DE69111600T2

DE69111600T2 - Bacillus thuringiensis-cryiiic-gen und für coleoptera-insekten toxisches protein.

Info

Publication number: DE69111600T2
Application number: DE69111600T
Authority: DE
Inventors: William Donovan; Timothy Johnson; Mark RUPAR; Annette SLANEY
Original assignee: Ecogen Inc
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 1996-02-29
Anticipated expiration: 2011-03-19
Also published as: RU2106409C1; ES2077223T3; DE69111600D1; EP0522036B1; US5187091A; WO1991014778A2; EP0522036A1; NZ237404A; CA2078571C; PL289512A1; WO1991014778A3; JP3078576B2; CA2078571A1; KR930700664A; ATE125569T1; EP0606110A1; AU645080B2; PL165919B1; AU7555291A; HUT62036A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein aus Bacillus thuringiensis (hier nachstehend als "Bt" bezeichnet) isoliertes Gen, das ein insektizides Kristallprotein mit der Bezeichnung CryIIIC codiert, sowie insektizide Zusammensetzungen, die das Protein enthalten, und Pflanzen, die mit dem Gen transformiert sind. Die insektiziden Zusammensetzungen und transformierten Pflanzen sind für Insekten der Ordnung Coleoptera toxisch und für Insekten der Gattung Diabrotica besonders toxisch.

Hintergrund der Erfindung

Bt ist ein Gram-positives Bodenbakterium, das während der Sporulierung Kristallproteine produziert, die für bestimmte Ordnungen und Arten von Insekten spezifisch toxisch sind. Es wurde festgestellt, daß viele verschiedene Bt- Stämme insektizide Kristallproteine produzieren. Zusammensetzungen, die insektizide Proteine produzierende Bt-Stämme enthalten, sind im Handel erhältlich und werden als umweltverträgliche Insektizide verwendet, da sie für ein bestimmtes Zielinsekt ziemlich toxisch, jedoch für Pflanzen und andere Nicht-Zielorganismen unschädlich sind.
Es wurden mehrere Kristallproteine codierende Gene aus mehreren Bt-Stämmen cloniert. Einen guten Überblick geben H. Hofte et al., Microbiol. Rev. 53 (1989), 242-255. Obwohl diese Veröffentlichung im Hinblick auf die vorliegende Erfindung nicht Stand der Technik ist, gibt sie einen guten Überblick über die von Bt erhaltenen Gene und Proteine und ihre Verwendungen, enthält ein Benennungs- und Klassifizierungsschema für Bt-Gene und Proteine und weist ein umfangreiches Literaturverzeichnis auf.
Das Bt-Kristallprotein ist nur nach seiner Aufnahme durch die Nahrung im Insekt wirksam. Nachdem es von einem Insekt durch die Nahrung aufgenommen worden ist, solubilisieren der alkalische ph-Wert und proteolytische Enzyme im Mitteldarm das Kristall, wobei die toxischen Bestandteile freigesetzt werden. Diese toxischen Bestandteile zerstören die Zellen des Mitteldarms, wonach das Insekt die Nahrungsaufnahme einstellt und schließlich stirbt. Bt hat sich tatsächlich als ein wirksames und umweltverträgliches Insektizid zur Bekämpfung von verschiedenen schädlichen Insekten erwiesen.
Wie von Hofte et al. beschrieben, ist der größte Teil der insektiziden Bt-Stämme gegen Insekten der Ordnung Lepidoptera, d. h., ein Raupenstadium durchlaufende Insekten, wirksam. Weitere Bt-Stämme sind als Insektizid gegen Insekten der Ordnung Diptera, d. h., Fliegen und Mosquitos, oder sowohl gegen Lepidopteren als auch Dipteren-Insekten wirksam. Bisher wurden nur wenige Bt-Stämme beschrieben, die als Insektizid gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, d. h., Käfer, wirksame Kristallproteine Produzieren.
Die erste Isolierung eines Coleopteren-toxischen Bt- Stamms wird von A. Krieg et al., in Z. angew. Ent. 96 (1983), 500-508, beschrieben; vgl. außerdem A. Krieg et al., Anz. Schädlingskde, Pflanzenschutz, Umweltschutz 57 (1984), 145-150, und das US-Patent Nr. 4,766,203 von A. Krieg et al., das am 23. August 1988 erteilt wurde. Vom Stamm mit der Bezeichnung Bt var. tenebrionis heißt es, daß er für Larven der Coleopteren-Insekten Agelastica alni ("blue alder leaf beetle") und Leptinotarsa deceinlineata ("Colorado"-Kartof felkäfer) toxisch ist. Bt tenebrionis produziert ein insektizides Kristallprotein, von dem es heißt, daß es etwa 65 bis 70 Kilodalton (kD) aufweist (US-Patent Nr. 4,766,203; vgl. außerdem K. Bernhard, FEMS Microbiol. Lett. 33 (1986), 261-265)
V. Sekar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7036-7040, beschreiben die Clonierung und Charakterisierung des Gens des Coleopteren-toxischen Kristallproteins von Bt tenebrionis. Die Größe des Proteins, wie sie aus der Gensequenz abgeleitet wurde, war 73 kD, das isolierte Protein enthielt jedoch primär einen 65 kD-Bestandteil. Hofte et al., Nucleic Acids Research 15 (1987), 7183, beschreiben außerdem die DNA-Sequenz des clonierten Gens von Bt tenebrionis, und die Sequenz des Gens ist mit der von Sekar et al. (1987) beschriebenen identisch.
McPherson et al., Bio/Technology 6 (1988), 61-66, beschreiben die DNA-Sequenz des clonierten Insekten-Kontrollgens von Bt tenebrionis, und die Sequenz ist mit der von Sekar et al. (1987) beschriebenen identisch. Es wurde festgestellt, daß E. coli-Zellen und Pseudomonas fluorescens-Zellen, die das clonierte Gen enthielten, für Larven des "Colorado"-Kartoffelkäfers toxisch waren.
Von C. Herrnstadt et al., Bio/Technology 4 (1986), 305-308, wird ein Coleopteren-toxischer Stamm mit der Bezeichnung Bt var. san diego beschrieben, der ein 64 kD- Kristallprotein produziert, das für verschiedene Coleopteren-Insekten toxisch ist: eine starke Toxizität für Pyrrhalta luteola (Ulmenblattkäfer), mäßige Toxizität für Anthonomus grandis (Baumwollkapselkäfer), Leptinotarsa decemlineata ("Colorado"-Kartoffelkäfer), Otiorhynchus sulcatus (Dickmaulrüßler), Tenebrio molitor (gelber Mehlwurmkäfer) und Haltica tombacina und eine schwache Toxizität für Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata ("western spotted cucumber beetle")
Die DNA-Sequenz des clonierten Coleopteren-Toxingens von Bt san diego wird von C. Herrnstadt et al., Gene 57 (1987), 37-46, beschrieben; vgl. ferner das US-Patent Nr. 4,771,131 von Herrnstadt et al., das am 13. September 1988 erteilt wurde. Die Sequenz des Toxingens von Bt san diego ist mit der identisch, die von Sekar et al. (1987) für das clonierte Coleopteren-Toxingen von Bt tenebrionis beschrieben wird.
A. Krieg et al., J. Appl. Ent. 104 (1987), 417-424, berichten, daß mehrere diagnostische Tests zeigen, daß der Stamm Bt san diego mit dem Stamm Bt tenebrionis identisch ist.
Von W. P. Donovan et al., Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 365-372, wird ein weiterer neuer Bt-Stamm mit der Bezeichnung EG2158, der ein eine insektizide Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten aufweisendes 73 kD-Kristallprotein produziert, beschrieben. Das Toxin-codierende Gen von Bt-Stamm EG2158 wurde cloniert und sequenziert, und seine Sequenz ist mit der von Sekar et al. (1987) für das clonierte Coleopteren-Toxingen von Bt tenebrionis beschriebenen Sequenz identisch. Dieses Coleopteren-Toxingen wird von Höfte et al., Microbiol. Rev. 53 (1989), 242-255, als cryIIIA-Gen bezeichnet.
Das am 10. Januar 1989 erteilte US-Patent Nr. 4,797,279 von D. Karamata et al. offenbart einen Bt-Hybridmikroorganismus, der ein Plasmid aus Bt kurstaki mit einem Lepidopteren-Toxingen und ein Plasmid aus Bt tenebrionis mit einem Coleopteren-Toxingen enthält. Das Bt-Hybrid produziert Kristallproteine, die für die von Bt kurstaki, sowie die für Bt tenebrionis produzierten typisch sind.
Die am 15. Februar 1989 veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 303 379 der Mycogen Corporation offenbart ein neues Bt-Isolat, das als Bt MT 104 mit einer insektiziden Wirksamkeit sowohl gegen Coleopteren- als auch Lepidopteren-Insekten identifiziert wurde.
Die am 31. Mai 1989 veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 318 143 der Lubrizol Genetics Inc. offenbart die Clonierung, Charakterisierung und selektive Expression des intakten, teilweise modifizierten Gens von Bt tenebrionis und den Transfer des clonierten Gens in einen Wirtsmikroorganismus, wodurch der Mikroorganismus ein Protein mit einer Toxizität für Coleopteren-Insekten produzieren kann. Ergebnisse von mit Bt san Diego durchgeführten biologischen Tests an Insekten, die von Herrnstadt et al., Bio/Technology 4 (1986), 305-308, wie vorstehend beschrieben, entnommen wurden, werden zusammengefaßt. Die Zusammenfassung enthält außerdem Daten für Bt tenebrionis aus einer anderen Quelle. Es wird berichtet, daß Bt tenebrionis eine starke Toxizität für den "Colorado"-Kartoffelkäfer, eine mäßige Toxizität für den "western corn rootworm" (Diabrotica virgifera virgifera) und eine schwache Toxizität für den "southern corn rootworm" (Diabrotica undecimpunctata) zeigt.
Die am 19. Juli 1989 veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 324 254 der Imperial Chemical Industries PLC offenbart einen neuen Bt-Stamm mit der Bezeichnung A30, der eine insektizide Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten aufweist.
Die am 16. August 1989 veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 328 383 der Mycogen Corporation offenbart einen neuen Bt-Mikroorganismus mit der Bezeichnung Bt PS40D1, der eine insektizide Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten aufweist.
Die am 30. August 1989 veröffentlichte europäische Patentanmeldung Nr. 0 330 342 der Mycogen Corporation offenbart einen neuen Bt-Mikroorganismus mit der Bezeichnung Bt P58681, der eine insektizide Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten aufweist.
Die letzten vier Veröffentlichungen stellen im Hinblick auf die vorliegende Erfindung keinen Stand der Technik dar.
Der zuerst von A. Krieg et al. beschriebene Bt tenebrionis wurde in oder in der Nähe von Darmstadt, Deutschland, entdeckt, und es wird angenommen, daß Bt san diego, der von Herrnstadt et al. beschrieben wurde, von einem Ort in oder in der Nähe von San Diego, Kalifornien, erhalten wurde. Der Bt-Stamm EG2158, der von Donovan et al. beschrieben wurde, wurde aus einer Getreidestaubprobe aus Kansas isoliert. Verschiedene Bt-Stämme, die an mehreren geographisch weit auseinanderliegenden Orten isoliert worden waren, enthielten daher alle ein anscheinend identisches Coleopteren-Toxingen, das cryIIIA-Gen.
Es gibt anscheinend nur Veröffentlichungen über das eine, vor mehr als sieben Jahren in Bt tenebrionis zuerst entdeckte Bt-Gen und keine über neue Coleopteren-Bt-Toxingene.
Selbst von den unterschiedlichen Bt-Stämmen, von denen es heißt, daß sie Kristallproteine mit einer insektiziden Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten produzieren, wies ferner keiner eine signifikante Toxizität für Larven und ausgewachsene Tiere der Insektengattung Diabrotica ("corn rootworm"), die den "Western corn rootworm" (Diabrotica virgifera virgifera), "southern corn rootworm" (Diabrotica undecimpunctata howardi) und "northern corn rootworm" (Diabrotica barberi) einschließt, auf. Das erfindungsgemäße cryIIIC-Gen exprimiert ein Proteintoxin mit einer quantifizierbaren insektiziden Wirksamkeit gegen Diabrotica-Insekten neben anderen Coleopteren-Insekten.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein gereinigtes und isoliertes Coleopteren-Toxingen mit einer Nucleotidbasensequenz, die die in Figur 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert und hier nachstehend als cryIIIC-Gen bezeichnet wird. Das cryIIIC-Gen weist einen codierenden Bereich auf, der sich von den Nucleotidbasen 14 bis 1972 von Figur 1 erstreckt.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft das vom cryIIIC-Gen produzierte insektizide Protein. Das CryIIIC-Protein weist die Aminosäuresequenz auf, die von der Nucleotidsequenz des cryIIIC-Gens von den Basen 14 bis 1972 von Figur 1 abgeleitet werden kann. Das Protein zeigt eine insektizide Wirksamkeit gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, insbesondere den "Colorado"-Kartoffelkäfer, und Insekten der Gattung Diabrotica.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft eine biologisch reine Kultur des Bakteriums Bt, das bei der NRRL unter der Hinterlegungsnr. NRRL B-18533 hinterlegt worden ist und als Bt-Stamm EG4961 bezeichnet wird. Der Bt- Stamm EG4961 trägt das cryIIIC-Gen und produziert das insektizide CryIIIC-Protein. Biologisch reine Kulturen von anderen, das cryIIIC-Gen tragenden Bt-Bakterien sind ebenfalls im Schutzbereich der Erfindung.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft insektizide Zusammensetzungen, die entweder das CryIIIC- Protein oder Fermentatlonskulturen eines BT-Stamms, der das CryIIIC-Protein produziert hat, zusammen mit einem landwirtschaftlich verträglichen Träger enthalten.
Die Erfindung schließt außerdem ein Verfahren zur Bekämpfung von Coleopteren-Insekten ein, in dem eine als Insektizid wirksame Menge des CryIIIC-Proteins oder eine Fermentationskultur eines Bt-Stamms, der das CryIIIC-Protein produziert hat, auf eine Wirtspflanze derartiger Insekten aufgetragen wird, Das Verfahren kann für verschiedene Coleopteren-Insekten, die den "Colorado"-Kartoffelkäfer, Ulmenblattkäfer, "imported willow leaf beetle" und "corn rootworm" einschließen, verwendet werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein rekombinantes Plasmid, das das cryIIIC-Gen enthält, eine biologisch reine Kultur eines mit einem derartigen rekombinanten Plasmid transformierten Bakteriums, wobei das Bakterium vorzugsweise Bt ist, sowie eine mit dem cryIIIC- Gen transformierte Pflanze.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein Verfahren zur Verstärkung der insektiziden Wirksamkeit einer ein Coleopteren-toxisches Protein enthaltenden Zusammensetzung gegen Coleopteren-Insekten, wobei in dem Verfahren die Zusammensetzung, die ein CryIIIC- und ein CryI- Protein in einer die insektizide Wirksamkeit der Zusammensetzung wirksam verstärkenden Menge enthält, zugesetzt oder eingeschlossen wird. Die insektiziden Zusammensetzungen, die das CryIIIC- und ein CryI-Protein enthalten, zeigen eine verbesserte insektizide Wirksamkeit gegen Insekten der Ordnung Coleoptera, besonders gegen den "Colorado"-Kartoffelkäfer und "corn rootworm".

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 umfaßt die Figuren 1-1 bis 1-3 und zeigt die Nucleotidbasensequenz des cryIIIC-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryIIIC-Proteins. Die mutmaßliche Ribosomenbindungsstelle (RBS) ist angezeigt. Die HindIII- und BamHI- Restriktionsstellen sind ebenfalls angegeben.
Figur 2 ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels, das nach Größe getrennte, native Plasmide der Bt-Stämme EG2158, EG2838 und EG4961 enthält. Die Zahlen auf der rechten Seite von Figur 2 geben die ungefähren Größen der Plasmide von Bt-Stamin EG4961 in Megadalton (MD) an.
Figur 3 ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Transfer der in Figur 2 dargestellten Plasmide auf ein Nitrozellulosefilter, Hybridisierung des Filters mit einer radioaktiv markierten 2,4 Kilobasen (kb)-cryIIIB-Sonde und Exponierung des Filters gegen einen Röntgenfilm erhalten wurde. Die Zahl auf der rechten Seite von Figur 3 gibt die Größe des an die cryIIIB-Sonde hybridisierenden Plasmids von Bt-Stamm EG4961 in MD an. Der Buchstabe "f" auf der rechten Seite von Figur 3 zeigt die Fragmente, die durch Zerbrechen des mit cryIIIB hybridisierenden Plasmids erhalten wurden.
Figur 4 ist ein Photo eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels, das mit HindIII und EcoRI gespaltene und durch Elektrophorese nach Größe getrennte DNA von den Bt-Stämmen EG2158, EG2838 und EG4961 enthält. Die mit "stnd" markierte Bahn ist ein Größenstandard.
Figur 5 ist ein Photo eines Autoradiogramms, das durch Transfer der in Figur 4 dargestellten DNA-Fragmente auf ein Nitrozellulosefilter, Hybridisierung des Filters mit der radioaktiv markierten 2,4 kb-cryIIIB-Sonde und Exponierung des Filters gegen einen Röntgenfilm erhalten wurde. Die Zahlen auf der rechten Seite von Figur 5 geben die Größe der an die cryIIIB-Sonde hybridisierenden Restriktionsfragmente von Bt-Stamm EG4961 in kb an. Die mit "stnd" markierte Bahn ist ein Größenstandard.
Figur 6 ist ein Photo eines mit Coomassie gefärbten Natriumdodecylsulfat ("SDS")-Polyacrylamidgels, das aus den Bt-Stämmen EG2158, EG2838 und EG4961 solubilisierte Kristallproteine zeigt. Die Zahlen auf der rechten Seite von Figur 6 geben die ungefären Größen der von Bt-Stamm EG4961 produzierten Kristallproteine in kD an.
Figur 7 zeigt eine Restriktionskarte von Plasmid pEG258. Die Lage und Orientierung des cryIIIC-Gens sind durch einen Pfeil angegeben. Ein als cryX-Gen bezeichnetes Gen liegt innerhalb des durch die punktierte Linie angezeigten Bereichs. Bezüglich der Restriktionsenzyme steht Asp für Asp718, Bam für BamHI, H3 für HindIII und P für PstI. Eine Maßeinheit von 1 kb ist ebenfalls angegeben.
Figur 8 zeigt eine an Figur 7 ausgerichtete und im selben Maßstab gezeichnete Restriktionskarte von Plasmid pEG260, das ein 8,3 kb-DNA-Fragment von Bt-Stamm EG4961 enthält, wobei das cryIIIC-Gen durch einen Pfeil angezeigt ist und das cryX-Gen innerhalb des durch die gepunktete Linie angezeigten Bereichs liegt. Zusätzlich zu den für die Restriktionsenzyme im Zusammenhang mit Figur 7 vorstehend angegebenen Abkürzungen steht (RV/Asp) für die Fusion der EcoRV- und Asp718-Restriktionsstellen und (RV/Pst) für die Fusion von EcoRV- und PstI-Restriktionsstellen.
Figur 9 zeigt eine an Figur 7 ausgerichtete und im selben Maßstab gezeichnete Restriktionskarte von Plasmid pEG269, das das cryIIIC-Gen, wie es durch einen Pfeil angezeigt ist, als Teil eines DNA-Fragments vom rekombinanten E. coli-Stamm EG7233 enthält. Die im Zusammenhang mit pEG258 verwendeten Abkürzungen, die in Figur 7 dargestellt sind, gelten auch für diese Figur. Ferner steht Sph für die SphI- Restriktionsstelle und S3A/Bam für die Fusion der SauIIIAund BamHI-Restriktionsstellen.
Figur 10 ist ein Photo eines Coomassie-gefärbten SDS- Polyacrylamidgels. Das Gel zeigt Proteinbanden, die von den nachstehend beschriebenen Bakterienstämmen synthetisiert wurden: E. coli-Stamm EG7221(pUC18/Cry&supmin;), E. coli-Stamm EG7218(pEG258/cryIIIC&spplus; cryx+), Bt-Stamm EG7211(pEG220/Cry&supmin;), Bt-Stamm EG4961(cryIIIC&spplus; cryX&spplus;), Bt-Stamm EG7231(pEG269/cryIIIC&spplus; cryX&supmin;) und Bt-Stamm EG7220(pEG260/cryIIIC&spplus; cryX&spplus;). Die Zahlen auf der rechten Seite des Gels geben die ungefähren Größen der von diesen Stämmen produzierten Kristallproteine in kD an.

Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Isolierung und Reinigung des cryIIIC-Gens und des Coleopteren-toxischen CryIIIC-Kristallproteins und die Charakterisierung des das CryIIIC-Protein produzierenden neuen Bt-Stamms EG4961 sind in den Beispielen ausführlich beschrieben. Die Nützlichkeit von Bt-Stamm EG4961 und des CryIIIC-Kristallproteins in insektiziden Zusammensetzungen und von Verfahren ist in den Beispielen ebenfalls beschrieben.
Die Beispiele beschreiben außerdem die synergistische Verstärkung der insektiziden Wirksamkeit des CryIIIC-Proteins durch Zugabe eines CryI-Proteins. Insektizide Zusammensetzungen erhalten daher durch eine Kombination aus CryIIIC- und CryI-Proteinen eine verstärkte insektizide Wirksamkeit, besonders im Hinblick auf Larven sowie ausgewachsene Tiere des "Colorado"-Kartoffelkäfers und "southern corn rootworm" sowie weiterer Insekten.
Das erfindungsgemäße Gen vom cryIII-Typ, das cryIIIC- Gen, weist die in Figur 1 dargestellte Nucleotidbasensequenz auf. Der codierende Bereich des cryIIIC-Gens erstreckt sich von der Nucleotidbasenposition 14 bis zur Position 1972 in Figur 1.
Ein Vergleich der Nucleotidbasenpaare des das cryI- IIC-Gen codierenden Bereichs mit dem entsprechenden codierenden Bereich des im Stand der Technik bekannten cryIIIA- Gens zeigt signifikante Unterschiede zwischen den beiden Genen. Das cryIIIC-Gen ist lediglich zu 75 % mit dem cryI- IIA-Gen homolog (an einigen Positionen identisch).
Ein Vergleich der Nucleotidbasenpaare des das cryI- IIC-Gen codierenden Bereichs mit dem entsprechenden codierenden Bereich des cryIIIB-Gens, das vom kürzlich entdeckten Bt-Stamm EG2838 (NRRL-Hinterlegungsnr. B-18603) erhalten wurde, zeigt, daß das cryIIIC-Gen zu 96 % mit dem cryIIIB- Gen homolog (an einigen Positionen identisch) ist.
Das erfindungsgemäße Protein vom CryIII-Typ, das CryIIIC-Protein, das vom cryIIIC-Gen codiert wird, weist die in Figur 1 dargestellte Aminosäuresequenz auf. In dieser Beschreibung wird der Begriff "CryIIIC-Protein" mit den Begriffen "Kristallprotein", "Proteintoxin", "insektizides Protein" oder ähnlichen Begriffen synonym verwendet, es sei denn, es ergibt sich aus dem Zusammenhang ein anderer Sinn. Die aus der DNA-Sequenz des cryIIIC-Gens abgeleitete Größe des CryIIIC-Proteins ist 74,4 kD.
Die aus der Sequenz des cryIIIB-Gens abgeleitete Größe des CryIIIB-Proteins ist 74,2 kD. Für das vom cryIIIA- Gen codierte, im Stand der Technik bekannte CryIIIA-Protein konnte eine Größe von 73,1 kD abgeleitet werden.
Trotz der offensichtlichen Ähnlichkeit in der Größe zeigen sich bei einem Vergleich der Aminosäuresequenz des CryIIIC-Proteins mit der des im Stand der Technik bekannten CryIIIA-Proteins signifikante Unterschiede. Das CryIIIC- Protein ist lediglich zu 69 % mit dem CryIIIA-Protein homolog (an einigen Positionen identische Aminosäuren). Das CryIIIC-Protein ist zu 94 % mit dem CryIIIB-Protein homolog. Trotz der offensichtlichen Homologie der CryIIIC- und CryIIIB-Proteine unterscheidet sich das CryIIIC-Protein trotzdem vom CryIIIB-Protein aufgrund seiner signifikant verstärkten insektiziden Wirksamkeit im Vergleich zum CryIIIB-Protein im Hinblick auf Insekten der Ordnung Coleoptera und besonders Insekten der Gattung Diabrotica. Das CryIIIC-Protein ist das erste Bt-Protein, das eine quantifizierbare insektizide Wirksamkeit gegen "corn rootworms" zeigt.
In den Schutzbereich der Erfindung sollen auch Mutanten und durch Rekombination oder gentechnisch hergestellte Derivate des cryIIIC-Gens eingeschlossen sein, die ein Coleopteren-toxisches Protein mit den im wesentlichen gleichen Eigenschaften wie das CryIIIC-Protein liefern.
Das cryIIIC-Gen kann ferner als DNA-Hybridisierungssonde zum Auffinden von ähnlichen oder nahe verwandten Genen vom cryIII-Typ in anderen Bt-Stämmen verwendet werden. Das cryIIIC-Gen, Teile oder Derivate davon können zur Verwendung als Hybridisierungssonde z B. mit einem radioaktiven Marker unter Verwendung von üblichen Verfahren markiert werden. Die markierte DNA-Hybridisierungssonde kann anschließend in der in den Beispielen beschriebenen Weise verwendet werden.
Das cryIIIC-Gen und das entsprechende insektizide CryIIIC-Protein wurden zuerst im Bt-Stamm EG4961, einem neuen Bt-Stamm, identifiziert. Die Eigenschaften von Bt- Stamm EG4961 sind in den Beispielen genauer beschrieben. Ein Vergleich der Plasmidanordnungen und weiterer Stammeigenschaften von Bt-Stamm EG4961 mit denen des kürzlich entdeckten Bt-Stamms EG2838 und denen des im Stand der Technik bekannten Bt-Stamms EG2158 zeigt, daß diese drei Coleopteren-toxischen Bt-Stämme eindeutig unterschiedlich sind.
Das cryIIIC-Gen kann unter Verwendung von dem Fachmann vertrauten Verfahren zur Transformation von geeigneten Wirten unter Bedingungen, die eine stabile Beibehaltung und Expression des clonierten cryIIIC-Gens ermöglichen, in zahlreiche Wirtsmikroorganismen eingeführt werden. Beispiele für geeignete Wirte, die das cryIIIC-Gen exprimieren und das CryIIIC-Protein produzieren können, sind Bacillus thuringiensis und weitere Bacillus-Arten, beispielsweise B. subtilis oder B. megaterium. Es ist selbstverständlich, daß genetisch veränderte oder gentechnisch behandelte Mikroorganismen, die das cryIIIC-Gen enthalten, auch andere im gleichen Mikroorganismus vorhandene Toxingene enthalten und diese Gene gleichzeitig vom CryIIIC-Protein unterscheidbare insektizide Kristallproteine produzieren können.
Die in dieser Offenbarung beschriebenen Bacillus- Stämme können unter Verwendung von üblichen Nährmedien und Standardfermentationsverfahren gezüchtet werden. Die das cryIIIC-Gen enthaltenden Bt-Stämme können, wie in den Beispielen beschrieben, bis zum Stadium des Wachstumszyklus der gezüchteten Bt-Zellen, in dem das CryIIIC-Kristallprotein gebildet wird, fermentiert werden. Bei sporenbildenden Bt- Stämmen wird die Fermentation üblicherweise während des Sporulierungsstadiums, in dem das CryIIIC-Kristallprotein zusammen mit den Sporen gebildet wird, fortgesetzt. Die Bt- Fermentationskultur wird anschließend üblicherweise durch Zentrifugation, Filtration oder ähnliche Verfahren geerntet, um die Feststoffe der Fermentationskultur, die das CryIIIC- Kristallprotein enthalten, vom wäßrigen Teil der Kulturbrühe zu trennen.
Die in dieser Offenbarung als Beispiele beschriebenen Bt-Stämme sind sporulierende Varietäten (sporenbildende oder sporogene Stämme), wobei das cryIIIC-Gen jedoch auch in nichtsporenbildenden Bacillus-Stämmen, d. h., in Stämmen, die das Kristallprotein ohne Sporenbildung produzieren, verwendet werden kann. Es ist selbstverständlich, daß der Begriff "Fermentationskulturen" von Bt-Stämmen (die das cryIIIC-Gen enthalten) bei seiner Verwendung in dieser Beschreibung sporulierte Bt-Kulturen, d. h., Bt-Kulturen, die das CryIIIC-Kristallprotein und Sporen enthalten, und sporogene Bacillus-Stämme, die während des vegetativen Stadiums Kristallproteine produziert haben, sowie das cryIIIC-Gen enthaltende nichtsporenbildende Bacillus-Stämme, in denen die Kultur das Wachstumsstadium mit der tatsächlichen Produktion des Kristallproteins erreicht hat, einschließt.
Die abgetrennten Feststoffe des Fermentationsmediums sind im wesentlichen das CryIIIC-Kristallprotein und Bt- Sporen zusammen mit einigen Zelltrümmern, einigen intakten Zellen und Feststoffrückständen des Fermentationsmediums. Das Kristallprotein kann gegebenenfalls durch übliche Verfahren, z. B. Saccharose-Dichtegradientenfraktionierung, von anderen gewonnenen Feststoffen abgetrennt werden. Hochgereinigtes CryIIIC-Protein kann durch Solubilisierung des gewonnenen Kristallproteins und einer anschließenden erneuten Ausfällung des Proteins aus der Lösung erhalten werden.
Das CryIIIC-Protein ist, wie vorstehend beschrieben, eine potente insektizide Verbindung gegen Coleopteren-Insekten, beispielsweise den "Colorado"-Kartoffelkäfer, Ulmenblattkäfer, "imported willow leaf beetle" und ähnliche Insekten. Das CryIIIC-Protein zeigt im Gegensatz zu den CryIIIA- und CryIIIB-Proteinen eine meßbare insektizide Wirksamkeit gegen Diabrotica-Insekten, z. B. "corn rootworms", die mit anderen Coleopteren-toxischen Bt-Kristallproteinen kaum bekämpft werden können. Das CryIIIC-Protein kann als aktiver Bestandteil in insektiziden Formulierungen, mit denen beispielsweise die vorstehend beschriebenen Coleopteren-Insekten bekämpft werden, verwendet werden. Derartige insektizide Formulierungen oder Zusammensetzungen enthalten außer dem aktiven Bestandteil üblicherweise landwirtschaftlich verträgliche Träger oder Adjuvanzien.
Das CryIIIC-Protein kann direkt nach der Isolierung oder nach einer Reinigung, z. B. als gereinigtes Kristallprotein, in insektiziden Formulierungen verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann das CryIIIC-Protein in den aus dem Fermentationsmedium gewonnenen Feststoffen, die durch Züchtung eines Bacillus-Stamms, z. B. Bacillus thuringiensis, oder anderer Wirtsmikroorganismen, die das cryIIIC-Gen tragen und das CryIIIC-Protein produzieren können, enthalten sein. Beispiele für bevorzugte Bacillus-Wirte sind der Bt-Stamm EG4961 und von Bt-Stamm EG4961 stammende, genetisch verbesserte Bt-Stämme. Die zuletzt genannten Bt-Stämme können durch Plasmideliminierung und/oder Konjugationsverfahren erhalten werden und enthalten das das native cryIIIC-Gen enthaltende Plasmid von Bt-Stamm EG4961. Gentechnisch veränderte oder transformierte Bt- Stämme oder andere Wirtsmikroorganismen, die ein das clonierte cryIIIC-Gen exprimierendes rekombinantes Plasmid, das durch DNA-Rekombinationsverfahren erhalten wird, enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Beispiele für derartige Transformanten sind die Bt- Stämme EG7231 und EG7220, die beide das clonierte cryIIIC- Gen auf einem rekombinanten Plasmid enthalten.
Die aus dem Fermentationsmedium gewonnenen Feststoffe enthalten im wesentlichen das Kristallprotein und (wenn ein sporulierender Bt-Wirt verwendet wird) Sporen. Zelltrümmer und Feststoffrückstände des Fermentationsmediums können ebenfalls vorhanden sein. Die das CryIIIC-Protein enthaltenden, aus dem Fermentationsmedium gewonnenen Feststoffe können gegebenenfalls vor der Zugabe zur insektiziden Formulierung getrocknet werden.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen oder Zusammensetzungen, die das insektizide CryIIIC-Protein als aktiven Bestandteil enthalten, werden in einer für eine insektizide Wirksamkeit ausreichenden Menge angewendet, die in Abhängigkeit von Faktoren, wie beispielsweise den jeweils zu bekämpfenden Coleopteren-Insekten, der jeweils zu behandelnden Pflanze oder Feldfrucht und dem Verfahren des Auftragens der insektiziden aktiven Zusammensetzungen, schwankt. Eine als Insektizid wirksame Menge der insektiziden Formulierung wird im erfindungsgemäßen Verfahren zur Bekämpfung von Insekten verwendet.
Die Insektizid-Zusammensetzungen werden hergestellt, indem der insektizide aktive Bestandteil mit dem gewünschten landwirtschaftlich verträglichen Träger formuliert wird. Die formulierten Zusammensetzungen können als Stäube, Granulat oder Suspension in (pflanzlichem oder mineralischem) öl oder Wasser oder Öl/Wasser-Emulsionen, netzbares Pulver oder zusammen mit einem zur landwirtschaftlichen Verwendung geeigneten beliebigen anderen Trägermaterial verwendet werden. Geeignete landwirtschaftliche Träger können fest oder flüssig sein und sind im Stand der Technik bekannt. Der Begriff "landwirtschaftlich verträglicher Träger" betrifft alle Adjuvanzien, z. B. inerte Bestandteile, Dispersionsmittel, grenzflächenaktive Mittel, Klebemittel, Bindemittel etc., die üblicherweise in der Technologie der Insektizidformulierung verwendet werden. Diese sind dem Fachmann für Insektizidformulierungen vertraut.
Die Formulierungen, die das CryIIIC-Protein und ein oder mehrere feste oder flüssige Adjuvanzien enthalten, werden durch übliche Verfahren hergestellt, z. B. durch homogenes Vermischen, Vermischen und/oder Verreiben des insektiziden aktiven CryIIIC-Protein-Bestandteils mit geeigneten Adjuvanzien unter Verwendung von üblichen Formulierungsverfahren.
Das CryIIIC-Protein kann ferner zusammen mit einem CryI-Protein verwendet werden, wobei eine unerwartete verstärkte insektizide Wirksamkeit gegen ein Coleopteren-Zielinsekt erhalten wird. Die Coleopteren-spezifische Wirksamkeit des CryIIIC-Proteins wird durch Zugabe oder Einschluß eines CryI-Proteins in eine das CryIIIC-Protein enthaltende insektizide Zusammensetzung wesentlich verstärkt. Dieses Verfahren kann zur Herstellung von synergistischen CryIIIC- CryI-Protein-Insektizidzusammensetzungen durch eine physikalische Kombination der CryIIIC- und CryI-Proteine oder eine Kombination von Bt-Stämmen, die die jeweiligen Proteine produzieren, verwendet werden. Das in den synergistischen CryIII-Insektizidkombinationen verwendete bevorzugte CryI- Protein ist CryIA und besonders CryIA(c), obwohl wahrscheinlich auch andere CryI-Proteine in synergistischen Kombinationen verwendet werden können. Überraschenderweise wird anscheinend die insektizide Wirksamkeit des CryI- Proteins gegen Lepidopteren-Insekten nicht verstärkt, d. h., es gibt anscheinend keine durch das CryIIIC-Kristallprotein verliehene "Umkehrsynergie" für CryI-Proteine.
Erfindungsgemäße Kombinationen der CryIIIC- und CryI- Proteine können gegebenenfalls zusammen in situ aus Kulturen von Bt-Stämmen oder anderen Wirtsmikroorganismen, die ein cryIIIC-Gen und cryI-Gene tragen, die die CryIIIC- und CryI- Proteine produzieren können, erhalten werden. Derartige Stämme oder Wirte können durch Plasmideliminierung und/oder Konjugationsverfahren erhalten werden, wobei Bt- oder andere Stämme oder Wirtsmikroorganismen, die ein die clonierten cryIIIC- und cryI-Gene exprimierendes rekombinantes Plasmid enthalten, eingeschlossen sind.
Die Zugabe von CryI-Protein in einer Menge, die etwa der in der Zusammensetzung vorhandenen Menge CryIIIC-Protein äquivalent ist, bewirkt eine deutliche Verstärkung der Coleopteren-spezifischen insektiziden Wirksamkeit. Kleinere Mengen CryI-Protein im CryI:CryIIIC-Verhältnis (1:1) verstärken die Wirksamkeit des CryIIIC-Proteins wahrscheinlich ebenfalls ausreichend.
Die erfindungsgemäßen insektiziden Zusammensetzungen werden über den Lebensraum des Coleopteren-Zielinsekts verteilt, üblicherweise auf dem Laubwerk der durch übliche Verfahren, vorzugsweise durch Versprühen, zu schützenden Pflanze oder Feldfrucht. Weitere Anwendungsverfahren, z. B. Bestäuben, Besprühen, Eintauchen, Bodeninjektion, Samenbeschichtung, Sämlingsbeschichtung oder Besprühen oder ähnliche Verfahren, sind ebenfalls durchführbar und können für Insekten, die die Wurzel oder den Stiel befallen, erforderlich sein. Diese Anwendungsverfahren sind im Stand der Technik üblich.
Das cryIIIC-Gen oder sein funktionelles Äquivalent (hier nachstehend gelegentlich als "Toxingen" bezeichnet) können in zahlreiche Wirtsmikroorganismen eingeführt werden. Eine Expression des cryIIIC-Gens bewirkt die Produktion eines insektiziden CryIIIC-Kristallproteintoxins. Beispiele für geeignete Wirte sind Bt und andere Arten von Bacillus, beispielsweise B. subtilis oder B. megaterium. Pflanzenoder Wurzel-befallende Mikroorganismen können auch als Wirt des cryIIIC-Gens verwendet werden. Verschiedene dem Fachmann vertraute Verfahren sind zur Einführung des cryIIIC-Gens in einen Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die eine stabile Beibehaltung und Expression des Gens in den erhaltenen Transformanten ermöglichen, verfügbar.
Die Transformanten, d. h., die Wirtsmikroorganismen, die ein cloniertes Gen in einem rekombinanten Plasmid enthalten, können gemäß üblicher Verfahren, meistens unter Verwendung eines Selektionsverfahrens, isoliert werden, das lediglich das Wachstum von Wirtsmikroorganismen, die ein rekombinantes Plasmid enthalten, ermöglicht. Die Transformanten können anschließend auf eine insektizide Wirksamkeit getestet werden. Diese Verfahren sind ebenfalls Standardverfahren.
Besonders wichtige Kennzeichen zur Auswahl einer zur Produktion verwendeten Wirtszelle sind beispielsweise die einfache Einführung des Gens in den Wirt, Verfügbarkeit von Expressionssystemen, Effizienz der Expression, Stabilität des insektiziden CryIIIC-Proteins im Wirt und die Gegenwart von genetischen Hilfsfunktionen. Die das insektizide cryI- IIC-Gen enthaltende Wirtszelle kann in jedem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, in dem das cryIIIC-Gens exprimiert und das CryIIIC-Protein, üblicherweise bei der Sporulierung, produziert wird. Die das Kristallprotein enthaltenden sporulierenden Zellen können anschließend durch übliche Verfahren, z. B. Zentrifugation oder Filtration, geerntet werden.
Das cryIIIC-Gen kann ferner in eine Pflanze, die das Gen exprimieren und das CryIIIC-Protein produzieren kann, eingeführt werden, um die Pflanze gegen Insektenbefall resistenter zu machen. Eine gentechnische Veränderung von Pflanzen mit dem cryIIIC-Gen kann durch Einführung der das Gen enthaltenden gewünschten DNA in Pflanzengewebe oder Zellen unter Verwendung von unterschiedlichsten DNA-Molekülen jedweder Herkunft, die dem Fachmann der gentechnischen Behandlung von Pflanzen vertraut sind, durchgeführt werden. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Einführung von DNA in Pflanzengewebe ist in der am 2. November 1988 veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. 0 289 479 von Monsanto offenbart.
DNA, die das cryIIIC-Gen oder ein modifiziertes cryI- IIC-Gen enthält, die das CryIIIC-Protein produzieren können, kann durch infektiöse Plasmide, beispielsweise Ti, das Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, Viren oder Mikroorganismen wie A. tumefaciens, unter Verwendung von Lysosomen oder Liposomen, durch mechanische Verfahren wie der Mikroinjektion und durch andere Verfahren, die dem Fachmann für die gentechnische Behandlung von Pflanzen vertraut sind, direkt in Pflanzenzellen oder Gewebe eingeführt werden.
Es können in den Nucleotidbasensequenzen des cryIIIC- Gens Veränderungen vorgenommen werden, da die verschiedenen Aminosäuren, die das vom Gen codierte Protein bilden, wie es dem Fachmann vertraut ist, durch mehr als ein Codon bestimmt werden können. Ferner kann der codierende Bereich der Nucleotidbasensequenz von cryIIIC verändert oder verkürzt werden, wodurch eine Expression des Gens und Produktion von funktionell äquivalenten Formen des insektiziden CryIIIC- Proteins möglich ist. Es sollte davon ausgegangen werden, daß diese Variationen, die ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand durch den Durchschnittsfachmann unter Bezugnahme auf die vorliegende Beschreibung bestimmt werden können, im Schutzbereich der angefügten Ansprüche liegen, da sie dem spezifisch beanspruchten Gegenstand der Erfindung vollständig äquivalent sind.
Die vorliegende Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die nachstehenden spezifischen, nicht-begrenzenden Beispiele genauer beschrieben. Die Beispiele beruhen auf Arbeiten, die auf der Grundlage von allgemein im Stand der Technik bekannten Verfahren und unter Verwendung von im Handel erhältlicher Ausrüstung tatsächlich durchgeführt wurden.
Der neue Bt-Stamm EG4961 wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren isoliert.

Beispiel 1

Isolierung von Bt-Stamm EG4961

Getreidestaubproben wurden von verschiedenen Quellen, üblicherweise von Einrichtungen zur Lagerung von Getreide, in den USA und im Ausland erhalten. Die Getreidestaubproben wurden durch Suspension des Getreidestaubs in einem wäßrigen Puffer und Erhitzung der Suspension 30 min. bei 60ºC behandelt, um Hitze-resistente sporenbildende Bacillus-Bakterien, beispielsweise Bt, anzureichern. Die behandelten Suspensionen des Staubs wurden in wäßrigem Puffer verdünnt und die Verdünnungen auf Agarplatten verteilt, damit jedes einzelne Bakterium aus dem Getreidestaub auf der Oberfläche der Agarplatte zu einer Kolonie heranwachsen konnte. Nach der Züchtung wurde ein Teil jeder Kolonie von der Agarplatte auf ein Nitrozellulosefilter übertragen. Das Filter wurde mit NaOH behandelt, um die Kolonien zu lysieren und die DNA jeder Kolonie auf dem Filter zu fixieren.
Ein modifiziertes Behandlungsverfahren wurde zur Verwendung bei Bt-Kolonien, die im Kolonie-Hybridisierungsverfahren verwendet wurden, entwickelt, da festgestellt wurde, daß bei E. coli verwendete Standardverfahren bei Bt nicht verwendet werden konnten. Zur vorstehend beschriebenen Behandlung waren spezielle Bedingungen erforderlich, um sicherzustellen, daß sich die Bt-Kolonien in einem vegetativen Wachstumsstadium, in dem sie für eine Lyse mit NaOH empfindlich waren, befanden. Nachdem ein Teil jeder Kolonie auf das Nitrozellulosefilter übertragen worden war, wurde das Filter daher mit den Kolonien nach oben auf ein 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose enthaltendes Agarmedium gelegt. Die transferierten Kolonien wurden anschließend auf dem Agar- Glucose-Medium 5 Stunden bei 30ºC gezüchtet. Die Verwendung von 0,5 % Glucose im Agarmedium und der 5 Stunden bei 30ºC durchgeführte Wachstumszyklus waren kritisch, um sicherzustellen, daß die Bt-Kolonien in einem vegetativen Stadium und daher gegen eine Lyse empfindlich waren.
Obwohl von mindestens einem Forscher die Ansicht geäußert wurde, daß die Verwendung eines vorhandenen Coleopteren-Toxingens als Sonde zum Auffinden eines für den "southern corn rootworm" toxischen, neuen Gens nicht erfolgreich sein würde, wurde ein cloniertes Coleopteren- Toxingen als spezifische Sonde verwendet, um weitere neue und seltene Coleopteren-toxische Bt-Stämme in Getreidestaubproben zu finden.
Ein das cryIIIA-Gen enthaltendes 2,9 kb-HindIII-DNA- Restriktionsfragment, das bisher als das von Donovan et al., Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 365-372, beschriebene cryC-Gen von Bt-Stamm EG2158 bekannt war, wurde als Sonde für Kolonie-Hybridisierungsverfahren verwendet.
Das das gesamte cryIIIA-Gen enthaltende 2,9 kb- HindIII-cryIIIA-DNA-Fragment wurde durch Standardverfahren mit alpha-P³²-dATP und dem Klenow-Enzym radioaktiv markiert. Die Nitrozellulosefilter, die DNA von jeder lysierten Kolonie enthielten, wurden 16 Stunden bei 65ºC in einer Pufferlösung, die die radioaktiv markierte 2,9 kb-HindIII- cryIIIA-DNA-Sonde enthielt, inkubiert, um die DNA der Kolonien mit der DNA der radioaktiv markierten cryIIIA-Sonde zu hybridisieren. Es wurde eine Hybridisierungstemperatur von 65ºC verwendet, um sicherzustellen, daß die cryIIIA-DNA- Sonde nur an DNA von Kolonien hybridisierte, die ein Gen enthielten, das der cryIIIA-DNA-Sonde ähnlich war.
Die 2,9 kb-cryIIIA-Sonde hybridisierte an viele Bt- Kolonien aus verschiedenen Getreidestaubproben. Eine Untersuchung dieser Kolonien zeigte, daß sie unerwarteterweise keine Gene vom cryIII-Typ enthielten. Diese Kolonien enthielten dagegen Gene vom cryI-Typ, die Lepidopterentoxische, Coleopteren-nichttoxische Kristallproteine mit Molekulargewichten von etwa 130 kd codieren. Computer-gestützte Vergleiche der Sequenz des cryIIIA-Gens mit der Sequenz von mehreren cryI-Genen zeigten, daß das 3'-Ende des cryIIIA-Gens mit Teilen der cryI-Gene teilweise homolog war. Dieser Befund stützte die Annahme, daß aufgrund des 3'-Endes des cryIIIA-Gens die 2,9 kb-cryIIIA-Sonde an cryI-Gene enthaltende Bt-Kolonien hybridisierte.
Zur Korrektur dieses Problems wurde die 2,9 kb- HindIII-cryIIIA-Sonde mit dem Enzym XbaI gespalten und ein 2,0 kb-HindIII-XbaI-Fragment isoliert, das das cryIIIA-Gen, dem sein 3'-Ende fehlte, enthielt. Das 2,0 kb-HindIII-XbaI- Fragment enthielt das am 3'-Ende verkürzte cryIIIA-Gen. Bei seiner Verwendung in wiederholten Kolonie-Hybridisierungsexperimenten hybridisierte das 2,0 kb-Fragment nicht an das cryI-Gen enthaltende Bt-Kolonien.
Etwa 48 000 Bacillus-Kolonien aus Getreidestaubproben von verschiedenen Orten wurden mit der radioaktiv markierten 2,0 kb-HindIII-XbaI-cryIIIA-Sonde abgesucht. Lediglich ein neuer Bt-Stamm aus einer Getreidestaubprobe aus Illinois wurde gefunden, der spezifisch an die cryIIIA-Sonde hybridisierte. Dieser neue Bt-Stamm, der bei der NRRL unter der Hinterlegungsnr. NRRL B-18603 hinterlegt wurde, erhielt die Bezeichnung EG2838.
Anschließend wurden weitere 50 000 Bacillus-Kolonien aus Getreidestaubproben mit der radioaktiv markierten 2,0 kb-HindIII-XbaI-cryIIIA-Sonde abgesucht, ohne daß jedoch weitere neue Gene vom cryIII-Typ enthaltende Stämme identifiziert werden konnten.
Es wurde festgestellt, daß der Bt-Stamm EG2838 eine insektizide Wirksamkeit gegen Coleopteren-Insekten, besonders gegen den "Colorado"-Kartoffelkäfer, aufwies. Der Bt- Stamm EG2838 weist keine signifikante insektizide Wirksamkeit im Hinblick auf den "southern corn rootworm" auf. Ein Gen mit der Bezeichnung cryIIIB wurde aus dem Bt-Stamm EG2838 isoliert und seine Nucleotidbasensequenz ermittelt. Das cryIIIB-Gen codierte ein Kristallprotein mit der Bezeichnung CryIIIB-Protein, das 651 Aminosäuren mit einer abgeleiteten Größe von 74.237 Dalton enthielt. Die früher abgeleitete Größe des im Stand der Technik bekannten CryIIIA-Proteins war 73.116 Dalton (644 Aminosäuren). Das cryIIIB-Gen ist mit dem cryIIIA-Gen zu 75 % und das CryIIIB- Protein mit dem CryIIIA-Protein zu 68 % homolog.
Etwa 40 000 Bacillus-Kolonien von 39 Getreidestaubproben von verschiedenen Orten auf der ganzen Welt wurden mit einer von Bt-Stamm EG2838 erhaltenen cryIIIB-Sonde abgesucht. Die cryIIIB-Sonde wurde unter Verwendung des vorstehend im Hinblick auf die radioaktiv markierte cryIIIA- Sonde beschriebenen Verfahrens radioaktiv markiert. Die radioaktiv markierte cryIIIB-Sonde bestand aus einem 2,4 kb- SspI-Restriktionsfragment der DNA aus dem Bt-Stamm EG2838. Das Fragment enthält den das vollständige Protein codierenden Bereich des Coleopteren-cryIIIB-Toxingens von Bt- Stamm EG2838. Schließlich wurde ein neuer Bt-Stamm in einer Getreidestaubprobe gefunden, der mit der cryIIIB-Sonde spezifisch hybridisierte. Der Bt-Stamm erhielt die Bezeichnung EG4961.
Zur Charakterisierung von Bt-Stamm EG4961 wurden mehrere Untersuchungen durchgeführt. Eine Reihe von Untersuchungen wurde zur Ermittlung seines Flagellen-Serotyps durchgeführt. Weitere Untersuchungen wurden zur Bestimmung der Größen der nativen Plasmide in Bt-Stamm EG4961 und zur Ermittlung von Plasmiden, die insektizide Kristallproteine codierende Gene enthielten, durchgeführt. Eine DNA-Blot- Analyse wurde durchgeführt, um festzustellen, welche der nativen Plasmide von Bt-Stamm EG4961 mit der cryIIIB-Sonde hybridisierten. Es war ebenfalls interessant, ob das an cryIIIB-hybridisierende DNA-Element von Bt-Stamm EG4961 von einem einzigen natürlich vorkommenden Plasmid getragen wird, und nicht, im Gegensatz dazu, auf mehreren Plasmiden oder auf der chromosomalen DNA vorhanden ist. Ferner wurde der Bt-Stamm EG4961 weiter charakterisiert, in dem die von ihm produzierten Kristallproteine charakterisiert und die mit Bt-Stamm EG4961 und seinen Kristallproteinen assoziierte insektizide Wirksamkeit gemessen wurde. Die Beispiele 2 bis 6 beziehen sich auf Verfahren zur Charakterisierung von Bt- Stamm EG4961 und die Beispiele 8 bis 12 auf die insektizide Wirksamkeit von Bt-Stamm EG4961.

Beispiel 2

Charakterisierung des Flagellen-Serotyps von Bt-Stamm EG4961

Für Serotyp-Untersuchungen wurde eine Reihe von Antikörperreagenzien gegen Flagellen von Bt-Stämmen unter Verwendung von öffentlich verfügbaren Bt-Stämmen konstruiert. Die Bt-Stämme HD1 (kurstaki, Serotyp 3ab), HD2 (thuringiensis, Serotyp 1), HDS (kenyae, Serotyp 4ac), HD11 (aizawai, Serotyp 7), HD12 (morrisoni, Serotyp 8ab) und HD13 (tolworthi, Serotyp 9) wurden in flüssigen Kulturen (ohne Schütteln) unter Bedingungen, bei denen bewegliche, vegetative Zellen produziert werden, gezüchtet. Flagellenfilamente wurden durch Vortexen von den Zellen abgeschert, die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die Flagellenfilamente aus den Überständen auf Filtern mit einer Porengröße von 0,2 um gesammelt. Gereinigte Flagellenfilament-Präparate wurden durch Natriuindodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Die SDS-PAGE-Profile für jedes dieser Präparate aus Flagellenfilamenten von Bt-Stämmen zeigten eine Hauptproteinbande im Bereich von 20 bis 35 kD.
Diese gereinigten Präparate aus Flagellenfilamenten wurden gemäß Standardverfahren zur Antikörperproduktion in Mäusen verwendet. Die erhaltenen Antiseren wurden auf eine Reaktion in einem Standardtest für eine Antikörper-vermittelte Zell-Agglutination abgesucht. In diesem Test wurde eine Verdünnungsreihe mit Antiseren auf einer 96 Vertiefungen mit rundem Boden aufweisenden Mikrotiterplatte hergestellt. Mit Formal in fixierte Zellsuspensionen von Bt- Stämmen (oder Probenstämmen, deren Serotyp zu ermitteln war) wurden den Vertiefungen zugesetzt und unbewegt stehengelassen, bis die Zellmasse in Bodennähe der Vertiefungen sichtbar war. Die Tests wurden unter Verwendung eines Vergrößerungsspiegels vom Boden der Platte visuell auf eine Zell-Agglutination untersucht. Antiseren, die die stärkste spezifische Reaktion mit Zellen vom Bt-Stamm, gegen den die Antiseren hergestellt worden waren, lieferten, wurden als Flagellen-Antikörper-Reagenzien verwendet.
Zellen von den beiden Bt-Stämmen EG2158 und EG4961 wurden in einem Zell-Agglutinationstest unter Verwendung eines Spektrums von Antikörper-Reagenzien gegen Flagellen von sechs Bt-Stämmen getrennt als Proben verwendet. Zellen von jedem Bt-Stamm wurden als Kontrollen eingeschlossen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, daß Zellen der Bt- Stämme HD1, HD2, HD5, HD11, HD12 und HD13 stark und spezifisch mit ihren jeweiligen Flagellen-Antikörper-Reagenzien reagierten. Die Zellen von Bt-Stamm EG2158 reagierten stark und spezifisch mit dem morrisoni (Bt-Stamm HD12) Flagellaten-Antikörper-Reagens, Zellen von Bt-Stamm EG4961 reagierten jedoch mit keinem der Antikörper-Reagenzien. Diese Ergebnisse bestätigen, daß der Bt-Stamm EG2158 eine Unterart von Bt-Stamm morrisoni ist, und zeigen, daß der Bt- Stamm EG4961 keine Unterart von morrisoni, kurstaki, thuringiensis, kenyae, aizawai oder tolworthi ist.

Beispiel 3

Fraktionierung nach Größe und Testen von nativen Plasmiden von EG4961 mit der cryIIIB-Sonde

Bt-Stämme können durch Größen-abhängige Fraktionierung ihrer Plasmide durch das übliche, als Agarose- Gelelektrophorese bezeichnete Verfahren charakterisiert werden. Das Verfahren umfaßt eine Lyse von Bt-Zellen mit Lysozym und SDS, Elektrophorese von Plasmiden der Lysate auf einem Agarosegel und Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid zur Sichtbarmachung der Plasmide. Größere Plasmide, die langsamer durch das Gel wandern, erscheinen oben auf dem Gel und kleinere Plasmide erscheinen weiter unten auf dem Gel.
Das Agarosegel in Figur 2 zeigt, daß der Bt-Stamm EG496L native Plasmide von etwa 150, 95, 70, 50, 5 und 1,5 MD enthält, wie es durch die dunklen horizontalen Banden angezeigt ist. Die Größen der Plasmide wurden durch Vergleichsplasmide mit bekannten Größen (nicht dargestellt) bestimmt. Figur 2 zeigt ferner, daß der Coleopteren-toxische Bt-Stamm EG2838 native Plasmide von etwa 100, 90 und 37 MD enthält. Figur 2 zeigt ferner, daß der Coleopteren-toxische Bt-Stamm EG2158 native Plasmide von etwa 150, 105, 88, 72 und 35 MD enthält. Möglicherweise sind einige Plasmide, beispielsweise die 150 und 1,5 MD-Plasmide von Bt-Stamm EG4961 und das 150 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG2158, auf dem Photo nicht sichtbar, obwohl sie im eigentlichen Gel sichtbar sind. Figur 2 zeigt, daß sich die Größen der nativen Plasmide von Bt-Stamm EG4961 von den Größen der nativen Plasmide der Bt-Stämme EG2158 und EG2838 unterscheiden.
Die in Figur 2 dargestellten Plasmide wurden durch Blotting unter Verwendung des Southern-Blot-Verfahrens, Southern, J. Molec. Biol. 98 (1975), 503-517, vom Agarosegel auf ein Nitrozellulosefilter übertragen und das Filter wurde, wie vorstehend beschrieben, mit der radioaktiv markierten 2,4 kb-cryIIIB-DNA-Sonde hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde das Filter gegen einen Röntgenfilm exponiert. Ein Photo des Röntgenfilms ist in Figur 3 dargestellt, die im eingedunkelten Bereich zeigt, daß die cryI- IIB-Sonde an das 95 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG4961 hybridisierte. Dieses Ergebnis zeigt, daß das 95 MD-Plasmid von Bt- Stamm EG4961 eine DNA-Sequenz enthält, die mindestens teilweise mit dem cryIIIB-Gen homolog ist. Figur 3 zeigt ferner, daß die cryIIIB-Sonde erwartungsgemäß an das 88 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG2158 und das 100 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG2838 hybridisierte. Es wurde bereits gezeigt, daß das 88 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG2158 das Coleopteren-toxische cryIIIA-Gen enthielt (vgl. Donovan et al., Mol. Gen. Genet. 214 (1988), 365-372). Es ist ermittelt worden, daß das 100 MD-Plasmid von Bt-Stamm EG2838 das Coleopteren-cryIIIB- Toxingen enthält.
Die cryIIIB-Sonde hybridisierte außerdem an kleine DNA-Banden in jedem der Bt-Stämme EG4961, EG2838 und EG2158, die durch den Buchstaben "f" in Figur 3 angezeigt sind. Die bisherige Erfahrung hat gezeigt, daß große Bt-Plasmide während der Elektrophorese oft in Fragmente zerbrechen. Diese Fragmente wandern üblicherweise zu den Positionen der Banden, die durch den Buchstaben "f" in Figur 3 angegeben sind. Daher stammen die Banden, die in Figur 3 durch den Buchstaben "f" angezeigt sind, höchstwahrscheinlich von der Fragmentierung der 95 MD-, 88 MD- und 100 MD-Plasmide der Bt-Stämme EG4961, EG2158 bzw. EG2838.

Beispiel 4

Blot-Analyse der DNA von Bt-Stamm EG4961

Sowohl chromosomale DNA als auch Plasmid-DNA von Bt- Stamm EG4961 wurden extrahiert und mit den Restriktionsenzymen HindIII und EcoRI gespalten. Die gespaltene DNA wurde durch Elektrophorese auf einem Agarosegel nach Größe fraktioniert und die Fragmente wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Figur 4 ist ein Photo des gefärbten Agarosegels, das nach Größe fraktionierte HindIII- und EcoRI-Restriktionsfragmente von Bt-Stamm EG4961 enthält. Zum Vergleich wurde die DNA der Coleopteren-toxischen Bt- Stämme EG2158 und EG2838 auf gleiche Weise verarbeitet. Die Bahn mit der Bezeichnung "stnd" enthält Lambda-DNA-Fragmente mit bekannten Größen, die als Größenstandards dienen. Figur 4 zeigt, daß die mit HindIII und EcoRI gespaltene Bt-DNA hunderte von DNA-Fragmenten mit verschiedenen Größen liefert.
Die in Figur 4 dargestellte DNA wurde vom Agarosegel auf ein Nitrozellulosefilter übertragen und das Filter bei 65ºC in einer wäßrigen Pufferlösung, die die radioaktiv markierte 2,4 kb-cryIIIB-DNA-Sonde enthielt, hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurde das Filter gegen einen Röntgenfilm exponiert. Figur 5 ist ein Photo des Röntgenfilms, in dem die Zahlen auf der rechten Seite die Größe der mit cryIIIB hybridisierenden Fragmente von Bt-Stamm EG496L in kb anzeigen, wie durch einen Vergleich mit HindIII-gespaltener Lambda-DNA als Größenmarker in der Bahn mit der Bezeichnung "stnd" ermittelt wurde. Figur 5 zeigt, daß mit HindIII und EcoRI gespaltene DNA von Bt-Stamm EG4961 mit cryIIIB hybridisierende Fragmente von etwa 3,8 kb und 2,4 kb liefert. Figur 5 zeigt außerdem, daß mit HindIII und EcoRI gespaltene DNA von Bt-Stamm EG2838 mit cryIIIB hybridisierende Fragmente von etwa 2,9 kb und 3,8 kb liefert. Figur 5 zeigt außerdem, daß die ungefähren Größen der mit cryIIIB hybridisierenden DNA-Restriktionsfragmente von Bt- Stamm EG2158 1,6 kb und 0,7 kb sind.
Diese Ergebnisse legen den Schluß nahe, daß der Bt- Stamm EG4961 ein Gen vom cryIII-Typ enthält, das mit der cryIIIB-Gen-Sonde verwandt ist. Die mit cryIIIB hybridisierenden Fragmente von Bt-Stamm EG4961 unterscheiden sich von denen der Bt-Stämme EG2838 und EG2158. Diese Ergebnisse und weitere in den nachstehenden Beispielen beschriebene Untersuchungen bestätigen, daß das Gen vom cryIII-Typ von Bt- Stamm EG4961 sich deutlich vom cryIIIB-Gen von EG2838 und cryIIIA-Gen von EG2158 unterscheidet. Das cryIII-Gen von Bt- Stamm EG4961 erhielt die Bezeichnung cryIIIC.

Beispiel 5

Charakterisierung von Kristallproteinen von Bt-Stamm EG4961

Der Bt-Stamm EG4961 wurde in DSMG-Sporulierungsmedium bei 30ºC bis zur Sporulierung und Zellyse (nach 3 bis 4 Tagen Wachstum) gezüchtet. Das DSMG-Medium besteht aus 0,4 % (Gew./Vol.) Difco-Nährlösung, 25 mM K&sub2;HPO&sub4;, 25 mM KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 mM Ca(NO&sub3;)&sub2;, 0,5 mM MgSO&sub4;, 10 uM FeSO&sub4;, 10 uM MnCl&sub2; und 0,5 % (Gew./Vol.) Glucose. Durch ein Mikroskop wurde beobachtet, daß die sporulierte Kultur von Bt-Stamm EG4961 außer den Bt-Sporen frei treibende, unregelmäßig geformte Kristalle enthielt. Die Erfahrung zeigt, daß Bt-Kristalle üblicherweise aus Proteinen bestehen, die für bestimmte Insekten toxisch sein können. Die Kristalle von Bt-Stamm EG4961 unterscheiden sich im Aussehen von den flachen, rechteckigen (oder rhombischen) Kristallen von Bt-Stamm EG2158, gleichen jedoch teilweise einigen der unregelmäßig geformten Kristallen von Bt-Stamm EG2838.
Sporen, Kristalle und der Rückstand an zertrümmerten, lysierten Zellen der sporulierten Kultur von Bt-Stamm EG4961 wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Kristalle wurden durch Erhitzen des Feststoffgemisches in einem Solubilisierungspuffer (0,13 M Tris, pH 8,5, 2 % (Gew./Vol.) SDS, 5 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol und 10 % (Vol./Vol.) Glycerin) 5 min. bei 100ºC aus den Feststoffen der zentrifugierten Fermentationskultur (die Kristalle, Sporen und einige Zelltrümmer enthielt) spezifisch solubilisiert. Die solubilisierten Kristallproteine wurden durch SDS-PAGE nach der Größe fraktioniert. Nach der Größen-abhängigen Fraktionierung wurden die Proteine durch Färbung mit Coomassie- Farbstoff sichtbar gemacht. Die Kulturen der Bt-Stämme EG2158 und EG2838 wurden zu Vergleichszwecken in identischer Weise verarbeitet.
Figur 6 zeigt die Ergebnisse dieser Analysen, wobei die Zahlen auf der rechten Seite die Größe der von Bt-Stamm EG496L synthetisierten Kristallproteine in kD anzeigen. Ein Hauptprotein von etwa 70 kD und ein kleineres Protein von etwa 30 kD wurden aus den Sporen und Kristalle von Bt-Stamm EG4961 enthaltenden zentrifugierten Feststoffen der Fermentation solubilisiert. Das Protein von Bt-Stamm EG4961 mit etwa 70 kD scheint in der Größe dem Coleopteren-toxischen Kristallprotein von Bt-Stamm EG2158 mit etwa 70 kD und dem Coleopteren-toxischen Kristallprotein von Bt-Stamm EG2838 mit etwa 70 kD ähnlich zu sein. Das kleinere Kristallprotein von etwa 30 kD von Bt-Stamm EG4961 ist ungefär den von Bt- Stamm EG2158 produzierten Kristallproteinen von etwa 31 kD und 29 kD und den von Bt-Stamm EG2838 produzierten Kristallproteinen von etwa 28 kD und 32 kD ähnlich. Es ist nicht bekannt, ob diese kleinen Proteine miteinander verwandt sind.
Gemäß dem Verfahren von Beispiel 4 zeigte eine weitere DNA-Blot-Analyse, daß die 2,4 kb-cryIIIB-DNA-Sonde spezifisch an ein einzelnes 8,3 kb-Asp718-PstI-Restriktionsfragment von DNA des Bt-Stamms EG4961 hybridisierte. Dieses Ergebnis legte den Schluß nahe, daß das 8,3 kb- Fragment das vollständige cryIIIC-Gen enthielt.
Das 8,3 kb-Asp718-PstI-Fragment von Bt-Stamm EG4961 wurde isoliert und zur Feststellung, ob das Fragment ein cryIII-Gen enthielt, und zur Identifizierung und Ermittlung der Nucleotidbasensequenz des cryIIIC-Gens wurden Untersuchungen am 8,3 kb-Asp718-PstI-Restriktionsfragment durchgeführt. Diese Verfahren sind in Beispiel 6 beschrieben.

Beispiel 6

Clonierung und Sequenzierung des cryIIIC-Gens von Bt-Stamm EG496L

Zur Clonierung des im vorstehenden Beispiel beschriebenen 8,3 kb-Fragments wurde durch Ligierung von nach Größe selektierten ASP718-PstI-DNA-Restriktionsfragmenten von Bt-Stamm EG4961 in den häufig verwendeten E. coli-Vektor pUC18 eine Plasmid-Bank von Bt-Stamm EG4961 konstruiert. In diesem Verfahren wurde zunächst die gesamte DNA von Bt-Stamm EG496L erhalten, indem eine Zellyse durchgeführt, die DNA anschließend aufgewickelt und darauf sowohl mit dem Asp718- als auch PstI-Restriktionsenzym doppelt gespalten wurde, eine Elektrophorese der gespaltenen DNA auf einem Agarosegel durchgeführt, ein Gelscheibchen, das nach ihrer Größe getrennte DNA-Fragmente von 7 kb bis 9 kb enthielt, ausgeschnitten und eine Elektroelution der nach ihrer Größe getrennten Asp718-PstI-Restriktionsfragmente aus dem Agarosegel-Scheibchen durchgeführt wurde. Die selektierten Fragmente wurden mit dem E. coli-Plasmidvektor pUC18, der ebenfalls mit Asp718 und PstI gespalten worden war, vermischt. Der pUC18-Vektor trägt das Gen für die Ampicillin-Resistenz (Ampr) und repliziert in E. coli. T4-DNA-Ligase und ATP wurden dem Gemisch der nach Größe selektierten Restriktionsfragmente der DNA von Bt-Stamm EG4961 und des gespaltenen Vektors pUC18 zugesetzt, damit der Vektor pUC18 mit den Restriktionsfragmenten von Bt-Stamm EG4961 ligieren konnte.
Die Plasmid-Bank wurde anschließend in E. coli- Zellen, einem Wirtsorganismus, dem das gewünschte Gen fehlte, wie nachstehend beschrieben, transformiert. Nach der Ligierung wurde das DNA-Gemisch mit dem Ampicillin-sensitiven E. coli-Wirtsstamm HB101 inkubiert, der mit CaCl&sub2; behandelt worden war, damit die Zellen die DNA aufnehmen konnten. Der E. coli Stamm HB101 wurde bevorzugt als Wirtsstamm verwendet, da diese Zellen mit rekombinanten Plasmiden leicht transformiert werden können und der E. coli-Stamm HB101 von Natur aus keine Gene für Bt-Kristallproteine enthält. Da pUC18 eine Ampicillin-Resistenz überträgt, wird jede Wirtszelle, die ein rekombinantes Plasmid aufnimmt, Ampicillin-resistent. Nach der Exponierung gegen die rekombinanten Plasmide wurden die E. coli-Wirtszellen auf Ampicillin enthaltendem Agarmedium verteilt. Mehrere tausend E. coli-Kolonien wuchsen auf dem Ampicillinenthaltenden Agar aus diesen ein rekombinantes Plasmid enthaltenden Zellen. Diese E. coli-Kolonien wurden anschließend auf Nitrozellulosefilter für ein anschließendes Absuchen geblottet.
Die radioaktiv markierte 2,4 kb-cryIIIB-Gensonde wurde anschließend als DNA-Sonde unter Bedingungen verwendet, unter denen die Sonde spezifisch an diese transformierten Wirtskolonien, die das 8,3 kb-Asp718-PstI-DNA- Fragment von Bt-Stamm EG4961 enthielten, binden konnte. Zwölf E. coli-Kolonien hybridisierten spezifisch an die 2,4 kb-cryIIIB-Sonde. Eine an cryIIIB hybridisierende Kolonie, die als E. coli-Stamm EG7218 bezeichnet wurde, wurde weiter untersucht. Der E. coli-Stamm EG7218 enthielt ein rekombinantes Plasmid mit der Bezeichnung pEG258, das aus pUC18 und dem 8,3 kb-Asp718-PstI-DNA-Restriktionsfragment bestand. Die cryIIIB-Sonde hybridisierte spezifisch an das 8,3 kb- Fragment von pEG258. Eine Restriktionskarte von pEG258 ist in Figur 7 dargestellt.
Das 8,3 kb-Fragment von pEG258 enthielt HindIII-Fragmente von 2,4 kb und 3,8 kb und ein BamHI-XbaI-Fragment von 4,0 kb, die spezifisch an die cryIIIB-Sonde hybridisierten. Das 2,4 kb-HindIII-Fragment wurde in den DNA-Sequenzierungsvektor M13mp18 subcloniert. Das 4,0 kb-BamHI-XbaI- Fragment wurde in die DNA-Sequenzierungsvektoren M13mp18 und M13mp19 subcloniert.
Die Nucleotidbasensequenz eines wesentlichen Teils jedes subclonierten DNA-Fragments wurde unter Verwendung des Didesoxy-Standardverfahrens von Sanger ermittelt. Beide DNA- Stränge für jedes subclonierte Fragment wurden unter Verwendung von Sequenz-spezifischen 17-mer-Oligonucleotid-Primern zur Initiierung der DNA-Sequenzierungsreaktionen sequenziert. Die Sequenzierung zeigte, daß das 8,3 kb-Fragment einen offenen Leserahmen und insbesondere ein neues Gen vom cryIII-Typ enthielt. Dieses neue Gen mit der Bezeichnung cryIIIC unterscheidet sich wesentlich vom cryIIIA-Gen. Wie nachstehend beschrieben, unterscheidet sich das cryIIIC-Gen ebenfalls deutlich vom cryIIIB-Gen.
Die DNA-Sequenz des cryIIIC-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz des vom cryIIIC-Gen codierten cryIIIC- Proteins sind in Figur 1 dargestellt. Der das Protein codierende Teil des cryIIIC-Gens ist durch die Nucleotide von Position 14 bis Position 1972 definiert. Die angenommene Ribosomenbindungsstelle ist in Figur 1-1 als "RBS" angegeben. Die vom offenen Leserahmen des cryIIIC-Gens abgeleitete Größe des durch das cryIIIC-Gen codierten CryIIIC-Proteins ist 74 393 Dalton (651 Aminosäuren). Es soll darauf hingewiesen werden, daß die durch SDS-PAGE ermittelte relative Größe des CryIIIC-Proteins etwa 70 kD ist. Daher wird das CryIIIC-Protein in dieser Beschreibung mit einer Größe von etwa 70 kD angegeben.
Die Größe des im Stand der Technik bekannten CryIIIA- Proteins ist zuvor mit 73 116 Dalton (644 Aminosäuren) abgeleitet worden. Die Größe des CryIIIB-Proteins ist zuvor mit 74 237 Dalton (651 Aminosäuren) abgeleitet worden.
Eine Sequenzierung der DNA zeigte die Gegenwart von BamHI- und HindIII-Restriktionsstellen innerhalb des cryI- IIC-Gens (vgl. Figur 1-2). Die Kenntnis der Lage dieser Restriktionsstellen ermöglichte die genaue Bestimmung der Lage und Orientierung des cryIIIC-Gens innerhalb des 8,3 kb- Fragments, wie es durch den Pfeil in Figur 7 angezeigt ist.
Das Computerprogramm von Queen und Korn (C. Queen und L. J. Korn, "Analysis of Biological Sequences on Small Computers", DNA 3 (1984), 421-436) wurde verwendet, um die Sequenzen des cryIIIC-Gens mit den cryIIIB- und cryIIIA- Genen und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen ihrer jeweiligen cryIIIC-, CryIIIB- und CryIIIA-Proteine zu vergleichen.
Die Nucleotidbasensequenz des cryIIIC-Gens war zu 96 % mit der Nucleotidbasensequenz des cryIIIB-Gens und nur zu 75 % mit der Nucleotidbasensequenz des cryIIIA-Gens identisch. Obwohl das cryIIIC-Gen mit den cryIIIB- und cryIIIA- Genen verwandt ist, wird trotzdem deutlich, daß sich das cryIIIC-Gen vom cryIIIB-Gen und wesentlich vom cryIIIA-Gen unterscheidet.
Es wurde festgestellt, daß die abgeleitete Aminosäuresequenz des CryIIIC-Proteins zu 94 % mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des CryIIIB-Proteins, jedoch nur zu 69 % mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz des CryIIIA- Proteins identisch war. Diese Unterschiede zusammen mit den Unterschieden in der insektiziden Wirksamkeit, wie nachstehend beschrieben, zeigen deutlich, daß das vom cryIIIC-Gen codierte CryIIIC-Protein ein anderes Protein als das CryIIIB- oder CryIIIA-Protein ist.
Obwohl eine Festlegung auf eine bestimmte Theorie nicht beabsichtigt ist, wird außerdem aufgrund eines Vergleichs der Aminosäuresequenzen des cryIIIC- und CryIIIB- Proteins angenommen, daß die nachstehend beschriebenen Aminosäurereste für die verstärkte Toxizität des cryIIIC- Proteins für den "corn rootworm" wesentlich sind, wobei die Zahlen, die nach den üblichen Abkürzungen für Aminosäuren angegeben sind, die Position der Aminosäure in der in Figur 1 dargestellten Sequenz anzeigen: His9, His231, Gln339, Phe352, Asn446, His449, Val450, Ser451, Lys600 und Lys624. Diese Aminosäurereste wurden selektiert, da sie wahrscheinlich für die Toxizität des CryIIIC-Proteins für den "corn rootworm" wesentlich sind, da durch Untersuchung der Amino- Säuresequenzen von mehreren anderen CryIII-Proteinen festgestellt werden konnte, daß sich die Aminosäuren an den angegebenen Positionen im Prinzip durchweg von den für das CryIIIC-Protein angegebenen Aminosäuren unterschieden.

Beispiel 7

Expression des clonierten cryIIIC-Gens

Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Produktion des CryIIIC-Proteins durch das cryIIIC-Gen zu bestimmen.
Tabelle 1 faßt die relevanten Eigenschaften der in diesem Verfahren verwendeten Bt- und E. coli-Stämme und Plasmide zusammen. Ein plus (&spplus;) zeigt die Gegenwart und ein minus (&supmin;) die Abwesenheit des bezeichneten Elements, der bezeichneten Aktivität oder Funktion an. Die Bezeichnungen s und r zeigen die Empfindlichkeit bzw. Resistenz gegen verwendete Antibiotika an. Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen weisen die nachstehend beschriebenen Bedeutungen auf: Amp (Ampicillin), Cm (Chloramphenicol), Cry (Kristalle produzierend) und Tc (Tetracyclin). Tabelle 1 Stämme und Plasmide Stamm oder Plasmid Relevante Eigenschaften B. thuringiensis E. coli enthält Plasmide enthält Bacillus-E. coli-Shuttle-Vektor, der aus in die SphI-Stelle von pNN101 ligiertem pBR322 besteht E.coli-Vektor Bacillus-Vektor rekombinantes E. coli-Plasmid, das aus dem Fragment von Bt-Stamm EG4961, das in die Asp718-PstI-Stellen von pUC18 ligiert ist, besteht. Fragment von Bt-Stamm EG4961, das mit stumpfen Enden in die EcoRV-Stelle von pNN101 ligiert ist, besteht. rekombinantes Shuttle-Plasmid, das aus in die SphI-Stelle von pEG268 ligiertem pNN101 besteht
E. coli-Zellen, die das in Beispiel 6 beschriebene, clonierte 8,3 kb-Fragment enthielten, wurden analysiert, um festzustellen, ob sie das 70 kD-CryIIIC-Kristallprotein produzieren konnten.
Die Erfahrung hat gezeigt, daß clonierte Bt-Kristallgene in E. coli wenig und in Bt stark exprimiert werden. Das rekombinante Plasmid pEG258, das, wie in Beispiel 6 beschrieben, konstruiert wurde, repliziert in E. coli, jedoch nicht in Bt. Zur Erreichung eines hohen Expressionsniveaus des clonierten cryIIIC-Gens wurde das 8,3 kb-cryIIIC- Fragment von pEG258 in einen Plasmidvektor pNN101 (Tcr Cmr Cry&supmin;), der in Bt replizieren kann, überführt.
Das konstruierte Plasmid pEG258 wurde aus dem E. coli-Stamm EG7218 isoliert, indem die Zellen mit Lysozym/SDS behandelt und die Plasmid-DNA anschließend mit Ethanol ausgefällt wurde, wobei immer Standardverfahren verwendet wurden. Die pEG258-Plasmid-DNA wurde anschließend zur Transformation von Zellen des E. coli-Stamms GM2163 verwendet, die durch das vorstehend in Beispiel 6 beschriebene Calciumchloridverfahren kompetent gemacht worden waren. Der E. coli-Stamm GM2163 ist ein Kristall-negativer (Cry&supmin;) und Ampicillin-empfindlicher (Amps) Stamm, der durch die Verfahren von M. G. Marinus et al., Mol. Gen. Genet. 192 (1983), 288-289 konstruiert wurde.
Das konstruierte Plasmid pEG258 wurde unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren aus dem transformierten E. coli-Stamm GM2163, erneut isoliert. Die isolierte pEG258-Plasmid-DNA wurde mit Asp718 und PstI gespalten. Mit dem gespaltenen Plasmid wurde auf einem Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt und das 8,3 kb- Asp718-PstI-cryIIIC-Fragment aus dem Agarosegel elektroeluiert. Das 8,3 kb-Fragment wurde durch Auffüllen der Asp718- und PstI-Enden unter Verwendung der T4-Polymerase und Desoxynucleotidtriphosphaten mit glatten Enden versehen.
Das mit glatten Enden versehene 8,3 kb-Fragment wurde mit dem Bacillus-Vektor pNN101, der mit EcoRV gespalten worden war, vermischt. T4-DNA-Ligase und ATP wurden dem Gemisch zugesetzt, damit das mit glatten Enden versehene 8,3 kb-Fragment in die EcoRV-Stelle des pNN101-Vektors ligiert werden konnte. Nach der Ligierung wurde das DNA-Gemisch einer Suspension von Zellen von Bt-Stamm HD73-26 zugesetzt. Zellen von Bt-Stamm HD73-26 sind Kristall-negativ (Cry&supmin;) und Chloramphenicol-empfindlich (Cms). Unter Verwendung von Elektroporationsverfahren wurden die im Gemisch vorhandenen Zellen von Bt-Stamm HD73-26 zur Aufnahme des im Gemisch ebenfalls vorhandenen, aus pNN101 und dem ligierten 8,3 kbcryIIIC-Fragment bestehenden rekombinanten Plasmid-Konstrukt induziert. So wurde das rekombinante Plasmid durch Elektroporation in den Bt-Stamm HD73-26 transformiert.
Nach der Elektroporation wurden die transformierten Bt-Zellen auf einem 5 ug Chloramphenicol enthaltenden Agarmedium verteilt und etwa 16 bis 18 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die Zellen, die das Plasmid pNN101 aufgenommen hatten, wachsen auf dem Chloramphenicol enthaltenden Agarmedium zu Kolonien, während Zellen, die das Plasmid nicht aufgenommen hatten, kein Wachstum zeigen. Cmr-Kolonien wurden auf Nitrozellulose übertragen, anschließend mit der radioaktiv markierten cryIIIB-Gen-Sonde abgesucht, und eine mit der cryIIIB-Sonde spezifisch hybridisierende Kolonie eines Bt-Stamms, der die Bezeichnung EG7220 erhielt, wurde weiter untersucht.
EG7220 enthielt ein Plasmid mit der Bezeichnung pEG260, das aus dem in die EcoRV-Stelle des pNN101-Vektors inserierten 8,3 kb-cryIIIC-Fragment bestand. Eine Restriktionskarte von Plasmid pEG260 ist in Figur 8 dargestellt.
Zellen von Bt-Stamm EG7220 wurden in einem Chloramphenicol (5 ug/ml) enthaltenden Sporulierungsmedium bei 23 bis 25ºC bis zur Sporulierung und Zellyse (3 bis 4 Tage) gezüchtet. Eine mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die Kultur von Bt-Stamm EG7220 Sporen und frei schwebende, unregelmäßig geformte Kristalle enthielt.
Sporen, Kristalle und Zelltrümmer der sporuliert Fermentationskultur von Bt-Stamm EG7220 wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Kristalle wurden durch Erhitzen des zentrifugierten Feststoffgemisches der Fermentation in einem Solubilisierungspuffer (0,13 M Tris, pH 8,5, 2 % (Gew./Vol.) SDS, 5 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol und 10 % (Vol./Vol.) Glycerin) 5 min. bei 100ºC solubilisiert. Nach dem Erhitzen wurde das Gemisch auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und die im Gemisch vorhandenen Proteine durch Elektrophorese nach Größe fraktioniert. Nach der Fraktionierung nach Größe wurden die Proteine durch Färbung mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht. Ein Photo des Coomassie-gefärbten Gels ist in Figur 10 dargestellt.
Figur 10 zeigt, daß der Bt-Stamm EG7220 ein Hauptprotein von etwa 70 kD und ein in geringeren Mengen vorhandenes Protein von etwa 30 kD produzierte. Diese Proteine wiesen anscheinend die gleiche Größe wie das Hauptprotein von etwa 70 kD und das in geringeren Mengen vorhandene Protein von etwa 30 kD, die von Bt-Stamm EG4961 produziert wurden, auf (Figur 10). Dieses Ergebnis zeigt, daß das 8,3 kb-Fragment von pEG260 zwei Kristallproteingene enthält: eines für das Protein von etwa 70 kD und eines für das Protein von etwa 30 kD.
Das das Protein von etwa 70 kD codierende Gen ist das cryIIIC-Gen und das codierte Protein das CryIIIC-Protein. Das das Kristallprotein von etwa 30 kD codierende Gen erhielt die Bezeichnung cryX und das codierte Protein die Bezeichnung CryX.
Wie erwartet wurde und in Figur 10 erläutert ist, produzierte ein isogener Bt-Kontrollstamm mit der Bezeichnung EG7211, der aus dem Bt-Stamm HD73-26 bestand und nur den Plasmidvektor pEG220 enthielt, keine Proteine mit etwa 70 kD oder etwa 30 kD. Plasmid pEG220 ist ein Ampicillinresistenter, Tetracyclin-resistenter, Chloramphenicol-resistenter und Kristall-negativer E. coli-Bacillus-Shuttle- Vektor, der aus dem in die SphI-Stelle von pNN101 ligierten pBR322 besteht.
E. coli-Zellen, die das das cryIIIC-Gen und das cryX- Gen enthaltende, clonierte 8,3 kb-Fragment enthielten, wurden analysiert, um festzustellen, ob sie die Kristallproteine mit etwa 70 kD und etwa 30 kD produzierten. pEG258 enthaltende E. coli-Zellen mit der Stamm-Bezeichnung EG7218 wurden bis zur späten stationären Phase gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Zellen des E. coli- Stamms EG7218 wurden lysiert und die gesamten zellulären Proteine durch Erhitzung der Zellen im Proteinpuffer solubilisiert. Das vollständige Spektrum von Proteinen, die aus Zellen von E. coli EG7218 solubilisiert worden waren, war anscheinend mit dem von Proteinen, die aus einem nur den Plasmidvektor pUC18, wie in Figur 10 dargestellt, enthaltenden negativen Kontrollstamm von E. coli mit der Bezeichnung EG7221 solubilisiert worden waren, identisch. Dieses Ergebnis zeigt, daß E. coli-Zellen, die das clonierte 8,3 kb-cryIIIC-Fragment enthielten, wenn überhaupt sehr wenig Kristallproteine von etwa 70 kD oder etwa 30 kD produzierten.
Die nachstehend beschriebenen Verfahren wurden zur Isolierung des für die Produktion des CryIIIC-Proteins mit etwa 70 kD verantwortlichen cryIIIC-Gens verwendet.
Ein Sau3A-DNA-Fragment von Bt-Stamm EG4961, das das cryIIIC-Gen, jedoch nicht das cryX-Gen enthielt, wurde unter Verwendung der cryIIIB-Gen-Sonde cloniert. Dies wurde durchgeführt, indem DNA von Bt-Stamm EG4961 mit Sau3A partiell gespalten, eine Elektrophorese der gespaltenen DNA auf einem Agarosegel durchgeführt und ein Gelscheibchen, das die Sau3A-Fragmente von 4 kb bis 9 kb enthielt, ausgeschnitten wurde. Die Sau3A-Fragmente wurden aus dem Gelscheibchen elektroeluiert und mit dem BamHI-gespaltenen Plasmidvektor pBR322 vermischt. Die Sau3A-Fragmente wurden mit dem pBR322- Vektor ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde mit CaCl&sub2;-behandelten Zellen von E. coli-Stamm DH5A inkubiert, damit die Zellen die Plasmid-DNA aufnehmen konnten.
Nach der Inkubation wurden die Zellen auf Ampicillin und LB-Medium (1 % (Gew./Vol.) Difco-Trypton, 0,5 % (Gew./Vol.) Difco-Hefeextrakt und 0,5 % (Gew./Vol.) NaCl, pH 7,0) enthaltenden Agarplatten verteilt, um die Zellen, die Plasmid-DNA aufgenommen hatten, zu selektieren. Mehrere hundert Ampr-transformierte Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter geblotted und die Filter mit der radioaktiv markierten cryIIIB-Sonde, wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben, abgesucht. Die Sonde hybridisierte an mehrere Kolonien, und die Charakterisierung einer dieser Kolonien mit der Bezeichnung EG7232 ist hier nachstehend genauer beschrieben. Der E. coli-Stamm EG7232 enthielt ein Plasmid mit der Bezeichnung pEG268, das aus pBR322 sowie einem inserierten Sau3A-BamHI-DNA-Fragment von etwa 5 kb bestand. Das inserierte DNA-Fragment hybridisierte spezifisch an die radioaktiv markierte cryIIIB-Sonde.
Das Plasmid pEG268 (Ampr Tcs) repliziert in E. coli, jedoch nicht in Bt. Um ein in Bt replizierbares Derivat von pEG268 zu erhalten, wurde pEG268 mit SphI gespalten, mit dem ebenfalls mit SphI gespaltenen Bacillus-Plasmid pNN101 (CMr Tcr) vermischt und das Gemisch ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde mit einer Suspension von CACl&sub2;-behandelten E. coli-Zellen inkubiert, damit die Zellen DNA des mit pNN101 ligierten Plasmids pEG268 aufnehmen konnten. Nach der Inkubation wurden die Zellen auf LB-Medium und Tetracyclin enthaltenden Agarplatten verteilt, und mehrere hundert Tetracyclin-resistente Kolonien wurden erhalten. Lediglich die Zellen, die ein aus pEG268 und pNN101 bestehendes Plasmid aufgenommen hatten, konnten wachsen und in Gegenwart von Tetracyclin Kolonien bilden. Eine dieser Tcr-Kolonien mit der Bezeichnung EG7233 wurde ausgewählt, um sie durch weitere Untersuchungen zu charakterisieren. Es wurde erwartungsgemäß festgestellt, daß der E. coli-Stamm EG7233 ein Plasmid enthielt, das aus in die SphI-Stelle von EG268 inseriertem pNN101 bestand und die Bezeichnung pEG269 erhielt. Eine Restriktionskarte von pEG269 ist in Figur 9 dargestellt.
Das konstruierte Plasmid pEG269 wurde aus dem E. coli-Stamm EG7233 isoliert, indem die Zellen mit Lysozym/SDS behandelt und anschließend die Plasmid-DNA mit Ethanol ausgefällt wurde, wobei immer Standardverfahren verwendet wurden. Die pEG269-Plasmid-DNA wurde anschließend zur Transformation von Zellen des E. coli-Stamms GM2163 verwendet, die durch das vorstehend beschriebene Calciumchloridverfahren kompetent gemacht worden waren.
Das konstruierte Plasmid pEG269 wurde erneut aus dem transformierten E. coli-Stamm GM2163, isoliert. Die isolierte pEG269-Plasmid-DNA wurde einer Suspension von Zellen des Kristall-negativen, Chloramphenicol-empfindlichen Bt- Stamms HD73-26 zugesetzt und elektrischer Strom durch das Gemisch geleitet, so daß pEG269 durch Elektroporation in den Bt-Stamm HD73-26 transformiert wurde. Die Zellen wurden auf einer LB-Medium und Chloramphenicol enthaltenden Agarplatte verteilt, und nach der Inkubation wuchsen mehrere hundert Cmr-Kolonien. Eine dieser Cmr-Kolonien mit der Bezeichnung EG7231 wurde ausgewählt, um sie durch weitere Untersuchungen zu charakterisieren. Es wurde erwartungsgemäß festgestellt, daß der Bt-Stamm EG7231 das pEG269 enthielt.
Zellen von Bt-Stamm EG7231 wurden in Chloramphenicol enthaltendem DSMG-Medium 4 Tage bei 20 bis 23ºC gezüchtet. Eine mikroskopische Untersuchung zeigte, daß die Kultur außer Sporen Partikel enthielt, die Bt-Kristallen ähnlich waren. Die festen Bestandteile, einschließlich der Sporen, Kristalle und Zelltrümmer, wurden durch Zentrifugation geerntet und in einer wäßrigen Lösung zu einer Konzentration von 100 mg Kulturfeststoffe/ml suspendiert. Ein Teil dieser Suspension wurde mit Solubilisierungspuffer (0,13 M Tris, pH 8,5, 2 % (Gew./Vol.) SDS, 5 % (Vol./Vol.) 2-Mercaptoethanol und 10 % (Vol./Vol.) Glycerin) 5 Minuten auf 100ºC erhitzt und das Gemisch auf einem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt, um die Proteine nach Größe zu fraktionieren. Nach der Größen-abhängigen Fraktionierung wurden die Proteine durch Färbung des Gels mit Coomassie-Farbstoff sichtbar gemacht. Ein Photo des gefärbten Cels zeigt Figur 10.
Der Bt-Stamm EG7231 produzierte ein Hauptprotein von etwa 70 kD, das anscheinend in der Größe mit dem von Bt- Stamm EG4961 produzierten CryIIIC-Protein mit etwa 70 kD, wie in Figur 10 dargestellt, identisch war. Der Bt-Stamm EG7231 produzierte keine nachweisbare Menge des Kristallproteins von etwa 30 kD (Figur 10). Dieses Ergebnis zeigt, daß das cryX-Gen für das Kristallprotein von etwa 30 kD innerhalb des durch die gepunktete Linie in den Figuren 7 und 8 angegebenen Bereichs liegt. Dies zeigt ferner, daß der Bt-Stamm EG7231 das cryIIIC-Gen in isolierter Form enthält.
Die nachstehenden Beispiele 8 bis 12 beschreiben das Verfahren, mit dem die insektizide Wirksamkeit von Bt-Stamm EG4961 und des CryIIIC-Proteins ermittelt wird.

Insektizide Wirksamkeit von Bt-Stamm EG4961 und des CryIIIC- Proteins im Vergleich mit Bt-Stamm EG2158, Bt tenebrionis und dem CryIIIA-Protein

Beispiel 8

Allgemeine Herstellungs- und Testverfahren für insektizide

biologische Tests

Fermentationskonzentrate.

Die Bt-Stämme EG4961 und EG2158 und Bt tenebrionis ("Btt") wurden in einem flüssigen Sporulierungsmedium bei 30ºC bis zur Sporulierung und Lyse gezüchtet. Das Medium enthielt eine Proteinquelle, eine Kohlehydratquelle und Mineralsalze und entspricht den im Stand der Technik üblichen Medien. NaOH wurde zugesetzt, um das Medium vor der Autoklavierung auf einen pH-Wert von 7,5 einzustellen. Die Fermentationsbrühe wurde durch Zentrifugation konzentriert und bis zur Verwendung gekühlt.
Wie hier verwendet, bezeichnet ein "CryIII"-Kristallprotein das Kristallprotein von etwa 70 kD, das von den getesteten Kulturen von Stamm Bt EG4961, Bt EG2158 bzw. Btt erhalten wird. Die CryIII-Kristallproteine wurden unter Verwendung von Saccharose-Dichtegradienten aus den Feststoffen der Fermentationskultur gereinigt. Wenn Saccharose- Dichtegradienten zur Trennung der Bestandteile der Fermentationskultur von sporulierenden Bt verwendet werden, bilden die Bt-Sporen ein Pellet auf dem Boden des Gradienten und die Bt-Kristalle eine Bande etwa in der Mitte des Gradienten. Daher können mit dem Saccharose-Dichtegradienten Bt-Kristallproteine in relativ reiner Form von Bt-Sporen und anderen Feststoffen der Fermentationskultur getrennt werden. Die abgetrennten CryIII-Kristallproteine wurden bis zur Verwendung bei 4ºC aufbewahrt.
Eine Quantifizierung der Menge an CryIII-Kristallprotein in allen biologisch getesteten Proben wurde unter Verwendung von Standard-SDS-PAGE-Verfahren durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen Insekten wurden untersucht:
"southern corn rootworm (SCRW)" - Diabrotica undecimpunctata howardi
"western corn rootworm (WCRW)" - Diabrotica virgifera virgifera
"Colorado"-Kartoffelkäfer (CPB) - Leptinotarsa decemlineata
Ulmenblattkäfer - Pyrrhalta luteola
"imported willow leaf beetle" - Plagiodera versicolora
Zwei verschiedene biologische Tests wurden durchgeführt, wobei in einem ein künstliches Futter und im anderen ein eingetauchtes Blatt verwendet wurde.

Biologische Tests mit künstlicher Nahrung.

SCRW-Larven wurden durch Kontaminierung der Oberflächen von künstlichem Futter gemäß Marrone et al., J. Econ. Entomol. 78 (1985), 290-293, jedoch ohne Formalin, biologisch getestet. Jeder biologische Test bestand aus acht wäßrigen Verdünnungsreihen mit Aliquots, die auf der Oberfläche des Futters aufgetragen wurden. Nach dem Trocknen des Verdünnungsmittels (einer wäßrigen 0,005 % Triton X-100- Lösung) wurden Larven im Entwicklungsstadium 1 auf das Futter gesetzt und bei 28ºCinkubiert. 32 Larven wurden pro Dosis getestet. Die Sterblichkeit wurde nach 7 Tagen ermittelt. Daten von reproduzierten biologischen Tests wurden für eine Probit-Analyse (R. J. Daum, Bull. Entomol. Soc. Am. 16 (1970), 10-15) gesammelt, wobei die Sterblichkeit anhand der getöteten Tiere der Kontrollen, die lediglich das Verdünnungsmittel enthielten, korrigiert wurden (W. S. Abbott, J. Econ. Entomol. 18 (1925), 265-267). Die Ergebnisse sind als Menge CryIII-Kristallprotein pro mm² der Futteroberfläche angegeben, wodurch der LC&sub5;&sub0; erhalten wird, der die für 50 % der getesteten Insekten tötliche Konzentration ist. 95 % Vertrauensintervalle sind innerhalb der Klammern angegeben.
WCRW-Larven im Entwicklungsstadium 1 wurden auf dem gleichen künstlichen Futter mit einer Dosis getestet. Die Sterblichkeit wurde nach 48 Stunden ermittelt.
CPB-Larven im Entwicklungsstadium 1 wurden unter Verwendung von ähnlichen Verfahren, ausgenommen des Austausches des "BioServe's" #9380-Insektenfutters gegen als künstliches Futter zugesetzte Kartoffelflocken, getestet. Die Sterblichkeit wurde nach drei anstelle von sieben Tagen ermittelt. Biologische Tests mit eingetauchten Blättern. Für Insektenarten oder -stadien, für die kein geeignetes künstliches Futter verfügbar war, wurden biologische Tests durch Eintauchen von geeigneten natürlichen Futtermaterialien (Blättern) in bekannte Behandlungskonzentrationen, wobei eine Suspension in einer wäßrigen 0,2 % Triton X-100-Lösung hergestellt wurde, durchgeführt. Nach dem Abtropfen von überschüssigem Material wurden die Blätter getrocknet. In 0,2 % Triton X-100 getauchte Blätter wurden als unbehandelte Kontrollen verwendet. Fünf oder zehn Insekten wurden in eine Petrischale mit einem behandelten Blatt eingeschlossen und konnten 48 Stunden fressen. Ausgewachsene SCRW, ausgewachsene CPB, Ulmenblattkäfer-Larven und ausgewachsene Tiere und "imported willow leaf beetle"-Larven und ausgewachsene Tiere wurden unter Verwendung von geeigneten Futterquellen entsprechend getestet.
Jede Abweichung von den vorstehend beschriebenen Verfahren ist mit den entsprechenden Angaben vermerkt.

Beispiel 9

Insektizide Wirksamkeit der CryIII-Proteine gegen CPB- Larven, Ulmenblattkäfer und "imported willow leaf beetle"- Larven

Der Bt-Stamm EG4961 gleicht in einem Test mit künstlichem Futter in seiner Wirksamkeit gegen CPB-Larven, wie durch die Daten in Tabelle 2 dargestellt ist, dem zuvor entdeckten Bt-Stamm EG2158. Tabelle 2 Insektizide Wirksamkeit der Bt-Stämme EG4961 und EG2158 gegen Larven des "Colorado"-Kartoffelkäfers im Entwicklungsstadium 1 in biologischen Tests mit künstlichem Futter LC&sub5;&sub0; (95% V.i.)* Probentyp Tests Sterblichkeit der Kontrolltiere 3,1 % * in Klammern angegebenes 95 % Vertrauensintervall
Biologische Tests mit eingetauchten Blättern zeigten ferner, daß die Wirksamkeit von Bt-Stamm EG4961 der von Bt- Stamm EG2158 und Btt gegen Larven und ausgewachsene Tiere des Ulmenblattkäfers und Larven des "imported willow leaf beetle" glich.

Beispiel 10

Insektizide Wirksamkeit der Bt-Stämme und CryIII-Proteine gegen SCRW-Larven in biologischen Tests mit künstlichem Futter

Der Bt-Stamm EG4961 besitzt in biologischen Tests mit künstlichem Futter im Vergleich zum Bt-Stamm EG2158 und Btt eine einzigartige Wirksamkeit gegen SCRW-Larven, wie es durch die Ergebnisse des biologischen Tests in Tabelle 3 gezeigt wird. Die Vergleiche in Tabelle 3, die als "Ferm.konz. #1" und "Ferm.konz. #2" angegeben sind, beruhten auf verschiedenen Fermentationskonzentraten von Bt-Stamm EG4961. Weder der Bt-Stamm EG2158 noch Btt verursachten eine höhere Sterblichkeit als 15 % mit der höchsten getesteten Dosis. Im Gegensatz dazu wurden LC&sub5;&sub0;-Werte (d. h., eine 50 % Sterblichkeit bei der angegebenen Dosis) für den Bt-Stamm EG4961 erhalten (Tabelle 3).
Im biologischen Test mit dem gereinigten CryIIIC- Kristallprotein von Bt-Stamm EG4961 war die beobachtete Wirksamkeit nur geringfügig geringer als die, die mit den Fermentationskonzentraten von Bt-Stamm EG4961 (die Sporen und Kristalle enthielten) erhalten wurden. Dieses Ergebnis identifiziert das CryIIIC-Kristallprotein als den toxischen Wirkstoff in Bt-Stamm EG4961. Überlebende Larven in biologischen Tests mit Bt-Stamm EG4961 (sowohl die Fermentationskonzentrate als auch das gereinigte Kristallprotein) wurden im Vergleich zu den nicht-behandelten Kontrollarven im Wachstum extrem behindert.
Der Bt-Stamm EG2158 zeigte lediglich als Fermentationskonzentrat eine geringe Wirksamkeit gegen SCRW-Larven, jedoch nicht, wenn nur sein gereinigtes CryIIIA-Kristallprotein getestet wurde. Selbst wenn die Konzentration des gereinigten CryIIIA-Proteins auf das fünffache der entsprechenden Menge des CryIIIC-Kristallproteins erhöht wurde, war das CryIIIA-Protein gegen SCRW nicht wirksam. Die minimale Wirksamkeit von Bt-Stamm EG2158 als Fermentationskonzentrat konnte von der Gegenwart von Sporen zusammen mit dem CryIIIA-Kristallprotein abhängig gewesen sein. Tabelle 3 Insektizide Wirksamkeit von Bt-Stamm EG4961 gegen SCRW-Larven in biologischen Tests mit künstlichem Futter Probentyp Tests Sterblichkeit der Kontrolltiere Gereinigte Proteinkristalle tot nicht getestet
Ein biologischer Test mit künstlichem Futter, in dem das Fermentationskonzentrat von Bt-Stamm EG4961 in einer Dosis gegen WCRW-Larven getestet wurde, lieferte eine ähnliche Sterblichkeit, wie sie bei SCRW-Larven beobachtet wurde. Im Hinblick auf SCRW-Larven lieferte Btt nur eine geringfügig höhere Sterblichkeit als die Kontrolle.

Beispiel 11

Insektizide Wirksamkeit der Bt-Stämme EG4961 EG2158 und Btt gegen ausgewachsene SCRW- und CPB-Insekten in biologischen Tests mit eingetauchten Blättern

Außer seiner einzigartigen Wirksamkeit gegen SCRW- Larven zeigt der Bt-Stamm EG4961 ferner eine einzigartige insektizide Wirksamkeit gegen ausgewachsene Tiere sowohl von SCRW als auch CPB (Tabelle 4), die durch den Bt-Stamm EG2158 oder durch Btt kaum bekämpft werden können. Die in biologischen Tests mit Insekten gewonnenen Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Insektizide Wirksamkeit der Bt-Stämme EG4961, EG2158 und Btt gegen ausgewachsene SCRW und CPB in biologischen Tests mit eingetauchten Blättern % getötete Tiere nach 48 Std. Stamm Sterblichkeit der Kontrollen (-) Striche bedeuten: nicht getestet.

Beispiel 12

Insektizide Wirksamkeit des clonierten cryIIIC-Gens

Der Bt-Stamm EG4961 und der rekombinante Bt-Stamm EG723L, die das clonierte cryIIIC-Gen von Bt-Stamm EG4961 enthielten und in Beispiel 7 beschrieben sind, wurden in einem flüssigen Sporulierungsmedium gezüchtet und, wie es allgemein in den Beispielen 5 bis 7 beschrieben ist, durch Zentrifugation konzentriert. Beide Konzentrate wurden an SCRW- und CPB-Larven auf künstlichem Futter unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren, allerdings mit drei statt acht Dosen und (bei CPB) 16 CPB-Larven pro Dosis anstelle von 32, biologisch getestet. Die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der Bt-Stamm EG7231 ein CryIIIC-Kristallprotein produziert, das so toxisch wie das in Bt-Stamm EG4961 festgestellte Protein ist. Der Kristallnegative, sporulierende Bt-Stamm EG7211, der zur Herstellung von Bt-Stamm EG7231 verwendet wurde, wurde als weitere Kontrolle getestet und war nicht wirksam. Dieser biologische Test bestätigte, daß das cryIIIC-Gen das Coleopteren-wirksame Kristallprotein in Bt-Stamm EG4961 produzierte. Tabelle 5 Insektizide Wirksamkeit der Bt-Stämme EG7231 und EG4961 gegen SCRW- und CPB-Larven in biologischen Tests mit künstlichem Futter Stamm Kontrolle % tot
Das nachstehend beschriebene Beispiel 13 betrifft Untersuchungen, in denen die insektizide Wirksamkeit des CryIIIC-Proteins gegen Coleopteren-Insekten durch die Kombination von einem CryI-Protein mit dem CryIIIC-Protein deutlich verstärkt wurde. Die CryIA(c)-Proteinkristalle sind für Coleopteren-Insekten nicht toxisch, es ist jedoch bekannt, daß sie gegen zahlreiche Arten von Lepidopteren- Insekten wirksam sind.

Beispiel 13

Synergistische Verstärkung der insektiziden Wirksamkeit des CryIII-Proteins durch Zugabe von CryI-Protein

Der rekombinante Bt-Stamm EG1269, der lediglich CryIA(c)-Proteinkristalle produzierte, wurde in flüssigen Sporulierungsmedien unter Verwendung der vorstehend in den Beispielen 5 bis 7 allgemein beschriebenen Verfahren gezüchtet. Der rekombinante Bt-Stamm EG1269 wurde durch Einführung von Plasmid pEG157 in den Bt-Stamm HD73-26 konstruiert. Das Plasmid G157 wurde durch Subclonierung des cryIA(c)-Gens von pEGB7 (Bt-Stamm HD263-6) in den Shuttle- Vektor pEGI47 hergestellt. Die CryIA(c)-Proteinkristalle wurden durch einen Renografin-Gradienten gereinigt und unter Verwendung des vorstehend beschriebenen SDS-PAGE-Verfahrens quantifiziert. Eine gleiche Menge dieser CryI-Kristalle wurde den CryIIIC-Kristallen zugesetzt und das Kristallproteingemisch auf künstlichem Futter an SCRW-Larven biologisch getestet. Das CryIIIC-CryI-Proteingemisch war deutlich toxischer als die CryIIIC-Kristalle allein, wie es durch die Ergebnisse in Tabelle 6 deutlich gezeigt wird. Tabelle 6 Insektizide Wirksamkeit eines Gemisches von CryIIIC- und CryIA(c)-Kristallproteinen gegen SCRW-Larven in biologischen Tests mit künstlichem Futter Behandlung Tests CryIIIC-Kristalle CryIA(c)-Kristalle Sterblichkeit der Kontrolle % getötete Tiere bei 571 ng/mm²
Zur Sicherstellung der Verfügbarkeit der Materialien für die Öffentlichkeit nach der Erteilung eines Patents für die vorliegende Anmeldung wurden die nachstehend beschriebenen Mikroorganismen vor dem Einreichen der vorliegenden Anmeldung bei der ARS Patent Collection, Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61064, wie es in der nachstehend beschriebenen Tabelle 7 angegeben ist, hinterlegt: Tabelle 7 Bakterienstamm NRRL-Hinterlegungsnr Hinterlegungsdatum B. thuringiensis E. coli 29. April 1987 12. Juni 1989 13. Sept. 1989 8. Februar 1990 28. Februar 1990 13. Sept. 1989
Diese Hinterlegungen der Mikroorganismen wurden nach den Bestimmungen des "Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentverfahrens" durchgeführt. Sämtliche Beschränkungen der öffentlichen Verfügbarkeit dieser hinterlegten Mikroorganismen werden nach der Erteilung eines US-Patents auf diese Anmeldung unwiderruflich beseitigt.

Claims

1. Gereinigtes und isoliertes CryIIIC-Gen mit einer Nucleotidbasensequenz, die die in Figur 1 dargestellte Aminosäuresequenz codiert.

2. Gereinigtes und isoliertes CryIIIC-Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen einen Codierungsbereich aufweist, der sich von den Nucleotidbasen 14 bis 1972 in der Nucleotidbasensequenz von Figur 1 erstreckt.

3. Rekombinantes Plasmid, enthaltend das Gen nach Anspruch 1 oder 2.

4. Coleopteren-toxisches Protein, erhältlich von dem Gen nach Anspruch 1 oder 2.

5. Biologisch reine Kultur eines mit dem rekombinanten Plasmid nach Anspruch 3 transformierten Bakteriums.

6. Bakterium nach Anspruch 5, wobei das Bakterium Bacillus thuringiensis ist.

7. Bacillus thuringiensis-Bakterium nach Anspruch 6, hinterlegt bei NRRL unter der Hinterlegungsnummer NRRL B- 18627.

8. Insektizide Zusammensetzung, umfassend das Protein nach Anspruch 4 und einen landwirtschaftlich verträglichen Träger.

9. Insektizide Zusammensetzung, umfassend das Bakterium nach Anspruch 5, ein Coleopteren-toxisches Protein erhältlich aus einem solchen Bakterium, und einen landwirtschaftlich verträglichen Träger

10. Pflanze, die mit dem Gen nach den Ansprüchen 1 oder 2 transformiert ist

11. CryIIIC-Gen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gen oder ein Teil davon zur Verwendung als eine Hybridisierungssonde markiert ist.

12. Biologisch reine Kultur eines Bacillus thuringiensis- Bakteriums, das bei NRRL unter der Minterlegungsnummer NRRL B-18533 hinterlegt ist.

13. Coleopteren-toxisches Protein, das von dem Bacillus thuringiensis-Bakterium nach Anspruch 12 erhältlich ist und die in Figur 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

14. Insektizide Zusammensetzung, umfassend das Coleopterentoxische Protein nach Anspruch 13, in Kombination mit einem landwirtschaftlich verträglichen Träger.

15. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Coleopteren-toxische Protein in einem Bacillus thuringiensis-Bakterium enthalten ist.

16. Verfahren zur Bekämpfung von Coleopteren-Insekten, umfassend die Anwendung einer insektizid wirksamen Menge des Coleopteren-toxischen Proteins nach Anspruch 4 auf eine Wirtspflanze solcher Insekten.

17. Verfahren zur Bekämpfung von Coleopteren-Insekten, umfassend die Anwendung einer insektizid wirksamen Menge des Coleopteren-toxischen Proteins nach Anspruch 13 auf eine Wirtspflanze solcher Insekten.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, wobei das Coleopteren-toxische Protein in einem Bacillus thuringiensis-Bakterium enthalten ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Insekten zur Gattung Diabrotica gehören.

20. Verfahren zur Verstärkung der insektiziden Wirksamkeit einer insektiziden Zusammensetzung, die ein Coleopterentoxisches Protein enthält, umfassend das Einbringen einer Menge an CryI-Protein, die eine Verstärkung der insektiziden Wirkung des Mittels gegen Coleopteren-Insekten bewirken kann, in eine CryIIIC-Protein enthaltende insektizide Zusammensetzung.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das CryI-Protein CryIA-Protein ist.

22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das CryI-Protein CryIA(c) -Protein ist.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei das CryIIIC-Protein und das CryI-Protein in etwa gleichen Mengen vorliegen.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, wobei die Zusammensetzung eine verstärkte insektizide Wirksamkeit gegen Insekten der Gattung Diabrotica aufweist.

25. Insektizide Zusammensetzung, die gegen Coleopteren-Insekten wirksam ist, umfassend das Coleopteren-toxische Protein nach Anspruch 13 und ein CryI-Protein, wobei das CryI-Protein in einer Menge vorliegt, die eine Verstärkung der insektiziden Wirksamkeit des Mittels gegen Coleopteren-Insekten bewirken kann.

26. Mittel nach Anspruch 25, wobei das CryI-Protein CryIA- Protein ist.

27. Mittel nach Anspruch 25, wobei das CryI-Protein CRYIA(c)-Protein ist.

28. Mittel nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das Coleopteren-toxische Protein und CryI-Protein in etwa gleichen Mengen vorliegen.