DD283840A5 - Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetischen manipulation von b.thuringiensis und/oder b.cereus unter verwendung der rekombinanten dna-technologie - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetischen Manipulation von B. thuringiensis und/oder B. cereus unter Verwendung der rekombinanten DNA Technologie. Mit der Erfindung wird ein neuartiges Verfahren zur Verfuegung gestellt, bei dem einfache, zum Teil bekannte Verfahrensschritte zur Anwendung kommen. Das Verfahren besteht darin, dasz man B. thuringiensis und/oder B. cereus mit Hilfe eines einfachen Transformationsverfahrens mit hoher Effizienz tranformiert unter Verwendung einer rekombinanten DNA, die fuer die vorgesehene genetische Manipulation von B. thuringiensis und/oder B. cereus geeignet ist.{Verfahren; Manipulation; B. thuringiensis; B cereus; rekombinante DNA-Technologie; Transformationsverfahren}

Description

Hierzu 9 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, welches erstmals eine direkte und zielgerichtete genetische Manipulation von Bacillus thuringiensis sowie dem nahe verwandten B. coreus mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie ermöglicht, basierend auf einem effizienten Transformationsverfahren für besagte Bacillus-Spezies.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Konstruktion von Plasmiden und „shuttle"-Vektoren sowie die damit transformierten B. thuringiensis- und/oder B. cereus-Stämme selbst.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einschleusung und gegebenenfalls Expression von Genen oder sonstigen nützlichen DNA Sequenzen in Bacillus thuringiensis und/oder Bacillus cereus, insbesondere aber ain Verfahren zur Einschleusung und Expression von Protoxingenen.

Ebenfalls umfaßt von der vorliegenden Erfindung i;-.t ein Verfahren zur direkten Klonierung sowie gegebenenfalls zur Expression und ldentifJ7!cr'ing neuer Gene oder sonstiger nützlicher DNA-Sequenzen in Bacillus thuringiensis und/oder Bacillus cereus, wodurch erstmals die Möglichkeit besteht, Genbanken direkt in Bacillus ihuringien Is und/oder Bacllluscereus zu etablieren und dortzuexprimieren.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Baciilüs thuringiensis gehört zur großen Gruppe der gram-positiven, aeroben, Endosporen bildenden Bakterien. Im Unterschied zu den sehr nahe verwandten Bacillus Arten, B. cereus und B. anthracls, produziert die Mehrzahl der bisher bekannten

B. thuringiensis-Spezies im Verlaufe ihrer Sporulation einen paraspolaren Einschlußkörper, der aufgrund seiner kristallinen Struktur allgemein auch als Kristallkörper be7eichnet wird. Dieser Kristallkörper ist aus insektizid wirksamen kristallinen Protoxin-Proteinen, dem sogenannten δ-Endotoxin, zusammengesetzt.

Diese Pioteinkristalle sind für die Insektentoxizität von E. thuringiensis verantwortlich. Das δ-En'i Moxin entfaltet seine insektizide Aktivität jedoch erst nach der oralen Aufnahme des Kristallkörpers und dessen Auflösung in, alkalischen Darmsaft der Zielinsektsn sowie der Freisetzung der eigentlichen toxischen Komponente aus dem Protoxin durch limitierte Proteolyso aufgrund der Einwirkung von Proteasen aus dem Verdauungstrakt der Insekten.

Die δ-Endotoxine der verschiedenen B, thurlnglensls-Stämme zeichnen sich durch ihre hohe Spezifität gegenüber bestimmten Zielinsekten, insbesondere gegenüber verschiedenen Lepidopteren-, Coleopteren- und Dipterenlarven sowie durch ihre große Wirksamkeit aus. Weitere Vorteile, die bei der Verwendung der δ-Endotoxine von B. thurlngler.sle eine Rolle spielen, liegen in der offensichtlichen Schwierigkeit für die Zielinsekten begründet, Resistenzen gegen das kristalline Protein zu entwickeln, sowie in der Unschädlichkeit der Toxine gegenüber Menschen, anderen Saugetieren, Vögeln, Fischen oder Insekten, mit Ausnahme der ob9n genannten Zielinsekten.

Das insektizide Potential der B. thurlnglensls-Protoxine wurde schon sehr früh erkannt. Bereits seit Ende der 20er Jahre werden

B. thuringiensls-Präparate als Bioinsektizide zur Bekämpfung verschiedener, durch Insekten verursachter Erkrankungen von Kulturpflanzen eingesetzt. Mit der Entdeckung von B. thurlngiensls var. israelensis durch üoldberg/1/ and Margalit (1977) sowie B.thurlnglensls var. tenebrionis durch Krieg/2/ et al (1983) konnte das Anwendungsspektrum von B. thurlngiensls sogar auf Mücken- und Käferlarven ausgedehnt werden.

Mit der Einführung der Gentechnologie und den sich daraus ergebenden neuen Möglichkeiten hat das Gebiet der B.thurlnglensls- Toxine einen neuen Aufschwung erfahren.

So gehört die Klonierung von δ-Endotoxingenen in fremden Wirtsorganismen wie beispielsweise in E. coli bereits zur Routine.

Das hat dazu geführt, daß mittlerweile die DNA-Sequenzen einer ganzen Reihe von δ-Endotoxingenen bekannt sind (z. B.

Schnepf, H. E./3/ and Whiteley, H. R., 1981; Klier, A./4/ et al, 1982; Geiser, M./5/ et al, 1986; Haider, M.Z./6/ et al, 1987).

Die meisten B, thuringlensis-Arten enthalten mehrere Gene, die ein insektizid wirksames Protein kodieren. Diese Gene, die nur während der Sporu'ationsphase exprimiert werden, sind in der Mehrzahl der Fälle auf großen übertragbaren Plasmiden (30 bis 150Md) lokalisiert und können daher sehr einfach zwischen den verschiedenen B.thurlnglensls-Stämmen sowie zwischen B.thurlnglensls und B.cereus ausgetauscht werden, sofern diese kompatibel sind (Gonzalez, J. M./7/ et al, 1982).

Die Protoxiiigene von B. thurlnglenslt var. kurstaki gehöre-« tu einer Familie verwandter Gene, von denen verschiedene bereits kloniert und sequentiort wurden. Diese Arbeiten wurden in erster Linie in einem E. coll-Klonierungssystem durchgeführt.

Die Kloniorung von B. thurlnglensls-Genen war somit bisher im wesentlichen auf einige wenige und ausschließlich hoterologe Wirtssysteme beschränkt, von denen das E. coli-System das am besten untersuchte und verstandene ist.

Mittlerweile sind jedoch auch Berichte über eine erfolgreiche Klonierung und Expression von Protoxingenen in anderen Wirtssystemen bekannt geworden, wie z. B. in B. subtilis (Klier, A./4/ et al, 1982), Pt»ei:domonat f luorenszens (Obukowicz, M. G./ 8/ et al, 1986), sowie Saccharomyces cerevlslao (EP 0238441). Auch der Einbau urd die Expression des δ-Endotoxingenes in pflanzliche Wirtszellen sind inzwischen geglückt (EP 0292435).

Bei der Klonierung in E. coil wird die Tatsache ausgenützt, daß manche Protoxi igeno zusätzlich zu den gram-positiven Promotoren zufälligerweise auch einen E.coll-ähnlichen Promotor enthalten. Diese promotorähnlichen DNA-Sequenzen machen es möglich, daß die 'j.thurlnglensls Protoxingene auch in heterologen Wirtssystemen exprimiert werden können, sofern diese in der Lage sino, die oben erwähnten Kontrollsequenzen zu erkennen.

Die exprimiertiin Protoxinprotüine können dann, nach Aufbrechen der Wirtszellen, mit Hilfe bekannter Verfahren isoliert und identifiziert werden.

Es hat sich zwischenzeitlich aber gezeigt, daß nicht in allen Fällen E.coli-ähnliche Promotoren in Protoxinnenen vorhanden sind (Donovan/9/ et al, 1988), so daß bisher nur ganz bestimmte Protoxingene, welche die zuvor genannten Voraussetzungen erfüllen, in heterologen Wirtssystemen exprimierbar und damit identifizierbar sind.

Die Klonierung von Genen außerhalb des natürlichen Wirtsorganismus sowie die Verwendung dieser Stämme in der Praxis als Bioinsektizide sind somit mit einer Reihe zum Teil gravierender Nachteile verbunden:

a) Eine Expression von B. thurlngienls-Protoxingenen ist nur in bestimmten Fällen möglich.

b) Es erfolgt im allgemeinen keine oder aber nur eine geringe Sekretion von exprimierten Fremdproteinen.

c) Eine korrekte Faltung der δ-Endotoxine ist im reduzierenden Milieu von heterologen Wirtszellen nicht immer gewährleistat, was eine unerwünschte Änderung der spezifischen Aktivität oder des Wirtsbereiches der Toxine zur Folge haben kann.

d) Falls eine Expression überhaupt stattfindet, so sind die Expressionsraten der klonierten Fremdgene unter den nativen Expressionssequenzen zumeist nur gering.

Schnepf/3/ und Whitley/10/ (1981; 1985) schätzen, daß das in E.coli klonierte B. thuringiensis-Toxin nur 0,5% bis 1 % des gesamten Zellproteins von E. coli ausmacht, wohingegen das Kristallprotein in B. thuringiensis zwischen 30% und 40% des Trockengewichts sporulierender Kulturen beträgt. Diese gravierenden Unterschiede in den Expreisionsraten sind möglicherweise auf das Fehlen von sporuiationsspezifischen Kontrollsignalen in den heterologen Wirtssystemen sowie auf Schwierigkeiten bei der Erkennung der B. thuringiensis-Promotoren und/oder Problemen bei der post ranslationalen Modifikation des Toxinmoleküls durch den Fremdwirt zurückzuführen.

e) Viele der allgemein zur Expression verwendeten Wirtsstämme sind toxikologisch nicht so unbedenklich wie B. thuringiensis und B.cereus.

f) B. thuringiensis und B. cereus bilden einen natürlichen Hauptbestandteil der mikrobif Ilen Bodenflora, was für die meisten der allgemeinen zur Expression verwendeten Wirtsstämme nicht zutrifft.

Diese zuvor genannten Probleme und Schwierigkeiten könnten überwunden werden, wenn es gelänge, besagte B. thurlngiensis-Gene direkt im homologen Wirtssystem zu Monieren, wo die natürlichen gram-positiven Promotoren der Protoxingene zur Expression benützt werden können.

Es existie 1 aber bishor kein Verfahren, das B. thuringiensis, dieses aus kommerzieller Sicht so wichtige Bakterium, einer direkten genetischen Modifizierbarkeit zugänglich macht und damit beispielsweise eine effiziente Wiedereinschleusung eines klonierten Protoxingens in einen B. thuringiensis-Stamm ermöglicht.

Der Grund hierfür ist in erster Linie darin zu sehen, daß es bisher nicht gelungen ist, ein effizientes Transformationssystem für

B. thuringiensis sowie den nahe verwandten B. cereus zu entwickeln, welches hinreichend hohe Transformationsraten gewährleistet und somit die Anwendung bereits etablierter rDNA-Techniken auch auf B. thuringiensis ermöglicht.

Die bisher verwendeten Verfahren zur Herstellung neuer B. thuringiensis-Stämrne mit neuen Insektiziden Eigenschaften basieren vornehmlich auf dem konjugalen Transfer von Plasmid kodierten Protoxingenen.

Eine erfolgreiche Wiedereinschleusung eines klonierten B. thuringiensis-Kristallproteingens in B. thuringiensis ist bisher erst in einem einzigen Fall beschrieber, (Klier, A./11/et al, 1983), wobei aber auch hier, in Ermangelung eines geeigneten Transformationssystems für B. thuringiensis, auf den konjugalen Transfer zwischen B. subtilis und B. thuringiensis zurückgegriffen werden mußte. Auch bei diesem von Klier et al beschriebenen Verfahren wird E. coli als Zwischenwirt verwendet.

Die konjugalen Transfer-Vorfahren weisen jedoch eino ganze Reihe von gravierenden Nachteilen auf, die sie für eine routinemäßige Anwendung zur genetischen Modifikation von B, thuringlensis und/oder B. cereus ungeeignet erscheinen lassen.

a) Der konjugale Transf Br von Plasmid kodierten Protoxingenen ist nur zwischen B. thurlnglensls-Stämmen bzw. zwischen B. cereus und B.Ihurhgiensls-Stämmen möglich, die kompatibel miteinander sind.

b) Bei konjugalem Plasmidtransfor zwischen weiter entfernten Stämmon wird häufig nur eine geringe Transferfrequenz erzielt.

c) Es gibt keine Möglichkeit, die Expression der Protoxingene zu regulieren oder zu modifizieren.

d) Es gibt keine Möglichkeit, das Gen selbst zu modifizieren.

e) Bei Anwesenheit mehrerer Protoxingene in einem Stamm kann die Expression einzelner Gene aufgrund des sog. Gen-Dosis-Effektes stark reduziert sein.

f) Es kann zum Auftreten von Instabilitäten kommen aufgrund einer möglichen homologen Rekombination verwandter Protoxingene.

Alternative Trar.cformationsverfahren, die beispielsweise bei vielen grampositiven Organismen mittlerwoile routinemäßig Anwendung finden, erwiesen sich sowohl bei B. thuringlensis als auch bei B. cereus als ungeeignet.

Zu den vorgenannten Verfahren gehört z. B. die direkte Transformation von Bakterienprotoplasten mit Hilfe der Polyethylenglykolbehandlung, die bei vielen Streptomyces-Stämmen (Bibb, J. J./12/ et al, 1978) sowie bei B, subtllls (Chang, S., and Cohen, S. N.,/3/ 1979), B. mogaterlum (Brown, B. J., and Carlton, B. C.,/14/1980), Streptococcus lactis (Kondo, J. K., and McKay, L. L.,/15/ 1984), S. faecalis (Wirth, R./16/ et al), Corynebacterium glutamlcum (Yoshihama, M./17/ et al, 1985) sowie zahlreichen anderen gram-positiven Bakterien erfolgreich angewendet wurde.

Für die Anwendung dieses Verfahrens müssen die Bakterienzellen zunächst protoplastisiert werden, d. h., die Zellwändo werden mit Hilfe lytischer Enzyms verdaut.

Eine weitere Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung dieses direkten Transformationsverfahrens bilden die Expression der neu eingeführten genetischen Information sowie die Regeneration der transformierten Protoplasten auf komplexen Festmedien, bevor eine erfolgreiche Transformation z. B. mit Hilfe eines Selektionsmarkers nachgewiesen werden kann.

Dieses Transformationsverfahren erwies sich für B. tliuringlensls und den nahe verwandten B. cereus als ungeeignet. Aufgrund der hohen Resistenz der B. thurlnglensls-Zellen gegenüber Lysozym und der nur mangelhaften Regenerierbarkeit der Protoplasten zu intakten zellwandhaltigen Zellen bleiben die erreichbaren Transformationsraten gering und schwierig zu reproduzieren (Alikhanian, S. J./18/ et al, 1981; Martin, P.A./19/ et al, 1981; Fischer, H.-M./20/ et al, 1984).

Mit diesem Verfahren lassen sich daher höchstens sehr einfache Plasmide, die für die Arbeit mit rekombinanter DNA ungeeignet sind, mit geringer frequenz in B. thuringlensis- oder B. cereus-Zellen einschleusen.

Einzelne Berichte über zufriedenstellende Transformationsraten, die mit Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens erroicht werden konnten, beruhen auf der Ausarbeitung sehr aufwendiger Opiimierungsprogramme, die aber immer nur konkret für einen bestimmten B.thurlnglensls-Stamm anwendbar sind und mit einem hohen Aufwand an Zait und Kosten verbunden sind (Schall, D./21/, 1986), Diese Verfahren sind daher für eine routinemäßige Anwendung im industriellem Maßstab ungeeignet.

Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein neuartiges Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetischen Manipulation von B. thuringlensis und/oder B. cereus zur Verfugung gestellt. Bei dem Verfahren kommen einfache, zum Teil bekannte Verfahrensschritte zur Anwendung.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, neue Verfahren zu entwickeln, die B. thuringlensis oder den nahe verwandten B. cereus einer direkten genetischen Modifizierbarkeit zugänglich machen, und damit beispielsweise eine Klonierung von Protoxingenen im natürlichen Wirtssystem ermöglichen. Dennoch ist es bisher nicht gelungen, die bestehenden Schwierigkeiten und Probleme zufriedenstellend zu lösen.

Zur Zeit stehen weder geeignete Transformationsverfahren zur Verfügung, die eino schnelle effiziente und reproduzierbare Transformation von B.thuringlensis und/oder R.cereus mit ausreichend hoher Transformationsfrequenz ermöglichen, noch sind geeign»'.e Klonierungsvektoren verfügbar, die eine Anwendung der für andere bakterielle Wirtssysteme bereits etablierten rekombinanten DNA-Techniken auch auf B. thuringiensls erlauben. Dies trifft in gleicher Weise auch für B. cereus zu.

Diese Aufgabe konnte jetzt überraschenderweise im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch die Anwendung einfacher, zum Teil bekannter Verfahrensmaßnahmen gelöst werden.

Erfindungsgemäß wird somit ein neuartiges Verfahren, welches basierend auf der rekombinanten DNA-Technologie erstmals eine direkte, zielgerichtete und reproduzierbare genetische Manipulation von B. thuringlansis sowie von B. cereus ermöglicht, indem man Bacillus thuringlensis und/oder Bacillus cereus mit Hilfe eines einfachen Transformationsverfahrens mit hoher Effizienz transformiert, unter Verwendung einer rekombinanten DNA, die für die vorgesehene genetische Manipulation von Bacillus thuringiensls und/oder Bacillus cereus geeignet ist.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einschleusung, Klonierung und Expression von Genen oder sonstigen nützlichen DNA-Sequenzen, insbesondere aber von Protoxingenen, in B. thuringiensls und/oder B. cereus, das sich dadurch kennzeichnet, daß man

a) besagte Gene oder DNA isoliert;

b) die isolierten Gene oder DNA gegebenenfalls mit Exprossionssequenzen, die in Bacillus thuringiensls und/oder B. cereus funktionsfähig sind, operabel verknüpft;

c) die genetischen Konstruktionen aus Abschnitt b) unter Vei Wendung geeigneter Vektoren in Bacillus thuringlensis und/oder B. cerous-Zellen transformiert und

d) gegebenenfalls ein entsprechendes Genprodukt exprimiert und, sofern gewünscht, isoliert.

Ebenfalls umfaßt von der vorliegenden Erfindung ist eine direkte Methode zur Klonierung, Expression und Identifizierung von Genen oder sonstigen nützlichen DNA-Sequenzen, insbesondere aber von Protoxingenen, in B. thuringiensls und/oder B. cereus, das sich dadurch kennzeichnet, daß man

a) die Gesamt-DNA von Bacillus thurlnglensls mit Hilfe geeigneter Restruktionsenzyme verdaut;

b) aus den resultierenden Restriktionsfragmenten solche geeigneter Größe isoliert;

c) besagte Fragmente in einen geeigneten Vektor einspleißt;

d) Bacillus thurlnglensls und/oder B. cereus-Zellen mit besagtem Vektor transformiert und

e) aus den Transformanten mit Hilfe geeigneter Screeningverfahren neue DNA-Sequenzen aufspürt und gegebenenfalls isoliert. Neben Strukturgenen können selbstverständlich auch beliebige andere nützliche DNA-Sequenzen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, wie z. B. nichtkodierende DNA-Sequenzen, die eine regulatorische Funktion aufweisen, wie z. B. 'anti-sense-DNA.

Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet damit eine Vielzahl neuer Möglichkeiten, die sowohl unter wissenschaftlichen als auch unter kommerziellen Gesichtspunkten von außerordentlichem Interesse sind.

So ist es beispielsweise nunmehr erstmals möglich, Aufschlüsse über die Regulation der Ö-Endotoxin-Synthese, insbesondere im Hinblick auf die Sporulation, auf der genetischen Ebene zu gewinnen.

Auch die Frage, an welcher Stelle des Toxinmoleküls sich der (die) für die Insektentoxizität verantwortliche(n) Abschnitt(e) befindet(n) und inwieweit diese(r) auch mit der Wirtsspezifität in Zusammenhang steht(en), sollte sich jetzt klären lassen. Die Kenntnisse der molekularen Organisation der verschiedenen Toxinmoleküle sowie der diese Moleküle kodierenden Toxingens aus den verschiedenen B.thurlnglensls-Spezies ist von außerordentlichem praktischen Interesse für eine gezielte genetische Manipulation dieser Gene, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens nunmehr erstmals möglich wird. Das neue erfindungsgemäße Verfahren erlaubt neben oiner gezielten Modifikation der δ-Endotoxin-Gene selbst auch die Manipulation der die Expression dieser Gene kontrollierenden regula'.orischen DNA-Sequenzon, wodurch sowohl die spezifischen Eigenschaften der δ-Endotoxine wie z. B. ihi β Wirtsspezifität, ihr Resorptionsverhalten u. a. gezielt verändert als auch ihre Produktionsraten gesteigert werden können, z. J. durch den Einbau von stärkeren und effizienteren Promotor-Sequenzen.

Durch gezielte Mutation ausgewählter Gene oder Subgene In vitro gelangt man somit zu neuen B.thuringlensis- und/oder B. cereus-Varianten.

Eine weitere Möglichkeit zur Konstruktion neuer B.thuringlensis- und/oder B.cereus-Varianten besteht im Zusammenspleißen von Genen oder Ganabschnitten, die aus verschiedenen B.thurlnglensls-Quellen stammen, wodurch B.thuringlensis- und/oder B, cereus-Stämme mit einem erweiterten Anwendungsspektrum entstehen. Auch synthetisch oder halb-synthetisch hergestellte Toxingene können auf diese Weise für die Konstruktion neuer B. thurlngiensls- und/oder B. cereus-Varietäten verwendet werden.

Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund der starken Erhöhung der Transformationsfrequenz sowie der Vereinfachung des Verfahrens zum erstenmal die Erstellung von Genbanken sowie ein schnelles Screening von modifizierten und neuen Genen in B.thuringlensis und/oder B.cereus.

Insbesondere ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren jetzt erstmals eine direkte Expression von oenbanken in 3.thuringiensls und/oder B. cereus sowie die Identifizierung neuer Protoxingene in B.thuringlensis mit Hilfe bekannter, vorzugsweise immunologischer oder biologischer Verfahren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren, das basierend auf einer stai Ken Erhöhung der Effizienz der B. thuringlensls-/B. cereus-Transformation gegenüber vorbekannten Verfahren erstmals eine direkte genetische Modifikation des B.thuringlensis- und/oder B.cereus-Genoms möglich macht.

Im einzelnen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Transformation von B.thuringlensis und/oder B. cereus durch Einschleusung rekombinanter DNA, insbesondere von Plasmid- und/oder Vektor-DNA, in B.thuringlensis- und/oder B. cereus-Zellen mit Hilfe der Elektroporation.

Bevorzugt ist dabei ein Verfahren zur Transformation von B.thuringlensis und/oder B.cereus mit δ-Endotoxin kodierenden DNA-Sequenzen sowie DNA-Sequenzen, die für ein Protein kodieren, das im wesentlichen die insektentoxischen Eigenschaften besagter B.thuringlensis Toxine aufweist.

Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung betrifft die Expression von DNA-Sequenzen, die ein δ <~ndotoxin kodieren oder aber ein Protein, welches zumindest im wesentlichen die insektentoxischen Eigenschaften des B.thurlnglensls-Toxins aufweist, in transformierten B.thuringlensis und/oder B.cereus-Zellen.

Ebenfalls umfaßt von der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung bifunktioneller Vektoren, sogenannte „shuttle"-Vektoren, für B. thuringiensis und/oder B. cereus sowie die Verwendung besagter „shuttle"-Vektoren zur Transformation von B. thuringiensis- und/oder B.cereus-Zellen.

Bevorzugt ist die Konstruktion bifunktioneller Vektoren, die außer in B. thuringiensis und/oder B. cereus in einem oder mehreren anderen, heterologen Wirtssystemen, insbesondere aber in E.coll-Zellen replizieren.

Im besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von „shuttle"-Vektoren für B.thuringlensis und/oder B.cereus, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuringiensis vorkommt, oder aber zumindest ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist, d. h. das zumindest im wesentlichen die insektentoxischen Eigenschaften des B.thuringionsis-Toxins aufweist. Ebenso umfaßt von der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieser „shuttle"-Vektoren zur Transformation von B.thuringiensis- und/oder B. cereus-Zellen sowie die Expression der auf besagten „shuttle"-Vektoren vorhandenen DNA-Sequenzen, insbesondere derjenigen DNA-Sequenzen, die für ein δ-Endotoxin aus B.thuringiensis kodieren oder aber zumindest für ein Protein, das im wesentlichen die insektentoxischen Eigenschaften derB.thuringiensis-Toxine aufweist.

Ebenso umfaßt von der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von B.thuringlensis und/oder B. cereus als generelle Wirtsorganismen für die Klonierung und Expressic η homologer sowie insbesondere auch heterologer DNA oder piner Kombination aus homologer und hetei ologer DNA.

Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung betrifft < zuvor näher charakterisierten Plasmide und „shuttle"-Vektoren selbst, deren Verwendung zur Transformation von B.thuringiensis und/oder B.cereus sowie die mit diesen transformierten B.thuringiensis-und B.cereus-Zellen selbst.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind die bifunktionellen („shuttle")-Vektoren pXI61 (= pk61) und pXI93 (= pk93), die, transformiert in B.thuringiensis var. kurstaki HD1 cryBbzw. B.cereus 569K, bei der als Internationale Hinterlegungsstelle anerkannten „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen" (Braunschweig, BRD) gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter der Nummer DSM4573 (DSM 4572, transformiert in B.thuringiensis var. kurstaki

HD 1 cryB) bzw. DSM4571 (pXI93, transformiert in B. thurlnglensls var. kurstaki HD 1 cryB) und DSM4573 (pXI 93, transformiert in B.cereus 569K) hinterlegt worden sind.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung neue B.thurlnglansls- und B.coreus-Varietäten, die mit einer DNA-Sequenz transformiert sind, welche ein δ-Endotoxin aus B.thurlnglen»l» kodiert und experimiert oder aber zumindest ein Protein, das im wesentlichen die toxischen Eigenschaften der B.thuringlonsls-Toxine aufweist.

Die transformierten B.thurlnglensls- und B.cereus-Zellen sowie die von diesen produzierten Toxlne können zur Herstellung insektizider Mittel verwendet werden, die einen weiteron Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen.

Ebenso umfaßt sind Verfahren sowie Mittel zur Bekämpfung von Insekten unter Verwendung der zuvor näher charakterisierton transformierten B.thurlnglensls- und/oder B.cereus-Zellen sowie zellfreie Kristallkqrper- (δ-Endotoxin) Präparate, welche die von besagten transformierten Baclllus-Zellen produzierten Protoxine enthalten.

Im folgenden soll eine kurze Beschreibung der Abbildungen gegeben werden.

Abbildung 1: Transformation von E.coli HB101 mit pBR322 (o) und *B.thurlnglensls HD1 cryB mit pBC 16 (·) (Δ Anzahl der überlebenden »HD1 cryB-Zellon).

Abbildung 2: Einfluß des Alters einer 'B.thurlnglensls HD1 cryB-Kultur auf die Transformationsfrequenz. Abbildung 3: Einfluß des pH-Wertes der PBS-Pufferlösung auf die Transformationsfrequenz. Abbildung 4: Einfluß der Saccharosekonzentration der PBS-Pufferlösung auf die Transformationsfrequenz. Abbildung 5: Abhängigkeit zwischen der Anzahl der Transformanten und der Menge an pro Transformation eingesetzter DNA. Abbildung 6: Vereinfachte Restriktionsktrte des „shuttle"-Vektors *pXI 61. Der schraffierte Balken kennzeichnet die vom

gram-positiven pBC 16 stammenden Sequenzen, der Rest stammt vom gram-negativen Plasmid pUC 8. Abbildung 7: Vereinfachte Restriktionskarte von *pXI93. Der schraffierte Balken kennzeichnet das Protoxin-Strukturgen (Pfeil, Kurhd 1) und die 5'- und 3'- nichtkodierenden Sequenzen. Der restliche nichtschraf Herta Teil stammt vom

„shuttle"-Vektor\oXI61

Abbildung 8: SDS (Sodiumdodecylsulfatl/Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Extrakten sporulierender Kulturen von »B.thurlngiensls HD 1 cryB, B.cereus 569K und ihren Derivaten.

[1: »HD1 cryB(pXI93), 2: "HD1 cryB(pXI61),3: »HD1 cryB,4: HD1, LBGB-1449, 5: »B.cereus 569K(pXI937,6:

569K)

a) Comassie-gefärbt, M: Molekulargewichtsstandard, MG: Molekulargewicht (Dalton), Pfeil: Position des 130000-

Dalton-Protoxins.

b) Western blot des gleichen Gels, versetzt mit polyklonalen Antikörpern gegen das K-1-Kristallprotein von B.thuringlensisHDL

Das Auffinden positiver Banden erfolgte mit Hilfe von markierten Anti-Ziegen-Antikörpern. Pfeil: Position des 130-00C-DaItOn-PrOtOXmS. Weitere Bandenß Abbauprodukte des Protoxins.

Abbildung 9: Transformation von B. subtills LBG B-4468 mit pBC 16 Plasmid-DNA mit der für B.thurlnglensls optimierten Elektroporationsmethode

(o: Transformanten^g Plasmid DNA; ·: Lebendkeimzahl/ml)

* Die im Prioritätsdokument für die Benennung der Plasmide gewählte interne Bezeichnung pK wurde für die Auslandsfassung durch dia offiziell anerkannte Bezeichnung pXI ersetzt.

Auch die Bezeichnung für die im Rahmen der Ausführungsbeispiele verwendete asporogene B.thuringlensls HD 1-Mutante wurde von cryß nach cryB geändert.

Ein wesentlicher Aspekt vorliegender Erfindung betrifft ein neuartiges Transformationsverfahren für B.thurlnglensls und

B. ce reu s, das auf der Einschleusung von Plasmid-DNA in B. thurlngiensis- und/oder B. cereus-Zellen unter Anwendung der an sich bekannten Elektroporationstechnologie beruht.

Nachdem bis zum Zeitpunkt der vorliegenden Erfindung alle Versuche gescheitert waren, die bei anderen bakteriellen Wirtssystemen bereits etablierten Transformationsverfahren auch auf B. thuringiensls und den nahe verwandten B. cereus zu übertragen, konnte jetzt im Rahmen dieser Erfindung durch die Anv/endung der Elektroporationstechnologie sowie begleitender Maßnahmen ein überraschender Erfolg erzielt werden.

Dieser Erfolg muß insbesondere auch deshalb als überraschend und unerwartet angesehen werden, als von Seiten einer sowjetischen Gruppe (Shivarova, N./22/ et al., 1983) bereits zu einem früheren Zeitpunkt Elektroporationsversuche an

B. thuringiensis-Protoplasten durchgeführt wurden, die erreichten Transformationsfrequenzen aber so gering waren, daß dieses Verfahren in der Folge als unbrauchbar für eine B.thuringiensis-Transformation angesehen wurde und infolgedessen keine weitere Beachtung mehr fand.

Aufbauend auf Untersuchungen der für eine Elektroporation von B.thuringiensls- und/oder B.cereus-Zellen kritischen Verfahrensparameter konnte jetzt überraschenderweise ein Transformationsverfahren entwickelt werden, das in idealer Weise an die Bedürfnisse von B.thuringlensis und B.cereus angepaßt ist und zu Transformationsraten führt, die in einem Bereich

zwischen 10⁶ und 10⁸ Zellen/pg Plasmid-DNA liegen, insbesondere aber in einem Bereich zwischen 10⁶ und 10⁷ Zellen/pg Plasmid-DNA.

Annähernd gleich hohe Transformationsraten mit Werten zwischen 10² und maximal 10⁶ Transformanten^g Plasmid-DNA, konnten bisher nur mit dem bei Schall/21/ (1986) beschriebenen PEG- (Polyethylenglykol-) Transformationsverfahren erzielt werden. Hohe Transformationsraten bleiben jedoch auf diejenigen B.thuringiensis-Stämme beschränkt, für die das PEG Verfahren in sehr zeitaufwendigen Optimierungsstudien spezifisch angepaßt wurde, was dieses Verfahren für eine praktische Anwendung als ungeeignet erscheinen läßt.

Darüber hinaus erweisen sich diese Verfahren in der Praxis in vielen Fällen als nicht oder aber nur schlecht reproduzierbar.

Im Gegensatz dazu handelt es sich bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren um ein prinzipiell auf alle B.thurlngiensls- sowie B. cereus-Stamme anwendbares Transformationsverfahren, das weniger zeitaufwendig, rationeller und somit effizienter ist als die traditionellen PEG-Transformationsverfahren.

So können in dem erfindungsgemäßen Vorfahren beispielsweise ganze, intakte Zellen eingesetzt werden, wodurch die zeitaufwendige und für B.thuringlensls sowie B. cereus kritische Protoplastierung sowie die anschließende Regeneration auf komplexen Nährmedien entfällt.

Darüber hinaus kann bei Anwendung der PEG-Vorfahron die Durchführung der notwendigen Verfahrensmaßnahmen bis zu einer Woche beanspruchen, während mit dem erfindungsgemäßen Transformationsverfahren die transformierten Zellen innerhalb weniger Stunden (in der Regel über Nacht) erhältlich sind.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Anzahl von B.thurlngiensls- und/oder B.cereus-Zellen, die pro Zeiteinheit transformiert werden kann.

Während bei den traditionellen PEG-Verfahren nur kleine Aliquots gleichzeitig ausplattiert werden können, um eine Hemmung der Regeneration durch ein zu dichtes Wachstum der Zellen zu vermeiden, können bei Anwendung der Elektroporationstechnik große Mengen an B.thurlnglensis- und/oder B.cereus-Zellen gleichzeitig ausplattiert werden.

Dies ermöglicht den Nachweis von Transformanten auch bei sehr kleinen Transformationsfrequenzen, was mit den vorbeschriebenen Verfahren nicht oder aber nur mit erheblichem Aufwand möglich ist.

Darüber hinaus genügen bereits DNA-Mengen im Nanogramm-Bereich, um zumindest einige Transformanten zu erhalten.

Dies ist ganz besonders dann von Bedeutung, wenn ein sehr effizientes Transformationssystem benötigt wird, wie beispielsweise bei der Verwendung von DNA-Material aus E. coil, was aufgrund eines stark ausgeprägten Restriktionssystems in B.thuringlensls-Zellen gegenüber B.thurlnglensls-DNA zu einer Reduktion der Transformationsfroquenzen um den Faktor 10³ führen kann.

Das erfindungsgemäßeTransformationsverfahren, daß im wesentlichen auf der an sich bekannten Elektroporationstechnologie basiert, ist durch die folgenden spezifischen Verfahrensrnaßnahmen charakterisiert:

a) Herstellen einer Zellsuspension mit geeigneter Zelldichte in einqm für die Anzucht von B.thurlnglenels-Zellen geeigneten Kultivierungsmedium und bei einer für das Wachstum der Zellen ausreichenden Belüftung;

b) Abtrennen der Zellen aus der Zellsuspension und resuspendieren in einem für die nachfolgende Elektroporation geeigneten Inokulationspuffer;

c) Zugabe einer DNA-Probe in einer für die Elektroporation geeigneten Konzentration;

d) Einbringen des unter Punkt b) und c) beschriebenen Ansatzes in eine Elektroporationsapparatur;

e) eine oder mehrere kurzzeitige Entladungen eines Kondensators über die Zellsuspension zur kurzfristigen Erzeugung hoher elektrischer Feldstärken über einen Zeitraum, der für eine Transformation von B.thuringlensls- und/oder B.cereus-Zellen mit rekombinanter DNA ausreichend ist;

f) gegebenenfalls Nachinkubation der elektroporierton Zellen;

g) Ausplattieren der elaktroporierten Zellen auf einem geeigneten Selektionsmedium und h) Auslesen der transformierten Zellen.

In einer spezifischen und im Rahmen dieser Erfindung bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die B.thuringlensh-Zellen zunächst in einem geeigneten Nährmedium bei ausreichender Belüftung und bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise von 3O⁰C bis 35°C, inkubiert, bis eine optische Dichte (OD₅₅₀) von 0,1 bis 1,0 erreicht ist.

Das Alter der für die Elektroporation vorgesehenen Bacillus-Kulturen hat einen deutlichen Einfluß auf die Transformations^ equenz. Besonders bevorzugt ist daher eine optische Dichte der Bacillus-Kulturen von 0,1 bis 0,3, insbesondere aber von 0,2. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß sich auch mit Bacillus-Kulturen aus anderen Wachstumsphasen, insbesondere auch mit Übernachtkulturen gute Transformationsfrequenzen erzielen lassen (siehe Abbildung 2).

Als Ausgangsmaterial verwendet man in der Regel frische Zellen oder Sporen, es kann aber ebensogut auch auf tiefgefrorenes Zellmaterial zurückgegriffen werden. Dabei handelt es sich vorzugsweise um Zellsuspensionen von B. thuringlensis- und/oder B, cereus-Zellen in geeigneten Flüssigmedien, welchen vorteilhafterweise ein bestimmter Anteil eines „Frostschutzmittels" zugesetzt wird.

Geeignete Frostschutzmittel sind in erster Linie Gemische von osmotisch aktiven Komponenten und DMSO in Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung. Weitere geeignete Komponenten, die für eine Verwendung in Frostschutzmittellösungen in Frage kommen, umfassen Zucker, mehrwertige Alkohole, wie z. B. Glycerin, Zuckeralkohole, Aminosäuren und Polymere, wie z.B.

Polyethylenglykol.

Geht man von B. thuringlensis-Sporen aus, so werden diese zunächst in einem geeigneten Medium inokuliert und über Nacht bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise von 25⁰C bis 28⁰C, und ausreichender Belüftung inkubiert. Dieser Ansatz wird anschließend verdünnt und in der oben beschriebenen Weise weiterbehandelt.

Zur Induktion der Sporulation bei B.thurlngiensls können alle Medien verwendet werden, die eine solche Sporulation hervorrufen. Bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist ein GYS-Medium nach Yousten, A.A., und Rogoff, M.H./23/, (1969).

Der Sauerstoffeintrag in das Kultivierungsmedium erfolgt in der Regel durch Bewegen der Kulturen, z. B. auf einer Schüttelmaschine, wobei Umdrehungsgeschwindigkeiten zwischen 50Upm und 300Upm bevorzugt sind.

Die Kultivierung von B. thuringionsis-Sporen sowie vegetativer Mikroorganismenzellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung erfolgt nach bekannten, allgemein gebräuchlichen Methoden, wobei aus Gründen der Praktikabilität vorzugsweise flüssige Nährmedien verwendet werden.

Die Zusammensetzung der Nährmedien kann je nach verwendetem B. thuringiensls- bzw. B. cereus-Stamm leicht variieren.

Allgemein werden komplexe Medien mit wenig definierten, leicht assimilierbaren Kohlenstoff- (C-) und Stickstoff- (N-) Quellen bevorzugt, wie sie üblicherweise für die Kultivierung aerober Bacillus-Arten eingesetzt werden.

Zusätzlich werden Vitamine und essentielle Metallionen benötigt, die aber in der Regel in den verwendeten komplexen Nährmedien in ausreichender Konzentration als Bestandteile bzw. Verunreinigungen enthalten sind.

Gegebenenfalls können besagte Bestandteile wie z. B. essentielle Vitamine sowie Na⁺-, K⁺-, Cu²⁺-, Ca²⁺-, Mg²⁺-, Fe³⁺-, NH₄ ⁰-, PO₄ ³"-, SO₄ ²"-, Cl"-, CO₃ ²"-lonen und die Spurenelemente Cobalt und Mangan, Zink u. a. in Form ihrer Salze zugesetzt werden.

Als besonders geeignete Stickstoffquellen sind neben Hefe-Extrakten, Hefe-Hydrolysaten, Hefe-Autolysaten sowie Hefe-Zellen vor allem Sojamehl, Maismehl, Hafermehl, Edamin (enzymatisch verdautes Lactalbumin), Pepton, Caseinhydrolysat, Maisablaugen sowie Fleischextrakte zu nennen, ohne daß der Erfindungsgegenstand durch diese beispielhafte Aufzählung in irgendeinerWeise eingeschränkt werden soll.

Die bevorzugte Konzentration für die genannten N-Quellen liegt zwischen 1,0g/l und 20g/l.

Als C-Quellen kommen in erster Linie Glucose, Lactose, Sucrose, Dextrose, Maltose, Stärke, Cerelose, Cellulose sowie Malzextrakt in Frage. Der bevorzugte Konzentrationsbereich liegt zwischen 1,0g/l und 20g/l.

Neben komplexen Nährmedien können selbstverständlich auch halb- oder vollsynthetische Medien verwendet werden, die die oben näher bezeichneten Nährstoffe in geeigneter Konzentration enthalten.

Außer dem im Rahmen der vorliegenden Erfindungen bevorzugt verwendeten LB-Medium können auch alle anderen, für die Kultivierung von B.thurlnglensls und/oder B.cereus geeigneten Kulturmedien verwendet werden, wie z. B. Antibiotic Medium 3, SCGY-Madium u.a. Die Aufbewahrung sporulierter B.thurlnglensls-Kulturen erfolgt bevorzugterweise auf GYS-Medien (Schrägagar) bei einer Temperatur von 4°C.

Nachdem die Zellkultur die gewünschte Zelldichte erreicht hat, werden die Zellen mit Hüte einer Zentrifugation geerntet und in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die zuvor vorzugsweise mit Eis gekühlt wird.

Die Temperatur erwies sich im Laufe der Untersuchungen als nicht kritisch und ist daher in einem weiten Bereich frei wählbar. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von 0°C bis 35⁰C, vorzugsweise von 2°C bis 15°C und ganz besonders bevorzugt von 4⁰C. Die Inkubationsdauer der Baclllus-Zellen vor und nach der Elektroporation hat nur geringen Einfluß auf die erreichbare Transformationsfrequenz (siehe Tabelle 1). Einzig eine überlange Inkubation führt zu einer Abnahme der Transformationshäufigkeit. Bevorzugt ist eine Inkubationszeit von 0,1 bis 30 Minuten, insbesondere von 10 Minuten. Die Temperatur erwies sich Im Laufe der Untersuchungen als nicht kritisch und ist daher in einem weiten Bereich frei wählbar. Bevorzugt ist ein Temperaturbereich von O⁰C bis 35⁰C, vorzugsweise von 2⁰C bis 15⁰C und ganz besonders bevorzugt von 4⁰C, Dieser Vorgang kann einmal bis mehrmals wiederholt werden. Besonders geeignete Pufferlösungen im Rahmen dieser Erfindung sind osmotisch stabilisierte Phosphatpuffei, die als stabilisierendes Agens Zucker, wie z. B. Glucose oder Saccharose, oder Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit, enthalten und auf pH-Werte von 5,0 bis 8,0 eingestellt sind. Ganz besonders bevorzugt sind Phosphatpuffer vom PBS-Typ mit einem pH-Wert von 5,0 bis 8,0, vorzugsweise von pH 5,5 bis 6,5, die Saccharose als stabilisierendes Agens in einer Konzentration von 0,1 M bis 1,0M, vorzugsweise aber von 0,3 M bis 0,5 M, enthalten (siehe Abbildungen 3 und 4). '

Aliquots dor suspendierten Bacillus-Zellen werden anschließend in Kü vetten oder beliebige andere, geeignete Gefäße überführt und mit einer DNA-Probe für einen geeigneten Zeitraum, vorzugsweise für einen Zeitraum von 0,1 bis 30 Minuten, insbesondere aber von 5 bis 15 Minuten, und bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise bei einer Temperatur von 0⁰C bis 35⁰C, insbesondere aber bei einer Temperatur von 2°C bis 15⁰C und ganz besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 4⁰C, gemeinsam inkubiert.

Beim Arbeiten mit tiefen Temperaturen ist es vorteilhaft, bereits vorgekühlte Küvetten oder beliebige andere, geeignete und vorgekühlte Gefäße zu verwenden.

Zwischen der Anzahl transformierter Zellen und der bei der Elektroporation verwendeten DNA-Konzentration besteht über einen weiten Bereich ein linearer Zusammenhang, wobei die Anzahl transformierter Zellen mit steigender DNA-Konzentration zunimmt (siehe Abbildung 5). Die im Rahmen dieser Erfindung bevorzugte DNA-Konzentration liegt in einem Bereich zwischen 1 ng

und 20pg. Besonders bevorzugt ist eine DNA-Kcnzentration von 10ng bis 2pg.

Danach wird der gesamte Ansatz enthaltend B.thuringlensls- und/oder B.cereus-Zellen sowie Plasmid-DNA oder eine andere geeignete DNA-Probe in eine Elektroporationsapparatur und einer Elektroporation unterzogen, d. h. kurzzeitig einem elektrischen Impuls ausgesetzt.

Elektroporationsapparaturen, die für eine Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, werden mittlerweile bereits von verschiedenen Herstellern angeboten, wie z. B. der Fa. Bio Rad (Richmond, CA, USA; „Gene Pulser Apparatus'¹), Biotechnologies and Experimental Research, Inc. (San Diego, CA, USA; „BTXTransfector 100"), Promiga (Madison, Wl, USA; „X-Cell 2000 Electroporation System"), usw.

Selbstverständlich kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren auch jedes beliebige andere geeignete Gerät verwendet werden.

Es können dabei verschiedene Impulsformen verwendet werden, so z. B. Rechteckimpulse oder aber exponentiell abklingende Impulse.

Letztere sind im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt. Sie kommen durch die Entladung eines Kondensators zustande und sind charakterisiert durch einen zunächst sehr raschen Anstieg der Spannung sowie durch eine sich anschließende exponentiell Abklingphase als Funktion aus Widerstand und Kapazitanz. Die Zeitkonstante RC gibt ein Maß für die Länge der exponentiellen Abklingzeit. Sie entspricht derjenigen Zeit, die benötigt wird, um die Spannung auf 37% der Ausgangsspannung (V₀) abklingen zu lassen.

Ein für die Beeinflussung der Bakterien-Zelle entscheidender Parameter betrifft die Stärke des elektrischen Feldes, mit dem die Zellen beaufschlagt werden und das sich aus dem Verhältnis von angelegter Spannung und dem Abstand der Elektrodenplatten berechnet.

Ebenfalls von großer Bedeutung ist in diesem Zusammenhang die exponentiell Abklingzeit, die sowohl von der Konfiguration der verwendeten Apparatur (z. B. der Kapazität des Kondensators) als auch von anderen Para netern abhängt, wie z. B. der Zusammenhang der Pufferlösung oder den eingesetzten Volumina der für die Elektroporation vorgesehenen Zellsuspension. So hat es sich beispielsweise im Verlaufe der Untersuchungen gezeigt, daß eine Reduktion des Volumens der für die Elektroporation vorgesehenen Zellsuspension um die Häifte zu einer Erhöhung der Transformationsfrequenz um den Faktor 10 führt.

Eine Verlängerung der exponentiellen Abklingzeit über eine Optimierung der verwendeten Pufferlösung resultiert ebenfalls in einer deutlichen Erhöhung der Transformationsfrequenz.

Alle Maßnahmen, die zu einer Verlängerung der exponentiellen Abklingzeit und in der Folge zu einer Erhöhung der Transformationsfrequenz führen, sind daher im Rahmen dieser Erfindung bevorzugt.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Abklingzeit liegt zwischen etwa 2 ms und etwa 50 ms, insbesondere aber zwischen etwa 8ms und etwa 20 ms. Ganz besonders bevorzugt ist eine exponentiell Abklingzeit von etwa 10ms bis etwa 12ms.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Bakterienzellen durch kurzzeitige Entladung(en) eines Kondensators über die DNA-haltige Zellsuspension kurzfristig mit sehr hohen elektrischen Feldstärken beaufschlagt, wodurch die Permeabilität der B. thuringiensis-Zellen kurzfristig und reversibel erhöht wird. Die Elektroporationsparameter werden im Verlaufe des erfindungsgemäßen Verfahrens in einer Weise aufeinander abgestimmt, daß eine optimale Aufnahme der im Elektrpporationspuffer befindlichen DNA in die Baclllus-Zellen gewährleistet ist.

Die Kapazitätseinstellung am Kondensator beträgt im Rahmen dieser Erfindung vorteilhafterweise 1 pF bis 250μΡ, insbesondere aber 1 pF bis 5OpF und ganz besonders bevorzugt 25pF. Die Wahl der Ausgangsspannung ist in weiten Bereichen unkritisch und daher frei wählbar. Bevorzugt ist eine Ausgangsspannung V₀ von 0,2 kV bis 5OkV, insbesondere aber von 0,2kV bis 2,5kV und

ganz besonders bevorzugt von 1,2 kV bis 1,8 kV. Der Abstand der Elektrodenplatten hängt u.a. ab von der Dimensionierung der Elektroporationsapparatur. Er beträgt vorteilhafterweise zwischen 0,1 cm und 1,0cm, vorzugsweise zwischen 0,2cm und 1,0cm. Besonders bevorzugt ist ein Plattenabstand von 0,4cm. Aus dem Abs' <ind der Elektrodenplatton und der am Kondensator eingestellten Ausgangsspannung ergeben sich die Feldstärkewerte, dit, auf die Zellsuspension einwirken. Diese liogen vorteilhaftorweiso in einem Bereich zwischen 100V/cm und 50000V/cm. Besonders bevorzugt sind Feldstärken von 100V/cm bis 10000 V/cm, insbesondere aber von 3000V/cm bis 4500V/cm.

Die Feinabstimmung der frei wählbaren Parameter, wie z. B. Kapazität, Ausgangsspannung, Plattenabstand usw. hängt bis zu einem gewissen Grad von der Architektur der verwendeten Geräte ab und kann daher von Fall zu Fall in bestimmten Grenzen variieren. Die angegebenen Grenzwerte können daher in gewissen Fällen auch über- oder unterschritten werden, sofern dies zum Erreichen optimaler Feldstärkewerte erforderlich sein sollte.

Der eigentliche Elektroporationsvorgang kann einmal bis mehrmals wiederholt werden, bis eine für das jeweilige System optimale Transformationsfrequenz erreicht ist.

Im Anschluß an die Elektropcrntion kann vorteilhafterweise eine Nachinkubation der behandelten Baclllus-Zellon durchgeführt werden, vorzugsweise für einen Zeitraum von 0,1 bis 30 Minuten, bei einer Temperatur von O⁰C bis 35⁰C, vorzugsweise von 2°C bis 15⁰C. Anschließend warden die elektroporierten Zeil m mit einem geeigneten Medium verdünnt und nochmals für einen geeigneten Zeitraum, vorzugsweise von 2 bis 3 Stunden, unter ausreichender Belüftung und bei einer geeigneten Temperatur, vorzugsweise von 20°C bis 35⁰C, inkubien.

Anschließend werden die B.thurlnglensls-Zellen auf Festmedien ausplattiert, die ein für die Selektion der neu in die Bakterienzelle eingeführten DNA-Sequenzen geeignetes Agens als Zusatz enthalten. Je nach Art der verwendeten DNA kann es sich bei besagten Agenzien z. B. um antibiotisch wirksame Verbindungen, um Farbstoffe u.a. handeln. Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung für die Selektion von Bacillus thuringlensls- und/oder B.ceroue-Zellen sind Antibiotika, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol und Erythromycin.

Ebenfalls bevorzugt sind chromogene Substrate, wie z. B. X-gal (ö-Brom^-chlor-S-indolyl-ß-D-galaktosid), die anhand einer spezifischen Farbreaktion nachgewiesen werden können.

Andere phänotypische Marker sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

Es können dabei beliebige, für die Kultivierung von B.thurlnglensls-Zellen geeignete Nährmedien verwendet werden, denen eines der üblicherweise verwendeten Verfestigungsmedien, wie z. B. Ag;, r, Agarose, Gelatine u.a. zugesetzt wird. Die zuvor im einzelnen für B. thuringlensls beschriebenen Verfahrensparameter sind in gleicher Weise auch auf B.cereus-Zellen anwendbar.

Das zuvor beschriebene erfindungsgemäße Verfahren zur Transformation von B.thuringiensis bzw. B.cereus bleibt nicht, wie die bisher im Stand der Technik zur Verfugung stehenden Verfahren, auf die Verwendung von bestimmten natürlicherweise in B.thuringiensis und/oder B.cereus vorkommenden Plasmiden beschränkt, sondern ist für alle Arten von DNA anwendbar. Somit ist es nunmehr erstmals möglich, B.thungiensis und/oder B.cereus gezielt zu transformieren, wobei neben homologer, d. h. natürlicherweise in B.thuringiensis oder dem nahe verwandten B.cereus vorkommender Plasmid-DNA, auch Plasmid-DNA heterologen Ursprungs verwendet werden kann.

Dabei kann es sich sowohl um Plasmid-DNA handeln, die natürlicherweise in einem anderen Organismus als B.thuringiensis oder dem nahe verwandten B. cereus vorkommt, wie beispielsweise die Plasmide pUB110 und pC194 aus Staphylococcus aureus (Horinouchi, S., und Weisblum, B./24/, 1982; Polak, J., und Novick, R.P./⁰ V, 1982) sowie das Plasmid plMI3 aus B.subtillsfMahler, J. und Halvorson,H.O./26/, 1980), die in der Lage sind, in B.thuringiensis und/oder B.cereuszu replizieren, als auch um hybride Plasmid-DNA, die mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie aus homologer Plasmid-DNA oder aus heterologer Plasmid-DNA oder aber aus einer Kombination von homologer und heterologer Plasmid-DNA konstruiert wird. Letztgenannte hybride Plasmid-DNA ist besser geeignet für die Arbeiten mit rekombinanter DNA als die natürliche Isolate. Beispielshaft seien hier die Plasmide pBD64 (/27/ Gryczan Tet al, 1980), pBD347, pBD348 sowie pUB1664 genannt, ohne dadurch jedoch den Gegenstand vorliegender Anmeldung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Von besonderer Bedeutung für die Durchführung von Klonierungsexperimenten bei verschiedenen B.thuringiensis- bzw. B.cereus-Stämmen dürften die für B.subtllis bereits etablierten Klonierungsvektoren, wie beispielsweise pBD64, sein. Neben Plasmid-DNA kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch jede beliebige andere DNA in B.thuringiensis bzw. B.cereus transformiert werden. Die transforn ,erte DNA kann dabei entweder autonom oder integriert im Chromosom replizieren. Dabei kann es sich beispielsweise um eine Vektor-DNA handeln, die sich nicht von einem Plasmid, sondern von einem Phagen ableitet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Konstruktion von bifunktionellen Vektoren („shuttle"-Vektoren).

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist die Konstruktion und Verwendung von bifunktionellen (hybriden) Plasmid-Vektoren, sogenannten „shuttle"-Vektoren, die in der Lage sind, außer in B.thuringiensis oder dem nahe verwandten B. cereus in einem oder aber in mehreren heteroloegen Wirtsorganismen zu replizieren und die sowohl in homologen als auch in heterologen Wirtssystnmen identifizierbar sind.

Als heterologe Wirtsorganismen sind im Rahmen dieser Erfindung alle diejenigen Organismen zu verstehen, die nicht in die Gruppe B.thuringiensis/B. cereus gehören und die in der Lage sind, eine sich selbst replizierende DNA stabil zu erhalten. Als heterologe Wirtsorganismen können gemäß obiger Definition somit sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Organismen fungieren. Beispielhaft seien an dieser Stelle als Vertreter aus der Gruppe der prokaryontischen Wirtsorganismen einzelne Vertreter aus den Gattungen Bacillus, wie z. B. B.subtllis oder B.megaterium, Staphylococcus, wie z. B. S.aureus, Streptococcus, wie z. B. Streptococcus faecalis, Streptomyces, wie z. B. Stroptomyces spp., Pseudomonas, wie z. B. A.tumefaciensoderA.rhlzogenes, Salomonella.Erwinia, usw. genannt. Aus der Gruppe der eukaryontischen Wirte sind in erster Linie Hefen sowie tierische und pflanzliche Zellen zu nennen. Diese beispielhafte Aufzählung ist nicht abschließend und soll den Gegenstand der vorliegenden Erfindung in keiner Weise limitieren. Dem Fachmann sind weitere geeignete Vertreter aus der Gruppe der prokaryontischen und eukaryontischen Wirtsorganismen bekannt.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind B.subtilis oder B. megaterium, Pseudomonas spp. und insbesondere E.coli aus der Gruppe der prokaryontischen Wirte sowie Hefen und tierische oder pflanzliche Zellen aus der Gruppe der eukaryontischen Wirte.

Ganz besonders bevorzugt sind bifunktionelle Vektoren, die in der Lage sind, sowohl in B.thuringlensls· und/odnr B.cereus-Zeller. als auch in E,coil zu replizieren.

Ebenso umfaßt von der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung besagter bifunktioneller Vektoren zur Transformation von B.thuringlensls und B.cereus.

Die Konstruktion von „shuttle"-Vektoren erfolgt mit Hilfe der rekombinanten DNA-Technologie, wobei Plasmid- und/oder Vektor-DNA homologen (B.thuringlensls, B. cereus) sowie heterologen Ursprungs zunächst mit Hilfe von geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten werden und anschließend diejenigen DNA-Fragmente, welche die für die Replikation in dem jeweiligen gewünschten Wirtssystem essentiellen Funktionen enthalten, in Gegenwart geeigneter Enzyme wieder miteinander verknüpft werden.

Als Quelle für Plasmid· und/oder Vektor-DNA heterologen Ursprungs können die zuvor genannten heterologen Wirtsorganismen dienen.

Die Verknüpfung der verschiedenen DNA-Fragmente muß in einer Weise erfolgen, daß die für die Replikation in den verschiedenen Wirtssystemen essentiellen Funktionen erhalten bleiben.

Daneben kann selbstverständlich auch Plasmid- und/oder Vektor-DNA rein heterologen Ursprungs für die Konstruktion von „shuttle'-Vektoren verwendet werden, wobei aber zumindest einer der heterologen Fusionspartner DNA-Abschnitte enthalten muß, die eine Replikation im homologen B.thurlnglensis-/B. cereus Wirtssystem ermöglichen.

Als Quelle von Plasmid- und/oder Vektor-DNA heterologen Ursprungs, die dennoch in der Lage ist. im B.thuringlensls-/ B.cereus-Wirtssystem zu replizieren, seien an dieser Stelle beispielhaft einige Vertreter aus der Gruppe eier gram-positiven Bakterien genannt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Staphylococcus, wie z. B. Staphylococcus aureus, Streptococcus, wie z. B. Streptococcus faecaüs, Bacillus, wie z. B. Bacillus megaterium oder B. subtilis, Streptomyces, wie z. B.

Streptomyces spp. usw. Noben den hier beispielhaft aufgezählten Vertretern aus der Gruppe der gram-positiven Bakterien gibt es eine ganze Reihe weiterer Organismen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können und die dem Fachmann bekannt sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung bifunktionellei Vektoren, die für dieTransformation von B.thurlngiensis und/oder B. cereusgeeignet sind, das sich dadurch kennzeichnet, daß man Plasmid-DNA homologen sowie heterologen Ursprungs zunächst

a) mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme in Fragmente zerlegt und

b) anschließend diejenigen Fragmente, welche die für die Replikation sowie die Selektionierung indem jeweiligen gewünschten Wirtssystem essentiellen Funktionen enthalten, in Gegenwart geeigneter Enzyme wieder miteinander verknüpft und zwar in einer Weise, daß die für die Replikation und Selektion in den verschiedenen Wirtssystemen essentiellen Funktionen erhalten bleiben.

Auf diese Weise entstehen bifunktionelle Plasmide, die neben den für eine Replikation in B. thuringeinsis oder B. cereus notwendigen Funktionen weitere DNA-Sequenzen enthalten, die die Replikation in zumindest einem we iteren heterologen Wirtssystem sicherstellen.

Um eine schnelle und effiziente Selektionierung der bifunktionellen Vektoren sowohl in homologen als auch im (in) heterologen Wirtssystem(en) zu gewährleisten, ist es vorteilhaft, besagte Vektoren mit spezifischen Selektionsmarkern zu versehen, die sowohl in B.thuringlensls und/oder B. cereus als auch in dem(n) heterologen Wirtssystem(en) brauchbar sind, d. h. eine schnelle und unkomplizierte Selektionierung ermöglichen. Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist die Verwendung Antibiotikaresistenzen kodierender DNA-Sequenzen, insbesondere von DNA-Sequenzen, die für Resistenzen gegenüber Antibiotika ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kanamycin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Erythromycin u.a. kodieren.

Ebenfalls bevorzugt sind Gene, die Enzyme mit einem chromogenen Substrat, wie z. B. X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid), kodieren. Die transformierten Kolonien können dann sehr einfach anhand einer spezifischen Farbreaktion nachgewiesen werden.

Andere phänotypische Markergene sind dem Fachmann bekannt und können ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist die Konstruktion von . shuttle"-Vektoren, die neben DNA-Sequenznn, die eine Replikation in B.thurlngiensis oder B. cereus oder in beiden Wirtssystemen erlauben, auch solche DNA-Abschnitte enthalten, die für eine Replikation in weiteren bakteriellen Wirtssystemen, wie beispielsweise in B. subtilis, B. megaterium, Pseudomonasspp., E.coli usw. notv/endig sind.

Ebenfalls bevorzugt sind „shuttle"-Vektoren, die einerseits sowohl in B.thuringiensis oder B.cereus oder in beiden replizieren, als auch andererseits in eukaryontischen Wirtssystemen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hefe, tierischen und pflanzlichen Zellen u.a.

Ganz besonders bevorzugt ist die Konstruktion von „shuttle"-Vektoren die neben DNA-Sequenzen, die für die Replikation besagter Vektoren in B.thuringlensls oder B. cereus oder in beiden Systemen notwendig sind, auch solche DNA-Sequenzen enthalten, die eine Replikation besagter „shuttle"-Vektoren in E.coU ermöglichen.

Beispiele solcher Ausgangsplasmide für die Konstruktion von „shuttle"-Vektoren fürdas B.thuringiensis-S.cerei s/E.coli-System, die aber in keiner Weise als limitierend angesehen werden dürfen, sind das B.cereus-Klasmid pBCM 6 sowie das vom E.coll-Plasmid pBR322 abgeleitete Plasmid pUC8 (Vieira, J., und Messing, J./28/, 1982).

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft bifunktionelle („shuttle"-) Vektoren, die neben den für die Replikation und Selektion in homologen und heterologen Wirtssystemen essentiellen Funktionen zusätzlich noch ein oder mehrere Gene in exprimierbarer Form oder sonstige nützliche DNA-Sequenzen enthalten. Ebenfalls umfaßt von dieser Erfindung sind Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß man besagte Gene oder sonstigen nützlichen DNA-Sequenzen mit Hilfe geeigneter Enzyme in diese bifunktionellen Vektoren einspleißt.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen „shuttle"-Vektoren sowie des zuvor beschriebenen Transformationsverfahrens ist es somit jetzt erstmals möglich, außerhalb von B. thuringiensls-Zellen, in einem fremden Wirtssystem klonierte DNA-Sequenzen mit hoher Effizienz in B.thuringiensis- und/oder B. cereus-Zellen zu transformieren.

Γ/amit können jetzt erstmals Gene oder sonstige nützliche DNA- Sequenzen, insbesondere auch solche mit regulatorischer Funktion, stabil in B.thuringiensis- bzw. B. cereus-Zellen eingebracht und dort gegebenenfalls exprimiert werden, wodurch B.thuringiensis- bzw. B. cereus-Zellen mit neuen und wünschenswerten Eigenschaften entstehen.

Als Gene, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können, kommen sowohl homologe als auch

heterologe Gen(e) oder DNA sowie synthetische Gen(e) oder DNA gemäß der im Rahmen der vorliegenden Erfindung gemachten Definition in Betracht sowie Kombinationen besagter DNA's.

Die kodierende DNA-Sequenz kann dabei ausschließlich aus genomischer, aus cDNA bzw. synthetischer DNA konstruiert sein. Eine andere Möglichkeit besteht in der Konstruktion einer hybriden DNA-Sequenz, bestehend sowohl aus cDNA als auch aus genomischer DNA und synthetischer DNA oder aber aus einer Kombination dieser DNA's.

In diesem Fall kann die cDNA aus demselben Gen stammen wie die genomische DNA odur aber sowohl die cDNA wie auch die genomische DNA können aus verschiedenen Genen stammen. In diesem Fall können aber sowohl die genomischen DNA und/oder die cDNA, jede für sich, aus dem gleichen oder aus verschiedenen Genen hergestellt sein. Wenn die DNA-Sequenz Anteile von mehr als einem Gen beinhaltet, können diese Gene entweder von ein und demselben Organismus, von mehreren Organismen, die verschiedenen Stämmen oder aber von Organismen, die mehr als einer Gattung derselben oder einer anderen taxonomischen Einheit angehören, abstammen.

Um die Expression besagter Strukturgene in der bakteriellen Zelle zu gewährleisten, müssen die kodierenden Gensequenzen zunächst in operabler Weise mit in B.thuringiensls· und/oc!er B.cereus-Zellen funktionsfähigen Expressions-Sequenzen verknüpft werden.

Die hybriden Genkonstruktionen im Rahmer: der vorliegenden Erfindung enthalten somit neben dem (den) Strukturgen(en) Expressions-Signale, die sowohl Promotor- und Terminator-Sequenzen als auch weitere regulatorische Sequenzen der 3'- und ö'-nichttranslatierten Regionen miteinschließen.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind die natürlichen Expressionssignale aus B.thuringiensls und/oder B, cereus selbst sowie Mutanten und Varianten davon, die im wesentlichen der natürlichen Sequenz homolog sind. Im Rahmen dieser Erfindung ist eine DNA-Sequenz einer zweiten DNA-Sequenz dann im wesentlichen homolog, wenn wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80%, insbesondere aber wenigstens 90%, der aktiven Abschnitte der DNA-Sequenz homolog sind. Gemäß vorliegender Definition des Begriffs „im wesentlichen homolog" werden zwei unterschiedliche Nukleotide in einer DNA-Sequenz einer kodierenden Region dann als homolog angesehen, wenn der Austausch des einen Nukleotids gegen das andere eine stille Mutation darstellt.

Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von sporulationsabhängigen Promotoren aus B.thuringiensls, die eine Expression in Abhängigkeit der Spekulation gewährleisten.

Besonders bevorzugt für die Transformation von B.thuringiensls bzw. B. cereus im Rahmen dieser Erfindung ist die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für ein δ-Endotoxin kodieren.

Die kodierende Region des erfindungsgemäßen Chimären Gens enthält vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches natürlicherweise in B.thuringiensls vorkommt, oder aber ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist, d. h., das zumindest im wesentlichen die Toxizitätseigenschaften eines kristallinen δ-Endotoxin-Proteins von B. thuringlensis aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat ein Polypeptid definitionsgemäß dann im wesentlichen die Toxizitätseigenschaften des kristallinen δ-Endotoxin-Proteins von B.thuringiensls, wenn es gegen ein ähnliches von Insekten-Larven insektizid wirkt wie Jas kristalline Protein einer Unterart von B. thuringiensis. Einige geeignete Unterarten sind beispielsweise solche, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kurstaki, berliner, alesti, tolworthi, sotto, dendrolimus, tenebrlonis und israelensis. Die für Lepidoptera-Larven bevorzugte Unterart ist kurstaki und insbesondere kurstaki HDI. Bei der kodierenden Region kann es sich um eine Region handeln, die natürlicherweise in B.thuringiensls vorkommt. Alternativ dazu kann die kodierende Region gegebenenfalls aber auch eine Sequenz enthalten, die sich von der Sequenz in B. thuringiensis unterscheidet, die ihr aber aufgrund der Degenerierung des genetischen Kodes äquivalent ist.

Die kodierende Region des Chimären Gens kann auch ein Polypeptid kodieren, das sich von einem natürlich vorkommenden kristallinen δ-Endotoxin-Protein unterscheidet, das aber immer noch im wesentlichen die Insektentoxizitätseigenschaften des kristallinen Proteins hat. Solch eine kodierende Sequenz wird gewöhnlicherweise eine Variante einer natürlichen kodierenden Region sein. Unter einer „Variante" einer natürlichen DNA-Sequenz ist im Rahmen dieser Erfindung definitionsgemäß eine modifizierte Form einer natürlichen Sequenz zu verstehen, die aber noch dieselbe Funktion erfüllt. Die Variante kann eine Mutante oder eine synthetische DNA-Sequenz sein und ist im wesentlichen der entsprechenden natürlichen Sequenz homolog. Im Rahmen dieser Erfindung ist eine DNA-Sequenz einer zweiten DNA-Sequenz dann im wesentlichen homolog, wenn wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80%, insbesondere aber wenigstens 90% der aktiven Abschnitte der DNA-Sequenz homolog sind. Gemäß vorliegender Definition des Begriffs „im wesentlichen homolog" werden zwei unterschiedliche Nukleotide in einer DNA-Sequenz einer kodierenden Region dann als homolog angesehen, wenn der Austausch des einen Nukleotids gegen das andere eine stille Mut ition darstellt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann somit jedes, eine Aminosäuresequenz kodierende, Chimäre Gen verwendet werden, das die Insektiziden Eigenschaften eines B.thuringionsls-Ö-Endotoxins aufweist und welches die offenbarten und beanspruchten Erfordernisse erfüllt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung einer Nukleotidsequenz, die im wesentlichen wenigstens dem Teil oder den Teilen der natürlichen Sequenz homolog ist, die für die insektizide Aktivität und/oder die Wirtsspezifität des B.thuringiensis-Toxins verantwortlich ist (sind).

Das durch das chimäre Gen exprimierte Polypeptid hat in der Regel auch wenigstens immunologische Eigenschaften mit einem natürlichen kristallinen Protein gemeinsam, weil es wenigstens zum Teil die gleichen antigenen Determinanton besitzt. Dementsprechend ist das Polypeptid, das von besagtem Chimären Gen kodiert wird, vorzugsweise strukturell mit dem δ-Endotoxin des von B. thuringiensis produzierten kristallinen Proteins verwandt. B. thuringiensis produziert ein kristallines Protein mit einer Untereinheit, die einem Protoxin mit einem Molekulargewicht (MG) von etwa 130000 bis 140000 entspricht. Diese Untereinheit kann durch Proteasen oder durch Alkali in insektizide Fragmente mit einem MG von 70000 und möglicherweise sogar weniger gespalten werden.

Für die Konstruktion chimärer Gene, deren kodierender Abschnitt solche Fragmente des Protoxins oder noch kleinere Teile davon umfaßt, kann die Fragmentierung der kodierer,den Region solange fortschreiten, wie dio Fragmente oder Teile dieser Fragmente noch die erforderliche insektizide Aktivität aufweisen. Das Protoxin, insektizide Fragmente des Protoxins und insektizide Teile dieser Fragmente können mit anderen Molekülen, wie Polypeptiden und Proteinen, verbunden werden. Kodierende Regionen, die für eine Verwendung im Rahmen des erfindungsgumäßen Verfahrens geeignet sind, können von Genen aus B. thuringiensis, die das kristalline Toxingsn kodieren, erhalten werden (Whiteley et al, PCT Anmeldung WO 86/01536 und US Patente 4448885 und 4467036). Eine bevorzugte Nukleotidsequenz, die ein kristallines Protein kodiert, befindet sich zwischen den Nukleotiden 153 und 3623 in Formel I oder ist eine kürzere Sequenz, die ein Insektizides Fragment solch eines kristallinen Proteins kodiert (Geiser et al./5/, 1986, und EP 238,441).

Formel I

10 20 30 40 50 60 GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT AGTAAAATTA GTTGCACTTT GTGCATTTTT

70 80 90 100 110 120 TCATAAGATG AGTCATATGT TTTAAATTGT AGTAATGAAA AACAGTATTA TATCATAATG

130 IAO 150 160 170 180 AATTGGTATC TTAATAAAAG AGATGGAGGT AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG

190 200 210 220 230 240 AATGCATTCC TTATAATTGT TTAAGTAACC CTGAAGTAGA AGTATTAGGT GGAGAAAGM

250 260 270 280 290 300 TAGAAACTGG TTACACCCCA ATCGATATTT CCTTGTCGCT¹AACGCAATTT CTTTTGAGTG

310 320 330 340 350 360 AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG

370 380 390 400 410 420 GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG

430 440 450 460 470 480 AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA

490 500 510 520 530 540 TTTACGCAGA ATCTTTTAGA GAGTGGGAAG CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG

550 560 570 580 590 600 AGATGCGTAT TCAATTCAAT GACATGAACA GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG

610 620 630 640 650 660 CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT CAGTATATGT TCAAGCTGCA AATTTACATT

670 680 690 700 710 720 TATCAGTTTT GAGAGATGTT TCAGTGTTTG GACAAAGGTG GGGATTTGAT GCCGCGACTA

730 740 750 760 770 780 TCAATAGTCG TVATAATGAT TTAACTAGGC TTATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC

790 800 810 820 830 840 GCTGGTACAA TACGGGATTA GAGCGTGTAT GGGGACCGGA TTCTAGAGAT IGGATAAGAT

850 860 870 880 890 900 ATAATCAATT TAGAAGAGM TTAACACTAA CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA

910 920 930 940 950 960 ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAGTTTCCCA ATTAACAAGA GAAATTTATA

970 980 990 1000 1010 1020 CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA GTTTTCGAGG CTCGGCTCAG GGCATAGAAG

1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG

1090 1100 1110 1120 1130 1140

CTCATAGAGG AGAATATTAT TGGTCAGGGC ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGGTTTT

1150 1160 1170 1180 1190 1200

CGGGGCCAGA ATTCACTTTT CCGCTATATG GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC

1210 1220 1230 1240 1250 1260

GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT ATAGAACATT ATCGTCCACT TTATATAG/υΛ

1270 1280 1290 1300 1310 1320

GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC AACTATCTGT TCTTGACGGG ACAGAATTTG

1330 1340 1350 1360 1370 1380

CTTATGGAAC CTCCTCAAAT TTGCCATCCG CTGTATACAG AAAAAGCGGA ACGGTAGATT

1390 1400 1410 1420 1430 1440

CGCTGGATGA AATACCGCCA CAGAATAACA ACGTGCCACC TAGGCAAGGA TTTAGTCATC

1450 1460 1470 1480 1490 1500

GATTAAGCCA TGTTTCAATG TTTCGTTCAG GCTTTAGTAA TAGTAGTGTA AGTATAATAA

1510 1520 1530 1540 1550 1560

GAGCTCCTAT GTTCTCTTGG ATACATCGTA GTGCTGAATT TAATAATATA ATTCCTTCAT

1370 1580 1590 1600 1610 1620

CACAAATTAC ACAAATACCT TTAACAAAAT CTACTAATCT TGGCTCTGGA ACTTCTGTCG

1630 1640 1650 1660 1670 1680

TTAAAGGACC AGGATTTACA GGAGGAGATA TTCTTCGAAG AACTTCACCT GGCCAGATTT

1690 1700 1710 1720 1730 1740

CAACCTTAAG AGTAAATATT ACTGCACCAT TATCACAAAG ATATCGGGTA AGAATTCGCT

1750 1760 1770 1780 1790 1800

ACGCTTCTAC CACAAATTTA CAATTCCATA CATCAATTGA CGGAAGACCT ATTAATCAGG

1810 1820 1830 1840 1850 1860

GGAATTTTTC AGCAACTATG AGTAGTGGGA GTAATTTACA GTCCGGAAGC TTTAGGACTG

1870 1880 1S90 1900 1910 1920

TAGGTTTTAC TACTCCGTTT AACTTTTCAA ATGGATCAAG TGTATTTACG TTAAGTGCTC

1930 1940 1950 1960 1970 1980

ATGTCTTCAA TTCAGGCAAT GAAGTTTATA TAGATCGAAT TGAATTTGTT CCGGCAGAAG

1990 2000 2010 2020 2030 2040

TAACCTTTGA GGCAGAATAT GATTTAGAAA GAGCACAAAA GGCGGTGAAT GAGCTGTTTA

2050 2060 2070 2080 2090 2100

CTTCTTCCAA TCAAATCGGG TTAAAAACAG ATGTGACGGA TTATCATATT GATCAAGTAT

2110 2120 2130 2140 2150 2160

CCAATTTAGT TGAGTGTTTA TCTGATGAAT TTTGTCTGC-A TGAAAAAAAA GAATTGTCCG

2170 2180 2190 2200 2210 2220 AGAAAGTCAA ACATGCGAAG CGACTTAGTG ATGAGCGGAA TTTACTTCAA GATCCAAACT

2230 2240 2250 2260 2270 22ÜO TTAGAGGGAT CAATAGACAA CTAGACCGTG GCTGGAGAGG AAGTACGGAT ATTACCATCC

2290 2300 2310 2320 2330 2340 AAGGAGGCGA TGACGTATTC AAAGAGAATT ACGTTACGCT ATTGGGTACC TTTGATGAGT

2350 2360 2370 2380 2390 2400 GCTATCCAAC GTATTfATAT CAAAAAATAG ATGAGTCGAA ATTAAAAGCC TATACCCGTT

2410 2420 2430 2440 2450 2460 ACCAATTAAG AGGGTATATC GAAGATAGTC AAGACTTAGA AATCTATTTA ATTCuCTACA

2470 2480 2490 2500 2510 2520 ATGCCAAACA CGAAACAGTA AATGTGCCAG GTACGGGTTCCTTATGGCCG CTTTCAGCCC

2530 2540 2550 2560 2570 2580 CAAGTCCAAT CGGAAAATGT GCCCATCATT CCCATCATTT CTCCTTGGAC ATTGATGTTG

2590 2600 2610 2620 2630 2640 GATGTACAGA CTTAAATGAG GACTTAGGTG TATGGGTGAT ATTCAAGATT AAGACGCAAG

2650 2660 2670 2680 2690 2700 ATGGCCATGC AAGACTAGGA AATCTAGAAT TTCTCGAAGA GAAACCATTa GTAGGAGAAG

2710 2720 2730 2740 2750 2760 CACTAGCTCG TGTGAAAAGA GCGGAGAAAA AATGGAGAGA CAAACGTGAA AAATTGGAAT

2770 2780 2790 2800 2810 2820 GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA AAGAATCTGT AGATGCTTTA TTTGTAAACT

28SO 2840 2850 2860 2870 2880 CTCAATATGA TAGATTACAA GCGGATACCA ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC

2890 2900 2910 2920 2930 2940 GCGTTCATAG CATTCGAGAA GCTTATCTGC CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG

2950 2960 2970 2980 2990 3000 CGGCTATTTT TGMGAATTA GAAGGGCGTA TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA

3010 3020 3030 3040 3050 3060 GAAATGTCAT TAAAAATGGT GATTTTAATA ATGGCTTATC CTGCTGGAAC GTGAAAGGGC

3070 3080 3090 3100 3110 3120 ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACAACCACC GTTCGGTCCT TGTTGTTCCG GAATGGGAAG

3130 3140 3150 3160 3170 3180 CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC CGGGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG

3190 3200 3210 3220 3230 .3240 CGTACAAGGA GGGATATGGA GAAGGTTGCG TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG

3250 3260 3270 3280 3290 3300 ACGAACTGAA GTTTAGCAAC TGTGTAGAAG AGGAAGTAiA TCCAAACAAC ACGGTAACGT

3310 3320 3330 3340 3350 3360 GTAVTGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT ATGAGGGTAC GTACACTTCT CGTaATCGAG

3370 3380 3390 3A00 3410 3420 GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTGTACCAGC TGATTATGCA TCAGCCTATG

3430 3440 3450 3460 3470 3480 AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG ACAATCC7TG TGAATCTAAC AGAGGATATG

3490 3500 3510 3520 3530 3540 GGGATTACAC ACCACTACCA GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA

3550 3560 3570 3580 3590 3600 CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAaC ATTCATCG7G GACAGCGTGG

3610 3620 3630 3640₍ 3650 3660 AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT'aAGGTGTGCA .-UTAAAGAAT

3670 3680 3690 3700 3710 3720 GATTACTGAC TTGTATTGAC AGATAAATAA GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACGGGCA

3730 3740 3750 3760 3/70 3780 TCACTCTTAA MGAATGATG TCCCTTTTiT GTATGATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT

3790 3800 3810 3820 3830 3840 TTTTTTGCGA AGGCTTTACT TAACGGGGTA CCGCCACATG CCCATCAACT TAAGAATTTG

3850 3860 3870 3880 3890 3900 CACTACCCCC AAGTGTCAAA AAACGTTATT CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGGATGAC

3910 3920 3930 3940 3950 3960 ATTTTTTATG AATCTTTCAA TTCAAGATGA ATTACAACTA TTTTCTGAAG AGCTGTATCG

3970 3980 3990 4000 4010 4020 TCATTTAAC CCTTCTCTTT TGGAAGAACT CGCTAAAGAA TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA

4030 4040 4050 4060 4070 4080 ACGAAAGTTT TCAGGAAATG AATTAGCTAC CATATuTATC TGGGGCAGTC AACGTACAuC

4090 4100 4110 4120 4130 4140 GAGTGATTCT CTCGTTCGAC TATGCAGTCA ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT

4150 4160 4170 4180 4190 4200 CCAGAAGGAC TCAATAAACG CTTTGATAAA AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT

4210 4220 4230 4240 4250 4260 TCTGCATTAT GGAAAAGTAA ACTTTGTAAA ACATCAGCCA TTTCAAGTGC AGCAC ~ACG

4270 4280 4290 4300 4310 4320 TATTTTCAAC GAATCCGTAT TTTAGATGCG ACGATTTTCC AAGTACCGAA ACATTTAGCA

4330 4340 4350 4360 CATGTATATC CTGGGTCAGG TGGTTGTGCA CAAACTGCAG

Die durch die Nukleotide 156 b's 3623 von Formel I definierte kodierende Region kodiert ein Poiypeptid dör Formel

Formel Il

Met Asp Asn Asn Pro Asn He Asn GIu Cys 10

He Pro Tyr Asn Cys Leu Ser Asn Pro GIu 20

VaI GIu VaI Leu GIy GIy GIu Arg He GIu 30

Thr GIy Tyr Thr Pro He Asp He Ser Leu AO

Ser Leu Thr Gin Phe Leu Leu Ser GIu Phe 50

VaI Pro GIy Ala GIy Phe VaI Leu GIy Leu 60

VaI Asp He He Trp GIy He Phe GIy Pro 70

Ser GIn Trp Asp Ala Phe Leu VaI Gin lie ₍ 80

GIu GIn Leu He Asn GIn Arg He GIu GIu 90

Phe AIa Arg Asn Gin Ala He Ser Arg Leu 100

GIu GIy Leu Ser Asn Leu Tyr Gin He Tyr 110

Ala GIu Ser Phe Arg GIu Trp GIu Ala Asp 120

Pro Thr Asn Pro AIa Leu Arg GIu GIu Met 130

Arg He GIn Phe Asn Asp Met Asn Ser AIa 140

Leu Thr Thr Ala He Pro Leu Phe Ala VaI 150

GIn Asn Tyr Gin VaI Pro Leu Lau Ser VaI 160

Tyr VaI Gin Ala AIa Asn Leu His Leu Ser 170

VaI Leu Arg Asp VaI Ser VaI Phe GIy GIn 180

Arg Trp GIy Phe Asp Ala Ala Thr He Asn 190

Ser Arg Tyr Asn Asp Leu Thr Arg Leu He 200

GIy Asn Tyr Thr Asp His Ala VaI Arg Trp 210

Tyr Asn Thr GIy Leu GIu Arg VaI Trp GIy 220

Pro Asp S'jr Arg Asp Tip He Arg Tyr Asn 230

GIn Phe Arg Arg GIu Leu Thr Leu Thr VaI 240

Leu Αερ He VaI Ser Leu Phe Pro Asn Tyr 250

Asp Ser Arg Thr Tyr Pro Hg Arg Thr VaI 260

Ser GIn Leu Thr Arg GIu He Tyr Thr Asn 270

Pro VaI Leu GIu Asn Phe Asp GIy Ser Phe 280

Arg GIy Ser Ala Gin GIy He GIu GIy Ser 290

He Arg Ser Pro His Leu Met Asp He Leu 300

Asn Ser Arg Gly He Met Pro GIu Met GIy VaI Ala Thr Leu Phe Asn Ser VaI GIy Thr Tyr Arg Asp GIu Pro Pro Ser His Ser Asn Pro Met GIu Phe He Thr Asn Leu GIy Pro Arg Arg Leu Arr, Gin Arg Ser Thr He Asp Phe Ser Leu Gin Phe Thr Ser Sec Phe Asn Arg He Phe GIu Gin Lys Ser Asn Thr Asp Leu VaI Leu Asp

He Thr GIu Tyr Ala Ser Phe Thr Asn Ala Gin Leu Ser Ser He GIy Leu Asp Ser Ser Lys Ser He Pro Arg Gin VaI Ser Ser Ser Phe Ser Asn Asn Gin He GIy Ser GIy Phe Thr Ser VaI Asn Tyr Arg Thr Asn GIy Arg AIa Thr Ser Gly Thr Pro VaI Phe Ser Gly GIu Phe Ala GIu Ala VaI Gin He Tyr His GIu Cys GIu Lys

He Tyr Thr Tyr Trp Ser Pro VaI Gly Phe Pro Leu Ala Pro GIn Gly Gin GIy Thr Leu Tyr He Asn Asn Gly Thr GIu Asn Leu Pro Gly Thr VaI Pro Gin Asn Gly Phe Ser Met Phe Arg VaI Ser He Trp He His He He Pro Pro Leu Thr Gly Thr Ser Thr Gly Gly Pro Gly GIn He Thr AIa VaI Arg He Leu GIn Phe Pro He Asn Met Ser Ser Ser Phe Arg Phe Asn Phe Thr Leu Ser Asn GIu VaI VaI Pro AIa Tyr Asp Leu Asn GIu Leu Gly Leu Lys He Asp Gin Leu Ser Asp Lys GIu Leu

Asp Ala His Gly His Gin Phe Ser Gly Tyr Gly Thr Gin Arg He VaI Tyr Arg Arg Arg Pro Gin Gin Leu Phe Ala Tyr Ser Ala VaI Asp Ser Leu Asn Asn VaI His Arg Leu Ser Gly Phe He Arg AIa Arg Ser AIa Ser Ser GIn Lys Ser Thr VaI VaI Lys Asp He Leu He Ser Thr Pro Leu Ser Arg Tyr AIa His Thr Ser GIn Gly Asn Gly Ser Asn Thr VaI Gly Ser Asn Gly Ala His VaI Tyr He Asp GIu VaI Thr GIu Arg AIa Phe Thr Ser Thr Asp VaI Va.l Ser Asn GIu Phe Cys Ser GIu Lys

310 320 330 3A0 350 360 370 380 390 AOO AlO 420 A 30 AAO A 50 A60 A70 A80 A90 500 510 520 530 5AO 550 560 570 580 590 600 610 620 630 6A0 650 660 670

VaI Lys His Ala Lys Arg Leu Ser Asp GIu 680

Arg Asn Leu Leu Gin Asp Pro Asn Phe Arg 690

GIy He Asn Arg GIn Leu Asp Arg GIy Trp 700

Arg GIy Ser Thr Asp He Thr He Gin GIy 710

GIy Asp Asp VaI Phe Lys GIu Asn Tyr VaI 720

Thr Leu Leu GIy Thr Phe Asp GIu Cys Tyr 730

Pro Thr Tyr Leu Tyr Gin Lys He Asp GIu 740

Ser Lys Leu Lys AIa Tyr Thr Arg Tyr GIn 750

Leu Arg GIy Tyr He GIu Asp Ser Gin Asp 760

Leu GIu He Tyr Leu He Arg Tyr Asn AIa 770

Lys His GIu Thr VaI Asn VaI Pro GIy Thr 780

GIy Ser Leu Trp Pro Leu Ser AIa Pro Ser ' 790

Pro He GIy Lys Cys Ala His His Ser His 800

His Phe Ser Leu Asp He Asp VaI GIy Cys 810

Thr Asp Leu Asn GIu Asp Leu GIy VaI Trp 820

VaI He Phe Lys He Lys Thr Gin Asp GIy 830

His Ala Arg Leu GIy Asn Leu GIu Phe Leu 840

GIu GIu Lys Pro Leu VaI GIy GIu AIa Leu 850

AIa Arg VaI Lys Arg Ala GIu Lys Lys Trp 860

Arg Asp Lys Arg GIu Lys Leu GIu Trp GIu 870

Thr Asn He VaI Tyr Lys GIu AIa Lys GIu 880

Ser VaI Asp Ala Leu Phe VaI Asn Ser GIn 890

Tyr Asp Arg Leu Gin Ala Asp Thr Asn He 900

AIa Met He His Ala Ala Asp Lys Arg Val 910

His Ser He Arg GIu Ala Tyr Leu Pro GIu 920

Leu Ser VaI He Pro GIy VaI Asn Ala Ala 930

He Phe GIu GIu Leu GIu GIy Arg He Phe 940

Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Asp Ala Arg Asn 950

VaI He Lys Asn GIy Asp Phe Asn Asn GIy 960

Leu Ser Cys Trp Asn VaI Lys GIy His VaI 970

Asp VaI GIu GIu Gin Asn Asn His Arg Ser 980

VaI Leu VaI VaI Pro GIu Trp GIu Ala GIu 990

VaI Ser Gin GIu VaI Arg VaI Cys Pro GIy 1000

Arg GIy Tyr He Leu Arg VaI Thr Ala Tyr '.

Lys GIu GIy Tyr GIy GIu GIy Cys VaI Thr 1020

He His GIu He GIu Asn Asn Thr Asp GIu 1030

Leu Lys Phe Ser Asn Cys VaI GIu GIu GIu 1040

VaI Tyr Pro Asn .\sn Thr VaI Thr Cys Asn 1050

Asp Tyr Thr Ala Thr Gin GIu GIu Tyr GIu 1060

GIy Thr Tyr Thr Ser Arg Asn Arg GIy Tyr 1070

Asp GIy Ala Tyr GIu Ser Asn Scr Ser VaI 1080

Pro Ala Asp Tyr Ala Ser Ala Tyr GIu GIu 1090

Lys Ala Tyr Thr Asp GIy Arg Arg Asp Asn 1100

Pro Cys GIu Ser Asn Arg GIy Tyr GIy Asp 1110

Tyr Thr Pro Leu Pro Ala GIy Tyr VaI Thr 1120

Lys GIu Leu GIu Tyr Phe Pro GIu Thr Asp 1130

Lys VaI Trp He GIu He GIy GIu Thr GIu HAO

GIy Thr Phe He VaI Asp Ser VaI GIu Leu 1150

Leu Leu Met GIu GIu End 1156

Um ein chimäres Gen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in B.thurlnglensls- bzw. B.cereus-Zellen zu transformieren, wird das Ge . vorzugsweise zuerst in einen Vektor eingebaut. Besonders bevorzugt ist der Einbau in die erfindungsgemäßen bifunktionellen Vektoren.

Wenn das entsprechende Gen nicht in einer Menge zur Verfugung steht, die für die Einschleusung in die Baclllus-Zellen ausreicht, kann der Vektor zunächst durch Replikation in einer heterologen Wirtszelle amplitiziert werden. Am besten geeignot für die Amplifikation von Genen sind Bakterien- oder Hefezellen. Wenn eine ausreichende Menge des Gens zur Verfügung steht, wird es in die Bacillus-Zellen eingeschleust. Die Einführung des Gens in B. thurlngiensls- oder B.cereus-Zellen kann mit dem gleichen Vektor erfolgen. Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen bifunktionellen Vektoren.

Einige Beispiele für bakterielle Wirtszellen, die für eine Replikation des Chimären üens geeignet sind, umfassen Bakterien, ausgewählt aus den Gattungen Escherlchla, wie E.coil, Agrobacterium, wie A. rhlzogenes, Pseudomonas, wie Pseudomonas spp„ Bacillus, wie B. magneterium oder B. subtills, usw. Durch das erfindungsgemäße Transformationsverfahren wird es jetzt im Rahmen dieser Erfindung erstmals möglich, auch B.thurlnglensls bzw. B.cereus selbst als Wirtszellen einzusetzen. Verfahren der Klonierung heterologer Gene in Bakterien sind in den US Patenten 4,237,224 und 4,468,464 beschrieben.

Die Replikation von Genen in E.coil, die das kristalline Protein von B.thuringlensls kodieren, wird von Wong et al./29/ (1983) beschrieben.

Einige Beispiele für Hefewirtszellen, die sich zur Replikation der erfrdungsgemäßen Gene eignen, schließen solche, ausgewählt aus der Gattung Saccharomyces, ein (Europäische Patentanmeldung EP 0238441).

Für die Amplifikation der erfindungsgemäßen Gene kann jeder beliebige Vektor verwendet werden, in den das chimäre Gen eingebaut werden kann und der sich in einer geeigneten Wirtszelle, wie in Bakterien oder Hefe, repliziert. Der Vektor kann beispielsweise von einem Phagen oder einem Plasmid abgeleitet sein. Beispiele für Vektoren, die von Phagen abgeleitet und im Rahmen dieser Erfindung verwendet werden können, sind Vektoren die von M13- und von λ-Phagen abgeleitet sind. Einige geeignete Vektoren, die von M 13-Phagen abgeleitet sind, schließen M 13mp18 und M 13mp19 ein. Einige von λ-Phagen abgeleitete geeignete Vektoren schließen Xgt11, \gt7 und X-Charon4 ein.

Von den Vektoren, die von Plasmiden abgeleitet und ganz besonders für die Replikation in Bakterien geeignet sind, seien hier beispielhaft pBR 322 (Bolivar et al./30/, 1977), pUC18 und pUC 19 (Norrander et al./31/, 1983) sowie Ti-Plasmide(Bevan et al./32/,

1983) genannt, ohne dadurch jedoch den Erfindungsgegenstand in irgendeiner Weise zu limitieren. Die bevorzugten Vektoren zur Amplifikation von Genen in Bakterien sind pBR322, pUC18und pUC19.

Für eine Klonierung direkt in B.thuringiensls und/oder B.cereus sind in erster Linie Direktklonierungsvektoren zu nennen, wie z.B. pBD347, pBD348, pBD64 sowie pUB 1664, sowie insbesondere „shuttle"-Vektoren, die zuvor bereits im Detail beschrieben wurden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung sind die bifunktionellen („shuttle") Vektoren pXI61 (= pK61) und pXI93 (= pK93), die, transformiert in B.thuringiensls var. kurstaki HD 1 cryB bzw. B. cereus 569K, bei der als Internationale Hinterk gungsstelle anerkannten „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen" (Braunschweig, BRD) gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages unter der Nummer DSM 4 573 (DSM 4 572, transformiert in B.thuringlensis var.

kurstaki HD1 cryB)bzw. DSM4571 (pXI93, transformiert in B.thuringiensls var. kurstaki HD 1 cryB)undDSM4573(pXI93, transformiert in B. cereus 569 K) hinterlegt worden sind.

Um ein für die Replikation in Bakterien geeignetes chimäres Gen zu konstruieren, werden eine Promotorsequenz, eine 5'-nichttranslatierte Sequenz, eine kodierende Sequenz und eine 3'-nichttranslatierte Sequenz in einen Vektor eingefügt oder in der richtigen Reihenfolge in einem der zuvor beschriebenen Vektoren zusammengebaut. Geeignete Vektoren sind erfindungsgemäß solche, die in der Lage sind, sich in der Wirtszelle zu replizieren.

Der Promotor, die 5'-nichttranslatierte Region, die kodierende Region und die 3'-nichttranslatierte Region, können gegebenenfalls zuerst außerhalb des Vektors in einer Einheit zusammengefaßt und dann in den Vektor eingefügt werden.

Alternativ dazu können aber auch Teile des Chimären Gens einzeln in den Vektor eingefügt werden.

Im Falle der B.thuringiensis- bzw. B.cereus -Klonierungsvektoren kann dieser Verfahrensschritt entfallen, da die gesamte aus B.thuringlensis isolierte Einheit, bestehend aus einer 5'-m'chttranslatierten Region, der kodierenden Region und einer 3'-nichttranslatierten Region, in den Vektor eingespleißt werden kann.

IL ti

Der Vektor enthält ciarüberhinaus vorzugsweise auch ein Markorgen, welches der Wirtszello eine Eigenschaft verleiht, durch die man die mit dem Vektor transformierten Zellen erkennen kann. Bevorzugt sind Markergene, die eine Antibiotikaresistenz kodieren. Einige Beispiele für geeignete Antibiotika sind Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetrazyklin, H/gromycin, G418 und Kanamycin.

Ebenfalls bevorzugt sind Markergene, die Enzyme mit einem chromogenen Substrat, wie z. B. X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid), kodieren. Die transformierten Kolonien können dann sehr einfach anhand einer spezifischen Farbreaktion nachgewiesen werden.

Die Einfügung oder der Zusammenbau des Gens im Vektor wird mit Hilfe von Standardverfahren durchgeführt, beispielsweise die Verwendung von rekombinanter DNA (Maniatis et al./33/, 1982) und die Anwendung der homologen Rekombination (Hinnen etal./34/, 1978).

Die Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie beruhen darauf, daß der Vektor zunächst geschnitten und die gewünschte DNA-Sequenz zwischen die geschnittenen Stücke des Vektors eingefügt wird; die Enden der gewünschten DNA-Sequenz werden anschließend mit den entsprechenden Enden des Vektors verknüpft.

Der Vektor wird vorzugsweise mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnitten. Einige Restriktionsendonukleasen sind beispielsweise solche, die glatte Enden bilden, wie Sma I, Hpa I und EcoR V, sowie solche, die kohäsive Enden bilden, wie EcoR I, Sacl undBamHI.

Die gewünschte DNA-Sequenz existiert normalerweise als Teil eines größeren DNA-Moleküls, wie eines Chromosoms, eines Plasmids, eines Transposons oder eines Phagen. Die gewünschte DNA-Sequenz wird in diesen Fällen aus ihrer ursprünglichen Quelle herausgeschnitten und gegebenenfalls so modifiziert, daß ihre Enden mit denen des geschnittenen Vektors verbunden werden können. Wenn die Enden der gewünschten DNA-Sequenz und des geschnittenen Vektors glatte Enden sind, können sie beispielsweise mit für glatte Enden spezifischen Ligasen, wie der T4 DNA-Ligase; miteinander verbunden werden.

Die Enden der gewünschten DNA-Sequenz können auch in der Form von kohäsiven Enden mit den Enden des geschnittenen Vektors verbunden werden, in welchem Fall eine für kohäsive Enden spezifische Ligase, die auch T4 DNA-Ligase sein kann, benutzt wird. Eine andere geeignete, für kohäsive Enden spezifische Ligase ist beispielsweise die E.coli-DNA-Ligase.

Kohäsive Enden werden zweckmäßigerweise gebildet, indem die gewünschte DNA-Sequenz und der Vektor mit der gleichen Restriliionsendonuklease geschnitten werden. In diesem Fall haben die gewünschte DNA-Sequenz und der geschnittene Vektor kohäsive Enden, die einander komplementär sind.

Die kohäsiven Enden können auch konstruiert werden, indem miv Hilfe derterminalen Desoxynukleotidyl-Transferase komplementäre, homopolymere Schwänze an die Enden der gewünschten DNA-Sequenz und des geschnittenen Vektors angehängt werden. Alternativ können auch kohäsive Enden hergestellt werden, indem eine synthetische Oligonukleotid-Sequenz, die von einer bestimmten Restriktionsendonuklease erkannt wird und die unter der Bezeichnung Linker bekannt ist, angehängt und die Sequenz mit der Endonuklease gespalten wird (siehe beispielsweise Maniatis et al./33/, 1982).

Damit ist es nunmehr im Rahmen dieser Erfindung erstmals möglich B.thurlngiensis-Gene, insbesondere aber δ-Endotoxinkodierende DNA-Sequenzen, außerhalb von B.thurlnglensls genetisch zu modifizieren, zu klonieren und anschließend in B.thuringlensis- und/oder B.cereus-Zellen zurückzuführen, wo besagte δ-Endtoxingene (in einem homologen bakteriellen Wirtssystem) exprimiert werden können.

Dies bedeutet, daß nunmehr auch das Genom von B.thuringiensis gezielt genetisch manipuliert werden kann, indem zunächst große Mengen an Plasmid-Material in einem fremden Klonierungssystem gewonnen werden und dieses anschließend in B.thuringiensis transformiert wird.

Von besonderem Interesse ist dabei die Möglichkeit zur Modifikation der δ-Endotoxingene sowie der die Expression dieser Gene regulierenden Kontrollsequenzen.

Neben Chimären Genen kann selbstverständlich auch jede beliebige andere chimäre genetische Konstruktion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in Bacillus thuringlensls- und/oder Bacillus cereua-Zellen eingeschleust werden.

So ist es beispielsweise denkbar unter Anwendung des erfindungsgemäßsn Verfahrens nichtkodierende, „antisense"-DNA in das Genom einer Bacillusthuringlensls- und/oder Bacillus cereus-Zelle einzuschleusen, so daß im Zuge der Expression besagter „antisense"-DNAeinemRNAtranskribiert wird, welche die Expression der korrespondierenden „sense"-DNA hemmt. Auf diese Weise ist es möglich, die Expression bestimmter, unerwünschter Gene in Bacillus thuringiensis und/oder Bacillus cereus gezielt zu unterdrücken.

Darüber hinaus ist nunmehr auch die Möglichkeit gegeben, neben der Bereitstellung verbesserter, gut definierter B.thurlngiensis-Stämme zur Herstellung von verbesserten Bioinsektiziden, B.thuringiensis als generellen Wirt für die Klonierung und gegebenenfalls Expression heterologer und/oder homologer Gene zu verwenden.

In einer spezifischen und bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es darüber hinaus nunmehr erstmals möglich, neue Gene, insbesondere aber neue Protoxingene direkt im natürlichen Wirt, d.h. in B.thuringiensis oder B.cereus zu klonieren.

Bei der Suche nach neuen Protoxingenen wird zunächst eine Genbibliothek von B.thuringiensis erstellt.

In einem ersten Verfahrensschritt wird dabei die Gesamt-DNA eines Protoxin-produzierenden B.thuringiensis· Stammes mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensmaßnahmen isoliert und anschließend in einzelne Fragmente zerlegt. Die B.thurlngiensis-DNA kann dabei entweder mechanisch, beispielsweise unter Einwirkung von Scherkräften, oder aber vorzugsweise durch Verdauung mit geeigneten Restriktionsenzymen fragmentiert werden. Je nach Wahl der Enzyme erhält man eine partielle oder eine vollständige Verdauung der DNA-Probe. Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist die Verwendung von Restriktionsenzymen, die quartäre Erkennungssteilen enthalten und/oder zu einer partiellen Verdauung der B.thuringlensis-DNA führen, wie z. B. das Restriktionsenzym SaulllA, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Selbstverständlich können auch alle anderen geeigneten Restriktionsenzyme in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Die auf die zuvor beschriebene Weise gewonnenen Restriktionsfragmente werden dann mit Hilfe an sich bekannter Verfahren entsprechend ihrer Größe aufgetrennt. Für die größenabhängige Auftrennung von DNA-Fragmenten verwendet man in der Regel Zentrifugationsverfahren, wie z. B. die Saccharosegradientenzentrifugation oder elektrophoretisch^ Verfahren, wie die Agarose Gelektrophorese oder aber eine Kombination dieser Verfahren.

Diejenigen Fraktionen, welche Fragmente der richtigen Größe enthalten, d. h. Fragmente, die aufgrund ihrer Größe in der Lage sind, ein Protoxin zu kodieren, werden vereinigt (gepoolt) und für die weiteren Verfahrensschritte verwendet.

Zunächst werden die zuvor isolierten Fragmente durch Verwendung von Standardverfahren in geeignete Klonierungsvektoren

eingespleißt und anschließend mit Hilfe des erfindungsgemäßen Transformationsverfahrens direkt in Bacillus thuringlensis oder B. cereus, vorzugsweise aber in pro oxinfreie Stämme von Bacillus thurlnglonsls eingeschleust. Als Vektoren können sowohl gram-positive Plosmide, wie z. B. pBC 16, pUB 110, pC 194, als auch die zuvor im einzelnen beschriebenen „Shuttle"-Vektoren verwendet werden. Besonders bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist der Shuttle-Vektor pXI 200, der im folgenden im Detail beschrieben ist (siehe Beispiel 9.1.). Geeignete Vektoren enthalten vorzugsweise DNA-Sequenzen, die eine leichte Identifizierbarkeit der transformierten, vektorhaltigen Klone aus der Unzahl nichttransformierter Klone gewährleistet. Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen, dio einen spezifischen Marker kodieren, der bei Expression zu einem leicht selektionierbaren Merkmal führt, wie z. B. einer Antibiotika-Resistenz. Beispielhaft sei hier eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Tetracyclin, Hygromycin, G 418 oder Kanamycin genannt. Ebenfalls bevorzugt sind Markergene, die Enzyme mit einem chromogenen Substrat, wie z. B. X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galaktosid), kodieren. Die transformierten Kolonien können dann sehr einfach anhand einer spezifischen Farbreaktion nachgewiesen werden.

Nr ι der Elektroporation werden die behandelten Bacillus thuringlensis- oder B.cereus-Zellen auf eine selektives Sporulationsmedium übertragen und dort bis zu vollständigen Sporulation bei einer Temperatur von 10°C bis 40⁰C, vorzugsweise aber bei einer Temperatur von 2O⁰C bis 35⁰C und ganz besonders bevorzugt bei einer Temperatur von 29⁰C bis 31⁰C inkubiert. Das Sporulationsmedium enthält als Selektivsubstanz vorzugsweise eine der obengenannten Antibiotika, abhängig vom verwendeten Vektor, sowie ein geeignetes Verfestigungsmittel, wie z. B. Agar, Agarose, Gelatine, usw. Im Zuge der Sporulation kommt es zur Autolyse der spekulierenden Zellen, was für das nachfolgende Screening von großem verfahrenstechnischem Vorteil ist, da ein künstliches Aufbrechen der Zellen entfällt. Bei Klonen, die das gesuchte Protoxingen enthalten und unter der Kontrolle ihres natürlichen Promotors exprimieren, liegen die gebildeten Kristallproteine frei zugänglich im Medium vor. Diese frei irn Medium vorliegenden Kristallproteine können dann z.B. mit Hilfe von Membranfiltern oder durch andere geeignete Maßnahmen fixiert werden. Geeignete Membranfilter sind beispielsweise Nylon- oder Nitrozellulose-Membranen. Membranen dieser Art sind frei käuflich.

Die so fixierten Kristallproteine können dann sehr einfach im Rahmen eines geeigneten Screenings aufgespürt und identifiziert werden.

Bevorzugt im Rahmen dieser Erfindung ist ein immunologisches Screening unter Verwendung protoxinspezifischer Antikörper. Die Verfahren des Immunscreenings sind bekannt und beispielsweise bei /35/Young et al,, 1983 im einzelnen beschrieben. Besonders bevorzugt im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verwendung monoklonaler Antikörper, die ganz spezifisch einen bestimmten Teil des Proteinmoleküls erkennen. Diese Antikörper können entweder einzeln oder aber in Form eines Gemisches verwendet werden. Darüber hinaus können selbstverständlich auch polygonale Antiseren für das Immunscreening verwendet werden. Auch Gemische basierend auf monoklonalen und polyklonalen Antikörpern sind denkbar.

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Bacillus thuringlensis-Protoxin-Proteine sind bekannt und z. B. bei /36/Huber-Lukafi, (1984) bzw. bei /37/Huber-Lukacetal., (1986) im Detail beschrieben. Diese Verfahren lassen sich auch im vorliegenden Fall anwenden.

Das immunologische Screening-Verfahren auf der Basis von Antikörpern ist ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung. Darüber hinaus können im Rahmen dieser Erfindung selbstverständlich auch andere geeignete Screeningverfahren zum Aufspüren neuer DNA-Sequenzen in B.thuringiensls und/oder B.cereus verwendet werden.

Bacillus thuringiensis und B. cereus-Zellen, die mit Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens transformiert worden sind, sowie die von diesen transformierten Bacillus-Zellen produzierten Toxine eignen sich in hervorragender Weise für die Bekämpfung von Insekten, insbesondere aber zur Bekämpfung von Insekten aus den Ordnungen Lepidoptera, Diptera und Coleoptra. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Bekämpfung von Insekten, das sich dadurch kennzeichnet, daß man Insekten oder deren Lebensraum mit

a) B.thuringiensis- oder B.cereus-Zellen oder mit einem Gemisch von beiden behandelt, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das ein Strukturgen enthält, welches für ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuringlensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist; oder aber b) mit zellfreien Kristallkörperpräparaten, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus-Zellen produziert wird.

Ebenso umfaßt von der vorliegenden Erfindung sind insektizide Mittel, die neben den üblicherweise verwendeten Trägermtfteln, Verteilungsmitteln oder Träger- und Verteilungsmitteln

a) B.thuringiensls- oder B.cereus- Zellen oder ein Gemisch besagter Bacillus-Zellen enthalten, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das ein Strukturgen enthält, welches für ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuringiensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesen im wesentlichen homolog ist; oder aber

b) zellfreie Kristallkörperpräparate, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus-Zellen produziert wird.

Für die Anwendung als Insektizide werden die transformierten Mikroorganismen, die das rekombinante B. thuringiensis-Toxin-Gen enthalten, vorzugsweise transformierte lebende odertote B.thuringiensis-oderB.cereus-Zellen, einschließlich Gemischen aus lebenden und toten B. thuringiensis- und B.cereus-Zellen, sowie die von besagten transformierten Zellen produzierten Toxin-Proteine in unveränderter Form oder vorzugsweise zusammen mit den in der Formulierungstechnik üblichen Hiifsstoffen, eingesetzt und in an sich bekannter Weise formuliert, z. B. zu Suspensionskonzentraten, streichbaren Pasten, direkt versprühbaren oder verdünnbaren Lösungen, benetzbaren Pulvern, löslichen Pulvern, Stäubemitteln, Granulaten, und auch Verkapselungen in z.B. polymeren Stoffen.

Die Anwendungsverfahren wie Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen, Bestreichen oder Gießen werden gleich wie die Art der Mittel den angestrebten Zielen und den gegebenen Verhältnissen entsprechend gewählt.

Es können darüber hinaus selbstverständlich auch insektizide Gemische verwendet werden, bestehend aus transformierten, lebenden oder toten B.thuringiensis- und/oder B.cereus-Zellen sowie aus zellfreien Kristallkörperpräparaten, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus- Zellen produziert wird.

Die Formulierungen, d. h. die die transformierten lebenden oder toten Bacillus-Zellen oder Mischungen davon sowie die von besagten transformierten Bacillus-Zellen produzierten Toxin-Proteine und gegebenenfalls feste oder flüssige Hilfsmittel

enthaltenden Mittel oder Zubereitungen werden in bekannter Weise hergestellt, z. B. durch inniges Vermissen der transformierten Zellen und/oder Toxin-Proteine mit festen Trägerstoffen und gegebenenfallsl oberflächenaktiven Verbindungen (Tensiden).

Als feste Trägerstoffe, z. B. für Stäubemittül und dispergierbare Pulver, werden in der Regel natürliche Gesteinsmehle verwendet, wie Calcit, Talkum, Kaolin, Montmorillonit oder Attapulgit. Zur Verbesserung der physikalischen Eigenschaften können auch hochdisperse Kieselsäure oder hochdisperse saugfähige Polymerisate zugesetzt werden. Als gekörnte adsorptive Granulatträger kommen poröse Typen wie z. B. Bimsstein, Ziegelbruch, Sepiolit oder Bentonit, als nichtsorptive Trägermaterialien z. B. Calcit oder Sand in Frage. Darüber hinaus kann eine Vielzahl von vorgranulierten Materialien anorganischer oder organischer Natur, wie insbesondere Dolomit oder zerkleinerte Pflanzenrückstände verwendet werden.

Als oberflächenaktive Verbindungen kommen nichtionogene, kation- und/oder anionaktive Tenside mit guten Dispergier- und Netzeigenschaften in Betracht. Unter Tensiden sind auch Tensidgemische zu versternn.

Geeignete anionische Tenside können sowohl sog. wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische oberflächenaktive Verbindungen sein.

Als Seifen seien die Alkali-, Erdalkali· oder unsubstituierte oder substituierte Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (Cio-Cjj), wie z. B. die No- oder K-Salze der Öl- oder Stearinsäure oder von natürlichen Fettsäuregemischen, die z. B. aus Kokosnuß- oder Talgöl gewonnen werden können, genannt. Ferner sind auch die Fettsäure-methyl-taurinsalze zu erwähnen, wie z. B. das Natriumsalz der cis^-tmethyl-S-octadecenylaminoJ-ethansulfonsäure (Gehalt in Formulierungen vorzugsweise etwa 3%).

Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, insbesondere Fettsulfonato, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylarylsulfonate oder Fett-Alkohole, wie z. B. 2,4, /,9-tetramethyl-5-decin-4,7-diol (Gehalt in Formulierungen, vorzugsweise bei etwa 2%).

Die Fettsulfonate oder -sulfate liegen in der Regel als Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls unsubstituierte Ammoniumsalze vor und weisen einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen auf, wobei Alkyl auch den Alkylteil von Acylresten einschließt, z. B. das Na- oder Ca-SaIz der Ligninsulfonsäure, des Dodecylsulfats oder eines aus natürlichen Fettsäuren hergestellten Fettalkoholsulfatgemisches. Hierher gehören auch die Salze der Schwefelsäureester und Sulfonsäuren von Fettalkohol-Ethylenoxid-Addukten. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise 2 Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit 8-22 C-Atomen. Alkylarylsulfonate sind z. B. die Na-, Ca- oder Triäthanolaminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, der Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfonsäure-Formaldehydkondensationsproduktes.

Ferner kommen auch entsprechende Phosphate, wir z. B. Salze des Phosphorsäureesters eines p-Nonylphenol-(4 bis 14)-ethylenoxid-Adduktes, in Frage.

Als nichticnischeTenside kommen in erster Linie Polyglykoletherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen, gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen in Frage, die 3 bis 30 Glykolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffrest und 6 bis 18 Kohlenstoffatome im Alkylrest der Alkylphenole enthalten können.

Weitere geeignete nichtionische Tenside sind die wasserlöslichen, 20 bis 250 Ethylenglykolethergruppen und 10 bis 100 Propylenglykolethergruppen enthaltenden Polyethylenoxid-Addukte an Polypropylenglykol, Ethylendiaminopolyprcpylenglykol und Alkylpolypropylenglykol mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette. Die genannten Verbindungen enthalten üblicherweise pro Propylenglykoleinheit 1 bis 5 Ethylenglykoleinheiten.

Als Beispiele nicht-ionischer Tenside seien Nonylphenolpolyethoxyethanole, Ricinusölpolyglykolether, Polypropylen/ Polye'.hylenoxid-Addukte, Tr!butylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol und Octylphenoxypolyethoxyethanol erwähnt. Ferner kommen auch Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan wie das Polyoxyethylensorbitan-trioleat in Betracht.

Bei den kationischnn Tensiden handelt es sich vor allem um quartäre Ammoniumsalze, welche als N-Substituenten mindestens einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen enthalten und als weitere Substituenten unsubstituierte oder halogenierte Nieder-Alkyl-, -Benzyl- oder niedrige Hydroxyalkylreste aufweisen. Die Salze liegen vorzugsweise als Halogenide, Methylsulfate oder Ethylsulfate vor, z. B. das Stearyltrimethylammoniumchlorid oder das Benzyldi(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.

Die in der Formulierungstechnik gebräuchlichen Tenside sind u. a. in folgenden Publikationen beschrieben:

/38/1986 International McCutcheon's Emulsifiers 81 Detergents, The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, NJ, USA; Helmut Stäche „Tensid-Taschenbuch" Carl Hanser-Verlag München/Wien 1981. Die agrochemischen Mittel enthalten in der Regel 0,1 bis 99%, insbesondere 0,1 bis 95%, der transformierten, lebenden oder toten Bacillus-Zellen oder Mischungen davon, bzw. der von besagten transformierten Bacilliis-Zellen produzierten Toxin-Proteinen, 99,9 bis 1 %, insbesondere 99,8 bis 5%, eines festen oder flüssigen Zusatzstoffes und 0 bis 25%, insbesondere 0,1 bis 25%, eines Tensides.

Während als Handelsware eher konzentrierte Mittel bevorzugt werden, verwendet der Endverbraucher in der Regel verdünnte Formulierungen.

Solche Mittel können noch weitere Zusätze wie Stabilisatoren, Entschäumer, Viskositätsregulatoren, Bindemittel, Haftmittel sowie Dünger oder andere Wirkstoffe zur Erzielung spezieller Effekte enthalten.

Die transformierten lebenden oder toten Bacillus-Zellen oder Mischungen davon, die die rekombinantsn B.thuringlensis-Toxin-Gene enthalten, sowie die von besagten transformierten Bacillus-Zellen produzierten Toxin-Proteine selbst sind hervorragend für die Bekämpfung von Schadinsekten geeignet. Vorzugsweise sind dabei pflanzenzerstörende Insekten der Ordnung Lepldoptei a zu nennen, insbesondere solche der Gattungen Plerls, Hellothis, Spodoptera und Plutella, wie beispielsweise Pieris brassicae, Heliothis virescens, Hellothis zea, Spodoptera llttoralis und Plutella xylostella.

Weitere Schadinsekten, die mit Hilfe der zuvor beschriebenen Insektiziden Zubereitungen bekämpft werden können, sind beispielsweise Käfer der Ordnung Coleoptera, insbesondere solche der Familie Chrysomelidae, wie z. B. Diabrotica undecimpunctata, D. longicornis, D. virgitera, D. undecimpunctata howardi, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlinoata usw. sowie Insekten der Ordnung Diptera, wie beispielsweise Anopheles sergentii, Uranatenla ungulculata, Culex univittatus, Aedes aegypti, Culex piplens, usw.

Die Aufwandmengen, in denen die Bacillus-Zellen, bzw. die von diesen produzierten Toxin-Proteine eingesetzt werden, hängen von den jeweiligen Bedingungen ab, wie beispielsweise den Witterungsverhältnissen, der Bodenbeschaffenheit, dem Pflanzenwachstum und dem Applikationszeitpunkt.

Formulloruiiflsbelspiele für B.thuringlensls-Toxln enthaltendes Material

Bei den folgenden Formulierungsbeispielen sind unter dem Begriff „Bacillus-Zellen" solche B.thurlnglensls- und/oder B.cereus-Zellen zu verstehen, die ein erfindungsgemäß rekombinantes B.thuringlensis-Gen enthalten. (Bei den Angaben handelt es sich durchgehend um Gewichtsprozente.)

F1. Granulate	a)	b)
Bacillus-Zellen und/oder von
diesen produziertes Toxin-Protein	5%	10Ή
Kaolin	94%	-
Hochdisperse Kieselsäure	1%	-
Attapulgit	-	90°/i

Die Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein werden zunächst in Methylenchlorid suspendiert, anschließend wird die Suspension auf das Trägermaterial aufgesprüht und danach das Suspendierungsagens im Vakuum verdampft.

F 2. Staubemittel	a)	b)
Bacillus-Zellen und/oder von
diesen produziertes Toxin-Protein	2%'	5%
Hochdisperse Kieselsäure	1%	5%
Talkum	97%	-
Kaolin	_	90%

Gebrauchsfertige Stäubemittel erhält man durch inniges Vermischen der Trägerstoffe mit den Bacillus-Zellen und/oder dem von diesan produzierten Toxin-Protein.

F 3. Spritzpulver Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein Natrium-Ligninsulfonat Natrium-Laurylsulfat Natrium-Diisopropylnaphthalinsulfonat Octylphenolpolyethylenglykolether (7-8 Mole Ethylenoxid

Hochdisperse Kieselsäure Kaolin

Die Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein werden sorgfältig mit den Zusatzstoffen vermischt und das erhaltene Gemisch anschließend in einer geeigneten Mühle gut vermählen.

Man erhält Spritzpulver, die sich mit Wasser zu Suspensionen jeder gewünschten Konzentration verdünnen lassen.

a)	b)	C)
25%	50%	75%
5%	5%	-
3%	-	5%
-	6%	10%
_	2%	_
5%	10%	10%
62%	27%	_

F4. Extruder-Granulate Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein Natrium-Ligninsulfonat Carboxymethylcellulose Kaolin

10% 2% 1% 87%

Die Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein werden mit den Hilfsstoffen gemischt, sorgfältig vormahlen und mit Wasser angefeuchtet. Dieses Gemisch wird extrudiert und anschließend in Luftstrom getrocknet.

F5. Umhüllungsgranulat Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein Polyethylenglykol 200 Kaolin

3%3%94%

Die homogen vermischten Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein werden in einem Mischer auf das mit Polyethylenglykol angefeuchtete Kaolin gleichmäßig aufgetragen. Auf diese Weise erhält man staubfreie Umhüllungsgranulate.

F6. Suspensionskonzentrat	40%
Bacillus-ΖοΙΙθπ und/oder von	10%
diesen produziertes Toxin-Protein
Ethylenglykot	6%
Nonylphenolpolyethylenglykol
(15 Mole Ethylenoxid)	3%
Alkylbenzolsulfonsäure-	1%
triethanolaminsalz*
Carboxymethylcellulose	0,1 %
Silikonöl in Form einer 75%igen	39%
wäßrigen Emulsion
Wasser

* Alkyl ist vorzugsweise linear mit 10 bis 14, insbesondere 12-14 Kohlenstoffatomen wie beispielsweise n-Dodecylbenzolsulfonsiluretriethanolaminsalz.

Die homogen vermischten Bacillus-Zellen und/oder von diesen produziertes Toxin-Protein werden mit den Zusatzst offen innig vermischt. Man erhält so ein Suspensionskonzentrat, aus welchem durch Verdünnen mit Wasser Suspensionen jediir gewünschten Konzentration hergestellt werden können.

Ausführungsbeispiele Allgemeine rekomblnante DNA-Techniken

Da viele der in dieser Erfindung genutzten rekombinanten DNA-Techniken Routine für den Fachmann sind, wird im fo'genden eine kurze Beschreibung der allgemein gebräuchlichen Techniken gegeben, so daß au, diese allgemeinen Angaben im conkreten Ausführungsbeispiel verzichtet werden kann. Sofern nicht ausdrücklich darauf hingewiesen wird, sind alle diese Verfal ,ren in der Referenz von /33/Maniatis et al., 1982 beschrieben.

A. Schneiden mit Restriktionsendonukleasen

Typischerweise sind etwa 50Mg/ml bisBOOpg/ml DNA in dem Reaktionsansatz enthalten, in der vom Hersteller, New England Biolabs, Beverly, MA., empfohlenen Pufferlösung. Für jsdespg DNA werden 2 bis 5 Einheiten von Restiiktionsendonukleasen hinzugefügt und der ReaktionsinsMz bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für eine bis drei Stunden inkubiert. Die Reaktion wird durch 10minütir,<P:> Erhitzen auf 65°C orier durch Extraktion mit Phenol, gefolgt durch Präzipitation der DNA mit Ethanol, beendet. Diese Technik wird auch auf den Seiten 104 bis 106 der /33/Maniats et al.-Referenz beschrieben.

B. Behandlung der DNA mit Polymerase, um glatte Enden zu erzeugen

50μg/ml bis 500pg/ml DNA-Fragmente werden zu einem Reaktionsansatz hinzugefügt, in dem vom Hersteller, New England Biolabs, empfohlenen Puffer. Der Reaktionsansatz enthält alle vier Desoxynukleotidtriphosphate in Konzentrationen von 0.2 mM. Nach Zusatz einer geeigneten DNA-Polymerase erfolgt die Reaktion während 30 Minuten bei 15°C und wird dann durch 10minütiges Erhitzen auf 65°C beendet. Für Fragmente, die durch Schneiden mit Restriktionsendonukleasen erhalten werden, welche 5'-überstehende Enden erzeugen, wie EcoRI und BamHI, wird das große Fragment, oder Klenow-Fragment, der DNA-Polymerase verwendet. Für Fragmente, die durch Endonukleasen erhalten werden, wolche 3'-überstehende Enden erzeugen, wie Pst I und Sac I, wird die T4-DNA-Polymerase verwendet. Die Verwendung diejer beiden Enzyme wird auf den Seiten 113 bis 121 der/33/Maniatis et al.-Röferenz beschrieben.

C. Agarose-Gelektrophorese und Reinigung der DNA-Fragmenten von Gelverunreinigungen

Die Agarose-Gelektrophoreso wird in oiner horizontalen Apparatur durchgeführt, wie dies auf den Seiten 150 bis 163 der /33/ Maniatis et al.-Referenz beschrieben ist. Der verwendete Puffer entspricht dem dort beschriebenen Tris-Boat- oder Tris-Acetatpuffer. Die DNA-Fragmente werden durch 0,5pg/ml Ethidiumbromid gefärbt, das entweder im Gel- oder im Tankpuffer während der Elektrophorese vorhanden ist oder aber wahlweise erst nach der Elektrophorese hinzugefügt wird. Die DNA wird durch Beleuchtung mit langwelligem Ultraviolettlicht sichtbar gemacht. Wenn die Fragmente vom Gel abgetrennt werden sollen, wird eine Agarose verwendet, die bei niedriger Temperatur jeliert und von Sigma Chemie »I, St. Louis, Missouri, bezogen werden kann. Nach der Elektrophorese wird das gewünschte Fragment ausgeschnitten, in ein Plastikröhrchen gegeben, etwa 15 Minuten auf 65⁰C erhitzt, dreimal mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol gefällt. Dieses Verfahren ist gegenüber dem von /33/Maniatis et al. auf Seite 170 beschriebenen leicht verändert.

Als Alternative kann die DNA auch aus dem Agarosegel mit Hilfe des „Geneclean Kits" (Bio 101 Inc., La JoIIa, CA, US) isoliert werden.

D. Entfernen von 5'-terminalen Phosphaten von DNA-Fragmenten

Während der Plasmidklonierungsschritte verminde-i eine Behandlung des Vektorplasmids mit Phosphatase die Rezirkularisation des Vektors (diskutiert auf Seite 13 der /33/Maniatis et al.-Referenz). Nach dem Schneiden der DNA mit der richtigen Restriktionsendonukleasc wird eine Einheit alkalische Phosphaiase aus dem Darm von Kälbern hinzugefügt, die von Boehringer-Mannheim, Mannheim, erworben werden kann. Die DNA wird eine Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend zweimal mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefäl't.

E. Verknüpfen der DNA-Fragmente

Wenn Fragmente mit komplementären kohäsiven Enden miteinander verknüpft werden sollen, werden etwa 100ng jedem Fragment in einem Reaktionsgemisch von 20μΙ bis 40μΙ mit etwa 0,2 Einheiten T4 DNA-Ligase von New England Biolabs im vom Hersteller empfohlenen Puffer inkubiert. Die Inkubation wird 1 bis 20 Stunden lang bei 15⁰C durchgeführt. Wenn DNA-Fragmente mit giatven Enden verknüpft werden sollen, werden sie, wie oben beschrieben, inkubiert, wobei aber die Menge der T4 DNA-Ligase in diesem F^-1II auf 2 bis 4 Einheiten erhöht wird.

F. Die Transform, jn von DNA in E.coil

E.coli-Stamm HB101 wird für die meisten Experimente vorwendet. DNA wird mit dem Kalziumchloridverfahren, wie es von /33/Maniatis et al., Seiten 250 bis 251, beschrieben wurde, in E. coli eingeführt.

G. ScreeningvonE.coM auf Plasmide

Nach der Transformation werden die resultierenden Kolonien von E. coli auf das Vorhandensein des gewünschten Plasmids durch ein schnelles Plasmidisolationsverfahren geprüft. Zwei gebräuchliche Verfahren werden auf den Seiten 366 bis 369 der /33/Maniatis jt al.-Referenz beschrieben.

H. Isolierung von Plasmid-DNA in großem Maßstab

Verfahren zur Isolierung von Plasmiden aus E. coli in großem Maßstab werden auf den Seiten 88 bis 94 der /33/Maniatis et

«..-Referenz beschrieben. ι

Medien und Pufferlösungen	(g/l)
LB-Medium	10
Trypton	5
Hefeextrakt	5
NaCI	(g/l)
Antibiotic Medium Nr. 3 (Difco Laboratories)	1,5
Rinder Fleischextrakt	1,5
Hefeextrakt	5
Peptone	1
Glucose	3,5
NaCI	3,68
K2HPO4	1,32
KH2PO4	(g/l)
SCGY-Medium	1
Casaminoacids	0,1
Hefeextrakt	5
Glucose	14
K2HPO4	6
KH2PO4	1
Na3-Citrat	2
(NH4I2SO4	0,2
MgSO4-7H2O	(g/l)
GYS-Medium (/22/Yousten & Rogoff, 1969)	1
Glucose	2
Hefeextrakt	2
(NH4J2SO,	0,5
K2HPO4	0,2
MgSO4-7H2O	0,08
CaCI2 -2H2O	0,05
MnSO4 · H2O
pH vor Autoklavieren auf 7,3 einstellen.	ImM)
PBS-Puffer	400
Saccharose	1
MgCI2	7
Phosphat-Puffer, pH6,0	(mM)
TBST-Puffer	0,05% (w/v)
Tween 20*	10
Tris/HCI»(pH8,0)	150
NaCI

* Tween 20 Polyethoxysorbitanlaurat

• Tris/HCI a^.a-Trislhydroxymethyllmethylaminohydrochlorid

Die im Prioritätsdokument für die Benennung der Plasmide gewählte interne Bezeichnung pK wurde für die Auslandsfassung durch die offiziell anerkannte i3ezeichnung pXI ersetzt.

Auch die Bezeichnung für die im Rahrnon der Ausführungsbeispiele verwendete asporognne B.thuringlonsis-HDt-Mutante wurde von cryß nach cryB geändert.

Beispiel 1: Transformation von B.thurlngiensis mit Hilfe der Elektroporation

Beispiel 1.1: 10ml eines LB-Mediums (Trypton lOg/l, Hefeextrakt 5g/l, NaCI 5g/l) worden mw Sporen von B.thurlnglonsls var. kurstaki HDIcryB (/39/Stahly DP et al., 1978) einer plasmidfreien Variante von B.thuringlensls var. kurstaki HD1, inokuliert. Dieser Ansaü wird über Nacht bei einer Temperatur von 27°C auf einer Rundschüttelmaschine bei 50Upm inkubiert. Danach wird die pg/ml Kultur in 100 ml bis 400 ml LB-Medium 100fach verdünnt und bei einer Temperatur von CO⁰C auf einer Rundschüttelmaschine bei 250 Upm weiter kultiviert, bis eine optischo Dichte (ODc₆₀) von 0,2 erreicht ist. Die Zellen werden mit Hilfe einer Zentrifugation geerntet und in Vw Volumen eines eisgekühlten PBS-Puffers (40OmM Saccharose, 1mM MgCI₂,7 mM Phosphat-P..ffer pH 6,0) suspendiert. Die Zentrifugation und anschließende Suspension der geernten ßthuringiensis-?e!ien in PBS-Puffer wird einmal wiederholt.

Die so vorbehandelten Ze'ien können dann entweder direkt elektroporiert oder aber nach Zugabe von Glycerin in die Pufferlösung (20% [w/v]), bei -2O⁰C bis -70°C aufbewahrt und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden. 800μΙ Aliquots der eisgekühlten Zellen werden dann in vorgekühlte Küvetten überführt, anschließend wird 0,2 μg pBC 16-Plasmid DNA (/40/Bernhard K. et al., 1978) (20μg/ml) zugegeben und der gesamte Ansatz 10 Minuten bei 4"C inkubiert. Bei Verwendung von tiefgekühltem Zell.naterial wird zunächst ein geeignetes Aliquot gefrorener Zellen in Eis oder bei Raumtemperatur aufgetaut. Die weitere Behandlung erfolgt analog dem Vorgehen bei Verwendung frischen Zellmaterials. Danach wird die Küvette in eine EleVtroporationsapparatur eingebracht und die in der Suspension vorliegenden B.thuringlensis Zellen werden einer Elektroporation unterzogen, ir Hem s'o durch einmaliges Entladen eine" Kondensators mit Spannungen zwischen 0,1 kV und 2,5kV beaufschlagt werden.

Der hier verwendete Kondensator weist eine Kapazität von 25pF auf, die Küvetten haben einen Elektrodenabstand von 0,4 cm, was bei einer Entladung je nach Einstellung zu einer exponentiell abnehmenden Feldstärke mit anfänglichen Spitzenwerten von 0,25kV/cm bis 6,25kV/cm führt. Disexponentielle Abklingzeit liegt in einem Bereich zwischen 10ms und 12ms. Für die beschriebenen Elektroporationsversucho kann beispielsweise ein Elektroporationsgerät der Firma Bio Rad verwendet werden („Gene Pulser Apparatus", #165-2075, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, CA&4804, USA). Selbstverständlich ist auch jedes andere geeignete Gerät in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar. Nach einer weiteren lOminütigen Inkubation bei 4⁰C wird die Zellsuspension mit 1,2ml LB-Medium verdünnt und 2 Stunden bei einer temperatur von 3O⁰C auf einer Rundschüttelmaschine bei 250Upm inkubiert.

Anschließend werden geeignete Verdünnungen auf LB Agar (LB-Medium verfestigt mit Agar, 15g/l) ausplattiert, der ein für die Selektion des neuerhaltenen Plasmids geeignetes Antibiotikum als Zusatz enthält. Im Falle von pBC 16 handelt es sich dabei um Tetracyclin, das dem Medium in einer Konzentration von 20mg/l zugegeben wird.

Die für B.thuringienslsHD 1cryB und -pBC 16 in Abhängigkeit der angelegten Ausgangsspannung bei gegebenem Plattenabstand erzialten Transformationsfrequenzen sind in Abbildung 1 wiedergegeben.

Die Expression der eingeschleusten DNA kann anhand der auftretenden Tetracyclinresistenz nachgewiesen werden. Bereits 2 Stunden nach der Transformation von pBC 16 in B.thuringiensls erfolgt eine vollständige phänotypische Expression der neu eingeführten Tetracyclin-Resistenz (siehe Tabelle 2).

Beispiel 1.2: Die Transformation von B.thuringiensis-Zellcn wird in genau analoger Weise zu Beispiel 1.1. durchgeführt, mit der Ausnahme, daß das Volumen, der für die Elektroporation vorgesehenen Zellsuspension, in diesem Fall 400 μΙ beträgt. Durch diese Verfahrensmaßnahme kann die Transformationsfrequenz um den Faktor 10 erhöht werden.

Boispiel 2: Transformation von B.thuringlensis HD1 cry B mit einer Reihe verschiedener Plasmidö Die meisten Versuche werden mit dem Plasmid pBC 16 durchgeführt, einem natürlich vorkommenden Plasmid ausB.cereus. Daneben können aber auch andere natürlich vorkommende Plasmide erfolgreich in B.thurlnrjlensls- Zellen eingeschleust werden, wie z.B. pUB1¹O (/25/Polack, J., und Novik, R.P., 1982), pC194 (/24/Horinouchi, S., und Weisblum, B., 1982) und plM 1i (/2ö/Mahler, I., und Halvorson, H.O., 1980) (siehe Tabello 3).

Auch Varianten dieser Plasmide, die besser geeignet sind für die Aiueiten mit lekombinanter DNA als die natürlichen Isolate lassen sich mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in den B.thuringiensls· Stamm HD 1 cryB transformieren, wie z. B. der B. subtilis Klonierungsvektor pBD64 (/27/Gryczan, T., et al., 1980) sowie die Plasrnido pBD347, pBD348 und pUB1 664 (siehe Tabelle 3; die Plasmidö pBD347, pBD348 und pi IB1164 können von Dr. W. Schurter, CIBA-GEGY AG, Basel bezogen werden). Die Transformationsergebnisse der Tabelle 3 machen deutlich, daß unabhängig von der verwendeten Plasmid-DNA bei Anwendung des erfindungsgemäßen Transformationsverfahrens Transformationsfrsquenzsn erreicht werden, die- mit einer Ausnahme-alle im Bereich zwischen 10^s bis 10⁷ liegen.

Beispiel 3: Konstruktion eines „Shuttle"-vektors für Bacillus thuringiensis

Bestehende bifunktionelle Vektoren für E. coil und B. subtilis wie z. B. pHV33 (/41/Primrose, S.B., und Ehrlich, S.D., Plasmid, 6:

193-201,1981) sind fü B.thuringiensis HD 1 cryB nicht geeignet (siehe Tabelle 3).

Für die Konstruktion eines potenten bifunktionellen Vektors wird zunächst das große EcoRI-Fragment von PBC16 mit Hilfe von T4 DNA-Ligase in die EcoRI-Stelle des Plasmids pUCP 728/Vieira, J., und Messing, J., 1982) eincjespleict. Anschließend werden E.coli-Zellen mit diesem Konstrukt transformiert. Eine mit Hilfe einer Restriktionsanalyse als korrekt erkannte Konstruktion wird pXI62 genannt.

Es folgt die Entfernung der distal der pUC8 Polylinkerregion gelegenen EcoRI Schnittstelle. Durch einb partielle EcoRI-Verdauung wird pXI 62 linearisiert. Die kohäsiven EcoRI-Enden werden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt und mit T4 DNA-Ligase wieder ζ isammengefügt. Nach Transformation in E. coil wird eine mit Hilfe einer Restriktionsanalyse als richtig erkannte Konstruktion ausgewählt und pXI61 genannt. Eine Karte von pX61 mit den Schnittstellen von Restriktionsenzymen, die pXI61 nur einmal schneiden, ist iri Abbildung 3 gezeigt.

Diese Konstruktion läßt sich mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Transformationsmntliode direkt in B.thuringlens'^ HD 1 cryB transformieren.

Aufgrund starker Restriktionsbarrieren in B.thurlnglensis Stämmen liegen die Transformationsraten in diesem Fall bei Verwendung der aus E. coil stammenden pXI61 DNA niedriger als bei Verwendung der aus B.thurlnglensls HD1 cryB stammenden Plasmid-DNA (siehe Tabelle 3). Dennoch erweist sich pXI61 als sohr geeignet für die Durchführung von Klonierungsexperimenten in B.thurlnglensls.

Beispiel 4: Einschleusung der Kurhdi delta-Endotoxlngens In Stämmen von B.thurlnglensls und B.cereus Die im Rahmen dieser Erfindung für die Einschleusung und Expression in B.thurlnglensls bzw. B.cereus verwendete DNA-Sequenz, die für ein kurhd 1 delta-Endotoxin-Protein kodiert, stammt aus dem Plasmid pK36, das mit Datum vom 4. März 1986 bei der als Internationale Hinterlegungsstelle anerkannten Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, BRD, entsprechend den Anforderungen des Budapestor Vertrages für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung unter dei Hinterlegungsnummer DSM3668 hinterlegt wurde.

Eine detallierte Beschreibung der Verfahren zur Identifizierung und Isolierung der δ-Endotoxin-Gene sowie der Konstruktion des Plasmids pK36 ist in der Europäischen Patentanmeldung EP 0238441 enthalten und in Form einer Referenz ein Bestandteil der vorliegenden Erfindung.

pK36 Plasmid DNA wird mit den Restrikationsenzymen Pst 1 undBamHI komplett verdaut und das 4.3 Kb umfassende Fragmsnt, das das Kurhd 1 delta-Endotoxingen (vgl. Formel I) enthält, aus einem Agarosegel isoliert. Dieses Fragment wird dann in pXI61 eingesplsißt, welches zuvor mit Pst 1 und BmH 1 verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm behandelt wurde. Nach der Transformation von E. coll HB101 wird ein mit Hilfe einer Rostrikationsanalyse als korrekt erkannte Konstruktion isoliert, die die Bezeichnung pXI93 erhält. Eine Restriktionskarte von pXI 93 ist in Abbildung 7 wiedergegeben. pXI93 kann auf 2 verschiedenen Wegen in B. thurlngiensls HD 1 cryB eingebracht werden.

a) B.thurlnglensls Zellen werden direkt mit einem pXI93 Isolat aus E.coil mit Hilfe des in Beispiel 1 beschriebenen erfindungsgemäßen Transformationsverfahrens transformiert.

b) pXI93 wird zunächst in B. snbtllis Zellen transformiert, wie bei Chang und Cohen, 1979 beschrieben. Aus einem Transformanten, der die komplette und intakte pXI93 Plasmid DNA enthält, wird diese isoliert und anschließend mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Elektroporationsmethode in B.thurlnglensls HD1 cryB transformiert.

Die Anwendung beider Verfahren führt zu Transformanten, die das intakte pXI93 Plasmid enthalten, was anhand einer Restriktionsanalyse gezeigt werden kann.

Beispiel 5: Nachweis der Expression des delta-Endotoxlngens In B.thuringiensls Sporulierende Kulturen von B.thuringiensls HD1 cryB, HD1 cryB (pXI61) und HD1 cryB (pXI93) und HD1 werden im Phasenkontrastmikroskop bei 400facher Vergrößerung miteinander verglichen. Nur im pXI93und in HD1 enthaltenden Stamm können die typischen bipyramidalen Proteinkristalle nachgewiesen werden. Extrakte aus den selben Kulturen werden auf einem SDS-Polyacryiamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Nur für den das Plasmid pXI93 und bei HD 1 enthaltenden Stamm konnte auf dem Gel eine Proteinbande vn 130000 Dalton nachgewiesen werden, die dem Kurhd 1 Genprodukt entspricht (Abbildung 8a).

In der „Western blot" Analyse (Abbildung 8 b) reagiert dieses 130000 Dalton Protein und seine Abbauprodukte spezifisch mit polyklonalen Antikörpern, die zuvor gegen Kristallprotein aus B.thurlnglensis var. Kurstoki HD 1 gemäß bei /42/Huber-Luksc, H., 1982 beschriebenen Verfahren hergestellt worden. Eine detallierte Beschreibung dieses Verfahrens findet man in der Europäischen Patentanmeldung EP 238,4 Al, di 3 '.1 Form einer Referenz ein Bestandteil dieser Erfindung ist. Auf dem Plasmid pXI93 befindet sich stromaufwärts der Toxin-kc Gierenden Region ein 156Bp umfassender DNA Abschnitt, der den vorbeschriebenen Sporulation-abhängig-J.-i Toi'.dem-Promotor (/29/Wong, H.C, ot al, 1983), enthält. Diese Sequenz ist ausreichend für eine hohe Expression des dbli- indotoxingens in B.thuringiensls HD1 cryB und B.cereus 569K.

Beispiel 6: Nachwels der Toxlzltät des vekombinanten B.thuringlensls H01 cryB (pXI93) B.thuringlensbHDI cryB und HD1 cryB (nX!93) werden bei 25°CinSporu!ationsmedium (GYS-Medium)gezüchte.. Nach vollständiger Sporulation, die im Phasenkontrastmikroskop kontrolliert wird, werden Sporen und (soweit vorhanden) Protoxinkristalle durch Zentrifugation geerntet und Sprüh-getrocknet. Das daraus resultierende Pulver wird in verschiedenen Konzentrationen der Diät von L-1 Larven von He'Iothls virescens (tobacco budworm) beigemischt. Die Mortalität der Larven wird nach sechs Tagen bestimmt.

Wie erwartet ist der Protoxingen-freie Sta.r.m HD 1 cryB nicht toxisch für Heliothis virescens, während der mit Plasmid pXI93 transformierte Stamm eine Dosis-abhängi je Mortalität von H. virescens verursacht (Tabelle 4). Dies zeigt, daß durch das Elektroporationsverfnhren hergestellte rekcimbinante Stämme tatsächlich als Bioinsektizid verwendet werden können.

Beispiel 7: Elaktroporation verschiedener B.thuringienols und R. spec. Stämme Das unter Beispiel 1 beschriebene Transformationsprotokoll für ß.thuringiensis HD 1 cryB läßt sich auch auf andere Stämme anwenden.

Alle getesteten Stümne von B.thurlnglensi j var. kurstaki lasser, sich mit dieser Methode sehr einfach und effizient transformieren (Taüelle 5).

Mit einem Laborstamm von B.cereus können ebenfalls ausgezeichnete Transformationsfrequenzen erreicht werden. Das gleiche gilt auch füi weitem der getesteten B. thuringiens!s Variei Ken (var. israelensis, var. kurstaki). B. subtilis dagegen läßt sich durch das Eiekiroporiiticn.werfahren nur sehr mangelhaft transformieren.

Bei Anwendung der Prc toplasten-abhängicjor: PEG-Methoc s konnte dagegen mit B.subtilis Transformationsraten von 4 χ 10⁶/μρ Plasmid DiMA erreicht werden.

Die niedrigen Transfo.rmationsraten von von B.subtilis bei Anwendung der Elektroporationstechnik stehen nicht im Zusammenhang mit '.tisch gewählten Parametern, wiez. B. einer ungeeigneten Spannung oder mit einer hohen Mortalitätsrate, verursacht durch ele.'-'rische Impulse, wie anhand der Abb. 9 ersichtlich ist.

Beispiel 8: Transformation von B. thurlngiensls HD 1 cry^p mit dem ß-Galaktosldasegen 8.1. Einbau einer BamHI-Restrlktlonsschnlttstelle unmittelbar vor das erste AUQ - Kodon des B.thurlngiensls Protoxlngens Bevor das ß-G&laktosidase Gen aus dem Plaomid piWiTh5 (erhältlich von Dr. M. Geiser, CIBA-GEIGY AG, Basel, Schweiz) mit dem Promotor des Kurhd 1 δ-Endotoxingens aus B. thurlngiensls verknüpft werden kann, muß zunächst die in der Umgebung des AUG Startkodons befindliche DNA Sequenz des Protoxingens modifiziert werden.

Diese Modifikation wird mit Hilfe einer Oligonukleotid-vermittelten Mutagenese durchgeführt, unter Verwendung des einzelsträngigen Phagen M 13mp8, der das 1.8kB umfassende Hincll-Hindlll Fragment aus dem δ-Endotoxingen, das die B'-Region des Toxingens umfaßt, enthält.

Zunächs; werden 3Mg des Plasmids pK36 (vgl. Beispiel 4) mit den Restriktionsenzymen Hindlll und Hindi verdaut. Das resultierende 1.8kb-Fragment wird über eine Agarosegelelektrophorese gereinigt und anschließend aus dem Gel isoliert.

Parallel dazu werden 100 ng M13 mp 8 RF P:,«sgen-DNA (Biolab, Tozer Road, Beverly MA, 01915, USA oder jeder beliebige Hersteller) mit den Restriktionsenzymen Smal und Hindlll verdaut, phneolisiert und durch Zugabe von Ethanol präzipitiert. Die so bahandelte Phagen-DNA wird dann mit 200r>g des zuvor isolierten Protoxin-Fragmentes vermischt und durch Zugabe von T4 DNA Ligase mit diesem verknüpft.

Nach der Transfektion von E.coll JM103 werden 6 weiße Plaques herausgelesen und mit Hilfe einer Restriktionskartierung analysiert.

Ein Isolat, bei dem die Verknüpfung zwischen de,n ß-Galaktosidase Gen und dem Promotor des Kurhd 1 δ-Endotoxingens aus B.thurli.glensls korrekt erfolgt ist, wird ausgelosten und erhält die Bezeichnung M13 mp8/Hinc-Hind.

Mit Hilfe eines DNA-Synthesoapparates („APPLIED BIOSYSTEM DNA SYNTHESIZER") wird ein Oligonukleotid synthetisiert, das die folgende Sequenz aufweist:

(5¹) GTTCGGATTGGGATCCATAAG <3')

Dieses synthetische Oligonukleotid ist einer Region auf der M 13mp8/Hinc-Hind DNA komplementär, die von Position 153 bis Position 173 des Kurdh 1 δ-Endotoxingens reicht (vgl. Formel I). Die oben wiedergegebene Oligonukleotidsequenz weist jedoch in Position 162 und 163 ein „Mismatch" gegenüber der in Formel I wiedergagebenen Sequenz auf, wodurch es zur Ausbildung einer BamHI Restriktionsschnittstelle kommt. Die allgemeine Vorgehensweise bei der Mutagenese ist bei J.M. Zoller und M.Smith (/43/J.M. Zoller and M.Smith; 19) beschrieben. Etwa 5pg einzelsträngiger M 13mp18/Hinc-Hind Phagen DNA wird mit 0^g phosphorylierten Obligonukleotiden in einem Gesamt-Volumen von 40μΙ gemischt. Diese Mischung wird für 5 Minuten auf 65⁰C erhitzt, dann zuniichst auf 5O⁰C abgekühlt und anschließend allmählich auf 4⁰C heruntergekühlt. Danach werden Puffer, Nucleotidtriphosphate, ATP, T4-DNA-Ligase und das große Fragment der DNA-Polymerase hinzugefügt und über Nacht bei 15⁰C, wie beschrieben (/43/J.M. Zoller and M. Smith) inkubiert. Nach einer Agarosegel ilektrophorese wird zirkuläre doppelsträngige DNA gereinigt und mittels Transfektion in den E.coll Stamm JM103 '.ngeschleust. Alternativ dazu kann auch der E.coll Stamm JM107 verwendet werden.

Die resultierenden Plaques werden auf Sequenzen hin untersucht, die mit ³²P-markier tem Oligonukleotid hybridisieren; die Phagen werden mit Hilfe der DNA Restriktionsendonukleasen-Analyse untersucht.

Ein Phage, der eine korrekte Konstruktion enthält, bei der 'h eine BamHI Schnittstelle unmittelbar vor dem ersten AUG Kodon des Protoxingens befindet, wird mit M ISmpe/iHinc-Hind/bam bezeichnet.

8.2 Verknüpfung des ß-Galktosidasegens mit dem δ-Endotoxin-Promotor

8.2.1: Der δ-Endotoxin Promotor befindet sich auf einem 162 Bp umfassenden EcoRI/BamHI Fragment der M 13mp8/Hinc-Hind/ Bam-Phagen DNA. RF-Phagen DNA wird mit dem Restriktionsenzym BamHI verdaut. Die dadurch an den 5'-Enden entstehenden Überhänge werden durch Behandlung mit „Mung Bean"-Nuklease (Biolabs) gemäß den Angaben des Herstellers entfernt.

Danach wird die DNA mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut und das 162 Bp umfassende Fragment nach Durchführung einer Agarosegelelektrophorese aus dem Agarosegel isoliert.

Das ß-Galaktosidasegen wird aus dem Plasmid piWiTh 5 isoliert. piWiTh 5 DNA wird zunächst an der einzigen Hindlll Schnittstelle geschnitten. Die 3' ausgesparten Enden werden mit Hilfe des Klenow-Fragments der DNA Polymerase aufgefüllt (vgl./33/ Maniatis et al., 1983, Seite 113-114) und die modifizierte DNA wird anschließend mit dem Restriktionsenzym Sail verdaut. Das DNA-Fragment, welches das ß-Galaktosidasegen enthält wird mit Hilfe einer Agarosegelelektrophorese isoliert.

Der Vektor pXI61 (vgl. Beispiti 3) wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Sail verdaut und die beiden zuvor isolierten Fragmente werden in den Vektor pXI61 eingespleißt.

Nach der Tran- formation dieser Ligationsmischung in den E.coll Stamm HB101 bzw. JM107 werden die korrekt verknüpften Zellklone mit I iilfe der Restriktionsanalyse und anhand ihrer ß-Galktosidaseaktivität gegenüber dem chromogenen Substrat X-gal (S-Brom^-chlor-Sindolyl-ß-D-galaktosid) selektioniert. Ein Klon, der eine korrekte genetische Konstruktion enthält wird mit pXI80 bezeichnet.

8.2.2.: In einei alternativen Ausführungsform wird das 162Bp umfassende EcoRI/BamHI Fragment, welches den δ-Endotoxin Promoter Gnthält, durch Schneiden von M 13mp8/Hinc-Hind/Bam mit EcoRI und BamHI und anschließende gelelektrophoretische Auftrennung isoliert.

Das ß-Galaktodasegen wird auch in diesem Fall aus dem Plasmid piWiTh 5 isoliert (vgl. Beispiel 8.1.). Die Plasmid DNA wir d dabei mit den ResUiKtionsemymen BamHI und BGIII verdaut und das großen Fragment nach Gelelektrophorese aus dem Aga osegel eluiert.

Der Vektor phY300 PLK (# PHY-001 Toyobo Co., Ltd., 2-8 Dojima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka, 530 Japan), der kommerziell bezogen werden kann (vgl. Beispiel 9.1.), wird mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BgIII verdaut. Die beiden ruvor isolierten Fragmente werden dann in den Vektor pHY300 PLK eingespleißt.

Die gesamte Ligationsmischung wird anschließend in den E.coll Stamm JM107 (Bethesda Research Laboratories [BRL], 411 N, Stonestreet Avenue, Rockville, MD 20850, USA) transformiert. Ein Klon, der eine ß-Galaktosidasaktivität aufweist wird weiter mit Hilfe von Restriktionsverdauungen analysiert. Ein Klon, der eine korrekte genetische Konstruktion enthält, wird mit PX1101 bezeichnet.

8.3. Transformation des Plasmids pXI80 bzw. pXI101 In B.subtilis und S.thurlnglensis pXieobzw. pX1101 Plasmid DNA wird zunächst gemäß einem bekannten, bei Chang und Cohen beschriebenen Versuchsprotokoll (/13/Chang und Cohen, 1979), in B.subtilis Protoplasten transformiert.

Ein korrekter Klon wird ausgelesen, die zu transformierende DNA mit Hilfe von Standardverfahren isoliert und via Elektroporation (vgl. Beispiel DinB.thurlnglensisHDI cryB Zellen transformiert.

Die transformierten B. thuringiensls Zellen werden auf GYS-Agar (Sporulationsmedium), der X-gal als Zusatz enthält, ausplattiert.

Korrekt transformierte Klonen farben sich beim Einsetzen der Sporulation blau.

Ein B.thurlnglenslt HD 1 cryB Stamm, der mit dem pXI61 Vektor transformiert wird, bleibt dagegen unter den gleichen Bedingungen weiß.

Die Restriktionsanalyse zeigt, daß bei korrekt transformierten Klonen ein intaktes pXI80bzw. pX1101 Plasmidinden

B. thuringiensls Zellen vorliegt.

3.4, ß-Glaktosldasegen unter der Kontrolle eines Sporulatlonsabhängigen Promotors

B. thurlrigiensls HD 1 cryB Zellen, die das pXI f 0 bzw. pX1101 Plasmid enthalten, werden wie zuvor beschrieben auf GYS-Medium kultivhrt. Zu verschiedenen Zeitpunkten wä! rend der Wachstumsphase (sowohl während der vegetativen Wachstumsphase als auch während der Sporulationsphase) wird ein ß-Galaktosidase-Assay gemäß dem bei /44/J.H. Miller beschriebenen Versu^hsprotokoll („Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, Experiment 48 und 49) durchgeführt.

Die ei.izigen Unterschiede zu dem oben erwähnten Versuchsprotokoll beziehen sich auf die Verwendung von X-gal als chromogenes Substrat und auf die Messung des farbigen Hydrolyseproduktes, das von den Zellen nach etwa 1 Stunde gebildet

Die Zellen werden anschließend mit Hilfe einer Zentrifugation entfernt und die optische Dichte des Überstcndes wird bei einer Wellenlänge von 650nm bestimmt (OD₆₆₀).

Es zeigt sich, daß die Zunahme der optischen Dichte in Abhängigkeit von der Sporulation erfolgt. Die nicht-transformierten B.thuringiensis Zellen können dagegen das chromogene Substrat X-gal nicht hydrolysieren.

Beispiel 9: Erstellen von Genbanken In Bacillus thuringiensls

9.1. Konstruktion von pXI200

Das Plasmid pXI200 ist ein Deriva; des Plasmids pHY300 PLK, das von Toyobo Co., Ltd. (#PHY-001;Toyobo Co., Ltd., 2-8 Dojima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka, 530 Japan) kommerziell bezogen werden kann. Plasmid pHY300, dessen Konstruktion in dur Europäischen Patentanmeldung EP 162725 beschrieben ist, enthält sowohl ein Ampicillin (amp^R)- als auch ein Tetrazyclin (tetr^R)-Res* istenzgen.

Das Plasmid pHY300 PLK wird mit BgII und Pvul vollständig verdaut. Die resultierenden Restriktionsfragmente werden anschließend mit Hilfe einer Agarosgelelektrophorese aufgetrennt. Das 4.4 Kb Fragment wird aus dem Agarosegel isoliert, gereinigt und anschließend mit T4 DNA-Ligase religiert.

Der gesamte Ligationsansatz wird in E.coli HB101 transformiert. Nach Inkubation der transformierten E.coli HB101 Zellen bei 37⁰C uuf einem selektiven L-Agar, der 20pg/ml Tetrazyklin enthält, werden die Tetrazyklin-resistenten (Tc¹) Transformanten selektioniert. Aus einem Ampicillin sensitiven (Ap^s) Klon (100μg/m Ampicillin) kann dann ein Piasmid isoliert werden, das die Pstl Schnittstelle im Ap'-Gen zusammen mit dem 0,3 Kb umfassenden Pvul/Bgll Fragment verloren hat. Dieses Plasmid erhält die Bezeichnung pXI200.

9.2. Klonierung von Protoxlngenen aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki HDI in Bacillus thurlgiensis HDI cryß

Die Gesamt-DNA (50μg) von Bacillus thuringiensis var. kurstaki HDI wird durch Inkubation mit den Restriktionsenzymon Pstl und Hpal vollständig verdaut. Die so gewonnenen Restriktionsfragmente werden auf einen kontinuierlichen Saccharosegradienten (5% (w/v] - 23% [w/v]) übertragen und dort mit Hilfe einer Dichtegradientenzentrifugation entsprechend ihrer Größe aufgetrennt und in Fraktionen von je 500μΙ gesammelt. Die Zentrifugation wird in einem TST 41-Rotor (Kontron Ausschwingrotor) bei max. 2,4 x 10⁵g über einen Zeitraum von 16 Stunden und bei einerTemperatur von 15⁰C durchgeführt. Anschließend werden je 50μΙ Aliquots zur Bestimmung der Fragmentgröße auf ein Agarosegel (0,8% I'.v/v]AgaroseinTris Acetat EDTAoderTris Borat EDTA; siehs/33/ Maniatis et al., 1982) übertragen. Diejenigen Friktionen, welche Fragmente zwischen 3Kb und 6Kb enthalten werden gepoolt und durch Ethanolfälliing auf ein Volumen von 10μΙ konzentriert.

5 μg des in Beispiel 9.1. beschriebenen „Shuttle" Vektors pXI200 werden mit den Restriktionsenzym Pstl und Sma1 vollständig verdaut. Die 5'-Phosphatgruppen der resultierenden Restriktionsfcagmente werden anschließend durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm entfernt.

0,2 μg bis 0,3 pg der zuvoi isolierten HDI DNA werden anschließend mit 0,5 |ig pXI200 vektor DNA vermischt und unter Zugabe von 0,1 U (sog. „Weiss Units"; eine Einheit T4 DNA-Ligase entspricht einer Enzymaktivität, die ausreicht 1 nM [³²P] aus Pyrophosphat bei einer Temperatur von 37⁰C und innerhalb eines Zeitraumes von 20 Minuten in ein Norit-absorbierbares Material umzuwandeln) T4 DNA-Ligase über Nacht bei 14°C inkubiert. Der gesamte Ligationsansatz wird anschließend durch Elektroporation (vgl. Beispiel 1) direkt in Bacillus thuringiensis HDI cryB-Zellen transformiert. Die elektroporierten B.thuringiensis Zellen werden dann auf einen selektiven Sporulationsagar, der 20μg/ml Tetrazyklin als Selektionsmittel enthält, ausplattiert und bei einer Temperatur von 25⁰C bis zur vollständigen Sporulation inkubiert.

9.3. Herstellung monoklonaler Antikörper gegen B.thuringiensis Protoxinprotein

Die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen δ-Endotoxin aus Bacillus thuringiensis var. kurstaki HDI wird analog der Beschreibung bei/36/ Huber-Lukai, (1984) bzw. bei/37/ Huber-Lukac et al. (1986) durchgeführt.

Bei den für die Antikörperherstellung verwendeten Hybridoma-Zellen handelt es sich um Fusionsprodukte von Sp2/0-Ag Myelomzellen (beschrieben bei/45/ Shulman et al., 1978; kann bei der „Americnn Type Culture Collection" in Rockville, Maryland, USA bezogen werden) und Milzlymphozyten von BALB/c Mäusen, die zuvor mit δ-Endotoxin und B.thuringiensis kurstaki HDI irr..nunisiert wurden.

Auf diese Weise können monoklonale Antikörper erhalten werden, die spezifisch gegen das δ-Endotoxin von B.thuringiensis gerichtet sind. Besondars bevorzugt sind monoklonale Antikörper, die entweder spezifisch an ein Epitop ir der K turminalen Hälfte des Protoxin-Proteins binden (z. B. Antikörper 54.1 der Huber-Lukaö et al., 1986 Referenz) oder aber ein Epitop in dem b ' Lepidopteren-aktiven Protoxinen konstanten Teil des Proteins, der C-terminalen Hälfte (z. B. Amikörper 83.16 der Huber-Lukaö et al., 1986 Referenz), erkennen.

Es können aber durchaus auch andere monoklonale oder auch polyklonale Antikörper für das sich anschließende Immunscrenning (vgl. Beispiel 9.4.) verwendet werden.

-39- 283 ό40

9.4. Immunologisches Screening

Für das immunologische Screening werden die gemäß Beispiel 9.3. hergestellten oder andere geeignete monoklonalen

Antikörper verwendet.

Zunächst werden die nach der Sporulation der B.thuringiensls Zellen frei vorliegenden Kristallproteine mit Hilfe von Transfer Membranen (z. B. Pail Biodyne Transfer-Membran; Pail Lutidine Filtration Corporation, Glen Cove, N. Y.) gebunden, indem diese für einen Zeitraum von etwa 5 Minuten auf die Platten aufgelegt werden. Die Filter werden danach 5 Minuten mit TBST Puffer (0,05% [w/v] Tween 20,1OmM Tris/HCI IpH 8,0), 15OmM NaCI in H₂O bidest.) gewaschen und anschließend für 15 bis 30 Minuten zur Blockierung unspezifischer Bindungen in einem Gemisch aus TBST Puffor und 1 % (w/v) Magermilch inkubiert.

Die so vorbereiteten Filter werden dann über Nacht mit dem Protoxinspezifischen Antikörpern (Antikörpergemisch aus 54,1 und 83,1,/37/ Huber-Lukai et al., (1986)) inkubiert. Die nicht gebundenen Antiköper werden durch dreimaliges Waschen des Filters mit TBST Puffer während jeweils 5 bis 10 Minuten entfernt. Zum Nachweis des Antikörpergebundenen Protoxins weiden die Filter mit einem weiteren Antikörper inkubiert. Als sekundärer Antikörper fungiert dabei ein mit alkalischer Phosphatase markierter Antikörper, der beispielsweise bei Bio-Rad (Katalog # 170-6520, Ziegen anti-Maus lgG|H+L]-alkalische Phosphatase Konjugat) kommerziell erworben werden kann. Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten werden die nicht gebundenen sekundärer« Antikörper, wie zuvor beschrieben, durch dreimaliges Waschen (jeweils 5 bis 10 Minuten) mit Filter mit TBST Puffer entfernt. Anschließend werden die Filter mit einem Substratgemisch bestehend aus NBT Cp-nitro blue tetrazolium chloride; Nitro-Blaues Tetrazoliumchlorid) und BCIP (ö-Brom^-chlor-S-indolylphosphat-p-toluidin Salz) inkubiert. Die enzymatische Reaktion wird gemäß den Angaben des Hersteller (Bio-Rad; 1414 Harbour Way South, Richmond CA, 94804, USA)

durchgeführt. ,

Positive, d.h. Protoxin-haltige Klone, können sehr einfach anhand ihrer violetten Färbung erkannt werden. Diese kommt zustande durch die enzymatische Reaktion der alkalischon Phosphatass mit dem zuvor erwähnten Substratgemisch. Aus der in Beispiel 9.2. beschriebenen Transformation mit dem dort angegebenen Ligationsansatz resultierten zwischen 800 und 1000 Transformanten. Davon zeigen 2 Kolonion eindeutig positive Signale in doi zuvor beschriebenen Enzymreaktion.

Aus positiven Klonen, bei denen anhand der beschriebenen Enzymreaktion eine Expression des Protoxingens nachgewiesen werden konnte, wird Plasmid DNA isoliert. Mit Hilfe der Restriktionsanalyse u id durch Vergleich mit bekannten Restriktionskarten können die klonierten Protoxingene weiter charakterisiert und schließlich identifiziert werden.

Beide Klone enthalten ein rekombinantes Plasmid mit einem Insert von 4.3 Kb. Die folgenden Restriktionsverdauungen mit Hindlll, Pvull, EcoRI und Xbal erlauben eine Identifizierung des Gens auf dem Insert durch Vergleich mit den bekannten Restriktionskarten der Endotoxingene aus B.thuringiensls var kurstaki HD1. Es handelt sich in beiden Fällen um das kurhdi Gen, das auch als 5.3 Kb Protoxi: .qen bekannt und bei/5/ Geiser et al., 1986 beschrieben ist.

Dieses direkt in B.thuringiensls klonierte und mit Hilfe eines immunologischen Screenings identifizierte Gen hybridisiert darüber hinaus mit einem 1847Bp umfassenden BamHI/Hindlll Fragment des 5.3Kb Gens im Plasmid pK36/5/Geiser et al., 1986). Im SDS/PAGE zeigen beide Klone eine für das Protoxin typischen Bande von 130000 Dalton, die im Western Blot/46/ Towbin et al.,

1979) spezifische mit den zuvor beschriebenen (siehe Beispiel 9.4.) monoklonalen Antikörpern reagieren.

Tabellen Tabelle 1:

Einfluß der Inkubationszeit bei 4⁰C vor und nach der Elektroporation auf die Transformationsfrequenz. B, thuringiensis HD1 cryB wurde mit Hilfe der Elektroporationsmethode mit 0,2 μg pBC 16 pro Ansatz transformiert

Probe	1	0	2	5	3	4	5	6	7	8
Vorinku bation* (Minuten)	20	20	10	20	20	20	20	20
Nachinku bation** (Minuten)	20	20	0	5	10	20

Transformationsfrequenz (Transforman-

Plasmid DNA)

2,6 x 10⁶

2,1 x 10⁶

2,2x10^e

2,3 x10⁶

2,5 x 10⁶

1,9 x10⁶

3,3x10"

1,7x10"

* Inkubation bei 4^CC zwischen der Zugabe von DNA und der Elektroporation

* * Inkubation bei 4⁰C zwischen der Elektroporation und dem Beginn der Expressionsperiode.

Tabelle 2:

Expression der Tetracyclin Resistenz von pBC 16 nach der Transformation in B. thuringienslsHDIcryB. B. thurlnglensis HD1 cryB wurde mit pBC16 Plasmid DNA unter Verwendung des erfindungsgemäßen Elektroporationsprotokolls transformiert. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten in LB Medium bei 30°C werden die transformierten Zellen durch Ausplattiorung auf LB Agar, der 20μ9/ηιΙ Tetracyclin enthält, sanktioniert.

Expressionszeit Transformations- Anzahl lebender

der Tetracyclin- frequenz (Trans- Zellen

resistenz (Stunden) formanten/Mg DNA)

0,5 0 4 x 10"

1 1,6 x 10⁶

2 8,8x10^e 1,4 χ

3 8 XiO¹ 1,6 x

Tabelle 3:

Transformation des B. thurlnglensis Stammes HD1 cryB mit verschiedenen Plasmiden

Plasmid

Herkunft

Resistenzmarker"

gram positiv

B.cereus

_

Tc

pUB110

-

Km, Cm

„shuttle" Vektoren

Cm

Transformations-21

Referenz

gram negativ

natürlich vorkommende Plasmide

Staphylococcus

Km1BIe

replicon

Amp, Tc

Tc

frequenz

aureus

-

plMI 3 repli

-

Cm

Amp

pBC16

S.aureus

-

Cm

con.

1,9x10B

pUB110

B.subtilis

-

Em

plMI 3 repli

-

Em. Cm

3,3x106*

modifizierte Plasmide/Klonierungsvektoren

con,

pC194

pUB110 repli

-

Cm, Em

6 χ 106·

plM13

con,

1,8 χ 106

pBD64

pBR322/pC194,

pUC8/pBC16,

5 x106

pBD347

2,9x105

pBD348

1,1 xiO5

PUB1664

3,5x104

pHV33

<50*

pK61

2,8x104

1 Tc: Tetrazyklin; Km: Kanamyzin; BIe: Bleomyzin; Cm: Chloramphenicol; Em: Erythromyzin.

2 Sämtliche Plasmid DNA stammt aus B.thuringlensls HDI cry8 mit Ausnahme von * iso'iert von B. subtills LBG4468.

Tabelle 4:

Biotest von B.thuringiensis HD1 cryB und HD1 cryB (pXI 93) gegen Heliothis virescens.

Sprühgetrocknete sporulierte Kulturen (Sporen und [sofern vorhanden] Protoxinkristalle) wurden in den angegebenen Mengen der Diät von L-1 Larven von Heliothis virescens beigemischt.

Konzentration von Mortalität (%) von H. virescens

Sporen und Protoxin- verursacht durch:

kristallen ^g/g Diät)

HDIcryB HD1 cryB (pXI93)

200 0 57

100 0 43

50 3 27

25 0 10

12,5 0 0

Tabelle 5:

Transformierbarkeit von Stämmen von B. thuringlensis, B. cereus und B. subtllls. Alle Stämme wurden nach der in Beispiel 1 geschilderten Elektroporationsmethode mit dem Plasmid pBC16 transformiert.

Stamm

Transformations-" Frequenz

B.thurlnglonsls var. kurstaki

HDIcryB

HD1 dipel

HD1-9

HD 73

HD191

B.thuringlensls var. thurigiensis

HD2-D6-4

B.thurlnglensls var. israelensis

LBG B-4444

B.cereus

569 K

B.subtllls

LBG B-4468

1 .

0,25

0,9

0,1

0,5

13,8 2,6 7.5 0,0002relative Werte bezogen auf die als 1 diiflnierte Transformationsfrequenz, die mit B. thuringlensis var. kurstaki HDI cryB erzielt wird.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Von jedem der im folgenden aufgelisteten Mikroorganismen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wurde eine Kultur bei der als internationale Hinterlegungsstelle anerkannten „Deutschen Sammlung von Mikroorganismen" in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrages für die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke der Patentierung, hinterlegt. Eine Erklärung zur Lebensfähigkeit der hinterlegten Proben wurden durch die besagt Internatione Hinterlegungssstelle ausgefertigt.

Hinterlegung von Mikroorganismen

Mikroorganismen	Hinterlegungs	Hinterlegungs-	Datum der
	datum	Nummer	Lebensfähigkeits
			bescheinigung
HB101(pK36)	4. März 1986	DSM 3668	7. März 1986
(E.coliHB101
transformiert
mitpK36
Plasmid DNA)
•HD1 cryß	4. Mai 1988	DSM 4574	4. Mai 1988
(Bacillusthu-
rlngienslsvar.
kurstaki HD1 cryß
•HD1cryß(*pK61)	4. Mai 1988	DSM 4572	4. Mai 1988
(B.thuringlensls
HD1 cryß transfor
miert mit »pK61
Plasmid DNA)
•HD1cryß(»pK93)	4. Mai 1988	DSM 4571	4. Mai 1988
(B.thuringlensls
HD1 cryß transfor
miert mit *pK93
Plasmid DNA)
569 K	4. Mai 1988	DSM 4575	4. Mai 1988
(Bacillus cereus
569K)
569K(*pK93)	4. Mai 1988	DSM 4573	4. Mai 1988
(B. cereus 569 K
transformiert mit
•pK93 Plasmid DNA)

Die im Prioritätsdokumer.t für die Benennung der Plasmide gewählte interne Bezeichnung pK wurde für die Auslandsfassung durch die offiziell anerkannte Bezeichnung pXI ersetzt.

Auch die Bezeichnung für die im Rahmen der Ausführungsbeispiele verwendete asporogene B. thurlnglensls HD1 Mutanto wurde von cryß nach cryB geändert.

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Patentliteratur EP 162,725 EP 238,441 WO 86/01536 US-P 4,448,885 US-P 4,447,036 US-P 4,237,224 US-P 4,468,464

Claims (68)

1. Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetischen Manipulation von B.thuringiensis und/oder B.cereus unter Verwendung der rekombinanten DNA Technologie, dadurch gekennzeichnet, daß man B.thuringiensis und/oder B.cereus mit Hilfe eines einfachen Transformationsverfahrens mit hoher Effizienz transformiert unter Verwendung einer rokombiniorten DNA, die für dio vorgesehene genetische Manipulation von B.thuringiensis und/ oder B.cereus geeignet ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Transformation von B.thuringiensis und/oder B.cereus mit Hilfe einer Elektroporation durchführt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation von B.thuringiensis und/oder B.cereus die folgenden Verfahrensmaßnahmen umfaßt:

a) Herstellen einer Zellsuspension mit geeigneter Zelldichte in einem für die Anzucht von

B.th iringiensis und/oder B.cereus-Zellen geeigneten Kultivierungsmedium und bei einer für das Wachstum der Zellen ausreichenden Belüftung;

b) Abtrennen der Zellen aus der Zellsuspension und resuspendieren in einem für die nachfolgende Elektroporation geeigneten Inokulationspuffer;

c) Zugabe einer DNA-Probe in einer für die Elektroporation geeigneten Konzentration;

d) Einbringen des unter Punkt b) und c) beschriebenen Ansatzes in eine Elektroporationsapparatur;

e) Eine oder mehrere kurzzeitige Entladungen eines Kondensators über die Zellsuspension zur kurzfristigen Erzeugung hoher elektrischer Feldstärken über einen Zeitraum, der für eine Transformation von B.thuringiensis und/oder B. cereus Zellen mit rekombinanter DNA ausreichend ist;

f) gegebenenfalls Nachinkubation der elektrooorierten Zellen;

g) Ausplattieren der elektroporierten Zellen auf einem geeigneten Selektionsmediuin; und h) Auslesen der transformierten Zellen.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung der unter Punkt 3a) genannten Zellsuspension B.thuringiensis Sporen verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der unter Punkt 3e) genannten Elektroporation tiefgefrorene Bacillus thuringiensis und/oder Bacillus cereus Zellen verwendet.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Kultivierung von B.thuringiensis Zellen

a) komplexe Nährmedien mit leicht assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwendet, wie sie üblicherweise für die Kultivierung von aeroben Dacillus-Arten eingesetzt werden;

ai) gegebenenfalls zu den unter a) genannten Medien zusätzlich Vitamine und essentielle Metallionen zusetzt; oder

b) voll- oder halbsynthetische Nährmedien verwendet, die

b,) eine komplexe oder aber eine definierte leicht assimilierbare Kohlenstoff- und

Stickstoffquelle oder eine Kombination beider sowie b₂) essentielle Vitamine und Metallionen enthalten.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Bacillus-Zellsuspension eine optische Dichte von 0,1 bis 1,0 aufweist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der unter Punkt b) genannte Inokulationspuffer ein osmotisch stabilisierter Phosphatpuffer ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Phosphatpuffer als stabilisierendes Agens Zucker oder Zuckeralkohole enthält.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem stabilisierendem Agens um Saccharose handelt, die in einer Konzentration von 0,1 M bis 1,0 M vorliegt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Phosphatpuffer einen pH-Wert von pH 5,0 bis pH 8,0 aufweist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation der Bacillus-Zellen sowohl vor, während als auch nach der Elektroporation bei einer Temperatur zwischen 0⁰C und 35⁰C erfolgt.

13. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation der Bacillus-Zellen sowohl vor, während als auch nach der Elektroporation bei einer Temperatur zwischen 2°C und 15°C erfolgt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der zugegebenen DNA-Probe 1 ng bis 20 μρ beträgt.

15. Verfahren gemäß Anspruch i4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter DNA-Probe um Vektor-DNA handelt.

16. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man im Zuge der Elektroporation die Bakterienzeilen durc¹! kurzzeitige Entladungen eines Kondensators über die DNA-haltige Zellsuspension kurzfristig mit einer sehr hohen elektrischen Feldstärke beau' chlagt, wodurch die Permeabilität der B.thuringiensis und/oder B.cereus Zellen in einer Weise erhöht wird, daß die Aufnahme der in der Suspension befindlichen DNA in die Bacillus Zellen erfolgt.

17. Vorfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Feldstärkewerte 100 V/cm bis 50000 V/ cm betragen.

18. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Feldstärkewerte 100 V/cm bis 10000V/cm betragen.

19. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die exponentiell Ablmgzeit des Impulses, mit deiM die Bacillus-Zellsuspension beaufschlagt wird, in einem Bereich von etwa 2ms und etwa 50ms lieyt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektroporierten Zellen nach einer geeigneten Nachinkubationsphase auf Festmedien ausplattiert, die einen für die Selektionierung der transformierten Bacillus Zellen geeigneten Zusatz enthalten.

21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Zusatz um ein für die Selektion von B.thuringiensis und/oder B.cereus geeignetes Antibiotikum ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tetrazyklin, Kanamycin, Chloramphenicol, Erythromycin handelt.

22. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Zusatz um ein für die Selektion von B.thurintjiensis und/oder B.cereus geeignetes chromogenes Substrat handelt.

23. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Transformation von B.thuringiensis und/oder B. cereus verwendete, rekombinante DNA homologen oder heterologen Ursprungs ist oder es sich um eine Kombination aus homologer und heterologer DNA handelt.

24. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagte rekombinante DNA ein oder mehrere Strukturgene sowie 3'- und 5' flankierende, in Bacillus thuringiensis oder Bacillus cereus oder in beiden funktionsfähige, regulatorische Sequenzen enthält, die in operabler Weise mit dem (den) Strukturgen(en) verknüpft sind und somit die Expression besagten(r) Strukturgens(e) in Bacillus thuringiensis oder Bacillus cereus oder in beiden gewährleisten.

Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Strukturgen ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B.thuringiensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist, d. h. das zumindest im wesentlichen die Toxiszitätseigenschaften eines kristallinen δ-Endotoxin-Polypeptids aus B.thuringiensis aufweist.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß besagte δ-Endotoxin-kodierende DNA-Sequenz im wesentlichen wenigstens dem Teil oder den Teilchen der natürlichen 6-Endotoxinkodierenden Sequenz homolog ist, der (die) für die insektizide Aktivität verantwortlich ist (sind).

27. Verfahren gemäß Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter DNA um Vektor-DNA handelt.

28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sich besagte Vektor-DNA von Plasmid DNA ableitet.

29. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sich besagte Vektor DNA von Phagen DNA ableitet.

30. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Transformation bifunktionelle Vektoren verwendet, die in der Lage sind, außer in B.thuringiensis oder dem nahe verwandten B.cereus oder in beiden zumindest noch in eir.em oder aber in mehreren anderen heterologen Wirtsorganismen zu replizieren und die sowohl in den homologen als auch in den heterologen Wirtssystemen identifizierbar sind.

31. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagten heterologen Wirtsorganismen um

a) prokaryontische Organismen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Pseudomonas, Escherichia, Agrobacterium, Salmonella, Erwinia, usw., oder

b) eukaryontische Organismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hefe, tierischen und pflanzlichen Zellen, usw. handelt.

32. Verfahren gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem heterologen Wirtsorganismus um E.coli handelt.

33. Verfahren gemäß Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß nian B.thuringiensls und/oder

B. cereus mit einem bifunktionellen Vektor transformiert, der nach einem Verfahren hergestellt ist, das durch die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:

a) Fragmentierung von Plasmid DNA homologen sowie heterologen Ursprungs mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme; und

b) anschließend Verknüpfung derjenigen Fragmente, welche die für die Repliktation sowie die Selektionierung in dem jeweiligen gewünschten Wirtssystem essentiellen Funktionen enthalten, in Gegenwart geeigneter Enzyme und zwar in einer Weise, daß die für die Replication und Selektion in den verschiedenen Wirtssystemen essentiellen Funktionen erhalten bleiben.

34. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß man Plasmid DNA rein heterologen

Ursprungs verwendet.

35. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter

a) homologer Plasmid DNA um DNA handelt, die natürlicherweise in Bacillus thuringiensis oder B. cereus vorliegt oder aber dieser im wesentlichen homolog ist,

b) heterologer Plasmid DNA um DNA handelt, die natürlicherweise in

bi) prokaryontischen Organismen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Pseudomonas, Escherichla, Agrobacterium, Salmonella, Erwinia, usw.,

b₂) eukaryontischen Organismen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hefe, tierischen

und pflanzlichen Zellen usw.
vorliegt oder aber dieser im wesentlichen homolog ist.

36. Verfahren gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter heterologer Plasmid DNA um eine DNA handelt, die natürlicherweise in E.coli vorliegt oder aber dieser im wesentlichen homolog ist.

37. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß besagte bifunktionelle Vektoren neben den für die Replikation und Selektion in homologen und heterologen Wirtssystemen essentiellen Funktionen zusätzlich noch ein oder mehrere Gen(e) in exprimierbarer Form oder sonstige nützliche DNA-Sequenzen besitzen, die man mit Hilfe geeigneter Enzyme in besagte bifunktionelle Vektoren einspleißt.

38. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Gene oder sonstige nützliche DNA Sequenzen homologen, heterologen oder synthetischen Ursprungs sind oder aber aus einer Kombination besagter Gene oder DNA-Sequenzen bestehen.

39. Verfahren gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Gene aus einem oder mehreren Strukturgenen sowie aus 3' und 5' flankierenden, in B.thuringiensis oder B.cereus oder in beiden funktionsfähigen regulatorischen Sequenzen bestehen, die in operabler Weise mit dem Strukturgen verknüpft sind und somit die Expression besagten Strukturgens in B.thuringiensis oder B. cereus oder in beiden gewährleisten.

40. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagten regulatorischen Sequenzen um Expressionssignale handelt, die sowohl Promotor- als auch Terminatorsequenzen sowie weitere regulatorische Sequenzen der 3' und 5' nichttranslatierten Regionen miteinander schließen.

41. Verfahren gemäß Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssignale natürlicherweise in B. thuringiensis oder in B.cereus oder in beiden vorkommen oder daß es sich um Mutanten und Varianten dieser natürlichen Expressionssignale handelt, die der natürlichen Sequenz im wesentlichen homolog sind.

42. Verfahren gemäß Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssignale einen Sporulations-abhängigen Promotor aus B.thuringiensis miteinschließen.

43. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Strukturgen ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuringiensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist, d. h. das zumindest im wesentlichen die Toxizitätseigenschaften eines kristallinen δ-Endotoxin Polypeptids aus B.thuringiensis aufweist.

44. Verfahren gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Strukturgen um eine natürlicherweise in B. thuringiensis vorkommende, δ-Endotoxin kodierende DNA-Sequenz handelt oder aber um eine Variante einer natürlichen DNA-Sequenz, die der entsprechenden natürlichen Sequenz zumindest im wesentlichen homolog ist.

45. Verfahren gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Polypeptid einem δ-Endotoxin-Polypeptid aus geeigneten Unterarten von B. thuringiensis, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus kurstaki, berliner, alesti, sotto, tolworthi, dendrolimus, tenebrionis und israelensis im wesentlichen homolog ist.

46. Verfahren gemäß Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß besagte δ-F.ndotoxin kodierende DNA Sequenz im wesentlichen wenigstens dem Teil oder den Teilen der natürlichen δ-Endotoxin kodierenden Sequenz homolog ist, der (die) fürd'e insektizide Aktivität verantwortlich ist (sind).

47. Verfahren gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagter δ-Endotoxin kodierender DNA Sequenz um ein DNA Fragment aus B. thuringiensis var. kurstaki HDI handelt, das sich zwischen den Nukleotiden 156 und 3623 in Formel I befindet oder aber um jedes beliebige kürzere DNA-Fragment, das noch ein Polypeptid mit insektentoxischen Eigenschaften kodiert:

Formull

10 20 30 AO 50 60 GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT AGTAAAATTA GTTGCACTTT GTGCATTTTT

70 80 90 100 110 120 TCATAAGATG AGTCATATGl TTTAAATTGT AGTAATGAAA AACAGTATTA TATCATAATG

130 140 150 160 170 180 AATTGGTATC TTAATAAAAG AGATGGAGGT AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG

190 200 210 220 230 240 AATGCATTCC TTATAATTGT TTAAGTAACC CTGAAGTAGA AGTATTAGGT GuAGAAAGAA

250 260 270 280 290 300 TAGAAACTGG TTACACCCCA ATCGATATTT CCTTGTCGCT AACGCAATTT CTTTTGAGTG

310 320 330 340 350 360 AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GACTAGTTGA TATAATATGG GGAATTTTTG

370 380 390 400 410 420 GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA GTTAATTAAC CAAAGAATAG

430 440 450 460 470 480 AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA

490 500 510 520 530 540 TTTACGCAGA ATCTTTTAGA GAGTGGGAAG CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG

550 560 570 580 590 600 AGATGCGTAT TCAATTCAAT GACATGAACA GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG

610 620 630 6A0 650 660 CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT CAGTATATGT TCAAGCTGCA AATTTACATT

670 680 690 700 710 720 TATCAGTTTT GAGAGATGTT TCAGTGTTTG GACAAAGGTG GGGATTTGAT GCCGCGACTA

730 740 750 760 770 780 TCAATAGTCG TTATAATGAT TTAACTAGGC TfATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC

790 800 810 820 830 840 GCTGGTACAA TACGGGATTA GAGCGTGTAT GGGGACCGGAi TTCTAGAGAT TGGATAAGAT

850 860 870 880 890 900 ATAATCAATT TAGAAGAGAA TTAACACTAA CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA

910 920 930 940 950 960 ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAGTTTCCCA ATTAACAAGA GAAATTTATA

970 980 990 1000 1010 1020 CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA GTTTTCGAGG CTCGGCTCAG GGCATAGAAG

1030 1040 1050 1060 1070 1080 GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG

1090 1100 1110 1120 1130 1140 CTCATAGAGG AGAATATTAT TGGTCAGGGC ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGGTTTT

1150 1160 1170 1180 1190 1200 CGGGGCCAGA ATTCACTTTT CCGCTATATG GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC

1210 1220 1230 1240 1250 1260 GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT ATAGAACATT ATCGTCCACT TTATATAGAA

1270 1280 1290 1300 1310 1320 GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC AACTATCTGT TCTTGACGGG ACAGAATTTG

VIIIOIDOVO IWOIOODOO WWDVDOVO VWOVIlIVO IV1W0VD00 VOIIIDDWI OVOZ 0C03 OZOc 0102 0003 0661

OWOVDOODD II0I1IW0I IWODIVOVI VIVIIlOWO IWDOOVDII WDIIDIOIV 0861 0L61 0961 0561 0V61 0C61

DIDOIOWII ODVIIIVIOI 0WD1V00IV WOIIIIDW III0DDIDV1 DVI1I100VI 0Z61 0161 006Ϊ 068Ϊ 0981 0L21

0IDV00V1II DOWOODDIO VDVIIIWlO VOOOIOVIOV 01V1DWD0V DIIIIlWOO 0981 0581 0V81 0C81 0281 0181

DOVDIWIlV IDDVOWOOD VOIIWDIVD VIVDDIlWD VIIIWVDVD DVIDIIDODV 0081 06Π 08Π OLLI 09LI OSU

IDODllWOV V1000D1VIV OVWDVDIVl 1VDDVD0IDV I1V1VWI0V OWIlDDWD O'?Ll OZLl OZLl OUl 00Π 0691

1I1V0VDD00 IDDVDlIDW OWODIlDIl VIVOVOOVOO VDV1I1V00V DDVOOWVlI 0891 Oi9l 0991 0591 0^91 0C91

0D10ID1IDV V001DID001 1D1WIDVID IWWDWlI IDDVlVWDV DVIIVWDVD 0Z91 0191 0091 0651 0851

IVDIIDD11V VIVlWIWI IIW0I0010 VI0DIVDV1V 00IIDID1I0 1V1DD1D0V0 0951 0551 0*751 0C51 0251 0151

WlWIVlOV VI010VI0VI WIOVIlIOO 0VDII0D1II 01VVDII101 VDDOWIIVO 0051 06Vl O8»7l OL*?l 09Vl 05Vl

D1VD10VI1I VOOWDOOVl DDVDD010DV VDWlWOVD VDDODOVIW V01V001000 OVVl OCVl GZVl OlVl 0OVl 06ei

J.1V0V100DV VODDOVWVV 0VDVIV101D 0DD1VDD011 IWVDlDDlD DWOOIVlID 08Cl OLiI 09Cl OStI OVEl OCCl

IWOOIIWV WOIOOWVO VOVOVOOlW VWVOVOOOO VOWWOIOI OOIOOVIOVO 09LZ OGLZ O*?LZ OZLZ OZLZ OILZ

OWOVOOVIO VIIVOOVWO VOWOOlOII IWOVlOlW VOOVIOVOW OOIVOOOOIV OOLZ 0692 0892 0L9Z 0993 0592

OWOOOVOW IIVOWOllV IVOIOOOIVI OIOOVIIOVO OVOiVWIIO VOVOVIOIVO 0V92 0Γ92 0292 0192 0092 0652

0II0IV0I1V OVOOIIOOIO 1IIV01V000 IIVOIVOOOO IOIWWOOO IWOOlOWO 0852 OLGZ 0952 0552 0V52 C^CG2

0000V01I10 000001VII0 0I10000VI0 OVOOOIOIW VIOVOVWOO VOVWOOOIV 0252 0152 OO'J2 06V2 08V? OLH

VOVIOOOIIV VIIIVIOIW VOVIlOVOW 0I0V1V0W0 OIVIVIOOOV OWlIWOOV O9V2 O5V2 0VV2 OCVZ O2V2

II0000V1VI OOOVWVIIV WOOIOVOIV OVIVWWVO IVIVIIIV10 OWOOIVIOO

00V2 O6C2 08C2 OLZZ 09t2 05£2

10V01V01II 00V100011V IOOOVIIOOV I1W0V0WV 0I1VI00V0I VOOOOVOOW

0VC2 0G€2 O2C2 OIZZ 00€2 0622

001V00VIIV 1V000VI0W 00V0V00100 OIOOOVOVIO WOVOVlWO IVOOOVOVII

0822 0^22 0922 0522 0*722 Oi22

iOVWOOIVO WOIIOVlIl WOOOOVOlV 010VII0V00 OWOOOlVOV WOIOWVOV

0222 0122 0022 0612 0812 0Π2

000I0I1W0 VWWVWOI V0010I0I11 1W0IV0I0I VI1I010V0I 10VI1IW00

0912 0512 0VI2 0C12 0212 0Π2

IVIOWOlVO IIV1V01V11 V000V0I01V OVOVWTVIl 00001WV0I WOOIIOIIO

0012 0602 0802 OiO2 0902 0502

2770 2780 2790 2800 2810 2820

GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA AAGAATCTGT AGATGCTTTA TTTGTAAACT

2830 2840 2850 2860 2870 2880

CTCAATATGA TAGATTACAA GCGGATACCA ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC

2890 2900 2910 2920 2930 29AO

GCGTTCATAG CATTCGAGAA GCTTATCTGC CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG

2950 2960 2970 2980 2990 3000

CGGCTATTTT TGAAGAATTA GAAGGGCGTA TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA

3010 3020 3030 30A0 3050 3060

GAAATGTCAT TAAAAATGGT GATTTTAATA ATGGCTTATC CTGCTGGAAC GTGAAAGGGC

3070 3080 3090 3100 3110 3120

ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACMCCACC GTTCGGTCCT TGTTGTTCCG GAATGGGAAG

3130 3140 3150 3160 3170 3180

CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC CGGGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG

3190 3200 3210 3220 3230 3240

CGTACAAGGA GGGATATGGA GAAGGTTGCG TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG

3250 3260 3270 3280 3290 3300

ACGAACTGAA GTTTAGCAAC TGTGTAGAAG AGGAAGTATA TCCAAACAAC ACGGTAACGT

3310 3320 3330 3340 3350 3360

GTAATGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT ATGAGGGTAC GTACACTTCT CGTAATCGAG

3370 3380 3390 3400 3410 3420

GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTGTACCAGC TGATTATGCA TCAGCCTATG

3430 3440 3450 3460 3470 3480

AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG

3690 3500 3510 3520 3530 35A0

GGGATTACAC ACCACiACCA GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA

3550 3560 3570 3580 3590 3600

CCGATAAGGT ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGG

3610 3620 3630 3640 3650 3660

AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT AAGGTGTGCA AATAAAGAAT

3670 3680 3690 3700 3710 3720

GATTACTG\C TTGTATTGAC AGATAAATAA GGAAATTTTT ATATGAATAA AAAACGGGCA

3730 3740 3750 3760 3770 3780

TCACTCTTAA AAGAATGATG TCCGTTTTTT GTATGATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT

3790 3800 3810 3820 3830 3840

TTTTTTGCGA aggctttact taacggggta ccgccacatg cccatcaact taagaatttg

3850 3860 3870 3880 3890 3900

CACTACCCCC AAGTGTCAAA AAACGTTATT CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGGATGAC

3910 3920 3930 3940 3950 3960

ATTTTTTATG AATCTTTCAA TTCAAGATGA ATTACAACTA TTTTCTGAAG AGCTGTATCG

3970 3980 3990 4000 4010 4020

TCATTTAACC CCTTCTCTTT TGGAAGAACT CGCTAAAGAA TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA

403Ö 4040 4050 4060 4070 4080

ACGAAAGTTT TCAGGAAATG AATTAGCTAC CATATGTATC TGGGGCAGTC AACGTACAGC

4090 4100 4110 4120 4130 4140

GAGTGATTCT CTCGTTCGAC TATGCAGTCA ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT

4150 4160 4170 4180 4190 4200

CCAGAAGGAC TCAATAAACG CTTTGATAAA AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT

4210 4220 4230 4240 4250 4260

ICTGCATTAT GGAAAAGTAA ACTTTGTAAA ACATCAGCCA TTTCAAGTGC AGCACTCACG

4270 4280 4290 4300 4310 4320

TATTTTCAAC GAATCCGTAT TTTAGATGCG ACGATTTTCC AAGTACCGAA ACATTTAGCA

4330 4j40 4350 4360

CATGTATATC CTGGGTCAGG TGGTTGTGCA CAAACTGCAG

48. Verfahren gemäß Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem bifunktionellen Vektor um den bifunktionellen Vektor pXI 61 (pK61) transformiert in B. thuringiensisvar. ku/staki HDI cryB (DSM 4572) handelt.

49. Verfahren gemäß Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem bifunktionellen Vektor um den bifunktionellon Vektor pXI 93 (pK93), transformiert in B.thuringiensis var. kurstaki HDI cryB (DSM 4571) und B.cereus 569K (DSM 4573) handelt.

50. Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetischen Manipulation von B.thuringiensis und/oder B.cereus gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Gene, welche in B.thuringiensis und/oder B.cereus kloniert und gegebenenfalls exprimiert werden sollen, zunächst isoliert;

b) die isolierten Gene gegebenenfalls mit Expressionssequenzen, die in Bacillus thuringiensis und/oder B.cereus funktionsfähig sind, operabel verknüpft;

c) die genetischen Konstruktionen aus Abschnitt b) unter Verwendung geeigneter Vektoren in Bacillus thuringiensis und/oder B.cereus Zellen transformiert; und

d) gegebenenfalls ein entsprechendes Genprodukt exprimiert und, sofern gewünscht, isoliert.

51. Verfahren gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem Gen um ein Protoxingen aus Bacillus thuringiensis handelt.

52. Verfahren gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Expressionssequenzen einen Sporulations-abhängigen Promotor aus Bacillus thuringiensis miteinschließen.

53. Verfahren gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man Direktklonierungsvektoren verwendet.

54. Verfahren gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man bifunktionelle („Shuttle") Vektoren verwendet.

55. Verfahren gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man anstelle von Genen sonstige nützliche DNA-Sequenzen in die Bacillus Zellen einschleust und dort kloniert.

56. Verfahren zur direkten, zielgerichteten und reproduzierbaren genetis· en Manipulation von Bacillus thuringiensis und/oder B. cereus gemäß Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die Gesamt-DNA von Bacillus thuringiensis mit Hilfe geeigneter Restriktionsenzyme verdaut;

b) aus den resultierenden Restriktionsfragmenten solche geeignete Größe isoliert;

c) besagte Fragmente in einen geeigneten Vektor einspleißt;

d) Bacillus thuringiensis und/oder B. cercus-Zellen mit besagtem Vektor transformiert; und

e) aus den Transformanten mit Hilfe geeigneter Screeningverfahren neue DNA Sequenzen isoliert.

57. Verfahren gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem neuen Gen um ein Protoxingen handelt.

58. Verfahren gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß man Direktklonierungsvektoren verwendet.

59. Verfahren gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß man „Shuttle" Vektoren verwendet.

60. Verfahren gemäß Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufspüren neuer DNA Sequenzen ein immunologisches Screeningverfahren verwendet.

61. Verfahren zur Bekämpfung von Insekten, dadurch gekennzeichnet, daß man Insekten oder deren Lebensraum mit

a) B. thuringiensis oder B. cereus-Zellen oder mit einem Gemisch von beiden behandelt, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das ein Strukturgen enthält, welches für ein δ-Endotoxin-Polypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuringiensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesem im wesentlichen homolog ist; oder aber

-n- 203840

b) mit zellfreiön Kristallkörperpräparaten, dia ein Protoxin enthalten, das von besagton transformierten Bacillus-Zellen produziert wird.

62. Verfahren gemäß Anspruch 57, dadurch gekennzeichnet, daß man insektizide Gemische verwendet, bestehend aus transformierten, lobenden oder toten B. thi'Hngiensis und/oder B. cereus Zellen gemäß Abschnitt a) sowie aus zollfreien Kristallkörperpräparaten, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus Zellen produziert wird, gemäß Abschnitt b).

63. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 oder 62, dadurch gekennzeichnet, rtaß es sich bei besagtem rekombinanten DNA-Molekül um einen bifunktionellen Vektor gen ^;iß einem der Ansprüche 33 bis 47 handelt.

64. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 61 bis 63, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Insekten der Ürc nung Lepidoptera, Diptera oder Coleopter« handelt.

65. Verfahren gemäß Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Insekten der Ordnung Lepidoptera handelt.

66. Mittel zur Bekämpfung von Insekten, dadurch gekennzeichnet, daß es neben den üblicherweist verwendeten Trägermitteln, Verteilungsmitteln oder Träger- und Verteilungsmitteln

a) B.thuringiansisoderB. cereus Zellen odjr ein Gemisch besagter Bacillus-Zellen enthält, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das ein Strukturgen enthält, welches für ein δ-F.ndotoxin-Folypeptid kodiert, das natürlicherweise in B. thuriny'ensis vorkommt oder aber ein Polypeptid, das diesen im wesentlichen homolog ist; oder aber

b) zellfreie Kristallkörperpräparate, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus-Zellen produziert wird.

67. Mittel zur Bekämpfung von Insekten gemäß Anspruch 66, dadurch gekennzeichnet, daß es neben den üblicherweise verwendeten Trägermitteln, Verteilungsmitteln oder Träger- und Verteilungsmitteln insektizide Gemische enthält, bestehend aus transformierten, lebenden oder toten B. thuringiensis und/oder B. cereus Zellen gemäß Abschnitt a) sowie aus zellfreien Kristallkörperpräparaten, die ein Protoxin enthalten, das von besagten transformierten Bacillus Zellen produziert wird, gemäß Abschnitt b).

68. Mittel gemäß einem der Ansprüche 66 oder 67, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei besagtem rekombinanten DNA-Molekül um einen bifunktionellen Vektor gemäß einem der Ansprüche 33 bis 47 handelt.

69. Verwendung von B. thuringiensis und/oder B. cereus, dadurch gekennzeichnet, daß sie als gener ;lle Wirtsorganismen für die Klonierung und Expression homologer sowie insbesondere auch heterologer DNA oder einer Kombination aus homologer und heterologer DNA eingesetzt werden.