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JP2958076B2 - 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 - Google Patents

遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法

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JP2958076B2
JP2958076B2 JP2222553A JP22255390A JP2958076B2 JP 2958076 B2 JP2958076 B2 JP 2958076B2 JP 2222553 A JP2222553 A JP 2222553A JP 22255390 A JP22255390 A JP 22255390A JP 2958076 B2 JP2958076 B2 JP 2958076B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕
捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法に係る。
（従来の技術） リポソーム（liposome）は脂質の二分子膜構造からな
る閉鎖型の小胞体であり、その寸法や膜層構造の違いに
より多重膜リポソーム（MLV）、小さな一枚膜リポソー
ム（SUV）、大きな一枚膜リポソーム（LUV）の３種類に
大別することができる。
これらリポソームの内水層や膜内には低分子のものか
ら核酸や蛋白質等の高分子のものまで捕捉することがで
きる。従って、その性質を利用し動植物細胞に遺伝子を
導入するキャリアーとしてリポソームを利用する技術
が、例えば下記の諸文献に示されるように開発されてき
た。
１）P.F.Lurquin「Nucleic Acids Res.」第６巻、第377
3頁（1979年）； ２）R.Franco等「Dev.Plant Biol.」第５巻、第237頁
（1980年）； ３）P.F.Lurquin等「FEBS Lett.」第125巻、第183頁（1
981年）； ４）特開昭57−43688号公報； ５）P.L.Felgner等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第84
巻、第7413頁（1987年）； ６）P.Pinnaduwage等「Biochim.Biophys.Acta」第985
巻、第33頁（1989年）； ７）R.Fraley等「J.Biol.Chem.」第255巻、第10431頁
（1980年）； ８）特開昭55−118415号公報； ９）M.S.Ridder等「Science」第215巻、第166頁（1982
年）； 10）C.Nicolau等「Proc.Natl.Acad.Sci.USA」第80巻、
第1068頁（1983年）； 11）W.B.Rizzo等「J.Gen.Virol.」第64巻、第911頁（19
83年）； 12）特開昭59−213392号公報； 13）T.Itani等「Gene」第56巻、第267頁（1987年）； 14）N.Ballas等「Biochim.Biophys.Acta」第939巻、第
８頁（1988年）； 15）J.Szelei等「Biochem.J.」第259巻、第549頁（1989
年）； 16）特開昭64−47381号公報；及び 17）特開平２−135092号公報。
しかしながら、調製方法が最も簡単なMLVを用いた場
合、遺伝子導入操作の段階でDNAにニック等の損傷を与
え（P.F.Lurquin,前記の文献１）、又高分子化合物の封
入乃至捕捉率が低いためにDNAの導入には適当でないこ
とが報告されている［R.M.Straubinger等「Methods in
Enzymol.」第102巻、第512頁（1983年）］。SUVの場合
においても、同様に、リポソーム調製時における超音波
処理が核酸等に損傷を与え、更にリポソームの内容積が
小さいことからも遺伝子等核酸の捕捉封入には適してい
ない。一方、LUVは前二者と異なり内容積も大きく、調
製段階でDNAに対して激しいダメージを与えないので核
酸等の封入には適していると考えられるが、LUVの調製
方法である逆相蒸発法、エーテル注入法及びCa2+融合法
等が何れも操作において極めて煩雑であるために、工業
的な大量生産を目的とした調製法として適当とは云えな
いのが実状である。
尚、遺伝子の捕捉乃至導入効率については、リポソー
ム膜の電荷が中性又は負電荷を帯びた状態では負電荷を
有する核酸等の捕捉効率が低く、且つ細胞への遺伝子導
入による形質転換細胞の発現率も高いものでないのが実
状であった。そこで、リポソーム膜に正電荷を示す脂質
を加えたり、界面活性剤等を加えることにより静電気的
な結合にて核酸を捕捉し、遺伝子の導入効率を高める方
法が開発された。例えば、１級アミンであるステアリル
アミンをリポソーム膜に加えることで核酸の高い捕捉効
率及びデオキシリボヌクレアーゼに対する高い抵抗性を
達成し、大腸菌やプロトプラストに遺伝子を導入できる
ことが報告されている（R.Franco等による前記の文献２
及びP.F.Lurquinによる前記の文献３）。更に、１級ア
ミンよりも塩基性が高い４級アミンを用いた場合にも、
上記と同様に高い核酸の捕捉効率を示し、従来より汎用
されてきた燐酸カルシウム法よりも非常に高い細胞への
導入効率を示すことが報告されている（P.L.Felgner等
による前記の文献５、P.Pinnaduwage等による前記の文
献６、及びN.Ballas等による前記の文献14）。
尚、本発明者等も特開平２−135092号公報（前記の文
献17）において、遺伝子導入効率が正電荷を示す脂質の
塩基性と相関することを明らかにし、且つ２級アミンや
３級アミンよりも４級アミンを有する脂質をリポソーム
膜に加えた方が細胞への遺伝子導入には効果的であるこ
とを実証している。
（発明が解決しようとする課題及び発明の目的） 上記の点を考慮に入れると、リポソームの遺伝子捕捉
効率を向上させるには、リポソームの構成脂質の一つと
して１級アミンを有する脂質を用いたのでは充分ではな
く、４級アミンを有する脂質を用いるのが好ましい。
しかしながら、４級アミンを有する脂質をリポソーム
の構成脂質として採用すると、遺伝子を導入すべき細胞
に当該脂質が毒性を示し、高い殺細胞作用を呈すること
が遺伝子導入の障害となっていた。
従って、本発明が解決しようとする課題は、このよう
な障害を排除することにある。
本発明の具体的な第１目的は、リポソームの調製が簡
便であり、従ってその大量調製が可能であり、リポソー
ムの遺伝子捕捉効率が高く、従って遺伝子の発現性が良
好であり、更に細胞に対する毒性の低い遺伝子導入用リ
ポソームを提供することにある。
本発明の具体的な第２目的は、上記のような且つ高い
効率を以って遺伝子が捕捉されているリポソーム製剤を
提供することにある。
本発明の具体的な第３目的は、上記のようなリポソー
ム製剤を製造する方法を提供することにある。
（課題を解決し、目的を達成するための手段及び作用） 本発明によれば、上記の課題はリポソームの構成脂質
がＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデ
シル−Ｄ−グルタメートクロライド（TMAG）、ジラウロ
イルホスファチジルコリン（DLPC）及びジオレオイルホ
スファチジルエタノールアミン（DOPE）であり、その構
成モル比が1:2:2であることを特徴とする、遺伝子導入
用多重膜リポソームにより解決されると共に、上記の第
１目的が達成される。
上記の第２目的は、上記の多重膜リポソームにより遺
伝子が捕捉されているリポソーム製剤により達成され
る。
上記の第３目的は、遺伝子捕捉多重膜リポソームの調
製をボルテックス処理により行うことにより達成され
る。
本発明による多重膜リポソームを調製する際に用いら
れるTMAGは既述の特開平２−135092号公報に記載されて
いる４級アミンである。本発明による多重膜リポソーム
は、その寸法や脂質膜を構成する層の数に格別の制限は
ない。本発明による多重膜リポソーム製剤の製法におい
てボルテックス処理が上記のように推奨されるのは下記
の理由によるものである。即ち、核酸や蛋白質等を捕捉
し得るMLVの調製には凍結乾燥法や凍結融解法［T.Ohsaw
a等「Chem.Pharm.Bull.」第32巻、第2442頁（1984
年）、L.D.Mayer等「Biochim.Biophys.Acta」第817巻、
第193頁（1985年）、S.F.Alino等「Biochem.Soc.Tran
s.」第17巻、第1000頁（1989年）］等多々提案されてい
る。そこで、脂質組成を既述のように設定し、凍結乾燥
法及び凍結融解法によりDNAを捕捉したMLV、又ボルテッ
クス処理により調製されたMLVを用いて、それぞれ遺伝
子捕捉効率、デオキシリボヌクレアーゼに対する抵抗性
及び細胞への遺伝子導入効率を比較した結果、何れのリ
ポソームとも同程度の遺伝子捕捉効率及びデオキシリボ
ヌクレアーゼに対する抵抗性を示したが、細胞への遺伝
子導入効率はボルテックス処理により調製されたMLVの
方が凍結乾燥法及び凍結融解法で調製されたMLVよりも
遙遙かに高いことが判明したからである。
従来提案されてきた４級アミンを有する脂質を含有す
るリポソームにおける最大の問題点は遺伝子導入の対象
となる細胞に対して毒性を示すことであった。
そこで、COS−１細胞を含有する培地中に本発明によ
る多重膜リポソームを添加し、上記の細胞と72時間接触
せしめて細胞に対する毒性試験を行った。その結果、驚
くべきことに本発明によるMLVは脂質組成及び脂質濃度
が同一であるLUVと比較して1.7倍以上毒性を抑制した。
尚、４級アミンを有する脂質を含有する遺伝子導入用
SUV（P.L.Felgner等が開発したもの、既述の文献５）は
既に「リポフェクチン」（標章）として市販されてお
り、容易に入手することができる。そこで、上記と同様
に細胞に対する毒性試験を行ったところ、リポフェクチ
ンは同脂質濃度の本発明によるMLVと比較した場合に1.8
−3.5倍の高い細胞毒性を示した。
細胞への遺伝子導入を効率よく行うためには、本発明
によるMLVと細胞とを充分に接触せしめる必要がある。
しかしながら、このための至適接触時間は遺伝子が導入
されるべき細胞の種類に依存して異なるので、遺伝子導
入に先立ち予備実験を行って細胞毒性を示さない時間を
予め設定しておくことが望ましい。
上記の点を要約するに、本発明によるリポソーム製
剤、即ち叙上のようにリポソームの構成脂質がTMAG、DL
PC及びDOPEであり、その構成モル比が1:2:2であり、遺
伝子を捕捉しており且つボルテックス処理により調製さ
れた多重膜リポソーム製剤を用いて細胞への遺伝子導入
を行えば、従来から汎用されてきた燐酸カルシウム法よ
りも非常に高い導入効率で遺伝子を目的とする細胞内に
取り込ませることができ、且つ従来提案されてきた４級
アミンを有する脂質を含有するリポソームによる遺伝子
導入法よりも細胞に対する毒性を著しく抑制することが
できるのである。
（実施例等） 次に、実施例、参考例、試験例等により本発明を更に
詳細に且つ具体的に説明する。
尚、以下の実施例等において用いられた原料、試験法
等は下記の通りである。
ａ）Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジド
デシル−Ｄ−グルタメートクロライド（TMAG）： 相互薬工株式会社から市販のもの。
ｂ）ジラウロイルホスファチジルコリン（DLPC）及びジ
オレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）： シグマケミカル社から市販のもの。
ｃ）pCH110プラスミド及びpMSG CATプラスミド： ファルマシア社から市販のもの。
ｄ）COS−１細胞（ATCC No.CRL−1650）、CV−１細胞
（CCL−70）及びNIH/3T3細胞（ATCC No.CRL−1658）： 大日本製薬株式会社から市販のもの。
ｅ）リポフェクチン： ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ ライフ テク
ノロジー社から市販のもの。
ｆ）キャットアッセイキット及び燐酸カルシウムトラン
スフェクションキット： ５プライム→３プライム社から市販のもの。
ｇ）β−ガラクトシダーゼ活性の測定方法： 文献“Experiments in Molecular Genetics"第352
頁、Cold Spring Harbor N.Y.（1972年）に記載の方法
に従って定量。
ｈ）細胞抽出液中の蛋白の定量： 文献“Methods in Enzymol."第72巻、第296頁（1981
年）に記載の方法に従って定量。
実施例１ 構成脂質がTMAG、DLPC及びDOPEであり、その構成モル
比が1:2:2であって、DNAを捕捉しているリポソーム製剤
を下記のようにして調製した。
TMAG 0.2μmolと、DLPC 0.4μmolと、DOPE 0.4μmol
とをクロロホルムに溶解させ、内壁をシリル化した円錐
形試験官に入れ、ロータリーエバポレータを用い溶媒を
除去することにより試験管内壁に脂質薄膜（全脂質量:1
μmol）を形成させ、真空乾燥させた。これに300μｌの
燐酸緩衝生理食塩水（PBS,pH7.4）に溶かした20μｇの
ファージλDNAを添加し、ボルテックスミキサにより２
分間攪拌処理することによりDNA捕捉多重膜リポソーム
（MLV）を得た。リポソームに捕捉されなかったDNAにつ
いてはフィコールパクの密度勾配遠心分離法にて除去し
た。尚、得られた所望のMLV中のDNAをアガロースゲル電
気泳動により分析した処、DNAに損傷は認められなかっ
た。
比較例１ 凍結乾燥法及び凍結融解法を利用してファージλDNA
を捕捉したMLVを下記のようにして調製した。
凍結乾燥法によるMLVは文献“Chem.Pharm.Bull."第32
巻、第2442頁（1984年）に記載の方法に従って、又凍結
融解法によるMLVは文献“Chem.Pharm.Bull."第33巻、第
2916頁（1985年）に記載の方法に従ってファージλDNA
捕捉リポソームをそれぞれ実施例１に示した脂質濃度、
脂質組成及びDNA濃度にて調製した。
試験例１ 実施例１によるリポソームの調製及び比較例１による
リポソームの調製に際して、用いたDNA量に対してリポ
ソームに捕捉されたDNA量の割合を調べて捕捉率とし
た。
更に、実施例１及び比較例１において得られたリポソ
ームに捕捉されたDNAについて文献“Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA"第80巻、第1068頁（1983年）に記載の方法に従っ
て、デオキシリボヌクレアーゼに対する抵抗性を調べ
た。即ち、得られたリポソームを一定量採取し、50mMの
塩化マグネシウム存在下、37℃にて１時間デオキシリボ
ヌクレアーゼにより処理し、その後1.5Mの塩化ナトリウ
ム及び30mM EDTAの混液を添加し、次いでクロロホルム
−メタノール（2:1,v/v）の混液により脂質を除去した
後、DNAを回収し、文献“Anal.Biochem."第92巻、第497
頁（1979年）に記載の方法に従ってDNAの定量を行い、
各リポソームのデオキシリボヌクレアーゼによる分解率
を求めた。
得られたリポソームにおけるDNAの捕捉率及びデオキ
シリボヌクレアーゼによる分解率は下記の表１に示され
る通りであり、同程度であることが判明した。
参考例１及び参考試験例１ （凍結乾燥法によるMLVを用いた、細胞への遺伝子導
入） リポソームの構成脂質がTMAG:DLPC:DOPE＝1:2:2（モ
ル比）の脂質１μmolを用い、大腸菌のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を組み込んだpCH110プラスミド（20μｇ）
を捕捉したMLVを、比較例１に示した凍結乾燥法に従っ
て調製した。
又、このMLVと膜層構造において異なるリポソームと
してのLUVを特開平２−135092号公報に記載の逆相蒸発
法により且つ上記と同様の条件で調製した。
10％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地
（2ml）を添加した35φmmの培養皿に約１×105個のCOS
−１細胞を加え、細胞培養を行った。約16時間後に新鮮
培地と交換し、７時間後に0.5μｇのpCH110プラスミド
を含有していて凍結乾燥法によるMLVを培地に添加し、
更に16時間後に培地の交換を行った。プラスミドDNAを
捕捉したMLVの添加から72時間後に培養皿より培地を除
去し、2mlのPBSにより細胞を洗浄した。その後に1mlのP
BSを培養皿に加え、ラバーポリスマンにより細胞を剥し
てサンプルチューブに集め、14000rpmにて２分間遠心処
理した後、上清を除去し細胞を集めた。次いで、得られ
た細胞に0.2乃至0.3mlのPBSを加えて細胞を懸濁させた
後、−76℃と37℃で凍結−融解操作を３回繰り返し、14
000rpmで５分間遠心処理し回収された上清を細胞抽出液
とした。この細胞抽出液中のβ−ガラクトシダーゼの酵
素活性を測定した。
尚、プラスミドを捕捉したLUVを上記のMLVの代わりに
用いた場合の試験も上記と同一条件で行った。
一方、対照としてグリセロール処理を含む燐酸カルシ
ウム法を用いた遺伝子導入試験を行った。
結果は下記の表２に示される通りであり、凍結乾燥法
により調製したMLVを用いる場合に発現したβ−ガラク
トシダーゼの酵素活性は逆相蒸発法により調製したLUV
を用いた場合の約1/6であり、対照とした燐酸カルシウ
ム法の場合の約1/3の発現量を示したに過ぎなかった。
このように脂質組成を同一に設定しても凍結乾燥法に
より調製したMLVの場合には、逆相蒸発法により調製し
たLUVや燐酸カルシウム法の場合よりも細胞への遺伝子
導入効率は低いのである。
実施例２及び試験例２（遺伝子導入） 実施例１に記載の方法に従って、脂質１μmol（TMAG:
DLPC:DOPE＝1:2:2）を用い、20μｇのpCH110プラスミド
を捕捉したMLVをボルテックス処理により調製した。
一方、対照リポソームとして参考例１と同様に、脂質
組成が上記と同一の、但しリポソームの調製を逆相蒸発
法により行って遺伝子捕捉LUVを調製した。又対照導入
法として燐酸カルシウム法を採用した。
上記の各MLV及びLUVを用いて、細胞への遺伝子導入を
行った。導入操作は比較参考例１と同様に行い、１×10
5個のCOS−１細胞に対して0.5μｇのpCH110プラスミド
を使用した。遺伝子導入の結果、発現したβ−ガラクト
シダーゼの酵素活性は下記の表３に示される通りであ
り、ボルテックス処理により調製されたMLVは逆相蒸発
法により調製したLUVと同等の導入効率を示し、且つ燐
酸カルシウム法よりも優れた遺伝子導入方法であること
が判明した。
実施例３及び試験例３ 実施例１に記載の方法に従って、１μmolの脂質（TMA
G:DLPC:DOPE＝1:2:2）を用い、ボルテックス処理によ
り、但しクロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ（CAT）遺伝子組み込みpMSG CATプラスミド20μｇ
を捕捉したMLVを調製した。
この遺伝子捕捉MLVを用いて、細胞への遺伝子導入を
行なった。pMSG CATプラスミドにおいて、CAT遺伝子は
デキサメサゾン等のグルココルチコイドにより発現制御
されるマウス乳癌ウィルスのLTR（MMTV LTR）プロモー
タの下流に配置されているため、デキサメサゾンを培地
に添加して、発現したCATの活性を測定した。導入操作
については10％ウシ血清含有ダルベッコ改変イーグル培
地（2ml）を添加した35φmmの培養皿に１×105個のNIH/
3T3細胞を加え、細胞培養を行なった。約16時間後に新
鮮培地と交換し、その８時間後に0.5μｇのpMSG CATプ
ラスミドを捕捉したMLVを培地に添加し、更に16時間培
養した。その後、MLVを除去し新鮮培地と交換し、１μ
Ｍの濃度となるようにデキサメサゾンをエタノールに溶
かして加えた。48時間培養した後、参考例１と同様に細
胞を集め、細胞抽出液を調製し、CATの酵素活性を測定
した。尚、対照として燐酸カルシウム法を用いて遺伝子
導入を行なった。
結果は下記の表４に示される通りであり、ボルテック
ス処理により調製されたMLVを用いて細胞への遺伝子導
入を行う場合には対照である燐酸カルシウム法により遺
伝子導入を行う場合と比較して約６倍高い発現量を示す
ことが判明した。
実施例４及び試験例４ 上記の実施例等においてはDNA導入後、数日以内に細
胞で遺伝子が発現する一過性発現で遺伝子の導入効率が
比較されている。
一方、本例では遺伝子が細胞DNAに組み込まれて発現
する細胞株の樹立による恒久的発現について検討を行な
った。
導入する遺伝子としては実施例３と同様にpMSG CATを
選択し、細胞としてはCV−１細胞を採択した。pMSG CAT
はSV40プロモータの下流に大腸菌キサンチングアニンホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（Eco gpt）遺伝子が
配置されているため、文献“Proc.Natl.Acad.Sci.USA"
第78巻、第2072頁（1981年）に記載のgpt選択条件下に
て形質導入を行った。実施例１に記載の方法に従って、
脂質１μmol（TMAG:DLPC:DOPE＝1:2:2）を用い、pMSG C
AT 20μｇを捕捉したMLVをボルテックス処理により調製
した。対照としてTMAGと異なる４級アミン含有脂質を構
成脂質の一つとしているリポフェクチンを用いた。即
ち、脂質１μmolを含有するリポフェクチンを採取し、2
0μｇのpMSG CATと混合することによりDNA複合体を調製
した。
上記のMLV及びリポフェクチンをキャリアーとして細
胞への遺伝子導入を行い、又対照として燐酸カルシウム
法により同様に遺伝子導入を行なった。MLV又はリポフ
ェクチンを利用する細胞への遺伝子導入操作は下記のよ
うにして行なわれた。2mlの10％ウシ胎児血清含有アー
ルミニマムエッセンシャル培地（EMEM）を添加した培養
皿に１×105個のCV−１細胞を加え、培養を行なった。
翌日、１μｇのDNAを捕捉したMLV又はリポフェクチンを
新鮮培地に交換した培養皿に加え、19時間培養した。燐
酸カルシウム法についてはDNAと燐酸カリシウムの混合
物を細胞に加え４時間培養し、次いで室温にて２分間グ
リセルロース処理を行い、上記と同様に細胞培養を行な
った。その後、新鮮生育培地と交換し、２日間培養し
た。次いで、培養した細胞をトリプシン処理して培養皿
より剥し、細胞を集め、生育培地で一度細胞を洗浄した
後、細胞を10倍希釈して新たに培地に加えた。２日後、
gpt選択培地と交換し、以後３日毎に選択培地を交換し
た。遺伝子導入処理から15日後に細胞をPBSにて洗浄
し、20％中性緩衝ホルマリン溶液にて固定し、次いで0.
05％メチレンブルーにて染色後、コロニー数を測定し
た。
結果は下記の表５に示されている通りであり、本発明
による遺伝子捕捉MLVにより形質転換された細胞のコロ
ニー数はSUVを利用する場合や燐酸カルシウム法の場合
と比較して約６倍以上多いことが判明した。
実施例５及び試験例５ （細胞毒性） 構成脂質がTMAG、DLPC及びDOPEであり、その構成モル
比が1:2:2であって遺伝子を捕捉していないMLV及びLUV
を調製した。これらのリポソームの内でMLVは４μmolの
上記で指定した脂質組成を有する脂質薄膜に1.5mlのPBS
を加え、実施例１に記載した方法に従ってボルテックス
処理により調製した。LUVについてはMLVと同組成及び同
脂質量よりなる脂質薄膜を用い、但し特開平２−135092
号公報に記載の逆相蒸発法に従って調製した。一方、対
照としては市販のリポフェクチン試薬を用いた。
細胞毒性の評価方法はdye−uptake法により測定し
た。すなわち、10％ウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イ
ーグル培地を0.4ml添加した24穴プレートに２×104個の
COS−１細胞を加え、37℃、５％ CO2インキュベータ内
で20時間培養した。その後、新鮮培地と交換し、各脂質
濃度に調製したリポソーム溶液を100μｌ宛添加した。
その状態で72時間培養した後に培地を除き、PBSにて細
胞を洗浄し、10％中性緩衝ホルマリン溶液にて固定し、
次いで0.05メチレンブルー染色液にて細胞を染色した。
その後、過剰のメチレンブルーを除去した後、細胞に取
り込まれたメチレンブルーを0.33Mの塩酸にて抽出し、6
65nmにて吸光度を測定した。毒性の評価はコントロール
の吸光度に対するそれぞれの脂質濃度における吸光度の
割合より細胞の生育阻害率を求めた。
結果は第１図に示される通りであり、本発明によるML
Vは同脂質組成及び同脂質濃度からなるLUVと比較する場
合にいずれの脂質濃度においても有意な差を以って毒性
の低いことが判明した。
尚、４級アミンを含有する脂質を含むリポフェクチン
は同脂質濃度の本発明によるMLVと比較して1.8−3.5倍
の高い細胞毒性を示した。
（発明の効果） 本発明によれば、リポソームの構成脂質がＮ−（α−
トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グ
ルタメートクロライド、ジラウロイルホスファチジルコ
リン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン
であり、その構成モル比が1:2:2であることを特徴とす
る、遺伝子導入用多重膜リポソーム及び該リポソームに
より遺伝子を捕捉した多重膜リポソーム製剤並びにその
製法が提供される。本発明による多重膜リポソームはボ
ルテックス処理により調製することができるので製造が
極めて容易であり、大量生産に適している。しかも、ボ
ルテックス処理により調製された遺伝子捕捉多重膜リポ
ソームは凍結乾燥法や凍結融解法により調製された遺伝
子捕捉多重膜リポソームよりも細胞への遺伝子導入効率
が遙かに高い。
更に、本発明による多重膜リポソームは、４級アミン
を有する脂質を構成脂質とするリポソームと比較する場
合に、遺伝子導入に際して細胞に与えるダメージが少な
く、従って形質転換細胞を多量得ることができるので、
当該形質転換細胞の培養による薬物等の有用物質の生産
においては生産効率を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＮ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−
ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド、ジラウロイ
ルホスファチジルコリン及びジオレオイルホスファチジ
ルエタノールアミンを構成脂質とし且つこれら脂質の構
成モル比が1:2:2であって、本発明による且つボルテッ
クス処理により調製された多重膜リポソーム（MLV）
と、構成脂質及びモル比が上記と同様であり、但し逆相
蒸発法により調製された大きな一枚膜リポソーム（LU
V）と、４級アミンを有する脂質を構成脂質の一つとし
て含有しているリポソーム試薬であるリポフェクチンと
を用い、これらのリポソームが細胞に及ぼす毒性を調べ
た結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 A61K 48/00 B01J 13/02 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】リポソームの構成脂質がＮ−（α−トリメ
    チルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメ
    ートクロライド、ジラウロイルホスファチジルコリン及
    びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであ
    り、その構成モル比が1:2:2であることを特徴とする、
    遺伝子導入用多重膜リポソーム。
  2. 【請求項２】リポソームの構成脂質がＮ−（α−トリメ
    チルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメ
    ートクロライド、ジラウロイルホスファチジルコリン及
    びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンであ
    り、その構成モル比が1:2:2であって、遺伝子を捕捉し
    ていることを特徴とする、遺伝子捕捉多重膜リポソーム
    製剤。
  3. 【請求項３】Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチ
    ル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメ−トクロライドと、ジ
    ラウロイルホスファチジルコリンと、ジオレオイルホス
    ファチジルエタノールアミンとをモル比が1:2:2となる
    ように秤取して溶媒に溶解させ、次いでロータリーエバ
    ポレータを用いて溶媒を除去することにより脂質薄膜を
    形成させ、その後に遺伝子DNAの溶液を添加してボルテ
    ックス処理することにより遺伝子捕捉多重膜リポソーム
    を形成させることを特徴とする、遺伝子捕捉多重膜リポ
    ソーム製剤の製法。
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