KR102569192B1

KR102569192B1 - 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 성장용 조성물

Info

Publication number: KR102569192B1
Application number: KR1020230025005A
Authority: KR
Inventors: 윤태종; 원은정; 주국연
Original assignee: 주식회사 무진메디
Priority date: 2023-02-24
Filing date: 2023-02-24
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2043-02-24

Abstract

N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 장쇄 세라마이드는 수용액에서의 용해도가 극히 낮아서 사용이 제한적이었고, 이를 약물로 사용해도 세포 전달성이 낮았다. 이에 본 발명은 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자와 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명을 통해 N-네르보노일-피토스핑고신 계열의 장쇄 세라마이드를 지질 나노입자를 통해 체내 타겟으로 전달함으로써 목적하는 바에 따라 세포 증식을 효과적으로 유도할 수 있고 수용해성과 수분산성이 높은 세포 치료제로의 활용도를 높일 수도 있다.

Description

장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 세포 성장용 조성물 {Lipid nanoparticles with long-chain ceramides and composition for cell proliferation comprising the same}

본 발명은 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자 및 이를 포함하는 수용해성 및 수분산성이 우수한 세포 성장용 나노입자 전달체 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 장쇄 세라마이드를 포함하는 체내 타겟 전달성이 높은 지질 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 나노입자를 통해 세포 성장을 유도하는 방법에 관한 것이다.

세라마이드는 스핑고신과 다양한 사슬 길이의 지방산으로 구성된 스핑고리피드이다. 일반적으로 세라마이드의 내인성 형태는 동물 세포에서 다양한 탄소 길이의 장쇄 탄소 사슬 길이로 구성된다. 동물 세포에는 6가지 유형의 세라마이드 합성효소가 존재하는데, 이는 특정 길이의 지방 아실 CoA를 장쇄 염기에 부착하여 세라마이드, 스핑고미엘린 및 글리코스핑고리피드를 포함한 스핑고리피드의 아실 사슬 길이를 결정하는 역할을 한다.

탄소 사슬 길이에 따라 나뉘는 세라마이드는 다양한 세포 과정을 조절하는 활성 신호 분자로 작용할 수 있다. 그 중에서도 특히, 장쇄 세라마이드는 세라마이드 합성효소 2에 의해 합성되고, 세포의 성장/증식을 촉진시킬 수 있다고 알려져 있다. 그러나 이러한 장쇄 세라마이드는 수용액상에서 용해도가 극도로 낮기 때문에 에탄올 등의 유기용매에 용해시켜 적용할 수밖에 없기 때문에 장쇄 세라마이드가 갖는 강력한 세포 증식 효능에도 불구하고 수분상 형태의 다양한 제품으로의 적용이 극히 제한적이다. 이러한 점에서 수용해성이 극히 떨어지는 장쇄 사슬을 갖는 세라마이드를 수분산시켜 활용할 수 있는 방안이 절실히 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-2325570호 (산소수와 세라마이드를 포함한 나노리포좀을 함유하는 보습 및 피부 장벽 개선용 화장료 조성물 및 그의 제조방법) 대한민국 등록특허 제10-0713555호 (세라마이드를 포접하여 안정화시킨 나노리포좀을 유효성분으로 함유하는 모발 보호용 조성물) 대한민국 등록특허 제10-2267378호 (C12, C16 또는 C18-세라마이드를 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물) 대한민국 등록특허 제10-1796036호 (Cas9 단백질, KRAS 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀 전달체 조성물 또는 이를 함유하는 KRAS 유전자 변이에 따른 항암제 저항성 대장암 치료제) 대한민국 등록특허 제10-1710026호 (Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 혼성체를 함유하는 나노 리포좀 전달체 조성물) 대한민국 등록특허 제10-2328197호 (KRAS 및 p53 유전자의 편집 기능이 있는 나노 리포좀 전달체 조성물) 일본 등록특허 제6944061호 (Cas9 단백질, SRD5A2 유전자의 발현을 억제하는 가이드 RNA 및 양이온성 폴리머의 복합체가 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물) 일본 등록특허 제6876202호 (탈모 치료용 약물이 봉입된 나노 리포좀-마이크로버블 결합체 및 이를 함유하는 탈모 개선 또는 치료용 조성물) 일본 등록특허 제3920330호 (폴리 에틸렌글리콜 변성된 세라마이드 지방질류 및 그들의 리포좀으로의 사용)

본 발명은 장쇄 세라마이드를 지질층에 혼입하여 지질 나노입자 (LNP) 조성물을 제조하여 수용해성 및 수분산성이 우수한 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 제공하는데 목적이 있다.

또한 본 발명은 수용해성 및 수분산성이 우수한 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 포함하는 우수한 세포 성장용 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한 본 발명은 수용해성 및 수분산성이 우수한 장쇄 세라마이드를 포함하는 지질 나노입자는 체내 타겟 전달성이 높다는 점에서 모유두 세포 또는 모모 세포와 같은 모발 세포의 증식을 유도하는 발모용 조성물을 제공하는 데 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 지질 나노입자는 화학식 1의 장쇄 세라마이드를 포함하면서,

레시틴; 콜레스테롤; 비양이온성 지질 및; PEG-변형 지질;에서 선택되는 지질을 1종 이상 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 레시틴, 콜레스테롤, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질을 모두 포함할 수 있다.

상기 레시틴은 동/식물계에 널리 분포되어 있어 생체 적합성이 우수하며 그 안정성에 있어서도 이미 검증되어 식품과 제약의 전달체 기술에 널리 활용되고 있다. 또한 지질 나노입자의 크기 조절과 변형을 용이하게 하는 재료로 사용될 수 있다.

상기 콜레스테롤은 상기 지질 나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다.

상기 비양이온성 지질은 중성 지질 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 중성 지질은 pH 4.0 내지 8.0의 범위 내에서 전하되지 않거나(uncharged) 중성 양성 이온성(zwitterion) 형태를 갖는 지질을 의미한다. 또한, 상기 중성 지질은 당업계의 통상의 기술자에게 공지된 어떠한 중성 지질을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 중성 지질은 HSPC(hydrogenated soy phosphatidylcholine), DOPC(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPE(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DSPE(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPC(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), SM(N-palmitoyl-D-erythro-sphingosylphosphorylcholine), DLPE(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DPPE(1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 디미리스톨글리세롤(dimyristoylglycerol), 석시노일 디아글리세롤(succinoyl-diacylglycerol), 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 테트라에테르 리피드(tetraether lipid), 스핑고리피드(sphingolipid), 디아크릴 글리세롤(diacryl glycerol) 및 글리세리드(glyceride)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 PEG-변형 지질의 지질은 폴리에틸렌글리콜과 결합할 수 있는 지질이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 결합할 수 있는 비양이온성 인지질일 수 있다.

상기 PEG-변형 지질 내 PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 지질 나노입자의 체내 순환시간을 증가시키며, 나노입자 간의 응집현상을 막는 역할을 한다. 또한, PEG-변형 지질은 생체 내에서 스텔스(stealth) 기능을 나타내어 나노입자의 분해를 방지할 수 있다.

상기 PEG는 지질과 결합하지 않은 쪽에 관능기가 결합된 것(functionalized PEG)일 수 있다. 이 때 사용 가능한 관능기는 숙시닐기(succinyl), 카르복시산(carboxylic acid), 말레이미드(maleimide), 아민기, 바이오틴, 시아누르기(cyanur), 및 폴레이트(folate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 PEG는 통상적인 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)류를 의미하며, 본 발명에서는 이를 대체할 수 있는 POZ[poly(2-oxazoline)]을 사용할 수도 있다.

상기 지질 나노입자는 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 가질 수 있다. 지질 나노입자의 크기가 10 nm 미만일 경우나 2,000 nm를 초과할 경우에는 입자 안정성이 낮아질 수 있어 바람직하지 않다.

본 발명은 상기 화학식 1의 구조를 갖는 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 포함하는 세포 성장용 나노입자 전달체 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 mL당 1 x 10⁹내지 1 x 10¹²개의 입자가 포함된 조성물일 수 있다.

상기 세포는 모유두세포, 모모세포, 피부진피세포, 피부표피세포, 피부각질세포 또는 섬유아세포일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 화학식 1의 장쇄 세라마이드를 포함하는 지질 나노입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

바람직하게는 (제1단계) 레시틴; 콜레스테롤; 비양이온성 지질 및; PEG-변형 지질;에서 선택되는 1종 이상의 지질 및 화학식 1의 장쇄 세라마이드를 유기용매 상에서 혼합하여 혼합 조성물을 제조하는 단계;

(제2단계) 상기 혼합 조성물을 분산액 상태로 제조하고, 컬럼 정제하는 단계; 및,

(제3단계) 컬럼 정제하여 얻은 정제물을 멸균 여과하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 제1단계에서 화학식 1의 구조를 갖는 장쇄 세라마이드의 농도는 1~5 mol의 농도인 것이 좋고, 더 바람직하게는 2~5mol이 좋다. 이 때 장쇄 세라마이드의 농도가 5mol을 초과하게 되면, 최종 제조되는 나노입자의 크기가 균일하지 않거나 생성되는 입자의 개수가 줄어들어 약물 전달체로서의 기능을 하기에 적절하지 않다.

상기 지질은 레시틴, 콜레스테롤, 비양이온성 지질 및 PEG-변형 지질이 포함된 것일 수 있다. 바람직하게는 0.1~10mol 레시틴, 0.01~1mol 콜레스테롤, 0.005~1mol 비양이온성 지질, 0.01~1mol PEG-변형 지질이 포함되는 것이 좋고, 더 바람직하게는 0.5~5mol 레시틴, 0.1~1mol 콜레스테롤, 0.01~0.5mol 비양이온성 지질 및 0.05~0.5mol PEG-변형 지질이 포함되는 것이 좋다.

상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 벤젠, 부탄올, 부틸 아세테이트, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 사이클로헥세인, 디클로로에테인, 디클로로메테인, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트, 헵테인, 헥세인, 이소옥테인, 메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 t-부틸 에테르(MTBE), 펜테인, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 자일렌 및 이들의 혼합 용매에서 선택될 수 있다.

이 때, 상기 제2단계에서 초음파 처리하거나 동결-해동하여 분산액을 제조할 수 있다. 혼합 조성물을 동결하거나 해동하는 과정이 수행될 경우, 바람직하게는, 1 ~ 12회 반복할 수 있다. 혼합 조성물을 동결하고 해동하는 단계를 반복함으로써 보다 균일한 크기의 지질 나노입자가 형성될 수 있고, 지질 나노입자의 형성 효율을 높일 수 있다. 12회를 초과하면 고른 크기의 지질 나노입자 형성이 오히려 줄어들 수 있기 때문에 12회 이내가 바람직하다.

이 때, 상기 제2단계에서 분산액은 별도의 반응기에서 제조될 수 있다. 상기 반응기 내에서 혼합 조성물이 동결하거나 해동하는 과정을 반복하여 지질 나노입자가 형성될 수 있다.

또 다른 방법으로서, 상기 제2단계에서 액적-기반 미세유체 시스템으로 분산액을 제조할 수 있다.

상기 제3단계의 멸균 여과에 사용하는 필터는 0.25 내지 0.4 μm의 공극 크기를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물로 제공될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 에센스, 로션, 에멀젼, 팩, 핸드크림, 풋크림, 립밤, 립스틱, 아이섀도우, 아이라이너, 아이브로우 펜슬, 블러셔, 하이라이터, 일반화장수, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징폼, 클렌징로션, 겔, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 헤어로션, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 것을 제공할 수 있다.

상기 화장료 조성물에는 통상의 부형제 조성물이라면 어느 것이든지 포함될 수 있다. 바람직하게는 유지 성분, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한제, 정제수 등이 포함될 수 있다.

또한 상기 화장료 조성물에는 또 다른 유효성분이 포함될 수 있고, 바람직하게는 주름개선제, 피부노화억제제, 피부미백제, 항산화제, 피부 항염제, 보습제 또는 발모제가 포함될 수 있다.

상기 주름개선제로서는 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 단백질 분해 효소인 MMP-1을 저해하는 물질로서, 규산(Silicic acid), N-메틸-L-세린(N-Methyl-Lserine), 이소플라보노이드(Isoflavonoids), 디히드로에피엔드로스테론(Dehydroepiendrosteron), 파오니플로린 (Paoniflorin) 등이 선택될 수 있으며, ECM의 붕괴를 촉진하는 활성산소를 제거하여 피부의 노화 방지하는 물질로서 벤자스타틴(Benzastatins), 코엔자임 큐10(Coenzyme Q10) 등이 사용될 수 있고, 이 외에도 각종 주름개선효과가 알려진 아데노신(adenosine), 아스코르빌글루코사이드(ascorbyl glucoside), 키네틴(kinetin), 옥신(auxin), 펩타이드(peptide), 레티놀(retinol), 레티닐팔미테이트(retinyl palmitate), 폴리에톡실레이티드레틴아마이드(Polyethoxylated Retinamide), 알파-하이드록시산(alpha hydroxyl acid) 등이 이용가능하다.

상기 미백제는 알부틴(arbutin), 나이아신아마이드(niacinamide), 아스코르빈산(ascorbic acid), 마그네슘 아스코빌 포스페이트(magnesium ascorbyl phosphate), 아스코빌 애시드-2-글루코사이드(ascorbyl acid-2-glucoside), 닥나무 추출물, 에틸아스코빌에티르(Ethyl ascorbyl ether, 유용성 감초 추출물 등이 사용 가능하다.

상기 보습제로는 하이드록시 프롤린, 글리세린, 글리세롤, 우레아, 아미노산, 락테이트 및 피로글루탐산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다.

장쇄 세라마이드는 수용액에서의 용해도가 극히 낮아서 사용이 제한적이었고, 이를 약물로 사용해도 세포 전달성이 낮았다. 이에 본 발명은 장쇄 세라마이드가 포함된 지질 나노입자와 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명을 통해 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 화합물과 같은 장쇄 세라마이드를 지질 나노입자를 통해 체내 타겟으로 전달함으로써 목적하는 바에 따라 세포 성장을 효과적으로 유도할 수 있고 수용해성과 수분산성이 높은 세포 치료제로의 활용도를 높일 수도 있다.

도 1은 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드를 포함하고 있는 지질 나노입자의 구조 모식도를 나타낸다.
도 2는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드를 제외하고 제조한 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 3은 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 4는 0.5mM N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 5는 1mM N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 6은 2mM N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 7은 5mM N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자의 DLS data 결과이다(a:Number, b:Intensity).
도 8는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 Dermal papilla cell에 처리하여 세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 9는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 MDA-MB-468 암세포에 처리하여 세포의 생존율을 확인한 결과이다.
도 10은 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 Dermal papilla cell에 처리하여 웨스턴 블롯팅을 통해 세포 증식 관련 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 11은 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자를 MDA-MB-468 세포에 처리하여 웨스턴 블롯팅을 통해 세포 증식 관련 단백질 발현을 확인한 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

실시예 1. 박막 수화 방법을 이용한 세라마이드 함유 지질 나노입자(LNP)의 합성

클로로포름 1 mL에 하기 농도로 5종의 각 지질을 첨가하였다.

1 mM 레시틴;

0.2 mM 콜레스테롤;

0.05 mM DSPC;

0.1mM DSPE-PEG(2000) Amine ; 및;

N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드(화학식 1) - 농도별로 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 mM. ( 순도 95.0% 이상임)

이 후 각 원료가 용해되면, 클로로포름 용매를 증발시켜 지질 필름을 형성하였다. 다음으로, 상기 지질 필름을 1 mL 포스페이트 완충 식염수 (PBS) (pH 7.2)로 수화하였다. 수화된 액상을 초음파 처리한 후, 액체질소를 이용하여 수화된 지질필름을 동결하고 해동하는 절차를 5차례 반복하는 동결-해동 절차를 수행하고, 다시 초음파 처리하여 분산액 상태의 액상을 얻은 후, LNP 분산액을 Sepharose CL-4B size extraction column으로 정제한 다음 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과함으로써 최종적으로 지질 나노입자(LNP)를 얻었다.

실시예 2. Microfluics 방법을 이용한 세라마이드 함유 지질 나노입자(LNP)의 합성

에탄올 1 mL에 하기 농도로 5종의 각 지질을 첨가하였다.

1 mM 레시틴;

0.2 mM 콜레스테롤;

0.05 mM DSPC;

0.1mM DSPE-PEG(2000) Amine ; 및;

N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드(화학식 1) - 농도별로 0, 0.1, 0.5, 1, 2, 5 mM.

이 후 각 원료가 용해되면, 지질 나노입자 분산액을 제조하기 위해 액적-기반 미세유체 시스템인 마이크로플루이딕스(microfluidics) 장비의 유기 용매 라인을 통해 흘려 보내고, 물은 물 용매 라인으로 흘려 보냈다. 이 때, 용매의 혼합비는 에탄올:물을 1:3의 부피비로 하였다. 지질 나노입자가 형성된 분산액 상태의 액상을 얻은 후, LNP 분산액을 Sepharose CL-4B size extraction column으로 정제한 다음 0.2 μm 주사기 필터를 통해 여과함으로써 최종적으로 지질 나노입자(LNP)를 얻었다. 최종적으로 용매 치환기를 이용하여 에탄올을 제거하였다.

실시예 3. N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질 나노입자(LNP)의 특성 확인

N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드의 농도별로 제조된 지질 나노입자를 DLS(dynamic light scattering) 분석, 제타 전위 측정을 하여 분산도, 표면 전하를 분석하였고 이를 표 1과 도 2 내지 도 7에 나타내었다. 이 때, 각 결과는 실시예 1과 실시예 2에서 얻은 지질 나노입자의 결과가 거의 유사하였기에, 이후의 모든 결과는 각 시료에 대해 모두 실시하되, 실시예 2의 지질 나노입자에 관한 결과를 대표로 표기하였다.

Ceramide concentration of NPs	DLS data (PDI)	Zeta-potential (mV)
0 mM	0.17	-14.2 ± 0.76
0.1 mM	0.12	-12.3 ± 0.72
0.5 mM	0.17	-11.5 ± 1.92
1 mM	0.17	-12.2 ± 0.86
2 mM	0.15	-12.4 ± 0.73
5 mM	0.18	-12.5 ± 0.26

상기 표 1과 도 2 내지 도 7의 결과에 따르면, 지질 나노입자에 포함된 세라마이드의 농도가 높아도 나노입자의 분산도(PDI; polydispersity index)가 모두 0.2 이하이므로 물에 대한 분산성이 매우 우수함을 확인할 수 있다.

또한, NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석하여 입자의 크기와 입자 농도를 평가하여 표 2에 나타내었다.

Ceramide concentration of NPs	NTA data
Ceramide concentration of NPs	Particle size (nm)	Particle concentration (particles/ml)
0 mM	97.3 nm ± 1.5	4.46 x 10¹² ± 2.89 x 10¹¹
0.1 mM	128.4 nm ± 15.0	2.05 x 10¹² ± 2.16 x 10¹¹
0.5 mM	141.7 nm ± 9.3	1.96 x 10¹² ± 7.51 x 10¹⁰
1 mM	154.3 nm ± 2.0	1.87 x 10¹² ± 6.26 x 10¹⁰
2 mM	147.7 nm ± 5.1	1.29 x 10¹² ± 2.16 x 10¹¹
5 mM	134.6 nm ± 2.2	0.96 x 10¹² ± 3.95 x 10¹⁰

표 2의 결과를 참고하면, 세라마이드의 농도별로 제조된 지질 나노입자는 90 - 160 nm 내외이며, 입자 수도 10¹¹개/mL 이상으로 합성된 것으로 확인된다.

실시예 4. N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질나노입자(LNP) 처리로 인한 세포 생존율 확인

DP(Dermal papilla) 세포 및 MDA-MB-468 세포를 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum; FBS) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 ATCC modified RPMI medium (Gibco), 5 % CO₂ 하에서 37 ℃에서 배양하였다.

실험을 위해, 96-웰 플레이트 (1.5 x 10³ 세포/웰)에 접종된 DP(Dermal papilla) 세포 및 MDA-MB-468 세포에 세라마이드의 농도별로 제조된 지질 나노입자를 처리 (입자　수:　1.3 x 10⁸ ± 0.38 x 10⁸) 하였다. 24 시간 배양 후 WST-8 시약 (Dojindo)을 37 ℃에서 1 시간 동안 배지에 첨가하였다. 마이크로 플레이트 리더 (BioTek)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 24시간 마다 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 확인하였다.

도 8을 확인해보면, Dermal papilla 세포에 5 mM N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드의 농도로 제조된 지질 나노 입자가 처리된 경우 세포 생존률이 평균 317 %까지 증가하였다

도 9를 참고하면 MDA-MB-468 암세포는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드의 지질 나노입자가 농도별로 처리되어도 세포 생존률에 차이는 없었으나 사멸하는 효과(독성)도 나타나지 않았다.

이를 통해 본 발명에서 제조된 LNP가 정상 세포의 성장을 유도하고 암세포에는 영향을 주지 않음을 확인할 수 있다.

실시예 5. N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 지질나노입자(LNP)에 의한 세포 증식 관련 단백질 발현 확인

실험을 위해, DP(Dermal papilla) 세포 및 MDA-MB-468 세포를 60 mm² 세포 배양 플레이트 (1.3 x 10⁶세포/플레이트)에 접종하였다. 24시간 후, N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드의 농도별로 제조된 LNP를 각 웰당 2.5 mL opti-MEM 배지에 2.48 x 10¹¹± 2.75 x 10¹⁰개의 입자가 포함되도록 계산하여 첨가하였다. LNP가 포함된 배지를 처리하고 37 ℃에서 24 시간 배양하였다.

이 후, 세포를 수집하였고, 웨스턴 블롯을 실시하였다. 이를 위해, LNP를 처리한 Dermal papilla 세포와 MDA-MB-468 세포를 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 (Sigma)가 포함된 RIPA 버퍼에서 용해하였다. 전체 세포 용해물은 BCA 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 정량하였다. 다음으로 세포 용해물 (50 μg)을 변성 조건 하에서 4-15 % gradient SDS-PAGE 겔 (Biorad)에 로딩하고 PVDF 막 (iBlot2 Dry Blotting System, Thermo Scientific)으로 이동하였다. 막을 5 % 탈지우유로 실온에서 1 시간 동안 차단하고 BAX, BAD, BCL2, Actin (Santa Cruz) 및 Cleaved caspase3 (cell signaling)의 1 차 항체를 4 ℃에서 밤새 반응시켰다.

HRP가 접합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 멤브레인에 웨스턴 ECL 처리한 다음 발광 이미지를 LAS500 (GE Healthcare)을 사용하여 분석하였고 이에 대한 결과는 도 10과 도 11에 나타내었다.

도 10을 통해 proliferation 관련 단백질(Ki67 및 PCNA)의 발현양을 확인한 바, Dermal papilla 세포의 경우 Ki67 및 PCNA의 발현양이 대조군과 비교하여 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드의 나노 입자가 처리된 실험군에서 증가하는 경향을 확인하였으나, 도 11의 결과와 같이 MDA-MB-468 암세포의 경우에는 발현양에 차이가 없음을 확인하였다.

이에 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 포함된 LNP가 Dermal papilla 세포와 같은 정상 세포의 성장 효과가 우수함을 알 수 있었고, 암세포에는 영향을 주지 않음이 입증된다.

추가적으로 세라마이드가 포함된 LNP와 대비하여 세라마이드 단독으로 실시예 1과 2와 같은 함량으로 수용액상에 분산시키고 컬럼정제하여 실시예 4의 세포 생존율 및 실시예 5의 세포 증식 인자 관련 단백질 발현 실험을 진행하였으나, 아무런 변화가 없음을 확인하였다. 이는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드 자체가 수용액상에서 불용성이기 때문에, 세포 생존율 및 항종양 관련 단백질 발현 실험시 수용액상에 유효성분으로 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 세라마이드가 없어 세라마이드 자체가 갖는 효과가 나타나지 않는다는 것을 알 수 있었다.

Claims

하기 화학식 1의 구조를 갖는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N-Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 장쇄 세라마이드;
레시틴;
콜레스테롤;
DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 및,
DSPE-PEG(2000) 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine polyethyleneglycol (2000) Amine);이,
2~5 mol : 0.5~5 mol : 0.1~1 mol : 0.01~0.5mol : 0.05~0.5 mol의 비율로 포함된 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자.
[화학식 1]
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제1항에 있어서,
상기 지질 나노입자는 10 ~ 2,000 nm의 입자크기를 갖는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자.
제1항 또는 제6항에 따른 지질 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 성장으로 인한 발모 효능이 있는 약학 조성물.
제1항 또는 제6항에 따른 지질 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 성장으로 인한 발모 효능이 있는 화장료 조성물.
(제1단계) 레시틴, 콜레스테롤, DSPC(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine); 및,
DSPE-PEG(2000) 아민(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine polyethyleneglycol (2000) Amine), 및, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 N-네르보노일-에리트로-스핑고신(N- Nervonoyl-erythro-sphingosine) 계열의 장쇄 세라마이드를 유기용매 상에서 0.5~5 mol : 0.1~1 mol : 0.01~0.5 mol : 0.05~0.5 mol : 2~5 mol로 혼합하여 혼합 조성물을 제조하는 단계;
(제2단계) 상기 혼합 조성물을 분산액 상태로 제조하고, 컬럼 정제하는 단계; 및 ,
(제3단계) 컬럼 정제하여 얻은 정제물을 멸균 여과하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자의 제조방법.
[화학식 1]
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제9항에 있어서,
상기 유기 용매는 메탄올, 에탄올, 벤젠, 부탄올, 부틸 아세테이트, 카본 테트라클로라이드, 클로로포름, 사이클로헥세인, 디클로로에테인, 디클로로메테인, 디에틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 에틸 아세테이트, 헵테인, 헥세인, 이소옥테인, 메틸 에틸 케톤(MEK), 메틸 t-부틸 에테르(MTBE), 펜테인, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 자일렌 및 이들의 혼합 용매에서 선택되는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 제2단계에서 초음파 처리하거나 동결-해동하여 분산액을 제조하는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 제2단계에서 액적-기반 미세유체 시스템으로 분산액을 제조하는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 제3단계의 멸균 여과에 사용하는 필터는 0.25 내지 0.4 μm의 공극 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 발모 효능이 있는 지질 나노입자의 제조방법.