DE69132913T2 - Neuer bacillusthuringsiensis stamm und sein für insektentoxin kodierendes gen - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft einen neuen Stamm von B. thuringiensis (den "BtI109P-Stamm"), welcher ein kristallisiertes Protein herstellt (die "BtI109P-Kristallproteine"), welches während der Sporulation in Kristalle (die "BtI109P-Kristalle") verpackt wird. Der BtI109P-Stamm wurde unter den Maßgaben des Budapester Abkommens bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen ("DSM"), Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, unter der Zugangsnummer 5870 am 4. April 1990 hinterlegt.
• Diese Erfindung berifft ebenfalls eine Insektizidzusammensetzung, welche wirksam gegen Coleoptera ist und welche den BtI109P-Stamm als solches, oder vorzugsweise das BtI109P- Kristallprotein oder die aktiven Komponente(n) davon als einen aktiven Bestandteil umfasst.
• Diese Erfindung betrifft weiterhin das btI109P-Gen aus dem Genom des BtI109P-Stamms, welches für ein insektizides Protein (das "BtI109P-Protoxin") codiert, welches in den BtI109P-Kristallen gefunden wird.
• Das BtI109P-Protoxin ist das Protein, welches von dem BtI109P-Stamm hergestellt wird, bevor es in BtI109P-Kristalle verpackt wird.
• Fernerhin betrifft diese Erfindung noch das "BtI109P-Toxin", welches (z. B. durch Trypsin- Verdau) erhalten werden kann aus dem BtI109P-Protoxin. Das BtI109P-Toxin ist ein insektizidisch wirksames Protein, welches aus den BtI109P-Kristallen freigesetzt werden kann, welche von dem BtI109P-Stamm hergestellt werden. Das Toxin besitzt eine hohe Aktivität gegen Coleoptera bzw. Käfer. Das BtI109P-Toxin repräsentiert angenommenermaßen den kleinste Anteil des BtI109P-Protoxins, welcher gegen Coleoptera insektizidisch wirksam ist.
• Diese Erfindung betrifft noch weiterhin ein chimäres Gen, welches verwendet werden kann, um eine Pflanzenzelle zu transformieren, und welches enthält:
• 1) Einen Teil des btI109P-Gens (den "insektizidisch wirksamen btI109P-Gen-Teil"), codierend für einen insektizidisch wirksamen Anteil des jeweiligen BtI109P-Protoxins, vorzugsweise ein trunkierter Teil des btI109P-Gens (das "trunkierte btI109P-Gen"), welches nur für das jeweilige BtI109P-Toxin codiert;
• 2) Einen Promotor, geeignet für die Transkription des insektizidisch wirksamen btI109P- Genteils in einer Pflanzenzelle; und
• 3) geeignete 3'-Enden-Transkriptbildungs- und Polyadenylierungs-Signale zur Expression des insektizidisch wirksamen btI109P-Genteils in einer Pflanzenzelle.
• Dieses chimäre Gen wird hierin nachfolgend im allgemeinen bezeichnet als das "chimäre btI109P-Gen". Vorzugsweise ist der insektizidisch wirksame btI109P-Genanteil in dem chimären btI109P-Gen als ein Hybridgen vorhanden, umfassend eine Fusion des trunkierten btI109P-Gens und ein selektierbares Markergen, wie das neo-Gen (das "btI109P-neo- Hybridgen"), codierend für ein BtI109P-NPTII- Fusionsprotein.
• Diese Erfindung betrifft ebenfalls:
• 1) Eine Zelle (die "transformierte Pflanzenzelle") einer Pflanze, wie Kartoffel oder Mais, deren Kerngenom mit dem insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil transformiert ist; und
• 2) eine Pflanze (die "transformierte Pflanze"), welche aus der transformierten Pflanzenzelle regeneriert wird oder aus der so regenerierten Pflanze erzeugt wird, deren Kerngenom den insektizidisch wirksamen btI109P-Genanteil enthält und welche resistent gegen Coleoptera ist.
• Diese Erfindung betrifft weiterhin noch einen B. thuringiensis ("Bt")-Stamm, transformiert, vorzugsweise durch Elektroporation, mit einem Vektor, welcher das gesamte oder einen Teil des btI109P-Gens trägt.
Hintergrund der Erfindung
• B. thuringiensis ("Bt") ist ein grampositives Bakterium, welches endogene Kristalle bei der Sporulation herstellt. Die Kristalle bestehen aus Proteinen, welche spezifisch toxisch gegen Insektenlarven sind. Es sind drei unterschiedliche Bt-Pathotypen beschrieben worden: Pathotyp A, welcher wirksam gegen Lepidoptera bzw. Schmetterlinge, z. B. Raupen, ist; Pathotyp B, welcher wirksam gegen bestimmte Dipteren, z. B. Moskitos und Kriebelmücken, ist; und Pathotyp C, welcher wirksam gegen Coleoptera, z. B. Käfer, ist (Ellar et al., 1986).
• Ein Bt-Stamm, dessen Kristalle toxisch gegenüber Coleoptera sind, ist beschrieben worden als Bt tenebrionis (U.S.-Patent 4 766 203; Europäische Patentveröffentlichung ("EP") 149 162), als Bt M-7 oder Bt San Diego (EP 213 818; U.S.-Patent 4 771 131) und als BtS1 (Europäische Patentanmeldung ("EPA") 88 402 115.5). Zwei weitere gegenüber Coleoptera toxische Stämme, BtPGSI208 und BtPGSI245, sind ebenfalls beschrieben worden (PCT-Veröffentlichung WO 90/09445).
• Die Tatsache, daß herkömmliche Eintauch-Fermentationstechniken verwendet werden können, um Bt-Sporen im großen Maßstab herzustellen, macht Bt-Bakterien kommerziell als eine Quelle von insektiziden Zusammensetzungen attraktiv.
• Genfragmente aus einigen Bt-Stämmen, codierend für insektizide Proteine, sind bislang identifiziert und in Pflanzengenome integriert worden, um die Pflanzen insektenresistent zu machen. Allerdings ist das Erzielen der Expression solcher Bt-Genfragmente in Pflanzen kein direktes Verfahren. Um eine optimale Expression eines insektiziden Proteins in Pflanzenzellen zu erzielen, ist es als notwendig befunden worden, jedes Bt-Genfragment so auf eine spezifische Weise zu manipulieren, daß es für einen wasserlöslichen Anteil eines Bt-Protoxins codiert, welcher eine wesentliche Toxizität gegen seine Zielinsekten beibehält (EPA 86 300 291.1 und EPA 88 402 115.5; U.S.-Patentanmeldung 821 582, eingereicht am 22. Januar 1986). Die EP 305 275 und WO 89/01515 betreffen Pflanzen, transformiert, um ein Coleoptera-wirksames Bt13-Toxin zu exprimieren.
Zusammenfassung der Erfindung
• Gemäß dieser Erfindung wird ein neuer Bt-Stamm des Pathotyps C, d. h. der BtI109P-Stamm, vorgesehen. Der BtI109P-Kristall, das -Kristallprotein, das -Protoxin und -Toxin, hergestellt von dem jeweiligen Stamm während der Sporulation, sowie insektizidisch wirksame Anteile des BtI109P-Protoxins, besitzen jeweils insektizide Aktivität und können deshalb in insektizidischen Zusammensetzungen gegen Coleoptera im allgemeinen formuliert werden, speziell gegen Agelastica alni, Diabrotica luteola, Haltica tombacina, Anthonomus grandis, Tenebrio molitor, Diabrotica undecimpunctata, Triboleum castaneum, Dicladispa armi era, Trichisna serica, Oulema oryzae, Colaspis brunnea, Lissorhomtrus oryzophilus, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Psylliodes punctulata, Entomoscelis americana, Meligethes aeneus, Ceutorynchus sp., Psylliodes chrysocephala und Phyllotreta undulata und insbesondere gegen den Kartoffelkäfer, Leptinotarsa decemlineata, welcher ein Hauptschädling von wirtschaftlich bedeutenden Nutzpflanzen ist.
• Ebenfalls gemäß dieser Erfindung wird ein Pflanzenzellgenom transformiert mit dem insektizidisch wirksamen btI109P-Genanteil, vorzugsweise dem trunkierten btI109P-Gen. Es wird bevorzugt, daß diese Transformation mit dem chimären btI109P-Gen ausgeführt wird. Die resultierende transformierte Pflanzenzelle kann verwendet werden, um eine transformierte Pflanze herzustellen, in welcher die Pflanzenzellen in manchen oder allen der Pflanzengewebe: 1) Den insektizidisch wirksamen btI109P-Genanteil als ein stabiles Insert in ihrem Genom enthalten, und 2) den insektizidisch wirksamen btI109P-Genanteil exprimieren durch Erzeugen eines insektizidisch wirksamen Anteils von dessen jeweiligem BtI109P-Protoxin, vorzugsweise dessen jeweiligem BtI109P-Toxin, wodurch die Pflanze resistent gegen Coleoptera gemacht wird. Die transformierten Pflanzenzellen dieser Erfindung können auch verwendet werden, um derartige insektizide Bt-Proteine für die Gewinnung herzustellen.
• Ferner wird gemäß dieser Erfindung ein Verfahren vorgesehen, um eine Pflanze resistent gegen Coleoptera zu machen, indem das Pflanzenzellgenom mit dem insektizidisch wirksamen btI109P-Genanteil, vorzugsweise dem trunkierten btI109P-Gen, transformiert wird. In dieser Hinsicht wird des bevorzugt, daß die Pflanzenzelle mit dem chimären btI109P-Gen transformiert wird.
• Noch weiter gemäß dieser Erfindung werden das BtI109P-Protoxin, die insektizidisch wirksamen Anteile eines solchen Protoxins und das BtI109P-Toxin sowie das btI109P-Gen, der insektizidisch wirksame btI109P-Genanteil, das trunkierte btI109P-Gen und das chimäre btI109P-Gen vorgesehen.
• Gemäß dieser Erfindung wird noch weitergehend ein Bt-Stamm transformiert, vorzugsweise durch Elektroporation, mit einem Vektor, welcher das gesamte oder einen Teil des btI109P- Gens trägt, codierend für das gesamte oder einen insektizidisch wirksamen Anteil des BtI109P-Protoxins.
• Ebenfalls gemäß dieser Erfindung werden eine insektizide Zusammensetzung gegen Coleoptera und ein Verfahren zum Bekämpfen von Coleoptera mit der insektiziden Zusammensetzung vorgesehen, wobei die insektizide Zusammensetzung den/das BtI109P-Stamm, -Kristall, -Kristallprotein, -Protoxin, -Toxin und/oder insektizidisch wirksame Protoxin-Anteile umfaßt. Weitere spezifische Ausführungsformen dieser Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen nochmals aufgeführt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Gemäß dieser Erfindung kann das BtI109P-Protoxin auf eine herkömmliche Weise isoliert werden aus dem BtI109P-Stamm, hinterlegt bei der DSM unter der Zugangsnummer 5870. Zum Beispiel kann der BtI109P-Kristall isoliert werden aus sporulierten Kulturen des BtI109P-Stammes (Mahillon und Delcour, 1984), und dann kann das Protoxin aus dem Kristall gemäß dem Verfahren von Höfte et al. (1986) isoliert werden. Das Protoxin kann verwendet werden, um für das Protoxin spezifische monoklonale oder polyklonale Antikörper auf eine herkömmliche Weise (Höfte et al., 1988) herzustellen. Das BtI109P-Toxin kann dann durch Proteaseverdau (z. B. durch Trypsinverdau) des BtI109P-Protoxins erhalten werden.
• Das btI109P-Gen kann auch aus seinem Stamm auf eine herkömmliche Weise isoliert werden. Zum Beispiel kann das btI109P-Gen in seinem BtI109P-Stamm identifiziert werden unter Anwendung des Verfahrens, beschrieben in der U.S.-Patentanmeldung 821 582 und in EPA 86 300 291.1 und EPA 88 402 115.5. Vorzugsweise wird das btI109P-Gen identifiziert durch: Verdauen von Gesamt-DNA aus dessen BtI109P-Stamm mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen; Größen-Fraktionieren der DNA-Fragmente, welche so hergestellt wurden, in DNA-Fraktionen von 5 bis 10 Kb; Ligieren derartiger Fraktionen in Klonierungsvektoren; Transformieren von E. coli mit den Klonierungsvektoren; und Screenen der Klone mit einer geeigneten DNA-Sonde. Die DNA-Sonde kann konstruiert werden: 1) Aus einer hochkonservierten Region eines bt-Gens, welches für ein anderes Kristall-Protoxin gegen Coleoptera codiert, wie: das bt13-Gen, beschrieben in EPA 88 402 115.5 und von Höfte et al. (1987); oder 2) auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des Protoxins, codiert durch das btI109P-Gen, wobei die Sequenz durch Gasphasen-Sequenzierung des immobilisierten Protoxins bestimmt werden kann (EPA 88 402 115.5).
• Alternativ dazu können die 5 bis 10 kB großen Fragmente, hergestellt aus Gesamt-DNA des BtI109P-Stammes, in geeignete Expressionsvektoren ligiert und in E. coli transformiert werden. Die Klone können dann durch herkömmliche Kolonie-Immunosondierungsverfahren (French et al., 1986) hinsichtlich der Expression des BtI109P-Toxins mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gescreent werden, welche gegen das Toxin erzeugt wurden.
• Das so identifizierte btI109P-Gen kann dann jeweils auf eine herkömmliche Weise sequenziert werden (Maxam und Gilbert, 1980), um die DNA-Sequenzen zu erhalten. Hybridisierungen in Southern-Blots zeigten, daß diese Gene verschieden von früher beschriebenen Genen sind, welche Protoxine und Toxine mit Aktivität gegen Coleoptera codieren (Höfte und Whiteley, 1989).
• Ein insektizidisch wirksamer Teil von jedem der Gene, codierend für einen insektizidisch wirksamen Anteil von dessen Protoxin, und ein trunkierter Teil von jedem der sequenzierten Gene, codierend nur für dessen Toxin, können in einer herkömmlichen Weise aus jedem Gen hergestellt werden, nachdem das Gen sequenziert worden ist. Die Aminosäuresequenzen des BtI109P-Protoxins und -Toxins können ferner aus den DNA-Sequenzen des btI109P-Gens und des trunkierten btI109P-Gens bestimmt werden. Mit "ein insektizidisch wirksamer Anteil" oder "ein Teil" des btI109P-Gens ist eine DNA-Sequenz gemeint, welche für ein Polypeptid codiert, das weniger Aminosäuren als das jeweilige BtI109P-Protoxin aufweist aber noch gegenüber Coleoptera toxisch ist. Ein solcher Teil des btI109P-Gens kann für ein BtI109P-Protoxin codieren, welches in Richtung auf mindestens eine Trypsinspaltungsstelle des Protoxins hin trunkiert worden ist (U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1).
• Um das gesamte oder einen insektizidisch wirksamen Teil des btI109P-Gens in E. coli und in Pflanzen zu exprimieren, können geeignete Restriktionsstellen eingeführt werden, welche jedes Gen oder jeden Genteil flankieren. Dies kann über ortsgerichtete Mutagenese unter Verwendung gut bekannter Verfahren erfolgen (Stanssens et al., 1987; Stanssens et al., 1989).
• Der insektizidisch wirksame btI109P-Genteil, codierend für einen als Insektizid wirksamen Anteil seines jeweiligen BtI109P-Protoxins, kann stabil auf eine herkömmliche Weise in das Kerngenom einer einzelnen Pflanzenzelle inseriert werden, und die so transformierte Pflanzenzelle kann auf eine herkömmliche Weise verwendet werden, um eine transformierte Pflanze herzustellen, welche insektenresistent ist. In dieser Hinsicht kann ein unschädlich gemachtes Ti-Plasmid, enthaltend den insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil, in Agrobacterium tumefaciens verwendet werden, um die Pflanzenzelle zu transformieren, und danach kann eine transformierte Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle unter Verwendung der Verfahren regeneriert werden, beschrieben zum Beispiel in EP 116 718 und EP 270 822, PCT- Veröffentlichung WO 84/02 913, EPA 87 400 544.0 und Gould et al. (1991). Bevorzugte Ti- Plasmidvektoren enthalten jeweils den insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil zwischen den Border-Sequenzen, oder zumindest lokalisiert zur Linken der rechten Border-Sequenz der T-DNA des Ti-Plasmids. Selbstverständlich können andere Typen von Vektoren verwendet werden, um die Pflanzenzelle zu transformieren, wobei Verfahren angewandt werden, wie direkter Gentransfer (wie beschrieben zum Beispiel in EP 233 247), Pollen-vermittelte Transformation (wie beschrieben zum Beispiel in EP 270 356, PCT-Veröffentlichung WO 85/01856 und U.S.-Patent 4 684 611), Pflanzen-RNA-Virus-vermittelte Transformation (wie beschrieben zum Beispiel in EP 67 553 und U.S.-Patent 4 407 956), Liposomen-vermittelte Transformation (wie beschrieben zum Beispiel in U.S.-Patent 4 536 475) und andere Verfahren, wie die kürzlich beschriebenen Verfahren zum Transformieren bestimmter Linien von Mais (Fromm et al., 1990; Gordon-Kamm et al., 1990).
• Die resultierende transformierte Pflanze kann in einem herkömmlichen Pflanzenzuchtschema verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit denselben Merkmalen herzustellen, oder um den insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil in andere Varietäten derselben oder verwandter Pflanzenspezies einzuführen. Samen, welche aus den transformierten Pflanzen erhalten werden, enthalten den insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil als ein stabiles genomisches Insert. Zellen der transformierten Pflanze können auf eine herkömmliche Weise kultiviert werden, um den als Insektizid wirksamen Anteil des BtI109P-Protoxins, vorzugsweise des BtI109P-Toxins, herzustellen, welcher gewonnen werden kann zur Verwendung in herkömmlichen Insektizidzusammensetzungen gegen Coleoptera (U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1).
• Der insektizidisch wirksame btI109P-Genteil, vorzugsweise das trunkierte btI109P-Gen, wird in ein Pflanzenzellgenom so inseriert, daß der inserierte Teil des Gens stromabwärts (d. h., 3') und unter der Kontrolle eines Promotors liegt, welcher die Expression des Genteils in der Pflanzenzelle steuern kann. Dies wird vorzugsweise durch Inserieren des chimären btI149P- Gens in das Pflanzenzellgenom bewerkstelligt. Bevorzugte Promotoren schließen ein: die starken konstitutiven 35S-Promotoren (die "35S-Promotoren") des Cauliflower-Mosaik-Virus aus Isolaten cm 1841 (Gardner et al., 1981), CabbB-S (Franck et al., 1980) und CabbB-JI (Hull und Howell, 1987); und den TR1'-Promotor und den TR2'-Promotor (den "TR1'-Promotor" bzw. "TR2'-Promotor"), welche die Expression des 1'- bzw. 2'-Gens der T-DNA steuern (Velten et al., 1984). Alternativ dazu kann ein Promotor verwendet werden, welcher nicht konstitutiv ist, sondern eher spezifisch für ein oder mehrere Gewebe oder Organe der Pflanze (z. B. Blätter und/oder Wurzeln) ist, wodurch der inserierte btI109P-Genteil nur in Zellen der/des spezifischen Gewebe(s) oder Organ(e) exprimiert wird. Zum Beispiel könnte der btI109P-Genteil selektiv in den Blättern einer Pflanze (z. B. Kartoffel, Mais, Ölsamen-Raps und Reis) exprimiert werden, indem der Genteil unter die Steuerung eines lichtinduzierbaren Promotors gestellt wird, wie dem Promotor des Gens für die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase aus der Pflanze selbst oder einer anderen Pflanze, wie der Erbse, wie offenbart in der U.S.-Patentanmeldung 821 582 und der EPA 86 300 291.1. Eine andere Alternative besteht darin, einen Promotor zu verwenden, dessen Expression induzierbar ist (z. B. durch Temperatur oder chemische Faktoren).
• Der insektizidisch wirksame btI109P-Genteil wird so in das Pflanzengenom inseriert, daß der inserierte Teil des Gens stromaufwärts (d. h. 5') von geeigneten 3'-Ende-Transkriptionsregulationssignalen (d. h. Transkriptbildungs- und Polyadenylierungs-Signalen) liegt. Dies wird vorzugsweise durch Inserieren des chimären btI109P-Gens in das Pflanzenzellgenom bewerkstelligt. Bevorzugte Polyadenylierungs- und Transkriptbildungs-Signale schließen diejenigen des Octopin-Synthase-Gens (Gielen et al., 1984) und des T-DNA-Gens 7 (Velten und Schell, 1985) ein, welche als 3'-untranslatierte DNA-Sequenzen in transformierten Pflanzenzellen wirken können.
• Es wird bevorzugt, daß der insektizidisch wirksame btI109P-Genteil in das Pflanzengenom in derselben Transkriptionseinheit und unter der Kontrolle desselben Promotors wie ein selektierbares Markergen inseriert wird. Das resultierende Hybrid-btI109P-Marker-Gen wird dadurch in einer transformierten Pflanze als ein Fusionsprotein exprimiert werden (U.S.- Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1; Vaeck et al., 1987). Dieses Ergebnis kann vorzugsweise bewerkstelligt werden durch Inserieren eines chimären btI109P-Gens, enthalten das Markergen, in das Pflanzenzellgenom. Es kann jedwedes herkömmliche Markergen verwendet werden, dessen Expression benutzt werden kann, um transformierte Pflanzenzellen zu selektieren. Ein Beispiel eines geeigneten selektierbaren Markergens ist ein Antibiotikum- Resistenzgen, wie das Neo-Gen, codierend für Kanamycin-Resistenz (Reiss et al., 1984; EPA 87 400 544.0; U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1). Dadurch werden der insektizidisch wirksame btI109P-Genteil und das Markergen (z. B. das btI109P-neo-Hybridgen) in einer transformierten Pflanze als ein Fusionsprotein exprimiert (U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1; Vaeck et al., 1987).
• Das gesamte oder ein insektizidisch wirksamer Teil des btI109P-Gens, codierend für Coleoptera-Toxine, können auch verwendet werden, um grampositive Bakterien zu transformieren, wie einen B. thuringiensis, welcher insektizidische Aktivität gegen Lepidoptera oder Coleoptera aufweist. Dadurch kann ein transformierter Bt-Stamm hergestellt werden, welcher nützlich ist zur Bekämpfung von sowohl Schmetterlings- bzw. Lepidoptera- als auch Coleoptera- Insektenschädlingen oder zur Bekämpfung zusätzlicher Coleoptera-Insektenschädlinge. Die Transformation eines Bakteriums mit dem gesamten oder einem Teil des btI109P-Gens, eingebracht in ein geeignetes Klonierungsvehikel, kann auf herkömmliche Weise ausgeführt werden, bevorzugt unter Verwendung herkömmlicher Elektroporationstechniken, wie beschrieben in der PCT-Patentanmeldung PCT/EP89/01539, eingereicht am 11. Dezember 1989.
• Der BtI109P-Stamm kann auch mit dem gesamten oder dem insektizidisch wirksamen Teile eines oder mehrerer Fremd-Bt-Gene transformiert werden, wie: dem bt2-Gen (U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1) oder einem anderen Bt-Gen, codierend für das gesamte oder einen insektizidisch wirksamen Anteil eines gegen Lepidopteren aktiven Bt- Protoxins; und/oder dem bt13-Gen (EPA 88 402 115.5) oder einem anderen Bt-Gen, wie dem btPGSI208-Gen oder btPGSI245-Gen (EPA 89 400 428.2; PCT-Veröffentlichung WO 90/09445), codierend für das gesamte oder einen insektizidisch wirksamen Anteil eines gegen Coleoptera aktiven Bt-Protoxins. Dadurch kann ein transformierter Bt-Stamm hergestellt werden, welcher nützlich zur Bekämpfung einer noch größeren Vielfalt von Insektenschädlingen ist, z. B. Lepidoptera und/oder zusätzlichen Coleoptera. Die Transformation des BtI109P- oder BtI260-Stammes mit dem gesamten oder einem Teil eines fremden Bt-Gens, eingebracht in einen herkömmlichen Klonierungsvektor, kann in einer gut bekannten Weise ausgeführt werden, vorzugsweise unter Anwendung herkömmlicher Elektroporationstechniken (Chassy et al., 1988).
• Der BtI109P-Stamm kann mittels herkömmlicher Verfahren (Dulmage, 1981) fermentiert werden, um hohe Ausbeuten an Zellen bereitzustellen. Unter angemessenen Bedingungen, welche gut verstanden sind (Dulmage, 1981), sporuliert jeder BtI109P-Stamm unter Bereitstellung von BtI109P-Kristallproteinen bei hohen Ausbeuten.
• Der/das BtI109P-Stamm, -Kristall, -Protoxin, -Toxin und/oder insektizidisch wirksame Anteil, vorzugsweise dessen Protoxin, können jeweils als der aktive Bestandteil in einer Insektizidzusammensetzung eingesetzt werden, welche zur Bekämpfung von Insektenschädlingen verwendet wird, die der Ordnung der Coleoptera angehören. Zum Beispiel kann der BtI109P- Kristall aus sporulierten Kulturen des BtI109P-Stammes isoliert werden (Mahillon und Delcour, 1984), und dann kann das entsprechende Protoxin aus diesen Kristallen gemäß dem Verfahren von Höfte et al. (1986) isoliert werden.
• Eine insektizidische, insbesondere Anti-Coleoptera-Zusammensetzung dieser Erfindung kann auf eine herkömmliche Weise unter Verwendung des BtI109P-Stammes oder vorzugsweise seines entsprechenden Kristalls, Kristallproteins, Protoxins, Toxins und/oder insektizidisch wirksamen Anteils seines Protoxins als aktiven Bestandteil(en), zusammen mit geeigneten Trägern, Verdünnungsmitteln, Emulgatoren und/oder Dispergiermitteln formuliert werden. Diese Insektizidzusammensetzung kann als benetzbares Pulver, Pellets, Granulate oder Stäubung oder als flüssige Formulierung mit wäßrigen oder nicht-wäßrigen Lösungsmitteln als ein Schaum, Gel, Suspension, Konzentrat etc. formuliert werden. Die Konzentration des BtI109P- Stammes, der Kristalle, Kristallproteine, des Protoxins, Toxins und/oder insektizidisch wirksamen Protoxin-Anteils in einer derartigen Zusammensetzung werden von der Natur der Formulierung und ihrer beabsichtigten Anwendungsweise abhängen. Im allgemeinen kann eine Insektizidzusammensetzung dieser Erfindung verwendet werden, um ein Kartoffelfeld 2 bis 4 Wochen lang gegen Coleoptera mit jeder Aufbringung der Zusammensetzung zu schützen. Für einen ausgedehnteren Schutz (z. B. für eine ganze Wachstumssaison) sollten zusätzliche Mengen der Zusammensetzung periodisch aufgebracht werden.
• Ein Verfahren zum Bekämpfen von Insekten, insbesondere Coleoptera, gemäß dieser Erfindung umfaßt vorzugsweise das Aufbringen (z. B. Besprühen) auf eine zu schützende Stelle (Fläche) einer insektiziden Menge des BtI109P-Kristalls, -Kristallproteins, -Protoxins, - Toxins oder des insektizidisch wirksamen Protoxin-Anteils, vorzugsweise des Protoxins. Die zu schützende Stelle kann beispielsweise das Habitat der Insektenschädlinge oder eine wachsende Vegetation oder eine Fläche, auf welcher Vegetation herangezogen werden soll, einschließen.
• Um das BtI109P-Protoxin oder -Toxin zu erhalten, können Zellen des BtI109P-Stammes auf eine herkömmliche Weise auf einem geeigneten Kulturmedium herangezogen werden und dann unter Verwendung herkömmlicher Mittel, wie enzymatischem Abbau oder Detergenzien oder dergleichen, lysiert werden. Das Protoxin kann dann durch Standardtechniken, wie Chromatographie, Extraktion, Elektrophorese oder dergleichen getrennt und gereinigt werden. Das Toxin kann dann durch Trypsinverdau des Protoxins erhalten werden.
• Die BtI109P-Zellen können auch abgeerntet und danach unversehrt, entweder lebendig oder tot, vorzugsweise getrocknet, auf die zu schützende Stelle aufgebracht werden. In dieser Hinsicht wird es bevorzugt, daß ein gereinigter BtI109P-Stamm (entweder lebendig oder tot) verwendet wird, insbesondere eine Zelimasse, welche zu 90,0 bis 99,9% BtI109P-Stamm ist.
• Die BtI109P-Zellen, -Kristalle, -Kristallproteine, das -Protoxin, -Toxin oder der insektizidisch wirksame Protoxin-Anteil können auf einer Vielzahl von Wegen in eine insektizide Zusammensetzung formuliert werden, wobei irgendeine Anzahl von herkömmlichen Zusatzstoffen, naß oder trocken, abhängig von der jeweiligen Verwendung, eingesetzt werden kann. Zusatzstoffe können Benetzungsmittel, Detergenzien, Stabilisatoren, Adhäsionsmittel, Ausbreitungsmittel und Streckmittel einschließen. Beispiele einer solchen Zusammensetzung schließen Pasten, Verstäubungspulver, benetzbare Pulver, Granulate, Köder- und Aerosol- Zusammensetzungen ein. Andere Bt-Zellen, -Kristalle, -Kristallproteine, -Protoxine, -Toxine und insektizidisch wirksame Protoxin-Anteile und weitere Insektizide, sowie Fungizide, Herbizide und Düngemittel können neben den BtI109P-Zellen, -Kristallen, -Kristallproteinen, -Protoxin, -Toxin und/oder insektizidisch wirksamen Protoxin-Anteil eingesetzt werden, um zusätzliche Vorteile oder Nutzen bereitzustellen. Eine solche insektizide Zusammensetzung kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden, und die Menge der BtI109P-Zellen, - Kristalle, -Kristallproteine, -Protoxin, -Toxin und/oder des insektizidisch wirksamen -Protoxinanteils, welcher verwendet wird, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie dem angezielten Insektenschädling, der verwendeten Zusammensetzung, dem Typ der Fläche, auf welche die Zusammensetzung aufgebracht werden soll, und den vorherrschenden Wetterbedingungen. Im allgemeinen wird die Konzentration des BtI109P-Protoxins, insektizidisch wirksamen -Protoxinanteils und/oder -Toxins mindestens etwa 0,1 Gew.-% der Formulierung bis etwa 100 Gew.-% der Formulierung, häufiger etwa 0,15 bis etwa 0,8 Gew.-% der Formulierung betragen.
• In der Praxis können einige Insekten das BtI109P-Protoxin, -Toxin, den insektizidisch wirksamen Protoxinanteil oder Mischungen hiervon auf der geschützten Fläche verzehren, d. h. auf der Fläche, wo derartiges Protoxin, Toxin und/oder der insektizidisch wirksame Protoxinanteil aufgebracht worden sind. Alternativ dazu können manche Insekten mit intakten und lebendigen Zellen des BtI109P-Stammes oder Transformanten davon gefüttert werden, so daß die Insekten etwas von dem Protoxin des Stammes aufnehmen und daran Tod oder Schaden erleiden.
• Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Die Figuren und die Sequenzauflistung, auf welche in den Beispielen Bezug genommen wird, sind wie folgend:
Figuren
• Fig. 1 - Gesamtproteinmuster durch SDS-PAGE von sporulierten BtI109P-, BtI260-, BtS1- und BtPGSI208-Bacillus-Kulturen. "MG" bezeichnet Molekulargewichts-Marker.
• Fig. 2 - Hybridisierungsmuster unter Bedingungen niedriger Stringenz von EcoRI-verdauter Gesamt-DNA, hergestellt aus den Stämmen BtS1, BtPGSI208, BtI109P und BtI260 mit einem 1,46 kb großen PstI-EcoRV-Fragment des Genoms des BtS1-Stammes, enthaltend ein internes Fragment des bt13-Gens ("cryIIIA"-Gen), als Sonde.
• Fig. 3 - Hybridisierungsmuster unter Bedingungen niedriger Stringenz von NIV-verdauter Gesamt-DNA, hergestellt aus den Stämmen BtS1, BtPGSI208, BtI109P und BtI260, mit einem 1,38 kb großen EcoRV-NcoI-Fragment des Genoms des BtPGSI208-Stammes, enthaltend ein internes Fragment des btPGSI208-Gens ("cryIIIB"-Gen), als Sonde. Die Sondenfragmente wurden mit 32P (A) oder mit Digoxygenin (B) (Boehringer Nicht-Radioaktives- Labeling-Kit) markiert.
Sequenzauflistung
• Seq. Id. Nr. 1 - DNA-Sequenz des btI109P-Gens. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des codierten BtI109P-Protoxins wird unterhalb der DNA-Sequenz präsentiert. Das trunkierte btI109P-Gen, codierend nur für das BtI109P-Toxin, scheint sich von Nukleotidposition 397 bis zum TAA-Terminationscodon an Nukleotidposition 2179 zu erstrecken.
• Wenn es nicht anderweitig in den Beispielen angegeben wird, werden alle Verfahren zur Erzeugung und Manipulierung rekombinanter DNA durch die standardisierten Verfahren ausgeführt, beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning -A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982).
Beispiel 1: Charakterisierung des BtI109P-Stammes
• Der BtI109P-Stamm wurde aus in den Philippinen gesammeltem Getreidestaub isoliert und am 4. April 1990 bei der DSM unter der Zugangs-Nr. 5870 hinterlegt.
• Der Stamm kann auf herkömmlichem Standardmedium kultiviert werden, vorzugsweise LB- Medium (Bacto-Trypton 10 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, NaCl 10 g/l und Agar 15 g/l), bevorzugt bei 28ºC. Für eine Langzeit-Aufbewahrung wird es bevorzugt, ein gleiches Volumen einer Sporen-Kristall-Suspension mit einem gleichen Volumen von 50%igem Glycerin zu vermischen und dies bei -70ºC aufzubewahren, oder eine Sporensuspension zu lyophilisieren. Für die Sporulation wird die Verwendung von T&sub3;-Medium (Trypton 3 g/l, Tryptose 2 g/l, Hefeextrakt 1,5 g/l, 5 mg MnCl&sub2;, 0,05 M Na&sub2;PO&sub4;, pH 6,8, und 1,5% Agar) während 24 Stunden bei 28ºC bevorzugt, woran sich eine Lagerung bei 4ºC anschließt. Während seiner vegetativen Phase kann der BtI109P-Stamm auch unter fakultativ anaeroben Bedingungen wachsen, jedoch findet eine Sporulation nur unter aeroben Bedingungen statt.
• Die Sterilisation jedes Stamms findet durch Autoklavenbehandlung während 20 Minuten bei 120ºC (Druck von 1 bar) statt. Eine solche Behandlung inaktiviert die Sporen und das kristalline BtI109P-Protoxin vollständig. Eine UV-Bestrahlung (254 nm) inaktiviert die Sporen, aber nicht die Protoxine.
• Nach Kultivierung auf Nährstoff-Agar ("NA", Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) während eines Tages bilden die Kolonien des BtI109P-Stamms trübe weiße Kolonien mit unregelmäßigen Rändern. Zellen aus jedem Stamm (Gram positive Stäbchen von 1,7-2,4 · 5,6-7,7 um) sporulieren nach drei Tagen Kultivierung bei 28ºC auf NA. Die während der Sporulation hergestellten Kristallproteine werden im BtI109P-Stamm in flachen quadratischen Kristallen verpackt. Der Stamm wurde ferner durch Serotypieren mit B. thuringiensis-H-Antiserum (von H. de Barjac vom Institut Pasteur, Frankreich) charakterisiert. BtI109P gehört dem Serotyp H 303b an, bei einem Agglutinationstiter von 25 000 mit Bt kurstaki.
Beispiel 2: Merkmale des BtI109P-Kristalls
• Der BtI109P-Stamm wurde 48 bis 72 Stunden lang bei 28ºC auf T&sub3;-Medium herangezogen. Nach der Sporulation wurden die Sporen und Kristalle in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ("PBS" von Oxoid Ltd., Basingstroke, Hampshire, U.K.) geerntet. Die resultierenden wäßrigen Sporen-Kristall-Suspensionen wurden zentrifugiert, und die Pellets wurden in PBS resuspendiert, erneut zentrifugiert, und das Pellet wurde wieder resuspendiert.
• Das Gesamtproteinmuster der sporulierten Kulturen des BtI109P-Stammes wurde (Fig. 1) mit anderen Bacillus-Stämmen verglichen, welche die CryIIIA- oder CryIIIB-Kristallproteine herstellen, gemäß Lambert et al. (1987). Für diesen Vergleich wurde ein Aliquot der gewaschenen Sporen-Kristall-Mischung von jedem Stamm zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in Probenpuffer-Mix solubilisiert. Die Extrakte, welche Kristallproteine enthielten, wurden auf einem 12,5%igen SDS-PAGE-Gel (Laemmli, 1970) analysiert und mit Coomassie-Brilliant-Blue R-250 gefärbt. Die Ergebnisse dieser Analyse enthüllten die Gegenwart einer Hauptbande (Molekulargewicht 65,5 kDa) und zweier kleinerer Banden (MG 72,4 kDa und 49,1 kDa) in Sporen-Kristallen des Stammes BtI109P. Darüber hinaus ist das Gesamtproteinmuster von BtI109P deutlich von dem Gesamtproteinmuster von BtS1 verschieden.
Beispiel 3: Insektizide Aktivität des BtI109P-Kristallproteins
• Wie in Beispiel 2 wurde der Stamm 48 bis 72 Stunden lang bei 28ºC auf T&sub3;-Medium herangezogen. Nach der Sporulation wurden die Sporen und Kristalle in PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) geerntet. Die resultierenden Sporen-Kristall-Suspensionen wurden zentrifugiert, und die Pellets wurden resuspendiert, erneut zentrifugiert, und die Pellets wurden, nach Entfernen des Überstands, wieder resuspendiert. Die Pellets wurden über Nacht in wäßrigen Lösungen inkubiert, enthaltend 50 mM Na&sub2;CO&sub3; und 5 mM Dithiotreitol. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände gewonnen, und der Proteingehalt der Extrakte der jeweiligen Kristallproteine der zwei Stämme wurde bestimmt.
• Kartoffelblätter wurden entweder in standardisierte Sporen-Kristall-Mischungen oder in wäßrige Verdünnungen der Kristallproteinlösungen eingetaucht und dann zwei Stunden lang an Luft trocknen gelassen. Kartoffelkäferlarven des ersten Larvenstadiums wurden auf die behandelten Blätter gebracht, und die Sterblichkeit der Larven wurde nach drei Tagen bestimmt. Diese Ergebnisse wurden mit der Sterblichkeit von Larven verglichen, welche mit Blättern gefüttert wurden, behandelt entweder mit Sporen-Kristall-Mischungen oder solubilisierten Kristallproteinen von BtS1 (von DSM, Zugangs Nr. 4288), welcher als ein Referenzstamm verwendet wurde. Die LC50 (50% lethale Konzentration), ausgedrückt entweder als ug der solubilisierten Kristallproteine/ml Lösung oder als die Anzahl von Sporenkristallen in der Eintauch-Suspension, wurde durch Probit-Analyse (Finney, 1971) berechnet. Die Ergebnisse, einschließlich des 95%-Konfidenzintervalls, und der Steigung der Probit-Linie, sind in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 zusammengefaßt. Tabelle 1: Vergleich der Toxizität von solubilisierten Kristallproteinen aus dem BtI109P-Stamm, dem Bt San Diego-Stamm (NRRL-Zugangs-Nr. B-15939) und dem BtS1-Stamm (Referenzstamm) gegen Larven von Leptinotarsa decemlineata. Tabelle 2: Vergleich der Toxizität von Sporen-Kristall-Mischungen aus dem BtI109P-Stamm und dem BtS1-Stamm (Referenzstamm) gegen Larven von Leptinotarsa decemlineata.
Beispiel 4: Identifizierung des btI109P-Gens
• Das BtI109P-Protoxin aus dem BtI109P-Stamm wurde durch ELISA (Engvall und Pesce, 1978) mit einem polyklonalen Antiserum gegen das Bt13-Coleoptera-Toxin (Höfte et al., 1987) detektiert. Das btI109P-Gen wurde in dem Stamm durch Herstellen von Gesamt-DNA von dem Stamm und danach Verdauen der DNA mit den Restriktionsenzymen NlaIV und EcoRI identifiziert.
• Die EcoRI-verdaute DNA wurde durch Southern-Blotting analysiert, wobei mit einem 32Pmarkierten 1,46 kb großen PstI-EcoRV-Fragment aus dem Genom des BtS1-Stamms (EPA 88 402 115.5), enthaltend das bt13-Gen, sondiert wurde. Nach der Hybridisierung mit der Sonde wurde der Blot unter Bedingungen geringer Stringenz (2·SSC, 0,1% SDS bei 68ºC während 2 · 15 Minuten) gewaschen und entwickelt. Das Autoradiogramm (Fig. 2) zeigt, daß nur das btI109P-Gen mit dem bt13-Gen verwandt ist. Das Hybridisierungsmuster mit der Sonde zeigte ebenfalls, daß das btI109P-Gen deutlich unterschiedlich zu dem bt13-Gen ist (Fig. 2).
• Die NlaIV-verdaute DNA wurde durch Southern-Blotting analysiert, wobei mit einem ³²Pmarkiertem oder Digoxygenin-markiertem (Nicht-Radioaktives-Labeling-Kit, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) 1,38 kb großem EcoRV-NcoI-Fragment aus dem Genom des BtPGSI208-Stammes (PCT-Patentanmeldung PCT/EP90/00244), enthaltend das btPGSI208- oder cryIIIB-Gen sondiert wurde. Nach Hybridisieren mit der Sonde wurde der Blot unter Bedingungen geringer Stringenz (2·SSC, 0,1% SDS bei 68ºC während 2 · 15 Minuten) gewaschen und entwickelt. Das Hybridisierungsmuster mit der Sonde zeigte, daß der btI109P-Genstamm DNA-Sequenzen enthält, welche unter den verwendeten experimentellen Bedingungen nur entfernt zu dem btPGSI208-Gen verwandt sind (Fig. 3).
Beispiel 5: Klonierung und Expression des btI109P-gens
• Um das btI109P-Gen zu isolieren, wurde Gesamt-DNA aus dem BtI109P-Stamm hergestellt. Anschließend wurde die Gesamt-DNA mit HindIII verdaut. Die verdaute DNA wurde auf einem Saccharose-Gradienten fraktioniert, und Fragmente im Bereich von 5 kb bis 7 kb wurden in den HindIII-verdauten und BAP-behandelten Klonierungsvektor pUC 19 (Yanisch- Perron et al., 1985) ligiert. Rekombinante E. coli-Klone, "pUC-cryIIIDHd1", welche den Vektor enthielten, wurden dann mit einem internen 1,4 kb großen EcoRV-PstI-DNA-Fragment des bt13-Gens (EP 305 275) als einer Sonde gescreent, um Klone zu identifizieren, welche das btI109P-Gen enthielten.
• Die so identifizierten DNA-Fragmente wurden dann nach Maxam und Gilbert (1980) sequenziert. (Seq. Id. Nr. 1).
• Basierend auf der Analyse seiner DNA-Sequenz, wird das Gen mit passenden Restriktionsenzymen geschnitten, um das trunkierte btI109P-Gen zu ergeben, welches für das BtI109P- Toxin codiert.
Beispiel 6: Konstruktion eines btI109P-neo-Hybridgens
• Unter Befolgung der Vorgehensweise von U.S.-Patentanmeldung 821 582 und der EPA 88 402 115.5 und EPA 86 300 291.1, wird das trunkierte btI109P-Gen aus Beispiel 5 an das neo-Gen fusioniert, um das entsprechende Hybridgen zu bilden.
Beispiel 7: Insertion des btI109P-Gens, des trunkierten btI109P-Gens und des btI109P- neo-Hybridgens in E. coli, und Insertion des trunkierten btI109P-Gens und des btI109P-neo-Hybridgens in Kartoffelpflanzen.
• Um das btI109P-Gen, das trunkierte btI109P-Gen und das btI109P-neo-Hybridgen aus den Beispielen 5 und 6 in E. coli und in Pflanzen zu exprimieren, werden verschiedene Gencassetten in E. coli gemäß den Verfahren, beschrieben in EPA 86 300 291.1 und EPA 88 402 115.5, hergestellt.
• Um eine größere Expression in Pflanzen zu gestatten, werden Cassetten, jeweils enthaltend eines der trunkierten und/oder Hybridgene, jeweilig in einen intermediären Pflanzenexpressionsvektor (zwischen die T-DNA-Border-Sequenzen dieses Vektors) inseriert, werden jeweils an Transkript-Bildungs- und Polyadenylierungs-Signale in dem Pflanzenexpressionsvektor fusioniert, werden jeweils unter die Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt, wie dem Promotor aus dem Cauliflower-Mosaik-Virus, welcher das 35S3-Transkript steuert (Hull und Howell, 1987), oder dem 2'-Promotor aus der TR-DNA des Octopin-Ti-Plasmides (Velten et al., 1984), und werden jeweils an 3'-Ende-Transkript-Bildungs- und Polyadenylierungs- Signale fusioniert, fähig zum Wirken in Pflanzen, wie dem 3'-Ende des Octopin-Synthase- Gens (Gielen et al., 1984).
• Unter Verwendung von Standardverfahren (Deblaere et al., 1985) werden die intermediären Pflanzenexpressionsvektoren, enthaltend das trunkierte btI109P-Gen und das btI109P-neo- Hybridgen, in den Agrobacterium-Stamm C 58 Cl RifR (U.S.-Patentanmeldung 821 582; EPA 86 300 291.1) überführt, welcher das unschädlich gemachte Ti-Plasmid pGV2260 (Vaeck et al., 1987) trägt. Die Selektion auf Spectionomycin-Resistenz ergibt cointegrierte Plasmide, bestehend aus pGV2260 und den jeweiligen intermediären Pflanzenexpressionsvektoren. Jeder dieser rekombinanten Agrobacterium-Stämme wird dann verwendet, um verschiedene Kartoffelpflanzen (Solanum tuberosum) so zu transformieren, daß das trunkierte btI109P-Gen und das btI109P-neo-Hybridgen in unterschiedlichen Kartoffelpflanzenzellen enthalten sind und von diesen exprimiert werden.
Beispiel 8: Expression des trunhierten btI109P-Gens und des btI109P-neo-Ilybridgens in Kartoffelpflanzen
• Die insektizide Aktivität gegen Coleoptera der Expressionsprodukte des trunkierten btI109P- Gens und des btI109P-neo-Hybridgens in Blättern von transformierten Kartoffelpflanzen, erzeugt aus den transformierten Kartoffelpflanzenzellen von Beispiel 7, wird ausgewertet durch Aufzeichnen der Wachstumsrate und Sterblichkeit von Larven von Leptinotarsa decemlineata, welche mit diesen Blättern gefüttert wurden. Diese Ergebnisse werden mit der Wachstumsrate von Larven verglichen, welche man mit Blättern aus untransformierten Kartoffelpflanzen fütterte. Die Toxizitätsassays werden durchgeführt wie beschrieben in der EPA 88 402 115.5, der U.S.-Patentanmeldung 821 582 und EPA 86 300 291.1. Eine signifikant höhere Sterblichkeitsrate wird unter Larven, welche gefüttert wurden mit Blättern transformierter Kartoffelpflanzen, enthaltend das trunkierte btI109P-Gen oder das btI109P-neo-Hybridgen, als unter Larven, welche mit den Blättern untransformierter Pflanzen gefüttert werden, erhalten.
• Unnötig zu erwähnen, daß diese Erfindung nicht auf den BtI109P(DSM 5870)-Stamm beschränkt ist. Vielmehr beinhaltet die Erfindung auch jegliche Mutante oder Variante des BtI109P-Stammes, welche Kristalle, Kristallproteine, Protoxin oder Toxin mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften, insbesondere insektiziden Eigenschaften, wie beim BtI109P-Kristall, -Kristallprotein, -Protoxin oder -Toxin, herstellt. In dieser Hinsicht schließen Varianten des BtI109P-Stammes Varianten ein, deren Gesamtproteinmuster im wesentlichen das gleiche ist, wie das Proteinmuster des BtI109P-Stammes, wie gezeigt in der Fig. 1.
• Diese Erfindung ist ebenfalls nicht auf mit dem trunkierten btI109P-Gen transformierte Kartoffelpflanzen eingeschränkt. Sie beinhaltet jegliche einkeimblättrige oder zweikeimblättrige Pflanze, wie Tomate, Tabak, Raps, Alfalfa, Sonnenblumen, Baumwolle, Mais, Sojabohnen, Kohlgewächse, Zuckerrüben und andere Gemüsearten, transformiert mit einem insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil.
• Ebensowenig ist diese Erfindung auf die Verwendung von Agrobacterium tumefaciens-Ti- Plasmiden zum Transformieren von Pflanzenzellen mit einem insektizidisch wirksamen btI109P-Genteil beschränkt. Andere bekannte Techniken für Pflanzenzelltransformationen, wie mittels Liposomen, mittels Elektroporation oder mittels Vektorsystemen, basierend auf Pflanzenviren oder Pollen, können zum Transformieren von Einkeimblättrigen und Zweikeimblättrigen mit einem solchen Genteil verwendet werden. Zum Beispiel kann ein insektizidisch wirksamer btI109P-Genteil verwendet werden, um bestimmte ausgewählte Linien von Mais- und Reispflanzen durch Verfahren zu transformieren, wie sie beschrieben sind von Fromm et al. (1990), Gordon-Kamm et al. (1990), Shimamoto et al. (1989) und Datta et al. (1990).
• Darüber hinaus können DNA-Sequenzen, die verschieden sind von jenen, welche natürlicherweise im BtI109P-Stamm vorhanden sind, und jeweilig das für natürliche BtI109P-Protoxin, - Toxin bzw. die insektizidisch wirksamen Protoxin-Anteile codieren, für die Transformation von Pflanzen und Bakterien verwendet werden. In dieser Hinsicht kann die natürliche DNA- Sequenz dieser Gene modifiziert werden durch: 1) Ersetzen einiger Codons mit anderen, welche entweder für die gleiche Aminosäure oder für andere, bevorzugt äquivalente Aminosäuren codieren; und/oder 2) Deletieren oder Hinzufügen einiger Codons; vorausgesetzt, daß derartige Modifikationen die Eigenschaften, insbesondere die insektiziden Eigenschaften, des codierten BtI109P-Protoxins, des insektizidisch wirksamen Anteils des BtI109P-Protoxins oder des BtI109P-Toxins nicht im wesentlichen verändern.
• Andere DNA-Rekombinanten, enthaltend die zuvor genannten DNA-Sequenzen in Assoziation mit weiterer Fremd-DNA, insbesondere der DNA von Vektoren, geeignet zum Transformieren von Pflanzen und Mikroorganismen, welche von E. coli verschieden sind, werden ebenfalls von dieser Erfindung abgedeckt. In dieser Hinsicht ist diese Erfindung nicht auf die spezifischen Plasmide, enthaltend das btI109P-Gen oder Teile davon, welche bisher beschrieben wurden, eingeschränkt, sondern diese Erfindung überspannt vielmehr jegliche DNA- Rekombinanten, enthaltend eine DNA-Sequenz, welche deren Äquivalent ist. Ferner betrifft die Erfindung alle DNA-Rekombinanten, welche die Gesamtheit oder einen Teil des btI109P- Gens einschließen und welche zur Transformierung von Mikroorganismen (z. B. Pflanzenassoziierten Bakterien, wie Bacillus subtilis, Pseudomonas und Xanthomonas, oder Hefen, wie Streptomyces cerevisiae) unter Bedingungen geeignet sind, welche gestatten, daß die Gesamtheit und ein Teil des Gens von den besagten Mikroorganismen exprimiert und daraus gewonnen werden kann, oder in eine Pflanzenzelle überführt werden kann.
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SEQUENZ-AUFLISTUNG 1. Allgemeine Information
• i) ANMELDER: PLANT GENETIC SYSTEM N. V.
• ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neue Stämme von Bacillus Thuringiensis und deren für insektizide Toxine codierende Gene
• iii) ANZAHL VON SEQUENZES: 2
• iv) KORRESPONDENZADRESSE
• A. ADRESSAT: Plant Genetic Systems N. V.
• B. STRASSE: Plateaustraat 22,
• C. POSTLEITZAHL UND STADT: 9000 Ghent,
• D. STAAT: Belgien
• v) COMPUTER-LESBARE FORM
• A. MEDIUM TYP 5,25-Zoll, doppelseitige, "High-Density" 1,2 MB Floppy-Disk
• B. COMPUTER: IBM PC/AT
• C. BETRIEBSSYSTEM: DOS Version 3.3
• D. SOFTWARE: WordPerfect
• v) DATEN DER GEGENWÄRTIGEN ANMELDUNG: nicht verfügbar
• vii) DATEN DER FRÜHEREN ANMELDUNG: EPA 90403724.9
• EPA 90401144.2
• SEQ. ID. Nr.: 1
• SEQUENZTYP: Nukleinsäure und entsprechendes Protein
• SEQUENZLÄNGE: 2411 Basenpaare
• STRANGART: doppelsträngig
• TOPOLOGIE: linear
• MOLEKÜLTYP: DNA, abgeleitet aus Bacillus thuringiensis
• HYPOTHETISCH: NEIN
• ANTI-SINN: NEIN
• ORIGINAL-QUELLE:
• A. ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis var. kurstaki
• B. STAMM: BtI109P (DSM Zugangsnummer 5870)
• INTERNATIONALE QUELLE: pUC.cryIIIDHd1
• MERKMALE: Nukleotide 1-232: 5'-(stromaufwärts)Sequenzen des btI109P-Gens (S) 231-2179: codierende Sequenz des btI109P-Gens (S)
• Nukleotide 2180-Ende: 3'-(stromabwärts)Sequenzen des btI109P-Gens (S)
• EIGENSCHAFTEN: Das btI109P-Gen codiert für ein 72 kD großes insektizides Kristallprotein, das gegenüber Coleoptera toxisch ist.

Claims (26)

1. Der BtI109P-Stamm mit der Hinterlegungsnummer DSM 5870.

2. Eine Sporen-Kristallmischung des Stammes nach Anspruch 1.

3. Ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 umfasst.

4. Ein als Insektizid wirksamer Anteil des Proteins nach Anspruch 3.

5. Der als Insektizid wirksame Anteil nach Anspruch 4, welcher durch Proteaseverdau erhalten wurde.

6. Eine DNA-Sequenz, welche das Protein nach Anspruch 3 codiert.

7. Eine DNA-Sequenz, welche das Protein nach Anspruch 4 oder 5 codiert.

8. Eine DNA-Sequenz, welche ein Protein codiert, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 1 von Aminosäureposition 56 bis zu Aminosäureposition 649 umfasst.

9. Ein chimäres Gen, umfassend:

1) die DNA nach Anspruch 7 oder 8;

2) einen Promoter, der für die Transkription der DNA in einer Pflanzenzelle geeignet ist; und

3) ein geeignetes 3'-terminales Transkriptbildungs- und Polyadenylierungssignal für die Expression der DNA in einer Pflanzenzelle.

10. Das chimäre Gen nach Anspruch 9, wobei die DNA im Vergleich zu der DNA der SEQ ID Nr. 1 eine veränderte Codonverwendung aufweist.

11. Das chimäre Gen nach Anspruch 9, wobei die DNA durch Austausche, Deletionen oder Additionen von Aminosäurecodons modifiziert wurde, unter der Voraussetzung, dass die insektizide Aktivität des Proteins, das von dem chimären Gen codiert wird, nicht verändert wird.

12. Das chimäre Gen nach Anspruch 11, wobei der codierende Bereich ein Hybrid der DNA nach Anspruch 7 oder 8 und einer DNA, welche für einen selektierbaren Marker codiert, ist, so dass bei Expression ein Fusionsprotein produziert wird.

13. Das chmimäre Gen nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12, wobei das chmimäre Gen stabil in das Genom einer Pflanzenzelle integriert ist.

14. Eine Pflanzenzelle, die so transformiert wurde, dass diese das chimäre Gen nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13 umfasst.

15. Eine transformierte Pflanze, welche das chmimäre Gen nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13 in einigen oder allen ihren Geweben umfasst.

16. Ein Samen der Pflanze nach Anspruch 15, welcher das chimäre Gen nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 12 umfasst, das stabil in das Genom seiner Zellen integriert ist.

17. Ein Bakterium wie beispielsweise ein Bacillus thuringiensis-Bakterium, das mit der DNA nach irgendeinem der Ansprüche 6 bis 8 transformiert wurde.

18. Eine insektizide Zusammensetzung, welche das Protein nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, den Stamm nach Anspruch 1 oder die Sporen-Kristallmischung nach Anspruch 2 umfasst.

19. Ein Verfahren zum Schützen einer Pflanze vor Coleopterainsekten, umfassend: Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem chimären Gen nach irgendeinem der Ansprüche 9 bis 13 und Regenerieren einer transformierten Pflanze aus der Zelle.

20. Ein Verfahren zum Bekämpfen von Coleopterainsekten, umfassend: Anwenden oder Sprühen der Sporen-Kristallmischung nach Anspruch 2 oder des Proteins nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 auf einen Bereich, der vor Coleopterainsekten geschützt werden soll.

21. Ein Mikroorganismus, welcher unter Bedingungen transformiert wurde, die ermöglichen, dass die gesamte oder ein als Insektizid wirksamer Teil der DNA nach Anspruch 6 exprimiert wird und aus dem Mikroorganismus gewonnen werden kann.

22. Ein Mikroorganismus, welcher unter Bedingungen transformiert wurde, die ermöglichen, dass die gesamte oder ein als Insektizid wirksamer Teil der DNA nach Anspruch 6 exprimiert wird und in eine Pflanzenzelle überführt wird.

23. Verwendung einer DNA-Sequenz, welche von der verschieden ist, die natürlicherweise in dem Stamm BtI109P mit der Hinterlegungsnummer DSM 5870 vorliegt, um Pflanzen und Bakterien zu transformieren, wobei die DNA-Sequenz das Protein der SEQ ID Nr. 1 oder einen als Insektizid wirksamen Anteil von diesem codiert.

24. Eine Pflanze, die transformiert wurde, so dass diese eine DNA-Sequenz enthält, welche von der verschieden ist, die natürlicherweise in dem Stamm BtI109P mit der Hinterlegungsnummer DSM 5870 vorliegt, wobei die DNA-Sequenz das Protein der SEQ ID Nr. 1 oder einen als Insektizid wirksamen Anteil von diesem codiert.

25. Die Verwendung nach Anspruch 23, wobei die DNA-Sequenz modifiziert wurde, indem: i) einige Codons durch andere ersetzt wurden, welche für dieselben Aminosäuren codieren, oder ii) einige Codons deletiert oder addiert wurden, unter der Voraussetzung, dass die Modifikationen die insektiziden Eigenschaften des codierten Proteins oder des als Insektizid wirksamen Anteils von diesem nicht verändern.

26. Die Pflanze nach Anspruch 24, wobei die DNA-Sequenz modifiziert wurde, indem: i) einige Codons durch andere ersetzt wurden, welche für dieselben Aminosäuren codieren, oder ii) einige Codons deletiert oder addiert wurden, unter der Voraussetzung, dass die Modifikationen die insektiziden Eigenschaften des codierten Proteins oder des als Insektizid wirksamen Anteils von diesem nicht verändern.