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KR100921959B1 - 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는다중-유화 베시클 - Google Patents

다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는다중-유화 베시클 Download PDF

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KR100921959B1
KR100921959B1 KR1020070054234A KR20070054234A KR100921959B1 KR 100921959 B1 KR100921959 B1 KR 100921959B1 KR 1020070054234 A KR1020070054234 A KR 1020070054234A KR 20070054234 A KR20070054234 A KR 20070054234A KR 100921959 B1 KR100921959 B1 KR 100921959B1
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vesicle
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liposome
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이종성
함영근
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바이오스펙트럼 주식회사
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Abstract

본 발명은 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는 다중-유화 베시클에 관한 것이다. 본 발명의 구성성분인 단일막 나노 리포좀은 다량의 난용성 활성성분을 효율적으로 봉입하고, 다중층 리포좀은 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하고 있어, 단일막 나노 리포좀과 다중층 리포좀을 혼합, 유화 즉 다중-유화에 의한 베시클을 제조하여, 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 생리 활성성분을 안정화한다. 또한, 본 발명의 다중-유화 베시클은 입자크기가 800-1500 nm로서 크기가 일정하게 유지되며 구조의 안정성이 우수하여, 다양한 제형에 적용 시 외부환경으로부터 보다 안정하게 생리활성성분을 보호하고, 피부 각질세포간극보다 크기가 커서 세포간극 통과 시 주위세포에 대한 장력의 영향을 받지 않아 진피층까지 투과할 수 있어 생리활성성분의 우수한 경피 흡수 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 다중-유화 베시클은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 의약외품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
다중-유화 베시클, 다중층 리포좀, 단일막 나노 리포좀, 레시틴

Description

다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는 다중-유화 베시클{Multi-Emulsified Vesicles Comprising a Multi Lamellar Liposome and Phospholipid Monolayer Nanoliposomes}
도 1은 단일막 리포좀이 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하는 본 발명의 다중-유화 베시클의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 실시예 2 에 의해 제조한 본 발명의 다중-유화 베시클의 전자현미경 사진이다.
본 발명은 다중-유화 베시클에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생리활성성분을 다량 봉입하고, 안정성, 인체안전성 및 경비 흡수 효과가 우수한 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는 다중-유화 베시클에 관한 것이다.
피부에 보습효과 부여를 통한 피부 각질층 개선 및 영양성분 공급을 통한 노화방지, 미백 또는 피부진정 등을 주된 기능으로 하는 화장료들은 일반적으로 o/w형 (oil-in-water type)과 w/o형 (water-in-oil type)으로 나눌 수 있다. 먼저, 수상성분들을 주로 사용하여 유상성분들을 수상성분들 중에 유화시켜 제조되는 타입을 o/w형(수중유화형)이라 하고, 반대로 유상성분들을 주로 사용하여 수상성분들을 유상성분들 중에 유화시켜 제조되는 타입을 w/o형(유중수화형)이라 한다. 이 밖에 최근에 개발되고 있는 다중 액정막 유화기법을 이용하여 w/o/w타입의 유화시스템 등이 있다.
일반적으로 기초 화장료에 사용되고 있던 계면활성제 유화기법은 대부분 그 입자의 크기가 수 마이크로미터(㎛)정도이며, 그 계면이 주로 비이온성 계면활성제로 인한 단일막(Uni-layer)으로 형성되어 있는 리포좀을 수득할 수 있었음에 불과하며, 그에 따라 피부의 간극보다 매우 큰 입자크기로 인해 활성성분의 피부로의 전달이 용이하지 못하고, 단일막으로 안정화시키므로 난용성 물질이 일단 용해되었다고 하더라도 입자간의 인력에 의해 활성성분이 불안정하고 피부와의 친화성이 떨어져 피부침투에 바람직하지 못한 효과를 갖는 문제점이 있다.
또한, 종래의 화학적으로 합성된 유화제들을 이용하여 에멀젼을 제조하는 경우, 화학적으로 합성된 인공의 유화제들은 피부와의 친화성이 좋지 않고, 그 구조상의 유사성이 적어 민감한 피부에서 자극을 유발할 수 있는 문제점이 있다.
피부는 피부세포 간의 간극이 마치 층상구조와 같이 물층-기름층-물층-기름층 등과 같이 반복적인 층으로 이루어져 있으며 기름층의 특성은 세포막의 구조와 비슷한 물리 화학적 성질을 나타내기 때문에 아데노신이나 비타민 C와 같은 친수성 물질은 대부분 통과하기가 어렵다.
피부를 통한 유효성분의 주요 통로는 피부세포를 직접 통하는 방법, 피부세포간극을 통하는 방법 또는 모공 등을 통하는 방법 등이 알려져 있다. 일반적으로, 모공이 크기 때문에 모공을 통해서 주로 침투 할 것으로 추정되나 실제 피부를 통한 유효성분의 침투는 대략 1% 정도에 머문다. 실제로는 대부분의 유효성분이 피부세포간극을 통하여 침투하는 것으로 알려져 있으며, 피부세포 간극이 30 에서 60 nm 정도로 그 틈이 아주 작기 때문에(Journal of controlled release 32:249(1994)) 100 nm 이하의 작은 크기의 리포좀만이 통과할 수 있을 것으로 간주되었다. 그 예로 대한민국 특허 제422763호에서 피부간극과 동일한 크기의 리포좀이나 크기가 40 내지 60 nm 정도의 나노 에멀젼의 제조법에 관하여 서술하고 있다. 그러나, 최근 발표된 논문 (J. of Controlled release 59:87-97(1999))에 따르면 100 nm 이하의 리포좀이 각질부 통과 시 세포의 장력에 의해 세포막에 융합되어 실제 진피층까지 도달하기 힘들지만 오히려 500 nm 내지 1500 nm의 큰 크기의 리포좀은 진피층에 도달할 수 있다고 기술되었다. 근본적인 피부침투 원리는 현재까지도 완전히 밝혀지지 않았으나 리포좀은 다른 미셀구조와는 달리 물 풍선 같이 그 구조가 유연하여 좁은 틈도 통과할 수 있는 것으로 여겨지고 있다.
따라서, 나노 리포좀의 안정성과 다중층 리포좀의 피부투과 우수성을 동시에 가지며 기존의 리포좀보다 개선된 이중 유화 베시클의 용이한 제조법을 개발하는 것이 절실한 상황이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 난용성 활성성분 및/또는 수용성 활성성분을 다량으로 안정되게 봉입하고 경피 흡수를 촉진할 수 있는 베시클 구조를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 상기 다중층 리포좀 내에 위치하는 단일막 나노 리포좀을 포함하는 독특한 구조의 다중-유화 베시클을 제공하고, 이 베시클이 상기의 바람직한 특성을 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 다중-유화 베시클을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 다중-유화 베시클의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 화장료, 약제학적 또는 의약외품 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 다중-유화 베시클을 제공한다:
(a) 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀; 및
(b) 단일막 나노 리포좀;
상기의 단일막 리포좀은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치한다.
본 발명자들은 난용성 활성성분 및/또는 수용성 활성성분을 다량으로 안정되게 봉입하고 경피 흡수를 촉진할 수 있는 베시클 구조를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 상기 다중층 리포좀 내에 위치하는 단일막 나노 리포좀을 포함하는 독특한 구조의 다중-유화 베시클을 제공하고, 이 베시클이 상기의 바람직한 특성을 나타낸다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다중-유화 베시클은 기본적으로 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함한다.
본 명세서에서, 베시클(vesicle)을 언급하면서 사용되는 용어 “다중-유화”는 베시클을 제공하는 과정에서 유화 공정을 두 번 이상 한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “리포좀”은 자기 스스로 회합하는 콜로이드 입자들의 구형 인지질 베지클을 의미한다. 수용성 헤드(친수기)와 불용성 테일(소수기)을 가진 양친매성 분자로 구성된 리포좀은 이들의 상호작용에 의하여 자발적으로 결합하여 정렬된 구조를 보이는데, 그 크기와 적층성(Lamellarity)에 따라 SUV(Small Unilamellar Vesicle), LUV(Large Unilamellar Vesicle) 및 MLV(Multi Lamellar Vesicle)로 분류된다. 이와 같이 다양한 적층성을 나타내는 리포좀은 세포막과 유사한 이중막 구조를 갖는다.
본 명세서에서, 용어 “단일막 나노 리포좀”은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것과는 달리, 하나의 인지질 막으로 친수기는 바깥쪽, 친유기는 안쪽으로 향하는 구조를 가지는 것으로서, 평균 입자지름이 1-300 nm인 리포좀을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “다중층 리포좀”은 최소 2개, 바람직하게는 최소 3개, 보다 바람직하게는 3-30개, 보다 더 바람직하게는 3-10개, 가장 바람직하게는 3개의 인지질 이중막 구조를 가지는 리포좀을 의미한다.
본 발명의 다중-유화 베시클의 기본 골격을 이루는 다중층 리포좀은 유상부로서 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 오일, 스테아르산 및 에탄올을 포함하며, 바람직한 구현예에 따르면, 베시클의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 오일 0.1-20.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다중층 리포좀의 수상부는 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 다중층 리포좀의 수상부는 베시클의 총 중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 수용성 활성성분을 추가적으로 포함하며, 상기 수용성 활성성분은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단일막 나노 리포좀의 유상부(다중-유화 베시클을 이루는 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치함)는, 단일막 나노 리포좀의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량%, 오일 0.1 내지 20.0중량%, 부틸렌글리콜 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 포함하며, 수상부는 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 베시클은 상기 단일막 나노 리포좀의 총중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 난용성 활성성분을 추가적으로 포함하며, 상기 난용성 활성성분은 상기 단일막 나노 리포좀의 내부에 포집되어 있다.
본 발명의 다중-유화 베시클에 이용되는 인지질은 양쪽 친화성 지질로 이용된 것으로서, 천연 인지질 및 합성 인지질을 포함하며, 바람직하게는 탄소수 12-24개인 지방산 사슬을 갖는 인지질류를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용될 수 있는 인지질은 포스파티딜콜린 (Phosphatidylcholine, PC; 천연 또는 합성) 또는 레시틴, 디팔미토일포스파티딜콜린, 포스파티딕애씨드 (Phosphatidic acid, PA), 리소포스파티딜콜린(Lysophosphatidylcholine, LPC), 포스파티딜세린(Phosphatidylserin, PS), 포스파티딜에탄올아민(Phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜글리세롤(Phosphatidylglycerol, PG), 포스파티딜이노시 톨(Phosphatidylinositol, PI), 스핑고마이엘린(Sphingomyelin), 카디올리핀(Cardiolipin), 이를 가수분해하여 제조된 지방산(인산기를 갖는 지방산), 그 유도체 또는 이들의 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 인지질은 레시틴이며, 보다 바람직하게는 대두 또는 난황에서 추출한 천연 유래의 불포화 레시틴 또는 포화 레시틴이다. 통상적으로 천연 유래의 레시틴은 포스파티딜 콜린의 양이 23-95%, 그리고 포스파티딜에탄올아민의 양이 20% 이하이다. 본 발명의 다중-유화 베시클에 있어서 다중층 리포좀은 바람직하게는 베시클 총 중량에 대하여 0.1-10.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.5-8.0 중량%, 가장 바람직하게는 1.5-3.0 중량%의 인지질을 포함한다. 본 발명의 다중-유화 베시클에 있어서 단일막 나노 리포좀은 바람직하게는 단일막 나노 리포좀 총 중량에 대하여 0.1-10.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.5-8.0 중량%, 가장 바람직하게는 1.5-3.0 중량%의 인지질을 포함한다.
본 발명의 다중-유화 베시클에 이용되는 다른 성분인 유성(oil) 성분은 당업계에서 공지된 다양한 오일이 이용될 수 있으며, 바람직하게는, 헥사데칸 및 파라핀 오일과 같은 하이드로카본계오일; 이소프로필 미리스테이트와 같은 에스테르계의 합성오일; 디메치콘 및 사이크로메치콘계과 같은 실리콘 오일; 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유, 호호바유, 올리브유, 너트유, 스쿠알란 및 어유와 같은 동식물성 오일; 에톡시레이티드 알킬에테르계오일; 프로폭시레이티드알킬에테르계오일; 피토스핑고신, 스핑고신 및 스핑가닌과 같은 스핑고노이드 지질; 세레브로사이드; 콜레스테롤; 캄페스테롤; 베타시토스테롤; 후코스테롤; 콜레 스테릴설페이트; 시토스테릴설페이트; C10 -40 지방알코올 또는 세라마이드이다. 보다 바람직하게는, 세라마이드, 콜레스테롤 및 동식물성 오일(호호바유, 올리브유, 스쿠알란 등)의 혼합물이다.
본 발명의 다중-유화 베시클의 제조에 있어서, 동식물성 오일의 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-20 중량%이고, 바람직하게는 1-10 중량%, 보다 바람직하게는 3-8 중량%, 가장 바람직하게는 4-6 중량%이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 다중-유화 베시클에서 다중층 리포좀에 사용되는 오일은 식물성 오일이며, 보다 바람직하게는 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유, 호호바유, 올리브유 또는 너트유이고, 보다 더 바람직하게는 호호바유 또는 올리브유이며, 가장 바람직하게는 올리브유이다. 다중-유화 베시클에서 단일막 나노 리포좀에 이용되는 오일은 식물성 오일이며, 보다 바람직하게는 해바라기유, 옥수수유, 대두유, 아보카도유, 참깨유, 호호바유, 올리브유 또는 너트유이고, 보다 더 바람직하게는 호호바유 또는 올리브유이며, 가장 바람직하게는 호호바유이다.
한편, 본 발명에 사용된 콜레스테롤은 피부침투성을 향상시키고 자극을 완화시키는 유연제, 유화제 또는 유화안정제로 사용된다. 그 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-5.0 중량%이고, 바람직하게는 0.1-3 중량%이다.
세라마이드는 스핑고리피드의 일종으로 스핑고신의 아미드 유도체이고, 방벽 기능, 보습효과 및 면역조절 기능을 가지고 있어 피부를 보호하는 기능을 가지며, 자연계에 존재하는 타입 1-타입 7까지 모든 종류를 포함한다. 그 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-3 중량%이고, 바람직하게는 0.1-1.5 중량%이다.
본 발명의 다중-유화 베시클 제조에 이용되는 지방산은 고급 지방산으로서, 바람직하게는 C12 -22 알킬 체인의 포화 또는 불포화 지방산으로서, 예컨대, 라우린산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산 및 리놀레산을 포함한다. 가장 바람직하게는 스테아르산이다. 스테아르산의 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-5.0 중량%이고, 바람직하게는 0.5-3 중량%이다.
본 발명의 다중-유화 베시클 제조에 이용되는 유기용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올 또는 부탄올 등의 알코올류를 사용하며, 바람직하게는 에탄올이다. 그 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-5.0 중량%이고, 바람직하게는 1-4 중량%이다.
본 발명의 다중-유화 베시클 제조에 이용되는 폴리올은 특히 제한되지 않으며, 바람직하게는 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 메틸프로판디올, 이소프렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 에리스리톨, 에틸 카비톨, 자이리톨 또는 솔비톨이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 폴리올은, 글리세린 및/또는 부틸렌글리콜이다. 폴리올의 사용량은 단일막 나노 리포좀 또는 베시클의 총 중량에 대하여 0.1-10 중량%이고, 바람직하게는 3-9 중량%이다. 폴리올은 리포좀의 성상을 안정화하기 위한 것으로서 오일과 함께 피부의 보습 효과를 부여하고 난용성 활성성분을 용해시키는 목적으로 사용하며, 단일막 나노 리포좀을 형성할 때 그 효율성을 증대하기 위하여 사용한다.
본 발명의 다중-유화 베시클의 제조에 이용되는 물은 바람직하게는 증류수이고, 가장 바람직하게는 탈이온화된 증류수이다.
본 발명의 베시클에 포함되는 단일막 나노 리포좀에 포집되어 생리 기능을 증진시킬 수 있는 난용성 활성성분에는 예를 들어, 단백질, 펩타이드, 핵산, 합성 화합물, 천연 추출물, 당류, 비타민, 무기물, 효소, 호르몬, 신경전달물질, 면역글로불린, 다당류, 면역조절제, 항생제, 항종양제, 항염증제, 해열제, 진통제, 항부종제, 진해 거담제, 진정제, 근육이완제, 항간질제, 항궤양제, 항우울제, 항알레르기제, 강심제, 항부정맥제, 혈관확장제, 혈압강하제, 당뇨치료제, 항상성제제, 호르몬제, 항산화제, 육모제, 양모제, 항균제, 미백제, 콜라겐 합성 촉진제, 주름 제거 완화제, 피부장벽 강화제, 피부 보습력 증강제 또는 피부 미용제 등으로서 난용성을 나타내는 성분이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 포함될 수 있는 수용성 활성성분은, 상술한 활성성분의 예시적인 물질 중에서 수용성을 나타내는 성분들이다. 예를 들어, 항종양제 중에서 난용성을 나타내는 물질(예컨대, 파클리탁셀)은 단일막 나노 리포좀에 포집되며, 수용성을 나타내는 물질(예컨대, 수용성 탁솔 유도체)은 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 다중-유화 베시클의 입자크기는 200-3000 nm, 바람직하게는 500-2000 nm, 보다 바람직하게는 800-1500 nm이다. 상기 베시클의 입자크기가 200 nm 미만인 경우에는 다중층 리포좀의 이중막의 개수가 적어지고 난용성 활성성분을 봉입한 단일막 나노 리포좀의 포집율이 매우 미약하며, 3000 nm를 초과하는 경우에는 본 발명에서 달성하고자 하는 기술적 효과 중 피부침투의 개선 및 제형 안정성의 개선이 매우 미약하다. 또한, 단일막 나노 리포좀의 입자크기는 1-300 nm, 바람직하게는 20-200 nm, 보다 바람직하게는 20-100 nm, 가장 바람직하게는 50-100 nm이다. 상기 단일막 나노 리포좀의 입자크기가 1 nm 미만인 경우에는 봉입되는 난용성 활성성분의 양이 매우 적으며, 300 nm를 초과하는 경우에는 다중층 리포좀의 이중막 구조사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 포집율이 매우 미약하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 다중-유화 베시클의 제조방법을 제공한다:
(a) 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 스테아르산, 오일, 부틸렌글라이콜 및 에탄올을 혼합하고 가온하여 단일막 나노리포좀의 유상부를 제조하는 단계;
(b) 폴리올을 물에 용해하여 단일막 나노리포좀의 수상부를 제조하는 단계;
(c) 상기 (a)의 유상부 및 (b)의 수상부를 혼합하고 1차 유화하는 단계;
(d) 상기 (c)의 결과물을 균질기를 사용하여 단일막 나노 리포좀을 형성하는 단계;
(e) 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 오일, 스테아르산 및 에탄올을 혼합하고 가온하여 다중층 리포좀의 유상부를 제조하는 단계;
(f) 폴리올을 정제수에 용해하여 다중층 리포좀의 수상부를 제조하는 단계;
(g) 상기 (e)의 유상부 및 (f)의 수상부를 혼합하고 2차 유화하여 다중층 리포좀을 형성하는 단계; 및
(h) 상기 (d)의 단일막 나노 리포좀 및 (g)의 다중층 리포좀을 혼합하고 3차 유화하여 다중-유화 베시클을 형성하는 단계.
본 발명의 방법은 상술한 본 발명의 다중-유화 베시클을 제조하기 위한 공정이기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
다중-유화 베시클을 제조하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
(a) 단일막 나노리포좀의 유상부의 제조
단일막 나노 리포좀의 유상부는, 바람직하게는 단일막 나노 리포좀의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량%, 오일 0.1 내지 20.0중량%, 부틸렌글리콜 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 혼합하여 제조된다. 상기 성분들의 혼합은 당업계의 통상적인 방법에 따라 다양한 방법으로 실시될 수 있다. 예를 들어, 진동믹서기 또는 교반기를 이용하여 혼합할 수 있다. 상기 혼합은 고온에서 실시하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 50-80℃, 가장 바람직하게는 60-70℃에서 실시한다. 이러한 혼합 및 가온에 의해 상기 유상부의 성분들이 균일하게 분산되며, 상기 유상부를 제조할 때 난용성 활성성분을 추가하여 제조하는 경우에는 난용성 활성성분이 유상부에 용해되도록 한다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 유상부에 단일막 나노 리포좀의 총중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 난용성 활성성분을 추가적으로 포함하며, 상기 난용성 활성성분은 단일막 나노 리포좀의 내부에 포집된다.
(b) 단일막 나노리포좀의 수상부의 제조
이어, 폴리올을 물에 혼합 및 용해하여 단일막 나노리포좀의 수상부를 제조한다. 상기 혼합은 당업계의 통상적인 방법에 따라 다양한 방법(예컨대, 진동믹서기 또는 교반기). 상기 혼합은 고온에서 실시하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 50-80℃, 가장 바람직하게는 60-70℃에서 실시한다. 이 단계에서 사용되는 폴리올의 종류는 상술한 바와 같으며, 가장 바람직하게는 글리세린이다.
(c) 단일막 나노리포좀의 유상부 및 수상부의 혼합 및 1차 유화
1차 유화단계는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 이루어진다. 유화는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있다. 예를 들면, 프로펠라 믹서, 디스퍼, 호모 믹서, 호모게나이저, 콜로이드 분산기 또는 초음파유화기를 사용하며, 바람직하게는 호모믹서를 사용한다. 호모믹서는 의약품, 화장품 및 식품에서 균질한 혼합을 위하여 통상적으로 사용되는 교반장치로서, 교반속도 및 교반시간을 조절하여 베시클의 크기를 조절할 수 있다. 보다 바람직하게는, (a)의 유상부와 (b)의 수상부를 호모믹서를 이용하여 2000-4000 rpm(바람직하게는 3000 rpm)의 속도로 1-20분(바람직하게는 4-6분) 동안 교반하여 유화시켜, 단일막 리포좀을 생성한다.
1차 유화단계에서는, 수분상에 유분상이 강하게 혼합됨으로써 미세한 구형으로 입자들이 형성되고 유상부에 용해되어 있는 인지질과 지질막 구성성분들은 주위의 수상용매상과의 계면에 단일막을 형성하여 유상성분들을 안정화시키고 단일막 리포좀을 형성한다.
(d) 단일막 나노 리포좀의 형성
상기 단계 (c)의 결과물을 균질기로 처리하여 단일막 나노 리포좀을 형성한다. 바람직하게는, 단계 (c)의 1차 유화단계 이후에 추가적으로 1차 유화된 결과물을 20-30℃로 냉각한 다음, 균질기로 처리한다.
단일막 나노리포좀의 형성은 바람직하게는, 고압균질기 또는 마이클로플루다이저를 사용하여 실시되며, 보다 바람직하게는 마이크로플루이다이저를 사용하여 실시된다. 이 과정에 의해 보다 균일하고 나노 크기의 리포좀을 얻을 수 있다. 마이크로플루다이저는 고압을 이용하여 유화를 수행하는 기계로서, 500-1500 bar의 고압을 사용하여 상압 1기압으로 유화물이 유출될 때 발생하는 압력 변동에 의한 케비테이션(cavitation)이라 하는 일종의 진공현상 및 충돌력으로 유화입자를 미세하게 만드는 원리를 이용한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 마이크로플 루다이저에 의한 처리는 500-1000 bar, 보다 바람직하게는 500-800 bar, 가장 바람직하게는 약 600 bar에서 실시된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최종적으로 생성된 단일막 나노 리포좀의 입자크기는 1-300 nm, 바람직하게는 20-200 nm, 보다 바람직하게는 20-100 nm, 가장 바람직하게는 50-100 nm이다.
(e) 다중층 리포좀의 유상부의 제조
이어, 상기 단일막 나노 리포좀을 포집하기 위한 다중층 리포좀을 제조한다. 바람직하게는, 베시클의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 오일 0.1-20.0중량% 및 부틸렌글리콜 0.1-5.0 중량%을 혼합하고 60-70℃로 가온하여 에탄올 0.1-5.0 중량%로 용해한다.
(f) 다중층 리포좀의 수상부의 제조
폴리올을 물에 60-70℃로 가온하여 완전 용해시켜 다중층 리포좀을 제조한다. 이 경우, 수용성 활성성분을 추가적으로 첨가하여 수상부를 제조할 수 있다. 상기 수용성 활성성분은, 최종적으로 생성되는 다중-유화 베시클의 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하게 된다.
(g) 다중층 리포좀의 형성
단계 (g)의 2차 유화 및 다중층 리포좀의 형성단계는 당업계에 공지된 다양 한 방법으로 이루어지는데, 바람직하게는 상기 (a)의 유상부와 (b)의 수상부를 혼합하고 호모믹서를 이용하여 2000-4000 rpm의 속도로 1-20분, 바람직하게는 3000 rpm의 속도로 4-6분 동안 교반하여 다중층 리포좀을 형성한다. 상기 다중층 리포좀은 최소 두 개의 이중막 구조를 가지며, 바람직하게는 세 개의 이중막 구조이다.
(h) 다중-유화 베시클의 형성
단계 (h)의 3차 유화 및 다중-유화 베시클 형성단계는, 바람직하게는 상기 (g)의 다중층 리포좀에 55-55℃에서 상기 (d)의 단일막 나노리포좀을 첨가하고 교반함으로써 3차 유화 즉 다중 유화를 하여 단일막 나노 리포좀을 다중층 리포좀내로 도입시키는 것으로 이루어진다.
본 발명의 상기 다중-유화 베시클은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 상기의 단일막 나노리포좀을 위치시켜, 다량의 활성성분을 봉입하고 향상된 경피 흡수 능력을 가지게 된다.
상기 과정을 통해 최종적으로 생성된 다중-유화 베시클은, 200-3000 nm, 바람직하게는 500-2000 nm, 보다 바람직하게는 800-1500 nm의 입자 크기를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다중-유화 베시클을 포함하는 화장료, 약제학적 또는 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분으로서의 다중-유화 베시클 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해 화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더 또는 립스틱의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다중-유화 베시클을 포함하여 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것 은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 예컨대 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사, 또는 경피 투여에 의해 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여 중 경피투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은, 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 치약, 구강청정제와 같은 의약외품 조성물로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 다중-유화 베시클을 포함하는 조성물의 적용에는 특별한 제한이 없으며, 예를 들면 샴푸, 린스 또는 바디클렌져 등의 세정료, 헤어토닉, 젤 또는 무스 등의 정발제, 양모제 또는 염모제등의 모발용 조성물에 폭넓게 적용 가능하다.
본 발명은 단일막 나노 리포좀 및 다중층 리포좀을 포함하는 다중-유화 베시클에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 단일막 나노 리포좀 및 다중층 리포좀을 포함하며, 상기 단일막 나노 리포좀은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하는 다중-유화 베시클에 관한 것이다. 본 발명의 다중-유화 베시클은 다량의 난용성 활성성분을 효율적으로 봉입, 안정성, 인체안전성 및 피부투과도가 우수하다. 따라서, 본 발명의 다중-유화 베시클은 안정성 및 인체안전성이 우수하므로 장기간 사용 시에도 효능의 저하 및 부작용 없이 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약제학적 및 의약외품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(ⅰ) 본 발명의 다중-유화 베시클은 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하다.
(ⅱ) 구성성분인 단일막 나노 리포좀은 다량의 난용성 활성성분을 효율적으로 봉입하고, 다중층 리포좀은 최소 두개의 인지질 이중막 구조를 포함하고 있어, 단일막 나노 리포좀과 다중층 리포좀을 혼합, 유화 즉 다중-유화에 의해 유중수중유형(O/W/O)의 베시클을 제조하여, 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 생리 활성성분을 안정화한다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 다중-유화 베시클은 입자크기가 800-1500 nm로서 크기가 일정하게 유지되며 구조의 안정성이 우수하여, 다양한 제형에 적용 시 외부환경으로부터 보다 안정하게 생리활성성분을 보호하고, 피부각질 세포간극보다 크기가 커서 세포간극 통과 시 주위세포에 대한 장력의 영향을 받지 않아 진피층까지 투과할 수 있어 생리활성성분의 우수한 경피 흡수 효과를 가진다.
(ⅳ) 본 발명의 다중-유화 베시클은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 의약외품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 내지 3 : 이중 유화 베시클의 제조
하기 표 1의 조성으로 난용성 활성성분으로서 제니스테인(Sigma)을 함유한 실시예 1 내지 3의 이중 유화 베시클을 포함하는 화장료 조성물을 제조하였으며, 그 제조방법은 다음과 같다:
(1) 비교예 2와 같이 미세한 단일막 리포좀을 제조하고 준비하였다.
(2) 대두에서 추출하여 수첨된 포스파티딜콜린 함량이 90-95%인 포화레시틴, 포스파티딜콜린 함량이 90-95%인 수첨되지 않은 불포화 레시틴, 식물성콜레스테롤, 콜레스테롤, 세라마이드, 올리브유, 스테아르산 및 에탄올 성분을 혼합하여 65℃에서 완전 용해시켰다.
(3) 정제수를 65℃로 가온하고 글리세린을 혼합 교반하여 완전히 용해시켰다.
(4) 상기 (2)의 유상부를 (3)의 수상부에 투입하여 3000 rpm의 속도로 5분 동안 호모믹서로 혼합유화하고 점증제로서 잔탄검, 첨가제로서 향 및 방부제를 첨가 및 혼합하여 다중층 리포좀을 제조하였다.
(5) 상기 (1)의 단일막 나노리포좀을 50 내지 55℃에서 상기 (4)의 다중층 리포좀에 투입하여 3000 rpm의 속도로 5분 동안 호모믹서로 혼합 유화하여 이중 유화 베시클을 제조하였다.
(6) 상온으로 냉각하고, 탈포한 후 냉암소에서 숙성시켰다.
구분 성분명 함량(중량 %)
실시예 1 실시예 2 실시예 3
리포좀 베이스 나노리포좀 20.00 10.00 1.0
유상부 포화레시틴 1.50 1.50 1.50
불포화레시틴 1.00 1.00 1.00
콜레스테롤 2.00 2.00 2.00
세라마이드 0.10 0.10 0.10
올리브유 5.00 5.00 5.00
스테아르산 1.00 1.00 1.00
수상부 에탄올 4.00 4.00 4.00
글리세린 4.00 4.00 4.00
아데노신 0.04 0.04 0.04
정제수 to 100 to 100 to 100
점증제 잔탄검 적당량 적당량 적당량
첨가제 향 적당량 적당량 적당량
방부제 적당량 적당량 적당량
비교예 1 내지 3 : 단일막 나노 리포좀 제조
하기 표 2의 조성으로 아래에 제시된 방법에 따라 제조하였다. 다만, 비교시험을 위하여 지표물질로 사용하기 위한 제니스테인을 유효성분으로 하였다.
대두에서 추출하여 수첨된 포스파티딜콜린 함량이 90-95%인 포화레시틴, 포스파티딜콜린 함량이 90-95%인 수첨되지 않은 불포화 레시틴, 식물성콜레스테롤, 콜레스테롤, 세라마이드, 호호바유, 부틸렌글라이콜, 제니스테인 및 에탄올 성분을 혼합하여 65℃에서 가온 용해시킨 유상부를, 정제수를 65℃로 가온하고 글리세린을 혼합하여 완전히 용해시킨 수상부에 투입하여 3000 rpm의 속도로 5분 동안 호모균질기(T25 Basic Ultra-turrax, IKA)로 유화한 후 20℃-25℃로 냉각하고 마이크로플루이다이저(Microfluidizer)(M-110EH Microfluidizer, MFIC)를 사용하여 600 bar 압력에서 3회 반복 처리하였다.
구분 성분명 함량(중량 %)
비교예 1 비교예 2 비교예 3
유상부 포화레시틴 2.50 1.50 -
불포화레시틴 - 1.00 2.50
콜레스테롤 0.40 0.40 0.40
세라마이드 0.10 0.10 0.10
호호바유 5.00 5.00 5.00
스테아르산 1.00 1.00 1.00
부틸렌글리콜 5.00 5.00 5.00
제니스테인 0.50 0.50 0.50
에탄올 4.00 4.00 4.00
수상부 글리세린 4.00 4.00 4.00
정제수 to 100 to 100 to 100
첨가제 향 적당량 적당량 적당량
방부제 적당량 적당량 적당량
비교예 4 : 이중막 나노 리포좀 제조
고압 균질기를 이용한 나노크기의 이중막 리포좀의 제조로서 대한민국 공개특허 제2006-0006988호에 제시된 방법에 따라 하기의 표 3의 조성으로 제조하였다. 상기의 특허공개공보에서 제시한 유효성분인 코엔자임 Q10 대신에, 본 발명에서는 지표물질로 사용하는 제니스테인을 유효성분으로 사용하였다.
구분 성분명 함량(중량 %)
비교예 4
유상부 포화레시틴 3.00
스쿠알란 10.00
시클로메치콘 5.00
제니스테인 0.50
수상부 글리세린 4.00
1,3-부틸렌글리콜 2.00
아데노신 0.04
정제수 to 100
점증제부 카보머 0.20
잔탄검 0.20
기타 향 0.05
방부제 0.30
비교예 5 : 일반 나노 에멀젼 제조
고압 균질기를 이용한 나노 에멀젼의 제조로서 하기 표 4의 조성에 따라 하기의 과정에 따라 제조하였으며, 비교실험을 위하여 지표물질로 사용하기 위한 제니스테인을 유효성분으로 하였다.
친유형 및 친수형 계면활성제인 소르비탄 스테아레이트, 폴리소르베이트, 스쿠알란 및 제니스테인을 혼합하여 65℃에서 가온 용해시킨 유상부를, 정제수를 65℃로 가온하여 카보머 및 글리세린을 혼합하고 용해시킨 수상부에 투입하여 3000 rpm의 속도로 5분 동안 호모균질기로 유화한 후 20℃-25℃로 냉각하고 고압균질기(Microfluidizer)를 사용하여 600 bar 압력에서 3회 반복 처리하고 나노 에멀젼을 수득하였다.
구분 성분명 함량(중량 %)
비교예 5
유상부 소르비탄 스테아레이트 1.00
폴리소르베이트 3.00
스쿠알란 12.00
제니스테인 0.50
수상부 글리세린 6.00
카보머 0.30
정제수 to 100
중화제부 정제수 1.00
트리에탄올아민 0.30
기타 향 0.05
방부제 0.30
비교예 6 : 유기 용매를 사용한 박막 리포좀 제조
미국 특허 제4761288호의 실시예 1에 제시된 방법에 의하여 하기 표 5의 조성에 따라 제조하였다. 다만, 비교시험을 위하여 상기 특허에서 제시된 유효성분인 미녹시딜(Minoxidil) 대신에, 본 발명에서는 지표물질로 사용하기 위한 제니스테인을 유효성분으로 사용하였다.
성분명 함 량
비교예 6
디-알파 디팔미토일 포스파티딜콜린 400 mg
콜레스테롤 200 mg
제니스테인 50 mg
에탄올 1.0 ml
프로필렌 글리콜 0.7 ml
칼슘 클로라이드 8.3 ml
비교예 7 : 일반 다중층 리포좀 제조
일반 유화기를 이용한 다중층 리포좀의 제조로서 대한민국 특허 제0461458호의 실시예 1에 제시된 방법으로 하기 표 6의 조성에 따라 제조하였으며, 본 발명에서 지표물질로 사용하기 위하여 제니스테인을 첨가하였다.
구분 성분명 함량(중량 %)
비교예 7
유상부 스쿠알란 3.00
세라마이드 1.00
식물성스테롤 2.00
동백오일 5.00
스테아르산 1.00
에탄올 10.00
레시틴 2.50
토코페롤 아세테이트 0.30
제니스테인 0.05
수상부 아데노신 0.04
정제수 to 100
첨가제 내츄로틱스(천연방부제) 적당량
잔탄검 적당량
식물성폴리페놀 적당량
솔비톨 적당량
시험예 1 : 입자분석기에 의한 입자크기의 측정
상기 실시예 1-3 및 비교예 1-7에서 제조한 리포좀, 에멀젼 및 베시클에 대하여 입자측정기(Particle size analyser, Model 370 Nicomp, 미국)를 이용하여 크기를 결정하였다. 상기 입자측정기로 각각 3회씩 유화 입자의 크기를 측정한 다음 그 결과의 평균치와 600X 배율의 현미경 하에서 관찰된 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 또한, 상기 실시예 1-3의 이중 유화 베시클을 전자현미경(Zeiss CEM 902, Zeiss)으로 관찰하였고, 이 중 대표적으로 실시예 2의 이중 유화 베시클의 전자현미경 사진을 하기 도 1에 나타내었다.
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2
입자크기분포 800-2000 800-2000 800-2000 40-150 40-150
평균입자 크기(nm) 1300 1200 1300 90 80
성상 이중유화베시클 이중유화베시클 이중유화베시클 단일막 나노리포좀 단일막 나노리포좀
구분 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7
입자크기분포 40-150 40-200 80-250 1500-17000 200-1500
평균입자 크기(nm) 80 110 140 4500 800
성상 단일막 나노리포좀 이중막 나노리포좀 일반 나노에멀젼 다중층리포좀 다중층리포좀
상기한 표 7에서 볼 수 있듯이, 비교예 1-3은 80-90 nm 크기의 단일막 나노리포좀을 생성하였고, 비교예 4는 110 nm 크기의 이중막 나노리포좀을 생성하였으며, 비교예 5는 140 nm 크기의 나노에멀젼을 생성하였고, 비교예 6-7은 800-4500 nm 크기의 다중층 리포좀을 생성하였다. 한편, 본 발명의 방법에 따라 실시예 1-3 으로부터 제조한 이중 유화 베시클의 입자의 분포는 800-2000 nm로 일정하게 나타났고, 입자 크기 분포가 비교적 좁게 나타났으며, 평균크기는 각각 1300, 1200 및 1300 nm로 비교적 일정한 평균 입자크기를 나타내었다. 또한, 전자현미경 관찰 결과, 실시예 2에서 제조된 제형은, 다중층 리포좀으로 단일막 나노리포좀을 포집한 이중 유화 베시클임을 확인할 수 있었다.
시험예 2 : 리포좀 및 베시클의 안정성 및 역가시험
상기의 실시예 1-3 및 비교예 1-7에서 제조한 리포좀 및 베시클의 안정성을 확인하기 위하여 상대습도 70± 5%, 온도 25℃에서 제조 직후, 1개월, 6개월 및 1년 경과 후 입자측정기를 이용하여 입자크기를 측정하였다(표 8). 또한, 시간의 경과에 따른 활성성분의 역가를 분석하기 위하여 고성능액체크로마토그래피 (HPLC)(Summit P530 pump, Dionex)를 이용하여 함량을 분석하였고, 광학현미경(ECLIPSE TS100F, NIKON)을 이용하여 석출되는 현상을 관찰하였으며, 그 결과는 하기 표 9에 정리되어 있다.
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2
제조 직후 1300 1200 1300 90 80
1개월 후 1320 1200 1300 93 81
6개월 후 1362 1284 1310 104 117
1년 후 1438 1325 1360 135 143
구분 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7
제조 직후 80 110 140 4500 800
1개월 후 84 126 173 4500 830
6개월 후 98 131 206 4570 830
1년 후 164 137 534 6250 890
상기 표 8에서 표에 기재되어 있는 숫자는 입자의 크기를 나타내며, 단위는 nm이다.
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 비교예 2
함량 석출 함량 석출 함량 석출 함량 석출 함량 석출
제조 직후 99.8 - 99.9 - 99.9 - 99.9 - 99.8 -
1개월 후 99.4 - 99.7 - 99.8 - 99.2 - 99.5 -
6개월 후 98.9 - 99.4 - 99.8 - 97.8 - 99.2 -
1년 후 98.9 - 99.3 - 99.5 - 82.6 O 85.3 O
구분 비교예 3 비교예 4 비교예 5 비교예 6 비교예 7
함량 석출 함량 석출 함량 석출 함량 석출 함량 석출
제조 직후 99.9 - 96.1 - 99.5 - 98.8 - 99.7 -
1개월 후 98.8 - 83.6 O 72.3 O 88.5 O 99.3 -
6개월 후 84.3 O 78.4 O 60.2 O 82.3 O 99.2 -
1년 후 80.5 O 73.3 O 54.3 O 65.8 O 83.6 O
상기 표 9에서, 표에 있는 숫자는 역가를 나타내며, 단위는 상대적인 퍼센트를 나타낸다.
상기 표 8의 안정성 시험 결과에서 확인되는 바와 같이, 비교예 1-5에서 제조한 나노 리포좀은 6개월 이후부터 크기가 커져서 1년이 경과한 후에는 약 2배 정도 커짐을 확인하였다. 또한, 비교예 6에서 제조한 유기용매를 이용한 다중층 리포좀도 6개월 이후부터 크기가 증가하여 1년 후에는 제조 직후의 크기에 비해 약 50% 증가하였다. 반면, 대한민국 특허 제0461458호에 제시된 방법에 따라 제조한 비교예 7의 다중층 리포좀과 실시예 1-3에서 제조한 이중 유화 베시클은 열역학적으로 안정하여 제조 후 6개월 동안 크기의 변화가 거의 없었으며 1년 경과 후에도 입자크기가 안정하게 유지되고 있음을 확인하였다. 따라서, 크기의 안정성 시험에서는 실시예 1-3의 이중 유화 베시클과 비교예 7의 다중층 리포좀이 우수하다는 것을 알 수 있었다.
한편, 상기의 표 9의 결과로부터 비교예 1 및 2에서 제조한 단일막 나노 리포좀은 1년 이후, 비교예 3에서 제조한 단일막 나노 리포좀은 6개월 이후 함량이 90% 이하로 감소하여 석출되었고, 비교예 4의 이중막 나노 리포좀은 6개월 이후, 비교예 5의 일반 나노 에멀젼은 1개월 이후 80% 이하로 감소하여 석출됨을 확인하였다. 또한, 비교예 6에서 제조한 다중층 리포좀도 6개월 이후 역가 함량이 약 80%로 감소하여 1년 경과 후에는 약 65%로 감소함을 확인하였다. 반면, 실시예 1-3에서 제조한 이중 유화 베시클과 비교예 7에서 제조한 다중층 리포좀은 6개월 이후 함량의 변화가 비교적 적어서 역가 함량이 약 99%를 유지함을 알 수 있었다. 그러나, 비교예 7의 다중층 리포좀의 경우 1년 경과 후 약 80%로 감소하여 석출됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 입자의 안정화도와 활성성분의 역가함량의 결과로 알 수 있듯이, 실시예 1-3, 보다 상세하게는 실시예 2의 이중 유화 베시클이 경시적인 크기 안정성 및 구조적 안정성이 가장 우수함을 확인하였다.
시험예 3 : 경피흡수 시험
상기 실시예 2, 비교예 2 및 비교예 7의 제형을 이용하여 경피흡수 정도를 시험하였다. 경피흡수는 털을 제거한 기니아 피그(Jackson Laboratories, Inc.) 피부를 대상으로 프란츠 투과셀(PermeGear, Inc.)을 이용하여 측정하였다. 시험 직전 털을 제거한 기니아 피그의 복부 부분의 피부를 채취하여 1 ㎠의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 0.9 ㎝인 투과셀에 장착하고 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽면(donor 용기)은 상기 실시예 2, 비교예 2 및 비교예 7의 리포좀 및 이중 유화 베시클을 0.5 ml 넣어주었다. 반대쪽 면(receptor 용기)은 정제수와 에탄올이 4:1 중량비로 혼합된 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험 시 온도는 실제피부 온도인 32℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 다음 피부를 통과한 제니스테인의 양을 측정하여, 도포 농도 당 피부흡수량(㎍/㎠/중량％)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 이때, 제니스테인의 정량 분석은 가스 크로마토그래피 방법과 고속 액체 크로마토그래피 방법으로 수행하였으며, 그 조건은 각각 다음과 같다:
[가스 크로마토그래피 방법]
주입기 : 스플릿 비율 1:50
검출기 : FID(Flame Ionization Detector)
컬 럼 : 30m DBWAX 0.25mm LD
컬럼 압력 : 10 psi
주입기 온도 : 250℃
검출기 온도 : 250℃
오븐 온도 프로그램
시작 : 200℃
가열 속도 : 4℃/분, 250℃ 까지
[고속 액체 크로마토그래피 방법]
기기: Dionex P530 pump, ASI-100 automated sample injector
컬럼 : Phenomenex Luna 5u (C18(2)), 150 x 4.6 mm
이동상: 10 mM KH2PO4 : water = 92 : 8 (0-6.5 min) - 40 : 60 (7.5-12 min) - 92 : 8 (12.5-15 min) gradient system
유속 : 0.6 ml/min
검출기 : UV/Vis Detector UVD 340S 260 nm
주입 부피:10 μl
가동시간: 25 min
구 분 시료 경과시간(hour) 평균 (제니스테인의 경피흡수량(㎍/㎠))
실험군 1 실험군 2 실험군 3
0h 4h 8h 12h 0h 4h 8h 12h 0h 4h 8h 12h 0h 4h 8h 12h
경 피 잔 류 실시예 2 0 78 187 194 0 79 175 196 0 83 184 207 0 80 182 199
비교예 2 0 12 31 46 0 16 28 43 0 13 32 51 0 13.7 30.3 46.7
비교예 7 0 82 173 186 0 76 169 184 0 85 178 191 0 81 173.3 187
상기 표 10의 결과로부터 확인할 수 있듯이, 비교예 2에서 제조한 나노 리포좀은 피부내로 제니스테인을 거의 통과시키지 못하였고, 비교예 7에서 제조한 다중층 리포좀은 비교예 2의 나노 리포좀보다 시간 의존적으로 다량의 제니스테인을 투과시켰다. 반면, 본 발명에서 제조된 실시예 2의 이중 유화 베시클은 비교예 2와 비교예 7에 비하여 높은 투과속도와 투과량을 나타내어 경피흡수에 가장 뛰어난 제형임을 확인할 수 있었다.
시혐예 4 : 인체 안정성 시험
사람을 상대로 한 자극시험으로서 첩포 시험(patch test)을 수행하여 자극유무를 판단하여, 자극이 있으면 어느 정도이며, 다른 진정성분으로 완화 가능한지를 점검하였다. 시험은 임상 전문기관인 더마프로㈜에서 수행하였으며, 최소 30명의 인원이 시험에 참가하였다. 첩포 부위는 사람의 상등부(정중선의 부분은 제외) 또는 전완부와 같은 인체사용 시험을 평가하기에 적정한 부위를 폐쇄 첩포하였다. 원칙적으로 첩포 48시간 후에 팻취를 제거하고 제거에 의한 일과성의 홍반의 소실을 기다린 후 관측하여 판정하였으며, 판정은 피부과 전문의 5년 이상 동종업계의 전문 종사자의 책임 하에 이루어졌다.
구체적으로, 첩포시험은 하기의 방법에 따라 진행하였다. 30명의 피험자를 대상으로, 사람의 정상피부(등 또는 전박부)에 핀 챔버(Finn Chamber, 직경 5 mm, Epitest Ltd, 핀란드)를 사용하여 첩포 시험을 수행하였다. 핀 챔버에 시료로 상기 실시예 2, 비교예 2 및 비교예 7을 소량 넣은 뒤 피부에 스캔포 테이프(Scanpor tape)를 사용하여 붙였다. 첩포를 붙이고 이틀간 붙여둔 후 첩포를 제거하고 30분 후 첩포 부위의 피부상태를 판독하였다. 이틀 후 동일부위를 다시 한번 판독하였다. 판독기준은 하기 표 11의 국제 접촉피부염 연구위원회가 추천한 첩포 시험 결과의 판독기준을 이용하였다. 피험자들에게 첩포 시험 3일 전부터 판독이 완료될 때까지(총 1주일) 일체의 항히스타민제의 복용을 금지하였다. 30명의 피험자를 대상으로 실시한 첩포 시험을 판독하여 IR 반응(자극반응) 및 알레르기성 반응 생성 여부를 확인하였다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
국제 접촉피부염 연구위원회가 추천한 첩포 시험 결과의 판독기준
± 의양성
1+ 약양성(비수포성)
2+ 강양성(수포성)
3+ 초강양성
4+ 자극성
시험물질 처치 후 48 시간 경과 처치 후 72 시간 경과 반응도(n=30)
± 1+ 2+ 3+ 4+ ± 1+ 2+ 3+ 4+ 48시간 72시간 평균
실시예 2 - - - - - - - - - - 0 0 0
비교예 2 1 - - - - - - - - - 0.4 0 0.2
비교예 7 - - - - - - - - - - - - -
상기 표 12의 인체 안정성 시험 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 2의 이중 유화 베시클은 72시간 경과 후에도 피부에 자극을 유발하지 않는 우수한 안전성이 있음을 확인하였다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 최소 두개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀 및 단일막 나노 리포좀을 포함하는 다중-유화 베시클에 관한 것이다. 본 발명의 구성성분인 단일막 나노 리포좀은 다량의 난용성 활성성분을 효율적으로 봉입하고, 다중층 리포좀은 최소 두개의 인지질 이중막 구조를 포함하고 있어, 단일막 나노 리포좀과 다중층 리포좀을 혼합, 유화 즉 다중-유화에 의한 베시클을 제조하여, 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 생리 활성성분을 안정화한다. 또한, 본 발명의 다중-유화 베시클은 입자크기가 800-1500 nm로서 크기가 일정하게 유지되며 구조의 안정성이 우수하여, 다양한 제형에 적용 시 외부환경으로부터 보다 안정하게 생리활성성분을 보호하고, 피부각질 세포간극보다 크기가 커서 세포간극 통과 시 주위세포에 대한 장력의 영향을 받지 않아 진피층까지 투과할 수 있어 생리활성성분의 우수한 경피 흡수 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 다중-유화 베시클은 세포독성 및 피부 부작용이 없어 화장료, 약제학적 및 의약외품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

  1. 다음을 포함하는 다중-유화 베시클:
    (a) 최소 두 개의 인지질 이중막 구조를 포함하는 다중층 리포좀; 및
    (b) 단일막 나노 리포좀;
    상기의 단일막 리포좀은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치한다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 인지질 이중막 구조는 세 개의 이중막을 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 다중층 리포좀은 유상부로서 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 오일, 스테아르산 및 에탄올을 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 다중층 리포좀은 베시클의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 오일 0.1-20.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 다중층 리포좀은 수상부로서 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 베시클은 베시클의 총 중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 수용성 활성성분을 추가적으로 포함하며, 상기 수용성 활성성분은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단일막 나노 리포좀은 유상부로서 단일막 나노 리포좀의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량%, 오일 0.1 내지 20.0중량%, 부틸렌글리콜 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%인 것을 특징으로 하는 베시클.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단일막 나노 리포좀은 수상부로서 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 베시클은 상기 단일막 나노 리포좀의 총중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 난용성 활성성분을 추가적으로 포함하며, 상기 난용성 활성성분은 상기 단일막 나노 리포좀의 내부에 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 베시클.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기의 인지질은 레시틴인 것을 특징으로 하는 베시클.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 다중-유화 베시클의 입자크기는 800-1500 nm 인 것을 특징으로 하는 베시클.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 단일막 나노 리포좀의 입자크기는 50-100 nm 인 것을 특징으로 하는 베시클.
  13. 다음의 단계를 포함하는 다중-유화 베시클의 제조방법:
    (a) 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 스테아르산, 오일, 부틸렌글라이콜 및 에탄올을 혼합하고 가온하여 단일막 나노리포좀의 유상부를 제조하는 단계;
    (b) 폴리올을 물에 용해하여 단일막 나노리포좀의 수상부를 제조하는 단계;
    (c) 상기 (a)의 유상부 및 (b)의 수상부를 혼합하고 1차 유화하는 단계;
    (d) 상기 (c)의 결과물을 균질기를 사용하여 단일막 나노 리포좀을 형성하는 단계;
    (e) 인지질, 콜레스테롤, 세라마이드, 오일, 스테아르산 및 에탄올을 혼합하고 가온하여 다중층 리포좀의 유상부를 제조하는 단계;
    (f) 폴리올을 정제수에 용해하여 다중층 리포좀의 수상부를 제조하는 단계;
    (g) 상기 (e)의 유상부 및 (f)의 수상부를 혼합하고 2차 유화하여 다중층 리포좀을 형성하는 단계; 및
    (h) 상기 (d)의 단일막 나노 리포좀 및 (g)의 다중층 리포좀을 혼합하고 3차 유화하여 다중-유화 베시클을 형성하는 단계.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 (a)단계의 단일막 나노 리포좀의 유상부는 단일막 나노 리포좀의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량%, 오일 0.1 내지 20.0중량%, 부틸렌글리콜 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 (b)단계의 단일막 나노 리포좀의 수상부는 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  16. 제 13 항에 있어서, 상기 (a)단계는 상기 단일막 나노 리포좀의 총중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 난용성 활성성분을 추가적으로 이용하며, 상기 난용성 활성성분은 상기 단일막 나노 리포좀의 내부에 포집되어 있는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 상기 (d)단계의 단일막 나노 리포좀의 입자크기는 50-100 nm 인 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 상기 (e)단계의 다중층 리포좀의 유상부는 베시클의 총 중량에 대하여 인지질 0.1-10.0 중량%, 콜레스테롤 0.1-5.0 중량%, 세라마이드 0.1-3.0 중량%, 오일 0.1-20.0 중량%, 스테아르산 0.1-5.0 중량% 및 에탄올 0.1-5.0 중량%를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  19. 제 13 항에 있어서, 상기 (f)단계의 다중층 리포좀의 수상부는 폴리올 0.1-10.0 중량% 및 물을 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 상기 (f)단계는 베시클의 총 중량에 대하여 0.01-5.0 중량%의 수용성 활성성분을 추가적으로 이용하며, 상기 수용성 활성성분은 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  21. 제 13 항에 있어서, 상기 인지질은 레시틴인 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  22. 제 13 항에 있어서, 상기 (g)단계의 다중층 리포좀은 최소 두 개의 인지질 이중막 구조인 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  23. 제 13 항에 있어서, 상기 (h)단계의 다중-유화 베시클은 상기의 단일막 리포좀이 상기 다중층 리포좀의 이중막 구조 사이 및 다중층 리포좀의 중앙부의 친수성 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 인지질 이중막 구조는 세 개의 이중막을 포함하는 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  25. 제 13 항에 있어서, 상기 (h)단계의 다중-유화 베시클의 입자크기는 800-1500 nm 인 것을 특징으로 하는 베시클의 제조방법.
  26. 상기 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 다중-유화 베시클을 포함하는 화장료조성물.
  27. 상기 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 다중-유화 베시클을 포함하는 약제학적 조성물.
  28. 상기 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 다중-유화 베시클을 포함하는 의약외품 조성물.
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