JP7680442B2 - 第ｖｉｉｉ因子に対する寛容を誘導するためのポリペプチド - Google Patents

Description

本発明は、第ＶＩＩＩ因子の抗体の形成を減少させるために有用なポリペプチドに関する。

血友病Ａは、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の血漿欠乏を特徴とする遺伝性出血性障害である。血友病Ａ患者は、現在、ＦＶＩＩＩ補充療法で処置されている。３０％の患者における主要な合併症は、ＦＶＩＩＩ活性を不活性化し、補充療法を無効化し得る同種抗体（インヒビター）の発生である。検出可能なインヒビターを有する患者は、ＦＶＩＩＩバイパス療法（ＦＩＩａ複合体濃縮製剤、ｒＦＶＩＩａ、エミシズマブ）ならびにＦＶＩＩＩ（ＩＴＩ）および／または免疫抑制剤の反復投与で処置される。このような処置はコストが高く、輸液が繰り返し必要であり、６０％の成功率しかない。

免疫寛容は新生児期に確立され、成人期の間は様々な生理学的機序によって維持されて自己組織に対して免疫反応が起きないようにしている。血友病男児においては、ＦＶＩＩＩはｆ８遺伝子座の様々な変異により発現しないか、または誤って発現されるため、ＦＶＩＩＩに対する寛容が十分に確立されておらず、そのため自己タンパク質として認識されない。成人期には、抗原特異的なＢおよび／またはＴ細胞の排除または抑制により、免疫寛容が誘導および維持される。この過程に関与する主な機序は、免疫寛容の誘導に特化した細胞（肝臓または脾臓のマクロファージ）による抗原提示、内在性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の拡大、または抗原特異的Ｔｒｅｇの誘導が含まれる。

本発明者らは、インヒビターを有する患者において、ＦＶＩＩＩに対する寛容を積極的に誘導することができるようにＦＶＩＩＩを製剤化し、投与することを目指した。非特許文献１は、アポトーシス赤血球を標的とした抗原が脾臓および肝臓で除去され、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞における抗原特異的な寛容原性応答を誘導することを実証した。グリコフォリンＡは赤血球（ＲＢＣ）の表面で多く発現され、ＲＢＣ表面に抗原（Ａｇ）をターゲティングするのに用いることができる。しかし、ＦＶＩＩＩおよび赤血球ターゲティング部分を含む融合タンパク質は、インヒビターの形成の低減において限定された効果しか有していないことがわかった。

血友病Ａの処置において、インヒビター形成を減少させることが引き続き必要である。

Ｋｏｎｔｏｓ Ｓ．ら，２０１２；ＰＮＡＳ；１１０（１）：Ｅ６０－Ｅ６８

本願の発明者らは、驚くべきことに、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）のＤ’Ｄ３ドメインおよび赤血球ターゲティング部分を含む融合タンパク質が、インヒビター形成を低減することを見出した。

従って、本発明は、以下の項目［１］～［６０］に定義された主題に関する。
［１］（ｉ）ＶＷＦ部分と（ｉｉ）赤血球結合部分とを含むポリペプチドであって、上記ポリペプチドが血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができる、ポリペプチド。
［２］上記ＶＷＦ部分がＦＶＩＩＩに結合することができる、項目［１］に記載のポリペプチド。
［３］上記ＶＷＦ部分が、ＶＷＦまたはそのフラグメント、好ましくはヒトＶＷＦまたはそのフラグメントである、項目［１］に記載のポリペプチド。
［４］上記ＶＷＦ部分が、ＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含む、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［５］上記ＶＷＦ部分が、ＶＷＦのフラグメントを含むか、または実質的にそれらからなる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［６］上記ＶＷＦ部分が、実質的に切断型ＶＷＦからなる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［７］ＶＷＦ部分が、配列番号１８のアミノ酸７７６から８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または配列番号１８のアミノ酸７６４から１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［８］ＶＷＦ部分が、配列番号１８のアミノ酸１２４３から２８１３を欠いている、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［９］ＶＷＦ部分が、（ａ）配列番号１８のアミノ酸７６４から１２４２、（ｂ）配列番号１８のアミノ酸７６４から１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のフラグメントからなる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１０］上記ＶＷＦ部分が、配列番号１８に示されるような野生型ＶＷＦのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１１］上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、上記少なくとも１つのアミノ酸置換を除いて同じ配列を有する対照ポリペプチドと比較して、ポリペプチドのＦＶＩＩＩへの結合親和性を増加させる、項目［１０］に記載のポリペプチド。
［１２］上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸の番号付けに関して、配列番号１８の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、およびＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａからなる組み合わせの群から選択される、項目［１０］または［１１］に記載のポリペプチド。
［１３］上記少なくとも１つのアミノ酸置換が、組み合わせＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６ＹまたはＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａのいずれかである、項目［１０］～［１２］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１４］上記ポリペプチドが、１μＭまたはそれ以下の解離定数ＫＤで上記ＦＶＩＩＩに結合する、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１５］上記ポリペプチドが、１ｎＭまたはそれ以下の解離定数ＫＤで上記ＦＶＩＩＩに結合する、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１６］上記ポリペプチドが、０．１ｎＭまたはそれ以下の解離定数ＫＤで上記ＦＶＩＩＩに結合する、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１７］上記ポリペプチドが、半減期延長部分（ＨＬＥＭ）を含む、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［１８］ＨＬＥＭが、ＶＷＦ部分に融合された異種アミノ酸配列である、項目［１７］に記載のポリペプチド。
［１９］上記異種アミノ酸配列が、トランスフェリンおよびそのフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド、ＸＴＥＮ配列、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）、プロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アルブミン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）アルファ－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、アルブミンまたは免疫グロブリン定常領域に生理的条件下で結合することができるポリペプチド、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）、特に免疫グロブリン定常領域およびその部分、好ましくは免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することができるポリペプチド、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質またはペプチドを含むか、またはそれからなる項目［１８］に記載のポリペプチド。
［２０］ＨＬＥＭが、ＶＷＦ部分を含むポリペプチドにコンジュゲートされている、項目［１７］に記載のポリペプチド。
［２１］ＨＬＥＭが、ＶＷＦ部分を含むポリペプチドのＣ末端にコンジュゲートされている、項目［２０］に記載のポリペプチド。
［２２］上記ＨＬＥＭが、ヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマー、ヒアルロン酸および非タンパク質性アルブミン結合リガンド、例えば脂肪酸鎖、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目［２０］または［２１］に記載のポリペプチド。
［２３］ＨＬＥＭが、ＶＷＦ部分を含むポリペプチドに非共有結合している、項目［１７］に記載のポリペプチド。
［２４］ポリペプチドが、ポリペプチドにコンジュゲートされたＨＬＥＭをなんら含まない、項目［１］～［２０］のいずれか１項に記載のポリペプチド。
［２５］上記ポリペプチドが、Ｎ－グリカンを含む糖タンパク質であり、上記Ｎ－グリカンの好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％が、平均して、少なくとも１つのシアル酸部分を含む、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［２６］上記ポリペプチドが、二量体として存在するか、または少なくとも高比率の二量体を有する、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［２７］上記ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、二量体として存在する、項目［２６］に記載のポリペプチド。
［２８］二量体を形成する２つの単量体が、ＶＷＦ部分内のシステイン残基によって形成される少なくとも１つまたはそれ以上のジスルフィド架橋を介して互いに共有結合している、項目［２６］または［２７］に記載のポリペプチド。
［２９］１つまたはそれ以上のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基が、Ｃｙｓ－１０９９、Ｃｙｓ－１１４２、Ｃｙｓ－１２２２、Ｃｙｓ－１２２５、Ｃｙｓ－１２２７およびそれらの組み合わせ、好ましくはＣｙｓ－１０９９およびＣｙｓ－１１４２からなる群から選択され、アミノ酸の番号付けは配列番号１８を指す、項目［２８］に記載のポリペプチド。
［３０］上記二量体のＦＶＩＩＩに対する親和性が、単量体ポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する親和性よりも大きく、上記単量体ポリペプチドが、二量体ポリペプチドの単量体サブユニットと同じアミノ酸配列を有する、項目［２６］～［２９］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［３１］ポリペプチドの二量体：単量体の比率が、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０であり；またはポリペプチドがポリペプチドの単量体および／または多量体の形態を含まないか；またはポリペプチドがポリペプチドの単量体および／または多量体を本質的に含まない、項目［２６］～［３０］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［３２］二量体ポリペプチドが、１μＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満、より好ましくは５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、９０ｐＭ未満または８０ｐＭ未満の解離定数Ｋ_Ｄを特徴とするＦＶＩＩＩ結合親和性を有する、項目［２６］～［３１］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［３３］Ｋ_Ｄが、０．１ｐＭ～５００ｐＭ、０．５ｐＭ～２００ｐＭ、０．７５ｐＭ～１００ｐＭ、または最も好ましくは１ｐＭ～８０ｐＭの範囲である、項目［３２］に記載のポリペプチド。
［３４］ポリペプチドがヘテロ二量体である、項目［２６］～［３３］のいずれか１つの項目に記載のポリペプチド。
［３５］ヘテロ二量体が第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが、上記項目のいずれか１つに定義された第１のＶＷＦ部分および赤血球結合部分を含み、第２のサブユニットが、上記項目のいずれか１つに定義された第２のＶＷＦ部分を含む、項目［３４］に記載のポリペプチド。
［３６］上記第１のＶＷＦ部分および上記第２のＶＷＦ部分が同一である、項目［３５］に記載のポリペプチド。
［３７］上記第２のサブユニットが赤血球結合部分を含まない、項目［３５］または［３６］に記載のポリペプチド。
［３８］上記第２のサブユニットが、実質的に第２のＶＷＦ部分からなる、項目［３５］～［３７］のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［３９］上記赤血球結合部分が、ヒト赤血球に結合することができる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［４０］、上記赤血球結合部分が、赤血球上の膜タンパク質、好ましくはヒト赤血球上のヒト膜タンパク質に結合することができる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［４１］上記赤血球結合部分が、ペプチドリガンド、抗体、抗体フラグメント、および単鎖抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［４２］上記赤血球結合部分が、バンド３（ＣＤ２３３）、アクアポリン－１、Ｇｌｕｔ－１、キッド抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコフォリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコフォリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコフォリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコフォリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｉｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド（Ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ）、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ－４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ－ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グルコシルトランスフェラーゼ、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）、ドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉｍｍａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ－Ｉ（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９およびＨ抗原（Ｈａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＤ１７３）からなる群から選択される生体分子に特異的に結合することができる、上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチド。
［４３］上記項目のいずれか１つに記載のポリペプチドと、場合により薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
［４４］組成物中のポリペプチドの二量体：単量体の比率が、少なくとも１．５、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも２．５または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも２０であるか；または組成物がポリペプチドの単量体および／または多量体の形態を含まないか；または組成物がポリペプチドの単量体および／または多量体の形態を本質的に含まない、項目［４３］の医薬組成物。
［４５］治療における使用のための、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目［４３］もしくは［４４］に記載の医薬組成物。
［４６］医薬品として使用するための、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目［４３］もしくは［４４］に記載の医薬組成物。
［４７］血液凝固障害の処置に使用するための、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目［４３］もしくは［４４］に記載の医薬組成物。
［４８］上記血液凝固障害が血友病Ａである、項目［４７］に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［４７］に記載の使用のための医薬組成物。
［４９］上記処置が、対象にＦＶＩＩＩを投与することを含む、項目［４７］もしくは［４８］に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［４７］もしくは［４８］に記載の使用のための医薬組成物。
［５０］ポリペプチドおよびＦＶＩＩＩが共投与される（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）、項目［４９］に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［４９］に記載の使用のための医薬組成物。
［５１］上記共投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が、（ｉ）ポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む単一組成物において一緒に投与することによって、または（ｉｉ）それぞれ別々の組成物に提供されたポリペプチドおよびＦＶＩＩＩの投与により、ポリペプチドがＦＶＩＩＩの前、後またはそれと同時に投与されることによって達成される、項目［５０］に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［５０］に記載の使用のための医薬組成物。
［５２］ＦＶＩＩＩに対するポリペプチドの比率が少なくとも１、または少なくとも２、または少なくとも４、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも５０、または少なくとも１００である、項目［４９］～［５１］のいずれか１項に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［４９］～［５１］のいずれか１項に記載の使用のための医薬組成物。
［５３］インヒビター形成の防止または低減に使用するための、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目［４３］もしくは［４４］に記載の医薬組成物。
［５４］上記のインヒビター形成の防止または低減が、（ｉ）上記ポリペプチドまたは上記医薬組成物および（ｉｉ）ＦＶＩＩＩを対象に投与することを含む、項目［５３］に記載の使用のためのポリペプチド、または項目［５３］に記載の使用のための医薬組成物。
［５５］項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［５６］項目［５５］に記載の核酸を含む、プラスミドまたはベクター。
［５７］項目［５６］に記載のプラスミドまたはベクターを含む宿主細胞。
［５８］ＶＷＦおよび赤血球結合部分を含むポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）ＶＷＦおよび赤血球結合部分を含むポリペプチドが発現するような条件下で項目［５７］の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）場合により、宿主細胞または培養液からＶＷＦおよび赤血球結合部分を含むポリペプチドを回収することとを含む、方法。
［５９］ＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチドの有効量を投与することを含む、方法。
［６０］ＦＶＩＩＩに対する寛容の誘導に使用するための、項目［１］～［４２］のいずれか１つに記載のポリペプチド、または項目［４３］もしくは［４４］に記載の医薬組成物。

Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ二量体のスキーム。ＶＷＦ－Ｄ’Ｄ３ ＦＶＩＩＩ結合ドメインは、Ｃ末端でヒトアルブミン（ＨＳＡ）およびＴＥＲ１１９ｓｃＦｖと融合している。Ｄ’Ｄ３はＤ１Ｄ２、ＶＷＦプロペプチド（図示せず）と並んで発現される。Ｄ１Ｄ２は、同じ発現細胞株中のＰＡＣＥ／フューリンの共発現により切断される。Ｃ１０９９およびＣ１１４２での２つの鎖間ジスルフィドを介して二量体が形成される（点線により例示した）。 発現中の二量体および単量体の形成。（Ｆ）ＣＳＬ６２６から誘導され精製されたＤ’Ｄ３－ＦＰ二量体および単量体の混合物、（Ｔ）ＣＨＯ培養上清中のＤ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ホモ二量体、（Ｍ）マーカーのウェスタンブロット。トリスグリシン（Ｔｒｉｓ Ｇｌｙｃｉｎ）８－１６％。検出：抗ヒト血清アルブミン抗体（ＡＰ標識化）。 Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖのｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスＲＢＣへの結合。フローサイトメトリー。マウスＲＢＣ（１：１００全血）を抗ＴＥＲ１１９－ＰＥ ＭＡｂで染色し、単一細胞分析（ＳＳＣ／ＦＳＣ）のためにゲートを規定した。次に、マウスＲＢＣを、（Ａ）ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ、（Ｂ）Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９二量体、５０μｇ／ｍｌ、（Ｃ）Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９単量体、５０μｇ／ｍｌ、（Ｄ）Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９単量体、５０μｇ／ｍｌ、および抗ヒトアルブミンＭＡｂ、２０μｇ／ｍｌ、（Ｅ）ＰＢＳ＋１％ＢＳＡおよび（Ｆ）抗ｔｅｒ１１９－ＰＥ ｍＡｂ、０．２μｇ／ｍｌと共にインキュベートした。 二重特異性Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体のスキーム。第一のＶＷＦ－Ｄ’Ｄ３ ＦＶＩＩＩ結合ドメインは、Ｃ末端でヒトアルブミン（ＨＳＡ）およびＴＥＲ１１９ｓｃＦｖと融合している。第２のＤ’Ｄ３はＣ末端でタグ付けされている。Ｄ’Ｄ３は、Ｄ１Ｄ２、ＶＷＦプロペプチド（図示せず）と並んで発現される。Ｄ１Ｄ２は同じ発現細胞株中のＰＡＣＥ／フューリンの共発現により切断される。Ｃ１０９９およびＣ１１４２の２つの鎖間ジスルフィド結合により２量体が形成される（点線により例示した）。 Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖヘテロ二量体の発現。ヘテロ二量体は、（Ａ）安定的にトランスフェクトされた細胞株（配列番号３および配列番号５）におけるＤ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖおよびＤ’Ｄ３の共発現により生成した。（Ｂ）サブユニット（配列番号７および配列番号９）の両方に対して、Ｄ’Ｄ３の高親和性バリアント、Ｄ’Ｄ３（ＥＹＡ）を用いて同じ発現戦略を適用した。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００ステップでのタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃｏｍｍａｓｓｉｅ，トリスグリシン）。Ｍ：ＳｅｅＢｌｕｅマーカー，ＴＨ：Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体。Ｆ：対照Ｄ’Ｄ３－ＦＰ、単量体および二量体。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体を介したマウスＲＢＣへのｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ結合。（Ａ）Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９構築物を滴定し、１２．５ＩＵ／ｍｌヒトｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎと共にインキュベーションした。ヒトＶＷＦ（１２．５ＩＵ／ｍｌ）を、所定の場所で添加した。洗浄したマウスＲＢＣ（１：１００全血）を、３７℃でタンパク質混合物に添加した。フローサイトメトリー。ＳＳＣ／ＦＳＣおよびＴＥＲ１１９－ＰＥ ＭＡｂによりゲーティングされたＲＢＣ。検出：ポリクローナルマウス抗ヒトＦＶＩＩＩ－ＦＩＴＣ、２０μｇ／ｍｌ。Ｄ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９：ｎ＝１；Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９：ｎ＝３（独立した実験、２バッチ）。（Ｂ）バッチ＃２を用いたＤ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９±ＶＷＦのＫＭを計算するためのミカエリスメンテン動態の例示的な適合。 ｉｎ ｖｉｖｏ試験計画のスキーム。ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスの予防処置。ＦＶＩＩＩ ＫＯマウス（ｎ＝１０）、毎週、５回静脈内注射。処置群：ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ（２０００ＩＵ／ｋｇ；１６０μｇ／ｋｇ）をＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体（８４０μｇ／ｋｇ、バッチ＃１またはバッチ＃２）と共投与した。 ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスの予防処置。ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎをＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９と共にまたはなしで投与した後のＦＶＩＩＩ ｋｏマウスの抗ＦＶＩＩＩ－抗体生成およびその抑制効果の結果。対照ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスはｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎのみで処置した。試験群は、ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎをＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９と共投与して処置した。（Ａ）ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおいて、ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎをＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９と共にまたはなしで投与した（バッチ１またはバッチ２）後の抗ＦＶＩＩＩ－抗体生成（ＥＬＩＳＡ ＯＤの減衰（ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ）の和）および（Ｂ）その抑制効果（ベセスダ単位）。（Ｃ）ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおいて、ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎをＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９と共にまたはなしで投与した後の抗ＦＶＩＩＩ－抗体生成およびその抑制効果の比較。 ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおける長期寛容を調査するための治療戦略の模式表示。処置：（ａ）１７００ＩＵ／ｋｇのｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎおよび（ｂ）Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体、６７２μｇ／ｋｇとの共投与。４回の注射、ｉ．ｖ．毎週。２８日目に中間出血。４９日目および５６日目に１２０ＩＵ／ｋｇで再チャレンジ。６３日目に終末出血および試験終了予定。 ｒＦＶＩＩＩと組み合わせたＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９処置の効果を示すグラフ表示。中間（２８日目）および終末（６３日目）出血時の対照（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ単独）および処置群（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ＋Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９）：１７００ＩＵ／ｋｇ ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ単独およびＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体、６７２μｇ／ｋｇと共投与。抗ＦＶＩＩＩ抗体は、（Ａ）ＦＶＩＩＩ ＡＤＡ ＥＬＩＳＡにより測定した。各滴定に適合した１／２００希釈時のＯＤに対応するＯＤ_２００（標準）に対するＯＤ_２００（サンプル）予測比に基づいて解釈を行った。統計解析には、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定とＤｕｎｎの多重比較検定を使用した；^＊ｐ＜０．０５，^＊＊＊ｐ＝０．０００５，ｎｓ＝有意ではない。 ＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおける血漿（Ａ）およびペレット（Ｂ）のＦＶＩＩＩレベル。血漿または全血から遠心分離して再懸濁させたペレットで測定したＦＶＩＩＩ発色活性。マウスの３つの群に、２００ＩＵ／ｋｇのｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎを単独で、またはＦＶＩＩＩとその結合パートナーＤ’Ｄ３との等しいモル比１～４でＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＦＰ（１００μｇ／ｋｇ、ＣＳＬ６２９）またはＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体（８４μｇ／ｋｇ）と共投与し、投与後５分、３、８、１６、２４、４８、７２および９６時間でサンプルを採取した。Ｎ＝３。データは、平均値およびモデル化された曲線として与えられる。 図１１－１の続き。

詳細な説明
本発明は、（ｉ）ＶＷＦ部分と（ｉｉ）赤血球結合部分とを含むポリペプチドであって、上記ポリペプチドは血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができる、ポリペプチドに関する。

ＶＷＦ部分
本明細書で使用される用語「フォンウィルブランド因子」（ＶＷＦ）は、自然発生の（天然）ＶＷＦだけでなく、そのバリアント、例えば１つまたはそれ以上の残基が挿入、削除、または置換されている配列バリアントも含む。

一実施形態では、ＶＷＦは、配列番号１８に示されるアミノ酸配列によって表されるヒトＶＷＦである。配列番号１８をコードするｃＤＮＡは、配列番号１７に示される。

ヒト天然ＶＷＦをコードする遺伝子は、９ｋｂのｍＲＮＡに転写され、これは、推定分子量３１０，０００Ｄａの２８１３個のアミノ酸のプレ－プロポリペプチド（ｐｒｅ－ｐｒｏ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）に翻訳される。プレ－プロポリペプチドは、Ｎ末端の２２個のアミノ酸のシグナルペプチド、それに続く７４１個のアミノ酸のプロ－ポリペプチド（配列番号１８のアミノ酸２３－７６３）、および成熟サブユニット（配列番号１８のアミノ酸７６４－２８１３）を含む。Ｎ末端から７４１個のアミノ酸のプロポリペプチドが切断されると、２０５０個のアミノ酸からなる成熟ＶＷＦが得られる。ヒト天然ＶＷＦプレ－プロポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１８に示されている。特に明記しない限り、本願におけるＶＷＦ残基のアミノ酸番号付けは、ＶＷＦ分子、特に切断型ＶＷＦが配列番号１８の全ての残基を含んでいなくても、配列番号１８を参照する。

天然ＶＷＦのプロポリペプチドは、複数のドメインを含む。異なるドメインアノテーションは、文献（例えば、Ｚｈｏｕら（２０１２）Ｂｌｏｏｄ １２０（２）：４４９－４５８）に見出すことができる。本願では、ＶＷＦ天然プレ－プロポリペプチドの以下：
Ｄ１－Ｄ２－Ｄ’－Ｄ３－Ａ１－Ａ２－Ａ３－Ｄ４－Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－ＣＫ
のドメインアノテーションを適用する。

配列番号１８を参照すると、Ｄ’ドメインは、アミノ酸７６４～８６５からなり；そしてＤ３ドメインは、アミノ酸８６６～１２４２からなる。

本明細書で使用される用語「ＶＷＦ部分」は、配列番号１８に示されるヒトＶＷＦとアミノ酸配列類似性を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのフラグメントを指す。配列類似性は、配列同一性が少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％となるようなものであることが好ましい。

一実施形態では、ＶＷＦ部分は、切断型ＶＷＦを含むか、または実質的にそれからなる。本発明の用語における特徴「切断型」は、ポリペプチドが成熟ＶＷＦの全アミノ酸配列（例えば、配列番号１８のアミノ酸７６４～２８１３）を含んでいないことを意味する。この実施形態によれば、ＶＷＦ部分は、配列番号１８の全アミノ酸７６４～２８１３を含んでいるわけではなく、典型的にはそのフラグメントのみを含む。切断型ＶＷＦは、ＶＷＦフラグメント、または複数形でもＶＷＦフラグメントと呼ばれる。

典型的には、ＶＷＦ部分は、第ＶＩＩＩ因子と結合することができる。好ましくは、ＶＷＦ部分は、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合することができる。別の実施形態では、ＶＷＦ部分は、組換えＦＶＩＩＩ、例えば、Ｂドメイン欠失または単鎖ＦＶＩＩＩに結合することができる。ＶＷＦ部分のＦＶＩＩＩへの結合は、ＷＯ２０１０／０８７２７１Ａ１の実施例２に記載されるような結合アッセイによって決定することができる。

本発明のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の成熟形態に結合することができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｂドメイン欠失または単鎖ＦＶＩＩＩなどの組換えＦＶＩＩＩに結合することができる。本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩへの結合は、ＷＯ２０１０／０８７２７１Ａ１の実施例２に記載されるような結合アッセイによって決定することができる。

本発明のＶＷＦ部分は、好ましくは、配列番号１８のアミノ酸７７６～８０５に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７７６～８０５に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合することができる。一実施形態では、ＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７７６～８０５を含むか、またはそれらからなる。本明細書において特に明記しない限り、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号１８のアミノ酸７７６～８０５）の全長にわたって決定される。

本発明のＶＷＦ部分は、好ましくは、配列番号１８のアミノ酸７６６～８６４に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＦＶＩＩＩと結合することができる。好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７６６～８６４に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合することができる。一実施形態では、ＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７６６～８６４を含むか、またはそれらからなる。

別の好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩと結合することができるならば、そのフラグメントからなる。より好ましくは、ＶＷＦ部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩに結合することができるならば、そのフラグメントからなる。一実施形態では、ＶＷＦ部分は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸７６４～１２４２、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩに結合することができるならば、そのフラグメントからなる。

以下に、より詳細に説明するように、本発明のポリペプチドは、ＶＷＦ部分を含むポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を使用する方法によって調製することができる。核酸は、それ自体知られている技術により、適切な宿主細胞に導入される。

好ましい実施形態では、宿主細胞中の核酸は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸１～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩに結合できるならば、そのフラグメントをコードする。より好ましくは、核酸は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸１～１２４２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩに結合することができるならば、そのフラグメントをコードする。一実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１８のアミノ酸１～１２４２、または（ｂ）ＶＷＦ部分が依然としてＦＶＩＩＩに結合することできるならば、そのフラグメントをコードする。特に、本発明によるポリペプチドが二量体である場合、核酸は、ポリペプチド中のＶＷＦ部分がＶＷＦ（例えば配列番号１８）のアミノ酸１～７６３を含んでいなくても、ＶＷＦのアミノ酸１～７６３をコードする配列も含むことになる。

好ましい実施形態による本発明のポリペプチドのＶＷＦ部分は、配列番号１８のＶＷＦのアミノ酸配列１～７６３を含まなくてもよい。

さらなる好ましい実施形態によれば、ＶＷＦ部分は、それぞれ配列番号１８を参照して、以下のアミノ酸配列のうちの１つを含むか、またはそれからなる：
７７６－８０５；７６６－８０５；７６４－８０５；７７６－８１０；７６６－８１０；７６４－８１０；７７６－８１５；７６６－８１５；７６４－８１５；
７７６－８２０；７６６－８２０；７６４－８２０；７７６－８２５；７６６－８２５；７６４－８２５；７７６－８３０；７６６－８３０；７６４－８３０；
７７６－８３５；７６６－８３５；７６４－８３５；７７６－８４０；７６６－８４０；７６４－８４０；７７６－８４５；７６６－８４５；７６４－８４５；
７７６－８５０；７６６－８５０；７６４－８５０；７７６－８５５；７６６－８５５；７６４－８５５；７７６－８６０；７６６－８６０；７６４－８６０；
７７６－８６４；７６６－８６４；７６４－８６４；７７６－８６５；７６６－８６５；７６４－８６５；７７６－８７０；７６６－８７０；７６４－８７０；
７７６－８７５；７６６－８７５；７６４－８７５；７７６－８８０；７６６－８８０；７６４－８８０；７７６－８８５；７６６－８８５；７６４－８８５；
７７６－８９０；７６６－８９０；７６４－８９０；７７６－８９５；７６６－８９５；７６４－８９５；７７６－９００；７６６－９００；７６４－９００；
７７６－９０５；７６６－９０５；７６４－９０５；７７６－９１０；７６６－９１０；７６４－９１０；７７６－９１５；７６６－９１５；７６４－９１５；
７７６－９２０；７６６－９２０；７６４－９２０；７７６－９２５；７６６－９２５；７６４－９２５；７７６－９３０；７６６－９３０；７６４－９３０；
７７６－９３５；７６６－９３５；７６４－９３５；７７６－９４０；７６６－９４０；７６４－９４０；７７６－９４５；７６６－９４５；７６４－９４５；
７７６－９５０；７６６－９５０；７６４－９５０；７７６－９５５；７６６－９５５；７６４－９５５；７７６－９６０；７６６－９６０；７６４－９６０；
７７６－９６５；７６６－９６５；７６４－９６５；７７６－９７０；７６６－９７０；７６４－９７０；７７６－９７５；７６６－９７５；７６４－９７５；
７７６－９８０；７６６－９８０；７６４－９８０；７７６－９８５；７６６－９８５；７６４－９８５；７７６－９９０；７６６－９９０；７６４－９９０；
７７６－９９５；７６６－９９５；７６４－９９５；７７６－１０００；７６６－１０００；７６４－１０００；７７６－１００５；７６６－１００５；７６４－１００５；
７７６－１０１０；７６６－１０１０；７６４－１０１０；７７６－１０１５；７６６－１０１５；７６４－１０１５；７７６－１０２０；７６６－１０２０；７６４－１０２０；
７７６－１０２５；７６６－１０２５；７６４－１０２５；７７６－１０３０；７６６－１０３０；７６４－１０３０；７７６－１０３５；７６６－１０３５；７６４－１０３５；
７７６－１０４０；７６６－１０４０；７６４－１０４０；７７６－１０４５；７６６－１０４５；７６４－１０４５；７７６－１０５０；７６６－１０５０；７６４－１０５０；
７７６－１０５５；７６６－１０５５；７６４－１０５５；７７６－１０６０；７６６－１０６０；７６４－１０６０；７７６－１０６５；７６６－１０６５；７６４－１０６５；
７７６－１０７０；７６６－１０７０；７６４－１０７０；７７６－１０７５；７６６－１０７５；７６４－１０７５；７７６－１０８０；７６６－１０８０；７６４－１０８０；
７７６－１０８５；７６６－１０８５；７６４－１０８５；７７６－１０９０；７６６－１０９０；７６４－１０９０；７７６－１０９５；７６６－１０９５；７６４－１０９５；
７７６－１１００；７６６－１１００；７６４－１１００；７７６－１１０５；７６６－１１０５；７６４－１１０５；７７６－１１１０；７６６－１１１０；７６４－１１１０；
７７６－１１１５；７６６－１１１５；７６４－１１１５；７７６－１１２０；７６６－１１２０；７６４－１１２０；７７６－１１２５；７６６－１１２５；７６４－１１２５；
７７６－１１３０；７６６－１１３０；７６４－１１３０；７７６－１１３５；７６６－１１３５；７６４－１１３５；７７６－１１４０；７６６－１１４０；７６４－１１４０；
７７６－１１４５；７６６－１１４５；７６４－１１４５；７７６－１１５０；７６６－１１５０；７６４－１１５０；７７６－１１５５；７６６－１１５５；７６４－１１５５；
７７６－１１６０；７６６－１１６０；７６４－１１６０；７７６－１１６５；７６６－１１６５；７６４－１１６５；７７６－１１７０；７６６－１１７０；７６４－１１７０；
７７６－１１７５；７６６－１１７５；７６４－１１７５；７７６－１１８０；７６６－１１８０；７６４－１１８０；７７６－１１８５；７６６－１１８５；７６４－１１８５；
７７６－１１９０；７６６－１１９０；７６４－１１９０；７７６－１１９５；７６６－１１９５；７６４－１１９５；７７６－１２００；７６６－１２００；７６４－１２００；
７７６－１２０５；７６６－１２０５；７６４－１２０５；７７６－１２１０；７６６－１２１０；７６４－１２１０；７７６－１２１５；７６６－１２１５；７６４－１２１５；
７７６－１２２０；７６６－１２２０；７６４－１２２０；７７６－１２２５；７６６－１２２５；７６４－１２２５；７７６－１２３０；７６６－１２３０；７６４－１２３０；
７７６－１２３５；７６６－１２３５；７６４－１２３５；７７６－１２４０；７６６－１２４０；７６４－１２４０；７７６－１２４２；７６６－１２４２；７６４－１２４２；
７６４－１４６４；７６４－１２５０；７６４－１０４１；７６４－８２８；７６４－８６５；７６４－１０４５；７６４－１０３５；７６４－１１２８；７６４－１１９８；
７６４－１２６８；７６４－１２６１；７６４－１２６４；７６４－１４５９；７６４－１４６３；７６４－１４６４；７６４－１６８３；７６４－１８７３；７６４－１４８２；
７６４－１４７９；７６４－１６７２；および７６４－１８７４。

他の実施形態では、ＶＷＦ部分は、ＶＷＦ部分がＦＶＩＩＩに結合できるならば、前の段落で記載されたアミノ酸配列の１つに対して少なくとも９０％、または少なくとも９１％、または少なくとも９２％、または少なくとも９３％、または少なくとも９４％、または少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

特定の実施形態では、ＶＷＦ部分は、成熟野生型ＶＷＦと比較して内部欠失を有する。例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、ＣＫドメインまたはそれらの組み合わせは欠失されてもよく、Ｄ’ドメインおよび／またはＤ３ドメインは保持される。さらなる実施形態によれば、ＶＷＦ部分は、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６またはＣＫのうちの１つまたはそれ以上を欠いている。さらなる実施形態によれば、ＶＷＦ部分は、配列番号４のアミノ酸１２４３～２８１３、すなわち、ドメインＡ１－Ａ２－Ａ３－Ｄ４－Ｃ１－Ｃ２－Ｃ３－Ｃ４－Ｃ５－Ｃ６－ＣＫを欠いている。

さらなる実施形態では、本発明のＶＷＦ部分またはポリペプチドは、血小板糖タンパク質Ｉｂα（ＧＰＩｂα）、コラーゲンおよび／またはインテグリンαＩＩｂβＩＩＩ（Ｃ１ドメイン内のＲＧＤＳ配列）に対する結合部分を含まない。他の実施形態では、本発明のＶＷＦ部分またはポリペプチドは、ＶＷＦの中心Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３の切断部位（Ｔｙｒ１６０５－Ｍｅｔ１６０６）を含まない。さらに別の実施形態では、本発明のＶＷＦ部分またはポリペプチドは、ＧＰＩｂαに対する結合部分を含まず、かつ／またはコラーゲンに対する結合部位を含まず、かつ／またはインテグリンαＩＩｂβＩＩＩに対する結合部分を含まず、かつ／またはＶＷＦの中心Ａ２ドメインに位置するＡＤＡＭＴＳ１３の切断部分（Ｔｙｒ１６０５－Ｍｅｔ１６０６）を含まない。好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分または本発明のポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸１６９１～１９０５を含まない。別の好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分または本発明のポリペプチドは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０４２７５として寄託されたアミノ酸配列のアミノ酸１６９１～１９０５を含まない。別の好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分または本発明のポリペプチドは、ヒトＶＷＦのアミノ酸１６９１～１９０５を含まない。

別の実施形態では、ポリペプチドは、ＶＷＦドメインＡ１およびＡ３またはその一部を含まず、コラーゲンＩ型およびＩＩＩ型に対する親和性が低いか、または本質的に親和性がなく、上記親和性が低いまたは本質的にないということは、ポリペプチドのコラーゲンＩ型およびＩＩＩ型への結合に関する解離定数Ｋ_Ｄ＞１０μＭを特徴とする。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの２つの単量体が共有結合している場合、本発明において「二量体」と称する。好ましくは、共有結合は、本発明のポリペプチドのＶＷＦ部分内に位置する。好ましくは、２つの単量体サブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して、例えば１、２、３または４個のジスルフィド架橋により共有結合されている。少なくとも１つのジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、好ましくは、本発明のポリペプチドのＶＷＦ部分内に位置する。一実施形態では、これらのシステイン残基は、Ｃｙｓ－１０９９、Ｃｙｓ－１１４２、Ｃｙｓ－１２２２、Ｃｙｓ－１２２５、もしくはＣｙｓ－１２２７、またはそれらの組み合わせである。好ましくは、本発明の二量体ポリペプチドは、ポリペプチドのＶＷＦ部分内に位置する上記共有結合に加えて、単量体を連結するさらなる共有結合をなんら含んでおらず、特にポリペプチドのＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ部分内に位置するさらなる共有結合をなんら含まない。しかしながら、代替の実施形態によれば、本発明の二量体ポリペプチドは、単量体を連結するポリペプチドのＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ部分内に位置する共有結合を含んでもよい。

二量体は、好ましくはヘテロ二量体である。本発明のポリペプチドが二量体である場合、各単量体は、好ましくは独立して、配列番号１８のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、アミノ酸７６４～１２２７またはアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＦＶＩＩＩに結合することができる。好ましい実施形態では、各サブユニット中のＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、アミノ酸７６４～１２２７またはアミノ酸７６４～１２４２に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を独立して含むか、または実質的にそれからなり、ＦＶＩＩＩに結合することができる。一実施形態では、各単量体のＶＷＦ部分は、配列番号１８のアミノ酸７６４～１０９９、アミノ酸７６４～１１４２、アミノ酸７６４～１２２２、アミノ酸７６４～１２２５、アミノ酸７６４～１２２７またはアミノ酸７６４～１２４２を含むか、または実質的にそれからなる。

ＶＷＦ部分は、ＷＯ２０１３／１０６７８７Ａ１、ＷＯ２０１４／１９８６９９Ａ２、ＷＯ２０１１／０６０２４２Ａ２またはＷＯ２０１３／０９３７６０Ａ２に開示されたＶＷＦフラグメントのいずれか１つであってもよいし、または実質的にそれからなってもよく、これらの開示は、参照により本書に組み込まれる。

さらなる好ましい実施形態によれば、上記開示されたようなＶＷＦ部分は、ＷＯ２０１６／００００３９Ａ１またはＷＯ２０１７／１１７６３１Ａ１に開示されたようなアミノ酸置換の少なくとも１つを含んでもよい。ＶＷＦ部分のそれらの改変バージョンは、配列番号１８による野生型ＶＷＦのＤ’ドメインのアミノ酸配列と比較して、そのＤ’ドメイン内に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。ＶＷＦ部分の改変バージョンのアミノ酸配列は、それぞれの野生型配列と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有することができる。改変型ＶＷＦ部分のＤ’ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１８のＤ’ドメインに対して１または２または３個のアミノ酸置換を有する。配列番号２０の位置１に対応する配列番号１８の位置７６４のＳが、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｅ、Ｙ、ＡおよびＬからなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることが好ましい。また、配列番号２０の位置３に対応する、配列番号１８の位置７６６のＳが、Ｙ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ、Ｈ、ＲおよびＷからなる群から選択されるアミノ酸で置換されていることも好ましい。配列番号１８の位置１０８３のＶがアミノ酸アラニン（Ａ）で置換されていることがさらに好ましい。好ましい置換の組み合わせとしては、配列番号１８の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＧＹＡ）、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＥＹＡ）およびＳ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＹＡ）が含まれる。最も好ましいのは、配列番号１８の配列を参照し、置換Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａ（ＥＹＡ）の組み合わせである。

本発明のポリペプチドのＦＶＩＩＩに対する結合親和性は、上記置換の導入によって、上記改変を除いて同じアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドの結合親和性と比較してさらに増加し得る。ＶＷＦ部分内の上記置換は、共投与されたＦＶＩＩＩの半減期、または共投与されたＦＶＩＩＩの安定性の増加に寄与し得る。

赤血球結合部分
「赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）」、「赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌ）」および「ＲＢＣ」という用語は、同じ意味を有し、本明細書において互換的に使用される。

赤血球結合部分は、好ましくは、赤血球、好ましくはヒト赤血球の表面に露出した分子に結合することができるペプチドまたはポリペプチドである。好ましくは、赤血球の表面に露出した分子は、赤血球、好ましくはヒト赤血球の表面上の膜タンパク質である。より好ましくは、赤血球、好ましくはヒト赤血球の表面に露出した分子は、Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）、アクアポリン－１、Ｇｌｕｔ－１、Ｋｉｄｄ抗原、ＲｈＡｇ／Ｒｈ５０（ＣＤ２４１）、Ｒｈ（ＣＤ２４０）、Ｒｈ３０ＣＥ（ＣＤ２４０ＣＥ）、Ｒｈ３０Ｄ（ＣＤ２４０Ｄ）、Ｋｘ、グリコフォリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコフォリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコフォリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、グリコフォリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）、Ｋｅｉｌ（ＣＤ２３８）、Ｄｕｆｆｙ／ＤＡＲＣｉ（ＣＤ２３４）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、グロボシド、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ－４（ＣＤ２４２）、Ｌｕ／Ｂ－ＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＸＧ１／ＸＧ２（ＣＤ９９）、ＥＭＭＰＲＩＮ／ニューロセリン（ＣＤ１４７）、ＪＭＨ、グリコシルトランスフェラーゼ、カートライト（Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ）、ドンブロック（Ｄｏｍｂｒｏｃｋ）、Ｃ４Ａ／ＣＡＢ、Ｓｃｉｍｍａ、ＭＥＲ２、ストマチン、ＢＡ－Ｉ（ＣＤ２４）、ＧＰＩＶ（ＣＤ３６）、ＣＤ１０８、ＣＤ１３９およびＨ抗原（Ｈａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＤ１７３）からなる群から選択される。

好ましくは、赤血球結合部分は、グリコフォリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコフォリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコフォリンＣ（ＣＤ２３５ｃ）、およびグリコフォリンＤ（ＣＤ２３５ｄ）からなる群から選択される分子に特異的に結合することができるペプチドまたはポリペプチドである。最も好ましくは、グリコフォリンＡ（ＣＤ２３５ａ）に特異的に結合することができる赤血球結合部分。

適切な赤血球結合部分は、ＷＯ２０１９／０７５５２３Ａ１、ＷＯ２０１４／１３５５２８Ａ１、ＷＯ２０１８／０９３７６６Ａ１、ＷＯ２０１３／１２１２９６Ａ１およびＷＯ２０１２／０２１５１２Ａ２に記載されており、これらの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。ヒト赤血球に結合する赤血球結合部分の例には、配列番号２１もしくは配列番号２３を含む、または本質的にそれからなるポリペプチドが含まれる。配列番号２１は、ＷＯ２０１４／１３５５２８Ａ１に開示されたＩＨ４と称するＶＨＨナノボディの例示的なアミノ酸配列を示す。配列番号２３は、ハイブリドーマＧ２６．４．１Ｃ３／８６［ＲＡＴ １Ｃ３／８６］（ＡＴＣＣ^(R) ＨＢ－９８９３^ＴＭ）から得られるｓｃＦｖ １Ｃ３を示す。

適切な赤血球結合部分は、ファージディスプレイ（例えば、ＷＯ２０１８／０９３７６６Ａ１に記載されているような、およびハイブリドーマ技術によって提供することができる。

好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＶＷＦ部分および赤血球結合部分が、場合によりリンカー配列を介して融合されている、融合タンパク質である。

半減期延長部分（ＨＬＥＭ）
ＶＷＦ部分および赤血球結合部分に加えて、本発明のポリペプチドは、ある好ましい実施形態において、半減期延長部分をさらに含んでもよい。半減期延長部分は、ＶＷＦ部分に融合された異種アミノ酸配列であってもよい。あるいは、半減期延長部分は、ペプチド結合とは異なる共有結合によって、ＶＷＦ部分を含むポリペプチドに化学的にコンジュゲートされていてもよい。好ましくは、半減期延長部分は、二量体化または多量体化を誘導しない。好ましくは、半減期延長部分は、二量体または多量体を形成することができない。

本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドの半減期は、化学修飾、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ化）、グリコシル化ＰＥＧ、ヒドロキシルエチルスターチ（ＨＥＳ化）、ポリシアル酸、エラスチン様ポリペプチド、ヘパロサンポリマーまたはヒアルロン酸などの半減期延長部分の付加によって延長される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、化学的リンカーを介してアルブミンのようなＨＬＥＭにコンジュゲートされる。このコンジュゲーション技術の原理は、Ｃｏｎｊｕｃｈｅｍ ＬＬＣによって例示的に記載されている（例えば、米国特許第７，２５６，２５３号参照）。

他の実施形態では、半減期延長部分は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である。好ましくは、ＨＬＥＰは、アルブミンまたはそのフラグメントである。アルブミンのＮ末端は、ＶＷＦ部分のＣ末端に融合されてもよい。あるいは、アルブミンのＣ末端は、ＶＷＦ部分のＮ末端に融合されてもよい。ＶＷＦ部分のＦＶＩＩＩへの結合能力を妨害または消失させないならば、１つまたはそれ以上のＨＬＥＰがＶＷＦ部分のＮ末端またはＣ末端に融合されてもよい。

組換えポリペプチドは、好ましくは、ＶＷＦ部分とＨＬＥＭとの間に位置する共有結合、またはＶＷＦ部分とＨＬＥＰの間に位置するリンカー配列をさらに含む。

上記リンカー配列は、１つまたはそれ以上のアミノ酸、特に１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個または１～３個（例えば１、２または３個）のアミノ酸からなり、互いに同等または異なっていてもよいペプチドリンカーであり得る。好ましくは、リンカー配列は、野生型ＶＷＦの対応する位置には存在しない。上記リンカー配列に存在する好ましいアミノ酸としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが含まれる。リンカー配列は、非免疫原性でなければなない。好ましいリンカーは、グリシン残基とセリン残基を交互にして構成されてもよい。適切なリンカーは、例えば、ＷＯ２００７／０９０５８４Ａ１に記載されている。

本発明の別の実施形態では、ＶＷＦ部分とＨＬＥＰとの間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーまたは配列として機能するペプチド配列からなる。好ましくは、このようなペプチド配列は、その自然環境において、この配列に対する自己寛容を担うことができるように、タンパク質表面の近くに位置し、免疫系にアクセス可能である。例は、ＷＯ２００７／０９０５８４Ａ１に示されている。切断可能なリンカー配列は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載されている。

組換えポリペプチドの好ましい実施形態では、ＶＷＦ部分とＨＬＥＰとの間のリンカーは、配列番号２のアミノ酸配列４８０～５１０を有するかまたはそれからなるグリシン／セリンペプチドのリンカーである。

一実施形態では、ポリペプチドは、以下の構造を有する。
ＶＷＦＭ－Ｌ１－Ｈ－Ｌ２－ＥＢＭ、［式１］
式中、ＶＷＦＭはＶＷＦ部分であり、Ｌ１は化学結合またはリンカー配列であり、ＨはＨＬＥＭ、特にＨＬＥＰであり、Ｌ２は化学結合またはリンカー配列であり、ＥＢＭは赤血球結合部分である。

Ｌ１およびＬ２は、独立して化学結合、または１つまたはそれ以上のアミノ酸、例えば１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～５個もしくは１～３個（例えば１、２もしくは３個）のアミノ酸からなり、互いに同等または異なってもよいリンカー配列であってもよい。通常、リンカー配列は、野生型ＶＷＦの対応する位置には存在しない。Ｌ１および／またはＬ２に存在する適切なアミノ酸の例としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが含まれる。リンカーは非免疫原性でなければならず、切断不可能なまたは切断可能なリンカーであってもよい。切断不可能なリンカーは、ＷＯ２００７／０９０５８４Ａ１に例示されているように、グリシン残基とセリン残基を交互にして構成されてもよい。本発明の別の実施形態では、ＶＷＦ部分とアルブミン部分との間のペプチドリンカーは、ヒトタンパク質における天然ドメイン間リンカーまたは配列として機能するペプチド配列からなる。好ましくは、このようなペプチド配列は、その自然環境において、この配列に対する自己寛容を担うことできるように、タンパク質表面の近くに位置し、免疫系にアクセス可能である。例は、ＷＯ２００７／０９０５８４Ａ１に示されている。切断可能なリンカー配列は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に記載されている。

好ましいＨＬＥＰ配列は、下に記載されている。同様に本発明に包含されるのは、それぞれのＨＬＥＰの正確な「Ｎ末端アミノ酸」もしくは正確な「Ｃ末端アミノ酸」への融合、またはＨＬＥＰの１つもしくはそれ以上のアミノ酸のＮ末端欠失を含む、それぞれのＨＬＥＰの「Ｎ末端部」もしくは「Ｃ末端部」への融合である。ポリペプチドは、１つより多いＨＬＥＰ配列、例えば２つまたは３つのＨＬＥＰ配列を含んでもよい。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、タンデムに、例えば連続した繰り返しとして、ＶＷＦのＣ末端部に融合されてもよい。

半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）
好ましくは、半減期延長部分は、半減期増強ポリペプチド（ＨＬＥＰ）である。より好ましくは、ＨＬＥＰは、アルブミン、アルブミン－ファミリーのメンバーまたはそのフラグメント、大きな流体力学的体積を有する溶媒和ランダム鎖（例えば、ＸＴＥＮ（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら、２００９；Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７：１１８６－１１９０）、ホモアミノ酸リピート（ＨＡＰ）またはプロリン－アラニン－セリンリピート（ＰＡＳ）、アファミン、アルファ－フェトプロテイン、ビタミンＤ結合タンパク質、トランスフェリンまたはそのバリアントもしくはフラグメント、ヒト絨毛性ゴナドトロピン－βサブユニットのカルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰ）、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができるポリペプチド、特に免疫グロブリン定常領域およびその一部、例えば、Ｆｃフラグメント、アルブミンに、アルブミンファミリーのメンバーもしくはそのフラグメントに、または免疫グロブリン定常領域もしくはその一部に生理学的条件下で結合することができるポリペプチドまたは脂質からなる群から選択される。免疫グロブリン定常領域またはその一部は、好ましくは、免疫グロブリンＧ１のＦｃフラグメント、免疫グロブリンＧ２のＦｃフラグメントまたは免疫グロブリンＡのＦｃフラグメントである。

好ましくは、ＨＬＥＰは、二量体化または多量体化を誘導しない。好ましくは、ＨＬＥＰは、二量体または多量体を形成することができない。

本明細書で使用される半減期増強ポリペプチドは、本明細書に記載された全長半減期増強タンパク質、または凝固因子の治療活性もしくは生物学的活性を安定化もしくは延長することができる、特に本発明のポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる、その１つまたはそれ以上のフラグメントであってもよい。このようなフラグメントは、１０個またはそれ以上のアミノ酸の長さであってもよいし、またはＨＬＥＰ配列から少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでもよいし、またはＨＬＥＰフラグメントが、ＨＬＥＰを含まないそれぞれのポリペプチドと比較して少なくとも２５％の機能半減期延長を提供する限り、それぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部または全部を含んでもよい。

本発明のポリペプチドのＨＬＥＰ部分は、野生型ＨＬＥＰのバリアントであってもよい。用語「バリアント」は、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失および置換を含み、このような変化はＶＷＦ部分のＦＶＩＩＩ結合活性を実質的に変化させない。

特に、本発明の提案されたＶＷＦ部分－ＨＬＥＰ融合構築物は、ＨＬＥＰの天然に存在する多型バリアントおよびＨＬＥＰのフラグメントを含んでもよい。ＨＬＥＰは、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来してもよい。非哺乳動物のＨＬＥＰには、雌鶏およびサケが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

本開示の特定の実施形態によれば、本発明の組換えポリペプチドのＨＬＥＭ、特にＨＬＥＰ部分は、代替用語「ＦＰ」により特定されてもよい。好ましくは、用語「ＦＰ」は、ヒトアルブミンを表す。

特定の好ましい実施形態によれば、組換えポリペプチドは、融合タンパク質である。本発明に関する融合タンパク質は、ＶＷＦ部分およびＨＬＥＰをコードする少なくとも２つのＤＮＡ配列のインフレーム結合によって作成されたタンパク質である。当業者は、融合タンパク質ＤＮＡ配列の翻訳が単一タンパク質配列になることを理解する。さらなる好ましい実施形態によるペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列のインフレーム挿入の結果として、ＶＷＦ部分、適切なリンカーおよびＨＬＥＰを含む融合タンパク質を得ることができる。

いくつかの実施形態によれば、合剤化された（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されたＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ構造をいずれも含まない。特定の他の実施形態によれば、合剤化されたＦＶＩＩＩは、本明細書に記載されたＨＬＥＭまたはＨＬＥＰ構造の少なくとも１つを含んでもよい。

ＨＬＥＰとしてのアルブミン
用語、「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）は、本出願において互換的に使用される。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はより広く、ヒト血清アルブミン（ならびにそのフラグメントおよびバリアント）、および他の種からのアルブミン（ならびにそのフラグメントおよびバリアント）を包含する。

本明細書で使用する場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つまたはそれ以上の機能的特性（例えば、生物学的機能）を有する、アルブミンポリペプチドもしくはアミノ酸配列、またはアルブミンフラグメントもしくはバリアントを総称して指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのフラグメント、特に本明細書の配列番号１９に示されるようなヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物からのアルブミンもしくはそのフラグメント、またはこれらの分子もしくはそのフラグメントの類似体もしくはバリアントを指す。

本開示の特定の実施形態によれば、代替用語「ＦＰ」は、ＨＬＥＰを特定するために、特にアルブミンをＨＬＥＰとして定義するために使用される。

特に、本発明の提案されたポリペプチドは、ヒトアルブミンの自然発生の多型バリアントおよびヒトアルブミンのフラグメントを含んでもよい。一般に、アルブミンフラグメントまたはバリアントは、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも４０個、最も好ましくは７０個またはそれ以上のアミノ酸長となる。

本発明の好ましい実施形態は、ＦｃＲｎ受容体への結合が強化された本発明のポリペプチドのＨＬＥＰとして使用されるアルブミンバリアントを含む。このようなアルブミンバリアントは、野生型アルブミンとのＶＷＦ部分の融合と比較して、ＶＷＦ部分アルブミンバリアント融合タンパク質のより長い血漿半減期を誘導し得る。

本発明のポリペプチドのアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的修飾を含んでもよい。

ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）は、治療用タンパク質の半減期を増加させることが当技術分野で知られている（Ｄｕｍｏｎｔ Ｊ Ａら、２００６．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０：１５１－１６０）。重鎖のＩｇＧ定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１－ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。免疫グロブリン配列は、いずれかの哺乳動物、またはそれぞれサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来であってもよい。抗原結合ドメインを持たないＩｇＧおよびＩｇＧフラグメントも、ＨＬＥＰとして使用され得る。治療用ポリペプチド部分は、好ましくは抗体のヒンジ領域またはペプチドリンカーを介してＩｇＧまたはＩｇＧフラグメントに連結され、それらは切断可能であってもよい。いくつかの特許および特許出願は、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増強するために、治療用タンパク質を免疫グロブリン定常領域に融合させることを記載している。ＵＳ２００４／００８７７７８およびＷＯ２００５／００１０２５Ａ２は、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と、ペプチドの半減期を増加させるが、そうでない場合は、迅速に体内で除去される生物学的活性ペプチドとの融合タンパク質を記載している。Ｆｃ－ＩＦＮ－β融合タンパク質により、生物学的活性の増強、循環半減期の延長、および溶解度の増加が達成されたことが記載されている（ＷＯ２００６／０００４４８Ａ２）。血清半減期が延長され、ｉｎ ｖｉｖｏでの効力が増加したＦｃ－ＥＰＯタンパク質（ＷＯ２００５／０６３８０８Ａ１）、ならびにＧ－ＣＳＦ（ＷＯ２００３／０７６５６７Ａ２）、グルカゴン様ペプチド－１（ＷＯ２００５／０００８９２Ａ２）、凝固因子（ＷＯ２００４／１０１７４０Ａ２）およびインターロイキン１０（米国特許第６，４０３，０７７号）とのＦｃ融合物は、すべて半減期の増強性を有することが開示された。

好ましくは、ＨＬＥＰとして使用される免疫グロブリンまたはＦｃ部分は、二量体化または多量体化を誘導しない。好ましくは、ＨＬＥＰとして使用される免疫グロブリンまたはＦｃ部分は、二量体または多量体を形成することができない。

本発明により使用することができる様々なＨＬＥＰは、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に詳細に記載されている。

二量体
本発明のポリペプチドは、二量体を高い比率で有してもよい。したがって、本発明のポリペプチドは、好ましくは二量体として存在する。一実施形態では、ポリペプチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９８％が、二量体として存在する。最も好ましくは、本発明の本質的に全てのポリペプチドが二量体として存在する。二量体は、好ましくはヘテロ二量体である。

さらに好ましいのは、本発明のポリペプチドが多量体を含まないことである。二量体は単量体と比較して第ＶＩＩＩ因子への改善された親和性を有するため、二量体の使用が好ましい。本発明のポリペプチドの二量体含有量および二量体と単量体との比率は、例えばＷＯ２０１０／０８７２７１Ａ１の第５６頁、第６～１０行目に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより決定することができる。あるいは、二量体含有量および二量体と単量体との比率は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって決定することができ、本出願の実施例を参照のこと。

特に明記しない限り、本明細書に記載された本発明のポリペプチドのあらゆるモル濃度は、実際にホモ二量体またはヘテロ二量体として存在するかどうかに関わらず、本発明のポリペプチドの二量体のモル濃度を指す。

一実施形態では、本発明のポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子への親和性は、同じ第ＶＩＩＩ因子分子に対するヒト天然ＶＷＦのものよりも大きい。ポリペプチドの第ＶＩＩＩ因子親和性は、ヒト天然の、血漿由来または組換えのいずれかの第ＶＩＩＩ因子、特に切断型または欠失Ｂドメインを有する組換え第ＶＩＩＩ因子分子を指すこともあり得る。

二量体の比率が高い本発明のポリペプチドの調製物は、第ＶＩＩＩ因子に対して増加した親和性を有することが見出されている。また、増加した二量体の比率の代わりに、またはそれと組み合わせて、第ＶＩＩＩ因子結合ドメイン内に変異を有する本発明によるポリペプチドも、第ＶＩＩＩ因子への親和性を増加させる本発明の好ましい実施態様である。適切な変異は、例えば、ＷＯ２０１３／１２０９３９Ａ１に開示されている。

好ましくは、本発明のポリペプチドはヘテロ二量体である。一実施形態では、ヘテロ二量体は、第１のサブユニットと第２のサブユニットとを含み、第１のサブユニットは本明細書に定義された第１のＶＷＦ部分と赤血球結合部分とを含み、第２のサブユニットは本明細書に定義された第２のＶＷＦ部分を含み、第２のサブユニットは赤血球結合部分を含まない。第１および第２のサブユニット（単量体）中のＶＷＦ部分は、好ましくは同一である。

一実施形態では、第２サブユニットは、実質的に第２のＶＷＦ部分からなる。

別の実施形態では、二量体を形成する２つの単量体は、ＶＷＦ部分内のシステイン残基によって形成される少なくとも１つのジスルフィド架橋を介して互いに共有結合されている。１つまたはそれ以上のジスルフィド架橋を形成するシステイン残基は、Ｃｙｓ－１０９９、Ｃｙｓ－１１４２、Ｃｙｓ－１２２５、Ｃｙｓ－１２２７およびそれらの組み合わせ、好ましくはＣｙｓ－１０９９およびＣｙｓ－１１４２からなる群から選択されてもよく、アミノ酸番号付けは配列番号１８を参照のこと。

ポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で知られた方法に従って調製することができる。ヒト天然ＶＷＦのプレ－プロ形態（ｐｒｅ－ｐｒｏ ｆｏｒｍ）のｃＤＮＡ配列（配列番号１７）に基づいて、上記のＶＷＦ部分構築物または本発明のポリペプチドをコードする組換えＤＮＡを設計および産生することができる。

宿主細胞から分泌されるポリペプチドが、ヒトＶＷＦのプレ－プロ形態のアミノ酸１～７６３を含まない場合であっても、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸は（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号１８のアミノ酸２３～７６３または好ましくはアミノ酸１～７６３に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことが好ましい。最も好ましくは、ポリペプチドの細胞内前駆体をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、配列番号１８のアミノ酸２３～７６３、または配列番号１８のアミノ酸１～７６３をコードするヌクレオチド配列を含む。

ＤＮＡが、発現プラスミドに正しい方向で挿入されたオープンリーディングフレーム全体を含む構築物は、タンパク質の発現に使用することができる。典型的な発現ベクターは、プラスミドを持つ細胞において、挿入された核酸に対応する大量のｍＲＮＡの合成を指示するプロモーターを含んでいる。また、宿主生物内でその自律的な複製を可能にする複製配列の起点、および合成されたｍＲＮＡが翻訳される効率を高める配列が含まれていてもよい。安定な長期ベクターは、例えばウイルスの制御要素（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ＶｉｒｕｓゲノムのＯｒｉＰ配列）を用いることにより、自由に複製する実体として維持され得る。また、ベクターをゲノムＤＮＡに組み込んだ細胞株を製造してもよく、このやり方では、遺伝子産物が連続的に生成される。

通常、提供される細胞は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を哺乳類宿主細胞に導入することにより得られる。

細胞培養、および糖タンパク質の発現に感受性のあるあらゆる宿主細胞は、本発明により利用され得る。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳類である。本発明により使用され得る哺乳類細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，オランダ））；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎株（２９３または懸濁培養において増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞，Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ，２３：２４３ ２５１、１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト頸部癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，Ａｎｎａｌｓ ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＰＳ４細胞；ヒト羊膜細胞の細胞（ＣＡＰ）；およびヒト肝細胞がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）。好ましくは、細胞株は、齧歯類細胞株、特にＣＨＯまたはＢＨＫなどのハムスター細胞株、またはヒト細胞株である。

目的の糖タンパク質の発現を達成するのに十分な核酸を哺乳類宿主細胞に導入するのに適した方法は、当技術分野で知られている。例えば、Ｇｅｔｔｉｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０－６２５，１９８１；Ｍａｎｔｅｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０－４６，１９７９；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、ＥＰ０１１７０６０；およびＥＰ０１１７０５８を参照のこと。哺乳類細胞については、遺伝物質を哺乳類細胞に導入する一般的な方法として、Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｒｂのリン酸カルシウム沈殿法（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６－４５７，１９７８）またはＨａｗｌｅｙ－Ｎｅｌｓｏｎのリポフェクタミン^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）Ｍｅｔｈｏｄ（Ｆｏｃｕｓ １５：７３，１９９３）が含まれる。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、Ａｘｅｌによって米国特許第４３９９２１６号に記載されている。哺乳類細胞に遺伝物質を導入するための様々な技術については、Ｋｅｏｗｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７－５３７，１９９０、およびＭａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８－３５２，１９８８を参照のこと。

細胞は、ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養される。ポリペプチドは、当業者に知られた方法を用いて回収および精製することができる。

治療的使用
本発明のポリペプチドは、血友病Ａを含む凝固障害の処置に有用である。用語「血友病Ａ」は、機能的凝固ＦＶＩＩＩにおける欠損のことであり、これは通常、遺伝する。

本発明のさらなる態様は、血液凝固障害を処置する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書において上記定義されるようなポリペプチドの有効量を投与することを含む方法である。

疾患の処置には、いずれかの臨床段階または症状において疾患のいずれかの形態を有すると既に診断された患者の処置；疾患の症状または徴候の発症または進展または憎悪または悪化の遅延；ならびに疾患の重症度の予防および／または軽減が包含される。

本発明のポリペプチドが投与される「対象」または「患者」は、好ましくはヒトである。特定の態様において、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。

本発明のポリペプチドを含む組成物を本明細書に記載する。この組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む、無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者にそれを投与する所望の方法に応じて）いずれかの適切な形態をとることができる。

本発明のポリペプチドは、皮下、皮内または筋肉内などの様々な血管外経路によって患者に投与することができる。いずれか所定の場合における最も適切な投与経路は、特定のポリペプチド、対象、ならびに疾患の性質および重症度ならびに対象の身体状態に依存することになる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、皮下投与されることになる。

一実施形態では、処置は、本発明のポリペプチドを唯一の有効成分として投与することを含む。別の実施形態では、処置は、本発明のポリペプチドを、少なくとも１つのさらなる有効成分と組み合わせて投与することを含む。本発明のポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなる有効成分は、同時に、別々にまたは順次に投与することができる。

好ましくは、さらなる有効成分はＦＶＩＩＩである。したがって、本発明の方法は、好ましくは、有効量のＦＶＩＩＩを患者に投与することを含む。本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、好ましくは皮下に共投与される。

本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩによる総投与回数および処置の長さの決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。本発明のポリペプチドの投与量および投与されるＦＶＩＩＩは、投与されるＦＶＩＩＩの濃度に依存する。また、血液凝固障害の重症度の程度も、本発明のポリペプチドおよび投与されるＦＶＩＩＩの適切な投与量を決定するために考慮され得る。ＦＶＩＩＩの典型的な投与量は、約２０ＩＵ／ｋｇ体重～約１０００ＩＵ／ｋｇ体重、好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重～約５００ＩＵ／ｋｇ体重、さらに好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重～約４００ＩＵ／ｋｇ体重、より好ましくは約２０ＩＵ／ｋｇ体重～約３００ＩＵ／ｋｇ体重の範囲であり得る。

本発明によれば、本発明のポリペプチドで処置される患者は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子でも処置される。本発明のポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子は、好ましくは同時に、すなわち一緒に投与され得るが、逐次的な様式での投与も原則的に実施することができ、投与の両方の様式は、用語「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）」および「共投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」によって包含される。本発明のポリペプチドおよび第ＶＩＩＩ因子は、混合物として、すなわち同じ組成物内で投与してもよいし、または別々に、すなわち別々の組成物として投与してもよい。組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質の共投与は、好ましくは、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質を含む単一の組成物において一緒に投与することによって達成される。さらなる好ましい実施形態によれば、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質の共投与は、単一の組成物中に配合された組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む配合製品を提供することによって、または投与前に混合されるように準備された少なくとも２つの別々の製品のセットもしくはキットを提供し、それによって第１の製品が組換えポリペプチドを含み、第２の製品がＦＶＩＩＩを含むことによって達成される。特に、組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩタンパク質が、共投与の前に混合される別々の組成物または製品で提供される場合、混合物は、投与前に、少なくとも上記組換えポリペプチドの比率が上記ＦＶＩＩＩに結合可能となるような方法で、投与前に処置され得る。例えば、混合物は、一定の時間インキュベートしてもよい。このようなインキュベーションは、周囲温度または、必要に応じて高められた温度のいずれかで、しかし、好ましくは４０℃未満の温度で、１分未満、または５分未満で実施され得る。このような迅速なインキュベーションステップは、単一の組成物中に配合された組換えポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを含む配合製品についての再構成中にも適切であり得る。

使用される組成物中の第ＶＩＩＩ因子の濃度は、典型的には、１０～１０，０００ＩＵ／ｍＬの範囲である。異なる実施形態において、本発明の組成物中のＦＶＩＩＩの濃度は、１０～８，０００ＩＵ／ｍＬ、または１０～５，０００ＩＵ／ｍＬ、または２０～３，０００ＩＵ／ｍＬ、または５０～１，５００ＩＵ／ｍＬ、または３，０００ＩＵ／ｍＬ、または２，５００ＩＵ／ｍＬ、または２，０００ＩＵ／ｍＬ、または１，５００ＩＵ／ｍＬ、または１，２００ＩＵ／ｍＬ、または１，０００ＩＵ／ｍＬ、または８００ＩＵ／ｍＬ、または７５０ＩＵ／ｍＬ、または６００ＩＵ／ｍＬ、または５００ＩＵ／ｍＬ、または４００ＩＵ／ｍＬ、または３００ＩＵ／ｍＬ、または２５０ＩＵ／ｍＬ、または２００ＩＵ／ｍＬ、または１５０ＩＵ／ｍＬ、または１２５ＩＵ／ｍＬ、または１００ＩＵ／ｍＬ、または６２．５ｍＬ、または５０ＩＵ／ｍＬの範囲であるが、但し、本明細書に定義された本発明のＶＷＦポリペプチドに関する比率に関する要件を満たすものとする。

「国際単位」または「ＩＵ」は、国際標準標本に対して「ＩＵ」で較正された標準を用いた一段階凝固アッセイまたは発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイなどのＦＶＩＩＩ活性アッセイによって測定されるＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の測定単位である。一段階凝固アッセイは、例えば、Ｎ Ｌｅｅ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌら，Ａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）３０，５１１ ５１９（１９８３）に記載されたように当業者に知られている。一段階アッセイの原理：試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの改良版として実施される：血漿をリン脂質および表面活性化剤とインキュベートすることにより、内在性凝固系の因子の活性化が誘導される。カルシウムイオンの添加により、凝固カスケードが開始される。測定可能なフィブリン塊が形成されるまでの時間を測定する。このアッセイは第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の存在下で実施される。凝固第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固能は、試験するサンプル中に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子によって回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に含まれる第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、国際単位で第ＶＩＩＩ因子の既知の活性を有する標準製剤と直接比較することにより定量される。もう１つの標準アッセイは、発色基質アッセイである。発色アッセイは、Ｃｏａｍａｔｉｃ^(R) ＦＶＩＩＩ検査キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ Ｖ．ｌｅ Ｍｏｎｚａ ３３８－２０１２８ ミラノ，イタリア）のように商業的に購入してもよい。発色アッセイの原理：カルシウムおよびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子は、第ＩＸａ因子から第Ｘａ因子の活性化される。この反応は補因子として第ＶＩＩＩａ因子によって刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定されるサンプル中のＦＶＩＩＩから、反応混合物中の少量のトロンビンによって生成される。

最適な濃度のＣａ２^＋、リン脂質および第ＩＸａ因子ならびに過剰量の第Ｘ因子を使用した場合、第Ｘ因子の活性化は第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化された第Ｘ因子は発色基質Ｓ－２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。したがって、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出量は、形成されたＦＸａの量に比例し、そのためサンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。

本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを併用療法で使用する場合、投与されるポリペプチドとＦＶＩＩＩとの比率は、以下の「比率」の項において定義されるようないずれかの比率であり得る。別の態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩの半減期の増加に使用するための本発明のポリペプチドに関する。本発明のさらに別の態様は、対象におけるＦＶＩＩＩの半減期を増加させる方法であって、有効量の本発明のポリペプチド、または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法である。本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、対象に同時に、別々にまたは順次に共投与することができる。

さらに別の態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでのインヒビター形成の防止および／または低減に使用するための本発明のポリペプチドに関する。本発明のさらに別の態様は、ＦＶＩＩＩで処置される対象におけるインヒビター形成を低減および／または防止する方法であって、上記方法は、有効量の本発明のポリペプチドを対象に投与することを含む方法である。

第ＶＩＩＩ因子
本明細書で使用する場合、用語「第ＶＩＩＩ因子」または「ＦＶＩＩＩ」は、ヒト天然第ＶＩＩＩ因子の凝固活性の少なくとも一部を有する分子を指す。ヒトＦＶＩＩＩは、２３５１個のアミノ酸（シグナルペプチドを含む）および２３３２個のアミノ酸（シグナルペプチドを含まない）からなる。「ヒト天然ＦＶＩＩＩ」とは、配列番号２０に示すような全長配列（アミノ酸１～２３３２）を有するヒト血漿由来のＦＶＩＩＩ分子である。詳細なドメイン構造、Ａ１－ａ１－Ａ２－ａ２－Ｂ－ａ３－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２は、対応するアミノ酸残基（配列番号２０参照）：Ａ１（１－３３６）、ａ１（３３７－３７２）、Ａ２（３７３－７１０）、ａ２（７１１－７４０）、Ｂ（７４１－１６４８）、ａ３（１６４９－１６８９）、Ａ３（１６９０－２０２０）、Ｃ１（２０２１－２１７３）およびＣ２（２１７４－２３３２）を有する。本明細書で言及されるＦＶＩＩＩは、血漿由来ＦＶＩＩＩ（ｐｄＦＶＩＩＩ）または組換え産生されたＦＶＩＩＩ（リコンビナントＦＶＩＩＩ）であってもよい。

ＦＶＩＩＩ分子の凝固活性は、一段階凝固アッセイ（例えば、Ｌｅｅら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０、５１１ ５１９（１９８３）に記載の通り）または発色基質アッセイ（例えば、ｃｏａｍａｔｉｃ ＦＶＩＩＩ検査キット、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製 ＳｐＡ Ｖ．ｌｅ Ｍｏｎｚａ ３３８－２０１２８ ミラノ，イタリア）を用いて決定することができる。これらの活性アッセイのさらなる詳細を、以下に記載する。

好ましくは、本発明により使用されるＦＶＩＩＩ分子は、ヒト天然ＦＶＩＩＩの比モル活性の少なくとも１０％を有する。用語「比モル活性」は、ＦＶＩＩＩ１モル当たりの凝固活性を指し、例えば「ＩＵ／モル」ＦＶＩＩＩまたは－より簡便には－「ＩＵ／ピコモル」ＦＶＩＩＩで表示される。

好ましい実施形態において、ＦＶＩＩＩ分子は、非自然発生のＦＶＩＩＩ分子である。好ましくは、非自然発生のＦＶＩＩＩ分子は、組換え的に産生されている。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は、細胞培養において産生されている。別の好ましい実施形態において、非自然発生のＦＶＩＩＩ分子は、血漿由来のＦＶＩＩＩのものとは異なるグリコシル化パターンを有する。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ分子は、（ｉ）Ｂドメイン欠失または切断型ＦＶＩＩＩ分子、（ｉｉ）単鎖ＦＶＩＩＩ分子、（ｉｉｉ）組換え産生二鎖ＦＶＩＩＩ分子、（ｉｖ）保護基または半減期延長部分を有するＦＶＩＩＩ分子、（ｖ）異種アミノ酸配列に融合されたＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む融合タンパク質および（ｖｉ）それらの組み合わせからなる群から選択される。

用語「第ＶＩＩＩ因子」および「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書において同義的に使用される。本発明の意味での「第ＶＩＩＩ因子組成物」は、ＦＶＩＩＩおよびＦＶＩＩＩａを含む組成物を含む。ＦＶＩＩＩａは、典型的には、組成物中のＦＶＩＩＩタンパク質の総量を基準として、少量、例えば約１～２％のＦＶＩＩＩａで存在し得る。タンパク質分解的に切断されたＦＶＩＩＩは、典型的には、組成物中のＦＶＩＩＩタンパク質の総量を基準にして、少量から中量、例えば、約１～５０％で存在してもよい。「ＦＶＩＩＩ」は、ある個体から別の個体へと存在し発生し得るＦＶＩＩＩの天然対立遺伝子変異を含む。ＦＶＩＩＩは、血漿由来であるか、または周知の産生および精製方法を用いて、組換え的に産生されてもよい。グリコシル化、チロシン硫酸化および他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞およびその増殖条件に依存して変化し得る。

用語ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩ類似体を含む。本明細書で使用する「ＦＶＩＩＩ類似体」という用語は、配列番号２０と比較して１つまたはそれ以上のアミノ酸が置換または欠失されたＦＶＩＩＩ分子（全長またはＢドメイン切断型／欠失）、またはＢドメイン切断型／欠失ＦＶＩＩ分子については配列番号２０の対応部分を指す。ＦＶＩＩＩ類似体は自然には存在しないが、人為的な操作によって得られる。

また、本発明により使用される第ＶＩＩＩ因子分子は、残りのドメインが配列番号２０のアミノ酸番号１～７４０および１６４９～２３３２に示されるような配列に対応するＢドメイン切断型／欠失ＦＶＩＩＩ分子であってもよい。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子の他の形態は、さらにそのａ３ドメインにおける部分欠失を有し、これは単鎖ＦＶＩＩＩ分子をもたらす。

このことから、これらのＦＶＩＩＩ分子は、好ましくは哺乳動物由来の形質転換宿主細胞において産生される組換え分子ということになる。しかしながら、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩにおける残りのドメイン（すなわち、３つのＡドメイン、２つのＣドメイン、およびａ１、ａ２およびａ３領域）は、配列番号２０（アミノ酸１～７４０および１６４９～２３３２）に示されるそれぞれのアミノ酸配列からわずかに例えば約１％、２％、３％、４％または５％異なってもよい。

本発明により使用されるＦＶＩＩＩ分子は、二鎖ＦＶＩＩＩ分子または単鎖ＦＶＩＩＩ分子であってよい。また、本発明により使用されるＦＶＩＩＩ分子は、ＦＶＩＩＩの生物学的に活性なフラグメント、すなわち、Ｂドメイン以外のドメインが欠失または切断されているが、欠失／切断された形態のＦＶＩＩＩ分子が血餅の形成を支援する能力を保持しているＦＶＩＩＩであってもよい。ＦＶＩＩＩ活性は、当技術分野でよく知られた技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができる。本発明によるＦＶＩＩＩ活性を決定するための好ましい試験は、発色基質アッセイまたは一段階アッセイ（以下を参照）である。例えば、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＰＲ）、種々の受容体、他の凝固因子、細胞表面などのような種々の他の成分との第ＶＩＩＩ因子の結合能力を改変するために、またはグリコシル化部分などを導入および／または消失させるために、残りのドメインにアミノ酸修飾（置換、欠損など）を導入してもよい。また、ＦＶＩＩＩ活性を消失させない他の変異を、本発明の組成物において使用するためのＦＶＩＩＩ分子／類似体に収容することができる。

ＦＶＩＩＩ類似体はまた、親ポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が欠失されているか、または他のアミノ酸残基で置換されている、および／または追加のアミノ酸残基が親ＦＶＩＩＩポリペプチドに付加されている、ＦＶＩＩＩ分子を含む。

さらに、第ＶＩＩＩ因子分子／類似体は、例えば切断型Ｂドメインにおいておよび／または分子の他のドメインの１つもしくはそれ以上において他の修飾を含んでもよい（「ＦＶＩＩＩ誘導体」）。これらの他の修飾は、例えば高分子化合物、ペプチド化合物、脂肪酸由来化合物などのような、第ＶＩＩＩ因子分子に結合した様々な分子の形態であってよい。

用語ＦＶＩＩＩは、保護基または半減期延長部分を有するＦＶＩＩＩ分子を含む。用語「保護基」／「半減期延長部分」は、本明細書では、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＮＨ_２などの１つもしくはそれ以上のアミノ酸部位鎖官能基、または１つもしくはそれ以上のＮ－および／またはＯ－糖鎖構造に結合し、これらのタンパク質／ペプチドにコンジュゲートされると多数の治療タンパク質／ペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ循環半減期を増加することができる１つまたはそれ以上の化学基を指すものと理解される。保護基／半減期延長部分の例としては、以下が：生体適合性脂肪酸およびその誘導体、ヒドロキシアルキルスターチ（ＨＡＳ）、例えばヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）、ポリ（Ｇｌｙ_ｘ－Ｓｅｒ_ｙ）_ｎ（ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ））、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヘパロサンポリマー（ＨＥＰ）、ホスホリルコリン系ポリマー（ＰＣポリマー）、Ｆｌｅｘｉｍｅｒ^(R)ポリマー（Ｍｅｒｓａｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭＡ，米国）、デキストラン、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｆｃドメイン、トランスフェリン、アルブミン、エラスチン様ペプチド、ＸＴＥＮ^(R)ポリマー（Ａｍｕｎｉｘ、ＣＡ、米国）、アルブミン結合ペプチド、フォンウィルブランド因子フラグメント（ｖＷＦフラグメント）、カルボキシル末端ペプチド（ＣＴＰペプチド、Ｐｒｏｌｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＩＬ）およびこれらのいずれかの組み合わせ（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｃ．Ｌ．，Ａ．Ｂ．Ｌｏｗｅ，およびＮ．Ａｙｒｅｓ，Ｗａｔｅｒ－Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｉｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。誘導体化の方法は重要ではなく、上記から明らかである。

用語ＦＶＩＩＩは、グリコペグ化ＦＶＩＩＩを含む。この文脈において、用語「グリコペグ化ＦＶＩＩＩ」は、１つまたはそれ以上のＰＥＧ基がポリペプチドの多糖側鎖（グリカン）を介してＦＶＩＩＩポリペプチドに結合された第ＶＩＩＩ因子分子（全長ＦＶＩＩＩおよびＢドメイン切断型／欠失ＦＶＩＩＩを含む）を指すものとする。

本発明により使用することができるＦＶＩＩＩ分子は、異種アミノ酸配列、好ましくは半減期延長アミノ酸配列に融合したＦＶＩＩＩアミノ酸配列を含む融合タンパク質を含む。好ましい融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質およびアルブミン融合タンパク質である。用語「Ｆｃ融合タンパク質」は、本明細書では、いずれかの抗体アイソタイプから誘導することができるＦｃドメインに融合されたＦＶＩＩＩを包含することを意味する。ＩｇＧ Ｆｃドメインは、ＩｇＧ抗体の比較的長い循環半減期のため、しばしば好まれるであろう。Ｆｃドメインはさらに、例えば補体結合および／または特定のＦｃ受容体への結合のような特定のエフェクター機能を調節するために修飾され得る。ＦｃＲｎ受容体に結合する能力を有するＦｃドメインとのＦＶＩＩＩの融合は、一般に、ｗｔ ＦＶＩＩＩの半減期と比較して融合タンパク質の循環半減期を延長させることになるであろう。これにより、本発明で使用するためのＦＶＩＩＩ分子はまた、例えば、ＦＶＩＩＩ類似体の融合タンパク質、ＰＥＧ化もしくはグリコＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ類似体、またはヘパロサンポリマーにコンジュゲートされたＦＶＩＩＩ類似体のようなＦＶＩＩＩ類似体の誘導体であり得るということになる。用語「アルブミン融合タンパク質」は、本明細書において、アルブミンアミノ酸配列またはそのフラグメントもしくは誘導体に融合したＦＶＩＩＩを包含することを意味する。異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩのＮ末端もしくはＣ末端に融合されてもよく、またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列内に内部挿入されてもよい。異種アミノ酸配列は、ＷＯ２００８／０７７６１６Ａ１に記載されたいずれかの「半減期延長ポリペプチド」であってもよく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本発明により使用され得るＦＶＩＩＩ分子の例は、例えば、ＷＯ２０１０／０４５５６８Ａ１、ＷＯ２００９／０６２１００Ａ１、ＷＯ２０１０／０１４７０８Ａ２、ＷＯ２００８／０８２６６９Ａ２、ＷＯ２００７／１２６８０８Ａ１、ＵＳ２０１０／０１７３８３１、ＵＳ２０１０／０１７３８３０、ＵＳ２０１０／０１６８３９１、ＵＳ２０１０／０１１３３６５、ＵＳ２０１０／０１１３３６４、ＷＯ２００３／０３１４６４Ａ２、ＷＯ２００９／１０８８０６Ａ１、ＷＯ２０１０／１０２８８６Ａ１、ＷＯ２０１０／１１５８６６Ａ１、ＷＯ２０１１／１０１２４２Ａ１、ＷＯ２０１１／１０１２８４Ａ１、ＷＯ２０１１／１０１２７７Ａ１、ＷＯ２０１１／１３１５１０Ａ１、ＷＯ２０１２／００７３２４Ａ２、ＷＯ２０１１／１０１２６７Ａ１、ＷＯ２０１３／０８３８５８Ａ１およびＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１に記載されたＦＶＩＩＩ分子を含む。

本発明に従って使用することができるＦＶＩＩＩ分子の例には、Ａｄｖａｔｅ^(R)、Ｈｅｌｉｘａｔｅ^(R)、Ｋｏｇｅｎａｔｅ^(R)、Ｘｙｎｔｈａ^(R)、Ａｄｙｎｏｖａｔｅ^(R)、Ｋｏｖａｌｔｒｙ^(R)、Ｎｏｖｏ８^(R)、Ｎｕｗｉｑ^(R)、Ｎｏｖｏｅｉｇｈｔ^(R)、Ｅｌｏｃｔａｔｅ^(R)の有効成分、ならびにＷＯ２００８／１３５５０１Ａ１、ＷＯ２００９／００７４５１Ａ１に記載のＦＶＩＩＩ分子およびＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１の「ｄＢＮ（６４～５３）」と表された構築物が含まれる。この構築物は、配列番号５に示されたアミノ酸配列を有する。

「国際単位」または「ＩＵ」は、「ＩＵ」で較正された国際標準標本に対して較正された標準を用いた一段階凝固アッセイまたは発色基質ＦＶＩＩＩ活性アッセイなどのＦＶＩＩＩ活性アッセイによって測定されるＦＶＩＩＩの血液凝固活性（効力）の測定単位である。一段階凝固アッセイは、例えば、Ｎ Ｌｅｅ，Ｍａｒｔｉｎ Ｌら，Ａｎ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｅｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙｓ ｏｆ ＦＶＩＩＩ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．）３０，５１１ ５１９（１９８３）に記載されたように当業者に知られている。一段階アッセイの原理：試験は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイの改良版として実施される：血漿をリン脂質および表面活性化剤とインキュベートすることにより、内在性凝固系の因子の活性化が誘導される。カルシウムイオンの添加により、凝固カスケードが開始される。測定可能なフィブリン塊が形成されるまでの時間を測定する。このアッセイは第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の存在下で実施される。凝固第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固能は、試験するサンプル中に含まれる凝固第ＶＩＩＩ因子によって回復される。凝固時間の短縮は、サンプル中に含まれる第ＶＩＩＩ因子の量に比例する。凝固第ＶＩＩＩ因子の活性は、国際単位で第ＶＩＩＩ因子の既知の活性を有する標準製剤と直接比較することにより定量される。もう１つの標準アッセイは、発色基質アッセイである。発色アッセイは、Ｃｏａｍａｔｉｃ ＦＶＩＩＩ検査キット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ－Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｐＡ Ｖ．ｌｅ Ｍｏｎｚａ ３３８－２０１２８ ミラノ，イタリア）のように商業的に購入してもよい。発色アッセイの原理：カルシウムおよびリン脂質の存在下で、第Ｘ因子は、第ＩＸａ因子から第Ｘａ因子の活性化される。この反応は補因子として第ＶＩＩＩａ因子によって刺激される。ＦＶＩＩＩａは、測定されるサンプル中のＦＶＩＩＩから、反応混合物中の少量のトロンビンによって生成される。

最適な濃度のＣａ^２＋、リン脂質および第ＩＸａ因子ならびに過剰量の第Ｘ因子を使用した場合、第Ｘ因子の活性化は第ＶＩＩＩ因子の効力に比例する。活性化された第Ｘ因子は発色基質Ｓ－２７６５から発色団ｐＮＡを放出する。したがって、４０５ｎｍで測定されるｐＮＡの放出量は、形成されたＦＸａの量に比例し、そのためサンプルの第ＶＩＩＩ因子活性にも比例する。

本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩを併用療法で使用する場合、投与されるポリペプチドとＦＶＩＩＩとの比率は、以下の「比率」の項において定義されるようないずれかの比率であり得る。別の態様において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩＩの半減期の増加に使用するための本発明のポリペプチドに関する。本発明のさらに別の態様は、対象におけるＦＶＩＩＩの半減期を増加させる方法であって、有効量の本発明のポリペプチド、または本発明の医薬組成物を対象に投与することを含む、方法である。本発明のポリペプチドおよびＦＶＩＩＩは、対象に同時に、別々にまたは順次に共投与することができる。

医薬組成物
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドと、場合により薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物である。第１の実施形態において、医薬組成物は、本発明のポリペプチドを唯一の有効成分として含む。第２の実施形態では、医薬組成物は、本発明のポリペプチドと少なくとも１つのさらなる有効成分とを含む。好ましくは、さらなる有効成分は、上述したようなＦＶＩＩＩ分子である。医薬組成物中の本発明のポリペプチドとＦＶＩＩＩとの比率は、後述の「比率」の項で定義されるようないずれかの比率とすることができる。

本発明のポリペプチドの治療用製剤は、所望の純度を有する本発明のポリペプチドを、当技術分野において典型的に使用される場合により薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これらはすべて本明細書において「担体」と称する）、すなわち緩衝剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、非イオン性洗剤、抗酸化剤および他の様々な添加剤と混合することにより凍結製剤または水性溶液として貯蔵するために調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版（Ｏｓｏｌ編，１９８０）を参照。このような添加剤は、使用する投与量および濃度において、対象に対して無毒でなければならない。

緩衝剤は、生理学的に許容される条件に近い範囲にｐＨを維持するのに役立つ。それは、典型的には約２ｍＭから約１００ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。適切な緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方、ならびにそれらの塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム－クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸－クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸－コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸－水酸化ナトリウム混合物、コハク酸－コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸－酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸－酒石酸カリウム混合物、酒石酸－水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えば、フマル酸－フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸－フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム－フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（グルコン酸－グリコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸－水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸－グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝液（例えば、シュウ酸－シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸－水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸－シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（乳酸－乳酸ナトリウム混合物、乳酸－水酸化ナトリウム混合物、乳酸－乳酸カリウム混合物など）、および酢酸緩衝液（酢酸－酢酸ナトリウム混合物、酢酸－水酸化ナトリウム混合物など）が含まれる。さらに、リン酸塩緩衝液、ヒスチジン緩衝液、Ｔｒｉｓのようなトリメチルアミン塩を用いることができる。

保存剤は、微生物の成長を遅らせるために添加することができ、典型的には０．２％～１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加することができる。適切な保存剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ベンザルコニウムハライド（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ヘキサメトニウムクロリド、およびメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールならびに３－ペンタノールが含まれる。

浸透圧調節剤は、しばしば「安定剤」として知られており、液体組成物の薬学的に許容される浸透圧、好ましくは等張性を確保するために加えることができ、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニット、ならびに塩化ナトリウムなどの無機塩が含まれる。安定剤は、増量剤から、治療薬を可溶化するか、または変性もしくは容器壁への付着の防止を助ける添加物までの機能に及ぶことができる賦形剤の広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙された）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ－ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールおよび、イノシトールなどのシクリトールを含む同様のもの；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基またはそれ以下のペプチド）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；二糖類、例えばラクトース、マルトース、スクロースおよび三糖類、例えばラフィノース；ならびに多糖類、例えばデキストランであることができる。安定剤は、本発明のポリペプチド１重量部あたり０．１～１０，０００重量部の範囲で存在することができる。非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても知られている）は、治療剤の可溶化を助けるだけでなく、治療タンパク質を撹拌誘発性凝集から保護するために添加することができ、これはまた、タンパク質の変性を引き起こすことなく製剤をせん断表面応力に曝すことを可能にする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ^(R)－２０、ＴＷＥＥＮ^(R)－８０など）が含まれる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ～約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在することができる。

追加の様々な賦形剤には、増量剤（例えば、デンプン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、および共溶媒が含まれる。

凍結乾燥（Ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ）または凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、それが現れる文脈によって特に明記されない限り、物質（すなわち、医薬有効成分および種々の製剤添加剤または「賦形剤」）の溶液を固体に変換する乾燥工程を示すために使用されるものとする。一般的な凍結乾燥工程は、３段階、「凍結」、「一次乾燥」および「二次乾燥」からなる。凍結段階では、ほぼ全ての含有水を氷に、溶質を固体（結晶または非晶質）に変換する。一次乾燥段階では、水分子（氷）と周囲の大気との間に良好な圧力勾配を維持することにより、直接昇華によって製品から氷を除去する。二次乾燥段階では、脱着により製品から残留水分を除去する。

凍結乾燥組成物の濃度（ｗ／ｖ）が示される場合、それは凍結乾燥直前の体積のことである。

特に明記しない限り、パーセントの用語は重量／重量パーセントを表し、温度は摂氏を表す。

比率
以下に、より詳細に記載するように、本発明のポリペプチドは、単量体、二量体、またはそれらの混合物であってもよい。本発明によるいずれかのモル比は、実際にホモ二量体またはヘテロ二量体として存在するかどうかにかかわらず、本発明のポリペプチドの二量体のモル濃度の比率を指している。

本出願におけるＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドのあらゆる比率は、特に明記しない限り、好ましくはヘテロ二量体として存在する、本発明のポリペプチドに含まれる二量体の量（モルで）をＦＶＩＩＩの量（モルで）で割ったものを指している。非限定的な例として、２００μＭの単量体サブユニットからなる１００μＭの本発明のヘテロ二量体ポリペプチドの、１μＭのＦＶＩＩＩを含む合剤（ｃｏ－ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、１００の比率を意味する。

ＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドのモル比は、少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも４、または少なくとも１０、または少なくとも２０、または少なくとも２５、または少なくとも５０、または５０より大きい、または少なくとも１００、または少なくとも１５０、または少なくとも２００、または少なくとも２５０、または少なくとも３００、または少なくとも３５０、または少なくとも４００、または少なくとも４５０、または少なくとも５００、または少なくとも１，０００、または少なくとも１，５００、または少なくとも２，５００、または少なくとも４，０００、または最大５，０００であってもよい。ＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドのモル比は、特定の実施形態によれば、５，０００の比率、２，５００の比率、１，２５０の比率、または１，０００の比率を超えなくてもよい。

ＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドのモル比は、約１～５，０００、または２～２，５００、または４～２，０００、または１０～１，５００、または２５～１，０００、または５０～５００の範囲であってよい。好ましくは、ＦＶＩＩＩに対する本発明のポリペプチドのモル比は、１～１，２５０、または２～１，０００、または４～７５０、または１０～５００の範囲である。

上記の比率は、併用処置の過程で投与される比率、または医薬組成物中の両有効成分の比率のことである。

配列表に示されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列を表１にまとめる。

次に、本発明の特定の実施形態を、以下の実施例を参照して説明するが、これらは例示のみを目的とし、本明細書に記載された概念の範囲を限定することを意図するものではない。

実施例
結果
Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９二量体はｉｎ ｖｉｔｒｏでネズミＲＢＣを架橋する。

血友病Ａの処置のために共投与されるＦＶＩＩＩの半減期を延長するために、組換えＶＷＦ Ｄ’Ｄ３アルブミン融合タンパク質（ｒＤ’Ｄ３－ＦＰ）を予め作成した（参考論文、Ａ２４５）。本発明者らは、Ｄ’Ｄ３－ＦＰとＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ（ＴＥＲ１１９特異的単鎖Ｆｖ；マウスグリコフォリンＡに対する特異性を有する抗体フラグメント）との融合体が、生体内原位置でその二重特異性によりＦＶＩＩＩをＲＢＣにターゲッティングするメディエーターとして機能しうると考えた。ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖと融合したｒＤ’Ｄ３－ＦＰ（Ｄ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ，配列番号３）を、Ｄ’Ｄ３ドメインの効率的二量化に不可欠なＶＷＦプロペプチド（Ｄ１Ｄ２）に沿って安定発現させた（図１）。ＣＨＯ発現細胞株は、予想通りＤ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖの単量体およびホモ二量体を分泌した（図２）。両種を別々に精製した。ＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ，ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，ドイツ）は、５μｇ／ｍｌ ＦＶＩＩＩの存在下で、Ｄ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖの単量体およびホモ二量体の両方を滴下したＲＢＣの表面上で実際に検出することができた。ＲＢＣはホモ二量体を用いたポリクローナル抗ＦＶＩＩＩ－ＦＩＴＣによって効率的に染色されたが、単量体ではそうならなかった（データは示さず）。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生理的に適切な濃度（＞５μｇ／ｍｌ）では、ＲＢＣは単量体ではなくホモ二量体を用いて目に見える凝集塊を形成することが観察された。驚くべきことに、単量体はヒトアルブミンに対する検出抗体の存在下でしかＲＢＣを架橋しなかった（図３）。本発明者らは、この知見を、ｉｎ ｖｉｖｏ応用における潜在的な安全性のリスクと考えた。

ＦＶＩＩＩがＤ’Ｄ３二量体によって効率的に結合されるが、単量体のＤ’Ｄ３によって結合されないことは以前に実証されている。単量体Ｄ’Ｄ３は、Ｄ’Ｄ３二量体と比較して、その天然リガンド、ＦＶＩＩＩに対する親和性が著しく低下している（ＷＯ２０１８／０８７２７１Ａ１）。ＦＶＩＩＩ－ＲＢＣ相互作用は、ｉｎ ｖｉｖｏでのシナリオにおいて内因的に循環するＶＷＦによってさらに阻害されるであろう。本発明者らは、以前に、二量体Ｄ’Ｄ３－ＦＰが、血漿中の内因性ＶＷＦのモル濃度と競合し、それを超える用量で投与された場合にしか、ＦＶＩＩＩの半減期を延長しないことを実証している。Ｄ’Ｄ３単量体はＦＶＩＩＩに対する親和性が低いため、Ｄ’Ｄ３二量体よりもかなり高い用量で注射する必要があるであろう。したがって、単量体のＤ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖの開発を通して架橋ＲＢＣの問題を克服することは、本発明者らの選択肢ではなかった。二重特異性分子のサブユニットとして二量体化Ｄ’Ｄ３が好ましかった。

Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体はｉｎ ｖｉｔｒｏで架橋されることなくＦＶＩＩＩのマウスＲＢＣへの結合を促進する。

驚くべきことに、安定にトランスフェクトされた細胞株で共発現したＤ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ（配列番号３）およびＤ’Ｄ３（アルブミンおよびＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ融合パートナーなし、配列番号５）はヘテロ二量体として分泌され、ヒトアルブミンおよび非融合Ｄ’Ｄ３のｃ末端のタグに対する２回の親和性ステップを使用して精製できた（図４および図５）。同じ発現戦略を、「Ｄ’Ｄ３ ＥＹＡ」またはＣＳＬ６２９（ＷＯ２０１７／１１７６３０Ａ１、ＷＯ２０１７／１１７６３１Ａ１；配列番号１４）として知られる、以前に公開されたＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖ（配列番号７）およびＤ’Ｄ３_ＥＹＡ（配列番号９）の高親和性バリアントを用いて適用した。図６は、Ｄ’Ｄ３－ＦＰ－ＴＥＲ１１９ｓｃＦｖが、野生型（ＷＴ）および高親和性バリアント（ＥＹＡ）の両方として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスＲＢＣへのヒトＦＶＩＩＩの結合を濃度依存的な様式で促進することを示している。簡潔に説明すると、一定濃度のｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ（１２．５ＩＵ／ｍＬ、約６ｎＭ、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ）を、精製した両ヘテロ二量体構築物、Ｄ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９およびＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９の濃度を増加させてインキュベートした後、１：１００希釈された新鮮血からの洗浄マウスＲＢＣを加え、分析した。マウスＲＢＣ表面のＦＶＩＩＩは、ポリクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ ＦＩＴＣ標識抗体によって特異的に検出された。重要なことは、Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体の二重特異性であるが一価のデザインは、マウスＲＢＣの凝集または架橋を、可視的にもＳＳＣ／ＦＳＣ（単一細胞）分析に基づいても示さなかった。ヒト血漿由来のＶＷＦ（１２．５ＩＵ／ｍｌ、約２５０ｎＭ、ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ、Ｍａｒｂｕｒｇ）を、示したとおり添加した。このように、血漿単位の定義に従って、ＦＶＩＩＩとＶＷＦのモル比は１対３５であり、生理学的に適切であると仮定された。Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体構築物を滴定しながら、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦの等しく固定された標準血漿単位濃度（１２．５ＩＵ／ｍｌ）を選択し、Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９および内因性ＶＷＦの両者の共通リガンド、ＦＶＩＩＩに対する競合をｉｎ ｖｉｔｒｏでシミュレートした。興味深いことに、Ｄ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９を用いるとＶＷＦはマウスＲＢＣへのＦＶＩＩＩ結合を阻害するが、Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９では阻害しなかった。それは、ヒトＶＷＦおよびＤ’Ｄ３ＷＴ－ＴＥＲ１１９は、そのＦＶＩＩＩ結合サブユニット、Ｄ’Ｄ３の同じアミノ酸配列を有しているため、ＦＶＩＩＩに対する親和性が等しいためである（ＷＯ２０１７／１１７６３０Ａ１、ＷＯ２０１７／１１７６３１Ａ１）。Ｄ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９は、ヒトＶＷＦの存在下でマウスＲＢＣに対するＦＶＩＩＩの結合を促進しない場合、Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９は、ＶＷＦのものよりも低いモル数であってもＦＶＩＩＩをターゲッティングすることが可能である。この観察は、ＦＶＩＩＩに対する野生型Ｄ’Ｄ３－ＦＰ（ＣＳＬ６２６）またはＶＷＦと比較して、Ｄ’Ｄ３（ＥＹＡ）－ＦＰ（ＣＳＬ６２９）バリアントの３０倍高い親和性により説明できる（ＷＯ２０１７／１１７６３０Ａ１、ＷＯ２０１７／１１７６３１Ａ１）。

Ｄ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９に結合したＦＶＩＩＩのマウスＲＢＣに対する結合動態の見かけのＫＭは、ミカエリスメンテン動態を仮定して計算した（図６Ｂ）。２つの独立したｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のＫＭ計算値の要約を、表２に提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の１つは、ＶＷＦを加えなかったデータ（１７．８ｎＭ±０．５％）と比較して、ＶＷＦの存在がＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９を用いたＲＢＣへのＦＶＩＩＩの結合のＫＭ（３２．４ｎＭ±０．７％）を増加させることを示唆した。この観察では、定性的な傾向が見られることは確認されなかった（図６Ａ）。さらに、２つのバッチのＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９を用いて実験を繰り返したところ、ＶＷＦ非存在下でも、または存在下でもＫＭに有意差は見られなかった（３．７ｎＭ±５．７％および３．６ｎＭ±０．２％）。Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９の第２バッチは、ＶＷＦ有りまたはなしの両方において、第１バッチの材料と比較してＫＭが増加した（９．３ｎＭ±８．３％および９．９ｎＭ±２．０％）ことが観察された。しかし、滴定曲線（１０２ｎＭまで）の傾向は、その観察を表していなかった。

Ｄ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９の滴定は、ＶＷＦ無しのＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９のＫＭと比較して増加したＫＭ（２５．６ｎＭ±４％）を示すが、再び図６Ａの傾向は、この観察を反映していない。興味深いことに、ＶＷＦ有りのＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９は既に最大結合を示す場合、ＲＢＣ上のＦＶＩＩＩ結合はＤ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９の高濃度（４～１２．５ｎＭ）においてのみ弱く検出され、ＶＷＦ有りのＤ’Ｄ３_ＷＴ－ＴＥＲ１１９のＫＭは算出することができなかった。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、共通の結合パートナーＦＶＩＩＩに対してＤ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９バリアントと競合する約２５０ｎＭの固定過剰モルＶＷＦ濃度を使用したため、本発明者らのフローサイトメトリー結合研究は、二重特異性ヘテロ二量体の高親和性バリアント、Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９を用いてＲＢＣにＦＶＩＩＩをターゲティングすることの有益な効果を明確に示した。

Ｄ’Ｄ３－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体で処置されたＦＶＩＩＩ ｋｏマウスにおけるＦＶＩＩＩ抗体の低減
ｒＦＶＩＩＩの週１回の投与は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）形成をもたらすことが知られており、典型的には、ＦＶＩＩＩ ｋ．ｏ．マウスにおける阻害抗体（ベセスダ単位で測定）であることが示されている。この実施例では、ｒＦＶＩＩＩ、ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎに対するＡＤＡの発生におけるＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体の効果を、非赤血球結合対照、Ｄ’Ｄ３（ＥＹＡ）－ＦＰと比較して調べた。

リコンビナントＦＶＩＩＩ（ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ、２００ＩＵ／ｋｇ、約１６μｇ／ｋｇ）を、ＣＳＬ６２９として以前に発表されたＤ’Ｄ３（ＥＹＡ）－ＦＰ（ＣＳＬ６２９）１００μｇ／ｍｌと共に共投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏで注入されたＦＶＩＩＩの半減期が延長されることが報告された（ＷＯ２０１８／０８７２７１Ａ１）。作用機序の１つの説明として、ＦＶＩＩＩとその高親和性シャペロン、Ｄ’Ｄ３（ＥＹＡ）－ＦＰ（ＣＳＬ６２９）とのモル比が少なくとも１対４であれば、注入されたＦＶＩＩＩ分子の大半を循環中に取り込むのに十分であったことが議論されている。したがって、注入されたＦＶＩＩＩのごく一部が内因性ＶＷＦに結合し、ＣＳＬ６２９には結合しなかったが、これによって出血モデルにおけるＦＶＩＩＩ ｋｏマウスを依然として救うことができることが示された（データは示さず）。本発明者らは、同じモル比（１対４）であるが、約１０倍多い投与量をｉｎ ｖｉｖｏで適用してＦＶＩＩＩに対する寛容を誘導した。初期投与レジメンについては、アナフィラキシーを回避するために、ヒト異種タンパク質を１ｍｇ／ｋｇ未満で注射することも考えた。

ｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎ（２０００ＩＵ／ｋｇ）をＤ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体（８４０μｇ／ｋｇ）と共にまたはなしで、０、７、１４、２１および２８日目に、ｎ＝１０のＦＶＩＩＩ ｋ．ｏ．マウス／群に投与すると（図７参照）、抗ＦＶＩＩＩ－ＡＤＡおよびＦＶＩＩＩ活性を中和する阻害抗体の生成が誘導された。抗ＦＶＩＩＩ ＡＤＡ値は、減衰の和として与えられ、個々の値および平均±ＳＤとして示される（図８Ａ）。２０００ＩＵ／ｋｇの用量のｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎをＦＶＩＩＩ ｋ．ｏ．マウスに単独投与すると、３５日目に６．６１±１．１４のＡＤＡの生成が誘導された。Ｄ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体を８４０μｇ／ｋｇの用量で２種類のバッチを使用して共投与すると、減衰の和は２．８８±１．０４（バッチ１）および３．０４±０．８２（バッチ２）に有意に減少した。２つの共投与Ｄ’Ｄ３_ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体バッチ間に有意差はなかった（図８Ａ）。

ＦＶＩＩＩに対する生成されたＡＤＡは、それぞれ個々の動物および平均±ＳＤ（図８Ｂ）についてプロットするとわかるように、ベセスダ単位で定量化され、概ね同じ応答を示す阻害性であることが示された。さらに、各個体のＡＤＡ値（減衰の和）をベセスダ単位で定量化した阻害電位と比較し、すべての値にわたって線形回帰を計算し、０．５５のｒ²値を得た（図８Ｃ）、それによって抗ＦＶＩＩＩのＡＤＡ減衰の和とベセスダ単位として測定したその阻害電位との直接相関が支持された。

結論として、２つの独立したバッチのＤ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体は、ＦＶＩＩＩ ｋ．ｏ．マウスのｒＶＩＩＩ－ＳｉｎｇｌｅＣｈａｉｎの免疫原性を低下させた。

Ｄ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９はＦＶＩＩＩ ｋ．ｏ．マウスのＦＶＩＩＩに対する長期寛容を誘導する。

また、本発明者らは、Ｄ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体がＦＶＩＩＩに対する長期寛容の誘導に有効かどうかも関心があった。そこで、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスに、１７００ＩＵ／ｋｇ ＦＶＩＩＩ（ＡＦＳＴＹＬＡ^(R)，約１３６μｇ／ｋｇ ＣＳＬ Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，ドイツ）を、Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９（６７２μｇ／ｋｇ，ＦＶＩＩＩと比べて約４倍のモル過剰）と共にまたはなしで、１週間に１回、４週間静脈内に注射（ｉ．ｖ．）した。４回目の注射の１週間後に中間出血を行い、ＥＬＩＳＡによって血漿を抗ＦＶＩＩＩ抗体について分析した。さらに４週間後、マウスにＦＶＩＩＩ単独（１２０ＩＵ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を２週間注射して再チャレンジさせた。ＦＶＩＩＩの最後の注射の７日後に、終末血漿の採取のためマウスを安楽死させて、ＥＬＩＳＡによって血漿を抗ＦＶＩＩＩ抗体について分析した。驚くべきことに、Ｄ’Ｄ３ＥＹＡ－ＴＥＲ１１９ヘテロ二量体をＦＶＩＩＩと組み合わせて投与すると、ＦＶＩＩＩに対する抗体形成が著しく低下し、再チャレンジ後も抗ＦＶＩＩＩ抗体レベルが有意に上昇することはなかった。

Claims (15)

1. （ｉ）ＶＷＦ部分と（ｉｉ）赤血球結合部分とを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが血液凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に結合することができ、前記ＶＷＦ部分がＦＶＩＩＩに結合することができ、前記ＶＷＦ部分がＶＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含む切断型ＶＷＦであり、前記赤血球結合部分が抗体、抗体フラグメント、および単鎖抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ）からなる群から選択され、前記ポリペプチドがヘテロ二量体であり、前記ヘテロ二量体が第１のサブユニットおよび第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが第１の前記ＶＷＦ部分および前記赤血球結合部分を含み、前記第２のサブユニットが第２の前記ＶＷＦ部分を含み、前記第２のサブユニットが前記赤血球結合部分を含まない、前記ポリペプチド。
2. 前記ＶＷＦ部分が、配列番号１８に示すような野生型ＶＷＦのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 前記少なくとも１つのアミノ酸置換が、アミノ酸番号に関して、配列番号１８の配列を参照して、Ｓ７６４Ｇ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｉ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｍ、Ｓ７６４Ｖ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｙ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｌ／Ｓ７６６Ｙ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｗ、Ｓ７６６Ｗ／Ｓ８０６Ａ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｋ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｎ、Ｓ７６６Ｙ／Ｐ７６９Ｒ、Ｓ７６４Ｐ／Ｓ７６６Ｌ、およびＳ７６４Ｅ／Ｓ７６６Ｙ／Ｖ１０８３Ａからなる組み合わせの群から選択される、請求項２記載のポリペプチド。
4. 前記赤血球結合部分が、赤血球上の膜タンパク質に結合することができる、請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
5. 請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドと、場合により薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
6. 治療に使用するためのまたは薬剤として使用するための、請求項５に記載の医薬組成物
   。
7. 血液凝固障害の処置に使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
8. 前記処置がＦＶＩＩＩの投与を含む、請求項７に記載の使用のための医薬組成物。
9. ポリペプチドおよびＦＶＩＩＩが共投与される、請求項８に記載の使用のための医薬組成物。
10. ＦＶＩＩＩのｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加に使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
11. ＦＶＩＩＩによる処置の過程におけるインヒビター形成の防止または減少に使用するための、請求項５に記載の医薬組成物。
12. 請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
13. 請求項１２に記載の核酸を含むプラスミドまたはベクター。
14. 請求項１３に記載のプラスミドまたはベクターを含む、宿主細胞。
15. ＶＷＦと赤血球結合部分とを含むポリペプチドを製造する方法であって、（ｉ）ＶＷＦと赤血球結合部分とを含むポリペプチドが発現するような条件下で請求項１４の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）場合により宿主細胞または培養液からＶＷＦと赤血球結合部分とを含むポリペプチドを回収することとを含む、方法。

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