JPS607932A - リポソーム懸濁液およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はリポソームの新規製法に関する。

脂質の閉鎖小胞であるリポソームは元来生体膜モデルと
して広く利用されてきたが、最近ドラッグ・デリバリ−
を指向した種々の応用がなされている。このリポソーム
の種類には大きく分けて多重層リポソーム（ＭＬＶ）、
大きな一枚膜リポソーム（ＬＵＶ）および小さな一枚膜
リポソーム（ＳＵＶ）があり、それぞれ種々のｉ：・；
１製法が既に報告されている〔アニュアル・レビュー・
オブ・バイオフィズイックス・アンド・バイオエンジニ
アリング、９巻、４６７頁（１９８０年）〕。しかしこ
れらはいずれも試験管あるいはナス型コルベン規膜の実
験室レベルでの調製方法にすぎず、即工業的生産に結び
つく製造方法ではない。これらが工業的生産に適さない
理由としてはｌ）どの調製方法も脂質の溶解剤としてク
ロロホルム、ベンゼン、エーテル等の人体に望ましくな
い揮発性有機溶媒を使用するため、保安上および安全作
業上問題となる　２）同じ理由で最終製品中に上記有機
溶媒が残留しゃすい　８）代表的製法であるポルチクス
イング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ　）法〔ジャーナル・オブ
・モルキュラー・バイオロジー、１８巻。

２８８頁（１９６５年）〕ではガラス壁に脂質のきれい
な薄膜を形成することが要求されるが。

これをそのままスケールアップするのは技術的に困難で
ある。などが挙げられる。従って多くの研究者によりリ
ポソームの臨床への応用研究がなされているにもかかわ
らず、いまだかってリポソーム製剤が商品化されえない
一つの大きな要因が工業的生産の困難さにあるといって
も過言ではない。リポソームの工業的製法としては最近
特開昭５７−１８６５１４号や特開昭５７−１７１９１
５号の方法などが開示されてはいるが、前者は界面活性
剤法〔パイオキミカ・エト・バイオフイズイ力・アクタ
、Ｓ２Ｓ巻。

５４７頁（＋９７ａ年）〕を、後者はエタノール注入法
〔バイオキミカ・エト・バイオフィズイ力・アクタ、２
９８巻、１０１５頁（１９７８年）〕あるいはエーテル
注入法〔バイオキミカ・エト・バイオフィズイ力・アク
タ、４４．３巻。

６２９頁（１９７６年）〕を改良したものである。そし
て、前者は脂質溶解剤として用いたエタノールを減圧除
去せねばならない、又脂質可溶化剤として用いた界面活
性剤を透析またはゲル濾過により分離除去せねばならな
い等の欠点を、後者は脂質溶解剤として用いたエタノー
ル。

ヘキサンなどの有機溶媒を最終的に加温等により除去せ
ねばならない。又有機溶媒の水性溶液中への注入速度に
細心の注意が必要である等の欠点をそれぞれ持っており
、必ずしもリポソームの工業的生産方法として満足でき
るものでない。

本発明者らはこれらの状況に艦み、リポソームの工業的
生産方法について鋭意検討した結果。

リポソームを構成する膜成分物質を水溶性でしかも生体
にとって無害である非揮発性有機溶媒に溶解又は膨潤せ
しめ、これと水性溶液とを混合し攪拌するとき、均一な
リポソームを再現性良く容易に製することができること
を見出し。

本発明を完成した。本発明は、水溶性でしかも生体にと
って無害でありそのまま最終製品に残留しても投与可能
な有機溶媒を膜成分物質の溶解剤として用いるところに
特徴を有し、この原理自体全く新規なものである。しか
も本発明によれば、リポソームを大量に製する上で設備
上および操作技術上何らの工夫も必要としない。

従って先に挙げたリポソーム製剤の工業的生産を困難に
ならしめている要因、即ち有毒性有機溶媒使用に際して
の保安上および安全作業上の問題、上記有毒性有機溶媒
の他、界面活性剤などの最終製品中への残留性およびス
ケールアップに伴う設備上および操作技術上の困難さ、
は本発明によって克服されたといえる。

本発明において使用される膜成分物質は１例えばボスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リ
ゾホスフ了チジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レ
シチン。

大豆レシチン等に代表されるリン脂質の他、糖脂質、ジ
アルキル型合成界面活性剤等の一種又は二種以上の混合
物が主体となる。なお、これに膜安定化剤としてコレス
テロール、コレスタノール等のステロール類を、荷電物
質としてジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ガ
ングリオシド、ステアリルアミン等を、更に酸化防止剤
としてα−トコフェロール等を加えて膜成分物質を形成
させてもよい。これらリポソームの膜成分物質の比率は
何ら限定されるべきものではないが、好ましくは脂質１
重量部に対しステロール類を０〜２重量部程度、荷電物
質を０．１重量部程度加えるのが適している。

又９本発明で使用される水溶性の非揮発性有機溶媒とし
てはグリセリン、ポリグリセリン。

プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エ
チレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチ
レングリコール、ジエチレングリコールモノエチルエー
テル、１．８−ブチレングリコール、マルチトール等の
多価アルコール類、モノアセチン、ジアセチン、グリセ
ロリン酸等のグリセリンエステル類、ベンジルアルコー
ル等の単独又は混合物が挙げられる。これ等有機溶媒の
使用量は膜成分物質に対し約１〜１００重量倍、水性溶
液に対しては約０．００１〜２重量倍程度となるよう使
用するのが好ましい。

なお、膜成分物質を溶解又は膨潤せしめた有機溶媒を混
合する水性溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、糖
液の水溶液およびこれ等の混合液等が好ましく使用され
φ。ここでいう溶解又は膨潤とは膜成分物質が有機溶媒
により分子レベルで自由混合あるいは溶媒和された状態
をいい、外観上は何ら限定されない。すなわち澄明な液
体状あるいはペース゛ト状であれ、不透明なペースト状
あるいは固体状であれ、これらの混合状態であれ、膜成
分物質が分子レベルで自由混合あるいは溶媒和された状
態ならば外観は全く問題としない（以下単に混合という
）。

一般に膜安定化剤であるステロール類以外ノ膜成分物質
は比較的容易に本発明の水溶性有機溶媒に混合しうるが
、加温等の手段を用いれば更に効率が良い。

即ち、ステロール類以外の膜成分物質は、有機溶媒と７
０〜９０°Ｃくらいまで加温し攪拌することにより、容
易に混合せしめることが可能である。膜成分物質の膜成
分としてステロール類を用いる場合には、まずステロー
ル類の融点まで有機溶媒を加温して一度スチロール類を
混合せしめ９次に７０〜９０℃の温度範囲にて。

他のＩＥ４ｔ２．分物質を混合せしめることが好ましい
。

もちろんステロール類を混合せしめた温度にて他の膜成
分物質を混合せしめることは可能であるが、不必要な高
温に膜成分物質をさらすことにより膜成分物質自体の分
解が生ずる恐れがあるので、より低温で混合せしめた方
が望ましいことは言うまでもない。また膜成分物質を個
々に上記方法により混合せしめ、その後に混合しても良
い。

かくして製されるリポソームに薬剤を保持させるには、
膜成分物質を有機溶媒に混合せしめたものと、薬剤を含
有する水性溶液とを混合し攪拌すればよい。この両者の
混合においては混５昆 合する順序は任意であるが、この場合、攪拌の操作にお
いては次の点に留意した方がよい。即ち ａ　一般には脂質の相転移温度（Ｔｃ　）以上で行った
方が効率は良い。従って膜成分物質を有機溶媒に混合せ
しめたものと、薬剤を含有する水性溶媒は両者共にあら
かじめ脂質の相転移温度以上にしておくことが好ましい
。

ｂ　膜成分物質を有機溶媒に混合せしめたものが澄明な
液体状あるいはペースト状を呈している場合には、でき
るリポソームは比較的粒径の小さなものとなりやすい。

Ｃ膜成分物質を有機溶媒に混合ぜしめたものが不透明な
ペースト状あるいは固体状を呈している場合には、でき
るリポソームは比較的粒径の大きなものとなりやすい。

ｄｉＪＱ拌における攪拌機の選択により、できるリポソ
ームの粒径は影響を受ける。即ちプロペラミキサーの如
く比較的緩和な攪拌機を用いた場合には大きな粒径のリ
ポソームができやすいし、ホモミキサーの如く比較的せ
ん断力の強い攪拌機を用いた場合には小さな粒径のリポ
ソームができやすい。また更に小さな粒径のリポソーム
を製するには超音波乳化機。

高圧乳化機等を用いるのも良いし、径を均一にするため
限外濾過膜法１例えばポリカーボネート製メンプラン・
フィルターによって粒径分布をコントロールすることも
可能である。

ｅ　同−処方内で薬剤のリポソームへの保持率を高める
には保持させる薬剤をできるだけ少量の水性溶媒に溶か
しこみ、これを有機溶媒に膜成分物質を溶解又は膨潤せ
しめたものと混合し、残りの水性溶媒は希釈に用いた方
がよい。

本発明のリポソーム製剤に保持させる薬剤としては特に
制限はないが、サイトシンアラビノシド、メトトレキセ
ートに代表される制癌剤。

ペニシリンＧに代表される抗生物質、インシュリン、イ
ンターフェロン、グルコアミラーゼに代表されるたんば
く質、デキストランに代表されル多糖類、：ＤＮＡ、几
ＮＡの如き核酸類、ビタミンＡに代表されるビタミン類
などの他サリチル酸ナトリウムのような一般共剤が用い
られる。これ等薬剤は前述した如く一般には水性溶媒に
溶解して用いるが、クロロフィル、グラミシジンＳｌビ
タミンＡ等に代表される膜親和性薬剤は膜成分物質と一
緒に濃グリセリン、プロピレングリコール等の水溶性有
機溶媒に混合せしめた方が効率は良い。また水に可溶性
の薬剤であっても酢酸クロルヘキシジン、アセトアミノ
フェンの如く濃グリセリン、プロピレングリコール等の
水溶性有機溶媒に混合する薬剤の場合には、やはり膜成
分物質と一緒に水溶性有機溶媒に混合せしめて用いた方
が効率は良い。

このようにして薬剤を保持した均一粒径のリポソーム製
剤が再現性良くしかも大量に得られるが、このリポソー
ム製剤はこのまま使用しても良く、また透析、ゲル濾過
、遠心分離等の手段によりリポソームに保持されなかっ
た薬剤を分離除去して使用しても良い。

既知のリポソーム調製法に比して本発明法が優れている
点としては先述した他下記の点が挙げられる。

○　本発明の有機溶媒はそのまま等張化剤として用いる
ことができる。

○　本発明の有機溶媒は粘稠剤あるいは分散剤としての
働きもあるため、リポソームの凝集あるいは沈降を防止
することができ、リポソーム製剤の安定性向上にも役立
つ。

○　本発明の有機溶媒の製剤への添加により。

リポソーム製剤の凍結・融解等に対する安定性も向上す
る。

次に実施例により本発明を例示するが、これらの実施例
は何ら本発明を限定するものではない。

実施例１ 濃グリセリン９．４ｇを９４°Ｃに加温し、これに完全
水添精製卵黄レシチン（■Ｖ−１．ソー１，９９％以上
、　Ｔｅ　−４５〜Ｇ　ＯｏＣ、’Ｉｈ＋ａｘ−５２°
Ｃ）２．２９及びジセチルホスフェー）１６４”９を加
え攪拌し均一に膨潤せしめた。次に６０°Ｃ水浴上更に
攪拌を続けたところ試料は白色の均一なペースト状にな
った。上記ペーストにあらかじめ６０°Ｃに保温してお
いた０、９％サリチル酸ナトリウム水溶液８００ｔｎｔ
を加え、そのまま６０°Ｃで８分間放置してペーストを
膨潤させた。最後にこの液を６０℃に保ったままホモミ
キサーにより８分間攪拌し室温に戻した。ところ、サリ
チル酸ナトリウムを保持した乳白色のリポソーム懸濁液
が得られた。

このリポソーム懸濁液８−をＵＯＯセロファンチューブ
透析バッグに入れ、１１の生理食塩水に対し透析（５℃
ｔ　ｌｌＸ１時間×６回）してリポソームに保持されな
かったサリチル酸ナトリウムを分離除去した。次いでリ
ポソーム内に保持されたサリチル酸ナトリウムを常法に
従って油／水分配により水層中に抽出し定量したところ
保持率は１０００％であった。

またこのリポソーム懸濁液を光学顕微鏡（日本光学、広
視野顕微鏡）により観察したところ。

粒径１１ｔｍ　前後の均一な球状を呈していた。

実施例２ プロピレングリコール７゜２ｇを水浴上にて９２℃に加
温した。ここに部分水添精製卵黄レシチン（ＩＶ−２０
，リン脂質９９％以上。

Ｔｃ−５〜５０°Ｃ，Ｔｍａｘ−８５°Ｃ）８．９ｇ及
びステアリルアミン８２０１ｎ９を加え澄明に溶解せし
めた。このものを６０°Ｃに放置しても試料は無色澄明
のままであった。この無色澄明液にあらかじめ５５°Ｃ
に保温しておいた１％デキストランＴ４０水溶液８００
−を加え、そのまま５０〜５５°Ｃでプロペラミキサー
により３分間攪拌し室温に戻したところ、デキストラン
’Ｉ’４０を保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得ら
れた。

このリポソーム懸濁液１−をとり、セファローズ０Ｌ−
４Ｂを用いてゲル濾過（２，２ｃｍφ×４２ｃｍ、生理
食塩水、５℃）シ、リポソームに保持されなかったデキ
ストランＴ４０を分離除去した。次いでリポソーム画分
のデキストランＴ４０を常法に従って油／水分配により
水層中に抽出し定量したところ保持率は１４．８％であ
った。

またゲル濾過して得たリポソーム画分を広視野光学顕微
鏡により観察したところ２粒径が０．５〜１μｍの均一
な球状を呈していた。

実施例８ 実施例２と同一の処方で行ったが、デキストランＴ４０
は高濃度水溶液で嬌加し膜成分物質と練合の抜水を加え
て攪拌した。即ち、実施例２と同様にまずプロピレング
リコール７．２９゜部分水添精製卵黄レシチン８．９ｇ
及びステアリルアミン８２０ｍ９の無色澄明液を製した
。別に３りのデキストランＴ４０を４ｏｆｎｔの水に溶
解させた液を作り、６０℃にて上記無色澄明液に添加し
、攪拌俸でよく攪拌したところ白色の粘稠液が得られた
。次いでこの粘稠液にあらがじめ５５°Ｃに保温してお
いた水２６０−を加え。

プロペラミキサーにより８分間攪拌し室温に戻したとこ
ろ、デキストランＴ４０を保持した乳白色のリポソーム
懸濁液が得られた。

この液１−をとり実施例２と同様にゲル濾過を行なって
保持率をめたところ１９．２％であった。

実施例４ 実施例２及び実施例８と同一の処方で行ったが、デキス
トランＴ４０は更に高濃度水溶液で添加した。即ち、３
りのデキストランＴ４０を６−の水に溶解し、これを６
０’Ｃにて膜成分物質の無色澄明液に添加、練合したと
ころ白色のペーストが得られた。次いでこのペーストに
あラカシめ５５℃に保温しておいた水２９４−を加え、
プロペラミキサーにより８分間攪拌し室温に戻したとこ
ろ、実施例８と同様の乳白色リポソーム懸濁液が得られ
た。

この液ｌ−をとり実施例２と同様にゲル濾過を行って保
持率をめたところ８３．５％であった。

実施例５ プロピレングリコール８．６りを１６０’Ｃに加温した
。次にコレステロール２．３９を加えテ溶融せしめた後
そのままポルテックスミキサーによって振盪してコレス
テロールをプロピレングリコール中に溶解せしめた。更
にこのものを６０°Ｃ上放置し、内容物を膨潤固化させ
た。別の容器にプロピレングリコール３．６９をとり水
浴にて９０°Ｃに加温、これに完全水添精製卵黄レシチ
ン４．４７及びジセチルホスフェートａａｏｍ９を加え
た後ポルチック１スミキサ−による振盪を行って溶解せ
しめ、６０″Ｃに放置した。

両者を混合し、これにあらかじめ６５°Ｃに保温してお
いた０、５％安息香酸ナトリウム水溶液８００ｍ１をす
ばやく加え、６０〜６５℃においてホモミキサーにより
８分間攪拌後室温に戻した。かくして安息香酸ナトリウ
ムを保持した乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

この液につき実施例１と同様、透析法によって安息香酸
ナトリウムのリポソーム内への保持率をめたところ１１
．４％であった。

また実施例２と同様に、このリポソーム砦濁液を広視野
光学顕微鏡により観察したところ。

粒径１〜数μｍの均一な球状を呈していた。なおこの大
きな球状のものは玉ねぎ状の構造を呈していた。

実施例６ プロピレングリコール７．２ｇを１６０°Ｃに加温した
。ここにまずコレステロール９７０ｍ９を加えて澄明に
溶解せしめ１次いで部分水添精製卵黄レシチン４．４ｇ
及びジセチルホス７エート８８０ｒｎ９を加え攪拌し澄
明に溶解せしめた。次にこれを９２°Ｃ水浴に浸し、膜
成分物質をプロピレングリコールに澄明に溶解させたま
まあらかじめ５５°Ｃに保温しておいた０、５％安息香
酸ナトリウム水溶液ａｏｏｍｔをすばやく加え。

５０〜５５℃にてホモミキサーにより８分間攪拌後室温
に戻した。かくして安息香酸す）　ＩＪウムを保持した
乳白色のリポソーム懸濁液が得られた。

この液０．５ｆｎｌをとり、セファデックスＧ−５０を
用いてゲル濾過（］、ｃｍφＸ１８ｃｍ、生理食塩水、
５°Ｃ）生理食塩水−５°Ｃ持されなかった安息香酸ナ
トリウムを分離除去した。次いでリポソーム画分の安息
香酸ナトリウムを常法に従い定量したところ、保持率は
３．９％であった。

またこのリポソーム画分を広視野光学顕微鏡により観察
したところ２粒径が０．５μｍ以下の均一なリポソーム
がみられた。

実施例７ 実施例６のコレステロールを２．３９にして同様に調製
したところ、保持率は５．９％であった。

またゲル濾過して得たリポソーム画分の広視野光学顕微
鏡観察の結果９粒径はやはり０．５μｍ以下であった。

実施例８ 濃グリセリン９．４９を１６０°Ｃに加湿した０ここに
まずコレステロール１．４７りを入れて溶融せしめ、攪
拌し充分膨潤せしめた。次に完全水添精製卵黄レシチン
６．７り及びジセチルホスフェー）４９０１ｎ９を加え
よく綜合した。１６０°Ｃにおいては無色半透明のペー
ストであった試料は、６０°Ｃにすることにより白色不
透明のペーストに変化した。このペーストにあらかじめ
６５℃に保温しておいた０、５％サリチル酸ナトリウム
水溶液８００−を加え６０〜６５℃でホモミキサーによ
り３分間攪拌後室温に戻した。

かくしてサリチル酸ナトリウムを保持した乳白色のリポ
ソーム懸濁液が得られた。

この液０．５　ｔｎｔをとり実施例６と同様にゲル濾過
（室温）を行ったところサリチル酸ナトリウムのリポソ
ーム内への保持率は１７．０％であった。

広視野光学顕微鏡観察の結果では、得られたリポソーム
の平均粒径は約１μｍ程度で比較的大きなものも散見さ
れた。この大きなものは玉ねぎ状の措造を呈していた。

実施例９ 実施例１と同様にして完全水添精製卵黄レシチンの代わ
りにＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（純
度９８％、Ｔｃ＝４１℃）を用い、攪拌温度４０〜４５
°Ｃで行ったところ。

サリチル酸ナトリウムを保持した乳白色のリポソーム懸
濁液が得られた。

この液につき実施例１と同様、透析法によってサリチル
酸ナトリウムのリポソーム内への保持率をめたところ、
１８．３％であった。

またこの液を広視腎光学顕微鏡により観察したところ１
粒径ｌ−数μｍの均一な球状を呈していた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. リポソーム膜成分物質を水溶性の非揮発性有機溶媒と混
   合し１次いでこのものを水性溶液に分散せしめることを
   特徴とするリポソームの製法。