. 제10항에 있어서,
    y 및 z는 각각 독립적으로 4 내지 10의 정수인 화합물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 선형 또는 분지형 C6-C24 알킬인 화합물.
  13. 제12항에 있어서,
    R1 및 R2 는 각각 독립적으로 하기 구조식을 갖는 화합물:

    여기서, R7a 및 R7b 는, 각각의 경우에, 독립적으로 (a) H 또는 C1-C12 알킬이거나, (b) R7a 는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R7b 은 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 인접한 R7b 및 그것이 결합된 탄소 원자와 함께 탄소-탄소 이중 결합을 형성하며; 및
    a는 2 내지 12의 정수이고,
    여기서, R7a, R7b 및 a는 R1 및 R2 가 각각 독립적으로 선형 또는 분지형이고, 독립적으로 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하도록 각각 선택된다.
  14. 제13항에 있어서,
    a는 8 내지 12의 정수인 화합물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    R7a 의 적어도 하나의 경우 H인 화합물.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    R7a 는 각각의 경우 H인 화합물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    R7b 의 적어도 하나의 경우 C1-C8 알킬인 화합물.
  18. 제17항에 있어서,
    C1-C8 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, 터트-부틸, n-헥실 또는 n-옥틸인 화합물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1 또는 R2, 또는 둘 다 독립적으로 하기 구조 중 하나를 갖는 화합물:
  20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Rb, Rc, Re 및 Rf 는 각각 독립적으로 C3-C12 알킬인 화합물.
  21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-헥실인 화합물.
  22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-옥틸인 화합물.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Rb, Rc, Re 및 Rf 는 n-데카닐인 화합물.
  24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ra 및 Rd 는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C2-C12 알케닐이고, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 C6-C18 알킬 또는 C6-C18 알케닐인 화합물.
  25. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ra 및 Rd 는 n-헥실이고, R1 및 R2 는 도데카펜틸인 화합물.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ra 및 Rd 는 n-헥실이고, R1 및 R2 는 (6Z, 9Z)-헵타데카-6,9-디엔인 화합물.
  27. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    Ra 및 Rd 는 n-헥실이고, R1 및 R2 는 7-펜타데칸인 화합물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 H인 화합물.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -OH인 화합물.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -C(=O)OR6인 화합물.
  31. 제30항에 있어서,
    R6 은 C1-C18 분지된 알킬, C1-C12 분지된 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C2 알킬인 화합물.
  32. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -N(R4)R5인 화합물.
  33. 제32항에 있어서,
    R4 및 R5 는 각각 독립적으로 C1-C12 알킬 또는 C1-C6 알킬 또는 C1-C2 알킬이고, 각각 임의로 히드록실로 치환된 화합물.
  34. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -C(=O)N(R4)R5인 화합물.
  35. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -N(R4)C(=O)R5인 화합물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    R4 또는 R5 중 하나는 H이고, R4 또는 R5 중 다른 하나는 C1-C12 알킬이며; 또는 R4 및 R5 둘 다 C1-C12 알킬 또는 C1-C6 알킬인 화합물.
  37. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 아릴인 화합물.
  38. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -N(R4)R5 이고, R4 는 H 이며, R5 는 C3-C6 시클로알케닐인 화합물.
  39. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -OR7 이고, R7은 OH 또는 OCH3로 치환된 C1-C6 알킬인 화합물.
  40. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 -N(R4)C(=O)OR5 이고, 여기서, R4 는 H이며, R5 는 C1-C6 알킬인 화합물.
  41. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 헤테로아릴인 화합물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3 는 하기 구조 중 하나를 갖는 화합물:
  43. 표 1의 화합물로부터 선택된 화합물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 화합물 및 치료제를 포함하는 지질 나노입자.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 화합물 및 치료제를 포함하는 조성물.
  46. 제44항 또는 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    중성 지질, 스테로이드 및 고분자 결합 지질(polymer conjugated lipid)로부터 선택된 하나 이상의 부형제를 더 포함하는 지질 나노입자 또는 조성물.
  47. 제46항에 있어서,
    조성물은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로부터 선택된 하나 이상의 중성 지질을 포함하는 지질 나노입자 또는 조성물.
  48. 제47항에 있어서,
    중성 지질은 DSPC인 지질 나노입자 또는 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    화합물 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1인 지질 나노입자 또는 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    스테로이드는 콜레스테롤인 지질 나노입자 또는 조성물.
  51. 제50항에 있어서,
    화합물 대 콜레스테롤의 몰비는 5:1 내지 1:1 또는 2:1 내지 1:1인 지질 나노입자 또는 조성물.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서,
    고분자 결합 지질은 페길화된 지질인 지질 나노입자 또는 조성물.
  53. 제52항에 있어서,
    화합물 대 페길화된 지질의 몰비는 약 100:1 내지 약 20:1 또는 약 100:1 내지 약 10:1인 지질 나노입자 또는 조성물.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    페길화된 지질은 PEG-DAG, PEG-PE, PEG-S-DAG, PEG-cer 또는 PEG 디알콕시프로필카바메이트인 지질 나노입자 또는 조성물.
  55. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    페길화된 지질은 하기 구조식 (II)를 갖거나, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체 또는 입체이성질체인 지질 나노입자 또는 조성물:

    여기서, R10 및 R11은 각각 독립적으로 10 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 여기서, 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 하나 이상의 에스테르 결합에 의해 임의로 차단되며; 및
    w는 30 내지 60의 평균 값을 갖는다.
  56. 제55항에 있어서,
    R10 및 R11 은 각각 독립적으로 12 내지 16개의 탄소 원자를 포함하는 선형 알킬 사슬인 지질 나노입자 또는 조성물.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서,
    평균 w는 약 49인 지질 나노입자 또는 조성물.
  58. 제46항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료제는 핵산을 포함하는 지질 나노입자 또는 조성물.
  59. 제58항에 있어서,
    핵산은 안티센스 및 메신저 RNA로부터 선택되는 지질 나노입자 또는 조성물.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항의 지질 나노입자 또는 조성물을 제조 또는 제공하는 단계, 및 환자에게 이 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 환자에게 치료제를 투여하는 방법.
  61. 제45항의 지질 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
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