DE69220791T2 - Neue bacillus-thuringiensis isolate zur bekämpfung von akariden - Google Patents

Description

Querverweis auf eine verwandte Anmeldung
• Dies ist eine Continuation-in-part der Parallelanmeldung Nr. 07/693,210, eingereicht am 30. April 1991. Dies ist ebenfalls eine Continuation-in-part der Anmeldung Nr. 07/768,141, eingereicht am 30. September 1991, welche eine Continuation-in-part der Anmeldung Nr. 07/759,248, eingereicht am 13. September 1991, darstellt.
Hintergrund der Erfindung
• Der sporenbildende Mikroorganismus Bacillus thuringiensis (B.t.) erzeugt das am besten bekannte Insektentoxin. Das Toxin ist ein Protein mit der Bezeichnung δ-Endotoxin. Es wird von der sporulierenden B.t.-Zelle synthetisiert. Das Toxin wird nach der Aufnahme in seiner kristallinen Form durch anfällige Insektenlarven durch die Darmsaft-Proteasen des Insekts in biologisch aktive Einheiten überführt. Das primäre Ziel sind Insektenzellen des Darmepithels, welche schnell zerstört werden. Die Erfahrung hat gezeigt, daß die Aktivität des B.t.-Toxins so hoch ist, daß nur Nanogramm-Mengen erforderlich sind, um anfällige Insekten abzutöten.
• Das berichtete Aktivitätsspektrum von B.t. umfaßt Insektenspezies innerhalb der Ordnung Lepidoptera, welche ein größeres Insektenproblem in der Landwirtschaft und Forstwirtschaft darstellen. Das Aktivitätsspektrum umfaßt auch die Insektenordnung Diptera, in der sich Moskitos und Kriebelmücken befinden. Siehe Couch, T.L., (1980) "Mosguito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis var. israelensis, Developments in Industrial Microbiology, 22:61-67; Beegle, C.C. (1978) "Use of Entomogeneous Bacteria in Agroecosystems", Developments in Industrial Microbiology, 20:97-104.
• Das US-Patent 4,771,131 offenbart ein Toxingen, das aus einem Stamm von Bacillus thuringiensis isoliert wurde. Dieses Gen kodiert für ein Toxin, welches gegen Käfer der Ordnung Coleoptera aktiv ist.
• Es wurden Berichte veröffentlicht, welche den Einsatz von Bacillus thuringiensis-Präparaten zur Bekämpfung von Milben betreffen. Diese Publikationen sind wie folgt:
• Royalty, R.N., Hall, F.R. und Taylor, R.A.J. 1990. Effects of thuringiensin on Tetranychus urticae (Acari: Tetranychidae) mortality, fecundity, and feeding. J. Econ. Entomol. 83:792- 798.
• Neal, J.W., Lindquist, R.K., Gott, K.M. und Casey, M.L. 1987. Activity of the thermostable beta-exotoxin of Bacillus thuringiensis Berliner on Tetranychus urticae and Tetranychus cinnabarinus. J.Agric. Entomol. 4:33-40.
• Vlayen, P., Impe, G. und Van Semaille, R. 1978. Effect of a commercial preparation of Bacillus thuringiensis on the spider mite Tetranychus urticae Koch. (Acari: Tetranychidae). Mededelingen 43:471-479.
• In den obigen veröffentlichten Studien war der aktive Bestandteil in den B.t.-Präparaten beta-Exotoxin (auch Thuringiensin genannt).
• Das US-Patent Nr. 4,695,455 betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung und zum Einsatz biologischer Pestizide, wobei die Pestizide in nicht-proliferierenden Zellen verkapselt sind.
• Das US-Patent Nr. 4,849,217 betrifft B.t.-Isolate, die Aktivität gegen den Alfalfa-Rüsselkäfer aufweisen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft Bacillus thuringiensis-Isolate und -Toxine, die akarizide Eigenschaften aufweisen. Im Gegensatz zu veröffentlichten Berichten über den Einsatz von B,t.-β-Exotoxinen zur Bekämpfung von Milben exprimieren die Isolate der vorliegenden Erfindung δ-Endotoxine, welche Milben bekämpfen. Angesichts der bekannten allgemeinen Toxizität von β-Exotoxinen für Menschen und Tiere ist der Einsatz von δ-Endotoxinen sehr vorteilhaft.
• Konkreter betrifft die vorliegende Erfindung Bacillus thuringiensis Isolate mit den Bezeichnungen B.t. PS50C, B.t. PS86A1, B.t. PS69D1, B.t. PS72L1, B.t. PS75J1, B.t. PS83E5, B.t. PS45B1, B.t. PS24J, B.t. PS94R3, P.t. PS17, B.t. PS62B1 und B.t. PS74G1.
• Die B.t.-Isolate der vorliegenden Erfindung sind toxisch für die Zweifleckige Spinnenmilbe Tetranychus urticae. So können diese Isolate zur Bekämpfung dieser Milbe eingesetzt werden. Ferner können die δ-Endotoxine aus diesen B.t.-Isolaten nach Standardverfahren, z.B. Ionenaustausch, isoliert werden und nach Standardverfahren formuliert werden, um die Zweifleckige Spinnenmilbe zu bekämpfen. Diese B.t.-Isolate können auch gegen nicht-phytophage Milben wie Akarid-Schädlinge von Vieh, Geflügel und gelagerten Produkten eingesetzt werden. Ferner können das Gen oder die Gene aus den B.t.- Isolaten der Erfindung, welche(s) für das akarizide Toxin kodiert (en), aus den Isolaten kloniert und dann eingesetzt werden, um andere Wirte zu transformieren, z.B. Prokaryoten, Eukaryoten oder Pflanzen, welcher transformierte Wirt zur Bekämpfung von Milben eingesetzt werden kann oder, im Falle transgener Pflanzen, gegen Milben resistent sein kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Die FIGUREN 1, 2A und 2B sind Photographien von 12%-igen SDS- Polyacrylamidgelen, welche alkalilösliche Proteine der Isolate der Erfindung zeigen.
Kurze Beschreibung der Sequenzen
• SEQ-ID-NR. 1 offenbart die DNA von 17a.
• SEQ-ID-NR. 2 offenbart die Aminosäuresequenz des von 17a kodierten Toxins.
• SEQ-ID-NR. 3 offenbart die DNA von 17b.
• SEQ-ID-NR. 4 offenbart die Aminosäuresequenz des von 17b kodierten Toxins.
• SEQ-ID-NR. 5 ist die Nukleotidsequenz des Gens 33F2.
• SEQ-ID-NR. 6 ist die Nukleotidsequenz eines Gens von 52A1.
• SEQ-ID-NR. 7 ist die Aminosäuresequenz des Proteins, welches von dem Gen von 52A1 exprimiert wird.
• SEQ-ID-NR. 8 ist die Nukleotidsequenz eines Gens von 69D1.
• SEQ-ID-NR. 9 ist die Aminosäuresequenz des Proteins, welches von dem Gen von 69D1 exprimiert wird.
• SEQ-ID-NR, 10 ist die DNA, welche für die Aminosäuresequenz von SEQ-ID-NR. 13 kodiert.
• SEQ-ID-NR. 11 ist die Aminosäuresequenz einer Sonde, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden kann.
• SEQ-ID-NR. 12 ist die N-terminale Aminosäuresequenz von 17a.
• SEQ-ID-NR. 13 ist die N-terminale Aminosäuresequenz von 17b.
• SEQ-ID-NR. 14 ist die N-terminale Aminosäuresequenz von 52A1.
• SEQ-ID-NR. 15 ist die N-terminale Aminosäuresequenz von 69D1.
• SEQ-ID-NR. 16 ist ein von 17 abgeleitetes synthetisches Oligonukleotid.
• SEQ-ID-NR. 17 ist eine Oligonukleotid-Sonde, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz von 52A1 konstruiert wurde.
• SEQ-ID-NR. 18 ist die synthetische Oligonukleotid-Sonde mit der Bezeichnung 69D1-D.
• SEQ-ID-NR. 19 ist der Oligonukleotid-"Vorwärtsprimer" von 63B.
• SEQ-ID-NR. 20 ist der erfindungsgemäß eingesetzte reverse Komplement-Primer zu SEQ-ID-NR. 29.
• SEQ-ID-NR. 21 ist die DNA, welche für den Primer von SEQ-ID- NR. 31 kodiert.
• SEQ-ID-NR. 22 ist ein erfindungsgemäßer "Vorwärtsprimer".
• SEQ-ID-NR. 23 ist eine erfindungsgemäße Sonde.
• SEQ-ID-NR. 24 ist eine erfindungsgemäße Sonde.
• SEQ-ID-NR. 25 ist eine erfindungsgemäße Sonde.
• SEQ-ID-NR. 26 ist ein erfindungsgemäßer Vorwärtsprimer.
• SEQ-ID-NR. 27 ist die Nukleotidsequenz eines Gens von PS86A1.
• SEQ-ID-NR. 28 ist die Aminosäuresequenz des Proteins, welches von dem Gen von PS86A1 exprimiert wird.
• SEQ-ID-NR. 29 ist die Nukleotidsequenz eines Gens von PS50C.
• SEQ-ID-NR. 30 ist die Aminosäuresequenz des Proteins, welches von dem Gen von PS50C exprimiert wird.
Detaillierte Offenbarung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung betrifft B.t.-δ-Endotoxine mit akarizider Aktivität. Neben akarizider Aktivität können die Toxine der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweisen:
• 1. Ein hoher Grad an Aminosäurehomologie zu hier offenbarten spezifischen Toxinen.
• 2. Eine für das Toxin kodierende DNA-Sequenz, die mit hier offenbarten Sonden oder Genen hybridisiert.
• 3. Eine Nukleotidsequenz, die unter Verwendung von hier offenbarten Primern amplifiziert werden kann.
• 4. Immunreaktivitat mit einem Antikörper, der gegen ein spezifisches, hier offenbartes Toxin induziert wurde.
• Erfindungsgemäße Akarid-aktive Toxine werden hier konkret beispielhaft erläutert durch die Toxine, welche von den Genen mit den Bezeichnungen 17a, 17b und 69D1 kodiert werden. Nachdem diese Toxine lediglich Beispiele für die hier präsentierten Toxine darstellen, sollte es ohne weiteres ersichtlich sein, daß die vorliegende Erfindung ferner Toxine aus den anderen offenbarten Isolaten sowie äquivalente Toxine (und Nukleotidsequenzen, die für äquivalente Toxine kodieren) der konkret hier offenbarten oder beanspruchten Toxine mit derselben oder einer ähnlichen biologischen Aktivität umfaßt. Diese äquivalenten Toxine werden Aminosäurehomologie zu den hier offenbarten und beanspruchten Toxinen aufweisen. Diese Aminosäurehomologie wird typischerweise größer als 50%, vorzugsweise größer als 75%, und besonders bevorzugt größer als 90% sein. Die Aminosäurehomologie wird am höchsten in bestimmten kritischen Bereichen des Toxins sein, welche für die biologische Aktivität verantwortlich sind oder an der Bestimmung der dreidimensionalen Konfiguration beteiligt sind, welche letztlich für die biologische Aktivität verantwortlich ist. Diesbezüglich sind bestimmte Aminosäuresubstitutionen annehmbar und zu erwarten, falls diese Substitutionen in Bereichen vorliegen, welche für die Aktivität nicht kritisch sind, oder konservative Aminosäuresubstitutionen sind, welche die dreidimensionale Konfiguration des Moleküls nicht beeinflussen. Beispielsweise können Aminosäuren in die folgenden Klassen eingeordnet werden: nicht-polar, ungeladen polar, basisch und sauer. Konservative Substitutionen, wodurch eine Aminosäure einer Klasse durch eine andere Aminosäure desselben Typs ersetzt wird, werden vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfaßt, solange die Substitution die biologische Aktivität der Verbindung nicht wesentlich ändert. Tabelle 1 bietet eine Auflistung von Aminosäurebeispielen, die zu jeder Klasse gehören. TABELLE 1
• In einigen Fällen können auch nicht-konservative Substitutionen durchgeführt werden. Der kritische Faktor ist dabei, daß diese Substitutionen die biologische Aktivität des Toxins nicht signifikant vermindern dürfen. Die in den generischen Formeln der vorliegenden Erfindung präsentierte Information gibt einem Fachmann eine klare Führung zur Herstellung verschiedener Aminosäuresubstitutionen.
• Die B.t.-Isolate der Erfindung haben die folgenden Eigenschaften:
• Ferner haben die Isolate die folgenden allgemeinen Bigenschaften: Kolonien-Morphologie -- große Kolonie, matte Oberfläche, typisch für B.t.
• Vegetative Zellmorphologie -- typisch für B.t.
• Die Toxine der vorliegenden Erfindung können in Begriffen der Gestalt und Lokalisierung von Kristalltoxin-Einschlüssen genau charaktensiert werden. Speziell bleiben Akarid-aktive Einschlüsse typischerweise nach der Zellyse mit der Spore verbunden. Diese Einschlüsse befinden sich nicht innerhalb des Exosporiums, wie in früheren Beschreibungen verbundener Einschlüsse, sondern werden durch einen anderen Mechanismus innerhalb der Spore gehalten. Die Einschlüsse der Akarid-aktiven Isolate sind typischerweise amorph, im allgemeinen lang und/oder multipel. Diese Einschlüsse sind unterscheidbar von den größeren runden/amorphen Einschlüssen, die mit der Spore verbunden bleiben. Bei keinem der B.t.-Stämme, welche dieser Beschreibung entsprechen, wurde eine Aktivität gegen die üblichen Ziele - Lepidoptera, Diptera oder Colorado-Kartoffelkäfer - festgestellt. Wir fanden eine sehr hohe Korrelation zwischen dieser Kristallstruktur und Akarid-Aktivität.
• Die Gene und Toxine gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen nicht nur die hier offenbarten Sequenzen vollständiger Länge, sondern auch Fragmente dieser Sequenzen oder Fusionsproteine, welche die charakteristische akarizide Aktivität der hier speziell beispielhaft erläuterten Sequenzen behalten.
• Es sollte für einen Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sein, daß Gene, die für Akarid-aktive Toxine kodieren, auf mehrere Weisen identifiziert und erhalten werden können. Die speziellen Gene können von einer Kulturhinterlegungsstelle wie oben beschrieben erhalten werden. Diese Gene oder Teile davon können synthetisch, z.B. mit Hilfe einer Gen-Maschine, konstruiert werden. Variationen dieser Gene können ohne weiteres mit Hilfe von Standardtechniken zur Herstellung von Punktmutationen konstruiert werden. Ebenso können Fragmente dieser Gene hergestellt werden, indem im Handel erhältliche Exonukleasen oder Endonukleasen nach Standardverfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können Enzyme wie Bal31 oder stellengerichtete Mutagenese eingesetzt werden, um systematisch Nukleotide von den Enden dieser Gene abzuspalten. Auch können Gene, die für aktive Fragmente kodieren, mit Hilfe einer Vielfalt anderer Restriktionsenzyme erhalten werden. Proteasen können eingesetzt werden, um direkt aktive Fragmente dieser Toxine zu erhalten.
• Äquivalente Toxine und/oder Gene, welche für diese äquivalenten Toxine kodieren, können auch aus B.t.-Isolaten und/oder DNA-Banken mit Hilfe der hier gegebenen Lehre lokalisiert werden. Es gibt eine Anzahl von Methoden, um die Akarid-aktiven Toxine der vorliegenden Erfindung zu erhalten, welche in der Natur vorkommen. Beispielsweise können Antikörper gegen die hier offenbarten und beanspruchten Akarid-aktiven Toxine eingesetzt werden, um andere Toxine aus einer Mischung von Proteinen zu identifizieren und isolieren. Konkret können Antikörper gegen die Akarid-aktiven Toxine mit Hilfe von Verfahren induziert werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Diese Antikörper können dann eingesetzt werden, um spezifisch äquivalente Toxine mit der charakteristischen akariziden Aktivität durch Immunprazipitation, Enzym-verknüpften Immunoassay (ELISA) oder "Western blotting" zu identifizieren. Antikörper gegen die hier offenbarten Toxine oder gegen äquivalente Toxine oder Fragmente dieser Toxine können ohne weiteres unter Anwendung von Standardverfahren auf diesem Gebiet hergestellt werden. Die Gene, welche für diese Toxine kodieren, können dann aus den Mikroorganismen erhalten werden.
• Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung der Toxine und Gene der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Oligonukleotid- Sonden. Diese Sonden sind Nukleotidsequenzen mit einer nachweisbaren Markierung. Wie im Stand der Technik wohlbekannt, kann vernünftigerweise angenommen werden, daß die Sonde und die Probe im wesentlichen identisch sind, wenn das Sondenmolekül und die Nukleinsäureprobe unter Ausbildung einer starken Bindung zwischen den beiden Molekülen hybridisieren. Die nachweisbare Markierung der Sonde bietet ein Mittel zur Bestimmung auf bekannte Weise, ob eine Hybridisierung stattgefunden hat. Eine derartige Sonden-Analyse ergibt ein schnelles Verfahren zur Identifizierung nematizider Endotoxin-Gene der vorliegenden Erfindung.
• Die Nukleotidsegmente, welche als Sonden erfindungsgemäß eingesetzt werden, können mit Hilfe von DNA-Synthesizern nach Standardverfahren synthetisiert werden. Beim Einsatz der Nukleotidsegmente als Sonden wird die spezielle Sonde mit irgendeiner geeigneten Markierung, die Fachleuten bekannt ist, einschließlich radioaktiver und nichtradioaktiver Markierungen, markiert. Typische radioaktive Markierungen umfassen ³²P, ¹²&sup5;I, ³&sup5;S oder dgl. Eine Sonde, die mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, kann aus einer Nukleotidsequenz, die zur DNA-Probe komplementär ist, durch eine herkömmliche "Nick-Translation"-Reaktion unter Verwendung einer Dnase und einer DNA-Polymerase konstruiert werden. Die Sonde und die Probe können dann in einer Hybridisierungspufferlösung kombiniert und bei einer geeigneten Temperatur gehalten werden, bis die Verschmelzung stattfindet. Danach wird die Membran von Fremdmaterial freigewaschen unter Zurücklassung der Probe und gebundener Sondenmoleküle, die typischerweise durch Autoradiographie oder Flüssigszintillationszählung nachgewiesen und quantifiziert werden.
• Nicht-radioaktive Markierungen umfassen beispielsweise Liganden wie Biotin oder Thyroxin, sowie Enzyme wie Hydrolasen oder Peroxidasen oder die verschiedenen Chemoluminescer wie Luciferin oder fluoreszierende Verbindungen wie Fluorescein und dessen Derivate. Die Sonde kann auch zur leichteren Trennung an beiden Enden mit unterschiedlichen Markierungstypen markiert werden, wie z.B. durch Verwendung einer Isotopen-Markierung am oben erwähnten Ende und einer Biotin-Markierung am anderen Ende.
• Doppelstrangbildung und Stabilität hängen von einer wesentlichen Komplementärität zwischen den beiden Strängen eines Hybrids ab und, wie oben dargelegt, kann ein bestimmter Grad an Fehlpaarung toleriert werden.
• Deshalb umfassen die Sonden der vorliegenden Erfindung Mutationen (sowohl einfache als auch mehrfache), Deletionen, Insertionen der beschriebenen Sequenzen und Kombinationen davon, wobei die Mutationen, Insertionen und Deletionen die Bildung stabiler Hybride mit dem Target-Polynukleotid von Interesse erlauben. Mutationen, Insertionen und Deletionen können in einer gegebenen Polynukleotidsequenz auf vielfache Weise erzeugt werden und diese Verfahren sind einem Durchschnittsfachmann bekannt. Andere Verfahren können in der Zukunft bekannt werden.
• Die bekannten Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:
• (1) chemische oder anderweitige Synthese einer künstlichen Sequenz, die eine Mutation, Insertion oder Deletion der bekannten Sequenz ist;
• (2) Verwendung einer Sonde der vorliegenden Erfindung, um durch Hybridisierung eine neue Sequenz oder eine Mutation, Insertion oder Deletion der Sondensequenz zu erhalten; und
• (3) Mutation, Insertion oder Deletion einer Testsequenz in vitro oder in vivo.
• Es ist wichtig festzuhalten, daß die Mutations-, Insertions- und Deletionsvarianten, die von einer gegebenen Sonde erzeugt werden, mehr oder weniger effizient als die ursprüngliche Sonde sein können. Trotz solcher Unterschiede in der Effizienz werden diese Varianten vom Umfang der vorliegenden Erfindung erfaßt.
• So können Mutations-, Insertions- und Deletionsvarianten der offenbarten Testsequenzen ohne weiteres nach Methoden hergestellt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Diese Varianten können auf dieselbe Weise wie die vorliegenden Sonden eingesetzt werden, solange die Varianten eine wesentliche Sequenzhomologie zu den Sonden aufweisen. Substantielle Sequenzhomologie, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Homologie, die ausreichend ist, um der Variante die Funktion mit derselben Kapazität wie die ursprüngliche Sonde zu ermöglichen. Vorzugsweise ist diese Homologie größer als 50%; noch bevorzugter ist diese Homologie größer als 75%; und am meisten bevorzugt ist diese Homologie größer als 90%. Der erforderliche Homologiegrad für die Variante, um mit der beabsichtigten Kapazität zu funktionieren, hängt von der vorgesehenen Verwendung der Sequenz ab. Es liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns auf diesem Gebiet, Mutations-, Insertions- und Deletionsmutationen herzustellen, welche zur Verbesserung der Funktion der Sequenz bestimmt sind oder anderweitig einen methodischen Vorteil bieten.
• Spezifische Nukleotid-Sonden, die gemäß der vorliegenden Erfindung für die schnelle Identifizierung von Akarid-aktiven Genen geeignet sind, können mit Hilfe der hier gegebenen Sequenzinformation hergestellt werden.
• Die potentiellen Variationen in den aufgelisteten Sonden sind teilweise auf die Redundanz des genetischen Codes zurückzuführen. Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, d.h. mehr als ein kodierendes Nukleotidtriplett (Codon) kann für die meisten der zur Herstellung von Proteinen verwendeten Aminosäuren eingesetzt werden, können verschiedene Nukleotidsequenzen für eine spezielle Aminosäure kodieren. So können die Aminosäuresequenzen der B.t.-Toxine und -Peptide durch äquivalente Nukleotidsequenzen hergestellt werden, welche für dieselbe Aminosäuresequenz des Proteins oder Peptids kodieren. Dementsprechend schließt die vorliegende Erfindung solche äquivalenten Nukleotidsequenzen ein. Inverse oder Komplement- Sequenzen sind ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung und können von einem Fachmann auf diesem Gebiet ohne weiteres eingesetzt werden. Darüber hinaus ist gezeigt worden, daß Proteine mit einer identifizierten Struktur und Funktion durch Änderung der Aminosäuresequenz konstruiert werden können, falls solche Änderungen die Proteinsekundärstruktur nicht verändern (Kaiser, E.T. und Kezdy, F.J. [1984] Science 223:249-255). So schließt die vorliegende Erfindung Mutanten der hier dargestellten Aminosäuresequenz ein, welche die Proteinsekundärstruktur nicht verändern oder, wenn die Struktur verändert ist, die biologische Aktivität im wesentlichen beibehalten wird. Ferner schließt die Erfindung auch Mutanten von Organismen ein, die das gesamte, für ein Toxin kodierende Gen der Erfindung oder einen Teil davon beherbergen. Solche mikrobiellen Mutanten können nach Techniken hergestellt werden, die Fachleuten wohlbekannt sind. Beispielsweise kann UV-Bestrahlung eingesetzt werden, um Mutanten von Wirtsorganismen herzustellen. Gleichermaßen können solche Mutanten nicht-sporenbildende Wirtszellen einschließen, die ebenfalls nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden können.
• Die B.t.-Isolate der Erfindung und Mutanten davon können unter Verwendung bekannten Standardmedien und Fermentationstechniken in Kultur gezüchtet werden. Nach Vollendung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem man zuerst die B.t. Sporen und -Kristalle von der Fermentationsbrühe durch im Stand der Technik wohlbekannte Mittel abtrennt. Die gewonnenen B. t.-Sporen und -Kristalle können als benetzbares Pulver, flüssiges Konzentrat, Granulat oder andere Formulierungen durch die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln, Dispergiermitteln, inerten Trägersubstanzen und anderen Komponenten formuliert werden, um die Handhabung und die Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern. Die Formulierungs- und Anwendungsverfahren sind im Stand der Technik alle bekannt und werden bei im Handel erhältlichen Stämmen eingesetzt. Die neuen B.t.-Isolate und Mutanten davon können zur Bekämpfung von Zielschädlingen eingesetzt werden.
• Die Kulturen der vorliegenden Erfindung wurden bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604 USA, hinterlegt.
• Die vorliegenden Kulturen wurden unter Bedingungen hinterlegt, welche sicherstellen, daß ein Zugang zu den Kulturen während der Anhängigkeit dieser Patentanmeldung für jemanden möglich ist, der dazu durch den Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 37 CRF 1.14 und 35 U.S.C. 122 ermächtigt wurde. Diese Hinterlegungen sind gemäß den Erfordernissen ausländischer Patentgesetze in Ländern zugänglich, wo Gegenstücke der vorliegenden Anmeldung oder deren Stammanmeldungen eingereicht sind. Es versteht sich jedoch, daß die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz bedeutet zur Ausführung der vorliegenden Erfindung unter Beeinträchtigung von staatlich erteilten Patentrechten.
• Ferner werden die vorliegenden Kulturhinterlegungen gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags zur Hinterlegung von Mikroorganismen hinterlegt und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht werden, d.h. sie werden mit aller nötigen Sorgfalt gelagert werden, um sie für einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren nach der letzten Anforderung zur Herausgabe einer Probe einer Hinterlegung lebensfähig und unkontaminiert zu halten, und in jedem Fall für einen Zeitraum von mindestens dreißig (30) Jahren nach dem Hinterlegungsdatum oder für die durchsetzbare Lebensdauer eines jeden Patents, welches unter Offenbarung einer Kultur erteilt werden mag. Der Hinterleger erkennt die Pflicht an, eine Hinterlegung zu ersetzen, sollte die Hinterlegungsstelle aufgrund des Zustands eines hinterlegten Guts nicht in der Lage sein, auf Anforderung eine Probe zu liefern. Alle Beschränkungen hinsichtlich der Zugänglichkeit der vorliegenden Kulturhinterlegung für die Öffentlichkeit werden nach der Erteilung eines Patents, welches diese offenbart, unwiderruflich aufgehoben werden.
• Nach dem Aufbringen einer als Akarizid wirksamen Menge eines Mikroorganismus oder Toxins, wie hier offenbart, in einer geeigneten akariziden Formulierung in der Umwelt des Zielschädlings wird eine effektive Bekämpfung dieser Schädlinge erzielt. Eine als Akarizid wirksame Menge kann von etwa 1 bis etwa 12 l/ha variieren, abhängig von der Art und Menge der zu bekämpfenden Schädlinge, der Jahreszeit, Temperatur, Feuchtigkeit und den anderen Faktoren, welche ein Bioinsektizid beeinflussen konnen. Es liegt ohne weiteres im Rahmen der Fähigkeit von Fachleuten auf diesem Gebiet, die Menge an Bioinsektizid zu bestimmen, welche aufzubringen ist, um eine effektive Bekämpfung von Zielschädlingen zu erzielen.
• Das intrazelluläre δ-Endotoxin-Protein kann mit anderen insektiziden Proteinen (einschließlich denjenigen, die aus anderen Quellen als Bacillus thuringiensis erhalten werden) zur Erweiterung des Aktivitätsspektrums kombiniert werden, um eine vollständige Bekämpfung von Zielschädlingen zu ergeben.
• Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granulat oder Staub, durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, z.B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (gepulverten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittel beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agentien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
• Die Pestizidkonzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Pestizid wird in mindestens 1 Gew.-% vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen werden etwa 1-95 Gew.- % des Pestizids enthalten, während die flüssigen Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Diese Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
• Die Formulierungen können in der Umwelt des Zielschädlings oder der Zielschädlinge, z.B. Pflanzen, Vieh, Geflügel, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
• Die Toxingene, welche von den neuen Isolaten der vorliegenden Erfindung beherbergt werden, können in eine große Vielfalt von mikrobiellen Wirten eingeführt werden. Die Expression des Toxingens resultiert direkt oder indirekt in der intrazelluären Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Bei geeigneten Wirten, z.B. Pseudomonas, können die Mikroorganismen auf dem Aufenthaltsort von Milben aufgebracht werden, wo sie sich vermehren und von den Milben aufgenommen werden. Das Ergebnis ist eine Bekämpfung der Milben. Als Alternative kann der Mikroorganismus, der das Toxingen beherbergt unter Bedingungen behandelt werden, welche die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins verlängern. Die behandelte Zelle kann dann in der Umwelt des Zielschädlings ausgebracht werden. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des B.t.-Toxins.
• Wenn das B.t.-Toxingen mittels eines geeigneten Vektors in einen mikrobiellen Wirt eingeführt wird und der Wirt in der Umwelt in lebendem Zustand ausgebracht wird, ist es essentiell, daß bestimmte Wirtsorganismen eingesetzt werden. Es werden Mikroorganismen-Wirte ausgewählt, von denen bekannt ist, daß sie die "Phytosphäre" (Phyllooberfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizooberfläche) einer oder mehrerer interessierender Erntepflanze(n) bewohnen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, daß sie imstande sind, in der besonderen Umwelt (Erntepflanze und andere Insekten-Habitate) erfolgreich mit den Wildtyp-Mikroorganismen im Wettbewerb zu stehen, für stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, welches das Polypeptid-Pestizid exprimiert, und wünschenswerterweise für verbesserten Schutz des Pestizids vor umweltbedingtem Abbau und Inaktivierung sorgen.
• Von einer großen Anzahl von Mikroorganismen ist bekannt, daß sie die Phylboberfläche (die Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder die Rhizosphäre (den Boden in der Umgebung von Pflanzenwurzeln) bewohnen. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Pilze ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z.B. der Gattungen Bacillus, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Stredtomyces, Rhizobium, Rhododseudomonas, Methylodhillus, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, Alcaligenes und Clostridium; Pilze, insbesondere Hefe, z.B. der Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium; Mikroalgen, z.B. der Familien Cyanophyceae, Prochlorophyceae, Rhododhyceae, Dinodhyceae, Chrysophyceae, Prymnesiodhyceae, Xanthodhyceae, Raphidophyceae, Bacillariophyceae, Eustigmatophyceae, Cryptodhyceae, Euglenophyceae, Prasinophyceae und Chlorodhyceae. Von besonderem Interesse sind solche Bakterienspezies der Phytosphäre wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacterxylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhododseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azotobacter vinlandii; und Hefespezies der Phytosphäre wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
• Eine große Vielfalt von Wegen sind zur Einführung eines B.t.-Gens, das ein Toxin exprimiert, in den Mikroorganismus-Wirt unter Bedingungen verfügbar, welche die stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens erlauben. Es ist möglich, DNA-Kontrukte bereitzustellen, welche einschließen die transkriptionalen und translationalen Regulationssignale zur Expression des Toxingens, das Toxingen unter deren regulatorischer Kontrolle und eine DNA-Sequenz, die zu einer Sequenz im Wirtsorganismus homolog ist, wodurch Integration eintreten wird, und/oder ein Replikationssystem, das in dem Wirt funktionell ist, wodurch Integration oder stabile Aufrechterhaltung eintreten wird.
• Die transkriptionalen Initiationssignale werden einen Promotor und eine transkriptionale Initiationsstartstelle einschließen. In einigen Fällen mag es wünschenswert sein, für eine regulative Expression des Toxins zu sorgen, wodurch die Expression des Toxins nur nach der Freisetzung in die Umwelt eintreten wird. Dies kann mit Operatoren erreicht werden oder einem Bereich, der an einen Aktivator oder an "Enhancer" bindet, die nach einer Änderung in der physikalischen oder chemischen Umwelt der Mikroorganismen zur Induktion imstande sind. Beispielsweise kann ein temperaturempfindlicher regulatorischer Bereich eingesetzt werden, wobei die Organismen im Labor ohne Expression eines Toxins gezüchtet werden können, aber die Expression nach Freisetzung in die Umwelt beginnen würde. Andere Techniken können ein spezielles Nährmedium im Labor verwenden, welches die Expression des Toxins verhindert, während das Nährmedium in der Umwelt die Expression des Toxins erlauben würde. Zur translationalen Initiation wird eine ribosomale Bindungsstelle und ein Initiationscodon vorhanden sein.
• Zur Erhöhung der Expression der "Messenger"-RNA können verschiedene Manipulationen durchgeführt werden, insbesondere die Verwendung eines aktiven Promotors ebenso wie der Einsatz von Sequenzen, welche die Stabilität der "Messenger"-RNA erhöhen. Der transkriptionale und translationale Terminationsbereich wird ein Stopcodon oder Stopcodons einschließen, einen Terminationsbereich und gegebenenfalls ein Polyadenylierungssignal. Eine hydrophobe "Leader"-Sequenz kann am Aminoterminus der translatierten Polypeptidsequenz eingesetzt werden, um die Sekretion des Proteins durch die innere Membran zu fördern.
• In Transkriptionsrichtung, nämlich in 5'- zu 3'-Richtung der kodierenden oder "Sense"-Sequenz, wird das Konstrukt den transkriptionalen regulatorischen Bereich, falls vorhanden, und den Promotor, wobei der regulatorische Bereich entweder 5' oder 3' vom Promotor gelegen sein kann, die ribosomale Bindungsstelle, das Initiationscodon, das Strukturgen mit einem offenen Leserahmen in Phase mit dem Initiationscodon, das Stopcodon oder die Stopcodons, die Polyadenylierungs-Signalsequenz, falls vorhanden, und den Terminationsbereich einschließen. Diese Sequenz kann als Doppelstrang für sich allein zur Transformation eines Mikroorganismus-Wirts verwendet werden, wird aber üblicherweise mit einer DNA-Sequenz, die einen Marker beinhaltet, eingeschlossen sein, wobei während der Einführung der DNA in den Wirt die zweite DNA-Sequenz mit dem Toxin- Expressionskonstrukt verknüpft sein kann.
• Durch einen Marker ist ein Strukturgen beabsichtigt, das die Selektion derjenigen Wirte, die modifiziert oder transformiert worden sind, ermöglicht. Der Marker wird normalerweise einen Selektionsvorteil bieten, beispielsweise Resistenz gegen ein Biozid, z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika oder Schwermetallen; Komplementierung, z.B. um einem auxotrophen Wirt Prototrophie zu verleihen oder dgl. Vorzugsweise wird Komplementierung eingesetzt, so daß der modifizierte Wirt nicht nur selektioniert werden kann, sondern auch im Freiland wettbewerbsfähig ist. Es können einer oder mehrere Marker bei der Entwicklung der Konstrukte ebenso wie zur Modifizierung des Wirts eingesetzt werden. Die Organismen können weiter modifiziert sein, indem für einen Wettbewerbsvorteil gegenüber anderen Wildtyp- Mikroorganismen im Freiland gesorgt wird. Beispielsweise können Gene, die Metall-chelierende Agentien, z.B. Siderophore, exprimieren, zusammen mit dem Strukturgen, welches das Toxin exprimiert, in den Wirt eingeführt werden. Auf diese Weise kann die erhöhte Expression eines Siderophors dem Toxin-erzeugenden Wirt einen Wettbewerbsvorteil bieten, so daß er effektiv mit den Wildtyp-Mikroorganismen im Wettbewerb stehen und stabil eine Nische in der Umwelt besetzen kann.
• Wenn kein funktionelles Replikationssystem vorhanden ist, wird das Konstrukt auch eine Sequenz von mindestens 50 Basenpaaren (bp), vorzugsweise mindestens etwa 100 bp, und üblicherweise nicht mehr als etwa 5000 bp einer Sequenz, die zu einer Sequenz im Wirt homolog ist, einschließen. Auf diese Weise wird die Wahrscheinlichkeit legitimer Rekombination erhöht, so daß das Gen in den Wirt integriert und durch den Wirt stabil aufrechterhalten wird. Wünschenswerterweise wird sich das Toxingen in enger Nachbarschaft zu dem Gen befinden, das für die Komplementierung sorgt, ebenso wie das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet. Deshalb wird, falls ein Toxingen verlorengeht, der resultierende Organismus wahrscheinlich auch das komplementierende Gen und/oder das Gen, das den Wettbewerbsvorteil bietet, verlieren, so daß er nicht mehr in der Lage sein wird, in der Umwelt mit dem Gen, welches das intakte Konstrukt enthält, in Wettbewerb zu stehen.
• Eine große Anzahl von transkriptionalen regulatorischen Bereichen sind aus einer großen Vielfalt von Mikroorganismen-Wirten wie Bakterien, Bakteriophagen, Cyanobakterien, Algen, Pilzen und dgl. verfügbar. Verschiedene transkriptionale regulatorische Bereiche schließen die Bereiche ein, die mit dem trp-Gen, lac-Gen, gal-Gen, den linken und rechten Lambda-Promotoren, dem tac-Promotor, den in der Natur mit dem Toxingen assoziierten Promotoren, wenn diese im Wirt funktionell sind, assoziiert sind. Siehe beispielsweise die US- Patente Nr. 4,332,898, 4,342,832 und 4,356,270. Der Terminationsbereich kann derjenige Terminationsbereich sein, der normalerweise mit dem transkriptionalen Initiationsbereich assoziiert ist, oder ein anderer transkriptionaler Initiationsbereich, solange die beiden Bereiche kompatibel und im Wirt funktionell sind.
• Wenn eine stabile episomale Aufrechterhaltung oder Integration gewünscht ist, wird ein Plasmid eingesetzt werden, welches ein im Wirt funktionelles Replikationssystem aufweist. Das Replikationssystem kann von dem Chromosom, einem episomalen Element, das normalerweise in diesem Wirt oder einem anderen Wirt vorhanden ist, oder einem Replikationssystem eines Virus, das im Wirt stabil ist, abgeleitet sein. Es sind eine große Anzahl von Plasmiden verfügbar, z.B. pBR322, pACY184, RSF1010, pRO1614 und dgl. Siehe beispielsweise Ohlsen et al. (1982) J. Bacteriol. 150:6069, und Bagdasarian et al., (1981) Gene 16:237, und die US-Patente Nr. 4,356,270, 4,362,817 und 4,371,625.
• Das B.t.-Gen kann zwischen dem transkriptionalen und translationalen Initiationsbereich und dem transkriptionalen und translationalen Terminationsbereich eingeführt werden, um so unter der regulatonschen Kontrolle des Initiationsbereichs zu stehen. Dieses Konstrukt wird in einem Plasmid enthalten sein, das mindestens ein Replikationssystem beinhalten wird, aber mehr als eines beinhalten kann, wenn ein Replikationssystem zur Klonierung während der Entwicklung des Plasmids eingesetzt wird und das zweite Replikationssystem zur Funktion im endgültigen Wirt nötig ist. Zusätzlich können ein oder mehrere Marker vorhanden sein, die oben beschrieben worden sind. Wenn Integration gewünscht ist, wird das Plasmid wünschenswerterweise eine Sequenz einschließen, die zu dem Wirts-Genom homolog ist.
• Die Transformanten kennen nach bekannten Verfahren isoliert werden, üblicherweise unter Verwendung eines Selektionstechnik, welche die Selektion des gewünschten Organismus gegenüber unmodifizierten Organismen oder übertragenden Organismen, falls diese anwesend sind, ermöglicht. Die Transformanten können dann auf pestizide Aktivität getestet werden.
• Geeignete Wirtszellen, wobei die Pestizid-enthaltenden Zellen behandelt werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die dann behandelte Zelle in der Umgebung des Zielschädlings oder der Zielschädlinge ausgebracht wird, können Prokaryoten oder Eukaryoten einschließen und sind normalerweise auf solche Zellen beschränkt, die keine Substanzen erzeugen, die für höhere Organismen wie Säuger toxisch sind. Es könnten jedoch Organismen, die Substanzen erzeugen, welche für höhere Organismen toxisch sind, eingesetzt werden, bei denen das Toxin instabil ist oder das Niveau der Anwendung ausreichend niedrig, um jede Möglichkeit der Toxizität für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als Wirte werden von besonderem Interesse die Prokaryoten und die niederen Eukaryoten, z.B. Pilze, sein.
• Eigenschaften, die für die Auswahl einer Wirtszelle für Produktionszwecke von besonderem Interesse sind, schließen die Leichtigkeit, mit der das B.t.-Gen in den Wirt eingeführt werden kann, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Effizienz der Expression, die Stabilität des Pestizids im Wirt und das Vorhandensein unterstützender genetischer Fähigkeiten ein. Eigenschaften, die für die Verwendung als Pestizid-Mikrokapsel von Interesse sind, schließen Schutzeigenschaften für das Pestizid wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Packung oder Bildung von Einschlußkörpern; Überleben in wäßrigen Umgebungen; mangelnde Toxizität gegenüber Säugern; Attraktivität für die Schädlinge zur Aufnahme; Leichtigkeit des Abtätens und Fixierens ohne Beschädigung des Toxins und dgl. ein. Andere Gesichtspunkte beinhalten die Leichtigkeit der Formulierung und der Handhabung, wirtschaftliche Gesichtspunkte, Lagerungsbeständigkeit und dgl.
• Die Zelle wird üblicherweise intakt sein und im wesentlichen in der Vermehrungsform vorliegen, wenn sie behandelt ist, eher als in der Sporenform, obwohl in einigen Fällen Sporen eingesetzt werden können.
• Die Behandlung der mikrobiellen Zelle, z.B. ein Mikroorganismus, der das B.t.-Toxingen enthält, kann auf chemische oder physikalische Weise oder durch eine Kombination von chemischen und/oder physikalischen Mitteln erfolgen, solange sich die Methode nicht schädlich auf die Eigenschaften des Toxins auswirkt oder die zelluläre Fähigkeit zum Schutz des Toxins nicht verringert. Beispiele chemischer Reagenzien sind Halogenierungsmittel, insbesondere Halogene der Atomzahl Nr. 17-80. Spezieller kann bd unter milden Bedingungen und fur eine ausreichende Zeit, um die gewünschten Resultate zu erreichen, eingesetzt werden. Andere geeignete Techniken beinhalten die Behandlung mit Aldehyden, z.B. Formaldehyd und Glutaraldehyd; Anti-Infektionsmitteln wie Zephiranchlorid und Cetylpyridiniumchlorid; Alkoholen wie Isopropanol und Ethanol; verschiedenen histologischen Fixativen, z.B. Lugol-Iod, Bouins Fixativ und Hellys Fixativ (siehe: Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman und Company, 1967); oder eine Kombination von physikalischen (Wärme) und chemischen Agentien, welche die Aktivität des in der Zelle erzeugten Toxins erhalten und verlängern, wenn die Zelle dem Wirtstier verabreicht wird. Beispiele physikalischer Mittel sind Strahlung kurzer Wellenlänge, z.B. Gamma- Strahlung und Röntgenstrahlung, Einfrieren, UV-Bestrahlung, Lyophilisierung und dgl.
• Die Zellen werden im allgemeinen erhöhte Strukturstabilität aufweisen, welche die Resistenz gegenüber Umweltbedingungen erhöht. Wenn das Pestizid in einer Proform vorliegt, sollte das Verfahren zur Inaktivierung so gewählt werden, daß das Processing der Proform zur reifen Form des Pestizids durch das Zielschädlingspathogen nicht behindert wird. Beispielsweise wird Formaldehyd Proteine vernetzen und konnte das Processing der Proform eines Polypeptid-Pestizids verhindern. Das Verfahren zur Inaktivierung oder Abtötung erhält mindestens einen wesentlichen Teil der Bioverfügbarkeit oder Bioaktivität des Toxins.
• Der zelluläre Wirt, der das insektizide B.t.-Gen enthält, kann in jedem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, worin das DNA- Konstrukt einen Selektionsvorteil bietet, vorausgesetzt, es ist ein selektives Medium, so daß im wesentlichen alle oder alle Zellen das B.t.-Gen behalten. Diese Zellen können dann nach üblichen Verfahren geerntet werden. Alternativ können die Zellen vor der Ernte behandelt werden.
• Die B.t.-Zellen der Erfindung können unter Verwendung bekannter Standardmedien und Fermentationstechniken in Kultur gezüchtet werden. Nach Vollendung des Fermentationszyklus können die Bakterien geerntet werden, indem man zuerst die B.t.-Sporen und -Kristalle von der Fermentationsbrühe durch im Stand der Technik wohlbekannte Verfahren abtrennt. Die gewonnen B.t.-Sporen und -Kristalle können als benetzbares Pulver, flüssiges Konzentrat, Granulat oder andere Formulierungen durch die Zugabe von oberflächenaktiven Mitteln, Dispergiermitteln, inerten Trägern und anderen Komponenten formuliert werden, um die Handhabung und Anwendung für bestimmte Zielschädlinge zu erleichtern. Diese Formulierungen und Anwendungsverfahren sind alle im Stand der Technik wohlbekannt.
• Formulierte Köder-Granula, umfassend einen Lockstoff und Sporen und Kristalle der B.t.-Isolate oder der rekombinanten Mikroorganismen, die das Gen oder die Gene, das bzw. die aus den hier offenbarten B.t.-Isolaten erhältlich sind, umfassen, können auf das Erdreich oder in der Nachbarschaft gelagerter Produkte ausgebracht werden. Formulierte Produkte können auch als Saatüberzug oder Wurzelbehandlung oder Behandlung der gesamten Pflanze in späteren Stadien des Erntezyklus eingesetzt werden.
• Mutanten der neuen Isolate der Erfindung können nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann eine nicht-sporenbildende Mutante durch Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese eines neuen Isolats erhalten werden. Die Mutanten konnen unter Verwendung von UV-Licht und Nitrosoguanidin nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren hergestellt werden.
• Ein kleinerer Prozentsatz der nicht-sporenbildenden Mutanten wird intakt bleiben und über längere Ferrnentationszeiträume nicht lysieren; diese Stämme werden als Lysis-minus (-) bezeichnet. Lysisminus-Stämme können identifiziert werden, indem nicht-sporenbildende Mutanten in Schüttelkolben-Medien gescreent und diejenigen Mutanten ausgewählt werden, die bei Fermentationsende noch intakt sind und Toxinkristalle enthalten. Lysis-minus-Stämme sind für ein Zellfixierungsverfahren geeignet, das ein geschütztes, verkapseltes Toxinprotein ergeben wird.
• Zur Herstellung einer phagenresistenten Variante der genannten nicht-sporenbildenden Mutante wird ein Aliquot des Phagenlysats auf Nähragar ausgebreitet und trocknengelassen. Ein Aliquot des phagensensitiven Bakterienstamms wird dann direkt über dem getrockneten Lysat ausplattiert und trocknengelassen. Die Platten werden bei 30ºC inkubiert. Die Platten werden 2 Tage lang inkubiert und zu diesem Zeitpunkt ist das Wachstum von zahlreichen Kolonien auf dem Agar zu sehen. Einige dieser Kolonien werden gepickt und auf Nähragar- Platten subkultiviert. Die anscheinend resistenten Kulturen werden auf Resistenz durch Überkreuz-Ausstreichen mit dem Phagenlysat getestet. Eine Linie des Phagenlysats wird auf der Platte ausgestrichen und trocknengelassen. Die mutmaßlich resistenten Kulturen werden dann quer über die Phagenlinie ausgestrichen. Resistente Bakterienkulturen zeigen nach einer Inkubation über Nacht bei 30ºC im Ausstrich quer über die Phagenlinie nirgends Lysis. Die Phagenresistenz wird dann bestätigt, indem ein Rasen der resistenten Kultur auf eine Nähragar-Platte ausplattiert wird. Der sensitive Stamm wird auf dieselbe Weise ebenfalls ausplattiert, um als positive Kontrolle zu dienen. Nach dem Trocknen wird ein Tropfen des Phagenlysats im Zentrum der Platte ausplattiert und trocknengelas sen. Resistente Kulturen zeigten nach 24-stündiger Inkubation bei 30ºC keine Lysis in dem Gebiet, wo das Phagenlysat plaziert worden war.
• Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.
BEISPIEL 1 - Züchtung der B.t.-Isolate
• Eine Subkultur der B.t.-Isolate oder Mutanten davon kann dazu verwendet werden, um das folgende Medium, ein Medium mit Pepton, Glucose und Salzen, anzuimpfen.
• Bacto - Pepton 7,5 g/l
• Glucose 1,0 g/l
• KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
• K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
• Salzlösung 5,0 ml/l
• CaCl&sub2;-Lösung 5,0 ml/l
• pH 7,2
• Salzlösung (100 ml)
• MGSO&sub4;. 7H&sub2;O 2,46 g
• MNSO&sub4;. H&sub2;O 0,04 g
• ZNSO&sub4;. 7H&sub2;O 0,28 g
• FESO&sub4;. 7H&sub2;O 0,40 g
• CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
• CaCl&sub2;. 2H&sub2;O 3,66 g
• Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden filtersterilisiert und zur autoklavierten und gekochten Brühe zum Animpfungszeitpunkt zugegeben. Die Kolben werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM 64 h lang inkubiert.
• Das obige Verfahren kann ohne weiteres nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren auf große Fermentoren maßstäblich übertragen werden.
• Die B.t.-Sporen und/oder -Kristalle, die bei der obigen Fermentation erhalten werden, können nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig verwendetes Verfahren besteht darin, die geerntete Fermentationsbrühe Trennungstechniken, z.B. Zentrifugation, zu unterwerfen.
BEISPIEL 2 - Proteinreinigung und Aminosäuresequenzierung
• Die B.t.-Isolate PS17, PS52A1 und PS69D1 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben kultiviert. Die Parasporen-Einschlußkörper wurden durch isopyknische Natriumbromidgradienten (28-38%)-Zentrifugation teilweise gereinigt (Pfannenstiel, M.A., E.J. Ross, V.C. Kramer und K.W. Nickerson [1984] FEMS Microbiol. Lett. 21:39). Die Proteine wurden an PVDF-Membranen (Millipore, Bedford, MA) durch "Western blotting"-Techniken (Towbin, H., T. Staehlelinund K. Gordon [1979] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350) gebunden urid die N-terminalen Aminosäuresquenzen durch die Standard-Edman-Reaktion mit einem automatischen Gasphasensequenator bestimmt (Hunkapiller, M.W., R.M. Hewick, W.L. Dreyer und L.E. Hood [1983] Meth. Enzyml. 91:399). Die erhaltenen Sequenzen waren:
• Ps17a: A I L N E L Y P S V P Y N V (SEQ-ID-NR. 12)
• Ps17b: A I L N E L Y P S V P Y N V (SEQ-ID-NR. 13)
• PS52A1: M I I D S K T T L P R H S L I N T (SEQ-ID-NR. 14)
• PS69D1: M I L G N G K T L P K H I R L A H I F A T Q N S (SEQ-ID-NR. 15)
BEISPIEL 3 - Klonierung neuer Toxingene und Transformation in Escherichia coli
• Gesamtzell-DNA wurde hergestellt, indem die B.t.-PS17-Zellen auf eine niedrige optische Dichte (OD&sub6;&sub0;&sub0; = 1,0) gezüchtet und die Zellen durch Zentrifugation gewonnen wurden. Die Zellen wurden in TES-Puffer (30 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, pH = 8,0), der 20% Sucrose und 50 mg/ml Lysozym enthielt, in Protoplasten überführt.
• Die Protoplasten wurden durch Zugabe von SDS bis zu einer Endkonzentration von 4% lysiert. Das Zellmaterial wurde über Nacht bei 4ºC in 100 mM (Endkonzentration) neutralem Kaliumchlorid gefällt. Der überstand wurde zweimal mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und durch isopyknische Bandenkonzentration auf einem Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid- Gradienten gereinigt.
• Gesamtzell-DNA aus PS17 wurde mit EcoRI verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,8%-igen (w/v) TAE (50 mM Tris-HCl, 20 mM NaOAc, 2,5 mM EDTA, pH = 8,0)-gepufferten Agarosegel aufgetrennt. Ein "Southern-Blot" des Gels wurde mit einer durch [³²P] radioaktiv markierten Oligonukleotid-Sonde, die von der N-terminalen Aminosäuresequenz des gereinigten 130 kDa-Proteins aus PS17 abgeleitet worden war, hybridisiert. Die Sequenz des synthetisierten Oligonukleotids ist (GCAATTTTAAATGAATTATATCC) (SEQ-ID-NR. 16). Die Ergebnisse zeigten, daß die hybridisierenden EcoRI-Fragmente von PS17 eine Größe von 5,0 kb, 4,5 kb, 2,7 kb und 1,8 kb aufwiesen, wodurch mutmaßlich mindestens vier neue Akarid-aktive Toxingene, PS17d, PS17b, PS17a bzw. PS17e identifiziert wurden.
• Eine Bibliothek wurde aus PS17-Gesamtzell-DNA konstruiert, die mit Sau3a partiell verdaut und durch Elektrophorese größenfraktioniert worden war. Der Bereidh von 9 bis 23 kb des Gels wurde ausgeschnitten und die DNA elektroeluiert und dann mittels einer Elutip -Ionenaustauschersäule (Schleicher und Schuell, Keene, NH) konzentriert. Die isolierten Sau3a-Fragmente wurden in Lambdagem-11 (PROMEGA) ligiert. Die verpackten Phagen wurden auf KW251-E.coli-Zellen (PROMEGA) mit einem hohen Titer ausplattiert und unter Verwendung des obigen radioaktiv markierten synthetischen Oligonukleotids als Nukleinsäure-Hybridisierungssonde gescreent. Die hybridisierenden Plaques wurden gereinigt und bei einer niedrigeren Plaquedichte erneut gescreent. Einzelne isolierte gereinigte Plaques, die mit der Sonde hybridisierten, wurden eingesetzt, um KW251-E. coli-Zellen in Flüssigkultur zur Präparation von Phagen für die DNA-Isolierung zu infizieren. DNA wurde nach Standardverfahren isoliert.
• Die gewonnene rekombinante Phagen-DNA wurde mit EcoRI-verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,8%-igen Agarose-TAE-Gel aufgetrennt. Das Gel wurde einem Southern Blot unterzogen und mit der Oligonukleotid-Sonde hybridisiert, um die aus der Lambda-Bank isolierten Toxingene zu charakterisieren. Es waren zwei Muster vorhanden, Klone, welche das 4,5 kb (PS17b) - oder das 2,7 kb (PS17a) - EcoRI-Fragment enthielten. Präparative Mengen an Phagen-DNA wurden mit Sah verdaut (um die inserierte DNA von den Lambda-Armen zu befreien) und durch Elektrophorese auf einem 0,6%-igen Agarose- TAE-Gel aufgetrennt. Die großen Fragmente, elektroeluiert und konzentriert wie oben beschrieben, wurden mit SalI-verdautem und dephosphoryliertem pBClac, ein E. coli/B. t. - "shuttle"-Vektor, der Replikationsursprünge von pBC16 und pUC19 umfaßt, ligiert. Die Ligierungsmischung wurde durch Transformation in kompetente NM522- E. coli-Zellen eingeführt und auf LB-Agar ausplattiert, der Ampicillin, Isopropyl-(β)-D-thiogalactosid (IPTG) und 5-Brom-4- chlor-3-indolyl-(β)-D-galactosid (XGAL) enthielt. Weiße Kolonien, mit mußmaßlichen Insertionen im (β)-Galactosidasegen von pBClac, wurden Standard-Plasmid-Schnellanreicherungsverfahren unterworfen, um die gewünschten Plasmide zu isolieren. Das ausgewählte Plasmid, welches das 2,7 kb-EcoRI-Fragment enthielt, erhielt die Bezeichnung pMYC1627 und das Plasmid, welches das 4,5 kb-EcoRI-Fragment enthielt, erhielt die Bezeichnung pMYC1628.
• Die Toxingene wurde sequenziert nach dem Standard-Didesoxykettenabbruchverfahren von Sanger unter Verwendung der oben offenbarten synthetischen Oligonukleotid-Sonde und durch "Walking" mit Primern, die für die Sequenz der neuen Toxingene hergestellt worden waren.
• Die PS17-Toxingene wurden in den "Shuttle"-Vektor pHT3101 (Leredus, D. et al., [1989] FEMS Microbiol. Lett. 60:211-218) unter Anwendung von Standardverfahren zur Expression in B.t. subkloniert. Kurz gesagt wurden Sali-Fragmente, welche die 17a- und 17b-Toxingene enthielten, aus pMYC162g bzw. pMYC1627 durch präparative Agarose-Gelelektrophorese, Elektroelution isoliert und wie oben beschrieben konzentriert. Diese konzentrierten Fragmente wurden in SalI- gespaltenen und dephosphorylierten pHT3101 ligiert. Die Ligierungsmischungen wurden separat eingesetzt, um eingefrorene kompetente E. coli-NM522 zu transformieren. Plasmide aus jedem rekombinanten E. coli-Stamm wurden durch alkalische Lyse präpariert und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Die resultierenden Subklone, pMYC2311 und pMYC2309, beherbergten die Toxingene 17a bzw. 17b. Mit diesen Plasmiden wurde der nicht-kristalltragende B.t.-Stamm HD- 1 cryB (Aronson, A., Purdue University, West Lafayette, IN) nach Standard-Elektroporationstechniken transformiert (Instruction Manual, Biorad, Richmond, CA).
• Die rekombinanten B.t.-Stämme HD-1 cryB [pMYC2311] und [pMYC2309] wurden bis zur Sporulation gezüchtet und die Proteine durch NaBr- Gradientenzentrifugation gereinigt wie oben für die Wildyp-B.t.- Proteine beschrieben.
BEISPIEL 4 - Molekulare Klonierung des Gens. welches für ein neues Toxin aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm PS52A1 kodiert
• Gesamtzell-DNA wurde aus Bacillus thuringiensis-PS52A1 (B.t. PS52A1) hergestellt wie in Beispiel 3 offenbart.
• RFLP-Analysen wurden durchgeführt durch Standard-Hybridisierung von "Southern blots" von PS52A1-DNA mit einer ³²P-markierten Oligonukleotid-Sonde, die von der in Beispiel 2 offenbarten N-terminalen Aminosäuresequenz konstruiert worden war. Die Sequenz dieser Sonde ist:
• Diese Sonde erhielt die Bezeichnung 52A1-C. Die hybridisierenden Banden umfassten ein etwa 3,6 kbp langes HindIII-Fragment und ein etwa 8,6 kbp langes EcoRV-Fragment. Eine Genbank wurde aus PS52A1- DNA konstruiert, die partiell mit Sau3a verdaut worden war. Die partiellen Restriktionsverdaus wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. DNA-Fragmente einer Größe von 6,6 bis 23 kbp wurden aus dem Gel ausgeschnitten, aus dem Gelstück elektroeluiert und durch Ethanolfällung nach Reinigung auf einer Elutip- D-Ionenaustauschersäule gewonnen. Die Sau3a-Inserts wurden in BamHI- verdauten LambdaGem-11 (Promega) ligiert. Rekombinante Phagen wurden verpackt und auf E. coli-KW251-Zellen (Promega) ausplattiert. Plaques wurden gescreent durch Hybridisierung mit der oben offenbarten radioaktiv markierten 52A1-C-Oligonukleotid-Sonde. Hybridisierende Phagen wurden Plaque-gereinigt und eingesetzt, um Flüssigkulturen von E. coli-KW251-Zellen zur Isolierung von Phagen-DNA nach Standardverfahren (Maniatis et al.) zu infizieren. Zur Subklonierung wurden präparative Mengen von DNA mit EcoRI und SalI verdaut und auf einem Agarosegel elektrophoresiert. Die Bande von etwa 3,1 kbp, welche das Toxingen enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten, aus dem Gelstück elektroeluiert und durch Ionenaustauschchromatographie wie oben gereinigt. Das gereinigte DNA-Insert wurde in EcoRI + SalI- verdauten pHTBlueII (ein E. coli/B. thuringiensis-"Shuttle"-Vektor, der pBluescript S/K [Stratagene] und den Replikationsursprung aus einem residenten B.t.-Plasmid [D. Leredus et al. 1989. FEMS Microbiology Letters 60:211-218] umfaßt) ligiert. Die Ligierungsmischung wurde eingesetzt, um eingefrorene kompetente E. coli-NM522-Zellen (ATCC 47000) zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB-Agar ausplattiert, der Ampicillin, Isopropyl-(β)-D-thiogalactosid (IPTG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-(β)-D-galactosid (XGAL) enthielt. Plasmide wurden aus mutmaßlichen Rekombinanten durch alkalische Lyse (Maniatis et al.) gereinigt und durch Elektrophorese von EcoRI- und SalI-Verdaus auf Agarosegelen analysiert. Das gewünschte Plasmidkonstrukt, pMYC2321, enthält ein Toxingen, das im Vergleich zu den Karten anderer Toxingene, welche für akarizide Proteine kodieren, neu ist.
• Das Plasmid pMYC2321 wurde in einen nicht-kristalltragenden (Cry&supmin;) B.t.-Wirt durch Elektroporation eingeführt. Die Expression eines Kristallproteins von etwa 55-60 kDa wurde durch SDS-PAGE- Analyse verifiziert.
BEISPIEL 5 - Molekulare Klonierung eines Gens, das für ein neues Toxin aus dem Bacillus thuringiensis-Stamm PS69D1 kodiert
• Gesamtzell-DNA wurde aus PS69D1 (B.t. PS69D1) hergestellt wie in Beispiel 3 offenbart. RFLP-Analysen wurden durch Standard- Hybridisierung von "southern blots" von PS69D1-DNA mit einer 32P- markierten Oligonukleotid-Sonde mit der Bezeichnung 69D1-D durchgeführt. Die Sequenz der 69D1-D-Sonde war:
• Die hybridisierenden Banden schlossen ein HinDIII-Fragment von etwa 2,0 kbp ein.
• Eine Genbank wurde aus PS69D1-DNA konstruiert, die partiell mit Sau3a verdaut worden war. Die partiellen Restriktionsverdaus wurden durch Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. DNA-Fragmente von 6,6 bis 23 kbp Größe wurden aus dem Gel ausgeschnitten, aus dem Gelstück elektroeluiert und durch Ethanolfällung nach Reinigung auf einer Elutip-D-Ionenaustauschersäule gewonnen. Die Sau3a-Inserts wurden in BamHI-verdauten Lambdagem-11 (Promega, Madison, WI) ligiert. Rekombinante Phagen wurden verpackt und auf E. coli-KW251-Zellen (Promega, Madison, WI) ausplattiert. Die Plaques wurden durch Hybridisierung mit der radioaktiv markierten 69D1-D-Oligonukleotid- Sonde gescreent. Hybridisierende Phagen wurden Plaque-gereinigt und eingesetzt, um Flüssigkulturen von E. coli-KW251-Zellen zur Isolierung von Phagen-DNA nach Standardverfahren (Maniatis et al. [1982] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) zu infizieren. Zur Subklonierung wurden präparative Mengen von DNA mit HindIII verdaut und auf einem Agarosegel elektrophoresiert. Die Bande von etwa 2, kbp, welche das Toxingen enthielt, wurde aus dem Gen ausgeschnitten, aus dem Gelstück elektroeluiert und durch Ionenaustauschchromatographie wie oben gereinigt. Das gereinigte DNA-Insert wurde in HindIII-verdauten pHTBlueII (ein E. coli/B.t.-"shuttle"-Vektor, der pBluescript S/K (Stratagene, San Diego, CA) und den Replikationsursprung aus einem residenten B.t.-Plasmid (D. Leredus et al. [1989] FEMS Microbidl. Lett. 60:211-218) umfaßt), ligiert. Die Ligierungsmischung wurde eingesetzt, um eingefrorene kompetente E. coli- NM522-Zellen (ATCC 47000) zu transformieren. Die Transformanten wurden auf LB-Agar ausplattiert, der 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-(β)- D-galactosid (XGAL) enthielt. Plasmide wurden aus den mutmaßlichen Rekombinanten durch alkalische Lyse (Maniatis et al., supra) gereinigt und durch Elektrophorese von HindIII-Verdaus auf Agarosegelen analysiert. Das erwünschte Plasmidkonstrukt pMYC2317 enthält ein Toxingen, das im Vergleich zu den Karten anderer Toxingene, welche für insektizide Proteine kodieren, neu ist.
BEISPIEL 6 - Aktivität von B.t.-Isolaten gegen Milben
• B. thuringiensis-Isolate der Erfindung wurden getestet als sprühgetrocknete Pulver von Fermentationsbrühen, die durch Zentrifugation konzentriert wurden. Pellets, die aus Wasser und Biomasse (Sporen, kristalline Delta-Endotoxine, Zelltrümmer und Wachstumsmedien) bestehen, wurden mit einem Standard-Träger, Konservierungsmittel und oberflächenaktiven Mittel gemischt. Pulver, die aus 25% Biomasse bestanden, wurden mit Hilfe eines Yamato- Sprühtrockners (vertrieben von Yamato Scientific Co., Ltd. Tokyo, Japan) hergestellt.
• Alle Nährbrühen wurden auf die Anwesenheit von Beta-Exotoxin durch einen Stubenfliegenlarven-Bioassay (Campbell, D.P., Dieball, D.E. und Brackett, J.M., 1987, Rapid HPLC-Assay for the β-exotoxin of Bacillus thuringiensis. J. Agric. Food Chem. 35:156-158) getestet. Nur Isolate, die im Test frei von β-Exotoxin waren, wurden in diesen Assays gegen Milben eingesetzt.
• 13. thuringiensis-Isolate wurden mit Hilfe eines Assays mit künstlicher Ernährung getestet. Sprühgetrocknete Pulver wurden für die Tests prapariert, indem 25 mg Pulver in 5 ml einer 10%-igen Sucroselösung gemischt wurden. Die Mischung wurde dann 8 Minuten lang ultrabeschallt, um eine Suspension zu erzeugen.
• Zwei ml der Suspension wurden in ein Reservoir eingebracht, das aus einem Metallring mit einem Parafilm M-Filmboden bestand. Eine Petrischale, die etwa 30 weibliche Zweifleckige Spinnenmilben (Tetranychus urticae) enthielt, wurde auf die Unterseite des Films plaziert. Den Milben wurde erlaubt, sich 24 Stunden lang von der Sucroselösung zu ernähren und dann auf 2 cm-Blattscheiben der französischen Bohne (20 Milben pro Scheibe) überführt. Die Sterblichkeit wurde nach 7 Tagen bestimmt (Tabelle 2). Jeder Assay wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt. TABELLE 2. Toxizität von Bacillus thuringiensis-Isolaten für die Zweifleckige Spinnenmilbe Tetranychus urticae. Die Sterblichkeit wurde nach 7 Tagen Behandlung bestimmt.
BEISPIEL 7 - Klonierung neuer Akarid-aktiver Gene unter Verwendung generischer Oligonukleotid-Primer
• Das akarizide Gen eines neuen akariziden B.t.-Isolats kann aus DNA des Stammes erhalten werden, indem die Standard-Polymerasekettenreaktion unter Verwendung der Oligonukleotide von SEQ-ID- NR.21 oder SEQ-ID-NR. 20 als reverse Primer und SEQ-ID-NR. 10, SEQ- ID-NR. 11, SEQ-ID-NR. 16, Sonde B von SEQ-ID-NR. 5 (AAT GAA GTA/T TAT CCA/T GTA/T AAT) oder SEQ-ID-NR. 19 als Vorwärtsprimer durchgeführt wird. Die erwarteten PCR-Fragmente würden etwa 330 bis 600 bp (mit einem der reversen Primer und SEQ-ID-NR. 10), 1000 bis 1400 bp (mit einem der reversen Primer und SEQ-ID-NR. 11) und 1800 bis 2100 bp (mit einem der reversen Primer und irgendeinem der N- terminalen Primer SEQ-ID-NR. 5 (Sonde B), SEQ-ID-NR. 16 und SEQ- ID-NR. 19) betragen. Alternativ kann ein Komplement der durch SEQ- ID-NR. 10 beschriebenen Primerfamilie als reverser Primer mit SEQ- ID-NR. 11, SEQ-ID-NR. 16, SEQ-ID-NR. 5 (Sonde B) oder SEQ-ID-NR. 19 als Vorwärtsprimer eingesetzt werden. Die erwarteten PCR-Fragmente würden etwa 650 bis 1000 bp mit SEQ-ID-NR. 11 und 1400 bis 1800 bp (für die drei N-terminalen Primer SEQ-ID-NR. 5 (Sonde B), SEQ-ID- NR. 16 und SEQ-ID-NR. 19) betragen. Amplifizierte DNA-Fragmente der angegebenen Größen können radioaktiv markiert und als Sonden zur Klonierung des gesamten Gens eingesetzt werden.
BEISPIEL 8 - Weitere Klonierung neuer Akarid-aktiver Gene unter Verwendung generischer Oligonukleotid-Primer
• Ein Gen, das für ein akarizides Toxin eines akariziden B.t.- Isolats kodiert, kann auch aus DNA des Stammes erhalten werden, indem die Standard-Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird unter Verwendung von Oligonukleotiden, die von den PS52A1- und PS69D1- Gensequenzen wie folgt abgeleitet sind:
• 1. Der Vorwärtsprimer "TGATTTT (T oder A) (C oder A) TCAATTATAT (A oder G)A(G oder T)GTTTAT" (SEQ-ID-NR. 22) kann mit Primern verwendet werden, die komplementär zur Sonde "AAGAGTTA(C oder T) TA(A oder G) A(G oder A)AAAGTA" (SEQ-ID-NR. 23)1 Sonde "TTAGGACCATT(A oder G) (C oder T)T(T oder A)GGATTTGTTGT (A oder T)TATGAAAT" (SEQ-ID-NR. 24) und Sonde "GA(C oder T)AGAGATGT(A oder T)AAAAT(C oder T) (T oder A)TAGGAATG" (SEQ-ID-NR. 25) sind, um amplifizierte Fragmente von etwa 440, 540 bzw. 650 bp zu erzeugen.
• 2. Der Vorwärtsprimer "TT(A oder C)TTAAA(A oder T)C(A oder T)GCTAATGATATT" (SEQ-ID-NR. 26) kann mit Primern eingesetzt werden, die komplementär zu SEQ-ID-NR. 23, SEQ-ID-NR. 24 und SEQ-ID-NR. 25 sind, um amplifizierte Fragmente von etwa 360, 460 bzw. 570 bp zu erzeugen.
• 3. Der Vorwärtsprimer SEQ-ID-NR. 23 kann mit Primern eingesetzt werden, die komplementär zu SEQ-ID-NR. 24 und SEQ-ID- NR. 25 sind, um amplifizierte Fragmente von etwa 100 bzw. 215 bp zu erzeugen.
• Amplifizierte DNA-Fragmente der angegebenen Größe können radioaktiv markiert und als Sonden zur Klonierung des vollständigen Gens eingesetzt werden.
BEISPIEL 9 - Insertion von Toxingenen in Pflanzen
• Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Transformation von Pflanzen mit Genen, die für ein akarizides Toxin kodieren. Die transformierten Pflanzen sind gegen einen Angriff durch Akaride resistent.
• Gene, die für akarizide Toxine wie hier offenbart kodieren, können in Pflanzenzellen mit Hilfe einer Vielfalt von Techniken inseriert werden, die im Stand der Technik wohlbekannt sind. Beispielsweise sind eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, die ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, welcher die Selektion der transformierten Zellen erlaubt, umfassen, zur Präparation für die Insertion fremder Gene in höhere Pflanzen verfügbar. Die Vektoren umfassen z.B. pBR322, die pUC-Reihe, M13mp-Reihe, pACYC184, etc. Dementsprechend kann die für das B.t.-Toxin kodierende Sequenz an einer geeigneten Restriktionsstelle in den Vektor eingebaut werden. Das resultierende Plasmid wird zur Transformation von E. coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse, Elektrophorese und andere biochemische/molekularbiologische Verfahren werden im allgemeinen als Analyseverfahren durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmidsequenz kann in die gleichen oder in andere Plasmide kloniert werden. Je nach dem Verfahren zur Insertion gewünschter Gene in die Pflanze konnen andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Wird beispielsweise das Ti- oder Ri-Plasmid für die Transformation der Pflanzenzelle eingesetzt, muß mindestens die rechte Grenze, oft jedoch die rechte und linke Grenze, der Ti- oder Ri-Plasmid-T-DNA dann als flankierende Region der zu inserierenden Gene angeschlossen werden.
• Die Verwendung von T-DNA zur Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv untersucht und ausreichend beschrieben in EP 120 516; Hoekema (1985) in: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Kapitel 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; und An et al. (1985) EMBO J. 4:277-287.
• Nachdem die inserierte DNA einmal in das Genom integriert wurde, ist sie dort relativ stabil und kommt in der Regel nicht wieder heraus. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, welcher den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegen ein Biozid oder ein Antibiotikum, wie u.a. Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol, verleiht. Der individuell eingesetzte Marker sollte dementsprechend die Selektion von transformierten Zellen gegenüber Zellen, welche die inserierte DNA nicht enthalten, erlauben.
• Zur Insertion von DNA in eine Pflanzenwirtszelle sind eine große Anzahl von Techniken verfügbar. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationmittel, Fusion, Injektion oder Elektroporation ebenso wie andere mögliche Verfahren. Falls Agrobakterien zur Transformation eingesetzt werden, muß die zu inserierende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, nämlich entweder in einen Zwischenvektor oder in einen binären Vektor. Die Zwischenvektoren können aufgrund von Sequenzen, die zu Sequenzen in der T-DNA homolog sind, in das Ti- oder Ri-Plasmid durch homologe Rekombination integriert werden. Das Ti- oder Ri-Plasmid enthält auch die vir-Region, welche für den Transfer der T-DNA erforderlich ist. Zwischenvektoren können sich in Agrobakterien nicht replizieren. Der Zwischenvektor kann mit Hilfe eines Helferplasmids (Konjugation) in Agrobacterium tumefaciens transferiert werden. Binäre Vektoren können sich sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie umfassen ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von den rechten und linken T- DNA-Grenzregionen eingerahmt sind. Mit ihnen können Agrobakterien direkt transformiert werden (Holsters et al. [1978] Mol. Gen. Genet. 163:181-187). Das als Wirtszelle eingesetzte Agrobaktenum hat ein Plasmid zu umfassen, das eine vir-Region trägt. Diese vir-Region ist erforderlich für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle. Weitere T-DNA kann enthalten sein. Das so transformierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen eingesetzt. Pflanzenexplantate können vorteilhaft mit Agrobacterium turnefaciens oder Agrobacterium rhizogenes zum Transfer der DNA in die Pflanzenzelle kultiviert werden. Ganze Pflanzen können dann aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z.B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) in einem geeigneten Medium regeneriert werden, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf die Anwesenheit der inserierten DNA getestet werden. Im Falle von Injektion und Elektroporation werden keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es ist möglich, gewöhnliche Plasmide, z.B. PUC-Derivate, einzusetzen.
• Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen auf übliche Weise. Sie können Keimzellen bilden und das oder die transformierte(n) Merkmal(e) den Pflanzennachkömmlingen übermitteln. Solche Pflanzen können auf normale Weise gezüchtet werden, und mit Pflanzen gekreuzt werden, welche dieselben transformierten Erbfaktoren aufweisen oder andere Erbfaktoren. Die resultierenden Hybrid-Individuen weisen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften auf.
BEISPIEL 10 - Klonierung von Bacillus thuringiensis-Genen in Baculoviren
• Die für die hier offenbarten insektiziden Toxine kodierenden Gene können in Baculoviren wie Autographa californica Kern- Polyhedrosis-Virus (AcNPV) kloniert werden. Es können Plasmide konstruiert werden, die das AcNPV-Genom in einen im Handel erhältlichen Klonierungsvektor wie pUC8 kloniert enthalten. Das AcNPV-Genom ist so modifiziert, daß der kodierende Bereich des Polyhedrin-Gens entfernt ist und eine nur einmal vorkommende Klonierungsstelle für ein "Passenger"-Gen direkt hinter dem Polyhedrin-Promotor plaziert ist. Beispiele solcher Vektoren sind pGP-B6874, beschrieben von Pennock et al. (Pennock, G.D., Shoemaker, C. und Miller, L.K. [1984] Mol. Cell. Biol. 4:399-406) und pAC380, beschrieben von Smith et al. (Smith, G.E., Summers, M.D. und Fraser, M.J. [1983] Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165). Die Gene, welche für die erfindungsgemäßen Proteintoxine kodieren, können mit BamHI-Linkern an geeigneten Bereichen sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts des kodierenden Bereichs modifiziert werden und in die "Passenger"- Stelle eines der AcNPV-Vektoren eingebaut werden.
• Es versteht sich, daß die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zur Erläuterung dienen und daß in deren Kenntnis verschiedene Modifikationen oder Änderungen für Fachleute naheliegen werden und vom Geist und Rahmen dieser Anmeldung und dem Umfang der beigefügten Ansprüche umfaßt werden.
SEOUENZVERZEICHNIS
• (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
• (i) ANMELDER: Payne, Jewel M. Cannon, Raymond J.C. Bagley, Angela L.
• (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Neue Bacillus thuringiensis-Isolate zur Bekämpfung von Akariden
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30
• (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
• (A) ADRESSAT: David R. Saliwanchik
• (B) STRASSE: 2421 N.W. 415t Street, Suite A-1
• (C) STADT: Gainesville
• (D) STAAT: FL
• (E) LAND: U.S.A.
• (F) PLZ: 32606
• (v) EDV-LESBARE FORM:
• (A) MEDIUMTYP: Diskette
• (B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
• (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
• (D) SOFTWARE: Patentin Release #1,0, Version #1,25
• (vi) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
• (A) ANMELDUNGSNUUMER: US
• (B) EINREICHUNGSDATUM:
• (C) KLASSIFIZIERUNG:
• (vi ii) ANWALT/VERTRETER-INFORMATION:
• (A) NAME: Saliwanchik, David R.
• (B) ZULASSUNGSNUMMER: 31, 794
• (C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: M/S 104
• (ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
• (A) TELEFON: 904-375-8100
• (B) TELEFAX: 904-372-5800
• (2) INFORMATION FUR SEQ-ID-NR. 1:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 4155 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (B) STAMM: PS17
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS17a
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1627) NRL B-18561
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 1:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 2.
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1385 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS17
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1627) NRRL B-18561
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 2:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 3:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 3867 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (B) STAMM: PS17
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS17b
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1628) NRL B-18562
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 3:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 4:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1289 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS17
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1628) NRRL B-18562
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 4:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 5:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 3771 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: 33f2
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2316) NRL B-18785
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: divers. Merkmal (misc feature)
• (B) LOKALISIERUNG: 4..24
• (D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "Oligonukleotid- Hybridisierungssonde" /Produkt = "GCA/T ACA/T TTA AAT GAA GTA/T TAT" /Standardbezeichnung = "Sonde a" /Notation = "Sonde A"
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: divers. Merkmal
• (B) LOKALISIERUNG: 13..33
• (D) WEITERE INFORMATION: /Funktion = "Oligonukleotid- Hybridisierungssonde" /Produkt = "AAT GAA GTA/T TAT CCA/T GTA/T AAT" /Standardbezeichnung = "Sonde B" /Markierung = "Sonde-b" /Notation = "Sonde b"
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 5:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 6:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1425 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS52A1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2321) NRRL B-18770
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: reifes Peptid (mat peptide)
• (B) LOKALISIERUNG: 1.1425
• (D) WEITERE INFORMATION: /Produkt = "offener Leserahmen des reifen Proteins"
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 6:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 7 (pS52A1):
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 475 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS52A1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2321) NRRL B-18770
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: Protein
• (B) LOKALISIERUNG: 1.475
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 7:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 8:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1185 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS69D1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2317) NRRL B-18816
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: reifes Peptid (mat peptide)
• (B) LOKALISIERUNG: 1..1185
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 8:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 9:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 395 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS69D1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2317) NRRL B-18816
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: Protein
• (B) LOKALISIERUNG: 1..395
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 9:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 10:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 22 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 10: AGARTRKWTW AATGGWGCKM AW
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 11:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 8 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 11:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 12:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 12:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 13:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 14 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 13:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 14:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 17 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 14:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 15:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 24 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 15:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 16:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 23 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 16:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 17:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 56 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRANGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 17:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 18:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 38 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzeisträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 18:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 19:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 17 Basen
• ((B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 19:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 20:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 23 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 20:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 21:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 23 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (c) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 21:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 22:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 28 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 22:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 23:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 20 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 23:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 24:
• (i) SEQUENZE IGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 35 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 24:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 25:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 27 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGTE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 25:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 26:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 23 Basen
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (c) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (synthetisch)
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 26:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 27:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1425 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS86A1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1638) NRRL B-18751
• (ix) MERKAAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: reifes Peptid (mat peptide)
• (B) LOKALISIERUNG: 1..1425
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 27:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 28:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 475 Basenpaare
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) NOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (c) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS86A1
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 1638) NRRL B-18751
• (ix) MERKMAL:
• (A) BEZEICHNUNG/SCHLÜSSEL: Protein
• (B) LOKALISIERUNG: 1..475
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 28:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 29:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 3471 Basenpaare
• (B) TYP: Nukleinsäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: doppelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (B) STAMM: kumamotoensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS50C
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2320) NRRL B-18769
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 29:
• (2) INFORMATION FÜR SEQ-TD-NR. 30:
• (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
• (A) LÄNGE: 1157 Aminosäuren
• (B) TYP: Aminosäure
• (C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
• (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) MOLEKÜLTYP: Protein
• (iii) HYPOTHETISCH: JA
• (iv) ANTI-SENSE: NEIN
• (vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
• (A) ORGANISMUS: Bacillus thuringiensis
• (B) STAMM: kumamotoensis
• (C) INDIVIDUELLES ISOLAT: PS50C
• (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
• (B) KLON: E. coli NM522 (pMYC 2320) NRRL B-18769
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 30:

Claims (11)

1. Verfahren zur Bekämpfung von Akarid-Schädlingen, welches das Kontaktieren der Schädlinge mit einem akariziden B.t.-Delta-Endotoxin umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Endotoxin erhältlich ist aus einem B.t.-Isolat, welches ausgewählt ist aus denjenigen mit den Bezeichnungen PS50C, PS86A1, PS69D1, PS72L1, PS72L2, PS75J1, PS83E5, PS45B1, PS24J, PS94R3, PS17, PS62B1 und PS74G1 und Mutanten davon.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Endotoxin eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus den SEQ-ID-Nummern 2, 41 10, 28 und 30 ausgewählt ist.

4. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Schädling eine Milbe ist, z.B. die zweifleckige Spinnenmilbe.

5. Zusammensetzung, umfassend ein Bacillus thuringiensis- Isolat, welches aus denjenigen mit den Bezeichnungen PS72L1, PS75J1, PS83E5, PS24J und PS94R3 und Mutanten davon ausgewählt ist, oder Proteine, toxische Kristalle oder Sporen dieser Isolate in Verbindung mit einem inerten Träger.

6. Zusammensetzung zur Bekämpfung eines Akarid-Schädlings, umfassend im wesentlichen intakte, behandelte Zellen mit pestizider Aktivität und verlängerter Persistenz im Ernährungsbereich des Schädlings, wenn sie in dessen Umgebung ausgebracht werden, wobei die Aktivität ein für Akarid-Schädlinge toxisches Polypeptid ist, intrazellulär vorliegt und wie in Anspruch 2 definiert erhältlich ist.

7. Pestizide Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Zellen mit chemischen oder physikalischen Mitteln behandelt sind, um die pestizide Aktivität in der Umgebung zu verlängern.

8. Gen, welches für ein gegen Akaride aktives Toxin kodiert, wobei das Gen erhältlich ist aus einem bestimmten Bacillus thuringiensis-Isolat wie in Anspruch 5 definiert oder einer Mutante oder einem Äquivalent davon.

9. Toxin, welches von einem Gen wie in Anspruch 8 definiert kodiert wird, wobei das Toxin gegen Akarid-Schädlinge aktiv ist.

10. Pflanze, Mikroorganismus oder Baculovirus, welche (r) von einem Gen wie in Anspruch 8 definiert transformiert ist.

11. Biologisch reine Kultur von Bacillus thuringiensis, ausgewählt aus den in Anspruch 8 definierten oder einer Mutante davon.