JP6909212B2

JP6909212B2 - 肝臓特異的コンストラクト、第ｖｉｉｉ因子発現カセット、およびその使用の方法

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Publication number: JP6909212B2
Application number: JP2018521965A
Authority: JP
Inventors: ブリジットイー．ライリー，; ゲイリーケー．リー，
Original assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2015-10-28
Filing date: 2016-07-13
Publication date: 2021-07-28
Anticipated expiration: 2036-07-13
Also published as: US20190142970A1; NZ741787A; CN115141836B; US20230119850A1; EP3368664A1; IL258826B1; CO2018005215A2; KR102766526B1; SG11201803547RA; CA3002524A1; AU2016343887B2; JP7324249B2; IL258826A; PE20181206A1; SA518391456B1; KR20250022906A; CN108473976B; WO2017074526A1; PH12018500927A1; IL258826B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２４７，４６９号；２０１６年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３０７，８９７号；２０１６年４月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／３２６，２２９号；２０１６年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３１５，４３８号；および２０１６年６月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３５５，１０６号（それらの開示はその全体を参照することにより本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、遺伝子療法、特に、有益な（治療用）タンパク質の発現のための導入遺伝子をコードするコンストラクトの肝臓への標的化送達の分野である。特に、本開示は血友病（血友病Ａ等）の治療に関する。

遺伝子療法を使用して、１つもしくは複数の不活性化遺伝子を有するように細胞を遺伝子操作すること、および／または、その細胞中で以前に産生されていない産物を（例えば導入遺伝子挿入経由および／または内在性配列の修正経由で）その細胞に発現させることができる。導入遺伝子挿入の使用の例としては、１つもしくは複数の新規治療用タンパク質をコードする１つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体に欠如するタンパク質をコードするコーディング配列の挿入、変異遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子の挿入、および／または構造核酸（マイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等）をコードする配列の挿入が挙げられる。内在性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例としては、疾患関連遺伝子突然変異の変更、スプライス部位をコードする配列中の変更、調節配列中の変更、および／またはタンパク質の構造特徴をコードする配列の標的化された変更が挙げられる。

肝臓への遺伝子の移入は、様々な障害（血友病およびリソソーム貯蔵障害が含まれる）の治療および／または予防のために被験体に導入遺伝子を送達する効果的な手段を提供する。例えば米国特許第９，１５０，８４７号、米国公報第２０１３０１７７９８３号および同第２０１４００１７２１２号を参照されたい。肝臓指向性の遺伝子療法のための特異的ベクターも記載されている。例えばＷＯ２０１４０６４２７７；ＷＯ２００９１３０２０８；ＥＰ２４５１４７４Ｂ１、Ｃｈｕａｈｅｔａｌ．，（２０１４）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２，１６０５−１６１３；およびＮａｉｒｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ１２３：３１９５−３１９９を参照されたい。これらのベクターは野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列を含み得る。例えばＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８３４−１８４３；ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）Ｖｉｒｏｌ．２５８：８４−９４を参照されたい。

哺乳動物個体全体において、免疫系の細胞メンバーの活性化または抑制のいずれかを調節できる複雑なメカニズムがある。例えば、樹状細胞（ＤＣ）は、免疫活性化ｖｓ免疫寛容の間のバランスにおける主役として確立されている。それらは免疫系において最も強力な抗原提示細胞であり、抗原を特異的に捕捉しナイーブＴ細胞へ提示する。抗原が微飲作用によって細胞の中へ運ばれる場合に、未成熟ＤＣは特異的受容体（トール様受容体等）を介して可能性のある抗原と相互作用する。次いで抗原はより小さなペプチドへと破壊され、それらは主要組織適合遺伝子複合体によってＴ細胞へ提示される。加えて、成熟ＤＣは炎症性メディエーター（ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびＴＮＦ等）を分泌し、それらはＴ細胞を活性化するようにさらに働く。他方では、ＤＣは、中枢性寛容および末梢性寛容を維持するために、いくつかの抗原への身体の寛容化における役割も果たす。寛容原性ＤＣ（ｔｏｌＤＣ）は細胞表面上に低量の共刺激シグナルを有し、上で記載される炎症性メディエーターの発現の低減を有する。しかしながら、これらのｔｏｌＤＣは多量の抗炎症サイトカイン（ＩＬ−１０のような）を発現し、これらの細胞がナイーブＴ細胞と相互作用する場合に、Ｔ細胞はアネルギーＴ細胞／調節性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）になるように駆動される。実際、これらの未成熟ＤＣ／寛容原性ＤＣによるＴ細胞の反復刺激に際して、このプロセスが促進されることが示された。ｔｏｌＤＣと協力して働いて異なるタイプのＴｒｅｇを誘導する、いくつかの因子も同定された。例えば、ｔｏｌＤＣおよびＨＧＦ、ＶＩＰペプチド、ＴＳＬＰまたはビタミンＤ３に共曝露されたナイーブＴ細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの誘導を導き、ＴＧＦ−βまたはＩＬ−１０による共曝露はＴｒ１Ｔｒｅｇを導き、コルチコステロイド、ラパマイシン、レチノイン酸による共曝露はＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを導き得る（Ｒａｋｅｒｅｔａｌ（２０１５）ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ６：ａｒｔ５６９およびＯｓｏｒｉｏｅｔａｌ（２０１５）ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ６：ａｒｔ５３５）。

血友病（血友病Ａおよび血友病Ｂ等）は、関節および軟組織の中への出血によって、ならびに外傷経験または外科手術中の任意の部位の中への過剰な出血によって特徴づけられる、血液凝固系の遺伝障害である。血友病Ａは血友病Ｂとは臨床的に判別不能であるが、血友病Ａにおいて第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩまたはＦ８）は欠損または存在しない一方で、血友病Ｂに罹患する患者において第ＩＸ因子（ＦＩＸまたはＦ．ＩＸ）が欠損または存在しない。Ｆ８遺伝子は、不活性形態のフォンウィルブランド（ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄ）因子と会合して血中循環する血漿糖タンパク質をコードする。表面の傷に際して、内因性の凝血カスケードが開始し、ＦＶＩＩＩは複合体から放出され活性化される。活性化形態は第ＩＸ因子と共に働いて、活性化Ｘａになるように第Ｘ因子を活性化し、最終的にはフィブリノーゲンのフィブリンへの変化および凝血誘導を導く。Ｌｅｖｉｎｓｏｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７（１）：１−１１を参照されたい。血友病Ａ患者の４０〜５０％は、Ｆ８のイントロン２２に関与する染色体逆位（ＩＶＳ２２としても知られている）を有する。逆位は、Ｆ８遺伝子のイントロン２２内の９．６ｋｂの配列と、Ｆ８遺伝子に対して約３００ｋｂ遠位に所在する２つの非常によく関連する逆方向の配列のうちの１つとの間の、染色体内組換え事象によって引き起こされ、エクソン２３〜２６に関してエクソン１〜２２の逆位をもたらす。ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＨｅｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｌｅｅｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）２００５、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。他の血友病Ａ患者は、Ｆ８中の欠陥（活性部位の突然変異ならびにナンセンス突然変異およびミスセンス突然変異が含まれる）を有する。

臨床的には、血友病Ａ患者は、患者に出血エピソードがどのくらい頻繁にあるか、およびそれらのエピソードがどのくらいの時間続くかに依存して、評価および層別化される。これらの特徴の両方は、患者の血液中のＦＶＩＩＩタンパク質の量に直接的に依存する。重度の血友病に罹患する患者は、典型的にはＦＶＩＩＩの正常血中レベルの１％未満を有し、傷に後続する出血および関節の中への頻繁な自然出血を経験する。中等度の患者は正常ＦＶＩＩＩレベルの１〜５％を有する一方で、軽度の患者は正常ＦＶＩＩＩの６％以上を有し、大怪我、外傷または外科手術後のみで出血エピソードを有する（Ｋｕｌｋａｒｎｉｅｔａｌ（２００９）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１５：１２８１−９０）。血友病Ａに罹患する患者は、ヒト血漿に由来するかまたは組換えにより産生されたいずれかの代替ＦＶＩＩＩタンパク質により治療され、そこで、治療の頻度は出血パターンおよび血友病の重症度に基づく。重度の血友病Ａに罹患する患者は、予防的治療を定期的に受けて出血が起こることを予防する一方で、それほど重度でない患者は、傷に後続して必要に応じてのみ治療を受けることができる。
血友病Ａまたは血友病Ｂに罹患する患者のための遺伝子療法（機能的なＦＶＩＩＩタンパク質またはＦ．ＩＸタンパク質をコードするプラスミドおよび他のベクター（例えばＡＡＶ）の導入を包含する）が記載されている（例えば米国特許第６，９３６，２４３号；同第７，２３８，３４６号および６，２００，５６０；Ｓｈｉｅｔａｌ．（２００７）ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．（２）：３５２−６１；Ｌｅｅｅｔａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：１２２９−１２３２；Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．（２００８）ＧｅｎｅｔＶａｃｃｉｎｅｓＴｈｅｒ．３：６−９；Ｍａｎｎｏｅｔａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（８）：２９６３−７２；Ｍａｎｎｏｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１２（３）：３４２−７；Ｎａｔｈｗａｎｉｅｔａｌ．（２０１１）ＭｏｌＴｈｅｒ１９（５）：８７６−８５；Ｎａｔｈｗａｎｉｅｔａｌ．（２０１１）；ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．３６５（２５）：２３５７−６５およびＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ１２１（１７）：３３３５−４４を参照）。しかしながら、これらのプロトコルにおいて、阻害性の抗第ＶＩＩＩ因子または抗第ＩＸ因子（抗ＦＶＩＩＩまたは抗Ｆ．ＩＸ）抗体および送達ベヒクルに対する抗体の形成は、血友病のためのＦＶＩＩＩおよびＦ．ＩＸの補充に基づく治療の主要な合併症である。例えばＳｃｏｔｔ＆Ｌｏｚｉｅｒ（２０１２）ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ．１５６（３）：２９５−３０２を参照されたい。
しかしながら、１つまたは複数の導入遺伝子（血友病において欠如する１つまたは複数のタンパク質をコードする導入遺伝子が含まれる）の発現を肝細胞中で高レベルで駆動する、肝臓に特異的なポリヌクレオチド（発現コンストラクトおよび転写モジュール）についての必要性が依然として存在する。

国際公開第２０１４／０６４２７７号国際公開第２００９／１３０２０８号欧州特許第２４５１４７４号明細書米国特許第６，９３６，２４３号明細書米国特許第７，２３８，３４６号明細書米国特許第６，２００，５６０号明細書

Ｃｈｕａｈｅｔａｌ．，（２０１４）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２，１６０５−１６１３Ｎａｉｒｅｔａｌ．（２０１４）Ｂｌｏｏｄ１２３：３１９５−３１９９ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１８３４−１８４３ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）Ｖｉｒｏｌ．２５８：８４−９４Ｒａｋｅｒｅｔａｌ（２０１５）ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ６：ａｒｔ５６９Ｏｓｏｒｉｏｅｔａｌ（２０１５）ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌ６：ａｒｔ５３５Ｌｅｖｉｎｓｏｎｅｔａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ７（１）：１−１１ＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＨｅｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｌｅｅｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）２００５、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＫｕｌｋａｒｎｉｅｔａｌ（２００９）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ１５：１２８１−９０Ｓｈｉｅｔａｌ．（２００７）ＪＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ．（２）：３５２−６１Ｌｅｅｅｔａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７：１２２９−１２３２Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．（２００８）ＧｅｎｅｔＶａｃｃｉｎｅｓＴｈｅｒ．３：６−９Ｍａｎｎｏｅｔａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ１０１（８）：２９６３−７２Ｍａｎｎｏｅｔａｌ．（２００６）ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ１２（３）：３４２−７Ｎａｔｈｗａｎｉｅｔａｌ．（２０１１）ＭｏｌＴｈｅｒ１９（５）：８７６−８５Ｎａｔｈｗａｎｉｅｔａｌ．（２０１１）；ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ．３６５（２５）：２３５７−６５ＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ１２１（１７）：３３３５−４４Ｓｃｏｔｔ＆Ｌｏｚｉｅｒ（２０１２）ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ．１５６（３）：２９５−３０２

本発明は、肝細胞中で導入遺伝子を発現させるための組成物および方法を記載する。導入遺伝子は、余剰染色体として（エピソームとして）発現され得るか、または肝細胞のゲノムの中への組み込まれ得る（例えばヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み経由で、例えばアルブミン遺伝子座の中へ）。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、凝血カスケードに関与するタンパク質をコードする。好ましい実施形態において、導入遺伝子はＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。本明細書において記載される組成物および方法は、インビトロおよびインビボの両方で高レベルのタンパク質産生をもたらす（インビボで臨床的に妥当な（治療）効果を示すのに十分なレベルが含まれる）。

一態様において、インスレーター配列を含む少なくとも１つスペーサー配列、肝臓特異的エンハンサー配列（例えば野生型セルピン１エンハンサー配列または変異セルピン１エンハンサー配列）、プロモーター配列（例えば野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたは変異ＴＴＲプロモーター）、および導入遺伝子（例えばヌクレアーゼおよび／または治療用タンパク質（血友病またはリソソーム蓄積症において欠如および／または欠損するタンパク質等））を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクトが、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド発現コンストラクトは、イントロン配列（例えば野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列または変異ＭＶＭイントロン配列）をさらに含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド発現カセットは、肝臓特異的エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列および導入遺伝子に隣接する、２つのスペーサー配列、ならびに随意にポリアデニル化シグナルを含む。任意のインスレーター配列（複数可）を使用することができ、これらには、任意の野生型インスレーター配列または変異インスレーター配列（例えば任意の組み合わせで、配列番号：２８、２９、３０および／または３８のうちの１つまたは複数）が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド発現コンストラクトは、ＣＲＭＳＢＳ１（配列番号：３７）またはＣＲＭＳＢＳ２（配列番号：３４）と表記されるポリヌクレオチドを含む。

別の態様において、肝臓特異的エンハンサー配列（例えば野生型セルピン１エンハンサー配列または変異セルピン１エンハンサー配列）、プロモーター配列（例えば野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたは変異ＴＴＲプロモーター）、配列番号：１５、１６または１７のうちの任意の１つ中で示されるようなイントロン配列、および導入遺伝子（例えばヌクレアーゼおよび／または、治療用タンパク質（血友病またはリソソーム蓄積症において欠如および／または欠損するタンパク質等））を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクトが、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド発現カセットは、インスレーター配列を含む少なくとも１つのスペーサー配列および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む。

さらに別の態様において、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、５、１４、３２および／または３９での突然変異を有する肝臓特異的エンハンサー配列（例えば配列番号：３５または３６中に示されるような）、プロモーター配列（例えば野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターまたは変異ＴＴＲプロモーター）、および導入遺伝子（例えばヌクレアーゼおよび／または治療用タンパク質（血友病またはリソソーム蓄積症において欠如および／または欠損するタンパク質等））を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクトが、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド発現コンストラクトは、イントロン配列（例えば野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列または変異ＭＶＭイントロン配列）、および／またはインスレーター配列を含む少なくとも１つのスペーサー配列、および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む。

他の態様において、本明細書において記載されるポリヌクレオチド発現コンストラクトのうちの任意のものを含む、ＡＡＶベクターが提供される（例えばそこで、ポリヌクレオチド発現コンストラクトは、ＡＡＶベクターの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と３’ＩＴＲとの間にある）。

さらに他の態様において、１つもしくは複数のＡＡＶベクターおよび／または本明細書において記載されるような１つもしくは複数のポリヌクレオチド発現コンストラクトを含む、医薬組成物が、本明細書において提供される。

タンパク質をそれを必要とする被験体へ提供するための方法であって、ポリヌクレオチド発現コンストラクト（ＡＡＶベクター）を被験体の肝臓へ、または本明細書において記載されるような医薬組成物を被験体へ、投与することを含み、導入遺伝子がタンパク質をコードし、タンパク質が被験体中で産生される、方法も、提供される。ある特定の実施形態において、導入遺伝子は被験体の肝細胞のゲノムの中へ組み込まれる。随意に、方法は被験体へ１つまたは複数のヌクレアーゼを投与することをさらに含み、そこで、ヌクレアーゼは内在性アルブミン遺伝子を切断し、導入遺伝子は内在性アルブミン遺伝子の中へ組み込まれる。導入遺伝子（例えばそれはタンパク質を産生する）を含むように細胞を遺伝的に修飾する方法も提供され、それらには、細胞の中へ導入遺伝子を導入する方法が含まれる（エピソームとしてまたは組み込まれる（ヌクレアーゼを媒介性標的化組み込みが含まれる））。哺乳動物において治療用タンパク質への寛容を誘導する方法であって、本明細書において記載されるように被験体中の細胞を遺伝的に修飾する（例えば本明細書において記載されるようにタンパク質を産生するように修飾された細胞）こと、ならびに哺乳動物が治療用タンパク質へ寛容化されるようになるように、１つまたは複数のステロイドおよび／またはＢ細胞阻害因子で治療することを含む、方法も、提供される。

一態様において、エンハンサー配列（例えば野生型セルピン１エンハンサーまたは変異セルピン１エンハンサー）、プロモーター配列（例えばトランスサイレチンの最小プロモーター（ＴＴＲｍ）プロモーター）、および導入遺伝子、ならびに随意にポリアデニル化配列（例えば合成ポリアデニル化配列（ＳＰＡ））および／またはシグナルペプチド（ＳＰ）を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクトが、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、イントロン配列（例えば野生型ＭＶＭ配列もしくは変異ＭＶＭ配列および／またはキメライントロン）をさらに含む。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、５’から３’の方向で、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン性配列、導入遺伝子（随意にシグナルペプチドを含む）、およびポリアデニル化シグナルを含む。

発現カセットは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）が含まれるがこれらに限定されない、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクター中に組入れられ得る。好ましい実施形態において、発現コンストラクトはＡＡＶコンストラクト上で保有され、本明細書において記載されるような発現コンストラクトに隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲをさらに含む。随意に、インスレーター（スペーサー）分子も、発現コンストラクトの構成要素の１つまたは複数の間に、例えば５’ＩＴＲとエンハンサーとの間に、および／またはポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲとの間に組入れられる。いくつかの実施形態において、インスレーター（スペーサー）領域は、標的化組み込みを促進するように相同性アームを含む。ある特定の実施形態において、コンストラクトは、図１、２、４、６、７、１０、１９、２０または２５のうちの任意のものの中で示されるようなコンストラクトである。例示的な２つのコンストラクトが配列番号：３４および配列番号：３７中に示される。個別の構成要素（プロモーター、インスレーター（複数可）、エンハンサー、導入遺伝子）が、任意の組み合わせで、本明細書において記載されるような他の構成要素と組み合わせられ得ることは明らかであろう。

本明細書において記載されるポリヌクレオチドのうちの任意のものにおいて、エンハンサーはセルピン−１エンハンサーに由来し得る。ある特定の実施形態において、エンハンサーは野生型配列である。他の実施形態において、エンハンサーは野生型に比較して１つまたは複数の修飾を含み、例えばセルピン１エンハンサーは、図５中に示されるような１つまたは複数のヌクレオチド修飾（配列番号：１〜１３のうちの任意のものにおいて示される配列の残基１、５、１４、３２および／または３９のうちの１つまたは複数でのヌクレオチドの修飾）を含有する。ある特定の実施形態において、セルピン１エンハンサーは、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、５、１４および３２での修飾を含む一方で、他の実施形態において、セルピン１エンハンサーは、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、１４、３２および３９での修飾を含む。例示的なエンハンサー配列は配列番号：３５および３６において示される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５またはそれ以上のエンハンサーエレメントを含む。ある特定の実施形態において、１、２、３、４、５またはそれ以上のエンハンサーエレメントは同一である一方で、他の実施形態において、２つ以上のタイプのエンハンサーエレメントが使用される。

本明細書において記載されるポリヌクレオチドのうちの任意のものは、イントロン性配列をさらに随意に含み得る。ある特定の実施形態において、例えば図６および７の下部パネル中で示されるように、発現コンストラクトはキメライントロン配列を含む。Ｔ−キメライントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋＵ４７１２０）中のキメライントロンの短縮バージョンである。ｐＣＩ−ｎｅｏ中のキメライントロンは、ヒトβ−グロビン遺伝子からの５’スプライスドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のブランチポイントおよび３’アクセプター部位である。Ｔ−キメライントロンは、５’スプライスドナーとブランチポイントとの間で４５ｂｐの欠失を含有する。さらに他の実施形態において、発現コンストラクトは、変異ＭＶＭイントロン配列（例えば図１２、１３および１４中で示される突然変異のうちの１つまたは複数（配列番号：１５〜１７））を含む。あるいは、例えば図６、７、１９および２０の中央パネルにおいて描写されるコンストラクト中で示されるように、発現コンストラクトは、本明細書において記載されるようなイントロン性配列を欠如し得る。

本発明の発現コンストラクトは、ＡＡＶＩＴＲと発現カセットとの間に最適化されたインスレーター配列も含み得る。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、インスレーター（スペーサー）領域（例えばＩｎｓ１、Ｉｎｓ３、配列番号：１５または２８および配列番号：１７または３０（それぞれ）ならびにＩｎｓ２（配列番号：１６または２９））を含む。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトはＩｎｓ４（配列番号：３８）を含む。インスレーター配列のうちの任意のものは５’または３’の所在位置のいずれかで使用することができ、インスレーター配列のうちの任意の組み合わせは発現コンストラクト内で使用することができる。５’所在位置でのＩｎｓ１および３’所在位置でのＩｎｓ３の組み合わせが特に好ましい。

発現コンストラクトは、本明細書において記載されるような１つまたは複数の導入遺伝子も含み発現する。任意の導入遺伝子（複数可）は本明細書において記載されるポリヌクレオチドを使用して発現させることができ、これらには、任意の遺伝性疾患（リソソーム貯蔵障害（例えばゴーシェ病、ファブリー病、ハンター病、ハーラー病、ニーマン−ピック病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）など）、代謝障害、および／または血液疾患（血友病および異常血色素症等）が含まれるがこれらに限定されないものなど）において、欠如または欠損するタンパク質の機能的なバージョンをコードする導入遺伝子が含まれるがこれらに限定されない。例えば米国公報第２０１４００１７２１２号および同第２０１４００９３９１３号；米国特許第９，２５５，２５０号および同第９，１７５，２８０号を参照されたい。本明細書において記載されるように発現され得るタンパク質の非限定例としては、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンウィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害因子、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡサブユニットおよび／またはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ−１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質、（ＮＡＧＳ（Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ）およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸合成酵素）、ＡＳＬ（アルギニノコハク酸リアーゼ）および／またはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、および／または溶質キャリアファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸キャリア）タンパク質等）、ＵＧＴ１Ａ１またはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼポリペプチドＡ１、フマリルアセトアセテートヒドロリアーゼ（ＦＡＨ）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、操作されたヌクレアーゼ、操作された転写因子および／または操作された一本鎖可変断片抗体（ダイアボディ、ラクダ科の動物のものなど）が挙げられる。１つの好ましい実施形態において、導入遺伝子はＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ＦＶＩＩＩポリペプチドは、Ｂドメインの欠失を含む。

いくつかの実施形態において、１つまたは複数の導入遺伝子は、操作されたヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする配列を含む。他の実施形態において、導入遺伝子は、操作された転写因子（例えばＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥ−ＴＦ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ＴＦ系）をコードする配列を含む。導入遺伝子は、対象となる標的について特異的な一本鎖抗体をコードする配列も含み得る。加えて、導入遺伝子は、構造ＲＮＡ（例えばＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をコードする配列を含み得る。

ある特定の態様において、本明細書において記載されるようなポリヌクレオチドは、それらがエピソームとして維持される一方で、導入遺伝子の発現を駆動するように細胞の中へ導入される。他の態様において、発現コンストラクトは、それらが導入される細胞のゲノムの中へランダムに組み込まれる。さらなる態様において、導入遺伝子発現を駆動する発現コンストラクトは、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによってゲノムの中へ組み込まれる。

さらなる態様において、肝細胞中で１つまたは複数の導入遺伝子を発現させるための方法であって、導入遺伝子が細胞中で発現されるように、本明細書において記載されるような１つまたは複数の発現コンストラクトを細胞の中へ導入することを含む、方法が、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ２またはＡＡＶ２／６）上で保有される。

別の態様において、生きている動物において１つまたは複数の導入遺伝子を発現する方法であって、本明細書において記載されるような１つまたは複数の発現カセットを生きている動物へ投与することを含む、方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、発現カセットは生きている動物の肝臓へ投与される。ある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ２／６またはＡＡＶ２／８）上で保有される。

いくつかの実施形態において、治療的に妥当なレベルの１つまたは複数の治療用タンパク質を１つまたは複数の導入遺伝子から発現させる方法および組成物が本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、補充タンパク質をコードする導入遺伝子コンストラクトの発現は、産生されるタンパク質の正常レベルの１％をもたらす一方で、他において、タンパク質の正常レベルの２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、８０％、１００％、１５０％、２００％またはそれ以上が産生される。いくつかの好ましい実施形態において、導入遺伝子はＦＶＩＩＩタンパク質をコードし、治療的に妥当な量のタンパク質が産生される。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物の使用の結果として、ヒト患者は、臨床症状の減少をもたらす増加した量の治療用タンパク質を血液中に有する。ある特定の態様において、本明細書において記載される方法および組成物による治療用タンパク質のヒト患者における産生は、治療されていない患者に比較してまたは治療の前の患者に比較して、傷に後続する凝血時間の減少をもたらす。いくつかの態様において、本発明の方法および組成物により治療されたヒト患者は、治療されていない患者よりもまたは治療の前に患者に比較して、減少した量の置換療法を要求する。

いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるような本発明の方法および組成物を使用して、導入遺伝子によってコードされる治療用タンパク質のレベルが、抗治療用タンパク質抗体の一時的上昇に後続して治療的に妥当なレベルで残存するように、治療用タンパク質への寛容を哺乳動物において誘導する。したがって、被験体において治療用タンパク質への寛容を誘導する方法であって、本明細書において記載されるような方法を使用して被験体中の細胞を遺伝的に修飾する（例えばその結果、細胞が治療用タンパク質を産生する）こと、随意に、動物が治療用タンパク質への寛容化されるようになるように、追加の組成物（例えばステロイドおよび／またはＢ細胞阻害因子）により被験体を治療することを含む、方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞の中への治療用タンパク質の挿入（組み込み）は、免疫阻害性ステロイドまたはＢ細胞阻害因子による治療と同時に行われるが、他の事例において、免疫修飾物質は動物へ投与されない。いくつかの事例において、抗治療用タンパク質抗体が生成される場合にのみ、免疫修飾剤が投与される。さらなる事例において、免疫修飾剤は期間後に中止される。

別の態様において、細胞、発現コンストラクト、および／または本明細書において記載される随意のヌクレアーゼのうちの１つまたは複数を含む医薬組成物が提供される。

ある特定の態様において、肝臓特異的発現カセットの標的化組み込みのための方法および系が、本明細書において記載される。方法および系は、本明細書において記載されるような１つまたは複数の発現カセットを投与すること、および標的遺伝子について特異的な１つまたは複数のヌクレアーゼを細胞へ投与することを含む。標的遺伝子のヌクレアーゼ媒介性切断に後続して、発現カセットは、相同性依存性メカニズムまたは相同性非依存性メカニズム経由で遺伝子の中へ組み込まれる。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は内在性アルブミン遺伝子である。

本発明の発現コンストラクトのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのために、発現コンストラクトがヌクレアーゼ（複数可）によって切断された領域（遺伝子）の中へ組み込まれるように、任意のヌクレアーゼを使用することができる（１つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼおよび／またはＴｔＡｇｏヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない）。ある特定の実施形態において、１つまたは複数のペアのヌクレアーゼが用いられる。ヌクレアーゼはｍＲＮＡの形態で導入され得るか、または非ウイルスベクターもしくはウイルスベクターを使用して細胞へ投与され得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼポリヌクレオチドはレンチウイルスまたは非組み込みレンチウイルスによって送達され得る。他の態様において、発現カセットはＡＡＶおよび／またはＤＮＡオリゴによって送達され得る。

別の態様において、哺乳動物または霊長動物（ヒト霊長動物等、疾患（例えば代謝疾患、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）、異常血色素症および／または血友病）に罹患するヒト患者等）において欠如または欠損する１つまたは複数の機能的タンパク質を提供するため、例えば被験体において欠如または欠損するタンパク質（複数可）の供給によって疾患を治療するための方法が、本明細書において提供される。別の態様において、タンパク質が欠如、欠損、または異常に発現される障害の治療のための機能的タンパク質を提供するための方法が、本明細書において提供される。さらなる実施形態において、方法は、障害の予防または治療のために有用な治療用タンパク質をコードする発現カセットを投与することを含む。さらなる態様において、治療用タンパク質が一本鎖抗体である場合に障害を治療するための治療用タンパク質の提供のための方法が、本明細書において記載される。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書において記載されるような発現カセット（例えばＡＡＶベクター）をそれを必要とする被験体の肝臓へ投与することを含む。他の実施形態において、方法は、修飾された細胞を（被験体において異常に発現されるタンパク質の機能的なバージョンを記載されるような発現カセットから発現する）を被験体へ投与することを含む。したがって、単離された細胞は被験体の中へ導入され得るか（エクスビボ細胞療法）、または被験体の一部である細胞が修飾され得る（インビボ）。

記載される組成物および方法のうちの任意のものにおいて、発現カセットおよび／またはヌクレアーゼは、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、またはシュードタイプ化ＡＡＶ（ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等）および同種のものが含まれるがこれらに限定されない）上で保有され得る。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチド（発現コンストラクトおよび／またはヌクレアーゼ）は同じＡＡＶベクタータイプを使用して送達される。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは異なるＡＡＶベクタータイプを使用して送達される。ポリヌクレオチドは１つまたは複数のベクターを使用して送達され得る。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、静脈内（例えば門脈内）投与経由でインタクトな動物の肝臓の中へ送達される。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは静脈内投与経由で末梢静脈中に送達される。

本明細書において記載される組成物および方法のうちの任意のものにおいて、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｆ８タンパク質、例えばＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤ−Ｆ８）を含み得る。他の実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は第ＩＸ因子タンパク質を含む。他の実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は第ＶＩＩ因子タンパク質を含む。他の実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質は第Ｘ因子タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質はグルコセレブロシダーゼを含む。他の実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質はαガラクトシダーゼを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質はイズロン酸−２−スルファターゼを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質はα−Ｌイズロニダーゼを含む。さらなる実施形態において、導入遺伝子によってコードされるタンパク質はスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼを含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は一本鎖抗体をコードする。他の実施形態において、導入遺伝子は構造ＲＮＡをコードする。本明細書において記載される組成物または方法のうちの任意のものにおいて、導入遺伝子は転写調節因子も含む一方で、他においては含まれず、転写は内在性調節因子によって調節される。別の態様において、本発明の方法は、それを必要とする被験体の治療法のための組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、安全領域（ｓａｆｅｈａｒｂｏｒ）特異的ヌクレアーゼを含む操作された幹細胞、ならびに第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、一本鎖抗体および／もしくはＳＭＰＤ１タンパク質またはその機能的断片および／もしくは短縮型をコードする導入遺伝子を含む。他の実施形態において、組成物は、修飾され、第ＶＩＩ因子、Ｆ８、Ｆ．ＩＸ、第Ｘ因子、ＧＢＡ、ＧＬＡ、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、一本鎖抗体および／もしくはＳＭＰＤ１タンパク質またはその機能的断片および／もしくは短縮型をコードする導入遺伝子を発現する、操作された幹細胞を含む。

本明細書において記載される方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実践することができる。ある特定の実施形態において、組成物は生きているインタクトな哺乳動物の中へ導入される。哺乳動物は、送達時で任意の発生のステージ、例えば、胚、胎仔、新生仔、乳仔、幼若体または成体であり得る。加えて、標的細胞は健康または疾患であり得る。ある特定の実施形態において、組成物のうちの１つまたは複数は、静脈内に（例えば門脈内静脈経由で肝臓へ、例えば尾静脈注射）、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、肝実質の中に（例えば注射経由で）、肝動脈の中に（例えば注射経由で）、および／または胆管系を介して（例えば注射経由で）送達される。

特定のタイプの細胞（例えば血小板、線維芽細胞、肝細胞など）へ組成物を標的化するために、投与された組成物のうちの１つまたは複数は、細胞の表面受容体へ特異的に結合するホーミング剤と会合し得る。例えば、ベクターは、ある特定の肝臓系細胞が受容体を有するリガンド（例えばガラクトース）へコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、共有結合（例えば架橋剤（グルタルアルデヒド等））または非共有結合（例えばビオチン化ベクターへのアビジン化リガンドの結合）であり得る。共有結合のコンジュゲーションの別の形態は、ベクターストックの調製に使用されるＡＡＶヘルパープラスミドを、コードされたコートタンパク質のうちの１つまたは複数が生来のＡＡＶコートタンパク質とペプチドリガンドまたはタンパク質リガンドのハイブリッドであるように操作し、その結果、リガンドがウイルス粒子の表面上で曝露されて提供される。

本明細書において記載される発現コンストラクト、ＡＡＶベクター、細胞および／または医薬組成物のうちの１つまたは複数を含む、キットも提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣａｓおよび修飾Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡ分子、ならびにガイドＲＮＡ）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、細胞、本発明の方法の遂行のための説明書、および同種のものをさらに含み得る。

これらおよび他の態様は、開示に照らして全体として当業者に容易に明らかである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
インスレーター配列を含む少なくとも１つのスペーサー配列、肝臓特異的エンハンサー配列、プロモーター配列および導入遺伝子を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクト。
（項目２）
イントロン配列をさらに含む項目１に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトであって、前記エンハンサー配列が野生型セルピン１エンハンサーもしくは変異セルピン１エンハンサーを含む；および／または、前記プロモーター配列が野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターもしくは変異ＴＴＲプロモーターを含む；および／または、前記イントロン配列が野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列もしくは変異ＭＶＭイントロン配列を含む、前記コンストラクト。
（項目３）
前記インスレーター配列が、配列番号：２８、２９および／または３０のうちの任意の１つである、項目１または項目２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目４）
前記肝臓特異的エンハンサー配列、前記プロモーター配列、前記イントロン配列および前記導入遺伝子に隣接する、２つのスペーサー配列を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目５）
前記インスレーター配列が、配列番号：２８、２９、３０および／または３８である、項目４に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目６）
前記導入遺伝子が血友病またはリソソーム蓄積症において欠如または欠損するタンパク質をコードする、項目１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目７）
前記導入遺伝子が１つまたは複数のヌクレアーゼをさらにコードする、項目６に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目８）
肝臓特異的エンハンサー配列、プロモーター配列、配列番号：１５、１６または１７のうちの任意の１つ中で示されるようなイントロン配列、および導入遺伝子を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクト。
（項目９）
前記エンハンサー配列が野生型セルピン１エンハンサーまたは変異セルピン１エンハンサーを含む；および／または、前記プロモーター配列が野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターもしくは変異ＴＴＲプロモーターを含む、項目８に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
（項目１０）
インスレーター配列を含む少なくとも１つのスペーサー配列および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目８または項目９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１１）
前記導入遺伝子が血友病またはリソソーム蓄積症において欠如または欠損するタンパク質をコードする、項目８〜１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１２）
前記導入遺伝子が１つまたは複数のヌクレアーゼをさらにコードする、項目８〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１３）
配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、５、１４、３２および／または３９で突然変異を有する肝臓特異的エンハンサー配列、プロモーター配列、および導入遺伝子を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクト。
（項目１４）
イントロン配列をさらに含む項目１３に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトであって、前記プロモーター配列が野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターもしくは変異ＴＴＲプロモーターを含む、および／または、前記イントロン配列が野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列もしくは変異ＭＶＭイントロン配列を含む、前記コンストラクト。
（項目１５）
インスレーター配列を含む少なくとも１つのスペーサー配列および／またはポリアデニル化シグナルをさらに含む、項目１３または１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１６）
前記導入遺伝子が血友病またはリソソーム蓄積症において欠如または欠損するタンパク質をコードする、項目１３〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１７）
前記導入遺伝子が１つまたは複数のヌクレアーゼをさらにコードする、項目１３〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット。
（項目１８）
項目１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトを含むＡＡＶベクターであって、前記ポリヌクレオチド発現コンストラクトが前記ＡＡＶベクターの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と３’ＩＴＲとの間にある、前記ベクター。
（項目１９）
前記ＡＡＶベクターがＣＲＭＳＢＳ１（配列番号：３４）またはＣＲＭＳＢＳ２（配列番号：３７）と表記される、項目１８に記載のＡＡＶベクター。
（項目２０）
項目１８または１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む、医薬組成物。
（項目２１）
タンパク質を、それを必要とする被験体へ提供する方法であって、項目１８もしくは１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを前記被験体の肝臓へ、または項目２０に記載の医薬組成物を前記被験体へ、投与することを含み、前記導入遺伝子が前記タンパク質をコードし、前記タンパク質が前記被験体中で産生される、前記方法。
（項目２２）
前記導入遺伝子が肝細胞のゲノムの中へ組み込まれる、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
１つまたは複数のヌクレアーゼを被験体へ投与することをさらに含む、項目２１または２２のいずれか一項に記載の方法であって、前記ヌクレアーゼが内在性アルブミン遺伝子を切断し、前記導入遺伝子が内在性アルブミン遺伝子の中へ組み込まれる、前記方法。
（項目２４）
哺乳動物において治療用タンパク質への寛容を誘導する方法であって、項目２１〜２３のいずれか一項に記載の方法に従ってタンパク質を産生するように前記哺乳動物における細胞を修飾すること、ならびに前記哺乳動物が治療用タンパク質へ寛容化されるようになるように、１つまたは複数のステロイドおよび／またはＢ細胞阻害因子により哺乳動物を治療することを含む、前記方法。
（項目２５）
項目１〜１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現カセット、項目１８もしくは項目１９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、および／または項目２０に記載の医薬組成物を含む、キット。

導入遺伝子カセットエレメント、ならびに改善されたエンハンサーおよびイントロンの同定に採用されたステップを示す概略図である。インスレーター１−３（「Ｉｎｓ１−３」）を備えた、親ＴＴＲｍプロモーターおよびＨＬＰコンストラクトを描写する概略図である。ＳｅｒｐＥは、肝臓特異的セルピン調節エレメントである、セルピンＡ１（ＳＥＲＰＩＮＡ１）遺伝子からのセルピンエンハンサーを指す。ＴＴＲｍはトランスサイレチン最小プロモーターを指す。ＨＬＰはハイブリッドの肝臓特異的プロモーターを指す（ＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ．、同書）。ｈＦＶＩＩＩはヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失導入遺伝子を指す。ＳＰはシグナルペプチドを指す。ＩＴＲは逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは合成ポリアデニル化配列を指す。異なるインスレーター配列またはプロモーター領域を含む、異なるＡＡＶコンストラクトの収量を描写するグラフである。親ＴＴＲｍプロモーターまたはＨＬＰコンストラクトのコンテキストにおいて、Ｉｎｓ１−Ｉｎｓ２へ比較されたＩｎｓ１−Ｉｎｓ３からの改善された収量が、図中で観察される。ウイルスはＨＥＫ２９３細胞中で産生され、収量は２つの細胞工場（ｃｅｌｌｆａｃｔｏｒｉｅｓ）（２つのＣＦ）からである。ＳｅｒｐＥは、肝臓特異的セルピン調節エレメントである、セルピンＡ１遺伝子からのセルピンエンハンサーを指す。ＴＴＲｍはトランスサイレチン最小プロモーターを指す。ＨＬＰはハイブリッドの肝臓特異的プロモーターを指す（ＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ．、同書）。ｈＦＶＩＩＩはヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失導入遺伝子を指す。ＳＰはシグナルペプチドを指す。ＩＴＲは逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは合成ポリアデニル化配列を指す。親ならびにＣＲＭＳＢＳ１およびＣＲＭＳＢＳ２と表記される新しいエンハンサーを備えたコンストラクト（各々はヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失（第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤ）導入遺伝子を保有する）を描写する概略図である。「ＳｅｒｐＥ」は、肝臓特異的セルピン調節エレメントである、セルピンＡ１遺伝子からのセルピンエンハンサーを指す。「ＴＴＲｍ」はトランスサイレチン最小プロモーターを指す。「ＳＢＳ」は内部のＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの数値参照を指す。「ｈＦＶＩＩＩ」はヒト第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ導入遺伝子を指す。「ＳＰ」はシグナルペプチドを指す。「ＩＴＲ」は逆方向末端反復を指す。「ＳＰＡ」は合成ポリアデニル化配列を指す。「Ｉｎｓ１」および「Ｉｎｓ３」は図２中で上で記載される通りである。セルピンＡ１遺伝子の複数の種のＥＮＣＯＤＥアライメントを使用する、複数の種からのセルピンＡ１遺伝子のアライメントを示す（配列番号：１〜１３）。同一の残基は図示しない（「．」によって表示される）。１〜５で表示される四角で囲った領域は、配列への修飾の部位である。さらに中央パネル中で黒いバーによって示されるものは、ＨｅｐＧ２細胞中でのＤＮＡｓｅＩ感受性の領域である。ＣＲＭＳＢＳ１は四角で囲った位置１、２、３および４での変化を含み、ＣＲＭＳＢＳ２は四角で囲った位置１、３、４および５での変化を含む。「ＣＲＭ」はシス調節モジュールを指す。「ＳＢＳ１／２」はコンストラクト１および２についてのＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの内部数値参照を指す。薄い灰色の四角で囲った領域は、省かれたセルピンＡ１遺伝子の配列である。ＣＲＭＳＢＳ１、およびＭＶＭイントロンのない（ＣＲＭＳＢＳ１イントロンなし）または短縮キメライントロンのある（ＣＲＭＳＢＳ１Ｔ−キメライントロン）ＣＲＭＳＢＳ１に由来する２つのコンストラクト（各々のコンストラクトは第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ導入遺伝子を含む）を描写する概略図である。「ＣＲＭ」はシス調節エレメントを指す。「ＳＢＳ」はＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの内部数値参照を指す。「ｈＦＶＩＩＩ」はヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤを指す。「ＳＰ」はシグナルペプチドを指す。「ＩＴＲ」は逆方向末端反復を指す。「ＳＰＡ」は合成ポリアデニル化配列を指す。「Ｉｎｓ１」および「Ｉｎｓ３」は図２中で上で記載される通りである。ＣＲＭＳＢＳ２、およびＭＶＭイントロンのない（ＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし）または短縮キメライントロンのある（ＣＲＭＳＢＳ２Ｔ−キメライントロン）ＣＲＭＳＢＳ２に由来する２つのコンストラクト（各々のコンストラクトは第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ導入遺伝子を含む）を描写する概略図である。「ＣＲＭ」はシス調節エレメントを指す。「ＳＢＳ」はＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの内部数値参照を指す。「ｈＦＶＩＩＩ」はヒト第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤを指す。「ＳＰ」はシグナルペプチドを指す。「ＩＴＲ」は逆方向末端反復を指す。「ＳＰＡ」は合成ポリアデニル化配列を指す。「Ｉｎｓ１」および「Ｉｎｓ３」は図２中で上で記載される通りである。図８Ａおよび８Ｂは、指示されたコンストラクトのマウスへの投与に後続する、ヒトの分泌性第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤのインビボの産生を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコンストラクトにより形質導入された。図８Ａは投与後７日目の分泌性ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルを示し、図８Ｂは２８日の研究の継続期間にわたる分泌性ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルを示す。各々のグラフの左側のｙ軸はｎｇ／ｍＬを示し、右側のｙ軸はパーセント正常（そこで１Ｕ＝１００％正常＝２００ｎｇ／ｍＬ）を示す。^＊＊＊はｐ＞．００１を示し、^＊はｐ＞．０５を示す。グループ内の各々の個別の形は、単一動物からの結果を表わす。図９Ａおよび９Ｂは、図７中で記載されるようなベクターの投与に後続する、Ｆ８−ＢＤＤｃＤＮＡの肝臓特異的発現を描写する。図９Ａは、指示された組織（脳、心臓、腎臓、肺、肝臓、脾臓、精巣）から分析されるヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤ（ｈＦＶＩＩＩ）ｍＲＮＡのレベルを示す。示されるように、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｍＲＮＡは肝臓中でのみ検出され、他の組織では、親Ｆ８−ＢＤＤｃＤＮＡコンストラクト（白抜きの記号）またはＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし（塗りつぶされた記号）のいずれかから検出されない。図９Ｂは、図９Ａ中で描写された同じ組織からのベクターゲノム（ＶＧ）の生体内分布を示す。血清型ＡＡＶ２／６は主として肝臓に形質導入される。コンストラクトＣＲＭＳＢＳ２、および追加のコンストラクト（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン１、２または３と表記される）を描写する概略図である。すべてのコンストラクトはヒト第ＶＩＩＩ因子ＢＤＤ導入遺伝子を含む。「ＣＲＭ」はシス調節エレメントを指す。「ＳＢＳ」は内部のＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの内部数値参照を指す。「ｈＦＶＩＩＩ」はヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤ導入遺伝子を指す。「ＳＰ」はシグナルペプチドを指す。「ＩＴＲ」は逆方向末端反復を指す。「ＳＰＡ」は合成ポリアデニル化配列を指す。「ＭＶＭ」はＭＶＭイントロン配列を指す。部分的配列（配列番号：１４）を含む、野生型マウス微小ウイルスイントロン（「ＷＴＭＶＭ」）ならびにドナーおよびアクセプターの所在位置を描写する概略図である。「Ｄ１」および「Ｄ２」はそれぞれドナー１およびドナー２を指す。「Ａ１」および「Ａ２」はそれぞれアクセプター１およびアクセプター２を指す。「ＩＥＳ」はイントロン性エンハンサー配列を指す。ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７２：１８３４−１８４３およびＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ（１９９８）ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ．，２５８：８４−９４も参照されたい。本明細書において記載されるコンストラクト中で使用されるＳＢＲイントロン１における野生型ＭＶＭイントロンへ行われた変化の概要を示す（配列番号：１５）。変化は灰色の四角で囲ってあり、可能なブランチポイントアクセプター１へのマイナーな突然変異（ＰＢＰＡ１）；変異されたアクセプター部位１ポリ−ピリミジントラクト（Ａ１ＰＰＴ（−））；変異されたアクセプター部位１（Ａ１（−））；改善された可能なブランチポイントアクセプター部位２（ＰＢＰＡ２（＋））；さらなるチミジン（Ｔ）の追加によって強化された、アクセプター部位２ポリ−ピリミジントラクト（Ａ２ＰＰＴ（＋、８Ｔ））；改善されたアクセプター部位２（Ａ２（＋））を含む。本明細書において記載されるコンストラクト中で使用されるＳＢＲイントロン２における野生型ＭＶＭイントロンへ行われた変化の概要を示す（配列番号：１６）。変化は灰色の四角で囲ってあり、可能なブランチポイントアクセプター１へのマイナーな突然変異（ＰＢＰＡ１）；変異されたアクセプター部位１ポリ−ピリミジントラクト（Ａ１ＰＰＴ（−））；変異されたアクセプター部位１（Ａ１（−））；さらなるチミジン（Ｔ）の追加によって強化された、アクセプター部位２ポリ−ピリミジントラクト（Ａ２ＰＰＴ（＋、８Ｔ））；改善されたアクセプター部位２（Ａ２（＋））を含む。本明細書において記載されるコンストラクト中で使用されるＳＢＲイントロン３における野生型ＭＶＭイントロンへ行われた変化の概要を示す（配列番号：１７）。変化は灰色の四角で囲ってあり、Ｇリッチイントロン性エンハンサー配列の突然変異（ＩＥＳｋｏ）；可能なブランチポイントアクセプター１へのマイナーな突然変異（ＰＢＰＡ１）；変異されたアクセプター部位１ポリ−ピリミジントラクト（Ａ１ＰＰＴ（−））；変異されたアクセプター部位１（Ａ１（−））；さらなるチミジン（Ｔ）の追加によって強化された、アクセプター部位２ポリ−ピリミジントラクト（Ａ２ＰＰＴ（＋、９Ｔ））；改善されたアクセプター部位２（Ａ２（＋））を含む。図１５Ａおよび１５Ｂは、新規イントロン配列を備えたヒトの分泌性第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失のマウスにおけるインビボの産生を描写する。図１５は、分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）Ｂドメイン欠失の、マウスからのレベルを描写するグラフを有し、ｎｇ／ｍＬ（左側のｙ軸）またはパーセント正常（右側のｙ軸）のいずれかとして表わされ、１Ｕ＝１００％正常＝２００ｎｇ／ｍＬである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ｘ軸上に表示されるように６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦＶＩＩＩコンストラクトにより形質導入された。図１５Ａは７日目の分泌性ｈＦＶＩＩＩのレベルを示す。図１５Ｂは２８日の研究の継続期間にわたるピークの分泌性ｈＦＶＩＩＩレベルを示す。数字は、群についての平均ｈＦＶＩＩＩパーセント正常レベルを表示する。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡの発現が肝臓特異的であることを示す。図１６Ａは、図１５中で表わされた研究における組織（脳、心臓、腎臓、肺、肝臓、脾臓、精巣）から分析されたヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）をコードするｍＲＮＡの値を示すグラフである。ｈＦＶＩＩＩｍＲＮＡは肝臓中でのみ検出され、他の組織では、親Ｆ８ｃＤＮＡコンストラクト（白抜きの記号）またはＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３（塗りつぶされた記号）のいずれかから検出されない。図１６Ｂは、図１６Ａ中で分析された同じ組織からのベクターゲノム（ＶＧ）生体内分布を示す。以前に出版されたように血清型ＡＡＶ２／６は主として肝臓に形質導入される。図１７Ａおよび１７Ｂは、血友病Ａマウスの血漿中の酵素的に活性なヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤの超生理学的レベルを描写する。図１７は、酵素的に活性な分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈＦＶＩＩＩ）Ｂドメイン欠失の、血友病ＡＲ５９３Ｃマウスからのレベルを描写するグラフを有し、パーセント正常として表わされ、１Ｕ＝１００％正常である。血友病ＡノックアウトマウスＲ５９３Ｃは、ｘ軸上に表示されるように約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤコンストラクトにより形質導入された。図１７Ａは１４日目の分泌性ｈＦＶＩＩＩ活性レベルを示す。図１７Ｂは４２日目の分泌性ｈＦＶＩＩＩ活性レベルを示す。数字は、群についての平均ｈＦＶＩＩＩパーセント正常レベルを表示する。Ｆ８ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３ｃＤＮＡにより治療された血友病ＡのＲ５９３Ｃマウスにおける出血時間を示すグラフである。結果から、尾静脈切断（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）後の血友病マウスにおいて止血を達成する時間の量の有意な低減（ｐ＜０．０００１）が実証される。ＣＲＭＳＢＳ１、および新しい例示的なコンストラクト（ＭＶＭイントロンなし、またはキメライントロンあり）を、第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失導入遺伝子およびＩｎｓ１−Ｉｎｓ３と一緒に描写する概略図。ＣＲＭはシス調節エレメントを指す。ＳＢＳはＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを指す。ｈＦＶＩＩＩはヒト第ＶＩＩＩ因子を指す。ＳＰはシグナルペプチドを指す。ＩＴＲは逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは合成ポリアデニル化配列を指す。「Ｉｎｓ１」および「Ｉｎｓ３」は図２中で上で記載される通りである。ＣＲＭＳＢＳ２、および新しい例示的なコンストラクト（ＭＶＭイントロンなし、キメライントロンあり、またはＳＢＲイントロン３あり）を、第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失導入遺伝子およびＩｎｓ１−Ｉｎｓ３と一緒に描写する概略図。ＣＲＭはシス調節エレメントを指す。ＳＢＳはＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを指す。ｈＦＶＩＩＩはヒト第ＶＩＩＩ因子を指す。ＳＰはシグナルペプチドを指す。ＩＴＲは逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは合成ポリアデニル化配列を指す。「Ｉｎｓ１」および「Ｉｎｓ３」は図２中で上で記載される通りである。ＨｅｐＧ２細胞におけるＡＡＶＦ８ｃＤＮＡのインビトロでの発現による、ｈＦＶＩＩＩのレベルおよび活性の評価を描写するグラフである。ＡＡＶ２／６Ｆ８ｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３）を、２４ウェルディッシュ中の１Ｅ＋０５細胞あたり４．８Ｅ＋０６、２．４Ｅ＋０６、１．２Ｅ＋−６および０．６Ｅ＋０６のウイルスゲノムの用量で、ＨｅｐＧ２細胞に加えた（時間ｔ０日として表示される）。上清は、ＡＡＶ２／６ウイルス添加７日目（ｔ７）に、ＥＬＩＳＡによって分泌性ｈＦＶＩＩＩレベル（左端のバー）、ならびにＡＰＴＴ凝血アッセイ（右端のバー）および発色活性アッセイ（中央のバー）によって活性について分析された。結果から分泌性ｈＦＶＩＩＩレベルと活性との間の良好な相関性が実証された（左側の軸上でＵ／ｍＬおよび右側のｙ軸上でパーセント正常として報告され、１Ｕ／ｍＬ＝１００パーセント正常）。示されたデータは、ｎ＝６の生物学的重複測定である。エラーバーは平均の標準誤差を表わす。ＣＲＭＳＢＳ１またはＣＲＭＳＢＳ２のイントロンシリーズのコンテキストにおける産生収量の改善を示すグラフである。ウイルスはＨＥＫ２９３細胞中で産生され、収量は２つの細胞工場（２つのＣＦ）からである。ＣＲＭはシス調節エレメントを指す。ＳＢＳはＳａｎｇａｍｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓを指す。ｈＦＶＩＩＩはヒト第ＶＩＩＩ因子を指す。ＳＰはシグナルペプチドを指す。ＩＴＲは逆方向末端反復を指す。ＳＰＡは合成ポリアデニル化配列を指す。Ｉｎｓ１およびＩｎｓ３はそれぞれインスレーター１およびインスレーター３を指す。示されるように、複数のＡＡＶ血清型を使用して、野生型マウス中のｈＦＶＩＩＩ−ＢＤ産生レベルを描写するグラフである。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／９のコンストラクトについて６Ｅ＋１０ｖｇ／マウス（約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）、またはＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／８のコンストラクトについて６Ｅ＋１０ｖｇ／マウス（約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）および１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）を静脈注射した。図は、ＡＡＶ２／６およびＡＡＶ２／５のより低い用量のうちのいくつか以外は、すべてのサンプルの血漿中で検出された超生理学的ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを実証する。導入遺伝子が、ＨＥＫ２９３産生（ＨＥＫ）またはＳｆ９細胞中でのバキュロウイルス産生（Ｓｆ９）のいずれかによって精製されたＡＡＶ２／６経由で送達された場合の、野生型マウスにおけるｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子の相対的発現を描写するグラフである。導入遺伝子をＦ８親ｃＤＮＡ（図４）により使用した。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９／ｒＢＶ（組み換えバキュロウイルス）のいずれかから産生された１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ２／６Ｆ８親ｃＤＮＡによる親Ｆ８親ｃＤＮＡを静脈注射（尾静脈）経由で投与した。ＨＥＫ２９３細胞からのＦ８親ｃＤＮＡによる治療は、正常ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの１４２．１％±８．３％標準誤差（ｎ＝８）（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定された）の平均ピーク値を達成した。同レベルの１３２．８％±１８．６％標準誤差（ｎ＝５）（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定された）が、Ｆ８親ｃＤＮＡ（Ｓｆ９／ｒＢＶ）のマウスへの投与に後続して達成された。図２５Ａおよび２５Ｂは、ＣＲＢＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３（Ｉｎｓ１−Ｉｎｓ３）ｃＤＮＡ導入遺伝子ドナーの、マウスにおける発現レベルを示す。図２５Ａはドナーの概略図であり、それは図１０中でも示される。図２５Ｂは、ｎｇ／ｍＬおよびパーセント正常（正常ヒト血漿における）の両方として表現される、血漿中の検出可能なｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの量を示す。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ２／６ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３ｃＤＮＡを静脈注射した（ｎ＝８）。ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの平均ピークレベルが示される。図２６Ａおよび２６Ｂは、様々な非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）研究におけるヒトＦＶＩＩＩ−ＢＤＤについての投薬スキーム（１０３日目でのすべての免疫抑制を除去する研究が含まれる）を示す。図２６Ａは、リツキサンおよびソル−メドロール投薬の概要を示す。リツキサン（１０ｍｇ／ｋｇ；静脈内）投薬は試験品の投与の前であり、その一方でメチルプレドニゾロン（ソル−メドロール）（１０ｍｇ／ｋｇ；筋肉内）投薬は１０３日目まで毎日であった。図２６Ｂは、試験品の添加の前および後の実験についての投薬スキームを示し、リツキサンおよびソル−メドロール投薬のタイミングも示す。群１〜５は、試験品の注射前の免疫抑制レジメンに従うが、群６〜８は、試験品の注射後の免疫抑制レジメンに従った。この研究の継続期間は５６日であった。ＡＡＶ２／６ｈＦ８ｃＤＮＡにより治療されたＮＨＰにおける、ｈＦＶＩＩＩ活性とレベルとの間の相関性を示すグラフである。カニクイザルに、製剤バッファーまたは６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦ８ｃＤＮＡ（親ベクター）を投与した。図２７は、製剤対照群（群１、動物識別１１０１〜１１０２）および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ用量群（群３、動物識別３１０１〜３１０３）についての個別の動物を示す。試験品添加後１４日目で、ｈＦＶＩＩＩの循環レベルおよび活性は、ＥＬＩＳＡまたはＡＰＴＴ凝血活性によって分析された。カニクイザルＦＶＩＩＩの正常レベルは、凝血活性アッセイがヒトＦＶＩＩＩについて特異的でないので、製剤対照群についての凝血活性データにおいて反映される、約１Ｕ／ｍＬ（約１００％正常）である。ＥＬＩＳＡはカニクイザルＦＶＩＩＩよりもヒトＦＶＩＩＩについて特異的であり、したがって、予想通りに、製剤対照群においてＥＬＩＳＡによって測定されるようなｈＦＶＩＩＩレベルはない。群３の動物において、８Ｕ／ｍＬ（８００％正常）を越える循環ｈＦＶＩＩＩの超生理学的なレベルおよび活性がある。図２８Ａおよび２８Ｂは、ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡにより治療されたＮＨＰにおける肝酵素プロファイルを示すグラフである。カニクイザルに、製剤バッファーまたは６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦ８ｃＤＮＡ（親ベクター）を投与した。製剤対照群（群１、動物識別１１０１）および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ用量群（群３、動物識別３１０２）についての動物における代表的な肝酵素プロファイルが、肝臓状態の指標として示される。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が示される。カニクイザルについてまだ正常範囲である許容される上限参照値は、ＡＬＴについて１２６Ｕ／Ｌであり、ＡＳＴについて１２０Ｕ／Ｌである。製剤対照群および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ（親ベクター）群の両方について、ＡＬＴ／ＡＳＴレベルは肝生検後（肝生検は４１日目であった）に上昇し、星印によって表示された。それ以外は、ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡは研究の全体にわたって（２４７日）良好な忍容性を示した。図２９Ａ〜２９Ｃは、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８）Ｂドメイン欠失（ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）タンパク質を保有するＡＡＶドナーを使用する、ＮＨＰ研究についてヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの要約を描写するグラフである。図２９Ａは群２の動物（ＡＡＶ２／６、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）についての結果を示し；図２９Ｂは群３の動物（ＡＡＶ２／６、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）についての結果を示し；図２９Ｃは群４の動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）についての結果を示し；図２９Ｄは群５の動物（ＡＡＶ２／８、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）についての結果を示す。１Ｕ／ｍＬのヒト第ＶＩＩＩ因子は生理的に正常と判断され、したがって正常な生理的循環ヒト第ＶＩＩＩ因子の１００％と等しい。指示されたコンストラクト（ＡＡＶ６またはＡＡＶ８のベクターにおける）による非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における治療に後続する研究にわたる、ピークのヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルを描写するグラフである。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの用量レベルで（ｎ＝３）、ヒトにおける正常ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの１１１．０％、４９３．９％および８４０．０％（全体の平均４８１．６％、ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定されるように）のピーク値が達成された。６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを表わすより高い用量で（ｎ＝３）、４５０．０％、６２５．６％および８８６．７％［全体の平均６５４．１％］のｈＦＶＩＩＩ血漿レベルのピーク値が達成された。ＡＡＶ８についての全体の平均値は１４７．１％であった。図３１Ａ〜３１Ｃは、低用量（２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、群２）のＡＡＶ２／６−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを投薬した個別のカニクイザル（ｎ＝３；動物２１０１、２１０２および２１０３）からの、投薬後１６８日の期間にわたる結果を描写するグラフである。すべての３つのグラフにおいて、血漿中のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの濃度は黒色で示される（ＥＬＩＳＡで測定されるように）。加えて、血漿中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の濃度（ベセスダ単位として示される）は、灰色で示される。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットオフポイントを表わす。ソル−メドロールは、垂直の破線によって示されるように１０３日目で停止された。各々のグラフは単一のサルについての結果を示し：図３１Ａは動物２１０１を示し；図３１Ｂは動物２１０２を示し；図３１Ｃは動物２１０３を示す。図３２Ａ〜３２Ｃは、高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、群３）のＡＡＶ２／６−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを投薬した個別のカニクイザル（ｎ＝３、動物３１０１、３１０２および３１０３）からの、投薬後の１６８日の期間にわたる結果を描写するグラフである。すべての３つのグラフにおいて、血漿中のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの濃度は黒色において示される（ＥＬＩＳＡで測定されるように）。加えて、血漿中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の濃度（ベセスダ単位として示される）は、灰色で示される。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットオフポイントを表わす。ソル−メドロールは１０３日目で（垂直の破線によって指示される）停止された。各々のグラフは単一のサルについての結果を示し：図３２Ａは動物３１０１を示し；図３２Ｂは動物３１０２を示し；図３２Ｃは動物３１０３を示す。図３３Ａ〜３３Ｄは、高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、群４）のＡＡＶ２／８−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを投薬した個別のカニクイザル（ｎ＝３、動物４１０１、４１０２および４１０３）からの、投薬後の１６８日の期間にわたる結果を描写するグラフである。グラフ３３Ａ〜３３Ｃにおいて、血漿中のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの濃度は黒色において示される（ＥＬＩＳＡで測定されるように）。加えて、血漿中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の濃度（ベセスダ単位として示される）は、灰色で示される。図３３Ｄは、動物４１０３についてのグラフ中のより低い値の「拡大」である（図３３Ａ〜３３Ｃ中のｙ軸は０〜５Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原である一方で、図３３Ｄは０〜１Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原であることに注目）。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットオフポイントを表わす。ソル−メドロールは１０３日目で（垂直の破線によって指示される）停止された。各々のグラフは単一のサルについての結果を示し：図３３Ａは動物４１０１を示し；図３３Ｂは動物４１０２を示し；図３３Ｃおよび３３Ｄは動物４１０３を示す。図３４Ａ〜３４Ｅは、高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、群５）のＡＡＶ２／８−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを投薬した個別のカニクイザル（ｎ＝３）からの、投薬後の１６８日の期間にわたる結果を描写するグラフである。図３４Ａ〜３４Ｃにおいて、血漿中のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの濃度は黒色において示される（ＥＬＩＳＡで測定されるように）。加えて、血漿中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の濃度（ベセスダ単位として示される）は、灰色で示される。図３４Ｄおよび３４Ｅは、グラフ中のより低い値の「拡大」である（３４Ａ〜Ｃ中のｙ軸は０〜５Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原である一方で、３４Ｄおよび３４Ｅの軸は０〜１Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原であることに注目）。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットオフポイントを表わす。ソル−メドロールは１０３日目で（垂直の破線によって指示される）停止された。各々のグラフは単一のサルについての結果を示す（動物５１０１：図３４Ａ、５１０２：図３４Ｂおよび５１０３：図３４Ｃ）。図３４Ａ〜３４Ｅは、高用量（６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ、群５）のＡＡＶ２／８−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを投薬した個別のカニクイザル（ｎ＝３）からの、投薬後の１６８日の期間にわたる結果を描写するグラフである。図３４Ａ〜３４Ｃにおいて、血漿中のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの濃度は黒色において示される（ＥＬＩＳＡで測定されるように）。加えて、血漿中の抗ＦＶＩＩＩ中和抗体の濃度（ベセスダ単位として示される）は、灰色で示される。図３４Ｄおよび３４Ｅは、グラフ中のより低い値の「拡大」である（３４Ａ〜Ｃ中のｙ軸は０〜５Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原である一方で、３４Ｄおよび３４Ｅの軸は０〜１Ｕ／ｍＬのＦＶＩＩＩ抗原であることに注目）。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットオフポイントを表わす。ソル−メドロールは１０３日目で（垂直の破線によって指示される）停止された。各々のグラフは単一のサルについての結果を示す（動物５１０１：図３４Ａ、５１０２：図３４Ｂおよび５１０３：図３４Ｃ）。図３５Ａおよび３５Ｆは、遺伝子導入ｈＦＶＩＩＩを発現する動物における治療用ｈＦＶＩＩＩ生物製剤によるチャレンジを描写するグラフである。群１、３、４および５（動物識別１１０１、３１０１、３１０３、４１０３、５１０１、５１０２）からのカニクイザルは、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）によりチャレンジされ、それは２５Ｕ／ｋｇのＸｙｎｔｈａ（登録商標）の４回の毎週の点滴からなり、図３５Ａ〜３５Ｆ中で逆さまの三角形として指示された。Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジは、１９８、２０５、２１２、２１９日目（０日目でのＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ試験品添加に後続して）に対応した。ｈＦＶＩＩＩの短い半減期および毎週の血漿収集に起因して、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）からのｈＦＶＩＩＩレベルの増加はなかった。しかしながら、対照製剤群１において、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して阻害抗体（ベセスダ単位（ＢＵ）による測定）の増加があった（ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与されない動物識別１１０１を参照、図３５Ａ）。図３５Ａ中で示されるように、ＢＵはＸｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して約０．９ＢＵ／ｍＬに達し、グラフの灰色領域によって指示される。動物識別３１０３は何週間もの間の３Ｕ／ｍＬを越える高いＢＵレベルを有し、添加されたｈＦＶＩＩＩ生物製剤チャレンジ（破線の垂線によって指示される）は、追加の検出可能な阻害抗体（ＢＵ）を誘導しなかった（図３５Ｂ）。ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与され、ｈＦＶＩＩＩレベルを持続したすべての群において、阻害抗体（ＢＵ）の増加はない（図３５Ｃ〜Ｆ、灰色の矢印によって指示される）。図３５Ｃは動物識別３１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５０％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｄは動物識別４１０３についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１０％で１９週間持続したことを示す。図３５Ｅは動物識別５１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｆは動物識別５１０２についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約３５％で１９週間持続したことを示す。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットポイントを表わす。垂直の点線は、図３５Ｂ、３５Ｅおよび３５Ｆにおいて、試験品投薬後１０３日目でのソル−メドロールの除去を表わす。図３５Ａおよび３５Ｆは、遺伝子導入ｈＦＶＩＩＩを発現する動物における治療用ｈＦＶＩＩＩ生物製剤によるチャレンジを描写するグラフである。群１、３、４および５（動物識別１１０１、３１０１、３１０３、４１０３、５１０１、５１０２）からのカニクイザルは、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）によりチャレンジされ、それは２５Ｕ／ｋｇのＸｙｎｔｈａ（登録商標）の４回の毎週の点滴からなり、図３５Ａ〜３５Ｆ中で逆さまの三角形として指示された。Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジは、１９８、２０５、２１２、２１９日目（０日目でのＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ試験品添加に後続して）に対応した。ｈＦＶＩＩＩの短い半減期および毎週の血漿収集に起因して、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）からのｈＦＶＩＩＩレベルの増加はなかった。しかしながら、対照製剤群１において、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して阻害抗体（ベセスダ単位（ＢＵ）による測定）の増加があった（ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与されない動物識別１１０１を参照、図３５Ａ）。図３５Ａ中で示されるように、ＢＵはＸｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して約０．９ＢＵ／ｍＬに達し、グラフの灰色領域によって指示される。動物識別３１０３は何週間もの間の３Ｕ／ｍＬを越える高いＢＵレベルを有し、添加されたｈＦＶＩＩＩ生物製剤チャレンジ（破線の垂線によって指示される）は、追加の検出可能な阻害抗体（ＢＵ）を誘導しなかった（図３５Ｂ）。ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与され、ｈＦＶＩＩＩレベルを持続したすべての群において、阻害抗体（ＢＵ）の増加はない（図３５Ｃ〜Ｆ、灰色の矢印によって指示される）。図３５Ｃは動物識別３１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５０％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｄは動物識別４１０３についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１０％で１９週間持続したことを示す。図３５Ｅは動物識別５１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｆは動物識別５１０２についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約３５％で１９週間持続したことを示す。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットポイントを表わす。垂直の点線は、図３５Ｂ、３５Ｅおよび３５Ｆにおいて、試験品投薬後１０３日目でのソル−メドロールの除去を表わす。図３５Ａおよび３５Ｆは、遺伝子導入ｈＦＶＩＩＩを発現する動物における治療用ｈＦＶＩＩＩ生物製剤によるチャレンジを描写するグラフである。群１、３、４および５（動物識別１１０１、３１０１、３１０３、４１０３、５１０１、５１０２）からのカニクイザルは、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）によりチャレンジされ、それは２５Ｕ／ｋｇのＸｙｎｔｈａ（登録商標）の４回の毎週の点滴からなり、図３５Ａ〜３５Ｆ中で逆さまの三角形として指示された。Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジは、１９８、２０５、２１２、２１９日目（０日目でのＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ試験品添加に後続して）に対応した。ｈＦＶＩＩＩの短い半減期および毎週の血漿収集に起因して、ｈＦＶＩＩＩ生物製剤Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）からのｈＦＶＩＩＩレベルの増加はなかった。しかしながら、対照製剤群１において、Ｘｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して阻害抗体（ベセスダ単位（ＢＵ）による測定）の増加があった（ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与されない動物識別１１０１を参照、図３５Ａ）。図３５Ａ中で示されるように、ＢＵはＸｙｎｔｈａ（登録商標）のチャレンジに後続して約０．９ＢＵ／ｍＬに達し、グラフの灰色領域によって指示される。動物識別３１０３は何週間もの間の３Ｕ／ｍＬを越える高いＢＵレベルを有し、添加されたｈＦＶＩＩＩ生物製剤チャレンジ（破線の垂線によって指示される）は、追加の検出可能な阻害抗体（ＢＵ）を誘導しなかった（図３５Ｂ）。ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡを投与され、ｈＦＶＩＩＩレベルを持続したすべての群において、阻害抗体（ＢＵ）の増加はない（図３５Ｃ〜Ｆ、灰色の矢印によって指示される）。図３５Ｃは動物識別３１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５０％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｄは動物識別４１０３についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１０％で１９週間持続したことを示す。図３５Ｅは動物識別５１０１についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約１５％で１９週間持続したことを示す一方で、図３５Ｆは動物識別５１０２についてのｈＦＶＩＩＩレベルが正常ｈＦＶＩＩＩの約３５％で１９週間持続したことを示す。点線の横線は、抗ＦＶＩＩＩ中和抗体について陽性である値と判断されないベセスダ単位カットポイントを表わす。垂直の点線は、図３５Ｂ、３５Ｅおよび３５Ｆにおいて、試験品投薬後１０３日目でのソル−メドロールの除去を表わす。図３６Ａおよび３６Ｂは、ＨｅｐＧ２細胞中の内在性アルブミン遺伝子座からのｈＶＩＩＩ−ＢＤＤのインビトロの発現を描写する。図３６Ａは、ＨｅｐＧ２細胞へのアルブミン標的化ＺＦＮ（ＳＢＳ＃４７１７１／４７８９８、ＡＡＶ２／６−ＺＦＮ）およびｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡＡＡＶ２／６−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ（ＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし）の投与（３．０Ｅ＋０５のＡＡＶ２／６−ＺＦＮと一緒に、ＡＡＶ２／６−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤは３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５で投与される）に後続して、ＨｅｐＧ２細胞上清中で経時的に（ｔ＝日）検出されたｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤを示すグラフである。図３６ＢはｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ単独（ＺＦＮなし）を示すグラフである。示されたデータは、ｎ＝３の生物学的重複測定である。エラーバーは重複測定の平均の標準誤差を表わし、点線はｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡの検出限界である。内在性アルブミン遺伝子座でのｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子標的化組み込みのインビトロの検出を示すグラフである。標的化組み込みはアルブミン挿入部位を含む定量的ＰＣＲによって検出された。５’ＰＣＲプライマーは内在性ヒトアルブミン遺伝子座内に所在し、ＰＣＲプローブはｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤカセットのＩＴＲ内に所在し、３’プライマーはｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子内である。提示された数字は、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨへ正規化されたものである。図２６Ｂ中で示されるスケジュールに従う非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）における治療に後続する、ピークのヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルを示すグラフである。群１〜５は、試験品の注射前の免疫抑制（ＩＳ）レジメンに従った。６Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇの用量レベル（ｎ＝３、群３）で、ヒトにおける正常ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの５．７％である、ピーク値の全体の平均（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定される）が、達成された。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを表わすより高い用量（ｎ＝３、群４）で、ピーク値の全体の平均は５６．４％であり、および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群５）で、ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの２２９．０％である、ピーク値の全体の平均（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定される）が、達成された。灰色の陰は、試験品後のＩＳレジメンに従う群７および８である。用量レベル２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群７）で、ピーク値の全体の平均は８７．９％であり、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群８）について、１０１．７％であった。群１および６は、製剤として表示された製剤対照群であった。検出可能な循環ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルにおいて同じ血清型結果を使用する、図３８中で示される２Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇコホートにおける被験物質の再投薬後の結果を示すグラフである。群２（もとは２Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇ用量（ｎ＝３）を表わす）は、研究の５６日目で９Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３）を再投薬された（図２６Ｂ）。再用量後７日目の循環ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルが示され、白抜きの半円により表示される（９Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇの新しい用量で７日目）。すべての残りのデータは図３８中で提示されるものと同じである（研究の５６日目の時点でのピークレベル）。図４０Ａおよび４０Ｂは、内在性アルブミン遺伝子座からのｈＶＩＩＩのインビトロの産生および検出を示すグラフである。図４０Ａは、アルブミン標的化ＺＦＮ（ＳＢＳ＃４２９０６／４３０４３）およびｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３）のＨｅｐＧ２細胞への投与に後続する、ＨｅｐＧ２細胞上清中で検出されるｈＦＶＩＩＩの合計レベルを示す（１９日目でアッセイされる）。この実施例において、ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡは、３．０Ｅ＋０５のＺＦＮと一緒に、３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５の増加用量で使用された。細胞へ添加された合計のウイルスについて調整するためのＧＦＰと（ＺＦＮなしの）ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ、およびｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ単独（ＺＦＮなし）も示され、後者の両方とも検出可能な分泌性ｈＦＶＩＩＩはほとんどまたは全くないことを実証する。これは、エピソームのｈＦＶＩＩＩが、十分な量の検出可能な分泌性ｈＦＶＩＩＩの蓄積の前に分解されるからである。示されたデータは、ｎ＝２の生物学的重複測定である。エラーバーは、技術的および生物学的な重複測定の平均の標準誤差を表わす。点線はｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡの検出限界である。図４０Ｂは、定量的ＰＣＲを使用する、ＮＨＥＪによる内在性アルブミン−ｈＦＶＩＩＩ標的化組み込みのレベルを示す。５’プライマーは内在性ヒトアルブミン遺伝子座内であり、プローブはｈＦＶＩＩＩカセットのＩＴＲ内に所在し、３’プライマーはｈＦＶＩＩＩ内である。図４０Ａおよび４０Ｂは、内在性アルブミン遺伝子座からのｈＶＩＩＩのインビトロの産生および検出を示すグラフである。図４０Ａは、アルブミン標的化ＺＦＮ（ＳＢＳ＃４２９０６／４３０４３）およびｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３）のＨｅｐＧ２細胞への投与に後続する、ＨｅｐＧ２細胞上清中で検出されるｈＦＶＩＩＩの合計レベルを示す（１９日目でアッセイされる）。この実施例において、ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡは、３．０Ｅ＋０５のＺＦＮと一緒に、３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５の増加用量で使用された。細胞へ添加された合計のウイルスについて調整するためのＧＦＰと（ＺＦＮなしの）ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ、およびｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡ単独（ＺＦＮなし）も示され、後者の両方とも検出可能な分泌性ｈＦＶＩＩＩはほとんどまたは全くないことを実証する。これは、エピソームのｈＦＶＩＩＩが、十分な量の検出可能な分泌性ｈＦＶＩＩＩの蓄積の前に分解されるからである。示されたデータは、ｎ＝２の生物学的重複測定である。エラーバーは、技術的および生物学的な重複測定の平均の標準誤差を表わす。点線はｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡの検出限界である。図４０Ｂは、定量的ＰＣＲを使用する、ＮＨＥＪによる内在性アルブミン−ｈＦＶＩＩＩ標的化組み込みのレベルを示す。５’プライマーは内在性ヒトアルブミン遺伝子座内であり、プローブはｈＦＶＩＩＩカセットのＩＴＲ内に所在し、３’プライマーはｈＦＶＩＩＩ内である。

特に肝細胞における導入遺伝子の発現のための発現カセットが本明細書において開示される。コンストラクトは、任意の導入遺伝子（複数可）のインビボまたはインビトロでの肝細胞への送達に使用することができ、導入遺伝子のうちの１つまたは複数の供与によって回復できる任意の疾患または障害の治療および／または予防のために使用することができる。現在使用される肝臓標的化コンストラクトとは異なり、本明細書において記載されるコンストラクトは、修飾されたエンハンサーおよび／またはイントロン性配列を含み、加えて、ＭＶＭイントロンの使用なしでさえ高レベルで導入遺伝子を発現する。これらのコンストラクトは小さくもあり、小さなベクター系（ＡＡＶ）によって送達される導入遺伝子の成功した使用を可能にする。

本明細書において記載されるコンストラクトを使用して、非ヒト霊長動物の肝臓においてｈＦＶＩＩＩＢＤＤを発現させることができる。ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ発現カセットの初期用量に依存して、循環血漿レベルのｈＦＶＩＩＩは正常循環ｈＦＶＩＩＩの８００％以上であった。これらの初期の高用量に後続して、多くの動物が、８週間を超える間に正常レベルの１０〜１５０％の発現へと落ち着いた。加えて、何匹かの動物は、注射されたｈＦＶＩＩＩタンパク質（Ｘｙｎｔｈａ（登録商標））によるチャレンジに際して抗ｈＦＶＩＩＩの抗体応答が高まらず、実験の経過にわたってこれらの動物におけるｈＦＶＩＩＩＩタンパク質への寛容の発生を示唆する。

全般
本明細書において開示される方法の実践に加えて、組成物の調製および使用は、特別の指示のない限り、当業者の技能の範囲内にあるような、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および分析、計算機化学、細胞培養、組換ＤＮＡならびに関連する分野における従来の技法を用いる。これらの技法は文献中で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ：ＡＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９およびＴｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴＰＲＯＴＯＣＯＬＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８７および定期的な改訂版；シリーズ、ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ、ＣＨＲＯＭＡＴＩＮＳＴＲＵＣＴＵＲＥＡＮＤＦＵＮＣＴＩＯＮ、Ｔｈｉｒｄｅｄｉｔｉｏｎ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳＩＮＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ」（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎａｎｄＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭＥＴＨＯＤＳＩＮＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，「ＣｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、直線状または環状の立体配座、および一本鎖または二本鎖の形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語はポリマーの長さに関して限定するものとして解釈するべきではない。これらの用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体に加えて、塩基部分、糖部分および／またはリン酸塩部分中で修飾されたヌクレオチド（例えばホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対を作る特異性を有し、すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を作るだろう。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体または修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーへも適用される。

「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝情報の交換のプロセス（非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない）を指す。本開示の目的のために、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば相同性指向修復機構経由の細胞中での二本鎖切断の修復の間に起こるような、交換の特殊化された形態を指す。

本開示のある特定の方法において、本明細書において記載されるような１つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、既定の部位（例えばアルブミン遺伝子）で標的配列（例えば細胞クロマチン）中に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。ＤＳＢは、本明細書において記載されるようなコンストラクトの組み込みを媒介する。随意に、コンストラクトは、切断の領域中のヌクレオチド配列への相同性を有する。発現コンストラクトは物理的に組み込まれ得るか、または、あるいは、発現カセットは相同組換え経由の切断の修復のためにテンプレートとして使用され、発現カセットとしてヌクレオチド配列のすべてまたは一部の細胞クロマチンの中への導入をもたらす。したがって、細胞クロマチン中の第１の配列は改変することができ、およびある特定の実施形態において、発現カセット中に存在する配列へと変換することができる。したがって、「置き換える」または「置き換え」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別のものによる置き換え（すなわち情報的な意味での配列の置き換え）を表わし、必ずしもあるポリヌクレオチドの別のものによる物理的または化学的な置換を要求しないことが理解され得る。

本明細書において記載される方法のうちの任意のものにおいて、外来性ヌクレオチド配列（「発現コンストラクト」または「発現カセット」または「ベクター」）は、対象となる領域中のゲノム配列へ相同であるが同一ではない配列を含有することができ、それによって相同組換えを刺激して対象となる領域中に同一でない配列を挿入する。したがって、特定の実施形態において、対象となる領域中の配列へ相同な発現カセット配列の部分は、置き換えられるゲノム配列へ約８０〜９９％の間（またはその間の任意の整数）の配列同一性を示す。他の実施形態において、例えば発現カセットの相同性領域と１００を上回る連続した塩基対のゲノム配列との間で、１つのヌクレオチドのみが異なるならば、発現カセットとゲノム配列との間の相同性は９９％以上である。ある特定の事例において、発現カセットの非相同な部分は、新しい配列が対象となる領域の中へ導入されるように、対象となる領域中に存在しない配列を含有することができる。これらの事例において、非相同な配列には、一般的には、対象となる領域中の配列へ相同または同一の５０〜１，０００塩基対（またはその間の任意の整数値）または１，０００を超える塩基対の任意の数字の配列が隣接する。

「配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、直線状、環状または分岐状であり得、一本鎖または二本鎖であり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。「導入遺伝子」という用語は、ゲノムの中へ挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、２〜１００，０００，０００ヌクレオチドの間（またはその間もしくはその上の任意の整数値）の長さ、好ましくは約１００〜１００，０００ヌクレオチドの間（またはその間の任意の整数）の長さ、より好ましくは約２０００〜２０，０００ヌクレオチドの間（またはその間の任意の値）の長さ、およびさらにより好ましくは約５〜１５ｋｂの間（またはその間の任意の値）の長さであり得る。

「染色体」は、細胞のゲノムのすべてまたは一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしばその核型（それは細胞のゲノムを含むすべての染色体のコレクションである）によって特徴づけられる。細胞のゲノムは１つまたは複数の染色体を含み得る。

「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク複合体または他の構造である。エピソームの例としては、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。本明細書において記載される肝臓の特異的なコンストラクトは、エピソームとして維持され得るか、または、あるいは、細胞の中へ安定的に組み込まれ得る。

「外来性」分子は、細胞中に通常は存在しないが、１つまたは複数の遺伝学的方法、生化学的な方法または他の方法によって細胞の中へ導入できる分子である。「細胞中での通常の存在」は、細胞の特定の発生ステージおよび環境条件に関して決定される。したがって、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は成体筋細胞に関しては外来性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非熱ショック細胞に関して外来性分子である。外来性分子は、例えば、正常に機能しない内在性分子の機能バージョンまたは通常は機能的な内在性分子の正常に機能しないバージョンを含むことができる。

外来性分子は、とりわけ、小分子（コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等）またはマクロ分子（タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つもしくは複数を含む任意の複合体等）であり得る。核酸にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれ、一本鎖または二本鎖であり得、直線状、分岐状または環状であり得、任意の長さであり得る。核酸には、二重らせんを形成できるものに加えて、三重らせんを形成する核酸が含まれる。例えば米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質には、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、脱メチル化酵素、アセチル化酵素、脱アセチル化酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、脱ユビキチン化酵素、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。

外来性分子は、内在性分子と同じタイプの分子（例えば外来性のタンパク質または核酸）であり得る。例えば、外来性核酸は、感染するウイルスゲノム、細胞の中へ導入されるプラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常はない染色体を含み得る。外来性分子の細胞の中への導入のための方法は当業者に公知であり、これらには、脂質媒介性移入（すなわちリポソーム、中性脂肪および陽イオン性脂質が含まれる）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子爆撃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外来性分子は内在性分子と同じタイプの分子でもあり得るが、細胞が由来するもののとは異なる種に由来し得る。例えば、ヒト核酸配列は、もとはマウスまたはハムスターに由来する細胞株の中へ導入され得る。外来性分子の植物細胞の中への導入のための方法は当業者に公知であり、これらには、プロトプラスト形質転換、炭化ケイ素（例えばＷＨＩＳＫＥＲＳ（商標））、アグロバクテリウム媒介性形質転換、脂質媒介性移入（すなわちリポソーム、中性脂質および陽イオン性脂質が含まれる）、エレクトロポレーション、直接注射、細胞融合、粒子爆撃（例えば「遺伝子銃」を使用して）、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。

これとは対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生ステージの特定の細胞中に通常は存在するものである。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞内小器官のゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。追加の内在性分子には、タンパク質（例えば転写因子および酵素）が含まれ得る。

本明細書において使用される時、「外来性核酸の産物」という用語には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物、例えば転写産物（ＲＮＡ等のポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）の両方が含まれる。

「融合」分子は、好ましくは共有結合で２つ以上のサブユニット分子が連結される分子である。サブユニット分子は、同じ化学的タイプの分子であり得るかまたは異なる化学的タイプの分子であり得る。融合分子の例としては、融合タンパク質（例えばタンパク質ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物）、切断ドメインと作動するように結合されたポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメイン（例えばｓｇＲＮＡ）との間の融合物、および融合核酸（例えば融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるがこれらに限定されない。

細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって（そこで、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて融合タンパク質を生成する）、生じ得る。トランススプライシング、ポリペプチド切断、およびポリペプチドライゲーションも、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの細胞への送達のための方法は、本開示中の他のところで提示される。

本開示の目的のための「遺伝子」には、遺伝子産物（下を参照）をコードするＤＮＡ領域に加えて、遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域（かかる調節配列がコーディング配列および／または転写配列へ隣接するか否かにかかわらず）が含まれる。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム侵入部位等）、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、バウンダリーエレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」は、遺伝子中に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたは他のタイプのＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、プロセッシング（キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集等）によって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）および糖鎖付加によって修飾されるタンパク質も含まれる。

遺伝子発現の「修飾」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現の修飾には遺伝子活性化および遺伝子抑制が含むまれ得るがこれらに限定されない。ゲノム編集（例えば切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用して発現を修飾することができる。遺伝子不活性化は、本明細書において記載されるようなＺＦＰ、ＴＡＬＥまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞に比較した、遺伝子発現の任意の低減を指す。したがって、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。

「対象となる領域」は、外来性分子を結合することが所望される細胞クロマチンの任意の領域（例えば遺伝子または遺伝子内のもしくは遺伝子に近接する非コーディング配列等）である。結合は標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えのためのものであり得る。例えば、対象となる領域は、染色体、エピソーム、細胞内小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）または感染ウイルスゲノム中に存在し得る。対象となる領域は、遺伝子のコーディング領域内、転写される非コーディング領域（例えばリーダー配列、トレーラー配列またはイントロン等）内、またはコーディング領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。対象となる領域は、単一のヌクレオチド対ほどの小ささ、もしくは２，０００ヌクレオチド対までの長さ、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。

「真核生物」細胞には、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、および幹細胞（万能性および多能性）が含まれるヒト細胞（例えばＴ細胞）が含まれるがこれらに限定されない。

「作動するようなリンケージ」および「作動するように連結される」（「または作動可能に連結される」）という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメント等）の並置に関して互換的に使用され、そこで、両方の構成要素が正常に機能し、少なくとも構成要素のうちの１つが少なくとも他の構成要素の１つに対して発揮される機能を媒介する可能性を許容するように、構成要素はアレンジされる。例としては、転写調節配列が１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコーディング配列の転写のレベルを制御するならば、転写調節配列（プロモーター等）はコーディング配列へ作動するように連結されている。転写調節配列は、一般的にはコーディング配列とシスで作動するように連結されるが、それに直接的に隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、たとえそれらが連続していなくても、コーディング配列へ作動するように連結される転写調節配列である。

タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸に同一でないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をまだ保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する生来の分子について、より多い、より少ないもしくは同じ残基数を保持することができる、および／または、１つもしくは複数のアミノ酸置換もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えばコーディング機能、別の核酸へハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、当技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定する方法は周知である。例えば、Ｂドメイン欠失ヒト第ＶＩＩＩ因子は、全長の第ＶＩＩＩ因子タンパク質の機能的断片である。

ポリヌクレオチドの「ベクター」または「コンストラクト」は、遺伝子配列を標的細胞へ移入させることができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、「発現コンストラクト」、「発現カセット」、および「遺伝子移入ベクター」は、対象となる遺伝子の発現を指令でき、標的細胞へ遺伝子配列を移入できる、任意の核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、クローニングベヒクルおよび発現ベヒクルに加えて、組み込みベクターを包含する。

「被験体」および「患者」という用語は互換的に使用され、哺乳動物（ヒト患者および非ヒト霊長動物等）に加えて、実験動物（ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物等）を指す。したがって、「被験体」または「患者」という用語は、本明細書において使用される時、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳動物の患者または被験体を意味する。本発明の被験体には、障害に罹患するものが含まれる。

肝臓特異的発現コンストラクト
肝細胞における導入遺伝子の発現の指令における使用（後続する発現カセット（複数可）の被験体へのインビボの投与（例えば肝臓への送達）が含まれる）のための発現カセット（コンストラクト）が本明細書において記載される。発現コンストラクトはエピソームとして維持され、導入遺伝子の発現を染色体外で駆動し得るかまたは、あるいは、発現コンストラクトは、例えばヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって肝細胞のゲノムの中へ組み込まれ得る。

ポリヌクレオチド発現コンストラクトは、エンハンサー配列、プロモーター配列、および１つまたは複数の導入遺伝子を含む。随意に、以下の：イントロン性配列、ポリアデニル化配列、および／またはシグナルペプチドのうちの１つまたは複数が含まれる。任意のエンハンサー配列が本明細書において記載される発現コンストラクト中で使用され得る。ある特定の実施形態において、エンハンサーは、野生型セルピン１エンハンサーまたは修飾セルピン１エンハンサーである（Ｃｈｕａｈｅｔａｌ．，（２０１４）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｙ，２２，１６０５−１６１３，；Ｎａｉｒｅｔａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ，１２３，３１９５−３１９９）。

好ましい実施形態において、セルピン１エンハンサーは、野生型に比較して１つまたは複数の突然変異（例えば点突然変異）を含み、例えば、セルピン１エンハンサーは、図５中に示されるような１つまたは複数のヌクレオチド修飾（すなわち配列番号：１〜１３のうちの任意のものにおいて示される配列の残基１、５、１４、３２および／または３９のうちの１つまたは複数でのヌクレオチドの修飾）を含有する。ある特定の実施形態において、セルピン１エンハンサーは、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、５、１４および３２（ＣＲＭＳＢＳ１と表記されるコンストラクト）での修飾を含む一方で、他の実施形態において、セルピン１エンハンサーは、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、１４、３２および３９（ＣＲＭＳＢＳ２と表記されるコンストラクト）での修飾を含む。例示的なエンハンサー配列は、以下に示される。
ＣＲＭＳＢＳ１（配列番号：３５）：
５’ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＧＣＣＣＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＴＣＡＣ
ＣＲＭＳＢＳ２（配列番号：３６）：５’
ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＣＣＣＣＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡＡＧＴＴＣＡＣ

同様に、任意のプロモーター配列が本発明の発現カセット中で使用され得る。ある特定の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは誘導可能プロモーターまたは組織特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。ある特定の実施形態において、プロモーターはトランスサイレチン最小プロモーター（ＴＴＲｍ）プロモーターである。他の実施形態において、プロモーターはα−１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターである。

本明細書において記載されるポリヌクレオチドのうちの任意のものは、イントロン性配列をさらに随意に含み得る。ある特定の実施形態において、例えば図６、７、１９および２０の下部パネル中で示されるように、発現コンストラクトは短縮キメライントロン（Ｔ−キメライントロン）配列を含む。Ｔ−キメライントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋＵ４７１２０）中のキメライントロンの短縮バージョンである。ｐＣＩ−ｎｅｏ中のキメライントロンは、ヒトβ−グロビン遺伝子からの５’スプライスドナー部位ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のブランチポイントおよび３’アクセプター部位である。Ｔ−キメライントロンは、５’スプライスドナーとブランチポイントとの間で４５ｂｐの欠失を含有する。さらに他の実施形態において、発現コンストラクトは、変異ＭＶＭイントロン配列（例えば図１２、１３および１４中で示される突然変異のうちの１つまたは複数（配列番号：１５〜１７））を含む。

あるいは、例えば図６、７、１９および２０の中央パネルにおいて描写されるコンストラクト中で示されるように、発現コンストラクトは、本明細書において記載されるようなイントロン性配列を欠如し得る。第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む例示的なコンストラクトは注釈付きで以下に示され、任意の導入遺伝子によりＦ８導入遺伝子を置き換えることができ、プロモーターおよびインスレーター配列が本明細書において記載されるようにさらに修飾され得ることは明らかだろう。
ｈＦ８ｃＤＮＡ、イントロンなし（プロモーターモジュール、ポリＡおよびＩｎｓ、ＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし、を含む、完全な配列）（配列番号：３４）：

5’

第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子を含む他の例示的なコンストラクトは注釈付きで以下に示され、任意の導入遺伝子によりＦ８導入遺伝子を置き換えることができ、プロモーターおよびインスレーター配列が本明細書において記載されるようにさらに修飾され得ることも明らかだろう。

ｈＦ８ｃＤＮＡ、イントロンを含む（プロモーターモジュール、ポリＡおよびＩｎｓ、ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３、を含む、完全な配列）（配列番号：３７）：

好ましい実施形態において、本明細書において記載されるコンストラクトは、図１、２、４、６、７、１０、１９、２０および２５中に示されるように、インスレーター（スペーサー）配列を含む。例示的なインスレーター配列は、Ｉｎｓ１：５’ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡ（配列番号：２８）；Ｉｎｓ２：５’ＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴ（配列番号：２９）；Ｉｎｓ３：５’ＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧ（配列番号：３０）およびＩｎｓ４：５’ＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＡ（配列番号：３８）を含む。

明らかであるように、任意の導入遺伝子は、本明細書において記載されるコンストラクト中で使用できる。さらに、本明細書において記載されるコンストラクトの個別の構成要素（プロモーター、エンハンサー、インスレーター、導入遺伝子など）は混合され、任意の組み合わせで調和し得る。

本明細書において記載されるコンストラクトは、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクター内に含有され得る。コンストラクトはエピソームとして維持され得るか、または細胞のゲノムの中へ組み込まれ得る（例えばヌクレアーゼを媒介とした標的化組み込み経由で）。

非ウイルスベクターには、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡＭＣ、むき出しの核酸、および送達ベヒクル（リポソーム、ナノ粒子またはポロキサマー等）と複合体化した核酸が含まれる。本明細書において記載される発現カセットの保有に使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。宿主ゲノム中の組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法により可能で、ヌクレアーゼ媒介性組み込みによって本明細書において記載されるように促進され得る。

特定の好ましい実施形態において、コンストラクトはアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターまたはベクター系中に含まれ、それらは、エピソームとして維持され得るか、または肝細胞のゲノムの中へ組み込まれ得る（例えばヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み経由で）。組換えＡＡＶベクターの構築は、多くの出版物（米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）が含まれる）中にある。

したがって、特定の実施形態において、発現コンストラクトはＡＡＶコンストラクト上で保有され、本明細書において記載されるような発現コンストラクトエレメント（例えばエンハンサー、プロモーター、随意のイントロン、導入遺伝子など）に隣接する５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲをさらに含む。随意に、スペーサー分子も、発現コンストラクトの構成要素の１つまたは複数の間に、例えば５’ＩＴＲとエンハンサーとの間に、および／またはポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲとの間に組入れられる。スペーサーは相同性アームとして機能して、安全領域遺伝子座（例えばアルブミン）の中へ組換えを促進することができる。ある特定の実施形態において、コンストラクトは、図１、２、４、６、７、１０、１８、１９、２０または２５のうちの任意のもの中で示されるようなコンストラクトである。

ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、本明細書において記載されるような任意のＡＡＶに由来し得る。ある特定の実施形態において、ＡＡＶベクターは、欠損のある非病原性のパルボウイルスアデノ随伴タイプ２ウイルスに由来する。すべてのかかるベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐの逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムの中へ組み込みに起因する、効率的な遺伝子移入および安定的な導入遺伝子送達は、本ベクター系のための重要な特色である（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ３５１：９１１７１７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。他のＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ．１０ならびに任意の新規ＡＡＶ血清型が含まれる）も、本発明に従って使用することができる。いくつかの実施形態において、キメラＡＡＶが使用され、そこで、ウイルス核酸のＬＴＲ配列のウイルス起源はカプシド配列のウイルス起源へ異種である。非限定例としては、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲおよびＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に由来するカプシドを備えたキメラウイルス（すなわちそれぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８およびＡＡＶ２／９）が挙げられる。

レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組み合わせに基づくものが含まれる（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照）。

本明細書において記載されるコンストラクトは、アデノウイルスベクター系の中へも取り込まれ得る。アデノウイルスベースのベクターは多くの細胞タイプにおいて非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求しない。かかるベクターにより、高力価および高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生することができる。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ９４：２２１２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは遺伝子療法試験において使用された最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率がＭＦＧ−Ｓパッケージベクターについて観察された（Ｅｌｌｅｍｅｔａｌ．，ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７））。

複製欠損性組換えアデノウイルスのベクター（Ａｄ）も本明細書において記載されるポリヌクレオチドと共に使用され得る。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄＥ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作され、続いて、複製欠損ベクターは、欠失遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターは、複数のタイプの組織（無分裂の分化細胞（肝臓および腎臓および筋肉において見出されるもの等）が含まれる）をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは高い保有能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫付与のためのポリヌクレオチド療法を包含していた（Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加の例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ２４：１５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．９：７１０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。

パッケージング細胞を使用して、宿主細胞を感染できるウイルス粒子を形成する。かかる細胞にはＨＥＫ２９３細胞およびＳｆ９細胞が含まれ、それらはＡＡＶおよびアデノウイルスを使用してパッケージングすることができ、ψ２細胞またはＰＡ３１７細胞はレトロウイルスをパッケージングする。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子の中へ核酸ベクターをパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび続いて行われる宿主の中への組み込み（適用可能なならば）のために要求される最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において典型的に使用されるＡＡＶベクターは、パッケージングおよび宿主ゲノムの中への組み込みのために要求される、ＡＡＶゲノムからの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを保持する。ウイルスＤＮＡは、細胞株（それは他のＡＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐおよびｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する）中でパッケージングされる。細胞株はヘルパーとしてアデノウイルスでも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は例えば熱処理によって低減させることができ、アデノウイルスはＡＡＶよりも熱処理へより感受性がある。いくつかの実施形態において、ＡＡＶはバキュロウイルス発現系を使用して産生される。

多くの遺伝子療法の適用において、特定の組織タイプへの高度の特異性を備えた遺伝子療法ベクターが送達されることが所望される。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現することによって、既定の細胞タイプについての特異性を有するように修飾され得る。リガンドは対象となる細胞タイプ上に存在することが既知の受容体について親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーマウス白血病ウイルスをｇｐ７０へ融合されたヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスはヒト表皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告する。この原理は他のウイルス−標的細胞のペアへ拡張することができ、そこで、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面の受容体についてのリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、線状ファージは、実質的には任意の選ばれた細胞受容体について特異的な結合親和性を有する抗体断片（例えばＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上の記載は主としてウイルスベクターへ適用されるが、同じ原則を非ウイルスベクターへ適用することができる。かかるベクターは特異的な取込み配列（それは特異的な標的細胞による取込みを容易にする）を含有するように操作され得る。

本明細書において記載されるポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非天然の塩基および／または骨格を含み得る。特に、本明細書において記載されるような発現カセットはメチル化シトシンを含んで、対象となる領域において転写静止の状態を達成することができる。

さらに、本明細書において記載されるような発現コンストラクトは、追加の転写配列、翻訳調節配列または他の配列（例えばコザック配列、追加のプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム侵入部位、２Ａペプチドをコードする配列、フューリン切断部位および／またはポリアデニル化シグナル）も含み得る。さらに、対象となる遺伝子の調節エレメントをレポーター遺伝子へ作動可能に連結して、モザイク遺伝子（例えばレポーター発現カセット）を生成することができる。

導入遺伝子
本明細書において記載されるコンストラクトは、任意の導入遺伝子の肝臓への送達のために使用され得る。例示的な導入遺伝子（対象となる遺伝子および／または外来性配列とも称される）には、任意のポリペプチドコーディング配列（例えばｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および様々なタイプの発現コンストラクトも含まれるがこれらに限定されない。マーカー遺伝子には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色タンパク質または蛍光タンパク質または発光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、ならびに細胞増殖および／または遺伝子増幅の促進を媒介するタンパク質（例えばジヒドロ葉酸還元酵素）が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたは任意の検出可能なアミノ酸配列のうちの１つまたは複数のコピーが含まれる。

好ましい実施形態において、導入遺伝子は細胞における発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、これには、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のもののうちの任意のものの機能的断片が含まれるがこれらに限定されない。コーディング配列は例えばｃＤＮＡであり得る。

ある特定の実施形態において、導入遺伝子（複数可）は、任意の遺伝性疾患（リソソーム貯蔵障害（例えばゴーシェ病、ファブリー病、ハンター病、ハーラー病、ニーマン−ピック病など）、代謝障害、および／または血液疾患（血友病および異常血色素症等）が含まれるがこれらに限定されないものなど）において、欠如または欠損するタンパク質の機能的なバージョンをコードする。例えば米国公報第２０１４００１７２１２号および同第２０１４００９３９１３号；米国特許第９，２５５，２５０号および同第９，１７５，２８０号を参照されたい。

例えば、導入遺伝子は、遺伝性疾患を有する被験体において欠如するかまたは非機能的なポリペプチドをコードする配列を含み、遺伝性疾患には、以下のもの：軟骨異栄養症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＯＭＩＭ番号１０２７００）、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α−１アンチトリプシン欠損症、α−サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈源性右室異形成症、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、β−サラセミア、青色ゴムまり様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉性異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えばＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β−グロビンの第６コドンにおけるヘモグロビンＣ突然変異（ＨｂＣ）、血友病、ハンチントン舞踏病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー−ギーディオン症候群、白血球接着不全症（ＬＡＤ、ＯＭＩＭ番号１１６９２０）、白質萎縮症、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎原発性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン−ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー−ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン−テイビ症候群、サンフィリポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュバックマン症候群、鎌型赤血球症（鎌状赤血球細胞貧血）、スミス−マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル−リンダウ病、ワールデンブルヒ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット−アルドリッチ症候群、Ｘ染色体性リンパ増殖症候群（ＸＬＰ、ＯＭＩＭ番号３０８２４０）、後天性免疫不全症、リソソーム蓄積症（例えばゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病およびテイ−サックス病）、ムコ多糖症（例えばハンター病、ハーラー病）、異常血色素症（例えば鎌型赤血球症、ＨｂＣ、α−サラセミア、β−サラセミア）および血友病のうちの任意のものが含まれるがこれらに限定されない。

本明細書において記載されるように発現され得るタンパク質（短縮バージョン等のその機能的断片が含まれる）の非限定例としては、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォンウィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、抗トロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害因子、プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡサブユニットおよび／またはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース６−リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ−１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質（ＮＡＧＳ（Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ）およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸合成酵素）、ＡＳＬ（アルギニノコハク酸リアーゼ酸性リアーゼ）および／またはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、および／または溶質キャリアファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸キャリア）タンパク質等、ＵＧＴ１Ａ１またはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼポリペプチドＡ１、フマリルアセトアセテートヒドロリアーゼ（ＦＡＨ）、アラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）タンパク質、リポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、操作されたヌクレアーゼ、操作された転写因子および／または治療用一本鎖抗体が挙げられる。

ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、標的化組み込みを受けた細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上で記載される）および追加機能性をコードする連結された配列を含み得る。マーカー遺伝子の非限定例としては、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）および同種のものが挙げられる。

本明細書において記載されるコンストラクトは、非コーディング導入遺伝子の送達のためにも使用され得る。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列も、標的化挿入のために使用され得る。

ある特定の実施形態において、導入遺伝子は、１ｋｂより大きい長さ、例えば２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはその間の任意の値）の配列（例えばコーディング配列、導入遺伝子とも称される）を含む。導入遺伝子は、１つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位も含み得る。

組み込まれる（例えばヌクレアーゼ媒介性組み込み経由で）場合に、内在性遺伝子のすべてもしくはいくらかが発現するように、またはまったく発現しないように、導入遺伝子は内在性遺伝子の中へ挿入され得る。

ヌクレアーゼ
上で指摘されるように、発現カセットはエピソームとして維持され得るか、または細胞のゲノムの中へ組み込まれ得る。組み込みはランダムであり得る。好ましくは、導入遺伝子コンストラクト（複数可）の組み込みは、１つまたは複数のヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系、およびホーミングエンドヌクレアーゼ）による標的遺伝子の切断に後続して標的化され、コンストラクトは、相同性指向修復（ＨＤＲ）によってまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動性プロセスの間の末端捕捉によってのいずれかで組み込まれる。例えば米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００５００６４４７４号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号；第２０１３０１９６３７３号および第２０１５００５６７０５号（それらの開示はその全体をすべての目的のために参照することにより本明細書に援用される）を参照されたい。

任意のヌクレアーゼが、導入遺伝子発現コンストラクトの標的化組み込みのために使用され得る。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含み、それはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。例えば米国特許第９，２５５，２５０号；同第９，２００，２６６号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第９，１５０，８４７号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９４５，８６８号；同第８，７０３，４８９号；同第８，５８６，５２６号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号を参照されたい。

他の実施形態において、ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮを含み、それはＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインおよび切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。例えば米国特許第８，５８６，５２６号および米国公報第２０１３０１９６３７３号を参照されたい。

なおさらなる実施形態において、ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系を含み、それは、標的部位および１つまたは複数の切断ドメインの認識のための単一のガイドＲＮＡを含む。例えば米国特許公報第２０１５００５６７０５号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄｅｔａｌ，（２０１５）ＧｅｎｏｍＢｉｏ１６：２５１を参照）。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｆｐ１系の両方を指すことが理解される。

ヌクレアーゼの切断ドメインは、野生型であるかまたは変異され得る（強制的なヘテロダイマーを形成する天然に存在しない（操作された）切断ドメインを含む）。例えば米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号および米国公報第２０１１０２０１０５５号を参照されたい。

ヌクレアーゼ（複数可）は、標的部位において１つまたは複数の二本鎖および／または一本鎖の切断を行い得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメイン（例えばＦｏｋＩおよび／またはＣａｓタンパク質）を含む。例えば米国特許第９，２００，２６６号；同第８，７０３，４８９号およびＧｕｉｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．（２０１４）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．３２（６）：５７７−５８２を参照されたい。触媒的に不活性な切断ドメインを、ニッカーゼとして作用する触媒的に活性のあるドメインと組み合わせて、一本鎖切断を生じさせることができる。したがって、２つのニッカーゼを組み合わせて使用して、特異的な領域において二本鎖切断を生じさせることができる。追加のニッカーゼも当技術分野において公知である（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｙｅｔａｌ．（２０１６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４４（２）：ｅ１１．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｖ８７８．Ｅｐｕｂ２０１５Ｏｃｔ１９）。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは安全領域遺伝子（例えばＣＣＲ５、Ｒｏｓａ、アルブミン、ＡＡＶＳ１など）を切断する。例えば米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；米国特許公報第２００３０２３２４１０号；同第２００５０２０８４８９号；同第２００５００２６１５７号；同第２００６００６３２３１号；同第２００８０１５９９９６号；同第２０１０００２１８２６４号；同第２０１２００１７２９０号；同第２０１１０２６５１９８号；同第２０１３０１３７１０４号；同第２０１３０１２２５９１号；同第２０１３０１７７９８３号および同第２０１３０１７７９６０号を参照されたい。好ましい実施形態において、発現カセットが肝細胞の内在性アルブミン遺伝子座の中へ組み込まれるように、ヌクレアーゼは内在性アルブミン遺伝子を切断する。アルブミン特異的ヌクレアーゼは、例えば米国特許第９，１５０，８４７号；ならびに米国公報第２０１３０１７７９８３号および同第２０１５００５６７０５号中に記載される。

送達
本明細書において記載されるコンストラクト（および／またはヌクレアーゼ）は、任意の好適な手段によってインビボでまたはエクスビボで任意の細胞タイプの中へ、好ましくは肝臓へ送達され得る（肝臓への送達）。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合に、ヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドおよび／もしくはタンパク質の形態（例えば非ウイルスベクター（複数可）、ウイルスベクター（複数可）を使用して）において、ならびに／またはＲＮＡの形態（例えばｍＲＮＡとして）において、送達され得る。

核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、顕微注射、微粒子銃、ビロゾーム、リポソーム、イムノリポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、むき出しのＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤促進性取込みが含まれる。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用するソノポレーションも、核酸の送達のために使用され得る。追加の例示的な核酸送達系には、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＩｎｃ．によって提供されるものが含まれる（例えばＵＳ６００８３３６を参照）。

好ましい実施形態において、発現コンストラクトはＡＡＶベクターである。随意のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡの形態で、または１つまたは複数のウイルスベクター（ＡＡＶ、Ａｄなど）を使用して、投与され得る。投与は任意の手段によることができ、そこでポリヌクレオチドは所望される標的細胞へ送達される。インビボおよびエクスビボの両方の方法が企図される。門脈への静脈注射は投与の好ましい方法である。他のインビボの投与モードには、例えば肝小葉もしくは胆管の中への直接注射およびに肝臓から遠位の静脈注射（肝動脈を介するものが含まれる）、肝実質の中への直接注射、肝動脈経由の注射、ならびに／または胆管系を介する逆行性注射が含まれる。エクスビボ投与モードには、切除された肝細胞または肝臓の他の細胞をインビトロで形質導入し、後続して、形質導入された切除肝細胞をヒト患者の門脈血管、肝実質または胆管系の中へ戻して点滴することが含まれる（例えばＧｒｏｓｓｍａｎｅｔａｌ．，（１９９４）ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，６：３３５−３４１を参照）。

２つ以上のポリヌクレオチド（例えば本明細書において記載されるようなコンストラクトおよびポリヌクレオチドの形態でのヌクレアーゼ）の送達を包含する系において、２つ以上のポリヌクレオチドは、同じベクターおよび／または異なるベクターのうちの１つまたは複数を使用して送達される。例えば、ポリヌクレオチドの形態でのヌクレアーゼはｍＲＮＡの形態で送達され得、本明細書において記載されるような肝臓特異的コンストラクトは、他の形式（ウイルスベクター（例えばＡＡＶ）、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、直線状ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子および同種のもの等）経由で送達され得る。

薬学的に許容されるキャリアは、投与されている特定の組成によって、加えて、組成物の投与に使用される特定の方法によって、部分的に決定される。したがって、下で記載されるように、入手可能な医薬組成物の様々な好適な製剤がある（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、１７ｔｈｅｄ．，１９８９を参照）。

投与される発現カセット（および随意のヌクレアーゼ（複数可）、および／または修飾された細胞）の有効量は、患者間で変動するだろう。したがって、有効量は組成物（例えば細胞）を投与する医師によって最も良好に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。治療用ポリペプチドの血清、血漿または他の組織内レベルの分析、および投与の前の初期のレベルへの比較は、投与されている量が低すぎるか、正しい範囲内か、または高すぎるかどうかを決定することができる。初期の投与および続いて行われる投与のために好適なレジームも変動するが、初期の投与によって代表され、必要であるならば続いて行われる投与が後続する。続いて行われる投与は、変動するインターバルで（毎日〜毎年〜数年毎の範囲で）投与され得る。当業者は、送達ベクターの免疫抑制による形質導入の阻害または遮断を避けるために、適切な免疫抑制性技法が推奨され得ることを認識するだろう（例えばＶｉｌｑｕｉｎｅｔａｌ．，（１９９５）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒ．，６：１３９１−１４０１を参照）。

エクスビボおよびインビボの投与のための製剤には、液体または乳化された液体中の懸濁物（例えば遺伝的に修飾された細胞、リポソームまたはナノ粒子の）が含まれる。活性成分は、多くの場合、薬学的に許容され活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。好適な賦形剤には、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは同種のもの、およびその組み合わせが含まれる。加えて、組成物は、少量の補助物質（湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨバッファー剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を促進する他の試薬等）を含有し得る。

適用
本明細書において開示される方法および組成物は、疾患において欠如もしくは欠損する産物を発現するか、またはそうでなければ疾患を治療もしくは防止する、導入遺伝子の供与による任意の疾患についての治療法の提供のためのものである。細胞はインビボで修飾され得るか、またはエクスビボで修飾され、続いて被験体へ投与され得る。したがって、方法および組成物はかかる遺伝性疾患の治療および／または予防を提供する。

以下の実施例は本開示の例示的な実施形態を包含し、そこで、随意に使用されるヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む。これが例示のみの目的のためであり、他のヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを備えたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然に存在するかもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインと異種のホーミングエンドヌクレアーゼ切断ドメインの融合物、および／またはメガヌクレアーゼとＴＡＬＥタンパク質の融合物が使用され得ることが認識されるだろう。加えて、他のベクター（ＡＡＶ以外）上に本明細書において記載されるような発現コンストラクトを保有して、欠損タンパク質産生によって行われる障害の治療および／または予防において同じ結果を生ずることができることが認識されるだろう。

実施例１：方法
ＤＮＡコンストラクト
ヒト第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡを保有する例示的なコンストラクトの開発のために行われた全体構造およびアプローチを、図１中で描写する。コンストラクトは、肝臓特異的エンハンサー、肝臓特異的プロモーター、随意のイントロン、インスレーター配列および導入遺伝子（例えばコドン至適化ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失導入遺伝子）、合成ポリアデニル化配列、スペーサーおよび５’／３’逆方向末端反復を含む。すべてのコンストラクトをルーチンの分子生物学クローニング法を使用してアセンブルした。

図１中で示されるように、ベクター開発の間にいくつかのステップが後続した。製造の間に得られるウイルス収量に対するコンストラクト構成要素の効果を、最初に検討した。コンストラクト中のインスレーター領域の配列の影響を、以下に示されるような３つの異なる可能なインスレーター配列の使用によって調査した。Ｉｎｓ１：５’ＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡ（配列番号：２８）、Ｉｎｓ２：５’ＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴ（配列番号：２９）、およびＩｎｓ３：５’ＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧ（配列番号：３０）。次いでインスレーター領域を導入遺伝子発現カセットの中へ挿入し、そこで、５’ＩＴＲ配列とエンハンサー／プロモーター配列の開始との間に使用されるインスレーターは、常にＩｎｓ１であった。しかしながら、コンストラクトの３’末端で、Ｉｎｓ２配列またはＩｎｓ３配列のいずれかを、ＳＰＡ５１合成ポリＡ配列（５’ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴ（配列番号：３１））へ、以下のように連結した。Ｉｎｓ２−ＳＰＡ５１：５’ＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴ（配列番号：３２）、およびＩｎｓ３−ＳＰＡ５１：５’ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＧＡＴＣＧＧＧ（配列番号：３３）。いくつかの実施形態において、Ｉｎｓ４をＳＰＡ５１へ連結する。

Ｉｎｓ配列バリアントを、ＳｅｒｐＥ−ＴＴＲｍ−ＭＶＭプロモーター領域がハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ、ＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ、同書）により置き換えられた発現コンストラクト中でも使用した。これらのコンストラクトを図２中で図示する。次いでこれらのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞を使用してＡＡＶ２／６粒子の中へパッケージングし、そこで、収量は２つの細胞工場からのものである（Ｙｕａｎｅｔａｌ．，（２０１１）ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ．，２２，６１３−６２４，２０１１）。修飾インスレーター配列を含有するコンストラクトについての収量（ベクターゲノム）は、親プロモーター領域を含むコンストラクトに対して、およそ３ｌｏｇ高いことが見出され、そこで、その発現カセットは、５’末端および３’末端でのＩｎｓ１インスレーター領域およびＩｎｓ３インスレーター領域がそれぞれ隣接していた（図３）。加えて、これらのインスレーター配列を、ステップ２において下で記載される、修飾されたＣＲＭＳＢＳ１コンストラクトおよびＣＲＭＳＢＳ２コンストラクトの中へも挿入し（図１９および２０）、ウイルス収量について試験した（図２２）。このデータから、親コンストラクトに比較して、新しいコンストラクトについてのウイルス収量が８〜１０倍改善したことが示された。

ステップ２において、点突然変異をセルピン１エンハンサー中に導入して、第１の２つの派生ベクターＣＲＭＳＢＳ１およびＣＲＭＳＢＳ２を生成した（図４）。これらのベクターはそれらのエンハンサー配列で異なり、そこで、点突然変異は図５中に示されるように導入される。行われた特異的な変化は以下の通りである。ＣＲＭＳＢＳ１については、図５中に描写されるように１、２、３および４として表示される、以下の置換がそれぞれ行われた。１＝ＧからＡ、２＝ＣからＧ、３＝ＴからＣ、および４＝ＧからＡ。同様に、ＣＲＭＳＢＳ２については、位置１、３、４および５は以下のように修飾された。１＝ＧからＡ、３＝ＴからＣ、４＝ＧからＡ、および５＝ＣからＴ。

ステップ３において、コンストラクトを作製して、ベクター中のイントロン配列を調査した。図６および７中で示されるように、ＣＲＭＳＢＳ２ベクターおよびＣＲＭＳＢＳ２ベクター中のイントロン配列を、ＭＶＭイントロンの除去によって修飾した（「ＣＲＭＳＢＳ１イントロンなし」、図６、および「ＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし」、図７）。別のバリアントにおいて、Ｔ−キメライントロン配列を試験した（「ＣＲＭＳＢＳ１Ｔ−キメライントロン」、図６、および「ＣＲＭＳＢＳ２Ｔ−キメライントロン」、図７）。

ステップ４については、スプライスのドナー部位およびアクセプター部位に向けた突然変異の導入を介して、ＭＶＭイントロンへの変化を行った。これらのベクターのマップは図１０中で示され、ここで、改変されたイントロンはＳＢＲイントロン１〜３と称される。ＭＶＭイントロンは、２つの可能なドナー部位およびそれらのドナーの２つの可能なアクセプター部位を有する（図示のために図１１を参照）。図１１中で、２つのドナー部位はＤ１およびＤ２と表示され、それらの対応するアクセプター部位はＡ１およびＡ２として示される。Ｄ１−Ａ１およびＤ２−Ａ２のスプライスによってなされたスプライス部位は、点線として遺伝子の上に示される。ＭＶＭイントロンの部分的配列を図１１中で遺伝子の下方に示し（配列番号：１４）、イントロン性エンハンサー配列（ＩＥＳ）の所在位置（下線を引いた）に加えて、Ａ１アクセプターおよびＡ２アクセプターの部位を指示する（ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ，（１９９８）ＪＶｉｒｏｌ，７２：１８３４−１８４３；ＨａｕｔａｎｄＰｉｎｔｅｌ，（１９９８）ＶｉｒｏｌＪ，２５８：８４−９４）。３つのイントロンを試験のために構築し、これらを図１０中で図示し、ＳＢＲイントロン１〜３と表示する（配列番号：１５〜１７中で示されるイントロン配列）。ＡＡＶＦ８ｃＤＮＡによって送達された発現ｈＦＶＩＩＩの活性もインビトロで評価した。ＡＡＶ２／６Ｆ８ｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３）を、２４ウェルディッシュ中の１Ｅ＋０５細胞あたり４．８Ｅ＋０６、２．４Ｅ＋０６、１．２Ｅ＋０６および０．６Ｅ＋０６のベクターゲノム／ｍＬの用量で、ＨｅｐＧ２細胞に加えた（時間ｔ０日として表示される）。上清を、ＡＡＶ２／６ウイルス添加後７日目（ｔ７）に、ＥＬＩＳＡによって分泌性ｈＦＶＩＩＩレベル、ならびにＡＰＴＴ凝血アッセイおよび発色活性アッセイによって活性について分析した（方法については以下を参照）。結果（図２１）から分泌性ｈＦＶＩＩＩレベルと活性との間の良好な相関性が実証された。示されたデータは、ｎ＝６の生物学的重複測定である。エラーバーは重複測定の平均の標準誤差を表わす。

次いでこれらのコンストラクトを下で記載されるようにインビボで試験した。

定量的ＰＣＲ
ｑＲＴ−ＰＣＲ（ヒト第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡのレベルのための）：製造者の指示によって、ＦａｓｔＰｒｅｐおよびＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＤ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＳａｎｔａＡｎａＣＡ）を使用して、マウス組織を溶解した。製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）によって、ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡをマウス組織から単離した。次いで抽出されたＲＮＡを使用し、ＱｕａｎｔｉｔｅｃｔｃＤＮＡ合成キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）を使用してｃＤＮＡを作製した。次いでＩＤＴ（ＣｏｒａｌｖｉｌｌｅＩＡ）からの標識プライマー／プローブアッセイを使用するＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６上でＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｓＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）を使用して、定量的ＰＣＲを実行した。マウスＧＡＰＤＨアッセイはＭｍ．ＰＴ．３９ａ．１であった。ヒト第ＶＩＩＩ因子ｍＲＮＡの特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＧＧＡＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧ）（配列番号：１８）、プローブ（ＡＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡ）（配列番号：１９）およびリバースプライマー（ＴＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＡＧＴＡＧ）（配列番号：２０）であった。定量的ｑＲＴ−ＰＣＲ（絶対的でない）をＧＡＰＤＨへ正規化して各々のサンプルについて使用し、最終データ解析を、１．０に設定した１つのマウスサンプルと比べて報告した。テンプレートなしの対照および逆転写酵素なしの対照をすべてのサンプルと共に実行し、それは検出可能なシグナルを産生しなかった。

ｑＰＣＲ（ベクターゲノム（ＶＧ）分析のための）：製造者の指示によって、ＦａｓｔＰｒｅｐおよびＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＤ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＳａｎｔａＡｎａＣＡ）を使用して、マウス組織を溶解した。製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）によって、ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡをマウス組織から単離した。抽出したＤＮＡを、ＡＢ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）上で、ＴａｑＭａｎＦａｓｔＵｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ＮｏＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）による定量的ＰＣＲのために使用した。ヒト第ＶＩＩＩ因子の特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＣＣＴＧＧＧＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＴ）（配列番号：２１）、プローブ（ＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＣＡ）（配列番号：２２）およびリバースプライマー（ＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＧ）（配列番号：２３）であった。テンプレートなしの対照をすべてのサンプルと共に実行し、それは検出可能なシグナルを産生しなかった。ｑＰＣＲＤＮＡスタンダードカーブを、７つの既知の量の精製した直線化ヒト第ＶＩＩＩ因子プラスミドの４倍希釈のシリーズから生成した。

ｑＰＣＲ（ＨｅｐＧ２細胞を使用するＮＨＥＪによる標的化組み込みのための）。製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）によって、ＱＩＡａｍｐＤＮＡｍｉｃｒｏを使用して、ＤＮＡをヒトＨｅｐＧ２細胞から単離した。次いでＩＤＴ（ＣｏｒａｌｖｉｌｌｅＩＡ）からの標識プライマー／プローブアッセイを使用するＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６上でＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄＵｎｉｖｅｓａｌＰｒｏｂｅｓＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）を使用して、定量的ＰＣＲを実行した。ヒトＧＡＰＤＨアッセイはＨｓ．ＰＴ．３９ａ．２２２１４８３６であった。内在性ヒトアルブミン遺伝子座でのＮＨＥＪによるヒト第ＶＩＩＩ因子の標的化組み込みの特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＧＡＣＴ）（配列番号：２４）、プローブ（ＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴ）（配列番号：２５）およびリバースプライマー（ＣＣＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴ）（配列番号：２６）であった。この研究の目的のために、定量的ｑＰＣＲ（絶対的でない）をＧＡＰＤＨへ正規化して各々のサンプルについて使用し、最終データ解析を、１．０に設定した１つのサンプルと比べて報告した。テンプレートなしの対照、トランスクリプターゼなしの対照およびＺＦＮなしの対照を実行し、それは検出可能なシグナルを産生しなかった。

ｑＰＣＲ（マウス組織からのＮＨＥＪおよびＨＤＲによる標的化組み込みのための）。製造者の指示によって、ＦａｓｔＰｒｅｐおよびＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＤ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＳａｎｔａＡｎａＣＡ）を使用して、マウス組織を溶解した。製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）によって、ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡをマウス組織から単離した。次いでＩＤＴ（ＣｏｒａｌｖｉｌｌｅＩＡ）からの標識プライマー／プローブアッセイを使用するＢｉｏｒａｄＣＦＸ９６上でＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄＵｎｉｖｅｒｓａｌＰｒｏｂｅｓＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ、ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）を使用して、定量的ＰＣＲを実行した。マウスＧＡＰＤＨアッセイはＭｍ．ＰＴ．３９ａ．１であった。内在性マウスアルブミン遺伝子座でのＮＨＥＪによるヒト因子８ｃＤＮＡの標的化組み込みの特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡＴＴ、配列番号：３９）、プローブ（ＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴ、配列番号：４０）およびリバースプライマー（ＧＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴ、配列番号：４１）であった。内在性マウスアルブミン遺伝子座でのＮＨＥＪによるＺＦＮの標的化組み込みの特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＡＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡ、配列番号：４２）、プローブ（ＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴＧＣＧＧＣＣＴ、配列番号：４３）およびリバースプライマー（ＣＡＧＧＧＴＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＡＣ、配列番号：４４）であった。内在性マウスアルブミン遺伝子座でのＨＤＲによるヒト因子８の標的化組み込みの特異的な検出のために、プライマー／プローブアッセイはカスタムであり、フォワードプライマー（ＡＡＣＴＴＴＧＡＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＧＡＧＧ、配列番号：４５）、プローブ（ＴＡＣＣＧＧＡＧＧＡＧＣＡＡＡＣＡＧＧＧＡＣＴＡ、配列番号：４６）およびリバースプライマー（ＣＴＣＴＡＣＧＡＡＡＴＧＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡ、配列番号：４７）であった。この研究の目的のために、定量的ｑＰＣＲ（絶対的でない）を使用し、最終データ解析を、１．０に設定した１つのサンプルと比べて報告した。テンプレートなしの対照、トランスクリプターゼなしの対照およびＺＦＮなしの対照を実行し、それは検出可能なシグナルを産生しなかった。

インデル（挿入および欠失）。製造者の指示によって、ＦａｓｔＰｒｅｐおよびＬｙｓｉｎｇＭａｔｒｉｘＤ（ＭＰＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＳａｎｔａＡｎａＣＡ）を使用して、マウス組織を溶解した。製造者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、ＣａｒｌｓｂａｄＣＡ）によって、ＡｌｌＰｒｅｐＤＮＡ／ＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡをマウス組織から単離した。抽出したＤＮＡをＰＣＲおよびディープシーケンシングのために使用して、マウスアルブミン遺伝子座でインデルを測定した。

血漿。Ｃ５７ＢＬ／６研究について、７、１４および２１日目（非終了時）および２８日目または指摘されるようにより長期（終了時）で、すべてのマウスから血液を収集した。血友病Ａマウス研究について、８、１４、２１、２８、３５および４２日目（非終了時）で、すべてのマウスから血液を収集した。すべての血液をクエン酸ナトリウムを含有するチューブの中へ収集し、血漿へとプロセシングした。非終了時の血液収集は顎下静脈または眼窩後方の副鼻腔経由で収集した。屠殺時での血液収集は心臓穿刺または大静脈経由で収集した。血漿を分離し、下で記載されるＥＬＩＳＡアッセイまたはＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘＣｏａｍａｔｉｃ活性アッセイにおける使用まで−６０〜−８０℃で保管した。

肝臓。Ｃ５７ＢＬ／６研究について、２８日目でマウスを屠殺し、肝臓、脾臓、精巣、脳、心臓、肺および腎臓を収集し、秤量した。肝臓の左側葉を分離し３片へと分割し、肝臓の残りから分けて液体窒素中で急冷凍結した。残りの肝葉および他の組織（丸のまま）を液体窒素中で急冷凍結した。ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出のためにプロセシングするまで、凍結試料を−６０〜−８０℃で保管した。

インビトロの研究（ＨｅｐＧ２ＡＡＶＦ８ｃＤＮＡ／ＺＦＮ）。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を製造者のガイドライン（ＡＴＣＣ、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ）によって維持した。実験の日に、ＨｅｐＧ２細胞を洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。使用されるＺＦＮは、ヒトアルブミンイントロン遺伝子座（左ＳＢＳ４７１７１および右ＳＢＳ４７８９８）へのものであった。ＺＦＮを、ｈＦ８ｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２イントロンなし）と一緒に、ＡＡＶ２／６として送達した（時間ゼロとして表示される）。２４ウェルディッシュの１ウェルあたり１Ｅ＋０５細胞について、ＡＡＶ２／６ＺＦＮを３．０Ｅ＋０５で、ならびにＡＡＶ２／６ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡＣＲＭＳＢＳ２イントロンなしを、３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５で、送達した。翌日培地を交換した。上清を、ＡＡＶ２／６ウイルス添加後のタイムポイントｔ３、ｔ５およびｔ７日目に、下で記載されるｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡを使用して、分泌性ｈＦＶＩＩＩについて分析した。

インビトロの研究（ＨｅｐＧ２ＡＡＶＦ８ｃＤＮＡ）。ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を製造者のガイドライン（ＡＴＣＣ、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ）によって維持した。実験の日に、ＨｅｐＧ２細胞を洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。ＡＡＶ２／６ｈＦ８ｃＤＮＡ（ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３）を、２４ウェルディッシュのウェル中の１Ｅ＋０５細胞あたり６．０Ｅ＋０６、１．２Ｅ＋０６、２．４Ｅ＋０６および４．８Ｅ＋０６のウイルスゲノムの用量で、送達した。培地をタイムポイントｔ３（ｔ＝日）で交換した。ＡＡＶ２／６ウイルス添加後のタイムポイントｔ５およびｔ７での上清を、ＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃｓからのｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡを使用して分泌性ｈＦＶＩＩＩレベルについて、ならびに下で記載される発色アッセイおよび凝血アッセイによってｈＦＶＩＩＩ活性について、分析した。

ヒト第ＶＩＩＩ因子ＥＬＩＳＡ。ＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃｓｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡ（マウスおよびＨｅｐＧ２細胞）。分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子レベルを、ヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードを例外として製造のプロトコルに従ってＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カナダ）ＥＬＩＳＡキット（ＦＶＩＩＩ−ＡＧ）を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードは、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓａｌｅｍ、ＭＡ）からの組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子（＃Ｆ００１６−０６）であった。簡潔には、マウス血漿をプレートへ添加し、室温で振動させながら１．５時間インキュベーションし、後続してキット中で提供される洗浄バッファーにより３回洗浄した。検出抗体（キットにより提供される）を添加し室温で４５分間インキュベーションし、後続してキット中で提供される洗浄バッファーにより３回洗浄した。キットにより提供されるＴＭＢ基質を添加し、１０分間顕色させた。反応を停止溶液により停止し、プレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎＭで読み取った。

インハウスのｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡ（カニクイザル）。ＮＨＰの血漿の中へ分泌されたｈＦＶＩＩＩのレベルをカスタムＥＬＩＳＡを使用して決定した。ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、９６ウェル、ハーフエリア、高結合）を、０．２Ｍの炭酸−重炭酸塩バッファー（ｐＨ９．４）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）中のマウスモノクローナル抗ｈＦＶＩＩＩ抗体（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ）により４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを、１×ＴＢＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）を使用して４回洗浄した。次いで９６ウェルプレートを、３％のＢＳＡ／ＴＢＳブロッキングバッファーを使用して室温で２時間ブロッキングし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。血漿をプレートへ添加し、室温で振動させながら２時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。検出抗体（ビオチン化モノクローナルマウス抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ））を添加し、室温で１時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅＰＡ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。ＴＭＢＵｌｔｒａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）を添加し、１０分間顕色させ、反応を停止溶液により停止し、プレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎＭで読み取った。バックグラウンド吸光度読み取りは無視できた（典型的には０）。

発色によるヒト第ＶＩＩＩ因子活性アッセイ。血漿中の分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子の活性を、ヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードを例外として製造のプロトコルに従ってＤｉａｐｈａｒｍａＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃＣｏａｍａｔｉｃＦａｃｔｏｒＶＩＩＩａｓｓａｙ（ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ（ＯＨ））を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードは、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓａｌｅｍ、ＭＡ）からの組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子（＃Ｆ００１６−０６）であった。

凝血活性アッセイ。ＨｅｐＧ２上清（またはカニクイザル血漿）中の分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子の活性を、ヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードおよびヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿を例外として製造のプロトコルに従ってＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａＳｔａｇｏ（ＢｏｓｔｏｎＭＡ）による活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを使用して決定した。ヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードは、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるものと同じであった（組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｓａｌｅｍ、ＭＡからの＃Ｆ００１６−０６）。凝血アッセイにおいて使用されるＦＶＩＩＩ欠損試薬は、ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＥｓｓｅｘＪｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ）からのＶＩＩＩ−ＣＤ＜１％ＦＶＩＩＩＡｃｔｉｖｉｔｙ（凍結ＦＶＩＩＩ欠損）であった。簡潔には、スタンダードまたはサンプルを鋼球を含有するキュベットへ添加した。キットにより提供されるＦＶＩＩＩ−ＣＤ＜１％ＦＶＩＩＩＡｃｔｉｖｉｔｙおよびＰＴＴＡｕｔｏｍａｔｅを添加し、３７℃で１８０秒間インキュベーションした。鋼球をキュベット内で動かしながら、キットにより提供されたＳＴＡＣａＣｌ_２を反応へ添加した。凝血時間は、ＳＴＡＣａＣｌ_２の添加から鋼球の動きが止まるまでを測定した。ＳｔａｇｏＳｔａｒｔＨｅｍｏｓｔａｓｉｓＡｎａｌｙｚｅｒをこのアッセイのために使用して、インキュベーションおよび時間の記録を行った。

実施例２：インビボの研究
野生型マウス：８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスをインビボの研究のために使用した。本研究は、動物の人道的なケアおよび使用のために動物福祉法を遵守した。試験品（コンストラクトを含有するＡＡＶウイルス）を投薬の前に室温で融解し、すべての動物に単一の２００μＬの静脈内（ＩＶ）注射を与えた。以下の表１は、図８中のインビボで研究されるコンストラクトの試験のための研究デザインを示す（図４、６および７中でマップが示される）。表２は、図１５中で略述されるコンストラクトの試験のための研究デザインを示す。用量は１マウスあたり１．８Ｅ＋１１ｖｇであり、それはおよそ７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇであった。すべての動物に、０および１４日目で２００μＬのシクロホスファミドのフォローアップの腹腔内注射を与えた。表１および２中で略述されるように、非終了時および終了時の血液収集を行った。

７、１４および２１日目（非終了時）および２８日目（終了時）で、すべてのマウスから血液を収集した。すべての血液をクエン酸ナトリウムを含有するチューブの中へ収集し、血漿へとプロセシングした。非終了時の血液収集は顎下静脈または眼窩後方の副鼻腔経由で収集した。屠殺時での血液収集は心臓穿刺または大静脈経由で収集した。血漿を分離し、下で記載されるＥＬＩＳＡアッセイにおける使用まで−６０〜−８０℃で保管した。

２８日目ですべての動物を屠殺し、肝臓、脾臓、精巣、脳、心臓、肺および腎臓を収集し、秤量した。肝臓の左側葉を分離し３片へと分割し、肝臓の残りから分けて液体窒素中で急冷凍結した。残りの肝葉および他の組織（丸のまま）を液体窒素中で急冷凍結した。ＲＮＡ／ＤＮＡ抽出のためにプロセシングするまで、凍結試料を−６０〜−８０℃で保管した。

図８および１５中で示されるように、試験されたすべてのコンストラクトは、投与後７日目（図８Ａおよび図１５Ａ）および２８日目（図８Ｂおよび図１５Ｂ）で、インビボの導入遺伝子（ヒト分泌性第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失）のインビボの産生をもたらした。さらに、図９および１６中で示されるように、導入遺伝子は肝臓においてのみ発現し、他の組織は発現せず（図９Ａおよび１６Ａ）、ＡＡＶベクターは主として肝細胞を形質導入する（図９Ｂおよび１６Ｂ中で示されるようなベクターゲノムの生体内分布分析）。これらのデータセットにおいて、ヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤ（ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ）ｍＲＮＡを、表１中で表わされる研究において、組織（脳、心臓、腎臓、肺、肝臓、脾臓、精巣）から上で記載されるような実施例１におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。加えて、ベクターゲノム分布を、ｑＰＣＲによってこれらの同じ組織において分析し（実施例１を参照）、結果を図９Ｂ／１６Ｂ中で示す。これらのデータから、ＡＡＶ２／６ベクターが主として肝臓を形質導入することが実証される。

イントロン修飾の有効性を検討するようにデザインされたコンストラクトを、表２中で略述された研究において同様にインビボで試験し、７日目についておよびピークレベルでのデータを図１５中で示す。ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｍＲＮＡ（図１６Ａ）も、ベクターゲノム分布（図１６Ｂ）も同様に分析し、ｈＦ８ｍＲＮＡ発現が肝臓に特異的であり、ＡＡＶ２／６が主として肝臓を形質導入することが示された。

したがって、本明細書において記載されるコンストラクトは、肝臓の送達に後続して着実な導入遺伝子発現を提供する。

インビボで観察されるｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのレベルが使用されているＡＡＶの血清型へ感受性があるかどうかを、追加の研究を実行して試験した。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、６Ｅ＋１０ｖｇ／マウス（約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）または１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／９のＦ８親ｃＤＮＡを静脈注射した。６Ｅ＋１０ｖｇ／マウス（約２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）での血清型ＡＡＶ２／６（マウス肝臓の形質導入で非効率的であることが既知）により形質導入したマウスで、ヒトにおいて正常なｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの９１．９％±１５．５標準誤差（ｎ＝６）の平均ピーク値が達成された。約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを表わすより高い用量で、６つの独立したインビボのマウス研究にわたって１６９．２％±１０．１標準誤差（ｎ＝３６）のｈＦＶＩＩＩ血漿の平均ピーク値が達成された。ＡＡＶ２／８についての平均ピークレベルは、２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで３２０％であり、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで３２３．６％であった。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇでのＡＡＶ２／９については、平均ピークレベルは３８９．６％であった（ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を使用する結果も示す、図２３を参照）。

研究を遂行して、ＡＡＶを生成するのに使用される産生方法が、インビボで達成されるｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ発現に対する影響を有するかどうかを決定した。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９／ｒＢＶ（組み換えバキュロウイルス）のいずれかから産生された１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ２／６Ｆ８親ｃＤＮＡによる親Ｆ８親ｃＤＮＡを静脈注射（尾静脈）経由で投与した。ＨＥＫ２９３細胞からのＦ８親ｃＤＮＡによる治療は、正常ヒトＦＶＩＩＩ血漿レベルの１４２．１％±８．３％標準誤差（ｎ＝８）（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定された）の平均ピーク値を達成した。同レベルの１３２．８％±１８．６％標準誤差（ｎ＝５）（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定された）が、Ｆ８親ｃＤＮＡ（Ｓｆ９／ｒＢＶ）のマウスへの投与に後続して達成された（図２４）。

Ｆ８ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３ｃＤＮＡとの比較の目的のために、研究を反復した（図１０を参照）。オスＣ５７ＢＬ／６マウスに、１．８Ｅ＋１１ｖｇ／マウス（約６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ２／６ＣＲＭＳＢＳ２ＳＢＲイントロン３ｃＤＮＡを静脈注射した（ｎ＝８）。ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血漿中のｈＦＶＩＩＩの平均ピークレベルが示される（図２５）。

血友病Ａマウス：コンストラクトを血友病ＡのＲ５９３Ａマウスモデルにおいても試験した（Ｂｒｉｌｅｔａｌ（２００６）ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ９５（２）：３４１−７；Ｃｈａｖｅｚｅｔａｌ．，（２０１２）ＨｕｍＧｅｎＴｈｅｒ．，２３（４）：３９０）。これらのマウスは内在性マウスＦ８遺伝子のノックアウトを保有する。加えて、これらのマウスは、マウスアルブミンプロモーターの制御下で突然変異体ヒトＦＶＩＩＩ−Ｒ５９３Ｃ導入遺伝子を保有し、その結果、検出不可能な量の突然変異体ヒトタンパク質を発現するが、微量の産生された突然変異体ＦＶＩＩＩＲ５９３Ａタンパク質があるのでヒトＦＶＩＩＩ発現へ寛容であると考えられる。もとの系統はＦＶＢであったが、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙで少なくとも５世代の間Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ戻し交配された。本研究は、動物の人道的なケアおよび使用のために動物福祉法を遵守した。試験品を投薬の前に室温で融解し、すべての動物に単一の２００μＬの静脈内（ＩＶ）注射を与えた。用量は１マウスあたり１．８Ｅ＋１１ｖｇであり、それはおよそ７Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇであった。研究デザインを表３中で以下に示す。

研究を３か月の間実行し、３か月の研究の代表的な結果が示され、１４日目および４２日目での両方の結果（図１７）から、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子は、１４日目（図１７Ａ）および４２日目（図１７Ｂ）の両方で、正常ヒト血漿中で見出されるＦＶＩＩＩタンパク質のレベルの＞３００％のレベルで発現されたことが示される。

マウス血友病ＡモデルにおいてｈＦＶＩＩＩの機能性および治療有効性を試験するために、尾静脈切断（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）（ＴＶＴ）モデルを使用した。簡潔には、最初にイソフルランによりマウスに麻酔をかけ、研究継続時間の間、麻酔マスク経由で麻酔を維持した。麻酔導入の直後に、マウスを、胃とヒーティングパッドとの間の温度センサーと共にヒーティングパッド（３７℃へ設定された）上に置き、頭部が適切に麻酔マスク中に位置することを保証する。マーカーブロックを測定のために使用して、尾を、正確に直径２．５ｍｍへ対応する「１２時」でマーカーペンによりマークし、その後、尾を食塩水収集チューブ（３７℃食塩水）の中へ沈めた。出血の誘導前に尾を合計１０分間体温にした食塩水（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓａｌｉｎｅ）中に沈めた。次いで尾を、切断が行われるおよそ１０秒前に、マークが「１３」から「１５時」を指すように切断ブロック中に置いた（左外側尾静脈の切断（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）を促進するために）。正確にｔ＝０分で、マウス尾の左側上の外側に位置する１ｍｍの深さの切断で切断し、それによって外側尾静脈を切断（ｔｒａｎｓｅｃｔ）した。直後に、尾をあらかじめ温めた食塩水収集チューブ中に沈めた。一次出血エピソードを３分間記録した。一次出血が３分間を超える時間だったならば、動物を安楽死させ、置き換えた。傷の３分後に、収集チューブを、新しいあらかじめ温められた食塩水収集チューブと交換した。すべての二次出血エピソードを、追加の５７分間記録した。出血が１５、３０または４５分に中止したならば、食塩水で湿らせられたガーゼスワブにより創傷を穏やかに２回拭うというチャレンジを行った。このチャレンジ直後に、尾を食塩水の中に再び沈めた。ｔ＝６０分で、依然として完全麻酔下である間に、マウスを安楽死させた。出血時間は、一次時間および二次出血時間の合計として報告した。一次出血および二次出血を溶解し、後の失血量についてのヘモグロビン測定のために保管した（Ｊｏｈａｎｓｅｎｅｔａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，（２０１６）ｄｏｉ：１０．１１１１／ｈａｅ．１２９０７）。

結果から、尾静脈切断（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ）後の血友病ＡのＲ５９３Ｃマウスにおける止血を達成する時間の量の有意な低減（ｐ＜０．０００１）が実証され（図１８）、これらのマウスにおける治療有効性が実証される。

非ヒト霊長動物：ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡコンストラクトを使用してＮＨＰにおいて実験を実行し、そこで、ＡＡＶ２／６血清型およびＡＡＶ２／８血清型を評価した。以下の表４および図２６Ｂは、投薬群の識別を示す。デザインされたＦ８導入遺伝子発現カセットの「ｃＤＮＡ１」（以下の表４の群２−４）と「ｃＤＮＡ２」（以下の表４の群５）との間の差は、「ｃＤＮＡ２」ドナーがわずかに異なるプロモーターモジュール（ハイブリッド肝臓プロモーター、ＭｃＩｎｔｏｓｈｅｔａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ１２１（１７）：３３３５を参照）を有していたということであるが、Ｆ８−ＢＤＤ導入遺伝子発現カセット（コーディング領域が含まれる）の残りは同じであった。これらの実験のために、図２６Ａ中で略述される投薬レジメンを使用した（そこでは、リツキシマブを試験品の前に投与し、ステロイドを試験品と同時に投与し、その後は毎日投与した）。

カニクイザルに、製剤バッファーまたは６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ２／６ｈＦ８ｃＤＮＡ（親）を投与した。試験品添加後１４日目で、ｈＦＶＩＩＩの循環レベルおよび活性をＥＬＩＳＡまたは凝血活性によって分析した（図２７を参照）。カニクイザルＦＶＩＩＩの正常レベルは、凝血活性アッセイがヒトＦＶＩＩＩについて特異的でないので、製剤対照群についての凝血活性データにおいて反映される、約１Ｕ／ｍＬである。ＥＬＩＳＡはカニクイザルＦＶＩＩＩよりもヒトＦＶＩＩＩについて特異的であり、したがって、予想通りに、製剤対照群においてＥＬＩＳＡによって測定されるようなｈＦＶＩＩＩレベルはない。製剤対照群（群１、動物識別１１０１〜１１０２）および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ用量群（群３、動物識別３１０１〜３１０３）についての個別の動物を示す。群３の動物において、８Ｕ／ｍＬを越える循環ｈＦＶＩＩＩの超生理学的なレベルおよび活性がある。

治療後の肝臓状態の指標として、肝酵素を、製剤対照群（群１、動物識別１１０１）および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ用量群（群３、動物識別３１０２）について測定した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）を測定した。カニクイザルについて許容される上限参照値は、ＡＬＴについて１２６Ｕ／Ｌであり、ＡＳＴについて１２０Ｕ／Ｌである。製剤対照群および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇのＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡ（親）群の両方について、ＡＬＴ／ＡＳＴレベルは後肝生検後（肝生検は４１日目であった）に上昇し、星印によって表示された。それ以外は、ＡＡＶｈＦ８ｃＤＮＡは研究の全体にわたって（２４７日）良好な忍容性を示した（図２８Ａおよび２８Ｂを参照）。

図２９中で提示されるデータは、グラフ上で描写される各々のサルについてのデータセットであった。データから、ＡＡＶ６血清型のバックグラウンドにおいて、試験品のより高い用量（図２９Ａを図２９Ｂと比較して）により、正常ヒト血漿中で見出されるレベルのおよそ１０×のＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの発現が生じたことが指摘される。ＡＡＶ２／８血清型における試験品についてのデータからＦＶＩＩＩ活性の増加が示されたが、ＡＡＶ２／６について観察されたものと同じ程度ではなかった。

上で記載される最初の１４日の期間に続いて、ＡＡＶ−ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤの単一用量後の２４７日目まで、実験を継続した。ステロイドの共投薬は１０３日目で停止した。サルの血漿中のｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルの決定は、以下のようにカスタムＥＬＩＳＡを使用して決定した。９６ウェルハーフエリアＨＢ（高結合）ポリスチレンマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、０．２Ｍの炭酸−重炭酸塩バッファー（ｐＨ９．４）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）中のマウスモノクローナル抗ｈＦＶＩＩＩ抗体（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ）により４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを、１×ＴＢＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）を使用して４回洗浄した。次いで９６ウェルプレートを、３％のＢＳＡ／ＴＢＳブロッキングバッファーを使用して室温で２時間ブロッキングし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。血漿をプレートへ添加し、室温で振動させながら２時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。検出抗体（ビオチン化モノクローナルマウス抗ＦＶＩＩＩ抗体（ＧｒｅｅｎＭｏｕｎｔａｉｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＴ））を添加し、室温で１時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。ストレプトアビジンＨＲＰ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ＷｅｓｔＧｒｏｖｅＰＡ）を添加し、室温で１時間インキュベーションし、後続して１×ＴＢＳＴにより４回洗浄した。ＴＭＢＵｌｔｒａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷａｌｔｈａｍＭＡ）を添加し、１０分間顕色させ、反応を停止溶液により停止し、プレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎＭで読み取った。バックグラウンド吸光度読み取りは無視できた（典型的には０）。阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在はベセスダアッセイを使用して決定した（例えばＫａｓｐｅｒｅｔａｌ（１９７５）ＴｈｒｏｍｂＤｉａｔｈＨａｅｍｏｒｒｈ３４：８６９−７２を参照）。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、研究にわたってピークヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルを評価した。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの用量レベルで（ｎ＝３）、ヒトにおける正常ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの１１１．０％、４９３．９％および８４０．０％（全体の平均４８１．６％、ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定されるように）のピーク値が達成された。６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを表わすより高い用量で（ｎ＝３）、４５０．０％、６２５．６％および８８６．７％［全体の平均６５４．１％］のｈＦＶＩＩＩ血漿レベルのピーク値が達成された（図３０）。

表４中で略述される研究を実行し、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤのレベルおよび任意の阻害性抗ＦＶＩＩＩ抗体を測定した。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで投薬された低用量動物（ｎ＝３）（ＡＡＶ２／６中でＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを含む）については、着実なｈＦＶＩＩＩ抗原レベル（Ａｇ）の検出に後続して、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルは減少し、それに付随してベセスダ単位（ＢＵ）は増加した。ＢＵは経時的に減少し、ｈＦＶＩＩＩＡｇは増加した（図３１）。結果から、免疫抑制療法の中断に後続して、ヒトＦＶＩＩＩ抗原のレベル（ＥＬＩＳＡによって測定されるように）が低下したことが実証された。

６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇで投薬された高用量の動物（ｎ＝３）（ＡＡＶ２／６中でＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡを含む）については、類似のパターンが観察された（図３２を参照）。しかしながら１匹の動物（３１０１）において、ソル−メドロールの除去に後続して、検出可能で持続的なレベルのＦＶＩＩＩ抗原（正常なｈＦＶＩＩＩレベルの２００％を表わす）にもかかわらず、抗ＦＶＩＩＩの抗体は検出されず、それはヒトＦＶＩＩＩ抗原への動物の寛容を暗示し得る。

血清型ＡＡＶ２／８が高用量の送達のために使用された場合に、血漿中の検出可能なｈＦＶＩＩＩ抗原の量がＡＡＶ２／６ベクターを使用して測定されたよりも少なかったという点を除いて、類似の結果が観察された（図３３）。同様に、異なるＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡプロモーターモジュールがＡＡＶ２／８ベクター中で試験された（群５、上で記載される）場合に、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ血漿レベルは群４中で観察されたものに類似していた（図３４）。しかしながら、上記のように、ソル−メドロールの除去に後続して、著しい抗体応答なしにＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ発現の検出可能な量を維持した２個体（５１０１および５１０２）および群４中の１個体（４１０３、図３３Ｄ）が存在し、この場合もやはり実験の初期の日において観察された着実な応答レベルに後続する抗原への寛容化が示唆される。

図３４Ｄ中で示されるように、メチルプレドニゾロンの除去後に、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルが、およそ０．１Ｕ／ｍＬ（正常なｈＦＶＩＩＩレベルの１０％を表わす）で８週間安定的なままであったので、動物番号５１０１はｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤへ寛容化されているように思われた。また、図３４Ｅ中で示されるように、メチルプレドニゾロンの除去後に、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤレベルが、およそ０．６Ｕ／ｍＬ（正常なｈＦＶＩＩＩレベルの６０％を表わす）で８週間安定的なままであったので、動物番号５１０２はｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤへ寛容化されているように思われた。ヒト血漿中のｈＦＶＩＩＩの正常値はおよそ１Ｕ／ｍＬまたは２００ｎｇ／ｍＬであること、および正常の１％〜５％（＞０．００１Ｕ／ｍＬ）の発現でさえ治療有効性を有し得ることを指摘する価値はある（Ｌｌｕｎｇ，ＲＣ（１９９９）ＴｈｒｏｍｂＨａｅｍｏｓｔ８２（２）：５２５−５３０）。

異なる免疫抑制レジームを調査したという点を除いて、ＮＨＰにおける実験も上で記載されるように遂行した。これらの実験について、図２６Ｂ中で示される投薬レジメンに従い、いくつかの群（１〜５）は試験品投薬の前に投与される免疫抑制療法を受けた一方で、他の群（６〜８）は試験品投薬の後に免疫抑制を受けた。

図３８中で示されるように、６Ｅ＋１１ｖｇ／ｋｇの用量レベル（ｎ＝３、群３）で、ヒトにおける正常ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの５．７％である、ピーク値の全体の平均（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定される）が、達成された。２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇを表わすより高い用量（ｎ＝３、群４）で、ピーク値の全体の平均は５６．５％であり、および６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群５）で、ｈＦＶＩＩＩ血漿レベルの２２９．０％である、ピーク値の全体の平均（ｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡによって測定される）が、達成された。用量レベル２Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群７）で、ピーク値の全体の平均は８７．９％であり、６Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇ（ｎ＝３、群８）について、１０１．７％であった。群１および６は、製剤として表示された製剤対照群であった。加えて、図３９中で示されるように、同じ血清型を使用する再投薬は、検出可能な循環ヒトＦＶＩＩＩ抗原レベルをもたらした。これらの結果から、免疫抑制による動物の前治療が最大の治療用タンパク質発現のために有用であり得ることが指摘される。加えて、前治療は、中和抗体が第１の用量の間に発生しなかった場合に、再投薬を可能にする。図３９は、投薬されたＦＶＩＩＩ−ＢＤＤｃＤＮＡの範囲の変動に応答したｈＦＶＩＩＩ発現の治療動物における用量応答も実証する。血漿中の１〜５％のＦＶＩＩＩタンパク質の存在でさえヒトにおいて有意な治療有効性を有すると考えられるので、Ｅ１１範囲（この実験において正常値の５．７〜１２．０パーセントをもたらす）中の臨床用量は、有意な治療利益を提供するだろう。したがって、データから、本明細書において記載されるコンストラクトが治療レベルの導入遺伝子産生をインビボでもたらすことが実証される。

実施例３：ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込み
実施例１および２において記載されるコンストラクトを、アルブミン遺伝子座の中への発現コンストラクトの標的化組み込みのために、アルブミン特異的ヌクレアーゼと組み合わせて使用した場合の発現についても評価した。特に、コンストラクトをアルブミン特異的ジンクフィンガーヌクレアーゼ共にＨｅｐＧ２細胞へ投与した。例えば米国特許第９，１５０，８４７号；同第９，２５５，２５０号ならびに米国特許公報第２０１３０１７７９８３号；同第２０１５０１５９１７２号；同第２０１５００５６７０５号および同第２０１５０１６６６１８号を参照されたい。

ヒトＨｅｐＧ２肝細胞を製造者のガイドライン（ＡＴＣＣ、ＭａｎａｓｓａｓＶＡ）によって維持した。実験の日に、ＨｅｐＧ２細胞を洗浄し、トリプシン処理し、カウントした。ヒトアルブミンイントロン遺伝子座へ使用されるＺＦＮを、ヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤ（ｈＦＶＩＩＩ）ｃＤＮＡＣＲＭＳＢＳ２イントロンなしと一緒に、ＡＡＶ２／６として送達した（時間ゼロとして表示される）。２４ウェルディッシュの１ウェルあたり１Ｅ＋０５細胞について、ＡＡＶ２／６ＺＦＮを３．０Ｅ＋０５で、ならびにＡＡＶ２／６ｈＦＶＩＩＩｃＤＮＡＣＲＭＳＢＳ２イントロンなしを、３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５で、送達した。したがって、発現コンストラクトを、３．０Ｅ＋０５のＺＦＮと一緒に、３．０Ｅ＋０４、６．０Ｅ＋０４および１．２Ｅ＋０５の増加用量で投与した。対照サンプルには、ＣＲＭＳＧＳ２ＳＢＲイントロン３導入遺伝子単独もしくはＧＦＰと共に、ＺＦＮ単独、またはＧＦＰ単独の投与が含まれていた。翌日培地を交換した。上清を、ＡＡＶ２／６ウイルス添加後１９日目に、下で記載されるｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡを使用して、分泌性ｈＦＶＩＩＩについて分析した。

分泌性ヒト第ＶＩＩＩ因子−ＢＤＤレベルを、ヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードを例外として製造のプロトコルに従ってＡｆｆｉｎｉｔｙＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カナダ）ＥＬＩＳＡキット（ＦＶＩＩＩ−ＡＧ）を使用して決定した。ＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用されるヒト第ＶＩＩＩ因子スタンダードは、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｓａｌｅｍ、ＭＡ）からの組換え精製ヒト第ＶＩＩＩ因子（＃Ｆ００１６−０６）である。簡潔には、ＨｅｐＧ２上清をプレートへ添加し、室温で振動させながら１．５時間インキュベーションし、後続してキット中で提供される洗浄バッファーにより３回洗浄した。検出抗体（キットにより提供される）を添加し室温で４５分間インキュベーションし、後続してキット中で提供される洗浄バッファーにより３回洗浄した。キットにより提供されるＴＭＢ基質を添加し、１０分間顕色させた。反応を停止溶液により停止し、プレートリーダーを使用して、吸光度を４５０ｎＭで読み取った。

アルブミン標的化ＺＦＮ（ＳＢＳ＃４７１７１／４７８９８、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１５／０８９０７７を参照）の投与に後続して、ＨｅｐＧ２細胞上清中のｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤタンパク質の合計レベルを経時的に（ｔ＝日）検出し、指示されたコンストラクトを分析した（図３６）。ＦＶＩＩＩＢＤＤ発現コンストラクトおよびＺＦＮの両方の存在下において、分泌性ＦＶＩＩＩＢＤＤは、ＦＶＩＩＩＢＤＤ導入遺伝子の最高用量での治療の３日後に上清中で検出され、次いで５日目でより低い用量で検出可能であり、７日目ですべてのレベルで検出可能であった。ＺＦＮの非存在下において、上清中のＦＶＩＩＩＢＤＤは、７日目でアッセイのバックグラウンドを超えてかろうじて検出可能であった。示されたデータは、ｎ＝３の生物学的重複測定である。エラーバーは技術的重複測定の平均の標準誤差を表わす。点線はｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡの検出限界を表わす。分泌性ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤは、ＺＦＮの非存在下において弱く検出されたのみであり、これは、エピソームのｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤが、そのエピソームからの十分な量の検出可能な分泌性ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤが蓄積する前に、希釈または分解される可能性が高いからである。

さらに、定量的ＰＣＲ（内在性ヒトアルブミン遺伝子座内に所在する５’プライマーおよびｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤカセットのＩＴＲ内に所在するプローブおよびｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ内の３’プライマーを使用する）によって決定されるように、指示されたコンストラクトの標的化組み込み（ＮＨＥＪによって）はアルブミン特異的ＺＦＮの存在下においてのみ達成された（図３７）。したがって、これらのデータから、ｈＦＶＩＩＩ−ＢＤＤカセットの成功した組み込みおよびコードされたＦ８タンパク質の発現が実証される。

アルブミン特異的ＺＦＮの別のセット（ＳＢＳ＃４２９０６／４３０４３、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２０１５／０８９０４６を参照）を試験して、これらの実験を反復した。結果（図４０Ａおよび４０Ｂ）から、これらの細胞の上清中のＦＶＩＩＩタンパク質の発現および導入遺伝子の標的化組み込みが示される。

本質的に実施例１および２において記載されるように、続いてアルブミン特異的ＺＦＮおよびコンストラクトを動物へインビボで送達する。コンストラクトは内在性アルブミン遺伝子座の中へ組み込まれ、導入遺伝子を発現する。

インビボの研究のための実験デザインを表５中で以下に示す。簡潔には、Ｆ１世代オスＣ５７ＢＬ／６仔マウスをインビボの研究のために使用した（試験品は表５中で表示される）。研究において使用されるＺＦＮはＳＢＳ＃４８６４１およびＳＢＳ＃３１５２３であった（米国特許公報２０１４−００１７２１２を参照）。本研究は、動物の人道的なケアおよび使用のために動物福祉法を遵守した。試験品を投薬の前に室温で融解し、以下で略述されるようにすべての動物に単一の１００μＬの皮下注射を与えた。ＺＦＮ用量は１マウスあたり１．５Ｅ＋１１ｖｇであり、Ｆ８ｃＤＮＡ用量は１マウスあたり１．５Ｅ＋１１ｖｇであった。７、１４、２１および２８日目の各々で１群あたり２または３匹の仔から血液を収集し、その後安楽死させ、血漿中のｈＦＶＩＩＩの循環レベルの分析のために血漿へと加工し、インハウスのｈＦＶＩＩＩＥＬＩＳＡをマウスのために使用した。ディープシーケンシング（インデル、挿入および欠失）による遺伝子修飾のレベルの分析、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの分析、ｑＰＣＲを使用するベクターゲノム分析、およびｑＰＣＲを使用する標的化組み込み分析のために、すべてのマウスから組織を収集した。

血漿中で検出されるＦ８のレベルに加えて、ＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子の標的化組み込みの量を表６中で以下で提示する。

したがって、ＦＶＩＩＩは、アルブミン特異的ヌクレアーゼおよびＦＶＩＩＩ−ＢＤＤ導入遺伝子の投与後に、マウス仔において検出可能であった。導入遺伝子の挿入も、ＺＦＮおよび導入遺伝子の両方により治療されたマウス中でより高い量で検出可能であった。

したがって、本明細書において記載されるコンストラクトのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みは、肝細胞における導入遺伝子発現を提供する。

本明細書において言及されるすべての特許、特許出願および出版物は、それらの全体の参照によって本明細書に援用される。

開示は、理解の明瞭性の目的のための図示および実施例によってかなり詳細に提供されてきたが、本開示の趣旨または範囲から逸脱せずに、様々な変化および修飾を実践できることは当業者に明らかであろう。したがって、先の記載および実施例は限定として解釈されるべきではない。

Claims

１つまたは２つの、配列番号：２８、２９、３０および３８から選択されるインスレーター配列、
野生型セルピン１エンハンサー配列もしくは変異セルピン１エンハンサー配列、
野生型トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーター配列もしくは変異ＴＴＲプロモーター配列、および
導入遺伝子
を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクト。
さらに、ポリアデニル化配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
イントロン配列をさらに含む請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトであって、前記イントロン配列が野生型マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロン配列もしくは変異ＭＶＭイントロン配列を含む、前記コンストラクト。
前記イントロン配列が、配列番号：１５、１６、１７、および、配列番号：３７のヌクレオチド３４０〜４３２から選択される、請求項３に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
前記エンハンサー配列が、配列番号：１〜１３のうちの任意のものの位置１、５、１４、３２および３９のいずれかで突然変異を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
配列番号：２８を含む第１のインスレーター配列および配列番号：３０を含む第２のインスレーター配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
前記２つのインスレーター配列が、前記エンハンサー配列、前記プロモーター配列、前記イントロン配列および前記導入遺伝子、および、前記ポリアデニル化配列に隣接する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
前記導入遺伝子が血友病またはリソソーム蓄積症に罹患する被検体において機能が欠如または欠損するタンパク質をコードする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
前記導入遺伝子が、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系から選択される１つまたは複数のヌクレアーゼをさらにコードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクト。
請求項１または請求項２に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトであって、５’から３’に、以下：
配列番号：２８を含む第１のインスレーター配列、
配列番号：３６を含むエンハンサー配列、
ＴＴＲ最小プロモーター配列、
配列番号：３７のヌクレオチド３４０〜４３２を含むイントロン配列、
ヒト第ＶＩＩＩ因子をコードする導入遺伝子、
ポリアデニル化シグナル配列、および、
配列番号：３０を含む第２のインスレーター配列
を含む、ポリヌクレオチド発現コンストラクト。
配列番号：３７を含むポリヌクレオチド発現コンストラクト。
配列番号：３４を含むポリヌクレオチド発現コンストラクト。
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド発現コンストラクトを含むＡＡＶベクターであって、前記ポリヌクレオチド発現コンストラクトが前記ＡＡＶベクターの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）と３’ＩＴＲとの間にある、前記ベクター。
前記ベクターがＡＡＶ６カプシドを含む、請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
請求項１３または１４に記載のＡＡＶベクターを含む、医薬組成物。