RS59670B1 - Himerni polipeptidi faktora viii i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

POZADINA PRONALASKA

[0001] Koagulacija je složen proces u kojem krv stvara ugruške. Važan je deo hemostaze, prestanka gubitka krvi iz oštećenog suda, pri čemu je oštećeni zid krvnog suda prekriven trombocitom i ugruškom koji sadrži fibrin kako bi se zaustavilo krvarenje i započelo saniranje oštećenog suda. Poremećaji koagulacije mogu dovesti do povećanog rizika od krvarenja (hemoragija) ili opstruktivnog zgrušavanja (tromboze).

[0002] Koagulacija počinje skoro odmah nakon što je povreda krvnog suda oštetila endotelnu oblogu suda. Izloženost krvi proteinima kao što tkivni faktor inicira promene u trombocitima u krvi i fibrinogen plazme, faktor zgrušavanja. Trombociti odmah formiraju čep na mestu povrede; ovo se naziva primarna hemostaza. Sekundarna hemostaza javlja se istovremeno: Proteini u krvnoj plazmi, zvani faktori koagulacije ili faktori zgrušavanja, reagiraju u složenoj kaskadi da bi formirali fibrinske niti, koje jačaju trombocitni čep. Neograničavajući faktori koagulacije uključuju, ali nisu ograničeni na, faktor I (fibrinogen), faktor II (protrombin), faktor tkiva, faktor V (proakcelerin, labilni faktor), faktor VII (stabilni faktor, prokonvertin), faktor VIII (Antihemofilni faktor A), faktor IX (Antihemofilni faktor B ili Koagulacioni faktor), faktor X (Stjuart-Prauer faktor), faktor XI (preteča plazma tromboplastina), faktor XII (Hagemanov faktor), faktor XIII (faktor stabilizacije fibrina), VWF, prekalikrein (Flečerov faktor), kininogen visoke molekulske težine (HMWK) (Ficdžeraldov faktor), fibronektin, antitrombin III, kofaktor heparina II, protein C, protein S, protein Z, plazmin, alfa 2-antiplazmin, tkivni plazminogeni aktivator (tPA), urokinaza, inhibitor aktivatora plazminogena-1 (PAI1) i inhibitor aktivatora plazminogena-2 (PAI2).

[0003] Hemofilija A je poremećaj krvarenja izazvan defektima gena koji kodira faktor koagulacije VIII (FVIII) i pogađa 1-2 na 10.000 rođenih muškaraca. Graw i dr., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Pacijenti pogođeni hemofilijom A mogu se lečiti infuzijom prečišćenog ili rekombinantno proizvedenog FVIII. Međutim, poznato je da svi komercijalno dostupni FVIII proizvodi imaju polu-raspad od oko 8-12 sati, što zahteva često intravenozno davanje pacijentima. Videti Weiner M.A. i Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D. Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Pored toga, brojni pristupi su isprobani kako bi se produžio polu-raspad FVIII. Na primer, pristupi u razvoju za produžavanje polu-raspada faktora zgrušavanja uključuju pegilaciju, glikopegilaciju i konjugaciju sa albuminom. Videti Dumont i dr., Blood.119(13): 3024-3030 (Objavljeno Jan.13, 2012). Bez obzira na upotrebljeni proteinski inženjering, međutim, dugo delujući FVIII proizvodi koji su trenutno u razvoju poboljšali su polu-raspad, ali navodno je da je polu-raspad ograničen - samo na oko 1.5 do 2 puta poboljšanja u predkliničkim modelima životinja. Dokazani su konzistentni rezultati kod ljudi, na primer, za rFVIIIFc se prijavilo da poboljšava polu-raspad do ∼ 1.7 puta u poređenju sa ADVATE® kod pacijenata sa hemofilijom A. Zbog toga povećanje polu-raspad, uprkos manjim poboljšanjima, može ukazivati na prisustvo drugih faktora koji ograničavaju T1/2. Videti Liu, T. i dr., 2007 ISTH meeting, abstract #P-M-035; Henrik, A. i dr., 2011 ISTH meeting, abstract #P=MO-181; Liu, T. i dr., 2011 ISTH meeting abstract #P-WE-131.

[0004] Polu-raspad plazme von Willebrand (VWF) iznosi oko 12 sati (u rasponu od 9 do 15 sati). http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2_scientificoverview.htm (poslednji put posećen 22. oktobra, 2011). Na polu-raspad VWF može uticati više faktora: obrazac glikozilacije, ADAMTS-13 (dezintegrin i metaloproteaza sa motivom trombospondina-13), i različite mutacije u VWF.

[0005] U plazmi 95-98% FVIII cirkuliše u tesnom nekovalentnom kompleksu sa VWF celom dužinom. Formiranje ovog kompleksa važno je za održavanje odgovarajućih nivoa FVIII u plazmi in vivo. Lenting i dr., Blood.92(11): 3983-96 (1998); Lenting i dr., J. Thromb.

Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). Divlji tip FVIII pune dužine uglavnom je prisutan kao heterodimer sa teškim lancem (MW 200kd) i lakim lancem (MW 73kd). Kada se FVIII aktivira zbog proteolize na pozicijama 372 i 740 u teškom lancu i na položaju 1689 u lakom lancu, VWF vezan za FVIII uklanja se iz aktiviranog FVIII. Aktivirani FVIII, zajedno sa aktiviranim faktorom IX, kalcijumom i fosfolipidom ("kompleks tenaze"), uključuje aktivaciju faktora X, stvarajući velike količine trombina. Trombin, sa svoje strane, zatim cepa fibrinogen da formira rastvorljive monomere fibrina, koji se zatim spontano polimerizuju da bi se formirao rastvorljivi polimer fibrina. Trombin takođe aktivira faktor XIII, koji zajedno sa kalcijumom služi za umrežavanje i stabilizaciju rastvorljivog polimera fibrina, formirajući umreženi (nerastvorljivi) fibrin. Aktivirani FVIII se brzo očisti iz cirkulacije proteolizom.

[0006] Zbog učestalog doziranja i neugodnosti uzrokovanih rasporedom doziranja, još uvek postoji potreba za razvojem proizvoda FVIII koji zahtevaju ređu primenu, tj. FVIII proizvoda koji imaju polu-raspad duži od ograničenja polu-raspada od 1.5 do 2 puta.

KRATAK REZIME PRONALASKA

[0007] Na osnovu obelodanjivanja koje je ovde sadržano, predmetni pronalazak obezbeđuje himerni protein koji sadrži protein faktora VIII ("FVIII") i fragment fon Willebrand faktora (VWF),

pri čemu FVIII protein sadrži A1 domen, A2 domen, A3 domen, C1 domen i C2 domen;

gde VWF fragment sadrži D' domenu i D3 domen VWF; i

pri čemu su VWF fragment i FVIII protein povezani kovalentnom vezom, koja sprečava disocijaciju VWF fragmenta iz FVIII proteina u prisustvu endogenog VWF, pri čemu VWF fragment inhibira ili sprečava endogeni VWF da se veže za protein FVIII zaštitom ili blokiranjem VWF mesta vezivanja za protein FVIII.

[0008] U srodnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein predmetnog pronalaska.

[0009] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida predmetnog pronalaska.

[0010] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža farmaceutski sastav koji sadrži himerni protein pronalaska, polinukleotid ili skup polinukleotida pronalaska, ili ćeliju domaćina pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0011] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje himerni protein pronalaska, polinukleotid ili skup polinukleotida pronalaska, ćeliju domaćina pronalaska ili sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja krvarenja. kod ispitanika kome je potrebna, gde je bolest ili poremećaj krvarenja izabran iz grupe koja se sastoji iz poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenja u mišićima, oralnog krvarenja, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, traume, trauma capitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u omotaču bočnog slabinskog mišića i bilo koje kombinacije istih.

[0012] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak pravljenja himernog proteina predmetnog pronalaska, koji obuhvata transfekciju jedne ili više ćelija domaćina polinukleotidom ili setom polinukleotida pronalaska i ekspresiju himernog proteina u ćeliji domaćinu.

[0013] Predmetni pronalazak i njegova otelotvorenja su izloženi u priloženim patentnim zahtevima

[0014] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment je povezan sa FVIII proteinom nekovalentnom vezom pored kovalentne veze između FVIII proteina i pripadajuće grupe (VWF fragment). U jednom primeru, VWF fragment je monomer. U drugom primeru, VWF fragment sadrži dva, tri, četiri, pet ili šest fragmenata VWF povezanih jedan ili više jedan drugog.

[0015] U jednom aspektu, himerni protein sadrži VWF fragment, i najmanje jednu heterolognu jedinicu (Hl) i fakultativni veznik između VWF fragmenta i heterologne grupe (H1). U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H1) može sadržati deo koji produžava poluraspad FVIII proteina, npr., polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, ostatak koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment i sve njihove kombinacije ili ne-polipeptidnu jedinicu odabranu iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njenog derivata i bilo koje kombinacije istih. U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H1) sadrži prvi Fc region. U drugom otelotvorenju, heterologni deo (H1) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najmanje oko 50 aminokiselina, najmanje oko 100 aminokiselina, najmanje oko 150 aminokiselina, najmanje oko 200 aminokiselina, najmanje oko 250 aminokiselina najmanje oko 300 aminokiselina, najmanje oko 350 aminokiselina, najmanje oko 400 aminokiselina, najmanje oko 450 aminokiselina, najmanje oko 500 aminokiselina, najmanje oko 550 aminokiselina, najmanje oko 600 aminokiselina, najmanje oko 650 aminokiselina, najmanje oko 700 aminokiselina, najmanje oko 750 aminokiselina, najmanje oko 800 aminokiselina, najmanje oko 850 aminokiselina, najmanje oko 900 aminokiselina, najmanje oko 950 aminokiselina, ili najmanje oko 1000 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži veznik između odgovarajuće grupe, npr., VWF fragmenta i heterologne grupe (H1), koja je razdeljivi veznik.

[0016] U drugom aspektu, FVIII protein u himernom proteinu sadrži FVIII i najmanje jednu heterolognu jedinicu (H2). U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H2) je sposobna da produži polu-raspad FVIII proteina, npr., polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, ostatak koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment i sve njihove kombinacije ili ne-polipeptidnu jedinicu koja sadrži polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njenog derivata i bilo koje kombinacije istih. U posebnom otelotvorenju, heterologni deo (H2) sadrži drugi Fc region.

[0017] U nekim otelotvorenjima, himerni protein sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment, prvi heterologni deo i veznik i drugi polipeptidni lanac koji sadrži FVIII protein i drugi heterologni deo, gde su prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac međusobno su povezane kovalentnom vezom. U jednom otelotvorenju, prvi heterologni deo i drugi heterologni deo međusobno su povezane kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom, peptidnom vezom ili veznikom, pri čemu kovalentna veza sprečava zamenu VWF fragmenta u prvom polipeptidni lanac sa endogenim VWF in vivo. U nekim otelotvorenjima, veznik između proteina FVIII i drugi heterologni deo je deljivi deo.

[0018] U nekim otelotvorenjima, prvi heterologni deo (H1) povezana sa VWF fragmentom i drugi heterologni deo (H2) koji je povezan sa FVIII proteinom su povezani vezom, npr., ScFc vezom, koji je procesor koji povezuje.

[0019] U još nekim otelotvorenjima, FVIII protein u himernom proteinu nadalje sadrži treći heterologni deo (H3), četvrti heterologni deo (H4), peti heterologni deo (H5), šesti heterologni deo (H6) ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom otelotvorenju, jedan ili više trećih heterolognih delova (H3), četvrtih heterolognih delova (H4), petih heterolognih delova (H5), šestih heterolognih delova (H6) mogu produžiti polu-raspad FVIII proteina. U drugim otelotvorenjima, treći heterologni deo (H3), četvrti heterologni deo (H4), peti heterologni deo (H5) i šesti heterologni deo (H6) povezane su sa C-terminalom ili N-terminalom FVIII ili su umetnute između dve aminokiseline FVIII. U drugom otelotvorenju, jedan ili više trećeg heterolognog dela (H3), četvrti heterologni deo (H4), peti heterologni deo (H5), ili šesti heterologni deo (H6) heterologni deo (H6) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja sadrži najmanje oko 50 aminokiselina, najmanje oko 100 aminokiselina, najmanje oko 150 aminokiselina, najmanje oko 200 aminokiselina, najmanje oko 250 aminokiselina najmanje oko 300 aminokiselina, najmanje oko 350 aminokiselina, najmanje oko 400 aminokiselina, najmanje oko 450 aminokiselina, najmanje oko 500 aminokiselina, najmanje oko 550 aminokiselina, najmanje oko 600 aminokiselina, najmanje oko 650 aminokiselina, najmanje oko 700 aminokiselina, najmanje oko 750 aminokiselina, najmanje oko 800 aminokiselina, najmanje oko 850 aminokiselina, najmanje oko 900 aminokiselina, najmanje oko 950 aminokiselina, ili najmanje oko 1000 aminokiselina.

[0020] U nekim otelotvorenjima, veznik između proteina FVIII i drugog heterolognog dela ili veze između VWF fragmenta i prvog heterolognog dela dalje sadrži prvo mesto deljenja (P1) na N-terminalnom području veze, drugo mesto deljenja (P2) na C-terminalnom području veznika, ili oba. U drugim otelotvorenjima, jedan ili više veznika između proteina FVIII i pripadajuće grupe, veznika između proteina FVIII i drugog heterolognog dela i veze između fragmenta VWF i prvog heterolognog dela imaju dužinu od oko 1 do oko 2000 aminokiselina.

[0021] U drugim slučajevima, himerni protein sadrži FVIII protein i pripadajuću jedinicu, koji su povezani veznikom između FVIII proteina i pripadajuće grupe, pri čemu veznik dalje sadrži motiv prepoznavanja sorta, npr., sekvencu LPXTG (SEQ ID NO:106).

[0022] Ovo obelodanjivanje je usmereno na fragment von Willebrandov faktor (VWF) koji sadrži D' domenu i D3 domen VWF, pri čemu se VWF fragment vezuje za faktor VIII (FVIII) i inhibira vezivanje endogenog VWF za protein FVIII. U jednom slučaju, VWF fragment obelodanjivanja nisu aminokiseline 764 do 1274 od SEQ ID NO:2. U jednom slučaju, protein FVIII, bez VWF fragmenta, ima polu-raspad uporediv sa divljim tipom FVIII. U drugom slučaju, FVIII protein je fuzioni protein koji sadrži FVIII i heterolognu jedinicu koja je sposobna da produži polu-raspad FVIII. Heterologni deo može biti polipeptid, ne-polipeptidna grupa ili oboje. Heterologna polipeptidna celina može biti izabrana iz grupe koja se sastoji iz konstantnog područja imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U drugim slučajevima, heterologni deo je imunoglobulinsko konstantno područje ili njegov deo, npr., Fc region. U drugim slučajevima, ne-polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njegovog derivata i bilo koje kombinacije istih. U određenim slučajevima, FVIII protein sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, pri čemu prvi polipeptidni lanac sadrži FVIII i prvi Fc region, a drugi polipeptidni lanac sadrži drugi Fc region bez FVIII.

[0023] U drugom slučaju, fragment VWF produžava polu-raspad FVIII. Aminokiselinska sekvenca D' domena može biti najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO:2. Takođe, aminokiselinska sekvenca D3 domena može biti najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 867 do 1240 SEQ ID NO:2. U određenim slučajevima, VWF fragment sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina u ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142 ili oba SEQ ID NO:2. U posebnom slučaju, VWF fragment sadrži, sastoji se u osnovi iz aminokiselina 764 do 1240 SEQ ID NO:2. VWF fragment može dalje da sadrži D1 domen, D2 domen ili D1 i D2 domene VWF. U nekim slučajevima, VWF fragment dalje sadrži VWF domen izabran iz grupe koja se sastoji iz A1 domena, A2 domena, A3 domena, D4 domena, B1 domena, B2 domena, B3 domena, C1 domena, C2 domen, CK domen, jedan ili više njegovih fragmenata i bilo koje kombinacije istih. U drugim slučajevima, VWF fragment je pegilovan, glikozilisan, heliran ili polisijalizovan.

[0024] Ovo obelodanjivanje je takođe usmereno na himerni protein koji sadrži VWF fragment koji je ovde opisan, heterolognu jedinicu i opcioni veznik između VWF fragmenta i heterologne grupe. Heterologni deo može biti polipeptid, ne-polipeptidna grupa ili oboje. U jednom slučaju, heterologna polipeptidna celina je izabrana iz grupe koja se sastoji iz konstantnog područja imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije . U drugom slučaju, heterologni ne-polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njegovog derivata i bilo koje kombinacije istih. U posebnom slučaju, heterologni deo je prvi Fc region. Himerni protein može dalje da sadrži drugi Fc region, pri čemu je drugi Fc region povezan ili povezan sa prvim Fc regionom ili je povezan ili je povezan sa VWF fragmentom.

[0025] U jednom aspektu, himerni protein predmetnog obelodanjivanja sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(aa) V-L1-H1-L2-H2,

(bb) H2-L2-H1-L1-V,

(cc) H1-L1-V-L2-H2, i

(dd) H2-L2-V-L1-H1,

gde je V jedan ili više fragmenata VWF ovde opisanih,

svaki od L1 i L2 je opcioni veznik;

H1 je prva heterologni deo;

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i

H2 je opcioni sekundarni heterologni deo.

[0026] U jednom slučaju, H1 je prva heterologni deo, npr., molekula za produženje poluraspada koji je poznat u struci. U jednom slučaju, prvi heterologni deo je polipeptid. Prva heterologna polipeptidna celina je izabrana iz grupe koja se sastoji iz konstantnog područja imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U drugom slučaju, H1 je ne-polipeptidna grupa izabrana iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njenog derivata i bilo koje kombinacije istih. H2 je opciona druga heterologni deo, na primer, molekul koji produžava polu-raspad, koji je poznat u stanju tehnike. U jednom slučaju, drugi heterologni polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U drugom slučaju, H2 je ne-polipeptidni deo izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njenog derivata i bilo koje kombinacije istih. U određenim slučajevima, H1 je prvi Fc region, a H2 je drugi Fc region. Prvi Fc region i drugi Fc region mogu biti isti ili različiti i mogu biti povezani jedni sa drugima pomoću veznika ili kovalentne veze, npr., disulfidne veze. U drugom slučaju, drugi Fc region povezan je ili povezan sa proteinom Faktor VIII. Po izboru, može postojati i treća heterologni deo, H3, koja je produžetak polu-raspada, koji je povezan sa VWF fragmentom, prvim heterolognim delom ili drugim heterolognim delom. Neograničavajući primeri trećeg heterolognog ostatka mogu da uključuju polipeptidni ili ne-polipeptidni deo ili oboje. U jednom slučaju, treći heterologni polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U drugom slučaju, H2 je ne-polipeptidni deo izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njenog derivata i bilo koje kombinacije istih. U nekim slučajevima, H3 je povezan sa VWF fragmentom ili prvim ili drugim heterolognim delom pomoću vezivnog veznika, na primer, veznika za deljenje trombina. Neograničavajući primeri veznika obelodanjeni su na drugom mestu ovde.

[0027] U jednom otelotvorenju, himerni protein sadrži VWF fragment ovde opisan, koji je povezan sa heterolognim delom. Heterologni deo može biti deo koji produžava polu-raspad proteina, koji sadrži polipeptid, ne-polipeptidnu jedinicu ili oboje. Primeri takvog heterolognog polipeptidnog dela uključuju, na primer, imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji veže albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, bilo koje derivate ili njihove varijante ili bilo koju njihovu kombinaciju. Primeri nepolipeptidne grupe uključuju, na primer, polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U drugom otelotvorenju, heterologni deo je prvi Fc region povezan sa VWF fragmentom. U drugim otelotvorenjima, himerni protein nadalje sadrži drugi Fc region povezan sa FVIII proteinom. VWF fragment ili FVIII protein mogu se povezati sa prvim Fc regionom ili drugim Fc regionom, respektivno, veznikom. U još nekim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment koji je ovde opisan, povezan je sa prvim heterolognimm delom, npr., prvim Fc regionom i FVIII protein povezan sa drugim heterolognim delom, npr., drugim Fc regionom, pri čemu je VWF fragment dalje vezan za drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) ili FVIII protein veznikom ili kovalentnom vezom ili je prvi heterologni deo (npr. Fc region) dalje povezan sa FVIII proteinom ili drugim heterolognim delom (npr., drugi Fc region) pomoću veznika ili kovalentne veze. U nekim otelotvorenjima, FVIII himernog proteina ima delimični B-domen. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sa delimičnim B domenom je FVIII198 (SEQ ID NO:105). U drugim otelotvorenjima, himerni protein nadalje sadrži motiv prepoznavanja sorte.

[0028] U nekim otelotvorenjima, kao rezultat pronalaska, polu-raspad proteina FVIII se produžava u poređenju sa proteinom FVIII bez VWF fragmenta ili divljim tipom FVIII. Poluraspad proteina FVIII je najmanje oko 1.5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2.5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta ,

1

najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili barem oko 12 puta duži od vremena polu-raspada proteina FVIII, bez VWF fragment. U jednom otelotvorenju, polu-raspad FVIII je oko 1.5 puta do oko 20 puta, oko 1.5 puta do oko 15 puta, ili oko 1.5 puta do oko 10 puta duže od vremena poluraspada divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, polu-raspad FVIII produžava se oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 -poklopac, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, otprilike 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, od oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta, u poređenju sa tim na divlji tip FVIII ili protein FVIII bez VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat , najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, na najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati ili najmanje oko 108 sati. U još nekim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sat do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana, oko 24 sata do oko tri dana ili oko 24 sata do oko dva dana.

[0029] U nekim otelotvorenjima, prosečni polu-raspad proteina FVIII po ispitaniku je oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sat, oko 22 sata, oko 23 sati, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sat, oko 32 sata, oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sati, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedne nedelje), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.

[0030] U drugom aspektu, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(a) V-L1-H1-L3- C-L2-H2,

(b) H2-L2-C- L3- H1-L1-V,

(c) C-L2-H2- L3- V-L1-H1,

(d) H1-L1-V- L3-H2-L2-C,

(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,

(f) H2-L2-C- L3- V-L1-H1,

(g) V-L1-H1-L3- H2-L2-C,

(h) C-L2-H2- L3- H1-L1-V,

(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,

(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,

(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, i

(l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,

gde je V ovde opisani fragment VWF;

svaki od L1 ili L2, je opcioni veznik, npr., trombin deljiv veznik;

L3 je opcioni veznik, npr. ScFc veznik, npr., veznik za obradu;

svaki od H1 i H2 je opcioni heterologni deo; i

C je FVIII protein; i

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina.

[0031] U drugim aspektima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(m) V-L1-H1: H2-L2-C,

(n) V-L1-H1:C-L2-H2,

(o) H1-L1-V:H2-L2-C,

(p) H1-L1-V:C-L2-H2,

(q) V:C-L1-H1:H2,

(r) V:H1-L1-C:H2,

(s) H2:H1-L1-C:V,

(t) C:V-L1-H1:H2, i

(u) C:H1-L1-V:H2,

gde je V ovde opisani fragment VWF;

svaki od L1 ili L2, je opcioni veznik, npr., trombin deljiv veznik;

svaki od H1 i H2 je opcioni heterologni deo; i

C je FVIII protein;

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i

(:) je kovalentna veza između H1 i H2, između V i C i između V i H1 i C i H2. (:) predstavlja najmanje jednu n-peptidnu vezu. U određenim otelotvorenjima, hemijska asocijacija, tj., (:) je kovalentna veza. U nekim otelotvorenjima, povezanost između Hl i H2 je kovalentna veza, npr. disulfidna veza. U drugim otelotvorenjima, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U drugim otelotvorenjima, (:) je peptidna veza. U jednom otelotvorenju, Hl je prvi heterologni deo. U jednom otelotvorenju, prvi heterologni deo je sposoban da produži polu-raspad FVIII aktivnosti. U drugom otelotvorenju, prvi heterologni deo je polipeptid, ne-polipeptidna grupa ili oboje. U jednom otelotvorenju, prvi heterologni polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U drugom otelotvorenju, nepolipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njegovog derivata i bilo koje kombinacije istih. U nekim otelotvorenjima, H2 je drugi heterologni deo. Drugi heterologni deo takođe može biti produžetak polu-raspada poznat u stanju tehnike i može biti polipeptid, ne-polipeptidna grupa ili kombinacija oba. U jednom otelotvorenju, drugi heterologni polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, transferina ili njegovog fragmenta i bilo koje njihove kombinacije. U određenim otelotvorenjima, ne-polipeptidni deo je izabran iz grupe koja se sastoji iz polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES), njegovog derivata i bilo koje kombinacije istih. U posebnom otelotvorenju, H1 je prvi Fc region. U posebnom otelotvorenju, H2 je drugi Fc region. Opciono, može postojati i treći heterologni deo H3, koja je produžetak polu-raspada. H3 može biti povezan sa jednim ili više od V, C, H1 ili H2 opcionim veznikom, npr., deljivim veznikom, npr., deljivim veznikom

1

trombina. Neograničavajući primeri treće heterologne grupe mogu da uključuju konstantnu oblast imunoglobulina ili njen deo, albumin ili njegov fragment, polietilen glikol (PEG), PAS sekvencu i hidroksietil skrob (HES) ili njegov derivat.

[0032] U određenim otelotvorenjima, jedan ili više veznika koji se koriste za povezivanje VWF fragmenta, FVIII proteina, prva heterologni deo i/ili druga heterologni deo formula (a) do (u) jedna sa drugom je deljivi veznik. Jedno ili više mesta deljenja koja se koriste u himernom proteinu mogu se podeliti proteazom odabranom iz grupe koja se sastoji od faktora XIa, faktora XIIa, kalikreina, faktora VIIa, faktora IXa, faktora Xa, faktora IIa (trombin), Elastaza-2, Granzim-B, TEV, Enterokinaza, Proteaza 3C, Sortaza A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 i MMP-20. U drugim otelotvorenjima, jedan ili više veznika koji se koriste u formulama (a) do (1) (npr., L3) sadrže veznik za preradu. Prerađivački se veznici mogu odvojiti unutarćelijskim enzimom nakon izlučivanja. Veznik za preradu može da sadrži prvo mesto deljenja (P1) na N-terminalnom regionu veznika, drugo mesto deljenja (P2) na C-terminalnom regionu veznika, ili oboje.

[0033] U nekim otelotvorenjima, jedan ili više veznika koji se koriste u pronalasku imaju dužinu od najmanje oko 1 do 2000 aminokiselina. U specifičnom otelotvorenju, jedan ili više veznika koji se koriste u pronalasku imaju dužinu najmanje oko 20, 35, 42, 48, 73, 98, 144, 288, 324, 576 ili 864 aminokiselina. U određenom otelotvorenju, jedan ili više veznika sadrži gly/ser peptid. Gly/ser peptid može biti (Gly4 Ser)3ili (Gly4 Ser)4.

[0034] U drugim aspektima, FVIII protein u himernom proteinu je funkcionalni protein faktora VIII. FVIII protein može da sadrži jedan ili više domena FVIII odabranih iz grupe koja se sastoji iz A1 domena, A2 domena, B domena, A3 domena, C1 domena, C2 domena, jednog ili više njihovih fragmenata i bilo koje njihove kombinacije. U jednom otelotvorenju, FVIII protein sadrži B domen ili njegov deo. U drugom otelotvorenju, protein FVIII je izbrisan FVIII domen SQ B. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži težak lanac FVIII i laki lanac faktora VIII, pri čemu su teški i laki lanac povezani metalnom vezom. U još nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži težak lanac FVIII i laki lanac faktora VIII, pri čemu su teški i laki lanac povezani metalnom vezom. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein ima nizak afinitet za ili se ne vezuje za protein povezan sa lipoproteinom niske gustine (LRP). Na primer, FVIII protein koristan za pronalazak može da sadrži bar jednu supstituciju aminokiselina koja smanjuje afinitet ili eliminišu vezivanje za LRP. Neograničavajući primeri najmanje jedne supstitucije aminokiselina su u ostatku koji odgovara ostatku 471, ostatku 484, ostatku 487, ostatku 490, ostatku 497, ostatku 2092, ostatku 2093 ili dve ili više kombinacija istih zrelih FVIII u celoj dužini. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein u himernom proteinu predmetnog pronalaska sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina, koja indukuje da je FVIII protein stabilniji od proteina FVIII bez supstitucije. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina u A2 domenu i najmanje jednu supstituciju aminokiselina u A3 domenu, pri čemu su A2 domen i A3 domen međusobno povezani kovalentnom vezom. Neograničavajući primeri supstitucije aminokiselina u A2 domenu su na ostatku koji odgovara ostatku 662 ili 664 zrele FVIII pune dužine. Pored toga, neograničavajući primeri supstitucije aminokiselina u A3 domenu su u ostatku koji odgovara ostatku 1826 ili 1828 zrelog FVIII pune dužine je polisijalizovan.

[0035] U daljim otelotvorenjima, obelodanjivanje obezbeđuje polinukleotid koji kodira VWF fragment ovde opisan ili himerni protein ovde opisan, ili skup polinukleotida koji sadrže prvi nukleotidni lanac i drugi nukleotidni lanac, pri čemu prvi nukleotidni lanac kodira VWF fragment i drugi nukleotidni lanac kodira drugi Fc region ili faktor zgrušavanja ili njen fragment himernog proteina. U jednom slučaju, set polinukleotida dalje sadrži treći polinukleotidni lanac, koji kodira proprotein konvertazu, pripada porodici proproteinkonvertaze slične subtilizinu. Neograničavajući primeri proprotein konvertaze uključuju proprotein konvertazu subtilizin/keksin tip 3 (PACE ili PCSK3), proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 5 (PCSK5 ili PC5), proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 7 (PCSK7 ili PC7), ili a kvas Kex 2. U još nekim aspektima, obelodanjivanje uključuje vektor koji sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida i jedan ili više promotora koji su operativno povezani sa polinukleotidom ili skupom polinukleotida ili skup vektora koji sadrže prvi vektor i drugi vektor, pri čemu je prvi vektor kodira prvi polinukleotidni lanac skupa polinukleotida i drugi vektor kodira drugi polinukleotidni lanac skupa polinukleotida. Skup vektora može dalje da sadrži treći vektor, koji sadrži treći polinukleotidni lanac koji kodira PC5 ili PC7. U nekim slučajevima, vektor dalje sadrži PACE. U nekim slučajevima, PACE cepa D1D2 domene VWF fragmenta.

[0036] U nekim aspektima, obelodanjivanje je usmereno na farmaceutski sastav koji sadrži VWF fragment, himerni protein, polinukleotid, skup polinukleotida, vektor ili skup vektora i farmaceutski prihvatljiv nosač. Sastav ovog obelodanjivanja može produžiti polu-raspad faktora VIII. U drugim aspektima, obelodanjivanje uključuje ćeliju domaćina koja sadrži

1

polinukleotid, skup polinukleotida, vektor ili skupove vektora.

[0037] U drugim aspektima, predmetno obelodanjivanje je privučeno na himerni protein koji sadrži FVIII protein, dodatnu jedinicu i opcioni veznik, pri čemu adjuvantna grupa inhibira ili sprečava endogeni VWF da se veže za protein FVIII i ima najmanje jedan VWF sličan FVIII zaštitnoj osobini. VWF-slično zaštitno svojstvo FVIII obuhvata zaštitu proteina FVIII od jednog ili više deljenja proteaze, štiteći FVIII protein od aktivacije, stabilizaciju teškog lanca i/ili lakog lanca FVIII proteina, ili sprečavanje uklanjanja proteina FVIII jednim ili više receptora za čišćenje.

[0038] Pomoćna grupa u himernom proteinu može inhibirati ili sprečavati vezivanje endogenog VWF na FVIII protein zaštitom ili blokiranjem VWF vezivnog mesta na FVIII proteinu. U nekim slučajevima, vezno mesto VWF je smešteno u A3 domenu ili C2 domenu FVIII proteina ili oba domena A3 i C2 domenu FVIII proteina. U drugom slučaju, vezno mesto VWF je aminokiselinska sekvenca koja odgovara aminokiselinama 1669 do 1689 i 2303 do 2332 od SEQ ID NO:16. U nekim slučajevima, pomoćna grupa je polipeptid, nepolipeptidna celina ili oboje. Polipeptid koristan kao dodatna grupa može da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ili 1000 aminokiselina u dužini. Na primer, polipeptid koristan kao dodatna grupa može biti izabran iz grupe koja se sastoji od VWF fragmenta, konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela, albumina ili njegovog fragmenta, vezivnog dela albumina, PAS sekvence, HAP sekvence, druge tehnologije za produženje polu-raspada i sve njihove kombinacije. Nepolipeptidna celina korisna kao dodatna grupa može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od polietilen glikola (PEG), polisijalne kiseline, hidroksietil skroba (HES) ili njegovog derivata i bilo koje kombinacije istih. U jednom slučaju, pomoćni deo je VWF fragment ovde opisan. Prilagodljivi deo i FVIII protein mogu biti povezani, npr., veznikom ili povezani jedni sa drugima. Veznik može sadržati deljivi veznik, npr., trombin deljivi veznik.

[0039] U jednom aspektu, obelodanjivanje obezbeđuje postupak sprečavanja ili inhibicije vezivanja proteina FVIII sa endogenim VWF koji sadrži dodavanje efektivne količine VWF fragmenta, himernog proteina, polinukleotida ili seta polinukleotida u ćeliju koja sadrži FVIII protein ili polinukleotid koji kodira FVIII protein, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein. U drugom aspektu, obelodanjivanje uključuje postupak sprečavanja ili

1

inhibicije vezivanja proteina FVIII sa endogenim VWF koji sadrži dodavanje efektivne količine himernog proteina, polinukleotida ili skupa polinukleotida ispitaniku kome treba, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein i na taj način sprečava ili inhibira vezivanje FVIII proteina. U nekim aspektima, obelodanjivanje uključuje postupak produženja ili povećanja polu-raspada proteina FVIII, pri čemu postupak uključuje dodavanje efikasne količine VWF fragmenta, himernog proteina, polinukleotida ili seta polinukleotida u ćeliju koja sadrži FVIII protein ili polinukleotid koji kodira FVIII protein ili ispitanik kome je to potrebno, pri čemu se VWF fragment vezuje na FVIII protein. U drugim aspektima, obelodanjivanje se skreće na postupak sprečavanja ili inhibicije uklanjanja FVIII proteina iz ćelije, pri čemu postupak uključuje dodavanje efektivne količine VWF fragmenta, himernog proteina, polinukleotida ili skupa polinukleotida u ćelija koja sadrži FVIII protein ili polinukleotid koji kodira FVIII protein ili ispitaniku kome je to potrebno, pri čemu se VWF fragment vezuje za protein FVIII.

[0040] U drugom aspektu, obelodanjivanje je usmereno na postupak lečenja krvarenja ili poremećaja kod ispitanika kome je to potrebno, koji obuhvata primenu efektivne količine VWF fragmenta, himernog proteina, polinukleotida ili skupa polinukleotida, gde je bolest ili poremećaj krvarenja izabran iz grupe koja se sastoji iz poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenja u mišićima, oralnog krvarenja, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, traume, trauma capitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču bočnog slabinskog mišića. U drugim slučajevima, tretman je profilaktički ili na zahtev. U još nekim slučajevima, obelodanjivanje je postupak lečenja bolesti ili poremećaja koji je povezan sa bolešću tipa 2N von Willebrand ispitaniku kome je potreban, a koja uključuje efikasnu količinu VWF fragmenta, himerni protein, polinukleotid ili skup polinukleotida, pri čemu se leči bolest ili poremećaj.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0041]

Slika 1A-F. Šematski dijagrami VWF proteina. Slika 1A prikazuje dva VWF fragmenta koji sadrže aminokiseline 1 do 276 SEQ ID NO:73 (aminokiseline 764 do 1039 od SEQ ID NO:2). VWF-001 se sintetiše bez pre/propeptidne sekvence VWF, dok je VWF-009 sintetizovan sa pre/propeptidnim sekvencama (D1 i D2 domeni).

1

Prepeptid VWF-009 se cepa tokom sinteze, a VWF-009 sadrži propeptid sa sekvencama D' i D3 domena. Slika 1B prikazuje tri VWF fragmenta koji sadrže aminokiseline 1 do 477 SEQ ID NO:73 (aminokiseline 764 do 1240 od SEQ ID NO:2). VWF-002 se sintetiše bez pre/propeptidnih sekvenci. VWF-010 sadrži D1D2 domene pored D'D3 domena. VWF-013 sadrži D1D2D'D3 domene pored ostataka alanina koji supstituišu cisteine na ostacima 336 i 379 od SEQ ID NO:72. Sl.1C prikazuje dva VWF fragmenta koji sadrže D'D3 domene i deo A1 domena. VWF-003 ima aminokiseline 764 do 1274 od SEQ ID NO:2). VWF-011 sadrži D1D2 domene pored D'D3 domena. Sl. ID prikazuje dva konstrukta, VWF-004 i VWF-012. VWF-004 sadrži D'D3 domene i kompletnu sekvencu A1 domena. VWF-012 sadrži D1D2D'D3 domene i kompletnu sekvencu A1 domena. Slika IE prikazuje tri konstrukta. VWF-006 sadrži D1D2D'D3 domene i CK domenu VWF (cistein domen čvora). VWF-008 je VWF pune dužine. VWF-031 (VWF-Fc) prikazuje konstrukt koji sadrži domene D1D2D'D3 povezane na jedan Fc region pomoću deljivog veznika. VWF-053 je D1D2 domeni. Slika IF prikazuje protein VWF pune dužine koji sadrži propeptid (domene D1 i D2) i zrele podjedinice (domeni D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2). VWF protein je oko 250 kDa proteina i formira multimere (> 20 MDa) disulfidnim vezanjem. VWF protein se asocira na FVIII (95-98%) u nekovalentnom kompleksu, a zatim produžava polu-raspad FVIII zaštitom FVIII od deljenja/aktivacije proteaze, stabilizacijom teškog i lakog lanca i sprečavanjem čišćenja FVIII od receptora za uklanjanje proteina. VWF protein takođe može ograničiti polu-raspad FVIII uklanjanjem FVIII-VWF kompleksa preko VWF receptora i sprečavanjem pinocitoze i recikliranja rFVIIIFc.

Slika 2. Šematski dijagrami primera VWF:FVIII heterodimernih konstrukcija. Levi konstrukt prikazuje VWVF fragment koji ima D'D3 domene VWF cele dužine (aminokiseline 1-477 od SEQ ID NO:73) i koji sadrži alaninske supstitucije sa ostacima 336 i 379 od SEQ ID NO:72. Konstrukt himernog proteina (FVIII 064/065) sadrži C-kraj VWF fragmenta povezanom za prvi Fc region i FVIII je povezan sa drugom Fc regionom, pri čemu je drugi Fc region dalje povezan sa N-kraj VWF fragmenta pomoću veznika (npr., formula C-H1-L1-V-L2-H2, gde je V fragment VWF, C je FVIII, H1 i H2 su Fc regije, a L1 i L2 su deljivi veznici). Konstrukt na Slici 2b je intracelularno obrađen VWF:FVIII heterodimerni konstrukt gde je veznik između drugog Fc i N-kraja VWF fragmenta odvojen. FVIII-064 sadrži D'D3 domene VWF (aminokiseline 1 do 477 SEQ ID NO:73 sa C336A i C379 supstitucije). FVIII-

1

065 sadrži D'D3 domene VWF (aminokiseline 1 do 276 SEQ ID NO:73). FVIII-136 sadrži FVIIIFc povezan na D'D3 fragment-Fc pomoću veznika koji može biti obrađen intracelularnim enzimom proteaze. Kada se FVIII-136 eksprimira, enzim cepa vezu između drugog Fc (spojenog u FVIII-LC) i VWF D'D3 fragmenta (spojenog sa prvim Fc), dok se Fc region spaja za (ili je povezan sa) FVIII-LC formira kovalentnu vezu (npr., disulfidnu vezu) sa prvim Fc spojenim (ili povezanim) sa VWF fragmentom. FVIII-148 je jednolančani FVIIIFc sa D'D3 fragmentom (jednolančani FVIII uvođenjem mutacije R1645A/R1648A u FVIII gen).

Slika 3. FVIII-064 sadrži D'D3 domene VWF (aminokiseline 1 do 477 SEQ ID NO:73 sa C336A i C379 zamene). Konstrukti (FVIII-064, FVIII-159, FVIII-160, FVIII-178 i FVIII-179) imaju zajedničku strukturu predstavljenu formulom C-H1-L1-V-L2-H2, ali sadrže primere različitih veznika ili supstitucije aminokiselina Prikazani konstrukti sadrže isti VWF fragment, koji je D' i D3 domene VWF (tj., aminokiseline 1 do 477 SEQ ID NO:73 sa supstitucijama aminokiselina C336A i C379A). Konstrukt FVIII 64 ima trombin deljivi veznik (tj., L2) između VWF fragmenta i Fc (tj., H2), koji sadrži 20 aminokiselina. Konstrukt FVIII 159 ima trombin deljivi veznik (tj., L2) između VWF fragmenta i Fc (tj., H2), koji sadrži 35 aminokiselina. Konstrukt FVIII 160 ima trombin deljivi veznik (tj., L2) između VWF fragmenta i Fc (tj., H2), koji sadrži 48 aminokiselina. Konstrukti FVIII-180, FVIII-181 i FVIII-182 su derivati FVIII-160 koji sadrže mutaciju K2092A u domenu FVIII C1, mutaciju K2093A u domenu FVIII C1, i mutacije K2092A/K2093A u domenu FVIII C1, respektivno. Konstrukt FVIII-178 ima trombin deljivi veznik (tj., L2) između VWF fragmenta i Fc (tj., H2), koji sadrži 73 aminokiselina. Konstrukt FVIII-179 ima trombin deljivi veznik (tj., L2) između VWF fragmenta i Fc (tj., H2), koji sadrži 98 aminokiselina. Slika 4: Šematski dijagrami primera konstrukata FVIII-VWF, u kojima je VWF D1D2D'D3 fragment VWF, Veznik je veznik promenljive dužine koji sadrži mesto deljenja, npr., mesto deljenja trombina, SC FVIII je jednolančani FVIII, koji sadrži supstitucije R1645A/R1648A, H je heterologni deo, npr., konstantni region imunoglobulina ili njen deo, deo za konjugaciju polietilen glikola (PEG) i/ili PEG, fragment albumina ili albumin, ostatak koji vezuje albumin, HAP sekvenca, deo za polisijalizovanje i/ili polisijalnu kiselinu, deo za hidroksietil skrob (HES) i/ili HES, ili PAS sekvencu itd., HC FVIII je teški lanac FVIII, LC FVIII je laki lanac od FVIII i Fc je Fc region imunoglobulinskog konstantnog regiona. Slika 4A ima formulu VWF-Veznik-SC FVIII. Slika 4B ima formulu VWF-Veznik-H-Veznik-SC FVIII. Veznici

1

(prvi veznik između VWF i H i drugi vez između H i SC FVIII) mogu biti identični ili različiti. Slika 4C ima formulu VWF-Veznik-SC FVIII-Veznik-H. Veznici (prvi veznik između VWF i SC FVIII i drugi vez između SC FVIII i H) mogu biti identični ili različiti. Slika 4D ima formulu VWF-Veznik-HC FVIII-H-Veznik-LC FVIII.

Veznici (prvi veznik između VWF i HC FVIII i drugi veznik između H i LC FVIII) mogu biti identični ili različiti. Slika 4E ima formulu HC FVIII-H-LC FVIII-Veznik prvi Fc-Veznik-VWF-Veznik-drugi Fc. Veznici (prvi veznik između LC FVIII i prvog Fc, drugi veznik između prvog Fc i VWF i treći veznik između VWF i drugog Fc) mogu biti identični ili različiti. Veznici mogu biti deljivi veznik. Na primer, veznik između prvog Fc i VWF može biti deljivi veznik i koji sadrži mesto deljenja na N-terminalu i/ili C-terminalu veznika. Prvi Fc i drugi Fc mogu biti identični ili različiti. Slika 4F ima formulu HC FVIII-H-LC FVIII-Veznik prvi Fc-Veznik-VWF-Veznik-drugi Fc. Veznici (prvi veznik između LC FVIII i prvog Fc, drugi veznik između prvog Fc i VWF i treći veznik između VWF i drugog Fc) mogu biti identični ili različiti. Jedan ili više veznika mogu biti deljivi veznici. Na primer, veznik između prvog Fc i VWF može biti deljivi veznik i koji sadrži mesto deljenja na N-terminalu i/ili C-terminalu veznika. Prvi Fc i drugi Fc mogu biti identični ili različiti. Slika 4G ima formulu SC FVIII-Veznik-Fc-Veznik-VWF-H-Veznik-Fc. Slika 4H ima formulu pegilovanog ili hesilovanog SC FVIII-Veznik-Fc-Veznik-VWF-H-Veznik-Fc.

Veznici (prvi veznik između SC FVIII i prvog Fc, drugi veznik između prvog Fc i VWF i treći veznik između H i drugog Fc) mogu biti identični ili različiti. Jedan ili više veznika mogu biti deljivi veznici. Na primer, veznik između prvog Fc i VWF može biti deljivi veznik i koji sadrži mesto deljenja na N-terminalu i/ili C-terminalu veznika. Prvi Fc i drugi Fc mogu biti identični ili različiti.

Slika 5. Šematski dijagrami heterodimerov sistem ko-transfekcije FVIII-VWF.

Konstrukcija FVIII-155 sadrži FVIII sekvenciju pune dužine (sa ostatkom alanina koji zamenjuje ostatke arginina u 1645 i 1648) povezane sa Fc regionom. VWF-031 sadrži fragment D1D2D'D3 (sa ostatkom alanina koji supstituiše cisteinske ostatke na 336 i 379) koji je povezan sa drugim Fc regionom sa 48-trombinim deljivim veznikom. Nakon unutarćelijske obrade, konstrukt FVIII-155 proizvodi jednolančani FVIII (SCFVIII) pune dužine spojen na jedan Fc fragment, konstrukcija VWF-031 proizvodi fragment 477 aminokiselina D'D3 povezan sa drugim Fc fragmentom. Dve kovalentne veze mogu se formirati između Fc fragmenata koji su povezani sa SC FVIII ili D'D3 fragmentom, što zauzvrat omogućava kovalentnu povezanost FVIII i

2

D'D3, što je glavni lik željenog krajnjeg proizvoda.

Slika 6 je ne-redukujući i i redukujući SDS PAGE VWF-009 (D1D2D'D31-276 aa x 6 HIS), koji pokazuje da VWF-009 postoji kao monomer. Neobrađen znači VWF-009 sa propeptidom (domeni D1D2).

Slika 7 je ne-redukujući i redukujući SDS PAGE VWF-002 (D'D31-477 aa x 6 his) ili VWF-010 (D1D2D'D31-477 aa x 6 his), što pokazuje da VWF-002 postoji kao monomera, a VWF-010 postoji kao dimer.

Slika 8 prikazuje razgradnju trombina heterodimera FVIII-VWF prikazanog na Slici 2(b). Traka 1 prikazuje marker. Traka 2 je rFVIII-Fc bez trombina. Traka 3 je rFVIII-Fc sa trombinom. Traka 5 je FVIIIFc-VVF. Traka 6 prikazuje FVIIIFc-VWF i trombin. A1 označava A1 domen FVIII, A2 označava A2 domen FVIII, a Δa3 LC označava laki lanac FVIII.

Slika 9A-B prikazuje FVIII aktivnost merenu FVIII hromogenim testom. Slika 9A prikazuje farmakokinetički profil rFVIII i rFVIIIFc kod HemA miša. Sl.9B prikazuje PK profil rFVIII i rFVIIIFc kod FVIII/VWF miša sa dvostrukim nokaut mišem (DKO). Osa Y pokazuje FVIII aktivnost u mIU/mL, a X osa pokazuje vreme.

Slika 10A-B prikazuje FVIII zaštitu od D'D3 fragmenata kao što je prikazano nivoom mFVIII u plazmi (mIU/mL) i nivoom ekspresije VWF (nM/mL) 48 sati nakon injekcije plazmida. VWF fragmenti koji se koriste za pokazivanje zaštite od FVIII su VWF-001 (276aa, monomer), VWF-009 (276aa, monomer), VWF-002 (477aa, monomer), VWF-010 (477aa,dimer), VWF-003 (511aa, monomer), VWF-011 (511aa, dimer), VWF-004 (716aa, monomer), VWF-012 (716aa, dimer), VWF-006 i VWF-008.

Slika 11 prikazuje farmakokinetički profil rBDD-FVIII kod FVIII-VWF DKO miševa kada se primenjuje zajedno sa D'D3 fragmentima. Slika 11A prikazuje aktivnost FVIII (mIU/mL) merenu FVIII hromogenim testom posle zajedničkog davanja rBDD-FVIII i VWF-002 ili rBDD-FVIII i VWF-010 ili rBDD-FVIII samo u FVIII/VWF DKO miševima. Slika 11B prikazuje nivo VWF-002 i VWF-010 u plazmi (ng/mL) nakon davanja. Osa X predstavlja vreme u satima.

Slika 12 prikazuje farmakokinetički profil rFVIIIFc kod miševa koji eksprimiraju VWF D'D3. Slika 12A prikazuje vremensku traku hidrodinamičke injekcije (HDI) D'D3 domena koji kodira plazmidnu DNK (dan -5), intravenozno doziranje rFVIIIFc (dan 0) i prikupljanje PK uzoraka (dan0 - dan3). Slika 12B prikazuje FVIII aktivnost infuzije u plazmi nakon fFVIIIFc (mIU/mL) merenu FVIII hromogenim testom u FVIII/VWF DKO miševima sa HDI D1D2D'D3 domena (477aa) (krug) i D1D2D'D3 domena (477aa) sa cisteinske supstitucije (pravougaonik) kod FVIII/VWF DKO miševa. Aktivnost FVIII kod kontrolnih miševa bez HDI D'D3 domena prikazana je kao trougao. Slika 10C prikazuje nivo D'D3 u plazmi (ng/mL) nakon HDI davanja dimera D1D2D'D3 ili DNK konstrukta D1D2D'D3 monomera. Osa X predstavlja vreme u satima.

Slika 13 prikazuje D'D3-Fc deo veznika od HDI kod FVIII/VWF DKO miševa.

Različite dužine veznika (20aa (FVIII-064), 35aa (FVIII-159) ili 48aa (FVIII-160) su ubačene između D'D3 domena i Fc regiona. FVIII aktivnost (mIU/ml) je merena FVIII hromogenim testom posle HDI kod FVIII/VWF DKO miševa.

Slika 14 prikazuje HDI jednolančani heterodimer FVIIIFc/D'D3 kod FVIII/VWF DKO miševa. Aktivnosti FVIII prerađenog (dvolančanog) rFVIIIFc-D'D3 (pSIN-FVIII-136) i jednolančanog rFVIIIFc-D'D3 (pSIN-FVIII-148) mereno je 24 sata i 48 sati nakon HDI.

Slika 15 prikazuje afinitet vezivanja FVIII-155/VWF-031 heterodimera na imobilizovani hVWF pomoću Octet testa. FVIIIFc, FVIII i IgG su takođe korišćeni kao kontrole. Osa x pokazuje vreme u sekundama, a osa y prikazuje vezivanje u nanometru (nm).

Slika 16 prikazuje FVIII-155/VWF-031 farmakokinetiku kod miševa sa nedostatkom FVIII/VWF (FVIII/VWF DKO). Osa x pokazuje vreme u satima, a osa y označava FVIII v. unos u procentima.

Slika 17: Šematski dijagrami primera konstrukcija fragmenata VWF u kojima je VWF fragment VWF D1D2D'D3; Veznik je veznik promenljive dužine koji sadrži mesto deljenja, npr., mesto deljenja trombina; H je heterologni deo, npr., konstantni region imunoglobulina ili njen deo, grupa za konjugaciju polietilen glikola (PEG) i/ili PEG, fragment albumina ili albumina, deo koji veže albumin, HAP sekvenca, deo za polisijalizovanje i/ili polisijalna kiselina, deo za hidroksietil skrob (HES) i/ili HES, ili sekvencu PAS, itd.; i Fc je Fc region imunoglobulina. Slika 17A ima formulu D1D2-D'parcijalni D3-H-parcijalni D3-Veznik-Fc. Slika 17B ima formulu D1D2-parcijalni D'-H- parcijalni D'D3-Veznik-Fc. Slika 17C ima formulu D1D2-pegilovanog ili hesilovanog D'D3-Veznik-Fc. Veznik je opciono podeljen.

Slika 18: A) pokazuje da FVIIIFc gubi FVIII aktivnost u HemA (dijamant) i DKO (kvadrat) plazmi tokom vremena. Aktivnost FVIII meri se hromogenim testom. Osa X pokazuje vreme u satima, a osa y pokazuje relativnu aktivnost. B) pokazuje da je gubitak aktivnosti FVIII posledica disocijacije ili degradacije teškog lanca (HC). Levi panel prikazuje test loženja imuniteta koristeći ovčje anti-FVIII poliklonalno antitelo u Bio-rad 4-15% gelu. Sistem je redukovan i zamišljen pomoću Bio-rad sistema. Traka 1 prikazuje nepromenjeni marker Bio-rad; Traka 2 prikazuje FVIIIFc i PBS; Traka 3 prikazuje FVIIIFc i DKO plazmu; i traka 5 prikazuje samo ovčje anti-FVIII poliklonsko antitelo. Desni panel prikazuje zapadnu analizu gela korišćenjem antitela teškog lanca FVIII (GMA012). Traka 1 prikazuje nepromenjeni marker Bio-rad; Traka 2 prikazuje FVIIIFc i PBS; Traka 3 prikazuje FVIIIFc i DKO plazmu; i traka 4 prikazuje samo ovčje anti-FVIII poliklonsko antitelo.

Slika 19: prikazuje aktivnost FVIII divljeg tipa FVIIIFc (krug), scFVIIIFc (jednolančani FVIII) (ispunjeni trougao), ili FVIII: VWF heterodimer (npr., FVIII155/VVF31) (prazan trougao) hromogenim testom u plazmi miša DKO (levi panel) i HemA plazma miša (desni panel) kao funkcija vremena. Y osa pokazuje relativnu FVIII aktivnost. Divlji tip FVIIIFc sadrži dvostruki lanac FVIII (tj., teški lanac FVIII i laki lanac FVIII koji se drži nekovalentno zajedno) i tako ima tri lanca, teški lanac FVIII, laki lanac FVIII spojen na Fc i samo Fc. ScFVIIIFc sadrži jednolančani FVIII i tako ima dva lanca, jedan jednolančani FVIII spojen sa Fc i drugi sa Fc sam. FVIII:VWF heterodimer (npr., FVIII155/VWF031) sadrži jednolančani FVIII spojen na Fc i VWF fragment (D'D3) spojen na Fc.

Slika 20 prikazuje obradu D1D2 domena iz VWF fragmenta (npr., VWF-031 (D1D2D'D3Fc)) pomoću PC5 ili PACE (Furin) u različitim koncentracijama. Obrada D1D2 prikazana je na Bio-rad 4-15% gelu u smanjenom stanju pomoću Bio-rad prikazivača. Traka 1 prikazuje samo VWF031; traka 2 prikazuje samo PC5; traka 3 prikazuje samo PACE; traka 4 prikazuje VWF031 i PC5 na 2.5%; traka 5 prikazuje VWF031 i PC5 na 5%; traka 6 prikazuje VWF031 i PC5 na 7.5%; traka 7 prikazuje VWF031 i PC5 na 10%; traka 8 prikazuje VWF031 i PACE na 2.5%; traka 9 prikazuje VWF031 i PACE na 5 %; traka 10 prikazuje VWF031 na 7.5%; i traka 11 prikazuje VWF031 i PACE na 10%.

Slika 21: A) pokazuje da je ispitivanje vezivanja FVIII:VWF heterodimera (npr., FVIII-155/VWF-031) pomoću ForteBio oktet instrumenta. Za ispitivanje, VWF pune dužine snimljen je korišćenjem APS senzora. Vezivanje FVIIIFc i FVIII na VWF pune dužine prikazano je na donjem levom panelu. Nedostatak vezivanja FVIIII1680 (mutant koji nema afinitet za VWF) i FVIII:VWF heterodimer (FVIII155/VWF031) prikazan je na donjem desnom panelu. B) prikazuje još jedan test vezivanja

2

FVIII:VWF heterodimera (npr., FVIII-155/VWF-031). U ovom testu, konstrukti (konstrukcija VWF031, FVIII-155/VWF031 ili FVIII) su imobilizovani na protein G senzoru. Izmereno je vezivanje konstrukata za FVIII.

Slika 22 prikazuje afinitet vezivanja VWF D'D3 domena sa FVIII molekulom merenim eksperimentom površinske rezonance plazme. Konstrukt VWF031 (100RU) snimljen je 1000RU anti-humanim IgG. Izbrisani B domen FVIII primenjen je u režimu kinetike jednog ciklusa u 1:1 stanju. Ukupan broj bio je 4.

Slika 23 prikazuje efekte različite dužine veznika u FVIIIFc/VWF heterodimernim konstrukcijama na farmakokinetiku kada se primenjuje u FVIII/VWF DKO miševima. Tri različita veznika (48 aa, 73aa ili 98aa) su umetnuta između D'D3 i Fc, tj.

VWF031, VWF035 i VWF036. FVIII aktivnost normalizovana na 5 minuta vrednosti (%) prikazana je u Y osi.

Slika 24 prikazuje primere sortacijske ligacije VWF fragmenta sa FVIII. A) prikazuje dva konstrukta ligacije (1) VWF fragment spojen na motiv prepoznavanja sortaze (npr., LPKSTG) na C-terminalu i (2) FVIII koji sadrži glicin (n) na N-terminalu. Nakon reakcije sa sortazom, VWF fragment i motiv prepoznavanja sorta vežu se na N-terminal FVIII. B) prikazuje dva konstrukta ligacije, (1) FVIII spojen na motiv prepoznavanja sortaze na svom C-terminalu i (2) VWF fragment koji na svom N-kraju ima glicin (n). Nakon reakcije sa sortazom, FVIII i motiv prepoznavanja sortaze su spojeni sa VWF fragmentom na N-kraju VWF fragmenta. C) prikazuje dva konstrukta ligacije, (1) VWF fragment spojen na motiv prepoznavanja sortaze veznikom promenljive dužine i (2) FVIII spojen sa glicinom (n) na njegovom N-terminalu. Nakon reakcije sa sortazom, VWF spojen veznikom na motiv prepoznavanja sorta vezuje se na N-terminal FVIII. D) prikazuje dva konstrukta ligacije, (1) FVIII spojen promenljivom dužinom veze za motiv prepoznavanja sortaze i (2) VWF fragment spojen na glicin (n) na njegovom N-terminalu. Posle reakcije sa sortazom, FVIII spojen veznikom za motiv prepoznavanja sorta vezuje se na N kraj VWF fragmenta. E) prikazuje konstrukciju ligacije koja sadrži VWF fragment koji je spojen veznikom promenljive dužine sa motivom prepoznavanja sortaze, koji je takođe spojen na deljivo mesto proteaze (npr., mesto deljenja trombina) spojeno fiksatorom promenljive dužine na Fc.

Slika 25 prikazuje šematsko poređenje FVIII155 i FVIII198. FVIII155 kodira FVIIIFc protein jednog lanca. FVIII198 je delimični B-domen koji sadrži jednolančani FVIIIFc molekul-226N6. 226 predstavlja aminokiselinu N-kraja 226 FVIII B-domena, a N6 predstavlja šest mesta N-glikozilacije u B-domenu.

Slika 26 A) prikazuje test stabilnosti koji meri relativnu aktivnost FVIII 155 i FVIII198 u DKO plazmi kao funkciju vremena. Kao što se može videti na slici, prisustvo delimičnog B domena u FVIII198 povećalo je stabilnost jednolančanog FVIIIFc u poređenju sa FVIII155; B) pokazuje poređenje polu-raspada FVIII198, FVIII155 i dvolančanog (dcFVIIIFc) kod DKO miševa. Kao što se može videti na slici, jednolančani FVIII (FVIII155) ima polu-raspad od 1.5 puta u odnosu na dvolančani FVIII. Jednolančani FVIII sa B-domenom 266N6 (FVIII198) imao je dalji životni vek od 1.5 puta. Grafik prikazuje FVIII oporavak v.5-minutne vrednosti (%) kao funkciju vremena.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

DEFIINICIJE

[0042] Treba napomenuti da se izraz "a" ili "an" entitet odnosi na jedan ili više entiteta; na primer, "nukleotidna sekvenca" se podrazumeva da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Kao takvi, termini "a" (ili "an"), "jedan ili više" i "najmanje jedan" se ovde mogu koristiti naizmenično.

[0043] Termin "polinukleotid" ili "nukleotid" treba da obuhvati jedinstvenu nukleinsku kiselinu kao i mnoštvo nukleinskih kiselina, a odnosi se na izolovani molekul ili konstrukciju nukleinske kiseline, na primer, mesna RNK (mRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). U nekim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži konvencionalnu fosfodiestersku vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr., amidnu vezu, kao što je pronađena u nukleinskim kiselinama peptida (PNK)). Termin "nukleinska kiselina" odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, na primer, fragmenti DNK ili RNK, prisutni u polinukleotidu. Pod "izolovanom" nukleinskom kiselinom ili polinukleotidom misli se na molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz rodnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid faktora VIII sadržan u vektoru smatra se izolovanim za potrebe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide održavane u heterolognim ćelijama domaćina ili su prečišćeni (delimično ili pretežno) od drugih polinukleotida u rastvoru. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripte polinukleotida predmetnog pronalaska.

Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku nadalje

2

uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da sadrže regulatorne elemente kao što su promotori, pojačivači, mesta vezivanja ribozoma ili signali za završavanje transkripcije.

[0044] Kao što se ovde koristi, "kodirajući region" ili "kodirana sekvenca" je deo polinukleotida koji se sastoji od kodona koji se mogu prevesti u aminokiseline. Iako se „stop kodon“ (TAG, TGA ili TAA) obično ne prevodi u aminokiselinu, može se smatrati da je deo kodirajućeg regiona, ali bilo koji propratni niz, na primer promotori, mesta vezivanja ribozoma, transkripcioni terminatori, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Granice kodirajuće regije obično su određene početnim kodonom na 5' završetku, kodiranjem amino kraja rezultirajućeg polipeptida i kodonom zaustavljanja translacije na 3' završetku, koji kodira karboksilni završetak rezultirajućeg polipeptida. Dva ili više kodirajućih regiona predmetnog pronalaska mogu biti prisutni u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr., na jednom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr., na odvojenim (različitim) vektorima. Sledi, zatim, da jedan vektor može sadržavati samo jedan kodirajući region ili sadrži dve ili više kodirajućih regiona, npr., jedan vektor može odvojeno kodirati vezujući domen-A i vezujući domen-B kao što je opisano u nastavku. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina predmetnog pronalaska može da kodira heterologne kodirajuće oblasti, bilo spojene ili fuzionisane na nukleinsku kiselinu koja kodira vezujući domen pronalaska. Heterologni deo kodiranja uključuju bez ograničenja specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen.

[0045] Određeni proteini koje izlučuju ćelije sisara povezani su sa sekretornim signalnim peptidom koji se cepa iz zrelog proteina nakon što je pokrenut izvoz rastućeg lanca proteina kroz grubi endoplazmatski retikulum. Stručnjaci u ovoj oblasti su svesni da su signalni peptidi obično spojeni sa N-terminalom polipeptida i da se cepaju iz celog ili "celog" polipeptida da bi se stvorio izlučeni ili "zreli" oblik polipeptida. U određenim otelotvorenjima koristi se izvorni signalni peptid, npr. imunoglobulinski teški lanac ili laki lanac signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost usmeravanja sekrecije polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, može se koristiti heterologni signalni peptid sisara, npr., aktivator plazminogena humanog tkiva (TPA) ili mišji βglukuronidaza signalni peptid ili njegov funkcionalni derivat.

[0046] Termin "nizvodno" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je smeštena 3' na

2

referentnu nukleotidnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, nizvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje prate početnu tačku transkripcije. Na primer, kodon pokretačkog prevođenja gena smešten je nizvodno od početnog mesta transkripcije.

[0047] Termin "uzvodno" odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je smeštena 5' na referentnu nukleotidnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, uzvodne nukleotidne sekvence odnose se na sekvence koje su smeštene na 5' strani kodirajućeg regiona ili početne tačke transkripcije. Na primer, većina promotora smeštena je uzvodno od početnog mesta transkripcije.

[0048] Kako se ovde koristi, termin "regulatorni region" odnosi se na nukleotidne sekvence smeštene uzvodno (5' nekodirajuće sekvence), unutar ili nizvodno (3' nekodirajuće sekvence) kodirajućeg regiona i koje utiču na transkripciju, obradu RNK, stabilnost ili prevod pridruženog regiona kodiranja. Regulatorni regioni mogu da uključuju promotore, sekvencije vođe prevođenja, introne, sekvencije prepoznavanja poliadenilacije, mesta za obradu RNK, mesta vezanja efektorskih struktura i strukture matičnih petlji. Ako je kodirajuća regija namenjena za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji, poliadenilacioni signal i redosled prekida transkripcije obično se nalaze 3' na kodirajućoj sekvenci.

[0049] Polinukleotid koji kodira genski proizvod, npr., polipeptid, može sadržavati promotor i/ili druge kontrolne elemente za transkripciju ili translaciju koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. U operativnom udruživanju, kodirajući region za genski proizvod, npr.. polipeptid, povezan je sa jednim ili više regulatornih regiona na takav način da stavi ekspresiju genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulacionog regiona. Na primer, kodirajući region i promotor su "operativno povezani" ako indukcija funkcije promotera rezultira transkripcijom mRNK koja kodira genski proizvod kodiran od strane kodirajućeg regiona i ako priroda veze između promotera i kodirajućeg regiona ne ometa sposobnost promotora da usmerava ekspresiju genskog proizvoda ili ometa sposobnost transkripcije DNK šablona. Ostali elementi za kontrolu transkripcije, pored promotora, na primer pojačivači, operateri, represori i signali završavanja transkripcije, takođe se mogu operativno povezati sa kodirućim regionom da usmeravaju ekspresiju genskog proizvoda.

[0050] Poznati su razni regioni za kontrolu transkripcije stručnjacima. Oni uključuju, bez ograničenja, regione za kontrolu transkripcije koje funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao

2

što su, ali ne ograničavajući se na njih, segmenti promotora i pojačivača iz citomegaloviruusa (neposredni rani promotor, u kombinaciji sa intron-A), simijan virus 40 (rani promotor) i retrovirusima (kao što je Rous sarkom virus). Ostali regioni za kontrolu transkripcije uključuju one izvedene iz gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i β-globin zeca, kao i druge sekvence koje mogu da kontrolišu ekspresiju gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije uključuju tkivne specifične promotore i pojačivače, kao i promotere indukovane limfokinom (npr., promotore inducirane interferonima ili interleukinima).

[0051] Slično tome, poznati su razni elementi kontrole prevođenja onima koji imaju uobičajene veštine. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na mesta vezanja za ribozome, kodone inicijacije prevođenja i završetak i elemente izvedene iz pikornavirusa (posebno internog mesta ulaska u ribozome ili IRES, koji se takođe nazivaju CITE sekvenca).

[0052] Termin "ekspresija", kao što je ovde korišćen, odnosi se na postupak u kojem polinukleotid proizvodi genski proizvod, na primer, RNK ili polipeptid. Uključuje neograničenu transkripciju polinukleotida u mesendžersku RNK (mRNK), transfer RNK (tRNK), malu RNK dlačicu (shRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK) ili bilo koji drugi RNK proizvod i prevod mRNK u polipeptid. Ekspresija proizvodi "genski proizvod." Kako se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, npr., mesendžerska RNK proizvedena transkripcijom gena ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Ovde opisani genski proizvodi nadalje uključuju nukleinske kiseline sa post-transkripcijskim modifikacijama, npr., poliadenilaciju ili spajanje, ili polipeptide sa post-translacijskim modifikacijama, npr., metilaciju, glikozilaciju, dodavanje lipida, povezanost sa drugim podjedinicama proteina ili proteolitičkim deljenjem.

[0053] "Vektor" se odnosi na svako sredstvo za kloniranje i/ili prenos nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Vektor može biti replikon na koji se može vezati drugi segment nukleinske kiseline tako da dolazi do replikacije vezanog segmenta. "Replikon" se odnosi na bilo koji genetski element (npr., plazmid, fag, kosmid, hromozom, virus) koji funkcioniše kao autonomna jedinica replikacije in vivo, tj., sposobna da se replicira pod svojom kontrolom. Termin "vektor" uključuje i virusne i ne virusne nosače za unošenje nukleinske kiseline u ćeliju in vitro, ex vivo ili in vivo. U struci je poznat i korišten veliki broj vektora, uključujući, na primer, plazmide, modifikovane eukariotske viruse ili modifikovane bakterijske viruse.

2

Umetanje polinukleotida u pogodan vektor može se izvršiti vezanjem odgovarajućih polinukleotidnih fragmenata u odabrani vektor koji ima komplementarne kohezivne završetke.

[0054] Vektori mogu biti dizajnirani tako da kodiraju selektivne markere ili reportere koji obezbeđuju izbor ili identifikaciju ćelija koje su ugradile vektor. Ekspresija selektivnih markera ili reportera omogućava identifikaciju i/ili selekciju ćelija domaćina koje sadrže i izražavaju ostale kodirajuće oblasti sadržane u vektoru. Primeri selektivnih marker gena koji su poznati i korišćeni u struci su: geni koji obezbeđuju rezistenciju na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, bialafos herbicid, sulfonamid i slično; i geni koji se koriste kao fenotipski markeri, tj., antocijaninski regulatorni geni, izopentanil transferazni gen i slično. Primeri reportera poznatih i korišćenih u tehnici uključuju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), -galaktozidazu (LacZ), -glukuronidazu (Gus) i slično. Odabir markera takođe se može smatrati reporterima.

[0055] Termin "plazmid" odnosi se na ekstrahromozomalni element koji često nosi gen koji nije deo centralnog metabolizma ćelije, a obično je u obliku kružnih dvolančanih molekula DNK. Takvi elementi mogu biti autonomno replicirajuće sekvence, sekvenci za genom integracije, fazne ili nukleotidne sekvence, linearne, kružne ili superkolodirane, jednostruke ili dvolančane DNK ili RNK, izvedene iz bilo kojeg izvora, u kojima je niz nukleotidnih sekvenci spojeni ili rekombinovani u jedinstvenu konstrukciju koja je sposobna da unese promotorni fragment i DNK sekvencu za izabrani genski proizvod zajedno sa odgovarajućim 3' ne prevedenim nizom u ćeliju.

[0056] Eukariotski virusni vektori koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, retrovirusne vektore, adeno-pridružene vektore virusa, poksvirus, npr., vektore virusa vakcinije, vektori bakulovirusa ili herpesvirusa. Ne virusni vektori uključuju plazmide, lipozome, lipidome koji su električno nabijeni (citofektini), DNK-proteinske komplekse i biopolimere.

[0057] "Klonirajući vektor" odnosi se na "replikon", koji je jedinična dužina nukleinske kiseline koja se ponovo replicira i koja sadrži poreklo replikacije, kao što su plazmid, fag ili kosmid, na koji može biti vezan drugi segment nukleinske kiseline. tako da dođe do

2

replikacije priključenog segmenta. Određeni vektori kloniranja mogu se razmnožavati u jednoj ćelijskoj vrsti, npr., bakterijama i ekspresiji u drugoj, npr. eukariotskim ćelijama. Klonirani vektori obično sadrže jednu ili više sekvenci koje se mogu koristiti za selekciju ćelija koje sadrže vektor i/ili jedno ili više višestrukih mesta kloniranja za ubacivanje nukleinskih kiselina koje su od interesa.

[0058] Termin "ekspresijski vektor" odnosi se na nosač dizajniran da omogući ekspresiju ubačene sekvence nukleinske kiseline posle ubacivanja u ćeliju domaćina. Umetnuta sekvenca nukleinskih kiselina smeštena je u operativnu povezanost sa regulatornim regionima kao što je iznad opisano.

[0059] Vektori se unose u ćelije domaćina postupcima dobro poznatim u struci, npr., transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, transdukcija, fuzija ćelija, DEAE dekstran, taloženje kalcijum-fosfata, lipofekcija (fuzija lizosoma), upotreba genskog pištolja ili DNK vektora prevoznik.

[0060] "Kultura", "kultivisati" i "kultivacija", kako se ovde koristi, znači inkubiranje ćelija pod in vitro uslovima koji omogućavaju rast ili deljenje ćelija ili održavanje ćelija u živom stanju. "Kultivisane ćelije", kako se ovde koristi, označavaju ćelije koje se razmnožavaju in vitro.

[0061] Kao što je ovde korišćen, termin "polipeptid" treba da obuhvati pojedinačni "polipeptid" kao i množinu "polipeptida", a odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiselina) linearno povezanih amidnim vezama (takođe poznat kao peptidne veze). Termin "polipeptid" odnosi se na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, "protein", "lanac aminokiselina", ili bilo koji drugi termin koji se koristi za označavanje lanca ili lanaca sa dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju "polipeptida" i termin "polipeptid" može se upotrebiti umesto bilo kog od ovih termina ili ih može izmeniti. Termin "polipeptid" se takođe odnosi na produkte modifikacija polipeptida posle ekspresije, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko deljenje ili modifikaciju ne-prirodno nastaju aminokiseline. Polipeptid može biti dobijen iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz naznačene sekvence nukleinske kiseline. Može se proizvesti na bilo koji način, uključujući hemijskom sintezom.

[0062] "Izolovani" polipeptid ili njegov fragment, varijanta ili derivat odnosi se na polipeptid koji nije u svom prirodnom okruženju. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može se jednostavno ukloniti iz rodnog ili prirodnog okruženja.

Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim u svrhu pronalaska, kao što su urođeni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, frakcionisani ili delimično ili pretežno prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom.

[0063] Takođe su obuhvaćeni ovim otkrićem fragmenti ili varijante polipeptida i bilo koje njihove kombinacije. Termin "fragment" ili "varijanta" kada se odnosi na domene koji se vezuju za polipeptide ili vezujuće molekule ovog obelodanjivanja obuhvata bilo koji polipeptid koji zadržava bar neka svojstva (npr., afinitet vezivanja FcRn za FcRn vezujući domen ili Fc varijantu, aktivnost koagulacije za varijantu FVIII ili FVIII vezujuću aktivnost za VWF fragment) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju proteolitičke fragmente, kao i fragmente delecije, pored specifičnih fragmenata antitela koji su ovde diskutovani, ali ne uključuju prirodni polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante domena koji vezuju polipeptide ili molekuli vezivanja ovog otkrića uključuju fragmente kao što je iznad opisano, takođe polipeptide sa izmenjenim sekvencama aminokiselina zbog supstitucija aminokiselina, delecija ili umetanja. Varijante mogu biti prirodne ili neprirodne. Varijante koje se ne pojavljuju u prirodi mogu se proizvesti korišćenjem poznatih tehnika mutageneze. Varijantni polipeptidi mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne supstitucije aminokiselina, brisanja ili adicije.

[0064] Termin "VWF fragment" ili "VWF fragmenti" koji se ovde koristi označava bilo koji VWF fragment koji deluje sa FVIII i zadržava najmanje jedno ili više svojstava koja se obično pružaju FVIII pomoću VWF pune dužine, npr., sprečavajući prevremenu aktivaciju na FVIIIa, sprečavajući preuranjena proteoliza, sprečavajući povezivanje sa fosfolipidnim membranama koje mogu dovesti do prevremenog klirensa, sprečavajući vezanje za receptore FVIII klirensa koji mogu da vežu goli FVIII, ali ne i VWF-vezan FVIII, i/ili stabilizuje interakciju teškog i lakog lanca FVIII. Termin "VWF fragment" kako se ovde koristi ne uključuje proteine VWF pune dužine ili zrele proteine. U posebnom otelotvorenju, "VWF fragment" kako se ovde koristi sadrži D' domen i D3 domen VWF proteina, ali ne uključuje A1 domen, A2 domen, A3 domen, D4 domen, B1 domen , B2 domen, B3 domen, C1 domen,

1

C2 domen i CK domen VWF proteina.

[0065] Termin "ograničavajući faktor polu-raspada" ili "faktor ograničavanja polu-raspada FVIII", kako se ovde koristi, označava faktor koji sprečava da polu-raspad FVIII proteina bude duži od 1.5 puta ili dvostruko više u poređenju sa divljim tipom FVIII (npr., ADVATE® ili REFACTO®). Na primer, VWF pune dužine ili zreli faktori mogu da deluju kao ograničavajući faktor polu-raspada FVIII inducirajući da se kompleks FVIII i VWF očisti iz sistema jednim ili više puteva čišćenja VWF. U jednom primeru, endogeni VWF je ograničavajući faktor polu-raspada FVIII. U drugom primeru, rekombinantni VWF molekul pune dužine koji se ne kovalentno vezuje na protein FVIII je faktor ograničavanja poluraspada FVIII.

[0066] Termin "endogeni VWF" kako se ovde koristi označava VWF molekule koji su prirodno prisutni u plazmi. Endogeni molekul VWF može biti multimer, ali može biti monomer ili dimer. Endogeni VWF u plazmi vezuje se za FVIII i formira nekovalentni kompleks sa FVIII.

[0067] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u struci, uključujući osnovne bočne lance (npr., lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), polarne bočne lance (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr., alanin, valin, leucin, izoleukin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Stoga, ako je aminokiselina u polipeptidu zamenjena drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, zamena se smatra konzervativnom. U drugom otelotvorenju, niz aminokiselina može se konzervativno zameniti strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.

[0068] Kao što je u stanju tehnike poznato, "identitet sekvence" između dva polipeptida je određen poređenjem aminokiselinske sekvence jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Kada se ovde raspravlja, da li je neki određeni polipeptid bar oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100% identičan drugom polipeptidu može se

2

utvrditi korišćenjem metode i računarski programi/softver poznati u oblasti tehnike, kao što je, ali nije ograničeno na, BESTFIT program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT koristi algoritam lokalne homologije iz Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), da se nađe najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvenci kako bi se utvrdilo da li je određena sekvencija, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci u skladu sa ovim pronalaskom, parametri se postavljaju, naravno, tako da se procenat identiteta izračunava preko puna dužina referentne polipeptidne sekvence i dozvoljene razlike u homologiji do 5% ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci su dozvoljene.

[0069] Kao što se ovde koristi „aminokiselina koja odgovara“ ili „ekvivalentna aminokiselina“ u VWF sekvenci ili FVIII sekvenci proteina identifikuje se podešavanjem da bi se maksimizirao identitet ili sličnost između prvog VWF ili FVIII sekvence i drugog VWF ili FVIII niz. Broj korišćen za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u drugom VWF ili FVIII nizu zasnovan je na broju korištenom za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u prvom VWF ili FVIII nizu.

[0070] "Fuzija" ili "himerni" protein sadrži prvu sekvencu aminokiselina koja je povezana sa drugom sekvencom aminokiselina sa kojom u prirodi nije prirodno povezan.

Aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u odvojenim proteinima mogu se spojiti u fuzijski polipeptid ili se aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u istom proteinu mogu biti smeštene u novom aranžmanu u fuzionom polipeptidu, npr., fuzija faktora VIII domen predmetnog pronalaska sa imunoglobulinskim Fc domenom. Fuzijski protein nastaje, na primer, hemijskom sintezom ili stvaranjem i prevođenjem polinukleotida u kojem su peptidnog regiona kodirane u željenom odnosu. Himerni protein može nadalje da sadrži drugu sekvencu aminokiselina koja je povezana sa prvom sekvencom aminokiselina kovalentnom, ne peptidnom vezom ili nekovalentnom vezom.

[0071] Kao što je ovde korišćen, termin "polu-raspad" se odnosi na biološki polu-raspad određenog polipeptida in vivo. Polu-raspad može biti predstavljen vremenom potrebnim da se polovina količine koja se daje ispitaniku očisti iz cirkulacije i/ili drugih tkiva životinje. Kada je krivulja zazora datog polipeptida konstruisana kao funkcija vremena, kriva je obično dvofazna sa brzom a-fazom i dužom β-fazom. α-faza obično predstavlja ravnotežu primenjenog Fc polipeptida između intra- i vanvaskularnog prostora, a delom je određena veličinom polipeptida. β-faza obično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. U nekim otelotvorenjima, FVIII i himerni proteini koji sadrže FVIII su monofazni, te stoga nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Zbog toga se u određenim otelotvorenjima termin polu-raspad kao što je ovde korišćen odnosi na polu-raspad polipeptida u β-fazi. Tipični polu-raspad β faze humanog antitela kod ljudi je 21 dan.

[0072] Termin "heterologan" kako se primenjuje na polinukleotid ili polipeptid, znači da je polinukleotid ili polipeptid izveden iz različitog entiteta od entiteta sa kojim se upoređuje. Zbog toga, heterologni polipeptid povezan sa VWF fragmentom znači polipeptidni lanac koji je povezan sa VWF fragmentom i nije deo prirodnog dela VWF fragmenta. Na primer, heterologni polinukleotid ili antigen mogu biti izvedeni od različite vrste, različitog ćelijskog tipa pojedinca ili iste ili različite vrste ćelija različitih jedinki.

[0073] Termin "povezan" kao što je ovde korišćen, odnosi se na prvu sekvencu aminokiselina ili nukleotidnu sekvencu kovalentno ili nekovalentno spojenu sa drugom sekvencom aminokiselina ili nukleotidnom sekvencom, respektivno. Termin "kovalentno povezan" ili "kovalentna veza" odnosi se na kovalentnu vezu, npr., disulfidnu vezu, peptidnu vezu ili jednu ili više aminokiselina, npr., vezujućeg sredstva, između dve grupe koje su povezane zajedno. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može se direktno pridružiti ili suprotstaviti drugoj aminokiselinskoj ili nukleotidnoj sekvenci ili alternativno interventna sekvencija može kovalentno pridružiti prvu sekvencu drugoj sekvenci. Termin "povezan" podrazumeva ne samo fuziju prve sekvencije aminokiselina sa drugom sekvencom aminokiselina na C-terminusu ili N-terminusu, već uključuje i ubacivanje čitave prve sekvencije aminokiselina (ili druge aminokiseline) sekvence) u bilo koje dve aminokiseline u drugoj sekvenci aminokiselina (ili prva aminokiselinska sekvenca, respektivno). U jednom otelotvorenju, prva sekvenca aminokiselina može se pridružiti drugoj sekvenci aminokiselina peptidnom vezom ili veznikom. Prva nukleotidna sekvenca može biti spojena sa drugom nukleotidnom sekvencom fosfodiesterskom vezom ili veznikom. Veznik može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koja hemijska grupa (i za polipeptidne i za polinukleotidne lance). Kovalentna veza ponekad je označena kao (-) ili crtica.

4

[0074] Kao što je ovde korišćen, termin "povezan sa" odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu formiranu između prvog lanca aminokiselina i drugog lanca aminokiselina. U jednom otelotvorenju, termin "povezan sa" označava kovalentnu, ne peptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. U nekim otelotvorenjima ovo povezivanje je označeno sa dve tačke, tj., (:). U drugom otelotvorenju, to znači kovalentnu vezu osim peptidne veze. U drugim otelotvorenjima, termin "kovalentno povezan", kao što je ovde korišćen, označava povezanost dve grupe kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom, peptidnom vezom ili jednom ili više aminokiselina (npr., veznik). Na primer, aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa tiolnom grupom na drugom cisteinskom ostatku. U većini IgG molekula koji se prirodno nalaze, CH1 i CL regioni povezani su disulfidnom vezom, a dva teška lanca povezana su dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 pomoću sistema Kabat numerisanja (položaj 226 ili 229, EU sistem brojanja). Primeri kovalentnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnostičku vezu, savijenu veza, dipolarnu vezu, Pi zadnju vezu, dvostruku vezu, trostruku vezu, četvorostruku vezu, četvorostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, brzinu ili anti-vezivanje. Neograničavajući primeri nekovalentne veze uključuju jonsku vezu (npr., katjon-pi vezu ili vezu soli), metalnu vezu, vodoničnu vezu (npr., dihidrogena veza, dihidrogen kompleks, vodonik-vezu sa niskom barijerom ili simetrični vodonik veza), van der Valsova sila, londonsku disperzijska sila, mehaničku vezu, halogenu vezu, aurofilnost, interkalizacija, slaganje, entropnu silu ili hemijsku polarnost.

[0075] Termin "monomer-dimerni hibrid" koji se ovde koristi odnosi se na himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, pri čemu prvi lanac sadrži faktor zgrušavanja, npr., Faktor VIII i Fc region i drugi lanac se sastoji, sastoji se u osnovi ili se sastoji od Fc regiona bez faktora zgrušavanja. Monomer-dimerni hibridni konstrukt je stoga hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor zgrušavanja i dimerni aspekt koji ima dva Fc regiona.

[0076] Kako se ovde koristi, termin "mesto deljenja" ili "mesto enzimatskog deljenja" odnosi se na mesto prepoznato enzimom. Određena mesta enzimskog deljenja sadrže mesto intraćelijske prerade. U jednom otelotvorenju, polipeptid ima mesto enzimatskog deljenja deljivog enzimom koji se aktivira tokom kaskade zgrušavanja, tako da se deljenje takvih mesta dešava na mestu formiranja ugruška. Primeri takvih mesta uključuju, na primer, one prepoznate pomoću trombina, faktora XIa ili faktora Xa. Primerna mesta deljenja FXIa uključuju, npr., TQSFNDFTR (SEQ ID NO:47) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO:48). Primerna mesta deljenja trombina uključuju, npr., DFLAEGGGVR (SEQ ID NO:49), TTKIKPR (SEQ ID NO:50), LVPRG (SEQ ID NO:55) i ALRPR (aminokiseline 1 do 5 od SEQ ID NO:51). Druga područja enzimskog deljenja su poznata u stanju tehnike.

[0077] Kao što je ovde korišćen, termin "mesto za obradu" ili "mesto intracelularne prerade" odnosi se na vrstu enzimskog deljenja u polipeptidu koji je meta za enzime koji funkcionišu posle translacije polipeptida. U jednom aspektu, takvi enzimi funkcionišu tokom transporta iz Golgijevog lumena u trans-Golgijev odeljak. Intraćelijski enzimi za obradu cepaju polipeptide pre izlučivanja proteina iz ćelije. Primeri takvih mesta za obradu uključuju, na primer, one koje cilja PACE/furin (gde je PACE akronim za parirani bazični enzim za odvajanje aminokiseline) endopeptidaza. Ovi enzimi su lokalizovani na Golgijevoj membrani i cepaju proteine na karboksi terminalnoj strani motiva sekvence Arg-[bilo koji ostatak]-(Lys ili Arg)-Arg. Kao što je ovde korišćeno, familija enzima "furin" uključuje, na primer, PCSKl (takođe poznat kao PC1/Pc3), PCSK2 (takođe poznat kao PC2), PCSK3 (takođe poznat kao furin ili PACE), PCSK4 (takođe poznat kao PC4), PCSK5 (takođe poznat kao PC5 ili PC6), PCSK6 (takođe poznat kao PACE4), ili PCSK7 (takođe poznat kao PC7/LPC, PC8, ili SPC7). Ostala mesta za obradu su poznata u stanju tehnike.

[0078] Termin "Furin" odnosi se na enzime koji odgovaraju EC br.3.4.21.75. Furin je proprotein konvertaza slična subtilizinu, koja je poznata i kao PACE (upareni bazni enzim za odvajanje aminokiseline). Furin briše delove neaktivnih proteina prekursora da ih pretvori u biološki aktivne proteine. Tokom svog ćelijskog transporta, pro-peptid se odvoji od zrelog molekula VWF pomoću enzima Furin u Golgi.

[0079] U konstruktima koji uključuju više od jednog mesta prerade ili deljenja razumeće se da takve stranice mogu biti iste ili različite.

[0080] Hemostatski poremećaj, kako se ovde koristi, znači genetski nasleđeno ili stečeno stanje koje karakteriše sklonost krvarenjima, bilo spontano, bilo kao posledica traume, usled oslabljene sposobnosti ili nemogućnosti formiranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja uključuju hemofiliju. Tri glavna oblika su hemofilija A (deficit faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili "božićna bolest") i hemofilija C (nedostatak faktora XI, blaga tendencija krvarenja). Ostali hemostatski poremećaji uključuju, npr. Von Willebrandovu bolest, nedostatak faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak faktora XII, nedostatke ili strukturne nepravilnosti fibrinogena, protrombina , faktora V, faktora VII, faktora X ili faktora XIII, sindrom Bernard-Soulier-a, koji je oštećenje ili nedostatak GPIb. GPIb, receptor za VWF, može biti neispravan i dovesti do nedostatka formiranja primarnog ugruška (primarna hemostaza) i povećane tendencije krvarenja) i trombastenije Glanzmana i Naegelija (Glanzmannova trombastenija). Kod zatajenja jetre (akutni i hronični oblici), jetra nije dovoljna proizvodnja faktora koagulacije; ovo može povećati rizik od krvarenja.

[0081] Himerni molekuli predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti profilaktički. Kao što je ovde korišćen, termin "profilaktički tretman" odnosi se na davanje molekula pre epizode krvarenja. U jednom otelotvorenju, ispitanik kome je potrebno opšte hemostatsko sredstvo je podvrgnut operaciji ili će se podvrgnuti. Himerni protein prema predmetnom pronalasku može se primeniti pre ili posle operacije kao profilaktički. Himerni protein prema ovom pronalasku može se primeniti tokom ili posle operacije za kontrolu akutne epizode krvarenja. Operacija može da uključuje, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke procedure ili transplantaciju matičnih ćelija.

[0082] Himerni protein prema pronalasku takođe se koristi za lečenje na zahtev (takođe se naziva i „epizodno“). Termin "lečenje na zahtev" ili "epizodno lečenje" odnosi se na davanje himernog molekula kao odgovor na simptome epizode krvarenja ili pre aktivnosti koja može izazvati krvarenje. U jednom aspektu, lečenje na zahtev (epizodno) može se dati ispitaniku kada započne krvarenje, na primer posle povrede ili kada se očekuje krvarenje, kao pre operacije. U drugom aspektu, tretman na zahtev može se dati pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su kontaktni sportovi.

[0083] Kako se ovde koristi, termin "akutno krvarenje" odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, ispitanik može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr., nedostatak faktora VII), poremećaj trombocita ili rezistenciju usled razvoja antitela na faktore zgrušavanja.

[0084] Lečiti , lečenje, tretiranje, kao što je ovde korišćeno, odnosi se, na primer, na smanjenje težine bolesti ili stanja; smanjenje trajanja kursa bolesti; ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem; pružanje korisnih efekata na ispitanika sa bolešću ili stanjem, bez nužnog izlečenja bolesti ili stanja ili profilaksa jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću ili stanjem. U jednom otelotvorenju, termin "lečenje" ili "tretman" znači održavanje nivoa FVIII najmanje približno1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, ili 20 IU/dL kod ispitanika davanjem himernog proteina predmetnog pronalaska. U drugom otelotvorenju, lečiti ili lečenje znači održavanje najnižeg nivoa FVIII između oko 1 i oko 20 IU/dL, oko 2 i oko 20 IU/dL, oko 3 i oko 20 IU/dL, oko 4 i oko 20 IU/dL, oko 5 i oko 20 IU/dL, oko 6 i oko 20 IU/dL, oko 7 i oko 20 IU/dL, oko 8 i oko 20 IU/dl, oko 9 i oko 20 IU/dl, ili oko 10 i oko 20 IU/dl. Lečiti ili lečenje bolesti ili stanja može takođe da uključi održavanje FVIII aktivnosti kod ispitanika na nivou uporedivom sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ili 20% FVIII aktivnosti kod ispitanika koji nema hemofiliju. Minimalni nivo potreban za lečenje može se meriti jednom ili više poznatih postupaka i može se prilagoditi (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.

Himerni proteini

[0085] Predmetni pronalazak je usmeren na produženje perioda polu-raspada proteina faktora VIII sprečavanjem ili inhibicijom faktora ograničavajućeg polu-raspada FVIII (npr., Endogenog VWF) in vivo iz asocijacije na protein FVIII. Endogeni VWF se pridružuje sa oko 95% do oko 98% FVIII u nekovalentnim kompleksima. Poznato je da su endogeni VWF vezani za FVIII protein zaštićeni od FVIII na različite načine. Na primer, VWF pune dužine (kao multimer sa oko 250 kDa) može zaštititi FVIII od deljenja proteaze i FVIII aktivacije, stabilizovati teški i/ili laki lanac FVIII i sprečiti uklanjanje FVIII od strane receptora za uklanjanje. Međutim, istovremeno, endogeni VWF ograničava polu-život FVIII sprečavanjem pinocitoze i uklanjanjem kompleksa FVIII-VWF iz sistema kroz put čišćenja VWF. Veruje se, kao što je prikazano u primerima, da je endogeni VWF faktor ograničavanja polu-raspada koji sprečava da životni vek FVIII proteina spojenog sa produživačem poluraspada bude duži od približno dvostrukog divljeg tipa FVIII. Prema tome, predmetni pronalazak sprečava ili inhibira interakciju između endogenog VWF i FVIII proteina korišćenjem adekvatne grupe, pri čemu je adjuvantna grupa VWF fragment koji sadrži aa D' domenu i D3 domen VWF, čime sprečava uklanjanje proteina FVIII kroz put čišćenja VWF i/ili induciranje pinocitoze. U jednom otelotvorenju, pripadajući deo je sposoban da spreči ili inhibira vezivanje proteina FVIII sa endogenim VWF i ima bar jedno zaštitno svojstvo FVIII slično. Pored toga, dodatni deo smanjuje klirens FVIII iz sistema sprečavanjem ili inhibiranjem interakcije sa endogenim VWF. Dodatne grupe predmetnog pronalaska se vezuju ili su povezane sa kovalentnim vezanjem proteina FVIII i/ili fizički ili hemijski blokiraju vezni deo VWF na protein FVIII. Stoga se protein FVIII povezan sa pripadajućom jedinicom izbacuje iz cirkulacije sporije od jednog ili više VWF receptora klirensa, u poređenju sa divljim tipom FVIII ili FVIII koji nisu povezani sa dodatnom jedinicom.

[0086] Pomoćni deo u predmetnom pronalasku je VWF fragment opisan ovde. U jednom otelotvorenju, adjuvantna grupa je povezana (ili vezana) sa proteinom FVIII kovalentnom vezom. Da bi se sprečila disocijacija adekvatne grupe sa proteinom FVIII, veza između proteina FVIII i pridružene grupe je kovalentna veza, npr., peptidna veza, jedna ili više aminokiselina ili disulfidna veza. U nekim otelotvorenjima, povezanost (tj., veza) između adekvatne grupe i FVIII proteina je peptidna veza ili veznik između FVIII proteina i pripadajuće grupe ("FVIII/AM veznik"). Neograničavajući primeri veznika obelodanjeni su na drugom mestu ovde. Pomoćni deo koji je kovalentno povezan sa FVIII proteinom je VWF fragment opisan na drugim mestima ovde.

[0087] U nekim otelotvorenjima, adjuvantna grupa hemijski (npr., nekovalentno) se vezuje za ili fizički blokira jedno ili više VWF mesta vezivanja na FVIII protein. Mesto vezivanja VWF za FVIII protein nalazi se unutar A3 domena ili C2 domena FVIII proteina. U još nekim drugim otelotvorenjima, mesto vezivanja VWF za protein FVIII nalazi se unutar A3 domena i C2 domena. Na primer, VWF mesto vezivanja na FVIII protein može da odgovara aminokiselinama 1669 do 1689 i/ili 2303 do 2332 od SEQ ID NO:16 [zreo pune dužine FVIII].

[0088] U drugim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži FVIII protein povezan sa pripadajućom jedinicom, pri čemu je adjuvantna grupa VWF fragment koji sadrži D' domenu i D3 domen, ali ne sadrži mesto vezivanja VWF receptora i zaštitne štitove ili štiti mesto vezivanja VWF na proteinu FVIII, čime inhibira ili sprečava interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment koristan za predmetni pronalazak sadrži D' domen i D3 domen, i dalje pruža jednu ili više prednosti svojstva sličnog VWF proteinu FVIII, ali VWF fragment ne prolazi put VWF. FVIII protein i pripadajuća grupa mogu kovalentno biti povezani veznikom (npr., FVIII/AM veznikom). U jednom otelotvorenju, veznik može biti deljivi veznik. Neograničavajući primeri veznika obelodanjeni su na drugom mestu ovde.

[0089] U jednom aspektu, predmetni pronalazak je usmeren na himerni ili fuzioni protein ili hibrid koji sadrži jedan ili više VWF fragmenata koji su ovde obelodanjeni i njihove upotrebe. Himerni ili fuzioni protein može biti spojen ili povezan sa jednom ili više heterolognih delova (koji su ovde ponekad označeni kao H ili HI). U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H1) je heterologni peptid ili heterologni polipeptid koji se prirodno ne bi javljao sa/i bio povezan sa VWF fragmentom. U drugom otelotvorenju, heterologni deo (H1) je ne-polipeptidna celina, npr., hemijska modifikacija ili kombinacija peptida ili polipeptida i ne-polipeptidnog dela. U nekim otelotvorenjima, VWF fragmenti su povezani ili povezani sa heterolognom grupom (H1) pomoću veznika (koji se ovde takođe naziva "VWF veznik"). U jednom otelotvorenju, VWF veznik je deljivi veznik. Neograničavajući primeri veznika između VWF fragmenta i heterolognog dela (Hl) su ovde obelodanjeni na drugim mestima.

[0090] U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H1) korisna u pronalasku poboljšava jedno ili više farmakokinetičkih svojstava fragmenata VWF bez značajnog uticaja na biološku aktivnost ili funkciju VWF fragmenata (npr., njihovo vezivanje za FVIII protein). U drugom otelotvorenju, heterologni deo (H1) povezan sa VWF fragmentom može produžiti poluraspad VWF fragmenata. Neograničavajući primeri heterologne polipeptidne grupe sadrže imunoglobulinsku konstantnu regiju ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji veže albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment ili dve ili više njihovih kombinacija. Neograničavajući primeri heterolognog ne-polipeptidnog dela uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0091] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo (H1) može se koristiti za povezivanje VWF fragmenta i FVIII proteina kovalentnom vezom. Primeri heterologne grupe koja može pružiti kovalentnu vezu uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoglobulinsko konstantno područje ili njegov deo koji sadrži zglobni region, npr., Fc region ili FcRn vezujući partner. U konkretnom primeru, FVIII protein je povezan sa prvom Fc regionom, a VWF fragment je povezan sa drugom Fc regionom, pri čemu prvi Fc region i drugi Fc region formiraju jednu ili više disulfidne veze.

4

[0092] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo (koja je ovde označena sa "H" ili "H1") je konstantno područje imunoglobulina ili njegov deo. Primeri imunoglobulinskog konstantnog regiona ili njegovog dela mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji iz CH1 domena, CH2 domena, CH3 domena, CH4 domena, zglobnog domena i dve ili više kombinacija istih. U jednom otelotvorenju, konstantno područje imunoglobulina ili njegov deo sadrži najmanje jedan CH1 domen, najmanje jedan CH2 domen, najmanje jedan CH3 domen, najmanje jedan CH4 domen, ili njegove funkcionalne fragmente. U drugom otelotvorenju, konstantno područje imunoglobulina ili njegov deo sadrži najmanje jedan domen šarke ili njegov deo i najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo (npr., u šarki-CH2 orijentaciji). U drugom otelotvorenju, imunoglobulinski konstantni domen ili njegov deo sadrži najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo i najmanje jedan CH3 domen ili njegov deo (npr., u CH2-CH3 orijentaciji.) Primeri kombinacije uključuju, ali nisu ograničeni na, CH2 domen, CH3 domen i zglobni domen, koji su takođe poznati kao Fc region (ili Fc domen), npr., prvi Fc region. U drugim otelotvorenjima, heterologna celina (H1) je vezanom s VWF fragmentom povezan. U nekim otelotvorenjima, heterologni deo (H1) je FcRn vezujući partner kao što je ovde opisano. U drugim otelotvorenjima, heterologni deo (H1) je zglobni region.

[0093] U nekim otelotvorenjima, himerni protein nadalje sadrži drugu (ili dodatnu) heterolognu jedinicu (ponekad je ovde označena sa "H2"). Treba napomenuti da se prvi heterologni deo (H1) i drugi heterologni deo (H2) mogu koristiti naizmenično i mogu biti isti ili različiti. Drugi heterologni deo (H2) može se povezati sa proteinom FVIII ili negde drugde u himernom proteinu peptidnom vezom, jednom ili više aminokiselina ili veznikom (npr., FVIII vezom ako je povezan sa FVIII). Takvi konstrukti se ponekad mogu nazvati FVIII/VWF heterodimerom. U jednom otelotvorenju, heterologni deo (H2) sadrži heterologni polipeptida. U drugom otelotvorenju, heterologni deo (H2) sadrži ne-polipeptidni deo. U drugim otelotvorenjima, heterologni deo (H2) sadrži kombinaciju heterolognog dela i nepolipeptidnog dela. Drugi heterologni deo (H2) može biti produžetak polu-raspada.

Neograničavajući primeri drugog heterolognog polipeptidnog dela sadrže imunoglobulinsku konstantnu regiju ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji veže albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment ili dve ili više njihovih kombinacija. Neograničavajući primeri heterolognog ne-polipeptidnog dela uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim otelotvorenjima, prvi heterologni deo (H1) i drugi heterologni deo su isti ili različiti. Bilo koja ili oba prva heterologna dela (H1) i druga heterologna dela (H2) mogu davati produžetak polu-raspada proteinu FVIII u himernom proteinu, obezbediti vezu jaču od nekovalentne asocijacije, tj., jednim ili više kovalentne veze između proteina FVIII i VWF fragmenta u himernom proteinu ili oboje. Jednom kada VWF fragment spojen ili povezan sa prvim heterolognim delom (H1) ukloni gornji vek poluvremena sprečavanjem ili inhibicijom interakcije između FVIII proteina i endogenog VVF proteina, FVIII protein spojen sa heterolognim delovima može dostići svoj puni potencijal i može imati polu-raspad duži od dvostrukog u poređenju s divljim tipom FVIII.

[0094] U nekim otelotvorenjima, prvi heterologni deo (npr., prvi Fc region) povezan sa VWF fragmentom i drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) povezana sa FVIII proteinom su povezane jedna sa drugom tako da udruženje sprečava zamenu VWF fragmenta endogenim VVF in vivo. U jednom otelotvorenju, drugi heterologni deo je drugi Fc region, gde je drugi Fc region povezan ili povezan sa prvim heterolognim delom, npr., prvi Fc region kovalentnom vezom, npr., disulfidna veza, peptidna veza ili veznik (jedna ili više aminokiselina). Na primer, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) povezan sa FVIII proteinom na jednom kraju može se dalje povezati sa prvim heterolognim delom (npr., prvim Fc regionom) vezom sa VWF fragmentom (npr., scFc veznik) ili povezan s prvim heterolognim delom kovalentnom vezom. U drugom otelotvorenju, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) povezan je sa VWF fragmentom koji je već povezan sa prvim heterolognim delom. U nekim otelotvorenjima, himerni protein sadrži prvi polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment i prvi heterologni deo i drugi polipeptidni lanac koji sadrži FVIII protein i drugi heterologni deo, pri čemu su prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac povezani, gde su povezanost između prvog polipeptidnog lanca koji sadrži prvi heterologni deo i drugi polipeptidni lanac koji sadrži drugi heterologni deo je kovalentna veza, omogućavajući tako VWF fragment i protein FVIII da održavaju međusobnu interakciju. U isto vreme, endogeni VWF koji može da formira nekovalentnu vezu sa proteinom FVIII ne može zameniti kovalentno vezan polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment.

[0095] Veznik između prvog heterolognog dela (H1) i VWF fragmenta (npr., VWF veznik) može biti veznik koji se može deliti, npr., veznik koji se može deliti trombinom. Veznici koji se mogu deliti mogu se deliti proteazom odabranom iz grupe koju čine faktor XIa, faktor XIIa, kalikrein, faktor VIIa, faktor IXa, faktor Xa, faktor IIa (trombin), Elastaza-2, Granzime-B, TEV, Enterokinaza, Proteaza 3C, sortaza A, MMP-12, MMP-13, MMP-17, MMP-20 i sve njihove kombinacije. Ovi deljivi veznici omogućavaju da se fragment VWF odvoji i odvoji od proteina FVIII nakon aktiviranja kaskade zgrušavanja, što rezultira FVIII proteinom koji ima puni potencijal aktivnosti.

[0096] U drugim otelotvorenjima, himerni protein se proizvodi kao pojedinačni polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment, deljivi veznik, prvi heterologni deo (Hl), procesni veznik, FVIII protein i drugi heterologni deo (H2) u bilo kojem redosledu. Posle sinteze, procesni veznik se može deliti pomoću intracelularnog enzima proteaze pre izlučivanja, stvarajući tako dva polipeptidna lanca kao što je iznad opisano. U konstrukciji jednog lanca pre izlučivanja, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) može se povezati sa VWF fragmentom procesnim veznikom. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više veznika može sadržati jedno ili više mesta deljenja.

[0097] U nekim otelotvorenjima, himerni protein prema pronalasku nadalje sadrži treći heterologni deo (ponekad je ovde označen sa "H3"). Treći heterologni deo (H3) može biti produžetak polu-raspada. Heterologni deo (H3) može da sadrži heterologni polipeptid, nepolipeptidni deo ili kombinaciju oba. Neograničavajući primeri trećeg heterolognog dela (H3) uključuju imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, bilo koje derivate ili njegove varijante ili dve ili više kombinacija. Neograničavajući primeri nepolipeptidnog dela uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. Prvi heterologni deo (H1) povezan sa VWF fragmentom, drugi heterologni deo (H2) povezan sa FVIII proteinom, a treći heterologni deo (H3) može biti isti ili različiti. U jednom otelotvorenju, prvi heterologni deo (H1) je identičan drugom heterolognom delu (H2), ali se razlikuje od trećeg heterolognog dela (H3). U drugom otelotvorenju, treći heterologni deo (H3) je spojen ili povezan sa FVIII proteinom ili VWF fragmentom himernog proteina. U nekim otelotvorenjima, treći heterologni deo je umetnut unutar jednog ili više domena FVIII proteina ili između dva domena FVIII proteina.

[0098] U jednom otelotvorenju, himerni protein sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, pri čemu prvi lanac sadrži FVIII protein povezan sa prvim heterolognim delom (H1), npr., prvim Fc regionom, opcionim veznikom (npr., FVIII veznik) i drugi lanac sadrži VWF fragment povezan sa drugim heterolognim delom (H2), npr., drugim Fc regionom, opcionim veznikom (npr., VWF veznik). FVIII protein može nadalje da sadrži

4

treći heterologni deo (H3), npr., bilo koji deo sa polu-raspadom, npr., albumin ili PAS sekvencu, između teškog lanca FVIII i lakog lanca FVIII (tj., aminokiselinskog ostatka 1648 SEQ ID NO:16), čime je FVIII jednolančani protein. Alternativno, FVIII protein može biti dvolančani protein, tj., teški lanac FVIII i laki lanac FVIII koji su međusobno povezani kovalentnom ili nekovalentnom vezom (npr., metalna veza), pri čemu je teški lanac dalje povezan sa trećim heterolognim delom (H3), npr., nestrukturni polipeptid koji produžava polu-raspad, albumin ili njegov fragment ili PAS sekvenca. U jednom otelotvorenju, himerni protein sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, pri čemu prvi lanac sadrži FVIII protein povezan sa prvim heterolognim delom (H1), npr., prvu Fc region, opcionim veznikom (npr., FVIII veznik) i drugi lanac sadrži VWF fragment povezan sa trećim heterolognim delom (H3), npr., nestrukturnim polipeptidom koji produžava polu-raspad, albuminom ili PAS sekvencom, koji je povezan sa drugim heterolognim delom (H2), npr., drugi Fc region, opcionim veznikom. U nekim otelotvorenjima, treći heterologni deo (H3) (npr., polipeptid koji produžava polu-raspad) može se povezati sa C-završetkom ili N-završetkom FVIII proteina ili umetnuti između dva domena proteina FVIII ili između dve aminokiseline u domenu proteina FVIII.

[0099] U nekim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska nadalje sadrži četvrti heterologni deo (koji je ovde označen sa "H4") i/ili peti heterologni deo (koji je ovde ponekad označen sa "H5"). Četvrti ili peti heterologni deo takođe može biti produživač poluraspada. Četvrti heterologni deo i/ili peti heterologni deo može biti isti ili različiti od trećeg heterolognog dela. Heterologni deo može da sadrži heterologni polipeptid, ne-polipeptidni deo ili kombinaciju oba. Neograničavajući primeri četvrtog heterolognog dela uključuju imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, bilo koje derivate ili njegove varijante ili dve ili više kombinacija. Neograničavajući primeri ne-polipeptidnog dela uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. Prvi heterologni deo, drugi heterologni deo, treći heterologni deo, četvrti heterologni deo i peti heterologni deo mogu biti isti ili različiti. U nekim otelotvorenjima, četvrti heterologni deo (npr., polipeptid koji produžava polu-raspad) može se povezati sa C-završetkom ili N-završetkom FVIII proteina ili umetnuti između dva domena proteina FVIII ili između dve aminokiseline u domenu proteina FVIII. U drugim otelotvorenjima, peti heterologni deo (npr., polipeptid koji produžava polu-raspad) može se takođe povezati sa C-završetkom ili N-završetkom FVIII proteina ili umetnuti između dva domena proteina FVIII ili između dve aminokiseline u domenu proteina FVIII.

[0100] U određenim otelotvorenjima, himerni protein sadrži FVIII protein, VWF fragment, prvi heterologni deo, drugi heterologni deo, treći heterologni deo, četvrti heterologni deo i peti heterologni deo, gde je prvi heterologni deo i drugi heterologni deo formira vezu (npr., kovalentnu vezu) između lanca koji sadrži FVIII protein i lanca koji sadrži VWF fragment, i treći heterologni deo, četvrti heterologni deo i peti heterologni deo su produživači poluraspada i pri čemu je veza između lanca koji sadrži FVIII protein i lanca koji sadrži VWF fragment jača od nekovalentne interakcije između FVIII i VWF fragmenta, sprečavajući na taj način vezivanje endogenog VWF za protein FVIII in vivo, in vitro, ili ex vivo.

[0101] U drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži FVIII protein, VWF fragment, prvi heterologni deo, drugi heterologni deo, treći heterologni deo, četvrti heterologni deo, peti heterologni deo i šesti heterologni deo (ponekad je ovde označen kao "H6" ), pri čemu prvi heterologni deo i drugi heterologni deo formiraju vezu između lanca koji sadrži FVIII protein i lanca koji sadrži VWF fragment i trećeg heterolognog dela, četvrtog heterolognog dela, petog heterolognog dela i šestog heterolognog dela ostatak su produživači polu-raspadi i gde je veza između lanca koji sadrži FVIII protein i lanca koji sadrži VWF fragment jača od interakcije između FVIII i VVF fragmenta, sprečavajući na taj način vezivanje endogenog VWF za protein FVIII in vivo, in vitro, ili ex vivo.

[0102] U nekim slučajevima, himerni protein sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(aa) V-L1-H1-L2-H2,

(bb) H2-L2-H1-L1-V,

(cc) H1-L1-V-L2-H2, i

(dd) H2-L2-V-L1-H1,

gde V sadrži ovde opisani fragment VWF;

Svaki od L1 i L2 sadrži opcioni veznik; i

H1 sadrži prvi heterologni deo; i

H2 sadrži opcioni sekundarni heterologni deo. Jedan ili oba prva heterologna dela i druga heterologna dela mogu biti delovi koji produžavaju polu-raspad. U jednom slučaju, H1 sadrži polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oba. Polipeptid koristan kao H1 može da sadrži konstantnu oblast imunoglobulina ili njegov deo, albumin ili njegov

4

fragment, vezujući albuminski deo, PAS sekvencu, HAP sekvencu, bilo koje derivate ili varijante ili bilo koju kombinaciju istih. Ne-polipeptidni deo može da sadrži polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu i hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili varijantu, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U drugom slučaju, H2 sadrži polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oba. Polipeptid koristan kao H2 može da sadrži konstantnu oblast imunoglobulina ili njegov deo, albumin ili njegov fragment, vezujući albuminski deo, PAS sekvencu, HAP sekvencu, bilo koje derivate ili varijante ili bilo koju kombinaciju istih. Ne-polipeptidni deo može da sadrži polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu i hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili varijantu, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim slučajevima, veznik između Hl i H2 u formulama (aa) i (bb) je procesor koji povezuje. U drugim slučajevima, veznik između VWF fragmenta i H1 u formulama (aa) i (bb) je deljivi veznik, npr., trombin deljiv veznik koji se može razbiti trombinom.

[0103] Orijentacija polipeptidnih formula prikazana ovde je od N-završetak (levo) do C-završetka (desno). Na primer, formula H-L-V znači formula NH2-H-L-V-COOH. U jednom slučaju, ovde opisane formule mogu da sadrže dodatne sekvence između dve grupa. Na primer, formula V-L1-H1-L2-H2 može dalje da sadrži sekvence na N-završetku V, između V i L1, između Ll i H1, između Hl ili L2, između L2 ili H2, ili na C-završetak H2 ako nije drugačije određeno. U drugom slučaju, crtica (-) ukazuje na peptidnu vezu ili jednu ili više aminokiselina.

[0104] U specifičnim slučajevima, himerni protein sadrži, sastoji se u osnovi od jedne ili više formula izabranih iz grupe koja se sastoji iz (a1) V-H, (a2) H-V, (a3) V-L-H, (a4) H-L-V, (a5) V-L1-H1-H2, (a6) H2-H1-L1-V, (a7) V-L1-H1:H2, (a8) H2:H1-L1-V, (a9) V-H1:H2, (b1) H2:H1-V, (b2) V-L1-H1-L2-H2, (b3) H2-L2-H1-L1-V, (b4) H1-V-H2, (b5) H1-L1-V-L2-H2, i (b6) H2-L2-V-L1-H1, pri čemu V sadrži jedan ili više VWF fragmenata ovde opisanih, L, L1 ili L2 sadrži veznik, H ili Hl sadrži prvi heterologni deo. U jednom slučaju, prvi heterologni deo (H1) može biti polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oboje. Heterologni polipeptidni deo može sadržati, na primer, imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji veže albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu ili bilo koju njihovu kombinaciju. Neograničavajući primeri ne-polipeptidne grupe korisne kao H1 uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U drugom slučaju, H2 može sadržati drugi

4

heterologni deo. Drugi heterologni deo može biti polipeptid, ne-polipeptidna grupa ili oboje. Heterologni polipeptidni deo može sadržati, na primer, imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji veže albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu ili bilo koju njihovu kombinaciju. Neograničavajući primeri ne-polipeptidne grupe korisne kao H1 uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim slučajevima, veznik između prvog heterolognog dela i drugog heterolognog dela je obradivi veznik. U drugim slučajevima, veznik između VWF fragmenta i prvog heterolognog dela ili drugog heterolognog dela je deljivi veznik, koji sadrži jedno ili više mesta deljenja, npr., trombin deljivi veznik.

[0105] Himerni protein predmetnog pronalaska sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz (aa), (bb), (cc), (dd), (a1), (a2), (a3), (a4), (a5 ), (a6), (a7), (a8), (a9), (b1), (b2), (b3), (b4), (b5) i (b6) i proteina FVIII, koji je kovalentno povezan sa ili kovalentno povezan sa VWF fragmentom, prvim heterolognim delom (npr., prvim Fc regionom) ili drugim heterolognim delom (npr., drugim Fc regionom) formule. U jednom otelotvorenju, FVIII protein je povezan ili povezan sa VWF fragmentom kovalentnom vezom ili veznikom. U drugom otelotvorenju, FVIII protein može biti povezan sa prvim heterolognim delom ili drugim heterolognim delom kovalentnom vezom ili veznikom.

[0106] U jednom otelotvorenju, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži VWF fragment ovde opisan kovalentno povezan ili kovalentno povezan sa FVIII proteinom. Na primer, himerni protein može da sadrži VWF fragment i FVIII protein, pri čemu su VWF fragment i FVIII protein povezani kovalentnom nepeptidnom vezom, peptidnom vezom ili veznikom, npr., deljivim veznikom. U specifičnom otelotvorenju, VWF fragment i FVIII protein su povezani ili međusobno deluju pomoću jedne ili više disulfidnih veza. U drugom otelotvorenju, VWF fragment vezan za FVIII protein ili u interakciji sa njim je povezan ili spojen sa prvim heterolognim delom. U drugim otelotvorenjima, FVIII protein vezan za VWF fragment ili interakciju sa njim je dalje povezan sa drugim heterolognim delom. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment vezan za ili interakciju sa FVIII proteinom je dalje povezan sa prvim heterolognim delom, a FVIII protein je dalje povezan sa drugim heterolognim delom. U nekim otelotvorenjima, prvi polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment i prvi heterologni deo i drugi polipeptidni lanac koji sadrži FVIII protein i drugi heterologni deo su međusobno povezani tako da udruživanje ne dozvoljava interakciju

4

proteina FVIII sa drugim ostaci, npr. endogenim VWF, pri čemu je asocijacija kovalentna veza, npr., disulfidna veza.

[0107] Svaki VWF fragment ili FVIII protein može se povezati ili povezati s prvim i drugim heterolognim delom pomoću veznika, npr, deljivog veznika npr., trombin deljivog veznika. Veznik između VWF fragmenta i prvog heterolognog dela ovde se može označiti kao VWF veznik. Veznik između FVIII proteina i drugog heterolognog dela ovde može biti označen kao FVIII veznik. Ili, oba od VWF fragmenta ili FVIII proteina može se povezati ili povezati s prvim i drugim heterolognim delom pomoću veznika, npr., deljivog veznika koji se može odvajati, npr., trombin deljivog veznika U određenim otelotvorenjima, prva heterologni deo povezana sa VWF fragmentom sadrži polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oboje.

Neograničavajući primeri prve heterologne polipeptidne grupe uključuju imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, ili dve ili više kombinacija od toga. Neograničavajući primeri ne-polipeptidne grupe uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES ili HAES), njegov derivat ili varijantu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U drugim otelotvorenjima, druga heterologni deo povezana sa FVIII proteinom sadrži polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oboje. Neograničavajući primeri drugog heterolognog dela uključuju imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, ili dve ili više kombinacija od toga. Neograničavajući primeri nepolipeptidne grupe uključuju polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES ili HAES), njegov derivat ili varijantu ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment je vezan za FVIII korišćenjem in vitro vezivanjem proteina posredovanim sortazom. U nekim otelotvorenjima koristi se motiv prepoznavanja sorta.

[0108] U jednom otelotvorenju, prvi heterologni deo je imunoglobulinski konstantni region ili njegov deo. U određenom otelotvorenju, prvi heterologni deo je prvi Fc region. U nekim otelotvorenjima, drugi heterologni deo je imunoglobulinski konstantni region ili njegov deo. U specifičnom otelotvorenju, drugi heterologni deo je drugo Fc region. U posebnom otelotvorenju, himerni protein sadrži VWF fragment ovde opisan i FVIII protein, pri čemu je VWF fragment povezan sa konstantnim regionom imunoglobulina ili njegovim delom, koji je Fc region. U drugom otelotvorenju, himerni protein sadrži VWF fragment ovde opisan i FVIII protein, pri čemu je FVIII protein povezan sa konstantnim regionom imunoglobulina ili

4

njegovim delom, koji je Fc region. U drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment ovde opisan i FVIII protein, pri čemu je VWF fragment povezan sa prvim imunoglobulinskim konstantnim regionom, koji je prvi Fc region, a FVIII protein je povezan sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina, koji je drugi Fc region i gde su prvi Fc region ili drugi Fc regioni povezani međusobno kovalentnom vezom. U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment povezan sa prvim heterolognim delom je dalje povezan sa drugim heterolognim delom, npr., drugim Fc regionom, pomoću veznika, npr., procesora koji se može obraditi. U jednom aspektu, VWF fragment je povezan sa prvim heterolognim delom pomoću veznika, npr. VWF veznika, npr., deljivog veznika. U drugom aspektu, FVIII protein je vezan za drugi heterologni deo pomoću veznika, npr., FVIII veznika, npr., deljivog veznika. Neograničavajući primeri heterolognih delova su ovde obelodanjeni na drugom mestu, npr., imunoglobulinski konstantni regiona ili njegov deo u odeljcima [0165]. - [0193], albumin, fragment ili njegova varijanta u paragrafima [0194]-[0198], HAP sekvence iz paragrafa [0293], transferin, fragmenti ili njegove varijante u odlomcima [0204]-[0205], polimer, npr. polietilen glikol, u paragrafima [0206] - [0213], HES u paragrafima [0214]-[0219], ili PSA u paragrafu [0220]- i PAS sekvence u paragrafima [0199]-[0202].

[0109] U nekim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sastoji se suštinski iz ili sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(a) V-L1-H1-L3-C-L2-H2,

(b) H2-L2-C-L3-H1-L1-V,

(c) C-L2-H2-L3-V-L1-H1,

(d) H1-L1-V-L3-H2-L2-C,

(e) H1-L1-V-L3-C-L2-H2,

(g) H2-L2-C-L3-V-L1-H1,

(g) V-L1-H1-L3-H2-L2-C,

(g) C-L2-H2-L3-H1-L1-V,

(i) H2-L3-H1-L1-V-L2-C,

(j) C-L2-V-L1-H1-L3-H2,

(k) V-L2-C-L1-H1-L3-H2, i

(l) H2-L3-H1-L1-C-L2-V,

gde je V ovde opisani fragment VWF;

svaki od L1 ili L2 je opcioni veznik, npr., veznik koji se može deliti, npr., trombin deljivi veznik;

4

L3 je opcioni veznik, npr., veznik za obradu

svaki od H1 i H2 je opcioni heterologni deo;

C je FVIII protein; i

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina.

[0110] U drugim aspektima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(m) V-L1-H1: H2-L2-C,

(n) V-L1-H1:C-L2-H2;

(o) H1-L1-V:H2-L2-C;

(p) H1-L1-V:C-L2-H2;

(q) V:C-L1-H1:H2;

(r) V:H1-L1-C:H2;

(s) H2:H1-L1-C:V,

(t) C:V-L1-H1:H2, i

(u) C:H1-L1-V:H2.

gde je V ovde opisani fragment VWF;

svaki od L1 ili L2, je opcioni veznik, npr., trombin deljiv veznik;

svaki od H1 i H2 je opcioni heterologni deo;

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i

C je FVIII protein; i (:) je kovalentna veza između H1 i H2.

[0111] U jednom otelotvorenju, jedan ili više heterolognih delova su produživači poluraspada. Produživači polu-raspada su poznati u struci, a neograničavajući primeri takvih produžetaka polu-raspada uključuju imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji vezuje albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin ili njegov fragment, njegov derivat ili varijanta ili dve ili više kombinacija. Primeri nepolipeptidne grupe uključuju, na primer, polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0112] U jednom otelotvorenju, (:) u formulama (m) do (u) predstavlja najmanje jednu nepeptidnu vezu. U određenim otelotvorenjima, hemijska asocijacija, tj., (:) je kovalentna veza. Formule (a) - (u) su ovde uključene samo kao neograničavajući primeri konstrukata predmetnog pronalaska. Orijentacija polipeptidnih formula prikazana je od N-kraja (levo) do C-kraja (desno). Na primer, formula V-L1-H1-L3-C-L2-H2 znači formula NH2-V-L1-H1-L3-C-L2-H2-COOH. Pored toga, (:) može biti udruživanje ili interakcija između dva polipeptidna lanca kovalentnom vezom između bilo kog dela prvog lanca i bilo kog dela drugog lanca, osim ako nije drugačije naznačeno. Na primer, formula V-H1:H2-C ima dva polipeptidna lanca, pri čemu je prvi lanac V-H1, a drugi lanac C-H2, pri čemu V u prvom lancu interaktivno deluje ili se povezuje sa C u drugom lancu i/ili H1 u prvom lancu interaktivno deluje ili se povezuje sa H2 u drugom lancu.

[0113] U određenim otelotvorenjima, himerni protein sastoji se suštinski iz ili sadrži formulu izabranu iz grupe koja se sastoji iz:

(1) V:C, (2) H-V:C ili C:V-H,

(3) V:C-H ili H-C:V, (4) V-H1:H2-C ili H1-V:C-H2,

(5) V:C-H1:H2 ili H2:H1-C:V, (6) H2:H1-V:C ili C:V-H1:H2,

(7) H-L-V:C ili C:V-L-H, (8) V:C-L-H ili H-L-C:V,

(9) V-C ili C-V, (10) H-V-C ili C-V-H,

(11) V-H-C ili C-H-V, (12) V-C-H ili H-C-V,

(13) V-H1-C-H2 ili H2-C-H1-V, (14) H1-V-C-H2 ili H2-C-V-H1,

(15) H1-V-H2-C ili C-H2-V-H1, (16) V-H1-H2-C ili C-H2-H1-V,

(17) V-L-C ili C-L-V, (18) H-L-V-C ili C-V-L-H,

(19) H-V-L-C ili C-L-V-H, (20) V-L-H-C ili C-H-L-V,

(21) V-H-L-C ili C-L-H-V, (22) V-L-C-H ili H-C-L-V,

(23) V-C-L-H ili H-L-C-V, (24) H-L1-V-L2-C ili C-L2-V-L1-H, (25) V-L-H1:H2-C ili C-H2:H1-L-V,

(26) V-H1:H2-L-C ili C-L-H2:H1-V,

(27) V:C-H1-H2 ili H2-H1-C:V,

(28) H2-H1-V:C ili C:V-H1-H2,

(29) V:C-L-H1:H2 ili H2:H1-L-C:V,

(30) H2:H1-L-V:C ili C:V-L-H1:H2,

(31) V-L1-H1:H2-L2-C ili L-L2-H2:H1-L1-V,

(32) V:C-L-H1-H2 ili H2-H1-L-C:V,

(33) V:C-H1-L-H2 ili H2-L-H1-C:V,

(34) V:C-L1-H1-L2-H2 ili H2-L2-H1-L1-C:V,

(35) H2-H1-V:C ili C:V-H1-H2,

1

(36) H2-H1-L-V:C ili C:V-L-H1-H2,

(37) H2-L-H1-V:C ili C:V-H1-L-H2,

(38) H2-L2-H1-L1-V:C ili C:V-L1-H1-L2-H2,

(39) V-L1-H-L2-C ili C-L2-H-L1-V,

(40) V-L1-C-L2-H ili H-L2-C-L1-V,

(41) V-L-H 1-C-H2 ili H2-C-H1-L-V,

(42) V-H1-C-L-H2 ili H2-L-C-H1-V,

(43) V-H1-L-C-H2 ili H2-C-L-H1-V,

(44) H1-L-V-C-H2 ili H2-C-V-L-H1,

(45) H1-V-L-C-H2 ili H2-C-L-V-H1,

(46) H1-V-C-L-H ili H-L-C-V-H1,

(47) H1-L-V-H2-C ili C-H2-V-L-H1,

(48) H1-V-L-H2-C ili C-H2-L-V-H1,

(49) H1-V-H2-L-C ili C-L-H2-V-H1,

(50) V-L-H1-H2-C ili C-H2-H1-L-V,

(51) V-H1-L-H2-C ili C-H2-L-H1-V,

(52) V-H1-H2-L-C ili C-L-H2-H1-V,

(53) V-L1-H1-L2-C-H2 ili H2-C-L2-H1-L1-V,

(54) V-L1-H1-C-L2-H2 ili H2-L2-C-H1-L1-V,

(55) V-L1-H1-L2-C-L3-H2 ili H2-L3-C-L2-H1-L1-V, (56) V-H1-L1-C-L2-H2 ili H2-L2-C-L1-H1-V,

(57) H1-L1-V-L2-C-H2 ili H2-C-L2-V-L1-H1,

(58) H1-L1-V-C-L2-H2 ili H2-L2-C-V-L1-H1,

(59) H1-L1-V-L2-C-L3-H2 ili H2-L3-C-L2-V-L1-H1, (60) H1-V-L1-C-L2-H2 ili H2-L2-C-L1-V-H1,

(61) H1-L1-V-L2-H2-C ili C-H2-L2-V-L1-H1,

(62) H1-L1-V-H2-L2-C ili C-L2-H2-V-L1-H1,

(63) H1-L1-V-L2-H2-L3-C ili C-L3-H2-L2-V-L1-H1, (64) H1-V-L1-H2-L2-C ili C-L2-H2-L1-V-H1,

(65) V-L1-H1-L2-H2-C ili C-H2-L2-H1-L1-V,

(66) V-L1-H1-H2-L2-C ili C-L2-H2-H1-L1-V,

(67) V-L1-H1-L2-H2-L3-C ili C-L3-H2-L2-H1-L1-V, i (68) V-H1-L1-H2-L2-C ili C-L2-H2-L1-H1-V,

V je VWF fragment opisan u daljem tekstu;

2

C je FVIII protein;

H ili H1 je heterologni deo ili prva heterologni deo;

H2 je druga heterologni deo; prvi i drugi heterologni delovi mogu biti isti ili različiti; Svaki od L, L1 ili L2 je opcioni veznik;

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i

(:) je kovalentna veza. Svaki veznik može biti isti ili različit i svaki može biti veznik koji se može deliti, a koji sadrži jedno ili više mesta enzimatskog deljenja.

Heterologne jedinice mogu biti tehnologija produženja polu-raspada poznata u struci, polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili oboje. Polipeptidna celina može da sadrži konstantnu oblast imunoglobulina ili njen deo, albumin ili njegov fragment, deo koji se veže za albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, bilo koje derivate ili njihove varijante ili bilo kakve kombinacije istih (npr., Fc region). Primeri ne-polipeptidne grupe uključuju, na primer, polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili varijanta ili bilo koju njihovu kombinaciju. Svaki od H, H1 ili H2 može biti pojedinačno izabran na osnovu karakteristika i mogu biti svi isti ili svaki različit. Neograničavajući primeri heterolognih delova su ovde obelodanjeni na drugom mestu, npr., imunoglobulinski konstantni regiona ili njegov deo u odeljcima [0126]. - [0153], albumin ili njegov fragment ili varijanta u odlomcima [0154]-[0157], polimer, npr., polietilen glikol, u paragrafima [0166] -[0173], i PAS sekvence u odlomcima [0159]-[0162]. Formule (1) - (68) su ovde uključene samo kao neograničavajući primeri konstrukata predmetnog pronalaska.

[0114] U jednom otelotvorenju, (:) predstavlja najmanje jednu ne-peptidnu vezu. U određenim otelotvorenjima, hemijska asocijacija, tj., (:) je kovalentna veza. U drugim otelotvorenjima, (:) je peptidna veza.

[0115] U jednom otelotvorenju, prvi heterologni deo (H ili HI) povezan sa VWF fragmentom u himernom proteinu je prvi Fc region. U drugom otelotvorenju, drugi heterologni deo (ili H2) povezan sa FVIII proteinom u himernom proteinu je drugi Fc region.

[0116] U određenim otelotvorenjima, himerni protein prema pronalasku sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži, sastoji se u osnovi ili sastoji od aminokiselinske sekvence koja kodira FVIII (npr., jednolančani FVIII) i prvi heterologni deo (npr., prvi Fc region) i drugi lanac koji sadrži, sastoji se u osnovi iz aminokiselinske sekvence ili se sastoji iz VWF fragmenta koji sadrži D' domen i D3 domen, drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region) i vezu između VWF fragmenta i drugog Fc domena (npr., VWF veznik). Veznik između VWF fragmenta i drugog Fc domena može biti trombin deljivi veznik. U nekim otelotvorenjima, jednolančani FVIII protein sadrži treći heterologni deo, npr., produživač polu-raspad, koji je povezan sa N-završetkom, C-završetkom ili jednim ili više mesta unutar FVIII sekvence.

[0117] U drugim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži tri polipeptidna lanca, pri čemu se prvi lanac sastoji, sastoji se u osnovi ili se sastoji od teškog lanca FVIII, a drugi lanac se sastoji, sastoji se u osnovi od lakog lanca ili se sastoji iz njega FVIII spojen sa prvim heterolognim delom (npr., prvim Fc regionom), a treći polipeptidni lanac sadrži, sastoji se u osnovi ili sastoji iz VWF fragmenta koji sadrži D' domen i D3 domen, drugi heterologni deo (npr., drugi region Fc) i veznik. Veznik između VWF fragmenta i drugog heterolognog dela može biti trombin deljivi veznik. U nekim otelotvorenjima, teški lanac FVIII je povezan sa trećim heterolognim delom, npr., produživač polu-raspada, koji može biti povezan sa N-završetkom, C-završetkom ili jednim ili više mesta unutar FVIII sekvence.

[0118] U još nekim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz teškog lanca FVIII i drugog lanca koji se sastoji, koji se sastoji u osnovi iz lakog lanca ili se sastoji iz lakog lanca FVIII, prvi heterologni deo (npr., prvi Fc region), prvi veznik (npr., mesto deljenja proteaze koje sadrži jedno ili više mesta za preradu u stanici), VWF fragment, drugi veznik (npr., trombin deljivi veznik) i drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region), gde je laki lanac FVIII povezan sa prvim heterolognim delom (npr., prvim Fc regionom), koji je dalje povezan sa VWF fragmentom prvog veznika (npr., procesni veznik koji ima mesto deljenja proteaze, koji sadrži jedno ili više mesta intracelularnog procesiranja, i gde je VWF fragment povezan sa drugim Fc regionom drugim veznikom (npr., trombin deljivi veznik). U nekim otelotvorenjima, prvi veznik i drugi veznik su identični ili različiti.

[0119] U određenim otelotvorenjima, himerni protein prema pronalasku sadrži jedan polipeptidni lanac, koji sadrži jednolančani FVIII protein, prvi heterologni deo (npr., Prvi Fc region), prvi veznik (npr., trombin deljivi veznik), VWF fragment, drugi veznik (npr., trombin deljivi veznik) i drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region), pri čemu je

4

jednolančani FVIII protein povezan sa prvim heterolognim delom, koji je takođe povezan sa VWF fragmentom prvim veznikom, a VWF fragment je povezan sa drugim Fc regionom drugim veznikom. U jednom otelotvorenju, prvi veznik je deljivi veznik koji sadrži prvo mesto deljenja i drugo mesto deljenja. U drugom otelotvorenju, drugi veznik je deljivi veznik i sadrži jedno ili dva mesta koja se mogu deliti. U specifičnom otelotvorenju, drugi veznik je trombin deljivi veznik. Veznik koristan u predmetnom pronalasku može biti bilo koje dužine, npr., najmanje 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, ili 700 aminokiselina. Na primer, veznik može biti 20 aminokiselina, 35 aminokiselina, 42 aminokiseline, 73 aminokiseline ili 98 aminokiselina.

[0120] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment je direktno povezan sa FVIII proteinom peptidnom vezom ili veznikom. Kao jedan od načina povezivanja VWF fragmenta i FVIII proteina direktno ili preko veze, može se koristiti enzimska ligacija (npr., sortaza). Na primer, sortaza se odnosi na grupu prokariotskih enzima koji modifikuju površinske proteine prepoznavanjem i deljenjem karboksil-terminalnog sortirajućeg signala. Za većinu supstrata enzima sortaze, signal za prepoznavanje se sastoji od motiva LPKSTG (Leu-Pro-any-Thr-Gly (SEQ ID NO:106), zatim visoko hidrofobna transmembranska sekvenca, zatim skup osnovnih ostataka kao što je arginin. Deljenje dolazi između Thr i Gly, privremenim spajanjem kroz Thr ostatak na aktivno mesto Cys ostatka ligacijskog partnera, praćenog transpeptidacijom koja protein kovalentno vezuje za ćelijski zid. U nekim otelotvorenjima partner za ligaciju sadrži Gly (n).

[0121] U jednom otelotvorenju, VWF fragment povezan sa motivom prepoznavanja sortaze opcionim veznikom može biti spojen na FVIII protein povezan sa Gly(n) sortazom, pri čemu n može biti bilo koji celi broj. Konstrukcija ligacije sadrži VWF fragment (N-terminalni deo konstrukta) i FVIII protein (C-terminalni deo konstrukta), pri čemu je motiv prepoznavanja sortaza umetnuta između. Primer konstrukcije je prikazan na slici 24 (A). Druga konstrukcija ligacije sadrži VWF fragment (N-terminalni deo konstrukta, veznik, motiv prepoznavanja sortaze i FVIII protein (C-terminalni deo konstrukcije) (npr., Slika 24 (C)). U drugom otelotvorenju, FVIII protein povezan sa motivom prepoznavanja sortaze opcionim veznikom može biti spojen na VWF fragment povezan sa Gly(n) sortazom, pri čemu je n celi broj. Konstrukcija ligacije sadrži FVIII protein (N-terminalni deo konstrukta) i VWF fragment (C-terminalni deo konstrukta), pri čemu je motiv prepoznavanja sortaza umetnuta između.

Primer konstrukcije je prikazan na slici 24(B). Još jedan rezultirajući ligacioni konstrukt sadrži FVIII protein (N-terminalni deo konstrukta), veznik, motiv prepoznavanja sortaze i VWF fragment (C-terminalni deo konstrukcije) (npr., Slika 24 (D)). U drugim otelotvorenjima, VWF fragment povezan sa motivom prepoznavanja sortaza prvim opcionim veznikom može se spojiti u heterolognu jedinicu, npr., imunoglobulinski konstantni region ili njen deo, npr., Fc region, povezan sa mestom deljenja trombina od strane drugog opcionog veznika. Rezultirajući konstrukt može da sadrži VWF fragment (N-terminalni deo), prvi veznik, motiv prepoznavanja sortaze, mesto deljenja proteaze, drugi opcioni veznik i heterologni deo (npr., Slika 24 (E)). U nekim otelotvorenjima, ovaj rezultirajući konstrukt je deo himernog proteina koji sadrži FVIII protein i drugi heterologni deo, npr., imunoglobulinski konstantni region ili njegov deo, npr., drugi Fc region. U jednom primeru, u drugom primeru, himerna supstanca sadrži tri polipeptidna lanca, prvi lanac sadrži VWF fragment, prvi veznik, motiv prepoznavanja sortaze, mesto deljenja proteaze, drugi opcioni veznik, prvi heterologni deo, drugi lanac sadrži laki lanac FVIII proteina i drugi heterologni deo, i treći lanac koji sadrži teški lanac FVIII proteina.

[0122] U još nekim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska koji sadrži VWF fragment i FVIII protein, pri čemu su VWF fragment i FVIII protein kovalentno povezani jedni sa drugima ili su kovalentno povezani jedni sa drugima ima manju imunogenost od FVIII proteina bez VWF fragment. Smanjena imunogenost uključuje, ali nije ograničena na, manji humoralni imuni odgovor, npr., manje neutrališući titar antitela, ili manje ćelijski posredovani imuni odgovor protiv FVIII, npr., proizvodnja različitih citokina.

[0123] U još nekim drugim otelotvorenjima, kao rezultat pronalaska, polu-raspad FVIII proteina (ili himernog proteina) se produžava u poređenju sa proteinom FVIII bez VWF fragmenta ili divljim tipom FVIII. Polu-raspad proteina FVIII je najmanje oko 1.5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2.5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta , najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili barem oko 12 puta duži od vremena polu-raspada proteina FVIII, bez VWF fragment. U jednom otelotvorenju, poluraspad FVIII je oko 1.5 puta do oko 20 puta, oko 1.5 puta do oko 15 puta, ili oko 1.5 puta do oko 10 puta duže od vremena polu-raspada divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, poluraspad FVIII produžava se oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 -poklopac, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, otprilike 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, od oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta, u poređenju sa tim na divlji tip FVIII ili protein FVIII bez VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat , najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, na najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati ili najmanje oko 108 sati. U još nekim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sat do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana, oko 24 sata do oko tri dana ili oko 24 sata do oko dva dana.

[0124] U nekim otelotvorenjima, prosečni polu-raspad proteina FVIII po ispitaniku je oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sat, oko 22 sata, oko 23 sati, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sat, oko 32 sata, oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sati, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedne nedelje), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.

[0125] U nekim otelotvorenjima, polu-raspad proteina FVIII koji je kovalentno povezan sa VWF fragmentom može se proširiti u FVIII/VWF sa dvostrukim nokaut miševima ("DKO") u poređenju sa polipeptidom koji se sastoji iz FVIII ili FVIII monomer-dimera hibrida.

A) Fragmenti Von Willebrandovog faktora (VWF)

[0126] VWF (takođe poznat kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i proizveden konstitutivno u endotelijumu (u telima Weibel-Palade), megakariocitima (a-granule trombocita) i subendotelnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je protein 2813 aminokiselina. Svaki monomer sadrži određeni broj specifičnih domena sa određenom funkcijom, D' i D3 domene (koji se zajedno vezuju za faktor VIII), domen A1 (koji se vezuje za GPIb receptor za trombocite, heparin i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kojem se RGD domen veže za trombocitni integrin αIIbβ3 kada je ovo aktivirano), i domen „cistein čvor“ na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa faktor rasta koji potiče iz trombocita (PDGF), transformirajući faktor rasta-β (TGFβ) i βhumani horionski gonadotropin (βHCG).

[0127] 2813 monomera aminokiselinske sekvence za humani VWF je prijavljeno kao pristupni broj_NP_000543.2_ u Genbank. Nukleotidna sekvenca koja kodira humani VWF prijavljena je kao pristupni broj_NM_000552.3_ u Genbank. Nukleotidna sekvenca humanog VWF označena je kao SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:2 je sekvenca aminokiselina kodirana sa SEQ ID NO:1. Svaki domen VWF je prikazan u Tabeli 1.

Tabela 1

1

�

�

[0128] Predmetni pronalazak je usmeren na fragment fon Willebrandov faktora (VWF) koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, pri čemu VWF fragment inhibira vezivanje endogenog VWF (VWF pune dužine) na protein FVIII. U jednom otelotvorenju, VWF fragment je povezan kovalentnom vezom za protein FVIII. VWF fragment pronalaska štiti FVIII od deljenja proteaze i aktivacije FVIII, stabilizuje teški i laki lanac FVIII i sprečava uklanjanje FVIII od receptora za uklanjanje. U drugom otelotvorenju, VWF fragment je povezan kovalentnom vezom za protein FVIII i blokira ili sprečava vezivanje proteina FVIII za fosfolipid i aktivirani protein C. Prevencijom ili inhibicijom vezivanja proteina FVIII sa endogenim VWF celom dužinom, VWF fragment pronalaska smanjuje klirens FVIII pomoću VWF receptora klirensa i tako produžava polu-raspad FVIII. Produženje polu-raspada proteina FVIII nastaje zbog vezanja ili povezivanja sa VWF fragmentom koji nedostaje mesto vezivanja receptora VWF klirensa za protein FVIII i zaštitom ili zaštitom FVIII proteina VWF fragmentom od endogenog VWF koji sadrži mesto vezivanja receptora VWF klirensa. FVIII protein vezan na VWF fragment ili zaštićen njim takođe može omogućiti recikliranje proteina FVIII. Zbog toga, fragment VWF ne može biti zreli VWF celom dužinom. Eliminacijom mesta vezivanja receptora za put rafinisanja VWF sadržanih u molekuli VWF pune dužine, FVIII/VWF heterodimeri ovog pronalaska se odvajaju od putanja VWF klirensa, što omogućava dalje produžavanje polu-raspada FVIII.

[0129] VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen može dalje da sadrži VWF domen izabran iz grupe koja se sastoji iz A1 domena, A2 domena, A3 domena, D1 domena, D2 domena, D4 domena, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njihovih fragmenata i bilo koje kombinacije istih. U jednom otelotvorenju, VWF fragment sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz: (1) D' i D3 domene VWF ili njihovi fragmenti; (2) D1, D' i D3 domene VWF ili njihovi fragmenti; (3) D2, D' i D3 domene VWF ili njihovi fragmenti; (4) D1, D2, D' i D3 domene VWF ili njihovi fragmenti; ili (5) D1, D2, D', D3 i A1 domene VWF ili njihovi fragmenti. Ovde opisani VWF fragment ne sadrži mesto koje se vezuje za VWF receptor za uklanjanje. U drugom otelotvorenju, ovde opisani VWF fragment nije aminokiselina 764 do 1274 od SEQ ID NO:2. VWF fragment predmetnog pronalaska može da sadrži bilo koje druge sekvence koje su povezane ili su spojene sa VWF fragmentom, ali nije VWF pune dužine. Na primer, ovde opisani VWF fragment može dalje da sadrži signalni peptid.

[0130] U jednom otelotvorenju, VWF fragment predmetnog pronalaska sadrži D' domen i D3 domen VWF, pri čemu je D' domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ili 100% identično aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO:2, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein, štiti, inhibira ili sprečava vezivanje endogenog VWF fragmenta na FVIII protein. U drugom otelotvorenju, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen VWF, pri čemu je D3 domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ili 100% identično aminokiselinama 867 do 1240 SEQ ID NO:2, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein ili inhibira ili sprečava vezivanje endogenog VWF fragmenta na FVIII protein. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani VWF fragment sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz D' domena i D3 domena VWF, koji su najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično aminokiselinama 764 do 1240 od SEQ ID NO:2, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein ili inhibira ili sprečava vezivanje endogenog VWF fragmenta na FVIII protein. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz domena D1, D2, D' i D3 najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično je aminokiselinama 23 do 1240 SEQ ID NO:2, pri čemu se VWF fragment vezuje za FVIII protein ili inhibira ili sprečava vezivanje endogenog VWF fragmenta na FVIII protein. U još nekim drugim otelotvorenjima, VWF fragment dalje sadrži signalni peptid koji je operativno povezan na njega.

[0131] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment predmetnog pronalaska se u osnovi sastoji ili sastoji iz (1) D'D3 domena, D1D'D3 domena, D2D'D3 domena ili D1D2D'D3 domena i (2) dodatne VWF sekvence gore do oko 10 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence aminokiselina 764 do 1240 od SEQ ID NO:2 aminokiseline 764 do 1250 od SEQ ID NO:2), do oko 15 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence aminokiselina) 764 to 1240 od SEQ ID NO:2 aminokiseline 764 do 1255 od SEQ ID NO:2), do oko 20 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence aminokiselina) 764 to 1240 od SEQ ID NO:2 aminokiseline 764 do 1260 od SEQ ID NO:2), do oko 25 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence aminokiselina) 764 to 1240 od SEQ ID NO:2 aminokiseline 764 do 1265 od SEQ ID NO:2), ili do oko 30 aminokiselina (npr., bilo koje sekvence aminokiselina) 764 to 1240 od SEQ ID NO:2 aminokiseline 764 do 1260 od SEQ ID NO:2). U posebnom otelotvorenju, VWF fragment koji sadrži ili se sastoji u osnovi iz D' domena i D3 domena nisu ni aminokiseline 764 do 1274 od SEQ ID NO:2 niti VWF zrele pune dužine.

[0132] U drugim otelotvorenjima, VWF fragment koji sadrži D'D3 domene povezane sa D1D2 domenima dalje sadrži mesto intracelularnog deljenja, npr., (mesto deljenja od PACE ili PC5), omogućavajući deljenje D1D2 domena iz D'D3 domena tokom ekspresije.

Neograničavajući primeri mesta unutarćelijskog deljenja obelodanjeni su na drugom mestu ovde.

[0133] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen, ali ne sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja sadrži (1) aminokiseline 1241 do 2813 SEQ ID NO:2, (2) aminokiseline 1270 do aminokiselina 2813 od SEQ ID NO:2, (3) aminokiseline 1271 do aminokiselina 2813 od SEQ ID NO:2, (4) aminokiseline 1272 do aminokiselina 2813 od SEQ ID NO:2, (5) aminokiseline 1273 do aminokiselina 2813 od SEQ ID NO:2, i (6) aminokiseline 1274 do aminokiselina 2813 od SEQ ID NO:2.

[0134] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment predmetnog pronalaska sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja odgovara D' domenu, D3 domenu i A1 domenu, pri čemu je sekvenca aminokiselina najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično aminokiselini 764 do 1479 od SEQ ID NO:2, gde je VWF vezan za FVIII. U posebnom otelotvorenju, VWF fragment nije aminokiseline 764 do 1274 od SEQ ID NO:2.

[0135] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment pronalaska sadrži D' domen i D3 domen, ali ne sadrži bar jedan VWF domen izabran iz grupe koja sadrži (1) domen A1, (2) domen A2, (3) domen A3, (4) domen D4, (5) domen B1, (6) B2 domen, (7) domen B3, (8) domen C1, (9) domen C2, (10) CK domen, (11) CK domen i C2 domen, (12) CK domen, C2 domen i C1 domen, (13) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, (14) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, (15) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen i B1 domen, (16) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen i D4 domen, (17) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen i A3 domen, (18) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen, domen A3 i domen A2, (19) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen, A3 domen, A2 domen i A1 domen, i (20) bilo koje kombinacije istih.

[0136] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži D'D3 domene i jedan ili više domena ili modula. Primeri takvih domena ili modula uključuju, ali nisu ograničeni na, domene i module obelodanjene u Zhour i dr., Blood published online April 6, 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Na primer, VWF fragment može da sadrži D'D3 domen i jedan ili više domena ili modula izabranih iz grupe koja se sastoji od A1 domena, A2 domena, A3 domena, D4N modula, VWD4 modula, C8-4 modula, TIL-4 modula , C1 modul, C2 modul, C3 modul, C4 modul, C5 modul, C5 modul, C6 modul i sve njihove kombinacije.

[0137] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment je povezan sa heterolognim delom, pri čemu je heterologni deo vezana za N-terminus ili C-terminus VWF fragmenta ili je umetnuta između dve aminokiseline u VWF fragmentu. Na primer, mesta za umetanje heterologne grupe u VWF fragment mogu biti u D' domenu, D3 domenu ili oboje. Heterologni deo može biti produžetak polu-raspada.

[0138] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment predmetnog pronalaska formira multimer, npr., dimer, trimer, tetramer, pentamer, heksamer, heptamer ili multimere višeg reda. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment je monomer koji ima samo jedan VWF fragment. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment predmetnog pronalaska može imati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, delecija, dodataka ili modifikacija. U jednom otelotvorenju, VWF fragment može da sadrži supstitucije aminokiselina, delecije, dodatke ili modifikacije tako da VWF fragment nije u stanju da formira disulfidnu vezu ili formira dimer ili multimer. U drugom otelotvorenju, supstitucija aminokiselina je unutar D' domena i D3 domena. U posebnom otelotvorenju, VWF fragment pronalaska sadrži najmanje jednu supstituciju aminokiselina u ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142, ili oba ostatka 1099 i 1142 od SEQ ID NO:2. Barem jedna supstitucija aminokiselina može biti bilo koja aminokiselina koja se prirodno ne pojavljuje kod divljih vrsta VWF. Na primer, supstitucija aminokiselina može biti bilo koja aminokiselina osim cisteina, na primer, izoleucin, alanin, leucin, asparagin, lizin, asparaginska kiselina, metionin, fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, glutamin, triptofan, glicin, valin, prolin, Serin, tirozin, arginin ili histidin. U drugom primeru, supstitucija aminokiselina ima jednu ili više aminokiselina koje sprečavaju ili inhibiraju VWF fragmente da formiraju multimere.

[0139] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment koji je ovde koristan može se dalje modifikovati da bi se poboljšala njegova interakcija sa FVIII, npr., da bi se poboljšao afinitet vezivanja za FVIII. Kao neograničavajući primer, VWF fragment sadrži serinski ostatak u ostatku koji odgovara aminokiselini 764 SEQ ID NO:2 i ostatak lizina na ostatku koji odgovara aminokiselini 773 SEQ ID NO:2. Ostaci 764 i/ili 773 mogu doprineti afinitetu vezivanja VWF fragmenata za FVIII. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment može da ima i druge modifikacije, npr., fragment može biti pegilisan, glikozilisan, heziliran ili polisijalizovan.

B) Heterologni delovi

[0140] Heterologni deo može biti heterologni polipeptid ili heterologna ne-polipeptidna celina. U određenim otelotvorenjima, heterologni deo je molekul koji produžava polu-raspad, a koji je poznat u stanju tehnike i sadrži polipeptidni, ne-polipeptidni deo ili kombinaciju oba. Heterologni polipeptidni deo može da sadrži konstantnu oblast imunoglobulina ili njen deo, albumin ili njegov fragment, vezući albuminski deo, transferin ili njegov fragment, PAS sekvencu, HAP sekvencu, njen derivat ili varijantu ili bilo koje kombinacije istih. U nekim otelotvorenjima, ne-polipeptidni vezni deo sadrži polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES), njegov derivat ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim otelotvorenjima, mogu postojati jedna, dve, tri ili više heterolognih delova, a svaki od njih može biti isti ili različiti molekuli.

1) Konstantni region ili njihov deo imunoglobulina

[0141] Konstantno područje imunoglobulina sastoji se od domena označenih CH (konstantno teški) domeni (CH1, CH2, itd.). U zavisnosti od izotipa (tj. IgG, IgM, IgA IgD ili IgE), konstantni region može da se sastoji od tri ili četiri CH domena. Neki konstantni regioni izotipova (npr. IgG) takođe sadrže zglobni region. Videti Janeway i dr.2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.

[0142] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo za proizvodnju himernog proteina predmetnog pronalaska može se dobiti iz više različitih izvora. U poželjnim otelotvorenjima, konstantni region imunoglobulina ili njen deo potiče iz humanog imunoglobulina. Međutim, podrazumeva se da konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može da se dobije iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer glodara (npr. miša, štakora, zeca, zamorca) ili ne-humanog primata (npr. šimpanze, makaki). Štaviše, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može se izvesti iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji imunoglobulinski izotip, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju se koristi humani izotip IgGl.

[0143] Razne sekvence gena s konstantnim regionom imunoglobulina (npr. sekvence gena humanog konstantnog regiona) dostupne su u obliku javno dostupnih depozita. Sekvence domena sa konstantnim regiona može se izabrati sa određenom efektorskom funkcijom (ili joj nedostaje određena efektorska funkcija) ili sa određenom modifikacijom da bi se smanjila imunogenost. Objavljene su mnoge sekvence antitela i gena koji kodiraju antitela i pogodne sekvence Ig konstantnog regiona (npr. zglobne, CH2 i/ili CH3 sekvence, ili njihovi delovi) mogu se izvesti iz ovih sekvenci koristeći tehnike poznate u umetnosti. Genetski materijal dobijen koristeći bilo koji od iznad navedenih postupaka može se zatim izmeniti ili sintetizovati da bi se dobili polipeptidi predmetnog pronalaska. Dalje će se razumeti da obim predmetnog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije DNK sekvenci konstantnih regiona.

[0144] Sekvence konstantnog regiona imunoglobulina ili njihov deo mogu se klonirati, npr., korišćenjem lančane reakcije polimeraze i prajmera koji su izabrani da povećaju domen od interesa. Da bi klonirali sekvencu konstantnog regiona imunoglobulina ili njegov deo iz antitela, mRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno prepisanih u DNK i gena antitela pojačanih PCR. Metode PCR amplifikacije su detaljno opisane u U.S. Pat. Nos.4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; i u, npr., "PCR Protocols: A Guide to

1

Methods and Applications" Innis i dr. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho i dr.

1989. Gene 77:51; Horton i dr.1993. Methods Enzymol.217:270). PCR se može inicirati konsenzusnim prajmerima sa konstantnim regionom ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih sekvencija DNK teških i lakih lanaca. Kao što je iznad diskutovano, PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju antitela lakim i teškim lancima. U ovom slučaju, biblioteke mogu biti prikazane konsenzusnim prajmerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde za konstantni region miša. U struci su poznati brojni setovi prajmera pogodnih za amplifikaciju gena antitela (npr., 5' primera zasnovana na N-terminalnom nizu prečišćenih antitela (Benhar and Pastan.1994. Protein Engineering 7:1509); završava se brzo amplifikacija cDNK (Ruberti, F. i dr.1994. J. Immunol. Methods 173:33); vodeće sekvence antitela (Larrick i dr.1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano u Newman i dr., U.S. Pat. No.

5,658,570, podnesen 25. januara, 1995.

[0145] Ovde korišćen konstantni region imunoglobulina može da obuhvata sve domene i zglobni region ili njegove delove. U jednom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njen deo sadrži CH2 domen, CH3 domen i zglobni region, tj. Fc region ili FcRn vezujući partner.

[0146] Kao što je ovde korišćen, termin "Fc region" je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu izvornog imunoglobulina, tj., formiran dimernom asocijacijom odgovarajućih Fc domena dvaju njegovih teških lanaca. Izvorni Fc region formira homodimer sa drugim Fc regionom. Suprotno tome, termin "genetski fuzionisani Fc region" ili "jednolančani Fc region" (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji iz Fc domena genetski povezanih u jednom polipeptidnom lancu (tj. kodirano u jedinstvenom genetskom nizu).

[0147] U jednom aspektu, "Fc region" se odnosi na deo jednog imunoglobulinskog teškog lanca koji počinje u zglobnom području tik iznad mesta odvajanja papaina (tj. ostatak 216 u IgG, uzimajući prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca na 114 ) i završava na C-terminalu antitela. Shodno tome, kompletan Fc domen sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.

[0148] Fc region konstantnog regiona imunoglobulina, zavisno od izotipa imunoglobulina,

2

može da obuhvata domene CH2, CH3 i CH4, kao i zglobni region. Himerni proteini koji sadrže Fc region imunoglobulina daju nekoliko poželjnih svojstava himernom proteinu, uključujući povećanu stabilnost, produženi polu-raspad u serumu (videti Capon i dr., 1989, Nature 337:525) kao i vezanje za Fc receptore kao što je neonatalni Fc receptor (FcRn) (U.S. Pat. Nos.6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).

[0149] Konstantni region imunoglobulina ili njegov deo može biti FcRn vezujući partner. FcRn je aktivan u epitelnim tkivima odraslih i izražava se u lumenu creva, plućnim disajnim putevima, nosnim površinama, vaginalnim površinama, debelom crevu i rektalnoj površini (U.S. Pat. No.6,485,726). FcRn vezujući partner je deo imunoglobulina koji se vezuje za FcRn.

[0150] FcRn receptor je izolovan od nekoliko vrsta sisara, uključujući ljude. Poznate su sekvence humanog FcRn, majmunskog FcRn, FcRn pacova i mišjeg FcRn (Story i dr.1994, J. Exp. Med.180:2377). FcRn receptor veže IgG (ali ne i druge imunoglobulinske klase kao što su IgA, IgM, IgD i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG preko ćelijski u luminalnom do seroznom smeru, a zatim oslobađa IgG pri relativno višem pH koji se nalazi u međuprostronoj tečnosti. Izražava se u epitelnom tkivu odraslih (U.S. Pat. Nos. 6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući plućni i crevni epitel (Israel i dr.1997, Immunology 92:69) bubrežni proksimalni tubularni epitel (Kobayashi i dr.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) kao i nazalni epitel, površine vagine i bilijarne površine drveta.

[0151] Partneri za vezanje FcRn korisni u predmetnom pronalasku obuhvataju molekule koje može specifično vezati FcRn receptor uključujući čitav IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente koji uključuju kompletno vezujuće područje FcRn receptora. Region Fc dela IgG koja se vezuje za FcRn receptor je opisana na osnovu kristalografije rendgenskih zraka (Burmeister i dr.1994, Nature 372:379). Glavno područje kontakta Fc sa FcRn je blizu spoja domena CH2 i CH3. Svi Fc-FcRn kontakti su unutar jednog teškog lanca Ig. Partneri za vezanje FcRn uključuju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletno vezujuće područje FcRn. Glavna kontaktna mesta uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 CH3 domen. Upućivanja na numerisanje aminokiselina imunoglobulina ili fragmenata imunoglobulina, ili regiona, zasnivaju se na Kabat i dr.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Public Health, Bethesda, Md.

[0152] Fc region ili FcRn vezujući partneri vezani za FcRn mogu se efikasno prebaciti preko epitelijskih barijera, tako što obezbeđuje neinvazivno sredstvo za sistemsko davanje željenog terapijskog molekula. Pored toga, fuzioni proteini koji sadrže Fc region ili FcRn vezujući partner su endocitozirani ćelijama koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu označeni za razgradnju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju u cirkulaciju, povećavajući tako in vivo polu-raspad ovih proteina. U nekim otelotvorenjima, delovi konstantnih regiona imunoglobulina su Fc region ili FcRn vezujući partner koji se obično povezuje, disulfidnim vezama i drugim nespecifičnim interakcijama, sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn vezujućim partnerom radi formiranja dimera i multimera višeg reda.

[0153] Dva FcRn receptora mogu da vežu jedan molekul Fc. Kristalografski podaci sugerišu da svaki molekul FcRn vezuje jedan polipeptid Fc homodimera. U jednom otelotvorenju, povezivanje FcRn vezujućeg partnera, npr., Fc fragmenta IgG, u biološki aktivni molekul pruža način za isporuku biološki aktivnog molekula oralno, bukalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, kao aerosol koji se daje nazalno ili preko plućnim putem ili okularnim putem. U sledećem otelotvorenju, himerni protein može se primeniti invazivno, npr., subkutano, intravenski.

[0154] FcRn vezujući partnerski region je molekul ili njegov deo koji se može specifično vezati za FcRn receptor sa posledičnim aktivnim transportom od FcRn receptora iz Fc regiona. Specifično se odnosi na dva molekula koja formiraju kompleks koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje karakteriše visoki afinitet i nizak do umeren kapacitet, za razliku od nespecifičnog vezanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do visokim kapacitetom. Obično se vezivanje smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA veća od 10<6>M<-1>ili veća od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje može se smanjiti bez znatnog uticaja na specifično vezivanje, promenom uslova vezivanja. Odgovarajući uslovi vezivanja kao što su koncentracija molekula, jonska jačina rastvora, temperatura, vreme dozvoljeno za vezivanje, koncentracija sredstva za blokiranje (npr., albumin u serumu, mlečni kazein), itd., mogu da optimizuju vešti stručnjaci koristeći rutinu tehnike.

4

[0155] U određenim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži jednu ili više skraćenih Fc regiona koje su ipak dovoljne da daju svojstva vezivanja Fc receptora (FcR) regionu Fc. Na primer, deo Fc regiona koji se veže za FcRn (tj., deo koji veže FcRn) sadrži otprilike aminokiseline 282-438 od IgGl, EU numerisanje (pri čemu su primarna mesta kontakta aminokiseline 248, 250-257, 272 , 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 iz domena CH2 i aminokiselinskih ostataka 385-387, 428 i 433-436 domena CH3. Prema tome, Fc region pronalaska može da sadrži ili sadrži FcRn vezujući deo. Delovi koji vezuju FcRn mogu se izvesti iz teških lanaca bilo kojeg izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju, koristi se FcRn vezujući deo antitela humanog izotipa IgGl. U drugom otelotvorenju, koristi se FcRn vezujući deo antitela humanog izotipa IgG4.

[0156] U drugom otelotvorenju, "Fc region" uključuje aminokiselinsku sekvencu Fc domena ili je izveden iz Fc domena. U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži najmanje jedan od: zglobni (npr. gornji, srednji i/ili donji zglobni region) domen (o aminokiselinama 216-230 Fc regiona antitela prema EU numeraciji), CH2 domen (o aminokiselinama 231-340 Fc regiona antitela prema EU numeraciji), CH3 domen (o aminokiselinama 341-438 regije Fc antitela prema EU numeraciji), CH4 domen, ili njegova varijanta, deo ili fragment. U drugim otelotvorenjima, Fc region sadrži kompletan Fc domen (tj., zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen). U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji iz zglobnog domena (ili njegovog dela) spojenog na CH3 domen (ili njegov deo), zglobni domen (ili njegov deo) spojen na CH2 domen (ili njegov deo), CH2 domen (ili njegov deo) spojen na CH3 domen (ili njegov deo), CH2 domen (ili njegov deo) spojen u zglobni domen (ili njegov deo) i CH3 domen (ili njegov deo). U još nekim drugim otelotvorenjima, Fc regionu nedostaje bar deo CH2 domena (npr., ceo ili deo CH2 domena). U određenom otelotvorenju, Fc region sadrži ili se sastoji od aminokiselina koje odgovaraju brojevima EU 221 do 447.

[0157] Fc regioni označeni kao F, F1 ili F2 ovde mogu biti dobijeni iz više različitih izvora. U jednom otelotvorenju, Fc region polipeptida je izveden iz humanog imunoglobulina.

Međutim, podrazumeva se da Fc region može da se dobije iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer glodara (npr., miša, štakora, zeca, zamorca) ili ne-humanog primata (npr., šimpanze, makaki). Štaviše, polipeptid Fc domena ili njihovih delova može da se dobije iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji imunoglobulinski izotip, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U drugom otelotvorenju se koristi humani izotip IgGl.

[0158] U određenim otelotvorenjima, Fc varijanta daje promenu u najmanje jednoj efektorskoj funkciji koju daje Fc region koji sadrži pomenuti Fc domen divljeg tipa (npr., poboljšanje ili smanjenje sposobnosti Fc regiona da se veže za Fc receptore (npr., FciRI , FciRII ili FciRIII) ili komplementiraju proteine (npr., C1q), ili da aktiviraju citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDCC)). U drugim otelotvorenjima, Fc varijanta obezbeđuje konstrukcijski ostatak cisteina.

[0159] Fc regioni pronalaska mogu da koriste verzije poznate u umetnosti poznate u Fc za koje se zna da prenose promenu (npr., poboljšanje ili smanjenje) funkcije efektora i/ili vezanje FcR ili FcRn. Specifično, molekul vezujućeg pronalaska može obuhvatati, na primer, promenu (npr., supstituciju) na jednom ili više položaja aminokiselina obelodanjenih u međunarodnim PCT objavama WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; patentne objave SAD br. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ili patenti SAD 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250;

5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, i 7,317,091. U jednom otelotvorenju, specifična promena (npr., specifična supstitucija jedne ili više aminokiselina koja je otkrivena u struci) može se izvršiti na jednom ili više obelodanjenih položaja aminokiselina. U drugom otelotvorenju, može se izvršiti različita promena na jednom ili više otkrivenih položaja aminokiselina (npr., različita supstitucija jednog ili više položaja aminokiselina otkrivenih u struci).

[0160] Fc region ili FcRn vezujući partner IgG može se modifikovati u skladu sa dobro prepoznatim postupcima, kao što je mutageneza usmerena na mesto i slično, da bi se modifikovani fragmenti IgG ili Fc ili njihovi delovi povezali sa FcRn. Takve modifikacije uključuju modifikacije udaljene od FcRn kontaktnih mesta kao i modifikacije unutar kontaktnih mesta koje očuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, sledeći pojedinačni aminokiselinski ostaci humanog IgG1 Fc (Fcg1) mogu biti supstituisani bez značajnog gubitka afiniteta vezanja Fc za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A i K447A, gde na primer P238A predstavlja prolin divljeg tipa supstituisan alaninom u položaju broj 238. Kao primer, specifično otelotvorenje uključuje mutaciju N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Pored alanina, druge aminokiseline mogu biti supstituisane za divlje vrste aminokiselina na iznad navedenim položajima. Mutacije se mogu uvesti pojedinačno u Fc, što dovodi do više od 100 Fc regiona koji se razlikuju od matičnih Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu se uvesti zajedno, što stvara stotine više Fc regiona. Štaviše, jedan od Fc regiona konstrukta predmetnog pronalaska može biti mutiran, a drugi Fc region konstrukta uopšte ne mutiran, ili obojica mogu biti mutirani, ali sa različitim mutacijama.

[0161] Neke od iznad navedenih mutacija mogu dodeliti novu funkcionalnost Fc regionu ili FcRn vezujućem partneru. Na primer, jedno otelotvorenje uključuje N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da smanji imunogenost, poboljšavajući na taj način polu-raspad u regionu Fc i učini da Fc region ne bude sposobna da se veže za FciRI, FciRIIA, FciRIIB i FciRIIIA, a da ne ugrozi afinitet za FcRn (Routledge i dr. 1995, Transplantation 60:847; Friend i dr.1999, Transplantation 68:1632; Shields i dr. 1995, J. Biol. Chem.276:6591). Kao dodatni primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz iznad opisanih mutacija, afinitet za FcRn u nekim slučajevima može biti veći od divljeg tipa. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu stopu „on“, smanjenu stopu „off“ ili oboje povećanu stopu „on“ i smanjenu stopu „off“. Primeri mutacija za koje se veruje da daju povećani afinitet za FcRn uključuju, ali nisu ograničeni na, T256A, T307A, E380A i N434A (Shields i dr.2001, J. Biol. Chem. 276:6591).

[0162] Pored toga, čini se da najmanje tri humana Fc gama receptora prepoznaju mesto vezivanja za IgG unutar donjeg zglobnog regiona, obično aminokiseline 234-237. Zbog toga, drugi primer nove funkcionalnosti i potencijalne smanjene imunogenosti može nastati mutacijama ovog regiona, na primer zamenom aminokiselina 233-236 humanog IgGI "ELLG" odgovarajućom sekvencom iz IgG2 "PVA" (sa jednom delecijom aminokiseline). Pokazano je da FcγRI, FcγRII i FcγRIII, koji posreduju različite efektorske funkcije, neće se vezivati za IgG1 kada su takve mutacije uvedene. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 i Armour i dr.1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.

[0163] U jednom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, npr. Fc region, je polipeptid uključujući sekvencu PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:3) i opciono dalje uključujući sekvencu odabranu iz HQSLGTQ (SEQ ID NO:4), HQNLSDGK (SEQ ID NO:5), HQNISDGK (SEQ ID NO:6), ili VISSHLGQ (SEQ ID NO:7) (U.S. Pat. No.

5,739,277).

[0164] U drugom otelotvorenju, konstantno područje imunoglobulina ili njegov deo sadrži aminokiselinsku sekvencu u zglobnom regionu ili njegov deo koji formira jednu ili više disulfidnih veza sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina ili njenim delom.

Disulfidna veza sa konstantnim regionom imunoglobulina ili njenim delom postavlja prvi polipeptid koji sadrži FVIII, a drugi polipeptid koji sadrži VWF fragment zajedno, tako da endogeni VWF ne zamenjuje VWF fragment i ne vezuje se za FVIII. Stoga, disulfidna veza između prvog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela i drugog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela sprečava interakciju između endogenog VWF i proteina FVIII. Ova inhibicija interakcije između VWF i FVIII proteina omogućava da poluraspad proteina FVIII pređe granicu od dva puta. Zglobni region ili njegov deo može se dalje povezati sa jednim ili više domena CH1, CH2, CH3, njihov fragment i bilo koje njihove kombinacije. U posebnom primeru, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo sadrži zglobni region i CH2 region (npr., aminokiseline 221-340 Fc regiona).

[0165] U nekim otelotvorenjima, konstantni region imunoglobulina ili njen deo je hemiglikozilisani. Na primer, himerni protein koji sadrži dva Fc regiona ili FcRn vezujuće partnere može sadržati prvi, glikozilisani, Fc region (npr., glikozilisani CH2 region) ili FcRn vezujući partner i drugi, aglikozilisani, Fc region (npr., aglikozilisani CH2 region) ili FcRn obavezujućeg partnera. U jednom otelotvorenju, veznik može biti smešten između glikozilisanog i aglikozilisanog Fc regiona. U drugom otelotvorenju, Fc region ili FcRn vezujući partner je u potpunosti glikolizovan, to jest, svi Fc regioni su glikolizovani. U drugim otelotvorenjima, Fc region može biti aglikozilisan, tj., nijedan od Fc delova nije glikozilisan.

[0166] U određenim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži supstituciju aminokiselina u konstantnom regionu imunoglobulina ili njegovom delu (npr., Fc varijante), koji menja antigen-nezavisne efektorske funkcije Ig konstantnog regiona, naročito cirkulišući polu-raspad proteina.

[0167] Takvi proteini pokazuju ili povećano ili smanjeno vezivanje za FcRn u poređenju sa proteinima kojima nedostaju ove supstitucije i, prema tome, imaju povećan ili smanjen poluraspad u serumu, respektivno. Očekuje se da Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn imaju duži polu-raspad u serumu, a takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima lečenja sisara gde je poželjan dugi polu-raspad primenjenog polipeptida, npr., za lečenje hronične bolesti ili poremećaja (videti npr., Patenti SAD 7,348,004, 7,404,956i 7,862,820). Suprotno tome, očekuje se da varijante Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn imaju kraći polu-raspad, a takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za davanje sisarima gde može biti korisno skraćeno vreme cirkulacije, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama kada početni polipeptid ima toksične sporedne efekte kada je prisutan u cirkulaciji duže vreme. Fc varijacije sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe imaju manju verovatnoću da prelaze kroz placentu i samim tim su korisne i u lečenju bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge aplikacije u kojima se može smanjiti afinitet vezivanja FcRn uključuju one aplikacije u kojima se želi lokalizacija mozga, bubrega i/ili jetre. U jednom primernom otelotvorenju, himerni protein pronalaska pokazuje smanjeni transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U drugom otelotvorenju, himerni protein pronalaska pokazuje smanjeni transport preko krvne barijera mozga (BBB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, protein sa izmenjenim FcRn vezanjem sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujući partner (npr., jedan ili dva Fc regiona ili FcRn vezujući partneri) koji imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina unutar "FcRn vezivne petlje" Ig konstantnog regiona. Petlja za vezanje FcRn sastoji se od aminokiselinskih ostataka 280-299 (prema EU numerisanju) divljeg tipa, pune dužine, Fc regiona. U drugim otelotvorenjima, konstantni region Ig ili njegov deo u himernom proteinu pronalaska koji ima izmenjen afinitet vezivanja FcRn sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujući partner koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina unutar 15 A FcRn "kontaktne zone." Kao što je ovde korišćen, izraz 15 Ǻ "FcRn" kontaktna zona "uključuje ostatke na sledećim položajima divljeg tipa, celokupne Fc grupe: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336- 348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU numerisanje). U drugim otelotvorenjima, konstantni region Ig ili njegov deo pronalaska koji ima izmenjen afinitet vezivanja FcRn sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujući partner koji ima jednu ili više supstitucija aminokiselina na položaju aminokiselina, koji odgovara bilo kom od sledećih EU pozicije: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (npr., N434A ili N434K), i 438. Primeri supstitucija aminokiselina koje su promenile aktivnost vezanja FcRn otkrivene su u Međunarodnoj PCT objavi br.

WO05/047327.

[0168] Fc region ili FcRn vezujući partner korišćen u pronalasku takođe može da sadrži supstituciju aminokiselina koja je poznata u struci i koja menja glikozilaciju himernog proteina. Na primer, Fc region ili FcRn vezujući partner himernog proteina vezanog za VWF fragment ili FVIII protein može da sadrži Fc region koji ima mutaciju što dovodi do smanjene glikozilacije (npr., N- ili O-vezana glikozilacija) ili može da sadrži izmenjene glikoformne delove vrste Fc divljeg tipa (npr., glikana sa niskom stopom fukoze ili bez fukoze).

[0169] U jednom otelotvorenju, neprerađeni himerni protein prema pronalasku može da sadrži genetski fuzionisan Fc region (tj., ScFc region) koja ima dva ili više od njenog konstantnog regiona Ig ili njegov deo nezavisno izabran iz Ig konstantnog regiona ili njegovog dela koji je opisan ovde. U jednom otelotvorenju, Fc regioni dimernog Fc regiona su isti. U drugom otelotvorenju, najmanje dva regiona Fc su različiti. Na primer, Fc regiona ili FcRn vezujući partneri proteina predmetnog pronalaska sadrže isti broj aminokiselinskih ostataka ili se mogu razlikovati u dužini od jednog ili više aminokiselinskih ostataka (npr., oko 5 aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselinskih ostataka), oko 10 ostataka, oko 15 ostataka, oko 20 ostataka, oko 30 ostataka, oko 40 ili oko 50 ostataka). U još nekim otelotvorenjima, Fc regioni ili FcRn vezujući partneri proteina predmetnog pronalaska mogu se razlikovati u nizu u jednom ili više položaja aminokiselina. Na primer, najmanje dve Fc regije ili FcRn vezujući partneri mogu se razlikovati na oko 5 položaja aminokiselina (npr., 1, 2, 3, 4 ili 5 položaja aminokiselina), oko 10 položaja, oko 15 položaja, oko 20 pozicije, oko 30 pozicija, oko 40 pozicija ili oko 50 pozicija).

2) Albumin ili fragment, varijanta navedenog

[0170] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo povezana sa VWF fragmentom ili povezana sa FVIII proteinom je albumin ili njen funkcionalni fragment.

[0171] Humani serumski albumin (HSA, ili HA), protein od 609 aminokiselina u celoj formi, odgovoran je za značajan deo osmotskog pritiska u serumu, a funkcioniše i kao nosilac endogenih i egzogenih liganda. Termin "albumin" kako se ovde koristi obuhvata albumin pune dužine ili njegov funkcionalni fragment, varijantu, derivat ili analog.

[0172] U jednom slučaju, himerni protein sadrži ovde opisani VWF fragment i njegov albumin, fragment ili varijantu, pri čemu je VWF fragment povezan sa albuminom ili njegovim fragmentom ili varijantom. U jednom otelotvorenju, himerni protein sadrži VWF fragment i FVIII protein, koji su međusobno vezani, pri čemu je VWF fragment povezan sa albuminom ili njegovim fragmentom ili njegovom varijantom, protein sa VIII aktivnošću je povezan sa albuminom ili fragmentom ili njegova varijanta ili VWF fragment i protein koji ima VIII aktivnost su povezani sa albuminom ili njegovim fragmentom ili varijantom. U drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment povezan sa albuminom ili njegov fragment ili varijantu, koji je dalje povezan sa heterolognom grupom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od imunoglobulinskog konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvenca, HES i PEG. U još nekim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment i FVIII protein, koji su međusobno povezani, gde je FVIII protein povezan sa albuminom ili njegovim fragmentom ili varijantom i dalje povezan sa heterolognom grupom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvence, HES i PEG. U još drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment povezan sa albuminom ili njegov fragment ili njegova varijanta i FVIII protein povezan sa albuminom ili njegov fragment ili njegova varijanta, koji su međusobno povezani, gde je aktivnost VWF fragmenta dalje povezana na prvi heterologni deo odabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvence, HES i PEG i gde je aktivnost proteina FVIII dalje povezana sa drugom heterolognom grupom koja je odabrana iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvence, HES i PEG.

1

[0173] U drugim otelotvorenjima, heterologni deo povezan sa VWF fragmentom ili FVIII proteinom je albumin ili njegov fragment ili varijanta, koji produžava (ili je u stanju da produži) polu-raspad VWF fragmenta ili proteina FVIII. Dalji primeri albumina ili njihovih fragmenata ili varijanti su obelodanjeni u patentna objava SAD. Nos.2008/0194481A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ili 2008/0153751 A1 ili PCT patentna prijava br.2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ili 2007/021494 A2.

3) Deo koji vezuje albumin

[0174] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo povezan sa VWF fragmentom ili FVIII proteinom je deo koji se vezuje za albumin, a koji sadrži peptid koji vezuje albumin, domen vezivanja za bakterijski albumin, fragment antitela koji vezuje albumin ili bilo koju kombinaciju istih. Na primer, protein za vezivanje albumina može biti protein za vezivanje bakterijskog albumina, antitelo ili fragment antitela, uključujući antitela na domenu (videti U.S. Pat. No.6,696,245). Protein za vezivanje albumina, na primer, može biti bakterijski albumin vezujući domen, kao što je streptokokni protein G (Konig, T. and Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Drugi primeri peptida koji vezuju albumin koji se mogu koristiti kao partneri za konjugaciju su, na primer, oni koji imaju a Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys konsenzus sekvenca, pri čemu Xaa1je Asp, Asn, Ser, Thr ili Trp; Xaa2je Asn, Gln, H je , Ile, Leu, ili Lys; Xaa3je Ala, Asp, Phe, Trp ili Tyr; i Xaa4je Asp, Gly, Leu, Phe, Ser ili Thr kao što je opisano u patentnoj prijavi SAD 2003/0069395 ili Dennis i dr. (Dennis i dr. (2002) J. Biol. Chem.277, 35035-35043).

4) PAS Sekvenca

[0175] U drugim otelotvorenjima, heterologni deo vezan za VWF fragment ili FVIII protein je PAS sekvenca.

[0176] PAS sekvenca, kako se ovde koristi, označava aminokiselinsku sekvencu koja sadrži uglavnom ostatke alanina i serina ili sadrži uglavnom ostatke alanina, serina i prolina, aminokiselinska sekvenca koja formira nasumičnu konformaciju zavojnice pod fiziološkim uslovima. Prema tome, PAS sekvenca je gradivni blok, aminokiselinski polimer, ili kaseta sekvenca koja sadrži, sastoji se u osnovi od alanina, serina i prolina koji se mogu koristiti kao deo heterolognog dela u himernom proteinu. Ipak, veštak je svestan da polimer aminokiselina takođe može formirati nasumičnu konformaciju zavojnice kad se ostaci koji nisu alanin, serin i prolin dodaju kao manji sastojak u PAS sekvenci. Termin "manji sastojak", kako je ovde

2

korišćen, znači da se aminokiseline osim alanina, serina i prolina mogu dodati u PAS sekvenci do određenog stepena, npr., do oko 12%, tj., oko 12 od 100 aminokiselina od PAS sekvenca, do oko 10%, tj., oko 10 od 100 aminokiselina PAS sekvence, do oko 9%, tj., oko 9 od 100 aminokiselina, do oko 8%, tj., oko 8 od 100 aminokiselina, oko 6%, tj. oko 6 od 100 aminokiselina, oko 5%, tj., oko 5 od 100 aminokiselina, oko 4%, tj., oko 4 od 100 aminokiselina, oko 3%, tj., oko 3 od 100100 aminokiselina, oko 2%, tj. oko 2 od 100 aminokiselina, oko 1%, tj., oko 1 od 100 aminokiselina. Aminokiseline različite od alanina, serina i prolina mogu biti izabrane iz grupe koju čine Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, i Val.

[0177] U fiziološkim uslovima, PAS sekvenca rasteže nasumičnu konformaciju zavojnice i na taj način može da posreduje povećanoj in vivo i/ili in vitro stabilnosti na VWF faktor ili protein koagulacione aktivnosti. Pošto slučajni domen zavojnice sam po sebi ne prihvata stabilnu strukturu ili funkciju, biološka aktivnost posredovana VWF fragmentom ili proteinom FVIII u koji je spojena u osnovi je sačuvana. U drugim otelotvorenjima, PAS sekvence koje formiraju slučajni domen zavojnice su biološki inertne, posebno u pogledu proteolize u krvnoj plazmi, imunogenosti, izoelektričnog ponašanja tačke/elektrostatičkog vezivanja, vezivanja na receptore ćelijske površine ili internalizacije, ali su i dalje biorazgradive, što daje jasne prednosti preko sintetičkih polimera kao što je PEG.

[0178] Neograničavajući primeri PAS sekvenci koje formiraju nasumičnu konformaciju zavojnice sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji iz ASPAAPAPASPAAPAPSAPA (SEQ ID NO:8), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS (SEQ ID NO:9), APSSPSPSAPSSPSPASPSS (SEQ ID NO:10), APSSPSPSAPSSPSPASPS (SEQ ID NO:11), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA (SEQ ID NO:12), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA (SEQ ID NO:13) i ASAAAPAAASAAASAPSAAA (SEQ ID NO:14) ili kombinacije navedenog. Dodatni primeri PAS sekvence su poznate iz, npr., patentna objava SAD br.2010/0292130 A1 i PCT patentna prijava br. WO 2008/155134 A1.

5) HAP Sekvenca

[0179] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo vezan za VWF fragment ili FVIII protein je homo-aminokiselinski polimer bogat bojom glicinom (HAP). HAP sekvenca može da sadrži ponavljajući niz glicina, koji ima najmanje 50 aminokiselina, najmanje 100 aminokiselina, 120 aminokiselina, 140 aminokiselina, 160 aminokiselina, 180 aminokiselina, 200 aminokiselina, 250 aminokiselina, 300 aminokiseline, 350 aminokiselina, 400 aminokiselina, 450 aminokiselina ili dužina 500 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, HAP sekvenca je sposobna produžiti polu-raspad jedinice koja je pripojena na HAP sekvencu ili je povezana sa njom. Neograničavajući primeri HAP sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na njih (Gly)n, (Gly4Ser)nili S(Gly4Ser)n, gde je n 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20. U jednom otelotvorenju, n je 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40. U jednom otelotvorenju, n je 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ili 200. Videti, npr., Schlapschy M i dr., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007).

6) Transferin ili njegov fragment

[0180] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo vezan za VWF fragment ili FVIII protein je transferin ili njegov fragment. Bilo koji transferin može da se koristi za pravljenje himernih proteina predmetnog pronalaska. Kao primer, divlji tip humanog Tf (Tf) je 679 aminokiselinskih proteina, od približno 75 KDa (ne računajući glikozilaciju), sa dva glavna domena, N (oko 330 aminokiselina) i C (oko 340 aminokiselina), za koje se čini da potiču iz umnožavanja gena. Pogledajte pristupne brojeve kompanije GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 i S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Transferin sadrži dva domena, N domen i C domen. N domen sadrži dva poddomena, N1 domen i N2 domen, a C domen sadrži dva poddomena, C1 domen i C2 domen.

[0181] U jednom otelotvorenju, deo transferina himernog proteina uključuje varijantu spajanja transferina. U jednom primeru, varijanta spajanja transferina može biti varijanta spajanja humanog transferina, npr., Genbank Accession AAA61140. U drugom otelotvorenju, deo transferinovog himernog proteina uključuje jedan ili više domena sekvence transferina, npr., N domen, C domen, N1 domen, N2 domen, C1 domen, C2 domen ili bilo koje kombinacije istih.

7) Polimer, npr., Polietilen glikol (PEG)

[0182] U drugim otelotvorenjima, heterologni deo vezan za VWF fragment ili FVIII je rastvorljivi polimer poznat u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polietilen glikol, etilen glikol/propilen glikol kopolimer, karboksimetilcelulozu, dekstran ili polivinil alkohol. Heterologni deo poput rastvorljivog polimera može biti pričvršćena na bilo koje položaje

4

unutar VWF fragmenta ili FVIII proteina ili N- ili C-završetak.

[0183] U drugom otelotvorenju, himerni protein sadrži VWF fragment i FVIII protein, koji su povezani jedni sa drugima, pri čemu je VWF fragment povezan sa PEG, FVIII protein je povezan sa PEG, ili su oba VWF fragmenta i FVIII protein povezani sa PEG. U drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment i FVIII protein, koji su povezani jedni sa drugima, pri čemu je VWF fragment povezan sa PEG, FVIII protein je povezan sa PEG, ili su oba VWF fragment i FVIII protein povezan sa PEG. U još nekim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment i FVIII protein, koji su međusobno povezani, gde je FVIII protein dalje povezan sa heterolognom grupom koja je izabrana iz grupe koja se sastoji konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela (npr., Fc region), PAS sekvence, HES i albumin i varijante navedenog. U još drugim otelotvorenjima, himerni protein sadrži VWF fragment povezan sa PEG i FVIII protein povezan na PEG, koji su povezani jedni sa drugima, pri čemu je aktivnost VWF fragmenta dalje povezana sa prvim heterolognim delom odabranim iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili njegov deo (npr., Fc region), PAS sekvenca, HES i albumin, fragment ili njegova varijanta i gde je aktivnost proteina FVIII dalje povezana sa drugim heterolognim delom koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz konstantnog regiona imunoglobulina ili a njegov deo (npr., Fc region), PAS sekvenca, HES i njegov albumin, fragment ili varijanta.

[0184] Pronalaskom su takođe obezbeđeni hemijski modifikovani derivati himernog proteina pronalaska koji mogu da daju dodatne prednosti kao što su povećana rastvorljivost, stabilnost i vreme cirkulacije polipeptida ili smanjena imunogenost (videti U.S. Pat. No.4,179,337). Hemijske grupe za modifikaciju mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji iz rastvorljivih polimera koji uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, kopolimer etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilcelulozu, dekstran i polivinil alkohol. Himerni protein može da se modifikuje na nasumičnim pozicijama unutar molekule ili na N- ili C-kraju, ili na unapred određenim pozicijama u molekuli i može da sadrži jednu, dve, tri ili više vezanih hemijskih grupa.

[0185] Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerazgranat. Za polietilen glikol, u jednom aspektu, molekulska masa je između oko 1 kDa i oko 100 kDa radi lakšeg rukovanja i proizvodnje. Mogu se koristiti i druge veličine, zavisno od željenog profila (npr., trajanje željenog kontinuiranog oslobađanja, efekti, ako ih ima na biološku aktivnost, jednostavnost u rukovanju, stepen ili nedostatak antigenosti i drugi poznati efekti polietilen glikola na protein ili analog). Na primer, polietilen glikol može imati prosečnu molekulsku masu od oko 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 45,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000, ili 100,000 kDa.

[0186] U nekim otelotvorenjima polietilen glikol može imati razgranatu strukturu. Razgranati polietilen glikoli su opisani, na primer, u U.S. Pat. No.5,643,575; Morpurgo i dr., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev i dr., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); i Caliceti i dr., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).

[0187] Broj ostataka polietilen glikola pričvršćenih za svaki himerni protein, VWF fragment ili FVIII protein prema pronalasku (tj., stepen supstitucije) takođe može varirati. Na primer, pegilovani proteini predmetnog pronalaska mogu biti u proseku povezani sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20 ili više molekula polietilen glikola. Slično tome, prosečan stepen supstitucije unutar raspona kao što su 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12 , 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19, ili 18-20 ostataka polietilen glikola po molekulu proteina. Postupci za određivanje stepena supstitucije diskutuju se, na primer, u Delgado i dr., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys.9:249-304 (1992).

[0188] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein može biti PEGiliran. PEGilirani faktor VIII može se odnositi na konjugat formiran između faktora VIII i bar jednog molekula polietilen glikola (PEG).

[0189] U drugim otelotvorenjima, FVIII protein korišćen u pronalasku je konjugovan sa jednim ili više polimera. Polimer može biti rastvorljiv u vodi i kovalentno ili nekovalentno vezan za faktor VIII ili druge delove konjugovane na faktor VIII. Neograničavajući primeri polimera mogu biti poli(alkilen oksid), poli(vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), polioksazolin ili poli(akriloilmorfolin). Obelodanjeni su dodatni tipovi polimerno konjugovanih FVIII U.S. Patent No.7,199,223.

8) Hidroksietil skrob (HES)

[0190] U nekim otelotvorenjima, heterologni deo vezana za VWF fragment ili FVIII protein je polimer, npr., hidroksietil skrob (HES) ili njegov derivat.

[0191] Hidroksietil skrob (HES) je derivat prirodnog amilopektina koji se razgrađuje alfaamilazom u telu. HES je supstituisani derivat amilopektina polimera ugljenog hidrata, koji je prisutan u kukuruznom skrobu u koncentraciji do 95 težinskih%. HES pokazuje povoljna biološka svojstva i koristi se kao sredstvo za nadoknadu zapremine krvi i u hemodilukcijskoj terapiji u klinikama (Sommermeyer i dr., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); i Weidler i dr., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).

[0192] Amilopektin sadrži delove glukoze, pri čemu se u glavnom lancu nalaze alfa-1,4-glikozidne veze, a na mestima razgranavanja nalaze se alfa-1,6-glikozidne veze. Fizičkohemijska svojstva ovog molekula uglavnom su određena vrstom glikozidnih veza. Zbog niklovane alfa-1,4-glikozidne veze, stvaraju se spiralne strukture sa oko šest monomera glukoze po okretanju. Fizikalno-hemijska i biohemijska svojstva polimera mogu se menjati supstitucijom. Uvođenje hidroksietil grupe može se postići alkalnom hidroksietilacijom. Prilagođavanjem reakcionih uslova moguće je iskoristiti različitu reaktivnost odgovarajuće hidroksi grupe u nesupstituisanom monomeru glukoze u odnosu na hidroksietilaciju.

Zahvaljujući ovoj činjenici, vešta osoba je u mogućnosti da utiče na model zamene u ograničenom obimu.

[0193] HES uglavnom karakteriše raspodela molekularne težine i stepen supstitucije. Stepen supstitucije, označen kao DS, odnosi se na molarnu supstituciju, poznat je stručnjacima. Videti Sommermeyer i dr., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), kao što je prethodno navedeno, naročito na str.273.

[0194] U jednom otelotvorenju, hidroksietil skrob ima srednju molekulsku masu (srednja masa) od 1 do 300 kD, od 2 do 200kD, od 3 do 100 kD, ili od 4 do 70kD. hidroksietil skrob može dalje pokazati molarni stepen supstitucije od 0.1 do 3, poželjno 0.1 do 2, poželjnije, 0.1 do 0.9, poželjno 0.1 do 0.8, i odnos između supstitucije C2:C6 u opsegu od 2 do 20 sa u pogledu hidroksietil grupa. Neograničavajući primer HES-a koji ima srednju molekulsku masu od oko 130 kD je HES sa stepenom supstitucije od 0.2 do 0.8, kao što su 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 ili 0.8, poželjno od 0.4 do 0.7 poput 0.4, 0.5, 0.6 ili 0.7. U specifičnom otelotvorenju, HES sa srednjom molekulskom težinom od oko 130 kD je VOLUVEN® kompanije Fresenius. VOLUVEN® je veštački koloid, koji se koristi, na primer, za zamenu zapremine koji se koristi u terapijskoj indikaciji za terapiju i profilaksu hipovolemije.

Karakteristike VOLUVEN® su srednja molekulska masa 130,000 /- 20,000 D, molarna supstitucija 0.4 i odnos C2:C6 od oko 9:1. U drugim otelotvorenjima, rasponi srednje molekulske težine hidroksietil škroba su, na primer, 4 do 70 kD ili 10 do 70 kD ili 12 do 70 kD ili 18 do 70 kD ili 50 do 70 kD ili 4 do 50 kD ili 10 do 50 kD ili 12 do 50 kD ili 18 do 50 kD ili 4 do 18 kD ili 10 do 18 kD ili 12 do 18 kD ili 4 do 12 kD ili 10 do 12 kD ili 4 do 10 kD. U još nekim otelotvorenjima, srednja molekulska masa upotrebljenog hidroksietil škroba je u opsegu od više od 4 kD i ispod 70 kD, kao što je oko 10 kD, ili u opsegu od 9 do 10 kD ili od 10 do 11 kD ili od 9 do 11 kD, ili oko 12 kD, ili u opsegu od 11 do 12 kD) ili od 12 do 13 kD, ili od 1 do 13 kD, ili oko 18 kD, ili u opsegu od 17 do 18 kD ili od 18 do 19 kD ili od 17 do 19 kD, ili oko 30 kD, ili u opsegu od 29 do 30, ili od 30 do 31 kD, ili oko 50 kD, ili u opsegu od 49 do 50 kD ili od 50 do 51 kD ili od 49 do 51 kD.

[0195] U određenim otelotvorenjima, heterologni deo može biti smeša hidroksietil skroba koji imaju različitu srednju molekulsku masu i/ili različitih stepena supstitucije i/ili različitih razmera C2: C6 supstitucije. Zbog toga se mogu koristiti smeše hidroksietil skroba koji imaju različitu srednju molekulsku masu i različit stepen supstitucije i različite odnose C2: C6 supstitucija ili sa različitim srednjim molekularnim težinama i različitim stepenom supstitucije i istim ili približno istim odnosom supstitucije C2:C6, ili sa različitim srednjim molekulskim težinama i istim ili približno istim stepenom supstitucije i različitim odnosima C2:C6 supstitucija, ili koja ima istu ili približno istu srednju molekularnu težinu i različite stepene supstitucije i različite razmere supstitucije C2:C6, ili ima različite srednje molekulske težine i isti ili približno isti stepen supstitucije i istu ili približno istu razmeru supstitucije C2:C6, ili s istim ili približno istim srednjim molekularnim težinama i različitim stepenima supstitucije i istim ili približno istom razmerom supstitucije C2:C6, ili s istom ili približno istom srednjom molekularnom težinom i istim ili približno istim stepenom supstitucije i različitom razmerom C2: C6 supstitucije, ili koja ima približno istu srednju molekularnu težinu i približno isti stepen supstitucije i približno istu razmeru supstitucije C2:C6.

9) Polisijalne kiseline (PSA)

[0196] U nekim otelotvorenjima, ne-polipeptidni heterologni deo vezan za VWF fragment ili FVIII protein je polimer, npr., polisijalna kiselina (PSA) ili njihov derivat. Polisijalne kiseline (PSA) su prirodno nerazgranati polimeri sijalne kiseline proizvedeni od strane određenih sojeva bakterija, a kod sisara u određenim ćelijama Roth J., i dr. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhäuser Verlag, Basel, Switzerland), pp 335-348.. Oni se mogu proizvesti u različitim stepenima polimerizacije od n=oko 80 ili više ostataka sijalne kiseline do n=2 ograničenom hidrolizom kiseline ili varenjem s neuraminidazama, ili frakcionisanjem prirodnih, bakterijski izvedenih oblika polimera. Sastav različitih polisijalnih kiselina takođe varira tako da postoje homopolimerni oblici, tj., polisijalna kiselina vezana za alfa-2,8 koja sadrži kapsularni polisaharid soja E. coli K1 i meningokoke iz grupe B, koji se takođe nalazi u embrionalnom obliku molekula adhezije neuronske ćelije (N-CAM). Postoje i heteropolimerni oblici - kao što je naizmenična alfa-2,8 alfa-2,9 polisijalna kiselina soja E. coli K92 i polisaharidi grupe C N. meningitidis. Sijalna kiselina se takođe može naći u naizmeničnim kopolimerima sa monomerima koji nisu sijalna kiselina kao što je grupa W135 ili grupa I iz N. meningitidis. Polisijalne kiseline imaju važne biološke funkcije uključujući evaziju imunoloških i komplementni sistema od strane patogenih bakterija i regulisanje glijalne adhezivnosti nezrelih neurona tokom fetalnog razvoja (pri čemu polimer ima funkciju protiv lepljenja) Cho and Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427-11431, iako kod sisara nema poznatih receptora za polisijalna kiseline.

Polisijalna kiselina vezana za alfa-2,8 E. coli soja K1 je takođe poznata kao "kolomična kiselina" i koristi se (u različitim dužinama) za primer predmetnog pronalaska. Opisani su različiti postupci vezivanja ili konjugacije polisijalnih kiselina na polipeptid (na primer, videti U.S. Pat. No.5,846,951; WO-A-0187922, i US 2007/0191597 A1.

C) FVIII Protein

[0197] "FVIII protein", kako se ovde koristi, znači funkcionalni FVIII polipeptid u svojoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije određeno. Termin FVIII protein uključuje funkcionalni fragment, varijantu, analog ili njegov derivat koji zadržava funkciju faktora VIII divljeg tipa pune dužine u putu koagulacije. "FVIII protein" se koristi naizmenično sa FVIII polipeptidom (ili proteinom) ili FVIII. Primeri funkcija FVIII uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost da deluje kao kofaktor faktora IX ili sposobnost formiranja tenaznog kompleksa sa faktorom IX u prisustvu Ca2 i fosfolipida, koji zatim pretvara Faktor X u aktivirani oblik Xa. FVIII protein može biti humani, svinjski, pasji, pacovski ili mišji FVIII protein. Pored toga, poređenjem FVIII od ljudi i drugih vrsta utvrđeni su sačuvani ostaci koji će verovatno biti potrebni za funkciju (Cameron i dr., Thromb. Haemost. 79:317-22 (1998); US 6,251,632).

[0198] Dostupno je nekoliko testova za procenu funkcije sistema za koagulaciju: aktivirani parcijalni test tromboplastinskog vremena (aPTT), hromogeni test, ROTEM test, protrombinsko vreme (koristi se i za određivanje INR), ispitivanje fibrinogena (često po Klausovoj metodi), broj trombocita, testiranje funkcije trombocita (često PFA- 100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se abnormalnost ispravlja ako se pacijentova plazma meša sa normalnom plazmom), testovi faktora koagulacije, antifosholipidna antitela, D-dimer, genetski testovi (npr., faktor V Leiden, protrombinska mutacija G20210A), razblažiti Raselovo vreme otrovnih vetrova (dRVVT), razne testove funkcije trombocita, tromboelastografiju (TEG ili Sonoclot), tromboelastometriju (TEM®, npr., ROTEM®), ili vreme lize euglobulina (ELT).

[0199] APTT test je indikator performansi koji meri efikasnost i "svojstvenog" (koji se takođe odnosi na kontaktni put aktivacije) i zajedničkog puta koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti zgrušavanja komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora zgrušavanja, npr. FVIII ili FIX. Koristi se zajedno sa protrombinskim vremenom (PT), koji meri spoljašnji put.

[0200] ROTEM analiza pruža informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vreme zgrušavanja, stvaranje ugruška, stabilnost ugruška i liza. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti plazmatskog sistema koagulacije, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može pružiti kompletan pregled sekundarne hemostaze.

[0201] Poznati su FVIII polipeptidni i polinukleotidni nizovi, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri humanih FVIII sekvenci (pune dužine) prikazani su kao sekvence u SEQ ID NO:16 ili 18.

Tabela 2. FVIII pune dužine (podvučeni peptid FVIII signala; FVIII teški lanac je dvostruko podvučen; B domen je označen kurzivom; i laki lanac FVIII je u običnom tekstu)

Signalni peptid: (SEQ ID NO:15)

MQIELSTCFFLCLLRFCFS

Zreli faktor VIII (SEQ ID NO:16)*

Tabela 3. Nukleotidna sekvenca kodira FVIII pune dužine (SEQ ID NO:17)*

1

�

*Podvučene nukleinske kiseline kodiraju signalizirajući peptid.

[0202] FVIII polipeptidi uključuju FVIII pune dužine FVIII, FVIII pune dužine minus Met na N-terminusu, zreli FVIII (minus signalna sekvenca), zreli FVIII sa dodatnim Met na N-terminusu i/ili FVIII sa potpunim ili delimičnim brisanje B domena. U nekim otelotvorenjima, varijante FVIII uključuju brisanje B domena, bilo delimično ili potpuno brisanje.

[0203] Humani FVIII gen je izolovan i eksprimiran u ćelijama sisara (Toole, J. J., i dr., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., i dr., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., i dr., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., i dr., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; i U.S. Pat. No.4,757,006). FVIII sekvenca aminokiselina je izvedena iz cDNK kao što je prikazano na slici U.S. Pat. No.4,965,199. Pored toga, delimično ili u potpunosti izbrisan FVIII iz domene B prikazan je u U.S. Pat. Nos. 4,994,371 i 4,868,112. U nekim otelotvorenjima, humani FVIII B-domen je zamenjen s B-domenom humanog faktora V kao što je prikazano u U.S. Pat. No.5,004,803. Sekvenca cDNK koja kodira humani faktor VIII i sekvenca aminokiselina prikazani su u SEQ ID NO:17 i 16, respektivno, US Application Publ. No.2005/0100990.

[0204] Svinjski FVIII niz objavljen je u Toole, J. J., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Dalje, kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena PCR amplifikacijom FVIII sekvenci iz sDNK biblioteke svinjske slezine je objavljena u Healey, J. F., i dr., Blood 88:4209-4214 (1996). Hibridni humani/svinjski FVIII sa supstitucijama svih domena, svih podjedinica i specifičnih sekvenci aminokiselina obelodanjeni su u U.S. Pat. No. 5,364,771 by Lollar and Runge, i u WO 93/20093. U novije vreme, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence svinja FVIII i himerni FVIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima supstituisane su za odgovarajuće humane domene u WO 94/11503. U.S. Pat. No.

5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje cDNK svinje i izvedene sekvence aminokiselina. U.S. Pat. No.6,458,563 obelodanjuje izbrisan B-domen svinjskog FVIII.

[0205] U.S. Pat. No.5,859,204 to Lollar, J. S. izveštava o funkcionalnim mutantima FVIII koji imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. U.S. Pat. No.6,376,463 to Lollar, J. S. takođe izveštava o mutantima FVIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. US Appl. Publ. No.2005/0100990 to Saenko i dr. izveštava o funkcionalnim mutacijama u A2 domenu FVIII.

[0206] U jednom otelotvorenju, FVIII (ili FVIII deo himernog proteina) može biti najmanje

50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično FVIII aminokiselinskom nizu aminokiselina 1 do 1438 od SEQ ID NO:18 ili aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:16 (bez signalne sekvence) ili FVIII aminokiselinske sekvence aminokiselina -19 do 1438 SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:18 ili aminokiseline -19 do 2332 od SEQ ID NO:15 i SEQ ID NO:16 (sa signalnom sekvencom), pri čemu FVIII ima aktivnost zgrušavanja, npr., Aktivira faktor IX kao kofaktor za pretvaranje faktora X u aktivirani faktor X. FVIII (ili deo VVIII himernog proteina) može biti identičan FVIII sekvenca aminokiselina

4

1 do 1438 od SEQ ID NO:18 ili aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO:16 (bez signalizirajuće sekvence). FVIII može nadalje sadržati signalnu sekvencu.

[0207] "B-domen" FVIII, kako je ovde korišćen, isti je kao B-domen poznat u struci koji je definisan internim identitetom sekvenci aminokiselina i mestima proteolitičkog deljenja, npr., ostacima Ser741-Arg1648 celovite dužine humanog FVIII. Ostali humani FVIII domeni su definisani sledećim aminokiselinskim ostacima: A1, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Asn2019; C1, ostaci Lys2020-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostali niz, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se naziva a3 kiseli region. Lokacije granica za sve domene, uključujući B-domene, za svinju, miša i pseći FVIII takođe su poznati u stanju tehnike. U jednom otelotvorenju, B domen FVIII se briše ("faktor VIII izbrisan iz B domena" ili "BDD FVIII"). Primer BDD FVIII je REFACTO® (rekombinantni BDD FVIII), koji ima istu sekvencu kao i deo faktora VIII sekvence u Tabeli 4. (BDD FVIII teški lanac je dvostruko podvučen; B domen je označen kurzivom; i laki lanac BDD FVIII je u običnom tekstu).

Tabela 4

BDD FVIII (SEQ ID NO:18)

Tabela 5. Nukleotidna sekvenca kodira BDD FVIII (SEQ ID NO:19)*

*Podvučene nukleinske kiseline kodiraju signalizirajući peptid.

[0208] "FVIII izbrisana sa B domena" može imati celokupno ili delimično brisanje obelodanjeno u U.S. Pat. Nos. 6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, BV domena izbrisana FVIII sekvenca iz predmetnog pronalaska sadrži bilo koju od brisanja koja su obelodanjena u kol.4, red 4 do kol. 5, red 28 i primeri 1-5 od U.S. Pat. No.6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U drugom otelotvorenju, faktor VIII sa izbrisanim B domenom je faktor VIII izbrisan iz B domena S743/Q1638 (SQ BDD FVIII) (npr., faktor VIII koji ima deleciju iz aminokiseline 744 u aminokiselinu 1637, npr., faktor VIII koji ima amino kiseline 1-743 i aminokiseline 1638-2332 od SEQ ID NO:16, tj., SEQ ID NO:18). U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak izbrisan iz B-domena ima brisanje obelodanjeno u kol.2, redovi 26-51 i primeri 5-8 od U.S. Patent No.5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, faktor VIII sa izbrisanom iz B domena ima brisanje opisano u kol.1, red 25 do kol.2, red 40 od US Patent No.5,972,885; kol.6, redovi 1-22 i primer 1 od U.S. Patent no.6,048,720; kol.2, redovi 17-46 od U.S. Patent No.5,543,502; kol.4, red 22 do kol.

5, red 36 od U.S. Patent no.5,171,844; kol.2, redovi 55-68, slika 2, i primer 1 od U.S. Patent No. 5,112,950; kol.2, red 2 do kol.19, red 21 i tabela 2 od U.S. Patent No.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol.7, red 43 do kol.8, red 26, i kol.

11, red 5 do kol.13, red 39 od U.S. Patent no.7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53 od U.S. Patent No.6,458,563.

[0209] U nekim otelotvorenjima, izbrisani B-domen FVIII ima deleciju većine B domena, ali još uvek sadrži amino-terminalne sekvence B domena koji su neophodni za in vivo proteolitičku obradu primarnog proizvoda prevođenja u dva polipeptidna lanca, kako je obelodanjeno u WO 91/09122. U nekim otelotvorenjima, FVIII izbrisan iz B domene konstruisan je sa delecijom aminokiselina 747-1638, tj., praktično potpunim brisanjem B domena. Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323 (1990). Faktor VIII izbrisan iz B domene takođe može sadržati brisanje aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 iz FVIII. Meulien P., i dr. Protein Eng.2(4): 301-6 (1988). Dodatna brisanja domena B koja su deo pronalaska uključuju: delecija aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, i dr.

Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT published application No. WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, i dr., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT application No.88/00831)), ili 816 do 1598 ili 741 do 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt.

(1988) br 82:16-25, EP 295597)). U drugim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži fragmente B-domena koji zadržavaju jedno ili više mesta vezanih za N glikozilacije, npr., ostatke 757, 784, 828, 900, 963 ili opciono 943, koji odgovaraju aminokiselinska sekvenca FVIII sekvence pune dužine. Primeri fragmenata B domene uključuju 226 aminokiselina ili 163 aminokiseline B-domena kako je obelodanjeno u Miao, H.Z., i dr., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, i dr., J. Thromb. Haemost.6: 1352-1359 (2008), i Pipe, S.W., i dr., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (tj. zadržavaju se prve 226 aminokiseline ili 163 aminokiseline B domena). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa delimičnim B domenom je FVIII198 (SEQ ID NO:105). FVIII198 je delimični B-domen koji sadrži jednolančani FVIIIFc molekul-226N6.226 predstavlja aminokiselinu N-kraja 226 FVIII B-domena, a N6 predstavlja šest mesta N-glikozilacije u B-domenu. U još nekim otelotvorenjima, BDD FVIII nadalje sadrži tačku mutaciju na ostatku 309 (od Phe do Ser) da bi se poboljšala ekspresija BDD FVIII proteina. Videti Miao, H.Z., i dr., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). U još nekim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži deo B-domene, ali ne sadrži jedno ili više mesta deljenja furina (npr., Arg1313 i Arg 1648). Videti Pipe, S.W., i dr., J. Thromb. Haemost.9: 2235-2242 (2011). Svako od prethodnih brisanja može se izvršiti u bilo kojoj FVIII sekvenci.

[0210] FVIII protein koristan u predmetnom pronalasku može da obuhvata FVIII koji ima jednu ili više dodatnih heterolognih sekvenci ili hemijske ili fizičke modifikacije u njima, koje ne utiču na aktivnost koagulacije FVIII. Takve heterologne sekvence ili hemijske ili fizičke modifikacije mogu biti spojene na C-terminus ili N-terminus FVIII proteina ili umetnute između jednog ili više od dva aminokiselinska ostatka u FVIII proteinu. Takvi unosi u protein FVIII ne utiču na aktivnost koagulacije FVIII ili na funkciju FVIII. Takvi unosi u protein FVIII ne utiču na aktivnost koagulacije FVIII ili na funkciju FVIII. U još jednom otelotvorenju, umeci mogu biti više od dva, tri, četiri, pet ili šest mesta.

[0211] U jednom otelotvorenju, FVIII se odvaja odmah nakon Arginina u aminokiselini 1648 (u faktoru VIII u celoj dužini ili u SEQ ID NO:16), aminokiselina 754 (u B-domeni S743/Q1638 izbrisan faktor VIII ili SEQ ID NO:16), ili odgovarajući ostatak arginina (u drugim varijantama), što rezultira teškim i lakim lancem. U drugom otelotvorenju, FVIII sadrži teški i laki lanac, koji su povezani ili su povezani nekovalentnom vezom posredovanom metalnim jonima.

[0212] U drugim otelotvorenjima, FVIII je jednolančani FVIII koji nije otcepljen odmah nakon arginina u aminokiselini 1648 (u celoj dužini FVIII ili SEQ ID NO:16), aminokiselina 754 (u B-domeni S743/Q1638 izbrisan FVIII ili SEQ ID NO:18), ili odgovarajući ostatak arginina (u drugim varijantama). Jednolančani FVIII može sadržavati jednu ili više supstitucija aminokiselina. U jednom otelotvorenju, supstitucija aminokiselina je u ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba polipeptida zrelog faktora VIII cele dužine (SEQ ID NO:16) ili ostatak 754, ostatak 751, ili oba SQ BDD Faktora VIII (SEQ ID NO:18). Supstitucija aminokiselina može biti bilo koja aminokiselina osim Arginina, npr., izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, ornitin, pirolizin ili taurin.

[0213] FVIII se dalje može podeliti trombinom i zatim aktivirati kao FVIIIa, a služi kao kofaktor za aktivirani faktor IX (FIXa). A aktivirani FIX zajedno sa aktiviranim FVIII formira Xase kompleks i pretvara Faktor X u aktivirani Faktor X (FXa). Za aktivaciju, FVIII se odvaja trombinom nakon tri ostatka arginina, u aminokiselinama 372, 740 i 1689 (što odgovara aminokiselinama 372, 740 i 795 u BV domeni izbrisanoj sekvenci FVIII), a deljenje stvara FVIIIa sa 50kDa Lanci A1, 43kDa A2 i 73kDa A3-C1-C2. U jednom otelotvorenju, FVIII protein koristan za predmetni pronalazak je neaktivni FVIII. U drugom otelotvorenju, protein FVIII je aktivirani FVIII.

[0214] Protein koji ima FVIII polipeptid povezan ili povezan sa VWF fragmentom može da sadrži sekvencu od najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa SEQ ID NO:16 ili 18, pri čemu sekvenca ima aktivnost zgrušavanja FVIII, npr., aktiviranje faktora IX kao kofaktora za pretvaranje faktora X u aktivirani faktor X (FXa).

[0215] "Hibridni" polipeptidi i proteini, kao što se ovde koristi, znači kombinacija prvog polipeptidnog lanca, npr., VWF fragment, opciono kondenzovan sa prvim heterolognim delom, sa drugim polipeptidnim lancem, npr., protein FVIII, opciono spojen sa drugim heterolognim delom, formirajući tako heterodimer. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptid i drugi polipeptid u hibridu povezani su međusobno preko disulfida ili drugih kovalentnih veza. Hibridi su opisani, na primer u US 2004/101740 i US 2006/074199. Drugi polipeptid može biti identična kopija prvog polipeptida ili ne identični polipeptid. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptid sadrži VWF fragment-Fc fuzioni protein, a drugi polipeptid sadrži FVIII-Fc fuzioni protein, čineći hibrid heterodimerom. Prvi polipeptid i drugi polipeptid mogu biti povezani kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom, između prvog Fc regiona i drugog Fc regiona. Prvi polipeptid i drugi polipeptid mogu se dalje povezati međusobno vezanjem između VWF fragmenta i FVIII proteina.

D) Veznici

[0216] Himerni protein predmetnog pronalaska dalje sadrži i veznik. Jedan ili više veznika može biti prisutno između bilo koja dva proteina, npr., između dodane grupe i FVIII proteina (koji se ponekad naziva i "FVIII/AM veznik"), između VWF fragmenta i prvog heterolognog dela (nekad se takođe spominje kao "VWF veznik"), npr., prvi Fc region, između FVIII proteina i drugog heterolognog dela (koji se ponekad naziva i "FVIII veznik"), npr., drugi Fc region, između VWF fragmenta i FVIII proteina (npr., FVIII/AM veznik), između VWF fragmenta i drugog heterolognog dela i/ili između FVIII proteina i prvog heterolognog dela. Svaki od veznika može imati istu ili različitu sekvencu. U jednom otelotvorenju, veznik je polipeptidni veznik. U drugom otelotvorenju, veznik je ne-polipeptidni veznik.

[0217] Veznik koristan u predmetnom pronalasku može da sadrži bilo koji organski molekul. U jednom otelotvorenju, veznik je polimer, npr., polietilen glikol (PEG) ili hidroksietil skrob (HES). U drugom otelotvorenju, veznik je sekvenca aminokiselina (npr., polipeptidni veznik). Polipeptidni veznik može da sadrži najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600,

1

1700, 1800, 1900 ili 2000 aminokiselina. Veznik može da sadrži 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 amino kiseline, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina ili 900-1000 aminokiselina.

[0218] Primeri polipeptidnih veznika su dobro poznati u stanju tehnike. U jednom otelotvorenju, veznik sadrži sekvencu Gn. Veznik može da sadrži sekvencu (GA)n. Veznik može da sadrži niz (GGS) n. U drugim otelotvorenjima, veznik sadrži (GGGS)n(SEQ ID NO:20). U još nekim otelotvorenjima, veznik sadrži sekvencu (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO:21). U tim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-100. U drugim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-20, tj., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20.

Primeri veznika uključuju, ali nisu ograničeni na, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO:22), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO:23), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:24), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO:25), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:26), i veznici prikazani u Tabeli 13 (SEQ ID NOs: 92, 93, i 94), i veznici prikazani u Table 14A (SEQ ID NOs: 95, 96 i 97). Veznik ne uklanja ili smanjuje aktivnost VWF fragmenta ili aktivnost zgrušavanja Faktora VIII. Po izboru, veznik pojačava aktivnost VWF fragmenta ili aktivnost zgrušavanja proteina faktora VIII, npr., daljim umanjivanjem dejstva steričkog ometanja i čineći VWF fragment ili deo Faktora VIII pristupačnijim svom ciljnom mestu vezivanja.

[0219] U jednom otelotvorenju, veznik koristan za himerni protein je dugačak 15-25 aminokiselina. U drugom otelotvorenju, veznik koristan za himerni protein je dugačak 15-20 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, veznik za himerni protein je dugačak 10-25 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, veznik za himerni protein je dugačak 15 aminokiselina. U još nekim otelotvorenjima, veznik je himerni protein (GGGGS)n(SEQ ID NO:27) gde G predstavlja glicin, S predstavlja serin i n je celi broj od 1-20.

E) Mesto deljenja

[0220] Veznik takođe može da obuhvati deo koji se može hemijski podeliti (npr., hidroliza estarske veze), enzimatski (tj., ugraditi sekvencu deljenja proteaze) ili fotolitički (npr., hromofor, kao što je 3-amino-3-(2-nitrofenil)proprionska kiselina (ANP) kako bi se jedan molekul oslobodio iz drugog.

1 1

[0221] U jednom otelotvorenju, veznik je deljivi veznik. Veznici koji se mogu da se dele mogu da sadrže jedno ili više mesta deljenja na N-završetku ili C-završetku ili oba. U drugom otelotvorenju, veznik koji se može deliti sastoji se u osnovi iz jednog ili više mesta za deljenja ili se sastoji iz njega. U drugim otelotvorenjima, deljivi veznici sadrže heterologne sekvence veznika aminokiselina koji su ovde opisani ili polimere i jedno ili više mesta deljenja.

[0222] U nekim otelotvorenjima, deljivi veznik sadrži jedno ili više mesta deljenja koja se mogu podeliti u ćeliji domaćina (tj., mesta ćelijsku preradu). Neograničavajući primeri mesta deljenja uključuju RRRR (SEQ ID NO:52), RKRRKR (SEQ ID NO:53), i RRRRS (SEQ ID NO:54).

[0223] U drugim otelotvorenjima, veznik koji se može deliti sadrži jedno ili više mesta deljenja koja se dele proteazom nakon što je himerni protein koji sadrži deljivi veznik dat ispitaniku. U jednom otelotvorenju, mesto deljenja se cepa proteazom odabranom iz grupe koju čine faktor XIa, faktor XIIa, kalikrein, faktor VIIa, faktor IXa, faktor Xa, faktor IIa (trombin), Elastaza-2, MMP-12, MMP -13, MMP-17 i MMP-20. U drugom otelotvorenju, mesto deljenja je izabrano iz grupe koja se sastoji iz mesta deljenja FXIa (npr., KLTR ↓ AET (SEQ ID NO:29)), FXIa mesto deljenja (npr, DFTR ↓ VVG (SEQ ID NO:30)), FXIIa mesto deljenja (npr., TMTR ↓ IVGG (SEQ ID NO:31)), Kalikrein mesto deljenja (npr., SPFR ↓ STGG (SEQ ID NO:32)), FVIIa mesto deljenja (npr., LQVR ↓ IVGG (SEQ ID NO:33)), FIXa mesto deljenja (npr., PLGR ↓ IVGG (SEQ ID NO:34)), FXa mesto deljenja (npr., IEGR ↓ TVGG (SEQ ID NO:35)), FIIa (trombin) mesto deljenja (npr., LTPR ↓ SLLV (SEQ ID NO:36)), Elastaza-2 mesto deljenja (npr., LGPV ↓ SGVP (SEQ ID NO:37)), Granzim-B deljenje (npr, VAGD ↓ SLEE (SEQ ID NO:38)), MMP-12 mesto deljenja (npr., GPAG ↓ LGGA (SEQ ID NO:39)), MMP-13 mesto deljenja (npr., GPAG ↓ LRGA (SEQ ID NO:40)), MMP-17 mesto deljenja (npr., APLG ↓ LRLR (SEQ ID NO:41)), MMP-20 mesto deljenja (npr., PALP ↓ LVAQ (SEQ ID NO:42)), TEV mesto deljenja (npr., ENLYFQ ↓ G (SEQ ID NO:43)), Enterokinaza mesto deljenja (npr., DDDK ↓ IVGG (SEQ ID NO:44)), Proteaza 3C (PRESCISSION™) mesto deljenja (npr., LEVLFQ ↓ GP (SEQ ID NO:45)), i mesto deljenja Sortaze A (npr., LPKT ↓ GSES) (SEQ ID NO:46). U nekim otelotvorenjima, mesta deljenja FXIa uključuju, ali nisu ograničena na, npr., TQSFNDFTR (SEQ ID NO:47) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO:48). Neograničavajući primeri deljenja trombina uključuju,

1 2

npr., DFLAEGGGVR (SEQ ID NO:49), TTKIKPR (SEQ ID NO:50), ili LVPRG (SEQ ID NO:55), i sekvenca koja sadrži, sastoji se u osnovi iz ili se sastoji iz ALRPR (npr., ALRPRVVGGA (SEQ ID NO:51)).

[0224] U specifičnom otelotvorenju, mesto deljenja je TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO:56). Polinukleotidi, vektori, ćelije domaćini i načini pravljenja

[0225] Takođe je u obelodanjivanju predviđen polinukleotid koji kodira VWF fragment koji je ovde opisan, himerni protein koji sadrži VWF fragment i heterolognu celinu, himerni protein koji sadrži FVIII protein i pripadajuću celinu ili himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII belančevina. Kada je VWF fragment povezan sa heterolognom grupom ili FVIII proteinom u himernom proteinu kao jedinstveni polipeptidni lanac, pronalazak se povlači u polinukleotid koji kodira VWF fragment povezan sa heterolognom celinom ili proteinom FVIII. Kada himerni protein sadrži prvi i drugi polipeptidni lanac, prvi polipeptidni lanac sadrži VWF fragment i prvi heterologni deo (npr., prvi Fc region) i drugi polipeptidni lanac koji sadrži drugi heterologni deo (npr., drugi Fc region), gde su prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac povezani jedan sa drugim, polinukleotid može da sadrži prvu nukleotidnu sekvencu i drugu nukleotidnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca su na istom polinukleotidu. U drugom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca su na dva različita polinukleotida (npr., različiti vektori). U određenim otelotvorenjima, predmetni pronalazak je usmeren na skup polinukleotida koji sadrže prvi nukleotidni lanac i drugi nukleotidni lanac, pri čemu prvi nukleotidni lanac kodira VWF fragment himernog proteina, a drugi nukleotidni lanac kodira FVIII protein.

[0226] U drugim otelotvorenjima, set polinukleotida nadalje sadrži dodatni nukleotidni lanac (npr., drugi nukleotidni lanac kada je himerni polipeptid kodiran jednim polinukleotidnim lancem ili treći nukleotidni lanac kada je himerni protein kodiran od dva polinukleotidna lanca) kodira protein konvertazu. Proteinska konvertaza se može izabrati iz grupe koja se sastoji iz proprotein konvertaze subtilizin/keksin tip 5 (PCSK5 ili PC5), proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 7 (PCSK7 ili PC5), kvasci Kex 2, proprotein konvertaza subtilizin/keksin tip 3 ( PACE ili PCSK3) i njihove dve ili više kombinacija. U nekim otelotvorenjima, protein konvertaza je PACE, PC5 ili PC7. U određenim otelotvorenjima,

1

protein konvertaza je PC5 ili PC7. Videti Međunarodnu patentnu prijavu br.

PCT/US2011/043568. U drugim otelotvorenjima, konvertaza proteina je PACE/Furin.

[0227] U nekim otelotvorenjima, pronalazak uključuje skup polinukleotida koji sadrže prvi nukleotidni niz koji kodira VWF fragment koji sadrži D' domenu i D3 domen VWF, drugi nukleotidni niz koji kodira FVIII protein i treći nukleotidni niz koji kodira D1 domen i D2 domen VWF. U ovom otelotvorenju, D1 domen i D2 domen su odvojeno izraženi (nisu povezani sa D'D3 domenom VWF fragmenta) kako bi se pravilno formiralo disulfidnu vezu i presavijanje D'D3 domena. Ekspresija domena D1D2 može biti ili cis ili trans.

[0228] Kao što je ovde korišćen, ekspresijski vektor odnosi se na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i prevod, kada se uvede u odgovarajuća ćelija domaćina. Ekspresijski vektori mogu uključivati plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.

[0229] Ekspresijski vektori predmetnog pronalaska će uključivati polinukleotide koji kodiraju VWF fragment ili himerni protein koji sadrži VWF fragment.

[0230] U jednom otelotvorenju, kodirajuća sekvenca za VWF fragmenta, drugi heterologni deo (npr., Drugi Fc region) ili FVIII protein operativno su vezani za kontrolnu sekvencu ekspresije. Kao što je ovde korišćeno, dve sekvence nukleinske kiseline su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da svakoj komponenti nukleinskih kiselina omogućava da zadrži svoju funkcionalnost. Za kodnu sekvencu i kontrolnu sekvencu genske ekspresije kaže se da su operativno povezani kada su kovalentno povezani na način da stave ekspresiju ili transkripciju i/ili prevod kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu kontrolne sekvence genske ekspresije. Za dve sekvence DNK se kaže da su operativno povezane ako indukcija promotora u 5' sekvenci ekspresije gena rezultira transkripcijom kodirajuće sekvence i ako priroda povezanosti između dve sekvence DNK ne (1) rezultira uvođenjem mutacije pomeranja okvira, (2) ometa sposobnost promoterskog regiona da usmerava transkripciju kodirajuće sekvence, ili (3) ometa sposobnost odgovarajućeg RNK transkripta da se prevede u protein. Prema tome, sekvencijalna genska ekspresija bi operativno bila vezana za kodirajuću sekvencu nukleinskih kiselina ukoliko bi genska ekspresiona sekvenca bila sposobna da izvrši transkripciju te kodirajuće sekvence nukleinskih

1 4

kiselina tako da je rezultujući transkript preveden u željeni protein ili polipeptid.

[0231] Kao ovde korišćena kontrolna sekvenca gena ekspresije je bilo koja regulatorna nukleotidna sekvenca, poput promoterske sekvence ili kombinacije pojačivača promotora, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline za koju je operativno povezana. Sekvenca kontrole ekspresije gena može, na primer, biti sisar ili virusni promotor, poput konstitutivnog ili inducibilnog promotora. Konstitutivni promotori sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, promotore za sledeće gene: hipoksantin fosforiboziltransferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktinski promoter i ostali konstitutivni promoteri. Primeri virusnih promotora koji konstitutivno deluju u eukariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotore citomegalovirusa (CMV), simijan virusa (npr., SV40), virusa papiloma, adenovirusa, virusa humane imunodeficijencije (HIV), virusa sarkoma Rous, citomegalovirusa, dugog terminalna ponavljanja (LTR) virusa mijeloidne leukemije i drugih retrovirusa i promotora timidin kinaze virusa herpes simpleksa. Ostali konstitutivni promoteri poznati su onima koji imaju uobičajene veštine. Promoteri korisni kao sekvencije ekspresije gena predmetnog pronalaska takođe uključuju inducibilne promotore. Inducibilni promoteri su eksprimirani u prisustvu sredstva za indukciju. Na primer, induktor metalotioneina indukuje se da promoviše transkripciju i translaciju u prisustvu određenih jona metala. Ostali inducibilni promoteri poznati su onima koji imaju uobičajene veštine.

[0232] Generalno, sekvenca za kontrolu ekspresije gena uključuje, prema potrebi, 5' neprepisivačkih i 5' neprenosivih sekvenci uključenih u započinjanje transkripcije i prevođenja, kao što su TATA polje, preslikavanje sekvenciranja, CAAT sekvenca i slično. Naročito, takve 5' ne-prepisivajuće sekvence će uključivati promoterski region koji uključuje promotersku sekvencu za transkripcijsku kontrolu operativno pridružene kodirajuće nukleinske kiseline. Sekvence ekspresije gena opciono uključuju sekvence pojačivača ili sekvencije uzlaznog aktivatora, po želji.

[0233] Virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinskih kiselina iz sledećih virusa: retrovirus, kao što je virus miševa mijelinske leukemije, virus Harvey miševa sarkoma, mišiji virus tumora sisara i virus Rous sarkoma; adenovirus, adeno-pridruženi virus; SV40-tip virusa; polomavirusi; Epstein-Barr virusi; papiloma virusi; virusi herpesa; virus vakcinije; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Mogu se lako uključiti drugi vektori dobro poznati u ovoj oblasti. Određeni virusni vektori zasnivaju se na ne citopatskim

1

eukariotskim virusima u kojima su ne esencijalni geni zamenjeni interesnim genom. Necitopatski virusi uključuju retroviruse čiji životni ciklus uključuje reverznu transkripciju genomske virusne RNKA u DNK sa kasnijom provirusnom integracijom u ćelijsku DNK domaćina. Retrovirusi su odobreni za ispitivanja na humanoj genskoj terapiji. Najkorisniji su oni retrovirusi sa nedostatkom replikacije (tj., sposobni su da usmeravaju sintezu željenih proteina, ali nesposobni da proizvode infektivne čestice). Takvi genetski izmenjeni retrovirusni vektori ekspresije imaju opštu korisnost za visoko efikasnu transdukciju gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa nedostatkom replikacije (uključujući korake ugradnje egzogenog genetskog materijala u plazmid, transfekciju linije punjenja ćelija plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa linijom punjenja ćelija, prikupljanje virusnih čestica iz podloge za kultivisanje tkiva, i infekcija ciljnih ćelija virusnim česticama) su obezbeđene u Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) i Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).

[0234] U jednom otelotvorenju, virus je virus koji je adeno povezan, virus sa dvolančanom DNK. Povezan adeno-virus može se konstruisati tako da nema replikaciju i sposoban je da inficira širok spektar ćelijskih tipova i vrsta. Pored toga, ima prednosti kao što su stabilnost toplotnih i lipidnih rastvarača; visoke frekvencije transdukcije u ćelijama različitih linija, uključujući hemopoetske ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije, što omogućava višestruke serije transdukcija. Kako se izveštava, virus adeno-asocijacije može se integrisati u humanu ćelijsku DNK na način specifičan za mesto, čime se minimizira mogućnost umetanja mutageneze i promenljivost ekspresije umetnutog gena karakteristične za retrovirusnu infekciju. Pored toga, infekcije virusom divljih vrsta su praćene u kulturi tkiva više od 100 pasaža u odsustvu selektivnog pritiska, što implicira da je adeno-povezana virusna integracija virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezan virus takođe može funkcionisati na ekstrahromozomski način.

[0235] Ostali vektori uključuju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opsežno opisani u struci i dobro su poznati onima koji poznaju ovu oblast. Videti, npr., Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U poslednjih nekoliko godina nađeno je da su plazmidni vektori naročito povoljni za isporuku gena ćelijama in vivo zbog njihove nemogućnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, koji imaju promotor

1

kompatibilan sa ćelijom domaćinom, mogu eksprimirati peptid iz gena koji je operativno kodiran unutar plazmida. Neki najčešće korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača uključuju pBR322, pUC18, pUC19, razne pcDNK plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40 i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida uključuju pcDNK3.1, kataloški broj V79020; pcDNK3.1/higro, kataloški broj V87020; pcDNK3.1/higro, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi iz kompanije Invitrogen (Carlsbad, CA.). Ostali plazmidi su dobro poznati onima koji imaju uobičajene veštine. Pored toga, plazmidi mogu biti prilagođeni dizajniranju koristeći standardne tehnike molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje određenih fragmenata DNK.

[0236] U jednom sistemu ekspresije insekata koji se može koristiti za proizvodnju proteina predmetnog pronalaska, virus nuklearne polihidroze Autographa californica (AcNPV) koristi se kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda.

Kodirajuća sekvenca može se klonirati u nebitne regione (na primer, polihedron gen) virusa i staviti pod kontrolu ACNPV promotora (na primer, polihedron promotor). Uspešno ubacivanje kodirajuće sekvence rezultiraće inaktivacija gena za polihedron i proizvodnjom neoklupiranog rekombinantnog virusa (tj., virusa kojem nedostaje proteinasta dlaka kodiranog poledonskim genom). Ovi rekombinantni virusi se zatim koriste za zarazu ćelija Spodoptera frugiperda u kojima se eksprimirani gen eksprimira. (videti, npr., Smith i dr. (1983) J Virol 46:584; U.S. Pat. No.4,215,051). Dalji primeri ovog sistema izražavanja mogu se naći u Ausubel i dr., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.

[0237] Drugi sistem koji se može koristiti za ekspresiju proteina predmetnog pronalaska je sistem ekspresije gena glutamin sintetaze, koji se takođe naziva "GS ekspresijski sistem" (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Ovaj sistem eksprimiranja je detaljno opisan u U.S. Pat. No.5,981,216.

[0238] U ćelijama domaćina sisara mogu se koristiti brojni virusni sistemi za ekspresiju. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao ekspresijski vektor, kodirajuća sekvenca može se vezati na kompleks kontrole transkripcije/translacije adenovirusa, npr., kasni promotor i tripartitni vođa sekvencu. Ovaj himerni gen može se zatim umetnuti u genom adenovirusa in vitro ili in vivo rekombinacijom. Ubacivanje u nebitno područje virusnog genoma (npr.,

1

region E1 ili E3) rezultiraće rekombinantnim virusom koji je održiv i sposoban je da eksprimira peptid u zaraženim domaćinima. Videti, npr., Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativno se može koristiti promotor vakcinije 7.5 K. Videti, npr., Mackett i dr. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett i dr. (1984) J Virol 49:857; Panicali i dr. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.

[0239] Da bi se povećala efikasnost proizvodnje, polinukleotidi mogu da budu dizajnirani tako da kodiraju više jedinica proteina predmetnog pronalaska razdvojenim na mesta enzimskog deljenja. Dobijeni polipeptid se može deliti (npr., tretiranjem odgovarajućim enzimom) kako bi se povratile polipeptidne jedinice. Ovo može povećati prinos polipeptida vođenih jednim promotorom. Kada se koristi u odgovarajućim virusnim ekspresijskim sistemima, translacija svakog polipeptida kodiranog mRNK je usmeren interno u transkript; npr., sa internog mesta ulaska u ribozome, IRES. Prema tome, policistronski konstrukt usmerava transkripciju pojedinačne, velike policistroničke mRNK koja usmerava smer prevođenja višestrukih, pojedinačnih polipeptida. Ovaj pristup eliminiše proizvodnju i enzimsku obradu poliproteina i može značajno povećati prinos polipeptida vođenih jednim promotorom.

[0240] Vektori koji se koriste u transformaciji obično sadrže marker koji se može birati i koji se koristi za identifikaciju transformatora. U bakterijskim sistemima, to može uključivati gen rezistencije na antibiotike, poput ampicilina ili kanamicina. Selektori markera za upotrebu u kulturama ćelija sisara uključuju gene koji daju otpornost na lekove, kao što su neomicin, higromicin i metotreksat. Odabir markera može biti marker koji se može odabrati. Jedan amplikator koji se može odabrati je gen dihidrofolat reduktaze (DHFR). Simonsen C C i dr. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9. Markeri koji se mogu odabrati su pregledani u Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., i izbor markera koji se može odabrati je unutar nivoa uobičajene veštine u tehnici.

[0241] Selektivni markeri se mogu uvesti u ćeliju na odvojenom plazmidu istovremeno sa genom koji vas zanima, ili se mogu uvesti na istom plazmidu. Ako na istom plazmidu, marker koji se može izabrati i gen koji vas zanima mogu biti pod kontrolom različitih promotora ili istog promotora, poslednji aranžman stvara diistroničnu poruku. Konstrukcije ovog tipa su poznate u struci (na primer, U.S. Pat. No.4,713,339).

1

[0242] Ekspresijski vektori mogu kodirati oznake koje omogućavaju lako pročišćavanje rekombinantno proizvedenog proteina. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther i dr. (1983) EMBO J 2:1791), u kojima se kodirajuće sekvence proteina koje treba eksprimirati mogu biti vezane u vektor u okviru sa lac z kodirajućim regionom, tako da se stvara obeleženi fuzijski protein; pGEX vektori se mogu koristiti za ekspresiju proteina predmetnog pronalaska sa glutation-S-transferazom (GST) oznakom. Ovi proteini su obično rastvorljivi i mogu se lako očistiti iz ćelija adsorpcijom u zrnca glutation-agaroze, a zatim elucijom u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori uključuju mesta deljenja (trombin ili Factor Xa proteazu ili PRESCISSION PROTEASE ™ (Pharmacia, Peapack, N.J.)) za lako uklanjanje oznake nakon prečišćavanja.

[0243] Ekspresijski vektor ili vektori se zatim transfektuju ili ko-transfektuju u pogodnu ćeliju koja će eksprimirati polipeptide. Tehnike transfekcije poznate u oblasti tehnike uključuju, ali nisu ograničene na taloženje kalcijum-fosfata (Wigler i dr. (1978) Cell 14:725), elektroporacija (Neumann i dr. (1982) EMBO J 1:841), i reagensi bazirani na lipozomu. Za ekspresiju ovde opisanih proteina, uključujući prokariotske i eukariotske ćelije, mogu se koristiti različiti vektorski sistem ekspresije domaćina. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme poput bakterija (npr., E. coli) transformisanih rekombinantnim bakteriofagnim DNK ili ekspresijskim vektorima plazmidne DNK koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; kvasne ili vlaknaste gljive transformisane sa rekombinantnim vektorima ekspresije kvasca ili gljiva koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sistem ćelijskih insekata zaražen vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr., bakulovirus) koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sistem biljnih ćelija zaražen vektorima ekspresije rekombinantnih virusa (npr., virus mozaika karfiola ili virus duvanskog mozaika) ili transformisan rekombinantnim ekspresijskim vektorima plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ili životinjskih ćelijskih sistema, uključujući ćelije sisara (npr., HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 i BHK ćelije).

[0244] U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska ćelija. Kako se ovde koristi, eukariotska ćelija se odnosi na bilo koju životinjsku ili biljnu ćeliju koja ima definitivno jezgro. Eukariotske ćelije životinja uključuju ćelije kralježnjaka, npr., sisara, i ćelije nekičmenjaka, npr., insekata. Eukariotske ćelije biljaka posebno mogu da uključuju, bez ograničenja, ćelije kvasca. Eukariotska ćelija se razlikuje od prokariotske ćelije, npr., bakterije.

1

[0245] U nekim otelotvorenjima, eukariotska ćelija je ćelija sisara. Ćelija sisara je svaka ćelija dobijena od sisara. Ćelije sisara posebno uključuju, ali nisu ograničene na, ćelijske linije sisara. U jednom otelotvorenju, ćelija sisara je ljudska ćelija. U drugom otelotvorenju ćelija sisara je ćelija HEK 293, koja je ćelijska linija bubrega u embrionalu. HEK 293 ćelije su dostupne kao CRL-1533 iz American Tipe Culture Collection, Manassas, VA, i kao 293-H ćelije, Kataloški br.11631-017 ili 293-F ćelije, kataloški br.11625-019 od kompanije Invitrogen (Carlsbad, Calif .). U nekim otelotvorenjima ćelija sisara je PER.C6® ćelija, koja je ljudska ćelijska linija izvedena iz mrežnjače. PER.C6® ćelije su dostupne u kompaniji Crucell (Leiden, Holandija). U drugim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). CHO ćelije su dostupne u American Collection Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CHO-K1; CCL-61). U još nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je ćelija bubrega beba hrčaka (BHK). BHK ćelije su dostupne u American Type Culture Collection, Manassas, Va. (npr., CRL-1632). U nekim otelotvorenjima ćelija sisara je HKB11 ćelija, koja je hibridna ćelijska linija HEK293 ćelije i ljudska B ćelijska linija. Mei i dr., Mol. Biotechnol.

34(2): 165-78 (2006).

[0246] U jednom otelotvorenju, plazmid koji kodira VWF fragment ili himerni protein pronalaska dalje uključuje marker koji se može odabrati, npr., zeocinsku rezistenciju, i transfektuju se u ćelije HEK 293, za proizvodnju VWF fragmenta ili himernog proteina.

[0247] U drugom otelotvorenju, prvi plazmid koji sadrži faktor VIII-Fc kodirajuću sekvencu fuzije i prvi selektivni marker, npr., gen za rezistenciju na zeocin, i drugi plazmid koji sadrži VWF fragment-Fc kodirajuću sekvencu i drugi selektivni marker, npr. gen za rezistenciju na neomicin, ko-transfektuje se u ćelije HEK 293, za proizvodnju faktora VIII-Fc i hibrida VWF-Fc. Prvi i drugi plazmidi se mogu uvesti u jednakim količinama (tj., odnos 1:1), ili se mogu uvesti u nejednakim količinama.

[0248] U nekim otelotvorenjima, prvi plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu fuzije faktora VIII-Fc i prvi selekcioni marker, npr., gen za rezistenciju na zeocin, i drugi plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu VWF fragmenta-Fc i drugi selektivni marker, npr. gen za rezistenciju na neomicin i treći plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu proteinske konvertaze (npr., PC5 ili Furin) i treći selektivni marker, npr., gen otpornosti na higromicin, ko-transfektuju se u ćelije HEK 293, za proizvodnju hibrida fragmenta VIII-VWF fragmenta.

11

Prvi i drugi plazmidi se mogu uvesti u jednakim količinama (tj., molarni odnos 1:1), ili se mogu uvesti u nejednakim količinama. U nekim otelotvorenjima, prvi plazmid, koji uključuje fuzionu sekvenciju faktora VIII-Fc, VWF fragment-Fc kodirajuću sekvencu, i prvi selekcioni marker, npr., gen za rezistenciju na zeocin i drugi plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu proteinske konvertaze (npr., PC5 ili Furin) i drugi selektivni marker, npr., gen za rezistenciju na higromicin, ko- transfektuju se u ćelije HEK 293, za proizvodnju hibrida fragmenta VIII-VWF fragmenta. U jednom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira FVIII-Fc sekvencu i VWF fragment-Fc sekvencu može biti povezana da kodira jedan jedini polipeptid. U drugom otelotvorenju, nukleotidna sekvenca koja kodira FVIII-Fc sekvencu i VWF fragment-Fc sekvencu može se kodirati kao dva polipeptidna lanca. Promoteri za kodirajuću sekvencu fuzionog faktora VIII-Fc i VWF fragment-Fc kodirajuća sekvenca mogu biti različiti ili mogu biti isti.

[0249] U nekim otelotvorenjima, plazmid koji sadrži Furin je ko-transfektovan plazmidom koji sadrži kodirajuću sekvencu faktora VIII-Fc i/ili VWF fragment-Fc kodirajuću sekvencu. U nekim otelotvorenjima, Furin protein je na istom plazmidu koji sadrži faktor VIII-Fc fuzione sekvence fuzije. U nekim otelotvorenjima, Furin protein je na istom plazmidu koji sadrži VWF fragment Fc-fragmenta kodirajuće sekvence. U nekim otelotvorenjima, Furin protein je na posebnom plazmidu.

[0250] U još nekim drugim otelotvorenjima, transfektovane ćelije su stabilno transfektovane. Ove ćelije mogu biti odabrane i održavane kao stabilna ćelijska linija, koristeći konvencionalne tehnike poznate onima koji poznaju ovu oblast.

[0251] Ćelije domaćina koje sadrže DNK konstrukcije proteina uzgajaju se u odgovarajućoj podlozi za rast. Kako se ovde koristi, termin "odgovarajuća podloga za rast" označava podlogu koja sadrži hranljive materije potrebne za rast ćelija. Hranljivi sastojci potrebni za rast ćelija mogu da uključuju izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Po izboru, podloge mogu da sadrže jedan ili više faktora selekcije. Po izboru, podloga može da sadrži serum telećeg goveda ili fetalni teleći serum (FCS). U jednom otelotvorenju, podloga u suštini ne sadrži IgG. Sredstvo za rast obično će birati za ćelije koje sadrže DNK konstrukciju, na primer, selekcijom leka ili nedostatkom esencijalnog hranljivog hranjivog materijala koji je upotpunjen selektivnim markerom na DNK konstrukciji ili ko-transfektiran sa DNK konstrukcijom. Kultivisane ćelije sisara uglavnom se uzgajaju u komercijalno dostupnim podlogama koje sadrže serum ili bez seruma (npr., MEM, DMEM, DMEM/F12). U jednom otelotvorenju, podloga je CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). U drugom otelotvorenju, podloga je CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). Izbor podloge pogodne za određenu ćelijsku liniju je unutar nivoa onih običnih stručnjaka iz ove oblasti.

[0252] Da bi eksprimirali VWF fragment i drugi heterologni deo ili FVIII protein, ćelije domaćini se uzgajaju pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju i VWF fragmenta i drugog heterolognog dela ili proteina FVIII. Kao što je ovde korišćeno, kultivacija se odnosi na održavanje živih ćelija in vitro najmanje određeno vreme. Održavanje može, ali ne mora uključivati i povećanje populacije živih ćelija. Na primer, ćelije održavane u kulturi mogu da budu statične u populaciji, ali da su i dalje sposobne da proizvode željeni proizvod, na primer, rekombinantni protein ili rekombinantni fuzioni protein. Pogodni uslovi za kultivaciju eukariotskih ćelija dobro su poznati u tehnici i uključuju odgovarajući izbor kultura, dodataka medijumu, temperaturu, pH, zasićenost kiseonikom i slično. U komercijalne svrhe, kultivisanje može obuhvatati upotrebu bilo koje od različitih vrsta sistema za merenje, uključujući boce za mućkanje, boce sa valjcima, bioreaktore sa šupljim vlaknima, bioreaktore sa mešanim rezervoarima, bioreaktore za vazdušni prenos, talasne bioreaktore i druge.

[0253] Uslovi ćelijske kulture su takođe odabrani da omoguće povezivanje VWF fragmenta sa drugim heterolognim delom ili FVIII proteinom. Uslovi koji omogućavaju ekspresiju VWF fragmenta i/ili proteina FVIII, mogu uključivati prisustvo izvora vitamina K. Na primer, u jednom otelotvorenju, stabilno transfektovane HEK 293 ćelije kultivirane su u mediju CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ili OptiCHO podloga (Invitrogen, Carlsbad, CA) sa 4 mM glutaminom.

[0254] U jednom aspektu, predmetno obelodanjivanje je usmereno na postupak izražavanja, pravljenja ili proizvodnje VWF fragmenta obelodanjivanja koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina polinukleotidom koji kodira VWF fragment i b) kultivaciju ćelije domaćina u podlozi za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju VWF fragmenta, pri čemu je VWF fragment izražen. U jednom slučaju, obelodanjivanje se skreće na postupak proizvodnje zrelog VWF proteina ili njegovog fragmenta koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina prvim polinukleotidom koji kodira VWF protein ili njegov fragment, koji je spojen sa propeptidom VWF, i drugi polinukleotid koji kodira protein konvertazu, npr., PC5, PC7, ili Furin i b) kultivisanje ćelije domaćina u podlozi za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju zrelog VWF proteina ili njegovog fragmenta. Polinukleotid koji kodira VWF protein ili njegov fragment takođe se može spojiti u prepeptid VWF. Prepeptidna sekvenca može se cepati tokom umetanja u endoplazmatski retikulum pre sekrecije.

[0255] U drugom aspektu, obelodanjivanje je usmereno na postupak ekspresije, pravljenja ili proizvodnje himernog proteina koji sadrži VWF fragment povezan ili povezan sa heterolognim delom ili FVIII proteinom koji sadrži a) transfekciju jedne ili više ćelija domaćina polinukleotidom ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein i b) kultivaciju ćelije domaćina u medijumu za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju himernog proteina. U jednom otelotvorenju, pronalazak se skreće na postupak ekspresije, pravljenja ili proizvodnje himernog proteina koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina prvim polinukleotidom koji kodira VWF fragment povezan sa heterolognim delom i drugi polinukleotid koji kodira FVIII protein povezan sa heterolognim delom i b) kultivisanje ćelije domaćina u podlozi za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju himernog proteina. Prvi polinukleotid i drugi polinukleotid mogu biti u jednom vektoru ili dva vektora. U drugom otelotvorenju, pronalazak se skreće na postupak ekspresije, pravljenja ili proizvodnje himernog proteina koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina prvim polinukleotidom koji kodira VWF fragment povezan sa heterolognim delom, drugi polinukleotid koji kodira FVIII protein povezan sa heterolognim delom i treća polinukleotidna enkodirajuća proteinska konvertaza i b) kultivisanje ćelije domaćina u podlozi za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju himernog proteina. U drugim otelotvorenjima, pronalazak se skreće na postupak ekspresije, pravljenja ili proizvodnje himernog proteina koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina prvim polinukleotidom koji kodira VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen povezan sa heterolognim delom, drugi polinukleotid koji kodira FVIII protein povezan sa heterolognim delom i treća polinukleotid koji enkodira D1 domen i D2 domen VWF, i b) kultivisanje ćelije domaćina u podlozi za kulturu pod uslovima pogodnim za ekspresiju himernog proteina. U jednom otelotvorenju, prvi polinukleotid, drugi polinukleotid i treći polinukleotid mogu biti u jednom vektoru ili u zasebnim vektorima. U drugom otelotvorenju, prvi polinukleotid i drugi polinukleotid mogu biti u jednom vektoru, a treći polinukleotid mogu biti drugi vektori. U drugim otelotvorenjima, prvi polinukleotid i treći polinukleotid mogu biti u jednom vektoru, a drugi polinukleotid mogu biti drugi vektori. U nekim otelotvorenjima, drugi polinukleotid i treći polinukleotid mogu biti u jednom vektoru, a prvi polinukleotid može biti u drugom vektoru.

11

[0256] U daljim otelotvorenjima, proteinski proizvod koji sadrži VWF fragment ili himerni protein koji sadrži VWF fragment se izlučuje u podlogu. Podloge se odvajaju od ćelija, koncentruju, filtriraju, a zatim prenose preko dve ili tri afinitetne kolone, npr., protein A kolonu i jednu ili dve kolone za izmenu anjona.

[0257] U određenim otelotvorenjima, ovo obelodanjivanje se odnosi na VWF fragment ili himerni polipeptid proizveden ovde opisanim postupcima.

[0258] Proizvodnja in vitro omogućava dobijanje velikih količina željenih izmenjenih polipeptida predmetnog pronalaska. Tehnike za uzgoj ćelija sisara u uslovima kulture tkiva su poznate u struci i uključuju homogenu kulturu suspenzije, npr. u reaktoru sa vazdušnim liftom ili u reaktoru sa neprekidnom mešalicom, ili imobilizovanom ili zarobljenom ćelijskom kulturom, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikrotrakama ili keramičkim ulošcima. Ako je potrebno i/ili poželjno, rastvori polipeptida mogu se prečistiti uobičajenim metodama hromatografije, na primer gel filtracijom, jono-izmenjenom hromatografijom, hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC, hromatografija preko DEAE-celuloze ili afinitetnom hromatografijom.

Farmaceutski Sastavi

[0259] Sastavi koje sadrže himerni protein predmetnog pronalaska mogu sadržati pogodan farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, mogu da sadrže ekscipijente i/ili pomoćne materijale koji olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate koji su dizajnirani za isporuku na mesto delovanja.

[0260] Farmaceutski sastav može biti formulisana za parenteralnu primenu (tj. intravensku, subkutanu ili intramuskularnu) bolusnom injekcijom. Formulacije za injekcije mogu se predstaviti u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili u više doznim posudama sa dodatkom konzervansa. Sastavi mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljanim ili vodenim nosačima, i sadrže formulaciona sredstva kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praška za konstituciju sa pogodnim nosačem, npr., vodom bez pirogena.

[0261] Prikladne formulacije za parenteralnu primenu takođe uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivog u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće masne suspenzije za ubrizgavanje. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje ili sintetičke estere masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride.

Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran.

Opciono, suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsulaciju molekula predmetnog pronalaska za isporuku u ćelije ili međuprostorne prostore. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su fiziološki kompatibilna rastvarača, disperzijska podloga, premazi, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, voda, fiziološka otopina, fiziološka puferisana fiziološka otopina, dekstroza, glicerol, etanol i slično. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorida. U drugim otelotvorenjima, sastavi sadrže farmaceutski prihvatljive supstance kao što su sredstva za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su ovlaživači ili emulgatori, konzervansi ili puferi koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.

[0262] Sastavi predmetnog pronalaska mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečne (npr., injektibilne i infuzijske rastvore), disperzije, suspenzije, polučvrste i čvrste oblike doziranja. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapijske primene.

[0263] Sastav se može formulisati kao rastvor, mikro emulzija, disperzija, lipozom ili druga naručena struktura pogodna visokoj koncentraciji leka. Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu se pripremiti tako da se aktivni sastojak u potrebnoj količini ugradi u odgovarajuće rastvarače sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, a po potrebi i filtriranom sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju tako što se aktivni sastojak ugradi u sterilno sredstvo koje sadrži osnovni disperzni medijum i potrebne ostale sastojke od iznad nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci za pripremu su sušenje vakuumom i sušenjem smrzavanjem koji daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Ispravna tečnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih materija. Produljena apsorpcija injekcionih kompozicija može se postići

11

uključivanjem u sastav sredstva koja odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatinu.

[0264] Aktivni sastojak se može formulisati sa formulacijom ili uređajem sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja uključuju implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri mogu se koristiti, na primer, etilen vinil acetat, polihidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija i uređaja poznati su u stanju tehnike. Videti npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0265] Formulacije za injektiranje mogu se proizvesti formiranjem mikrokapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru, i prirode primenjenog polimera, može se kontrolisati brzina otpuštanja leka. Ostali uzorni biorazgradivi polimeri su poliortoestri i polihidridi. Formulacije za deponovanje injekcija takođe se mogu pripremiti umetanjem leka u lipozome ili mikroemulzijama.

[0266] Dopunska aktivna jedinjenja mogu biti ugrađena u sastave. U jednom otelotvorenju, himerni protein pronalaska je formulisan sa drugim faktorom zgrušavanja, ili njegovom varijantom, fragmentom, analogom ili derivatom. Na primer, faktor zgrušavanja uključuje, ali nije ograničen na, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin, fibrinogen, Willebrandov faktor ili rekombinantni faktor rastvorljivog tkiva (rsTF) ili aktivirani oblici bilo kojeg od prethodnih. Faktor zgrušavanja hemostatskog sredstva može takođe da uključuje antifibrinolizne lekove, npr., epsilon-aminokaproinsku kiselinu, transeksaminsku kiselinu.

[0267] Režimi doziranja se mogu prilagoditi tako da pruže optimalni željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti više podeljenih doza tokom vremena, ili se doza proporcionalno smanjiti ili povećati što je naznačeno potrebama terapijske situacije. Povoljno je formulisati parenteralne sastave u doznom jedinstvenom obliku za lakše davanje i ujednačenost doziranja. Videti npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa.1980).

11

[0268] Pored aktivnog jedinjenja, tečni oblik doziranja može da sadrži inertne sastojke, kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana.

[0269] Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača su takođe opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Neki primeri pomoćnih sastojaka uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatinu, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum-stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum-hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Sastav takođe može da sadrži reagense za pufer sa pH i sredstva za vlaženje ili emulgator.

[0270] Za oralnu primenu, farmaceutski sastav može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na konvencionalni način. Sastav se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može da sadrži suspendujuća sredstva (npr., sirup sorbitola, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili bagrem), nevodene nosače (npr., bademovo ulje, masni estri, etilni alkohol ili frakcionisana biljna ulja), i konzervansi (npr., metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparat takođe može da sadrži sredstva za aromatiziranje, bojenje i zaslađivanje. Alternativno, smeša se može predstaviti kao suvi proizvod za mešanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem.

[0271] Za bukalnu primenu, sastav može biti u obliku tableta ili pastila u skladu sa konvencionalnim protokolima.

[0272] Za primenu inhalacijom, jedinjenja za upotrebu prema predmetnom pronalasku su pogodno isporučena u obliku nebulizovanog aerosola sa ili bez ekscipijenasa ili u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, opciono potisnog sredstva, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluorometan, ugljen dioksid ili drugi pogodni gas. U slučaju aerosola pod pritiskom dozirna jedinica može se odrediti obezbeđivanjem ventila za doziranje dozirane količine. Kapsule i ulošci, npr., želatina za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru, mogu se formulisati tako da sadrže mešavinu praška ovog jedinjenja i pogodne baze praha kao što je laktoza ili skrob.

[0273] Farmaceutski sastav se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao klistir za

11

supozitorijum ili retenciju, npr., koji sadrži uobičajene baze supozitorija kao što je kakao maslac ili drugi gliceridi.

Genska terapija

[0274] Himerni protein predmetnog pronalaska može se proizvesti in vivo kod sisara, npr., ljudskog pacijenta, korišćenjem genske terapije za lečenje bolesti krvarenja ili poremećaja izabranog iz grupe koja se sastoji od poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenja u mišićima. oralno krvarenje, krvarenje, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalna krvarenja, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitorni prostor i krvarenja u omotaču bočnog slabinskog mišića bili bi terapeutski korisni. U jednom slučaju, bolest ili krvarenje je hemofilija. U drugom slučaju, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A. To uključuje davanje odgovarajućeg VWF fragmenta ili himerne proteine koja kodira proteine i koja je operativno povezana sa odgovarajućim sekvencijama za kontrolu ekspresije. U određenim slučajevima, ove sekvence su ugrađene u virusni vektor. Prikladni virusni vektori za takvu gensku terapiju uključuju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, bakulovirusne vektore, virusne vektore Epstein Barra, papovavirusne vektore, virusne vektore vakcinije, virusne vektore herpes simpleksa i vektore sa adeno pridruženim virusima (AAV). Virusni vektor može biti virusni vektor sa nedostatkom replikacije. U drugim slučajevima, adenovirusni vektor ima deleciju u svom E1 genu ili E3 genu. Kada se koristi adenovirusni vektor, sisar ne može biti izložen nukleinskoj kiselini koja kodira markerski gen koji se može odabrati. U drugim slučajevima, sekvence su ugrađene u ne-virusni vektor poznat stručnjacima.

Načini upotrebe VWF fragmenta ili himernog proteina

[0275] Jedan aspekt predmetnog obelodanjivanja usmeren je na sprečavanje ili inhibiciju interakcije FVIII sa endogenim VWF blokadom ili zaštitom VWF mesta vezivanja na FVIII od endogenog VWF. U jednom slučaju, obelodanjivanje je usmereno na postupak za konstrukciju proteina FVIII koji ima polu-raspad duži od divljeg tipa FVIII ili hibrida FVIII monomera-dimera, pri čemu postupak uključuje kovalentno povezivanje adekvatne grupe sa proteinom FVIII, stvarajući tako himerni protein koji sadrži FVIII protein i pripadajuću jedinicu, pri čemu adjuvantna grupa štiti ili sprečava interakciju proteina FVIII sa endogenim VWF. Himerni protein koristan u predmetnom postupku uključuje bilo koji ili više ovde opisanih himernih proteina.

11

[0276] Drugi aspekt obelodanjivanja uključuje postupak davanja ispitaniku kome je to potreban FVIII protein koji ima polu-raspad duži od divljeg tipa FVIII ili FVIII monomerdimerni hibrid, koji se sastoji od dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji se sastoji od sekvenca aminokiselina koja kodira FVIII i Fc region i drugi lanac koji se sastoji od Fc regiona, pri čemu se postupak sastoji od davanja VWF fragmenta ovde opisanog ili himernog proteina opisanog ovde. Sekvencija aminokiselina FVIII u monomer-dimernom hibridu može biti SQ FVIII ili divlji tip FVIII.

[0277] U jednom slučaju, obelodanjivanje je usmereno na postupak upotrebe odgovarajuće grupe, npr., VWF fragmenta ovde opisanog ili himernog proteina koji sadrži VWF fragment, da se spreči ili inhibira endogena VWF interakcija sa FVIII proteinom. U drugom slučaju, FVIII protein koji je sposoban za interakciju sa VWF fragmentom je endogeni FVIII. U drugim slučajevima, FVIII protein koji je sposoban za interakciju sa VWF fragmentom je FVIII sastav koji se odvojeno daje ispitaniku pre ili posle ili istovremeno sa VWF fragmentom ili himernim proteinom koji sadrži VWF fragment. U drugim slučajevima, FVIII protein koji se može vezati za VWF fragment je FVIII sastav koja se daje ispitaniku zajedno sa VWF fragmentom ili himernim proteinom. U drugim slučajevima, FVIII protein koji se može vezati za VWF fragment je FVIII prisutan sa VWF fragmentom ili povezan sa VWF fragmentom u himernom proteinu. VWF fragment ili himerni protein koji sadrži VWF fragment se vezuje ili je povezan sa FVIII proteinom i na taj način produžava polu-raspad FVIII proteina vezanog za VWF fragment ili himerni protein. FVIII protein vezan na VWF fragment ili himerni protein je zaštićen ili zaštićen od puta za uklanjanje VWF i tako ima smanjeni klirens u poređenju sa proteinom FVIII koji nije vezan za VWF fragment ili himerni protein. Zaštićeni FVIII protein stoga ima duži polu-raspad od proteina FVIII koji nije vezan ili povezan sa VWF fragmentom ili himernim proteinom. U određenim slučajevima, FVIII protein povezan ili zaštićen VWF fragmentom ili himernim proteinom predmetnog pronalaska se ne uklanja VWF receptorom klirensa. U drugim slučajevima, FVIII protein povezan sa ili zaštićen VWF fragmentom ili himernim proteinom uklanja se iz sistema sporije od FVIII proteina koji nije povezan ili zaštićen VWF fragmentom.

[0278] U jednom aspektu, himerni protein koji sadrži isti ima smanjeni klirens od cirkulacije jer VWF fragment ili himerni protein ne sadrži mesto vezivanja VWF receptora za čišćenje. VWF fragment sprečava ili inhibira uklanjanje FVIII vezanog ili povezanog s VWF

11

fragmentom iz sistema kroz put za uklanjanje VWF. Fragmenti VWF korisni za predmetni pronalazak takođe mogu da daju najmanje jedno ili više svojstava zaštite VWF sličnih FVIII koja se dobijaju endogenim VWF. U određenim otelotvorenjima, VWF fragmenti takođe mogu da maskiraju jedno ili više mesta vezivanja receptora FVIII, čime sprečava uklanjanje FVIII sopstvenim putem uklanjanja.

[0279] U drugom aspektu, himerni protein ovog pronalaska može se koristiti za lečenje ili sprečavanje bolesti ili poremećaja koji su povezani sa tipom 2N von Willebrandove bolesti (VWD). Tip 2N VWD je kvalitativni VWF defekt koji je rezultat neispravnog vezivanja VWF za FVIII i posledično rezultira niskim nivoima cirkulacije FVIII. Zbog toga, himerni protein ovog pronalaska vezanjem ili vezanjem na protein FVIII ne samo da stabilizuje FVIII protein, već i sprečava uklanjanje FVIII proteina iz cirkulacije.

[0280] U nekim otelotvorenjima, prevencija ili inhibicija vezivanja proteina FVIII na endogeni VWF pomoću VWF fragmenta ili himernog proteina može biti in vitro ili in vivo.

[0281] Takođe je obezbeđen postupak povećanja polu-raspada proteina FVIII koji sadrži davanje VWF fragmenta ili himernog proteina koji sadrži VWF fragment i FVIII protein ispitaniku kome je potreban. Polu-raspad ne aktiviranog FVIII vezanog za VWF celog dužine ili povezano sa njim je oko 12 do 14 sati u plazmi. Kod VWD tipa 3, gde skoro da nema VWF u cirkulaciji, polu-raspad FVIII je samo oko šest sati, što dovodi do simptoma blage do umerene hemofilije A kod takvih pacijenata usled smanjene koncentracije FVIII. Polu-raspad proteina FVIII povezan ili povezan sa VWF fragmentom ovog pronalaska može da se poveća najmanje oko 1.5 puta, 1.6 puta, 1.7 puta, 1.8 puta, 1.9 puta, 2.0 puta, 2.1 puta, 2.2 puta, 2.3 puta, 2.4 puta, 2.6 puta, 2.7. puta, 2.8 puta, 2.9 puta, 3.0 puta, 3.1 puta, 3.2 puta, 3.3 puta, 3.4 puta, 3.5 puta, 3.6 puta, 3.7 puta, 3.8 puta, 3.9 puta ili 4.0 puta višeg od perioda polu-raspada neaktivirani FVIII vezan za VWF pune dužine ili povezan sa njim. U jednom otelotvorenju, polu-raspad proteina FVIII povezan ili povezan sa VWF fragmentom u himernom proteinu povećava se najmanje oko 2 puta, 2.5 puta, 3.0 puta, 3.5 puta, 4.0 puta, 4.5 puta, 5.0 puta, 5.5 puta, 6.0 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, ili 10 puta više od polu-raspad ne aktiviranog FVIII vezanog ili povezanog sa VWF celom dužinom. U drugom otelotvorenju, polu-raspad proteina FVIII povezan sa ili povezan sa VWF fragmentom u himernom proteinu povećava se oko 2 do oko 5 puta, oko 3 do oko 10 puta, oko 5 do oko 15 puta, oko 10 do oko 20 puta, oko 15 do oko 25 puta, oko 20 do oko 30 puta, oko 25 do oko 35 puta, oko 30 do oko 40

12

puta, oko 35 do oko 45 puta veći od perioda polu-raspada ne aktiviranog vezanog FVIII do VWF pune dužine. U specifičnom otelotvorenju, polu-raspad proteina FVIII povezan sa ili povezan sa VWF fragmentom u himernom proteinu povećava se najmanje oko 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ili 40 puta veći od polu-raspada divljeg tipa FVIII kod FVIII i VWF duplog nokaut miša. U nekim otelotvorenjima, polu-raspad himernog proteina koji sadrži VWF fragment spojen na prvi heterologni deo, npr., prvi Fc region i FVIII protein povezan sa drugim heterolognim delom, npr., drugi Fc region je duži od polu-raspada himernog proteina koji sadrži FVIII protein i dva Fc regiona, pri čemu je FVIII protein povezan sa jednim od dva Fc regiona (tj., hibridom FVIII monomera i dimera). U nekim otelotvorenjima, poluraspad himernog proteina koji sadrži VWF fragment spojen na prvi heterologni deo, npr., prvi Fc region i FVIII protein povezan sa drugim heterolognim delom, npr., drugi Fc region je najmanje oko 1.5 puta, 2 puta, 2.5 puta, 3.5 puta, 3.6 puta, 3.7 puta, 3.8 puta, 3.9 puta, 4.0 puta, 4.5 puta, ili 5.0 puta vremena polu-raspada himernog proteina koji sadrži FVIII protein i dva Fc regiona, gde je FVIII protein je povezan sa jednim od dva Fc regiona (tj., hibrid FVIII monomera i dimera).

[0282] U nekim otelotvorenjima, kao rezultat pronalaska, polu-raspad proteina FVIII se produžava u poređenju sa proteinom FVIII bez VWF fragmenta ili divljim tipom FVIII. Poluraspad proteina FVIII je najmanje oko 1.5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2.5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta , najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili barem oko 12 puta duži od vremena polu-raspada proteina FVIII, bez VWF fragment. U jednom otelotvorenju, polu-raspad FVIII je oko 1.5 puta do oko 20 puta, oko 1.5 puta do oko 15 puta, ili oko 1.5 puta do oko 10 puta duže od vremena poluraspada divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, polu-raspad FVIII produžava se oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 -poklopac, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, otprilike 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, od oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta, u poređenju sa tim na divlji tip FVIII ili protein FVIII bez VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat , najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, na najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati ili najmanje oko 108 sati. U još nekim otelotvorenjima, polu-raspad FVIII je oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sat do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana, oko 24 sata do oko tri dana ili oko 24 sata do oko dva dana.

[0283] U nekim otelotvorenjima, prosečni polu-raspad proteina FVIII po ispitaniku je oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sat, oko 22 sata, oko 23 sati, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sat, oko 32 sata, oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sati, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedne nedelje), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.

[0284] U specifičnom otelotvorenju, polu-raspad himernog proteina predmetnog pronalaska je oko dva puta duži od vremena polu-raspada divljeg tipa FVIII ili BDD FVIII. U drugom otelotvorenju, polu-raspad himernog proteina je oko tri puta duži od vremena polu-raspada divljeg tipa FVIII ili BDD FVIII.

[0285] Pored toga, obelodanjivanje pruža postupak lečenja ili sprečavanja krvarenja ili poremećaja koji sadrži primenu efektivne količine VWF fragmenta ili himernog proteina (npr., himerni protein koji sadrži VWF fragment povezan sa prvim heterolognim delom, npr., prvi Fc region i FVIII protein povezan sa drugim heterolognim delom, npr., drugi Fc region, gde je VWF fragment vezan ili povezan sa FVIII proteinom). U jednom slučaju, krvarenje ili poremećaj je izabran iz grupe koja se sastoji iz poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenja u mišićima, oralnog krvarenja, krvarenje, krvarenja u mišićima, oralnog krvarenja, traume, trauma capitis, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalnog krvarenja, intra- krvarenje u trbuhu, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču bočnog slabinskog mišića. U specifičnom slučaju, krvarenje ili poremećaj je hemofilija A.

[0286] VWF fragment i himerni protein sadrže adekvatni deo, npr., ovde opisani VWF fragment i FVIII protein pripremljen u skladu sa pronalaskom ima mnogo upotreba koje će prepoznati stručnjak u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke lečenja ispitanika koji ima hemostatski poremećaj i postupke lečenja ispitanika kojima je potrebno opšte hemostatsko sredstvo. U jednom slučaju, obelodanjivanje se odnosi na postupak lečenja ispitanika koji ima hemostatski poremećaj koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine VWF fragmenta ili himernog proteina.

[0287] Udeo proteina FVIII u himernom proteinu leči ili sprečava hemostatski poremećaj tako što služi kao kofaktor faktoru IX na negativno naelektrisanoj fosfolipidnoj površini, stvarajući tako Xase kompleks. Vezivanje aktiviranih faktora koagulacije na površinu fosfolipida lokalizuje ovaj proces na mesta oštećenja vaskula. Na fosfolipidnoj površini, faktor VIIIa povećava maksimalnu brzinu aktivacije faktora X od strane faktora IXa, približno za 200,000 puta, što dovodi do velikog drugog naleta generacije trombina.

[0288] Himerni protein koji sadrži dodatnu jedinicu, npr., VWF fragment i FVIII protein mogu se koristiti za lečenje bilo kojeg hemostatskog poremećaja. Hemostatski poremećaji koji se mogu lečiti primenom himernog proteina predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, hemofiliju A, kao i nedostatke ili strukturne nepravilnosti koje se odnose na faktor VIII. U jednom slučaju, hemostatski poremećaj je hemofilija A.

[0289] Himerni protein koji sadrži dodatni deo, npr., VWF fragment i FVIII protein može se upotrebiti profilaktički za lečenje ispitanika sa hemostatskim poremećajem. Himerni protein prema pronalasku može se koristiti za lečenje epizode akutnog krvarenja kod ispitanika sa hemostatskim poremećajem. U drugom slučaju, hemostatski poremećaj može biti rezultat neispravnog faktora zgrušavanja, npr., von Willebrandovog faktora. U jednom slučaju,

12

hemostatski poremećaj je nasledni poremećaj. U drugom slučaju, hemostatski poremećaj je stečeni poremećaj. Stečeni poremećaj može biti rezultat osnovne sekundarne bolesti ili stanja. Nepovezano stanje može biti, na primer, ali ne kao ograničenje, kancer, auto-imunološka bolest ili trudnoća. Stečeni poremećaj može biti rezultat starosti ili lekova za lečenje osnovnih sekundarnih poremećaja (npr., hemoterapije protiv kancera).

[0290] Obelodanjivanje se takođe odnosi na postupke lečenja ispitanika koji nema urođeni hemostatski poremećaj, ali ima sekundarno oboljenje ili stanje koje rezultira sticanjem hemostatskog poremećaja, npr., usled razvoja anti-FVIII antitela ili hirurgije.

Obelodanjivanje se prema tome odnosi na postupak lečenja ispitanika kome je potrebno opšte hemostatske sredstvo, koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine himernog proteina koji sadrži VWF fragment i FVIII protein pripremljen ovim postupcima.

[0291] Ovo obelodanjivanje je takođe povezano sa postupcima smanjenja imunogenosti FVIII ili induciranjem manje imunogenosti protiv FVIII koji uključuju primenu efektivne količine VWF fragmenta, ovde opisanih himernih proteina ili polinukleotida koji kodiraju isti.

[0292] U jednom slučaju, ispitanik kome je potrebno opšte hemostatsko sredstvo je podvrgnut operaciji ili će se podvrgnuti. Himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein može se primenjivati pre, tokom ili nakon operacije kao profilaktički režim. Himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein može se primeniti pre, tokom ili nakon operacije za kontrolu akutne epizode krvarenja.

[0293] Himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein može se koristiti za lečenje ispitanika koji ima epizodu akutnog krvarenja koji nema hemostatski poremećaj. Eksplozija akutnog krvarenja može biti posledica teške traume, npr,. operacije, automobilske nesreće, rane, razderotina od metka ili bilo kojeg drugog traumatičnog događaja koji rezultira nekontrolisanim krvarenjem. Neograničavajući primeri epizoda krvarenja uključuju poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, krvarenje, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, traumu, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalna hemoragija, intratralno krvarenje kostiju , krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u omotaču bočnog slabinskog mišića i bilo koje kombinacije istih.

[0294] U profilaktičke primene, jedna ili više sastava koji sadrže himerni protein predmetnog pronalaska ili njegov koktel se daju pacijentu koji već nije u bolesnom stanju kako bi poboljšao pacijentovu otpornost ili smanjio simptome povezane sa bolešću ili poremećajem. Ovakva količina je definisana kao "efikasna profilaktička doza". U terapijskim primenama, relativno velika doza (npr., od oko 1 do 400 mg/kg polipeptida po dozi, pri čemu se doze od 5 do 25 mg češće koriste za radioimuno konjugate i veće doze za polipeptide modifikovane u leku citotoksinom) ponekad su potrebni kratki intervali dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine i sve dok pacijent ne pokaže delimičnu ili potpunu ublažavanje simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može uvesti profilaktički režim.

[0295] U nekim slučajevima, himerni protein, VWF fragment ili sastav predmetnog obelodanjivanja koristi se za lečenje na zahtev, što uključuje lečenje epizode krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, krvarenje iz usta, krvarenje, krvarenje u mišiće, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis (trauma glave), gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalna hemoragija, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru ili krvarenje u omotaču bočnog slabinskog mišića. Ispitaniku je možda potrebna hirurška profilaksa, perperativno upravljanje ili lečenje za operaciju. Takve operacije uključuju, na primer, manju operaciju, veliku operaciju, vađenje zuba, tonzilektomiju, ingvinalnu herniotomiju, sinovektomiju, totalnu zamenu kolena, kraniotomiju, osteosintezu, traumu, intrakranijalnu hirurgiju, intra-abdominalnu hirurgiju, intratorakalnu hirurgiju ili operaciju zamene zglobova.

[0296] U jednom slučaju, himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein se daje intravenski, subkutano, intramuskularno ili preko bilo koje površine sluznice, npr., oralno, sublingvalno, bukalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili pulmonalnim putem. Himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein može biti implantiran unutar ili povezan sa čvrstim nosačem biopolimera koji omogućava sporo oslobađanje himernog proteina do mesta krvarenja ili implantiran u zavoj/oblog. Doza himernog proteina koja sadrži VWF fragment i FVIII protein varira u zavisnosti od ispitanika i od određenog načina primene koji se koristi. Doze mogu biti u rasponu od 0.1 do 100,000 µg/kg telesne mase. U jednom slučaju, raspon doziranja je 0.1-1,000 µg/kg. U drugom slučaju, raspon doziranja je 0.1-500 µg/kg. Protein se

12

može davati kontinuirano ili u određenim vremenskim intervalima. In vitro testovi se mogu koristiti za određivanje raspona doza i/ili rasporeda davanja. In vitro testovi koji mere aktivnost faktora zgrušavanja poznati su u struci, npr., STA-CLOT VIIa-rTF test zgrušavanja ili ROTEM test zgrušavanja. Pored toga, efikasne doze mogu se ekstrapolirati iz krivulja doza-odgovor dobijenih od životinjskih modela, npr., psa sa hemofilijom (Mount i dr.2002, Blood 99(8):2670).

[0297] Nakon što je sada detaljno opisao ovaj pronalazak, isti će biti jasnije shvaćen pozivanjem na sledeće primere, koji su ovde uključeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni ograničavanju pronalaska.

Primeri

[0298] Kroz primere su korišćeni sledeći materijali i postupci ako nije drugačije navedeno.

Materijali i postupci

[0299] Generalno, praksa predmetnog pronalaska koristi, ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike hemije, biofizike, molekularne biologije, rekombinantnu DNK tehnologiju, imunologiju (naročito npr., tehnologiju antitela) i standardne tehnike u elektroforezi. Videti npr., Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i dr., CS.H.L. Press, Pub. (1999); i Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel i dr., John Wiley & Sons (1992).

Primer 1: Kloniranje različitih VWF domena (Slika 1)

(a) Kloniranje pSYN-VWF-001, 002, 003 i 004

[0300] pSYN-VWF-001 do 004 sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju VWF fragmente, a to su aminokiseline 1-276 (001), aminokiseline 1-477 (002), aminokiseline 1-511 (003) i aminokiseline 1-716 (004)VWF-D'D3A sekvenca proteina. Nominovanje aminokiselina predstavlja zrelu VWF sekvencu bez propeptida i odgovara aminokiselinama 764-1039 (001), aminokiselinama 764-1240 (002), aminokiselinama 764-1274 (003) i aminokiselinama 764-1479 (004) od SEQ ID NO:2, respektivno. Sva četiri konstrukta imaju peptid signala FVIII na N-terminusu, koji omogućava pravilno izlučivanje sintetizovanog proteina i zatim 6xHis

12

oznaku na C-terminusu, koja se koristi za prečišćavanje proteina. Iznad navedeni konstrukti sintetizovani su korišćenjem sledećih kombinacija prajmera:

pSYN VWF- 001:

ESC48- Fwd - VWF-D'D3 sa VIII signalom i BsiW1 mestom

Proteini iz VWF-001, 002, 003 i 004 konstrukcija bi trebalo da postoje kao monomera.

[0301] Izvedena je 50 µl PCR reakcija sa ESC 48/ESC50, ESC 48/ESC 51, ESC 48/ESC52, ESC48/ESC53 prajmer kombinacijama i VWF plazmidom pune dužine kao šablona, koristeći dvostepeni PCR ciklus amplifikacije: 94 °C 2 minuta; 21 ciklusa od (96 °C 30 sekundi, 68 °C

12

2 minuta). Trake odgovarajuće veličine (∼960bp za VWF 001; 1460 za VWF 002, 1520bp za VWF 003; i 2150bp za VWF 004) gel je prečišćen kompletom za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Calif.) i kloniran u BsiWI i Not1 restrikciona mesta pcDNK 4 da bi se generisale pSYN-VWF 001,002,003 i 004, respektivno.

(b) Kloniranje pSYN-VWF-006

[0302] pSYN-VWF-006 sadrži D1D2D'D3-CK (čvor cisteina) domena VWF. Da bi se klonirao ovaj konstrukt, uložena je sinteza DNK fragmenta koji sadrži deo D3 domena i CK domena (Genscript-ID broj 122026, prikazan ispod). Fragment Genscript konstrukcije subkloniran je u BamH1/EcoRV digestirani pSYN-VWF 008, tj., vektor koji kodira VWF pune dužine.

Genscript-broj sekvence- 122026 (SEQ ID NO:65)

(c) Kloniranje pSYN-VWF-009, 010, 011, 012 i 013

[0303] pSYN VWF 008 konstrukt sadrži VWF sekvencu pune dužine u pcDNK 3.1 (aminokiseline 1-2813 SEQ ID NO:2). To uključuje 763 propeptida aminokiselina (tj. D1D2 domene), a zatim preostalih 2050 aminokiselinskih sekvenci zrelog VWF. pSYN-VWF-009, 010, 011 i 012 sadrže iste kodirajuće sekvence kao i VWF 001, 002, 003 i 004, ali dodatno ima D1D2 domene (VWF propeptid) na N-terminusu umesto peptida FVIII signala. pSYN-VVF-008 ima BamH1 mesto na mestu Arg907 i Not1 na kraju područja kodiranja (nakon zaustavljanja kodona). pSYN-VWF- 008, 001, 002, 003 i 004 digestirani su sa restrikcionim enzimima BamH1 i Not1. Umetanja od pSYN-VWF-001 (423 bp), pSYN- VWF-002 (1026 bp), pSYN-VWF- 003 (1128 bp) i pSYN-VWF-004 (1743 bp) su vezani u bamH1/Not1 digestirani pSYN-VWF-008 (8242bp) kako bi se dobilo pSYN-VWF-009 (D1D2D'D3:

12

aminokiseline 1-1039 od SEQ ID NO:2); pSYN-VWF -010 (D1D2D'D3: aminokiseline 1-1240 od SEQ ID NO:2); pSYN-VWF-011 (D1D2D'D3: aminokiseline 1-1274 od SEQ ID NO:2); pSYN-VWF-012 (D1D2D'D3: aminokiselina 1-1479). Sva 4 konstrukta imaju 6xHis oznaku na C-završetku. U transfektovanim ćelijama, pSYN-VWF-009, 010, 011 i 012 se sintetišu sa propeptidom, ali zahvaljujući unutarćelijskoj preradi, izlučeni proizvodi ne sadrže nikakav propeptid (D1D2). Protein eksprimiran iz VWF-009 konstrukta postoji kao monomer, a proteini eksprimirani iz VWF-010, 011 i 012 konstrukti trebali bi postojati kao dimeri, kao što je prikazano na slici 6 i slici 7 pomoću VWF-009 i VWF- 010 kao primere, respektivno.

[0304] pSYN-VWF-010 je korišćen za generisanje pSYN-VWF-013, koji ima dve tačke mutacije na C336A i C379A, što odgovara SEQ ID NO:73 (numerisanje aminokiselina predstavlja zreli VWF niz bez D1D2 domena-VWF sekvenca 2). Predviđa se da ove mutacije sprečavaju dimerizaciju VWF D'D3 domena.

(d) Kloniranje pSYN-VWF-025 i 029

[0305] pSYN-VWF-025 sadrži divlji tip D1D2D'D3 sekvence VWF pune dužine u pLIVE vektoru dok pSYN-VWF-029 sadrži D1D2D'D3 domene sa C336A/C379A mutacijama u pLIVE vektoru. Za kloniranje pSYN-VWF-025 i 029, korišćena je sledeća kombinacija prajmera:

ESC 89-fwd sa Nhelsite= CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (SEQ ID NO:66)

ESC 91-rev sa Sal1=

CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (SEQ ID

NO:67)

[0306] Izvedena je 50 µl PCR reakcija sa kombinacijama prajmera ESC 89/ESC91 i bilo pSYN-VWF-010 (za pSYN-VWF-025) ili pSYN-VWF-013 (za pSYN-VWF-029) plazmida kao obrazac uz korišćenje trostepenog ciklusa PCR pojačanja: 94 °C -2 minuta; 21 ciklusa (96 °C -30 sekundi, 55 °C-30 sekundi, 68 °C-4 minuta). Očekivani opseg veličine (∼3800bp) je prečišćen gel pomoću kompleta za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Calif.) i klonirano na Nhe1 i Sal1 restrikciona mesta pLIVE-Mirus vektora (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) za generisanje pSYN-VWF-025 i 029.

12

(e) Kloniranje pSYN-VWF-031

[0307] pSYN-VWF-031 je D1D2D'D3 (C336A/C379A) -Fc konstrukcija koja ima 48 aminokiselinskih dugih trombinskih veza (8x GGGGS (SEQ ID NO:110)+trombinsko mesto) između VWF D1D2D'D3 (C336A/C379A) i Fc sekvence. Da bi se napravio ovaj konstrukt, VWF-Fc regija je amplificirana iz konstrukcije pSYN-FVIII-064 (pogledajte konstrukciju FVIII-VWF dole). pSYN-FVIII-VWF je digestiran sa Xba1 i Nhe1. Rezultujuća regija umetanja od 4165bp, koja sadrži VWF fragment i Fc region, korišćena je kao obrazac za amplifikaciju VWF i Fc regiona primenom kombinacija prajmera LV 22/LV23.

LW 22-FWD-VWF-D'D3 sa FVIII signalnalnom sekvencom BsiW1 mesta

LW 23-Rev- Fc sa stop kodom i Not1 mestom TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC (SEQ ID NO:69)

Nukleotidna sekvenca VWF 031 (SEQ ID NO:108)

1

11

12

[0308] PCR proizvod dobijen pojačanjem LW22/LW23 (∼2300bp) klonirano u pSYN-VWF-002 digestiranim BsiW1/Not1 da bi se dobilo pSYN-VWF-014 međujedinjenje. pSYN-VWF-014 sadrži FVIII signalni peptid-D'D3-20 aminokiselinski trombin koji se može podeliti, a zatim Fc region.

[0309] Da bi se generisala konstrukcija D1D2D'D3-Fc, region D1D2D'D3 je amplifikovana iz pSYN-VWF-013 korišćenjem kombinacije prajmera LW24/LW27 standardnim PCR postupkom.

LW24- Fwd- VWF D1D2D'D3 kloniranje oligo sa BsiW1 mestom

GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG (SEQ ID

NO:70)

LW27-Rev-VWF D'D3 oligo sa EcoRV

CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID

NO:71)

[0310] PCR proizvod dobijen pojačanjem LW22/LW23 (∼3750bp) je kloniran u

1

BsiW1/EcoRV digestiranom pSYN-VWF-014 kako bi se dobilo pSYN-VWF-015 međujedinjenje. Dužina veznika između VWF fragmenta i Fc regiona je promenjena da bi se dobila pSYN-VWF-031.

[0311] VWF sekvenca proteina pune dužine prikazana je u Tabeli 1.

VWF-D1D2D'D3 proteinska sekvenca 1b (SEQ ID NO:72)

Primer 2: Heterodimerni konstrukti koji sadrže domen FVIII-Fc i VWF-D'D3 na amino završetku drugog Fc lanca (FVIII-VWF-Fc heterodimer, Slika 2)

(a) Kloniranje pSYN-FVIII-064

[0312] FVIII-064 plazmid sadrži jednolančanog FC (scFc) skela sa mestima deljenja enzima koji se procesiraju tokom sinteze u ćeliji. Konstrukcija ima FVIII vezujući domen VWF pune dužine (D'D3).

[0313] Plazmid (pSYN-FVIII-064) dizajniran je za ekspresiju FVIII-Fc i VWF-Fc

1 4

heterodimera, gde D'D3 domeni vezuju FVIII i sprečavaju interakciju FVIII sa fosfolipidima i aktiviranim proteinom C i/ili sprečavaju ili inhibiraju vezivanje za endogeni VWF. Protein iz pSYN-FVIII-064 se izražava u ćeliji kao jedan polipeptid gde je C-završetak FVIII-Fc podjedinice povezan sa N-završetkom VWF D'D3-Fc podjedinice pomoću 6y (GGGGS) polipeptidnog veznika (SEQ ID NO:74). Dodatno, RRRRS (SEQ ID NO:75) i RKRRKR (SEQ ID NO:76) sekvence su ubačene na 5' i 3' kraj polipeptidnog veznika, respektivno, za intracelularno deljenje proprotein-konvertazama posle poslednjeg Arg pri svakoj sekvenci. Dakle, ćelije mogu da eksprimiraju heterodimer sa dvolančani FVIII-Fc/D'D3-Fc gde FVIII-Fc lanac ima RRRRS sekvencu (SEQ ID NO:75) na C-završetku, ali je uklonjen ostatak sekvence veznika. Još jedan 3x (GGGGS) polipeptidni veznik (SEQ ID NO:28) zajedno sa mestom odvajanja trombina uvodi se između domena VWF i Fc regiona kako bi se olakšalo oslobađanje VWF fragmenta iz FVIII nakon što se FVIII-VWF hetero-dimerni protein aktivira trombinom omogućavajući interakciju FVIII sa ostalim faktorima zgrušavanja.

[0314] Sinteza DNK fragmenata koji sadrže deo prvog Fc regiona praćen 6x (GGGGS) (SEQ ID NO:74), domen VWF-D'D3 (1-477aa; C336A/C379A mutacija), 3x (GGGGS) (SEQ ID NO:28), mesto deljenja trombina i deo drugog Fc je dobijen od spolja (Genscriptsekvencijalni broj 103069, prikazan ispod). Fragment Genscript konstrukcije subkoloniran je u SalI/RsRII digestirani pSYN-FVIII-049, što je FVIII-Fc konstrukt sa vezujućim vezom između dva Fc domena.

Genscript-broj sekvence 103069 (SEQ ID NO:82):

1

(b) Kloniranje pSYN-FVIII-065

[0315] FVIII-065 plazmid sadrži prvih 276 aminokiselina D'D3 domena VWF vezanog za drugi Fc region. VWF fragment je PCR amplifikovan iz VWF plazmida pune dužine pSYN-VWF-008 korišćenjem kombinacija prajmera ESC17 i ESC41.

ESC17-Fwd- VWF kloniranje oligo sa Cla1 GTCCGGCATGAGAATCGATGTGTG (SEQ ID NO:77)

ESC41- Rev-VWF sa EcoRV CCTCCACCGCCAGATATCAGAGGCACTTTTC (SEQ ID NO:78)

[0316] Očekivani opseg veličine (∼692bp) je prečišćen gelom pomoću kompleta za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Kalifornija) i kloniran na Cla1 i EcoRV mesta pSYN-FVIII-064 da bi se stvorio pSYN-FVIII-065.

Primer 3: Kloniranje pSYN-FVIII-159, 160, 178, 179 (Slika 3)

[0317] Da bi se izmenila dužina veznika između VWF fragmenta i Fc regiona, uveden je EcoRV mesto na mestu spajanja VWF i početak 20 veznika aminokiselina u pSYN-FVIII-064, veznici promenljive veličine su korišćeni za zamenu 20 veznika u PSYN-FVIII-064. Novi DNK konstrukti su: pSYN-FVIII-159, 160, 178, i 179 koji sadrži 35 aa, 48 aa, 73aa i 98aa veznike, respektivno.

[0318] Za umetanje veze za aminokiseline od 35 u pSYN-FVIII-159, dve oligo (ESC78-105bp i ESC79 -107bp) naručene su od Integrated DNK Technologies, Inc (Coralville, IA).

1

Oligo je prekaljen i proširen standardnim PCR postupkom:

Prajmeri:

ESC78- Fwd sa EcoRV mestom

[0319] Reakcija prekaljivanja i produženja oligo od 50 µl PCR izvršena je sa ESC78/ESC79 prajmer kombinacijom koristeći ciklus povećanja u 3 koraka: 25 ciklusa od (96° C 30 sekundi, 55° C 30 sekundi, 68° C 30 sekundi). Očekivani opseg veličine (∼186bp) je prečišćen gelom pomoću kompleta za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Kalifornija) i kloniran na EcoRV i RsRII mesta restrikcije pSYN-FVIII-064 da bi se stvorio pSYN-FVIII-159.

(b) Kloniranje pSYN-FVIII-160, 178 i 179

[0320] pSYN-VIII-160 ima veznik 48 aminokiselina između VWF fragmenta i Fc regiona. Sinteza fragmenta DNK kodiranja 48 aminokiselinskih veznika (ISGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO:81), a deo Fc regiona je dodeljen od spolja (Genscript-sekvenca br.132601, prikazano ispod). Fragment konstrukcije Genscript subkloniran je u EcoRV/RsRII digestirani pSYN-FVIII-0159 (pomenuto iznad).

Genscript-broj sekvence no-132601 (SEQ ID NO:83)

[0321] pSYN-VIII-178 ima veznik 73 aminokiselina između VWF fragmenta i Fc regiona. Sinteza fragmenta DNK kodiranja 73 aminokiselinskih veznika (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSLVP RGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO:84), a deo Fc regiona je dodeljen od spolja (Genscript-sekvenca br. 144849, prikazano ispod). Fragment konstrukcije Genscript

1

subkloniran je u EcoRV/RsRII digestirani pSYN-FVIII-0159 (pomenuto iznad). Genscript-Sekvenca #-144849 (SEQ ID NO:85)

[0322] pSYN-VIII-179 ima veznik 98 aminokiselina između VWF fragmenta i Fc regiona. Sinteza fragmenta DNK kodiranja 98 aminokiselinskih veznika (ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID NO:86), a deo Fc regiona je dodeljen od spolja (Genscript-sekvenca br.144849, prikazano ispod). Fragment konstrukcije Genscript subkloniran je u EcoRV/RsRII digestirani pSYN-FVIII-0159 (pomenuto iznad).

Genscript-Sekvenca #-144849 (SEQ ID NO:87)

Kloniranje pSYN-FVIII-180, 181, i 182

[0323] pSYN-FVIII-180, 181 i 182 konstruisani su iz pSYN-FVIII-160. Mutacije K2093A ili F2093A ili K2093A/F2093A su uvedene u C1 domen FVIII u pSYN-FVIII-160 da bi formirali pSYN-FVIII-180, pSYN-FVIII-181 i pSYN-FVIII-182.

FVIII-VWF-Fc heterodimerna sekvenca proteina (SEQ ID NO:88)

(položaj aminokiselina FVIII sekvence 1-1457; podvučeni region predstavlja Fc region; vijugavo podvučeni predstavlja deljiv veznik između prvog Fc i VWF fragmenta; dvostruko podvučeni region predstavlja VWF fragment; podebljani region predstavlja veznik promenljive dužine koji se može deliti između fragmenta VWF i Fc. Dužina veznika varira u konstruktima FVIII-064, 159, 160, 178 i 179).

1

Primer 4: Primer FVIII-VWF DNK konstrukata (Slika 4)

[0324] VWF fragment i FVIII protein mogu se povezati zajedno pomoću veznika ili drugog proteina ili polipeptida korišćenjem uobičajenih tehnika rekombinantne DNK, kao što je prikazano na Slici 4. Na Slici 4A, domeni D1D2D'D3 VWF su povezani sa proteinom FVIII pomoću 48aa veznik-ISGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLVPRGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:89) i štiti FVIII od prevremenog uklanjanja. Da bi se dodatno poboljšala FVIII zaštitna aktivnost D'D3, u konstrukciju se može ugraditi još jedan protein ili polipeptid koji ima

1

potencijal produženja polu-raspada, poput albumina ili PAS sekvence (heterolognih ostataka). Heterologni deo, na primer, albuminski protein ili PAS sekvenca, može da se ugradi u različite položaje molekula FVIII; na slici 4B-4D prikazano je nekoliko primera: na N-terminima FVIII (4B), na C-završetku FVIII (4C), ili u B regionu (4D). U tim konstruktima, dodatne sekvence proteina mogu poboljšati D'D3 zaštitnu aktivnost i dalje produžiti polu-raspada FVIII.

[0325] Pored toga, heterologni deo, na primer, albuminska ili PAS sekvenca, takođe se može ugraditi u FVIII/VWF heterodimerne konstrukcije kao što je prikazano na slici 4E-4G. Na Slici 4E, heterologni deo, na primer, albuminska ili PAS sekvenca, je ugrađena u region domena FVIII B domena FVIII-148; Na Slici 4F, heterologni deo, na primer, albuminska ili PAS sekvenca, je ugrađena u region domena FVIII B domena FVIII-136; Na slici 4G, heterologni deo, na primer, albuminska ili PAS sekvenca, koristi se kao veznik za povezivanje D'D3 fragmenta i Fc. U tim konfiguracijama očekuje se sinergetski efekat D'D3, Fc i heterologni deo koji je produživač polu-raspada (npr., sekvenca albumina/PAS) na produžetku polu-raspada FVIII.

Primer 5: Plazmidna konstrukcija ko-transfekcionog sistema za FVIIIFc-VWF Heterodimer (Slika 5)

[0326] Za proizvodnju heterodimera FVIIIFc-VWF generisan je sistem ko-transfekcije, koji sadrži tri DNK konstrukta. Prva DNK konstrukcija-pSYN-FVIII-155 kodira FVIII-Fc fuzioni protein u kome je jednolančani FVIII protein direktno spojen sa jednim Fc fragmentom, a drugi DNK konstrukt je pSYN-VWF-031, koji kodira D 'D3-Fc fuzioni protein (pomenut iznad u primeru 1). HEK293F ćelije su transfektovane sa dva plazmida zajedno sa trećim plazmidom (PC5) u odnosu 80:15:5. Ko-transfekcija sa PC5 osigurava potpunu obradu propeptida D1 i D2 regionima tako da imamo zrele D'D3 domene. Sintetizovani proteini su izlučeni kao FVIIIFc/D'D3Fc heterodimer i D'D3Fc homodimer, a FVIIIFc/D'D3Fc heterodimer je odvojen od D'D3Fc homodimera prečišćavanjem proteina.

pSYN-FVIII-155 zrelo sekvencioniranje proteina (SEQ ID NO:90):

14

Ċ

[0327] Dodatni VWF fragmenti i FVIIIFC-VWF heterodimeri koji su konstruisani su navedeni ispod.

Tabela 6. Fragmenti VWF i konstrukcije heterodimera FVIII/VWF

14

14

Primer 6: Prečišćavanje proteina

Prečišćavanje proteina fragmenata VWF

[0328] VWF fragmenti su prečišćeni dvostepenim postupkom prečišćavanja. Za primarno pročišćavanje je korišćena IMAC sulfatna niklom napunjena IMAC (imobilisana hromatografija metalnih afiniteta) kolona, a za finalno prečišćavanje korišćen je Fractogel DEAE jonoizmenjivačka kolona. Detaljni postupak prečišćavanja je opisan ispod.

(a) Primarno prečišćavanje fragmenta VWF na nikl IMAC

[0329] 14 mL Nikl IMAC Sefaroza HP kolona [XK26/3] bio je uravnotežen sa 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5. Približno 7.2 L VWF kondicionirane podloge podešeno je sa 100 mL od 1M HEPES @ pH 7.5 i 600 mL od 5M NaCl. Zatim je dodato 80 ml 1M imidazola (@ pH 7.5) do krajnje koncentracije od 10 mM. Zatim je 7.8 L podešene podloge sa kondicioniranim VWF stavljen na kolonu pri 2-8°C pri 10 mL/min [113 cm/čas]. Koraci pranja izvedeni su sa 13.3 ml/minutu [150 cm/čas]. Prvo, a 2xZapremina kolone (CV) ispiranje vrši se sa 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazola, i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5 u normalnom protoku {"DownFlow"}. Zatim je

14

izvedeno 3xCV ispiranje sa 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazolom i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5 u obrnutom toku {"UpFlow"}. Na kraju je izvedeno 3xCV ispiranje sa 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazolom i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5 u normalnom protoku {"DownFlow"}. Elucija je izvedena kao 10xCV gradijent do 50% B1 (25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazola i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5). Zapremina frakcije je postavljena na 10 mL. Zatim je kolona odstranjena sa 100% B1. Nakon toga je usledilo ispiranje sa 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM imidazola i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5. Izvršeno je drugo skidanje sa IN NaOH. Zatim je kolona isprana sa 1M TRIS, 1M NaCl @ pH 7.8, a zatim 25 mM HEPES, 500 mM NaCl, 10 mM imidazola i 0.05% Tween-20 @ pH 7.5. Konačno, kolona je isprana sa 5 CV DPBS 20% etanola i čuvana na 4°C.

(b) Sekundarno prečišćavanje VWF fragmenta na Fraktogelu DEAE

[0330] Sekundarno prečišćavanje VWF fragmenta je izvršeno na Fraktogel DEAE @ pH 7.5. Prvo, 20 mL VWF nikl IMAC eluata (što odgovara maksimumu VWF fragmenta) je podešeno sa 200 mg Zwittergent deterdženta Zwittergent 3-14 u pokušaju da poremeti agregirane vrste bez upotrebe denaturirajućih ili redukcijskih pomoćnih sastojaka. Nakon rastvaranja deterdženta, protein je ostavljen na sobnoj temperaturi oko 15 minuta. Zatim se protein podesi sa 4 grama trehaloze, 1 ml 10% Tween-20, 5 ml 1M HEPES-a sa pH 7.5 i 174 ml vode "Milli-Q". Ravnotežni pufer "A12" je bio 25 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1% Trehaloza, 0.05% Tween-20 @ pH 7.5. Eluirani pufer "B1" je bio 25 mM HEPES, 1000 mM NaCl, 1% Trehaloza, 0.05% Tween-20 @ pH 7.5. Elucija je izvedena kao gradijent od 10 CV do 50% BI, sa zadržavanjem 5+ CV, nakon čega sledi korak do 100% B1. Zatim je kolona uklonjena sa 0.85% fosforne kiseline, a zatim 1M TRIS, 1M NaCl @ pH 7.5. Zatim je kolona uklonjena sa 1 N NaOH, 2M NaCl, a zatim 1M TRIS, 1M NaCl @ pH 7.5. Zatim je kolona isprana sa 25 mM HEPES, 100 mM NaCl 20% etanol @ pH 7.5 za skladištenje.

(c) Prečišćavanje proteina FVIII-VWF heterodimera

[0331] FVIII-VWF heterodimer je prvo prečišćen kolonom afiniteta (GE VIIISelect), a zatim jonoizmenjivačkom kolonom Fractogal TMAE. (McCue JT, Selvitelli K, Walker J, J Chromatogr A. 2009 Nov 6; 1216(45):7824-30. Epub 2009 Sep 23.)

[0332] Za prečišćavanje FVIII-155/VWF-31, korišćen je korak filtracije tangencijalnog toka (TFF) za pufer razmenjivanje pročišćene kondicionirane podloge. Ciljani proteini u filtratu su zatim hvatani koristeći afinitetnu hromatografiju. Usledio je slab hromatografski korak sa

14

anjonskom razmenom da bi se smanjila vrsta HMQ. I čistoći i veličini molekula pristupili su HPLC-SEC i SDS-PAGE. Prisutnost različitih domena FVIII-155/VWF-31 potvrđeno je i dalje zapadnim blotovanjem. Specifična aktivnost molekula bila je uporediva sa izbrisanom iz B-domena FVIII.

(d) Razgradnja trombina heterodimera FVIII-VWF (Slika 8)

[0333] FVIII-VWF-Fc heterodimer ili FVIII-Fc (kontrola) je pomešan sa trombinom u odnosu 1:10 u puferu deljivog trombina (50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 5% glicerol). Reakcija je zagrevana na 37 °C u trajanju od 20 minuta. Digestirani proizvod je pušten na 4-12% redukujućem tris-glicin gelu. Kao kontrola korišćen je nedigestirani protein. Trake su vizualizovane „coomassie“ mrlje.

(e) Procena Octet testa procenjivanja VWF sposobnosti vezanja FVIII-155/VWF-031 [0334] Sposobnost vezanja VWF FVIII-155/VWF-031 određena je merenjima na osnovu Bio-Laier Interferometri (BLI) (Octet test) na 25°C pomoću instrumenta ForteBio Octet 384 koristeći Tris vezujući pufer (50 mM Tris, pH 7.2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Octetov test za određivanje vezivanja FVIII zasnovan je na hidrofobnoj imobilizaciji humanog faktora Willebrand faktora (hVWF) (Katalog hematoloških tehnologija br. HCVWF-0191) na APS biosenzor, a zatim je vezano 1,0% goveđeg serumskog albumina (Jackson ImmunoResearch Katalog br.001-000-161). Ukratko, hVWF (38.5 nM) je razblažen u Tris puferu i napunjen preko APS Biosenzora tokom 600 sekundi, čime se dobija približno 3.0 - 3.5 nm vezivanja na reakcijskim sondama. Kontrolne APS sonde su napunjene sa 1.0% BSA u odsustvu hVWF za referentno oduzimanje. Nakon punjenja, sve sonde su inkubirane u Tris puferu 300 sekundi da bi se uspostavila nova osnovna linija. Potom su biosenzorne sonde inkubirane u rastvorima FVIII-155/VWF-031, supstanci leka FVIIIFc ili rFVIII (60 nM) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je usledio korak disocijacije od 5 minuta. Koristeći Octet softver za analizu podataka, vezujući odgovor (nm) je izveden iz oduzetih podataka (Reakciona sonda minus referentna sonda). Kao što je prikazano na slici 15, u poređenju sa afinitetom vezanja za VWF rFVIIIFc i rFVIII, afinitet vezanja VWF za FVIII-155/VWF-031 je ozbiljno narušen. Ovo ukazuje na uspešan štit FVIII od VWF pune dužine D'D3 fragmentom unutar FVIIIFc/VWF heterodimera.

Primer 7. Interakcija VWF-FVIII je ograničavajući faktor za produženje polu-raspad FVIII

14

[0335] Većina cirkulišućeg FVIII postoji kao FVIII-VWF kompleks (> 95% FVIII u plazmi). Ova interakcija FVIII-VWF promoviše klirens FVIII putem putanje VWF klirensa, na taj način čineći polu-raspad VWF-a (T1/2) ograničenje produženja polu-raspad FVIII. Da bi se procenila ova hipoteza, testiranje ograničenja produženja polu-raspada FVIII pomoću Fc tehnologije testirano je na miševima sa nedostatkom FVIII (HemA miševi, koji imaju netaknuti gen VWF) i manjkom FVIII/VWF (FVIII-VVF dupli nokaut (DKO)).

[0336] HemA miševi ili FVIII-VWF DKO miševi tretirani su jednom intravenskom dozom rFVIII ili rFVIIIFc pri 125 IU/kg kod HemA miševa ili 200 IU/kg kod DKO miševa. Uzorci krvi prikupljeni su do 72 sata u HemA miševima ili do 8 sati u FVIII/VWF DKO miševima. FVIII aktivnost uzorka plazme je zatim merena testom FVIII hromogeni. Farmakokinetički (PK) profil dve varijante rFVIII analiziran je korišćenjem WinNonline programa.

[0337] Kao što je prikazano u tabeli 7 i slici 9, kod FVIII/VWF DKO miševa rFVIIIFc je pokazao oko 4.8 puta duži T1/2(tj. T1/2od 1,2 sata) u poređenju sa T1/2od rFVIII (tj., T1/2od 0.25 sati). Suprotno tome, kada je testiran na HemA miševima, rFVIIIFc je imao samo 1.8 puta duži T1/2u poređenju sa rFVIII. T1/2rFVIIIFc je bio 13.7 h, što je u skladu sa endogenskim polu-raspadom mišjeg VWF. Ovo ukazuje da je interakcija FVIII-VWF ograničavajući faktor za produženje polu-raspad FVIII. Da bi se postiglo višestruko produženje polu-raspada FVIII, FVIII-VWF interakcija mora biti eliminisana.

Tabela 7: FVIII PK u HemA i FVIIII/VWF DKO miševi

FVIII hromogeni test

[0338] FVIII aktivnost je merena korišćenjem COATEST SP FVIII kompleta iz DiaPharme (serija#N089019) i sve inkubacije su izvedene na 37°C ploči sa grejačem.

[0339] Raspon rFVIII standarda bio je od 100 mIU/mL do 0.78 mIU/mL. Skupljena

14

normalna kontrola ljudske plazme i uzorci plazme (razblaženi sa IX Coatest puferom) su dodate u ploče sa 96 udubljenja u imunolonu 2HB u duplikatu (25 µL/udubljenje). Sveže pripremljena smeša IXa/FX/fosfolipida (50 µL), 25 µL 25 mM CaCl2i 50 µL FXa supstrata dodata su uzastopno u svaki otvor sa 5 minuta inkubacije između svakog dodavanja. Posle inkubacije sa supstratom, dodato je 25 µL 20% sirćetne kiseline da bi se prekinula reakcija u boji, a apsorbancija OD405 je izmerena instrumentom SpectraMAX plus (Molekularni uređaji). Podaci su analizirani softverom SoftMax Pro (verzija 5.2). Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 7.8 mIU/mL.

Primer 8. VWF D'D3 dimer štiti FVIII od FVIII proteolize i klirensa (Slika 10)

[0340] Zaštitna aktivnost FVIII fragmenata VWF procenjena je njihovom sposobnošću da štiti endogeni mišji FVIII od njegovog čišćenja u miševima sa nedostatkom VWF. Različiti fragmenti VWF kao što je navedeno u Tabeli 8, Kolona 1 (Slika 1, Primer 1), uvedeni su u krvotok miševa sa nedostatkom VWF hidrodinamičkom injekcijom njihovih odgovarajućih DNK konstrukcija u 100 µg/miš. Uzorci plazme su sakupljeni 48h nakon ubrizgavanja, a aktivnost plazme kod mišje FVIII merena je FVIII hromogenim testom. Nivo ekspresije VWF izmeren je VWF ELISA.

[0341] Četiri različite dužine testiranih fragmenata VWF su 276, 477, 511 i 716 aminokiselina. Raspon aminokiselina 276 do 716 je testiran da se utvrdi dužina VWF fragmenata potrebnih za vezivanje FVIII (276aa) bez vezujućeg domena VWF klirens receptora (716aa). VWF pune dužine i D1D2D'D3CK multimer korišćeni su kao pozitivna kontrola za FVIII zaštitu. U cirkulaciji krvi, VWF fragmenti sintetizovani s D1D2 domenom postoje kao dimer i postoje kao monomeri kada su sintetizovani bez D1D2 domena.

[0342] Porast aktivnosti mišjeg FVIII u plazmi nakon hidrodinamičke injekcije meri FVIII efekat zaštite VWF fragmenata. Kao što je prikazano u Tabeli 8 i Slici 10A-B, prvih 276aa D'D3 fragmenta nije imalo zaštitnu aktivnost FVIII kao što je pokazano sličnim nivoom FVIII u plazmi pre/posle injekcije (Slika 10A). Međutim, uvođenje drugog VWF fragmenti su inducirali značajno povećanje nivoa FVIII u plazmi, što ukazuje da ti VWF fragmenti mogu zaštititi FVIII od njenog puta čišćenja.

Tabela 8: FVIII/VWF DKO mišji nivo mišjeg nivoa FVIII u plazmi pre/posle uvođenja fragmenata VWF (DNK konstrukti su ilustrovani na Slici 1)

1

[0343] Odnos FVIII aktivnosti plazme nakon injekcije i nivo antigena u plazmi VWF fragmenata koji sadrže D'D3 domenu VWF pune dužine navedeni su u Tabeli 8. Sličan odnos FVIII/VWF nakon ubrizgavanja primećen je iz VWF pune dužine i dva dimera oblika VWF fragmenata, što znači da ta dva VWF dimera za fragment pružaju istu FVIII zaštitu kao i VWF pune dužine. Pored toga, opažen je trostruko veća razmera FVIII/VVF iz dimernih izoforma VWF fragmenta u poređenju sa njihovim odgovarajućim monomerima: D'D3 (477aa) dimer ima odnos FVIII/VWF od 38.7 mIU/nmol; D'D3 (477aa) monomer ima odnos FVIII/VWF od 11.6 mIU/nmol: D'D3A1 (511aa) dimer ima odnos FVIII/VWF od 32.9 mIU/nmol; i D'D3 (511aa) monomer ima odnos FVIII/VVF od 13.8 mIU/nmol, što ukazuje na dimne izoforme VWF fragmenata pružaju bolju FVIII zaštitu u odnosu na njihove odgovarajuće monomere.

Tabela 9: FVIII efekat zaštite cele dužine D'D3 fragmenta

1 1

Hidrodinamična injekcija:

[0344] Hidrodinamična injekcija je efikasan i siguran ne virusni postupak isporuke gena jetri kod malih životinja, kao što su miševi i pacovi. Prvobitno je opisan kao brza injekcija golog plazmidnog DNK/fiziološkog rastvora bez endotoksina u desetoj zapremini telesne težine životinje u približno 5-7 sekundi. Gola plazmidna DNK sadrži gen koji vas zanima i jetreni ciljni protein iz ubrizgane DNK može se otkriti u roku od 24 sata nakon injekcije. Zatim su prikupljeni uzorci plazme radi proučavanja terapijskog svojstva eksprimiranog proteina.

[0345] Za sve hidrodinamičke injekcije koje su ovde izvedene u ovoj patentnoj prijavi, 2 ml plazmidne DNK u 0.9% sterilnom fiziološkom rastvoru isporučeno je intravenski injekcijom repne vene u roku od oko 4-7 sekundi miševima težinama 20-35 grama. Miševi su pomno nadgledani prvih par sati dok se normalna aktivnost nije nastavila. Nakon uzimanja uzoraka krvi retro-orbitalnim uzorkovanjem krvi, dobijeni su uzorci plazme i čuvani na -80°C radi dalje analize.

VWF ELISA:

[0346] Koza anti-humana VWF antitela (Afinitet prečišćen, afinitet biološki, GAVWF-AP) je korišćen kao antitelo za hvatanje u 0.5 ug/bušotini, a VWF-EIA-D (Affiniti Biologicals, VWF-EIA-D, razređivanje 1:100) koristi se za detektovanje antitela za VWF ELISA. ELISA test izvršen je po standardnom ELISA postupku, TMB je korišćen kao HRP supstrat, PBST/1.5% BSA/0.5M NaCl pufer je korišćen kao pufer za blokiranje i vezivanje.

Standardni raspon testa je 100ng do 0.78ng, a najniža granica kvantifikacije (LLOQ) analize je 7.8ng/ml.

Primer 9: Zajedničko davanje fragmenta VWF D'D3 pune dužine produžava poluraspad rBDD-FVIII kod miševa FVIII-VWF DKO (Slika 11)

[0347] Primer 8 je pokazao da D'D3 fragment pune dužine može zaštititi endogeni FVIII od njegovog putanja čišćenja. Da bi se dodatno procenila FVIII zaštitna aktivnost D'D3 proteina, FVIII-VWF DKO miševi su primenjeni istovremeno sa B domenom izbrisanim FVIII (rBDD-FVIII) i D'D3 dimerom (VWF-010) ili rBDD-FVIII i D'D3 monomer (VVF-002), intravenskim ubrizgavanjem od 200 IU/kg za rBDD-FVIII, 770 µg/kg za D'D3 dimer i 590 µg/kg za D'D3 monomer. PK profil rBDD-FVIII je praćen njegovom aktivnošću u plazmi

1 2

nakon injekcije. Zbog kratkog polu-raspada fragmenata D'D3 in vivo, tri sata nakon početne zajedničke-injekcije, dodatnom dozom D'D3 primenjen je istim putem da se održi željeni nivo D'D3 u plazmi.

[0348] Za PK analizu, uzorak plazme je dobijen retro-orbitalnim uzorkovanjem krvi za 5 minuta, 30 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata i 6 sati nakon injekcije, aktivnost FVIII u plazmi i nivo antigena D'D3 analiziran je pomoću FVIII hromogenog ispitivanja i VWF ELISA.

[0349] Kao što je prikazano na Slici 11 i Tabeli 10, D'D3 monomer produžio je polu-raspad rBDD-FVIII za 2.5 puta i poboljšao njegov oporavak za 1.8 puta. D'D3 dimer produžio je polu-raspad rBDD-FVIII za 4.1 puta i poboljšao njegov oporavak za 3.5 puta. Poboljšano srednje vreme zadržavanja, klirens i AUC takođe su primećeni iz obe D'D3 izoforme.

Međutim, D'D3 dimer postigao je bolje rezultate u svim PK parametrima u poređenju sa monomernim oblikom.

[0350] Ukratko, ko-injekcija D'D3 pune dužine štiti FVIII od njenog putanja čišćenja, kao što je prikazano na poboljšanom PK profilu rBDD-FVIII. Potencijalnu kliničku vrednost ovog nalaza potrebno je dodatno proceniti.

Tabela 10: BDD-FVIII PK parametar u FVIII-VWF DKO miševima kada se primenjuje zajedno sa D'D3 fragmentima

1

Primer 10. D'D3 monomer sintetizovan sa D1D2 domenom i njegova dimerna izoforma imaju istu FVIII zaštitnu aktivnost i dodatno produžavaju polu-raspad FVIIIFc ∼4 puta kod FVIII-VWF DKO miševa (Slika 12)

[0351] Kako bi se kvantifikovala FVIII zaštitna sposobnost D'D3 domena i utvrdilo da li je d'D3 dimerizacija neophodna za njenu FVIII zaštitnu aktivnost, svaki od dva DNK konstrukta (tj., VWF-025 (koji sadrži DNK sekvencu koja kodira D1D2D'D3) i VWF-029 (koji sadrži D1D2D'D3 kodon DNK sa mutacijom C336A i C379A)) je primenjen FVIII/VWF DKO miševima hidrodinamičkom injekcijom. Ova injekcija rezultirala je D'D3 dimerom (VWF-025) ili ekspresijom monomera (VWF-029) kod FVIII/VWF DKO miševa. Na dan 5 posle hidrodinamičke injekcije, primenjena je jedna intravenska doza rFVIIIFc sa 200 IU/kg, a uzorci plazme su sakupljeni na 5 minuta, 4, 8,16, 24, 31, 40, 55, 66 sati posle rFVIIIFc IV injekcije. Korišćeno je rFVIIIFc PK ispitivanje koja je izvedena na naivnim FVIII-VWF DKO miševima u istoj dozi kao rFVIIIFc osnovna linija polu-raspada. Aktivnost plazme FVIII analizirana je hromogenim testom FVIII. Nivo plazme D'D3 je meren VWF ELISA, a PF profil rFVIIIFc je analiziran korišćenjem WinNonlin programa.

[0352] Kao što je prikazano u Tabeli 11 i Slici 12, sa fragmentima VWF D'D3 u cirkulaciji, početni oporavak rFVIIIFc se povećao sa 42% na 75% sa D'D3 dimer i 60% sa D'D3 monomerom. rFVIIIFc T1/2je takođe povećan sa 2.5 sata na 9.3 sata i 9.2 sata. Slično T1/2, poboljšani srednji čas zadržavanja, klirens i distribucija zapremine primećeni su i kod D'D3 monomera i dimera koji eksprimiraju dimere. Sveukupno, vidimo oko 8 puta poboljšanja na rFVIIIFc polu-raspadu i 6 puta poboljšanja na AUC i u D'D3 monomeru i u miševima koji eksprimiraju dimer. Kao i njegova dimerna izoforma, D'D3 monomer VWF pune dužine koji je sintetizovan sa propeptidom (D1D2) VWF dovoljan je da obezbedi pun efekat zaštite FVIII kao molekul VWF pune dužine.

[0353] Kod FVIII/VWF DKO miševa, WT-FVIII ima 0.25hr T1/2. Fc fuziona tehnologija povećala je FVIII T1/2na 1.2 sata, što je oko 4.8 puta više. Kada se Fc tehnologija fuzije kombinovala sa D'D3 domenima, FVIII T1/2je povećan na 9.3hr (D'D3 dimer) i 9.2hr (D'D3 monomer), što je ukupno oko 37 puta više. (Tabela 10) Ovaj rezultat pokazuje sinergistički efekat Fc fuzije i D'D3 VWF fragmenta na produžetak polu-raspada FVIII.

Tabela 11: rFVIIIFc PK parametar sa/bez D'D3 fragmenta u cirkulaciji krvi

1 4

Primer 11: FVIII-VWF heterodimer PK kod HemA miševa

[0354] PK profil vodećih kandidata FVIII-VWF heterodimera (kao što je FVIII-155/VWF-031) testiraće se na HemA miševima da bi se procenila njihova sposobnost zaštite FVIII od endogenog VWF i njihove sposobnosti za produženje polu-raspada FVIII.

[0355] HemA miševi biće tretirani jednom intravenskom dozom olovnih kandidata na 200 IU/kg, uzorci plazme će se zatim uzimati u 5min, 4h, 8h, 24h, 48hr, 72hr, 96hr i 120h, a aktivnost plazme će se testirati FVIII hromogeni test i polu-raspad varijante FVIII će se izračunati programom WinNonlin.

[0356] U optimalnoj FVIII/VWF heterodimernoj konfiguraciji, vezivanje FVIII za endogeni VWF biće u potpunosti inhibirano, zbog čega će se polu-raspad rFVIII osnovne linije smanjiti sa 7.6 h na 0.25 h kao što je prikazano u primeru 7. Kada je D'D3 fragment koji nije kovalentno povezan sa FVIII, primećeno je oko 8 puta koristi polu-raspad (primer 9). Kod vodećih kandidata FVIII/VWF heterodimera, VWF fragment je kovalentno povezan sa FVIII molekulom, možda će se moći postići bolja zaštita od FVIII. Pronalazak ove prijave otvorio je vrata za daljnje produženje polu-raspada FVIII izvan stropa sa dva preklopa, uz kombinaciju dostupnih tehnologija produženja polu-raspada, pacijenti sa HemA mogli bi očekivati bolju varijantu FVIII u dugom vremenu.

[0357] PK profil FVIII-155/VWF-031 testiran je na HemA i FVIII/VWF DKO miševima da procene sposobnost D'D3 fragmenta da štiti FVIII deo od endogenog VWF. Miševi HemA ili FVIII/VWF DKO su tretirani jednom intravenskom dozom FVIII-155/VWF-031 pri 200

1

IU/kg, uzorci plazme su zatim sakupljeni za 5 minuta, 8 sati, 24 sata i 48 sati nakon doziranja. FVIII aktivnost uzorka plazme testirana je FVIII hromogenim testom, a poluraspad FVIII-155/VWF-031 izračunat je korišćenjem WinNonlin programa.

[0358] Teško oslabljeno vezivanje za imobilisani VWF otkriveno je bioplastnom interferometrijom (Slika 15, oktet; ForteBio Inc., Menlo Park, CA) za FVIII-155/VWF-031 u poređenju sa rFVIIIFc i rFVIII. To pokazuje da je D'D3 domen u molekuli uspešno blokirao vezivanje FVIII za izvorne VWF molekule. Zbog toga se očekivao sličan polu-raspad rFVIII-155/VWF-031 kod dva različita soja miša. Rezultati ispitivanja navedeni su na Slici 16 i Tabeli 12A. Kao što je predviđeno, rFVIII-155NVF-031 imao je uporediv PK profil i kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa, što ukazuje da je polu-raspad FVIIIFc/VWF heterodimera nezavisan o polu-raspadu endogenog VWF. Rezultati pokazuju da inhibicija interakcije između rFVIIIFc i endogenog VWF od strane domena VWF D'D3 omogućava eliminaciju FVIII plafona polu-raspada i otvara mogućnost produženja FVIII polu-raspada izvan poluraspada koji je moguć bez VWF D'D3 domena (oko dva puta divljeg tipa FVIII).

Tabela 12A. FVIII-155/VWF-031 PK i FVIII/VWF DKO miševa i HemA miševa

[0359] FVIII zaštitna sposobnost D'D3 domena procenjena je poređenjem t1/2FVIII-155/VWF-031 sa FVIIIFc u FVIII/VWF DKO miševima. Nakon jedne IV primene, uzorci krvi su sakupljeni u 5 minuta, 8 sati, 24 sata i 48 sati za FVIII-155/VWF-031, i za 5 minuta, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 6 sati i 8 sati za FVIIIFc. FVIII aktivnost uzorka plazme testirana je FVIII hromogenim testom, a polu-raspad FVIII-155/VWF-031 izračunat je korišćenjem WinNonlin programa.

1

[0360] Slika 16B i Tabela 12B pokazuju značajno poboljšani PK profil za FVIII-155/VWF-031 u poređenju sa rFVIIIFc kod DKO miševa: oko 6 puta se povećava na t1/2; i oko 5 puta povećava se zazor i AUC. Ovaj rezultat pokazuje da D'D3 domen u FVIIIFc/VWF heterodimeru štiti FVIII deo od nekih puteva čišćenja, pružajući tako određenu zaštitu obično obezbeđenu VWF pune dužine. Ovaj zaključak je takođe potvrđen kod HemA miševa. U poređenju sa rFVIIIFc kod HemA miševa, rFVIII-155/VWF-031 je pokazao kraći t1/2i manji AUC, što u ovoj konfiguraciji znači, domeni D'D3 (VWF-031) uspešno sprečavaju vezivanje proteina FVIII (rFVIII- 155) na endogeni VWF koji ima svojstva koja produžavaju vek poluraspada, kao i svojstvo koje ograničava polu-raspad FVIII. VWF pune dužine iznosi 250 kDa i formira multimere tako da endogeni VWF može biti do 2 MDa, i stoga je u skladu s ovom hipotezom da 55 kDa D'D3 region VWF ne pruža istu zaštitu koju obično pruža mnogo veliki endogeni VWF u ovom kontekstu. Pošto VWF fragment sprečava endogeni VWF da veže rFVIII-155/VWF-031, u ovom konkretnom konstruktu polu-raspad je smanjen kod HemA miša. Zbog toga, rezultati u Tabeli 12B pokazuju da je molekul rFVIII-155/VWF-031 sposoban da spreči produživač polu-raspada (endogeni VWF) FVIII da vezuje rFVIII-155/VWF-031. Međutim, eksperiment pokazuje da je uklanjanje faktora ograničavajućeg polu-raspada FVIII otvorilo mogućnost produženja polu-raspada proteina FVIII iznad 1.5 puta ili 2 puta ranije prikazanih. Kada se FVIII kombinuje sa ostalim elementima produženja polu-raspada kao što je prikazano na Slici 4, može se postići proboj dvostrukog gornjeg produženog plafona polu-raspada FVIII.

Tabela 12B. FVIII-155/VWF-031 i FVIIIFc PK kod FVIII/VWF DKO miševa

Primer 12: Optimizacija D'D3-Fc veznika FVIII/D'D3 heterodimera (Slika 13)

1

[0361] Da bi se rFVIIIFc mogao izvući iz putnog pražnjenja VWF i eliminirati dvostruki FVIII produženi plafon produženog polu-raspada, fragment VWF D'D3 je ugrađen u molekul rFVIIIFc (Slika 2), što rezultira heterodimerom FVIIIFc/VWF. Kako bi se uklonila interakcija između rFVIIIFc i endogenog VWF i maksimizirao zaštitni potencijal D'D3 FVIII, veznik između D'D3 domena i Fc regiona je podešen da omogući optimalno vezanje FVIII/D'D3. Optimalniji veznik će omogućiti D'D3 domeni veću FVIII zaštitu od manje optimalne konstrukcije veznika. Ovo se može testirati hidrodinamičkom injekcijom DNK konstrukcija u FVIII/VWF DKO miševima. Optimalniji konstrukt će dobiti višu ekspresiju proteina stabilnog stanja FVIIIFc/D'D3 heterodimera.

[0362] Tri različita FVIIIFc/D'D3 heterodimera (Slika 3, Primer 3) napravljena su za optimalnu selekciju veznika. Mogući veznici između D'D3 domena i Fc regiona navedeni su u Tabeli 13. Ti DNK konstrukti su primenjeni u FVIII/VWF DKO miševima hidrodinamičkom injekcijom ("HDI") pri 100 µg/mišu, a uzorci plazme su sakupljeni 48 sati posle HDI. Cirkulišuća aktivnost heterodimera FVIIIFc/D'D3 je analizirana FVIII hromogenim testom.

[0363] Rezultat ispitivanja je prikazan na Slici 13.48 sati nakon HDI, sličan nivo ekspresije postignut je FVIII-064 i FVIII-159, što ukazuje da 20aa veznik i 35aa veznik promovišu sličan nivo interakcije FVIII/D'D3. S druge strane, FVIII-160 pokazao je značajno veću ekspresiju od FVIII-064, što znači da 48aa veznik omogućava bolje vezanje FVIII/D'D3 u poređenju sa veznicima 20aa i 35aa.

[0364] Optimalan veznik između VWF fragmenta i Fc regiona je jedan od ključnih elemenata FVIIIFc/VWF heterodimera. Pronalaženje najboljeg veznika omogućiće optimalnu interakciju između FVIII i VWF fragmenta, sprečiti vezivanje FVIII za endogeni VWF, omogućiti FVIII da izbegne put VWF klirensa i produžiti polu-raspad FVIII izvan poluraspada plazme VWF.

Tabela 13: Različiti veznici između D'D3 i Fc fragmenta

1

Primer 13: Stabilnost jednolančanog FVIII

[0365] Jednolančani FVIII protein može biti stabilniji od svoje izoforme sa dvolančanim lancem. Da bi se ispitala ova hipoteza, napravljene su dve konstrukcije DNK: FVIII-136 (obradiv FVIIIFc sa D'D3 domenom) i FVIII-148 (jednolančani (SC) FVIIIFc sa D'D3 domenom, koji sadrži mutaciju R1645A/R1648A radi sprečavanja deljenja između teškog i lakog lanca FVIII).

[0366] Oba plazmida su primenjena u FVIII/VWF DKO miševima hidrodinamičkom injekcijom. Uzorci plazme prikupljeni su 24 i 48 sata nakon injekcije za merenje nivoa ekspresije dve izoforme FVIIIFc/D'D3. Kao što je prikazano na slici 14, u obe vremenske tačke primećen je trend bolje ekspresije konstrukcijom SC-FVIIIFc/D'D3 (FVIII-148) (p=0.12, p=0.19), što ukazuje da bi jedan lanac FVIII mogao biti više stabilna ili bolje izražena od svoje dvoformne izoforme (FVIII-136). PK profil dve izoforme FVIII i nivoi njihove ekspresije ćelijske kulture biće dodatno istraženi. Jedno lančani FVIII izoform može se potencijalno koristiti za zamenu konvencionalne izoforme dvolančanog lanca da bi se postigla bolja proizvodnja proteina i bolji in vivo polu-raspad FVIII.

Primer 14. PEGilacija

[0367] Jedan ili više molekula polietilen glikola (PEG) mogu biti povezani u bilo kom regionu proteina FVIII, fragmenta VWF ili oboje. Kako FVIII nema slobodnog cisteina na svojoj površini zasnovanom na kristalnoj strukturi (PDB:2R7E, Shen i dr., Blood 111:1240 (2008); PDB:3CDZ, Ngo, Structure, 16:597-606 (2008)), jedan pristup je umetanje peptida koji sadrži cistein (npr., GGGSGCGGGS) (SEQ ID NO:107) u ili ga povežu sa proteinom FVIII, VWF fragmentom ili oboje. Molekuli PEG koji sadrže maleimid mogu se konjugirati specifično sa cisteinom koji je uveden na rekombinantnom proteinu FVIII. Ukratko, rekombinantni protein FVIII koji sadrži Cys umetanje može se konstruisati standardnom molekularnom tehnologijom, a rekombinantni FVIII protein eksprimiran u sistemu sisanja sisara (npr., HEK293, CHO, BHK21, PER.C6 i CAP ćelije) se može prečistiti afinitetom i

1

jonoizmenjivačka hromatografija. Prečišćeni rekombinantni protein FVIII je redukovan Tris(2-karboksietil)fosfinom (TCEP) da bi se izložio tiol grupi uvedenog cisteina, a zatim reagovao sa maleimidnim PEG. Rezultirajući rekombinantni protein FVIII testiran je na aktivnost prokoagulanse i produžen polu-raspad.

[0368] PEG je vezan za bar jednu od lokacija obelodanjenih u U.S. Appl. No.61/670,553, ili druga pogodna mesta za umetanje. FVIII aktivnost PEGilovanog rekombinantnog proteina FVIII analizira se upotrebom FVIII hromogenog testa. PK PEGilovanog rekombinantnog proteina FVIII analizira se kod HemA miševa i FVIII-VWF DKO miševa kako je iznad opisano.

Primer 15: FVIII stabilnost u HemA i FVIII/VWF dvostrukoj nokaut (DKO) plazmi [0369] Stabilnost plazme različitih fuzija FVIIIFc testirana je u HemA ili FVIII/VWF dvostrukom nokaut (DKO) plazmi. Za ispitivanje stabilnosti, 5 IU/ml različitih FVIIIFc proteina se inkubiraju bilo sa mišjim HemA, bilo sa DKO plazmom, na 37°C. Alikvoti su sakupljeni u različitim vremenskim tačkama da bi se merila aktivnost pomoću FVIII hromogenog ispitivanja. Aktivnost u svakoj vremenskoj tački merena je u duplikatu, a prosečna aktivnost je prikazana kao funkcija vremena.

[0370] Za imuno-taložni test za FVIIIFc, 5 µg FVIIIFc se inkubira sa ili 250 µl PBS ili mišje DKO plazme tokom 24 sata na 37°C. FVIIIFc je imunološki istaložen dodavanjem 5 µg ovčjeg anti-FVIII poliklonskog antitela (ab61370) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i 100 µl proteina A. Nakon ispiranja 4xlml PBS-a, kuglice su ponovo suspendovane u 50 µl 1x redukovanog SDS-PAGE pufera. Nakon ključanja, 20µl uzorak (tj. ∼ 1µg FVIIIFc) je napunjen do 4-15% Bio-Rad gela bez mrlja. Gel je snimljen Bio-rad sistemom, a zatim je usledila zapadna analiza sa FVIII antitelom teškog lanca (GMA012).

[0371] Aktivnost FVIIIFc (dvolančani FVIII molekul, koji ima odvojene FVIII teške i lagane lance, koje drže zajedno nekovalentnim interakcijama) opada sa vremenom i u HemA i u DKO plazmi (Slika 18A). Zbog nedostatka zaštite posredovane VWF, gubitak aktivnosti FVIIIFc bio je izraženiji u DKO plazmi. Ovaj gubitak aktivnosti FVIII uglavnom je posledica disocijacije ili degradacije teškog lanca FVIII (HC). Zapaženo je oko 75% smanjenja teškog lanca FVIIIFc nakon 24 sata inkubacije u DKO plazmi (Slika 18B). Nije primećeno značajno smanjenje ni za laki lanac (LC) (podaci nisu prikazani), ni neobrađeni/jednolančani FVIIIFc

1

(tj., molekul FVIII u kome se laki i teški lanac i dalje drže zajedno kovalentno - gornji opseg na slici gela) (Slika 18B).

[0372] Pošto se predlaže VWF da poveća stabilnost FVIII in vivo, testirali smo da li je himerni protein - FVIII-VWF heterodimer (FVIII155:VWF31, koji ima kovalentno VWF D'D3, vezan na FVIII do Fc) bio stabilniji u Hem A i DKO plazma. Iz podataka o stabilnosti plazme prikazanih na slici 19, prisustvo D'D3 povećalo je stabilnost FVIIIFc, kako u HemA, tako i u DKO plazmi. Jednolančani FVIIIFc bez D'D3 korišten je kao kontrola u ovim eksperimentima (scFVIII). Sa slike 19, jednolančani FVIII bio je stabilniji od dvolančanog FVIIIFc; međutim, prisustvo D'D3 značajno je povećalo stabilnost plazme jednolančanog molekula FVIIIFc dalje. Ovo sugeriše da D'D3 stabilizuje FVIII, ne samo tako što drži teški i laki lanac zajedno, već i kroz neke druge nepoznate mehanizme.

Primer 16: Upotreba Furina/PACE-a za obradu VWF

[0373] VWF je jedinstven protein u smislu da sadrži veoma veliki pro-peptid (tj. D1D2 domen VWF, ∼85kDa). VWF propeptid služi kao unutrašnji pratilac za pravilno sklapanje VWF molekula. Dva enzima testirana su na VWF obradu - PC5 i Furin (PACE). VWF031 konstrukt (D1D2D'D3Fc) bio je prolazno ko-transfektira u ćelijama HEK293 sa različitim koncentracijama ili PC5 ili PACE. Posle četiri dana, sakupljena je podloga kulture tkiva i podvrgnut rasturanju proteina A. Čak i u nižoj koncentraciji (2.5%), furin (PACE) je bio efikasniji od 10% PC5, u uklanjanju pro-peptida (D1D2) iz D'D3Fc (Slika 20). Uklanjanje D1D2 je važno jer je prisustvo D1D2 implicirano u sprečavanju interakcije D'D3 sa FVIII.

Primer 17: VWF fragment u heterodimeru FVIII-VWF sprečava interakciju FVIII sa VWF celom dužinom

[0374] Za testiranje FVIII konstrukcije 155/VWF31 vezanja heterodimera na VWF pune dužine korišten je oktet instrument ForteBio (Slika 21A). Za ispitivanje vezivanja, VWF pune dužine snimljen je korišćenjem APS senzora, a zatim je blokiran sa 1% BSA. Posle blokiranja, različiti FVIII konstrukti su testirani na VWF vezivanje. Kao što je predviđeno, divlji tip FVIII i FVIIIFc snažno su vezani za VWF senzore. FVIII I1680F mutant, za koji se zna da ima nizak ili nikakav afinitet za VWF, pokazao je značajno smanjeno VWF vezivanje. FVIII155/VWF31 heterodimer se uopšte nije vezao za VWF pune dužine, potvrđujući oklop FVIII sa D'D3 u FVIII-VWF heterodimeru.

1 1

[0375] Isti eksperiment je izveden u obrnutoj orijentaciji kako bi se utvrdilo da li deo D'D3 u FVIII-VWF heterodimeru može da stupa u interakciju sa drugim molekulima FVIII koji nisu kovalentno vezani za D'D3. Kao što je prikazano na slici 21B, konstrukcija VWF31 (D'D3Fc) sama kada se imobilizovana na protein G senzoru može snažno vezati za FVIII, međutim heterodimer D'D3 u FVIII155:VWF31 nije pokazao nikakvo vezivanje za FVIII. Protein G sam sa FVIII korišćen je kao kontrola. Ovi eksperimenti vezivanja potvrdili su da D'D3 u heterodimeru može da komunicira sa samo jednim molekulom FVIII koji je kovalentno vezan na njega i sprečava FVIII da interakcije sa molekulima divljeg tipa VWF pune dužine.

[0376] Da bi se odredio tačan afinitet vezivanja VWF D'D3 za FVIII molekul, izvedeni su eksperimenti površinske rezonance plazme sa VWF031 (Slika 22). Koncept VWF031 (D'D3Fc) je snimljen korišćenjem anti-humanog IgG i B-domen izbrisan FVIII je prenesen preko čipa koji sadrži D'D3Fc. Primećen je KDod oko 10 n M za FVIII. Taj afinitet je oko 25 puta niži u poređenju sa divljim tipom VWF pune dužine i sličan je onome što je ranije rečeno u literaturi.

Primer 18: Uticaj različite dužine veznika između D'D3 i Fc na heterodimernu aktivnost i PK

[0377] Da bi se proverilo da li izmena dužine vezujućeg vezivnog trombina između D'D3 i Fc ima bilo kakav uticaj na PK i aktivnost FVIII-VWF heterodimera, različiti VWF konstrukti su ko-eksprimirani zajedno sa FVIII 155. Ispitane su tri konstrukcije različitih dužina veznika navedenih u Tabeli 14A (VWF031, VWF035 i VWF036). Svaki plazmid je pomešan sa FVIII155 plazmidom (Primer 5) i transfektiran u HEK293 ćelije. Četvrtog dana nakon transfekcije, sakupljena je podloga ćelijske kulture i koncentrovan na 10 IU/ml FVIII hromogene aktivnosti.

[0378] Koncentrovana ćelijska podloga je zatim primenjivana u FVIII/VWF DKO miševe stare 8-12 nedelja u dozi od 100 IU/10 mL/kg. Uzorci plazme prikupljeni su nakon doziranja od 5 minuta, 8 sati, 16 sati, 24 sata, 32 sata i 48 sati. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hromogenim testom i polu-raspad je izračunat korišćenjem programa WinNonlin-Phoenix.

[0379] Kao što je prikazano na Slici 23, kada se dužina veznika između D'D3 i Fc fragmenta povećala sa 48 aa na 73aa ili 98aa, polu-raspad odgovarajućeg FVIIIFc/VWF heterodimera se

1 2

povećao i dostigao 12.2 h i 13.3 h respektivno. Ovo predstavlja povećanje od 1.5 do 1.6 puta u odnosu na 48aa varijantu. Do danas, veznik 98aa je najoptimalniji veznik za upotrebu FVIII zaštitne aktivnosti D'D3 fragmenta i biće ugrađen u heterodimer FVIIIFc/VWF radi daljeg poboljšanja njegovog polu-raspada.

[0380] Da bi se uporedio efekat veznika na FVIII aktivnost, FVIII hromogeni i aPTT test izvedeni su na podlozi za kultivisanje tkiva iz ćelija koje eksprimiraju različite FVIII-VWF heterodimere. Iako je aPTT aktivnost bila dvostruko smanjena u poređenju sa hromogenom aktivnošću za heterodimerne konstrukte, nije primećena značajna razlika između različitih veznika, osim kada veznik takođe sadrži PARI mesto pored mesta trombina (Tabela 14B).

Tabela 14A. Redosled promenljivog veznika između VWF D'D3 i Fc

Tabela 14B: Aktivnost heterodimera različite dužine veze

1

Primer 19: Povezivanje FVIII sa VWF fragmentom upotrebom enzima sortaze [0381] U drugom aspektu, VWF fragment (npr., D1D2D'D3 ili D'D3 domen) je vezan za FVIII korišćenjem metode in vitro vezivanja proteina posredovane sortazom. U jednom primeru, motiv prepoznavanja Staphylococcus aureus sortaze A (LPXTG) uveden je na C-kraju VWF fragmenta, a Gly(n) ostatak na N-završetku FVIII (gde je broj ostataka glicina promenljiv). Upotrebljeni molekul FVIII može biti ili jednolančani ili dvolančani. Reakcija transpeptidacije, katalizovane sortazom, kovalentno će vezati VWF fragment na FVIII. Obrnuta orijentacija motiva prepoznavanja takođe se može koristiti za povezivanje ova dva proteina, gde imamo FVIII na N-terminusu sa LPXTG motivom i VWF fragment na C-završetku sa Gly(n) (videti Sliku 24 - primer sortiranja sorta za referenca). LPXTG motiv i ostaci glicina mogu se zameniti drugim sekvencama za prepoznavanje sortaze.

[0382] Napravljen je i VWF fragment koji sadrži sortazu Fc fuzioni protein. Za Fc fuzione konstrukte, VWF D1D2D'D3 fragment je fuzioniran sa Fc regionom IgG preko GS veznika koji sadrži sekvencu za prepoznavanje sortaze i mesto deljenja trombina (Tabele 15 i 16). Jednom kada se protein eksprimira i prečisti na koloni Protein A, Fc region može biti uklonjen trombinskim deljenjem. Rezultirajući VWF fragment sa sortazom mesto prepoznavanja može se zatim koristiti za vezivanje s molekulom FVIII (Slika 24 - Primer sortacijske ligacije za referentni red E).

[0383] pSYN-VWF-051 ima 54 aminokiselinski veznik sa mestom sortaze i trombina između VWF fragmenta i Fc regiona. Sinteza fragmenta DNK kodiranja 54 aminokiselinskih veznika (ISGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSGGGGSGGG GSLPETGALR PRVVGGGGSG GGGS) (SEQ ID NO:98) a deo regiona Fc je podučavan (Genewiz sekvenca br-10-210746313, prikazano ispod). Fragment konstrukcije Genewiz subkloniran je u digestirani EcoRV/RsRII pSYN-VWF-031.

Genewiz-sekvenca br-10-210746313(SEQ ID NO:99)

1 4

[0384] Redosled N-završetka pentaglicina koji sadrži jednolančani FVIII prikazan je u Tabelama 17 i 18.

1

�

�

�

�

Primer 20: Stabilnost plazme i PK FVIII198 u HemA i FVIII/VWF dvostrukoj nokaut (DKO) plazmi

[0385] Stabilnost plazme FVIII 198 (koja je delimična B domena koja sadrži jednolančani molekul FVIIIFc-226N6; gde 226 predstavlja N-završetak 226 aminokiselina FVIII B-domena i N6 predstavlja šest mesta N-glikozilacije u B-domenu) u poređenju sa jednolančanim FVIIIFc (FVIII 155/Fc) u FVIII/VWF dvostrukoj nokaut (DKO) plazmi. Šematski prikaz FVIII155 i FVIII198 može se videti na Slici 25.

[0386] Za test stabilnosti, 5 IU/ml proteina FVIII 198 ili FVIIIFc se inkubira sa mišjom ili DKO plazmom na 37°C. Alikvoti su prikupljeni u različitim vremenskim tačkama za merenje aktivnosti pomoću FVIII hromogenog ispitivanja. Aktivnost u svakoj vremenskoj tački merena je u duplikatu, a prosečna aktivnost je prikazana kao funkcija vremena. U ispitivanju stabilnosti, prisustvo delimičnog B domena povećalo je stabilnost jednolančanog FVIIIFc (Slika 26A).

[0387] Polu-raspad FVIII 198 (jednolančani-B226N6) je takođe upoređen sa FVIII155 (jednočlani B-domen izbrisan FVIII) kod DKO miševa. FVIII 198 ima najmanje oko 1.5 puta duži polu-raspad u poređenju sa FVIII155 (Slika 26B). Ovi eksperimenti sugeriraju da može postojati povezanost između stabilnosti FVIII i njegovog in-vivo polu-raspad.

FVIII198 nukleotidna sekvenca (FVIIIFc sa delimičnim B-domenom, 226N6)(SEQ ID NO:104)

1

11

��

Primer 21. Ekspresija D1D2 proteina VWF

1

[0388] Pravilno savijanje D'D3 domena od suštinskog je značaja za njegovo vezivanje za FVIII. VWF propeptid (D1D2-aminokiseline 1-763) je potreban za efikasno formiranje disulfidne veze i savijanje D'D3. Deluje kao unutrašnji pratilac za D'D3 preklapanje. VWF konstrukcije koje prave VWF fragmente mogu se izraziti tamo gde je VWF propeptid (tj., D1D2 domen) direktno vezan za D'D3 domen i uklonjen tokom redovne unutarćelijske obrade D'D3 (tj. u cis), ili se može izraziti iz drugog plazmid, tj. u trans. Dizajnirali smo FVIII-VWF heterodimer na takav način gde se D1D2 može izraziti u cis ili trans.

[0389] Kloniranje VWF 053: VWF 053 klon eksprimira VWF propeptid (D1D2 domen) za trans ekspresiju D1D2. VWF propeptid je PCR amplifikovan celom dužinom koristeći ESC 54 i ESC124.

ESC54-VWF prosledite sa BsiW1 sajtom (SEQ ID NO:111) (CGCTTCGCGACGTACGGCCGCCACCATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGG TGCTGCTTGCTC)

ESC 124 - D1D2 kloniranje oligo sa stranice Not1 (SEQ ID NO:112) (CTAGACTCGAGCGGCCGCTCACCTTTTGCTGCGATGAGACAGGGGACTGC TGAGGACAGC)

[0390] PCR proizvod je digestiran sa BsiW1 i Not1 i liziran u BSiW1/Not1 digestirane pCDNK 4.

Nukleotidna sekvenca VWF 053 (VWF D1D2-propeptida) (SEQ ID NO:113)

1 4

Proteinska sekvenca VWF 053 (VWF D1D2-Propeptida) (SEQ ID NO:114)

[0391] Prethodni opis specifičnih realizacija će tako u potpunosti otkriti opštu prirodu pronalaska da drugi mogu, primenjujući znanje u okviru veštine, lako modifikovati i/ili prilagođavati za različite primene takve specifične realizacije, bez nepotrebnog eksperimentiranja, bez odstupanja. iz opšte koncepcije predmetnog pronalaska. Stoga su predviđena takva prilagođavanja i modifikacije da budu u značenju i rasponu ekvivalenata obelodanjenih otelotvorenja, zasnovane na ovde podučavanju i uputstvima. Treba shvatiti da su ovde frazeologija ili terminologija u svrhu opisivanja, a ne ograničavanja, tako da terminologiju ili frazeologiju ove specifikacije treba da protumači vešt stručnjak u svetlu učenja i uputstava.

1

[0392] Ostala otelotvorenja pronalaska će biti jasna stručnjacima iz razmatranja specifikacije i prakse pronalaska ovde obelodanjenim. Namerava se da specifikacije i primeri budu smatrani samo kao primeri, a istinski obim i duh pronalaska su naznačeni sledećim patentnim zahtevima.

1

1

�

�

�

11

��

�

��

�

�

1

1

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

1

2

21

22

2

��

�

�

�

�

�

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

24

24

24

24

24

��

��

�

21

22

�

24

2

2

2

2

2

2

21

22

�

��

�

�

�

�

�

2

21

22

�

��

�

�

�

2

�

�

21

22

2

24

�

2

�

�

�

�

21

22

2

��

2

�

�

�

�

1

�

4

�

11

12

1

��

1

�

�

�

�

21

22

2

��

2

�

�

�

Claims (18)

Patentni zahtevi

1. Himerni protein koji sadrži protein faktora VIII ("FVIII") i von Willebrandov faktor (VWF),

pri čemu FVIII protein sadrži A1 domen, A2 domen, A3 domen, C1 domen i C2 domen; gde VWF fragment sadrži D' domenu i D3 domen VWF; i

pri čemu su VWF fragment i FVIII protein povezani kovalentnom vezom, koja sprečava disocijaciju VWF fragmenta iz FVIII proteina u prisustvu endogenog VWF,

pri čemu VWF fragment inhibira ili sprečava endogeni VWF da se veže za protein FVIII zaštitom ili blokiranjem VWF mesta vezivanja za protein FVIII.

2. Himerni protein prema patentnom zahtevu 1, gde kovalentna veza sadrži:

(i) peptidnu vezu ili

(ii) disulfidnu vezu ili

(iii) veznik između FVIII proteina i VWF fragmenta.

3. Himerni protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je VWF fragment povezan sa FVIII proteinom nekovalentnom vezom pored kovalentne veze.

4. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu VWF fragment sadrži najmanje jedan heterologni deo (H1).

5. Himerni protein iz patentnog zahteva 3, gde VWF fragment dalje sadrži veznik, pri čemu je veznik između VWF fragmenta i heterolognog dela (H1).

6. Himerni protein prema patentnom zahtevu 4 ili zahtev 5, gde FVIII protein sadrži najmanje jedan dodatni heterologni deo (H2).

7. Himerni protein prema patentnom zahtevu 6, gde heterologni deo (H1) sadrži:

a. najmanje jedan konstantni region imunoglobulina, albumin, deo koji vezuje albumin, sekvencu Pro-Ala-Ser (PAS), sekvencu homo-aminokiselinskih polimera (HAP), transferin, polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES) i sve njihove kombinacije; ili

b. prvi Fc region; i/ili

heterologni deo (H2) sadrži:

2

c. najmanje jedan konstantni region imunoglobulina, albumin, deo koji se vezuje za albumin, PAS sekvencu, HAP sekvencu, transferin, polietilen glikol (PEG), polisijalnu kiselinu, hidroksietil skrob (HES) i sve njihove kombinacije; ili d. drugi Fc region.

8. Himerni protein prema patentnom zahtevu 6 ili 7, gde heterologni deo (H1) sadrži prvi Fc region, a heterologni deo (H2) sadrži drugi Fc region, gde je kovalentna veza između prvog Fc regiona i drugog Fc region.

9. Himerni protein prema patentnom zahtevu 1, gde himerni protein sadrži formulu odabranu iz:

(a) V-L1-H1-L3-H2-L2-C, ili

(b) C-L2-H2-L3-H1-L1-V,

pri čemu u formulama (a) i (b)

V je VWF fragment;

L1 je opcioni veznik;

L2 je opcioni veznik;

L3 je opcioni veznik;

Svaki od H1 i H2 sadrže opcioni heterologni deo;

C sadrži FVIII protein; i

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina;

ili gde himerni protein sadrži formulu:

(c) V-L1-H1: H2-L2-C,

gde u formuli (c)

V je VWF fragment;

L1 je opcioni veznik;

L2 je opcioni veznik;

H1 je prvi heterologni deo;

H2 je drugi heterologni deo;

C je FVIII protein;

(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i

(:) je kovalentna veza između H1 i H2.

10. Himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 8, koji nadalje sadrži veznik između FVIII proteina i VWF fragmenta.

11. Himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, gde je aminokiselinska sekvenca D' domena VWF fragmenta najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO:2 i gde je aminokiselinska sekvenca D3 domena VWF fragmenta najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 867 do 1240 SEQ ID NO:2.

12. Himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu VWF fragment dalje sadrži D1 domen, D2 domen ili D1 i D2 domene VWF.

13. Himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 12, pri čemu FVIII protein sadrži B domen ili njegov deo.

14. Polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 13, pri čemu set polinukleotida sadrži prvi polinukleotid koji kodira VWF fragment i drugi polinukleotid koji kodira FVIII protein.

15. Ćelija domaćina koja sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida prema patentnom zahtevu 14.

16. Farmaceutski sastav koji sadrži himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 13, polinukleotid ili skup polinukleotida prema patentnom zahtevu 14 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

17. Himerni protein prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 13, polinukleotid ili skup polinukleotida prema patentnom zahtevu 14 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 16 za upotrebu u lečenju bolesti krvarenja ili stanja kod ispitanika kome je potrebno, gde je bolest ili poremećaj krvarenja izabran iz grupe koja se sastoji iz poremećaja koagulacije krvarenja, hemartroze, krvarenja u mišićima, oralnog krvarenja, hemoragije, hemoragije u mišićima, oralne hemoragija, traume, povreda, gastrointestinalnog krvarenja, intrakranijalno krvarenja, intra-abdominalnog krvarenja, intratorakalnog krvarenja, preloma kostiju, krvarenja iz centralnog nervnog sistema, krvarenja u retrofaringealnom prostoru, krvarenja u

1

retroperitonealnom prostoru, krvarenja u omotaču bočnog slabinskog mišića i bilo koje kombinacije istih.

18. Postupak za pravljenje himernog proteina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 13, koji obuhvata transfekciju jedne ili više ćelija domaćina polinukleotidom ili setom polinukleotida prema patentnom zahtevu 14 i ekspresiju himernog proteina u ćeliji domaćinu.

2