ES2844232T3

ES2844232T3 - Factor de Von Willebrand modificado

Info

Publication number: ES2844232T3
Application number: ES15814529T
Authority: ES
Inventors: Michael Wilson; Steve Dower; Dallas Hartman; Matthew Hardy
Original assignee: CSL Behring Lengnau AG
Current assignee: CSL Behring Lengnau AG
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2015-07-02
Publication date: 2021-07-21
Anticipated expiration: 2035-07-02
Also published as: JP2017521070A; KR20170026580A; AU2015283822A1; CN106659771A; JP6676551B2; EP3164150A4; EP3164150A1; DK3164150T3; CA2953593A1; US10253088B2; US20170152300A1; CA2953593C; BR112016030950A2; CN106659771B; AU2015283822B2; EP3164150B1; WO2016000039A1

Abstract

Un polipéptido modificado que se une al factor VIII en el que el polipéptido modificado comprende una secuencia de aminoácidos del dominio D' del factor de Von Willebrand humano (VWF) como se muestra en la SEQ ID NO: 3 en el que la secuencia comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 (S764G/S766Y), SEQ ID NO: 6 (S764P/S766I), SEQ ID NO: 7 (S764P/S766M), SEQ ID NO: 8 (S764V/S766Y), SEQ ID NO: 9 (S764E/S766Y), SEQ ID NO: 10 (S764Y/S766Y), SEQ ID NO: 11 (S764L/S766Y), SEQ ID NO: 12 (S764P/S766W), SEQ ID NO: 13 (S766W/S806A), SEQ ID NO: 14 (S766Y/P769K), SEQ ID NO: 15 (S766Y/P769N), SEQ ID NO: 16 (S766Y/P769R) y SEQ ID NO: 17 (S764P/S766L), de manera que el polipéptido modificado se une al Factor VIII con una velocidad de disociación al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor, que un polipéptido de referencia que comprende una SEQ ID NO: 3 sin modificar.

Description

DESCRIPCIÓN

Factor de Von Willebrand modificado

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos, en particular, al factor de von Willebrand modificado que muestra una afinidad de unión al factor VIII mejorada. La invención se refiere además a un complejo que comprende el polipéptido y FVIII, a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención y a un procedimiento para producir el polipéptido. Asimismo, la invención tiene que ver con el uso terapéutico o profiláctico del polipéptido o complejo de la invención para tratar trastornos hemorrágicos.

Antecedentes de la invención

Existen varios trastornos hemorrágicos causados por deficiencias de los factores de coagulación sanguínea. Los trastornos más comunes son la hemofilia A y B, resultado de deficiencias de los factores VIII y IX de coagulación sanguínea, respectivamente. Otro trastorno hemorrágico conocido es la enfermedad de von Willebrand.

En plasma, el FVIII existe predominantemente en un complejo no covalente con VWF (por sus siglas en inglés) y actúa como cofactor del factor IX activado en el complejo generador de factor X activado unido a la membrana. Se han realizado varios intentos para prolongar la semivida del FVIII no activado, ya sea reduciendo su interacción con los receptores celulares (documentos WO 03/093313A2, WO 02/060951A2), fijando covalentemente polímeros al FVIII (documentos WO 94/15625, WO 97/11957 y US 4970300), mediante encapsulación del FVIII (documento WO 99/55306), mediante la introducción de nuevos sitios de unión de metales (documento WO 97/03193), mediante la unión covalente del dominio A2 al dominio A3 ya sea por enlace peptídico (documentos WO 97/40145 y WO 03/087355) o disulfuro (documento WO 02/103024A2) o fijando covalentemente el dominio A1 al dominio A2 (documento WO2006/108590).

Otro enfoque para potenciar la semivida funcional de FVIII o VWF es mediante PEGilación de FVIII (documentos WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923). También se ha intentado la PEGilación del VWF (documento WO 2006/071801) en un esfuerzo por potenciar indirectamente la semivida del FVIII presente en el plasma. También se han descrito proteínas de fusión de FVIII (documentos WO 2004/101740, WO2008/077616 y WO 2009/156137). El VWF, que está ausente, es funcionalmente defectuoso o solo está disponible en cantidad reducida en diferentes formas de la enfermedad de von Willebrand (VWD, por sus siglas en inglés), es una glucoproteína adhesiva multimérica presente en el plasma, que tiene múltiples funciones fisiológicas. Durante la hemostasia primaria, el VWF actúa como mediador entre los receptores específicos en la superficie de las plaquetas y los componentes de la matriz extracelular, tal como colágeno. Además, el VWF sirve como vehículo y proteína estabilizadora para el FVIII procoagulante. El VWF se sintetiza en células endoteliales y megacariocitos como una molécula precursora de 2813 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADNc del VWF de tipo silvestre se desvelan en Collins y col., 1987, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397. El polipéptido precursor, pre-pro-VWF, consiste en un péptido señal de 22 restos, un propéptido de 741 restos y el polipéptido de 2050 restos que se encuentran en el plasma (Fischer y col., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). Después de la escisión del péptido señal en el retículo endoplásmico, se forma un puente disulfuro carboxiterminal entre dos monómeros del VWF. Durante el transporte adicional a través de la vía secretora, se añaden 12 cadenas laterales de carbohidrato unidas a N y 10 unidas a O. De manera importante, los dímeros del VWF se multimerizan a través de puentes disulfuro aminoterminales y el propéptido de 741 aminoácidos de longitud se escinde mediante la enzima PACE/furina en el aparato de Golgi tardío. El propéptido, así como los multímeros de alto peso molecular del VWF (VWF-HMWM, por sus siglas en inglés) se almacenan en los cuerpos de Weibel-Pallade de las células endoteliales o en los gránulos a de las plaquetas.

Una vez secretada al plasma, la proteasa ADAMTS13 escinde el VWF dentro del dominio A1 del VWF. El VWF en plasma consiste en una gama de multímeros que varían desde dímeros individuales de 500 kDa hasta multímeros que consisten en más de 20 dímeros de un peso molecular de más de 10.000 kDa. Normalmente, los multímeros de alto peso molecular del VWF (VWF-HMWM) tienen la actividad hemostática más fuerte, que se puede medir en la actividad del cofactor de ristocetina (VWF:RCo). Cuanto mayor sea la relación de VWF:RCo/antígeno de VWF, mayor es la cantidad relativa de multímeros de alto peso molecular.

Los defectos en el VWF son los causantes de la enfermedad de von Willebrand (VWD), que se caracteriza por un fenotipo hemorrágico más o menos pronunciado. La VWD de tipo 3 es la forma más grave en la que el VWF está completamente ausente, la VWD de tipo 1 se refiere a una pérdida cuantitativa del VWF y su fenotipo puede ser muy leve. La VWD de tipo 2 se refiere a defectos cualitativos del VWF y puede ser tan grave como la VWD de tipo 3. La VWD de tipo 2 tiene muchas subformas, estando asociadas algunas de ellas con la pérdida o disminución de multímeros de alto peso molecular. La VWD de tipo 2a se caracteriza por una pérdida de multímeros tanto intermedios como grandes. La VWD de tipo 2B se caracteriza por una pérdida de multímeros de mayor peso molecular.

La VWD es el trastorno hemorrágico hereditario más frecuente en seres humanos y puede tratarse mediante terapia de reemplazo con concentrados que contienen VWF de origen plasmático o recombinante. El VWF se puede preparar a partir de plasma humano como se describe, por ejemplo, en el documento EP 05503991. El documento EP 0784632 describe un procedimiento para producir y aislar V^wF recombinante.

En plasma, el FVIII se une con alta afinidad al VWF, que lo protege del catabolismo prematuro y, por lo tanto, desempeña además de su papel en la hemostasia primaria, un papel crucial en la regulación de los niveles plasmáticos de FVIII y, como consecuencia, también es un factor central en el control de la hemostasia secundaria. La semivida del FVIII no activado unido al VWF es de aproximadamente 12 a 14 horas en plasma. En la enfermedad de von Willebrand de tipo 3, en la que no hay o casi no hay VWF, la semivida del FVIII es de solo aproximadamente 6 horas, lo que conduce a síntomas de hemofilia A leve a moderada en dichos pacientes debido a la disminución de las concentraciones de FVIII. El efecto estabilizante del VWF sobre el FVIII también se ha usado para ayudar a la expresión recombinante de FVIII en células CHO (Kaufman y col. 1989, Mol Cell Biol).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un polipéptido modificado que se une al factor VIII en el que el polipéptido modificado comprende una secuencia de aminoácidos del dominio D' del factor de von Willebrand (VWF) humano como se muestra en la SEQ ID NO: 3 en el que la secuencia comprende una modificación como se define en la reivindicación 1 de manera que el polipéptido modificado se une al Factor VIII con una velocidad de disociación al menos 5 veces menor que un polipéptido de referencia que comprende una SEQ ID NO: 3 sin modificar.

El polipéptido modificado se une al Factor VIII preferentemente con una velocidad de disociación al menos 10 veces menor que un polipéptido de referencia que comprende una SEQ ID NO: 3 sin modificar.

La presente invención proporciona un complejo que comprende una molécula de factor VIII y el polipéptido modificado de la presente invención.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado.

La presente invención también proporciona un procedimiento para aumentar la afinidad de unión al factor VIII del VWF, que comprende introducir al menos dos mutaciones en el dominio D' de la secuencia de aminoácidos del VWF en el que la secuencia del dominio D' después de la mutación se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO 5 a 17.

Descripción detallada

VWF

La expresión "factor de von Willebrand" o "VWF", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier polipéptido que tenga una actividad biológica del VWF de tipo silvestre, en particular, la capacidad de unirse al factor VIII. El gen que codifica el VWF de tipo silvestre se transcribe en un ARNm de 9 kb que se traduce en un prepolipéptido de 2813 aminoácidos con un peso molecular estimado de 310.000 Da. El pre-propolipéptido contiene un péptido señal de 22 aminoácidos, un pro-polipéptido de 741 aminoácidos y la subunidad madura. La escisión del pro-polipéptido de 741 aminoácidos del extremo N da como resultado un VWF maduro que consiste en 2050 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del pre-pro-polipéptido del VWF se muestra en la SEQ ID NO: 2. A menos que se indique lo contrario, la numeración de aminoácidos de los restos del VWF en la presente solicitud se refiere a la SEQ ID NO: 2, incluso si la molécula del VWF no necesita comprender todos los restos de la SEQ ID NO:2. La secuencia de aminoácidos del VWF maduro se muestra en la SEQ ID NO: 4. El término "VWF" como se usa en el presente documento se refiere a la forma madura del VWF a menos que se indique lo contrario.

El propolipéptido del VWF de tipo silvestre comprende múltiples dominios que están dispuestos en el siguiente orden: D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK

Los dominios D1 y D2 representan el propéptido que se escinde para producir el VWF maduro. El dominio D' abarca los aminoácidos 764 a 865 de la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF de tipo silvestre se muestra en la SEQ ID NO: 3. Los 90 restos carboxiterminales comprenden el dominio "CK" que es homólogo a la superfamilia de proteínas "nudo de cisterna". Estos miembros de la familia tienen tendencia a dimerizarse a través de enlaces disulfuro.

Preferentemente, el VWF de tipo silvestre comprende la secuencia de aminoácidos del VWF maduro como se muestra en la SEQ ID NO: 4. También se abarcan las adiciones, inserciones, deleciones aminoterminales, carboxiterminales o internas del VWF siempre que se conserve una actividad biológica del VWF, en particular la capacidad de unirse al FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si el VWF con deleciones conserva al menos un 10 %, preferentemente al menos un 25%, más preferentemente al menos un 50 %, lo más preferentemente al menos un 75 % de la actividad biológica del VWF de tipo silvestre. El experto puede determinar la actividad biológica del VWF de tipo silvestre utilizando procedimientos para determinar la actividad del cofactor de ristocetina (Federici AB y col. 2004. Haematologica 89:77-85), la unión del VWF a GP Iba del complejo de glicoproteína plaquetaria Ib-V-IX (Sucker y col. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), o un ensayo de unión a colágeno (Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471). Cuando la actividad biológica del VWF es la capacidad de unirse al FVIII, esto puede medirse de varias formas, sin embargo, se mide preferentemente como se describe en el ejemplo 1 en el presente documento.

Factor VIII

Las expresiones "factor VIII de coagulación sanguínea", "Factor VIII" y "FVIII" se usan indistintamente en el presente documento. "Factor VIII de coagulación sanguínea" incluye el FVIII de coagulación sanguínea de tipo silvestre así como derivados del FVIII de coagulación sanguínea de tipo silvestre que tienen la actividad procoagulante del FVIII de coagulación sanguínea de tipo silvestre. Los derivados pueden tener deleciones, inserciones y/o adiciones comparadas con la secuencia de aminoácidos del FVIII de tipo silvestre. El término FVIII incluye formas de FVIII procesadas proteolíticamente, p. ej., la forma antes de la activación, que comprende cadena pesada y cadena ligera. El término "FVIII" incluye cualquier variante o mutante de FVIII que tenga al menos un 25 %, más preferentemente al menos un 50 %, lo más preferentemente al menos un 75 % de la actividad biológica del factor VIII de tipo silvestre. Como ejemplos no limitantes, las moléculas de FVIII incluyen mutantes de FVIII que previenen o reducen la escisión de APC (Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563), mutantes de FVIII que estabilizan aún más el dominio A2 (documento WO 97/40145), mutantes de FVIII que tienen expresión aumentada (Swaroop y col. 1997. JBC 272:24121-24124), mutantes de FVIII que tienen inmunogenicidad reducida (Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508), FVIII reconstituido a partir de cadenas pesadas y ligeras expresadas de manera diferente (Oh y col. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100), mutantes de FVIII que tienen una unión reducida a receptores que conducen al catabolismo de FVIII como HSPG (por sus siglas en inglés, proteoglicanos de heparán sulfato) y/o LRP (por sus siglas en inglés, proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad) (Ananyeva y col. 2001. TCM, 11:251-257), variantes de FVIII estabilizadas por enlace disulfuro (Gale y col., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), mutantes de FVIII con propiedades de secreción mejoradas (Miao y col., 2004. Blood 103:3412-3419), mutantes de FVIII con actividad específica de cofactor aumentada (Wakabayashi y col., 2005. Biochemistry 44:10298-304), mutantes de FVIII con biosíntesis y secreción mejoradas, interacción reducida del chaperonas del RE, transporte RE-Golgi mejorado, activación o resistencia a la inactivación aumentadas y semivida mejorada (resumido por Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237). Otro ejemplo particularmente preferido es una forma recombinante del FVIII como se describe en Zollner y col. 2013, Thrombosis Research, 132:280-287. Todos estos mutantes y variantes de FVIII se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad.

Preferentemente, el FVIII comprende la secuencia de longitud completa del FVIII como se muestra en la SEQ ID NO: 18. También se abarcan las adiciones, inserciones, sustituciones, deleciones aminoterminales, carboxiterminales o internas del FVIII siempre que se conserve la actividad biológica del FVIII. La actividad biológica se conserva en el sentido de la invención si el FVIII con modificaciones conserva al menos un 10 %, preferentemente al menos un 25 %, más preferentemente al menos un 50 %, lo más preferentemente al menos un 75 % de la actividad biológica del FVIII de tipo silvestre. El experto puede determinar la actividad biológica del FVIII como se describe a continuación.

Una prueba adecuada para determinar la actividad biológica del FVIII es, por ejemplo, el ensayo de coagulación de una etapa o de dos etapas (Rizza y col. 1982. El ensayo de coagulación de FVIII:C y FIXa en Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) o el ensayo del sustrato cromogénico FVIII:C (S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.). El contenido de estas referencias se incorpora en el presente documento como referencia.

La secuencia de aminoácidos de la forma madura de tipo silvestre del FVIII de coagulación sanguínea humana se muestra en la SEQ ID NO: 18. La referencia a la posición de un aminoácido de una secuencia específica significa la posición de dicho aminoácido en la proteína de tipo silvestre del FVIII y no excluye la presencia de mutaciones, p. ej., eliminaciones, inserciones y/o sustituciones en otras posiciones en la secuencia atribuida. Por ejemplo, una mutación en "Glu2004" que se atribuye a SEQ ID NO: 18 no excluye que en el homólogo modificado falten uno o más aminoácidos en las posiciones 1 a 2332 de la SEQ ID NO: 13.

"FVII" y/o "VWF" dentro de la definición anterior también incluye variaciones alélicas naturales que pueden existir y producirse de un individuo a otro. "FVIII" y/o "VWF" dentro de la definición anterior incluye además variantes de FVIII y/o VWF. Dichas variantes difieren en uno o más restos de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre. Ejemplos de tales diferencias pueden incluir sustituciones conservativas de aminoácidos, es decir, sustituciones dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo, (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos. En la Tabla 1 se muestran ejemplos de tales sustituciones conservativas.

Tabla 1

continuación

VWF modificado

El VWF modificado de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la del VWF de tipo silvestre, en la que de acuerdo con la presente invención el VWF modificado tiene las combinaciones de sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R y S764P/S766L dentro de su dominio D', en comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF de tipo silvestre como se muestra en la SEQ ID NO: 3.

La secuencia de aminoácidos del dominio D' del VWF modificado tiene 2 sustituciones de aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 3.

La afinidad de unión del polipéptido de la presente invención a FVIII es mayor que la de un polipéptido de referencia que tiene la misma secuencia de aminoácidos excepto por la modificación en la SEQ ID NO: 3.

La afinidad de unión de una molécula de VWF a una molécula de factor VIII puede determinarse mediante un ensayo de unión utilizado en la técnica. Por ejemplo, la molécula de VWF puede inmovilizarse sobre un soporte sólido, se aplican concentraciones crecientes de Factor VIII, se incuba durante un determinado período de tiempo, y después del lavado, se determina el factor VIII unido con un ensayo cromogénico. La constante de afinidad o constante de disociación puede determinarse después mediante análisis de Scatchard u otro procedimiento adecuado. Un procedimiento para determinar la afinidad de unión del factor VIII humano al factor de von Willebrand se describe en Vlot y col. (1995), Blood, Volumen 85, Número 11, 3150-3157. Preferentemente, sin embargo, la afinidad del VWF por el Factor VIII se determina como se describe en el ejemplo 1 de la presente solicitud.

Cualquier indicación de afinidad en el presente documento, incluidas las constantes de disociación, preferentemente se refiere a la unión del VWF modificado de la invención, o del polipéptido de la invención al FVIII. La secuencia de aminoácidos de cadena sencilla de FVIII se muestra en la SEQ ID NO: 14.

Como la interacción del VWF con el FVIII normalmente tiene una alta velocidad de asociación, los cambios en la constante de disociación dependen en gran medida de los cambios en la velocidad de disociación. En consecuencia, el enfoque principal en el aumento de la asociación del VWF con FVIII implica esfuerzos para disminuir la velocidad de disociación entre FVIII y VWF. La velocidad de disociación del VWF modificado y FVIII en comparación con el VWF de tipo silvestre y FVIII es al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor y más preferentemente al menos 20 veces menor.

La constante de disociación del complejo que consiste en VWF y FVIII es preferentemente 0.2 nmol/l o menos, más preferentemente 0,175 nmol/l o menos, más preferentemente 0,15 nmol/l o menos, más preferentemente 0,125 nmol/l o menos, más preferentemente 0,1 nmol/l o menos, más preferentemente 0,05 nmol/l o menos, lo más preferentemente 0,01 nmol/l o menos.

La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el factor VIII de SEQ ID NO: 13 es normalmente menos del 90 % de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (p.ej., el polipéptido de SEQ ID NO: 4) y el Factor VIII de SEQ ID NO: 13. La constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de la invención y el Factor VIII de SEQ ID NO: 13 es preferentemente menos del 75 %, más preferentemente menos del 50 %, más preferentemente menos del 25 %, más preferentemente menos del 10 %, más preferentemente menos del 5 %, de la constante de disociación KD de un complejo del polipéptido de referencia (p. ej., el polipéptido de SEQ ID NO: 4) y el Factor VIII de SEQ ID NO: 13.

El polipéptido de referencia es un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la del polipéptido de la presente invención excepto por la mutación dentro del dominio D' del VWF. Es decir, el polipéptido de referencia tiene preferentemente una secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido de la presente invención, con la condición de que el dominio D' en el polipéptido de referencia consista en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 3. En otras palabras, la única diferencia de secuencia entre el polipéptido de la invención y el polipéptido de referencia reside en la secuencia de aminoácidos del dominio D'. El polipéptido de referencia se ha preparado preferentemente en las mismas condiciones que el polipéptido de la invención.

El polipéptido de la presente invención puede consistir en el VWF modificado. En otra realización, el polipéptido de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos adicional, preferentemente una secuencia de aminoácidos heteróloga. La secuencia de aminoácidos heteróloga normalmente no está fusionada con el VWF en la naturaleza.

La presente invención es particularmente útil en los casos en los que se usa una variante del VWF que tiene una semivida mejorada. Esto se puede lograr, por ejemplo, fusionando VWF con albúmina de suero humano. En el documento US8.575.104 se proporciona un análisis detallado de dichas fusiones, cuya divulgación se incorpora en el presente documento como referencia.

En una realización, el polipéptido de la presente invención comprende el VWF modificado y una proteína potenciadora de la semivida (HLEP, por sus siglas en inglés). Preferentemente, la HLEP es una albúmina.

Una o más HLEP se pueden fusionar a la parte carboxiterminal del VWF preferentemente para no interferir con las capacidades de unión del VWF, por ejemplo, a FVIII, plaquetas, heparina o colágeno.

En una realización, el VWF modificado tiene la siguiente estructura:

N -VWF -C -L1-H, [fórmula 1]

en la que

N es una parte aminoterminal del VWF,

L1 es un enlace químico o una secuencia enlazadora

H es una HLEP y

C es una parte carboxiterminal del VWF

L1 puede ser un enlace químico o una secuencia enlazadora que consiste en uno o más aminoácidos, p. ej., de 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 5 o 1 a 3 (p. ej., 1, 2 o 3) aminoácidos y que pueden ser iguales o diferentes entre sí. Habitualmente, las secuencias enlazadoras no están presentes en la posición correspondiente en el factor de coagulación de tipo silvestre. Los ejemplos de aminoácidos adecuados presentes en L1 incluyen Gly y Ser. Las secuencias de HLEP preferidas se describen a continuación. Asimismo, la invención abarca las fusiones con el "aminoácido aminoterminal" exacto de la HLEP correspondiente, o las fusiones con la "parte aminoterminal" de la HLEP correspondiente, que incluye deleciones aminoterminales de uno o más aminoácidos de la HLEP.

El VWF modificado o el complejo del FVIII con el VWF modificado de la invención puede comprender más de una secuencia de HLEP, por ejemplo, dos o tres secuencias de HLEP. Estas múltiples secuencias de HLEP pueden fusionarse a la parte carboxiterminal del VWF en tándem, por ejemplo, como repeticiones sucesivas.

Secuencias enlazadoras

De acuerdo con la presente invención, el resto de polipéptido terapéutico se puede acoplar al resto de HLEP mediante un enlazador peptídico. El enlazador debe ser no inmunogénico y puede ser un enlazador no escindible o escindible.

Los enlazadores no escindibles pueden estar compuestos de restos alternos de glicina y serina como se ilustra en el documento WO2007/090584.

En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre el resto de VWF y el resto de albúmina consiste en secuencias peptídicas, que sirven como enlazadores interdominios naturales en proteínas humanas. Preferentemente, dichas secuencias peptídicas en su entorno natural están ubicadas cerca de la superficie de la proteína y son accesibles para el sistema inmunitario de modo que se puede asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. Se dan ejemplos en el documento WO2007/090584.

Los enlazadores escindibles deberían ser lo suficientemente flexibles para permitir la escisión por proteasas. En una realización preferida, la escisión del enlazador se produce de forma comparablemente rápida a la activación de FVIII dentro de la proteína de fusión, si la proteína de fusión es un FVIII modificado.

El enlazador escindible comprende preferentemente una secuencia derivada de

(a) el polipéptido terapéutico que se administrará por sí mismo si contiene sitios de escisión proteolítica que se escinden proteolíticamente durante la activación del polipéptido terapéutico,

(b) un polipéptido sustrato escindido por una proteasa que se activa o forma por la implicación del polipéptido terapéutico, o

(c) un polipéptido implicado en la coagulación o fibrinólisis.

La región enlazadora en una realización más preferida comprende una secuencia de VWF, lo que debería dar como resultado una disminución del riesgo de propiedades neoantigénicas de la proteína de fusión expresada.

Los péptidos enlazadores son preferentemente escindibles por las proteasas del sistema de coagulación, por ejemplo FIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa y FVIIa.

Las combinaciones ilustrativas de polipéptido terapéutico, enlazador escindible y HLEP incluyen las construcciones enumeradas en los documentos Wo2007/090584 (por ejemplo, en la tabla 2 y figura 4) y WO2007/144173 (por ejemplo, en las tablas 3a y 3b), pero no se limitan a estas.

Polipéptidos que potencian la semivida (HLEP)

Un "polipéptido que potencia la semivida" como se usa en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en albúmina, un miembro de la familia de las albúminas, la región constante de la inmunoglobulina G y fragmentos de la misma, la región y los polipéptidos capaces de unirse en condiciones fisiológicas a la albúmina, a miembros de la familia de las albúminas, así como a porciones de una región constante de inmunoglobulina. Puede ser una proteína que potencia la semivida de longitud completa descrita en el presente documento (p. ej., albúmina, un miembro de la familia de las albúminas o la región constante de la inmunoglobulina G) o uno o más fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica o la actividad biológica del factor de coagulación. Dichos fragmentos pueden tener 10 o más aminoácidos de longitud o pueden incluir al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100 o más aminoácidos contiguos de la secuencia HLEP o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios específicos de la HLEP, siempre que el fragmento de HLEP proporcione una extensión de la semivida funcional de al menos un 25 % en comparación con un VWF de tipo silvestre.

La porción de HLEP de las construcciones de inserción de factor de coagulación propuestas de la invención puede ser una variante de una HLEP normal. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sea conservativas o no conservativas, en las que tales cambios no alteran sustancialmente el sitio activo o el dominio activo que confiere las actividades biológicas del VWF modificado.

En particular, las construcciones de fusión de HLEP del VWF propuestas de la invención pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de HLEP y fragmentos de HLEP. La HLEP puede derivar de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo seres humanos, mono, vaca, oveja o cerdo. Las HLEP no de mamíferos incluyen, pero sin limitación, gallina y salmón.

Albúmina como HLEP

Las expresiones, "seroalbúmina humana" (HSA, por sus siglas en inglés) y "albúmina humana" (HA, por sus siglas en inglés) y "albúmina" (ALB) se usan indistintamente en la presente solicitud. Los términos "albúmina" y "seroalbúmina" son más amplios y abarcan seroalbúmina humana (y fragmentos y variantes de la misma), así como albúminas de otras especies (y fragmentos y variantes de las mismas).

Como se usa en el presente documento, "albúmina" se refiere colectivamente a un polipéptido o secuencia de aminoácidos de albúmina, o un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (p. ej., actividades biológicas) de albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a la albúmina humana o fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de albúmina humana como se muestra en la SEQ ID NO: 15 en el presente documento o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de las mismas, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de los mismos.

En particular, las construcciones de fusión del VWF propuestas de la invención pueden incluir variantes polimórficas de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana de origen natural. Hablando en general, un fragmento o variante de albúmina tendrá al menos 10, preferentemente al menos 40, más preferentemente más de 70 aminoácidos de longitud. La variante de albúmina puede consistir en preferentemente o comprender alternativamente al menos un dominio completo de albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo dominios 1 (aminoácidos 1-194 de la SEQ ID NO: 15), 2 (aminoácidos 195-387 de la SEQ ID NO: 15), 3 (aminoácidos 388-585 de la SEQ ID NO: 15), 1 2 (1-387 de la SEQ ID NO: 15), 2 3 (195-585 de la SEQ ID NO: 15) o 1 3 (aminoácidos 1-194 de la SEQ ⁱD NO: 15 aminoácidos 388-585 de la SEQ ID NO: 15). Cada dominio se compone en sí mismo de dos subdominios homólogos, concretamente, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones enlazadoras entre subdominios flexibles que comprenden los restos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.

La porción de albúmina de las construcciones de fusión del VWF propuestas de la invención puede comprender al menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservativas de la misma.

En una realización preferida, el extremo aminoterminal de la albúmina se fusiona con el extremo carboxiterminal de la secuencia de aminoácidos del VWF modificado. Es decir, el polipéptido de la presente invención puede tener la estructura:

N-mVWF-C-L1-A,

en la que N es una parte aminoterminal del VWF, mVWF es el VWF modificado como se describe anteriormente en el presente documento, C es una parte carboxiterminal del VWF, L1 es un enlace químico o una secuencia enlazadora

y A es albúmina como se define anteriormente en el presente documento.

Inmunoglobulinas como HLEP

Las regiones constantes (Fc) de inmunoglobulina G (IgG) son conocidas en la técnica por aumentar la semivida de proteínas terapéuticas (Dumont J A y col. 2006. BioDrugs 20:151-160). La región constante de IgG de la cadena pesada consiste en 3 dominios (CH1-CH3) y una región bisagra. La secuencia de inmunoglobulina puede derivar de cualquier mamífero, o de las subclases IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, respectivamente. La IgG y los fragmentos de IgG sin un dominio de unión a antígeno también se pueden usar como HLEP. La porción de polipéptido terapéutico está conectada a la IgG o a los fragmentos de IgG preferentemente a través de la región de bisagra del anticuerpo o de un enlazador peptídico, que incluso puede ser escindible. Varias patentes y solicitudes de patentes describen la fusión de proteínas terapéuticas a regiones constantes de inmunoglobulina para potenciar la semivida in vivo de proteínas terapéuticas. Los documentos US 2004/0087778 y WO 2005/001025 describen las proteínas de fusión de dominios Fc o al menos porciones de regiones constantes de inmunoglobulina con péptidos biológicamente activos que aumentan la semivida del péptido, que, de lo contrario, se eliminarían rápidamente in vivo. Se describieron proteínas de fusión Fc-IFN-p que lograron una actividad biológica potenciada, una semivida circulante prolongada y una mayor solubilidad (documento WO 2006/000448). Se han desvelado proteínas Fc-EPO con una semivida en suero prolongada y una mayor potencia in vivo (documento WO 2005/063808), así como fusiones de Fc con G-CSF (documento WO 2003/076567), péptido 1 similar al glucagón (documento WO 2005/000892), factores de coagulación (documento WO 2004/101740) e interleucina-10 (documento US 6.403.077), todos con propiedades de potenciación de la semivida.

En otra realización, la semivida funcional del polipéptido de la invención o del FVIII complejado con el polipéptido de la invención se prolonga en comparación con la del VWF de tipo silvestre o con la del FVIII complejado con el VWF de tipo silvestre o con el polipéptido de referencia como se define anteriormente. El aumento puede ser superior al 15 %, por ejemplo, al menos un 20 % o al menos un 50 %. De nuevo, dichos valores de semivida funcional se pueden medir in vitro en muestras de sangre tomadas a diferentes intervalos de tiempo de dicho mamífero después de que se haya administrado el VWF modificado o el complejo de FVIII con VWF modificado.

En otra realización de la invención, el polipéptido de la invención o FVIII complejado con el polipéptido de la invención muestra una recuperación in vivo mejorada comparada con el VWF de tipo silvestre o con el FVIII complejado con el VWF de tipo silvestre o con el polipéptido de referencia definido anteriormente. La recuperación in vivo se puede determinar in vivo por ejemplo en animales normales o en modelos animales de hemofilia A, como ratones nuligénicos para FVIII en los que se esperaría que se encontrara un porcentaje aumentado de FVIII mediante ensayos de antígeno o actividad en la circulación poco tiempo (5 a 10 min) después de la administración i.v. en comparación con el VWF de tipo silvestre correspondiente, o polipéptido de referencia definido anteriormente. La recuperación in vivo se incrementa preferentemente en al menos un 10 %, más preferentemente en al menos un 20 %, e incluso más preferentemente en al menos un 40 % en comparación con el FVIII complejado con el VWF de tipo silvestre o con el polipéptido de referencia definido anteriormente.

En otra realización más de la invención, las regiones constantes de inmunoglobulina o porciones de las mismas se utilizan como HLEP. Preferentemente, la región Fc comprende un dominio CH2 y CH3 y una región bisagra de una IgG, más preferentemente se usan de una IgG1 o fragmentos o variantes de la misma, incluyendo las variantes mutaciones que potencian la unión al receptor de Fc neonatal (FcRn).

Polinucleótidos

La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado, como se describe en la presente solicitud. El término "polinucleótido(s)" generalmente se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser ADN monocatenario o bicatenario, ARN monocatenario o bicatenario. Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido(s)" también incluye ADN o ARN que comprenden una o más bases modificadas y/o bases inusuales, tal como inosina. Se apreciará que se pueden realizar diversas modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para muchos fines útiles conocidos por los expertos en la materia. El término "polinucleótido(s)" como se emplea en el presente documento abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas.

El experto entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede estar codificado por diferentes polinucleótidos. Estas "variantes" están abarcadas en la presente invención.

Preferentemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. La expresión polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, tales como, y sin limitación, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula hospedadora. Pueden usarse procedimientos convencionales de purificación de ácidos nucleicos conocidos por los expertos en la materia para obtener polinucleótidos aislados. La expresión también incluye polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.

La invención se refiere además a un grupo de polinucleótidos que juntos codifican el VWF modificado de la invención, o el polipéptido de la invención que comprende el VWF modificado. Un primer polinucleótido del grupo puede codificar la parte aminoterminal del VWF modificado, y un segundo polinucleótido puede codificar la parte carboxiterminal del VWF modificado.

Otro aspecto más de la invención es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferentemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una realización particular, el vector es un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.

La invención también se refiere a un grupo de plásmidos o vectores que comprenden el grupo anterior de polinucleótidos. Un primer plásmido o vector puede contener dicho primer polinucleótido, y un segundo plásmido o vector puede contener dicho segundo polinucleótido. Alternativamente, ambas secuencias codificantes se clonan en un vector de expresión usando dos secuencias promotoras separadas o un promotor y un elemento de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés) que puede usarse, por ejemplo, para dirigir la expresión furina para potenciar la generación del VWF maduro.

Otro aspecto más de la invención es una célula hospedadora que comprende un polinucleótido, un plásmido o vector de la invención, o un grupo de polinucleótidos o un grupo de plásmidos o vectores como se describe en el presente documento.

Las células hospedadoras de la invención pueden emplearse en un procedimiento para producir un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado, que es parte de la presente invención. El procedimiento comprende:

(a) cultivar células hospedadoras de la invención en condiciones tales que se exprese la proteína modificada deseada; y

(b) recuperar opcionalmente la proteína modificada deseada de las células hospedadoras o del medio de cultivo. Se prefiere purificar el VWF modificado de la presente invención, o el polipéptido que comprende el VWF modificado hasta una pureza > 80 %, más preferentemente una pureza > 95 % y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro que es más del 99,9 % puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos y sin agentes infecciosos ni pirógenos. Preferentemente, un VWF modificado de la invención o un polipéptido de la invención aislado o purificado está sustancialmente libre de otros polipéptidos no relacionados.

Los diversos productos de la invención son útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un VWF modificado o un polipéptido que comprende dicho VWF modificado como se describe en el presente documento, un polinucleótido de la invención o un plásmido o vector de la invención.

El polipéptido modificado de la invención puede usarse para tratar a un individuo que padece un trastorno de la coagulación sanguínea, tal como hemofilia A o B o VWD. El tratamiento comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz de (i) FVIII y del VWF modificado o del polipéptido que comprende el VWF modificado o (ii) del complejo de FVIII con VWF modificado o (iii) del complejo de FVllI con el polipéptido que comprende VWF modificado como se describe en el presente documento. En otra realización, el tratamiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polinucleótido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Alternativamente, el tratamiento puede comprender administrar al individuo una cantidad eficaz de las células hospedadoras de la invención descritas en el presente documento.

Expresión de los mutantes propuestos

La producción de proteínas mutantes recombinantes a niveles altos en células hospedadoras adecuadas requiere el ensamblaje de los ADNc modificados mencionados anteriormente en unidades transcripcionales eficaces junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante que puede propagarse en diversos sistemas de expresión de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Los elementos reguladores de la transcripción eficaces podrían derivar de virus que tienen células animales como hospedadores naturales o del ADN cromosómico de células animales. Preferentemente, se pueden usar combinaciones de promotor-potenciador derivadas del virus simio 40, adenovirus, poliomavirus BK, citomegalovirus humano, o la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o combinaciones de promotor-potenciador que incluyen genes transcritos constitutivamente de forma fuerte en células animales como beta-actina o GRP78. Para lograr niveles altos estables de ARNm transcrito a partir de los ADNc, la unidad transcripcional debe contener en su parte 3' proximal una región de ADN que codifique una secuencia terminación transcripcional-poliadenilación. Preferentemente, esta secuencia deriva de la región transcripcional temprana del virus simio 40, el gen de la betaglobina de conejo o el gen activador del plasminógeno tisular humano.

A continuación, los ADNc se integran en el genoma de una línea de células hospedadoras adecuada para la expresión de las proteínas FVIII y/o VWF modificadas. Preferentemente, esta línea celular debe ser una línea celular animal de origen vertebrado para asegurar un plegamiento correcto, formación de enlaces disulfuro, glicosilación ligada a asparagina y otras modificaciones postraduccionales, así como secreción en el medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones postraduccionales son la O-sulfatación de tirosina y el procesamiento proteolítico de la cadena polipeptídica naciente. Ejemplos de líneas celulares que pueden usarse son células COS de mono, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células 293 de riñón embrionario humano y células CHO de hámster.

El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes se puede introducir en una línea celular animal de varias formas diferentes. Por ejemplo, se pueden crear vectores de expresión recombinantes a partir de vectores basándose en diferentes virus animales. Ejemplos de estos son vectores basados en baculovirus, vaccinia virus, adenovirus, y preferentemente virus del papiloma bovino.

Las unidades de transcripción que codifican los ADN correspondientes también pueden introducirse en células animales junto con otro gen recombinante que puede funcionar como marcador seleccionable dominante en estas células para facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que han integrado el ADN recombinante en su genoma. Ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son la aminoglucósido fosfotransferasa Tn5, confiriendo resistencia a gentamicina (G418), higromicina fosfotransferasa, confiriendo resistencia a la higromicina y a la puromicina acetil transferasa, confiriendo resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede residir en el mismo vector que el que codifica el ADNc de la proteína deseada, o puede estar codificado en un vector separado que se introduce e integra simultáneamente en el genoma de la célula hospedadora, dando como resultado con frecuencia un estrecho enlace físico entre las diferentes unidades de transcripción.

Otros tipos de genes marcadores seleccionables que pueden usarse junto con el ADNc de la proteína deseada se basan en diversas unidades de transcripción que codifican la dihidrofolato reductasa (dhfr). Después de la introducción de este tipo de gen en células que carecen de actividad dhfr endógena, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG-44), les permitirá crecer en medios que carecen de nucleósidos. Un ejemplo de dicho medio es F12 de Ham sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos genes dhfr pueden introducirse junto con las unidades transcripcionales de ADNc de FVIII en células CHO del tipo anterior, ya sea enlazados en el mismo vector o en diferentes vectores, creando así líneas celulares dhfr positivas que producen proteína recombinante.

Si las líneas celulares anteriores se hacen crecer en presencia del inhibidor citotóxico de dhfr metotrexato, surgirán nuevas líneas celulares resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína recombinante a una velocidad aumentada debido al número amplificado de dhfr enlazadas y las unidades transcripcionales de la proteína deseada. Al propagar estas líneas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000 nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que producen la proteína deseada a una velocidad muy alta.

Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada se pueden hacer crecer a gran escala, ya sea en cultivo en suspensión o sobre varios soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son microportadores basados en dextrano o matrices de colágeno, o soportes sólidos en forma de fibras huecas o diversos materiales cerámicos. Cuando se hace crecer en cultivo celular en suspensión o en microportadores, el cultivo de las líneas celulares anteriores se puede realizar como cultivo en baño o como cultivo de perfusión con producción continua de medio acondicionado durante períodos de tiempo prolongados. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares anteriores son muy adecuadas para el desarrollo de un procedimiento industrial para la producción de las proteínas mutantes recombinantes deseadas.

Purificación y formulación

La proteína VWF modificada recombinante, que se acumula en el medio de las células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar mediante una variedad de procedimientos bioquímicos y cromatográficos, incluidos los procedimientos que utilizan diferencias de tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc. entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular.

Un ejemplo de dicha purificación es la adsorción de la proteína mutante recombinante a un anticuerpo monoclonal, dirigido, por ejemplo, a una HLEP, preferentemente albúmina humana, o dirigido al factor de coagulación correspondiente, que está inmovilizado sobre un soporte sólido. Después de la adsorción del VWF modificado al soporte, el lavado y la desorción, la proteína se puede purificar adicionalmente mediante una variedad de técnicas cromatográficas basadas en las propiedades anteriores.

El orden de las etapas de purificación se elige, p. ej., de acuerdo con la capacidad y selectividad de las etapas, estabilidad del soporte u otros aspectos. Las etapas de purificación preferidas incluyen, pero sin limitación, etapas de cromatografía de intercambio iónico, etapas de cromatografía de afinidad inmunitaria, etapas de cromatografía de afinidad, etapas de cromatografía de interacción hidrófoba, etapas de cromatografía con colorantes, etapas de cromatografía con hidroxiapatita, etapas de cromatografía multimodal y etapas de cromatografía de exclusión por tamaño.

Para minimizar el riesgo teórico de contaminación por virus, se pueden incluir etapas adicionales en el procedimiento que permitan la inactivación o eliminación eficaz de virus. Dichas etapas, por ejemplo, son el tratamiento térmico en estado líquido o sólido, tratamiento con disolventes y/o detergentes, radiación en el espectro visible o ultravioleta, radiación gamma o nanofiltración.

Los polinucleótidos modificados (p. ej., ADN) de la presente invención también pueden integrarse en un vector de transferencia para su uso en la terapia génica humana.

Las diversas realizaciones descritas en el presente documento pueden combinarse entre sí. La presente invención se describirá con más detalle en los siguientes ejemplos de la misma. Esta descripción de realizaciones específicas de la invención se realizará junto con las figuras adjuntas.

El VWF modificado como se describe en la presente invención se puede formular en preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. La proteína purificada se puede disolver en soluciones tampón acuosas convencionales fisiológicamente compatibles a las que se puede añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparados farmacéuticas.

Dichos vehículos y excipientes farmacéuticos, así como las formulaciones farmacéuticas adecuadas, son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer y col., Taylor y Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edición, Kibbe y col., Pharmaceutical Press (2000)). Las técnicas de formulación farmacéutica convencionales son bien conocidas por los expertos en la materia (véanse, p. ej., 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennaro y col., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante polipeptídica de la invención puede formularse en forma liofilizada o líquida estable. La variante polipeptídica se puede liofilizar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes de su uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril.

Las formulaciones de la composición se suministran al individuo mediante cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Se conocen varios sistemas de administración y se pueden usar para administrar la composición por cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la invención se administran sistémicamente. Para uso sistémico, las proteínas de la invención se formulan para suministro parenteral (p. ej., intravenoso, subcutáneo, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmico) o enteral (p. ej., oral, parto vaginal o rectal) de acuerdo con procedimientos convencionales. Las vías de administración más preferentes son la administración intravenosa y subcutánea. Las formulaciones se pueden administrar de forma continua mediante infusión o mediante inyección en bolo. Algunas formulaciones abarcan sistemas de liberación lenta.

Las proteínas de la presente invención se administran a pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, es decir, una dosis suficiente para producir los efectos deseados, prevenir o disminuir la gravedad o propagación de la afección o indicación que se está tratando sin alcanzar una dosis que produzca efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como, p. ej., la indicación, formulación y modo de administración, y debe determinarse en ensayos preclínicos y clínicos para cada indicación correspondiente.

La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden incorporarse como parte del mismo producto farmacéutico. Un ejemplo de dicho agente es la combinación del VWF modificado con FVIII.

En la tabla 2 se incluye un sumario de las secuencias a las que se hace referencia en el presente documento.

Tabla 2

continuación

Ejemplos

Ejemplo 1

Mutantes puntuales de VWF con unión a FVIII mejorada

Antecedentes

Como se analiza anteriormente, la mayoría del FVIII circulante está en complejo con el VWF. En seres humanos, el FVIII se elimina de la sangre con una t-i^/2de aproximadamente 2 horas y 16 horas en ausencia y presencia del VWF, respectivamente. Aunque VWF da un aumento en la semivida del FVIII, también coloca un límite superior en la t-i^/2que está dictado por su propia semivida. El documento US 8.575.104 desvela una proteína de fusión VWF-albúmina. Esta proteína de fusión tiene una semivida cinco veces más larga que el VWF de tipo silvestre en un modelo de roedores. Un complejo estable entre esta proteína de fusión y el FVIII puede conferir beneficios de semivida adicionales para el FVIII. Aunque la constante de unión en equilibrio para la interacción FVIII/VWF es alta, la cinética de unión es rápida y cualquier FVIII en complejo con la proteína de fusión VWF-albúmina se intercambiará rápidamente con el vWF endógeno tras la infusión. Por consiguiente, si la velocidad de disociación de FVIII con fusión VWF-albúmina es sustancialmente equivalente a la velocidad de disociación de FVIII con VWF natural, entonces el uso de la fusión VWF-albúmina no proporcionará ningún aumento sustancial en la semivida del FVIII. Por consiguiente, con el fin de aprovechar la semivida más larga de la fusión VWF-albúmina para ampliar la semivida de FVIII, es necesario disminuir la velocidad de disociación de FVIII con la fusión VWF-albúmina. A partir de estudios de modelado que aprovechan las mediciones realizadas en pacientes con enfermedad de von Willebrand de tipo 2N en los que el nivel del VWF es normal pero la capacidad del VWF para asociarse con el FVIII está gravemente disminuida, se ha estimado que se necesita una disminución de al menos cinco veces en la velocidad de disociación para proporcionar una mejora clínicamente relevante en la semivida del FVIII. La relación postulada entre la disminución de la velocidad de disociación de la fusión VWF-albúmina con FVIII y el aumento de la semivida del FVIII se expone en la tabla 3.

Tabla 3

En un esfuerzo por disminuir la velocidad de disociación de la fusión VWF-albúmina con FVIII, se llevaron a cabo experimentos para evaluar si la proteína de fusión FVW-albúmina mutante puede proporcionar una velocidad de disociación de FVIII significativamente más lenta, proporcionando así una opción viable para ampliar la semivida del FVIII a través de una asociación estable con la proteína de fusión VWF-albúmina.

Se construyó una serie de mutantes alrededor de las posiciones de aminoácidos 764, 765, 766, 768, 769, 773, 806 y 809 del vWF con la intención de ralentizar la constante de disociación del FVIII unido. En estos experimentos se utilizó una forma recombinante de FVIII. Este FVIII se describe en Zollner y col. 2013, Thrombosis Research, 132:280-287. Inicialmente, se midió la unión de FVIII para las construcciones de vWF que tenían uno de los restos mencionados anteriormente mutado en todos los aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo la cisteína. Tras la identificación de aglutinantes mejorados, se produjeron conjuntos adicionales de variantes que incluían combinaciones de mutaciones. Además, como la extensión de la semivida proporcionada por la fusión de albúmina depende del reciclaje mediado por FcRn, también se probaron varios de los mutantes a un pH de 5,5. Los resultados de las diversas mutaciones se muestran en las tablas 4 a 19.

Procedimientos

Un ADNc sintético, con codones optimizados que codifica los dominios D' y D3 del factor de von Willebrand humano (vWF; aminoácidos (aa) 764-1270; basado en el número de referencia de GenBank. NP_000543 y los límites de dominio aclarados por Zhou y col. 2012 Blood 120: 449-458) se obtuvieron de GeneART ^aG (Regensberg, Alemania). Este se modificó en el extremo 5' para codificar su propio péptido señal (aa1-22) y en el extremo 3' para codificar una etiqueta 8xHis carboxiterminal. La construcción (Hu-vWF[764-1270] -8His) se clonó direccionalmente en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3.1 (Invitrogen, EE. UU.) con una secuencia consenso de Kozak (GCCACC) cadena arriba de la metionina de inicio y un codón de doble parada (TGA ) en el extremo 3' del marco abierto de lectura y la secuencia del plásmido se confirmó por secuenciación automática. Este plásmido de expresión se usó después como plantilla para hacer un cambio de esto único, doble o triple en Ser764, Leu765, Ser766 o Lys773 usando técnicas de PCR convencionales y las construcciones se clonaron en pcDNA3.1 y se secuenciaron como se describe anteriormente. También se sintetizó y se obtuvo de GeneArt un segundo ADNc de codones optimizados que codifica los dominios D1 y D2 (aa1-762) de Hu-vWF con una etiqueta FLAG (DYKDDDDK) carboxiterminal; este se clonó como anteriormente en pcDNA3.1 y se secuenció.

Para la expresión transitoria de mamíferos, las células en suspensión FreestyleTM 293 (Invitrogen) se cultivaron hasta 1,1 x 106 células/ml en 5 ml de medio de expresión Freestyle (Invitrogen). Se incubaron previamente 7 pl de reactivo de transfección 293fectine (Invitrogen) durante 5 minutos con 167 pl de medio Opti-MEM I (Invitrogen), después se añadió a 2,5 pg de ADN plasmídico que codifica Hu-vWF[764-1270]-8His de tipo silvestre / mutante más 2.5 pg de ADN plasmídico que codifica Hu-vWF[1-762] -FLAG y la mezcla se incubó durante 20 minutos adicionales. Se añadió el complejo DNA-293Fectine a las células que se cultivaron durante 6 días a 37 °C, CO²al 8 % en una incubadora con agitación a 250 rpm. Los sobrenadantes de los cultivos se recogieron mediante centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos y se almacenaron a 4 °C para su análisis.

La cinética de unión se investigó mediante resonancia de plasmón de superficie usando un biosensor Biacore 4000 a 37 °C. Cada mutante se capturó del medio de cultivo celular a una densidad de 40-150UR en un chip sensor CM-5 inmovilizado previamente con anticuerpo anti-His (14.000 UR). En un estudio de detección inicial, se inyectó FVIII sobre los mutantes capturados durante 5 minutos a InM y se controló la disociación durante 5 minutos. Los mutantes que mostraron una disminución en la kd con respecto al tipo silvestre se volvieron a examinar con FVIII inyectado durante 5 minutos a 1,0,5 y 0,25 nM, y se controló la disociación durante 30 minutos.

Todos los sensogramas fueron referenciados doblemente por sustracción de señales de un punto de referencia (que contiene sólo anticuerpo anti-His inmovilizado) y de una inyección en blanco. La cinética de unión se determinó ajustando los sensogramas de doble referencia a un modelo cinético 1:1.

Resultados

La mutagénesis de la serina 764 a prolina generó una variante de vWF con una disminución de aproximadamente 3.5 veces en la velocidad de disociación y un aumento de 4,4 veces en la afinidad. Las mutaciones en la posición 765 no produjeron mejores aglutinantes frente al vWF de tipo silvestre. Numerosas mutaciones en la posición 766 generaron moléculas de vWF variantes con características mejoradas de velocidad de disociación y mayor afinidad que el vWF de tipo silvestre (His, Arg, Val, Tyr, Trp, Thr, Phe, Ile, Gln, Gly y Asn). Dado que la prolina en la posición 764 confirió una potenciación significativa a la velocidad de disociación, mientras que numerosas mutaciones en la posición 766 afectaron positivamente la unión, se generó una serie de mutantes que consistía en S764P y todos los demás aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo cisteína, en la posición 766. Se produjeron mutaciones similares que contenían S764P y todos los demás aminoácidos codificados genéticamente, excluyendo cisteína, en la posición 765. Varios de estos mutantes dobles tienen velocidades de disociación significativamente más lentas y mayor afinidad frente al vWF de tipo silvestre. En particular, S764P en combinación con S766I genera una variante de vWF con una disminución de 22 veces en la velocidad de disociación y un aumento de 30 veces en la afinidad.

Ejemplo 2

Fusiones de vWF con albúmina sérica humana con mutantes puntuales y unión de FVIII

El anticuerpo anti-HSA de ratón se inmovilizó en un chip CM5 usando química de acoplamiento NHS/EDC convencional. Normalmente, el nivel de inmovilización estuvo entre 10.000 y 12.000 UR. Cada lote de vWF-HSA (monómeros y dímeros) se capturó en un único punto en cada celda de flujo durante 2 minutos a diversas concentraciones que oscilan de 0,1 a 1 pg/ml. Los niveles de captura oscilaron entre 40 y 150UR. Un punto adyacente en el que se inmovilizó anti-vWF, pero no se capturó vWF-HSA se usó como referencia. La captura se realizó en cada ciclo, antes del análisis de unión de FVIII.

Se inyectó FVIII al azar y por duplicado en todos los puntos de todas las celdas de flujo a concentraciones variables dependiendo de la afinidad de la interacción y el pH del análisis. La asociación y disociación del FVIII se controló durante varios períodos de tiempo que se adaptaban mejor a la interacción que estaba teniendo lugar.

Después del período de disociación, la superficie se regeneró con una inyección de 30 segundos de glicina 25 mM a pH 2,6. El tampón de ejecución de principio a fin fue HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Citrato de Na 10 mM, CaCh 2,5 mM, BSA al 0,1 %, pH7,3 y pH5, mientras que el caudal fue de 30 pl/min. Cada interacción se midió 4 veces (n = 4) a 37 °C.

Las respuestas de unión al punto de referencia se restaron de las de los puntos capturados con vWF-HSA. A continuación, se restaron las respuestas de las inyecciones en blanco de las de todas las muestras diferentes para producir sensogramas de doble referencia. Se ajustaron los sensorgramas de doble referencia a un modelo cinético 1:1, incluyendo un término para la limitación del transporte masivo. Las tasas de asociación y disociación se ajustaron globalmente y Rmax se ajustó localmente. Los resultados obtenidos se exponen en las tablas 20 y 21.

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

continuación

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

continuación

Tabla 10

Tabla 11

Tabla 12

continuación

Tabla 13

Tabla 14

continuación

Tabla 15

Tabla 16

continuación

Tabla 17

Tabla 18

Tabla 19

continuación

Tabla 20

Tabla 21

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido modificado que se une al factor VIII en el que el polipéptido modificado comprende una secuencia de aminoácidos del dominio D' del factor de Von Willebrand humano (VWF) como se muestra en la SEQ ID NO: 3 en el que la secuencia comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 (S764G/S766Y), SEQ ID NO: 6 (S764P/S766I), SEQ ID NO: 7 (S764P/S766M), SEQ ID NO: 8 (S764V/S766Y), SEQ ID NO: 9 (S764E/S766Y), SEQ ID NO: 10 (S764Y/S766Y), SEQ ID NO: 11 (S764L/S766Y), SEQ ID NO: 12 (S764P/S766W), SEQ ID NO: 13 (S766W/S806A), SEQ ID NO: 14 (S766Y/P769K), SEQ ID NO: 15 (S766Y/P769N), SEQ ID NO: 16 (S766Y/P769R) y SEQ ID NO: 17 (S764P/S766L), de manera que el polipéptido modificado se une al Factor VIII con una velocidad de disociación al menos 5 veces menor, preferentemente al menos 10 veces menor, que un polipéptido de referencia que comprende una SEQ ID NO: 3 sin modificar.

2. El polipéptido modificado según la reivindicación 1, en el que el polipéptido modificado se une al factor VIII con una KD al menos 5 veces menor que el polipéptido de referencia.

3. El polipéptido modificado según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el polipéptido es el factor de Von Willebrand (VWF) modificado.

4. El polipéptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido modificado comprende además una proteína potenciadora de la semivida (HLEP).

5. Un complejo que comprende una molécula de factor VIII y el polipéptido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El polipéptido modificado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el complejo según la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento o profilaxis de un trastorno hemorrágico, preferentemente la enfermedad de Von Willebrand (VWD) o hemofilia A.

7. Un polinucleótido que codifica el polipéptido modificado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Un procedimiento para aumentar la afinidad de unión de VWF al factor VIII, que comprende introducir al menos dos mutaciones en el dominio D' de la secuencia de aminoácidos del VWF, en el que la secuencia del dominio D' después de la mutación se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5-17.