TWI851647B - 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體 - Google Patents

Abstract

本發明尤其提供編碼用於在哺乳動物細胞中表現之因子VIII變異體的密碼子改變之多核苷酸。在一些實施例中，本發明亦提供用於治療A型血友病之哺乳動物基因治療載體及方法。

Description

用於A型血友病基因治療之編碼表現增加之重組FVIII變異體的病毒載體

本案係關於編碼用於在哺乳動物細胞中表現之因子VIII變異體的密碼子改變之多核苷酸，相關的組合物、載體與病毒顆粒、及其用途。

凝血係經由相互依賴性生物化學反應之複雜及動態生物路徑進行，該路徑稱為凝血級聯。凝血因子VIII(FVIII)係該級聯中之關鍵組分。因子VIII募集至出血位點，且與活化因子IX(FIXa)及因子X(FX)形成Xase複合物。Xase複合物活化FX，FX又將凝血酶原活化成凝血酶，接著凝血酶活化凝血級聯中之其他組分，從而產生穩定凝塊(以下中評述：Saenko等人，Trends Cardiovasc.Med.,9：185-92(1999)；Lenting等人，Blood,92：3983-96(1998))。

A型血友病係一種特徵在於缺乏因子VIII活性之先天性X連鎖出血病症。因子VIII活性降低抑制凝血級聯中之正反饋迴路。此引起凝血不完整，顯現為持續時間增加、大範圍皮下出血、口腔及鼻自發性出血、關節僵硬及慢性疼痛且在嚴重情況下可能內出血及貧血的出血事件(Zhang等人，Clinic.Rev.Allerg.Immunol.,37：114-24(2009))。

通常，A型血友病藉由因子VIII替代療法治療，該替代療法由向 患有A型血友病之個體投與因子VIII蛋白(例如源自血漿或重組產生之因子VIII)組成。預防性投與因子VIII以回應於急性失血事件，預防出血事件或降低出血事件之頻率，及/或圍手術期投與以在手術期間管理出血。然而，因子VIII替代療法存在若干不合需要之特徵。

首先，因子VIII替代療法用於治療或管理A型血友病，但不治癒根本之因子VIII缺乏症。因此，患有A型血友病之個體在其一生中需要因子VIII替代療法。持續治療係昂貴的，且需要個體維持嚴格的順應性，因為錯過幾次預防性給藥即可能給患有重度A型血友病之個體帶來嚴重後果。

其次，因為因子VIII具有相對較短之活體內半衰期，所以習知預防性因子VIII替代療法需要每兩天或每三天投與。此給個體一生帶來負擔，以維持順應性。雖然第三代「長效」因子VIII藥物可降低投與頻率，但利用此等藥物之預防性因子FVIII替代療法仍然需要永遠每月、每週或更多頻繁投與。舉例而言，利用ELOCTATE^TM[抗血友病因子(重組)，Fc融合蛋白]之預防性治療需要每三至五天投與(ELOCTATE^TM Prescribing Information,Biogen Idec公司，(2015))。此外，經化學修飾之生物製劑(例如聚乙二醇化多肽)的長期效應尚未完全瞭解。

第三，接受因子VIII替代療法之所有個體中的15%至30%形成抗因子VIII抑制劑抗體，使得療法效率低。因子VIII繞道療法(例如投與血漿來源或重組產生之凝血酶原複合物濃縮物)可用於治療形成抑制劑抗體之個體中的血友病。然而，因子VIII繞道療法不如因子VIII替代療法有效(Mannucci P.M.,J Thromb Haemost.,1(7)：1349-55(2003))且可能引起心血管併發症之風險增加(Luu及Ewenstein,Haemophilia,10增刊2：10-16(2004))。

體細胞基因治療非常有望用於治療A型血友病，因為其將彌補根本的表現不足之功能因子VIII活性(例如由於錯義或無義突變)，而非一次給與個體因子VIII活性。由於與因子VIII替代療法相比，作用機制存在此差異，所以一 次投與因子VIII基因治療載體可提供個體因子VIII若干年，降低治療成本且消除對持續患者順應性之需要。

凝血因子IX(FIX)基因治療已有效用於治療患有B型血友病之個體，B型血友病係一種特徵在於因子IX活性減少之相關凝血病狀(Manno C.S.等人，Nat Med.,12(3)：342-47(2006))。然而，因子VIII基因治療呈現若干獨特挑戰。舉例而言，全長的野生型因子VIII多肽(2351個胺基酸；UniProt存取編號P00451)比全長的野生型因子IX多肽(461個胺基酸；UniProt存取編號P00740)大五倍。因而，野生型因子VIII之編碼序列為7053個鹼基對，其太大以致於無法包裝在習知AAV基因治療載體中。此外，據報導因子VIII之B結構域缺失變異體(BDD-FVIII)的重組表現不佳。因而，若干群體企圖改變BDD-FVIII構築體之密碼子使用，獲得有限的成功。

因此，需要編碼序列更有效地包裝至基因治療載體中且經由基因治療載體遞送之因子VIII變異體。亦需要密碼子改變之合成核酸，其更有效地表現因子VIII。亦需要密碼子改變之編碼因子VIII多肽之核酸，其與野生型因子VIII或B結構域缺失之野生型因子VIII相比，具有提高之摺疊特性、提高之自表現細胞之分泌、增加之活性及/或提高之活體內循環半衰期。此類因子VIII變異體及密碼子改變之核酸允許改善因子VIII缺乏症(例如A型血友病)之治療。所揭示之密碼子改變之因子VIII變異體減少或消除以上缺乏症及與因子VIII缺乏症(例如A型血友病)之治療相關的其他問題。

在一個態樣中，描述編碼因子VIII變異體之核酸組合物(例如密碼子改變之多核苷酸)。在一些實施例中，核酸組合物包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12(SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核 苷酸，如本文所述。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII編碼序列及/或其他密碼子優化之因子VIII編碼序列，本文所述之核酸組合物增加動物血液中之因子VIII表現及/或增加因子VIII活性。在一些實施例中，核酸組合物亦允許增加基於AAV之基因治療病毒體之產生。在一些實施例中，本文所述之核酸組合物與編碼因子VIII之野生型序列相比，GC含量降低與或包括更少CpG二核苷酸。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，由核酸組合物編碼之因子VIII變異體在活體內更有效地分泌至血液中，及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期。

在一些實施例中，核酸組合物包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，核酸組合物進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，核酸組合物進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中，核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直接附接，例如如圖11 中所描繪。

在一些實施例中，核酸組合物具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，核酸組合物具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一個態樣中，描述包括編碼因子VIII變異體之核酸的哺乳動物基因治療載體。在一些實施例中，編碼因子VIII之核酸包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12(SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，相對於包括天然編碼之因子VIII變異體多核苷酸或其他密碼子優化之因子VIII變異體多核苷酸的基因治療載體，本文所述之哺乳動物基因治療載體增加動物血液中之因子VIII表現及/或增加因子VIII活性。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，本文所述之哺乳動物基因治療載體編碼在活體內更有效地分泌至血液中及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期的因子VIII變異體蛋白。

在一些實施例中，哺乳動物基因治療載體包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，哺乳動物基因治療載體進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施 例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，哺乳動物基因治療載體進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中，核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直接附接，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，哺乳動物基因治療載體具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，哺乳動物基因治療載體包括於具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)之核酸序列的質體中。

在一個態樣中，描述包括編碼因子VIII變異體之核酸的腺相關病毒(AAV)顆粒。在一些實施例中，編碼因子VIII之核酸包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12(SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，相對於包括天然編碼之因子VIII變異體多核苷酸或其他密碼子優化之因子VIII變異體多核苷酸的AAV顆粒，本文所述之AAV顆粒增加動物血液中之因子VIII表現及/或增加因子VIII活性。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，本文所述之AAV顆粒編碼在活體內更有效地分泌至血液中及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期 的因子VIII變異體蛋白。

在一些實施例中，AAV顆粒中所含之核酸包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，AAV顆粒中所含之核酸進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，AAV顆粒中所含之核酸進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中，核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直接附接，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，AAV顆粒中所含之核酸具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，AAV顆粒中所含之核酸使用具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)之核酸 序列的質體產生。

在一個態樣中，描述用於治療A型血友病之方法，其係藉由向A型血友病患者投與編碼因子VIII變異體之核酸組合物。在一些實施例中，核酸組合物包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12(SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，本文所述之用於治療A型血友病之方法使患者血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加超過投與包括野生型因子VIII編碼序列及/或密碼子優化之不同因子VIII編碼序列之核酸組合物的患者之血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，由核酸組合物編碼之因子VIII變異體在活體內更有效地分泌至血液中，及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期。

在一些實施例中，投與之核酸組合物包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，投與之核酸組合物進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之核酸組合物進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中， 核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直接附接，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之核酸組合物具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，投與之核酸組合物具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一個態樣中，描述用於治療A型血友病之方法，其係藉由投與包括編碼因子VIII變異體之核酸之哺乳動物基因治療載體。在一些實施例中，編碼因子VIII之核酸包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12(SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，本文所述之用於治療A型血友病之方法使患者血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加超過投與包括野生型因子VIII編碼序列及/或密碼子優化之不同因子VIII編碼序列之哺乳動物基因治療載體的患者之血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，由哺乳動物基因治療載體內之核酸編碼之因子VIII變異體在活體內更有效地分泌至血液中，及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期。

在一些實施例中，投與之哺乳動物基因治療載體包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，投與之哺乳動物基因治療載體進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之哺乳動物基因治療載體進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中，核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直接附接，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之哺乳動物基因治療載體具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，投與之哺乳動物基因治療載體包括於具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)之核酸序列的質體中。

在一個態樣中，描述用於治療A型血友病之方法，其係藉由投與包括編碼因子VIII變異體之核酸之腺相關病毒(AAV)顆粒。在一些實施例中，編碼因子VIII之核酸包括編碼因子VIII變異體的與CS04(SEQ ID NO：37)或CS12 (SEQ ID NO：1)序列具有高度序列一致性的多核苷酸，如本文所述。在一些實施例中，本文所述之用於治療A型血友病之方法使患者血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加超過投與包括野生型因子VIII編碼序列及/或密碼子優化之不同因子VIII編碼序列之腺相關病毒(AAV)顆粒的患者之血液中因子VIII表現之增加及/或因子VIII活性之增加。在一些實施例中，相對於野生型因子VIII及/或其他因子VIII變異體，由腺相關病毒(AAV)顆粒內之核酸編碼之因子VIII變異體在活體內更有效地分泌至血液中，及/或在活體內在血液中具有增加之循環半衰期。

在一些實施例中，投與之AAV顆粒中所含之核酸進一步包括編碼具有CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽的多核苷酸，其中該多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。

在一些實施例中，投與之AAV顆粒中所含之核酸進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有與hTTR(SEQ ID NO：6)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%序列一致性)的序列。在一些實施例中，啟動子直接附接於因子VIII多核苷酸，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之AAV顆粒中所含之核酸進一步包括可操作地連接於因子VIII多核苷酸之肝特異性元件。在一些實施例中，肝特異性元件為與CRM8(SEQ ID NO：5)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或100%)序列一致性之強化子元件。在一些實施例中，核酸組合物包括兩個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，核酸組合物包括三個可操作地連接於因子VIII多核苷酸之此類肝特異性元件。在一些實施例中，一或多個肝特異性元件及啟動子直 接附接，例如如圖11中所描繪。

在一些實施例中，投與之AAV顆粒中所含之核酸具有與CS12-CRM8.2-Vr(SEQ ID NO：3)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)的核酸序列。

在一些實施例中，投與之AAV顆粒中所含之核酸使用具有與CS12-CRM8.2-Vrp(SEQ ID NO：10)具有至少90%序列一致性(例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%)之核酸序列的質體產生。

[圖1A及1B]共同展示編碼根據一些實施例之因子VIII變異體的CS12密碼子優化之核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(全長編碼序列為「CS12-FL-NA」)。

[圖2]展示由根據一些實施例之CS12密碼子改變之核苷酸序列編碼的因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO：2)(全長編碼序列為「CS12-FL-AA」)。

[圖3A及3B]共同展示編碼根據一些實施例之因子VIII變異體的CS12-CRM8.2-Vr核苷酸減少之基因治療載體之核酸序列(SEQ ID NO：3)。

[圖4]展示可用於編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之基因治療載體的各種遺傳元件的核酸序列，包括5'-ITR(SEQ ID NO：4)、CRM8強化子元件(SEQ ID NO：5)、人類TTR啟動子(SEQ ID NO：6)、最小科紮克序列(Kozak sequence)(SEQ ID NO：7)及合成聚腺苷化元件(SEQ ID NO：8)及3'-ITR(SEQ ID NO：9)。

[圖5A、5B及5C]共同展示含有編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之基因治療載體的CS12-CRM8.2-Vrp質體之核酸序列(SEQ ID NO：10)。

[圖6A及6B]共同展示編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之CS12-CRM8.2-V基因治療載體的核酸序列(SEQ ID NO：38)。

[圖7A及7B]共同展示編碼根據一些實施例之因子VIII變異體的CS04密碼子優化之核苷酸序列(SEQ ID NO：37)(全長編碼序列為「CS12-FL-NA」)。

[圖8A及8B]共同展示插入根據一些實施例之因子VIII變異體之B-結構域取代連接子中的例示性糖基化肽之胺基酸及核苷酸序列。「NG1」或「NG1-AA」為胺基酸序列之代碼，以頂線展示。「NG1-NA」為核酸序列之代碼，每組以底線展示。圖8A及8B揭示胺基酸序列為SEQ ID NO 11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35，且揭示核苷酸序列為SEQ ID NO 12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36，所有均分別呈出現次序。

[圖9]展示在Huh-7細胞中表現之因子VIII變異體之西方墨點分析，該等變異體具有(vNG4/CS04、vNG5/CS04及vNG16/CS04)及不具有(具有SQ之vCS04)經工程改造至SQ連接子中之糖基化肽。

[圖10]展示在AAV8基因治療載體感染之後，在HepG2細胞中表現之因子VIII變異體之西方墨點分析，該等變異體具有(vNG4/CS04、vNG5/CS04及vNG16/CS04)及不具有(具有SQ之vCS04)經工程改造至SQ連接子中之糖基化肽。

[圖11]示出編碼根據一些實現方式之因子VIII變異體的例示性因子VIII基因治療構築體。

[圖12]展示在用編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之AAV8基因治療載體感染之後，在活體內「品系E」hFVIII耐受小鼠模型中及在活體外使用HepG2細胞的因子VIII活性水準。

[圖13]展示編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之vCS04、 vX5/NG5/CS120及vX5/NG5/CS12基因治療載體的瓊脂糖凝膠電泳分析。

[圖14]展示在用編碼根據一些實施例之因子VIII變異體蛋白之AAV8基因治療載體感染之後，在活體內FVIII E17敲入小鼠模型中及在活體外使用HepG2細胞(一種人類肝細胞株，ATCC #HB-8065)的因子VIII活性水準。

[圖15]展示野生型及Refacto型人類因子VIII蛋白質構築體以及含有X5突變及NG5糖基化肽之由CS12多核苷酸編碼之因子VIII蛋白質的示意圖。

[圖16]展示根據一些實施例之野生型人類因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：39)(「FVIII-FL-AA」)。

[圖17]展示根據一些實施例之B-結構域取代連接子的示例編碼序列(SEQ ID NO 41-53，分別呈出現次序)。BDLO04(SEQ ID NO：41)為編碼B-結構域取代連接子之CS04密碼子改變之核苷酸序列的部分。

[圖18]展示用於整合根據一些實施例之因子VIII基因治療基因組的示例質體主鏈(SEQ ID NO：54)。

[圖19]展示根據一些實施例可用於整合因子VIII基因治療基因組之質體的示例複製子(「pMB1複製子」-SEQ ID NO：55)及安比西林抗性標記物(「Bla(ApR)」-SEQ ID NO：56)。

[圖20A、20B及20C]共同展示含有編碼根據一些實施例之因子VIII變異體之基因治療載體的CS12-CRM8.2-Vp質體之核酸序列(SEQ ID NO：57)。

I.引言

基於AAV之基因治療非常有望用於治療血友病患者。對於B型血友病，第一臨床資料振奮人心，因為至少在一些患者中可維持約10%之FIX水準 超過1年。然而，對於A型血友病，出於種種原因，用AAV載體實現5-10%之治療表現水準仍然具有挑戰性。首先，因子VIII編碼序列對於習知之基於AAV之載體而言過大。第二，即使進行密碼子優化，經工程改造之B-結構域缺失或截短之因子VIII構築體仍然在活體內表現不佳。第三，此等B-結構域缺失或截短之因子VIII變異體構築體的活體內半衰期短，加重不良表現之影響。第四，即使表現，FVIII亦沒有如其他凝血因子諸如因子IX一般自細胞有效地分泌。

本發明部分關於含有密碼子改變之因子VIII變異體編碼序列之基因治療載體的發現，此解決此等問題及與因子VIII基因治療相關之其他問題。舉例而言，在一些實施例中，本文揭示之因子VIII變異體多核苷酸、多肽及基因治療構築體提高哺乳動物細胞中外源性因子VIII表現。在一些實施例中，本文揭示之因子VIII變異體多核苷酸、多肽及基因治療構築體提高活體內生體可用率(例如提高患者血液中之因子VIII活性)。在一些實施例中，本文揭示之因子VIII變異體多核苷酸、多肽及基因治療構築體提高患者血液中外源性因子VIII之循環半衰期。如本文所述，藉由使用基因治療系統之以下改善中之一或多者的任何組合，來實現此等優點中之一或多者。

在一些實現方式中，藉由如本文所述，將X5突變工程改造至由密碼子改變之因子VIII多肽編碼的因子VIII變異體多肽中來實現此等優點中之一或多者。有利地，如本文所述，編碼因子VIII多肽中X5突變之包括提高活體內及活體外外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例4中所述，在投與編碼Refacto因子VIII-X5變異體之AAV基因治療載體之後，與投與編碼野生型Refacto因子VIII變異體之另外一致基因治療載體的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽之重鏈之A1結構域中包括五個X5突變可使品系E2小鼠中活體內外源性因子VIII生物效能增加3倍(圖12中比較vX5/CS24與vCS04)。在與活體內結果一致，在用編碼Refacto因子VIII-X5變異體之AAV基因治療載體感染HepG2細胞之後， 與用編碼野生型Refacto因子VIII變異體之另外一致基因治療載體的HepG2細胞相比，在因子FVIII重鏈之A1結構域中包括五個X5突變可使活體外外源性因子VIII生物效能增加4倍(圖12中比較vX5/CS24與vCS04)。

在一些實現方式中，如本文所述，藉由將NG5糖基化肽工程改造至由密碼子改變之因子VIII多肽編碼之因子VIII變異體多肽之B-結構域連接子中來實現此等優點中之一或多者。有利地，如本文所述，編碼之因子VIII多肽中包括NG5糖基化肽提高活體內外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例3中所述，在投與編碼Refacto因子VIII-NG5變異體之AAV基因治療載體之後，與投與編碼野生型Refacto因子VIII變異體之另外一致基因治療載體的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽之SQ-連接子中包括NG糖基化肽可使品系E2小鼠中活體內外源性因子VIII生物效能增加2倍(圖12中比較vNG5/CS04與vCS04)。

在一些實現方式中，如本文所述，藉由將X5突變與NG5糖基化肽兩者工程改造至由密碼子改變之因子VIII多肽編碼之因子VIII變異體多肽中來實現此等優點中之一或多者。有利地，如本文所述，編碼之因子VIII多肽中包括X5突變及NG5糖基化肽提高活體內及活體外外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例5中所述，在投與編碼Refacto因子VIII-X5/NG5變異體之AAV基因治療載體之後，與投與編碼野生型Refacto因子VIII變異體之另外一致基因治療載體的小鼠相比，在Refacto FVIII多肽之重鏈之A1結構域中包括五個X5突變及在Refacto FVIII多肽之SQ-連接子中包括NG5糖基化肽可使品系E2小鼠中活體內外源性因子VIII生物效能增加4.5倍(圖12中比較vX5/NG5/CS125與vCS04)。與活體內結果一致，在用編碼Refacto因子VIII-X5/NG5變異體之AAV基因治療載體感染HepG2細胞之後，與用編碼野生型Refacto因子VIII變異體之另外一致基因治療載體的HepG2細胞相比，在Refacto FVIII多肽之重鏈之A1結構域中包括五個X5突變及在Refacto FVIII多肽之SQ-連接子中包括NG5糖基化肽可使活 體外外源性因子VIII生物效能增加3倍(圖12中比較vX5/NG5/CS125與vCS04)。

在一些實現方式中，藉由在編碼因子VIII變異體多肽之多核苷酸序列上游使用人類hTTR啟動子及一或多個肝特異性CRM8元件來實現此等優點中之一或多者。有利地，hTTR啟動子及一或多個肝特異性CRM8元件之使用在活體外提高人類細胞中外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例2中所述，與小鼠TTR啟動子及強化子序列之使用相比，hTTR啟動子及一或兩個肝特異性CRM8元件之使用分別使HepG2細胞中活體內外源性因子VIII生物效能增加約2倍及4倍(圖12中比較vCS115及vCS116與vCS04)。

在一些實現方式中，藉由移除位於編碼因子VIII變異體蛋白之AAV基因治療載體之各種元件之間的外來核苷酸來實現此等優點中之一或多者。有利地，移除各種元件之間的外來核苷酸在活體外提高人類細胞中外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例6中所述，自編碼Refacto因子VIII-X5/NG5變異體之vX5/NG5/CS120 AAV基因治療載體移除僅71個核苷酸即可使表現之因子VIII變異體的活體外生物效能提高50%(圖14中比較vX5/NG5/CS12與vX5/NG5/CS120)。

在一些實現方式中，藉由將X5突變及NG5糖基化肽兩者工程改造至由密碼子改變之因子VIII多肽編碼之因子VIII變異體多肽中及在編碼因子VIII變異體多肽之多核苷酸序列上游使用人類hTTR啟動子及一或多個肝特異性CRM8元件來實現此等優點中之一或多者。有利地，使用提高措施之此組合在活體內及活體外提高外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例6中所述，相對於包括針對編碼之野生型Refacto因子VIII具有使用鼠類TTR啟動子及強化子序列之相同密碼子改變之多核苷酸的AAV基因治療載體之使用，AAV基因治療載體中提高措施之此組合之使用使活體內生物效能增加14.5倍(圖14中比較vX5/NG5/CS120與vSC04)。與活體內結果一致，相對於包括針對編碼之野生型 Refacto因子VIII具有使用鼠類TTR啟動子及強化子序列之相同密碼子改變之多核苷酸的AAV基因治療載體之使用，AAV基因治療載體中提高措施之此組合之使用使活體外生物效能增加17倍(圖14中比較vX5/NG5/CS120與vSC04)。如WO 2017/083762(其內容在此以引用之方式併入本文中)之表4中所報導，相對於使用野生型編碼序列編碼Refacto因子VIII多核苷酸之同等基因治療載體，vCS04載體在活體內提供大超過70倍之FVIII生物效能。因此，預期相對於野生型Refacto編碼序列之使用，vX5/NG5/CS120基因治療載體將提供1000倍至1250倍之FVIII生物效能增加。

在一些實現方式中，藉由將X5突變及NG5糖基化肽兩者工程改造至由密碼子改變之因子VIII多肽編碼之因子VIII變異體多肽中，在編碼因子VIII變異體多肽之多核苷酸序列上游使用人類hTTR啟動子及一或多個肝特異性CRM8元件，以及移除位於AAV基因治療載體之各種元件之間的外來核苷酸來實現此等優點中之一或多者。有利地，使用提高措施之此組合在活體內及活體外提高外源性表現之因子VIII的生物效能。舉例而言，如實例6中所述，相對於包括針對編碼之野生型Refacto因子VIII具有使用鼠類TTR啟動子及強化子序列之相同密碼子改變之多核苷酸的AAV基因治療載體之使用，AAV基因治療載體中提高措施之此組合之使用使活體內生物效能增加14倍(圖14中比較vX5/NG5/CS12與vSC04)。與活體內結果一致，相對於包括針對編碼之野生型Refacto因子VIII具有使用鼠類TTR啟動子及強化子序列之相同密碼子改變之多核苷酸的AAV基因治療載體之使用，AAV基因治療載體中提高措施之此組合之使用使活體外生物效能增加24倍(圖14中比較vX5/NG5/CS12與vSC04)。如WO 2017/083762(其內容在此以引用之方式併入本文中)之表4中所報導，相對於使用野生型編碼序列編碼Refacto因子VIII多核苷酸之同等基因治療載體，vCS04載體在活體內提供大超過70倍之FVIII生物效能。因此，預期相對於野生型Refacto編 碼序列之使用，vX5/NG5/CS120基因治療載體將提供1000倍至1750倍之FVIII生物效能增加。

II.定義

除非另外指定，否則如本文所用，以下術語具有歸於其之含義。

如本文所用，術語「因子VIII」及「FVIII」可互換使用，且係指例如如使用歐洲藥典(European Pharmacopoeia)9.0之第2.7.4中所述之兩步顯色因子X活化分析所量測，具有因子VIII活性之任何蛋白質(例如活性FVIII，常常稱為FVIIIa)或在特定條件下具有因子IXa輔因子活性之蛋白質之蛋白前驅體(例如前蛋白或前蛋白原)。在一示例性實施例中，因子VIII多肽係指具有與野生型因子VIII多肽之重鏈及輕鏈具有高序列一致性(例如至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多)之序列的多肽。在一些實施例中，因子VIII多肽之B-結構域缺失，截短，或替換為連接子多肽，以減小編碼因子VIII多肽之多核苷酸的尺寸。

野生型因子VIII多肽之非限制性實例包括人類前因子VIII原(例如GenBank存取編號AAA52485、CAA25619、AAA58466、AAA52484、AAA52420、AAV85964、BAF82636、BAG36452、CAI41660、CAI41666、CAI41672、CAI43241、CAO03404、EAW72645、AAH22513、AAH64380、AAH98389、AAI11968、AAI11970或AAB61261)、對應前因子VIII及其天然變異體；豬科前因子VIII原(例如UniProt存取編號F1RZ36或K7GSZ5)、對應前因子VIII及其天然變異體；小鼠前因子VIII原(例如GenBank存取編號AAA37385、CAM15581、CAM26492或EDL29229)、對應前因子VIII及其天然變異體；大鼠前因子VIII原(例如GenBank存取編號AAQ21580)、對應前因子VIII及其天然變異體；大鼠前因子VIII原；及其他哺乳動物因子VIII同源物(例如猴、猿、倉鼠、豚鼠等)。

如本文所用，因子VIII多肽包括天然變異體及具有因子IX輔因子活性之人工構築體。如本發明中所用，因子VIII涵蓋保留一些基礎因子IX輔因子活性(例如對應野生型活性)之至少5%、10%、25%、50%、75%或更多)之任何天然變異體、替代序列、同功型或突變蛋白。

因子VIII變異體特別包括在「因子VIII」之定義內，有時亦稱「變異FVIII」。與人類野生型FVIII相比，變異FVIII蛋白質具有至少一個胺基酸修飾。在人群中發現之因子VIII胺基酸變體(相對於FVIII-FL-AA(SEQ ID NO：19))之實例包括不限於S19R、R22T、Y24C、Y25C、L26P/R、E30V、W33G、Y35C/H、G41C、R48C/K、K67E/N、L69P、E72K、D75E/V/Y、P83R、G89D/V、G92A/V、A97P、E98K、V99D、D101G/H/V、V104D、K108T、M110V、A111T/V、H113R/Y、L117F/R、G121S、E129V、G130R、E132D、Y133C、D135G/Y、T137A/I、S138R、E141K、D145H、V147D、Y155H、V159A、N163K、G164D/V、P165S、C172W、S176P、S179P、V181E/M、K185T、D186G/N/Y、S189L、L191F、G193R、L195P、C198G、S202N/R、F214V、L217H、A219D/T、V220G、D222V、E223K、G224W、T252I、V253F、N254I、G255V、L261P、P262L、G263S、G266F、C267Y、W274C、H275L、G278R、G280D、E284K、V285G、E291G/K、T294I、F295L、V297A、N299I、R301C/H/L、A303E/P、I307S、S308L、F312S、T314A/I、A315V、G323E、L326P、L327P/V、C329F、I331V、M339T、E340K、V345A/L、C348R/S/Y、Y365C、R391C/H/P、S392L/P、A394S、W401G、I405F/S、E409G、W412G/R、K427I、L431F/S、R437P/W、I438F、G439D/S/V、Y442C、K444R、Y450D/N、T454I、F455C、G466E、P470L/R/T、G474E/R/V、E475K、G477V、D478N、T479R、F484C、A488G、R490G、Y492C/H、Y492H、I494T、P496R、G498R、R503H、G513S/V、I522Y、K529E、W532G、P540T、T541S、D544N、R546W、R550C/G/H、S553P、S554C/G、V556D、R560T、D561G/H/Y、I567T、P569R、S577F、V578A、D579A/H、 N583S、Q584H/K/R、I585R/T、M586V、D588G/Y、L594Q、S596P、N601D/K、R602G、S603I/R、W604C、Y605H/S、N609I、R612C、N631K/S、M633I、S635N、N637D/I/S、Y639C、L644V、L650F、V653A/M、L659P、A663V、Q664P、F677L、M681I、V682F、Y683C/N、T686R、F698L、M699T/V、M701I、G705V、G710W、N713I、R717L/W、G720D/S、M721I/L、A723T、L725Q、V727F、E739K、Y742C、R795G、P947R、V1012L、E1057K、H1066Y、D1260E、K1289Q、Q1336K、N1460K、L1481P、A1610S、I1698T、Y1699C/F、E1701K、Q1705H、R1708C/H、T1714S、R1715G、A1720V、E1723K、D1727V、Y1728C、R1740G、K1751Q、F1762L、R1768H、G1769R、L1771P、L1775F/V、L1777P、G1779E/R、P1780L、I1782R、D1788H、M1791T、A1798P、S1799H、R1800C/G/H、P1801A、Y1802C、S1803Y、F1804S、L1808F、M1842I、P1844S、T1845P、E1848G、A1853T/V、S1858C、K1864E、D1865N/Y、H1867P/R、G1869D/V、G1872E、P1873R、L1875P、V1876L、C1877R/Y、L1882P、R1888I、E1894G、I1901F、E1904D/K、S1907C/R、W1908L、Y1909C、A1939T/V、N1941D/S、G1942A、M1945V、L1951F、R1960L/Q、L1963P、S1965I、M1966I/V、G1967D、S1968R、N1971T、H1973L、G1979V、H1980P/Y、F1982I、R1985Q、L1994P、Y1998C、G2000A、T2004R、M2007I、G2013R、W2015C、R2016P/W、E2018G、G2022D、G2028R、S2030N、V2035A、Y2036C、N2038S、2040Y、G2045E/V、I2051S、I2056N、A2058P、W2065R、P2067L、A2070V、S2082N、S2088F、D2093G/Y、H2101D、T2105N、Q2106E/P/R、G2107S、R2109C、I2117F/S、Q2119R、F2120C/L、Y2124C、R2135P、S2138Y、T2141N、M2143V、F2145C、N2148S、N2157D、P2162L、R2169C/H、P2172L/Q/R、T2173A/I、H2174D、R2178C/H/L、R2182C/H/P、M2183R/V、L2185S/W、S2192I、C2193G、P2196R、G2198V、E2200D、I2204T、I2209N、A2211P、A2220P、P2224L、R2228G/L/P/Q、L2229F、V2242M、W2248C/S、V2251A/E、M2257V、T2264A、 Q2265R、F2279C/I、I2281T、D2286G、W2290L、G2304V、D2307A、P2319L/S、R2323C/G/H/L、R2326G/L/P/Q、Q2330P、W2332R、I2336F、R2339T、G2344C/D/S及C2345S/Y。因子VIII蛋白亦包括含有轉譯後修飾之多肽。

一般地，編碼因子VIII之多核苷酸編碼進行轉譯後加工以形成活性因子VIII蛋白(例如FVIIIa)之非活性單鏈多肽(例如前蛋白原)。舉例而言，參看圖15，首先使野生型人類因子VIII前蛋白原裂解以釋放編碼之信號肽(未示)，形成第一單鏈前蛋白(示為「人類野生型FVIII」)。接著使前蛋白在B結構域與A3結構域之間裂解，以形成包括因子VIII重鏈(例如A1及A2結構域)及B-結構域之第一多肽，及包括因子VIII輕鏈(例如包括A3、C1及C3結構域)之第二多肽。進一步使第一多肽裂解以移除B-結構域，且亦分離A1及A2結構域，在成熟因子VIIIa蛋白中A1及A2結構域保持與因子VIII輕鏈締合。關於因子VIII成熟過程之評述，參見Graw等人，Nat Rev Genet.,6(6)：488-501(2005)，其內容以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的。

如本文所用，術語「因子VIII重鏈」或簡稱「重鏈」係指因子VIII多肽之A1及A2結構域之聚集體。在一示例性實施例中，hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO：39)之胺基酸20-759構成因子VIII重鏈。

如本文所用，術語「因子VIII輕鏈」或簡稱「輕鏈」係指因子VIII多肽之A3、C1及C2結構域之聚集體。在一示例性實施例中，hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO：39)之胺基酸1668-2351構成因子VIII輕鏈。在一些實施例中，因子VIII輕鏈不包括酸性a3肽，其在活體內成熟期間釋放。

一般地，因子VIII重鏈及輕鏈可表示為單一多肽鏈，例如與視情況存在之B-結構域或B-結構域取代之連接子一起。然而，在一些實施例中，因子VIII重鏈及因子VIII輕鏈可表示為單獨多肽鏈(例如共同表現)，且重新組成以形成因子VIII蛋白(例如在活體內或活體外)。

如本文所用，術語「B-結構域取代之連接子」及「因子VIII連接子」可互換使用，且係指野生型因子VIII B-結構域之截斷型式(例如hFVIII-FL-AA(SEQ ID NO：39)之胺基酸760-1667))或經工程改造以替換因子VIII多肽之B-結構域之肽。如本文所用，因子VIII連接子位於根據一些實施例之因子VIII變異體多肽中因子VIII重鏈之C端與因子VIII輕鏈之N端之間。B-結構域取代之連接子之非限制性實例揭示於美國專利第4,868,112號、第5,112,950號、第5,171,844號、第5,543,502號、第5,595,886號、第5,610,278號、第5,789,203號、第5,972,885號、第6,048,720號、第6,060,447號、第6,114,148號、第6,228,620號、第6,316,226號、第6,346,513號、第6,458,563號、第6,924,365號、第7,041,635號及第7,943,374號；美國專利申請公開案第2013/024960號、第2015/0071883號及第2015/0158930號；及PCT公開案第WO 2014/064277號及第WO 2014/127215號，其揭示內容以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的。

除非本文中另作說明，因子VIII胺基酸之編號係指在圖16中呈SEQ ID NO：39呈現之全長野生型人類因子VIII序列(hFVIII-FL-AA)中之對應胺基酸。因而，當提及本文揭示之因子VIII變異體蛋白中之胺基酸取代時，所述胺基酸編號係指全長野生型因子VIII序列中之類似(例如在結構上或功能等效)及/或同源(例如在最初胺基酸序列中進化保守)胺基酸。舉例而言，T2105N胺基酸取代係指在全長野生型人類因子VIII序列(hFVIII-FL-AA；SEQ ID NO：39)之位置2105上的T至N取代、在由CS12編碼之因子VIII變異體蛋白(CS12-FL-AA；SEQ ID NO：2)之位置1218上的T至N取代。

如本文所述，因子VIII胺基酸編號系統視是否包括因子VIII信號肽(例如全長野生型人類因子VIII序列之胺基酸1-19)而定。在包括信號肽之情況下，編號稱為「包括信號肽」或「SPI」。在不包括信號肽之情況下，編號稱為「排除信號肽」或「SPE」。舉例而言，F328S為SPI編號，在SPE編號中相同胺 基酸為F309S。除非另外指示，否則所有胺基酸編號係指在圖16中呈SEQ ID NO：39呈現之全長野生型人類因子VIII序列(hFVIII-FL-AA)中之對應胺基酸。

如本文所述，與由天然編碼之因子VIII構築體(例如使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之多核苷酸)提供的因子VIII表現之水準相比，密碼子改變之多核苷酸使活體內轉殖基因因子VIII之表現增加(例如當作為基因治療載體之一部分投與時)。如本文所用，術語「表現增加」係指與投與天然編碼之因子VIII構築體之動物的血液中轉殖基因因子VIII活性之水準相比，投與編碼因子VIII之密碼子改變之多核苷酸的動物之血液中的轉殖基因因子VIII活性之水準增加。可使用所屬領域中已知之任何因子VIII活性，例如歐洲藥典9.0之第2.7.4章中所述之兩步顯色因子X活化分析量測活性水準。用於測定因子VIII活性之一例示性分析為Technochrome FVIII分析(Technoclone,Vienna,Austria)。

在一些實施例中，生體可用率增加係指與投與天然編碼之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的轉殖基因因子VIII多肽之水準相比，投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的轉殖基因因子VIII多肽大至少25%。在一些實施例中，生體可用率增加係指與投與包括相同或不同的密碼子改變之因子VIII多核苷酸之不同基因治療載體的動物之血液中的轉殖基因因子VIII多肽之水準相比，投與包括密碼子改變之因子VIII多核苷酸之改良基因治療載體的動物之血液中的轉殖基因因子VIII多肽大至少25%。在一些實施例中，表現增加係指投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之動物的血液中轉殖基因因子VIII活性大至少50%、至少75%、至少100%、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍、至少225倍或至少250倍。

本文中「因子VIII」意謂經由野生型因子IX中Arg194-Ile195肽鍵之水解，促進因子X多肽由因子IXa、例如因子IXa輔因子活性裂解之能力，因此使因子X活化成因子Xa。可使用所屬領域中已知之任何因子VIII活性量測活性水準；本文中概述合適分析。用於測定因子VIII活性之一例示性分析為歐洲藥典9.0之第2.7.4章中所述之兩步顯色因子X活化分析。

如本文所用，術語「生物效能」係指活體內個體血液中或活體外細胞培養上清液中因子VIII活性之量。在一些實施例中，生物效能將指每單位體積之活性之量，諸如活體內每毫升血液或活體外每毫升細胞培養上清液之因子XIa輔因子活性單位。在一些實施例中，生物效能將表示為相對於第一水準，例如天然編碼之因子VIII蛋白或密碼子優化之天然因子VIII(例如『野生型』Refecto FVIII蛋白)之增加倍數。在一些實施例中，如本文所用，外源性表現之因子VIII的生物效能係指由自基因治療載體表現之重組因子VIII蛋白提供的因子VIII活性之量。亦即，相比於天然因子VIII活性之任何基線量的血液或細胞培養上清液中因子VIII活性之量。因此，藉由增加外來因子VIII蛋白之表現水準及/或增加外來因子VIII蛋白之比活性，例如藉由包括賦予更大比活性之胺基酸取代(諸如X5突變)中的一者或兩者，可實現生物效能之增加。

在一些實施例中，例如代替因子VIII表現及/或生體可用率增加或除此之外，藉由投與因子VIII多核苷酸之動物之血液中因子VIII活性的增加來評估因子VIII多核苷酸組合物之治療潛能。在一些實施例中，如本文所用，因子VIII活性增加係指投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的因子VIII活性相對於投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之前動物之血液中的基線因子VIII活性的增加比投與天然編碼之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的因子VIII活性相對於投與天然編碼之因子VIII多核苷酸之前動物之血液中的基線因子VIII活性的增加大。在一些實施例中，因子VIII活性增加係指投與密碼子改變之 因子VIII多核苷酸之動物的血液中的因子VIII活性相對於投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之前動物之血液中的因子VIII活性之基線水準的增加比投與天然編碼之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的因子VIII活性水準相對於投與天然編碼之因子VIII多核苷酸之前動物中的因子VIII活性之基線水準的增加大至少25%。在一些實施例中，因子VIII活性增加係指投與包括密碼子改變之因子VIII多核苷酸之改良基因治療載體的動物之血液中的因子VIII活性相對於投與該改良基因治療載體之前動物之血液中的因子VIII活性之基線水準的增加比投與包括相同或不同的密碼子改變之因子VIII多核苷酸之不同基因治療載體的動物之血液中的因子VIII活性水準相對於投與該不同基因治療載體之前動物中的因子VIII活性之基線水準的增加大至少25%。在一些實施例中，因子VIII活性增加係指投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之動物的血液中的因子VIII活性相對於投與密碼子改變之因子VIII多核苷酸之前動物之血液中的因子VIII活性之基線水準的增加比投與天然編碼之因子VIII多核苷酸或包括相同或不同的密碼子改變之因子VIII多核苷酸之不同基因治療載體之動物的血液中的因子VIII活性水準相對於投與天然編碼之因子VIII多核苷酸或包括相同或不同的密碼子改變之因子VIII多核苷酸之不同基因治療載體之前動物之血液中的因子VIII活性之基線水準的增加大至少50%、至少75%、至少100%、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少125倍、至少150倍、至少175倍、至少200倍、至少225倍或至少250倍。如本文所述，使用歐洲藥典9.0第2.7.4章中所述之兩步顯色因子X活化分析量測活性。

如本文所述，與由天然編碼之因子VIII構築體(例如使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之多核苷酸)提供的載體產生水準相比，密碼 子改變之多核苷酸使載體產生增加。如本文所用，術語「病毒產生增加」係指與接種天然編碼之因子VIII構築體之細胞培養物中的載體產率相比，接種密碼子改變之編碼因子VIII之多核苷酸的細胞培養物中之載體產率(例如每公升培養物之效價)增加。可使用所屬領域中已知之任何載體效價分析量測載體產率。用於測定載體產率(例如AAV載體)之一例示性分析為靶向AAV2反向末端重複序列之qPCR(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods：Part B 23：18-28(2012))。

在一些實施例中，病毒產生增加係指密碼子改變之載體產率比相同類型培養物中天然編碼之因子VIII構築體之產率大至少25%。在一些實施例中，病毒產生增加係指包括密碼子改變之因子VIII多核苷酸之改良載體比包括相同或不同的密碼子改變之因子VIII多核苷酸之不同載體的產率大至少25%。在一些實施例中，載體產生增加係指密碼子改變之載體產率大至少50%、至少75%、至少100%、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。

如本文所用，術語「血友病」係指廣義上，特徵在於血液凝固或凝血減少之一組疾病病況。血友病可指A型、B型或C型血友病或所有三種疾病類型之複合疾病。A型血友病(A型血友病)係由因子VIII(FVIII)活性減少或喪失引起，且在血友病亞型中最突出。B型血友病(血友病B)由因子IX(FIX)凝血功能喪失或減少引起。C型血友病(血友病C)係因子XI(FXI)凝血活性喪失或減少之結果。A型血友病及B為X連鎖疾病，而血友病C為常染色體疾病。習知用於血友病之治療包括諸如FVIII、FIX(包括Bebulin®-VH)及FXI之凝血因子以及FEIBA-VH、去胺加壓素(desmopressin)及血漿輸注的預防性與根據需求投與。

如本文所用，術語「FVIII基因治療」包括向患者提供編碼因子VIII之核酸以減輕、減少一或多種與血友病相關之症狀(例如臨床因素)或預防其復發的任何治療方法。該術語涵蓋投與包含編碼因子VIII分子，包括因子VIII之任何 修飾形式(例如因子VIII變異體)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，以維持或改善患有血友病之個體的健康。所屬領域之技術人員將瞭解，FVIII療法之過程或FVIII治療劑之劑量可例如基於根據本發明獲得之結果變化。

如本文所用，術語「因子VIII基因治療」或「FVIII基因治療」包括向患者提供編碼因子VIII多肽之核酸以減輕、減少一或多種與因子VIII缺乏症(例如A型血友病)相關之症狀(例如臨床因素)或預防其復發的任何治療方法。該術語涵蓋投與包含編碼因子VIII分子，包括因子VIII之任何修飾形式(例如具有X5突變、B-結構域缺失及/或插入B-結構域連接子多肽中之糖基化肽的因子VIII變異體)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，以維持或改善患有因子VIII缺乏症(例如A型血友病)之個體之健康。所屬領域之技術人員將瞭解，FVIII基因治療之過程或FVIII基因治療之劑量可例如基於根據本發明獲得之結果變化。

如本文所用，術語「繞道療法」包括向患者提供非因子VIII止血劑、化合物或凝血因子以減輕、減少一或多種與血友病相關之症狀(例如臨床因素)或預防其復發的任何治療方法。非因子VIII化合物及凝血因子包括(但不限於)因子VIII抑制劑繞道活性(FEIBA)、重組活化因子VII(FVIIa)、凝血酶原複合物濃縮物及活化凝血酶原複合物濃縮物。此等非因子VIII化合物及凝血因子可為重組的或源於血漿。所屬領域之技術人員將瞭解，繞道療法之過程或繞道療法之劑量可例如基於根據本發明獲得之結果變化。

如本文所用，包括編碼因子VIII分子之核酸及習知A型血友病治療劑之投與的「組合療法」包括向患者提供編碼因子VIII分子之核酸與因子VIII分子及/或非因子VIII止血劑(例如繞道治療劑)以減輕、減少一或多種與血友病相關之症狀(例如臨床因素)或預防其復發的任何治療方法。該術語涵蓋投與包括編碼因子VIII分子，包括因子VIII之任何修飾形式之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，此可用於維持或改善患有血友病之個體的健康且包括本文所述之任 一治療劑。

術語「治療有效量或劑量」或「治療充足量或劑量」或「有效或充足量或劑量」係指產生投與其所要達成之治療作用的劑量。舉例而言，可用於治療血友病之藥物的治療有效量可為能夠預防或減輕一或多種與血友病相關之症狀的量。

在一些實施例中，治療學上有效治療引起個體中出血事件之頻率及/或嚴重度下降。

在一些實施例中，治療學上有效治療引起患者血流中之因子VIII活性相比於治療之前的活性增加。

如本文所用，術語「基因」係指編碼多肽鏈之DNA分子之區段(例如編碼區)。在一些實施例中，基因由緊靠編碼區域之前、之後及/或插入編碼區的與產生多肽鏈相關之區域(例如諸如啟動子、強化子、聚腺苷酸化序列、5'未轉譯區、3'未轉譯區或內含子之調控元件)定位。

如本文所用，術語「調控元件」係指諸如啟動子、強化子、終止子、聚腺苷酸化序列、內含子等提供編碼序列在細胞中之表現的核苷酸序列。

如本文所用，術語「啟動子元件」係指幫助控制編碼序列之表現的核苷酸序列。一般地，啟動子元件位於基因之轉譯起始位點之5'。然而，在某些實施例中，啟動子元件可位於內含子序列內或編碼序列或3'。在一些實施例中，可用於基因治療載體之啟動子源自於標靶蛋白(例如因子VIII啟動子)之天然基因。在一些實施例中，可用於基因治療載體之啟動子對在標靶生物體之特定細胞或組織中表現具有特異性(例如肝特異性啟動子)。在其他實施例中，複數個充分表徵之啟動子元件中之一者用於本文所述之基因治療載體。充分表徵之啟動子元件之非限制性實例包括CMV早期啟動子、β-肌動蛋白啟動子及甲基CpG結合蛋白2(MeCP2)啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型啟動子，其驅動 標靶蛋白之基本上恆定表現。在其他實施例中，啟動子為誘導型啟動子，其驅動標靶蛋白響應於特定刺激物(例如暴露於特定治療或藥劑)之表現。關於設計用於AAV介導之基因治療之啟動子的評述，參見Gray等人(Human Gene Therapy 22：1143-53(2011))，其內容以引用的方式整體明確併入本文中以達成所有目的。

如本文所用，「CRM8」元件係指源自於SERPINA1基因(NCBI存取編號NM_000295.4)之順式作用之調控模組，其以肝特異性方式增強可操作地連接之基因、例如編碼因子VIII多肽之序列的表現，與SEQ ID NO：5具有高度序列一致性。在一些實施例中，CRM8元件與SEQ ID NO：5一致。如本文所用，CRM8元件係指調控元件之單一複本，在一些實施例中，其包括於因子VIII多核苷酸內之一或多個複本、例如1個、2個、3個或更多個複本中。關於CRM元件、諸如CRM8之進一步資訊，參見Chuah MK等人，Mol Ther.,22(9)：1605-13(2014)，其以引用之方式併入本文中。

如本文所用，術語「可操作地連接」係指第一參考核苷酸序列(例如基因)與第二核苷酸序列(例如調控控制元件)之間的關係，該關係允許第二核苷酸序列影響一或多種與第一參考核苷酸序列相關之特性(例如轉錄速率)。在本發明之上下文中，當調控元件位於基因治療載體內以使得其對因子VIII轉殖基因之轉錄發揮作用(例如促進性或組織選擇性作用)時，調控控制元件可操作地連接於因子VIII轉殖基因。

如本文所用，術語「載體」係指用於將核酸(例如編碼因子VIII基因治療構築體)轉移至宿主細胞中之任何媒劑。在一些實施例中，載體包括複製子，複製子用於複製媒劑以及標靶核酸。可用於基因治療之非限制性實例包括質體、噬菌體、黏粒、人工染色體及病毒，其充當活體內自主複製單元。在一些實施例中，載體為用於引入標靶核酸(例如編碼因子VIII變異體之密碼子改變之多核苷酸)之病毒媒劑。所屬領域中已知可用於基因治療之許多經修飾之真 核病毒。舉例而言，腺相關病毒(AAV)尤其非常適用於人類基因治療中，因為人類為該病毒之天然宿主，已知該等天然病毒不引起任何疾病，且該等病毒引發輕度免疫反應。

如本文所用，術語「因子VIII病毒載體」係指包含編碼因子VIII多肽之因子VIII多核苷酸之重組病毒，其在引入合適動物宿主(例如人類)中時足夠表現因子VIII多肽。編碼因子VIII多肽之密碼子改變之因子VIII多核苷酸插入病毒基因組中之重組病毒特別包括在因子VIII病毒載體之定義內。病毒之天然基因組替換為編碼因子VIII多肽之因子VIII多核苷酸之重組病毒亦特別包括在因子VIII病毒載體之定義內。包含編碼具有X5突變、B-結構域缺失及/或插入B-結構域連接子多肽中之糖基化肽之因子VIII變異體的因子VIII多核苷酸的重組病毒包括在因子VIII病毒載體之定義內。

如本文所用，術語「因子VIII病毒顆粒」係指包封編碼因子VIII多肽之因子VIII多核苷酸之病毒顆粒，其在引入合適動物宿主(例如人類)中時對表現因子VIII多肽具有特異性。包封已插入編碼因子VIII多肽之密碼子改變之因子VIII多核苷酸的基因組之重組病毒顆粒特別包括在因子VIII病毒顆粒之定義內。包封編碼因子VIII多肽之因子VIII多核苷酸替換病毒之天然基因組的重組病毒顆粒亦特別包括在因子VIII病毒顆粒之定義內。包封編碼具有X5突變、B-結構域缺失及/或插入B-結構域連接子多肽中之糖基化肽之因子VIII變異體的因子VIII多核苷酸的重組病毒顆粒包括在因子VIII病毒顆粒之定義內。

本文中「AAV」或「腺相關病毒」意謂病毒之細小病毒科(Parvoviridae genus)內之依賴病毒(Dependoparvovirus)。如本文所用，AAV可指源自於已插入因子VIII多核苷酸之天然存在之「野生型」AAV基因組的病毒、源自於使用由天然存在之AAV cap基因編碼之衣殼蛋白包裝至衣殼中之重組因子VIII多核苷酸的重組病毒或源自於使用由非天然衣殼cap基因編碼之衣殼蛋白包 裝至衣殼中之重組因子VIII多核苷酸的重組病毒。AAV定義內包括包封因子VIII多核苷酸之AAV類型1(AAV1)、AAV類型2(AAV2)、AAV類型3(AAV3)、AAV類型4(AAV4)、AAV類型5(AAV5)、AAV類型6(AAV6)、AAV類型7(AAV7)、AAV類型8(AAV8)及AAV類型9(AAV9)病毒及由一或多種包封因子VIII多核苷酸之變異AAV衣殼蛋白形成之病毒。

本文中「AAV8」、「AAV-8」或「AAV血清8型」意謂由包封因子VIII多核苷酸之AAV8衣殼病毒蛋白形成之病毒。

如本文所用，術語「CpG」係指沿著DNA之單一股之胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，其中「p」表示兩者之間的磷酸酯鍵。

如本文所用，術語「CpG島」係指具有統計學增加之密度之CpG二核苷酸的多核苷酸內的區域。如本文所用，若在200鹼基對窗口上，多核苷酸(例如編碼密碼子改變之因子VIII蛋白之多核苷酸)之區域如下，則為CpG島：(i)該區域具有超過50%之GC含量；及(ii)如以下關係所定義，每一預期CpG二核苷酸所觀察到之CpG二核苷酸之比率為至少0.6：

0.6。

關於鑑別CpG島之方法的額外資訊，參見Gardiner-Garden M.等人，J Mol Biol.,196(2)：261-82(1987)，其內容以引用之方式整體明確併入本文中以達成所有目的。

如本文所用，術語「核酸」係指呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物以及其互補物。該術語涵蓋含有已知之核苷酸類似物或經修飾之主鏈殘基或鍵的核酸，其為合成、天然存在及非天然存在的，具有與參考核酸類似之結合特性，且以類似於參考核苷酸之方式代謝。此類類似物之實例包括不限於硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸及肽-核酸(PNA)。

術語「胺基酸」係指天然存在之胺基酸，包括由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之彼等胺基酸，例如羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。在本文中胺基酸可藉由其通常已知之三字母符號提及，或藉由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦之單字母符號提及。同樣地，核苷酸可藉由其通常公認之單字母代碼提及。

本文中「修飾」意謂多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失或化學連接於蛋白質之部分的改變。舉例而言，修飾可為改變之碳水化合物或附接於蛋白質之PEG結構。本文中「胺基酸修飾」意謂多肽序列中之胺基酸取代、插入及/或缺失。為清楚起見，除非另作說明，否則胺基酸修飾始終為針對DNA進行編碼之胺基酸，例如在DNA及RNA中具有密碼子之20種胺基酸。

本文中「胺基酸取代」或「取代」意謂親本多肽序列中特定位置處之胺基酸經不同胺基酸替換。詳言之，在一些實施例中，取代為在該特定位置處非天然存在，在生物體內或任何生物體中非天然存在之胺基酸。舉例而言，取代G151K係指變異體多肽，其中位置151處之甘胺酸替換為離胺酸。為清楚起見，經工程改造以改變核酸編碼序列而非改變起始胺基酸(例如CGG(編碼精胺酸)換成CGA(仍然編碼精胺酸)以增加宿主生物體表現水準)之蛋白質並非「胺基酸取代」；亦即，儘管建立編碼相同蛋白質之新基因，但若該蛋白質在其開始之特定位置處具有相同胺基酸，則其不為胺基酸取代。因此，在各相對於表現產物而非相對於實際基因治療構築體，在所述序列中暗含編碼相同多肽之核酸的各變體。

如本文所用，「胺基酸插入物」或「插入」意謂胺基酸序列添加在親本多肽序列中之特定位置處。舉例而言，-233E或233E表示在位置233之後及在位置234之前插入麩胺酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之後 及在位置234之前插入AlaAspGlu。

如本文所用，「胺基酸缺失」或「缺失」意謂移除親本多肽序列中之特定位置處的胺基酸序列。舉例而言，E233-或E233#、E233()或E233del表示在位置233處的麩胺酸缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示在位置233開始之序列GluAspAla缺失。在兩個或更多個核酸或肽序列之情況下術語「一致」或「一致性」百分比係指如使用BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法，利用以下描述之預設參數，或藉由手動比對及目測檢查所量測，兩個或更多個序列或子序列相同或具有指定百分比之相同之胺基酸殘基或核苷酸(亦即當為求在比較窗口或指定區域上最大對應而進行比較及比對時，在指定區域上約60%一致性、較佳65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)。

如所屬領域中已知，許多不同程式可用於鑑別蛋白質(或如以下論述，核酸)是否與已知序列具有序列一致性或相似性。序列一致性/或相似性係使用所屬領域中已知之標準技術測定，該等標準技術包括(但不限於)：Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.,2：482(1981)之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.,48：443(1970)之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85：2444(1988)之相似性搜索演算法；此等演算法之計算機實現方式(Wisconsin Genetics套裝軟體中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA,Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WI)；Devereux等人，Nucl.Acid Res.,12：387-395(1984)描述之最佳擬合序列程式，較佳使用預設設置或藉由檢查。較佳地，一致性百分比藉由FastDB基於以下參數計算：錯配罰分1；缺口罰分1；缺口尺寸罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis」,Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988),Alan R.Liss公司，均以引 用之方式併入。

適用演算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進成對比對自一組相關序列建立多重序列比對。其亦可繪出展示用於產生比對之群集關係的樹。PILEUP使用Feng及Doolittle,J.Mol.Evol.35：351-360(1987)之漸進比對方法的簡化；該方法類似於Higgins及Sharp CABIOS 5：151-153(1989)所述之方法，兩者以引用之方式併入。適用PILEUP參數包括3.00之預設缺口權重、0.10之預設缺口長度權重及加權末端缺口。

適用演算法之另一實例為以下中描述之BLAST演算法：Altschul等人，J.Mol.Biol.215,403-410,(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；及Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787(1993)，兩者以引用之方式併入。一種尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人.，Methods in Enzymology,266：460-480(1996)；http：//blast.wustl/edu/blast/README.html]。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，大部分參數設定成預設值。可調參數設定成以下值：重疊跨度=1，重疊分數=0.125，字閾值(T)=11。HSP S和HSP S2參數為動態值，且藉由程式本身建立，視特定序列之組成及所關注序列正搜索之特定資料庫的組成而定；然而，可調節該等值以增加靈敏度。

一種額外適用演算法為缺口BLAST，如Altschul等人，Nucl.Acids Res.,25：3389-3402所報導，以引用之方式併入。缺口BLAST使用BLOSUM-62取代分數；閾值T參數設定為9；觸發無空隙擴增之雙命中法；k之缺口長度加上10+k之代價；Xu設定成16，且對於資料庫搜索階段，Xg設定成40，且對於演算法輸出階段，設定成67。缺口比對由對應於約22位元之分數觸發。

胺基酸序列一致性%值藉由匹配一致殘基數目除以比對區域中「較長」序列之殘基總數來確定。「較長」序列為在比對區域中具有最有效殘 基之序列(忽略藉由WU-Blast-2引入以最大化比對分數之缺口)。以類似方式，關於所鑑別多肽之編碼序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與細胞週期蛋白之編碼序列中之核苷酸殘基一致的核苷酸殘基之百分比。一較佳方法利用設定成預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊跨度及重疊分數分別設定為1及0.125。

比對可包括待比對之序列中引入缺口。此外，對於含有比由圖1之序列(SEQ ID NO：1)編碼之蛋白質更多或更少胺基酸的序列，應瞭解在一個實施例中，序列一致性百分比將基於相對於胺基酸或核苷酸總數之一致胺基酸或核苷酸之數目確定。因此，舉例而言，如以下所論述，在一個實施例中，比圖1中所示序列(SEQ ID NO：1)短的序列之序列一致性將使用較短序列中之核苷酸數目確定。在一致性百分比計算中，未分配序列變體之各種表現形式、諸如插入、缺失、取代等以相對權重。

在一個實施例中，僅一致性為正分數(+1)，且包括缺口之序列變體之所有形式均分配值「0」，此排除如下所述用於序列相似性計算之加權尺度或參數的必要。序列一致性百分比可例如藉由將匹配一致殘基數目除以比對區域中「較短」序列之殘基總數且乘以100來計算。「較長」序列為在比對區域中具有最有效殘基之序列。

術語「對偶基因變異體」係指在特定基因座處基因之多態形式，以及源自於基因之mRNA轉錄產物之cDNA及由其編碼之多肽。術語「較佳哺乳動物密碼子」係指來自在哺乳動物細胞中表現之蛋白質中最常使用之編碼胺基酸的密碼子組的密碼子子集，如選自以下清單：Gly(GGC、GGG)；Glu(GAG)；Asp(GAC)；Val(GTG、GTC)；Ala(GCC、GCT)；Ser(AGC、TCC)；Lys(AAG)；Asn(AAC)；Met(ATG)；Ile(ATC)；Thr(ACC)；Trp(TGG)；Cys(TGC)；Tyr(TAT、TAC)；Leu(CTG)；Phe(TTC)；Arg(CGC、AGG、AGA)；Gln(CAG)；His(CAC)； 及Pro(CCC)。

如本文所用，術語密碼子改變係指編碼多肽(例如因子VIII變異體蛋白)之多核苷酸序列，其中編碼多肽之天然多核苷酸之至少一個密碼子已改變以提高多核苷酸序列之特性。在一些實施例中，提高之特性有助於增加編碼多肽之mRNA之轉錄，增加mRNA之穩定性(例如提高mRNA半衰期)，增加多肽轉譯，及/或增加載體內多核苷酸之包裝。可用於實現提高之特性之改變的非限制性實例包括改變特定胺基酸之密碼子的使用率及/或分佈；調整整體及/或局部GC含量；移除富含AT之序列；移除重複序列元件；調整整體及/或局部CpG二核苷酸含量；移除隱藏調控元件(例如TATA框及CCAAT框元件)；移除內含子/外顯子剪接位點；提高調控序列(例如引入科紮克共有序列(Kozak consensus sequence))；及移除轉錄mRNA中能夠形成二級結構(例如莖環)之序列元件

如本文中所論述，存在各種命名法來提及本文中之揭示內容之組分。「CS-編號」(例如「CS12」、「CS04」等)係指編碼FVIII多肽之密碼子改變之多核苷酸及/或編碼多肽，包括變異體。舉例而言，CS12-FL係指全長的密碼子改變之CS12多核苷酸序列或由CS12多核苷酸序列編碼之胺基酸序列(本文中胺基酸序列有時稱為「CS12-FL-AA」且核酸序列有時稱為「CS12-FL-NA」)。類似地，「CS12-LC」係指編碼FVIII多肽之輕鏈的密碼子改變之核酸序列(「CS12-LC-NA」)或由CS12多核苷酸序列編碼之FVIII輕鏈之胺基酸序列(本文中有時亦稱為「CS12-LC-AA」)。同樣地，CS12-HC、CS12-HC-AA及CS12-HC-NA對FVIII重鏈而言係相同的。如所屬領域之技術人員所瞭解，對於諸如CS04之僅密碼子改變之構築體(例如其與Refacto相比不含有額外胺基酸取代)，胺基酸序列將一致，因為胺基酸序列未藉由密碼子優化改變。因此，本發明之序列構築體包括(但不限於)CS12-FL-NA、CS12-FL-AA、CS12-LC-NA、CS12-LC-AA、CS12-HC-AA及CS12-HC-NA。

此命名法亦適用於糖基化肽，如圖8所示，以使得「NG1-AA」係指胺基酸序列且NG1-NA係指核酸序列。

本發明亦包括額外新因子VIII變異體，如下所述，利用適當命名法。

如本文所用，術語「肝特異性表現」係指與其他組織中相比，肝組織中特定基因(例如密碼子改變之轉殖基因因子VIII基因)之優先或主要活體內表現。在一些實施例中，肝特異性表現意謂特定基因全部表現之至少50%發生在個體之肝組織內。在其他實施例中，肝特異性表現意謂特定基因全部表現之至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%發生在個體之肝組織內。因此，肝特異性調控元件為驅動基因在肝組織中之肝特異性表現之調控元件。

如本文所用，術語「少於」X及「少於」X%係指自0至X之範圍，不包括值X，例如0%至X%，不包括X%。如本文所用，該等術語與以0或0%開始至(但不包括)X或X%之範圍可互換使用。

如本文所用，術語「至多」X或「至多」X%係指自0至X之範圍，包括值X，例如0%至X%，包括X%。如本文所用，該等術語與以0或0%開始至且包括X或X%之範圍可互換使用。

如本文所用，術語「超過」X或「超過」X%係指自X至上限之範圍，不包括值X，例如X%至100%，不包括X%。如本文所用，該等術語與以X或X%(但不包括X或X%)開始至上限(在百分比之情況下為100%)之範圍可互換使用。

如本文所用，術語「至少」X或「至少」X%係指自X至上限之範圍，包括值X，例如X%至100%，包括X%。如本文所用，該等術語與以X或X%開始(且包括X或X%)至上限(在百分比之情況下為100%)之範圍可互換使用。

如本文所用，術語「介於『X』與『Y』之間」、「介於『X』%與『Y』%之間」、「『X』至『Y』」及「『X』%至『Y』%」係指X至Y之範圍，包括值X及Y，例如X%至Y%，包括X%及Y%。如本文所用，該等術語與以X或X%開始至且包括Y或Y%之範圍可互換使用。

III.密碼子改變之因子VIII多核苷酸

在一些實施例中，本發明提供編碼因子VIII變異體之密碼子改變之多核苷酸。此等密碼子改變之多核苷酸在於基於AAV之基因治療構築體中投與時顯著提高因子VIII生物效能(例如活性)。與習知密碼子優化之構築體相比，密碼子改變之多核苷酸亦顯示提高之AAV-病毒體包裝。

野生型因子VIII與19胺基酸之信號肽(SEQ ID NO：39之胺基酸1-19)一起編碼，在因子VIII活化前該信號肽自編碼多肽裂解。如所屬領域之技術人員所瞭解，在不影響在藉由細胞加工移除信號肽之後留下之成熟多肽的序列下，因子VIII信號肽可突變，經來自其他基因或來自其他生物體之因子VIII基因的信號肽替換，或完全移除。

因此，在一些實施例中，本文提供之密碼子改變之多核苷酸(例如核酸組合物)具有編碼因子VIII重鏈及輕鏈之與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分具有高度序列一致性的核苷酸序列，及短的14胺基酸之B-結構域取代之連接子(例如含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活體內活性FVIIIa蛋白成熟之「SQ」連接子)，其進一步包括五個「X5突變」中之一或多個(例如相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P突變中之一個、兩個、三個、四噁或全部五個(SPI編號；(SPE編號分別為I86V/A108S/G132K/M147T/L152P)))及/或插入B-結構域取代連接子(例如SQ連接子)中之短糖基化肽(例如NG5；SEQ ID NO：15)。

特定言之，X5突變組係基於如下事實：當在HEK293細胞中表現 時在B-結構域缺失基因治療構築體中豬科胺基酸82-176取代對應人類胺基酸增加因子VIII活性(W.Xiao,communication)。單個豬科胺基酸回復突變成人類BDD-FVIII構築體鑑別出A1結構域內促進此現象之五個胺基酸：I105V、A127S、G151K、M166T及L171P(SPI)。此等突變之組合引入人類構築體中提高較大豬科取代之活性(W.Xiao,communication)。因此，在一些實施例中，編碼之因子VIII多肽包括選自I105V、A127S、G151K、M166T及L171P之一或多個胺基酸取代，其中整個5胺基酸組在許多實施例中特別適用。

CS12密碼子改變之多核苷酸

在一些實施例中，本文提供之核酸組合物包括密碼子改變之因子VIII多核苷酸，該密碼子改變之因子VIII多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有高度序列一致性之核苷酸序列且編碼具有人類因子VIII重鏈及輕鏈之因子VIII多肽，及短的14胺基酸之B-結構域取代之連接子(例如SQ連接子)，該連接子含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活體內活性FVIIIa蛋白成熟，其中因子VIII多肽之重鏈包括五個「X5突變」(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T及L171P(SPI))，及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，因子VIII多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99.9%一致性。在一些實施例 中，核苷酸序列與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)一致。

在一些實施例中，由密碼子改變之多核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有高度序列一致性之胺基酸序列，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少97%一致性，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少98%一致性，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99%一致性，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.5%一致性，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.9%一致性，其包括五個X5突變(相對於 全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)一致。

因子VIII B-結構域取代之連接子

如上所述，在本文所述之因子VIII變異體中FVIII重鏈與輕鏈之間的鍵(例如野生型因子VIII中之B-結構域)改變。自野生型因子VIII構築體移除B-結構域似乎不影響活化酶(例如FVIIIa)之活性，推測係因為在活化期間B-結構域移除。由於受AAV包裝容納之尺寸約束，B-結構域缺失、截短及或連接子取代之變異體將提高FVIII基因治療構築體之功效。最常用之B-結構域取代之連接子為SQ FVIII之連接子，其僅僅保留B結構域之14個胺基酸作為連接子序列。豬科VIII之另一變異體(美國專利第6,458,563號中所述之「OBI-1」)在CHO細胞中良好表現，且具有24個胺基酸之略微更長之連接子。在一些實施例中，由本文所述之密碼子改變之多核苷酸編碼的因子VIII構築體包括SQ型B-結構域連接子序列。在其他實施例中，由本文所述之密碼子改變之多核苷酸編碼的因子VIII構築體包括OBI-1型B-結構域連接子序列。

雖然因子VIII B-結構域並非活性所必需，但B-結構域含有若干例如藉由N-或O-連接之糖基化進行轉譯後修飾之殘基。野生型因子VIII B-結構域之計算機分析(Prediction of N-glycosylation sites in human proteins,R.Gupta,E.Jung及S.Brunak，在準備中(2004))預測此等位點中之至少四個位點在活體內糖基化。認為此等在B-結構域內之修飾有助於轉譯後調控及/或因子VIII在活體內之半衰期。因此，在一些實施例中，本文所述之編碼之因子VIII構築體的多肽連接子包括一或多個糖基化序列以允許在活體內糖基化。在一些實施例中，多肽連接子包括至少一個共有糖基化序列(例如N-或O-連接之糖基化共有序列)。在一些 實施例中，多肽連接子包括至少兩個共有糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少三個共有糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少四個共有糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少五個共有糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少6個、7個、8個、9個、10個或更多個共有糖基化序列。

在一些實施例中，多肽連接子含有至少一個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少兩個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少三個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少四個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少五個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少6個、7個、8個、9個、10個或更多個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為除P、S或T以外之任何胺基酸。

在一些實施例中，本文所述之編碼之因子VIII多肽包括SQ型B-結構域連接子，該連接子包括野生型人類因子VIII B-結構域之胺基酸760-762/1657-1667(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：39)(Sandberg等人Thromb.Haemost.85：93(2001)，內容在此以引用之方式併入本文中)。在一些實施例中，SQ型B-結構域連接子相對於對應野生型序列具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，SQ型B-結構域連接子相對於對應野生型序列具有兩個胺基酸取代。

在一些實施例中，糖基化肽插入SQ型B-結構域連接子中。在一些實施例中，糖基化肽係選自圖8中所示之彼等肽(以出現次序，分別為SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35)。在一些實施例 中，糖基化肽由圖8中所示之相應多核苷酸編碼(以出現次序，分別為SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36。在一個特定實施例中，NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)插入本文所述之因子VIII多肽之SQ型B-結構域連接子中。在一個特定實施例中，NG5糖基化肽藉由具有SEQ ID NO：16之核酸序列之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，含有糖基化肽之SQ型B-結構域連接子由圖17中所示之相應多核苷酸編碼(以出現次序，分別為SEQ ID NO：40-53。在一個特定實施例中，含有糖基化肽之SQ型B-結構域由具有SEQ ID NO：43之核酸序列之多核苷酸編碼。

在一些實施例中，多肽連接子(例如SQ型B-結構域連接子)包括與如圖8A-8B所示，以出現次序分別為SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35中之任一者具有高度序列一致性的糖基化肽。在一些實施例中，糖基化肽相對於如圖8A-8B所示，以出現次序分別為SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35中之任一者具有至多兩個胺基酸取代，。在一些實施例中，糖基化肽相對於如圖8A-8B所示，以出現次序分別為SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35中之任一者具有至多一個胺基酸取代。在一些實施例中，糖基化肽具有選自如圖8A-8B所示，以出現次序分別為SEQ ID NO：11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33及35中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，糖基化肽由與選自如圖8A-8B所示，以出現次序分別為SEQ ID NO：12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36之對應核苷酸序列具有高度序列一致性的多核苷酸序列編碼。

在一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多兩個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少90%一致性之多核苷酸序列編碼。在 一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多兩個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少95%一致性之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多兩個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少98%一致性之多核苷酸序列編碼。

在一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多一個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少90%一致性之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多一個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少95%一致性之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，糖基化肽相對於SEQ ID NO：15具有至多一個胺基酸取代且由與SEQ ID NO：16具有至少98%一致性之多核苷酸序列編碼。

在一些實施例中，糖基化肽具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列且由與SEQ ID NO：16具有至少90%一致性之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，糖基化肽具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列且由與SEQ ID NO：16具有至少95%一致性之多核苷酸序列編碼。在一些實施例中，糖基化肽具有SEQ ID NO：15之胺基酸序列且由與SEQ ID NO：16具有至少98%一致性之多核苷酸序列編碼。

順式調控元件

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物亦包括一或多個順式作用調控元件，例如啟動子及/或強化子元件，其驅動活體內之基因表現，可操作地連接於編碼因子VIII變異體之多核苷酸。在此情況下，「順式作用」意謂調控元件存在於DNA之與其調控之基因相同之分子上。如所屬領域之技術人員所瞭解且下文所論述，適用於本發明之調控元件包括(但不限於)啟動子、強化子元件、聚腺苷酸化信號單件及/或反向末端重複元件。

啟動子

適用於本發明之啟動子可操作地連接於編碼區，一般直接連接 (例如啟動子與編碼區之間不包括額外核苷酸)，不過在一些實施例中，可使用間接鍵，例如經由使用無功能連接子，或在可使用在啟動子「下游」但在編碼區「上游」起作用之額外調控元件的情況下。然而，由於本發明載體之尺寸約束，此一般非較佳。

強化子元件

在一些實施例中，一或多個強化子元件用於因子VIII變異體構築體中。如所屬領域中已知，強化子元件一般以組織依賴性方式，例如主要在特定組織中驅動表現。一般而言，如下所述，強化子元件一般位於啟動子元件「上游」。因為因子VIII主要在肝臟中合成，所以在一些實施例中，本文所述之核酸組合物包括肝特異性調控元件，該肝特異性調控元件基本上將編碼之因子VIII變異體之表現限制於肝細胞。

一般地，肝特異性調控元件可源自於已知只在肝臟中表現之任何基因。WO 2009/130208鑑別出以肝特異性方式表現之若干基因，包括serpin肽酶抑制劑分枝A成員1，亦稱α-抗胰蛋白酶(SERPINA1；GeneID 5265)；載脂蛋白C-I(APOC1；GeneID 341)、載脂蛋白C-IV(APOC4；GeneID 346)、載脂蛋白H(APOH；GeneID 350)；轉甲狀腺素蛋白(TTR；GeneID 7276)、白蛋白(ALB；GeneID 213)、醛縮酶B(ALDOB；GeneID 229)、細胞色素P450家族2子族E多肽1(CYP2E1；GeneID 1571)、血纖維蛋白原α鏈(FGA；GeneID 2243)、轉鐵蛋白(TF；GeneID 7018)、結合珠蛋白相關蛋白(HPR；GeneID 3250)。在一些實施例中，本文所述之核酸組合物包括源自於此等蛋白質中之一或多者之基因座的肝特異性調控元件。此類元件之若干實例描述於WO 2009/130208中，其內容以引用之方式整體明確併入本文中以達成所有目的。

肝特異性調控元件之一實例來自於轉甲狀腺素蛋白(TTR)基因，通常稱為「TTRe」或「TTREnh」。Hsieh J.L.等人，Cancer Sci.,100(3)：537-45 (2009)，其內容以引用之方式整體明確併入本文中以達成所有目的。在一些實施例中，如本文所述之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括人類TTR啟動子元件。在一個實施例中，人類TTR啟動子具有與圖4中所示之hTTR啟動子(SEQ ID NO：6)具有高度序列一致性的核酸序列。在一些實施例中，人類TTR啟動子具有與SEQ ID NO：6至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致之核酸序列。

肝特異性調控元件之另一實例來自於SERPINA1基因，如PCT公開案第WO 2016/146757號中所述，該公開案之內容以引用之方式整體明確併入本文中以達成所有目的。此類元件之一實例為圖4中所示之CRM8調控控制元件(SEQ ID NO：5)。在一些實施例中，源自SERPINA1之調控控制元件具有與CRM8(SEQ ID NO：5)至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致之核酸序列。

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括一或多個源自SERPINA1之調控控制元件，如圖11中所示之構築體所例示。在一個實施例中，因子VIII多核苷酸包括一個源自SERPINA1之調控控制元件(例如CRM8)。在另一實施例中，因子VIII多核苷酸包括兩個源自SERPINA1之調控控制元件(例如CRM8)。在其他實施例中，因子VIII多核苷酸包括3個、4個、5個、6個或更多個源自SERPINA1之調控控制元件(例如CRM8)。

在一個實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括一或多個源自SERPINA1之調控控制元件(例如CRM8)及人類TTR啟動子元件，如圖11中所例示。在一個實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括可操作地連接於編碼因子VIII變異體之多核苷酸的兩個CRM8元件及人類TTR啟動子元件。

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括一或多個位於人類TTR啟動子上游之CRM8元件。例如，在雙股構築體 中，相對於分子之轉錄取向，該一或多個CRM8元件位於TTR啟動子之5'。此意謂在(+)單股構築體中(例如在單股編碼因子VIII變異體之情況下)，一或多個CRM8元件位於TTR啟動子之5'。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，一或多個CRM8元件直接附接於TTR啟動子之5'末端，例如在CRM8元件與TTR啟動子之間未安置外來核苷酸。同樣地，在一些實施例中，TTR啟動子直接附接於因子VIII變異體多肽之編碼序列之5'末端，或附接於轉譯起始序列(例如科紮克序列)，例如在TTR啟動子與因子VIII變異體基因之間未安置外來核苷酸。

聚腺苷酸化信號

在一些實施例中，本文所述之構築體(例如編碼因子VIII變異體之核酸組合物)之調控元件為作為聚腺苷酸化信號之調控元件，例如如圖11中之示例構築體中所示。聚腺苷酸化信號引導聚A尾在由因子VIII多核苷酸產生之mRNA轉錄產物之3'末端上合成。因此，聚腺苷酸化信號位於因子VIII變異體編碼序列之3'。可用於本文所述之因子IX基因治療構築體中之聚腺苷酸化信號的非限制性實例包括合成聚腺苷酸化信號、源自於猿猴病毒40(SV40)晚期基因之聚腺苷酸化信號、牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化信號及最小兔β-球蛋白(mRBG)基因聚腺苷酸化信號。

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括合成聚腺苷酸化信號，如圖11中所示之構築體所例示。在一個實施例中，合成聚腺苷酸化信號具有與圖4中所示之合成聚A信號(SEQ ID NO：8)至少90%、95%、97%或100%一致之核酸序列。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸 大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，聚腺苷酸化信號直接附接於因子VIII變異體多肽之編碼序列之3'末端，包括一或多個位於編碼序列末端之終止密碼子。例如，在因子VIII變異體基因與聚腺苷酸化序列之間未安置外來核苷酸。

反向末端重複序列

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物亦包括腺相關病毒(AAV)內部末端重複序列(ITR)，該內部末端重複序列側接因子VIII變異體編碼序列及相關調控元件(例如啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號等)。反向末端重複序列各形成髮夾，此有助於第二DNA股之非引發酶依賴性合成的自引發。ITR亦幫助促進AAV病毒體內之包封以及AAV基因組整合至宿主細胞基因組中。

在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括與圖4中所示之AAV2 5'ITR具有高度序列一致性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)的5'ITR。在一些實施例中，如本文提供之編碼因子VIII變異體之核酸組合物包括與圖4中所示之AAV2 3'ITR具有高度序列一致性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)的3'ITR。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，5'ITR直接附接於肝特異性元件(例如一或多個CRM8元件)之5'末端，以使得在5'ITR序列與肝特異性元件之間未安置外來核苷酸。類似地，在一些實施例中，3'ITR直接附接於聚腺苷酸化信號之3'末端，以使得在聚腺苷酸化信號與3'ITR序列之間未安置外來核苷酸。

IV.因子VIII表現載體

在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之多核苷酸整合至表現載體中。表現載體之非限制性實例包括病毒載體(例如適合於基因治療之載體)、質體載體、噬菌體載體、黏粒、噬菌粒、人工染色體及其類似物。一般而言，存在兩種適用於本發明中之表現載體基本類型：用於細胞培養中以產生因子VIII多肽的表現載體及用作基因治療載體以投與患者，從而增加內源性因子VIII水準(無論蛋白質還是活性)的表現載體。

病毒載體之非限制性實例包括：逆轉錄病毒，例如莫洛尼鼠類白血病毒(Moloney murine leukemia virus，MMLV)、哈維鼠類肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠類乳腺腫瘤病毒及勞氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr viruses)；乳頭狀瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；及脊髓灰質炎病毒。

在許多實施例中，本發明之密碼子優化之多核苷酸用於基因治療應用中，以使得投與患者產生因子VIII，如本文所概述。一般而言，基因治療病毒載體較佳為複製缺陷型的，因此基因治療載體引入患者中不會引起病毒繁殖。

因此，在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之多核苷酸整合至基因治療載體中。在一些實施例中，基因治療載體為逆轉錄病毒，且尤其為複製缺陷型逆轉錄病毒。在一些實施例中，本文所述之密碼子改變之多核苷酸整合至逆轉錄病毒表現載體中。先前已描述此等系統，且所屬領域中一般熟知(Mann等人，Cell,33：153-159,1983；Nicolas及Rubinstein,Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez及Denhardt編輯，Stoneham：Butterworth，第494-513頁，1988；Temin,Gene Transfer,Kucherlapati(編輯)，New York：Plenum Press，第149-188頁，1986)。在一特定實施例中，逆轉錄病毒載體為慢病毒載體(參見例如Naldini等人，Science,272(5259)：263-267,1996；Zufferey等 人，Nat Biotechnol,15(9)：871-875,1997；Blomer等人，J Virol.,71(9)：6641-6649,1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號)。所屬領域中已知用於產生複製缺陷型逆轉錄病毒之方案。評述參見Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman公司，New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology，第7卷，Humana Press公司，Cliffton,N.J.(1991)。

多種載體可用於在細胞培養中自密碼子改變之多肽表現因子VIII多肽，包括真核及原核表現載體。在某些實施例中，涵蓋質體載體用於在細胞培養中表現因子VIII多肽。一般而言，含有源自於與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體結合此等宿主使用。載體可攜帶複製位點以及標記序列，該等標記序列能夠在轉型細胞中提供表型選擇。質體將包括編碼因子VIII多肽之密碼子改變之多核苷酸，該密碼子改變之多核苷酸可操作地連接於一或多個控制序列，例如啟動子。

用於原核表現之載體的非限制性實例包括諸如pRSET、pET、pBAD等質體，其中用於原核表現載體中之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用於真核表現之載體之實例包括：(i)對於在酵母中表現，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET之載體，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等啟動子；(ii)對於在昆蟲細胞中表現，諸如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等載體，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等啟動子；及(iii)對於在哺乳動物細胞中表現，諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等載體，及源自於諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、逆轉錄病毒等病毒系統之載體，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。

腺相關病毒(AAV)載體

在一個實施例中，如本文所述之密碼子改變之多核苷酸整合至基於腺相關病毒(AAV)之基因治療載體中。先前已描述AAV系統，且所屬領域中一 般熟知(Kelleher及Vos,Biotechniques,17(6)：1110-17(1994)；Cotten等人，Proc Natl Acad Sci USA,89(13)：6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3)：141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158：97-129(1992)；及Asokan A等人，Mol.Ther.,20(4)：699-708(2012)，各以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的)。關於rAAV載體之產生及使用的詳情描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號，各以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的。

因此，在一些實施例中，提供一種AAV基因治療載體，其包括如本文所述之密碼子改變之多核苷酸(例如核酸組合物)，該密碼子改變之多核苷酸包括編碼因子VIII重鏈及輕鏈之與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分具有高度序列一致性的核苷酸序列，及短的14胺基酸之B-結構域取代之連接子(例如含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活體內活性FVIIIa蛋白成熟之「SQ」連接子)，且其進一步包括五個X5突變中之一或多個(例如相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T、L171P突變(SPI)中之一個、兩個、三個、四個或全部五個)及/或插入B-結構域取代之連接子(例如SQ連接子)中之短糖基化肽(例如NG5；SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，AAV基因治療載體包括密碼子改變之因子VIII多核苷酸，該密碼子改變之因子VIII多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有高度序列一致性之核苷酸序列且編碼具有人類因子VIII重鏈及輕鏈之因子VIII多肽，及短的14胺基酸之B-結構域取代之連接子(例如SQ連接子)，該連接子含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活體內活性FVIIIa蛋白成熟，其中因子VIII多肽之重鏈包括五個「X5突變」(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V、A127S、G151K、M166T及L171P(SPI))，及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。在一些實施例中，因子VIII多核苷酸具有與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性之 核苷酸序列。

在一些實施例中，由AAV基因治療載體之密碼子改變之多核苷酸編碼的因子VIII變異體具有與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有高度序列一致性之胺基酸序列，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。在一些實施例中，編碼之因子VIII變異體之胺基酸序列與CS12-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性，其包括五個X5突變(相對於全長人類野生型因子VIII序列，I105V/A127S/G151K/M166T/L171P(SPI))及插入SQ連接子中之NG5糖基化肽(SEQ ID NO：15)。

在一些實施例中，AAV基因治療載體內編碼因子VIII變異體之多核苷酸可操作地連接於具有與圖4中所示之hTTR啟動子(SEQ ID NO：6)具有高度序列一致性之核酸序列的啟動子元件。在一些實施例中，啟動子元件具有與SEQ ID NO：6至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致之核酸序列。

在一些實施例中，AAV基因治療載體內編碼因子VIII變異體之多核苷酸可操作地連接於具有與圖4中所示之CRM8元件(SEQ ID NO：5)具有高度序列一致性之核酸序列的一或多個肝特異性調控元件。在一些實施例中，肝特異性調控元件具有與SEQ ID NO：5至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或100%一致之核酸序列。在一些實施例中，如圖11中所示，多核苷酸包括一個CRM8元件。在一些實施例中，如圖11中所示，多核苷酸包括兩個CRM元件。

在一些實施例中，AAV基因治療載體內編碼因子VIII變異體之多核苷酸可操作地連接於一個CRM8元件及人類TTR啟動子元件，如圖11中所例示。在一些實施例中，AAV基因治療載體內編碼因子VIII變異體之多核苷酸可操 作地連接於兩個CRM8元件及人類TTR啟動子元件，如圖11中所例示。如實例2中所述，與小鼠TTR啟動子及強化子序列之使用相比，hTTR啟動子及一或兩個肝特異性CRM8元件之使用分別使HepG2細胞中活體內外源性因子VIII生物效能增加約2倍及4倍(圖12中比較vCS115及vCS116與vCS04)。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，一或多個CRM8元件直接附接於TTR啟動子之5'末端，例如在CRM8元件與TTR啟動子之間未安置外來核苷酸。同樣地，在一些實施例中，TTR啟動子直接附接於因子VIII變異體多肽之編碼序列之5'末端，或附接於轉譯起始序列(例如科紮克序列)，例如在TTR啟動子與因子VIII變異體基因之間未安置外來核苷酸。

在一些實施例中，AAV基因治療載體內編碼因子VIII變異體之多核苷酸可操作地連接於聚腺苷酸化信號，例如如圖11中所之示例構築體中所示。在一個實施例中，合成聚腺苷酸化信號具有與圖4中所示之合成聚A信號(SEQ ID NO：8)至少90%、95%、97%或100%一致之核酸序列。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，聚腺苷酸化信號直接附接於因子VIII變異體多肽之編碼序列之3'末端，包括一或多個位於編碼序列末端之終止密碼子。例如，在因子VIII變異體基因與聚腺苷酸化序列之間未安置外來核苷酸。

內部末端重複序列為基於AAV之重組載體所需之順式調控元件。因此，用於本文所述之AAV基因治療載體中的編碼因子VIII變異體之多核苷酸包括5'及3' ITR序列。在一些實施例中，5' ITR與圖4中所示之AAV2 5' ITR(SEQ ID NO：4)具有高度序列一致性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)。在一些實施例中，3' ITR與圖4中所示之AAV2 3' ITR(SEQ ID NO：9)具有高度序列一致性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致)。

如實例6中所報導，因為本文所述之因子VIII變異體構築體尺寸大，所以作為AAV基因治療載體一部分之因子VIII多核苷酸中核苷酸數目的微小減少可顯著增加載體之因子VIII生物效能。因此，在一些實施例中，5'ITR直接附接於肝特異性元件(例如一或多個CRM8元件)之5'末端，以使得在5'ITR序列與肝特異性元件之間未安置外來核苷酸。類似地，在一些實施例中，3'ITR直接附接於聚腺苷酸化信號之3'末端，以使得在聚腺苷酸化信號與3'ITR序列之間未安置外來核苷酸。

在一特定實施例中，如圖11中所例示，本文提供之AAV基因治療載體內所包括的多核苷酸在5'至3'取向上包括5' ITR序列(例如與SEQ ID NO：4具有高度序列一致性)、與SEQ ID NO：5具有高度序列一致性之一或兩個CRM元件、與SEQ ID NO：6具有高度序列一致性之hTTR啟動子元件、與SEQ ID NO：7具有高度序列一致性之最小科紮克共有序列、與SEQ ID NO：1具有高度序列一致性之因子VIII變異體多核苷酸、聚腺苷酸化序列(例如與SEQ ID NO：8具有高度序列一致性)及3' AAV ITR序列(例如與SEQ ID NO：9具有高度序列一致性)。在一些實施例中，所述多核苷酸與圖3中所示之CS12-CRM8.2-Vr載體(SEQ ID NO：3)具有高度序列一致性性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性)。

本文所述之AAV基因治療載體與AAV衣殼蛋白一起使用，該等AAV衣殼蛋白包封如本文所述之編碼因子VIII變異體多肽之多核苷酸。亦即，藉由使用病毒顆粒遞送將產生因子VIII之病毒載體，該病毒顆粒包括包封病毒載體之衣殼蛋白之「殼」。

AAV載體之血清型通常由所用衣殼蛋白定義。已表徵若干AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8及AAV9。一般地，任何AAV血清型可用於本文所述之因子VIII基因治療構築體。然而，血清型具有不同向性，例如其優先感染不同組織。在一個實施例中，因為因子VIII主要在肝臟中產生，所以所揭示之基因治療構築體之AAV血清型係基於肝臟向性選擇，在至少血清型AAV7、AAV8及AAV9中發現。因此，在一個實施例中，因子VIII基因治療構築體為AAV7血清型載體。在另一實施例中，因子VIII基因治療構築體為AAV8血清型載體。在又一個實施例中，因子VIII基因治療構築體為AAV9血清型載體。

在一些實施例中，亦提供合併密碼子改變之因子VIII基因治療基因組的質體多核苷酸。例如當引入能夠重組產生AAV之哺乳動物細胞(例如具有編碼AAV rep及cap基因以及用於產生AAV之輔助基因(例如腺病毒基因)之核酸的細胞)時，質體可用於產生最終AAV顆粒(例如攜帶編碼變異因子VIII多肽之多核苷酸的AAV病毒體)。在一些實施例中，質體包括允許質體在宿主細胞(例如原核宿主細胞，諸如細菌，或真核宿主細胞，諸如酵母)中複製(例如按比例增加質體)之調控元件。

舉例而言，根據本發明之一個實施例，攜帶密碼子改變之因子VIII基因治療基因組之示例質體的序列展示於圖5(CS12-CRM8.2-Vrp；SEQ ID NO：10)。CS12-CRM8.2-Vrp質體包括CS12-CRM8.2-Vr因子VIII基因治療基因組(圖3中示為SEQ ID NO：3)及質體主鏈(圖18中示為SEQ ID NO：54)。CS12-CRM8.2-Vr因子VIII基因治療基因組之遺傳元件展示於圖4中，如上所述。CS12-CRM8.2-Vrp質體之質體主鏈包括pMB1複製子(圖19中示為SEQ ID NO：55；Bolívar F.,Life Sci.,25(10)：807-17(1979))，其促進質體在細菌宿主細胞中之複製；及Bla(ApR)安比西林抗性基因(圖19中示為SEQ ID NO：56；Sutcliffe, P.N.A.S.U.S.A,75(8)：3737-41(1978))，其促進經質體轉型之細菌宿主細胞之選擇。CS12-CRM8.2-Vrp質體中各元件之位置展示為以下表1中。

在一個實施例中，合併因子VIII變異體基因治療基因組之質體與圖5中所示之CS12-CRM8.2-Vrp質體(SEQ ID NO：10)具有高度序列一致性。在一些實施例中，所述多核苷酸與圖5中所示之CS12-CRM8.2-Vrp質體(SEQ ID NO：10)具有高度序列一致性性(例如至少90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性)。在一些實施例中，所述多肽包括因子VIII-BDD編碼序列，例如與本文揭示之因子VIII-BDD編碼序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致性且與圖5中所示之CS12-CRM8.2-Vrp質體之剩餘部分具有高度序列一致性，例如與SEQ ID NO：10之核苷酸1-528及4924-7794至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%一致的序列。在一些實施例中，所述多核苷酸為包含表1中所示之一些或全部元件的質體。在一些實施例中，表1中所示之一或多個元件經可比較之元件置換。

AAV載體之產生

本文所述之密碼子改變之因子VIII多核苷酸及病毒載體根據用於核酸擴增及載體產生之習知方法產生。已開發若干平台用於大規模產生重組AAV載體。第一平台係基於含有所需病毒基因組之序列的質體引入含有編碼AAV rep及cap基因以及病毒複製輔助基因之多核苷酸的哺乳動物細胞中。評述參見Kotin R.M.,Hum.Mol.Genet.,20(R1)：R2-6(2011)；Penaud-Budloo,M.等人，Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8)：166-80(2018)；及Aponte-Ubillus JJ等人，Appl Microbiol Biotechnol.,102(3)：1045-54(2018)，其內容以引用之方式明確整體併入本文中以達成所有目的。第二平台係基於例如藉由將哺乳動物細胞用野生型腺病毒及具有所需病毒基因組之序列的重組腺病毒共同感染來構築所需病毒基因組整合至哺乳動物細胞基因組中之穩定哺乳動物細胞株。評述參見Penaud-Budloo,M.等人，Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8)：166-80(2018)，其內容以引用之方式明確整體併入本文中以達成所有目的。第三平台係基於用具有所需病毒基因組之序列的第一重組HSV及編碼AAV rep及cap基因之第二重組HSV共同感染哺乳動物細胞。評述參見Penaud-Budloo,M.等人，Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8)：166-80(2018)；及Aponte-Ubillus JJ等人，Appl Microbiol Biotechnol.,102(3)：1045-54(2018)，其內容以引用之方式明確整體併入本文中以達成所有目的。第四平台係基於用具有所需病毒基因組之序列的第一重組桿狀病毒及編碼AAV rep及cap基因之第二重組桿狀病毒共同感染昆蟲細胞。評述參見Penaud-Budloo,M.等人，Mol Ther Methods Clin Dev.,8(8)：166-80(2018)；及Aponte-Ubillus JJ等人，Appl Microbiol Biotechnol.,102(3)：1045-54(2018)，其內容以引用之方式明確整體併入本文中以達成所有目的。第五平台係基於含有所需病毒基因組之序列的質體引入含有編碼AAV rep及cap基因以及病毒複製輔助基因之多核苷酸的酵母細胞中。評述參見Aponte-Ubillus JJ等人，Appl Microbiol Biotechnol.,102(3)：1045-54(2018)，其內容以引用之方式明確整體併入本文中以達成所有目的。

V.治療A型血友病之方法

在一些實施例中，根據已知之投與方法，向A型血友病患者投與本文所述之核酸組合物(例如編碼因子VIII變異體之密碼子改變之多核苷酸)及基因治療載體(例如含有編碼因子VIII變異體之密碼子改變之多核苷酸的AAV顆粒)，以治療A型血友病用於投與基因治療載體之方法為所屬領域中所熟知。此等包括不限於靜脈內投與、肌肉內注射、間質注射及肝臟內投與(例如肝動脈或靜脈內)。例如參見Chuah MK等人，Hum Gene Ther.,23(6)：557-65(2012)；Chuah MK等人，J Thromb Haemost.,10(8)：1566-69(2012)；Chuah MK等人，J Thromb Haemost.11增刊1：99-110(2013)；VandenDriessche等人，Hum Gene Ther.23(1)：4-6(2012)；High KA,Blood,120(23)：4482-87(2012)；Matrai等人，Mol Ther.,18(3)：477-90(2010)；及Matrai等人，Curr Opin Hematol.,17(5)：387-92(2010)，各內容在此以引用之方式併入本文中供評述。

因此，本發明提供用於治療因子VIII缺乏症(例如A型血友病)之方法。在一些實施例中，該等方法包括向有需要之患者投與如本文所述之核酸組合物(例如密碼子改變之因子VIII多核苷酸構築體及/或重組AAV載體)。在一些實施例中，核酸組合物包括編碼因子VIII變異體多肽之密碼子改變之多核苷酸，例如與CS12-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有高度核酸序列一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%或100%)。如本文所述，在一些實施例中，編碼因子VIII變異體多肽之密碼子改變之多核苷酸可操作地連接於啟動子(例如如本文所述之人類TTR啟動子)及一或多個肝特異性調控元件(例如如本文所述之一或兩個CRM8元件)。

在一些實施例中，核酸組合物為哺乳動物基因治療載體之一部 分。在一特定實施例中，哺乳動物基因治療載體為病毒載體，例如慢病毒、逆轉錄病毒、腺病毒或腺相關病毒載體。

在一個實施例中，基因治療載體為具有編碼密碼子改變之因子VIII變異體編碼序列之病毒載體的腺相關病毒(AAV)顆粒一般地，病毒載體包括在各末端之反向末端重複序列、一或多個表現調控元件(例如啟動子(例如如本文所述之人類TTR啟動子)及一或多個肝特異性調控元件(例如如本文所述之一或兩個CRM8元件))、密碼子改變之因子VIII編碼序列及聚A信號序列。

評定治療功效

A型血友病治療之治療功效可例如藉由量測來自所治療之個體之血液的因子VIII依賴性凝血潛能來評估。用於評定凝血潛能之量度包括不限於活體外活化部分凝血活酶時間分析(APPT)、因子IX顯色活性分析、凝血時間及因子VIII抗原水準(例如使用因子VIII特異性ELISA)。注意到治療劑量無需在患者中產生野生型因子VIII水準；更確切些，出於本發明之目的，足夠表現至在有意義或可量測之方式減少症狀視為治療性的。

根據美國國家血友病基金會(the National Hemophilia Foundation)，當血漿含有6%與49%之間的正常人類血漿因子VIII活性時，個體分類為患有輕度A型血友病。患有輕度A型血友病之個體通常僅在嚴重受傷、外傷或手術之後出血。多數情況下，不會診斷出輕度血友病，直至受傷、手術或拔牙引起長時間出血時。第一次發作可能直至成人期才出現。患有輕度血友病之女性常常經歷月經過多、月經期出血過多，且在產後可能大出血。

根據美國國家血友病基金會，當血漿含有1%與5%之間的正常人類血漿因子VIII活性時，個體分類為患有中度A型血友病。患有重度A型血友病之個體往往在受傷之後出血。無明顯原因而發生之出血稱為自發出血事件。

根據美國國家血友病基金會，當血漿含有少於1%之正常人類血 漿因子VIII活性時，個體分類為患有重度A型血友病。患有重度A型血友病之個體在受傷後出血，且可具有頻繁的自發出血事件，常常流至其關節及肌肉中。

在一些實施例中，正常人類血漿定義為每毫升含有1 IU因子VIII活性。因此，在一些實施例中，來自分類為輕度A型血友病之個體的血漿含有每毫升0.06與0.49 IU之間的因子VIII活性。在一些實施例中，來自分類為中度A型血友病之個體的血漿含有每毫升0.01與0.05 IU之間的因子VIII活性。在一些實施例中，來自分類為嚴重A型血友病之個體的血漿含有每毫升0.01與0.05 IU之間的因子VIII活性。

在一些實施例中，當療法例如藉由提高個體血液中因子VIII活性之平均水準而減輕A型血友病之症狀之嚴重度時，其為治療有效的。因此，在一些實施例中，當A型血友病療法提高個體血液/血漿中之因子VIII活性之平均水準時，其為治療有效的。在一些實施例中，治療有效之治療使個體血液/血漿中之因子VIII活性之平均水準提高至少0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或更多。

在一些實施例中，治療有效之治療提高個體血液中之因子VIII活性之平均水準，使得個體分類為患有不太嚴重形式A型血友病。舉例而言，在一個實施例中，最初分類為重度A型血友病之個體在進行治療有效之治療之後重新分類為中度A型血友病或輕度A型血友病。在另一實施例中，最初分類為中度A型血友病之個體在進行治療有效之治療之後重新分類為輕度A型血友病。在另一實施例中，最初分類為輕度A型血友病之個體在進行治療有效之治療之後重新分類為未患A型血友病。

調配物

本文提供用於治療A型血友病之組合物。此類組合物含有治療有效量之如本文所述之核酸組合物，例如包括編碼因子VIII之密碼子改變之多核苷 酸的AAV基因治療載體。治療有效量之密碼子改變之VIII多核苷酸(例如包括密碼子改變之因子VIII編碼序列之AAV基因治療載體)與合適醫藥載劑或媒劑混合，用於例如全身投與。所屬領域之技術人員能夠最終調配本文揭示之密碼子改變之因子VIII多核苷酸。

劑量

向有需要之患者投與本發明之核酸組合物。基因治療治療劑投與之量或劑量視諸如特定的密碼子改變之VIII多核苷酸構築體、使用之遞送載體、疾病嚴重度及個體之整體特徵而定。精確劑量將視治療目的而定，且所屬領域之技術人員使用已知技術可確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1 3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003,Gennaro編輯，Lippincott,Williams & Wilkins)。熟練醫師能夠確定治療特定個體之特定劑量及給藥方案。

VI.實例

實例1-藉由添加N-糖基化連接子序列改良表現FVIII之單股AAV8載體構築體

為闡明BDD-FVIII之SQ序列內的額外N-糖基化位點是否增加FVIII蛋白表現，設計一組含有假定之N-連接之糖基化位點的短肽序列。先前，McIntosh等人(Blood 121(17)：3335-44(2013))展示6個潛在位點之N-糖基化(「V3肽」)之概念增強小鼠血漿中之FVIII表現水準。令人關注地，該「V3肽」之計算機預測鑑別出6個位點中之兩個可能在活體內進行N-糖基化。

在密碼子優化之BDD-FVIII「CS01」序列(參見WO 2017/083762，其內容在此以引用之方式併入本文中)背景下，藉由應用程式NetNGlyc-資料庫(Steentoft等人，H.EMBO J,32(10)：1478-88,2013)，設計12個不同連接子序列，在 圖8A-8B中示為NG1-NG21，目標係產生含有多個N-糖基化位點之短序列。NetNGly平台將分析人類蛋白質序列之N-糖基化模式的九個神經網路組合。基於NetNGly資料庫，分析所設計之肽轉移N-糖基化作為轉譯後修飾的可能性，如Steentoft等人，H.EMBO J,32(10)：1478-88,(2013)(其內容在此以引用之方式併入本文中)中所述。在12種新穎替代肽中，將預測具有低免疫原性(如下文所解釋)之四個有希望之NG連接子插入稱為「CS04」之密碼子優化之BDD-FVIII序列(SEQ ID NO：10)的14個胺基酸尺寸之SQ序列(SFSQN-新穎肽-PPVLKRHQR)中。

藉由轉染人類肝臟Huh-7細胞且用抗FVIII西方墨點分析來偵測經修飾之BDD-FVIII，在實驗上證實包括vNG4/CS04、vNG5/CS04及vNG16/CS04之三種載體的預測N-糖基化位點之轉譯後修飾(圖9)。藉由凝膠電泳偵測到FVIII之修飾型式之重鏈比僅僅含有SQ序列之BDD-FVIII尺寸大，此表明存在新的N-糖基化位點。此外，如針對表現載體vNG5/CS04及高分泌之X5變異體vX5/NG5/CS125例示性展示，人類肝臟細胞株HepG2之AAV8感染證實N-糖基化(圖10；將在實例3及5中描述vX5/NG5/CS125)。

連接子序列設計之焦點在於產生伴有低免疫原性風險之短肽序列(7-17個胺基酸殘基)。為此，應用計算機免疫原性特徵分析EpibaseTM(Lonza)(HLA結合)。EpibaseTM之抗原決定基預測法包含用於預測免疫原性之結構及統計層。結構部分基於Pepscope技術估計結合親和力，如Desmet等人，Proteins.58(1)：53-69(2005)(其內容在此以引用之方式併入本文中)中所述統計部分自肽序列及其實驗結合親和力提取資訊。基於關鍵抗原決定基計數，受影響之HLA II類異型(Krischmann等人，J Immunol.15；155(12)：5655-62(1995)；Verreck等人，Int Immunol.8(3)：397-404(1996)，其內容在此以引用之方式併入本文中)及DRB1(Laupeze等人，Hum Immunol.60(7)：591-7(1999)，其內容在此以引用之方式併入本文中)風險分數用於估計蛋白質之免疫原性風險。基於此評分系統，肽NG16之 免疫原性風險中等，NG4及NG10之免疫原性風險低，且NG5之免疫原性風險甚至比BDD-FVIII之未經修飾之SQ序列更低(表1)。

進一步，在賓夕法尼亞大學(the University of Pennsylvania)之Haig Kazazian實驗室中產生的外顯子16 FVIII敲除小鼠模型中分析載體vNG4/CS04、vNG5/CS04、vNG10/CS04及vNG16/CS04(表1)。在AAV8感染後兩週，藉由小鼠血漿樣品之顯色活性確定FVIII表現水準。FVIII表現水準比不含肽之vCS04構築體高1.4至2.4倍。整體而言，構築體vNG5/CS04展現最有利之特徵，包括高FVIII表現水準(3.8 IU/mL)、最低免疫原性風險及最短肽尺寸(7個胺基酸殘基)。在另一FVIII小鼠模型(「品系E」模型)中進一步測試構築體vNG5/CS04，該模型在免疫學上耐受人類FVIII(Reipert等人，Haemophilia.16(增刊5)：47-53(2010)及van Helden等人，Blood 118(13)：3698-707(2011)中描述，其內容在此以引用之方式明確併入本文中)。在此獨立小鼠模型中，證實vNG5/CS04之FVIII表現增加且經評定，比vCS04高3倍。

綜上所述，開發出一種稱為vNG5/CS04之改良載體，其含有新的短N-糖基化肽序列，具有極低免疫原性風險且活體內FVIII表現水準增強。

實例2-藉由啟動子/強化子替換改良表現FVIII之單股AAV8載體構築體

稱為vCS04的表現FVIII之基於AAV8之初始單股載體構築體的啟動子匣含有源自於肝特異性鼠類轉甲狀腺素蛋白(TTR)基因之核心啟動子及強化子序列(Yan等人，EMBO J,9：869-78(1990)，其內容在此以引用之方式併入本文中)，參見圖11。此肝特異性mTTR啟動子/強化子匣經雙重修飾，首先鼠類核心(基礎)啟動子序列經對應人類序列完全替換。其次，鼠類強化子序列經近來描述之肝特異性順式調控模組CRM8(Nair等人，Blood,123：3195-99(2014)及Chuah等人，Mol Ther,22：1605-13(2014)，其內容在此以引用之方式併入本文中)替換。將一或兩個CRM8元件插入人類TTR核心(基礎)啟動子上游，分別產生載體構築體vCS115及vCS116(圖11)。

藉由活體外及活體內分析，在人類肝臟來源之HepG2細胞株及在「品系E」小鼠中，以4.0E+12vg/kg之劑量，評定新穎啟動子匣之強度。在活體外，具有一個CRM8元件(vCS115)及兩個CRM8元件(vCS116)之構築體分別產生比參考(vCS04)高2.2倍及3.7倍之生物效能單位(圖12)。在活體內，CRM8/hTTR啟動子匣效能與mTTR啟動子/強化子相當(圖12)。

在三組構築體中進一步評估CRM8相關之對FVIII表現之加強作用，在該等構築體中包括mTTR啟動子/強化子、1×CRM8/hTTR及2×CRM8/hTTR之所述啟動子匣與BDD-FVIII之新穎修飾見下文，實例3-5)組合。整體而言，藉由直接比較以下各者，基於一個及兩個CRM8元件之存在，活體外資料揭露生物效能單位之增加：(1)vNG5/CS115與vNG5/CS117(高2.5倍)及vNG5/CS118(高4.0倍)、(2)vX5/CS24與vX5/CS101(1.8高倍)及vX5/CS105(高5.3倍)以及(3)vX5/NG5/CS125與vX5/NG5/CS119(高4.4倍)及vX5/NG5/CS120(高6.2倍)。未在活體內觀察到對FVIII水準之CRM8依賴性作用。然而，活體內資料清楚顯示在該小鼠模型中新穎之1×CRM8/hTTR與2×CRM8/hTTR啟動子匣與mTTR啟動子/ 強化子相比效能同等優良。

實例3-藉由引入「NG5」變異體改良表現FVIII之單股AAV8載體構築體

基於實例1中所示之資料，選擇構築體vNG5/CS04中之N-糖基化連接子NG5與新穎之人類肝特異性啟動子1×CRM8/hTTR及2×CRM8/hTTR組合，產生構築體vNG5/CS117及vNG5/CS118(圖11)。vNG5/CS04構築體含有mTTR啟動子/強化子匣(圖11)。vNG5/CS04之活體內生物效能水準比vCS04高1.9倍，此歸因於對NG5連接子序列之積極作用(圖12)。在活體外，觀察到含有CRM8元件之載體vNG5/CS117及vNG5/CS118的生物效能增加。在活體內，vNG5/CS117及vNG5/CS118之表現水準類似於vNG5/CS04(圖12)。

實例4-藉由引入「X5」變異體改良表現FVIII之單股AAV8載體構築體

為進一步改良表現FVIII之載體，將X5變異體(在WO 2017/083762中描述為突變『m2』，文獻內容在此以引用之方式併入本文中)引入BDD-FVIII中。X5變異體在重鏈之A1結構域內含有五個豬科FVIII胺基酸殘基，此賦予人類FVIII之有效分泌(Cao等人，2014,ASGCT摘要#460；所揭示之變異體之細節呈口頭展示)。特定言之，BDD-FVIII之X5變異體與mTTR啟動子/強化子組合，產生vX5/CS24，與一或兩個CRM8元件加hTTR啟動子組合，產生構築體vX5/CS101及vX5/CS105(圖11)。在活體外在肝臟來源之HepG2細胞株中以及在活體內在「品系E2」小鼠中，分析三種新穎構築體且與參考構築體vCS04相比，「品系E2」小鼠係一種轉殖基因FVIII敲除小鼠品系，其表現最低量之人類FVIII cDNA，從而免疫學上耐受人類FVIII(van Helden PM等人，Blood 118(13)：3698-707(2011)，其內容以引用之方式整體併入本文中以達成所有目的)。在活體內，vX5/CS24、vX5/CS101及vX5/CS105使FVIII活性水準增強2.5-3.1倍(圖12)。在活體外，生物效能之增加介於4.0與21.2之間。活體外測試系統揭露X5變異體(構築體vX5/CS24)使生物效能增加4.0倍，且含有X5及CRM8元件之一或兩個複本之構築 體(分別為構築體vX5/CS101及vX5/CS105)進一步使生物效能增加7.3及21.2倍。

實例5-藉由引入「X5」與「NG5」變異體改良表現FVIII之單股AAV8載體構築體

在另一組載體中，N-糖基化連接子NG5(實例3)及X5變異體(實例4)同時引入BDD-FVIII，且另外與包括mTTR啟動子/強化子、1×CRM8/hTTR及2×CRM8/hTTR之三種不同啟動子組合，分別產生構築體vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119及vX5/NG5/CS120(圖11)。與vCS04相比，vX5/NG5/CS125、vX5/NG5/CS119及vX5/NG5/CS120之活體內及活體外生物效能分別增加3.6-5.5及3.2-19.8倍。如針對各具有共同啟動子之三個系列構築體所示，兩個新穎修飾X5及NG5之引入揭露在活體內表現進一步增加。舉例而言，對於具有2×CRM8/hTTR啟動子之系列(構築體vCS116、vNG5/CS118、vX5/CS105及vX5/NG5/CS120)，單獨NG5之存在使FVIII表現水準自1.9升高至2.9 IU/mL，單獨X5之存在使FVIII表現水準自1.9升高至5.1 IU/mL，且X5與NG5兩者之存在使FVIII表現水準自1.9升高至11.4 IU/mL。

綜上所述，確定攜帶新穎2×CRM8/hTTR啟動子匣及另外具有兩個修飾X5變異體及NG5序列之密碼子優化之BDD-FVIII「CS04」核苷酸序列的構築體vX5/NG5/CS120為具有最高活體外及活體內生物效能之構築體。

實例6-單股AAV8載體構築體之核苷酸減少

為減小略微過大之載體構築體vX5/NG5/CS120的載體尺寸，使得包裝更高效，將側接ITR內之所有非功能DNA序列刪除。此減少總共71個核苷酸，自5191核苷酸尺寸減小至5120尺寸之表現卡匣。刪除包括5'-ITR與CRM8序列在之間的19個核苷酸、人類TTR啟動子與科紮克序列之間的9個核苷酸、BDD-FVIII編碼序列與合成聚腺苷酸化位點之間的27個核苷酸及合成聚腺苷酸化位點與3'-ITR序列之間的16個核苷酸。稱為vX5/NG5/CS12之尺寸減小之表現 卡匣由具有兩個CRM8元件及核心人類TTR啟動子序列之啟動子、包括X5變異體以及NG5序列之BDD-FVIII序列及合成聚腺苷酸化位點組成，且側接兩個基於AAV2之反向末端重複序列。構築體vX5/NG5/CS12示意性展示於圖11中。

藉由瓊脂糖凝膠電泳闡明AAV載體基因組製劑vCS04、vX5/NG5/CS120及vX5/NG5/CS12之載體基因組完整性。圖13中所示之結果表明vCS04、vX5/NG5/CS120及vX5/NG5/CS12病毒載體具有類似尺寸之基因組，如大約5kb之不同亮帶所指示。儘管計算之載體尺寸接近5.2kb，但基因組為證實略大基因組恰當包裝之均質亮帶(相對於4.7kb之AAV野生型基因組)。較短之vX5/NG5/CS12變異體為較佳。

以1x vg/kg、2x vg/kg及8x vg/kg載體劑量向FVIII F17敲入小鼠投與一組基於AAV8之病毒載體，包括vCS04、vX5/NG5/CS120及vX5/NG5/CS12，且在第14天測定FVIII活性水準。如圖14所示，vX5/NG5/CS12與vX5/NG5/CS120兩者在2x vg/kg之載體劑量下產生大約4 IU/mL之相當表現水準。與在2x vg/kg之劑量下具有0.3 IU/mL之極低FVIII表現水準的參考構築體vCS04對比，改良載體vX5/NG5/CS12及vX5/NG5/CS120展示FVIII表現水準增加大約14倍(圖14)。甚至在1x vg/kg之劑量下，載體vX5/NG5/CS12亦可獲得1.5 IU/mL FVIII之表現水準。與活體內資料一致，以同等感染複數(MOI)感染HepG2細胞，vX5/NG5/CS120及vX5/NG5/CS12之活體外生物效能分別強力增加大約17倍及24倍(圖14)。因此，因為所有載體係在相同濃度(感染複數)下投與，所以生物效能之差異應歸於所用變異體且與尺寸無關。

Claims (21)

1. 一種核酸組合物，其包含：編碼因子VIII蛋白之因子VIII多核苷酸，該因子VIII多核苷酸編碼該因子VIII蛋白且具有SEQ ID NO：1之核酸序列，可操作地連接於該因子VIII多核苷酸之啟動子多核苷酸，其中該啟動子多核苷酸具有SEQ ID NO：6之核酸序列，可操作地連接於該因子VIII多核苷酸之肝特異性元件，其中該肝特異性元件具有SEQ ID NO：5之序列，且第二肝特異性元件可操作地連接於該因子VIII多核苷酸，其中該第二肝特異性元件具有SEQ ID NO：5之序列。
2. 如請求項1之核酸組合物，其中該啟動子多核苷酸直接附接於該因子VIII多核苷酸。
3. 如請求項1之核酸組合物，其中該肝特異性元件及該啟動子係直接附接。
4. 如請求項2之核酸組合物，其中該肝特異性元件及該啟動子係直接附接。
5. 如請求項1之核酸組合物，其具有包含SEQ ID NO：3之核酸序列。
6. 一種哺乳動物基因治療載體，其包含如請求項1至5中任一項之核酸組合物。
7. 如請求項6之哺乳動物基因治療載體，其中該哺乳動物基因治療載體係腺相關病毒(AAV)載體。
8. 如請求項7之哺乳動物基因治療載體，其中該AAV載體係血清8型腺相關病毒(AAV-8)載體。
9. 如請求項6之哺乳動物基因治療載體，其中該核酸組合物為編碼該因子VIII蛋白之單股多核苷酸。
10. 一種腺相關病毒(AAV)顆粒，其包含包封如請求項1至5中任一項之核酸組合物的衣殼(capsid)蛋白。
11. 如請求項10之AAV顆粒，其中該等衣殼蛋白包含血清8型腺相關病毒(AAV-8)衣殼蛋白。
12. 如請求項10之AAV顆粒，其中該核酸組合物為編碼該因子VIII蛋白之單股多核苷酸。
13. 如請求項1至5中任一項之核酸組合物，其用於治療A型血友病。
14. 一種如請求項1至5中任一項之核酸組合物的用途，其用於製造供治療A型血友病之藥劑。
15. 如請求項9之哺乳動物基因治療載體，其用於治療A型血友病。
16. 一種如請求項9之哺乳動物基因治療載體的用途，其用於製造供治療A型血友病之藥劑。
17. 如請求項12之腺相關病毒(AAV)顆粒，其用於治療A型血友病。
18. 一種如請求項12之腺相關病毒(AAV)顆粒的用途，其用於製造供治療A型血友病之藥劑。
19. 一種用於產生腺相關病毒(AAV)顆粒之活體外方法，其包括將如請求項1至5中任一項之核酸組合物引入真核宿主細胞中，其中：該核酸組合物包含因子VIII多核苷酸，該因子VIII多核苷酸具有側接5'反向末端重複序列(5' ITR)及3'反向末端重複序列(3' ITR)之SEQ ID NO：1之核酸序列，且該哺乳動物宿主細胞包含一或多種多核苷酸，該一或多種多核苷酸編碼AAV rep基因、AAV cap基因及病毒複製輔助基因。
20. 如請求項19之活體外方法，其中該核酸組合物為具有SEQ ID NO：10之核酸序列的質體。
21. 如請求項19之活體外方法，其中該AAV cap基因係血清8型腺相關病毒(AAV-8)cap基因。