JP7610338B2 - 血友病ａの遺伝子療法のための発現が上昇した組換えｆｖｉｉｉバリアントをコードするウイルスベクター - Google Patents
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関連出願の相互参照
本願は、２０１９年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７９３，０５８号に対する優先権を主張し、その開示内容全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に援用するものである。
本願は、２０１９年１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／７９３，０５８号に対する優先権を主張し、その開示内容全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に援用するものである。
本開示の背景
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる相互依存的な生化学的反応の複雑かつ動的な生物学的経路を経る。凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、このカスケードにおける主要な構成要素である。第ＶＩＩＩ因子は、出血部位に動員され、活性化した第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）とテナーゼ複合体を形成する。テナーゼ複合体はＦＸを活性化し、ＦＸはプロトロンビンを活性化してトロンビンにし、次いでトロンビンは、凝固カスケードにおける他の構成要素を活性化して、安定した血餅を生成する（Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５－９２（１９９９）（非特許文献１）、Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３－９６（１９９８）（非特許文献２）にて概説されている）。
血液凝固は、凝固カスケードと呼ばれる相互依存的な生化学的反応の複雑かつ動的な生物学的経路を経る。凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）は、このカスケードにおける主要な構成要素である。第ＶＩＩＩ因子は、出血部位に動員され、活性化した第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）及び第Ｘ因子（ＦＸ）とテナーゼ複合体を形成する。テナーゼ複合体はＦＸを活性化し、ＦＸはプロトロンビンを活性化してトロンビンにし、次いでトロンビンは、凝固カスケードにおける他の構成要素を活性化して、安定した血餅を生成する（Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５－９２（１９９９）（非特許文献１）、Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３－９６（１９９８）（非特許文献２）にて概説されている）。
血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子活性の欠損を特徴とする先天性Ｘ連鎖出血障害である。第ＶＩＩＩ因子活性の減弱は、凝固カスケードにおける正のフィードバックループを阻害する。これにより凝固が不完全になり、長期にわたる出血エピソード、広範囲の打撲傷、突発性の口腔及び鼻からの出血、関節硬直及び慢性疼痛をきたし、重症例では場合により内出血及び貧血をきたす（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４－２４（２００９）（非特許文献３））。
従来、血友病Ａは、血友病Ａ患者に第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、血漿由来または組換え生成型の第ＶＩＩＩ因子）を投与することからなる第ＶＩＩＩ因子補充療法によって治療されている。第ＶＩＩＩ因子は、出血エピソードを防止するもしくはその頻度を低下させるために予防的に、急性出血エピソードに応じて、及び／または手術中の出血を管理するために手術時に投与される。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子補充療法にはいくつかの望ましくない特徴がある。
第１には、第ＶＩＩＩ因子補充療法は、血友病Ａを治療または管理するために使用されるが、根底にある第ＶＩＩＩ因子欠損を治癒するものではない。そのため、血友病Ａ患者は、その生涯にわたって第ＶＩＩＩ因子補充療法を必要とする。継続的治療は高価であり、予防的投薬をほんの数回でも逃すと、重度の血友病Ａ患者にとって重大な結果が生じ得るため、患者は厳格なコンプライアンスを維持する必要がある。
第２には、第ＶＩＩＩ因子はｉｎ ｖｉｖｏで比較的短い半減期を有するため、従来の予防的な第ＶＩＩＩ因子補充療法は、２日毎または３日毎の投与を必要とする。これは、患者がその生涯にわたってコンプライアンスを維持する上で負担となる。第３世代の「長時間作用型」第ＶＩＩＩ因子薬は投与の頻度を低下させ得るが、これらの薬物を用いた予防的な第ＦＶＩＩＩ因子補充療法でも、毎月、毎週、またはより高頻度の投与が一生涯必要である。例えば、ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）［抗血友病因子（組換え）、Ｆｃ融合タンパク質］による予防的治療は、３日毎から５日毎の投与を必要とする（ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）処方情報、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ Ｉｎｃ．，（２０１５））。さらに、化学的に修飾された生物製剤（例えば、ＰＥＧ化ポリペプチド）の長期的効果は、未だ完全には理解されていない。
第３には、第ＶＩＩＩ因子補充療法を受ける全患者の１５％～３０％では抗第ＶＩＩＩ因子阻害抗体が形成されるので、療法が非効率的になる。第ＶＩＩＩ因子バイパス療法（例えば、血漿由来または組換え生成型のプロトロンビン複合体濃縮物の投与）が、阻害抗体を形成する患者の血友病を治療するために使用される場合がある。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子バイパス療法は、第ＶＩＩＩ因子補充療法ほど効果的ではなく（Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．Ｍ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９－５５（２００３）（非特許文献４））、心血管合併症のリスク増加に関連し得る（Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０－１６（２００４）（非特許文献５））。
体細胞遺伝子療法は、単回用量の第ＶＩＩＩ因子活性を患者に提供するのではなく、根底にある、機能的な第ＶＩＩＩ因子活性の（例えば、ミスセンスまたはナンセンス変異に起因する）低発現を是正するため、血友病Ａの治療にきわめて有望である。第ＶＩＩＩ因子補充療法と比べて作用機序がこのように異なるため、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ベクターの単回投与により、患者に第ＶＩＩＩ因子を数年間にわたって提供し、治療コストを削減し、継続的な患者コンプライアンスの必要性をなくすことができる。
凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）遺伝子療法は、第ＩＸ因子活性の減弱を特徴とする（Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２－４７（２００６）（非特許文献６））、関連する血液凝固の病態である血友病Ｂを有する患者を効果的に治療するために使用されてきた。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法には、特有の課題がいくつかある。例えば、完全長、野生型の第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド（２３５１アミノ酸；ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ００４５１）は、完全長、野生型の第ＩＸ因子ポリペプチド（４６１アミノ酸；ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ００７４０）のよりも５倍大きい。したがって、野生型第ＶＩＩＩ因子のコード配列は７０５３塩基対であり、従来のＡＡＶ遺伝子療法ベクターには大きすぎてパッケージングできない。さらに、第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失バリアント（ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ）のこれまでに報告されている組換え発現は不十分である。したがって、いくつかのグループがＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ構築物のコドン使用頻度を改変しようと試みたが、限られた成功しか収めていない。
Ｓａｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，９：１８５－９２（１９９９）
Ｌｅｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：３９８３－９６（１９９８）
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３７：１１４－２４（２００９）
Ｍａｎｎｕｃｃｉ Ｐ．Ｍ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１（７）：１３４９－５５（２００３）
Ｌｕｕ ａｎｄ Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ，１０ Ｓｕｐｐｌ．２：１０－１６（２００４）
Ｍａｎｎｏ Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，１２（３）：３４２－４７（２００６）
本開示の概要
したがって、コード配列がより効率的に、遺伝子療法ベクターにパッケージングされ、遺伝子療法ベクターによって送達される、第ＶＩＩＩ因子バリアントが必要とされている。また、第ＶＩＩＩ因子をより効率的に発現する合成のコドン改変核酸も必要とされている。また、野生型第ＶＩＩＩ因子または野生型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子と比較して、フォールディング特性が改善され、発現細胞からの分泌が改善され、活性が上昇し、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏの循環半減期が改善された、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変核酸も必要とされている。そのような第ＶＩＩＩ因子バリアント及びコドン改変核酸は、第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）の治療の改善を可能にする。上記の欠損、及び第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）の治療に関連する他の問題は、本開示のコドン改変第ＶＩＩＩ因子バリアントによって減少または解決する。
したがって、コード配列がより効率的に、遺伝子療法ベクターにパッケージングされ、遺伝子療法ベクターによって送達される、第ＶＩＩＩ因子バリアントが必要とされている。また、第ＶＩＩＩ因子をより効率的に発現する合成のコドン改変核酸も必要とされている。また、野生型第ＶＩＩＩ因子または野生型Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子と比較して、フォールディング特性が改善され、発現細胞からの分泌が改善され、活性が上昇し、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏの循環半減期が改善された、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変核酸も必要とされている。そのような第ＶＩＩＩ因子バリアント及びコドン改変核酸は、第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）の治療の改善を可能にする。上記の欠損、及び第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）の治療に関連する他の問題は、本開示のコドン改変第ＶＩＩＩ因子バリアントによって減少または解決する。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物（例えば、コドン改変ポリヌクレオチド）が記載される。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列及び／または他のコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コード配列と比べて、動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸組成物はまた、ＡＡＶベースの遺伝子療法ビリオンの生成増大を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子をコードする野生型配列と比較して、減少したＧＣ含有量を有する、及びまたは少ないＣｐＧジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、酸組成物は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸を含む哺乳動物遺伝子療法ベクターが記載される。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する哺乳動物遺伝子療法ベクターは、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチドまたは他のコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターと比べて、動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する哺乳動物遺伝子療法ベクターは、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する、第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有するプラスミドに含まれている。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が記載される。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶ粒子は、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチドまたは他のコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子と比べて、動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＡＡＶ粒子は、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する、第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有するプラスミドを使用して生成される。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物を血友病Ａ患者に投与することによって血友病Ａを治療するための方法が記載される。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する血友病Ａを治療するための方法は、患者の血液中で、野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列及び／または異なるコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コード配列を含む核酸組成物を投与された患者の血液中における第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇よりも大きな、第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、核酸組成物によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する。
いくつかの実施形態では、投与される核酸組成物は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与される核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与される核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与される核酸組成物は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与される核酸組成物は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸を含む哺乳動物遺伝子療法ベクターを投与することによって血友病Ａを治療するための方法が記載される。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する血友病Ａを治療するための方法は、患者の血液中で、野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列及び／または異なるコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コード配列を含む哺乳動物遺伝子療法ベクターを投与された患者の血液中における第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇よりも大きな、第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクター内の核酸によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する。
いくつかの実施形態では、投与される哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与される哺乳動物遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与される哺乳動物遺伝子療法ベクターは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与される哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与される哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有するプラスミドに含まれている。
一態様では、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与することによって血友病Ａを治療するための方法が記載される。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸は、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするＣＳ０４（配列番号３７）またはＣＳ１２（配列番号１）の配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する血友病Ａを治療するための方法は、患者の血液中で、野生型第ＶＩＩＩ因子コード配列及び／または異なるコドン最適化された第ＶＩＩＩ因子コード配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を投与された患者の血液中における第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇よりも大きな、第ＶＩＩＩ因子の発現上昇及び／または第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。いくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子中の核酸によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、野生型第ＶＩＩＩ因子及び／または他の第ＶＩＩＩ因子バリアントと比べて、ｉｎ ｖｉｖｏでより効果的に血液中に分泌され、及び／またはｉｎ ｖｉｖｏで延長された血中循環半減期を有する。
いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列同一性）を有する配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、プロモーターポリヌクレオチドは、ｈＴＴＲ（配列番号６）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、例えば、図１１に示すように、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的エレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または１００％）を有するエンハンサーエレメントである。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを２つ含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、そのような、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントを３つ含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の肝臓特異的エレメント及びプロモーターは、例えば、図１１に示すように、直接結合している。
いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、投与されるＡＡＶ粒子に含まれる核酸は、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％）を有する核酸配列を有するプラスミドを使用して生成される。
[本発明1001]
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む核酸組成物であって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、ＣＳ12－ＦＬ－ＮＡ（配列番号1）の核酸配列を有する、前記核酸組成物。
[本発明1002]
前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、前記プロモーターポリヌクレオチドが、ｈＴＴＲ（配列番号6）の核酸配列を有する、本発明1001の核酸組成物。
[本発明1003]
前記プロモーターが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している、本発明1002の核酸組成物。
[本発明1004]
前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含み、前記肝臓特異的エレメントが、ＣＲＭ8（配列番号5）の配列を有する、本発明1001～1003のいずれかの核酸組成物。
[本発明1005]
第2の肝臓特異的エレメントが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに機能的に連結している、本発明1004の核酸組成物。
[本発明1006]
前記肝臓特異的エレメント及び前記プロモーターが、直接結合している、本発明1004または1005の核酸組成物。
[本発明1007]
ＣＳ12－ＣＲＭ8．2－Ｖｒ（配列番号3）を含む核酸配列を有する、本発明1001の核酸組成物。
[本発明1008]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を含む、哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1009]
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明1008の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1010]
前記ＡＡＶベクターが、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）ベクターである、本発明1009の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1011]
前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1008～1010のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1012]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を封入しているカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
[本発明1013]
前記カプシドタンパク質が、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）カプシドタンパク質を含む、本発明1012のＡＡＶ粒子。
[本発明1014]
前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1012または1013のＡＡＶ粒子。
[本発明1015]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1016]
血友病Ａを治療するための、本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物。
[本発明1017]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物の使用。
[本発明1018]
本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクターを血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1019]
血友病Ａを治療するための、本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1020]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクターの使用。
[本発明1021]
本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1022]
血友病Ａを治療するための、本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
[本発明1023]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の使用。
[本発明1024]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を真核生物宿主細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成するための方法であって、
前記核酸組成物が、5’逆位末端反復配列（5’ＩＴＲ）及び3’逆位末端反復配列（3’ＩＴＲ）が隣接するＣＳ12－ＦＬ－ＮＡ（配列番号1）の核酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、及びウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、
前記方法。
[本発明1025]
前記核酸組成物が、ＣＳ12－ＣＲＭ8．2－Ｖｒｐ（配列番号10）の核酸配列を有するプラスミドである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子が、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）ｃａｐ遺伝子である、本発明1024または1025の方法。
[本発明1001]
第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む核酸組成物であって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、ＣＳ12－ＦＬ－ＮＡ（配列番号1）の核酸配列を有する、前記核酸組成物。
[本発明1002]
前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、前記プロモーターポリヌクレオチドが、ｈＴＴＲ（配列番号6）の核酸配列を有する、本発明1001の核酸組成物。
[本発明1003]
前記プロモーターが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している、本発明1002の核酸組成物。
[本発明1004]
前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含み、前記肝臓特異的エレメントが、ＣＲＭ8（配列番号5）の配列を有する、本発明1001～1003のいずれかの核酸組成物。
[本発明1005]
第2の肝臓特異的エレメントが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに機能的に連結している、本発明1004の核酸組成物。
[本発明1006]
前記肝臓特異的エレメント及び前記プロモーターが、直接結合している、本発明1004または1005の核酸組成物。
[本発明1007]
ＣＳ12－ＣＲＭ8．2－Ｖｒ（配列番号3）を含む核酸配列を有する、本発明1001の核酸組成物。
[本発明1008]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を含む、哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1009]
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、本発明1008の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1010]
前記ＡＡＶベクターが、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）ベクターである、本発明1009の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1011]
前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1008～1010のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1012]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を封入しているカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
[本発明1013]
前記カプシドタンパク質が、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）カプシドタンパク質を含む、本発明1012のＡＡＶ粒子。
[本発明1014]
前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、本発明1012または1013のＡＡＶ粒子。
[本発明1015]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1016]
血友病Ａを治療するための、本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物。
[本発明1017]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物の使用。
[本発明1018]
本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクターを血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1019]
血友病Ａを治療するための、本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクター。
[本発明1020]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1008～1011のいずれかの哺乳動物遺伝子療法ベクターの使用。
[本発明1021]
本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を血友病Ａ患者に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
[本発明1022]
血友病Ａを治療するための、本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
[本発明1023]
血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、本発明1012～1014のいずれかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の使用。
[本発明1024]
本発明1001～1007のいずれかの核酸組成物を真核生物宿主細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成するための方法であって、
前記核酸組成物が、5’逆位末端反復配列（5’ＩＴＲ）及び3’逆位末端反復配列（3’ＩＴＲ）が隣接するＣＳ12－ＦＬ－ＮＡ（配列番号1）の核酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、及びウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含む、
前記方法。
[本発明1025]
前記核酸組成物が、ＣＳ12－ＣＲＭ8．2－Ｖｒｐ（配列番号10）の核酸配列を有するプラスミドである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子が、血清型8アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－8）ｃａｐ遺伝子である、本発明1024または1025の方法。
Ｉ．序論
ＡＡＶベースの遺伝子療法は、血友病者の治療にきわめて有望である。血友病Ｂについては、最初の臨床データは、少なくとも一部の患者では１年超にわたって約１０％のＦＩＸレベルが維持され得るという点で期待が持てる。しかしながら、血友病Ａについては、ＡＡＶベクターを用いて５～１０％の治療的な発現レベルを達成するには、種々の理由で課題が残っている。第１には、第ＶＩＩＩ因子コード配列は、従来のＡＡＶベースのベクターには大きすぎる。第２には、工学操作されたＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子構築物には、コドン最適化してもｉｎ ｖｉｖｏでの発現が乏しいという問題がある。第３には、これらのＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が短く、発現不良の影響を悪化させる。第４には、ＦＶＩＩＩは、発現しても、第ＩＸ因子などの他の凝固因子がそうであるように、細胞から効率的には分泌されない。
ＡＡＶベースの遺伝子療法は、血友病者の治療にきわめて有望である。血友病Ｂについては、最初の臨床データは、少なくとも一部の患者では１年超にわたって約１０％のＦＩＸレベルが維持され得るという点で期待が持てる。しかしながら、血友病Ａについては、ＡＡＶベクターを用いて５～１０％の治療的な発現レベルを達成するには、種々の理由で課題が残っている。第１には、第ＶＩＩＩ因子コード配列は、従来のＡＡＶベースのベクターには大きすぎる。第２には、工学操作されたＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子構築物には、コドン最適化してもｉｎ ｖｉｖｏでの発現が乏しいという問題がある。第３には、これらのＢドメイン欠失型または切断型の第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が短く、発現不良の影響を悪化させる。第４には、ＦＶＩＩＩは、発現しても、第ＩＸ因子などの他の凝固因子がそうであるように、細胞から効率的には分泌されない。
本開示は、部分的には、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法に関連するこれら及び他の問題を解決する、コドン改変第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列を含む遺伝子療法ベクターの発見に関する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び遺伝子療法構築物は、哺乳動物細胞における外因性第ＶＩＩＩ因子発現の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び遺伝子療法構築物は、ｉｎ ｖｉｖｏのバイオアベイラビリティの改善をもたらす（例えば、患者の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の改善をもたらす）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び遺伝子療法構築物は、患者の血液中の外因性第ＶＩＩＩ因子の循環半減期の改善をもたらす。本明細書に記載するように、これらの利点のうちの１つ以上は、遺伝子療法システムの次の改善のうちの１つ以上の任意の組み合わせを使用することによって実現される。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、本明細書に記載するように、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドに、Ｘ５変異を工学的に挿入することによって実現される。有利なことに、本明細書に記載するように、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドにＸ５変異を含めると、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例４に記載するように、リファクトＦＶＩＩＩポリペプチドの重鎖のＡ１ドメインに５つのＸ５変異を含めた場合、リファクト第ＶＩＩＩ因子－Ｘ５バリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与後の系統Ｅ２マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードすることを除いては同一の遺伝子療法ベクターを投与されたマウスと比較して３倍上昇した（図１２のｖＸ５／ＣＳ２４をｖＣＳ０４と比較されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの結果と整合して、第ＶＩＩＩ因子重鎖のＡ１ドメインに５つのＸ５変異を含めた場合、リファクト第ＶＩＩＩ因子－Ｘ５バリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターにＨｅｐＧ２細胞を感染させた後のｉｎ ｖｉｔｒｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードすることを除いては同一の遺伝子療法ベクターに感染させたＨｅｐＧ２細胞と比較して４倍上昇した（図１２のｖＸ５／ＣＳ２４をｖＣＳ０４と比較されたい）。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、本明細書に記載するように、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドのＢドメインリンカーに、ＮＧ５グリコシル化ペプチドを工学的に挿入することによって実現される。有利なことに、本明細書に記載するように、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドにＮＧ５グリコシル化ペプチドを含めると、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｖｏで改善する。例えば、実施例３に記載するように、リファクトＦＶＩＩＩポリペプチドのＳＱリンカーにＮＧグリコシル化ペプチドを含めた場合、リファクト第ＶＩＩＩ因子－ＮＧ５バリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与後の系統Ｅ２マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードすることを除いては同一の遺伝子療法ベクターを投与されたマウスと比較して２倍上昇した（図１２のｖＮＧ５／ＣＳ０４をｖＣＳ０４と比較されたい）。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、本明細書に記載するように、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドに、Ｘ５変異とＮＧ５グリコシル化ペプチドの両方を工学的に挿入することによって実現される。有利なことに、本明細書に記載するように、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドにＸ５変異及びＮＧ５グリコシル化ペプチドを含めると、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例５に記載するように、リファクトＦＶＩＩＩポリペプチドの重鎖のＡ１ドメインに５つのＸ５変異を含め、ＳＱリンカーにＮＧ５グリコシル化ペプチドを含めた場合、リファクト第ＶＩＩＩ因子－Ｘ５／ＮＧ５バリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与後の系統Ｅ２マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードすることを除いては同一の遺伝子療法ベクターを投与されたマウスと比較して４．５倍上昇した（図１２のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５をｖＣＳ０４と比較されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの結果と整合して、リファクトＦＶＩＩＩポリペプチドの重鎖のＡ１ドメインに５つのＸ５変異を含め、ＳＱリンカーにＮＧ５グリコシル化ペプチドを含めた場合、リファクト第ＶＩＩＩ因子－Ｘ５／ＮＧ５バリアントをコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターにＨｅｐＧ２細胞を感染させた後のｉｎ ｖｉｔｒｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードすることを除いては同一の遺伝子療法ベクターに感染させたＨｅｐＧ２細胞と比較して３倍上昇した（図１２のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５をｖＣＳ０４と比較されたい）。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の上流のヒトｈＴＴＲプロモーター及び１つ以上の肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントを使用することによって実現される。有利なことに、ｈＴＴＲプロモーター及び１つ以上の肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントの使用により、ヒト細胞における外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例２に記載するように、ｈＴＴＲプロモーター及び１つまたは２つの肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントの使用により、ＨｅｐＧ２細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列の使用と比較して、それぞれ約２倍及び４倍上昇した（図１２のｖＣＳ１１５及びｖＣＳ１１６をｖＣＳ０４と比較されたい）。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質をコードするＡＡＶ遺伝子療法ベクターの種々のエレメント間に位置付けられた外来性ヌクレオチドを除去することによって実現される。有利なことに、種々のエレメント間の外来性ヌクレオチドの除去により、ヒト細胞における外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例６に記載するように、リファクト第ＶＩＩＩ因子－Ｘ５／ＮＧ５バリアントをコードするｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０ ＡＡＶ遺伝子療法ベクターからわずか７１個のヌクレオチドを除去することにより、発現される第ＶＩＩＩ因子バリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物作用能が５０％改善した（図１４のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２をｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０と比較されたい）。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドにＸ５変異とＮＧ５グリコシル化ペプチドの両方を工学的に挿入し、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の上流のヒトｈＴＴＲプロモーター及び１つ以上の肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントを使用することによって実現される。有利なことに、こうした改善の組み合わせを使用することにより、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例６に記載するように、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターにおけるこうした改善の組み合わせの使用により、ｉｎ ｖｉｖｏ生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列を使用した、コードされる野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子の同じコドン改変を有するポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの使用と比べて、１４．５倍上昇した（図１４のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０をｖＳＣ０４と比較されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの結果と整合して、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターにおけるこうした改善の組み合わせの使用により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列を使用した、コードされる野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子の同じコドン改変を有するポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの使用と比べて、１７倍上昇した（図１４のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０をｖＳＣ０４と比較されたい）。ＷＯ２０１７／０８３７６２（その内容は参照により本明細書に援用される）の表４で報告されているように、ｖＣＳ０４ベクターは、野生型コード配列を使用するリファクト第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドをコードする均等な遺伝子療法ベクターと比べて７０倍よりも高いｉｎ ｖｉｖｏのＦＶＩＩＩ生物作用能をもたらす。したがって、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０遺伝子療法ベクターは、野生型リファクトコード配列の使用と比べて、ＦＶＩＩＩ生物作用能の１０００倍～１２５０倍の上昇をもたらすと予想される。
いくつかの実施態様では、これらの利点のうちの１つ以上は、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドにＸ５変異とＮＧ５グリコシル化ペプチドの両方を工学的に挿入し、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の上流のヒトｈＴＴＲプロモーター及び１つ以上の肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントを使用し、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの種々のエレメント間に位置付けられた外来性ヌクレオチドを除去することによって実現される。有利なことに、こうした改善の組み合わせを使用することにより、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能がｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで改善する。例えば、実施例６に記載するように、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターにおけるこうした改善の組み合わせの使用により、ｉｎ ｖｉｖｏ生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列を使用した、コードされる野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子の同じコドン改変を有するポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの使用と比べて、１４倍上昇した（図１４のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２をｖＳＣ０４と比較されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの結果と整合して、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターにおけるこうした改善の組み合わせの使用により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列を使用した、コードされる野生型リファクト第ＶＩＩＩ因子の同じコドン改変を有するポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターの使用と比べて、２４倍上昇した（図１４のｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２をｖＳＣ０４と比較されたい）。ＷＯ２０１７／０８３７６２（その内容は参照により本明細書に援用される）の表４で報告されているように、ｖＣＳ０４ベクターは、野生型コード配列を使用するリファクト第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドをコードする均等な遺伝子療法ベクターと比べて７０倍よりも高いｉｎ ｖｉｖｏのＦＶＩＩＩ生物作用能をもたらす。したがって、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０遺伝子療法ベクターは、野生型リファクトコード配列の使用と比べて、ＦＶＩＩＩ生物作用能の１０００倍～１７５０倍の上昇をもたらすと予想される。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途記載しない限り、それらに与えられる意味を有する。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別途記載しない限り、それらに与えられる意味を有する。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子」及び「ＦＶＩＩＩ」という用語は、同義に使用され、第ＶＩＩＩ因子活性を有する任意のタンパク質（例えば、しばしばＦＶＩＩＩａと称される活性ＦＶＩＩＩ）、または、特定の条件下で、例えば、欧州薬局方９．０の第２．７．４章に記載されている２ステップ発色第Ｘ因子活性化アッセイを使用して測定した場合に、第ＩＸａ因子補因子活性を有するタンパク質のタンパク質前駆体（例えば、プロタンパク質またはプレプロタンパク質）を意味する。例示的な実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドとは、野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖及び軽鎖と高い配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上）を有する配列を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインは、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのサイズを削減するように、欠失しているか、切断されているか、またはリンカーポリペプチドで置換されている。
野生型第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの非限定的な例としては、ヒトプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５２４８５、ＣＡＡ２５６１９、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＡ５２４８４、ＡＡＡ５２４２０、ＡＡＶ８５９６４、ＢＡＦ８２６３６、ＢＡＧ３６４５２、ＣＡＩ４１６６０、ＣＡＩ４１６６６、ＣＡＩ４１６７２、ＣＡＩ４３２４１、ＣＡＯ０３４０４、ＥＡＷ７２６４５、ＡＡＨ２２５１３、ＡＡＨ６４３８０、ＡＡＨ９８３８９、ＡＡＩ１１９６８、ＡＡＩ１１９７０、またはＡＡＢ６１２６１）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；ブタプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｆ１ＲＺ３６またはＫ７ＧＳＺ５）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；マウスプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ３７３８５、ＣＡＭ１５５８１、ＣＡＭ２６４９２、またはＥＤＬ２９２２９）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＱ２１５８０）、対応するプロ第ＶＩＩＩ因子、及びそれらの天然バリアント；ラットプレプロ第ＶＩＩＩ因子；ならびに他の哺乳動物の第ＶＩＩＩ因子相同体（例えば、サル、類人猿、ハムスター、モルモットなど）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、第ＩＸ因子補因子活性を有する天然バリアント及び人工構築物を含む。本開示において使用する場合、第ＶＩＩＩ因子は、いくらかの基礎的な第ＩＸ因子補因子活性（例えば、対応する野生型活性の少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、またはそれ以上）を保持する、あらゆる天然バリアント、代替的な配列、アイソフォーム、または変異体タンパク質を包含する。
「第ＶＩＩＩ因子」の定義には、「バリアントＦＶＩＩＩ」と称される場合もある第ＶＩＩＩ因子バリアントが具体的に含まれる。バリアントＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒト野生型ＦＶＩＩＩと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有する。ヒト集団に見出される第ＶＩＩＩ因子の（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号１９）に対する）アミノ酸変化の例は、限定するものではないが、
を含む。第ＶＩＩＩ因子タンパク質には、翻訳後修飾を含むポリペプチドも含まれる。
概して、第ＶＩＩＩ因子をコードするポリヌクレオチドは、翻訳後プロセシングを受けて活性の第ＶＩＩＩ因子タンパク質（例えば、ＦＶＩＩＩａ）を形成する不活性の一本鎖ポリペプチド（例えば、プレプロタンパク質）をコードする。例えば、図１５を参照すると、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子プレプロタンパク質がまず切断されて、コードされるシグナルペプチド（図示せず）を放出し、第１の一本鎖プロタンパク質（「ヒト野生型ＦＶＩＩＩ」として示される）を形成する。プロタンパク質は次いで、ＢドメインとＡ３ドメインとの間で切断されて、第ＶＩＩＩ因子重鎖（例えば、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメイン）及びＢドメインを含む第１のポリペプチド、ならびに第ＶＩＩＩ因子軽鎖を含む（例えば、Ａ３、Ｃ１、及びＣ３ドメインを含む）第２のポリペプチドを形成する。第１のポリペプチドはさらに切断されてＢドメインが除去され、また、Ａ１ドメイン及びＡ２ドメインが分離するが、これらは、成熟した第ＶＩＩＩａ因子タンパク質の第ＶＩＩＩ因子軽鎖と関連したままである。第ＶＩＩＩ因子の成熟プロセスの概説については、Ｇｒａｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．，６（６）：４８８－５０１（２００５）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子重鎖」、または単に「重鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ１ドメイン及びＡ２ドメインの凝集体を意味する。例示的な実施形態では、ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号３９）のアミノ酸２０～７５９が第ＶＩＩＩ因子重鎖を構成する。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子軽鎖」、または単に「軽鎖」という用語は、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＡ３、Ｃ１、及びＣ２ドメインの凝集体を意味する。例示的な実施形態では、ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号３９）のアミノ酸１６６８～２３５１が第ＶＩＩＩ因子軽鎖を構成する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子軽鎖は、ｉｎ ｖｉｖｏで成熟中に放出される酸性のａ３ペプチドを除外する。
概して、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖は、単一のポリペプチド鎖として、例えば、任意選択のＢドメインまたはＢドメイン置換リンカーと共に発現される。しかしながら、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子重鎖及び第ＶＩＩＩ因子軽鎖は、別々のポリペプチド鎖として発現（例えば、共発現）され、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を形成するように（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）再構成される。
本明細書で使用する場合、「Ｂドメイン置換リンカー」及び「第ＶＩＩＩ因子リンカー」という用語は、同義に使用され、切断型の野生型第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（例えば、ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ（配列番号３９）のアミノ酸７６０～１６６７）または第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＢドメインを置換するように工学操作されたペプチドを意味する。本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子リンカーは、いくつかの実施形態による第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドにおいて、第ＶＩＩＩ因子重鎖のＣ末端と第ＶＩＩＩ因子軽鎖のＮ末端との間に位置付けられる。Ｂドメイン置換リンカーの非限定的な例は、米国特許第４，８６８，１１２号、同第５，１１２，９５０号、同第５，１７１，８４４号、同第５，５４３，５０２号、同第５，５９５，８８６号、同第５，６１０，２７８号、同第５，７８９，２０３号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第６，０６０，４４７号、同第６，１１４，１４８号、同第６，２２８，６２０号、同第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第６，４５８，５６３号、同第６，９２４，３６５号、同第７，０４１，６３５号、及び同第７，９４３，３７４号、米国特許出願公開第２０１３／０２４９６０号、同第２０１５／００７１８８３号、及び同第２０１５／０１５８９３０号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／０６４２７７号及び同第ＷＯ２０１４／１２７２１５号に開示されており、これらの開示内容は全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
本明細書で別途記載しない限り、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸の付番は、図１６に配列番号３９として提示する完全長、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ）における対応するアミノ酸を意味する。したがって、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質におけるアミノ酸置換を参照するとき、記載されるアミノ酸番号は、完全長、野生型の第ＶＩＩＩ因子配列において類似（例えば、構造的または機能的に均等）及び／または相同の（例えば、一次アミノ酸配列において進化的に保存されている）アミノ酸を意味する。例えば、Ｔ２１０５Ｎアミノ酸置換は、完全長、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ；配列番号３９）の２１０５位におけるＴからＮへの置換、ＣＳ１２によってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質（ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ；配列番号２）の１２１８位におけるＴからＮへの置換を意味する。
本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子アミノ酸の付番システムは、第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチド（例えば、完全長、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子配列のアミノ酸１～１９）が含まれるかどうかに依存する。シグナルペプチドが含まれる場合、その付番は、「シグナルペプチド包括的」または「ＳＰＩ」と称される。シグナルペプチドが含まれない場合、その付番は、「シグナルペプチド排他的」または「ＳＰＥ」と称される。例えば、Ｆ３２８Ｓは、ＳＰＥ付番のＦ３０９Ｓと同じアミノ酸のＳＰＩ付番である。別途示さない限り、すべてのアミノ酸付番は、図１６に配列番号３９として提示する完全長、野生型のヒト第ＶＩＩＩ因子配列（ｈＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ）における対応するアミノ酸を意味する。
本明細書に記載するように、コドン改変ポリヌクレオチドは、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物（例えば、野生型ヒトコドンを使用する、同じ第ＶＩＩＩ因子構築物をコードするポリヌクレオチド）によってもたらされる第ＶＩＩＩ因子の発現レベルと比較して、トランスジェニック第ＶＩＩＩ因子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現上昇をもたらす（例えば、遺伝子療法ベクターの一部として投与されるとき）。本明細書で使用する場合、「発現上昇」という用語は、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物を投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルと比較した、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子の活性レベルの上昇を意味する。活性レベルは、当該技術分野で知られる任意の第ＶＩＩＩ因子活性、例えば、欧州薬局方９．０の第２．７．４章に記載されている２ステップ発色第Ｘ因子活性化アッセイを使用して測定することができる。第ＶＩＩＩ因子活性を決定するための例示的なアッセイは、Ｔｅｃｈｎｏｃｈｒｏｍｅ ＦＶＩＩＩアッセイ（Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）である。
いくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティの上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも２５％多いことを意味する。いくつかの実施形態では、バイオアベイラビリティの上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む、改善された遺伝子療法ベクターを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドが、同じまたは異なるコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む異なる遺伝子療法ベクターを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのレベルと比較して、少なくとも２５％多いことを意味する。いくつかの実施形態では、発現上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中のトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子活性が、少なくとも５０％高い、少なくとも７５％高い、少なくとも１００％高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、少なくとも１０倍高い、少なくとも１５倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも２５倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、少なくとも１２５倍高い、少なくとも１５０倍高い、少なくとも１７５倍高い、少なくとも２００倍高い、少なくとも２２５倍高い、または少なくとも２５０倍高いことを意味する。
本明細書における「第ＶＩＩＩ因子活性」とは、野生型第ＩＸ因子におけるＡｒｇ１９４－Ｉｌｅ１９５ペプチド結合を加水分解し、第Ｘ因子を活性化して第Ｘａ因子にすることによる、第ＩＸａ因子、例えば、第ＩＸａ因子補因子活性による、第Ｘ因子ポリペプチドの切断を促進する能力を意味する。活性レベルは、当該技術分野で知られる任意の第ＶＩＩＩ因子活性を使用して測定することができる。好適なアッセイについては本明細書に概説している。第ＶＩＩＩ因子活性を決定するための例示的なアッセイは、欧州薬局方９．０の第２．７．４章に記載されている２ステップ発色第Ｘ因子活性化アッセイである。
本明細書で使用する場合、「生物作用能」という用語は、ｉｎ ｖｉｖｏでは対象の血液中、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養上清中の、第ＶＩＩＩ因子の活性量を意味する。いくつかの実施形態では、生物作用能とは、単位体積当たりの活性量、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでは血液１ｍＬ当たりの、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養上清１ｍＬ当たりの、第ＸＩａ因子補因子活性の単位を意味する。いくつかの実施形態では、生物作用能は、第１のレベル、例えば、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子タンパク質またはコドン最適化された天然第ＶＩＩＩ因子（例えば、「野生型」リファクトＦＶＩＩＩタンパク質）に対する、上昇倍率として表される。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する場合、外因的に発現される第ＶＩＩＩ因子の生物作用能とは、遺伝子療法ベクターから発現される組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質によってもたらされる第ＶＩＩＩ因子の活性量を意味する。すなわち、あらゆる天然第ＶＩＩＩ因子活性のベースライン量を考慮した後の血液または細胞培養上清中の第ＶＩＩＩ因子の活性量である。したがって、生物作用能の上昇は、外因性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現レベルを上昇させること、及び／または、例えば、より高い特異的活性をもたらすアミノ酸置換（例えばＸ５変異）を含めて、外因性第ＶＩＩＩ因子タンパク質の特異的活性を上昇させることのいずれかまたは両方により、達成され得る。
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド組成物の治療的可能性は、例えば、第ＶＩＩＩ因子の発現及び／またはバイオアベイラビリティの上昇の代わりに、またはそれに加えて、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇によって評価される。いくつかの実施形態では、本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子の活性上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの投与前の動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインに対する、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの投与前の動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインに対する、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇と比較して大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の活性上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの投与前の動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの投与前の動物における第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性レベルの上昇と比較して、少なくとも２５％大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の活性上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む、改善された遺伝子療法ベクターの投与前の動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、改善された遺伝子療法ベクターを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇が、同じまたは異なるコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む異なる遺伝子療法ベクターの投与前の動物における第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、異なる遺伝子療法ベクターを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性レベルの上昇と比較して、少なくとも２５％大きいことを意味する。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子の活性上昇とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの投与前の動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇が、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドまたは同じもしくは異なるコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む異なる遺伝子療法ベクターの投与前の動物における第ＶＩＩＩ因子活性のベースラインレベルに対する、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドまたは同じもしくは異なるコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む異なる遺伝子療法ベクターを投与された動物の血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性レベルの上昇と比較して、少なくとも５０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも１００％大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも１５倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも２５倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、少なくとも１２５倍大きい、少なくとも１５０倍大きい、少なくとも１７５倍大きい、少なくとも２００倍大きい、少なくとも２２５倍大きい、または少なくとも２５０倍大きいことを意味する。活性は、本明細書に記載するように、欧州薬局方９．０の第２．７．４章に記載されている２ステップ発色第Ｘ因子活性化アッセイを使用して測定される。
本明細書に記載するように、コドン改変ポリヌクレオチドは、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物（例えば、野生型ヒトコドンを使用する、同じ第ＶＩＩＩ因子構築物をコードするポリヌクレオチド）によってもたらされるベクター生成のレベルと比較して、ベクター生成の増大をもたらす。本明細書で使用する場合、「ウイルス生成の増大」という用語は、天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物を播種した細胞培養物におけるベクター収量と比較した、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを播種した細胞培養物におけるベクター収量（例えば、培養物１リットル当たりの力価）の増大を意味する。ベクター収量は、当該技術分野で知られる任意のベクター力価アッセイを使用して測定することができる。ベクター収量（例えば、ＡＡＶベクターの収量）を決定するための例示的なアッセイは、ＡＡＶ２逆位末端反復を標的とするｑＰＣＲ（Ａｕｒｎｈａｍｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐａｒｔ Ｂ ２３：１８－２８（２０１２））である。
いくつかの実施形態では、ウイルス生成の増大とは、コドン改変ベクターの収量が、同じ種類の培養下での天然にコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物の収量と比較して、少なくとも２５％多いことを意味する。いくつかの実施形態では、ウイルス生成の増大とは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む改善されたベクターの収量が、同じまたは異なるコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む異なるベクターの収量と比較して、少なくとも２５％多いことを意味する。いくつかの実施形態では、ベクター生成の増大とは、コドン改変ベクターの収量が、少なくとも５０％多い、少なくとも７５％多い、少なくとも１００％多い、少なくとも３倍多い、少なくとも４倍多い、少なくとも５倍多い、少なくとも６倍多い、少なくとも７倍多い、少なくとも８倍多い、少なくとも９倍多い、少なくとも１０倍多い、少なくとも１５倍多い、または少なくとも２０倍多いことを意味する。
本明細書で使用する場合、「血友病」という用語は、凝血または血液凝固の低下を大きな特徴とする病状群を意味する。血友病は、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型血友病、または３つすべての疾患型の複合を意味し得る。Ａ型血友病（血友病Ａ）は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性の低下または損失によって生じ、血友病サブタイプの中で最も顕著なものである。Ｂ型血友病（血友病Ｂ）は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）凝血機能の損失または低下に起因する。Ｃ型血友病（血友病Ｃ）は、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）凝血活性の損失または低下の結果である。血友病Ａ及びＢはＸ連鎖性疾患であり、血友病Ｃは常染色体性である。血友病の従来の治療は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ（Ｂｅｂｕｌｉｎ（登録商標）－ＶＨを含む）、及びＦＸＩのような凝血因子の予防的及び応需的な投与、ならびにＦＥＩＢＡ－ＶＨ、デスモプレシン、及び血漿注入を含む。
本明細書で使用する場合、「ＦＶＩＩＩ遺伝子療法」という用語は、血友病に関連する１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の緩和、減少、または再発防止のために、第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸を患者に提供する、任意の治療手法を含む。この用語には、血友病患者の健康を維持または改善するために、第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態を含めた第ＶＩＩＩ因子分子（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアント）をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手技、またはレジメンを供与することが包含される。当業者には、ＦＶＩＩＩ療法の過程またはＦＶＩＩＩ治療剤の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法」または「ＦＶＩＩＩ遺伝子療法」という用語は、第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）に関連する１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の緩和、減少、または再発防止のために、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする核酸を患者に提供する、任意の治療手法を含む。この用語には、第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）を有する患者の健康を維持または改善するために、第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態を含めた第ＶＩＩＩ因子分子（例えば、Ｘ５変異、Ｂドメイン欠失、及び／またはＢドメインリンカーポリペプチドに挿入されたグリコシル化ペプチドを有する第ＶＩＩＩ因子バリアント）をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手技、またはレジメンを供与することが包含される。当業者には、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法の過程またはＦＶＩＩＩ遺伝子療法の治療剤の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、「バイパス療法」という用語は、血友病に関連する１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の緩和、減少、または再発防止のために、第ＶＩＩＩ因子ではない止血剤、化合物、または凝固因子を患者に提供する、任意の治療手法を含む。第ＶＩＩＩ因子ではない化合物及び凝固因子としては、限定するものではないが、第ＶＩＩＩ因子阻害剤バイパス活性（ＦＥＩＢＡ）、組換え活性化型第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）、プロトロンビン複合体濃縮物、及び活性化型プロトロンビン複合体濃縮物が挙げられる。これらの第ＶＩＩＩ因子ではない化合物及び凝固因子は、組換え型であっても血漿由来であってもよい。当業者には、バイパス療法の過程またはバイパス療法の用量はいずれも、例えば、本開示に従って得られる結果に基づいて変更され得ることが理解されよう。
本明細書で使用する場合、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸及び従来の血友病Ａ治療剤の投与を含む「併用療法」は、血友病に関連する１つ以上の症状（例えば、臨床因子）の緩和、減少、または再発防止のために、第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸と、第ＶＩＩＩ因子分子及び／または第ＶＩＩＩ因子ではない止血剤（例えば、バイパス治療剤）との両方を患者に提供する、任意の治療手法を含む。この用語には、血友病患者の健康を維持または改善するのに有用であり、本明細書に記載する治療剤のうちのいずれかを含む、第ＶＩＩＩ因子の任意の修飾形態を含めた第ＶＩＩＩ因子分子をコードする核酸を含む任意の化合物、薬物、手技、またはレジメンを供与することが包含される。
「治療的に有効な量または用量」または「治療的に十分な量または用量」または「有効または十分な量または用量」という用語は、投与される対象に治療効果をもたらす用量を意味する。例えば、血友病の治療に有用な薬物の治療的に有効な量は、血友病に関連する１つ以上の症状を防止または緩和することができる量であり得る。
いくつかの実施形態では、治療的に有効な治療は、対象における出血事象の頻度及び／または重症度の低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、治療的に有効な治療は、治療前の活性と比較した、患者の血流中の第ＶＩＩＩ因子の活性上昇をもたらす。
本明細書で使用する場合、「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ分子のセグメント（例えば、コード領域）を意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ポリペプチド鎖の生成に関与するコード領域の直前にある領域、直後にある領域、及び／または介在する領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、またはイントロンなどの制御エレメント）によって位置付けられる。
本明細書で使用する場合、「制御エレメント」という用語は、細胞におけるコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリアデニル化配列、イントロンなどのようなヌクレオチド配列を意味する。
本明細書で使用する場合、「プロモーターエレメント」という用語は、コード配列の発現のコントロールを助けるヌクレオチド配列を意味する。概して、プロモーターエレメントは、遺伝子の翻訳開始部位の５’に位置する。しかしながら、特定の実施形態では、プロモーターエレメントは、イントロン配列内、またはコード配列の３’に位置し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、標的タンパク質の天然遺伝子に由来する（例えば、第ＶＩＩＩ因子プロモーター）。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターに有用なプロモーターは、標的生物の特定の細胞または組織における発現に特異的である（例えば、肝臓特異的プロモーター）。さらに他の実施形態では、複数の十分に特徴付けられたプロモーターエレメントのうちの１つが、本明細書に記載する遺伝子療法ベクターに使用される。十分に特徴付けられたプロモーターエレメントの非限定的な例としては、ＣＭＶ初期プロモーター、β－アクチンプロモーター、及びメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的タンパク質の実質的に一定の発現を駆動する構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、特定の刺激（例えば、特定の治療または剤への曝露）に応答して標的タンパク質の発現を駆動する誘導性プロモーターである。ＡＡＶによる遺伝子療法のためのプロモーターの設計の概説については、Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１１４３－５３（２０１１））を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用する場合、「ＣＲＭ８」エレメントとは、配列番号５と高い配列同一性を有する、肝臓特異的に、機能的に連結した遺伝子、例えば、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする配列の発現を向上させる、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子（ＮＣＢＩ受入番号ＮＭ＿０００２９５．４）に由来するシス作用性制御モジュールを意味する。いくつかの実施形態では、ＣＲＭ８エレメントは、配列番号５と同一である。本明細書で使用する場合、ＣＲＭ８エレメントとは、制御エレメントの単一コピーを意味し、これは、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中の１以上のコピー、例えば、１、２、３、またはそれ以上のコピーに含まれる。ＣＲＭ８などのＣＲＭエレメントに関するさらなる情報については、参照により本明細書に援用されるＣｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２２（９）：１６０５－１３（２０１４）を参照されたい。
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結」という用語は、第１の参照ヌクレオチド配列（例えば、遺伝子）と第２のヌクレオチド配列（例えば、制御性コントロールエレメント）との間の関係で、第２のヌクレオチド配列が、第１の参照ヌクレオチド配列に関連する１つ以上の特性（例えば、転写速度）に影響を及ぼすことを可能にするものを意味する。本開示においては、制御エレメントが、第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子の転写に影響（例えば、促進的または組織選択的影響）を及ぼすように遺伝子療法ベクター内に位置付けられているとき、制御性コントロールエレメントは、第ＶＩＩＩ因子導入遺伝子に作動可能に連結している。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物をコードするもの）を宿主細胞に移入するために使用される任意のビヒクルを意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的核酸と共にビヒクルを複製するように機能するレプリコンを含む。遺伝子療法に有用なベクターの非限定的な例としては、ｉｎ ｖｉｖｏで自律的複製単位として機能する、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、及びウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、標的核酸（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチド）を導入するためのウイルスビヒクルである。当該技術分野では、遺伝子療法に有用な、多くの改変された真核生物ウイルスが知られている。例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法に使用するのに特に適しているが、その理由は、ヒトがこのウイルスの天然の宿主であり、天然のウイルスが何らかの疾患に寄与するとは知られておらず、これらのウイルスは軽度の免疫応答を誘起するからである。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子ウイルスベクター」という用語は、好適な動物宿主（例えば、ヒト）に導入した場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に十分である、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む、組換えウイルスを意味する。第ＶＩＩＩ因子ウイルスベクターの定義には、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、ウイルスのゲノムに挿入されている、組換えウイルスが具体的に含まれる。また、第ＶＩＩＩ因子ウイルスベクターの定義には、ウイルスの天然ゲノムが、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドで置換されている、組換えウイルスも具体的に含まれる。第ＶＩＩＩ因子ウイルスベクターの定義には、Ｘ５変異、Ｂドメイン欠失、及び／またはＢドメインリンカーポリペプチドに挿入されたグリコシル化ペプチドを有する第ＶＩＩＩ因子のバリアントをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む、組換えウイルスが含まれる。
本明細書で使用する場合、「第ＶＩＩＩ因子ウイルス粒子」という用語は、好適な動物宿主（例えば、ヒト）に導入した場合、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの発現に特異的である、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入する、ウイルス粒子を意味する。第ＶＩＩＩ因子ウイルス粒子の定義には、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが挿入されているゲノムを封入する、組換えウイルス粒子が具体的に含まれる。また、第ＶＩＩＩ因子ウイルス粒子の定義には、ウイルスの天然ゲノムを置換する、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入する、組換えウイルス粒子も具体的に含まれる。第ＶＩＩＩ因子ウイルス粒子の定義には、Ｘ５変異、Ｂドメイン欠失、及び／またはＢドメインリンカーポリペプチドに挿入されたグリコシル化ペプチドを有する第ＶＩＩＩ因子のバリアントをコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入する、組換えウイルス粒子が含まれる。
本明細書における「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」とは、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）属のウイルスに属するデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）を意味する。本明細書で使用する場合、ＡＡＶは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが挿入されている天然起源の「野生型」ＡＡＶゲノムに由来するウイルス、天然起源のＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を使用してカプシドにパッケージングされた組換え第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに由来する組換えウイルス、または非天然カプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるカプシドタンパク質を使用してカプシドにパッケージングされた組換え第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに由来する組換えウイルスを意味し得る。ＡＡＶの定義には、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入する、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ８）、及びＡＡＶ９型（ＡＡＶ９）のウイルス、ならびに第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入する１つ以上のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質によって形成されたウイルスが含まれる。
本明細書における「ＡＡＶ８」、「ＡＡＶ－８」、または「ＡＡＶ血清型８」とは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを封入するＡＡＶ８カプシドウイルスタンパク質によって形成されたウイルスを意味する。
本明細書で使用する場合、「ＣｐＧ」という用語は、ＤＮＡの一本鎖に沿ったシトシン－グアニンジヌクレオチドを意味し、ここで「ｐ」は、２つの間のリン酸結合を表す。
本明細書で使用する場合、「ＣｐＧアイランド」という用語は、ポリヌクレオチドのうち、統計学的に高い密度のＣｐＧジヌクレオチドを有する領域を意味する。本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド（例えば、コドン改変第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードするポリヌクレオチド）の領域は、２００塩基対のウィンドウにわたって、（ｉ）その領域が５０％超のＧＣ含有率を有し、（ｉｉ）次の関係：
によって定義されるように、予想されるＣｐＧジヌクレオチド当たりの観察されるＣｐＧジヌクレオチドの比率が、少なくとも０．６である場合、ＣｐＧアイランドである。ＣｐＧアイランドを同定する方法に関するさらなる情報については、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，１９６（２）：２６１－８２（１９８７）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド及びそれらのポリマー、ならびにそれらの相補体を意味する。この用語には、既知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基もしくは連結を含む核酸であって、合成、天然起源、及び非天然起源のものであり、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される核酸が包含される。かかる類似体の例としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラル－メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、及びペプチド－核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
「アミノ酸」という用語は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、ｙ－カルボキシグルタメート、及びＯ－ホスホセリンを含む、天然起源のアミノ酸を意味する。天然起源のアミノ酸には、例えば、Ｄ－アミノ酸及びＬ－アミノ酸が含まれ得る。アミノ酸は、本明細書では、広く知られている３文字の記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている１文字の記号のいずれかによって表されていることがある。ヌクレオチドも同様に、広く認められている１文字の略号で表されていることがある。
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失、またはタンパク質に化学的に結合した部分に対する改変のことを意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変糖質またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／または欠失を意味する。分かりやすくするために付言すると、別途示さない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡがコードするアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにコドンを有する２０種のアミノ酸に対するものである。
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸に置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、生物内の非天然起源のものまたは任意の生物のいずれかにおける、特定の位置の、非天然起源のアミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｇ１５１Ｋは、１５１位のグリシンがリジンに置き換えられているバリアントポリペプチドを意味する。分かりやすくするために付言すると、核酸コード配列は変化させるが開始アミノ酸は変化させない（例えば、宿主生物での発現レベルを上昇させるように、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（やはりアルギニンをコードする）に交換する）ように工学操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない；すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子を作製したにもかかわらず、そのタンパク質が開始した特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。したがって、同じポリペプチドをコードする核酸の各バリエーションは、実際の遺伝子療法構築物に関してではなく、発現産物に関して、記載される各配列に暗示される。
「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、－２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後かつ２３４位の前にグルタミン酸を挿入することを示す。さらに、－２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後かつ２３４位の前にＡｌａＡｓｐＧｌｕを挿入することを示す。
「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、本明細書で使用する場合、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３－またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３－またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。２つ以上の核酸またはペプチド配列との関連における「同一」または「同一性」パーセントという用語は、ＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメータで使用して、または手作業によるアライメント及び目視確認によって測定した場合に、同じである、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の割合（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域にわたって一致率が最大になるように比較及びアラインしたときに、所定の領域にわたって約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列に関するものである。
当該技術分野で知られているように、タンパク質（または以下に詳解する核酸）が既知の配列に対する配列同一性または類似性を有するかどうかを識別するには、いくつかの異なるプログラムを使用することができる。配列同一性及び／または類似性は、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズムによるもの、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるもの、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装によるもの（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１２：３８７－３９５（１９８４）により説明されているＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラムによる、好ましくはデフォルト設定を使用するもの、または検査によるものを含む、当該技術分野で知られる標準的技術を使用して決定される。好ましくは、同一性パーセントは、ＦａｓｔＤＢにより、次のパラメータ：ミスマッチペナルティ１；ギャップペナルティ１；ギャップサイズペナルティ０．３３；及びジョイニングペナルティ３０に基づいて計算される。“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ １２７－１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ（これらはすべて、参照により援用される）。
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進法によるペアワイズアラインメントを使用して、関連する配列の群から複数配列アラインメントを作成する。これは、アラインメントを作成するために使用されるクラスター関係を示す系図をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１－３６０（１９８７）の累進法によるアラインメント方法を簡素化したものを使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３（１９８９）に記載されているものと同様であり、これらはいずれも参照により援用される。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、デフォルトのギャップ重み３．００、デフォルトのギャップ長重み０．１０、及び重み付きエンドギャップを含む。
有用なアルゴリズムの別の例は、いずれも参照により援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）、及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５７８７（１９９３）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０－４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ］から取得したＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、その大部分は、デフォルト値に設定されている。調節可能なパラメータは、次の値：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１に設定される。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメータは、動的値であり、特定の配列の組成及び目的の配列を検索する特定のデータベースの組成に応じて、プログラム自体によって確立される。しかしながら、これらの値は、感度を上昇させるように調節してもよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、参照により援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２によって報告されている、ギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ－６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメータは９に設定し、２ヒット法でギャップなし伸張をトリガし、ｋのギャップ長に１０＋ｋのコストを課し、Ｘｕは１６に設定し、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定する。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに対応するスコアによってトリガされる。
アミノ酸配列同一性％値は、アラインされる領域内で、マッチする同一の残基の数を「長い方の」配列の残基総数で除すことによって決定される。「長い方の」配列は、アラインされる領域内に実際の残基を最も多く有するものである（アラインメントスコアを最大にするためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２によって導入されたギャップは無視される）。同様に、同定されるポリペプチドのコード配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」とは、候補配列内のヌクレオチド残基で、細胞周期タンパク質のコード配列内のヌクレオチド残基と同一であるものの割合として定義される。好ましい方法は、オーバーラップスパン及びオーバーラップフラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定された、デフォルトパラメータに設定されたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
アラインメントは、アラインしようとする配列にギャップを導入することを含み得る。さらに、図１の配列（配列番号１）によってコードされるタンパク質よりも多いまたは少ないアミノ酸を含む配列については、一実施形態において、配列同一性の割合は、アミノ酸またはヌクレオチドの総数に対する同一のアミノ酸またはヌクレオチドの数に基づいて決定されると理解される。したがって、例えば、以下に詳解するように、図１に示す配列（配列番号１）よりも短い配列の配列同一性は、一実施形態では、短い方の配列内のヌクレオチドの数を使用して決定される。同一性パーセントの計算においては、挿入、欠失、置換などの種々の配列変化の出現に対して、相対的な重みは割り当てられない。
一実施形態では、同一性のみが正（＋１）のスコアを与えられ、ギャップを含むあらゆる形態の配列変化は「０」の値を割り当てられるので、配列類似性の計算の際に、後述する重み付きスケールまたはパラメータの必要がなくなる。配列同一性パーセントは、例えば、アラインされる領域内で、マッチする同一の残基の数を「短い方の」配列の残基の総数で除し、１００を乗じることによって計算することができる。「長い方の」配列は、アラインされる領域内に実際の残基を最も多く有するものである。
「対立遺伝子バリアント」という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の多型、ならびに遺伝子のｍＲＮＡ転写物に由来するｃＤＮＡ、及びそれらによってコードされるポリペプチドを意味する。「好ましい哺乳動物コドン」という用語は、次のリスト：Ｇｌｙ（ＧＧＣ、ＧＧＧ）；Ｇｌｕ（ＧＡＧ）；Ａｓｐ（ＧＡＣ）；Ｖａｌ（ＧＴＧ、ＧＴＣ）；Ａｌａ（ＧＣＣ、ＧＣＴ）；Ｓｅｒ（ＡＧＣ、ＴＣＣ）；Ｌｙｓ（ＡＡＧ）；Ａｓｎ（ＡＡＣ）；Ｍｅｔ（ＡＴＧ）；Ｉｌｅ（ＡＴＣ）；Ｔｈｒ（ＡＣＣ）；Ｔｒｐ（ＴＧＧ）；Ｃｙｓ（ＴＧＣ）；Ｔｙｒ（ＴＡＴ、ＴＡＣ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）；Ｐｈｅ（ＴＴＣ）；Ａｒｇ（ＣＧＣ、ＡＧＧ、ＡＧＡ）；Ｇｌｎ（ＣＡＧ）；Ｈｉｓ（ＣＡＣ）；及びＰｒｏ（ＣＣＣ）から選択される、アミノ酸をコードするコドンのセットのうち、哺乳動物細胞において発現されるタンパク質に最も高頻度で使用されるコドンのサブセットを意味する。
本明細書で使用する場合、コドン改変という用語は、ポリペプチド（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントタンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列において、ポリペプチドをコードする天然ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコドンが、ポリヌクレオチド配列の特性を改善するように変更されていることを意味する。いくつかの実施形態では、特性の改善は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの転写の増大、ｍＲＮＡの安定性の上昇（例えば、ｍＲＮＡ半減期の改善）、ポリペプチドの翻訳の増大、及び／またはベクター内のポリヌクレオチドのパッケージングの増大を促進する。特性の改善を達成するために使用され得る改変の非限定的な例としては、特定のアミノ酸に対するコドンの使用頻度及び／または分布の変化、大域的及び／または局所的なＧＣ含有率の調節、ＡＴリッチ配列の除去、反復配列エレメントの除去、大域的及び／または局所的なＣｐＧジヌクレオチド含有率の調節、潜在的な制御エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス及びＣＣＡＡＴボックスエレメント）の除去、イントロン／エクソンスプライス部位の除去、制御配列の改善（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の導入）、ならびに転写されたｍＲＮＡに二次構造（例えば、ステム－ループ）を形成することのできる配列エレメントの除去が挙げられる。
本明細書に詳解するように、本明細書における開示内容の構成要素を参照する種々の命名法が存在する。「ＣＳ番号」（例えば「ＣＳ１２」、「ＣＳ０４」など）は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするコドン改変ポリヌクレオチド及び／またはコードされるポリペプチドを意味し、バリアントを含む。例えば、ＣＳ１２－ＦＬは、ＣＳ１２ポリヌクレオチド配列によってコードされる、完全長のコドン改変されたＣＳ１２ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を意味する（場合により、本明細書では、アミノ酸配列は「ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ」、核酸配列は「ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ」と称される）。同様に、「ＣＳ１２－ＬＣ」は、ＦＶＩＩＩポリペプチドの軽鎖をコードするコドン改変核酸配列（「ＣＳ１２－ＬＣ－ＮＡ」）、またはＣＳ１２ポリヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩ軽鎖のアミノ酸配列（本明細書では「ＣＳ１２－ＬＣ－ＡＡ」と称される場合もある）のいずれかを意味する。同様に、ＣＳ１２－ＨＣ、ＣＳ１２－ＨＣ－ＡＡ、及びＣＳ１２－ＨＣ－ＮＡは、ＦＶＩＩＩ重鎖について同じである。当業者には理解されるように、コドン改変されているのみである（例えば、リファクトと比較して付加的なアミノ酸置換を含まない）ＣＳ０４などの構築物については、アミノ酸配列がコドン最適化によって改変されないため、アミノ酸配列は同一になる。したがって、本開示の配列構築物は、限定するものではないが、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ、ＣＳ１２－ＬＣ－ＮＡ、ＣＳ１２－ＬＣ－ＡＡ、ＣＳ１２－ＨＣ－ＡＡ、及びＣＳ１２－ＨＣ－ＮＡを含む。
この命名法は、「ＮＧ１－ＡＡ」がアミノ酸配列を意味し、ＮＧ１－ＮＡが核酸配列を意味するように、図８に示すグリコシル化ペプチドにも適用される。
本開示には、適切な命名法を用いて後述するように、さらなる新たな第ＶＩＩＩ因子バリアントも含まれる。
本明細書で使用する場合、「肝臓特異的発現」という用語は、他の組織と比較して肝組織において優先的または優勢な、特定の遺伝子（例えば、コドン改変されたトランスジェニック第ＶＩＩＩ因子遺伝子）のｉｎ ｖｉｖｏ発現を意味する。いくつかの実施形態では、肝臓特異的発現とは、特定の遺伝子の全発現の少なくとも５０％が対象の肝組織内で生じることを意味する。他の実施形態では、肝臓特異的発現とは、特定の遺伝子の全発現の少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％が対象の肝組織内で生じることを意味する。したがって、肝臓特異的制御エレメントは、肝組織における遺伝子の肝臓特異的発現を駆動する制御エレメントである。
本明細書で使用する場合、Ｘ「未満」及びＸ％「未満」という用語は、０～Ｘ（値Ｘを除く）、例えば０％～Ｘ％（Ｘ％を除く）の範囲を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、０または０％から始まるがＸまたはＸ％を含まない範囲と同義に使用される。
本明細書で使用する場合、Ｘ「以下」またはＸ％「以下」という用語は、０～Ｘ（値Ｘを含む）、例えば０％～Ｘ％（Ｘ％を含む）の範囲を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、０または０％から始まりＸまたはＸ％を含む範囲と同義に使用される。
本明細書で使用する場合、Ｘ「超」またはＸ％「超」という用語は、Ｘから上限まで（値Ｘを除く）、例えばＸ％～１００％（Ｘ％を除く）の範囲を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、ＸまたはＸ％から始まるがＸまたはＸ％を含まず、割合の場合は１００％である上限までの範囲と同義に使用される。
本明細書で使用する場合、「少なくとも」Ｘまたは「少なくとも」Ｘ％という用語は、Ｘから上限まで（値Ｘを含む）、例えばＸ％～１００％（Ｘ％を含む）の範囲を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、ＸまたはＸ％から始まり、かつＸまたはＸ％を含み、割合の場合は１００％である上限までの範囲と同義に使用される。
本明細書で使用する場合、「『Ｘ』～『Ｙ』」、「『Ｘ』％～『Ｙ』％」、「『Ｘ』～『Ｙ』」、及び「『Ｘ』％～『Ｙ』％」という用語は、Ｘ～Ｙ（値Ｘ及びＹを含む）、例えば、Ｘ％～Ｙ％（Ｘ％及びＹ％を含む）の範囲を意味する。本明細書で使用する場合、これらの用語は、ＸまたはＸ％から始まりＹまたはＹ％を含む範囲と同義に使用される。
ＩＩＩ．コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法構築物において投与すると、著しく改善された第ＶＩＩＩ因子の生物作用能（例えば、活性）をもたらす。コドン改変ポリヌクレオチドはまた、従来的にコドン最適化された構築物と比較して改善されたＡＡＶ－ビリオンパッケージングを示す。
いくつかの実施形態では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを提供する。これらのコドン改変ポリヌクレオチドは、ＡＡＶベースの遺伝子療法構築物において投与すると、著しく改善された第ＶＩＩＩ因子の生物作用能（例えば、活性）をもたらす。コドン改変ポリヌクレオチドはまた、従来的にコドン最適化された構築物と比較して改善されたＡＡＶ－ビリオンパッケージングを示す。
野生型第ＶＩＩＩ因子は、１９アミノ酸のシグナルペプチド（配列番号３９のアミノ酸１～１９）でコードされ、シグナルペプチドは、第ＶＩＩＩ因子の活性化前にコードされたポリペプチドから切断される。当業者には理解されるように、第ＶＩＩＩ因子シグナルペプチドは、シグナルペプチドが細胞プロセシングによって除去された後に残る成熟ポリペプチドの配列に影響を及ぼすことなく、変異させる、他の遺伝子もしくは他の生物の第ＶＩＩＩ因子遺伝子のシグナルペプチドに置換する、または完全に除去することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供するコドン改変ポリヌクレオチド（例えば、核酸組成物）は、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（例えば、活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を促進するフリン切断部位を含む「ＳＱ」リンカー）をコードする、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）の部分と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、これは、５つの「Ｘ５変異」のうちの１つ以上（例えば、完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ変異（ＳＰＩ付番；（ＳＰＥ付番はそれぞれ、Ｉ８６Ｖ／Ａ１０８Ｓ／Ｇ１３２Ｋ／Ｍ１４７Ｔ／Ｌ１５２Ｐである））のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべて）、及び／またはＢドメイン置換リンカー（例えば、ＳＱリンカー）に挿入された短いグリコシル化ペプチド（例えば、ＮＧ５；配列番号１５）をさらに含む。
具体的には、Ｘ５変異セットは、Ｂドメイン欠失遺伝子療法構築物において対応するヒトアミノ酸をブタアミノ酸８２～１７６で置換すると、ＨＥＫ２９３細胞で発現させた第ＶＩＩＩ因子の活性が上昇したという事実に基づく（Ｗ．Ｘｉａｏ、短報）。単一ブタアミノ酸のヒトＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ構築物への復帰変異により、この現象に寄与するＡ１ドメイン内の５つのアミノ酸：Ｉ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐ（ＳＰＩ）が同定された。これらの変異の組み合わせをヒト構築物に導入すると、より大きなブタ置換の活性の改善が再現された（Ｗ．Ｘｉａｏ、短報）。したがって、いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、Ｉ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐから選択される１つ以上のアミノ酸置換を含み、この５アミノ酸セット全体が、多くの実施形態において特に有用である。
ＣＳ１２コドン改変ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する核酸組成物には、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を促進するフリン切断部位を含む短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが含まれ、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する核酸組成物には、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を促進するフリン切断部位を含む短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが含まれ、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む。
いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９６％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９７％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９９．５％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９９．９％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と同一である。
いくつかの実施形態では、コドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９７％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９８％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９９．５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９９．９％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）に対するものである。
第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン置換リンカー
上述のように、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との間の連結部（例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン）は、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアントでは改変されている。野生型第ＶＩＩＩ因子構築物からのＢドメインの除去は、活性化型酵素（例えば、ＦＶＩＩＩａ）の活性に影響を及ぼさないようであるが、これは、Ｂドメインが活性化中に除去されるためだと考えられる。ＡＡＶパッケージング能力のサイズ制限のため、Ｂドメイン欠失型、切断型、及びまたはリンカー置換型のバリアントは、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法構築物の有効性を改善するはずである。従来最も使用されているＢドメイン置換リンカーは、リンカー配列としてＢドメインの１４アミノ酸のみを保持するＳＱ ＦＶＩＩＩのものである。ブタＶＩＩＩの別のバリアント（米国特許第６，４５８，５６３号に記載されている「ＯＢＩ－１」）は、ＣＨＯ細胞で良好に発現され、わずかに長い２４アミノ酸のリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＳＱ型Ｂドメインリンカー配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカー配列を含む。
上述のように、ＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖との間の連結部（例えば、野生型第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン）は、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアントでは改変されている。野生型第ＶＩＩＩ因子構築物からのＢドメインの除去は、活性化型酵素（例えば、ＦＶＩＩＩａ）の活性に影響を及ぼさないようであるが、これは、Ｂドメインが活性化中に除去されるためだと考えられる。ＡＡＶパッケージング能力のサイズ制限のため、Ｂドメイン欠失型、切断型、及びまたはリンカー置換型のバリアントは、ＦＶＩＩＩ遺伝子療法構築物の有効性を改善するはずである。従来最も使用されているＢドメイン置換リンカーは、リンカー配列としてＢドメインの１４アミノ酸のみを保持するＳＱ ＦＶＩＩＩのものである。ブタＶＩＩＩの別のバリアント（米国特許第６，４５８，５６３号に記載されている「ＯＢＩ－１」）は、ＣＨＯ細胞で良好に発現され、わずかに長い２４アミノ酸のリンカーを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＳＱ型Ｂドメインリンカー配列を含む。他の実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物は、ＯＢＩ－１型Ｂドメインリンカー配列を含む。
第ＶＩＩＩ因子Ｂドメインは活性のために必須ではないが、Ｂドメインは、例えばＮ－結合型またはＯ－結合型のグリコシル化によって翻訳後に修飾されるいくつかの残基を含む。野生型第ＶＩＩＩ因子ＢドメインのＩｎ ｓｉｌｉｃｏ分析（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｒ．Ｇｕｐｔａ，Ｅ．Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｓ．Ｂｒｕｎａｋ，ｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（２００４））は、これらの部位のうちの少なくとも４つがｉｎ ｖｉｖｏでグリコシル化されることを予測する。Ｂドメイン内のこれらの修飾は、ｉｎ ｖｉｖｏの第ＶＩＩＩ因子の翻訳後制御及び／または半減期に寄与すると考えられている。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされる第ＶＩＩＩ因子構築物のポリペプチドリンカーは、ｉｎ ｖｉｖｏのグリコシル化を可能にするために、１つ以上のグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのコンセンサスグリコシル化配列（例えば、Ｎ－結合型またはＯ－結合型グリコシル化コンセンサス配列）を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも３つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも４つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５つのコンセンサスグリコシル化配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコンセンサスグリコシル化配列を含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも１つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも３つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも４つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも５つのＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＮ－結合型グリコシル化配列Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔを含み、ここでＸは、Ｐ、Ｓ、またはＴ以外の任意のアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコードされる第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン（ＦＶＩＩＩ－ＦＬ－ＡＡ；配列番号３９）のアミノ酸７６０～７６２／１６５７～１６６７を含む、ＳＱ型Ｂドメインリンカーを含む（Ｓａｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：９３（２００１）、その内容は参照により本明細書に援用される）。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して１つのアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、対応する野生型配列に対して２つのアミノ酸置換を有する。
いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドがＳＱ型Ｂドメインリンカーに挿入されている。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図８に示すもの（それぞれ、記載順に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５）から選択される。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、図８に示す各ポリヌクレオチド（それぞれ、記載順に、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６）によってコードされる。特定の実施形態において、ＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）は、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドのＳＱ型Ｂドメインリンカーに挿入されている。特定の実施形態において、ＮＧ５グリコシル化ペプチドは、配列番号１６の核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、図１７に示す各ポリヌクレオチド（それぞれ、記載順に、配列番号４０～５３）によってコードされるグリコシル化ペプチドを含む。特定の実施形態において、ＳＱ型Ｂドメインリンカーは、配列番号４３の核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるグリコシル化ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカー（例えば、ＳＱ型Ｂドメインリンカー）は、それぞれ、図８Ａ～８Ｂに示す記載順に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５のうちのいずれか１つと高い配列同一性を有するグリコシル化ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、それぞれ、図８Ａ～８Ｂに示す記載順に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５のうちのいずれか１つに対して、２つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、それぞれ、図８Ａ～８Ｂに示す記載順に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５のうちのいずれかに対して、１つ以下のアミノ酸置換を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、それぞれ、図８Ａ～８Ｂに示す記載順に、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、及び３５のうちのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、それぞれ、図８Ａ～８Ｂに示す記載順に、配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択される対応するヌクレオチド配列と高い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して２つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して２つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して２つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して１つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して１つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５に対して１つ以下のアミノ酸置換を有し、配列番号１６と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、配列番号１６と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、配列番号１６と少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、グリコシル化ペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、配列番号１６と少なくとも９８％の同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
シス制御エレメント
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物には、ｉｎ ｖｉｖｏの発現を駆動し、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、１つ以上のシス作用性制御エレメント、例えば、プロモーター及び／またはエンハンサーエレメントも含まれる。この文脈において、「シス作用性」とは、制御エレメントが、それらが制御する遺伝子と同じＤＮＡ分子上に存在することを意味する。当業者には理解されるように、また以下に詳解するように、本発明で使用するのに好適な制御エレメントとしては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化シグナルエレメント、及び／または逆位末端反復エレメントが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物には、ｉｎ ｖｉｖｏの発現を駆動し、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結している、１つ以上のシス作用性制御エレメント、例えば、プロモーター及び／またはエンハンサーエレメントも含まれる。この文脈において、「シス作用性」とは、制御エレメントが、それらが制御する遺伝子と同じＤＮＡ分子上に存在することを意味する。当業者には理解されるように、また以下に詳解するように、本発明で使用するのに好適な制御エレメントとしては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化シグナルエレメント、及び／または逆位末端反復エレメントが挙げられる。
プロモーター
本発明において有用なプロモーターは、コード領域に作動可能に連結しており、一般的には直接連結している（例えば、プロモーターとコード領域との間に付加的なヌクレオチドは含まれない）が、いくつかの実施形態では、例えば非機能的リンカーの使用によって、またはプロモーターの「下流」だがコード領域の「上流」で機能する付加的な制御エレメントが使用され得る場合には、間接的連結を使用してもよい。しかしながら、本発明のベクターのサイズ制限のため、これは一般的に好ましくない。
本発明において有用なプロモーターは、コード領域に作動可能に連結しており、一般的には直接連結している（例えば、プロモーターとコード領域との間に付加的なヌクレオチドは含まれない）が、いくつかの実施形態では、例えば非機能的リンカーの使用によって、またはプロモーターの「下流」だがコード領域の「上流」で機能する付加的な制御エレメントが使用され得る場合には、間接的連結を使用してもよい。しかしながら、本発明のベクターのサイズ制限のため、これは一般的に好ましくない。
エンハンサーエレメント
いくつかの実施形態では、１つ以上のエンハンサーエレメントが第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物に使用される。当該技術分野で知られているように、エンハンサーエレメントは概して、組織依存的に、例えば、主に特定の組織において発現を駆動する。一般に、後述するように、エンハンサーエレメントは概して、プロモーターエレメントの「上流」に位置付けられる。第ＶＩＩＩ因子は主に肝臓で合成されるため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントの発現を肝細胞に実質的に制限する肝臓特異的制御エレメントを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のエンハンサーエレメントが第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物に使用される。当該技術分野で知られているように、エンハンサーエレメントは概して、組織依存的に、例えば、主に特定の組織において発現を駆動する。一般に、後述するように、エンハンサーエレメントは概して、プロモーターエレメントの「上流」に位置付けられる。第ＶＩＩＩ因子は主に肝臓で合成されるため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントの発現を肝細胞に実質的に制限する肝臓特異的制御エレメントを含む。
概して、肝臓特異的制御エレメントは、肝臓においてのみ発現されることが知られている任意の遺伝子に由来し得る。ＷＯ２００９／１３０２０８は、α－アンチトリプシンとしても知られるセルピンペプチダーゼ阻害剤クレードＡメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＡ１；遺伝子ＩＤ５２６５）、アポリポタンパク質Ｃ－Ｉ（ＡＰＯＣ１；遺伝子ＩＤ３４１）、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＶ（ＡＰＯＣ４；遺伝子ＩＤ３４６）、アポリポタンパク質Ｈ（ＡＰＯＨ；遺伝子ＩＤ３５０）；トランスサイレチン（ＴＴＲ；遺伝子ＩＤ７２７６）、アルブミン（ＡＬＢ；遺伝子ＩＤ２１３）、アルドラーゼＢ（ＡＬＤＯＢ；遺伝子ＩＤ２２９）、チトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＥ、ポリペプチド１（ＣＹＰ２Ｅ１；遺伝子ＩＤ１５７１）、フィブリノーゲンα鎖（ＦＧＡ；遺伝子ＩＤ２２４３）、トランスフェリン（ＴＦ；遺伝子ＩＤ７０１８）、ハプトグロビン関連タンパク質（ＨＰＲ；遺伝子ＩＤ３２５０）を含め、肝臓特異的に発現されるいくつかの遺伝子を同定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物は、これらのタンパク質のうちの１つ以上のゲノム遺伝子座に由来する肝臓特異的制御エレメントを含む。そのようなエレメントのいくつかの例が、ＷＯ２００９／１３０２０８に記載されており、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
肝臓特異的制御エレメントの一例は、一般的に「ＴＴＲｅ」または「ＴＴＲＥｎｈ」と称される、トランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子由来のものである。Ｈｓｉｅｈ Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉ．，１００（３）：５３７－４５（２００９）。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、ヒトＴＴＲプロモーターエレメントを含む。一実施形態において、ヒトＴＴＲプロモーターは、図４に示すｈＴＴＲプロモーター（配列番号６）と高い配列同一性を有する核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＴＴＲプロモーターは、配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である核酸配列を有する。
肝臓特異的制御エレメントの別の例は、内容が全体としてあらゆる目的のために参照により本明細書に明確に援用されるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１６／１４６７５７号に記載されるような、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子由来のものである。そのようなエレメントの一例は、図４に示すＣＲＭ８制御性コントロールエレメント（配列番号５）である。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメントは、ＣＲＭ８（配列番号５）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、図１１に示す構築物によって例示するように、１つ以上のＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメントを含む。一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、１つのＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメント（例えば、ＣＲＭ８）を含む。別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、２つのＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメント（例えば、ＣＲＭ８）を含む。さらに他の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、３、４、５、６、またはそれ以上のＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメント（例えば、ＣＲＭ８）を含む。
一実施形態において、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、図１１に例示するように、１つ以上のＳＥＲＰＩＮＡ１由来制御性コントロールエレメント（例えば、ＣＲＭ８）及びヒトＴＴＲプロモーターエレメントを含む。一実施形態において、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した、２つのＣＲＭ８エレメント及びヒトＴＴＲプロモーターエレメントを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、ヒトＴＴＲプロモーターの上流に位置付けられた１つ以上のＣＲＭ８エレメントを含む。例えば、１つ以上のＣＲＭ８エレメントは、分子の転写方向に対して、二本鎖構築物のＴＴＲプロモーターの５’に位置付けられる。これは、（＋）一本鎖構築物（例えば、一本鎖が第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする場合）では、１つ以上のＣＲＭ８エレメントがＴＴＲプロモーターの５’に位置付けられることを意味する。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＭ８エレメントは、ＴＴＲプロモーターの５’末端に直接結合しており、例えば、ＣＲＭ８エレメントとＴＴＲプロモーターとの間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。同様に、いくつかの実施形態では、ＴＴＲプロモーターは、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドのコード配列の５’末端または翻訳開始配列（例えば、Ｋｏｚａｋ配列）に直接結合しており、例えば、ＴＴＲプロモーターと第ＶＩＩＩ因子バリアント遺伝子との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。
ポリアデニル化シグナル
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する構築物（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物）の制御エレメントは、例えば、図１１の例示的構築物において示されるように、ポリアデニル化シグナルである制御エレメントである。ポリアデニル化シグナルは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドから生成されるｍＲＮＡ転写物の３’末端におけるポリＡテールの合成を指示する。したがって、ポリアデニル化シグナルは、第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列の３’側に位置付けられる。本明細書に記載する第ＩＸ因子遺伝子療法構築物に使用することのできるポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、合成ポリアデニル化シグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び最小ウサギβ－グロビン（ｍＲＢＧ）遺伝子ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する構築物（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物）の制御エレメントは、例えば、図１１の例示的構築物において示されるように、ポリアデニル化シグナルである制御エレメントである。ポリアデニル化シグナルは、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドから生成されるｍＲＮＡ転写物の３’末端におけるポリＡテールの合成を指示する。したがって、ポリアデニル化シグナルは、第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列の３’側に位置付けられる。本明細書に記載する第ＩＸ因子遺伝子療法構築物に使用することのできるポリアデニル化シグナルの非限定的な例としては、合成ポリアデニル化シグナル、サルウイルス４０（ＳＶ４０）後期遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び最小ウサギβ－グロビン（ｍＲＢＧ）遺伝子ポリアデニル化シグナルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、図１１に示す構築物によって例示するように、合成ポリアデニル化シグナルを含む。一実施形態において、合成ポリアデニル化シグナルは、図４に示す合成ポリＡシグナル（配列番号８）と少なくとも９０％、９５％、９７％、または１００％同一である核酸配列を有する。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、コード配列の末端に位置付けられた１つ以上の終止コドンを含め、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドのコード配列の３’末端に直接結合している。例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアント遺伝子とポリアデニル化配列との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。
逆位末端反復
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物はまた、第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列及び関連する制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなど）に隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内部末端反復（ＩＴＲ）を含む。逆位末端反復は各々、ヘアピンを形成し、これは、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成のための自己プライミングを促進する。ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムのＡＡＶビリオンへの封入及び宿主細胞ゲノムへの組み込みの促進に役立つ。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物はまた、第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列及び関連する制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなど）に隣接するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）内部末端反復（ＩＴＲ）を含む。逆位末端反復は各々、ヘアピンを形成し、これは、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存的合成のための自己プライミングを促進する。ＩＴＲはまた、ＡＡＶゲノムのＡＡＶビリオンへの封入及び宿主細胞ゲノムへの組み込みの促進に役立つ。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、図４に示すＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号４）と高い配列同一性を有する（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の）５’ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードする核酸組成物は、図４に示すＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号９）と高い配列同一性を有する（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の）３’ＩＴＲを含む。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、５’ＩＴＲ配列と肝臓特異的エレメントとの間に位置付けられた外来性ヌクレオチドが存在しないように、肝臓特異的エレメント（例えば、１つ以上のＣＲＭ８エレメント）の５’末端に直接結合している。同様に、いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲは、ポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲ配列との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドが存在しないように、ポリアデニル化シグナルの３’末端に直接結合している。
ＩＶ．第ＶＩＩＩ因子発現ベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば、遺伝子療法に好適なベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。一般に、本発明において有用な発現ベクターには２つの基本的な種類がある。すなわち、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを生成するために細胞培養下で使用されるものと、第ＶＩＩＩ因子（タンパク質か活性かのいずれにせよ）の内因性レベルが上昇するように患者に投与するための遺伝子療法ベクターとして使用されるものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込まれる。発現ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（例えば、遺伝子療法に好適なベクター）、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミド、ファージミド、人工染色体などが挙げられる。一般に、本発明において有用な発現ベクターには２つの基本的な種類がある。すなわち、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを生成するために細胞培養下で使用されるものと、第ＶＩＩＩ因子（タンパク質か活性かのいずれにせよ）の内因性レベルが上昇するように患者に投与するための遺伝子療法ベクターとして使用されるものである。
ウイルスベクターの非限定的な例としては、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ならびにポリオウイルスが挙げられる。
多くの実施形態において、本発明のコドン最適化されたポリヌクレオチドは、患者に投与すると、本明細書に一般的に記載するような第ＶＩＩＩ因子が生成されるように、遺伝子療法用途において使用される。一般に、遺伝子療法ウイルスベクターは、好ましくは、患者への遺伝子療法ベクターの導入がウイルス伝播をもたらさないように、複製欠損性である。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、遺伝子療法ベクターに組み込まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターは、レトロウイルス、特に複製欠損レトロウイルスである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、レトロウイルス発現ベクターに組み込まれる。これらのシステムは、これまでに報告されており、当該技術分野で一般的によく知られている（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３－１５９，１９８３、Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｉｎ：Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，ｅｄｓ．，Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，ｐｐ．４９４－５１３，１９８８、Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１４９－１８８，１９８６）。特定の実施形態では、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３－２６７，１９９６、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１５（９）：８７１－８７５，１９９７、Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７１（９）：６６４１－６６４９，１９９７、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。複製欠損レトロウイルスの生成のプロトコールは当該技術分野で知られている。概説については、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）を参照されたい。
細胞培養下でコドン改変ポリペプチドから第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを発現させるには、真核生物及び原核生物の発現ベクターを含め、多種多様なベクターを使用することができる。特定の実施形態では、プラスミドベクターが、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドを細胞培養下で発現させるために使用するのに想定される。一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を行うことができるマーキング配列を保有する場合がある。プラスミドは、１つ以上のコントロール配列、例えばプロモーターに作動可能に連結した、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含む。
原核生物における発現のためのベクターの非限定的な例としては、ｐＲＳＥＴ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどのようなプラスミドが挙げられ、原核生物発現ベクターに使用されるプロモーターは、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤなどを含む。真核生物における発現のためのベクターの例としては、（ｉ）酵母での発現の場合、ＡＯＸ１、ＧＡＰ、ＧＡＬ１、ＡＵＧ１などのようなプロモーターを使用する、ｐＡＯ、ｐＰＩＣ、ｐＹＥＳ、ｐＭＥＴのようなベクター；（ｉｉ）昆虫細胞での発現の場合、ＰＨ、ｐ１０、ＭＴ、Ａｃ５、ＯｐＩＥ２、ｇｐ６４、ｐｏｌｈなどのようなプロモーターを使用する、ｐＭＴ、ｐＡｃ５、ｐＩＢ、ｐＭＩＢ、ｐＢＡＣなどのようなベクター、ならびに（ｉｉｉ）哺乳動物細胞での発現の場合、ｐＳＶＬ、ｐＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＢＰＶなどのようなベクター、及び、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＥＦ－１、ＵｂＣ、ＲＳＶ、ＡＤＶ、ＢＰＶ、及びβ－アクチンのようなプロモーターを使用する、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどのようなウイルスシステムに由来するベクターが挙げられる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
一実施形態において、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法ベクターに組み込まれる。ＡＡＶシステムは、これまでに報告されており、当該技術分野で一般的によく知られている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）。これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
一実施形態において、本明細書に記載するコドン改変ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースの遺伝子療法ベクターに組み込まれる。ＡＡＶシステムは、これまでに報告されており、当該技術分野で一般的によく知られている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）。これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、これらは各々、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される。
したがって、いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターが提供され、これには、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（例えば、活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を促進するフリン切断部位を含む「ＳＱ」リンカー）をコードする、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）の部分と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ、５つのＸ５変異のうちの１つ以上（例えば、完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、Ｌ１７１Ｐ変異（ＳＰＩ）のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべて）、及び／またはＢドメイン置換リンカー（例えば、ＳＱリンカー）に挿入された短いグリコシル化ペプチド（例えば、ＮＧ５；配列番号１５）をさらに含む、コドン改変ポリヌクレオチド（例えば、核酸組成物）が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターには、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と高い配列同一性を有するヌクレオチド配列を有し、ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖及び軽鎖、ならびに活性ＦＶＩＩＩａタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの成熟を促進するフリン切断部位を含む短い１４アミノ酸のＢドメイン置換リンカー（「ＳＱ」リンカー）を有する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードする、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが含まれ、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドの重鎖は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ、Ａ１２７Ｓ、Ｇ１５１Ｋ、Ｍ１６６Ｔ、及びＬ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む。いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドは、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターのコドン改変ポリヌクレオチドによってコードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントは、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と高い配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、コードされる第ＶＩＩＩ因子バリアントのアミノ酸配列は、５つのＸ５変異（完全長ヒト野生型第ＶＩＩＩ因子配列に対するＩ１０５Ｖ／Ａ１２７Ｓ／Ｇ１５１Ｋ／Ｍ１６６Ｔ／Ｌ１７１Ｐ（ＳＰＩ））、及びＳＱリンカーに挿入されたＮＧ５グリコシル化ペプチド（配列番号１５）を含む、ＣＳ１２－ＦＬ－ＡＡ（配列番号２）と少なくとも９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内の第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、図４に示すｈＴＴＲプロモーター（配列番号６）と高い配列同一性を有する核酸配列を有するプロモーターエレメントに機能的に連結している。いくつかの実施形態では、プロモーターエレメントは、配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である核酸配列を有する。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内の第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、図４に示すＣＲＭ８エレメント（配列番号５）と高い配列同一性を有する核酸配列を有する１つ以上の肝臓特異的制御エレメントに機能的に連結している。いくつかの実施形態では、肝臓特異的制御エレメントは、配列番号５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％同一である核酸配列を有する。いくつかの実施形態では、図１１に示すように、ポリヌクレオチドは、１つのＣＲＭ８エレメントを含む。いくつかの実施形態では、図１１に示すように、ポリヌクレオチドは、２つのＣＲＭエレメントを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内の第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、図１１に例示するように、１つのＣＲＭ８エレメント及びヒトＴＴＲプロモーターエレメントに機能的に連結している。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内の第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、図１１に例示するように、２つのＣＲＭ８エレメント及びヒトＴＴＲプロモーターエレメントに機能的に連結している。実施例２に記載するように、ｈＴＴＲプロモーター及び１つまたは２つの肝臓特異的ＣＲＭ８エレメントの使用により、ＨｅｐＧ２細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏの外因性第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が、マウスＴＴＲプロモーター及びエンハンサー配列の使用と比較して、それぞれ約２倍及び４倍上昇した（図１２のｖＣＳ１１５及びｖＣＳ１１６をｖＣＳ０４と比較されたい）。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＲＭ８エレメントは、ＴＴＲプロモーターの５’末端に直接結合しており、例えば、ＣＲＭ８エレメントとＴＴＲプロモーターとの間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。同様に、いくつかの実施形態では、ＴＴＲプロモーターは、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドのコード配列の５’末端または翻訳開始配列（例えば、Ｋｏｚａｋ配列）に直接結合しており、例えば、ＴＴＲプロモーターと第ＶＩＩＩ因子バリアント遺伝子との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子療法ベクター内の第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、例えば、図１１の例示的構築物において示されるように、ポリアデニル化シグナルに機能的に連結している。一実施形態において、合成ポリアデニル化シグナルは、図４に示す合成ポリＡシグナル（配列番号８）と少なくとも９０％、９５％、９７％、または１００％同一である核酸配列を有する。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、コード配列の末端に位置付けられた１つ以上の終止コドンを含め、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドのコード配列の３’末端に直接結合している。例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアント遺伝子とポリアデニル化配列との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドは存在しない。
内部末端反復は、ＡＡＶベースの組換えベクターに必要なシス制御エレメントである。したがって、本明細書に記載するＡＡＶ遺伝子療法ベクターで使用される、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするポリヌクレオチドは、５’及び３’ＩＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、図４に示すＡＡＶ２ ５’ＩＴＲ（配列番号４）と高い配列同一性を有する（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）。いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲは、図４に示すＡＡＶ２ ３’ＩＴＲ（配列番号９）と高い配列同一性を有する（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である）。
実施例６で報告するように、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子バリアント構築物はサイズが大きいため、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターの一部である第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの数がわずかに低減すると、ベクターの第ＶＩＩＩ因子の生物作用能が著しく上昇し得る。したがって、いくつかの実施形態では、５’ＩＴＲは、５’ＩＴＲ配列と肝臓特異的エレメントとの間に位置付けられた外来性ヌクレオチドが存在しないように、肝臓特異的エレメント（例えば、１つ以上のＣＲＭ８エレメント）の５’末端に直接結合している。同様に、いくつかの実施形態では、３’ＩＴＲは、ポリアデニル化シグナルと３’ＩＴＲ配列との間に位置付けられた外来性ヌクレオチドが存在しないように、ポリアデニル化シグナルの３’末端に直接結合している。
特定の実施形態では、図１１に例示するように、本明細書で提供するＡＡＶ遺伝子療法ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、５’から３’の方向に、５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号４と高い配列同一性を有するもの）、配列番号５と高い配列同一性を有する１つまたは２つのＣＲＭエレメント、配列番号６と高い配列同一性を有するｈＴＴＲプロモーターエレメント、配列番号７と高い配列同一性を有する最小Ｋｏｚａｋコンセンサス配列、配列番号１と高い配列同一性を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントポリヌクレオチド、ポリアデニル化配列（例えば、配列番号８と高い配列同一性を有するもの）、及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列（例えば、配列番号９と高い配列同一性を有するもの）を含む。いくつかの実施形態では、記載するポリヌクレオチドは、図３に示すＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒベクター（配列番号３）と高い配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性）を有する。
本明細書に記載するＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、本明細書に記載するように、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを封入するＡＡＶカプシドタンパク質と共に使用される。すなわち、第ＶＩＩＩ因子を生成するウイルスベクターの送達は、ウイルスベクターを封入するカプシドタンパク質の「殻」を含むウイルス粒子を使用してなされる。
ＡＡＶベクターの血清型は通常、使用されるカプシドタンパク質によって定義される。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含め、いくつかのＡＡＶ血清型の特徴が明らかにされている。概して、任意のＡＡＶ血清型が、本明細書に記載する第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物に使用され得る。しかしながら、血清型は異なる指向性を有し、例えば、異なる組織に優先的に感染する。一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子は主に肝臓で産生されるため、本開示の遺伝子療法構築物のＡＡＶ血清型は、少なくとも血清型ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９に見出される肝臓指向性に基づいて選択される。したがって、一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物は、ＡＡＶ７血清型ベクターである。別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物は、ＡＡＶ８血清型ベクターである。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法構築物は、ＡＡＶ９血清型ベクターである。
いくつかの実施形態では、コドン改変第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ゲノムを組み込むプラスミドポリヌクレオチドも提供される。プラスミドは、例えば、組換えＡＡＶ生成に適格な哺乳動物細胞（例えば、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにＡＡＶ生成のためのヘルパー遺伝子（例えば、アデノウイルス遺伝子）をコードする核酸を有する細胞に導入すると、最終的なＡＡＶ粒子（例えば、バリアント第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有するＡＡＶビリオン）の生成に有用である。いくつかの実施形態では、プラスミドは、宿主細胞（例えば、細菌などの原核生物宿主細胞、または酵母などの真核生物宿主細胞）におけるプラスミドの複製（例えば、プラスミドのスケールアップ）を可能にする制御エレメントを含む。
例えば、本開示の一実施形態による、コドン改変第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ゲノムを保有する例示的プラスミドの配列は、図５（ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ；配列番号１０）に示している。ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミドは、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ゲノム（図３に配列番号３として示している）、及びプラスミド骨格（図１８に配列番号５４として示している）を含む。上述のように、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ第ＶＩＩＩ因子遺伝子療法ゲノムの遺伝子エレメントは図４に示している。ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミドのプラスミド骨格は、細菌宿主細胞におけるプラスミドの複製を促進するｐＭＢ１レプリコン（図１９に配列番号５５として示している；Ｂｏｌｉｖａｒ Ｆ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．，２５（１０）：８０７－１７（１９７９））、及びプラスミドによって形質転換された細菌宿主細胞の選択を促進するＢｌａ（ＡｐＲ）アンピシリン耐性遺伝子（図１９に配列番号５６として示している；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．Ｕ．Ｓ．Ａ，７５（８）：３７３７－４１（１９７８））を含む。ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミドにおける各エレメントの位置を下記の表１に示す。
（表１）ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミドに存在するエレメント
一実施形態において、第ＶＩＩＩ因子バリアント遺伝子療法ゲノムを組み込むプラスミドは、図５に示すＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミド（配列番号１０）と高い配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、記載するポリヌクレオチドは、図５に示すＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミド（配列番号１０）と高い配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性）を有する。いくつかの実施形態では、記載するポリペプチドは、第ＶＩＩＩ因子－ＢＤＤコード配列、例えば、本明細書に開示する第ＶＩＩＩ因子－ＢＤＤコード配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性、及び図５に示すＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐプラスミドの残りの部分と高い配列同一性、例えば、配列番号１０のヌクレオチド１～５２８及び４９２４～７７９４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％の同一性を有する、配列を含む。いくつかの実施形態では、記載するポリヌクレオチドは、表１に示すエレメントのいくつかまたはすべてを含むプラスミドである。いくつかの実施形態では、表１に示すエレメントのうちの１つ以上が、比較可能なエレメントによって置換されている。
ＡＡＶベクターの生成
本明細書に記載するコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド及びウイルスベクターは、核酸増幅及びベクター生成の従来の方法に従って生成される。いくつかのプラットフォームが、組換えＡＡＶベクターの大規模生産のために開発されている。第１のプラットフォームは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（Ｒ１）：Ｒ２－６（２０１１）、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第２のプラットフォームは、例えば、野生型アデノウイルスと、所望のウイルスゲノムの配列を有する組換えアデノウイルスとを、哺乳動物細胞に同時感染させることにより、所望のウイルスゲノムが哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれている、安定な哺乳動物細胞株の構築に基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第３のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第１の組換えＨＳＶと、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２の組換えＨＳＶとを、哺乳動物細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第４のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第１の組換えバキュロウイルスと、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２の組換えバキュロウイルスとを、昆虫細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第５のプラットフォームは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む酵母細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
本明細書に記載するコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド及びウイルスベクターは、核酸増幅及びベクター生成の従来の方法に従って生成される。いくつかのプラットフォームが、組換えＡＡＶベクターの大規模生産のために開発されている。第１のプラットフォームは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む哺乳動物細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Ｋｏｔｉｎ Ｒ．Ｍ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（Ｒ１）：Ｒ２－６（２０１１）、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第２のプラットフォームは、例えば、野生型アデノウイルスと、所望のウイルスゲノムの配列を有する組換えアデノウイルスとを、哺乳動物細胞に同時感染させることにより、所望のウイルスゲノムが哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれている、安定な哺乳動物細胞株の構築に基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第３のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第１の組換えＨＳＶと、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２の組換えＨＳＶとを、哺乳動物細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第４のプラットフォームは、所望のウイルスゲノムの配列を有する第１の組換えバキュロウイルスと、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする第２の組換えバキュロウイルスとを、昆虫細胞に同時感染させることに基づく。概説については、Ｐｅｎａｕｄ－Ｂｕｄｌｏｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．，８（８）：１６６－８０（２０１８）、及びＡｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。これらの内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。第５のプラットフォームは、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、ならびにウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む酵母細胞に、所望のウイルスゲノムの配列を含むプラスミドを導入することに基づく。概説については、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ＪＪ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０２（３）：１０４５－５４（２０１８）を参照されたい。その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明確に援用される。
Ｖ．血友病Ａを治療する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチド）及び遺伝子療法ベクター（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子）は、公知の投与方法に従って、血友病Ａの治療のために血友病Ａ患者に投与される。遺伝子療法ベクターを投与する方法は、当該技術分野でよく知られている。これらは、限定するものではないが、静脈内投与、筋肉内注射、組織内注射、及び肝内投与（例えば、肝動脈内または肝静脈内）を含む。概説については、例えば、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２３（６）：５５７－６５（２０１２）、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１０（８）：１５６６－６９（２０１２）、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１１ Ｓｕｐｐｌ １：９９－１１０（２０１３）、ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１）：４－６（２０１２）、Ｈｉｇｈ ＫＡ，Ｂｌｏｏｄ，１２０（２３）：４４８２－８７（２０１２）、Ｍａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１８（３）：４７７－９０（２０１０）、及びＭａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．，１７（５）：３８７－９２（２０１０）を参照されたい。これらの各々の内容は、参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する核酸組成物（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチド）及び遺伝子療法ベクター（例えば、第ＶＩＩＩ因子バリアントをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子）は、公知の投与方法に従って、血友病Ａの治療のために血友病Ａ患者に投与される。遺伝子療法ベクターを投与する方法は、当該技術分野でよく知られている。これらは、限定するものではないが、静脈内投与、筋肉内注射、組織内注射、及び肝内投与（例えば、肝動脈内または肝静脈内）を含む。概説については、例えば、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２３（６）：５５７－６５（２０１２）、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．，１０（８）：１５６６－６９（２０１２）、Ｃｈｕａｈ ＭＫ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．１１ Ｓｕｐｐｌ １：９９－１１０（２０１３）、ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２３（１）：４－６（２０１２）、Ｈｉｇｈ ＫＡ，Ｂｌｏｏｄ，１２０（２３）：４４８２－８７（２０１２）、Ｍａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，１８（３）：４７７－９０（２０１０）、及びＭａｔｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ．，１７（５）：３８７－９２（２０１０）を参照されたい。これらの各々の内容は、参照により本明細書に援用される。
したがって、本開示は、第ＶＩＩＩ因子欠損（例えば、血友病Ａ）を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載する核酸組成物（例えば、コドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチド構築物及び／または組換えＡＡＶベクター）を、それを必要とする患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、核酸組成物は、例えば、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）と高い核酸配列同一性（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または１００％）を有する、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含む。本明細書に記載するように、いくつかの実施形態では、第ＶＩＩＩ因子バリアントポリペプチドをコードするコドン改変ポリヌクレオチドは、プロモーター（例えば、本明細書に記載するようなヒトＴＴＲプロモーター）及び１つ以上の肝臓特異的制御エレメント（例えば、本明細書に記載するような１つまたは２つのＣＲＭ８エレメント）に作動可能に連結している。
いくつかの実施形態では、核酸組成物は、哺乳動物遺伝子療法ベクターの一部である。特定の実施形態では、哺乳動物遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターである。
一実施形態において、遺伝子療法ベクターは、コドン改変第ＶＩＩＩ因子バリアントコード配列をコードするウイルスベクターを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である。概して、ウイルスベクターは、各末端における逆位末端反復（ＩＴＲ）、１つ以上の発現制御エレメント（例えば、プロモーター（例えば、本明細書に記載するようなヒトＴＴＲプロモーター）及び１つ以上の肝臓特異的制御エレメント（例えば、本明細書に記載するような１つまたは２つのＣＲＭ８エレメント））、コドン改変第ＶＩＩＩ因子コード配列、及びポリＡシグナル配列を含む。
治療有効性の評価
血友病Ａ治療の治療有効性は、例えば、治療されている対象の血液の第ＶＩＩＩ因子依存性の凝固可能性を測定することにより、評価することができる。凝固可能性を評価するための基準としては、限定するものではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）、第ＩＸ因子発色活性アッセイ、凝血時間、及び第ＶＩＩＩ因子抗原レベル（例えば、第ＶＩＩＩ因子特異的ＥＬＩＳＡを使用する）が挙げられる。なお、治療的用量は、患者において野生型レベルの第ＶＩＩＩ因子をもたらす必要はなく、むしろ、有意義または測定可能なかたちで症状を減少させるのに十分な発現が、本開示の目的では治療的とみなされることに留意されたい。
血友病Ａ治療の治療有効性は、例えば、治療されている対象の血液の第ＶＩＩＩ因子依存性の凝固可能性を測定することにより、評価することができる。凝固可能性を評価するための基準としては、限定するものではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（ＡＰＰＴ）、第ＩＸ因子発色活性アッセイ、凝血時間、及び第ＶＩＩＩ因子抗原レベル（例えば、第ＶＩＩＩ因子特異的ＥＬＩＳＡを使用する）が挙げられる。なお、治療的用量は、患者において野生型レベルの第ＶＩＩＩ因子をもたらす必要はなく、むしろ、有意義または測定可能なかたちで症状を減少させるのに十分な発現が、本開示の目的では治療的とみなされることに留意されたい。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによれば、対象の血漿が、正常なヒト血漿の６％～４９％の第ＶＩＩＩ因子活性を含むとき、対象は、軽度血友病Ａを有するものと分類される。軽度血友病Ａを有する対象は、通常、重大な受傷、外傷、または手術の後にのみ出血を起こす。多くの場合、軽度血友病は、受傷、手術、または抜歯が長期出血をもたらして初めて診断される。最初のエピソードは成人期まで発生しない場合がある。軽度血友病を有する女性は、月経過多、すなわち重い月経期をしばしば経験し、出産後に大出血する場合がある。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによれば、対象の血漿が、正常なヒト血漿の１％～５％の第ＶＩＩＩ因子活性を含むとき、対象は、中等度血友病Ａを有するものと分類される。中等度血友病Ａを有する対象は、受傷後に出血エピソードを起こす傾向にある。明らかな原因なしに起こる出血は、突発性出血エピソードと呼ばれる。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによれば、対象の血漿が、正常なヒト血漿の１％未満の第ＶＩＩＩ因子活性を含むとき、対象は、重度血友病Ａを有するものと分類される。重度血友病Ａを有する対象は、受傷後に出血を起こし、しばしば関節内及び筋肉内に生じる、頻回の突発性出血エピソードを起こす場合がある。
いくつかの実施形態では、正常なヒト血漿は、１ｍＬ当たり１ＩＵの第ＶＩＩＩ因子活性を含むものと定義される。したがって、いくつかの実施形態では、軽度血友病Ａと分類された対象の血漿は、１ｍＬ当たり０．０６～０．４９ＩＵの第ＶＩＩＩ因子活性を含む。いくつかの実施形態では、中等度血友病Ａと分類された対象の血漿は、１ｍＬ当たり０．０１～０．０５ＩＵの第ＶＩＩＩ因子活性を含む。いくつかの実施形態では、重度血友病Ａと分類された対象の血漿は、１ｍＬ当たり０．０１～０．０５ＩＵの第ＶＩＩＩ因子活性を含む。
いくつかの実施形態では、療法が治療的に有効であるのは、例えば、対象の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の平均レベルを上昇させることにより、血友病Ａの症状の重症度を減弱させるときである。したがって、いくつかの実施形態では、血友病Ａ療法は、対象の血液／血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性の平均レベルを上昇させるとき、治療的に有効である。いくつかの実施形態では、治療的に有効な治療は、対象の血液／血漿中の第ＶＩＩＩ因子活性の平均レベルを、少なくとも０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上上昇させる。
いくつかの実施形態では、治療的に有効な治療は、対象が、より重症度の低い形態の血友病Ａを有するものと分類されるように、対象の血液中の第ＶＩＩＩ因子活性の平均レベルを上昇させる。例えば、一実施形態において、最初に重度血友病Ａと分類された対象は、治療的に有効な治療を受けた後、中等度血友病Ａまたは軽度血友病Ａと再分類される。別の実施形態では、最初に中等度血友病Ａと分類された対象は、治療的に有効な治療を受けた後、軽度血友病Ａと再分類される。別の実施形態では、最初に軽度血友病Ａと分類された対象は、治療的に有効な治療を受けた後、血友病Ａを有しないものと再分類される。
処方
本明細書では、血友病Ａの治療に使用される組成物が提供される。そのような組成物は、本明細書に記載するように、治療的に有効な量の核酸組成物、例えば、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターを含む。治療的に有効な量のコドン改変ＶＩＩＩポリヌクレオチド（例えば、コドン改変第ＶＩＩＩ因子コード配列を含むＡＡＶ遺伝子療法ベクター）は、例えば、全身投与のために、好適な薬学的担体またはビヒクルと混合される。本明細書に開示するコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの最終的な処方は、当業者の能力の範疇にある。
本明細書では、血友病Ａの治療に使用される組成物が提供される。そのような組成物は、本明細書に記載するように、治療的に有効な量の核酸組成物、例えば、第ＶＩＩＩ因子をコードするコドン改変ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ遺伝子療法ベクターを含む。治療的に有効な量のコドン改変ＶＩＩＩポリヌクレオチド（例えば、コドン改変第ＶＩＩＩ因子コード配列を含むＡＡＶ遺伝子療法ベクター）は、例えば、全身投与のために、好適な薬学的担体またはビヒクルと混合される。本明細書に開示するコドン改変第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドの最終的な処方は、当業者の能力の範疇にある。
投与量
本発明の核酸組成物は、それを必要とする患者に投与される。投与される治療的遺伝子療法剤の量または用量は、特定のコドン改変ＶＩＩＩポリヌクレオチド構築物、使用される送達ベクター、疾患の重症度、及び対象の全身的特徴などの要因に依存する。正確な用量は、治療の目的に左右され、当業者であれば公知の技術を使用して確認することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１ ３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。特定の対象を治療するための特定の投与量及び投薬レジメンの決定は、熟練した医師の能力の範疇にある。
本発明の核酸組成物は、それを必要とする患者に投与される。投与される治療的遺伝子療法剤の量または用量は、特定のコドン改変ＶＩＩＩポリヌクレオチド構築物、使用される送達ベクター、疾患の重症度、及び対象の全身的特徴などの要因に依存する。正確な用量は、治療の目的に左右され、当業者であれば公知の技術を使用して確認することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ（ｖｏｌｓ．１ ３，１９９２）、Ｌｌｏｙｄ，Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ（１９９９）、Ｐｉｃｋａｒ，Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ（１９９９）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００３，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。特定の対象を治療するための特定の投与量及び投薬レジメンの決定は、熟練した医師の能力の範疇にある。
ＶＩ．実施例
実施例１：Ｎ－グリコシル化リンカー配列の付加による、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＳＱ配列における付加的なＮ－グリコシル化部位がＦＶＩＩＩタンパク質発現を上昇させるかどうかを調べるために、推定上のＮ－結合型グリコシル化部位を含む短いペプチド配列のセットを設計した。これまでに、ＭｃＩｎｔｏｓｈら（Ｂｌｏｏｄ １２１（１７）：３３３５－４４（２０１３））は、６つの潜在的部位（「Ｖ３ペプチド」）でのＮ－グリコシル化の概念が、マウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ発現レベルの向上をもたらしたことを示した。興味深いことに、「Ｖ３ペプチド」のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測により、６つの部位のうち２つがｉｎ ｖｉｖｏで潜在的にＮ－グリコシル化されていることが確認された。
実施例１：Ｎ－グリコシル化リンカー配列の付加による、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＳＱ配列における付加的なＮ－グリコシル化部位がＦＶＩＩＩタンパク質発現を上昇させるかどうかを調べるために、推定上のＮ－結合型グリコシル化部位を含む短いペプチド配列のセットを設計した。これまでに、ＭｃＩｎｔｏｓｈら（Ｂｌｏｏｄ １２１（１７）：３３３５－４４（２０１３））は、６つの潜在的部位（「Ｖ３ペプチド」）でのＮ－グリコシル化の概念が、マウスの血漿におけるＦＶＩＩＩ発現レベルの向上をもたらしたことを示した。興味深いことに、「Ｖ３ペプチド」のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測により、６つの部位のうち２つがｉｎ ｖｉｖｏで潜在的にＮ－グリコシル化されていることが確認された。
複数のＮ－グリコシル化部位を含む短い配列を生成することを目的として、ＮｅｔＮＧｌｙｃ－Ｄａｔａｂａｓｅのプログラム（Ｓｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈ．ＥＭＢＯ Ｊ，３２（１０）：１４７８－８８，２０１３）を適用することにより、図８Ａ～８ＢにＮＧ１～ＮＧ２１として示す１２種の異なるリンカー配列を、コドン最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ「ＣＳ０１」配列（内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／０８３７６２を参照されたい）との関連で設計した。ＮｅｔＮＧｌｙプラットフォームは、ヒトタンパク質配列のＮ－グリコシル化パターンを分析する９つのニューラルネットワークを組み合わせる。ＮｅｔＮＧｌｙデータベースに基づいて、内容が参照により本明細書に援用されるＳｔｅｅｎｔｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈ．ＥＭＢＯ Ｊ，３２（１０）：１４７８－８８，（２０１３）に記載されるように、Ｎ－グリコシル化を翻訳後修飾として伝達する可能性について、設計されたペプチドを分析した。１２種の新規な代替的ペプチドのうち、低免疫原性が予測された（下記で説明するとおり）４つの有望なＮＧリンカーを、「ＣＳ０４」というコドン最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１０）の１４アミノ酸サイズのＳＱ配列に挿入した（ＳＦＳＱＮ－新規ペプチド－ＰＰＶＬＫＲＨＱＲ）。
ヒト肝臓Ｈｕｈ－７細胞をトランスフェクトし、修飾されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩを抗ＦＶＩＩＩウエスタンブロット分析（図９）によって検出することにより、予測されるＮ－グリコシル化部位の翻訳後修飾を、ｖＮＧ４／ＣＳ０４、ｖＮＧ５／ＣＳ０４、及びｖＮＧ１６／ＣＳ０４を含む３つのベクターで実験的に確認した。ＳＱ配列のみを含むＢＤＤ－ＦＶＩＩＩと比較して大きなサイズの修飾型ＦＶＩＩＩの重鎖が、ゲル電気泳動によって検出され、新規Ｎ－グリコシル化部位の存在が示された。さらに、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２のＡＡＶ８感染により、発現ベクターｖＮＧ５／ＣＳ０４及び高分泌性Ｘ５バリアントｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５について例示したように、Ｎ－グリコシル化が確認された（図１０；ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５については実施例３及び５で説明する）。
リンカー配列の設計の焦点は、低リスクの免疫原性を伴う短いペプチド配列（７～１７アミノ酸残基）を生成することであった。このために、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ免疫原性プロファイリングＥｐｉｂａｓｅ（商標）（Ｌｏｎｚａ）を適用した（ＨＬＡ結合）。Ｅｐｉｂａｓｅ（商標）のエピトープ予測方法は、免疫原性の予測のために、構造的層及び統計的層を含む。構造的部分は、内容が参照により本明細書に援用されるＤｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．５８（１）：５３－６９（２００５）に記載されるように、Ｐｅｐｓｃｏｐｅ技術に基づいて結合親和性を推定する。統計的部分は、ペプチド配列及びそれらの実験的結合親和性から情報を抽出する。必須エピトープ数に基づき、関係するＨＬＡクラスＩＩアロタイプ（Ｋｒｉｓｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５；１５５（１２）：５６５５－６２（１９９５）、Ｖｅｒｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（３）：３９７－４０４（１９９６）、これらの内容は参照により本明細書に援用される）、及びＤＲＢ１（Ｌａｕｐｅｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６０（７）：５９１－７（１９９９）、その内容は参照により本明細書に援用される）のリスクスコアを使用して、タンパク質の免疫原性リスクを推定した。このスコアリングシステムに基づくと、ペプチドＮＧ１６の免疫原性リスクは中等度であり、ＮＧ４及びＮＧ１０の免疫原性リスクは低く、ＮＧ５の免疫原性リスクはＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの未修飾ＳＱ配列よりもさらに低い（表２）。
（表２）ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＡＶ治療の２週間後のＦＶＩＩＩ活性
さらに、ベクターｖＮＧ４／ＣＳ０４、ｖＮＧ５／ＣＳ０４、ｖＮＧ１０／ＣＳ０４及びｖＮＧ１６／ＣＳ０４を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＨａｉｇ Ｋａｚａｚｉａｎの研究室で生成されたエクソン１６ ＦＶＩＩＩノックアウトマウスモデルにおいて分析した（表２）。ＡＡＶ８感染の２週間後、ＦＶＩＩＩ発現レベルをマウス血漿試料の発色活性によって決定した。４．０×１０１２の用量におけるＡＡＶ８感染の２週間後、ＦＶＩＩＩ発現レベルは、ペプチドなしのｖＣＳ０４構築物と比べて１．４～２．４倍高かった。全体として、構築物ｖＮＧ５／ＣＳ０４が、高いＦＶＩＩＩ発現レベル（３．８ＩＵ／ｍＬ）、最も低い免疫原性リスク、及び最も短いサイズのペプチド（７アミノ酸残基）を含め、最も好ましい特徴を示した。構築物ｖＮＧ５／ＣＳ０４を、別のＦＶＩＩＩマウスモデルである「系統Ｅ」モデルにおいてさらに試験した。「系統Ｅ」モデルは、ヒトＦＶＩＩＩに対して免疫寛容を示す（内容が参照により本明細書に明確に援用される、Ｒｅｉｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．１６（Ｓｕｐｐｌ ５）：４７－５３（２０１０）及びｖａｎ Ｈｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（１３）：３６９８－７０７（２０１１）に記載されている）。この独立したマウスモデルでは、ｖＮＧ５／ＣＳ０４のＦＶＩＩＩ発現上昇が確認され、ｖＣＳ０４よりも３倍高いと評価された。
まとめると、非常に低い免疫原性リスク及び向上したレベルのＦＶＩＩＩ発現をｉｎ ｖｉｖｏで示す、短い新規なＮ－グリコシル化ペプチド配列を含む、ｖＮＧ５／ＣＳ０４という改善されたベクターが開発された。
実施例２：プロモーター／エンハンサー置換による、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
ｖＣＳ０４という、最初のＦＶＩＩＩを発現するＡＡＶ８ベースの一本鎖ベクター構築物のプロモーターカセットは、肝臓特異的マウストランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，９：８６９－７８（１９９０）、その内容は参照により本明細書に援用される）に由来するコアプロモーター及びエンハンサー配列を含む。図１１を参照されたい。この肝臓特異的ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーカセットは、２段階で修飾した。第１に、マウスのコア（基礎）プロモーター配列を、対応するヒト配列で完全に置換した。第２に、マウスエンハンサー配列を、最近報告された肝臓特異的シス制御性モジュールＣＲＭ８（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２３：３１９５－９９（２０１４）及びＣｈｕａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２：１６０５－１３（２０１４）、これらの内容は参照により本明細書に援用される）で置換した。１つまたは２つのＣＲＭ８エレメントをヒトＴＴＲコア（基礎）プロモーターの上流に挿入し、それぞれ、ベクター構築物ｖＣＳ１１５及びｖＣＳ１１６を得た（図１１）。
ｖＣＳ０４という、最初のＦＶＩＩＩを発現するＡＡＶ８ベースの一本鎖ベクター構築物のプロモーターカセットは、肝臓特異的マウストランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，９：８６９－７８（１９９０）、その内容は参照により本明細書に援用される）に由来するコアプロモーター及びエンハンサー配列を含む。図１１を参照されたい。この肝臓特異的ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーカセットは、２段階で修飾した。第１に、マウスのコア（基礎）プロモーター配列を、対応するヒト配列で完全に置換した。第２に、マウスエンハンサー配列を、最近報告された肝臓特異的シス制御性モジュールＣＲＭ８（Ｎａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１２３：３１９５－９９（２０１４）及びＣｈｕａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２２：１６０５－１３（２０１４）、これらの内容は参照により本明細書に援用される）で置換した。１つまたは２つのＣＲＭ８エレメントをヒトＴＴＲコア（基礎）プロモーターの上流に挿入し、それぞれ、ベクター構築物ｖＣＳ１１５及びｖＣＳ１１６を得た（図１１）。
新規プロモーターカセットの強度を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ分析により、ヒト肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞株及び「系統Ｅ」マウスにおいて、４．０Ｅ＋１２ｖｇ／ｋｇの用量で評価した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、１つのＣＲＭ８エレメント（ｖＣＳ１１５）及び２つのＣＲＭ８エレメント（ｖＣＳ１１６）を含む構築物は、参照（ｖＣＳ０４）と比較して、それぞれ２．２倍及び３．７倍高い生物作用能単位をもたらした（図１２）。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ＣＲＭ８／ｈＴＴＲプロモーターカセットは、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーと比較可能な性能を示した（図１２）。
ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサー、１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲ、及び２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲを含む、記載のプロモーターカセットを、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩの新規修飾形態と組み合わせた、構築物の三連セットにおいて、ＦＶＩＩＩ発現に対するＣＲＭ８に関連する増強効果をさらに評価した（下記、実施例３～５参照）。全体として、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータは、（１）ｖＮＧ５／ＣＳ０４とｖＮＧ５／ＣＳ１１７（２．５倍高い）及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８（４．０倍高い）、（２）ｖＸ５／ＣＳ２４とｖＸ５／ＣＳ１０１（１．８倍高い）及びｖＸ５／ＣＳ１０５（５．３倍高い）、ならびに（３）ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５とｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１１９（４．４倍高い）及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０（６．２倍高い）を直接比較することにより、１つ及び２つのＣＲＭ８エレメントの存在に基づく生物作用能単位の増大を明らかにしている。ＦＶＩＩＩレベルに対するＣＲＭ８依存性効果は、ｉｎ ｖｉｖｏでは観察されなかった。それにもかかわらず、ｉｎ ｖｉｖｏデータは、新規な１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲと２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲの両方のプロモーターカセットが、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーと比較して、マウスモデルにおいて等しく良好な性能を示すことを明示している。
実施例３：「ＮＧ５」バリアントの導入による、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
実施例１に示したデータに基づいて、構築物ｖＮＧ５／ＣＳ０４におけるＮ－グリコシル化リンカーＮＧ５を選択して、新規なヒト肝臓特異的プロモーターである１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲ及び２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲと組み合わせ、構築物ｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８を得た（図１１）。ｖＮＧ５／ＣＳ０４構築物は、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーカセットを含む（図１１）。ｖＮＧ５／ＣＳ０４のｉｎ ｖｉｖｏ生物作用能レベルは、ＮＧ５リンカー配列に対する陽性効果に起因して、ｖＣＳ０４よりも１．９倍高かった（図１２）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、生物作用能の上昇が、ＣＲＭ８エレメント（複数可）を含むベクターであるｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８について観察された。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８の発現レベルは、ｖＮＧ５／ＣＳ０４）と同様であった（図１２）。
実施例１に示したデータに基づいて、構築物ｖＮＧ５／ＣＳ０４におけるＮ－グリコシル化リンカーＮＧ５を選択して、新規なヒト肝臓特異的プロモーターである１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲ及び２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲと組み合わせ、構築物ｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８を得た（図１１）。ｖＮＧ５／ＣＳ０４構築物は、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーカセットを含む（図１１）。ｖＮＧ５／ＣＳ０４のｉｎ ｖｉｖｏ生物作用能レベルは、ＮＧ５リンカー配列に対する陽性効果に起因して、ｖＣＳ０４よりも１．９倍高かった（図１２）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、生物作用能の上昇が、ＣＲＭ８エレメント（複数可）を含むベクターであるｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８について観察された。Ｉｎ ｖｉｖｏでは、ｖＮＧ５／ＣＳ１１７及びｖＮＧ５／ＣＳ１１８の発現レベルは、ｖＮＧ５／ＣＳ０４）と同様であった（図１２）。
実施例４：「Ｘ５」バリアントの導入による、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
ＦＶＩＩＩを発現するベクターをさらに改善させるために、Ｘ５バリアント（内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／０８３７６２では、変異「ｍ２」と記載されている）をＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに導入した。Ｘ５バリアントは、重鎖のＡ１ドメイン内に、ヒトＦＶＩＩＩを効率的に分泌させる、５つのブタＦＶＩＩＩアミノ酸残基を含む（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＡＳＧＣＴ ａｂｓｔｒａｃｔ ＃４６０；バリアントの詳細は口頭説明によって開示された）。具体的には、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＸ５バリアントを、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーと組み合わせて、ｖＸ５／ＣＳ２４をもたらし、また、１つまたは２つのＣＲＭ８エレメント（複数可）とｈＴＴＲプロモーターと組み合わせて、構築物ｖＸ５／ＣＳ１０１及びｖＸ５／ＣＳ１０５をもたらした（図１１）。３つの新規構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞株において、ｉｎ ｖｉｖｏでは「系統Ｅ２」マウス［わずかな量のヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを発現し、ヒトＦＶＩＩＩへの免疫寛容をもたらす、トランスジェニックＦＶＩＩＩノックアウトマウス系統（ｖａｎ Ｈｅｌｄｅｎ ＰＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（１３）：３６９８－７０７（２０１１）、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される）］において分析し、参照構築物ｖＣＳ０４と比較した。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｖＸ５／ＣＳ２４、ｖＸ５／ＣＳ１０１、及びｖＸ５／ＣＳ１０５は、２．５～３．１倍のＦＶＩＩＩ活性レベルの向上をもたらした（図１２）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、生物作用能の上昇は、４．０～２１．２の範囲であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験システムは、Ｘ５バリアント（構築物ｖＸ５／ＣＳ２４）から生じた４．０倍の上昇を明らかにし、さらに、Ｘ５及び１コピーまたは２コピーのＣＲＭ８エレメントを含む構築物（それぞれ、構築物ｖＸ５／ＣＳ１０１及びｖＸ５／ＣＳ１０５）により、７．３倍及び２１．２倍上昇した。
ＦＶＩＩＩを発現するベクターをさらに改善させるために、Ｘ５バリアント（内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／０８３７６２では、変異「ｍ２」と記載されている）をＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに導入した。Ｘ５バリアントは、重鎖のＡ１ドメイン内に、ヒトＦＶＩＩＩを効率的に分泌させる、５つのブタＦＶＩＩＩアミノ酸残基を含む（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４，ＡＳＧＣＴ ａｂｓｔｒａｃｔ ＃４６０；バリアントの詳細は口頭説明によって開示された）。具体的には、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩのＸ５バリアントを、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサーと組み合わせて、ｖＸ５／ＣＳ２４をもたらし、また、１つまたは２つのＣＲＭ８エレメント（複数可）とｈＴＴＲプロモーターと組み合わせて、構築物ｖＸ５／ＣＳ１０１及びｖＸ５／ＣＳ１０５をもたらした（図１１）。３つの新規構築物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは肝臓由来ＨｅｐＧ２細胞株において、ｉｎ ｖｉｖｏでは「系統Ｅ２」マウス［わずかな量のヒトＦＶＩＩＩ ｃＤＮＡを発現し、ヒトＦＶＩＩＩへの免疫寛容をもたらす、トランスジェニックＦＶＩＩＩノックアウトマウス系統（ｖａｎ Ｈｅｌｄｅｎ ＰＭ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（１３）：３６９８－７０７（２０１１）、その内容は、全体として、あらゆる目的のために、参照により本明細書に援用される）］において分析し、参照構築物ｖＣＳ０４と比較した。Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ｖＸ５／ＣＳ２４、ｖＸ５／ＣＳ１０１、及びｖＸ５／ＣＳ１０５は、２．５～３．１倍のＦＶＩＩＩ活性レベルの向上をもたらした（図１２）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、生物作用能の上昇は、４．０～２１．２の範囲であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験システムは、Ｘ５バリアント（構築物ｖＸ５／ＣＳ２４）から生じた４．０倍の上昇を明らかにし、さらに、Ｘ５及び１コピーまたは２コピーのＣＲＭ８エレメントを含む構築物（それぞれ、構築物ｖＸ５／ＣＳ１０１及びｖＸ５／ＣＳ１０５）により、７．３倍及び２１．２倍上昇した。
実施例５：「Ｘ５」と「ＮＧ５」の両方のバリアントを導入することによる、ＦＶＩＩＩを発現する一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物の改善
さらなるベクターセットにおいて、Ｎ－グリコシル化リンカーＮＧ５（実施例３）及びＸ５バリアント（実施例４）をＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに並行して導入し、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサー、１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲ、及び２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲを含む３つの異なるプロモーターとさらに組み合わせて、それぞれ、構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１１９、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０を得た（図１１）。ｖＣＳ０４と比較すると、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１１９、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの生物作用能は、それぞれ、３．６～５．５倍及び３．２～１９．８倍上昇した。２つの新規修飾のＸ５及びＮＧ５の導入は、一般的なプロモーターを各々が有する３シリーズの構築物について示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでさらなる発現上昇を明らかにしている。例えば、２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲプロモーターを有するシリーズ（構築物ｖＣＳ１１６、ｖＮＧ５／ＣＳ１１８、ｖＸ５／ＣＳ１０５、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０）において、ＮＧ５のみの存在は、ＦＶＩＩＩ発現レベルを１．９ＩＵ／ｍＬから２．９ＩＵ／ｍＬに上昇させ、Ｘ５のみの存在は、ＦＶＩＩＩ発現を１．９ＩＵ／ｍＬから５．１ＩＵ／ｍＬに上昇させ、Ｘ５とＮＧ５の両方の存在は、ＦＶＩＩＩ発現を１．９ＩＵ／ｍＬから１１．４ＩＵ／ｍＬに上昇させる。
さらなるベクターセットにおいて、Ｎ－グリコシル化リンカーＮＧ５（実施例３）及びＸ５バリアント（実施例４）をＢＤＤ－ＦＶＩＩＩに並行して導入し、ｍＴＴＲプロモーター／エンハンサー、１ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲ、及び２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲを含む３つの異なるプロモーターとさらに組み合わせて、それぞれ、構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１１９、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０を得た（図１１）。ｖＣＳ０４と比較すると、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２５、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１１９、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０のｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏの生物作用能は、それぞれ、３．６～５．５倍及び３．２～１９．８倍上昇した。２つの新規修飾のＸ５及びＮＧ５の導入は、一般的なプロモーターを各々が有する３シリーズの構築物について示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏでさらなる発現上昇を明らかにしている。例えば、２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲプロモーターを有するシリーズ（構築物ｖＣＳ１１６、ｖＮＧ５／ＣＳ１１８、ｖＸ５／ＣＳ１０５、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０）において、ＮＧ５のみの存在は、ＦＶＩＩＩ発現レベルを１．９ＩＵ／ｍＬから２．９ＩＵ／ｍＬに上昇させ、Ｘ５のみの存在は、ＦＶＩＩＩ発現を１．９ＩＵ／ｍＬから５．１ＩＵ／ｍＬに上昇させ、Ｘ５とＮＧ５の両方の存在は、ＦＶＩＩＩ発現を１．９ＩＵ／ｍＬから１１．４ＩＵ／ｍＬに上昇させる。
まとめると、新規２ｘＣＲＭ８／ｈＴＴＲプロモーターカセットと、コドン最適化されたＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ「ＣＳ０４」ヌクレオチド配列と、Ｘ５バリアント及びＮＧ５配列の２つの修飾をさらに保有する構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの生物作用能が最も高い構築物であると決定された。
実施例６：一本鎖ＡＡＶ８ベクター構築物のヌクレオチドの削減
わずかに過大のベクター構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０のベクターサイズを削減するために（これにより、パッケージングが効率化するはずである）、隣接するＩＴＲ内のすべての非機能ＤＮＡ配列を欠失させた。これにより、５１９１ヌクレオチドから合計７１ヌクレオチドが削減され、５１２０ヌクレオチドのサイズの発現カセットがもたらされた。欠失は、５’－ＩＴＲとＣＲＭ８配列との間の１９ヌクレオチド、ヒトＴＴＲプロモーターとＫｏｚａｋ配列との間の９ヌクレオチド、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩコード配列と合成ポリアデニル化部位の間の２７ヌクレオチド、及び合成ポリアデニル化部位と３’－ＩＴＲ配列との間の１６ヌクレオチドを含んだ。このｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２というサイズ削減発現カセットは、２つのＣＲＭ８エレメント及びコアヒトＴＴＲプロモーター配列を含むプロモーター、Ｘ５バリアントと共にＮＧ５配列を含むＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列、ならびに合成ポリアデニル化部位からなり、２つのＡＡＶ２ベースの逆位末端反復が隣接している。構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２は、図１１に概略的に示している。
わずかに過大のベクター構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０のベクターサイズを削減するために（これにより、パッケージングが効率化するはずである）、隣接するＩＴＲ内のすべての非機能ＤＮＡ配列を欠失させた。これにより、５１９１ヌクレオチドから合計７１ヌクレオチドが削減され、５１２０ヌクレオチドのサイズの発現カセットがもたらされた。欠失は、５’－ＩＴＲとＣＲＭ８配列との間の１９ヌクレオチド、ヒトＴＴＲプロモーターとＫｏｚａｋ配列との間の９ヌクレオチド、ＢＤＤ－ＦＶＩＩＩコード配列と合成ポリアデニル化部位の間の２７ヌクレオチド、及び合成ポリアデニル化部位と３’－ＩＴＲ配列との間の１６ヌクレオチドを含んだ。このｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２というサイズ削減発現カセットは、２つのＣＲＭ８エレメント及びコアヒトＴＴＲプロモーター配列を含むプロモーター、Ｘ５バリアントと共にＮＧ５配列を含むＢＤＤ－ＦＶＩＩＩ配列、ならびに合成ポリアデニル化部位からなり、２つのＡＡＶ２ベースの逆位末端反復が隣接している。構築物ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２は、図１１に概略的に示している。
ＡＡＶベクターゲノム調製物ｖＣＳ０４、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２のベクターゲノム完全性を、アガロースゲル電気泳動によって調べた。図１３に示した結果は、ｖＣＳ０４、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２ウイルスベクターが、およそ５ｋｂの明確なバンドによって示されるように、同様のサイズのゲノムを有することを示す。計算されたベクターサイズはおよそ５．２ｋｂであったが、このゲノムは、わずかに過大なゲノム（４．７ｋｂのＡＡＶ野生型ゲノムに対して）の適正なパッケージングを裏付ける均一なバンドである。より短いｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２バリアントが好ましい。
ｖＣＳ０４、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０、及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２を含むＡＡＶ８ベースのウイルスベクターのセットを、ＦＶＩＩＩ Ｆ１７ノックインマウスに、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、及び４×１０１２ｖｇ／ｋｇのベクター用量で投与し、ＦＶＩＩＩ活性レベルを１４日目に決定した。図１４に示すように、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２とｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０の両方が、１×１０１２ｖｇ／ｋｇのベクター用量において、およそ４ＩＵ／ｍＬの比較可能な発現レベルをもたらした。１×１０１２ｖｇ／ｋｇの用量でＦＶＩＩＩ発現レベルが０．３ＩＵ／ｍＬと非常に低かった参照構築物ｖＣＳ０４とは対照的に、改善されたベクターのｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０は、およそ１４倍上昇したＦＶＩＩＩ発現レベルを示した（図１４）。５×１０１１ｖｇ／ｋｇの用量においても、ベクターｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２では、１．５ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩの発現レベルを得ることができた。ｉｎ ｖｉｖｏデータによれば、ｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２０及びｖＸ５／ＮＧ５／ＣＳ１２のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物作用能は、それぞれ、およそ１７倍及び２４倍と大きく上昇し、等しい感染多重度（ＭＯＩ）でＨｅｐＧ２細胞に感染した（図１４）。このように、すべてのベクターを同じ濃度（感染多重度）で投与したため、生物作用能の差は、使用したバリアントに起因するものであり、サイズ依存性ではない。
Claims (23)
- 第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含む核酸組成物であって、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドが、ＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）の核酸配列を有する、前記核酸組成物。
- 前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーターポリヌクレオチドをさらに含み、前記プロモーターポリヌクレオチドが、ｈＴＴＲ（配列番号６）の核酸配列を有する、請求項１に記載の核酸組成物。
- 前記プロモーターが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに直接結合している、請求項２に記載の核酸組成物。
- 前記第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドに機能的に連結した肝臓特異的エレメントをさらに含み、前記肝臓特異的エレメントが、ＣＲＭ８（配列番号５）の配列を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸組成物。
- 第２の肝臓特異的エレメントが、前記第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドに機能的に連結している、請求項４に記載の核酸組成物。
- 前記肝臓特異的エレメント及び前記プロモーターが、直接結合している、請求項４または５に記載の核酸組成物。
- ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒ（配列番号３）を含む核酸配列を有する、請求項１に記載の核酸組成物。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物を含む、哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 前記ＡＡＶベクターが、血清型８アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－８）ベクターである、請求項９に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項８～１０のいずれか１項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物を封入しているカプシドタンパク質を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
- 前記カプシドタンパク質が、血清型８アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－８）カプシドタンパク質を含む、請求項１２に記載のＡＡＶ粒子。
- 前記核酸組成物が、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１２または１３に記載のＡＡＶ粒子。
- 血友病Ａを治療するための、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物。
- 血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物の使用。
- 血友病Ａを治療するための、請求項８～１１のいずれか１項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクター。
- 血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、請求項８～１１のいずれか１項に記載の哺乳動物遺伝子療法ベクターの使用。
- 血友病Ａを治療するための、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
- 血友病Ａの治療用の薬剤の製造のための、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子の使用。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸組成物を真核生物宿主細胞に導入することを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を生成するためのインビトロの方法であって、
前記核酸組成物が、５’逆位末端反復配列（５’ＩＴＲ）及び３’逆位末端反復配列（３’ＩＴＲ）が隣接するＣＳ１２－ＦＬ－ＮＡ（配列番号１）の核酸配列を有する第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子、ＡＡＶｃａｐ遺伝子、及びウイルス複製ヘルパー遺伝子をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む、
前記方法。 - 前記核酸組成物が、ＣＳ１２－ＣＲＭ８．２－Ｖｒｐ（配列番号１０）の核酸配列を有するプラスミドである、請求項２１に記載のインビトロの方法。
- 前記ＡＡＶｃａｐ遺伝子が、血清型８アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ－８）ｃａｐ遺伝子である、請求項２１または２２に記載のインビトロの方法。
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