DE69530194T2

DE69530194T2 - Chimäre delta-endotoxin exprimierung in pseudomonas fluoreszens

Info

Publication number: DE69530194T2
Application number: DE69530194T
Authority: DE
Inventors: George E Schwab; Mark Thompson
Original assignee: Mycogen Corp
Current assignee: Mycogen Corp
Priority date: 1994-05-06
Filing date: 1995-05-05
Publication date: 2003-11-13
Anticipated expiration: 2015-05-06
Also published as: ATE236253T1; KR970702925A; NZ285524A; AU2465295A; US5527883A; JP3878209B2; KR100376096B1; WO1995030753A1; JPH10500292A; EP0758385B1; ES2194909T3; CA2188795A1; DE69530194D1; AU697148B2; EP0758385A1; US5840554A

Description

Hintergrund der Erfindung

Der Bodenmikroorganismus Bacillus thuringiensis (B.t.) ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das durch parasporale, kristalline Proteineinschlüsse gekennzeichnet ist. Diese Einschlüsse erscheinen häufig im Mikroskop als deutlich geformte Kristalle. Die Proteine können gegenüber Schadorganismen stark toxisch und bezüglich ihrer toxischen Aktivität spezifisch sein. Bestimmte B.t.-Toxin-Gene wurden isoliert und sequenziert. Ferner wurden rekombinante, DNA-basierte B.t.- Produkte hergestellt und zur Anwendung zugelassen. Ferner werden unter Einsatz gentechnischer Maßnahmen neue Wege zur Abgabe dieser B.t.-Endotoxine im landwirtschaftlichen Bereich entwickelt, wozu die Verwendung von Pflanzen gehört, die zur Insektenresistenz gentechnisch mit Endotoxin-Genen manipuliert sind, sowie die Verwendung von stabilisierten, intakten Mikroorganismenzellen als B.t.- Endotoxin-Abgabeträger (F. H. Gaertner, L. Kim, TIBTECH, Bd. 6 (1988), S4-S7). Somit ergibt sich für isolierte B.t.-Endotoxin-Gene ein gewerblicher Nutzen.
Bis vor 10 Jahren war die gewerbliche Nutzung von B.t.-Pestiziden weitgehend auf den engen Bereich der Schmetterlingsschädlinge (Raupen) beschränkt. Präparate von Sporen und Kristallen von B. thuringiensis, Subspezies kurstaki, werden seit vielen Jahren als gewerbliche Insektizide für Schmetterlingsschädlinge verwendet. Beispielsweise liefert B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 ein kristallines ä- Endotoxin, das für die Larven einer Anzahl von Schmetterlingsinsekten toxisch ist.
In den letzten Jahren haben jedoch Forscher B.t.-Pestizide mit Spezifität für einen wesentlich breiteren Bereich von Schädlingen aufgefunden. Beispielsweise werden weitere Spezies von B.t., nämlich israelensis und tenebrionis (a.k.a. B.t. M-7, a.k.a. Bd. san diego) gewerblich zur Bekämpfung von Insekten der Ordnungen Diptera bzw. Coleoptera eingesetzt (F. H. Gaertner, "Cellular Delivery Systems für Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms", in Controlled Delivery of Crop Protection Agents, Hrsg. R. M. Wilkins, Taylor and Francis, New York und London (1990), S. 245-255). Es wird auch auf T. L. Couch (1980), "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis", Developments in Industrial Microbiology, Bd. 22, S. 61-76; C. C. Beegle (1978), "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems", Developments in Industrial Microbiology, Bd. 20, S. 97-104, verwiesen. A. Krieg, A. M. Huger, G. A. Langenbruch und W. Schneller, Z. ang. Ent., Bd. 96 (1983), S. 500-508, beschreiben Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, von dem berichtet wird, dass er gegen zwei Käfer der Ordnung Coleoptera aktiv ist. Es handelt sich um den Colorado-Kartoffelkäfer Leptinotarsa decemlineata und Agelastica alni.
Kürzlich wurden zwei neue Subspezies von B.t. identifiziert, und Gene, die für die Kodierung von aktiven-δ-Endotoxinproteinen verantwortlich sind, wurden isoliert (H. Höfte, H. R. Whiteley, Microbiological Reviews, Bd. 52(2) (1989), S. 242-255). Höfte und Whiteley klassifizierten die B.t.-Kristallproteingene in vier Hauptklassen. Bei den Klassen handelt es sich um CryI (spezifisch für Lepidoptera), CryII (spezifisch für Lepidoptera und Diptera), CryIII (spezifisch für Coleoptera) und CryIV (spezifisch für Diptera). Ferner wurde über die Entdeckung von Stämmen, die für andere Schädlinge eine spezifische Toxizität aufweisen, berichtet (J. S. Feitelson, J. Payne und L. Kim, Bio/Technology, Bd. 10 (1992), S. 271-275).
Die Klonierung und Expression eines B.t.-Kristallproteingens in Escherichia coli wird in der Literatur beschrieben (H. E. Schnepf, H. R. Whiteley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 2893-2897). Das US-Patent 4 448 885 und das US- Patent 4 467 036 beschreiben die Expression von B.t.-Kristallprotein in E. coli. Hybride B.t.-Kristallproteine wurden so konstruiert, dass sie eine erhöhte Toxizität aufweisen und einen erweiterten Wirtsbereich gegenüber einem zu bekämpfenden Schädling aufweisen; vergl. die US-Patente 5 128 130 und 5 055 294. Die US- Patente 4 797 276 und 4 853 331 beschreiben den Stamm B. thuringiensis tenebrionis (a.k.a. M-7, a.k.a. B.t. san diego), der zur Bekämpfung von Coleoptera- Schädlingen in verschiedenen Umgebungen eingesetzt werden kann. Das US-Patent 4 918 006 beschreibt B.t.-Toxine mit Aktivität gegen Diptera. Das US-Patent 4 849 217 beschreibt B.t.-Isolate mit Aktivität gegen den Luzernen-Rüsselkäfer. Das US-Patent 5 208 077 beschreibt gegen Coleoptera aktive Bacillus thuringiensis- Isolate. Das US-Patent 5 151 363 und das US-Patent 4 948 734 beschreiben bestimmte Isolate von B.t., die gegen Nematoden wirken. Als Ergebnis umfangreicher Forschungen und unter Einsatz großer Mittel wurden weitere Patente für neue B.t.-Isolate und neue Anwendungen von B.t.-Isolaten erwirkt. Jedoch stellt das Auffinden von neuen B.t.-Isolaten und neuen Anwendungen bekannter 81- Isolate immer noch ein empirisches Gebiet dar, auf dem keine Vorhersagen getroffen werden können.
Ein Großteil von Bacillus thuringiensis-δ-Endotoxin-Kristallproteinmolekülen ist aus zwei funktionellen Segmenten zusammengesetzt. Das proteaseresistente Kerntoxin stellt das erste Segment dar und entspricht etwa der ersten Hälfte des Proteinmoleküls. Die dreidimensionale Struktur eines Kernsegments von cryIIIA-B.t.- δ-Endotoxin ist bekannt. Es wird angenommen, dass sämtliche verwandten Toxine die gleiche Gesamtstruktur aufweisen (J. Li, J. Carroll, D. J. Ellar, Nature, Bd. 353 (1991), S. 815-821). Die zweite Hälfte des Moleküls stellt das zweite Segment dar. Für die Zwecke dieser Anmeldung wird dieses zweite Segment als "Protoxin- Segment" bezeichnet. Man nimmt an, dass das Protoxin-Segment an der Toxin- Kristallbildung teilnimmt (H. Arvidson, P. E. Dunn, S. Strand, A. I. Aronson, Molecular Microbiology, Bd. 3 (1989), S. 1533-1534; C. T. Choma, W. K. Surewicz, P. R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan, Eur. J. Biochem., Bd. 189 (1990), S. 523-527). Das vollständige 130 kDa-Toxinmolekül wird durch Protease im Verdauungstrakt von Insekten rasch zum resistenten Kernsegment verarbeitet. Das Protoxin-Segment kann somit eine partielle Insektenspezifität für das Toxin durch Beschränkung der Verfügbarkeit des Kerns für das Insekt gewährleisten, indem man die Protease- Verarbeitung des Toxinmoleküls vermindert (M. Z. Haider, B. H. Knowles, D. J. Ellar, Eur. J. Biochem., Bd. 156 (1986), S. 531-540) oder indem man die Toxinlöslichkeit verringert (A. I. Aronson, E. S. Han, W. McGaughey, D. Johnson, Appl. Environ. Microbiol., Bd. 57 (1991), S. 981-986).
Über chimäre Proteine, die innerhalb der Toxindomänen zwischen CryIC und CryIA(b) verbunden sind, wurde berichtet (G. Honee, D. Convents, J. Van Rie, S. Jansens, M. Perferoen, B. Visser, Mol. Microbiol., Bd. 5 (1991), S. 2799-2806). Jedoch war die Aktivität dieser chimären Proteine entweder wesentlich geringer oder nicht nachweisbar, verglichen mit CryIC bei einem einschlägigen Insekt.
Honee et al. (G. Honee, W. Vriezen, B. Visser, Appl. Environ. Microbiol., Bd. 56 (1990), S. 823-825) berichteten ferner über die Herstellung eines chimären Fusionsproteins durch Verknüpfung von Tandem-Toxindomänen von CryIC und CryIA(b). Das erhaltene Protein wies ein erhöhtes Aktivitätsspektrum entsprechend den kombinierten Aktivitäten der einzelnen Toxine auf, jedoch war die Aktivität des chimären Produkts gegenüber keinem der Zielinsekten erhöht.

Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, dass die Expression von Bacillus thuringiensis (B.t.)-δ-Endotoxin in Pseudomonas erheblich verbessert werden kann, indem man das Gen modifiziert, das für das B.t.-Toxin kodiert. Speziell lässt sich die B.t.-Endotoxin-Expression in P. fluorescens verbessern, indem man das Gen so rekonstruiert, dass man das native Protoxin-Kodierungssegment durch ein alternatives Protoxin-Segment ersetzt und dadurch ein chimäres Gen erhält.
In speziellen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung lassen sich chimäre Gene zusammensetzen, be denen ein natives cryIF-Protoxin-Segment durch ein heterologes Protoxin-Segment ersetzt ist. Speziell kann die Gesamtheit oder ein Teil der Protoxin-Kodierungsregion eines cryIA(b)-Gens anstelle der Gesamtheit oder eines Teils der Region, die für das Protoxin eines nativen cryIF- Toxins kodiert, verwendet werden. Gleichermaßen kann ein chimäres Gen konstruiert werden, bei dem die Region, die für die Gesamtheit oder einen Teil des Protoxins eines cryIF-Toxins kodiert, durch eine DNA ersetzt ist, die für die Gesamtheit oder einen Teil des Protoxins eines chimären cryIA(c)/cryIA(b)-Gens kodiert. In einer speziellen Ausführungsform handelt es sich beim chimären cryIA(c)/cryIA(b)-Gen um das Gen mit der Bezeichnung 436, das im US-Patent 5 128 130 beschrieben ist. Dieses Gen lässt sich aus den Plasmid P. fluorescens MR436 erhalten.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung des chimären Gens, das für das beanspruchte Toxin kodiert. Das chimäre Gen kann in eine Vielzahl von mikrobiellen oder Pflanzenwirten eingeführt werden. Ein transformierter Wirt, der das chimäre Gen exprimiert, kann zur Erzeugung des erfindungsgemäßen Lepidopteraaktiven Toxins verwendet werden. Transformierte Wirte können zur Erzeugung des insektiziden Toxins verwendet werden, oder im Fall einer Pflanzenzelle, die zur Erzeugung des Toxins transformiert worden ist, wird die Pflanze gegenüber dem Insektenbefall resistent. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des chimären Toxins oder von Wirten, die das für das chimäre Toxin kodierende Gen enthalten, in Verfahren zur Bekämpfung von Lepidoptera-Schädlingen.
Ferner betrifft die Erfindung die Behandlung von im wesentlichen intakten, rekombinanten Zellen zur Erzeugung des erfindungsgemäßen chimären Toxins. Die Zellen werden zur Verlängerung der Lepidoptera-Aktivität behandelt, wenn die im wesentlichen intakten Zellen in der Umgebung eines Zielschädlings eingesetzt werden. Eine derartige Behandlung kann durch chemische oder physikalische Maßnahmen oder durch eine Kombination von chemischen und physikalischen Maßnahmen erfolgen, sofern die gewählten Maßnahmen nicht in nachteiliger Weise die Eigenschaften des Pestizids beeinflussen oder die Fähigkeit der Zelle zum Schutz des Pestizids verringern. Die behandelte Zelle wirkt als Schutzüberzug für das pestizide Toxin. Das Toxin wird bei Aufnahme durch ein Zielinsekt aktiv.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1: Die BamHI-Stelle wird aus pMYC1050 unter Auffüllen mit Klenow- Polymerase unter Bildung des Plasmids pMYC1050ΔBamHI entfernt. Zur Erleichterung der Klonierung wird ein NsiI-DNA-Fragment, das den Großteil des offenen Leserasters des Toxins enthält, in pGEM5 kloniert. Das erhaltene Plasmid wird als pGEMtox bezeichnet. C = ClaI, H = HindIII.
Fig. 2: BamHI- oder PvuI-Klonierungsstellen werden in die Toxin-DNA durch die Technik der Spleiß-Überlappungserweiterung (Splice Overlap Extension, SOE) eingeführt. Die DNA-Fragmente mit den neuen Stellen werden als Ersatz für homologe DNA-Fragmente in pGEMtox verwendet. Bei den erhaltenen Plasmiden handelt es sich um pGEMtoxBamHI oder pGEMtoxPvuI. Die Buchstaben A bis 6 unter den Pfeilen entsprechen den Oligonucleotid-Primern im Text. Buchstaben über vertikalen Linien entsprechen den Restriktionsenzymstellen. B = BamHI, C = ClaI, H = HindIII, P = PvuI, S = SacI.
Fig. 3: Das DNA-Fragment mit einem Gehalt an der BamHI-Mutation wird zum Ersatz des homologen Fragmentes in pGEMtoxPvuI verwendet. Das erhaltene Plasmid, das beide Klonierungsstellen enthält, ist pGEMtoxBamHI/PvuI. Zur Konstruktion eines Expressionsplasmids wird das toxinhaltige NsiI-Fragment zur Klonierung in den breiten pTJS260-Wirtsbereichvektor ausgeschnitten. B = BamHI, C = ClaI, H = HindIII, P = PvuI.
Fig. 4: Das das NsiI-Toxin enthaltende Fragment mit den neuen Restriktionsstellen wird mit der vektorhaltigen DNA aus pMYC1050ΔBamHI unter Bildung von pMYC2224 verknüpft. Ein von BamHI-PvuI-PCR abgeleitetes DNA- Fragment mit einem Gehalt an dem cryIF-Toxin wird gegen das äquivalente Fragment in pMYC2224 ausgetauscht. Die erhaltene Chimäre wird als pMYC2239 bezeichnet. B = BamHI, C = ClaI, H = HindIII, N = NsiI, P = PvuI.
Fig. 5: Das kleine ApaI-DNA-Fragment von pMYC2047 wird als Ersatz für die homologe Region von pMYC2239 verwendet. Man erhält das Plasmid pMYC2244. Diese Chimäre besteht aus cryIF im Toxinbereich und cryIA(b) im Protoxin. C = ClaI, H = HindIII, N = NsiI, P = PvuI.
Fig. 6: Stumme Codonänderungen werden in cryIF-Toxin durch SOE eingeführt. Das SpeI-KpnI-PCR-DNA-Fragment mit den Veränderungen wird als Ersatz für das homologe, toxinhaltige Fragment in pMYC2047 verwendet. Beim erhaltenen Plasmid handelt es sich um pMYC2243. Die Buchstaben H bis K unter den Pfeilen entsprechen den Oligonucleotid-Primern im Text.
Fig. 7: Stumme Codonänderungen werden in pMYC2244 unter Substitution des homologen Fragments durch das kleine ApaI-DNA-Fragment von pMYC2243 eingeführt. Beim fertigen Plasmid handelt es sich um pMYC2523. P = PvuI.
Fig. 8: Ein chimäres Toxin, das das 436-Protoxin enthält, wird konstruiert, indem man eine durch PCR erzeugte PvuI-BstEII-Protoxin-DNA als Ersatz für das homologe Fragment im pMYC2523 verwendet. Beim fertigen Plasmid handelt es sich um pMYC2254. Die Buchstaben F und M unter den Zeilen entsprechen den Oligonucleotid-Primern im Text.
Fig. 9: Eine chimäre CryIF/CryIA(b)-Proteinsequenz und Rest-für-Rest- Substitutionen. Die "Cons"-Linie zeigt eine chimäre CryIF/CryIA(b)-Sequenz. Die "Alt"-Linien zeigen die Rest-für-Rest-Substitutionen, die in 436-Protein, varianten CryI(b)-Proteinen und CryIF-Protoxinen gefunden werden.

Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO: 1 ist der Oligonucleotid-Primer "A"
SEQ ID NO: 2 ist der Oligonucleotid-Primer "B"
SEQ ID NO: 3 ist der Oligonucleotid-Primer "C"
SEQ ID NO: 4 ist der Oligonucleotid-Primer "D"
SEQ ID NO: 5 ist der Oligonucleotid-Primer "E"
SEQ ID NO: 6 ist der Oligonucleotid-Primer "F"
SEQ ID NO: 7 ist der Oligonucleotid-Primer "G"
SEQ ID NO: 8 ist der Oligonucleotid-Primer "L"
SEQ ID NO: 9 ist der Oligonucleotid-Primer "N"
SEQ ID NO: 10 ist der Oligonucleotid-Primer "O"
SEQ ID NO: 11 ist der Oligonucleotid-Primer "H"
SEQ ID NO: 12 ist der Oligonucleotid-Primer "I"
SEQ ID NO: 13 ist der Oligonucleotid-Primer "J"
SEQ ID NO: 14 ist der Oligonucleotid-Primer "K"
SEQ ID NO: 15 ist der Oligonucleotid-Primer "P"
SEQ ID NO: 16 ist der Oligonucleotid-Primer "Q"
SEQ ID NO: 17 ist der Oligonucleotid-Primer "M"
SEQ ID NO: 18 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2224.
SEQ ID NO: 19 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2224 kodierten Toxins.
SEQ ID NO: 20 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2239.
SEQ ID NO: 21 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2239 kodierten Toxins.
SEQ ID NO: 22 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2244, die für ein chimäres cryIF/cryIA(b) Toxin kodiert.
SEQ ID NO: 23 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2244 kodierten chimären cryIF/cryIA(b)-Toxins.
SEQ ID NO: 24 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2243.
SEQ ID NO: 25 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2243 kodierten Toxins.
SEQ ID NO: 26 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2523, die unter Codon-Nacharbeitung (rerwork) für ein chimäres cryIF/cryIA(b)-Toxin kodiert.
SEQ ID NO: 27 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2523 kodierten Toxins.
SEQ ID NO: 28 zeigt die für Toxin kodierende DNA-Sequenz von pMYC2254, die für ein chimäres cryIF/436-Toxin kodiert.
SEQ ID NO: 29 zeigt die vorhergesagte Aminosäuresequenz des durch pMYC2254 kodierten Toxins.
SEQ ID NO: 30 ist eine charakteristische Sequenz von cryI-Toxinen. Diese Sequenz endet am Rest 601 von SEQ ID NO: 23.
SEQ ID NO: 31 stellt die acht Aminosäuren vor der Aminosäure 1043 in SEQ ID NO: 23 dar.
SF0 ID NO: 32 zeigt die Aminosäuresequenz eines nativen cryIF-Toxins.
SEQ ID NO: 33 zeigt die Aminosäuresequenz eines nativen cryIA(b)-Toxins.
SF0 ID NO: 34 zeigt die Aminosäuresequenz eines cryIA(c)/cryIA(b)-Toxins.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft den Befund, dass bestimmte chimäre Gene, die für B.t.-Toxine kodieren, eine verbesserte Expression in rekombinantem Pseudomonas fluorescens aufweisen. Die chimären Gene kodieren für Toxine, bei denen die Gesamtheit oder ein Teil des nativen Protoxin-Bereiches durch die Gesamtheit oder einen Teil des Protoxins eines anderen B.t.-Toxins ersetzt ist. Bei speziell hier aufgeführten Beispielen handelt es sich um Gene, die für ein B.t.-toxin kodieren, das im wesentlichen aus einem N-terminalen cryIF-Kern-Toxinbereich besteht, der an ein Protoxin-Segment gebunden ist, das sich entweder von einem cryIA(b)-Toxin oder einem cryIA(c)/cryIA(b)-Toxin gemäß den hier gemachten Angaben ableitet. Der hier verwendete Ausdruck "Kern"-Toxinbereich bezieht sich auf einen Bereich des B.t.-Toxins von voller Länge, der sich vom Protoxin unterscheidet und für die pestizide Aktivität des Toxins verantwortlich ist.
Nachstehend sind Bakterien aufgeführt, die erfindungsgemäß geeignete Plasmide beinhalten:
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Verfügbarkeit bei einer Hinterlegungsstelle keine Lizenz zur Ausübung der vorliegenden Erfindung zu Lasten der behördlich gewährten Patentrechte darstellt.
Die Fließdiagramme der Figg. 1-8 bieten einen allgemeinen Überblick über die Vektorkonstruktion, die erfindungsgemäß durchgeführt werden kann. BamHI und PvuI-Klonierungsstellen können in ein chimäres cryIA(c)/cryIA(b)-Toxin durch Mutagenese unter Anwendung der PCR-Technik der Spleiß- Überlappungserweiterung (SOE) eingeführt werden (R. M. Horton, H. D. Hunt, S. N. Ho, J. K. Pullen, L. R. Pease, Gene, Bd. 77 (1989), S. 61-68), wodurch man das Plasmid pMYC2224 erhält. Eine Region des cryIF-Gens aus einem cryIF enthaltenden Plasmid, wie pMYC1260, kann durch PCR erzeugt und als Ersatz für das BamHI-PvuI-cryIA(c)/cryIA(b)-Genfragment von pMYC2224 verwendet werden. Das neue Plasmid, das wir als pMYC2239 bezeichneten, bestand aus einem kurzen Segment von cryIA(c), dem sich an die Toxin/Protoxin-Segment-Verbindungsstelle cryIF anschloss. Somit war das Protoxin-Segment nunmehr von cryIA(b) (pMYC1050) abgeleitet. Ein ApaI-Fragment, das vom cryIF-Klon (pMYC2047) abgeleitet war, wurde als Ersatz für das ApaI-Fragment in pMYC2239 verwendet. Der erhaltene Klon (pMYC2244) bestand aus cryIF vom Initiator Methionin bis zur Toxin/Protoxin-Segment-Verbindungsstelle und aus cryIA(b) bis zum Ende der Kodierungsregion. Der Klon pMYC2243 wurde durch SOE konstruiert, um stumme Codonänderungen in einer begrenzten Region einzuführen. Das ApaI-Fragment aus pMYC2243, das die stummen Änderungen enthielt, wurde als Ersatz für das ApaI- Fragment in pMYC2244 verwendet, wodurch man den Klon pMYC2523 erhielt. Das chimäre pMYC2523 zeigte eine Expressionsverbesserung gegenüber pMYC2243, das die unveränderte cryIF-Proteinsequenz enthält.
Eine cryIF/436-Chimäre lässt sich durch Ersetzen des das PvuI-BstEII- Proteinsegment enthaltenden Fragments von pMYC2523 durch ein entsprechendes Fragment, das durch PCR aus einem ein cryIA(c)/cryIA(b)-Gen enthaltenden Plasmid erzeugt worden ist, erhalten. Ein derartiges Gen ist das 436-Gen (z. B. pMYC467 gemäß US-Patent 5 128 130 und US-Patent 5 169 760). Diese Konstruktion führt ebenfalls zu einer verbesserten Expression im Vergleich zur nativen cryIF- Proteinsequenz.
Die erfindungsgemäßen chimären Toxine umfassen einen vollständigen, N- terminalen Kern-Toxinbereich eines B.t.-Toxins, und an einer Stelle nach dem Ende des Toxinbereiches weist das Protein einen Übergang zu einer heterologen Protoxin- Sequenz auf. Dieser Übergang zum heterologen Protoxin-Segment kann etwa an der Toxin/Protoxin-Verbindung erfolgen oder alternativ kann ein Teil des nativen Protoxins (der sich über den Toxinbereich hinaus erstreckt) erhalten bleiben, wobei der Übergang zum heterologen Protoxin stromabwärts erfolgt. Beispielsweise weist ein chimäres Toxin der Erfindung den vollständigen Toxinbereich von cryIF (Aminosäuren 1-601) und ein heterologes Protoxin (Aminosäuren 602 bis zum C- Ende) auf. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der heterologe Bereich des Protoxins von einem cryIA(b)- oder 436-Toxin abgeleitet.
Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt, dass B.t.-Toxine (auch innerhalb einer bestimmten Klasse, wie cryIF) in einem gewissen Ausmaß in Bezug auf Länge und genaue Position der Übergangsstelle vom Toxinbereich zum Protoxinbereich variieren. Typischerweise weisen die cryIA(b)- und cryIF-Toxine eine Länge von etwa 1150 bis etwa 1200 Aminosäuren auf. Der Übergang vom Toxinbereich zum Protoxinbereich erfolgt typischerweise bei etwa 50% bis etwa 60% des Toxins von voller Länge. Das chimäre Toxin der Erfindung umfasst die vollständige Ausdehnung dieses N-terminalen Kern-Toxinbereiches. Somit umfasst das chimäre Toxin mindestens etwa 50% des cryIF-B.t.-Toxins von voller Länge. Hierbei handelt es sich typischerweise um mindestens etwa 590 Aminosäuren. In Bezug auf den Protoxinbereich erstreckt sich die volle Ausdehnung des cryIA(b)-Protoxinbereiches vom Ende des Toxinbereiches bis zum C-Ende des Moleküls. Es handelt sich um die letzten etwa 100 bis 150 Aminosäuren dieses Bereiches, die als Bestandteil im erfindungsgemäßen chimären Toxin besonders kritisch sind. In einem chimären Toxin, das hier speziell durch ein Beispiel belegt ist, werden mindestens die Aminosäuren 1043 (von SEQ ID NO: 23) bis zum C-Ende des cryIA(b)-Moleküls verwendet. Der Aminosäure 1043 im SEQ ID NO: 23 geht die Sequenz Tyr Pro Asn Asn Thr Val Thr Cys (SEQ ID NO: 31) voraus. Diese Aminosäuresequenz markiert die Stellung im Protoxin-Segment des Moleküls, über die hinaus immer heterologe Aminosäuren im chimären Toxin auftreten. In einem weiteren Beispiel liegt das als SEQ ID NO: 31 dargestellte Peptid bei den Aminosäuren 1061 bis 1068 vor. In diesem Fall sind die Aminosäuren 1069 bis zum C-Ende vorzugsweise heterolog (SEQ ID NO: 29). Das in SEQ ID NO: 31 dargestellte Peptid lässt sich in Fig. 9 an den Positionen 1061 bis 1068 finden. Somit handelt es sich um mindestens die letzten etwa 5 bis 10% des gesamten B.t.-Proteins, die im erfindungsgemäßen chimären Toxin heterologe DNA umfassen (verglichen mit dem N-terminalen cryIF- Kern-Toxinbereich). In den hier dargelegten speziellen Beispielen treten die heterologen Protoxin-Sequenzen von der Aminosäure 640 bis zum C-Ende auf.
Somit handelt es sich bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung um ein chimäres B.t.-Toxin mit einer Länge von etwa 1150 bis etwa 1200 Aminosäuren, wobei das chimäre Toxin einen N-terminalen cryIF-Kern-Toxinbereich von mindestens etwa 50 bis 60% eines vollständigen cryIF-Moleküls jedoch von nicht mehr als etwa 90 bis 95% des vollständigen Moleküls umfasst. Das chimäre Toxin umfasst ferner einen C-endständigen cryIA(b) oder einen 436-Protoxinbereich, der mindestens etwa 5 bis 10% des cryIA(b)- oder 436-Moleküls umfasst. Der Übergang von der cryIF- zur cryIA(b)- oder 436-Sequenz erfolgt somit innerhalb des Protoxin- Segments (oder an der Verbindungsstelle der Toxin- und Protoxin-Segmente) zwischen etwa 50% und etwa 95% der Strecke durch das Molekül. In den hier vorgelegten speziellen Beispielen erfolgen die Übergänge von der cryIF-Sequenz zu den heterologen Protoxin-Sequenzen vor dem Ende der in SEQ ID NO: 31 gezeigten Peptidsequenz.
Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um das in Fig. 9 dargestellte chimäre Toxin. Weitere Konstrukte können vom Fachmann unter Ausnutzung der hier gegebenen Lehre gemacht und verwendet werden. Das Kern- Toxinsegment von cryI-Proteinen endet charakteristischerweise mit der Sequenz: Val/Leu Tyr/Ile Ile Asp Arg/Lys Ile/Phe Glu IIe/Phe/Leu IIe/Leu/Val Pro/Leu Ala/Val Glu/Thr/Asp (SEQ ID NO: 30), die am Rest 601 von SEQ ID NO: 23 endet. Ferner weisen die Protoxin-Segmente der cryI-Toxine (die dem Rest 601 folgen) eine stärkere Sequenzähnlichkeit als die Toxinsegmente auf. Aufgrund dieser Sequenzähnlichkeit lässt sich die Übergangsstelle im Protoxin-Segment zur Herstellung eines chimären Proteins zwischen der cryIF-Sequenz und der cryIA(b)- oder 436-Sequenz vom Fachmann leicht feststellen. Durch Studium der Daten bezüglich der partiellen Proteolyse von cryI-Genen werden die am wenigsten konservierten Aminosäureregionen nach der konservierten cryI-Protoxin-Sequenz in den Positionen 1061-1068 von Fig. 9 gefunden.
Somit kann ein erfindungsgemäßes chimäres Toxin das vollständige cryIF- Toxin und einen Teil des cryIF-Protoxins umfassen, wobei der Übergang zur entsprechenden cryIA(b)- oder 436-Sequenz an einer beliebigen Position zwischen dem Ende des Toxinsegments (gemäß der vorstehenden Definition) und dem Ende der in SEQ ID NO: 31 gezeigten Peptidsequenz erfolgt. Vorzugsweise umfasst die Aminosäuresequenz des C-Endes des chimären Toxins eine cryIA(b)-Sequenz oder eine Sequenz vom 436-Gen oder eines Äquivalents von einer dieser Sequenzen.
CryIF-Toxine und Gene, die für diese Toxine kodieren, sind aus dem Stand der Technik bekannt. CryIF-Gene und Toxine werden beispielsweise von Chambers et al., J. Bacteriol., Bd. 173 (1991), S. 3966, beschrieben. CryIA(b)-Gene und -Toxine werden beispielsweise von Höfte et al., Eur. J. Biochem., Bd. 161 (1986), S. 273; Geiser et al., Gene, Bd. 48 (1986), S. 109; und Haider et al., Nucleic Acids Res., Bd. 16 (1988), S. 10927, beschrieben. Der Fachmann kann auf der Grundlage der hier vorgelegten Lehre leicht DNA identifizieren und einsetzen, die für den N-terminalen Toxinbereich eines cryIF-Moleküls und den C-terminalen Protoxinbereich der cryIA(b)-Toxine kodiert.
Fig. 9 zeigt Beispiele von Aminosäuresubstitutionen, die in den erfindungsgemäßen Toxinen eingesetzt werden können. Ferner ist es aus dem Stand der Technik bekannt, dass verschiedene Mutationen an einer Toxinsequenz ohne eine Veränderung der Aktivität eines Toxins vorgenommen werden können. Außerdem können aufgrund der Degeneration des genetischen Codes eine Vielzahl von DNA-Sequenzen zum Kodieren eines speziellen Toxins herangezogen werden. Diese alternativen DNA- und Aminosäuresequenzen können vom Fachmann auf die vorliegende Erfindung angewandt werden.
Die Protoxin-Substitutionstechniken der Erfindung können bei anderen Klassen von B.t.-Endotoxinen zur Verstärkung der Expression des Toxins herangezogen werden. Die Technik ist besonders gut auf andere B.t.-Toxine anwendbar, die die in SEQ ID NO: 30 dargestellte charakteristische Sequenz aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfasst nicht nur die neuen chimären Toxine und die für diese Toxine kodierenden Gene, sondern auch die Verwendung dieser neuen Toxine und Gene. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Gen zur Transformation von Wirtszellen verwendet werden. Diese Wirtszellen, die das Gen exprimieren und das chimäre Toxin erzeugen, können in insektiziden Zusammensetzungen oder im Fall einer transformierten Pflanzenzelte zur Erzielung von Insektenresistenz der transformierten Zelle selbst verwendet werden.

Gene und Toxine

Die erfindungsgemäß geeigneten Gene und Toxine umfassen nicht nur die beschriebenen Sequenzen voller Länge, sondern auch Fragmente dieser Sequenzen, Varianten und Mutanten davon, bei denen die charakteristische pestizide Aktivität der hier speziell durch Beispiele belegten Toxine erhalten bleibt. Die hier verwendeten Ausdrücke "Varianten" oder "Variationen" von Genen beziehen sich auf Nucleotidsequenzen, die für die gleichen Toxine kodieren oder die für äquivalente Toxine mit pestizider Aktivität kodieren. Der hier verwendete Ausdruck "äquivalente Toxine" bezieht sich auf Toxine, die die gleiche oder im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität gegen die Zielschädlinge wie die beanspruchten Toxine aufweisen.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass Gene, die für aktive Toxine kodieren, mit verschiedenen Mitteln identifiziert und erhalten werden können. Die speziellen Gene (oder Teile davon, die für Toxin- oder Protoxindomänen kodieren), die erfindungsgemäß geeignet sind, können aus den rekombinanten Isolaten, die bei den vorgenannten Hinterlegungsstellen hinterlegt worden sind, erhalten werden. Diese Gene oder Teile oder Varianten davon können auch synthetisch konstruiert werden, beispielsweise unter Verwendung eines Gen-Synthesegeräts. Variationen von Genen lassen sich leicht unter Heranziehung standardmäßiger Techniken zur Herstellung von Punktmutationen konstruieren. Ferner lassen sich Fragmente dieser Gene unter Verwendung handelsüblicher Exonucleasen oder Endonucleasen gemäß üblichen Verfahren herstellen. Beispielsweise können Enzyme, wie Bal31 verwendet werden, um systematisch Nucleotide von den Enden dieser Gene abzuschneiden. Alternativ kann eine positionsgerichtete Mutagenese durchgeführt werden. Ferner lassen sich Gene, die für aktive Fragmente kodieren, unter Verwendung einer Vielzahl von Restriktionsenzymen erhalten. Proteasen können dazu herangezogen werden, direkt aktive Fragmente dieser Toxine zu erhalten.
Fragmente und Äquivalente, bei denen die pestizide Aktivität der durch Beispiele belegten Toxine erhalten bleibt, fallen ebenfalls unter den Umfang der Erfindung. Ferner können aufgrund der Redundanz des genetischen Codes eine Vielzahl unterschiedlicher DNA-Sequenzen für die hier beschriebene Aminosäuresequenz kodieren. Der Fachmann kann diese alternativen DNA- Sequenzen, die für das gleiche oder im wesentlichen das gleiche Toxin kodieren, erzeugen. Diese varianten DNA-Sequenzen fallen unter den Umfang der Erfindung. Der hier verwendete Ausdruck "im wesentlichen die gleiche" Sequenz bezieht sich auf Sequenzen, die Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Insertionen von Aminosäuren aufweisen, die die pestizide Aktivität oder das Expressionsniveau nicht wesentlich beeinträchtigen. Fragmente, bei denen die pestizide Aktivität erhalten bleibt, fallen ebenfalls unter diese Definition.
Ein weiteres Verfahren zum Identifizieren der erfindungsgemäßen Toxine und Gene besteht in der Verwendung von Oligonucleotidsonden. Bei diesen Sonden handelt es sich um nachweisbare Nucleotidsequenzen. Diese Sequenzen können mittels einer geeigneten Markierung nachweisbar sein oder sie können gemäß WO93/16094 mit eigener Fluoreszenz versehen werden. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass dann, wenn das Sondenmolekül und die Nucleinsäureprobe unter Ausbildung einer starken Bindung zwischen den beiden Molekülen hybridisieren, in vernünftiger Weise angenommen werden kann, dass die Sonde und die Probe im wesentlichen homolog sind. Vorzugsweise wird die Hybridisierung unter stringenten Bedingungen nach bekannten Techniken durchgeführt; beispielsweise gemäß G. H. Keller, M. M. Manak, DNA Probes, Stockton Press, New York, NY, (1987), S. 169-170. Der Nachweis der Sonde liefert ein Mittel, um in bekannter Weise festzustellen, ob eine Hybridisierung eingetreten ist. Eine derartige Sondenanalyse bietet ein rasches Verfahren zum Identifizieren der erfindungsgemäßen, für das Toxin kodierenden Gene. Vorzugsweise handelt es sich bei derartigen Genen um cryIF-Gene, deren für das Toxin kodierenden Kernbereiche zusammen mit einem für ein cryIA(b)- oder 436-Protoxin kodierenden Bereich verwendet werden können, um das erfindungsgemäße chimäre Gen zu erzeugen. Die Nucleotidsegmente, die erfindungsgemäß als Sonden verwendet werden, lassen sich unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts und unter Einsatz üblicher Verfahren synthetisieren. Diese Nucleotidsequenzen können auch als PCR-Primer verwendet werden, um die erfindungsgemäßen Gene zu amplifizieren.
Bestimmte erfindungsgemäße chimäre Toxine werden hier speziell durch Beispiele erläutert. Es ist aber leicht ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung variante oder äquivalente Toxine (und Nucleotidsequenzen, die für äquivalente Toxine kodieren) mit der gleichen oder einer ähnlichen pestiziden Aktivität wie bei den beispielhaften Toxinen umfasst. Äquivalente Toxine weisen eine Aminosäurehomologie mit dem beispielhaften Toxin auf Diese Aminosäurehomologie beträgt typischerweise mehr als 75%, vorzugsweise mehr als 90% und insbesondere mehr als 95%. Die Aminosäurehomologie ist am höchsten in den kritischen Regionen des Toxins, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind oder die bei der Festlegung der dreidimensionalen Konfiguration, die letztlich für die biologische Aktivität verantwortlich ist, beteiligt sind. Diesbezüglich sind bestimmte Aminosäuresubstitutionen akzeptabel und lassen sich erwarten, wenn sich diese Substitutionen in Regionen befinden, die für die Aktivität nicht kritisch sind, oder wenn es sich um konservative Aminosäuresubstitutionen handelt, die die dreidimensionale Konfiguration des Moleküls nicht beeinflussen. Beispielsweise lassen sich Aminosäuren in die folgenden Klassen einteilen: nicht-polare, ungeladene polare, basische und saure Aminosäuren. Konservative Substitutionen, bei denen eine Aminosäure einer Klasse durch eine Aminosäure der gleichen Klasse ersetzt ist, fallen unter den Umfang der Erfindung, sofern die Substitution nicht in erheblicher Weise die biologische Aktivität der Verbindung verändert. In Tabelle 1 sind Beispiele für Aminosäuren einer jeden Klasse aufgeführt.

Tabelle 1

Aminosäureklasse Beispiele für Aminosäuren

Unpolar Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
Ungeladen polar Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
Sauer Asp, Glu
Basisch Lys, Arg, His
In einigen fällen können auch nicht-konservative Substitutionen vorgenommen werden. Der kritische Faktor besteht darin, dass diese Substitutionen nicht in signifikanter Weise die biologische Aktivität des Toxins beeinträchtigen.

Rekombinante Wirte

Ein für ein erfindungsgemäßes chimäres Toxin kodierendes Gen kann in eine Vielzahl von mikrobiellen oder pflanzlichen Wirten eingeführt werden. Die Expression des Toxin-Gens führt direkt oder indirekt zur intrazellulären Bildung und Aufrechterhaltung des pestiziden, chimären Toxins. Mit geeigneten mikrobiellen Wirten, z. B. Pseudomonas, lassen sich die Mikroorganismen auf die Orte des Schädlings aufbringen, wo sie sich vermehren und aufgenommen werden. Daraus ergibt sich die Bekämpfung des Schädlings. Alternativ kann der Mikroorganismus, der das Toxin-Gen aufgenommen hat, unter Bedingungen behandelt werden, die die Aktivität des Toxins verlängern und die Zelle stabilisieren. Die behandelte Zelle, die ihre toxische Aktivität behält, kann in der Umgebung des Zielschädlings ausgebracht werden.
Sofern das für das chimäre Toxin kodierende Gen über einen geeigneten Vektor in einen mikrobiellen Wirt eingeführt wird und der Wirt in lebendem Zustand in die Umgebung ausgebracht wird, ist es wesentlich, dass bestimmte Wirtsmikroorganismen verwendet werden. Es werden Mikroorgnismenwirte gewählt, von denen bekannt ist, dass sie die "Phytosphäre" (Blattebene, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Wurzelebene von einer oder mehreren Kulturpflanzen) von Interesse besetzen. Diese Mikroorganismen werden so gewählt, dass sie dazu befähigt sind, in der speziellen Umgebung (Kulturpflanzen und andere Lebensräume von Insekten) in erfolgreicher Weise mit den Wildtyp-Mikroorganismen zu konkurrieren, für eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des für das Polypeptid-Pestizid exprimierenden Gens zu sorgen und wünschenswerterweise einen verbesserten Schutz des Pestizids gegen einen Abbau und eine Inaktivierung in der Umgebung zu sorgen.
Von einer großen Anzahl von Mikroorganismen ist bekannt, dass sie die Blattebene (Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (Boden um die Pflanzenwurzeln) einer Vielzahl von wichtigen Kulturpflanzen bewohnen. Zu diesen Mikroorganismen gehören Bakterien, Algen und Pilze. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen, wie Bakterien, z. B. der Gattungen Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefen, z. B. der Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind derartige Bakterienspezies der Phytosphäre, wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azotobacter vinlandii; und Hefespezies der Phytosphäre, wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. auranriaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Es steht eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Einführung eines für ein chimäres Toxin kodierenden Gens in einen Mikroorganismenwirt unter Bedingungen, die eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens ermöglichen, zur Verfügung. Diese Verfahren sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise im US-Patent 5 135 867, auf das hier verwiesen wird, beschrieben.

Behandlung von Zellen

Wie vorstehend erwähnt, lassen sich rekombinante Zellen, die das erfindungsgemäße chimäre Toxin bilden, behandeln, um die toxische Aktivität zu verlängern und die Zelle zu stabilisieren. Die gebildete Pestizid-Mikrokapsel umfasst das B.t.-Toxin innerhalb einer zellulären Struktur, die stabilisiert worden ist und das Toxin schützt, wenn die Mikrokapsel in der Umgebung des Zielschädlings ausgebracht wird. Zu geeigneten Wirtszellen gehören Prokaryonten oder Eukaryonten, die normalerweise auf solche Zellen beschränkt sind, die keine Substanzen produzieren, die gegenüber höheren Organismen, wie Säugetieren, toxisch sind. Jedoch können Organismen, die für höhere Organismen toxische Substanzen erzeugen, verwendet werden, wenn die toxischen Substanzen instabil sind oder die Aufwandmenge ausreichend nieder ist, um jede mögliche Toxizität gegenüber dem Säugetierwirt zu vermeiden. Wirte von besonderem Interesse sind Prokaryonten und die niederen Eukaryonten, wie Pilze.
Die Zelle ist bei der Behandlung üblicherweise intakt und liegt im wesentlichen in der proliferativen Form, statt in einer Sporenform vor, obgleich in einigen Fällen auch Sporen verwendet werden können.
Die Behandlung der mikrobiellen Zelle, z. B. eines Mikroorganismus, der das für ein erfindungsgemäßes chimäres Toxin kodierende Gen enthält, kann durch chemische oder physikalische Mittel oder durch eine Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, sofern die Technik nicht in nachteiliger Weise die Eigenschaften des Toxins beeinflusst oder die zelluläre Fähigkeit zum Schutz des Toxins verringert. Zu Beispielen für chemische Reagenzien gehören Halogenierungsmittel, insbesondere Halogene mit einer Atomzahl von 17-80. Insbesondere kann Iod unter milden Bedingungen und für eine zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse ausreichenden Zeitspanne eingesetzt werden. Zu weiteren geeigneten Techniken gehören die Behandlung mit Aldehyden, wie Glutaraldehyd, Mitteln gegen Infektionen, wie Zephiranchlorid und Cetylpyridiniumchlorid, Alkoholen, wie Isopropanol und Ethanol, verschiedenen histologischen Fixativen, wie Lugol-Iod, Bouin-Fixativ, verschiedenen Säuren und Helly-Fixativ (vergl. Gretchen L. Humason, Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman und Company, 1967), oder eine Kombination von physikalischen (Wärme) und chemischen Mitteln, die eine Konservierung und Verlängerung der Aktivität des in der Zelle gebildeten Toxins bewirken, wenn die Zelle auf die Wirtsumgebung ausgebracht wird. Zu Beispielen für physikalische Mittel gehören kurzwellige Strahlen, wie Gammastrahlen und Röntgenstrahlen, Einfrieren, UV-Strahlen, Lyophilisieren und dergl. Verfahren zur Behandlung von mikrobiellen Zellen sind in den US-Patenten 4 695 455 und 4 695 462, auf die hier Bezug genommen wird, beschrieben.
Die Zellen weisen im allgemeinen eine erhöhte strukturelle Stabilität auf, was die Beständigkeit gegenüber den Umweltbedingungen erhöht. Da das Pestizid in einer Vorform vorliegt, ist das Verfahren zur Zellbehandlung so zu wählen, dass die Prozessierung der Vorform in die reife Form des Pestizids durch den pathogenen Zielschädling nicht gehemmt wird. Beispielsweise vernetzt Formaldehyd Proteine und kann die Prozessierung der Vorform eines Polypeptid-Pestizids hemmen. Beim Behandlungsverfahren soll mindestens ein wesentlicher Teil der biologischen Verfügbarkeit oder biologischen Aktivität des Toxins erhalten bleiben.
Zu charakteristischen Merkmalen von besonderem Interesse bei der Auswahl einer Wirtszelle zu Herstellungszwecken gehören die Einfachheit der Einführung des Gens in den Wirt, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, der Expressionswirkungsgrad, die Stabilität des Pestizids im Wirt und das Vorliegen von unterstützenden genetischen Fähigkeiten. Zu charakteristischen Eigenschaften von Interesse zur Verwendung als Pestizid-Mikrokapsel gehören die Schutzeigenschaften für das Pestizid, wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Packung oder Bildung von Einschlusskörpern, das Überleben in wässriger Umgebung, das Fehlen einer Säugetiertoxizität, die Attraktivität für eine Aufnahme durch die Schädlinge, das einfache Abtöten, das Fixieren ohne Schädigung des Toxins und dergl. Zu weiteren Gesichtspunkten gehören die Einfachheit der Zubereitung und der Handhabung, die Wirtschaftlichkeit, die Lagerstabilität und dergl.

Wachstum von Zellen

Der zelluläre Wirt, der das für ein erfindungsgemäßes chimäres Toxin kodierende Gen enthält, kann in einem beliebigen zweckmäßigen Nährmedium gezüchtet werden, worin das DNA-Konstrukt einen selektiven Vorteil bietet, wobei ein selektives Medium bereitgestellt wird, so dass alle oder im wesentlichen alle Zellen das rekombinante Gen enthalten. Diese Zellen können sodann gemäß herkömmlichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor dem Ernten behandelt werden.

Zubereitungen

Rekombinante Mikroorganismen, die ein für ein hier beschriebenes chimäres Toxin kodierendes Gen umfassen, lassen sich zu Ködergranulaten zubereiten und auf den Erdboden ausbringen. Das zubereitete Produkt kann auch zur Saatgutbeschichtung, zur Wurzelbehandlung oder zur Behandlung der gesamten Pflanze in späteren Stadien des Kulturpflanzenzyklus verwendet werden. Pflanzen- und Bodenbehandlungen können in Form von benetzbaren Pulvern, Granulaten oder Stäubemitteln vorgenommen werden, indem man eine Mischung mit verschiedenen inerten Materialien, wie anorganischen Mineralien (Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate oder dergl.) oder botanischen Materialien (pulverisierte Maiskolben, Reishüllen, Walnussschalen und dergl.) vornimmt. Die Zubereitungen können Streu- Haft-Hilfsmittel, Stabilisierungsmittel, andere Pestizidadditive oder oberflächenaktive Mittel enthalten. Flüssige Zubereitungen können auf wässriger oder nicht-wässriger Basis vorliegen und in Form von Schäumen, Gelen, Suspensionen, emulgierbaren Konzentraten oder dergl. vorliegen. Die Bestandteile können rheologische Hilfsmittel, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere enthalten.
Für den Fachmann ist es ersichtlich, dass die Pestizidkonzentration weitgehend von der Art der speziellen Zubereitung abhängt, insbesondere davon, ob es sich um ein Konzentrat handelt oder eine direkte Verwendung vorgesehen ist. Das Pestizid ist in einer Konzentration von mindestens 1 Gew.-% vorhanden und kann bis zu 100 Gew.-% ausmachen. Trockene Zubereitungen weisen etwa 1 bis 95 Gew.-% Pestizidgehalt auf, während flüssige Zubereitungen im allgemeinen einen Feststoffgehalt in der flüssigen Phase von etwa 1 bis 60 Gew.-% aufweisen. Die Zubereitungen weisen im allgemeinen etwa 10² bis 10&sup4; Zellen/mg auf. Diese Zubereitungen werden in einer Menge von etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg - oder mehr pro Hektar ausgebracht.
Die Zubereitungen können der Umgebung des Schädlings, z. B. auf den Boden und auf Blätter, durch Spritzen, Zerstäuben, Versprengen oder dergl. ausgebracht werden.

Materialien und Methoden

Zur Reinigung von elektroeluierter DNA wurde die NACS (Bethesda Research Labs, Gaithersburg, MD)-Säulenchromatographie herangezogen. Sie wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Puffer auf 0,5X TBE/0,2 M NaCl für die Bindung und 0,5X TBE/2,0 M NaCl für die Elution modifiziert wurden.
Eine willkürliche Priming-Markierung von DNA mit α-[³²P]dATP wurde mit einem Kit (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Eine Gelreinigung bezieht sich auf die sequenzielle Anwendung von Agarose- TBE-Gelelektrophorese, Elektroelution und NACS-Säulenchromatographie zur Reinigung ausgewählter DNA-Fragmente, d. h. Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die PCR-Amplifikation von DNA wurde für 25 Zyklen mit einem Perkin-Elmer (Norwalk, CT)-Thermocycler mit den folgenden Zyklusparametern vorgenommen: 94ºC für 1 Minute, 37ºC für 2 Minuten, 72ºC für 3 Minuten (jeder 72ºC-Zyklus wies eine Verlängerungszeit von 5 Sekunden auf). PCR-DNA-Produkte wurden zur Verbesserung des Klonierungswirkungsgrads mit Proteinase K behandelt (J. S. Crowe, H. J. Cooper, M. A. Smith, M. A. Sims, D. Parker, D. Gewert, Nucl. Acids Res., Bd. 19 (1991), S. 184).
Oligodesoxyribonucleotide (Oligonucleotide) wurden an einem Applied Biosystems (Foster City, CA)-DNA-Synthesegerät Modell 381A synthetisiert. Eine Reinigung wurde gegebenenfalls mit Nensorb-Säulen (New England Nuclear- Dupont, Wilmington, DE) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Die Elektroporation von Pseudomonas fluorescens wurde mit bis zur logarithmischen Phase in L-Brühe (LB) bei 30ºC auf einem Drehschüttler gezüchteten Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden 2- bis 3-mal mit eiskaltem, sterilem, destilliertem Wasser gewaschen und auf das 0,03-fache des Ausgangsvolumens in destilliertem Wasser eingeengt. DNA in 1-20 ul wurde mit 50- 300 ul Zellen vermischt. Die Parameter für das Biorad Gene Pulser-Gerät (Bio-Rad, Richmond, CA) waren: 200 Ω, 25 Microfarad und 2,25 kV in einer Küvette mit einem Elektrodenabstand von 0,2 cm. Im Anschluss an die Elektroporation wurde 1 ml LB zugesetzt und die Zellen wurden mindestens 2 Minuten auf Eis belassen. Sodann wurden die Zeilen 2 Stunden über Nacht bei 30ºC ohne Schütteln inkubiert.
Die Expression von B.t.-Toxin in P. fluorescens wurde im empfohlenen Medium gemäß Manual of Methods for General Bacteriology (P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1991) durchgeführt. Glucose wurde durch Glycerin ersetzt. Die Rezeptur wurde mit Leitungswasser hergestellt, wobei der pH-Wert auf 7,2 eingestellt wurde. Anzuchtkolben wurden mit L-Brühe zubereitet. Folgende Rezepturen wurden angewandt:

Basismedium (für 1 Liter)

Glycerin 65 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 1,0 g
Na&sub2;HPO&sub4; 5,24 g
KH&sub2;PO&sub4; 2,77 g
Hefeextrakt 5,0 g
Casaminsäuren 1,0 g

Metalle 44 (für 100 ml)

EDTA 250 mg
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 1095 mg
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 500 mg
MnSO&sub4;·H&sub2;O 154 mg
CuSO&sub4;·5H&sub2;O 39,2 mg
Co(NO&sub3;)&sub2;·6H&sub2;O 24,8 mg
Na&sub2;B&sub4;O&sub7;·10H&sub2;O 17,7 mg
Zur Verzögerung der Ausfällung werden einige Tropfen 6 N H&sub2;SO&sub4; zugegeben.

Huntners-Mineralgemisch (für 1 Liter)

Nitriloessigsäure (gelöst und 10 g neutralisiert mit KOH)
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 14,45 g
CaCl&sub2;·2H&sub2;O 3,33 g
(NH&sub4;)&sub6;Mo&sub7;O&sub2;&sub4;·4H&sub2;O 9,25 g
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 99 mg
Metalle 44 50 mg
pH-Wert eingestellt auf 6,6-6,8
Bei Inokulation zur Analyse auf die Expression von B.t.-Toxin wurden 4 ml Huntner-Mineralgemisch auf 200 ml Brühe zugegeben. Die Kolben wurden sodann mit 2% (bezogen auf das Volumen) Inokulum aus einer über Nacht gezüchteten Kultur versetzt. Die Kulturen wurden 24 Stunden bei 32ºC und ≥200 U/min gezüchtet. Zu diesem Zeitpunkt wurden sie mit 0,75 mM IPTG induziert und mit 2 g Hefeextrakt supplementiert. Nach 48 und 72 Stunden gezogene Proben ließ man an Proteingelen laufen. Das Protein von etwa 130 kDa wurde durch Laserdensitometrie quantitativ bestimmt.
Nachstehend finden sich Beispiele zur Erläuterung der Verfahrensweisen zur Durchführung der Erfindung unter Einschluss der besten Ausführungsform. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung anzusehen. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und sämtliche Verhältnisangaben für Lösungsmittelgemische auf das Volumen.

Beispiel 1 - Expressionsvektormodifikation durch Spleiß- Überlappungserweiterung (SOE)

Ein Klonierungsvektor lässt sich auf der Basis von pTJS260 konstruieren, einem von RSF1010 abgeleiteten Plasmid mit breitem Wirtsbereich (pTJS260 kann von Dr. Donald Helinski, U.C. San Diego, bezogen werden). Ein Beispiel für das bei der Vektorkonstruktion verwendete System findet sich in EP-A-0 471 564. Ein cryIA(c)/cryIA(b)-Gen, hier als 436-Gen bezeichnet, und das Toxin sind im US-Patent 5 055 294 beschrieben. Ein Plasmid mit der Bezeichnung pMYC1050 enthält ein chimäres cryIA(c)/cryIA(b)-Gen, das als 420-Gen bekannt ist. pMYC1050 wurde durch Reklonierung des Toxin-Gens und des Promotors von pM3,130-7 (beschrieben im US-Patent 5 055 294) in einen auf pTJS260 basierenden Vektor, wie pMYC467 (beschrieben im US-Patent 5 169 760), gemäß bekannten Verfahren konstruiert. Insbesondere lassen sich der pM3,130-7-Promotor und das Toxin-Gen als ein BamHI- bis NdeI-Fragment erhalten und in das pMYC467-Plasmid platzieren, das ein durch die gleichen Stellen gebundenes Fragment ersetzt (BamHI nahe der Base 12100 und NdeI nahe der Base 8000).
Der verbesserte Vektor enthält idealerweise eine einzige BamHI- Klonierungsstelle. Die Plasmid-BamHI-Stelle, die sich stromaufwärts vom tac- Promotor (Ptac) befindet, kann durch Abstumpfen mit Klenow und Religation entfernt werden (Fig. 1). Das Fehlen der Stelle kann durch Restriktionsverdau bestätigt werden. Ein gemäß diesem Verfahren erzeugtes Plasmid erhielt die Bezeichnung pMYC1050ΔBamHI. Das Konstrukt kann nunmehr eine BamHI-Stelle aufweisen, die dem Plasmid durch SOE-Mutagenese hinzugefügt worden ist. Die SOE-Mutagenese kann durch Subklonieren eines NsiI-Toxin enthaltenden DNA-Fragments in den kleineren pGEM5-Vektor (Promega Corp., Madison, WI) erleichtert werden, der sich des Ampicillin-Resistenzgens (bla) als selektierbarem Marker bedient (Fig. 1). Das Fragment kann durch Restriktionsverdau orientiert werden. Ein gemäß diesem Verfahren erzeugtes Plasmid erhielt die Bezeichnung pGEMtox.
DNA im Toxin-Kodierungsbereich kann durch die PCR-vermittelte Technik von SOE mutiert werden, um Restriktionsenzym-Klonierungsstellen einzuführen, wie in Fig. 2 dargestellt ist. Nachstehend sind als Primer geeignete Oligonucleotide aufgeführt.
pMYC1050-DNA wurde als Matrize zur PCR-Amplifikation unter Einsatz der Primersets A/B, C/D, E/D und F/G verwendet. Amplifizierte DNA-Fragmente erhielten die Bezeichnungen AB, CD, ED und FG. Amplifizierte DNAs wurden durch Agarose- TBE-Gelelektrophorese, Elektroelution und NACS-Säulenchromatographie, d. h. durch bekannte Verfahren, gereinigt. Gereinigte Matrizen-DNAs wurden im zweiten Satz von PCR-Reaktionen verwendet. Die Fragmente AB und CD wurden vermischt und mit den Primern A und D amplifiziert. In einer getrennten Reaktion wurden die Fragmente ED und FG vermischt und mit den Primern E und G amplifiziert. Amplifizierte DNA wurde durch Agarose-TBE-Gelelektrophorese aufgetrennt. Fragmente mit der entsprechenden Größenzunahme wurden ausgeschnitten, elektroeluiert und an NACS-Säulen auf bekannte Weise gereinigt. Amplifizierte DNA- Fragmente erhielten die Bezeichnungen AD oder EG.
Die DNA-Fragmente AD oder EG mit den neuen Restriktionsenzymstellen wurden durch mehrere Subklonierungsverfahren in die toxinhaltige DNA eingebaut (Figg. 2 und 3). pGEMtox wurde mit ClaI oder HindIII verdaut. Vektorhaltige DNA wurde einer Gelreinigung unterzogen. Das Fragment AD wurde mit ClaI verdaut und in ClaI-verdaute pGEMtox-Vektor-DNA ligiert. Das Fragment EG wurde mit HindII verdaut und in HindIII-verdaute pGEMtox-Vektor-DNA ligiert. E. coli-Stamm NM522 wurde mit Ligationsgemischen transformiert. Korrekt zusammengesetzte Konstrukte wurden durch Restriktionsenzymverdau von Plasmid-DNA aus isolierten Kolonien identifiziert. Das Plasmid mit der neuen BamHI-Stelle erhielt die Bezeichnung pGEMtox-BamHI. Das Plasmid mit der neuen PvuI-Stelle erhielt die Bezeichnung pGEMtox-PvuI. Das ClaI-Fragment mit der BamHI-Stelle aus dem Plasmid pGEMtox- BamHI wurde in das mit Phosphatase behandelte vektorhaltige ClaI-Fragment aus pGEMtox-PvuI ligiert. E. coli-Stamm NM522 wurde mit Ligationsgemischen transformiert. Korrekt zusammengesetzte Konstrukte wurden durch PCR-Analyse mit dem Primerset C/D und durch Restriktionsverdau identifiziert. Das Plasmid mit beiden neuen Restriktionsenzymstellen erhielt die Bezeichnung pGEMtox- BamHI/PvuI.
Ein vervollständigter Expressionsvektor wurde mit dem Insert aus pGEMtox- BamHI/PvuI und dem Vektor aus pMYC1050ΔBamHI zusammengesetzt (Figg. 3 und 4). Ein gelgereinigtes Insert wurde aus pGEMtox-BamHI/PvuI durch NsiI-Verdau und ScaI-Verdau (zur Entfernung von kontaminierendem Vektor) hergestellt. Das Produkt wurde in gelgereinigte, NsiI-verdaute, vektorhaltige pMYC1050ΔBamHI-DNA ligiert. E. coli-Stamm NM522 wurde mit den Ligationsgemischen transformiert. Transformationsgemische wurden auf LB-Agar mit einem Gehalt an 12 ug/ml Tetracyclin ausgestrichen. Kolonien, die das NsiI-Insert enthielten, wurden durch Kolonienhybridisierung und Autoradiographie identifiziert. Inserts wurden durch PCR unter Verwendung des Primersets A/D, das eine NsiI-Klonierungsstelle überbrückt, und durch Agarose-TBE-Gelelektrophorese orientiert. Das korrekt zusammengesetzte Plasmid erhielt die Bezeichnung pMYC2224. Die DNA- und Proteinsequenzen des Toxins finden sich in SEQ ID NO: 18 bzw. 19. Ein durch Lactose induzierbarer P. fluorescens-Stamm wurde mit korrekt zusammengesetzter Plasmid-DNA der Elektroporation unterworfen. Transformationsgemische wurden auf LB-Agar mit einem Gehalt an 20 ug/ml Tetracyclin ausgestrichen. Plasmid-DNA wurde aus P. fluorescens zur Verwendung bei anschließenden Klonierungversuchen hergestellt.

Beispiel 2 - Subklonierung der hypervariablen cryIF-Region in pMYC2224

Ein DNA-Fragment mit einem Gehalt an der hypervariablen Region aus cryIF (pMYC1260) wurde gegen das BamHI-PvuI-Toxin enthaltende DNA-Fragment aus pMYC2224 ausgetauscht (Fig. 4). Da die Kodierungssequenz eine vorhandene BamHI-Stelle enthält, wurde BglII zur Klonierung verwendet. Die Überstände von 4 Basen von BamHI und BglII sind kompatibel und ermöglichen eine Ligation, während beide Stellen von der Verbindung ausgeschlossen sind. Es war erforderlich einen neuen Primer für PCR zu synthetisieren:
Ein toxinhaltiges DNA-Fragment wurde durch PCR mit den Primern L/D an der Matrize pMYC1260 erzeugt. Die DNA wurde mit BglII und PvuI zur Subklonierung verdaut. Da der tetAR-Locus mehrfache PvuI-Stellen enthält, war es erforderlich, die vektorhaltige DNA an zwei getrennten Fragmenten zu isolieren. Um das erste Fragment zu erhalten, wurde pMYC2224 mit BamHI x BstEII verdaut, und das große DNA-Fragment, das die Ptac-tetAR-Locus-rep-Funktionen enthielt, wurde der Gelreinigung unterzogen. Um das zweite Fragment zu erhalten, wurde pMYC2224 mit BstEII · PvuI verdaut, und das DNA-Fragment, das das Vektor-Protoxin-Modul enthielt, wurde der Gelreinigung unterzogen. Eine dreiteilige Ligation wurde eingerichtet und zur Transformation des E. coli-Stammes NM522 verwendet. In etwa korrekte Plasmide wurden durch PCR-Analyse und Agarose-TBE-Gelelektrophorese unter Verwendung des Primersets N/O, das die BamHI/BglII-Fusionsverbindung überbrückt, identifiziert.
Das korrekte Plasmid erhielt die Bezeichnung pMYC2239. Es besteht aus cryIA(c) am Aminoende, cryIF bis zur Toxin/Protoxin-Verbindungsstelle und cryIA(b) bis zum Protoxinsegment. Die Toxin-DNA- und Proteinsequenzen finden sich bei SEQ ID NO: 20 bzw. 21.

Beispiel 3 - Konstruktion der P. fluorescens-Expressionsplasmide pMYC1260 und pMYC2047

Das klonierte Toxin-Gen cryIF lässt sich zur Expression in P. fluorescens auf folgende Weise modifizieren:
1. Ein Plasmid mit einem Gehalt an den pKK223-3 rrnB- Terminationssequenzen im von pTJS260 abgeleiteten Vektor (Dr. Donald Helinski, U.C. San Diego) lässt sich durch Ligation des BamHI-ScaI-Fragments, das den Ptac- Promotor und den rrnB-Terminator aus pKK223-3 (Pharmacia E. coli-Vektor) enthält, in das Vektorfragment von BamHI bis zum stumpfendigen KpnI von pMYC1197 (beschrieben in EP-0 417 564) herstellen. Das zusammengesetzte Plasmid wird im Anschluss an Transformation von E. coli und Wachstum unter Tetracyclin-Selektion gewonnen.
2. Ein Plasmid mit einem Gehalt an dem Ptac-promovierten cryIF-Toxin- Gen lässt sich durch Ligation des das Toxin-Gen enthaltenden NdeI-NdeI-Fragments (mit unter Verwendung von DNA-Polymerase und dNTPs stumpf gemachten Enden) von etwa 3800 bp aus pMYC1603 (aus NRRL B-18517) in die stumpfendigen EcoRI- und HindIII-stellen von pKK223-3 herstellen. Das Ptac-promovierte cryIF-Toxin- Plasmid lässt sich im Anschluss an Transformation von E. coli nach Züchtung unter Ampicillin-Selektion und Screening auf Plasmide mit Inserts in für die Expression geeigneter Orientierung aus dem Ptac-Promotor nach bekannten Verfahren gewinnen.
3. Das Ptac-promovierte cryIF-Toxin lässt sich in den von pTJS260 abgeleiteten Vektor in einer dreiteiligen Ligation unter Verwendung des 2,4 kb-DNA- Fragments mit BamHI- und ApaI-Enden aus dem Plasmid pTJS260, des ApaI- bis HindIII-Fragments von 8,5 kb mit einem Gehalt an der Replikationsregion des Plasmids von der vorstehenden Stufe 1 und eines HindIII- bis partiellen BamHI- Fragments mit einem Gehalt an dem Ptac-Promotor und dem cryIF-Toxin-Gen aus der vorstehenden Stufe 2 einsetzen.
Das erhaltene, von pTJS260 abgeleitete cryIF-Toxin-Expressionsplasmid (pMYC1260) lässt sich durch Elektroporation in P. fluorescens einführen.
4. pMYC2047 lässt sich durch Ligation eines SpeI- bis KpnI-Fragments, das durch PCR einer geeigneten cryIF-Matrize mit den Primern H und K und anschließenden Verdau mit SpeI und KpnI und Gelreinigung erhalten worden ist, eines ApaI- bis KpnI-Fragments von etwa 10 kb aus dem Plasmid von Stufe 3 und des ApaI- bis SpeI-Fragments von etwa 2600 bp aus pMYC1197 mit einem Gehalt an dem Ptac-Promotor konstruieren. Die korrekten cryIF-Toxin-Expressionsplasmide werden durch Restriktionsenzymverdau von Plasmiden im Anschluss an Elektroporation in Pseudomonas fluorescens ermittelt.

Beispiel 4 - Konstruktion von chimärem cryIF/cryIA(b)

Das cryIA(c)-Segment am Aminoende läst sich durch die cryIF- Kodierungssequenz durch einen einfachen, unkomplizierten Tausch ersetzen (Fig. 5). Sowohl der tetAR-Locus als auch die cryIF-Kodierungssequenz enthalten eine ApaI-Stelle. Ein kleines ApaI-Fragment mit einem Gehalt an einem Teil der tetAR- Gene und dem Aminoende von cryIF lässt sich aus pMYC2047 isolieren und in das große, den ApaI-Vektor enthaltende Fragment von pMYC2039 ligieren. Ein durch Lactose induzierbarer P. fluorescens-Stamm lässt sich der Elektroporation mit dem Ligationsgemisch unterziehen und auf LB-Agar mit einem Gehalt an 20 ug/ml Tetracyclin ausstreichen. Mit Lactose induzierbare Stämme sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise im US-Patent 5 169 760 beschrieben. Die korrekte Orientierung des ApaI-Fragments stellt die Tetracyclin-Resistenz wieder her. Von einem auf diese Weise erzeugten Klon wurde durch Restriktionsenzymverdau gezeigt, dass er im Großen und Ganzen korrekt war. Er erhielt die Bezeichnung pMYC2244. Die Toxin-DNA-Sequenz ist in SEQ ID NO: 22 und die vorhergesagte Proteinsequenz in SEQ ID NO: 23 dargestellt.

Beispiel 5 - Konstruktion einer begrenzten Codon-Rework von cryIF

Die Codon-Verwendung in Pseudomonas spp. begünstigt G oder C in der Wobbelposition von Triplettcodons, wie sich durch Analyse von Genen in den Sequenzbanken der GenBank/EMBL ermitteln lässt. Ein begrenzter Bereich des cryIF-Gens wurde durch SOE nachgearbeitet, um begünstigte Wobbelpositionsänderungen, die stumm waren, einzubauen (Fig. 6). Die verwendeten Oligonucleotide sind nachstehend aufgeführt:
Zwei getrennte PCR-Reaktionen wurden an einer pMYC2047-Matrize mit den Primersets H/I oder J/K durchgeführt. Amplifizierte DNA-Fragmente erhielten die Bezeichnungen HI oder JK. Eine zweite PCR-Reaktion wurde durch Mischen der Fragmente HI und JK und durch PCR-Amplifikation mit dem Primerset H/K durchgeführt. Die größere SOE-DNA wurde der Gelreinigung unterzogen und mit SpeI · KpnI verdaut. Eine dreiteilige Ligation wurde mit SpeI-ApaI-Ptac-tetAR-Locus- DNA, ApaI-KpnI-Vektor-Protoxin-Modul-DNA und SpeI-KpnI-PCR-DNA durchgeführt. Ein durch Lactose induzierbarer Stamm von P. fluorescens kann mit dem Ligationsgemisch der Elektroporation unterworfen werden. Im Großen und Ganzen korrekte Klone lassen sich durch PCR-Analyse unter Verwendung des Primersets P/Q und durch Agarose-TBE-Gelelektrophorese identifizieren. Oligo-P (SEQ ID NO: 15) wurde zur Unterscheidung zwischen dem Wildtypgen und dem Codonnachgearbeiteten Gen konstruiert.
Das vollständige Plasmid erhielt die Bezeichnung pMYC2243. Die Toxin-DNA- Sequenz ist in SEQ ID NO: 24 dargestellt. Die Toxin-Proteinsequenz ist gemäß Vorhersage unverändert und in SEQ ID NO: 25 dargestellt.

Beispiel 6 - Konstruktion des chimären cryIF/cryIA(b) mit einem Gehalt am begrenzten Codon-Rework

Das Konstrukt (Fig. 7) wurde unter Anwendung der gleichen ApaI-Fragment- Austauschstrategie, wie sie vorstehend für pMYC2244 (cryIF/cryIA(b)) angewandt wurde, zusammengesetzt. Das kleine Toxin-tetAR-Locus-ApaI-DNA-Fragment wurde aus pMYC2243 der Gelreinigung unterzogen. Das größere Vektor-Protoxin-Modul- ApaI-DNA-Fragment wurde aus pMYC2244 durch Gelreinigung erhalten. Das vollständige Plasmid erhielt die Bezeichnung pMYC2523. Die vorhergesagten DNA- und Proteinsequenzen finden sich in SEQ ID NO: 26 bzw. 27.

Beispiel 7 - Vergleichende Expression von Toxinen aus pMYC2243 und pMYC2523

Die Toxin-Expression in P. fluorescens wurde auf die vorstehend beschriebene Weise analysiert. 24 und 48 Stunden nach der Induktion erzeugte der pMYC2523 enthaltende Stamm mehr Toxin als der pMYC2243 enthaltende Stamm. Die toxinspezifische Aktivität gegenüber Spodoptera exigua war statistisch unverändert.

Beispiel 8 - Konstruktion des chimären cryIF/436 mit einem Gehalt am begrenzten Codon-Rework

Ein zweiter Typ eines chimären Toxins wurde durch Ersatz des 436-Protoxin- Moduls anstelle von cryIA(b)-Protoxin in pMYC2523 zusammengesetzt (Fig. 8). Die 436-Protoxin-Sequenz besteht aus der cryIA(c)-Sequenz, ausgenommen die Sequenz ganz am C-Ende (vergl. die US-Patente 5 128 130 und 5 169 760, auf die vollinhaltlich verwiesen wird). Protoxin-DNA zur Klonierung wurde durch PCR mit dem Primerset F/M unter Verwendung eines Plasmids, wie pMYC467 (US-Patent 5 169 760) als Matrize erzeugt.
PCR-DNA wurde mit PvuI x BstEII verdaut. Eine dreiteilige Ligation wurde mit SpeI-PvuI-Toxin-DNA aus pMYC2523, SpeI-BstEII-Vektor-DNA aus pMYC2523 und PvuI-BstEII-PCR-Protoxin-Modul-DNA durchgeführt. Ein mit Lactose induzierbarer P. fluorescens-Stamm wurde der Elektroporation mit dem Ligationsgemisch unterzogen. Im Großen und Ganzen korrekte Plasmide wurden durch PCR mit dem Primerset FIG und Screening auf einen geringfügigen Größenanstieg durch Agarose-TBE- Gelelektrophorese identifiziert. Das Konstrukt erhielt die Bezeichnung pMYC2254. Die vorhergesagten DNA- und Proteinsequenzen finden sich in SEQ ID NO: 28 bzw. 29.

Beispiel 9 - Vergleichende Expression von Toxinen aus pMYC2243 und pMYC2254

Die Toxin-Expression in P. fluorescens wurde auf die vorstehend beschriebene Weise analysiert. Die Toxin-Expression aus pMYC2254 war gegenüber der pMYC2243-Expression verbessert.

Beispiel 10 - Insertion des für das chimäre Toxin kodierenden Gens in Pflanzen

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Transformation von Pflanzen mit Genen, die für das insektizide Toxin kodieren. Die transformierten Pflanzen sind gegenüber einem Angriff durch den Zielschädling resistent.
Das für das chimäre Toxin kodierende Gen gemäß der vorliegenden Beschreibung lässt sich in Pflanzenzellen unter Einsatz verschiedener Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, einführen. Beispielsweise stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht, umfassen, zur Durchführung der Insertion fremder Gene in höhere Pflanzen zur Verfügung. Die Vektoren umfassen beispielsweise pBR322, die pUC-Serie, die M13mp-Serie, pACYC184 und dergl. Demzufolge kann die für das B.t.-Toxin kodierende Sequenz in den Vektor an einer geeigneten Restriktionsstelle inseriert werden. Das erhaltene Plasmid wird zur Transformation in E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet, sodann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Die Sequenzanalyse, die Restriktionsanalyse, die Elektrophorese und andere biochemisch/molekularbiologische Verfahren werden nach allgemeinen Analyseverfahren durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Die einzelnen Plasmidsequenzen lassen sich in das gleiche oder in andere Plasmide klonieren. Je nach dem Verfahren zur Insertion der erwünschten Gene in die Pflanze können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wenn beispielsweise das Ti- oder Ri- Plasmid zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet wird, so müssen zumindest der rechte Rand, häufig aber der rechte und der linke Rand der Ti- oder Ri-Plasmid- T-DNA als flankierende Region der zu inserierenden Gene verbunden werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde eingehend untersucht und ist in folgenden Literaturstellen ausführlich beschrieben: EP-0 120 516; Hoekema, The Binary Plant Vector System, Offset-Drukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Kapitel 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., Bd. 4, S. 1- 46; und An et al., EMBO J., Bd. 4 (1985), S. 277-287.
Nachdem die inserierte DNA in das Genom integriert worden ist, ist sie dort relativ stabil und tritt in der Regel nicht wieder aus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum, wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, Chloramphenicol und dergl., verleiht. Der individuell verwendete Marker soll demgemäß die Selektion von transformierten Zellen statt der Zellen, die die inserierte DNA nicht enthalten, ermöglichen.
Eine große Anzahl von Techniken zur Insertion von DNA in eine Pflanzenwirtszelle steht zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation sowie andere mögliche Verfahren. Wenn Agrobakterien für die Transformation verwendet werden, muss die zu inserierende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, nämlich entweder in einen Zwischenvektor oder in einen binären Vektor. Die Zwischenvektoren lassen sich in das Ti- oder Ri-Plasmid durch homologe Rekombination aufgrund von Sequenzen, die mit Sequenzen in der T-DNA homolog sind, integrieren. Das Ti- oder Ri-Plasmid umfasst auch die vir-Region, die für den Transfer der T-DNA erforderlich ist. Zwischenvektoren können sich in Agrobakterien nicht selbst replizieren. Der Zwischenvektor kann mittels eines Helferplasmids in Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).
Binäre Vektoren können sich in E. coli und in Agrobakterien selbst replizieren. Sie umfassen ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, die von den rechten und linken T-DNA-Borderregionen im Raster gehalten werden. Sie können direkt in Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., Bd. 163 (1978), S. 181-187). Das als Wirtszelle verwendete Agrobakterium soll ein eine vir-Region tragendes Plasmid umfassen. Die vir-Region ist für den Transfer der T- DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das auf diese Weise transformierte Bakterium wird für die Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Pflanzenexplantate können in vorteilhafter Weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle gezüchtet werden. Vollständige Pflanzen lassen sich sodann aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stängelsegmente, Wurzeln, jedoch auch Protoplasten oder in Suspension gezüchtete Zellen) in einem geeigneten Medium, das Antibiotika oder Biozide für die Selektion enthält, regenerieren. Die auf diese Weise erhaltenen Pflanzen lassen sich auf die Anwesenheit der inserierten DNA testen. Im Fall von Injektion und Elektroporation werden keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es ist möglich, übliche Plasmide, z. B. pUC- Derivate, zu verwenden.
Die transformierten Zellen wachsen auf übliche Weise im Innern der Pflanzen. Sie können Keimzellen bilden und die transformierten Merkmale an die späteren Pflanzengenerationen übertragen. Derartige Pflanzen können auf normale Weise gezüchtet und mit Pflanzen gekreuzt werden, die die gleichen transformierten, erblichen Faktoren oder andere erbliche Faktoren aufweisen. Die erhaltenen hybriden Individuen weisen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Pflanzen mit Genen transformiert, wobei die Codonverwendung für die Pflanzen optimiert worden ist. Ferner werden vorteilhafterweise Pflanzen, die für ein gekürztes Toxin kodieren, verwendet. Das gekürzte Toxin kodiert typischerweise für etwa 55 bis etwa 80% des Toxins von voller Länge. Verfahren zur Erzeugung synthetischer Gene zur Verwendung in Pflanzen sind aus dem Stand der Technik bekannt.

Beispiel 11 - Klonierung des für das chimäre Toxin kodierenden Gens in Insektenviren

Von einer Anzahl von Viren ist bekannt, dass sie Insekten infizieren. Diese Viren umfassen beispielsweise Baculoviren und Entomopockenviren. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung lassen sich Gene, die für die insektiziden Toxine gemäß den hier gegebenen Ausführungen kodieren, in das Genom des Insektenvirus platzieren, wodurch die Pathogenizität des Virus erhöht wird. Verfahren zum Konstruieren von Insektenviren, die das chimäre Toxin-Gen enthalten, sind bekannt und lassen sich vom Fachmann leicht in der Praxis ausführen. Diese Verfahren werden beispielsweise von Merryweather et al., (A. T. Merryweather, U. Weyer, M. P. G. Harris, M. Hirst, T. Booth, R. D. Possee, J. Gen. Virol., Bd. 71 (1990), S. 1535-1544) und Martens et al. (J. W. M. Martens, G. Honee, D. Zuidema, J. W. M. von Lent, B. Visser, J. M. Vlak, Appl. Environmental Microbiol., Bd. 56(9) (1990), S. 2764-2770) beschrieben.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
(i) ANMELDER:
NAME: Mycogen Corporation
STRASSE: 5501 Oberlin Drive
ORT: San Diego
STAAT: California
LAND: US
POSTLEITZAHL: 92121
TELEFON: (619) 453-8030 FAX: (619) 453-6991
TELEX:
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Improvement of Delta-Endotoxin Expression in Pseudomonas fluorescens
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 34
(iv) KORRESPONDENZANSCHRIFT:
(A) ADRESSAT: David R. Saliwanchik
(B) STRASSE: 2421 N.W. 41st Street, Suite A-1
(C) ORT: Gainesville
(D) STAAT: Florida
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 32606
(v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US
(B) Anmeldetag:
(C) KLASSIFIKATION:
(viii) ANGABEN ZUM VERTRETER:
(A) NAME: Saliwanchik, David R.
(H) VERTRETERNUMMER: 31,794
(C) AKTENZEICHEN: MA83
(ix) TELEKOMMUNIKATION:
(A) TELEFON: (904) 375-8100
(B) TELEFAX: (904) 372-5800
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 18 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 29 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 28 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basen
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(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 36 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 23 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 64 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 65 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 17 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 41 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 24 Basen
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3465 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1155 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3450 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1150 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3444 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1148 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3522 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1174 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3444 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1148 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3522 Basenpaare
(B) ART: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1174 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1184 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1165 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1188 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:

Claims

1. Reines chimäres Bacillus thuringiensis-Toxin umfassend einen N-terminalen cryIF-Kern-Toxinbereich und einen heterologen C-terminalen Protoxinbereich aus einem cryIA(b)-Toxin oder chimären cryIA(b)/cryIA(c)-Toxin.

2. Toxin nach Anspruch 1, welches ungefähr 1150 bis 1200 Aminosäuren aufweist, wobei der Toxinbereich 590 bis 1100 Aminosäuren umfasst und der Protoxinbereich mindestens 100 Aminosäuren am C-Terminus des Toxins umfasst.

3. Toxin nach Anspruch 2, worin der Übergang vom Toxinbereich zum Protoxinbereich nach der Sequenz von SEQ ID NO. 30 und vor dem Ende der Peptidsequenz von SEQ ID NO. 31 erfolgt.

4. Toxin nach Anspruch 3, worin der Toxinbereich die ersten 601 Aminosäuren eines cryIF-Toxins umfasst und der Protoxinberich die cryIA(b) oder cryIA(c)/cryIA(b)- Aminosäuresequenz, die der Peptidsequenz von SEQ ID NO. 31 folgt, umfasst.

5. Toxin nach Anspruch 1, welches im wesentlichen aus der in SEQ ID NO. 23 gezeigten Aminosäuresequenz besteht.

6. Toxin nach Anspruch 1, welches im wesentlichen aus der in SEQ ID NO. 29 gezeigten Aminosäuresequenz besteht.

7. Toxin nach Anspruch 1, welches im wesentlichen aus der in Fig. 9 gezeigten Aminosäuresequenz besteht.

8. Isoliertes Polynucleotid umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein wie in irgendeinem vorangehenden Anspruch definiertes Toxin codiert.

9. Polynucleotid nach Anspruch 8, welches die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO. 22 umfasst.

10. Polynucleotid nach Anspruch 8, welches so modifiziert worden ist, dass ein höherer Prozentsatz an Codons, die von Pseudomonaden favorisiert werden, genutzt wird.

11. Polynucleotid nach Anspruch 10, welches für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO. 27 codiert und vorzugsweise im wesentlichen aus der Sequenz von SEQ ID NO. 26 besteht.

12. DNA-Transfervektor umfassend das Polynucleotid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11.

13. Transformierter Pseudomonad umfassend das Polynucleotid nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 11 und befähigt, das Toxin zu exprimieren.

14. Behandelte intakte Zellen, die intrazellulär ein wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiertes Toxin enthalten.

15. Verfahren zur Bekämpfung von Lepidoptera-Schädlingen, umfassend das Kontaktieren der Schädlinge mit einem wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definierten Toxin.

16. Verfahren zur Verbesserung der Expression von Bacillus thuringiensis-δ- Endotoxin in einem Pseudomonaden, umfassend die Transformation des Pseudomonaden mit einem Gen, das für ein wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 definiertes Toxin codiert.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Gen wie in irgendeinem der Ansprüche 9 bis 11 definiert ist.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin der Pseudomonad ein Pseudomonas fluorescens ist.