DE69227911T2

DE69227911T2 - Neuer mikroorganismus und insektizid

Info

Publication number: DE69227911T2
Application number: DE69227911T
Authority: DE
Inventors: Shouji Ushiku City Ibaraki 300-12 Asano; Hidetaka Fujisawa City Kanagawa 251 Hori; Hidenori Machida City Tokyo 194-01 Iwahana; Tadaaki Ushiku City Ibaraki 300-12 Kawasugi; Katsutoshi Ryuugasaki City Ibaraki 30101 Ogiwara; Michio Fukuoka City Fukuoka 812 Ohba; Kazunobu Ryuugasaki City Ibaraki 301 1 Sakanaka; Ryoichi Koganei Koumuin Juutaku Kohanei City Tokyo 184 Sato; Nobukazu Ryuugasaki City Ibaraki 301 Suzuki
Original assignee: Kubota Corp; Mycogen Corp
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1991-08-02
Filing date: 1992-07-31
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2012-08-01
Also published as: CA2112676A1; IL102712A0; CA2112676C; AU675628B2; US5747450A; ES2124738T3; AU2411692A; WO1993003154A1; DE69227911D1; EP0602064B1; ATE174626T1; EP0602064A1; IL102712A; US5824878A; KR100241117B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung. Diese Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus, der zu Bacillus thuringiensis Serovar japonensis gehört, ein Insektizid, das von diesem neuen Mikroorganismus stammt und DNA, die für das Insektizid kodiert.
Beschreibung des Standes der Technik. Das berichtete Aktivitätsspektrum von B.t. umfaßt Insektenspezies innerhalb der Ordnung Lepidoptera, von denen viele Hauptschädlinge in der Land- und Forstwirtschaft sind. Das Aktivitätsspektrum umfaßt auch die Insektenordnung Diptera, welche Moskitos und Kriebelmücken einschließt. Siehe Couch, T. L. (1980) "Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis Var. israelensis", Developments in Industrial Microbiology 22: 61-76; Beegle, C. C., (1978) "Use of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems", Developments in Industrial Microbiology 20: 97-104. Krieg et al. (1983) Z. ang. Ent. 96: 500-508, beschreiben ein B.t.-Isolat mit der Bezeichnung Bacillus thuringiensis Var. tenebrionis, welches Berichten nach Aktivität gegen zwei Käfer in der Ordnung Coleoptera aufweist. Diese sind der Colorado-Kartoffelkäfer, Leptinotarsa decemlineata, und Agelastica alni.
In der europäischen Patentanmeldung 0 202 739 wird ein neues B.t.-Isolat mit Aktivität gegen Coleoptera offenbart. Es ist bekannt als B. thuringiensis Var. san diego (B.t.s.d.). Das US-Patent Nr. 4,966,765 offenbart das gegen Coleoptera aktive Bacillus thuringiensis-Isolat B.t. PS86B1. Die europäische Patentanmeldung 0 337 604 offenbart ebenfalls ein neues B.t.-Isolat mit Aktivität gegen Coleoptera.
Gegen Coleoptera aktive B.t.-Stämme können zur Bekämpfung von blattfressenden Käfern eingesetzt werden. Beispielsweise ist der Colorado-Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) empfänglich für das Delta-Endotoxin von B.t.s.d. und die Larven werden nach Aufnahme einer ausreichenden Dosis einer Sporen/Kristall-Präparation auf behandeltem Blattwerk getötet. Stamm-Zellen von Bacillus thuringiensis Serovar japonensis erzeugen bekanntermaßen insektizide Proteine, welche Lepidoptera-Larven abtöten. Es ist jedoch von keinen Zellen eines japonensis-Stammes bekannt, daß sie andere Toxinproteine erzeugen als die insektiziden Proteine, welche Lepidoptera-Larven töten. Somit standen solche Zellen für eine Verwendung als Insektizid, um andere Insekten als Lepidoptera zu töten, nicht zur Verfügung. Ferner besitzen Bacillus thuringiensis san diego und Bacillus thuringiensis tenebrionis keine insektizide Wirkung auf Larven von Anomala cuprea Hope, welche für Brennholz, Taro, Süßkartoffel, Erdnuß und dgl. sehr schädigend sind.
Die Erfinder fanden einen neuen Typ von Mikroorganismus, zu Bacillus thuringiensis Serovar japonensis gehörig, welcher insektizide Proteine erzeugt, um Coleoptera-Larven statt Lepidoptera-Larven abzutöten.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Bacillus thuringiensis (B.t.)-Isolat. Das neue B.t.-Isolat, bekannt als Bacillus thuringiensis Serovar japonensis-Stamm Buibui (im folgenden als "B.t. Buibui" bezeichnet) wurde befunden, Aktivität gegen Coleoptera-Schädlinge einschließlich des Japankäfers aufzuweisen. Ein neues Delta-Endotoxingen der Erfindung kodiert für ein Protein von 130 kDa. Die Nukleotidsequenz dieses Gens ist in SEQ-ID-Nr. 1 dargestellt. Die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Toxins ist in SEQ-ID-Nr. 2 dargestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Varianten von B.t. Buibui, welche im wesentlichen dieselben pestiziden Eigenschaften wie B.t. Buibui aufweisen. Diese Varianten würden Mutanten einschließen. Verfahren zur Herstellung von Mutanten sind in der Mikrobiologie wohlbekannt. UV-Licht und Nitrosoguanidin werden für diesen Zweck in großem Umfang eingesetzt.
Ferner umfaßt die Erfindung auch die Behandlung von im wesentlichen intakten B.t.-Zellen und rekombinanten Zellen, die ein Gen der Erfindung enthalten, um die pestizide Aktivität zu verlängern, wenn die im wesentlichen intakten Zellen in der Umwelt eines Zielschädlings ausgebracht werden. Eine solche Behandlung kann durch chemische oder physikalische Mittel oder durch eine Kombination von chemischen oder physikalischen Mitteln erfolgen, solange sich die Technik nicht nachteilig auf die Eigenschaften des Pestizids auswirkt oder die Fähigkeit der Zelle zum Schutz des Pestizids eliminiert. Die behandelte Zelle dient als Schutzhülle für das pestizide Toxin. Das Toxin wird nach Aufnahme durch ein Zielinsekt verfügbar, um als solches zu wirken.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die Wachstumskurven von B.t. Buibui zeigt. Die durch Ausbreiten der Zellen in den folgenden Agar-Kulturmedien der Petrischale erzeugte Kolonienzahl wird gemessen. - -LB-Medium; - -NB-Medium; -Δ-NYS-Medium.
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, die Wachstumskurven von B.t. Buibui zeigt. Die Zunahme der Zellanzahl wird durch die Absorptionserhöhung der Medien bei 660 nm angezeigt. - -LB-Medium; - -NB-Medium; -Δ-NYS-Medium.
Fig. 3 ist eine Photographie, die Kolonien von B.t. Buibui im LB- Kulturmedium zeigt. Die Kulturen des Buibui-Stammes wurden in dem LB-Agar- Kulturmedium 72 Stunden lang kultiviert, nachdem sie 8 Stunden lang in dem LB- Kulturmedium kultiviert worden waren.
Fig. 4 ist eine Photographie, die Kolonien von B.t. Buibui in verschiedenen Kulturmedien zeigt. Die Kulturen des Buibui-Stammes wurden in den jeweiligen Agar-Kulturmedien 72 Stunden lang kultiviert, nachdem sie in den LB-, NB- und NYS-Kulturmedien 8 Stunden und 14 Stunden lang gezüchtet worden waren.
Fig. 5 ist eine Photographie des japonensis-Stammes, die mit einem Rasterelektronenmikroskop aufgenommen wurde. Die dunklen Pfeile zeigen Kristalle von Toxinproteinen. Die elliptischen Elemente mit gefurchten Oberflächen sind Sporen.
Fig. 6 ist eine Photographie von B.t. Buibui, die mit dem Rasterelektronenmikroskop aufgenommen wurde. Die dunklen Pfeile zeigen Kristalle von Toxinproteinen. Die elliptischen Elemente mit gefurchten Oberflächen sind Sporen.
Fig. 7 ist eine Photographie, die eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese zeigt. Spur 1 ist ein Molekulargewichtsmarker. Spur 2 zeigt Toxinproteine, die von dem japonensis-Stamm produziert werden (5 ul). Spur 3 zeigt Toxinproteine, die von dem japonensis-Stamm produziert werden (10 ul). Spur 4 zeigt Toxinproteine, die von dem japonensis-Stamm produziert werden (15 ul). Spur 5 zeigt Toxinproteine, die von dem japonensis-Stamm produziert werden (20 ul). Spur 6 zeigt Toxinproteine, die von dem Buibui-Stamm produziert werden (5 ul). Spur 7 zeigt Toxinproteine, die von dem Buibui-Stamm produziert werden (10 ul). Spur 8 zeigt Toxinproteine, die von dem Buibui-Stamm produziert werden (5 ul). Spur 9 ist ein Molekulargewichtsmarker.
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung, die zeitabhängige Sterblichkeitskurven von Larven von Anomala cuprea Hope zeigt. - 12,5 ug/ml; ---- 1,25 ug/ml; ····· 0,125 pg/ml; ug/ml; -- Kontrolle.

Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ-ID-Nr. 1 ist die zusammengestellte Nukleotid- und Aminosäuresequenz des neuen Gens der Erfindung.
SEQ-ID-Nr. 2 ist die vorausgesagte Aminosäuresequenz des Toxins.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

1 Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Stamm von Bacillus thuringiensis, der die sehr vorteilhafte Eigenschaft aufweist, mindestens ein Endotoxin zu exprimieren, welches für Coleoptera toxisch ist. Der neue Mikroorganismus erhielt die Bezeichnung Bacillus thuringiensis Serovar japonensis Stamm Buibui (im folgenden als "B.t. Buibui" bezeichnet). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein insektizides Toxin, welches aus B.t. Buibui erhältlich ist, sowie DNA, die für das Insektizid kodiert. Ebenfalls offenbart und beansprucht sind andere Mikroorganismen als Bacillus thuringiensis, welche mit B.t. Buibui-DNA transformiert wurden, so daß die transformierten Mikroorganismen ein gegen Coleoptera aktives Toxin exprimieren. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Toxins der vorliegenden Erfindung oder eines transformierten Wirts, der ein Toxin exprimiert, um Coleoptera-Schädlinge zu bekämpfen. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Pflanzen, welche mit einer B.t. Buibui-DNA, die für ein Toxin mit Aktivität gegen Coleoptera-Schädlinge kodiert, transformiert wurden.
Neue Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung wurden international gemäß dem Budapester Vertrag beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry hinterlegt, welches eine anerkannte internationale Hinterlegungseinrichtung ist.
Die vorliegenden Kulturhinterlegungen werden für die Öffentlichkeit gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Hinterlegung von Mikroorganismen gelagert und verfügbar gemacht werden, d. h. sie werden mit aller erforderlichen Sorgfalt gelagert werden, um sie für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren nach der letzten Anforderung zur Freigabe einer Probe einer Hinterlegung lebensfähig und unkontaminiert zu halten, und in jedem Fall für einen Zeitraum von mindestens dreißig (30) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Lebensdauer eines jeden Patents, welches unter Offenbarung der Kulturen erteilt werden mag. Der Hinterleger erkennt die Pflicht zum Ersatz der Hinterlegungen an, sollte die Hinterlegungsstelle aufgrund des Zustands der Hinterlegungen nicht imstande sein, auf Anforderung eine Probe zur Verfügung zu stellen. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Verfügbarkeit der vorliegenden Kulturhinterlegungen für die Öffentlichkeit werden nach Erteilung eines Patents, welches diese offenbart, unwiderruflich aufgehoben.
Die Erfindung umfaßt auch Varianten der vorliegenden Isolate, welche Varianten Gene aufweisen, die für einen Teil oder die Gesamtheit eines Toxins der Erfindung mit im wesentlichen derselben insektiziden Aktivität wie B.t. Buibui kodieren. Solche mikrobiellen Varianten können isoliert werden oder können nach Techniken hergestellt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Beispielsweise kann UV-Bestrahlung eingesetzt werden, um Varianten von Mikroorganismen herzustellen. Gleichermaßen können solche Varianten asporogene Wirtszellen einschließen, die ebenfalls nach im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden können. Beispielsweise kann eine asporogene Mutante durch Ethylmethansulfonat(EMS)-Mutagenese eines neuen Isolats erhalten werden. Ein kleiner Prozentsatz der asporogenen Mutanten wird intakt bleiben und über längere Fermentationszeiträume nicht lysieren; diese Stämme werden als Lysis-minus bezeichnet (-). Lysis-minus-Stämme können identifiziert werden, indem asporogene Mutanten in Schüttelkolbenmedien gescreent und diejenigen Mutanten ausgewählt werden, die bei Fermentationsende noch intakt sind und Toxinkristalle enthalten. Lysis-minus-Stämme sind für ein Zellfixierungsverfahren geeignet, das ein geschütztes verkapseltes Toxinprotein ergeben wird.
Zur Herstellung einer Phagen-resistenten Variante der genannten asporogenen Mutante wird ein Aliquot des Phagen-Lysats auf Nähragar ausgebreitet und trocknen gelassen. Ein Aliquot des Phagen-sensitiven Bakterienstamms wird dann direkt über dem getrockneten Lysat ausplattiert und trocknen gelassen. Die Platten werden bei 30ºC inkubiert. Die Platten werden 2 Tage lang inkubiert und zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum von zahlreichen Kolonien auf dem Agar sichtbar. Einige dieser Kolonien werden gepickt und auf Nähragar-Platten subkultiviert. Diese anscheinend resistenten Kulturen werden auf Resistenz durch Überkreuz- Ausstreichen mit dem Phagen-Lysat getestet. Eine Linie des Phagen-Lysats wird auf der Platte ausgestrichen und trocknen gelassen. Die mutmaßlich resistenten Kulturen werden dann quer über die Phagenlinie ausgestrichen. Resistente Bakterienkulturen zeigen nach einer Inkubation über Nacht bei 30ºC im Ausstrich quer über die Phagenlinie nirgends Lysis. Die Phagen-Resistenz wird dann bestätigt, indem ein Rasen der resistenten Kultur auf eine Nähragar-Platte ausplattiert wird. Der sensitive Stamm wird auf dieselbe Weise ebenfalls ausplattiert, um als positive Kontrolle zu dienen. Nach dem Trocknen wird ein Tropfen des Phagen-Lysats im Zentrum der Platte ausplattiert und trocknen gelassen. Resistente Kolonien zeigten nach 24-stündiger Inkubation bei 30ºC keine Lysis in dem Gebiet, wo das Phagen- Lysat plaziert worden war.
Die Varianten können auch unter Verwendung von UV-Licht und Nitrosoguanidin nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
Der neue Mikroorganismus B.t. Buibui, als speziell erläutertes Beispiel der vorliegenden Erfindung, weist die folgenden charakteristischen Eigenschaften auf:
1. Wachstum in verschiedenen Kulturmedien. Dieser Mikroorganismus kann in allen Mediumtypen gezüchtet werden, welche zur Kultivierung üblicher Bakterien eingesetzt werden, und die Toxinproteine können darin produziert werden. Wie in den Fig. 1 und 2 gezeigt, zeigten die Mikroorganismen normale Wachstumsmuster in typischen Kulturmedien wie NYS, L-Bouillon und Bouillon- Medium. D. h., die Zellanzahl begann nach dem Verstreichen mehrerer Stunden logarithmisch zuzunehmen und die Zunahme endete nach dem Verstreichen von 24 Stunden. Toxine traten kurz nach der Erhöhung der Zellanzahl auf. Die Menge an Toxinen, bei Messung in der Hauptbande von 130 kDa, betrug 200 bis 300 ug/ml Medium.
2. Morphologische Eigenschaften. Wie in den Fig. 3 und 4 gezeigt, weisen die gebildeten Kolonien auf einem Agarmedium Oberflächenglanz auf und breiten sich auf den Agaroberflächen ohne Aufwölben dünn aus. Die peripheren Reihen zeigen Charakteristiken von normalen Bacillus-Zellen. Die Farbe der Kolonien ist leicht beige.
Bei Beobachtung durch ein Rasterelektronenmikroskop zeigen Bacillus thuringiensis Serovar japonensis und Bacillus thuringiensis Serovar japonensis Stamm Buibui beide sphärische Kristallproteine. Diese unterscheiden sich von den bipyramidalen Kristallen, die gewöhnlich bei anderen B.t.-Zellen beobachtet werden, die tödlich für Lepidoptera-Larven sind.
3. Biochemisches Erscheinungsbild. Die folgenden Tests wurden durchgeführt, um die biochemischen Eigenschaften von B.t. Buibui im Vergleich zu üblichen japonensis-Stämmen zu bewerten:
Test 1. Serotypen-Bestimmung unter Verwendung von Antikörpern, die gegen Geißelantigene erzeugt wurden; dies ist ein Verfahren zur Identifizierung eines unbekannten Organismus durch Verwendung eines Antikörpers, der Aktivität gegen die Geißelproteine von Bacillus-Organismen besitzt, und Einsatz einer Antigen-Antikörper-Reaktion, worin die Geißelproteine des unbekannten Organismus als die Antigene wirken. Der japonensis-Stamm ist eine Subspezies, die als H23-Typ klassifiziert und identifiziert wurde (J. Invertebr. Pathol. 32: 303-309, 1978; J. Invertebr. Pathol. 48: 129-130, 1986). B.t. Buibui kann mit dem H-Antigen des japonensis-Stammes reagieren. Diese Eigenschaft ist serologisch äquivalent zu derjenigen des japonensis-Stammes. Somit gehört B.t. Buibui taxonomisch zur selben Subspezies wie der japonensis-Stamm. Details dieses Tests sind wie folgt:
(1) Herstellung von Geißel-H-Serum: Es wurden vierzig bekannte Typen von H-Antigen-Standardstämmen von Bacillus thuringiensis eingesetzt. Mikroorganismen mit ausgezeichneter Mobilität wurden unter Verwendung eines Craigie-Röhrchens (0,5% halbflüssiges Agarmedium) ausgewählt und mit Formalin abgetötete Organismen präpariert. Mit diesen Organismen wurden Kaninchen immunisiert. H-Serum wurde hergestellt durch Absorption von Antikörpern, die mit Bacillus thuringiensis-Zellantigenen reagieren können, aus den jeweiligen Antiseren. Die Zellantigene wurden präpariert durch deren Erwärmung auf 100ºG und Abtrennung der Geißeln.
(2) Identifizierung von H-Antigen: Die Serum-Typen von H- Antigen wurden durch Agglutinierungsreaktionen auf Objektträger identifiziert (Ohba und Aizawa [1978] J. Invertebr. Pathol. 32: 303-309). Die Agglutinierungswerte von H-Serum wurden durch in vitro-Agglutinierungsreaktionen gemessen (Ohba und Aizawa, oben).
(3) Ergebnisse: Der japonensis-Stamm wurde bei Standardseren, die 40 bekannte Typen von Geißelantigenen einschlossen, nur speziell durch das Serum für Standardstamm-Zellen des Serovars japonensis (H- Antigen 23) agglutiniert. Der Agglutinierungswert des japonensis-H-Serums für korrespondierende Homo-Antigene war 12.800-fach und dessen Agglutinierungswert für den Stamm Buibui war 6.400-fach. Der Agglutinierungswert des B.t. Buibui H- Serums für Homo war 12.800-fach und dessen Agglutinierungswert für den japonensis-Standardstamm war 6.400-fach. So wurde festgestellt, daß die beiden Stamm-Zellen zur selben Spezies gehören.
Test 2. Insektizides Spektrum von Kristallproteinen, die von dem japonensis-Stamm und B.t. Buibui erzeugt wurden: Wie in Tabelle 1 angegeben, zeigten die von B.t. Buibui erzeugten insektiziden Proteine in einer Konzentration von 0,125 bis 12,5 ug/ml eine insektizide Wirkung auf Anomala cuprea Hope, einen Coleoptera-Angehörigen. Die insektiziden Proteine, welche von dem japonensis- Stamm erzeugt wurden, zeigten jedoch keine insektizide Wirkung, sogar in einer Konzentration von 100 ug/ml. Wie in Tabelle 2 dargestellt, zeigten die insektiziden Proteine, die von dem japonensis-Stamm erzeugt wurden, einen höheren Aktivitätsgrad gegenüber Larven von Lepidoptera wie Plutella xylostella, Adoxophyes sp. und Bombyx mori. Jedoch zeigten die insektiziden Proteine, die von B.t. Buibui erzeugt wurden, wenig oder einen sehr geringen Grad an Aktivität. Diese Ergebnisse zeigen, daß die beiden Stämme nicht als dieselben Stämme bezeichnet werden können. Darüber hinaus ist die Beobachtung von Coleoptera-Aktivität, jedoch keiner Lepidoptera-Aktivität, ziemlich überraschend und unerwartet. Tabelle 1. Insektizide Wirkungen des japonensis-Stammes und von B.t. Buibui auf Anomala cuprea Hope
* Anzahl der Proben = 20 Larven in der ersten Erscheinungsform Tabelle 2. Insektizide Aktivitäten des japonensis-Stammes und B.t. Buibui- Stammes gegenüber einigen Lepidoptera.
* Anzahl der Proben = 50 Larven in der ersten bis dritten Erscheinungsform
Test 3. Elektrophorese von insektiziden Proteinen, die in den Zellen des japonensis-Stammes und von B.t. Buibui akkumulieren: B.t. Buibui erzeugt in den Zellen sphärische kristalline Proteine, ebenso der japonensis-Stamm (Fig. 5 und 6). Die kristallinen Proteine wurden nach einem Standardverfahren (Goodman, N. S., R. J. Gottfried, M. J. Rogoff [1987] J. Bacteriol. 34: 485) aus dem Kulturmedium isoliert. Nach der Reinigung wurden die Proteine in 0,4 N Alkalilösung gelöst und durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert. Wie in Fig. 7 gezeigt, besitzt der japonensis-Stamm eine Hauptbande bei etwa 76 kDa und eine andere Bande bei 52 kDa. B.t. Buibui besitzt eine Hauptbande bei 130 kDa und andere Banden bei 52 kDa und 45 kDa. Diese Elektrophoresemuster zeigen klar, daß die beiden Typen von kristallinen Proteinen unterschiedliche Bestandteile aufweisen.
Test 4. Unterschied im Verwertungsvermögen in Kulturmedien zwischen dem japonensis-Stamm und B.t. Buibui: Wie in Tabelle 3 gezeigt, verwertet der japonensis-Stamm Glucose, Salicin und Maltose, Mannose nicht, und verwertet Cellobiose bis zu einem bestimmten Grad. B.t. Buibui kann alle diese Substanzen verwerten.
Diese Merkmale zeigen, daß B.t. Buibui serotypisch als japonensis-Stamm klassifiziert ist, aber eindeutig eine Zelle darstellt, die sich von dem japonensis- Stamm unterscheidet. Tabelle 3.
+++ = sehr gut verwertet; + = gut verwertet; +- = verwertet, - = nicht verwertet.
B.t. Buibui kann unter Verwendung bekannter Standardmedien und Fermentationstechniken in Kultur gezüchtet werden. Spezielle Beispiele von Fermentationsmedien und -techniken werden in den folgenden Beispielen gegeben. 1 Nach Vollendung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem man zuerst die B.t.-Sporen und -Kristalle von der Fermentationsbouillon durch im Stand der Technik wohlbekannte Mittel abtrennt. Die gewonnenen B.t.-Sporen und -Kristalle können als benetzbares Pulver, flüssiges Konzentrat, Granulat oder andere Formulierungen durch die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln, Dispergiermitteln, inerten Trägersubstanzen und anderen Komponenten formuliert werden, um die Handhabung und die Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern. Diese Formulierungs- und Anwendungsverfahren sind im Stand der Technik alle wohlbekannt.
DNA, welche das Toxingen von B.t. Buibui enthält, kann aus E. coli KBR9207 nach im Stand der Technik wohlbekannten Standardverfahren gereinigt werden. Das Toxingen kann aus der Plasmid-DNA durch Restriktionsenzymverdauung ausgeschnitten werden. Die vorliegende Erfindung betrifft nicht nur die spezielle DNA-Sequenz, die in SEQ-ID-Nr. 1 dargestellt ist, sondern auch Variationen dieser Sequenz, kodierend für eine Aminosäuresequenz mit Aktivitätseigenschaften gegenüber Coleoptera wie das Toxin, welches von B.t. Buibui produziert wird. Es steht zu erwarten, daß diese DNA-Sequenzen einen hohen Homologiegrad aufweisen werden und beispielsweise miteinander und/oder gemeinsamen Sonden oder Primern unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren werden. Gleichermaßen betrifft die vorliegende Erfindung nicht nur das Protein mit der in der SEQ-ID- Nr. 2 dargestellten Aminosäuresequenz, sondern auch äquivalente Toxine mit der gleichen oder ähnlichen biologischen Aktivität wie das Toxin, das in SEQ-ID-Nr. 2 dargestellt ist. Diese äquivalenten Toxine können Aminosäure-Homologie zu dem hier offenbarten und beanspruchten Toxin aufweisen. Diese Aminosäure-Homologie wird typischerweise größer als 50%, vorzugsweise größer als 75%, und am meisten bevorzugt größer als 90% sein. Die Aminosäure-Homologie wird am höchsten in bestimmten kritischen Bereichen des Toxins sein, welche die biologische Aktivität ausmachen oder an der Festlegung der dreidimensionalen Konfiguration beteiligt sind, welche letztlich für die biologische Aktivität verantwortlich ist. In dieser Hinsicht sind bestimmte Aminosäuresubstitutionen annehmbar und zu erwarten, wenn diese Substitutionen in Bereichen vorliegen, welche für die Aktivität nicht kritisch sind oder konservative Aminosäuresubstitutionen sind, welche die dreidimensionale Konfiguration des Moleküls nicht beeinträchtigen. Beispielsweise können Aminosäuren in die folgenden Klassen eingeordnet werden: nicht-polar, ungeladen polar, basisch und sauer. Konservative Substitutionen, wodurch eine Aminosäure einer Klasse durch eine andere Aminosäure derselben Klasse ersetzt wird, werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt, solange die Substitution die biologische Aktivität der Verbindung nicht wesentlich ändert. Tabelle 4 bietet eine Auflistung von Beispielen von Aminosäuren, die zu jeder Klasse gehören.

Tabelle 4

Aminosäureklasse Beispiele von Aminosäuren
nicht polar Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
ungeladen polar Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln
sauer Asp, Glu
basisch Lys, Arg, His
In einigen Fällen können auch nicht-konservative Substitutionen durchgeführt werden. Der kritische Faktor ist, daß diese Substitutionen die biologische Aktivität des Toxins nicht wesentlich vermindern dürfen.
Die Gene und Toxine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen nicht nur die hier offenbarten vollständigen Sequenzen, sondern auch Fragmente dieser Sequenzen oder Fusionsproteine, welche die charakteristische Coleoptera-Aktivität der Toxine, die hier speziell erläutert werden, behalten.
Für einen Fachmann auf diesem Gebiet sollte ersichtlich sein, daß Gene, die für gegen Coleoptera aktive Toxine kodieren, auf verschiedene Weise identifiziert und erhalten werden können. Die spezifischen Gene können von einer Kulturhinterlegung wie hier offenbart erhalten werden. Alternativ können diese Gene oder Teile davon synthetisch konstruiert werden, z. B. unter Verwendung einer Genmaschine. Variationen dieser Gene können ohne weiteres unter Anwendung von Standardtechniken zur Erzeugung von Punktmutationen konstruiert werden. Ebenso können Fragmente dieser Gene unter Verwendung von im Handel erhältlichen Exonukleasen oder Endonukleasen nach Standardverfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Enzyme wie Ba/31 oder stellengerichtete Mutagenese eingesetzt werden, um systematisch Nukleotide von den Enden dieser Gene abzuschneiden. Ebenfalls können Gene, welche für aktive Fragmente kodieren, unter Verwendung einer Vielzahl anderer Restriktionsenzyme erhalten werden. Proteasen können eingesetzt werden, um direkt aktive Fragmente dieser Toxine zu erhalten.
DNA der vorliegenden Erfindung, welche für ein gegen Coleoptera aktives Toxin kodiert, kann in eine große Vielfalt von mikrobiellen und Pflanzen-Wirten eingeführt werden. Die Expression der DNA resultiert direkt oder indirekt in der Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Bei geeigneten Wirten, z. B. Pseudomonas, können die Mikroorganismen auf den Aufenthaltsort der Coleoptera- Insekten aufgebracht werden, wo sie sich vermehren und von den Insekten aufgenommen werden. Das Ergebnis ist eine Kontrolle der unerwünschten Insekten. Als Alternative kann ein Mikroorganismus, der die für das Toxin kodierende DNA beherbergt, unter Bedingungen behandelt werden, welche die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins verlängern. Die behandelte Zelle kann dann in der Umwelt eines Zielschädlings oder von Zielschädlingen ausgebracht werden. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des B.t.-Toxins.
Wenn die für das B.t.-Toxin kodierende DNA mittels eines geeigneten Vektors in einen mikrobiellen Wirt eingeführt wird und der Wirt in der Umwelt in lebendem Zustand ausgebracht wird, ist es essentiell, daß bestimmte Wirts-Mikroorganismen verwendet werden. Es werden Mikroorganismus-Wirte ausgewählt, von denen bekannt ist, daß sie die "Phytosphäre" (Phyllooberfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizooberfläche) einer oder mehrerer interessierende(n)r Erntepflanze(n) bewohnen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, daß sie imstande sind, in der besonderen Umwelt (Erntepflanze und andere Insekten-Habitate) erfolgreich mit den Wildtyp-Mikroorganismen in Wettbewerb zu stehen, für stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, welches das Polypeptid-Pestizid exprimiert, und wünschenswerterweise für verbesserten Schutz des Pestizids vor umweltbedingten Abbau und Inaktivierung sorgen.
Von einer großen Anzahl von Mikroorganismen ist bekannt, daß sie die Phyllooberfläche (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (den Boden in der Umgebung von Pflanzenwurzeln) einer großen Vielfalt von wichtigen Erntepflanzen bewohnen. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z. B. der Gattungen Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebstella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Mefhylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconosfoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z. B. der Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienspezies der Phytosphäre wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodopseudomas spheroides, Xanfhomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azofobacter vinlandil; und Hefespezies der Phytosphäre wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentü, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Eureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Eine große Vielfalt von Wegen sind zur Einführung der B.t.-DNA, welche das Toxin exprimiert, in den Mikroorganismus-Wirt unter Bedingungen verfügbar, welche die stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens erlauben. Diese Verfahren sind wohlbekannt und von Fachleuten ohne weiteres durchzuführen. Die Transformanten können auf üblichen Wegen isoliert werden, gewöhnlich unter Einsatz einer Selektionstechnik, welche die Selektion des gewünschten Organismus gegenüber unmodifizierten Organismen oder übertragenden Organismen, falls diese anwesend sind, ermöglicht. Die Transformanten können dann auf Pestizid-Aktivität getestet werden.
Die B.t.-Zellen können vor der Formulierung behandelt werden, um die pestizide Aktivität zu verlängern, wenn die Zellen in der Umwelt eines Zielschädlings ausgebracht werden. Eine solche Behandlung kann auf chemische oder physikalische Weise oder mit einer Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, solange sich die Methode nicht schädlich auf die Eigenschaften des Pestizids auswirkt oder die zelluläre Fähigkeit zum Schutz des Pestizids nicht verringert. Beispiele chemischer Reagenzien sind Halogenierungs- mittel, insbesondere Halogene der Atomzahl Nr. 17-80. Spezieller kann Iod unter milden Bedingungen und für eine ausreichende Zeit, um die gewünschten Resultate zu erreichen, eingesetzt werden. Andere geeignete Techniken beinhalten die Behandlung mit Aldehyden, z. B. Formaldehyd und Glutaraldehyd; Anti- Infektionsmitteln, z. B. Zephiran-Chlorid; Alkoholen wie Isopropanol und Ethanol; verschiedenen histologischen Fixativen wie Bouin's Fixativ und Helly's Fixativ (siehe: Humason, Gretchen, L. Animal Tissue Techniques, W. H. Freeman und Company, 1967); oder eine Kombination von physikalischen (Wärme) und chemischen Agentien, welche die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins verlängern, wenn die Zelle in der Umwelt des Zielschädlings oder der Zielschädlinge ausgebracht wird. Beispiele physikalischer Mittel sind Strahlung kurzer Wellenlänge, z. B. Gamma- Strahlung und Röntgenstrahlung, Einfrieren, UV-Bestrahlung, Lyophilisierung und dgl. Die Zellen werden gewöhnlich intakt sein und im wesentlichen in der Vermehrungsform vorliegen, wenn sie behandelt sind, eher als in einer Sporenform, obwohl in einigen Fällen Sporen eingesetzt werden können.
Die Zellen werden im allgemeinen erhöhte Strukturstabilität aufweisen, welche die Resistenz gegenüber Umweltbedingungen erhöht. Wenn das Pestizid in einer Proform vorliegt, sollte das Verfahren zur Inaktivierung so gewählt werden, daß das Processing der Proform zur reifen Form des Pestizids durch das Zielschädlingspathogen nicht behindert wird. Beispielsweise wird Formaldehyd Proteine vernetzen und könnte das Processing der Proform eines Polypeptid-Pestizids verhindern. Das Verfahren zur Inaktivierung oder Abtötung hält mindestens einen wesentlichen Teil der Bioverfügbarkeit oder Bioaktivität des Toxins aufrecht.
Der zelluläre Wirt, das das insektizide B.t.-Gen enthält, kann in jedem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, worin das DNA-Konstrukt einen Selektionsvorteil bietet, vorausgesetzt, es ist ein selektives Medium, so daß im wesentlichen alle oder alle Zellen das B.t.-Gen enthalten. Diese Zellen können dann nach üblichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor der Ernte behandelt werden.
Die B.t.- oder transformierten Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulat oder Staub, durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, z. B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (gepulverten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittel beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agentien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
Ein weiterer Weg, der eingeschlagen werden kann, ist die Inkorporation der Sporen und Kristalle von B.t. Buibui in Ködergranulat, das ein Lockmittel enthält, und die Ausbringung dieses Granulats auf den Boden zur Bekämpfung von bodenbewohnenden Coleoptera. Formulierte B.t. Buibui können auch als Samenüberzug oder Wurzelbehandlung oder Behandlung der Gesamtpflanze eingesetzt werden.
Die Pestizidkonzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Pestizid wird in mindestens 1 Gew.- % vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen werden etwa 1-95 Gew.-% des Pestizids enthalten, während die flüssigen Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Diese Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
Die Formulierungen können in der Umwelt des oder der Coleoptera- Schädlinge(s), z. B. Pflanzen, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1 - Züchtung von B.t. Buibui

Eine Subkultur von B.t. Buibui kann zur Animpfung des folgenden Mediums, eines Mediums mit Pepton, Glucose und Salzen, verwendet werden.
Bacto-Pepton 7,5 g/l
Glucose 1,0 g/l
KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
Salzlösung 5,0 ml/l
CaCl&sub2;-Lösung 5,0 ml/l
Salzlösung (100 ml)
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 2,46 g
MnSO&sub4; · H&sub2;O 0,04 g
ZnSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,28 g
FeSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,40 g
CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
CaCl&sub2; · 2H&sub2;O 3,66 g
pH 7,2
Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden Filter-sterilisiert und zur autoklavierten und gekochten Bouillon zum Animpfungszeitpunkt zugegeben. Die Kolben werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM 64 h lang inkubiert.
Das obige Verfahren kann ohne weiteres nach im Stand der Technik bekannten Verfahren auf große Fermenter maßstäblich übertragen werden.
Die B.t.-Spuren und -Kristalle, die bei der obigen Fermentation erhalten werden, können nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig verwendetes Verfahren besteht darin, die geerntete Fermentationsbouillon Trennungstechniken, z. B. Zentrifugation, zu unterwerfen.

BEISPIEL 2 - Weitere Verfahren zur Züchtung von B.t. Buibui

B.t. Buibui. wächst leicht in Kulturmedien, die üblicherweise zur Kultivierung von Bakterien eingesetzt werden, z. B. L-Bouillon, Nährbouillon und dgl., und erzeugt Sporen und kristalline Proteine. Die Erfinder haben hochproduktive Medien zur Züchtung von B.t. Buibui durchgetestet, um insektizide Bestandteile einschließlich der kristallinen Proteine zu produzieren.
Zuerst wurde ein Agarmedium auf einer 9 cm-Petrischale mit 3, 3 · 10&sup5; Sporen angeimpft. Die in 10 Tagen produzierten kristallinen Proteine wurden mit einem Mikroskop beobachtet. Ein Medium, bei dem MnSO&sub4; (10-#M) zu L-Bouillon zugesetzt worden war, war am produktivsten, wobei die Reihenfolge der Produktivität wie folgt war:
L-Bouillon + MnSO&sub4; > Spizizen + Aminosäure > L-Bouillon > PGSM > Spizizen + Casaminosäure + Vitamin > Spizizen + Casaminosäure > NYS > NYS + Casaminosäure.
Die jeweiligen Medien besitzen die folgenden Zusammensetzungen:
L-Bouillon: 10 g Tryptose, 5 g Hefeextrakt und 5 g Tafelsalz, alle pro Liter, und pH = 7,18 bis 7,2.
Spizizen: 14 g Kalium-1-hydrogenphosphat (K&sub2;H), 6 g Kalium-2- Hydrogenphosphat (KH&sub2;PO&sub4;), 2 g Ammoniumsulfat, 0,2 g Magnesiumsulfat, 1 g Natriumcitrat und 5 g Glucose, alle pro Liter, und pH = 7,0.
NYS: 1,25 g Nährbouillon, 1,25 g Trypton, 0,5 g Hefeextrakt, 10,3 g Calciumchlorid, 20,35 g Magnesiumchlorid, 1,0 g Manganchlorid, 0,02 g Eisensulfat und 0,02 g Zinksulfat, alle pro Liter, und pH = 7,2.
NYS + Casaminosäure: 2,0 g Casaminosäure, zugegeben zu dem obigen NYS-Medium, und pH = 2.
Bei der Herstellung eines Insektizids unter Verwendung der insektiziden kristallinen Proteine, welche von den vorliegenden Zellen erzeugt werden und gegen Coleoptera-Larven wirksam sind, werden als nächstes die erfindungsgemäßen Mikroorganismen in den verschiedenen oben aufgeführten Medien kultiviert oder in festen Medien wie Fischmehl, Sojabohnenpulver und dgl. oder in Abfällen aus der Stärke- oder Zuckerverarbeitung wie Maisstärkesirup und Maisquellwasser. Die Zellen, die nach den verschiedenen obigen Verfahren kultiviert wurden, werden zu cremiger Form konzentriert. Diese wird angemessen mit Wasser oder dgl. verdünnt, um als Insektizid versprüht zu werden. Ein Antiseptikum, Streckmittel oder dgl. kann nach einem üblichen Verfahren in die cremige Substanz eingemischt werden. Die cremige Substanz kann anschließend mit Hilfe eines Sprühtrockners zu Pulverform reduziert werden.
Das obige Verfahren verwendet die Zellen selbst, welche die Toxinproteine produzieren. Es können jedoch nach Kultivierung der Zellen bis zur Autolyse nur die kristallinen Proteine eingesetzt werden. Das so erhaltene Produkt wird als Zellpräparation lebensfähiger Mikroorganismen eingesetzt, da die Zellen Sporen produzieren. Die Toxinproteine, welche von diesen Zellen produziert werden, zeigen keine Toxizität gegenüber Bombyx mori. So ist die Verwendung der Zellpräparation lebensfähiger Mikroorganismen mit Sporen für eine Seidenkultur keineswegs schädigend. Ferner können die Sporen mit einer geeigneten Verbindung abgetötet werden, um als Zellpräparation abgetöteter Mikroorganismen eingesetzt zu werden.
Ein Verfahren zum Versprühen der obigen Präparation wird anschließend beschrieben. Die zu tötenden Coleoptera-Larven leben gewöhnlich im Boden. So kann das Insektizid, welches die vorliegenden Zellen als wirksamen Bestandteil aufweist, in den Boden gesprüht werden oder kann zusammen mit Lauberde ausgestreut werden, wobei sofort eine Mischvorgang mit einem Kultivator oder dgl. folgt. Eine Suspension des obigen Insektizids kann direkt mit Hilfe eines automatischen oder eines manuellen Injektors oder dgl. in den Boden injiziert werden. Für diesen Zweck kann ein vollautomatischer Injektor auf einem Kultivator installiert sein.

BEISPIEL 3 - Insektizide Wirkung von B.t. Buibui gegenüber Anomala cuprea Hope, einem Coleoptera-Angehörigen

Wie oben festgestellt, zeigt der Buibui-Stamm gegenüber Anomala cuprea Hope ein sehr hohes Maß an insektizider Aktivität, die bisher nicht berichtet wurde. Die insektizide Aktivität von B.t. Buibui wurde getestet unter Verwendung von Larven von Anomala cuprea Hope in der ersten bis dritten Erscheinungsform.
Die Aktivität wurde wie folgt bestimmt: 2 ml Wasser mit insektiziden Bestandteilen wurden zu 2 g trockener Lauberde zugegeben. Die Mischung wurde in einen Plastikbecher gebracht. Die Larven wurden dann hintereinander plaziert und darin für einen vorbestimmten Zeitraum gehalten.
Die insektiziden Bestandteile umfaßten eine Kulturlösung des Buibui- Stammes (d. h. eine Lösung, die Zellen des Buibui-Stammes enthielt) und aus der Kulturlösung isolierte und gereinigte kristalline Toxinproteine. Die insektizide Aktivität eines jeden Bestandteils wurde getestet. Es ist anzumerken, daß die Sterblichkeitsrate die Anzahl der toten Larven geteilt durch die Gesamtzahl der Larven ist.
Fig. 8 zeigt, daß die Sterblichkeitsrate mit dem Zeitverlauf variiert, in Abhängigkeit von der Menge des insektiziden Bestandteils (Toxin), den die Kulturlösung enthält. Es ist ersichtlich, daß eine 100%ige Sterblichkeitsrate mit einer niedrigen Toxindosierung von 0,125 ug/ml und mit einer hohen Dosierung von 12,5 ug/ml erhalten wird. Es wurde jedoch festgestellt, daß es im Fall einer niedrigen Konzentration zweimal solange dauert, bis alle Larven abgetötet sind.
Der Ausdruck "Kontrolle" in Fig. 8 bedeutet Variationen, die auftreten, wenn nur Wasser ohne Toxin eingesetzt wird.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, zeigte der insektizide Bestandteil, welcher die isolierten und gereinigten kristallinen Proteine umfaßte, allein insektizide Aktivität. Keine insektizide Aktivität wurde mit 0,1 ug/ml Kristallen nachgewiesen. Es wurde jedoch eine 100%ige Sterblichkeitsrate erhalten, wenn auch langsam, wenn die Kulturlösung, die 130 kDa-Proteine mit 1 ug/ml enthielt, auf Anomala cuprea Hope wie oben angegeben aufgebracht wurde. Dies wird auf die Tatsache zurückgeführt, daß die in den Zellen vorhandenen Sporen mit den kristallinen Proteinen in Anomala cuprea Hope kooperieren, um den hohen Aktivitätsgrad zu zeigen, und nicht darauf, daß aufgrund von Denaturierung der Proteine im Verlauf der Reinigung der kristallinen Proteine Aktivität verloren geht. So kann das Insektizid die Zellen enthalten. Tabelle 5. Insektizide Aktivitäten von Kulturlösung und kristallinen Proteinen des Buibui-Stammes gegenüber Anomala cuprea Hope
* Anzahl der Proben = 20 Larven in der ersten Erscheinungsform. Die Zellen wurden in NYS kultiviert.

Beispiel 4 - Insektizide Wirkungen von B.t. Buibui auf Larven anderer Coleoptera

Wie in Tabelle 6 gezeigt, zeigte der Buibui-Stamm abgesehen von Anomala cuprea Hope auch einen höheren Grad an insektizider Aktivität gegenüber Anomala rufocuprea Motschulsky, Anomala schoenfeldti Ohaus. So steht zu erwarten, daß der B.t. Buibui-Stamm insektizide Wirkung auf Larven verschiedener anderer Minela splendens zeigt. Somit ist das Insektizid in der Anwendung nicht auf diese drei Coleptera-Typen beschränkt. Tabelle 6. Insektizide Aktivitäten von kristallinen Proteinen, die von dem Buibui-Stamm erzeugt werden, gegenüber Anomala rufocuprea Motschulsky und Anomala schoenfeldti Ohaus
Die Insekten waren mit Ausnahme der Larven in der dritten Erscheinungsform von Anomala rufocuprea Motschulsky alle Larven in der ersten Erscheinungsform. Die Kristalle wurden aus Zellen gereinigt, die in NYS kultiviert worden waren. Die Anzahl der Proben betrug 10.
Der obige Ausdruck "Kontrolle" zeigt die Ergebnisse, die erhalten werden, wenn Wasser ohne Toxin eingesetzt wird (in einem Vergleichstest).

BEISPIEL 5 - Insektizide Wirkungen auf andere Coleoptera

Die insektizide Aktivität des Buibui-Stammes wurde getestet unter Verwendung von Larven in der ersten Erscheinungsform von Anomala albopilosa, Larven in der ersten Erscheinungsform von Anomala daimiana, Larven in der ersten Erscheinungsform von Minela splendens, Larven in der ersten Erscheinungsform von Popillia japonica und Larven in der zweiten Erscheinungsform von Blitopertha orientalis. Die Proben waren junge Larven, ausgeschlüpft aus Eier von erwachsenen Exemplaren, die im Freiland gesammelt und zeitweilig in einer handelsüblichen Lauberde ausgebrütet worden waren.
Das Testverfahren war wie folgt: 1 Gramm Lauberde, getrocknet und sterilisiert in einem Trockenofen bei 160ºC für 60 Minuten, wurde in einen Becher eingewogen, der einen Deckel und eine Kapazität von etwa 30 ml besaß. Buibui- Kultur in einer vorherbestimmten Konzentration wurde in den Becher eingemischt und ausreichend gerührt und dann eine Larve hineingesetzt. Eine Vielzahl solcher Mischungen wurde hergestellt und in einer thermostatischen Kammer bei 25ºC zur Zucht gehalten. Die Sterblichkeitsrate wurde am 7., 14. und 21. Tag überprüft, um die Wirksamkeit von Buibui zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7.
Die Anzahl der Proben betrug 8 und 5 für Anomala daimiana bzw. Blitopertha orientalis und 10 für alle anderen.
Wie oben festgestellt, zeigte der Buibui-Stamm insektizide Aktivität gegenüber Anomala albopilosa, Anomala daimiana, Minela splendens, Popillia japonica und Blitopertha orientalis. Im Falle von Anomala daimiana betrug die Sterblichkeitsrate nach 21 Tagen 70%, was geringer ist als die Raten der anderen Insekten. Es wurde jedoch keine Zunahme des Gewichts beobachtet und es war offensichtlich, daß die Larven von Anomala daimiana in absehbarer Zeit sterben würden. Obwohl somit einige Verzögerungen beobachtet wurden, wird das Ende der Nahrungsaufnahme als gleichbedeutend mit Tod eingestuft. Besonders bedeutsam ist das insektizide Vermögen zur Abtötung der Japankäfer, welche ein ernstes Problem in den Vereinigten Staaten darstellen.
Nach der Bestimmung der Aktivität gegenüber mehreren Coleoptera legt die Tatsache der Aktivität gegenüber Popillia-, Minela- und Blitopertha-Spezies sowie Anomala-Spezies nahe, daß die vorliegenden Zellen in der Anwendung nicht auf die in den Tabellen 6 und 7 aufgelisteten Insekten beschränkt sind, sondern gegen eine große Vielfalt von Coleoptera-Schädlingen anwendbar sind.

BEISPIEL 6 - Aktivität von Beta-Exotoxin

Einige Bacillus-Stamm-Zellen scheiden in das Kulturmedium Beta-Exotoxin aus, welches ein Nukleotid-Derivat ist. Es besitzt eine ähnliche insektizide Wirkung wie diejenige von Toxinproteinen. Beta-Exotoxin zeigt eine teratogene Wirkung gegenüber Larven von Hausfliegen, was eine Basis zur Bewertung der Aktivität von Beta-Exotoxin bietet. Wie in Tabelle 8 dargestellt, zeigte, wenn ein Kulturüberstand von einem Medium eines Buibui-Stammes nach einem üblichen Verfahren hergestellt und gegen Hausfliegen eingesetzt wurde, der Buibui-Stamm jedoch keine Teratogenese, ihre Verpuppungsrate und Entpuppungsrate blieben unbeeinflußt. Wenn das obige Behandlungsmedium des Buibui-Stammes gegen Anomala cuprea Hope eingesetzt wurde, blieben die Larven nach dem Verstreichen von 14 Tagen am Leben, wie in Tabelle 9 gezeigt. Die Ergebnisse dieses Tests zeigen, daß die insektizide Wirkung des Buibui-Stammes auf Anomala cuprea Hope nicht von Beta-Exotoxin abhängt.
Das bedeutet, daß Beta-Exotoxin nicht in einem Ausmaß vorhanden ist, um die Testergebnisse zu beeinflussen. Tabelle 8. Wirkung von Beta-Exotoxin in Buibui-Stamm-Kulturmedium auf Hausfliegen Tabelle 9. Insektizide Wirkung des Buibui-Stamm-Kulturmediums* auf
* Das obige Buibui-Medium bedeutet das zurückbleibende Medium, nachdem die Zellen des Stammes durch Zentrifugationsabtrennung aus dem Medium entfernt wurden.

BEISPIEL 7 - Insertion eines Toxingens in Pflanzen

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist Transformation von Pflanzen mit Genen, die für ein gegen Coleoptera aktives Toxin kodieren. Die transformierten Pflanzen sind resistent gegenüber einem Angriff durch Coleoptera.
Gene, die für Toxine mit Aktivität gegen Coleoptera kodieren, wie hier offenbart, können in Pflanzenzellen mit Hilfe einer Vielfalt von Techniken eingeführt werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Beispielsweise stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, welcher die Selektion der transformierten Zellen erlaubt, umfassen, zur Präparation für die Insertion fremder Gene in höhere Pflanzen zur Verfügung. Die Vektoren umfassen beispielsweise pBR322, die pUC-Reihe, M13mp-Reihe, pACYC184, etc. Dementsprechend kann die für das B.t.-Toxin kodierende Sequenz in den Vektor an einer geeigneten Restriktionsstelle inseriert werden. Das resultierende Plasmid wird zur Transformation in E. coli eingesetzt. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektrophorese und andere biochemische/molekularbiologische Verfahren werden im allgemeinen als Analyseverfahren durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA- Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in das gleiche Plasmid oder in andere Plasmide kloniert werden. In Abhängigkeit von dem Verfahren zur Insertion gewünschter Gene in die Pflanze können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid zur Transformation der Pflanzenzelle eingesetzt, dann muß mindestens die rechte Grenze, häufig jedoch die rechte und die linke Grenze der Ti- oder Ri-Plasmid-T-DNA als flankierende Region der zu inserierenden Gene verknüpft sein.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde eingehend untersucht und ausreichend beschrieben in EP 120 516; Hoekema (1985) in: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Kapitel 5; Fraley et al., Crif. Rev. Plant Sci. 4: 1-46; und An et al. (1985) EMBO J. 4: 227-287.
Nachdem die inserierte DNA in das Genom integriert wurde, ist sie dort relativ stabil und kommt in der Regel nicht wieder heraus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. verleiht. Der individuell eingesetzte Marker sollte demgemäß die Selektion von transformierten Zellen gegenüber denjenigen Zellen erlauben, welche nicht die inserierte DNA enthalten.
Zur Insertion von DNA in eine Pflanzenwirtszelle stehen eine große Anzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T- DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Fusion, Injektion oder Elektroporation sowie andere mögliche Verfahren. Falls Agrobakterien zur Transformation eingesetzt werden, muß die zu inserierte DNA in spezielle Plasmide, nämlich entweder in einen Zwischenvektor oder in einen binären Vektor, kloniert werden. Die Zwischenvektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Das Ti- oder Ri-Plasmid enthält auch die vir-Region, die für den Transfer der T-DNA erforderlich ist. Zwischenvektoren können sich nicht selbst in Agrobakterien replizieren. Der Zwischenvektor kann in Agrobacferium tumefaciens mit Hilfe eines Helfer-Plasmids (Konjugation) überführt werden. Binäre Vektoren können sich sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien selbst replizieren. Sie umfassen ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von den Bereichen der rechten und linken T-DNA-Grenze eingerahmt sind. Sie können direkt in Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163: 181- 187). Das als Wirtszelle verwendete Agrobakterium muß ein Plasmid umfassen, das eine vir-Region trägt. Die vir-Region ist erforderlich für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle. Weitere T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen eingesetzt. Pflanzen-Explantate können zum Transfer der DNA in die Pflanzenzelle vorteilhaft mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Vollständige Pflanzen können dann aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder suspensionskultivierte Zellen) in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf die Anwesenheit der inserierten DNA getestet werden. Im Fall von Injektion und Elektroporation gibt es keine speziellen Anforderungen an die Plasmide. Es ist möglich, gewöhnliche Plasmide wie z. B. pUC-Derivate, einzusetzen.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen auf übliche Weise. Sie können Keimzellen bilden und das transformierte Merkmal oder die transformierten Merkmale auf die nachkommenden Pflanzen übertragen. Solche Pflanzen können auf übliche Weise gezüchtet und mit Pflanzen gekreuzt werden, welche dieselben transformierten Erbfaktoren besitzen oder andere Erbfaktoren. Die resultierenden Hybrid-Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

BEISPIEL 8 - Klonierung neuer B. thuringiensis-Gene in Insektenviren

Eine Anzahl von Viren infizieren bekanntermaßen Insekten. Diese Viren umfassen beispielsweise Baculoviren und Entomopockenviren. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können ant-aktive Gene, wie hier beschrieben, in das Genom des Insektenvirus eingebracht werden und so die Pathogenizität des Virus erhöhen. Verfahren zur Konstruktion von Insektenviren, welche B.t.-Toxingene umfassen, sind wohlbekannt und unschwer von Fachleuten durchzuführen. Diese Verfahren werden beispielsweise beschrieben in Merryweather et al. (Merryweather, A. T., U. Weyer, M. P. G. Harris, M. Hirst, T. Booth, R. D. Possee (1990) J. Gen. Virol. 71: 1535-1544) und Martens et al. (Martens, J. W. M., G. Honee, D. Zuidema, J. W. M. von Lent, B. Visser, J. M. Vlak (1990) Appl. Environmental Microbiol. 56(9): 2764-2770).

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Ohba, Michio
Iwahana, Hidenori
Sato, Reüchi
Suzuki, Nobukazu
Ogiwara, Katsutoshi
Sakanaka, Kazunobu
Hori, Hidetaki
Asano, Shouji
Kawasugi, Tadaaki
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neuer Mikroorganismus und Insektizid
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: David R. Saliwanchik
(B) STRASSE: 2421 N. W. 41st Street, Suite A-1
(C) STADT: Gainesville
(D) STAAT: FL
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 32606
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) Software: Patentln Release #1,0, Version #1,25
(vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Saliwanchik, David R.
(B) ZULASSUNGSNUMMER:31794
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: M/K 301
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON:904-375-8100
(B) TELEFAX:904-372-5800

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 3797 Basenpaare
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
(B) STAMM: japonensis
(C) INDIVIDUELLES ISOLAT: Buibui
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LOKALISIERUNG: 187..3636 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 2:

(1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1149 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-Nr. 2:

Claims

1. Biologisch reine Kultur von Bacillus thuringiensis mit im wesentlichen denselben Pestizid-Eigenschaften wie Bacillus thuringiensis Serovar japonensis Varietät Buibui (FERM BP-3465).

2. Nukleotidmolekül, umfassend eine Sequenz, welche für die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2 oder ein gegen Coleoptera aktives Fragment davon kodiert.

3. Nukleotidmolekül, umfassend eine Sequenz, welche für ein gegen Coleoptera aktives Toxin kodiert und mehr als 75% Homologie mit der Nukleotidsequenz von SEQ-ID-Nr. 1 aufweist.

4. Nukleotidmolekül nach Anspruch 3, welches die Nukleotidsequenz von SEQ- ID-Nr. 1 umfaßt.

5. Im wesentlichen reines, gegen Coleoptera aktives Toxin, das mehr als 75% Homologie mit der Aminosäuresequenz von SEQ-ID-Nr. 2 aufweist.

6. Im wesentlichen reines Toxin, welches die Aminosäuresequenz von SEQ-ID- Nr. 2 oder ein gegen Coleoptera aktives Fragment davon umfaßt.

7. Mikroorganismus, transformiert mit einer Nukleotidsequenz wie in Anspruch 2 oder Anspruch 3 definiert.

8. Pflanzenzelle, transformiert mit einer Nukleotidsequenz wie in Anspruch 2 oder Anspruch 3 definiert.

9. Behandelte, im wesentlichen intakte Zellen, die intrazellulär ein Toxin wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert enthalten, wobei die Zellen unter Bedingungen behandelt werden, welche die insektizide Aktivität verlängern, wenn die Zellen in der Umwelt eines Ziel-Insekts ausgebracht werden.

10. Insektizide Zusammensetzung, umfassend als aktiven Bestandteil ein Toxin wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert.

11. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 10, welche einen Mikroorganismus nach Anspruch 7 umfaßt.

12. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 10 in flüssiger versprühbarer Form, welche Bacillus thuringiensis Buibui, zu Cremeform konzentriert und mit Wasser verdünnt, umfaßt.

13. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei der Bacillus thuringiensis Buibui erhältlich ist durch Kultivierung in Medien, die NYS, L-Brühe, Bouillon-Medium, feste Medien wie Fischmehl und Sojabohnenpulver und Abfälle aus der Stärke- oder Zuckerverarbeitung wie Maisstärkesirup und Maisquellwasser einschließen.

14. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 12, welche ferner ein Antiseptikum und ein Streckmittel umfaßt.

15. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 10 in Pulverform, erhältlich durch Sprühtrocknung einer Zusammensetzung nach Anspruch 14.

16. Verfahren zur Bekämpfung von Coleoptera-Insekten, welches umfaßt, daß auf die Insekten oder in deren Umwelt ein Toxin wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert, ausgebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, welches die Ausbringung eines Mikroorganismus, der das Toxin exprimiert, umfaßt.