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KR101710026B1 - Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물 - Google Patents

Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물 Download PDF

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KR101710026B1
KR101710026B1 KR1020160101701A KR20160101701A KR101710026B1 KR 101710026 B1 KR101710026 B1 KR 101710026B1 KR 1020160101701 A KR1020160101701 A KR 1020160101701A KR 20160101701 A KR20160101701 A KR 20160101701A KR 101710026 B1 KR101710026 B1 KR 101710026B1
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KR
South Korea
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nanoliposome
guide rna
seq
cas9 protein
composition
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English (en)
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유경남
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주식회사 무진메디
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Abstract

본 발명은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다. 상기 나노 리포좀 전달체 조성물은 표적 DNA의 발현을 억제하는 효과가 우수하여, 상기 나노 리포좀 전달체 조성물이 포함된 약학 조성물은 당뇨병과 같은 질병을 개선 또는 치료할 수 있는 약학조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물 {Composition comprising delivery carrier of nano-liposome having Cas9 protein and guide RNA}
본 발명은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
유전자 편집 기술은 미생물의 적응면역에서 비롯된 기술이다. 박테리오파지 감염에 박테리오파지의 단편을 DNA로 기억하고 있다가 재감염 되었을 때 유전자 가위 역할을 하는 누클레아제(nuclease)인 Cas9(CRISPR associated protein 9 : RNA-guided DNA endonuclease enzyme)으로 잘라 없애는 면역 시스템에서 시작되었다. 이는 유전체에서도 특정 염기 서열을 가이드 RNA(guide RNA, gRNA)에 의해서 인식 가능하면 원하는 부위를 잘라 고칠 수 있는 유전자 교정 기술로 발전하였다(Woo JW et al., 2015).
이는 불치병으로 분리되었던 유전자 이상으로 유도된 질환에서 질병의 근본원인을 치료할 수 있는 방법으로 각광받고 있다. 하지만 유전자 편집 시스템의 효율적인 체내 전달과 목표 유전자가 아닌 다른 유전자를 자르는 off targeting 등의 해결해야 하는 문제점들을 가지고 있다. 특히 초기 방식인 Cas9 플라스미드를 사용한 유전자 편집 시스템은 체내 전달시의 항생제 저항성, 여러 면역 반응 등의 안전성에 대한 검증이 필요하였다. 최근에는 단백질로 이뤄진 유전자 가위(Cas9)와 가이드 RNA를 실험관내에서 만들어 전달하는 시스템이 그 대안으로 적용되고 있으나 이 또한 세포내 효율적인 전달과 단백질과 RNA의 안정성에 대한 문제가 제기되고 있다(Ramakrishna S et al., 2014).
제2형 당뇨병은 인슐린 분비 기능은 남아있지만 여러 가지 원인에 의해 상대적으로 인슐린 저항성이 증가하여 정상적인 당대사가 이루어지지 않는 질환이다. 특히 인슐린 저항성에 관여하는 GLP-1(Glucagon-like peptide-1)은 췌장에서 인슐린 분비를 조절한다. 제2형 당뇨병의 경우 GLP-1을 분해시키는 것으로 알려진 DPP4(Dipeptidyl peptidase-4)의 발현이 증가되고 이로 인하여 인슐린 저항성이 증가되는 것으로 알려져 있다. 실제로도 제2형 당뇨병의 경우 DPP4 억제제로 알려진 시타글립틴(sitagliptin) 등이 치료약으로 사용되고 있다. 이런 DPP4 억제제를 제형으로 쓰는 경우는 효과가 일시적이므로 날마다 약을 섭취해야 하며 신장장애를 동반하는 2형 당뇨의 경우는 그 사용이 제한적이다. 또한 약으로 인한 알레르기 반응을 포함한 각종 부작용도 보고되어 있다(Lenski M et al., 2011).
한편 세포 내 약물 전달 시스템에서 요구되는 중요 두가지 성질은 효율성과 세포 독성(안전성)으로서, 콜레스테롤이나 지질 등으로 구성된 나노 리포좀 전달체 기술이 폭넓게 사용되고 있다(Zuris JA et al., 2015).
이에 본 발명자들은 유전자 편집을 통한 제2형 당뇨 치료를 위해 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 DOGS-NTA-Ni 지질을 포함하는 나노 리포좀에 봉입함으로써 약물전달 효율이 좋은 세포 전달체를 제조하고, 이를 제2형 당뇨병 체료제로서 이용함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0101476호 (발명의 명칭 : 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도, 출원인 : 주식회사 툴젠, 공개일 : 2015년09월03일) 대한민국 공개특허 제10-2015-0101477호 (발명의 명칭 : 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도, 출원인 : 주식회사 툴젠, 공개일 : 2015년09월03일) 대한민국 공개특허 제10-2015-0101478호 (발명의 명칭 : 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도, 출원인 : 주식회사 툴젠, 공개일 : 2015년09월03일)
Lenski M et al., Effects of DPP-4 inhibition on cardiac metabolism and function in mice." J Mol Cell Cardiol, 2011, 51(6), 906-918. Ramakrishna S et al., Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA, Genome Res, 2014, 24(6), 1020-1027. Woo JW et al., DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol, 2015, 33(11), 1162-1164. Zuris JA et al., Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol, 2015, 33(1), 73-80.
본 발명의 목적은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물을 제공하는 데에 있다. 보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
상기 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체에 양이온성 폴리머가 결합되어 복합체를 형성할 수 있다. 상기 양이온성 폴리머로는 바람직하게는 폴리-L-리신, 폴리아미도아민, 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타아크릴레이트], 키토산, 폴리-L-오르니틴, 시클로덱스트린, 히스톤, 콜라겐, 덱스트란 및 폴리에틸렌이민으로 선택되는 것 1종 이상이 사용될 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤 및 DOGS-NTA-Ni 지질을 포함할 수 있다.
상기 DOGS-NTA-Ni는 하기의 화학구조를 갖는 지질로서,
Figure 112016077606164-pat00001
1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)이라 한다.
* 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl](nickel salt)
상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 가질 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 제2형 당뇨병의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 제2형 당뇨병의 개선 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 나노 리포좀 전달체 조성물은, '표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA'로서 'DPP4의 발현을 억제하는 가이드 RNA'를 함유할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 단일가닥 가이드 RNA로서 하기의 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다.
서열번호 1 : UUUGGGCCAUUUGGGGAGUU
서열번호 2 : GUCCGGUUUCGCCAGCUUUU
본 발명은 또한 하기와 같은 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 제조하고, 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 및,
상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전된 것을 회수하는 제4단계;
를 포함할 수 있다.
상기 제1단계의 혼성체에 양이온성 폴리머가 결합되어 복합체를 형성할 수 있다.
상기 제1단계의 혼성체 제조시, Cas9 단백질과 가이드 RNA는 1:1~3의 몰 비로 혼합될 수 있다.
상기 제1단계의 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤은 1.5~2.5 : 0.5~1.5 : 0.1~0.5의 몰 비로 혼합될 수 있다.
이 때, 상기 제3단계에서 동결하고 융해 과정은 3~6회 반복할 수 있다.
이하 본 발명을 보다 자세하게 설명한다.
본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다.
상기 Cas9 단백질은 하기의 구조를 갖는 pET28a/Cas9-Cys 플라스미드(pET28a(+) 벡터에 Cas9-Cys가 삽입된 것)가 형질전환된 세포 또는 균주에서 획득할 수 있다. 바람직하게는 pET28a/Cas9-Cys 플라스미드를 대장균에 형질전환하여 Cas9 단백질을 과발현하여 얻을 수 있다.
상기 가이드 RNA는 표적 DNA의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명에서 적용할 수 있는 가이드 RNA는 하기의 서열번호 1 또는 2를 포함하는 가이드 RNA이며, 하기의 서열번호 1 또는 2의 가이드 RNA가 포함된 나노 리포좀 전달체 조성물은 DPP4(Dipeptidyl peptidase-4)의 발현을 억제하여 제2형 당뇨병을 개선 또는 치료할 수 있는 기능을 한다.
서열번호 1 : UUUGGGCCAUUUGGGGAGUU
서열번호 2 : GUCCGGUUUCGCCAGCUUUU
상기 서열번호 1의 가이드 RNA는 하기의 서열번호 3의 사람(Homo sapiens) DPP4의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이며, 하기의 서열번호 5의 DPP4의 일부 DNA 염기서열을 타겟으로 한다(서열번호 3과 서열번호 5는 상보적인 염기서열을 가짐). 상기 서열번호 2의 가이드 RNA는 하기의 서열번호 4의 DPP4의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이며, 하기의 서열번호 6의 DPP4의 일부 DNA 염기서열을 타겟으로 한다(서열번호 4와 서열번호 6은 상보적인 염기서열을 가짐).
서열번호 3 : TTTGGGCCATTTGGGGAGTT
서열번호 4 : GTCCGGTTTCGCCAGCTTTT
서열번호 5 : AACTCCCCAAATGGCCCAAA
서열번호 6 : AAAAGCTGGCGAAACCGGAC
한편, 본 발명에서는 임상적용이 힘든 사람을 대신해서 동물실험용 나노 리포좀을 제공하며, 이 동물실험용 나노 리포좀은 하기의 서열번호 7 또는 8의 가이드 RNA를 포함한다. 상기 동물로는 바람직하게는 마우스(Mus musculus)를 사용한다.
서열번호 7 : UCAAGUCCUACUCUUUGUGG
서열번호 8 : CCAAUAGUUCUGCUGAGCAA
상기 서열번호 7의 가이드 RNA는 하기의 서열번호 9의 DPP4의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이며, 하기의 서열번호 11의 DPP4의 일부 DNA 염기서열을 타겟으로 한다(서열번호 9와 서열번호 11은 상보적인 염기서열을 가짐). 상기 서열번호 8의 가이드 RNA는 하기의 서열번호 10의 DPP4의 일부 DNA 염기서열로부터 유래된 것이며, 하기의 서열번호 12의 DPP4의 일부 DNA 염기서열을 타겟으로 한다(서열번호 10과 서열번호 12는 상보적인 염기서열을 가짐).
서열번호 9 : TCAAGTCCTACTCTTTGTGG
서열번호 10 : CCAATAGTTCTGCTGAGCAA
서열번호 11 : CCACAAAGAGTAGGACTTGA
서열번호 12 : TTGCTCAGCAGAACTATTGG
상기 서열번호 1 또는 2의 가이드 RNA 염기서열과 서열번호 7 또는 8의 가이드 RNA 염기서열 이후에는 Cas9 단백질과 복합체를 형성하기 위해 스캐폴드 염기서열(scaffold sequence)이 포함될 수 있다. 이 때 스캐폴드 염기서열의 종류는 크게 제한되지 않으며, 가이드 RNA의 제조에 이용되는 통상적인 염기서열이라면 어떤 것이든지 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 나노 리포좀에 적용되는 가이드 RNA는 하기의
서열번호 13 :
UUUGGGCCAUUUGGGGAGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
또는, 서열번호 14 :
GUCCGGUUUCGCCAGCUUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
를 포함할 수 있고, 본 발명에서 동물 실험을 위해,
서열번호 15 :
UCAAGUCCUACUCUUUGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
또는, 서열번호 16 :
CCAAUAGUUCUGCUGAGCAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
가 적용된 나노 리포좀을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1 또는 2의 가이드 RNA의 염기서열이 타겟으로 하는 서열번호 5 또는 6의 DNA 염기서열은 사람의 DPP4(Homo sapiens Chromosome 2, Gene bank No. NC_000002.12)의 Exon1과 Exon2 사이에 존재하는 염기서열이며, 서열번호 1 또는 2의 가이드 RNA를 통해 상기 Exon1과 Exon2 사이의 DNA가 잘려지게 된다.
서열번호 7의 가이드 RNA는 마우스의 DPP4(Mus musculus strain C57BL/6J Location : Chromosome 2, Gene bank No. NC_000068.7)의 Exon3의 DNA를 자르며, 서열번호 8의 가이드 RNA는 상기 마우스의 DPP4의 Exon2를 자른다.
상기 서열번호 1 또는 2, 서열번호 7 또는 8의 가이드 RNA는 T7 RNA 폴리머라아제(polymerase)를 사용한 시험관 내 전사 반응 과정(in vitro transcription)을 통하여 합성할 수 있다.
상기 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체에 양이온성 폴리머가 결합되어 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 양이온성 폴리머로서 바람직하게는 폴리-L-리신, 폴리아미도아민, 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타아크릴레이트], 키토산, 폴리-L-오르니틴, 시클로덱스트린, 히스톤, 콜라겐, 덱스트란 및 폴리에틸렌이민으로 선택되는 것 1종 이상이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 폴리에틸렌이민이 사용될 수 있다.
상기 나노 리포좀은 레시틴(lecithin, α-phosphatidylcholin), 콜레스테롤 및 DOGS-NTA-Ni 지질을 포함할 수 있으며, 이를 통해, 상기 레시틴, 콜레스테롤 및 DOGS-NTA-Ni 지질이 나노 리포좀을 형성하는 막을 이룰 수 있다.
레시틴은 동/식물계에 널리 분포되어 있어 생체 적합성이 우수하며 그 안정성에 있어서도 이미 검증되어 식품과 제약의 전달체 기술에 널리 활용되고 있다. 또한 나노 리포좀의 크기 조절과 변형을 용이하게 하는 재료로 사용될 수 있다.
상기 DOGS-NTA-Ni는 하기의 화학구조를 갖는 지질이다.
Figure 112016077606164-pat00002
상기 DOGS-NTA-Ni 지질은 단백질 정제 방법에서 사용되는 His-Tag(6X histidin)과 Ni2 + 친연성(affinity)을 활용하여 Cas9 단백질(His-Tag 포함된 것)이 효과적으로 나노 리포좀 내부로 봉입(encapsulation)되게 하는 역할을 할 수 있다. 더 자세하게는 상기 DOGS-NTA-Ni은 18개의 탄소에 이중결합이 1개 있는 구조로 레시틴과 함께 지질(lipid)를 형성할 수 있고, 끝에 Ni2+가 결합되어 있어, Cas9 단백질에 붙어있는 His-tag 2개와 Ni2+ 1개가 결합하여 Cas9 단백질이 좀 더 효율적으로 나노 리포좀 안으로 봉입되게 한다.
본 발명의 나노 리포좀 내에는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질과, 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질이 혼재되어 존재할 수도 있다. 동물실험용 나노 리포좀의 경우에도, 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질과, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 가이드 RNA와 결합된 Cas9 단백질이 혼재되어 존재할 수도 있다.
상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 가질 수 있다. 나노 리포좀의 크기가 10 nm 미만일 경우, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 상기 나노 리포좀에 봉입되기 어려울 수 있으며, 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다. 또한 2,000 nm를 초과할 경우에도 상기 나노 리포좀이 포함된 조성물이 체내로 주입될 경우에 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명의 나노 리포좀은 중성의 물, 세포 배양액, 혈액 등에서 수시간 이상 안정하게 분산될 수 있다.
본 발명은 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 제2형 당뇨병의 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 상기 제2형 당뇨병의 개선 또는 치료용 조성물에 있어서, 상기 나노 리포좀 전달체 조성물은 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA로서 DPP4의 발현을 억제하는 가이드 RNA를 함유할 수 있다. 상기 DPP4는 당뇨병과 관련된 유전자로서 시타글립틴(Sitagliptin) 등과 같은 당뇨병 치료제로 알려진 약물이 DPP4의 발현을 억제하는 효과가 우수한 것으로 알려져 있다.
본 발명은 또한 하기와 같은 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 제조하고, 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계; 상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계; 상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전된 것을 회수하는 제4단계;를 포함할 수 있다.
상기 제1단계의 혼성체에 양이온성 폴리머가 결합되어 복합체를 형성할 수 있다. 상기 양이온성 폴리머로서 폴리-L-리신, 폴리아미도아민, 폴리[2-(N,N-디메틸아미노)에틸 메타아크릴레이트], 키토산, 폴리-L-오르니틴, 시클로덱스트린, 히스톤, 콜라겐, 덱스트란 및 폴리에틸렌이민으로 선택되는 것 1종 이상이 사용될 수 있다.
상기 제1단계에서 Cas9 단백질과 가이드 RNA는 1:1~3의 몰 비로 혼합될 수 있으며, 상기 Cas9 단백질와 가이드 RNA의 혼성체에 양이온성 폴리머가 첨가되어 복합체를 이룰 경우, Cas9 단백질:가이드 RNA:양이온성 폴리머가 1:1~3:30~70의 몰 비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:2:50의 몰비로 혼합될 수 있다.
이 때, 상기 제1단계의 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤은 1.5~2.5 : 0.5~1.5 : 0.1~0.5의 몰 비로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1.8~2.2 : 0.8~1.2 : 0.2~0.4의 몰 비로 혼합될 수 있으며, 가장 바람직하게는 2:1:0.3의 몰 비로 혼합될 수 있다.
이 때, 상기 제3단계에서 동결하고 융해하는 과정은 3~6회 반복할 수 있다. 지질 필름 조성물을 동결하고 융해하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 나노 리포좀 분산액이 형성될 수 있고, 나노 리포좀의 약물 봉입 효율을 높일 수 있다. 단, 6회를 초과할 경우에는 나노 리포좀의 봉입 효율이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 6회 이내가 바람직하다.
본 발명의 나노 리포좀 제조시, DOGS-NTA-Ni 지질은 음전하(-)를 띄기 때문에, Cas9과 가이드 RNA의 혼성체의 음전하(-)에 반응하여 리포좀의 캡슐화가 잘 되지 않을 수 있다. 따라서 이를 극복하기 위하여 Cas9과 가이드 RNA의 혼성체에 양전하(+)를 갖는 양이온성 고분자를 결합시킨 복합체를 제조함으로써 나노 리포좀의 캡슐화를 강화할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 약학 조성물을 제공할 수 있는데, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것으로서, 보다 자세하게는 본 발명은 Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물에 관한 것이다. 상기 나노 리포좀 전달체 조성물은 표적 DNA의 발현을 억제하는 효과가 우수하고, 매일 당뇨 치료제를 투여하지 않더라도 한 번의 주사로 장기간 효율적으로 혈당관리를 할 수 있다. 이에 상기 나노 리포좀 전달체 조성물이 포함된 약학 조성물은 당뇨병과 같은 질병을 개선 또는 치료할 수 있는 약학조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.
도 1의 상단 그림은 제2형 당뇨병을 억제하기 위해 본 발명에서 사용하는 단일 가닥 상태의 가이드 RNA(sgRNAs)의 염기서열 구조를 도식화한 것이고, 하단 그림은 실시예 1에서 제조한 Cas9 단백질을 정제하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀을 도식화한 것으로서, 상기 나노 리포좀은 레시틴(Lecithin), 콜레스테롤(Cholesterol) 및 DOGS-NTA-Ni 지질로 구성되며, Cas9 단백질과 가이드 RNA(guide RNA)의 혼성체에 폴리에틸렌이민(PEI)이 결합된 복합체가 봉입되어 있다.
도 3은 본 발명의 실시예 2의 나노 리포좀의 바이오 투과전자현미경(Bio-TEM) 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에서 제조한 나노 리포좀들의 봉입효율을 나타낸 그래프(상단)와 나노 리포좀을 제조하고 남은 여액(상층액)에 잔류한 Cas9 단백질 함량을 나타내는 웨스턴 블롯 결과(하단)를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 제조한 나노 리포좀들의 표면 전하 변화(zeta potential, mV)와 크기 및 분산도에 대한 안정성을 나타낸 것이다(표면전하 - 도 5A, 크기 - 도 5B, 분산도 - 도 5C).
도 6은 본 발명의 나노 리포좀 이용을 통해 DPP4의 야생 유전자(WT)와 비교해서 인간간암세포에서의 DPP4 유전자의 18개의 염기서열이 잘렸음(mutation)을 나타내는 그림이다.
도 7은 RITC(rhodamine B isothiocyanate)가 표지된 실시예 2의 나노 리포좀이 인간간암세포 내 유입이 잘 되는지를 RITC 및 Cas9 항체를 이용하여 형광면역법으로 확인한 공초점 형광 현미경 사진이다.
도 8은 본 발명에서 제조한 나노 리포좀을 인간간암세포에 처리하여 목표 유전자인 DPP4의 발현 변화를 확인한 것이다(도 8A - DPP4의 mRNA 발현, 도 8B - DPP4의 단백질 발현, 도 8C - DPP4 활성 확인).
도 9는 본 발명에서 제조한 나노 리포좀을 인간간암세포에 처리했을 때의 세포 생존/증식을 WST-1 어세이로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 실시예 2에서 제조한 나노 리포좀을 제2형 당뇨병 동물 모델에 적용한 시간표를 도식화한 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예 2에서 제조한 나노 리포좀을 제2형 당뇨병 동물 모델에 적용하여 간조직에서의 목표 유전자(DPP4)의 mRNA와 단백질 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 나노 리포좀을 제2형 당뇨병 동물 모델에 적용하고 면역 염색법을 통해 간조직에서의 목표 유전자(DPP4)의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 실시예 2에서 제조한 나노 리포좀을 제2형 당뇨병 동물 모델에 적용한 후 실험동물의 몸무게와 혈당의 변화를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 나노 리포좀을 제2형 당뇨병 동물 모델에 적용하고 면역 염색법을 통하여 췌장 세포에서 인슐린의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 가이드 RNA 제조 및 Cas9 단백질 정제>
실시예 1-1. DPP4를 목표유전자로 하는 가이드 RNA 제조
T7 RNA polymerase(NEB)를 활용한 in vitro transcription 방법을 이용하여 DPP4를 목표유전자로 하는 가이드 RNA를 제조하였다. 이를 위해 표 1의 T7 promoter 염기서열과 DPP4(사람 또는 마우스)의 20 b.p. 염기서열(서열번호 3 : TTTGGGCCATTTGGGGAGTT, 서열번호 4 : GTCCGGTTTCGCCAGCTTTT, 서열번호 9 : TCAAGTCCTACTCTTTGTGG, 서열번호 10 : CCAATAGTTCTGCTGAGCAA)을 포함하는 '69 mer forward primer' 4개, 가이드 RNA에 연결될 스캐폴드 염기서열을 포함하는 '20 mer reverse primer' 1개, plasmid Cas guide vector(origene)를 사용하여 PCR법으로 140 b.p.의 DNA　주형(template)을 제조하였다. 이 DNA 주형, rNTP mixture, T7 RNA polymerase, RNase inhibitor를 포함하여 37℃에서 2시간 전사 반응을 통하여 가이드 RNA를 제작하였고 RNA 정제 과정을 거쳐 RNA 순도를 높였다.
* T7 promoter 염기서열은 아래 표 1의 밑줄 친 부분에 해당됨.
* 표 1의 굵은 글씨의 염기 서열은 DPP4 유전자를 인식하는 부위이며, 스캐폴드 염기서열의 주형(plasmid Cas guide vector)을 인식하여 가이드 RNA 합성이 되며, 최종 제조된 가이드 RNA의 서열과 이 염기서열이 같은(T 대신 U로 치환된) 염기서열 구조를 가짐.
* F 프라이머 뒤의 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCA는 스캐폴드 염기 서열 일부분임.
* plasmid Cas guide vector에 스캐폴드 염기서열의 주형이 포함되어 있음.
* 이 실험에 사용된 plasmid Cas guide vector의 구조는 하기와 같음.
Figure 112016077606164-pat00003
출처 : http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/Detail.aspx?sku=GE100001
forward primer Human DPP4 sgRNA 1_F GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG TTTGGGCCATTTGGGGAGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
Human DPP4 sgRNA 2_F GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG GTCCGGTTTCGCCAGCTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
Mouse DPP4 sgRNA 1_F GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG TCAAGTCCTACTCTTTGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
Mouse DPP4 sgRNA 2_F GCGGCCTCTAATACGACTCACTATAGGG CCAATAGTTCTGCTGAGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA
reverse primer(sg RNA_R) AAAAGCACCGACTCGGTGCCA
상기 실험을 통해 하기 표 2의 염기서열을 갖는 가이드 RNA를 제조하였다.
서열번호 13
(사람 DPP4 타겟) 		UUUGGGCCAUUUGGGGAGUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 14
(사람 DPP4 타겟) 		GUCCGGUUUCGCCAGCUUUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 15
(마우스 DPP4 타겟) 		UCAAGUCCUACUCUUUGUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
서열번호 16
(마우스 DPP4 타겟) 		CCAAUAGUUCUGCUGAGCAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUUU
본 발명에서 제조한 표 2의 단일 가닥 상태의 가이드 RNA(sgRNA)의 구조 도식화는 도 1의 상단에 개시되어 있다.
최종 제조된 상기 가이드 RNA는 사람의 DPP4 유전자의 AACTCCCCAAATGGCCCAAA(서열번호 5) 또는 AAAAGCTGGCGAAACCGGAC(서열번호 6)를 타겟으로 인식하고, 마우스의 DPP4 유전자의 CCACAAAGAGTAGGACTTGA(서열번호 11) 또는 TTGCTCAGCAGAACTATTGG(서열번호 12)를 타겟으로 인식하여 각 DPP4 유전자의 발현을 억제하는 역할을 한다.
실시예 1-2. Cas9 단백질 정제
pET28a/Cas9-Cys plasmid(Addgene plasmid # 53261)를 대장균(DH5α)에 형질전환하여 0.5 mM IPTG(isopropyl β- D -1-thiogalactopyranoside)와 28℃ 조건에서 Cas9 단백질을 과발현하였고, Cas9 단백질이 과발현된 대장균을 lysis buffer(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, protease inhibitor cocktail, 1 mg/mL lysozyme)와 함께 초음파 처리하였다. 초음파 처리하여 얻은 분쇄물을 원심분리하여 단백질이 포함된 액상을 얻었다. Ni-NTA agarose bead 추출법(elution buffer : 20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, protease inhibitor cocktail)으로 상기 액상에 포함된 Cas9 단백질을 분리하였다. 이후 분리물을 storage buffer(50 mM Tris-HCl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 20% glycerol)에 혼합한 상태로 투석하여(cut off 10K) 이미다졸을 제거한 후 단백질 농도를 정량하였다(BCA법 이용). 이 때, 투석하여 얻은 Cas9 단백질을 농도의존적으로 SDS-PAGE하여 확인하여 Cas9 단백질이 잘 생성되었음을 확인하였다(도 1의 하단 사진 참조).
** pET28a/Cas9-Cys plasmid(Addgene plasmid # 53261)의 구조 :
Figure 112016077606164-pat00004
출처 : Addgene (http://www.addgene.org/)
<실시예 2. 나노 리포좀 제작>
실시예 1에서 제조한 Cas9 단백질, 가이드 RNA, 폴리에틸렌이민을 1:2:50 몰 비(mole ratio)로 혼합하여 복합체를 제조하였다. 이 때 가이드 RNA로는 스캐폴드 염기서열이 포함된 서열번호 13~16을 사용하였다. 다음으로 레시틴(Lecithin, Sigma Aldrich), DOGS-NTA-Ni 지질(Avanti polar lipids), 콜레스테롤(Cholesterol, Sigma Aldrich)을 2 : 1 : 0.3 몰 비로 클로로포름(chloroform) 상에서 섞은 후 Rotary evaporator를 활용하여 지질필름(lipid film)화 하였다. 여기에 Cas9 단백질/가이드 RNA/폴리에틸렌이민의 복합체를 넣어 초음파를 가하며 혼합하였다. 액체질소를 활용하여 동결하고 융해하는 과정(freeze thaw cycle)을 5차례 반복하고 이후 초음파(probe 방식) 처리하여 좀 더 작은 사이즈이면서도 균일한 상태의 나노 리포좀을 제작하였다. 이후 원심분리 방법으로 침전된 것만을 회수하여 본 발명의 나노 리포좀을 얻었고, 진행 buffer(세포배양용 배지 또는 PBS[Phosphate Buffered Saline])에 섞어 다음 실험에 사용하였다. 이러한 방식으로 제조된 나노 리포좀의 세포처리군은 NL(Ni)-Cas9/gDPP4(PEI)으로 표기하였고, 동물처리군은 db/db(Cas9/gDPP4)라 표기하였다. 상기 나노 리포좀의 도식은 도 2에 나타내었고, 이 상태의 나노 리포좀을 Bio-TEM으로 촬영한 이미지는 도 3에 나타내었다. 이 때 도 3의 나노 리포좀에는 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함되어 있으며, 서열번호 1, 서열번호 7 및 서열번호 8의 가이드 RNA를 포함한 나노 리포좀, 또는 서열번호 1 및 2를 함께 포함한 나노 리포좀, 서열번호 7 및 8을 함께 포함한 나노 리포좀도 이와 유사한 안정적인 이미지를 갖는 것으로 확인되었다.
<비교예 1. 나노 리포좀 제조 - NL>
DOGS-NTA-Ni 지질을 제외하고, 실시예 2에 기재된 방법으로 레시틴과 콜레스테롤만 혼합하여 나노 리포좀을 제조하였다. 또한 Cas9 단백질/가이드 RNA/ 폴리에틸렌이민의 복합체를 나노 리포좀에 봉입하는 과정은 제외하였으며, 이 나노 리포좀을 세포처리시 NL이라 표기하였다.
< 비교예 2. 나노 리포좀 제조 - NL( Ni )>
실시예 2에 기재된 방법으로 레시틴, 콜레스테롤, DOGS-NTA-Ni 지질로 나노 리포좀을 제조하였으나 Cas9 단백질/가이드 RNA/ 폴리에틸렌이민의 복합체를 첨가하는 과정은 제외하였고, 이 나노 리포좀을 세포처리시 NL(Ni)라 표기하였다.
<비교예 3. DOGS-NTA-Ni 지질과 폴리에틸렌이민을 포함하지 않은 나노 리포좀 - NL-Cas9/gDPP4>
비교예 1에서처럼 DOGS-NTA-Ni 지질을 제외하고, 레시틴과 콜레스테롤만 포함하여 나노 리포좀을 제조하였고, 이후는 실시예 2의 과정을 수행하되, Cas9 단백질/가이드 RNA/ 폴리에틸렌이민의 복합체 대신 Cas9 단백질/가이드 RNA의 혼성체가 나노 리포좀에 봉입되게 하였다. 이 나노 리포좀은 세포처리시 NL-Cas9/gDPP4로 표시하였다.
<비교예 4. 폴리에틸렌이민을 포함하지 않은 나노 리포좀 - NL(Ni)-Cas9/gDPP4>
실시예 2에서처럼 나노 리포좀을 제조하되, Cas9 단백질/가이드 RNA/ 폴리에틸렌이민의 복합체 대신 Cas9 단백질/가이드 RNA의 혼성체가 나노 리포좀에 봉입되게 하였다. 이 나노 리포좀은 세포처리시 NL(Ni)-Cas9/gDPP4로 표시하였다.
<실험예 1. 나노 리포좀의 상태 확인>
실험예 1-1. 나노 리포좀의 봉입 효율 확인
나노 리포좀을 합성 시작 시에 넣은 Cas9 단백질의 총량과, 나노 리포좀 합성 후 여액에 남은 Cas9 단백질 양을 웨스턴 블롯 실험 방법으로 측정하여 나노 리포좀의 봉입 효율을 확인하였다. 이 때 나노 리포좀을 제조 후, 원심분리기를 이용하여 13000rpm에 원심분리하면 나노 리포좀이 가라앉게 되고, 나노 리포좀에 봉입되지 않은 Cas9 단백질은 여액에 그대로 존재하기 때문에, 상기 여액을 취해서 나노 리포좀에 들어가지 않은 Cas9 단백질으로만 웨스턴 블롯 실험을 진행하였다. 나노 리포좀 제조 후 남은 여액에 잔류한 Cas9 단백질의 함량 비교를 통해 나노 리포좀의 봉입 효율이 용이하게 확인된다.
상기 봉입효율 결과는 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 4에 나타내었다. 도 4를 참고하면, 가이드 RNA가 포함된 혼성체 또는 복합체의 봉입효율은 실시예 2의 나노 리포좀에서 가장 좋음을 알 수 있다.
실험예 1-2. 나노 리포좀의 표면 전하, 크기 및 분산도 확인
본 발명에서 제조한 나노 리포좀들의 표면 전하 변화(zeta potential, mV)와 크기 및 분산도를 Dynamic Light Scattering(DLS)로 측정하였다. 이들 측정값 역시 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 그 결과를 도 5에 나타내었다(표면전하 - A, 크기 - B, 분산도 - C).
세포 내로 가이드 RNA가 포함된 나노 리포좀을 전달하기 위해서는 (-) 전하를 띄는 표면전하값이 최대한 감소하는 것이 좋은데, 도 5를 참고하면 실시예 2의 나노 리포좀은 표면전하값이 낮은 편에 속한다. 비교예 3의 나노 리포좀 조건도 표면전하가 낮지만, 시간의 흐름에 따라 분산도가 낮아져 나노 리포좀의 안정성이 좋지 않음이 확인된다. 또한, 나노 리포좀의 입자크기 또한 실시예 2의 나노 리포좀은 일정한 크기로 제조됨이 확인되지만, 비교예 3의 나노 리포좀은 크기가 균일하지 않은 것을 알 수 있다(2개의 피크 확인). 상기 도 5에는 나타내지 않았지만 비교예 4의 나노 리포좀보다는 실시예 2의 나노 리포좀이 크기와 분산도 면에서 더 우수한 것으로 확인된다.
<실험예 2. DPP4 발현 및 활성 측정>
실험예 2-1. DPP4 유전자의 mutation 확인
인간간암세포(SNU398)에 본 발명에서 제조한 각 나노 리포좀(사람 타겟용)을 24시간 동안 Cas9:gRNA(74㎍:28㎍)의 농도로 처리 후 수집된 세포에서 DNA를 추출하고, Foward primer : GTGAGTGCCGCGCCACGTACG, Reverse primer : CTGCAAGCCGAGCAGATCAAG를 이용하여 PCR법을 통해 template fragment를 만들었다. 다음으로는 T-blunt PCR cloning kit(solgent)를 이용하여 template fragment를 T-blunt vector안에 삽입시켜 준 뒤, (주)바이오니아에 Sequencing service를 요청하여 template fragment 부분의 서열을 분석하였다. 상기 결과는 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 6에 mutation 된 DNA를 나타내는 그림을 표현하였다.
도 6을 참고하면, 본 발명의 나노 리포좀을 통해, 가이드 RNA가 염기서열 20개를 인식하게 되고, Cas9 단백질이 PAM(protospacer adjacent motif)(TGG 서열) 부위를 자르게 됨으로써, 잘려진 DNA가 스스로 회복(repair)되는 과정 중에 18개의 DNA 염기서열이 잘려 나간 것이 확인된다.
실험예 2-2. DPP4 발현 측정 i
실시예 2의 나노 리포좀(사람 타겟용)에 RITC(rhodamine B isothiocyanate)를 표지하고, 인간간암세포(SNU398)에 처리 후 면역염색하여 도 7에 공초점 형광 현미경 사진을 나타내었다. 나노 리포좀에 RITC를 표지하기 위해서는 나노 리포좀 제조 시, Cas9 단백질에 RITC 염료를 같이 혼합하여 함께 봉입하였다. 또한 면역염색을 위해 CFL-488의 Cas9 1차 항체(Rabbit)를 이용하여 세포 내 Cas9 단백질을 표지하고 공초점 형광 현미경으로 이미지화하였다. 상기 결과는 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 7에 나타내었다.
도 7을 참고하면, 실시예 2의 나노 리포좀 처리로 인해 인간간암세포의 핵 내로 RITC와 Cas9 단백질이 잘 주입되어 있음을 알 수 있다.
실험예 2-3. DPP4 발현 측정 ii
인간간암세포(SNU398)에 본 발명에서 제조한 각 나노 리포좀(사람 타겟용)을 24시간 동안 Cas9:gRNA(74㎍:28㎍)의 농도로 처리 후 수집된 세포에 Trizol(invitrogen)을 이용하여 총RNA를 추출하였고, SuprimeScript RT premix 2x(GeNetBio)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
DPP4의 mRNA 발현 확인을 위한 Real-time PCR은 SYBR green 2x Premix(Applied Biosystems)와 AB step one plus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 활용하여 측정하였다. 이 때 검출에 사용한 primer의 염기서열은 다음과 같다.
DPP4 sense : TCCCAACTCCAGAGGACAAC
DPP4 antisense : CAGGGCTTTGGAGATCTGAG
GAPDH sense : GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH antisense : AGGGATCTCGCTCCTGGAA
또한 mRNA 발현 확인 실험과 동일한 조건으로 인간간암세포(SNU398)에 본 발명에서 제조한 각 나노 리포좀을 처리 후 세포를 수집하고, 상기 세포에 RIPA Buffer(Sigma)를 처리하여 단백질을 추출하였고, anti-DPP4(mouse)(origene, TA500733), anti-GAPDH(mouse)(santacruz, sc-32233)를 통하여 DPP4 단백질 발현량을 검출하였다.
상기 실험의 결과는 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 8에 나타내었다. 도 8A와 도 8B(도 8B 상단은 단백질 전기영동 그래프, 도 8B 하단은 이를 정량화한 그래프)을 참고하면, 실시예 2의 나노 리포좀이 DPP4의 mRNA와 단백질 발현을 효과적으로 제한하고 있음이 확인된다.
실험예 2-4. DPP4 활성 측정
DPP4의 활성은 DPP4 assay kit(Abnova)를 기본 재료로 사용한다. 본 발명에서 제조한 각 나노 리포좀(사람 타겟용) 처리 후 세포(SNU398) 추출 단백질에 substrate solution(H-Gly-Pro-AMC)을 넣어 37℃에서 30분간 반응한다. 반응 후 sodium acetate solution(1M, pH 5.0)을 넣어 반응을 정지하고 excitation 360nm와 emission 460nm에서 형광 값을 측정하여 활성을 측정한다.
상기 결과는 도 8C에 나타내었으며, 실시예 2의 나노 리포좀이 DPP4 유전자의 발현을 가장 효과적으로 제한함을 알 수 있다.
<실험예 3. 세포 생존율 및 증가율 확인>
세포 생존율 및 증가율의 확인은 WST-1 어세이를 통해 진행하였다. 이를 위해, EZ-Cytox(DoGen, EZ-3000) 키트를 사용하였고, 인간간암세포(SNU398)를 96웰 플레이트(96well plate)에 각 웰당 5 x 103의 밀도로 24시간 배양 후 실시예 2 및 비교예 1~4에서 제조한 나노 리포좀(사람 타겟용), Cas9/gDPP4(PEI)를 처리하고 24시간 후 배양액으로 바꾼 후에 WST-1 용액이 10%(v/v) 농도가 되도록 처리하였다. *Cas9/gDPP4(PEI) : 나노 리포좀을 제조하지 않고 Cas9 단백질/가이드 RNA/ 폴리에틸렌이민의 복합체를 처리함.
2시간 후에 460nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존 및 증식을 대조군(비처리군)과 비교하였다. 세포 독성 평가는 처리 후 72시간 동안 24시간을 주기로 측정하였다. 상기 결과는 가이드 RNA의 종류에 따른 차이는 거의 없었으며, 서열번호 2의 가이드 RNA가 포함된 것을 대표로 하여 도 9에 나타내었다.
도 9를 참고하면, 실시예 2 및 비교예 1~4에서 제조한 나노 리포좀을 처리한 샘플의 세포 증식 및 생존이 비처리군과 비교하여 유의미한 변화를 보이지 않은 것으로 확인된다. 이는 본 발명의 나노 리포좀이 생체적합성이 뛰어나고 세포의 증식과 성장에 유해하지 않음을 나타낸다.
<실험예 4. 2형 당뇨 동물 모델을 통한 DPP4 발현 억제 확인>
in vivo 적용 실험은 현재 사용되고 있는 DPP4 억제제(sitagliptin)와 비교하여 수행하였다. 실시예 2의 나노 리포좀(200㎕, 용매 PBS)(동물 타겟용)을 Cas9:gRNA이 1.48㎍:0.56㎍인 농도로 db/db 마우스에 정맥 주사 방법으로 단회투여하였다. 이 때 사용된 나노 리포좀으로는 서열번호 7과 서열번호 8을 동시에 포함하는 것을 사용하였다.
DPP4 억제제(sitagliptin)는 10 mg/day의 농도로 매일 실험종료시까지 경구투여하였고, 질환모델의 대조군과 정상 마우스(비 질환모델-C57BL/6)에는 PBS를 투여하였다(db/db(PBS)와 Normal(PBS)로 표기)(시타글립틴[sitagliptin] 투여군은 db/db(sitagliptin)로 표기). 이 때 in vivo 실험 수행 시간은 도 10에 나타내었다. in vivo 실험 진행 중에는 3일 간격으로 실험동물의 몸무게와 혈당을 체크하였으며 실험 종료 후에는 실험동물의 장기(간, 췌장)를 적출하여 면역염색법을 통하여 목표 유전자의 발현 변화를 확인하였다.
이 때, DPP4의 mRNA와 단백질 발현량은 세포실험과 동일한 방법으로 측정하되, mRNA 분석을 위한 프라이머는 하기의 염기서열로 구성된 것을 사용하였다.
DPP4 sense : TCCCAACTCCAGAGGACAAC
DPP4 antisense : CAGGGCTTTGGAGATCTGAG
GAPDH sense : GCACCGTCAAGGCTGAGAA
GAPDH antisense : AGGGATCTCGCTCCTGGAA
면역염색법을 수행하기 위해 동물 조직을 적출 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정시킨 후, 파라핀 몰드 방식을 사용해서 조직 몰드를 제작 후 5㎛로 절편하여 조직 슬라이드를 얻었다. 이 슬라이드에 DPP4 항체와 DAB(3,3-Diaminobenzidine tablets, sigma, D4418)을 사용하여 발색하였다.
각 실험 결과는 도 11 내지 14에 나타냈으며, 실시예 2의 나노 리포좀을 투여한 동물 모델의 간조직에서 목표 유전자인 DPP4의 발현이 나노 리포좀을 투여하지 않은 질환동물군에 비하여 현저히 감소되는 것이 확인되며, 나노 리포좀 투여군이 DPP4 억제제를 매일 투여한 군과 비교 혈당의 변화가 비슷한 것으로 나타난다. 면역 염색법으로 확인한 결과에서도 췌장 세포에서 인슐린을 분비하는 영역이 DPP4 억제제와 비슷하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 한편 각 실험결과는 서열번호 7 또는 서열번호 8을 단독으로 포함하는 나노 리포좀을 사용해도 실험결과가 비슷한 것으로 확인된다.
<110> Moogene Medi Co., Ltd. <120> Composition comprising delivery carrier of nano-liposome having Cas9 protein and guide RNA <130> P2016-0137 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 uuugggccau uuggggaguu 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 guccgguuuc gccagcuuuu 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tttgggccat ttggggagtt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtccggtttc gccagctttt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aactccccaa atggcccaaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 aaaagctggc gaaaccggac 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 7 ucaaguccua cucuuugugg 20 <210> 8 <211> 20 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 8 ccaauaguuc ugcugagcaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 tcaagtccta ctctttgtgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 ccaatagttc tgctgagcaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 ccacaaagag taggacttga 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 ttgctcagca gaactattgg 20 <210> 13 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens DPP4 <400> 13 uuugggccau uuggggaguu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 14 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Homo sapiens DPP4 <400> 14 guccgguuuc gccagcuuuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 15 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus DPP4 <400> 15 ucaaguccua cucuuugugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104 <210> 16 <211> 104 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for Mus musculus DPP4 <400> 16 ccaauaguuc ugcugagcaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuu 104

Claims (13)

  1. Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체에 폴리에틸렌이민이 결합된 복합체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물이며,
    상기 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노 리포좀은 레시틴, 콜레스테롤 및 하기 화학식 1의 DOGS-NTA-Ni 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112016117936424-pat00019
  5. 제1항에 있어서,
    상기 나노 리포좀은 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물.
  6. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 나노 리포좀 전달체 조성물을 함유하는 제2형 당뇨병의 개선 또는 치료용 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 제조하되, 상기 혼성체에 폴리에틸렌이민이 결합되어 복합체를 형성하게 하고, 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤을 클로로포름 상에서 혼합하여 지질 필름 조성물을 제조하는 제1단계;
    상기 지질 필름 조성물에, Cas9 단백질 및 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA의 혼성체를 넣어 초음파 처리하는 제2단계;
    상기 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 동결하고 융해한 후, 다시 초음파 처리하는 제3단계; 및,
    상기 제3단계에서 초음파 처리된 지질 필름 조성물을 원심분리하고 침전된 것을 회수하는 제4단계;
    를 포함하되,
    상기 DOGS-NTA-Ni 지질은 하기 화학식 1의 화학구조를 갖는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법.
    [화학식 1]
    Figure 112016117936424-pat00020
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 제1단계의 혼성체 제조시, Cas9 단백질과 가이드 RNA는 1:1~3의 몰 비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 제1단계의 레시틴, DOGS-NTA-Ni 지질 및 콜레스테롤은 1.5~2.5 : 0.5~1.5 : 0.1~0.5의 몰 비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 제3단계에서 동결하고 융해하는 과정은 3~6회 반복되는 것을 특징으로 하는 나노 리포좀 전달체 조성물의 제조방법.
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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101796036B1 (ko) 2016-12-29 2017-11-10 주식회사 무진메디 Cas9 단백질, KRAS 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 KRAS 유전자 변이에 따른 항암제 저항성 대장암 치료제
KR101870694B1 (ko) * 2017-10-18 2018-06-25 주식회사 무진메디 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물
CN109072205A (zh) * 2016-02-10 2018-12-21 密歇根大学董事会 核酸的检测
US11337923B2 (en) 2018-06-18 2022-05-24 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
WO2022191431A1 (ko) * 2021-03-09 2022-09-15 주식회사 무진메디 Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물
KR102544632B1 (ko) 2022-08-05 2023-06-16 주식회사 무진메디 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 사멸용 조성물
KR102569192B1 (ko) 2023-02-24 2023-08-22 주식회사 무진메디 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 성장용 조성물
KR20240149552A (ko) 2023-04-06 2024-10-15 주식회사 무진메디 수분산성이 우수한 고함량 세라마이드 조성물

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2853829C (en) 2011-07-22 2023-09-26 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US20150166985A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting von willebrand factor point mutations
EP4079847A1 (en) 2014-07-30 2022-10-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
IL258821B (en) 2015-10-23 2022-07-01 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
JP7231935B2 (ja) 2016-08-03 2023-03-08 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
KR101710026B1 (ko) * 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
GB2575930A (en) 2017-03-23 2020-01-29 Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592B2 (en) 2017-10-16 2025-03-27 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108330138B (zh) * 2018-03-29 2018-09-25 上海欣百诺生物科技有限公司 一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒
EP3797160A1 (en) 2018-05-23 2021-03-31 The Broad Institute Inc. Base editors and uses thereof
US12281338B2 (en) 2018-10-29 2025-04-22 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising GeoCas9 and uses thereof
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
JP7669281B2 (ja) 2019-03-19 2025-04-28 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
EP4119166A4 (en) 2020-03-12 2024-06-05 Institute for Basic Science COMPOSITION FOR INDUCING APOPTOSIS OF CELLS HAVING GENOMIC SEQUENCE VARIATION AND METHOD FOR INDUCING APOPTOSIS OF CELLS USING THE COMPOSITION
JP2023525304A (ja) 2020-05-08 2023-06-15 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014204728A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
KR20150101478A (ko) 2012-10-23 2015-09-03 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
WO2016100857A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7341835B2 (en) 2004-01-13 2008-03-11 Affymetrix, Inc. Methods of analysis of alternative splicing in mouse
LT2800811T (lt) 2012-05-25 2017-09-11 The Regents Of The University Of California Būdai ir kompozicijos, skirti tikslinės dnr modifikavimui, panaudojant adresuotą rnr, ir transkripcijos moduliavimui, panaudojant adresuotą rnr
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US20160237455A1 (en) 2013-09-27 2016-08-18 Editas Medicine, Inc. Crispr-related methods and compositions
WO2015089473A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
EP3079726B1 (en) 2013-12-12 2018-12-05 The Broad Institute, Inc. Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components
EP3204032B1 (en) 2014-10-10 2024-03-27 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Chimeric molecule comprising crispr/cas or cas9 nuclease and at least one guide rna targeting pmca2 gene locus and fused, complexed or linked to an anionic fluorescent protein, and its use in the treatment of deafness or disorders thereof
EP3247328A1 (en) 2015-01-21 2017-11-29 PhaseRx, Inc. Methods, compositions, and systems for delivering therapeutic and diagnostic agents into cells
US10787523B2 (en) 2015-01-29 2020-09-29 University Of Massachusetts Nanoparticle-protein complex for intracellular protein delivery
EP3280803B1 (en) 2015-04-06 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Chemically modified guide rnas for crispr/cas-mediated gene regulation
EP3087974A1 (en) 2015-04-29 2016-11-02 Rodos BioTarget GmbH Targeted nanocarriers for targeted drug delivery of gene therapeutics
US10626393B2 (en) 2015-06-04 2020-04-21 Arbutus Biopharma Corporation Delivering CRISPR therapeutics with lipid nanoparticles
WO2016205613A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
WO2017035659A1 (en) 2015-09-01 2017-03-09 The Hospital For Sick Children Method and compositions for removing duplicated copy number variations (cnvs) for genetic disorders and related uses
JP2018532404A (ja) 2015-10-14 2018-11-08 ライフ テクノロジーズ コーポレーション リボ核タンパク質トランスフェクション薬剤
US20180327781A1 (en) 2015-11-09 2018-11-15 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Novel rna-based vector system for transient and stable gene expression
KR101710026B1 (ko) * 2016-08-10 2017-02-27 주식회사 무진메디 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150101478A (ko) 2012-10-23 2015-09-03 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
KR20150101476A (ko) 2012-10-23 2015-09-03 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
KR20150101477A (ko) 2012-10-23 2015-09-03 주식회사 툴젠 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cas 단백질을 포함하는, 표적 DNA를 절단하기 위한 조성물 및 이의 용도
WO2014204728A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for targeting and modeling diseases and disorders of post mitotic cells
WO2016100857A1 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stem cells for modeling type 2 diabetes

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
dipeptidyl peptidase IV promoter(2016.07.14.) *
J Liposome Res. 2008, 18(4): 263-277 *
Lenski M et al., Effects of DPP-4 inhibition on cardiac metabolism and function in mice." J Mol Cell Cardiol, 2011, 51(6), 906-918.
Ramakrishna S et al., Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA, Genome Res, 2014, 24(6), 1020-1027.
Woo JW et al., DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol, 2015, 33(11), 1162-1164.
Zuris JA et al., Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo, Nat Biotechnol, 2015, 33(1), 73-80.

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109072205A (zh) * 2016-02-10 2018-12-21 密歇根大学董事会 核酸的检测
KR101796036B1 (ko) 2016-12-29 2017-11-10 주식회사 무진메디 Cas9 단백질, KRAS 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 KRAS 유전자 변이에 따른 항암제 저항성 대장암 치료제
US11766485B2 (en) 2017-10-18 2023-09-26 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate having complex of Cas9 protein, guide RNA inhibiting SRD5A2 gene expression and cationic polymer encapsulated in nanoliposome and composition for ameliorating or treating hair loss containing the same
KR101870694B1 (ko) * 2017-10-18 2018-06-25 주식회사 무진메디 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물
WO2019078611A1 (ko) * 2017-10-18 2019-04-25 주식회사 무진메디 Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물
CN110446506A (zh) * 2017-10-18 2019-11-12 无尽医疗有限公司 具有包封在纳米脂质体中的cas9蛋白、抑制srd5a2基因表达的指导rna和阳离子聚合物之复合物的纳米脂质体-微泡缀合物，以及用于改善或治疗毛发脱落的包含所述纳米脂质体-微泡缀合物的组合物
CN110446506B (zh) * 2017-10-18 2023-03-24 无尽医疗有限公司 纳米脂质体-微泡缀合物及包含其的用于改善或治疗毛发脱落的组合物
US11337923B2 (en) 2018-06-18 2022-05-24 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
US11980688B2 (en) 2018-06-18 2024-05-14 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
US11944705B2 (en) 2018-06-18 2024-04-02 Moogene Medi Co., Ltd. Nanoliposome-microbubble conjugate including drug for hair loss treatment encapsulated in nanoliposome and composition for alleviating or treating hair loss containing same
WO2022191431A1 (ko) * 2021-03-09 2022-09-15 주식회사 무진메디 Kras 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물
WO2024029981A1 (ko) 2022-08-05 2024-02-08 주식회사 무진메디 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 사멸용 조성물
KR102544632B1 (ko) 2022-08-05 2023-06-16 주식회사 무진메디 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 사멸용 조성물
KR102569192B1 (ko) 2023-02-24 2023-08-22 주식회사 무진메디 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 성장용 조성물
KR20240149552A (ko) 2023-04-06 2024-10-15 주식회사 무진메디 수분산성이 우수한 고함량 세라마이드 조성물

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