DE69022590T2

DE69022590T2 - Bacillus thuringiensis Gen, Protein und seine Verwendung.

Info

Publication number: DE69022590T2
Application number: DE69022590T
Authority: DE
Inventors: Robert G Blenk; Susan Ely; Ravindra Haribhai Tailor; Janet Mary Tippett
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1989-05-09
Filing date: 1990-05-08
Publication date: 1996-03-28
Anticipated expiration: 2010-05-09
Also published as: JPH04505250A; US5965797A; EP0474662A1; AU5630390A; BR9007452A; ATE128185T1; DE69022590D1; WO1990013651A1; EP0474662B1; GB8910624D0; ES2081370T3; AU629349B2; US5573766A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bakterielle Gene des Bakteriums Bacillus thuringiensis und Verwendungen dafür.
Der Organismus Bacillus thuringiensis produziert ein Endotoxin-Proteinkristall, das Insektenlarven abtötet. Es ist jedoch für Säugetiere nicht toxisch. Es ist daher sehr nützlich als landwirtschaftliches Insecticid, insbesondere gegen Lepidoptera, Coleoptera und Diptera. Bacillusthuringiensis-Stämme werden seit einer Anzahl von Jahren als landwirtschaftliche Insecticide verwendet.
Bei dem am gründlichsten untersuchten Bacillusthuringiensis-Stamm, der gegen Coleoptera-Schädlinge wirksam ist, handelt es sich um die Bacillus-thuringiensis- Varietät (Var.) tenebrionis, die bei der German Collection of Microorganisms (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) unter der Zugangs-Nr. DSM 2803 hinterlegt ist. Es wurden nun neue Bacillus-thuringiensis-Stämme gefunden, die im allgemeinen ähnliche Eigenschaften wie DSM 2803 haben, aber sich davon durch eine spezifische insecticide Wirkung gegen Coleoptera-Larven der Gattung Diabrotica sowie durch Toxizität für Lepidoptera-Larven unterscheiden. Die neuen Eigenschaften dieser Stämme ergeben sich durch neue Gene, die sie enthalten.
Die neuen Bacillus-thuringiensis-Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 wurden bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter den Zugangs-Nrn. NCIB 40091 bzw. 40090 hinterlegt.
Erfindungsgemäß wird DNA bereitgestellt, die zu der in den Figuren 5 - 10 angegebenen DNA-Sequenz homolog ist und ein neues insecticid wirksames Endotoxin mit einem Molekulargewicht von etwa 81,2 Kilodalton (im folgenden mit "das 81 kD Endotoxin" bezeichnet) kodiert. In einer konkreten Ausführungsform der Erfindung wird eine rekombinierte DNA, die ein Insekten-Endotoxin kodiert, aus Bacillus thuringiensis JHCC 4835 in den E.-coli-Stamm BL21/pJH11 kloniert, der bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter der Zugangs-Nr. 40275 hinterlegt ist.
Die erfindungsgemäße DNA kann Gene unterschiedlicher Länge aufweisen, die insecticid wirksame Proteine kodiert. Bei der Klonierung von DNA aus dem bakteriellen Chromosom ist es zweckmäßig, Bakteriophage-Lamda-Vektoren oder andere Kloniervektoren zu verwenden, welche die rekombinierte DNA für Wirtszellenenzyme maskieren, die homologe Rekombination verursachen könnten.
Außerdem werden neue insecticide Zusammensetzungen bereitgestellt, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie das von der DNA kodierte δ-Endotoxin enthalten sowie ein Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen Insektenbefall, bei dem die Larven der Einwirkung eines derartigen δ-Endotoxins ausgesetzt werden.
Bei den Stämmen JHCC 4835 und JHCC 4353 handelt es sich um Isolierungen aus dem Erdboden von Marshall, Iowa, USA bzw. Dallas, Iowa, USA. Die Koloniemorphologie ist im allgemeinen der von DSM 2803 und der des Stammes HD-1, der für Lepidoptera-Larven insecticid ist, ähnlich.
Die Morphologie der Stämme der Erfindung wird in Tabelle 1 mit der von bekannten Stämmen verglichen.
Die biochemischen Eigenschaften der neuen und der bekannten Stämme werden in den Tabellen 2-4 verglichen. Es ergibt sich, daß viele Ähnlichkeiten zwischen den Stämmen bestehen.
Angesichts dieser biochemischen Ähnlichkeiten ist es überraschend, daß das Gen, welches das 81 kD Endotoxin in E. coli BL21/pJH11 kodiert, eine sehr geringe DNA-Sequenzhomologie zum B.-thuringiensis-Var.-tenebrionis-Endotoxin- Gen von DSM 2803 zeigt. Die Verwendung der kodierenden Sequenz des B.-thuringiensis-Var.-tenebrionis-Endotoxin- Gens als DNA-Sonde unter relativ milden stringenten Bedingungen (3 x Standard-Kochsalz-Citrat bei 37ºC) ist nicht ausreichend, um ein Signal mit den kodierenden Sequenzen dieses Endotoxin-Gens in den Stämmen JHCC 4835 und JHCC 4353 zu erzeugen. Gleichermaßen ist die Verwendung der kodierenden Sequenz für das Lepidoptera-spezifische CryIA(c) (dieses Nomenklatursystem wird von Höfte und Whitely in Microbiol. Reviews, 53, 1989, S. 242 - 255 beschrieben) -Endotoxin-Gen eines Bacillus-thuringiensis- Var.-kurstaki-Stamms nicht ausreichend, um ein DNA-Hybridisierungssignal mit der kodierenden Sequenz für das 81 kD Endotoxin zu erzeugen. Desgleichen erzeugt die Verwendung der neuen genkodierenden Sequenz als DNA-Sonde kein Hybridisierungssignal mit dem Tenebrionis-Gen oder den drei CryIA-Genen.
Die neu gefundenen B.-thuringiensis-Stämme JHCC 4853 und JHCC 4353 zeigen im Vergleich mit DSM 2803 eine signifikant unterschiedliche Spezifität der insecticiden Wirkung.
Insbesondere zeigen 4385 und 4353 eine selektivere Wirkung gegen Käfer als bekannte Coleoptera-wirksame B.- thuringiensis-Stämme, und zwar insofern, als sie spezifisch larvicid für Diabrotica spp. sind. Außerdem sind die Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 larvicid für Lepidoptera-Schädlinge, während der Stamm DSM 2803 dies nicht ist. Auf der molekularen Ebene kodiert das neue gefundene Gen in den Bacillus-thuringiensis-Stärnmen JHCC 4835 und 4353 ein Gen- Produkt, das im Vergleich mit dem Coleoptera-spezifischen Endotoxin-Gen in DSM 2803 oder den Lepidoptera-spezifischen CryIA-Endotoxin-Genen in HD1 und anderen Var.-kurstaki- Stämmen ein signifinkant unterschiedliches insecticides Wirkungsspektrum zeigt.
Das neue Endotoxin-Gen kodiert ein 81,2 Kilodalton Endotoxin, das ein völlig neues Wirkungsspektrum aufweist: es ist sowohl für Lepidoptera- als auch Coleoptera-Larven toxisch. Dies ist besonders überraschend, weil der Bacillus-thuringiensis-Stamm, von dem es stammt, nicht für alle Coleoptera toxisch ist, sondern nur Diabroticaspezifisch ist. Mögliche Erklärungen für diesen Befund könnten sein: eine niedere Konzentration dieses Protein in dem Kristall, den der Mikroorganismus produziert; die Unzugänglichkeit des Proteins in dem Kristall; die Gegenwart des Toxins in dem Kristall als Protoxin, das im Verdauungstrakt bestimmter Insekten nicht in die aktive Form umgewandelt wird; oder andere bisher unerkannte Faktoren.
Die Bacillus-thuringiensis-Stämme können in jeder benötigten Menge hergestellt werden, indem eine von der National Collections of Industrial and Marine Bacteria erhaltene Probe NCIB 40091 oder 40090, unter geeigneten Bedingungen in einem entsprechenden Medium fermentiert wird. Derartige Bedingungen und Medien sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Das Medium wird beispielsweise im allgemeinen eine Stickstoff-Quelle (z.B. Fisch-Protein) und eine Kohlenhydrat-Quelle wie Stärke enthalten. Geeignete Bedingungen sind beispielsweise eine Temperatur im Bereich 15 - 45ºC und ein ungefähr neutraler pH-Wert. Die Fermentation kann ohne weiteres chargenweise durchgeführt werden, üblicherweise über einen Zeitraum von 3 - 5 Tagen.
Die E.-coli-Stämme, welche klonierte erfindungsgemäße Endotoxin-Gene tragen, können hergestellt werden, indem die Zellen auffestem Nährmedium (z.B. L-Agar) bis zur stationären Phase gezüchtet werden, bevor die Zellen von der Oberfläche des Mediums abgekratzt und lyophilisiert werden, und indem das insecticide Material vor dem Auftauen und Auswiegen eingefroren wird.
Die erfindungsgemäßen insecticiden Zusammensetzungen sind aus der Fermetationsbrühe erhältlich, indem beispielsweise durch Zentrifugation oder Filtration konzentriert wird, woraufhin dann jedes erwünschte und geeignete Formulierungsmittel zugegeben wird. Hilfreiche Formulierungsmittel sind beispielsweise grenzflächenaktive Mittel, z.B. Benetzungsmittel, feste Streckmittel, Dispersionsmittel und UV-Stabilisatoren. Falls erwünscht, können feste Formulierungen nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Das Verfahren der Erfindung wird im allgemeinen durchgeführt, indem die Pflanzen, die von Insekten befallen sind, oder gegen dem Befall empfindlich sind, mit den oben beschriebenen insecticiden Zusammensetzungen, die mit einem Verdünnungsmittel wie Wasser verdünnt wurden, behandelt werden (z.B. durch Besprühen). Bei dem insecticiden Mittel handelt es sich um das toxische δ-Endotoxin, und falls erwünscht, kann dieses auf die Pflanzen oder die Insekten, welche diese befallen, unabhängig von den Bakterien, die es produzieren, aufgebracht werden. Die Abtrennung des kristallinen Proteins von dem Bakterium Bacillus thuringiensis oder des klonierten Gen-Produkts von dem Bakterium E. coli ist jedoch im allgemeinen nicht erforderlich.
Eine weitere Methode zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung besteht darin, daß die Pflanze, die empfindlich gegen den Insektenbefall ist, dazu gebracht wird, das δ- Endotoxin in situ zu produzieren. Dies geschieht dadurch, indem ein δ-Endotoxin-Gen vom Stamm NCIB 40090 oder NCIB 40091 mit bekannten Mitteln kloniert und mit einer Promotor-Sequenz (beispielsweise dem CaMV35S-Promotor) versehen wird, der die Expression des Gens in Pflanzen bewirkt, und die Pflanze mit bekannten Verfahren transformiert wird. Geeignete Transformationsverfahren umfassen beispielsweise die Verwendung von Ti-Plasmidvektoren für die durch Agrobacterium hervorgerufene Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen oder direkte DNA-Aufnahme- Methoden wie die Embryo-Mikroinjektion oder die Verwendung von Mikroprojektilen, worauf die Protoplasten regeneriert werden. Um den größten Expressionsgrad des Gens zu erhalten, sollte die Promotor-Sequenz entsprechend ausgewählt und konstruiert werden, und andere Faktoren (beispielsweise die Codon-Verwendung) sollten angepaßt werden, um die Expression in Pflanzen zu maximieren.
Die Coleoptera-Larven, die mit dem Verfahren der Erfindung bekämpft werden, können zu verschiedenen Spezies gehören. Wie oben angegeben, töten die Bacillus-thuringiensis-Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 lediglich Diabrotica, und zwar die in der folgenden Tabelle 5A angegeben eingeschlossen, während das insecticide Produkt des klonierten Gens der Erfindung ebenso andere Coleoptera abtötet. Tabelle 5A Üblicher Name Latainischer Name Westlicher Maiswurzelwurm Südlicher Maiswurzelwurm Nördlicher Maiswurzelwurm Mexikanischer Maiswurzelwurm Gestreifter Gurkenkäfer Westlicher gefleckter Gurkenkäfer Diabrotica virgifera virgifera Diabrotica undecimpunctata howardi Diabrotica barberi Diabrotica virgifera zea Diabrotica balteata Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata
Bei den Lepidoptera-Larven, die mit dem Verfahren der Erfindung bekämpft werden, handelt es sich beispielsweise um die in Tabelle 5B angegebenen. Tabelle 5B Üblicher Name Latainischer Name Tabak-Knospenwurm Maiskolbenwurm Europäischer Maisbohrer Kohlwinder Kohlmotte Herbst-Heerwurm Rüben-Heerwurm Heliothis virescens Heliothis zea Ostrinia nubilalis Trichoplusia ni Plutella xylostella Spodoptera frugiperda Spodoptera exigua
Das Verfahren der Erfindung kann angewendet werden, um eine große Anzahl von Pflanzen zu schützen, die gegen den Befall durch Coleoptera oder Lepidoptera anfällig sind. Konkrete Beispiele für kommerziell wichtige Pflanzen, die durch die Erfindung zu schützen sind, sind Mais (Korn), Tomaten, Kartoffeln, Baumwolle, Tabak und Gurken.
Bei Bacillus thuringiensis JHCC 4835 und 4353 handelt es sich um Var.-kurstaki-Stämme, nämlich in Übereinstimmung mit Tests mit Antikörpern gegen Geißel-Antigene. Bis heute waren die Var.-kurstaki-Stämme nur für ihre insecticide Wirkung auf Lepidoptera-Larven bekannt. Überraschenderweise sind diese Stämme und tatsächlich auch andere Kurstaki- Stämme, die früher von der ICI beschrieben wurden (z.B. der Stamm A20, der bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter der Zugangsnummer NCIB 12570 hinterlegt wurde und Gegenstand unserer europäischen Patentanmeldung EP-A-0 325 037 ist), wirksam gegen Coleoptera- Larven der Gattung Diabrotica, und zwar zusätzlich zu ihrer erwarteten Wirksamkeit gegen Lepidoptera. Außerdem finden sich stark hybridisierende Sequenzen sowohl in chromosomalen als auch Plasmid-DNA-Proben von anderen bekannten Bacillus-thuringiensis-Stämmen, wenn das 81 kD Endotoxin- Gen als Hybridisierungs-Sonde verwendet wird. Diese Stämme umfassen Var.-kurstaki-Stämme wie HD1, HD73 und HD241 und den Var.-kenyae-Stamm HDL23. Abgesehen davon ist das 81 kD Endotoxin-Gen der vorliegenden Erfindung vorher weder beschrieben worden noch wurde erkannt, dar es in diesen oder anderen Bacillus-thuringiensis-Stämmen vorhanden ist.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen klarer, von denen:
Figur 1 schematisch die Ableitung des klonierten 81 kD Endotoxin-Gens in dem rekombinierten Plasmid pJH11 zeigt;
Figur 2 schematisch die Struktur von pJH11 und die Strukturen der Coleoptera-spezifischen Gene vom Tenebrionis-Typ und der Gene vom CryA-6.6-Typ zeigt, die in das gleiche Vektorsystem (PT712) kloniert wurden und mit pIC 226 bzw. pIC 228 bezeichnet werden;
die Figuren 5 - 10 die Basen-Sequenz, die Aminosäure- Sequenz und die Restrictionsendonuclease-Haupterkennungsstellen des 81 kD Endotoxin-Gens zeigen, das pJH11 trägt;
Figur 11 graphisch die Mittelwerte von 12 separaten Bioassays zeigt, mit denen die Wirksamkeit des rekombinierten E.-coli-Stamms MC1022/pIC244 gegen Larven der ersten Erscheinungsform des Westlichen Maiswurzelwurms 4 Tage nach der Behandlung untersucht wurde;
Figur 12 graphisch die Mittelwerte von 12 separaten Bioassays zeigt, mit denen die Wirksamkeit des rekombinierten E.-coli-Stamms MC1022/pIC244 gegen Larven der ersten Erscheinungsform des Westlichen Maiswurzelwurms 5 Tage nach der Behandlung untersucht wurde.
Unter weiterer Bezugnahme auf Figur 1, stellt in dieser schematischen Darstellung, die nicht maßstabsgetreu ist, N die Restriktionsendonuclease NdeI dar, H = HindIII, E = EcoR1, D = DraI und S = SmaI. Die Restriktionsstellen oberhalb der Karten befinden sich in der klonierten DNA, wohingegen die Stellen unterhalb der Karten sich in dem Vektor befinden. Klammern bezeichnen Stellen, die durch "Auffüllen" mit Klenow-DNA-Polymerase funktionsunfähig gemacht wurden. Gestrichelte Linien stellen pUC19-Vektor- DNA dar. Gepunktete Linien stellen PT712-Vektor-DNA im Klon pJH11 dar, und die Pfeilspitze stellt den Bacteriophage-T7- Promotor dar. Der Stern stellt ein ³²P-markiertes DNA- Fragment dar.
In Figur 2 stellen die Zahlen unterhalb der Karten die Anzahl der Basenpaare zwischen der T7-RNA-Polymerase- Transkriptionsstartstelle und dem Beginn des offenen Leserahmens dar. Die große Pfeilspitze stellt den Bacteriophage-T7-Promotor dar. Das schwarze Rechteck in PT7I2 stellt die Klonierstelle dar, H = HindIII und S = SmaI. ApR bezeichnet das Gen, das die Resistenz gegen Ampicillin kodiert.
Die Figuren 5 - 10 zeigen die Basen-Sequenz, die Aminosäure-Sequenz und die Hauptrestriktionsstellen des Gens, welches das 81 kD Endotoxin-Protein kodiert, und flankierende DNA. Der offene Leserahmen beginnt bei der Base 355 und endet bei der Base 2514 mit dein G des Terminations (Ter)-Codons TAG.
Figur 11 ist eine graphische Darstellung des Westlicher- Maiswurzelwurm-Bioassays mit klonierten Endotoxin-Gen- Produkts 4 Tage nach der Behandlung (DAT). Bei den Punkten auf der Kurve handelt es sich um die Mittelwerte der prozentualen Mortalität bei einer bestimmten Konzentration.
Figur 12 ist eine graphische Darstellung des Westlicher- Maiswurzelwurm-Bioassays mit klonierten Endotoxin-Gen-Produkten 5 Tage nach der Behandlung (DAT). Bei den Punkten auf der Kurve handelt es sich um die Mittelwerte der prozentualen Mortalität bei einer bestimmten Konzentration.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.

Beispiel 1

Isolation des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835

Bodenproben wurden verdünnt, indem 5,0 g der Probe in 45 ml 0,5 %iges Pepton gegeben wurden, und zwar unter Erhalt einer 10&supmin;¹-Verdünnung, bevor emulgiert wurde. Die Probe wurde dann 10 min in einem Wasserbad auf 60ºC erhitzt. Vor dem Ausplattieren von 0,1 ml der 10&supmin;³- und 10&supmin;&sup5;-Verdünnungen auf B.-ceresus-selektiven Agarplatten (Bacillus cereus-Agarbasis, Oxoid) und Exsulin-Agarplatten (in g/l H&sub2;O: Esculin 1,0, Eisen(III)-citrat 0,5, Pepton 10, NaCl 5, Oxoid-Agar 10) wurden Verdünnungsreihen hergestellt. Die ausplattierten Proben wurden 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Dann wurden Schnitte von potentiellen B.-thuringiensis- Kolonien angefertigt, gemäß dem Verfahren von Smirnoff gefärbt und mit mikroskopisch bei einer Vergrößerung von 1000 auf die Anwesenheit von gefärbten, parasporalen Kristallen untersucht.
Kristall-positive Kolonien wurden auf L-Agar (10 g Trypton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 10 g Agar pro Liter) ausgestrichen, um eine reine Kultur sicherzustellen, und bei 30ºC inkubiert. Gereinigte Kolonien wurden über Nacht in L- Brühe inkubiert, und nach der Inkubation wurde ein gleicher Volumenteil 80 %iges steriles Glycerol zugegeben, bevor bei -70ºC gelagert wurde.
Der Stamm JHCC 4353 wurde mit einem ähnlichen Verfahren extrahiert.

Beispiel 2

Fortpflanzung der B.-thuringiensis-Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 auf Festmedien

Aus einem Glycerol-Lagerungsgefäß wurde ein Inokulum auf eine L-Agarplatte übertragen, um die Reinheit zu überprüfen. Dann wurde eine repräsentative Anzahl an Kolonien verwendet, um 5 ml Brühe (10 g Trvpton, 10 g Hefeextrakt, 5 g NaCl pro Liter) zu inokulieren, und zwar bevor unter Schütteln 3 - 5 h bei 30ºC inkubiert wurde. 1 ml dieser Kultur wurde dann verwendet, um eine präparative (210 mm x 210 mm) Petrischale zu inokulieren, die 300 ml CRL 1- Medium-Agar enthielt (in g oder ml/Liter Wasser: Nährbrühe 8, Glucose 6, Hefeextrakt 5, Xylose 0,5, Baumwollsamenmehlextrakt 30 ml, Maisquellwasser 3,2 ml, Mary Mendel's Salzgemisch 1 ml, Oxoid-Agar 15). Bei Mary Mendel's Salzgemisch handelt es sich um folgendes:

Mary Mendel's Salze

Destilliertes Wasser 495 ml
HCl, konz. 5 ml
FeSO&sub4; 2,5 g
MnSO&sub4;, H&sub2;O oder MnCl&sub2;.4H&sub2;O 0,98 g
ZnCl&sub2; oder ZnSO&sub4;.4.H&sub2;O 1,76 g
Die Kulturen wurden 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen, Sporen und Kristalle geerntet, indem konfluenter Bewuchs von der Agar-Oberfläche abgekratzt wurde, und zwar vor der Gefriergetrocknung.

Beispiel 3

Fortpflanzung der B. thuringiensis-Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 in Flüssigkultur

Aus einem Glycerol-Lagerungsgefäß wurde ein Inokulum in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen, der 100 ml CRL 1-Medium (in g oder ml/Liter Wasser: Nährbrühe 8, Glucose 6, Hefeextrakt 5, Xylose 0,5, Baumwollsamenmehlextrakt 30 ml, Maisquellwasser 3,2 ml, Mary Mendel's Salzgeinisch 1 ml) enthielt, und unter Schütteln mit 3400 U/min bei 30ºC inkubiert. Nach 24 h wurden die gesamten 100 ml verwendet, um 1 l des gleichen Mediums in einem 2 l-Kolben zu inokulieren. Dieses wurde unter Schütteln 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Dann wurden die Zellen, Sporen und Kristalle durch Zentrifugation geerntet und unter Anwendung des Verfahrens von Dulmage mit Aceton ausgefällt.

Beispiel 4

Formulierung

Nach der Beendigung des Fermentationszyklus können JHCC- 4353- oder JHCC-4835-Bakterien geerntet werden, indem zuerst die B.-thuringiensis-Sporen und -Kristalle wie in Beispiel 2 beschrieben von der Fermentationsbrühe abgetrennt werden. Die gewonnenen Sporen und Kristalle können dann in 100 ml Wasser resuspendiert und zu einem flüssigen Konzentrat formuliert werden, indem 4,9 g Morwet D-425 (Dispersionsmittel), 4,9 g Veegum HV (Suspendiermittel), 4,9 ml Tween 80 (Benetzungsmittel) und 24,4 ml Sorbo (Antigefriermittel) zugegeben werden. Jeder Inhaltsstoff wird separat in der oben angegebenen Reihenfolge zugegeben. Das Produkt wird vor der Verwendung bei 4ºC gehalten.

Beispiel 5

Klonierung von von Plasmiden stammenden Endotoxin-Genen aus dem B.-thuringiensis-Stamm 4835.

Die Endotoxin-Gene wurden aus den aus dem B.-thuringiensis- Stamm 4835 präparierten kovalent geschlossenen Ring (ccc)- Plasmid-DNA wie folgt koniert:
Eine 500 ml Kultur des Stamms 4835 wurde bei 37ºC unter Schütteln bis zu einem Absorptionswert von 1,00 optischen Dichte(O.D)-Einheiten bei 600 nm in Nährbrühe gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation mit 8000 U/min (Upm) bei 4ºC geerntet und dann in 5 ml TE- Puffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM EDTA) resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden zu 95 ml TE-Puffer, der 1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,085 M NaOH, pH 12,4, enthielt, gegeben, und während der Inkubation bei Raumtemperatur kam es zur Lyse der Zell-Suspension. Dann wurden 10 ml 10 %iges SDS zu dem Lysat gegeben, und die Lösung wurde vorsichtig gemischt, bevor allmählich unter vorsichtigem Mischen 10 ml 2 M Tris-HCl, pH 7,0, zugegeben wurden. Dann wurden 34 ml 5 M NaCl zugegeben, und die Lösung wurde gut gemischt, bevor sie über Nacht auf Eis/Wasser inkubiert wurde. Das Lysat wurde dann mit 9000 U/min 15 min bei 4ºC zentrifugiert, und der überstand wurde vorsichtig in ein neues Zentrifugengefäß überführt, bevor 36 ml 50 %iges Polyethylenglycol (PEG) 600 in TE- Puffer zugegeben wurden. Das Lysat wurde auf Eis/Wasser 3 h (Minimum) bis über Nacht inkubiert, bevor 10 min bei 4ºC mit 10 000 U/min zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in 9 ml TE-Puffer und 100 ul 5 mg/ml RNA (vor der Verwendung 5 min bei 100ºC behandelt) gelöst und bei 45ºC 10 min inkubiert, bevor 9,23 g Caesiumchlorid (Cscl) zugegeben wurden. Nach der Auflösung des CSCl wurden 0,9 ml 5 mg/ml Ethidiumbromid zugegeben, bevor das Gemisch bei 15ºC 48 h bei 40 000 Upm isopyknisch zentrifugiert wurde, dann wurde die ccc-DNA-Bande isoliert. Nach der Entfernung von CsCl und Ethidiumbromid mit üblichen Verfahren wurde Plamid-ccc- DNA mit hohem Molekulargewicht (höher als 40 Kilobasenpaare) durch Größenfraktionierung mit 10 % - 40 % Sucrose- Stufen-Gradienten isoliert, bevor mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen (d.h. solchen, die nicht die DNA des Endotoxin-Strukturgens spalten) verdaut wurde. Dann wurde in geeignet verdaute Plasmid-Kloniervektoren (z.B. pUC18 oder pUC19) ligiert und in geeignete E.-coli-Wirtsstämme transformiert (der konkret verwendete Stamm ist MC1022, bei dem es sich um einen Ampicillin-empfindlichen Stamm des Genotyps ara D139, Δ(ara, leu) 7697, Δ(lac Z) M15, gal U, gal K, str A handelt). Die Transformanten, die resistent gegen geeignete Antibiotika sind, welche den eingeführten Plasmidvektor selektieren, wurden dann mit Standard-DNA-Hybridisierungs-Verfahren auf rekombinierte Endotoxin-Gene durchmustert, und zwar unter Verwendung des klonierten Tenebrionis-Gens (plus flankierende Sequenzen) und eines klonierten CRYIA-Gens als Sonden.

Beispiel 6 Klonierung von chromosoinalen Endotoxin-Genen aus dem B.-thuringiensis-Stamm 4835.

Aus chromosomaler DNA, die wie im folgenden beschrieben aus dem Stamm 4835 präpariert wurde, wurden Endotoxin-Gene kloniert:
Eine 500 ml-Kultur des Stamms 4835 wurde in L-Brühe unter Schütteln bei 37ºC bis zu einem Absorptionswert von 1,00 optischen Dichteeinheiten bei 600 nm gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 8000 U/min (Upm), nämlich 10 min bei 4ºC, geerntet und dann in 5 ml TES-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden 30 min bei 37ºC mit Lysozym (0,5 mg/ml Endkonzentration) und RNase (0,1 mg/ml Endkonzentration, aus einer Stammlösung mit 5 mg/ml entnommen, vor der Verwendung 5 min bei 100ºC gekocht). Die Lyse wurde durch die Zugabe von Sarcosyl unter Erhalt einer Endkonzentration von 0,8 % und 60 min Inkubation bei 37ºC in Gegenwart von Pronase (0,5 mg/ml Endkonzentration, aus einer Stammlösung mit 5 mg/ml entnommen, vor der Verwendung 60 min bei 37ºC vorinkubiert) beendet. Das Volumen des Lysats wurde mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM EDTA auf 9,0 ml eingestellt, und zwar vor der Zugabe von 9,2 g Caesiumchlorid (CsCl). Nach der Auflösung des CsCl wurden 1,25 ml einer 5 mg/ml Ethidiumbromid-Lösung zugegeben, bevor das Gemisch bei 15ºC 48 h mit 40 000 Upm isopyknisch zentrifugiert wurde.
Nach der Entfernung von CsCl und Ethidiumbromid mit üblichen Verfahren wurde ein Aliquot gereinigter chromosomaler DNA mit der Restriktionsendonuclease EcoR1-teilverdaut, bevor sie in EcoR1-verdaute Bacteriophage-λ-EMBL4- Vektor-DNA ligiert wurde. Die Ligations-Reaktionsgeinische wurden in lebensfähige Phagen-Teilchen verpackt, und zwar unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits von Amersham International PLC.
Die sich ergebenden rekoinbinierten Phagen-Teilchen wurden durch Züchtung auf dem E.-coli-Wirtsstamm PE392 selektiert, einein P2-Lysogen des Stamms LE392, der den Genotyp hsd R514 (rK&supmin;,MK&spplus;), sup E44, sup F58, lacY1 oder Δ (lac12Y), gal K2, gal T22, met B1, trp R55 aufweist. Rekombinierte Phagen, die ein oder mehrere Endotoxin-Gene enthielten, wurden durch Hybridisierung von lysierten Plaques, die auf einem Doppelsatz Nitrocellulose-Filter fixiert waren, nachgewiesen, und zwar unter Verwendung von radioinarkierten Fragmenten eines CryIA-Endotoxin-Gens und eines 3'-terminalen Fragments des Gens für das 81 kD Protein als Sonden.
Die Plaques, die Endotoxin-Gene enthielten, wurden gereinigt und durch Restriktions-Endonuklease-Kartierungstechniken, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, charakterisiert.
Die chromosomalen Endotoxin-Gene können auch direkt in Plasmidvektoren (z.B. pUC19) kloniert werden. Dazu kann es erforderlich sein, daß das Gen in kleinen Fragmenten kloniert wird, und zwar mittels der auf dem Fachgebiet als "Chromosom-Walking" wohlbekannten Technik. Probleme mit auftretenden Deletionen aufgrund von durch den Wirt hervorgerufenen homologen Rekombination können umgangen werden, indem auf diese Art und Weise kloniert wird, und der gewünschte offene Leseramen rekonstruiert wird, indem das Gen nach der Sequenzierung einer geeigneten Anzahl von überlappenden Gen-Fragmenten stückweise zusammengesetzt wird,

Beispiel 7

Fortpflanzung von insecticid wirksamen E.-coli-Stämmen, die klonierte erfindungsgemäße Endotoxin-Gene enthalten, auf festen Medien.

Ein Inokulum wurde aus einem Glycerol-Lagerungsgefäß auf L- Agar-Petrischalen übertragen, welche zur Selektion des Kloniervektors geeignete Antibiotika enthielten. Die inokulierten Schalen wurden 24 - 72 h inkubiert, um das Auftreten der charakteristischen Koloniemorphologie zu gestatten. Eine Auswahl einzelner Kolonien mit dem richtigen Aussehen (z.B. rauhe Kolonien im Fall des E.-coli- Stamms BL21/pJH11, der das klonierte 81 kD Endotoxin-Gen trägt) wurden verwendet, um ein geringes Volumen L-Brühe [15g Trypton, 7,5 g Hefeextrakt, 7,5 g NaCl pro 1500 ml Gesamtvolumen], die ein Antibiotikum (z.B. Ampicillin) enthielt, das sich zur Selektion des Plasmidvektors eignet, der das klonierte Endotoxin-Gen enthält, zu inokulieren. Die Kulturen wurden bis zu einem Absorptionswert von 0,5 - 0,7 O.D.-Einheiten bei 600 nm gezüchtet. Ein Milliliter (ml) Kultur wurde verwendet, um durch Ausstreichen mit einem Glas-"Ausstreicher" eine präparative (d.h. 245 mm x 245 mm x 20 mm) Petrischale zu inokulieren, die L-Agar [L-Brühe wie oben, mit 16 g Oxoid-Agar, einem geeigneten Antibiotikum und IPTG auf eine Endkonzentration von 120 ug/ml ergänzt] enthielt. Die präparativen Schalen wurden über Nach bei 37ºC inkubiert. Der Bakterienbewuchs wurde unter Verwendung eines Glas-Ausstreichers von den präparativen Platten abgekratzt. Das abgekratzte Produkt, das erforderlichenfalls von mehreren Schalen zusammengegeben wurde, wurde in einen sterilen Kunststoffbehälter überführt und bei -20ºC 2 h gefroren, bevor 16 - 18 h lyophilisiert wurde. Das Material wurde bei -20ºC gelagert. Das getrocknete Produkt wurde vor der Verwendung als insecticides Material in Insekten-Bioassays zu einem einheitlichen Pulver vermahlen.

Beispiel 8

Reinigung des neuen 81,2 Kilodalton Endotoxin-Proteins aus dem rekombinierten E.-coli-Stamm MC1022/pJH11.

Der E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 wurde wie in Beispiel 7 beschrieben auffesten Medien präpariert, aber die abgekratze Zellmasse wurde ohne Lyophilisation bei -20ºC gelagert. Die gefrorenen Zellen wurden auf Eis aufgetaut, bevor sie durch Beschallung unter Verwendung einer Sonde mit einem Durchmesser von 1 cm bei einer Amplitude von 14 Mikron für 9 x 20 s zerstört wurden. Die beschallten Zellen wurden dann bei 9300 x g bei 4ºC zentrifugiert, um unzerstörte Zellen zu entfernen, bevor mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert wurde (100 000 x g, 60 min bei 4ºC), um Membranen zu entfernen. Der Hochgeschwindigkeitsextrakt wurde dann der Ionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Sepharose bei ph 8,0 unterzogen. Die Säule wurde dann mit einem Gradienten von 0 - 500 mM NaCl eluiert, und die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE überprüft. Die Fraktionen, die das 81,2 kD Protein enthielten, wurden zusammengegeben, gegen 10 mM Tris, pH 8,0, dialysiert und einem zweiten FPLC-Ionenaustausch-Chromatographie-Schritt unterzogen, wobei wiederum die gebundenen Proteine mit einem Gradienten von 0 bis 500 mM NaCl eluiert wurden. Die Fraktionen, welche das zum Teil gereinigte 81,2 kD Protein enthielten, wurden identifiziert und zusammengegeben, bevor durch Gelfiltrations-Chromatographie weiter gereinigt wurde. Dieses Verfahren führte zu einem Endotoxin-Protein mit 90 %iger Reinheit, das (mit oder ohne Konzentrationsschritt) in Insekten-Bioassays verwendet werden kann.
Die Beispiele 9 und 10 illustrieren die Wirksamkeit der neuen B.-thuringiensis-Stämme gegen verschiedene Diabrotica spp.

Beispiel 9

Stärke der larviciden Wirkung des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 gegen den Westlichen Maiswurzelwurm (Diabrotica virgifera virgifera).

Von jedem B.-thuringiensis-Stamm wurde ein Gemisch von Sporen und Kristallen hergestellt, indem der Organismus bei 30ºC 5 Tage wie in Beispiel 2 auf 210 mm x 210 mm Petrischalen inkubiert und der konfluente Wuchs von der Agar- Oberfläche abgekratzt und gefriergetrocknet wurde. Für Tests mit Larven der ersten Erscheinungsform des Westlichen Maiswurzelwurms (Diäbrotica virgifera virgifera) wurden gefriergetrocknete Sporen und Kristalle mit sterilem Wasser und einer sterilen Sucrose-Lösung gemischt, und zwar unter Erhalt der in Tabelle 6 in Teilen pro Million Teile (ppm) angegebenen Behandlungskonzentrationen und einer Sucrose- Endkonzentration von 2,5 %. Das solubilisierte Sporen- Kristall-Gemisch (Zubereitung) wurde dann durch 5 min Beschallung in einem Wasserbad-Beschaller homogen dispergiert. Die Zubereitung wurde dann verwirbelt, und 0,075 ml der Lösung wurden auf eine Scheibe mit einem Durchmesser von 1,5 cm, die aus "Teri towels" (Kimberly- Clark-Produkt #34770) ausgeschnitten worden war, aufgebracht. Ein Test bestand aus 5 Teri-towel-Scheiben mit aufgebrachter Zubereitung, die jeweils in eine separate Falcon-Kunststoff-Testschale gegeben wurden, nämlich vor dem Befall mit 5 Larven der ersten Erscheinungsform pro Schale. Die Tests wurden in eine geschlossene Styroporbox mit einem befeuchteten Teri-towel als Feuchtigkeitsquelle gestellt, und die Box wurde in einem bei 25,5 - 27,7ºC (78 - 80ºF) gehaltenen Raum 3 oder mehr Tage nach der Behandlung (DAT) inkubiert, bevor der Bioassay ausgewertet wurde. Die Bedingungen im Inneren der Styroporbox waren 23,3 - 24,5ºC (74 - 76ºF) und 80 % relative Luchtfeuchtigkeit. Die Tests wurden ausgewertet, indem ein Präpariermikroskop verwendet wurde. Die Wirksamkeit dieser Behandlungen bei verschiedenen Konzentrationen (Raten) ist in Tabelle 6 angegeben.

Beispiel 10

Stärke der larviciden Wirkung des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 gegen den Südlichen Maiswurzelwurm (Diabrotica undecimpunctata howardi).

Von jedem B.-thuringiensis-Stamm wurde ein Gemisch von Sporen und Kristallen hergestellt, indem der Organismus bei 30ºC 5 Tage wie in Beispiel 2 auf 210 mm x 210 mm Petrischalen inkubiert und der konfluente Bewuchs von der Agar- Oberfläche abgekratzt und gefriergetrocknet wurde. Die Tests mit dem Südlichen Maiswurzelwurm der ersten Erscheinungsform (Diabrotica undecimpunctata howardi) wurden wie in Beispiel 9 beschrieben vorbereitet, inkubiert und ausgewertet. Die Wirksamkeit dieser Behandlungen bei verschiedenen Konzentrationen (Raten) ist in Tabelle 7 angegeben.

Beispiel 11

Spezifität der insecticiden Wirkung der B.-thuringiensis- Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353.

Ein Gemisch von Sporen und Kristallen wurde hergestellt, indem der Organismus bei 30ºC 5 Tage wie in Beispiel 2 auf 210 mm x 210 mm Petrischalen inkubiert, und der konfluente Bewuchs von der Agar-Oberfläche abgekratzt und gefriergetrocknet wurde. Für Tests mit Larven der ersten Erscheinungsform des Südlichen Maiswurzelwurms (Diabrotica undecimpunctata howardi) wurden gefriergetrocknete Sporen und Kristalle mit einer sterilen 2,5 %igen Sucrose-Lösung gemischt. Für Tests mit Larven der ersten Erscheinungsform des Colorado-Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata) wurden gefriergetrocknete Sporen und Kristalle mit sterilem H&sub2;O gemischt und durch Eintauchen in diese Suspension auf Kartoffelblätter aufgebracht und angeboten. Für Tests mit ausgewachsenen Baumwollkapselkäfern (Anthonomus grandis) wurden gefriergetrocknete Sporen und Kristalle mit sterilem H&sub2;O gemischt und durch Eintauchen in diese Suspension auf Baumwollekeimblätter aufgebracht und angeboten. Die Wirksamkeit dieser Präparationen bei verschiedenen Konzentrationen in Teilen pro Million Teile (ppm) ist in Tabelle 8 angegeben. Der Vergleich des Wirkungsspektrums der B.- thuringiensis-Varietät tenebrionis (DSM 2803) mit dem der Stämme JHCC 4835 und JHCC 4353 zeigt die selektivere Wirkung der letzten beiden Stämme (Tabelle 8).
Die Wirksamkeit des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 bei der Bekämpfung von verschiedenen Lepidoptera-Larven wird in den Beispielen 12 - 15 illustriert.

Beispiel 12

Wirksamkeit des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 bei der Bekämpfung von verschiedenen Lepidoptera-Larven.

Ein wie in Beispiel 2 beschrieben hergestelltes Gemisch von Sporen und Kristallen wurde mit einer geeigneten üblichen künstlichen Insektennahrung gemischt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 9 angegeben. Der Vergleich der Wirksamkeit der B.-thuringiensis-Varietät Tenebrionis (DSM 2803) mit der des Stamms JHCC 4835 zeigt, daß lediglich der Stamm 4835 und der bekannte Var.-kurstaki-Stamm JHCC 4360 insecticid für Lepidoptera-Larven sind (Tabelle 9).

Beispiel 13

Wirksamkeit des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 bei der Bekämpfung des Herbst-Heerwurms (Spodoptera frugiperda).

Ein wie in Beispiel 2 hergestelltes Gemisch von Sporen und Kristallen wurde mit einer geeigneten üblichen künstlichen Insektennahrung gemischt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 10 angegeben. Der Vergleich der Wirksamkeit des B.- thuringiensis-Stamms JHCC 4580 (ein Isolat, das der Var. Tenebrionis sehr ähnlich ist) mit der des Stamms JHCC 4835 zeigt, daß lediglich der Stamm 4835 und der bekannte Kurstaki-Stamm JHCC 4360 insecticid für S. frugiperda sind (Tabelle 10).

Beispiel 14

Wirksamkeit des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4835 bei der Bekämpfung des Rüben-Heerwurms (Spodoptera exigua).

Ein wie in Beispiel 2 hergestelltes Gemisch von Sporen und Kristallen wurde mit einer geeigneten üblichen künstlichen Insektennahrung gemischt. Der Vergleich der Wirksamkeit des B.-thuringiensis-Stamms JHCC 4580 (ein Isolat, das der Var. Tenebrionis sehr ähnlich ist) mit der des Stamms JHCC 4835 zeigt, daß lediglich der Stamm 4835 und der bekannte Kurstaki-Stamm JHCC 4360 insecticid für S. exigua sind.

Beispiel 15

Wirksamkeit der Bacillus-thuringiensis-Stämme JHCC 4835 und 4353 bei der Bekämpfung von Heliothis viriscens.

Ein wie in Beispiel 2 hergestelltes Gemisch von Sporen und Kristallen wurde mit einer geeigneten üblichen künstlichen Insektennahrung gemischt. Die erzielte Larvenbekämpfung ist in der folgenden Tabelle 12 angegeben.
Die Wirksamkeit und das neue larvicide Wirkungsspektrum von rekombinierten E.-coli-Zellen, die das klonierte Endotoxin- Gen enthalten, welches das 81,2 kD-Protein kodiert, sind in den Beispielen 16 - 18 illustriert.

Beispiel 16

Stärke der larviciden Wirkung des 81 kD Endotoxins, das von dem rekombinierten E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 exprimiert wird, bei der Bekämpfung des Europäischen Maisbohrers (Ostrinia nubilalis).

Der E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 wurde wie in Beispiel 7 beschrieben auffesten Medien präpariert. Die gefriergetrockneten Zellen wurden aufgetaut und mit einer geeigneten üblichen künstlichen Insektennahrung gemischt, und zwar unter Erhalt der in Tabelle 13 angegebenen Behandlungsendkonzentration in Teilen pro Million Teile (ppm). Die Tests wurden von Larven der ersten Erscheinungsform des Europäischen Maisbohrers befallen gelassen und 6 Tage nach der Behandlung (DAT) ausgewertet. Die das rekombinierte Plasmid mit dem 81 kD Endotoxin-Gen (pJH11) enthaltenden E.-coli-Stämme und die, welche das Lepidoptera-spezifische Gen vom Typ CryIA 6.6 (pIC228) enthielten, waren insecticid, wohingegen diejenigen, die lediglich den Vektor (PT712) oder das Gen vom Tenebrionis- Typ (pIC226) enthielten, es nicht waren.

Beispiel 17

Stärke der larviciden Wirkung des 81 kD Endotoxins, das von dem rekombinierten E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 exprimiert wird, bei der Bekämpfung des Colorado-Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata).

Der E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 wurde wie in Beispiel 7 beschrieben auffesten Medien präpariert. Die gefriergetrockneten Zellen wurden aufgetaut, mit sterilein H&sub2;O gemischt und für die Tests mit den Larven der ersten Erscheinungsform des Colorado-Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata) unter Erhalt der in Tabelle 14 angegebenen Behandlungsendkonzentration in Teilen pro Million Teile (ppm) durch Eintauchen in diese Suspension auf Kartoffelblätter aufgebracht und angeboten. Die E.-coli-Stämme, die das rekombinierte Plasmid mit dem 81 kD Endotoxin-Gen (pJH11) enthielten und diejenigen, die das Gen vom Tenebrionis-Typ (pIC226) enthielten, waren insecticid, wohingegen diejenigen, die lediglich den Vektor (PT712) oder das Lepidoptera-spezifische Gen vom Typ CryIA 6.6 (pIC228) enthielten, es nicht waren.

Beispiel 18

Stärke der larviciden Wirkung des 81 kD Endotoxins, das von dem rekombinierten E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 exprimiert wird, bei der Bekämpfung des Westlichen Maiswurzelwurms (Diabrotica virgifera virgifera).

Der E.-coli-Stamm MC1022/pJH11 wurde wie in Beispiel 7 beschrieben auffesten Medien präpariert. Für die Tests mit Larven der ersten Erscheinungsform des Westlichen Maiswurzelwurms (Diabrotica virgifera virgifera) wurden gefriergetrocknete Zellen aufgetaut und mit sterilem Wasser und einer sterilen Sucrose-Lösung unter Erhalt der angegebenen Behandlungskonzentrationen und einer Sucrose- Endkonzentration von 2,5 % gemischt. Das solubilisierte Zell (Zubereitungs)-Gemisch wurde durch 5 min Beschallen in einem Wasserbad-Beschaller homogen dispergiert. Die Zubereitung wurde dann verwirbelt, und 0,075 ml der Lösung wurden auf eine Scheibe mit einem Durchmesser von 1,5 cm, die aus "Teri towels" (Kimberly-Clark-Produkt #34770) wie in Beispiel 9 beschrieben ausgeschnitten worden war, aufgebracht, und zwar unter Erhalt der in den Tabellen 15 und 16 angegebenen Behandlungsendkonzentration in Teilen pro Million Teile (ppm). Diese Tests wurden nach 4 und 5 DAT abgelesen, und die Ergebnisse wurden der statistischen Analyse unterzogen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 11 und 12 graphisch dargestellt und zeigen, daß E.-coli- Stämme, die das rekombinierte Plasmid mit dem 81 kD- Endotoxin-Gen (pJH11) tragen und diejenigen, die das Gen vom Tenebrionis-Typ (pIC226) tragen, insecticid waren, wohingegen diejenigen, die lediglich den Vektor (PT712) oder das Lepidoptera-spezifische Gen vom Typ CryIA 6.6 (pIC228) trugen, es nicht waren. Die Wirksamkeitsunterschiede zwischen diesen beiden Gruppen von Stämmen (pJH11 und pIC226, den Vektoren PT712 und pIC228 gegenübergestellt) sind statistisch sifnifikant.
Die Wirksamkeit und das neue larvicide Wirkungsspektrum des teilweise gereinigten und gereinigten neuen 81,2 kD Endotoxin-Proteins wird in den Beispielen 19 - 21 illustriert.

Beispiel 19

Stärke der larviciden Wirkung des teilweise gereinigten und gereinigten 81 kD Endotoxins bei der Bekämpfung des Europäischen Maisbohrers (Ostrinia nubilalis).

Das teilweise gereinigte und gereinigte 81 kD Endotoxin- Protein wurde wie in Beispiel 8 beschrieben aus gefriergetrockneten rekombinierten E.-coli-Zellen MC1022/pJH11 hergestellt. Die Fraktionen von der zweiten FPLC-Ionenaustauschsäule wurden mit MonoQ A, B und C bezeichnet und enthielten etwa 50 %, 50 % bzw. 25 % des 81,2 kD Endotoxin-Proteins. Diese Fraktionen wurden unter Erhalt der in Tabelle 19 angegebenen Behandlungskonzentrationen in ppm zu üblicher künstlicher Insektennahrung gegeben, nämlich in Bioassays, um die insecticide Wirkung auf Larven der ersten Erscheinungsform des Europäischen Maisbohrers (Ostrinia nubilalis) zu testen. Die Ergebnisse in Tabelle 19 zeigen, daß alle Fraktionen wirksam waren, und zwar führten Sie entweder zur Abtötung oder zur Wachstumshemmung der Larven. Das gereinigte 81,2 kD Protein wurde ebenfalls getestet und erwies sich als insecticid gegen Larven des Europäischen Maisbohrers und hemmte das Wachstum der Larven (Tabelle 20).

Beispiel 20

Stärke der larviciden Wirkung des teilweise gereinigten und gereinigten 81 kD Endotoxins bei der Bekämpfung des Colorado-Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata).

Das teilweise gereinigte und gereinigte 81,2 kD Endotoxin- Protein wurde wie in Beispiel 8 beschrieben aus gefriergetrockneten rekombinierten E.-coli-Zellen MC1022/pJH11 hergestellt. Die Fraktionen von der zweiten FPLC-Ionenaustauschsäule wurden mit MonoQ A, B und C bezeichnet und enthielten etwa 50 %, 50 % bzw. 25 % des 81,2 kD Endotoxin- Proteins. Diese Fraktionen und das gereinigte 81,2 kD Protein wurden mit sterilem H&sub2;O gemischt und für die Tests mit Larven der ersten Erscheinungsform des Colorado-Kartoffelkäfers (Leptinotarsa decemlineata) unter Erhalt der in Tabelle 21 angegebenen Behandlungsendkonzentration in Teilen pro Million Teile (ppm) durch Eintauchen in diese Suspension auf Kartoffelblätter aufgebracht und angeboten. Die Ergenisse in Tabelle 21 zeigen, daß alle Fraktionen insecticid für Larven des Colorado-Kartoffelkäfers waren.

Beispiel 21

Stärke der larviciden Wirkung des teilweise gereinigten und gereinigten 81 kD Endotoxins bei der Bekämpfung des Westlichen Maiswurzelwurms (Diabrotica virgifera virgifera).

Das teilweise gereinigte und gereinigt neue 81 kD Endotoxin-Protein wurde wie in Beispiel 8 beschrieben aus gefriergetrockneten rekombinierten E.-coli-Zellen MC1022/pJH11 hergestellt. Die Fraktionen von der zweiten FPLC-Ionenaustauschsäule wurden mit MonoQ A, B und C bezeichnet und enthielten etwa 50 %, 50 % bzw. 25 % des 81,2 kD Endotoxin-Proteins. Diese Fraktionen und das gereinigte 81,2 kD-Protein wurden unter Erhalt der in Tabelle 22 angegebenen Behandlungskonzentrationen und einer Sucrose-Endkonzentration von 2,5 % mit sterilem Wasser und einer sterilen Sucrose-Lösung gemischt. Die Tests mit den Larven der ersten Erscheinungsform des Westlichen Maiswurzelwurms wurden wie in Beispiel 18 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle 22 zeigen, daß das 81,2 kD-Endotoxin insecticid für Larven des Westlichen Maiswurzelwurms ist.
Die folgenden Mikroorganismen und Klone, auf die in dieser Beschreibung Bezug genommen wurde, sind bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria, 23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Schottland hinterlegt: Name Hinterlegungs-Nr. Datum Bacillus thuringiensis: E. coli: Oktober Dezember April Es folgen nun die Tabellen, auf die in den Beispielen Bezug genommen wurde. Tabelle 1 - Morphologie Stamm Kristalle Zell-Morphologie Kolonie Morphologie (Kultivert auf Bacillus-Cereus-selectiven Agar) Mittelgroß Bipyramiden und Kristalle mit undefinierter Form. Kleine unregelmäßige Kristalle; wenige bipryramidale Kristalle. Große, hauptsächlich regelmäßige biprymadidale Kristalle. Stäbchen mit terminalen Sporen, welch die Zelle nicht aufblähen. Stäbchen mit ovalen terminalen oder subterminalen Sporen, welch die Zelle nicht aufblähen. Große Kolonien, gelbe Zentren. Eidotter-Lecithinase: NEGATIV Große Kolonien, blaue Zentren. Eidotter-Lecithinase: NEGATIV Große blaue Kolonien mit gelben Zentren. Eidotter-Lecithinase: POSITIV Tabelle 1- Morpholigie (Fortsetzung) Stamm Kristalle Zell-Morphologie Kolonie-Morpholigie (Kultivert auf Bacillus-Cereus-selectiven Agar) Große, hauptsächlich regelmäßige bipyramidale Kristalle. Stäßchen mit ovalen terminalen oder subterminalen Sporen, welch die Zelle nicht auflähen. Große blaueKolonien mit gelben Zentren. Eidotter-Lecithinase: POSITIV Tabelle 2 Biochemische Marker auf der Mikrotiter-Platte Reagenz Glycerol Erythritol D-Arabinose L-Arabinose Ribose D-Xylose L-Xylose Adonitol β-Metliylxylosid Galactose D-Glucose D-Fructose D-Mannose L-Sorbose Rhamnose Dulcitol Inositol Mannitol Sorbitol α-Methyl-D-mannosid α-Methyl-D-glucosid Tabelle 2 (Fortsetzung) Reagenz N-Acetylglucosamin Amygdalin Arbutin Esculin Salicin Cellobiose Maltose Lactose Melibiose Saccharose Trehalose Inulin Melezitose D-Raffinose Amidon Glycogen Xylitol β-Gentiobiose D-Turanose D-Lyxose D-Tagatose Tabelle 2 (Fortsetzung) Reagenz D-Fucose L-Fucose D-Arabitol L-Arabitol Gluconat 2-Ceto-gluconat 5-Ceto-gluconat Orthonitrophenyl-Galactosid (ONPG) Arginin (ADC-Arginin-Dihydrolase) Lysin (LDH-Lysin-Decarboxylase) Natriumcitrat (Citrat-Verwertung) Natriumthiosulfat (H&sub2;S-Bildung) Harnstoff (Urease) Tryptophan (Deaminase-Nachweis) Tabelle 2 (Fortsetzung) Reagenz Tryptophan (Indol-Bildung) Natriumpyruvat (VP) Gelatine (Gelatinase) NO&sub3;-NO&sub2;-Reduktion Ornithin-Decarboxylase (ODC) + = Positive Reaktion - = Negative Reaktion +/- = Schwache Reaktion Tabelle 3 Biochemische Marker auf ID-IDENT-Platten Reagenz 2-Naphthylphosphat 2-Naphthylbuyrat 2-Naphthylcaprylat 2-Naphthylmyristat L-Leucyl-2-naphthylamid L-Valyl-2-naphthylamid L-Cystyl-2-naphtylamid N-Benzoyl-DL-arginin-2-naphthylamid N-Glutaryl-phenylalanin-2-naphthylamin Naphthol-AS-B1-phosphat 6-Brom-2-naphthyl-αD-glactopyranosid 2-Naphthyl-βD-galactopyranosid Naphthol-AS-B1-βD-glucuronid Tabelle 3 (Fortsetzung) Reagenz 2-Naphthyl-αD-glucopyranosid 6-Brom-2-naphthyl-βD-glucopyranosid 1-Naphthyl-N-acetyl-βD-glucosaminid 6-Brom-2-Naphthyl-αD-mannopyranosid 2-Naphthyl-αL-fucopyranosid ID-IDENT ist ein Warenzeichen von API Analytab Products Tabelle 4 Empfindlichkeiten gegen Antibiotika Stamm S = Emplfindlich, R = Resistent, S/R = Reduzierte Empfindlichkeit C = Chloramphenicol 50 ug/ml F = Nitrofuration 200 ug/ml NA = Naladixinsäure 30 ug/ml S = Streptomycin 25 ug/ml TET = Tetracyclin 50 ug/ml VA = Vancomycin 30 ug/ml OA = Oxolinsäure 2 ug/ml CN = Gentamicin 10 ug/ml E = Erythormycin 10 ug/ml CT = Colistinsulfat 10 ug/ml SF = Sulfurazol 500 ug/ml AMP = Amicillin 25 ug/ml CR = Cephaloridin 25 ug/ml K = Kanamycin 30 ug/ml RIF = Rifampicin 2 ug/ml LI = Lincomycin 15 ug/ml CAR = Carbenicillin 100 ug/ml Tabelle 6 Stamm % Mortalität ppm SCRW 3 DAT 6 DAT ppm CPB BW Unbehandelte Kontrolle ppm = Teile pro Million Teile SCRW = Südlicher Maiswurzelwurm CPB = Colorado-Kartoffelkäfer BW = Baumwollkapselkäfer (RF) = % Fraßverringerung Tabelle 7 Exp.-Nr. B. thuringiensis Diabrotica virgifera virgifera % Mortalität 3 Tage nach der Behandlung Test-Larven* Unbehandelte Kontrollen* *25 Larven der ersten Erscheinungsform pro Testgruppe Tabelle 8 Bt-Stamm Südlicher Maiswurzelwurm Baumwollkapselkäfer Colorado-Kartoffelkäfer DAT Tenebrionis Kontrolle Ergebnisse = % Mortalität DAT = Tage nach der Behandlung Tabelle 9 Bt-Stamm Konz.(ppm) H.zea T.ni P.xylostella Kurstaki Tenebrionis-Typ Kontrolle Ergebnisse = % Mortalität 4 Tage nach der Behandlung Tabelle 10 Bt-Stämme gegen Spodoptera frugiperda 6 Tage nach der Behandlung Tenebrionis Kurstaki Kontrolle Präp. Die Ergebnisse sind als % Mortalität bei 80 Teilen pro Million Teile ausgedrückt Tabelle 12 B.t.-Stämme gegen Heliothis zea 6 Tage nach der Behandlung Tenebrionis Kurstaki Präp. Kontrolle 1 = 3,5 % Kontrolle 2 = 2 % Die Ergebnisse sind als % Mortalität bei 80 Teilen pro Million Teile ausgedrückt Tabelle 13 Europäischer-Maisbohrer-Bioassays 1. Experimente Konz./%R.S. Präp.-Nummer Kontrolle Ergebnisse = % Mortalität bei 6 DAT %R.S.= % überlebende mit geringerer Größe Tabelle 14 Colorado-Kartoffelkäfer-Bioassays Probe Konz. Präp.-Nummer Kontrolle Ergebnisse = % Mortalität 3 Tage nach der Behandlung Tabelle 15 Westlicher-Maiswurzelwurm-Bioassay Präp.-Experiment E.Coli Rekombinantes Plasmid Konz. (ppm) pIC226 (gen vom Tenebrionis-Typ) pJH11 (nueses Gen) pIC228 (Cry IA, Lepidopteraspezifiches Gen) Tabelle 15 (Fortsetzung) Präp.-Experiment E.Coli Rekombinantes Plasmid Konz. (ppm) PT712 (nur Vektor) Ergebnisse = % Mortalität 4 Tage nach der behandlung Tabelle 16 Westlicher-Maiswurzelwurm-Bioassay Präp.-Experiment E.Coli Rekombinantes Plasmid Konz. (ppm) pIC226 (Gen vom Tenebrionis-Typ) pJH11 (neues Gen) pIC228 (Cry IA, Lepidpteraspezifisches gen) Tabelle 16 (Fortsetzung) Präp.-Experiment E.Coli Rekombinantes Plasmid Konz. (ppm) PT712 (nur Vektor) Ergebenisse = % Mortalität 5 Tage nach der behandlung Tabelle 17 Europäischer-Maisbohrer-Bioassay 6 Tage nach der Behandlung Nichte behandelte Kontrollen %Mortalität/durchschn. Größe in mm MonoQ-Fractionen B.T. Stamm 4835 Konz. (ppm) Präp Pre Post Durchschn. Größe in mm = Durchschn. Größe der überlebenden Larven Tabelle 17 (Fortsetezung) Europäischer-Maisbohrer-Bioassay 6 tage nach der Behandlung Nichte behandelte Kontrollen (%Mortalität/durchschn. Größe in mm) MonoQ-Fraktionen B.T. Stamm Konz. (ppm) Präp Pre Post Durchschn. Größe in mm = Durchschn. Größe der überlebenden Larven Tabelle 18 81 kD-Protein gegen den Europäischen Maisbohrer IA JH Konz. % Mortalität Durchschn. Größe Präp Prot Ctrl IA = IOWA, JH = JEALOT'S HILL, CTRL = KONTROLLE Durchschn. Größe = Durchschn. Größe der überlebenden Larven Tabelle 19 81 kD Protein gegen den Colorado-Kartoffelkäfer Präp. 1 Mono Q-Fraktionen B.t.Stamm Kontrolle Konz.(ppm): Ergebnisse = % Mortalität 3 Tage nach der Behandlung Tabelle 20 81 kD Protein gegen den Westlichen Maiswurzelwurm Probe Konz. % Mortalität bei:3 DAT 4 DAT 81 kD Protein Tris-Kontrolle Kontrolle (2) DAT = Tage nach der Behandlung

Claims

1. DNA, die homolog zu der in den Figuren 5 - 10 dargestellten DNA-Sequenz ist und ein Protein kodiert, das sowohl für Lepidoptera- als auch Coleoptera-Larven toxisch ist.

2. DNA nach Anspruch 1, die in dem E.-coli-Stamm BL21/pJH11 enthalten ist, der bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria unter der Zugangs-Nr. 40275 hinterlegt ist.

3. Protein, das durch die in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beanspruchte DNA kodiert wird.

4. Insecticide Zusammensetzung, die als wirksamen Inhaltsstoff ein Protein nach Anspruch 3 enthält.

5. Insecticide Zusammensetzung nach Anspruch 4, die außerdem ein festes Streckmittel oder ein grenzflächenaktives Mittel enthält.

6. Verfahren zum Schutz von Pflanzen gegen den Befall mit einpfindlichen Insekten der Ordnungen Coleoptera oder Lepidoptera, bei dem derartige befallende Insekten der Einwirkung eines Proteins nach Anspruch 3 ausgesetzt werden.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Pflanzen vor oder während eines derartigen Befalls mit insecticid wirksamen Mengen einer Formulierung nach einem der Ansprüche 4 oder 5 behandelt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Protein in der Pflanze durch Expression von DNA nach Anspruch 1 produziert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei der Pflanze um Mais (Korn) handelt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei der Pflanze um die Kartoffel, die Tomate, die Baumwolle, den Tabak oder die Gurke handelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei es sich bei dem befallenden Insekt um den Westlichen Maiswurzelwurm, dem Nördlichen Maiswurzelwurm, den Südlichen Maiswurzelwurm, den Europäischen Maisbohrer, den Maiskolbenwurm, den Colorado-Kartoffelkäfer oder den Baumwollkapselkäfer handelt.