[go: up one dir, main page]

EA020462B1 - Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов - Google Patents

Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов Download PDF

Info

Publication number
EA020462B1
EA020462B1 EA200800174A EA200800174A EA020462B1 EA 020462 B1 EA020462 B1 EA 020462B1 EA 200800174 A EA200800174 A EA 200800174A EA 200800174 A EA200800174 A EA 200800174A EA 020462 B1 EA020462 B1 EA 020462B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
herbicide
sunflower
plants
methyl
Prior art date
Application number
EA200800174A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800174A1 (ru
Inventor
Карлос-Альберто Сала
Адриана-Мариель Эчарте
Мариано БУЛОС
Шерри Р. Уитт
Роберт Ассензи
Original Assignee
Басф Се
Нидера Семильяс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Басф Се, Нидера Семильяс С.А. filed Critical Басф Се
Publication of EA200800174A1 publication Critical patent/EA200800174A1/ru
Publication of EA020462B1 publication Critical patent/EA020462B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1464—Helianthus annuus [sunflower]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/48—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A01N43/50—1,3-Diazoles; Hydrogenated 1,3-diazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Описаны резистентные к гербицидам растения подсолнечника, изолированные полинуклеотиды, кодирующие резистентную к гербицидам и дикого типа большую субъединицу полипептидов ацетогидроксикислотной синтазы (AHASL), и аминокислотные последовательности этих полипептидов. Описаны кассеты экспрессии и векторы трансформации, содержащие полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением, а также растения и клетки-хозяева, трансформированные при помощи полинуклеотидов. Также описаны способы применения полинуклеотидов для повышения резистентности растений к гербицидам и способы борьбы с бурьянами поблизости резистентных к гербицидам растений.

Description

Данное изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, особенно к гербицид-резистентным растениям подсолнечника и новым полинуклеотидным последовательностям, кодирующим дикого типа и имидазолинон-резистентную большую субъединицу белков ацетогидроксикислотной синтазы.
Предпосылки создания изобретения
Ацетогидроксикислотная синтаза (ΑΗΑδ; ЕС 4.1.3.18, также известная как ацетолактат-синтаза или ЛЬ§), является первым ферментом, который катализирует биохимический синтез аминокислот с разветвленной цепью: валина, лейцина и изолейцина (8ίη§Η (1999) Вю8уп1Ье818 οί уайпе, 1еисше апб 18о1еисше, в Р1ап1 Лшшо Άοίά, 8ίη§Η, В.К., ред., Магсе1 Эеккег 1пс. Ыете Уогк, №у Уогк, стр. 227-247). ΑΗΆδ это место действия пяти структурно разных семейств гербицидов, включая сульфонилмочевины (Тап и др. (2005) Ре81 Мапад. δα. 61:246-57; Ма11огу-8шйк и КеШпдет (2003) \ееб ТесЬпо1оду 17:620-626; ЬаКо55а и Ра1ео (1984) Тгепб8 Вю1есЬпо1. 2:158-161), имидазолиноны (8Ьапет и др. (1984) Р1ап1 РЬу8ю1. 76: 545-546), триазолпиримидины (8иЪгашашап и Сегуаск (1989) 1п1иЫОоп оГ асе1о1ас1а1е 8упИа8е Ьу 0та7о1орупт1бте8, в Вюса1а1у818 ш ЛдпсиИига1 Вю1есЬпо1оду, \Ьйакег, ЕК. и 8оппе1 Р.Е. ред., ЛС8 8утро8шт 8ег1е8, Лтепсап СЬетюа1 8ос1е1у, \а8Ыпд1оп, Ό. С, стр. 277-288), пиримидинилоксибензоаты (8иЪтаташап и др. (1990) Р1ап1 РЬу8ю1. 94: 239-244) и сульфониламинокарбонилтриазолиноны (Тап и др. (2005) Ре81 Мапад. δα. 61:246-57; Ма11оту-8тйЬ и КеШпдег (2003) \ееб ТесЬпо1оду 17:620-626). Гербициды на основе имидазолинона и сульфонилмочевины широко применяют в современном сельском хозяйстве благодаря их эффективности при очень низких нормах дозировки и относительной нетоксичности у животных. Ингибируя активность ΑΗΆδ, эти семейства гербицидов предотвращают дальнейший рост и развитие восприимчивых к их действию растений, включая множество видов бурьянов. К нескольким примерам коммерчески доступных гербицидов на основе имидазолинона относятся РИКЬШТ® (имазетапир), δСΕРТΕК® (имазахин) и ΑΒδΕΝΑΣ® (имазапир). Примеры гербицидов на основе сульфонилмочевины включают хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, тифенсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифторсульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфурон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил и галосульфурон.
Преимущественными являются гербициды на основе имидазолинона благодаря их высокой эффективности и низкой токсичности при применении путем распыления на широкой области выращивания растений.
Способность распылять гербицид на широкой области выращивания растений уменьшает затраты, связанные с созданием и обслуживанием посевной площади, и уменьшает потребность в подготовке участка к применению таких химикалий. Распыление сверх желательных стойких к действию гербицидов видов также обуславливает возможность достичь максимально возможного урожая желательных видов из-за отсутствия конкурентных видов. Однако способность применять такие методы распыления зависит от наличия резистентных к имидазолинону видов желательных растений в области обработки путем распыления.
Среди главных сельскохозяйственных культур, некоторые стручковые виды, такие, как соя, являются естественно стойкими к гербицидам на основе имидазолинона из-за их способности быстро метаболизировать соединения гербицидов (Ыапег и КоЪшкоп (1985) \ееб δα. 33: 469-471). Другие культуры, такие, как зерновые (№уЬои8е и др. (1992) Р1ап1 РЬу8ю1. 100: 882886) и рис (Ватгейе и др. (1989) Сгор δ3Β№2Γ5 Гог НегЫайе8, ^айетЕ Рте88, №у Уогк, стр. 195-220) имеют некоторую восприимчивость к гербицидам на основе имидазолинона. Различная чувствительность к гербицидам на основе имидазолинона зависит от химической природы конкретного гербицида и различного метаболизма соединения от токсичной до нетоксичной форм в каждом растении (Ыапег и др. (1984) Р1ап1 РЬу8ю1. 76: 545-546; Вгоуп и др., (1987) Ре80с. ВюсНет. Р1у81о1. 27: 24-29). Разные физиологические отличия растений, такие, как поглощение и перемещения, также играют важную роль в чувствительности (Ыапег и КоЪт8оп (1985) \\еей δοί. 33: 469-471).
Растения, устойчивые к имидазолинонам, сульфонилмочевинам и триазолпиримидинам, были успешно получены при помощи мутагенеза семян, микроспор, пыльцы и калуса в 2еа тау8, Ά^аЪ^άοр8^8 НаИапа, Вта88юа пари8 (то есть, канола) О1усше тах, №сойапа 1аЪасит и Огу/а 8айуа, ^еЪа8Йап и др. (1989) Сгор δΧ. 29: 1403-1408; δуаη8οη и др., 1989 ТЬеог. Άрр1. Оепек 78: 525-530; №уйои8е и др. (1991) ТЬеог. Άрр1. Оепек 83: 65-70; δаΐЬа8^νаη и др. (1991) Р1ап1 РЬу8ю1. 97: 1044-1050; Моитапй и др. (1993) I. Нетеййу 84: 91-96; \Упд1и и Реппег (1998) ТЬеог. Άрр1 Сепеб 96:612-620; Патент США №. 5 545 822). Во всех случаях, единственный частично доминантный ген ядра обусловливал резистентность. Четыре стойкие к имидазолинону растения пшеницы были также предварительно отделены после мутагенеза семян ТпОсит ае80уит Ь. су. Ийе1 (№уЬои8е и др. (1992) Р1ап1 РЬу8ю1. 100: 882-886). Исследования наследственности подтвердили, что единственный частично доминантный ген обусловливал резистентность. На основании исследований аллелей авторы пришли к выводу, что мутации в четырех идентифицированных линиях были расположены в том же локусе. Один из генов резистентности культивара Фиделя обозначали как Ρδ-4 (№уЬои8е и др. (1992) Р1ап1 РЬу8ю1. 100: 882-886).
- 1 020462
Популяции растений природного происхождения, которые, как было обнаружено, были резистентными к гербицидам на основе имидазолинона и/или сульфонилмочевины, также были применены для выведения резистентных к гербицидам селективных линий подсолнечника. Недавно путем использования зародышевой плазмы, полученной из дикой популяции подсолнечника обыкновенного (НеНап11ш8 аппии8), были разработаны две линии подсолнечника, которые являются резистентными к гербициду на основе сульфонилмочевины, в качестве источников признака резистентности к гербициду (МШет и А1КйайЬ (2004) Сгор 8с1. 44: 1037-1038). Ранее А1Ше и др. ((2002) Аеей δα. 50: 432-437) заявили, что отдельные растения из дикой популяции подсолнечника обыкновенного из штата Южная Дакота, США, являлись поперечно резистентными к гербицидам на основе имидазолинона и сульфонилмочевины. Анализ части кодирующей области большой субъединицы генов ацетогидроксикислотной синтазы (АНА8Ь) отдельных растений из этой популяции обнаружил точечную мутацию, приводящую к аминокислотному замещению А1а-На-Уа1 в АНА8Ь белке подсолнечника, которое отвечает А1а205 в АНА8Ь белке АтаЫύορδΐδ (йайапа дикого типа (А1Ше и др. (2003) Аеей δα. 51:845-853). Ранее А1-КйайЬ и МШет ((2000) Сгор δα. 40:869) сообщили про продуцирование четырех селекционных линий подсолнечника, резистентных к имидазолинону.
Компьютерное моделирование трехмерной конформации комплекса АНАδ - ингибитор предполагает несколько аминокислот в предложенном кармане связывания ингибитора как сайты, где вызванные мутации, вероятно, обусловили бы селективную резистентность к имидазолинонам (Ой и др. (1996) 1. Мо1. ВЫ. 263: 359-368). Растения табака, полученные при помощи некоторых из этих рационально разработанных мутаций в предложенных сайтах связывания фермента АНАδ, фактически продемонстрировали специфическую резистентность к отдельному классу гербицидов (Ой и др. (1996) 1. Мо1. Βίο1. 263: 359-368). Про резистентность растений к гербицидам на основе имидазолинона также сообщалось в ряде патентов. В патентах США №№ 4761373, 5331107, 5304732, 6211438, 6211439, 6222100, как правило описывается использование измененного гена АНАδ, чтобы вызвать резистентность к гербицидам у растений, и, в частности, раскрываются определенные устойчивые к имидазолинону линии зерновых. В Патенте США № 5013659 описываются растения, проявляющие резистентность к гербицидам вследствие мутаций, по меньшей мере, в одной аминокислоте в одном или более консервативных участках. Мутации, описанные в нем, кодируют либо поперечную резистентность к имидазолинонам и сульфонилмочевинам, либо специфическую резистентность к сульфонилмочевинам, но специфическая резистентность к имидазолинону не описана. В патентах США № 5731180 и № 5767361 обсуждается изолированный ген, имеющий единственное замещение аминокислоты в аминокислотной последовательности АНАδ дикого типа, что приводит к имидазолинон-специфической резистентности. Кроме того, растения риса, являющиеся резистентными к гербицидам, которые препятствуют АНАδ, были выведены путем селекционирования мутаций, а также путем отбора резистентных к гербицидам растений из совокупности рисовых растений, полученных путем культивирования пыльников. См., патенты США № 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 и 6274796.
У растений, как у всех других исследуемых организмов, фермент АНАδ состоит из двух субъединиц: большой субъединицы (каталитическая роль) и малой субъединицы (регуляторная роль) (ЭидДеЬу и Рапд (2000) 1. Вюсйет. Мо1. Вю1. 33: 1-36). АНАδ большая субъединица (также известная под названием ΛΒΆδΡ) может быть закодирована единственным геном как в случае ЛгаЫйор818 и риса или многими членами генного семейства, как в кукурузе, каноле и хлопке. Специфические замены одного нуклеотида в большой субъединице придают ферменту ступень нечувствительности к одному или нескольким классам гербицидов (Сйапд и Эидд1еЬу (1998) Вюсйет 1. 333: 765-777).
Например, пшеница обыкновенная, Ттйюит ае8ЙУит Ь., содержит три гомологичных гена большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы. Каждый из генов проявляет значительную экспрессию, основанную на реакции гербицида и биохимических данных от мутантов в каждом из этих трех генов (А8сеп71 и др. (2003) 1п1етпайопа1 δοαеίу о! Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1ощ818 Сопдге88, Вагсе1опа, δ|ρ·ιίη. РеГ. Ыо. δ10-17). Кодирующие последовательности всех трех генов разделяют большую гомологичность на нуклеотидном уровне (АО 03/014357). Путем секвенирования генов ΛНАδ^ от нескольких разновидностей Ттйюит ае8ЙУит молекулярной основой стойкости к гербицидам в большинстве 1М1-устойчивых (имидазолинон-устойчивых) линиях, как установлено, была обнаружена мутация δ653(Аΐ)N, включая замещение серина на аспарагин в положении, эквивалентном серину при аминокислоте 653 в АгаЫйор818 1йайапа (АО 03/014356; АО 03/014357). Эта мутация происходит вследствие полиморфизма одного нуклеотида (δΝΡ - 8ш§1е пис1еоОйе ро1утогрй18т) в последовательности ДНК, которая кодирует белок ΛНАδ^.
Также известно, что множественные ΛНАδ^ встречаются в образцах двудольных растений. Недавно Ко1ктап и др. ((2004) Тйеог. Арр1. Сепек 109: 1147-1159) сообщили про идентификацию, клонирование и секвенирование трех ΛНАδ^ генов (ΛНАδ^1, ΛНАδ^2 и ΛНАδ^3) из резистентных к гербицидам и дикого типа генотипов подсолнечника (Нейап1йи8 аппии8 Ь.). Ко1ктап и др. сообщили, что устойчивость к гербицидам была вызвана либо Рго197Ьеи (с использованием номенклатуры аминокислотных положений АгаЬМор818 ΛНАδ^) замещением, либо А1а205Уа1 замещением в белке ΛНΛδ^1. и каждое из этих замещений обеспечивало резистентность как к гербицидам на основе имидазолинона, так и к гербицидам на основе сульфонилмочевины. Принимая во внимание их высокую эффективность и низкую ток- 2 020462 сичность, гербициды на основе имидазолинона являются преимущественными для применения в сельском хозяйстве. Однако, возможность применять гербициды на основе имидазолинона в конкретной системе выращивания сельскохозяйственных культур зависит от наличия имидазолинон-резистентных видов указанного сельскохозяйственного растения. Для получения таких имидазолинон-резистентных видов, селекционеры растений должны выводить селекционные линии с имидазолинон-резистентным свойством. Таким образом, необходимы дополнительные имидазолинон-резистентнные селекционные линии и виды сельскохозяйственных растений, а также способы и композиции для получения и применения имидазолинон-резистентных селекционных линий и видов.
Краткое описание изобретения
Данное изобретение обеспечивает растения подсолнечника, имеющие повышенную резистентность к гербицидам в сравнении с растением подсолнечника дикого типа. В частности, растения подсолнечника в соответствии с данным изобретением имеют повышенную резистентность к гербицидам на основе имидазолинона, в сравнении с растением подсолнечника дикого типа. Резистентные к гербицидам растения подсолнечника в соответствии с данным изобретением содержат по меньшей мере одну копию гена или полинуклеотида, кодирующего гербицид-резистентную большую субъединицу ацетогидроксикислотной синтазы (АНА§Ь). Такой гербицид-резистентный АНА§Ь белок содержит треонин в аминокислотном положении 107 или эквивалентном положении. Резистентное к гербицидам растение подсолнечника в соответствии с данным изобретением может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть или больше копий гену или полинуклеотида, кодирующий гербицид-резистентный АНА§Ь белок в соответствии с данным изобретением. Растения подсолнечника в соответствии с данным изобретением также включают семена и потомство растений, содержащие по меньшей мере одну копию гена или полинуклеотида, кодирующего гербицид-резистентный АНА§Ь белок данного изобретения.
В данном воплощении, данное изобретение обеспечивает гербицид-резистентные растения подсолнечника, происходящие из линии подсолнечника, обозначенной в данной заявке как §4897, и ее потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками §4897. Генетическая линия, обозначенная в данной заявке как ОМ40, была получена из §4897 и обладает ее гербицид-резистентными характеристиками. Образец семян ОМ40 линии был депонирован в Американской коллекции типовых культур (Атепсап Туре СиНиге Со11ес1юп - АТСС) под патентным депозитарным номером АТСС (АТСС Ра1еп1 Эеро511 ЫитЬег) № РТА-6716. Таким образом, растение подсолнечника в соответствии с данным изобретением, обладающее гербицид-резистентными характеристиками ОМ40, или растение подсолнечника, имеющее патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716, также обладают гербицидрезистентными характеристиками §4897. §4897 растения подсолнечника, ОМ40 растения подсолнечника и растения подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716, и их потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками §4897, ОМ40, или растение подсолнечника, имеющее патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716, содержат в своем геноме ген АНА§Ь1, содержащий нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕО ГО №: 1, который кодирует АНА§Ь1 белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в §ЕО ГО №: 2. По сравнению с аминокислотной последовательностью АНА§Ь1 белка (§ЕО ГО №: 4), которая кодируется АНА§Ь1 геном (§ЕО ГО №: 3) из дикого растения подсолнечника, аминокислотная последовательность, представленная в §ЕО ГО №: 2, имеет одну аминокислотное отличие от аминокислотной последовательности дикого типа. В аминокислотной последовательности, представленной в §ЕО ГО №: 2, треонин находится в аминокислотном положении 7. Это положение соответствует положению 107 в полновесном АНА§Ь1 белке подсолнечника, который кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в §ЕО ГО №: 12 (номер доступа АУ541451). В аминокислотной последовательности дикого типа АНА§Ь1 в соответствии с данным изобретением (§ЕО ГО №: 4), это эквивалентное аминокислотное положение имеет аланин. Если не указано иное, то аминокислотные положения, приведенные в данной заявке для АНА§Ь белков подсолнечника, отвечают аминокислотным положениям полновесной аминокислотной последовательности, представленной в §ЕО ГО №: 12.
В другом воплощении данное изобретение обеспечивает гербицид-резистентные растения подсолнечника, представляющие собой линию подсолнечника, обозначенную в данной заявке как ОМ1606. Образец семян генетического материала ОМ1606 депонирован в АТСС под патентным депозитарным номером АТСС № РТА-7606. Таким образом, данное изобретение обеспечивает гербицид-резистентные растения подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606, и их потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками растений подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606. Подобно растениям подсолнечника §4897 и ОМ40, ОМ1606 и их потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками ОМ1606, содержат в своих геномах ген АНА§Ь1, кодирующий АНА§Ь1 белок, содержащий треонин в положении 107 в полновесном АНА§Ь1 белке подсолнечника. Аналогично, растения подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606, и их потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками растений подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606, содержат в своих геномах ген АНА§Ь1, кодирующий АНА§Ь1 белок, содержащий треонин в положении 107 в полновесном АНА§Ь1 белке подсолнечника.
- 3 020462
Данное изобретение дополнительно обеспечивает изолированные полинуклеотиды и изолированные полипептиды для (НсПап11ш5 аппиик) ЛНЛ8Ь белков подсолнечника. Полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением охватывают нуклеотидные последовательности, кодирующие гербицидрезистентный и дикого типа ЛНЛ8Ь белки, включая белки, кодирующиеся АНЛ8Ь1, ЛНЛ8Ь2 и ЛНЛ8Ь3 генами, но не ограничиваясь ими. Гербицид-резистентные ЛНЛ8Ь белки подсолнечника в соответствии с данным изобретением представляют собой гербицид-резистентные ЛНЛ8Ь белки, содержащие аминокислоту, отличающуюся от аланина, в положении 107 полновесного АНЛ8Ь1 белка подсолнечника или в эквивалентном положении. Преимущественно, аминокислотой в положении 107 или в эквивалентном положении является треонин. Полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением охватывают нуклеотидные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №№: 1 и 3, нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №№: 2 и 4, и фрагменты и варианты указанных нуклеотидных последовательностей, кодирующие белки, обладающие активностью АНА8.
Данное изобретение обеспечивает кассеты экспрессии для экспрессии полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением в растениях, растительных клетках и других нечеловеческих клеткаххозяевах. Кассеты экспрессии содержат промотор, который может экспрессироваться в растении, растительной клетке или других рассматриваемых клетках-хозяевах, функционально связанный с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, который кодирует белок ЛНЛ8Ь дикого типа или гербицид-резистентный белок ЛНЛ8Ь. В случае необходимости для направления экспрессии на хлоропласт, кассета экспрессии может также содержать функционально связанную направленную на хлоропласт последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропласта, чтобы направить экспрессированый белок ЛНЛ8Ь на хлоропласт. Кассеты экспрессии в соответствии с данным изобретением можно применять в способе для повышения устойчивости к гербициду растения и клетки-хозяина. Указанный способ включает трансформирование растения или клетки-хозяина при помощи кассеты экспрессии в соответствии с данным изобретением, где кассета экспрессии содержит промотор, что может экспрессироваться у растения или в клетке-хозяине, который рассматривается, и промотор, функционально связанный с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, кодирующий гербицид-резистентный ЛНЛ8Ь белок в соответствии с данным изобретением. Способ дополнительно включает восстановление трансформированного растения из трансформированной растительной клетки.
Данное изобретение обеспечивает способ повышения АНА8 активности в растении, который включает трансформирование растительной клетки при помощи полинуклеотидной конструкции, которая содержит нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, который запускает экспрессию в растительной клетке, и восстановление трансформированного растения из трансформированной растительной клетки. Нуклеотидную последовательность выбирают из тех нуклеотидных последовательностей, которые кодируют гербицид-резистентный или дикий АНА8Ь белки в соответствии с данным изобретением, особенно нуклеотидные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №№: 1 и 3, и нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №№: 2 и 4, и их фрагменты и варианты. Растение, полученное в соответствии с данным способом, имеет повышенную АНА8 активность по сравнению с ^трансформированным растением.
Данное изобретение обеспечивает способ получения резистентного к гербициду растения, который включает трансформирование растительной клетки при помощи полинуклеотидной конструкции, содержащей нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, который запускает экспрессию в растительной клетке, и восстановление трансформированного растения из указанной трансформированной растительной клетки. Нуклеотидную последовательность выбирают из тех нуклеотидных последовательностей, которые кодируют гербицид-резистентный или дикий АНА8Ь белки в соответствии с данным изобретением, особенно нуклеотидные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №: 1, нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ ГО №: 2, и их фрагменты и варианты. Резистентное к гербициду растение, полученное в соответствии с данным способом, имеет повышенную резистентность, по сравнению с нетрансформированным растением по меньшей мере к одному гербициду, особенно гербициду на основе имидазолинона.
Данное изобретение обеспечивает способ повышения устойчивости к гербицидам у стойкого к гербицидам растения. Способ применяют для повышения резистентности растения, которое уже является резистентным к уровню гербицида, который бы уничтожал или в значительной степени поражал растение дикого типа. Такое устойчивое к гербицидам растение может представлять собой устойчивое к гербицидам растение, которое было создано методами генной инженерии для устойчивости к гербицидам, или устойчивое к гербицидам растение, которое было разработано при помощи методов, в которых не задействуют рекомбинантную ДНК, такое, как, например, растения подсолнечника 84897, СМ40, и СМ1606 в соответствии с данным изобретением. Указанный способ включает трансформирование устойчивого к гербицидам растения при помощи полинуклеотидной конструкции, которая содержит нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, который запускает экспрессию в растительной клетке, и восстановление трансформированного растения из трансформированной
- 4 020462 растительной клетки. Нуклеотидную последовательность выбирают из тех нуклеотидных последовательностей, которые кодируют гербицид-резистентные АНА8Ь белки в соответствии с данным изобретением, особенно нуклеотидную последовательность, представленную в 8ЕО ГО №: 1, нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в 8ЕО ГО №: 2, и их фрагменты и варианты.
Данное изобретение обеспечивает векторы трансформации, содержащие выбираемый ген-маркер в соответствии с данным изобретением. Выбираемый ген-маркер содержит промотор, который запускает экспрессию в клетке-хозяине, функционально связанный с полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую резистентный к гербицидам АНА8Ь белок в соответствии с данным изобретением. Вектор трансформации может дополнительно содержать ген, который рассматривается, который будет экспрессироваться в клетке-хозяине, и может также, по желанию, включать направленную на хлоропласт последовательность, функционально связанную с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением.
Данное изобретение дополнительно обеспечивает способы применения векторов трансформации в соответствии с данным изобретением для выбора клеток, трансформированных при помощи гена, который рассматривается. Такие способы включают трансформирование клетки-хозяина при помощи вектора трансформации путем действия на клетку того уровня количества гербицида на основе имидазолинона, которая могла бы разрушать или ингибировать рост ^трансформированной клетки-хозяина, и идентификацию трансформированной клетки-хозяина по ее способности расти в присутствии гербицида. В одном воплощении данного изобретения, клетка-хозяин - это растительная клетка, а выбираемый генмаркер содержит промотор, который запускает экспрессию в растительной клетке.
Данное изобретение обеспечивает способ для контроля бурьянов поблизости от резистентных к гербицидам растений в соответствии с данным изобретением, включая гербицид-резистентные растения подсолнечника, описанные выше, и растений, трансформированных при помощи гербицид-резистентных АНА8Ь полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением. Такие трансформированные растения содержат в своих геномах, по меньшей мере, одну кассету экспрессии, содержащей промотор, который запускает экспрессию в растительной клетке, где промотор функционально связан с полинуклеотидом АНА8Ь в соответствии с данным изобретением. Указанный способ включает применение эффективного количества гербицида к бурьянам и к резистентному к гербицидам растению, причем резистентное к гербицидам растение имеет повышенную резистентность, по меньшей мере, к одному гербициду, особенно гербициду на основе имидазолинона по сравнению с растением дикого типа или нетрансформированным растением.
Растения в соответствии с данным изобретением могут быть трансгенными или нетрансгенными. Пример нетрансгенного растения подсолнечника, имеющего повышенную резистентность к гербицидам на основе имидазолинона и/или гербицидов на основе сульфонилмочевины, включает растения подсолнечника 84897, ОМ40 или ОМ1606 и растения подсолнечника, имеющие патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716 или РТА-7606; или мутантное, рекомбинантное или генетически модифицированное производное 84897, ОМ40 или ОМ1606 растение подсолнечника, имеющее патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716 или РТА-7606, или двух и более 84897, ОМ40, ОМ1606 растений подсолнечника, имеющих патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716, и растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606; или какого-либо потомства 84897, ОМ40 или ОМ1606, растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716 РТА7606, двух или более 84897, ОМ40, ОМ1606 растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716 и растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606; или растения, которое является потомством какого-либо из этих растений; или растения, обладающего характеристикой гербицидной резистентности 84897, ОМ40, ОМ1606 растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-6716, и/или растения подсолнечника, имеющего патентный депозитарный номер АТСС № РТА-7606.
Данное изобретение также обеспечивает растения, растительные органы, растительные ткани, растительные клетки, семена и нечеловеческие клетки-хозяева, трансформированные по меньшей мере при помощи одного полинуклеотида, кассеты экспрессии или вектора трансформации в соответствии с данным изобретением. Такие трансформированные растения, растительные органы, растительные ткани, растительные клетки, семена и нечеловеческие клетки-хозяева имеют повышенную устойчивость или резистентность по меньшей мере к одному гербициду, на уровнях гербицидов, которые разрушают или ингибируют рост нетрансформированного растения, растительной ткани, растительной клетки или нечеловеческой клетки-хозяина, соответственно. Преимущественно трансформированные растения, растительные ткани, растительные клетки и семена в соответствии с данным изобретением являются АтаЫбор818 Шайаиа, подсолнечником и другими сельскохозяйственными растениями.
Данное изобретение дополнительно обеспечивает изолированные полипептиды, содержащие имидазолинон-резистентный и дикого типа АНА8Ь белки подсолнечника. Изолированные полипептиды содержат аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ГО №№ 2 и 4, аминокислотные последовательности, кодированные нуклеотидными последовательностями, представленными в 8ЕО ГО
- 5 020462 №№: 1 и 3, и фрагменты и варианты указанных аминокислотных последовательностей, которые кодируют белки, обладающие АНАЗ активностью.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показана линеаризованная нуклеотидная последовательность нуклеотидных последовательностей резистентного к гербицидам гена подсолнечника АНАЗЬ1 (ЗЕС ГО №: 1), гена подсолнечника АНАЗЬ1 дикого типа (ЗЕС ГО №: 3), СеиБаик Ассеззюи Νο. Ш6280 (ЗЕС ГО №: 5), СеиБаик Ассез5юи Νο. ΑΥ541451 (ЗЕС ГО №: 11) и СеиВаик Ассеззюп Νο. ΑΥ124092 (ЗЕС ГО №: 13). Сайт одной мутации у (ЗЕС ГО №: 1) обозначен звездочкой. Мутация представляет собой транзицию С-на-А в нуклеотидном положении 21 ЗЕС ГО №: 1.
На фиг. 2 показана линеаризованная аминокислотная последовательность гербицид-резистентного АНАЗЬ1 белка подсолнечника (ЗЕС ГО №: 2), АНАЗЬ1 белка подсолнечника дикого типа (ЗЕС ГО №: 4), СеиВаик Ассеззюи Νο. И16280 (ЗЕС ГО №: 6), СеиВаик Ассеззюи Νο. ΑΥ541451 (ЗЕС ГО №: 12) и СеиВаик Ассеззюн Νο. ΑΥ 124092 (ЗЕС ГО №: 14). Звездочкой обозначен сайт одного аминокислотного замещения (А1а-на-ТЬт), найденного в резистентном к гербицидам АНАЗЬ1 белке подсолнечника. Этот сайт замещения соответствует аминокислотному положению 7 в неполном АНАЗЬ1 аминокислотном остатке, представленном в ЗЕС ГО №: 2. Эквивалентным положением этого замещения в полновесном АНАЗЬ1 аминокислотном остатке подсолнечника, представленного в ЗЕС ГО №: 12, является 107.
Фиг. 3 представляет собой фотоиллюстрацию, на которой показана повышенная устойчивость к гербицидам растений подсолнечника З4897 (правая сторона) по сравнению с устойчивыми к гербицидам растениями подсолнечника ΙΜΙ3υΝ-1 (А1-КйабЬ и МШет (2000) Сгор ЗсЕ 40:869-870) в оранжерейном исследовании. Растения подсолнечника З4897 и ΙΜΙ3υΝ-1 обрабатывали имазамоксом путем распыления в количестве 200 г аРат. Контрольные растения подсолнечника дикого типа не выживали после обработки распылением имазамоксом в количествах 100 или 200 г аРат (не показано). Фотографию делали через несколько дней после обработки растений распылением.
Фиг. 4 является графической иллюстрацией гербицидного поражения в оранжерейном тесте после обработки растений подсолнечника ΙΜΙ3υΝ-1, дикого типа и З4897 распылением имазамокса в количествах 100 (левый столбец) или 200 г аР га (темные столбцы). На этой фигуре показано, что гербицидрезистентные растения подсолнечника З4897 имеют значительно большую резистентность или устойчивость к количествам имазамокса по сравнению с гербицид-резистентными растениями ΙΜΙ3υΝ-1 и растениями дикого типа. Гербицидное поражение оценивали через 17 дней после нанесения имазамокса. Известно, что у растений ΙΜΙ3υΝ-1 аланин замещен на валин в аминокислоте 190 (ΚοΙΕιικιπ и др. (2004) ΤΠόγ. Арр1. СеиеЕ 109: 1147-1159).
Фиг. 5 представляет собой фотоиллюстрацию, на которой показана повышенная устойчивость к гербицидам растений подсолнечника З4897 (правая сторона) по сравнению с гербицид-резистентными растениями подсолнечника ΙΜΙ3υΝ-1 в оранжерейном исследовании, описанном в примере 4.
Фиг. 6 представляет собой фотоиллюстрацию, на которой показана повышенная устойчивость к гербицидам растений подсолнечника З4897 по сравнению с растениями подсолнечника С1еагПе1б®. вид А, в оранжерейном исследовании, описанном в примере 5.
Фиг. 7 является графической иллюстрацией сравнения ингибирования АНАЗ при помощи Раптор для растений подсолнечника вида не-С1еатйе1б, вида С1еагПе1б и З4897, как описано в примере 5.
Фиг. 8 является графической иллюстрацией сравнения ингибирования АНАЗ при помощи Глин для растений подсолнечника вида не-С1еатйе1б, вида С1еагПе1б и З4897, как описано в примере 5.
Фиг. 9 является графической иллюстрацией влияния нанесения имазапира на листья, когда рост растений составлял 14 дней после обработки двух мутантов подсолнечника. Средний рост (% от необработанных участков), представленный в виде квадратов и планок погрешностей, которые представляют стандартное отклонение средних значений.
Фигура 10 является графической иллюстрацией влияния нанесения имазапира на листья на индекс фитотоксичности (ΡΙ) через 14 дней после обработки двух мутантов подсолнечника. Среднее значение ΡΙ представлено в виде квадратов и планок погрешностей, которые представляют собой стандартное отклонение средних значений.
Фиг. 11 является графической иллюстрацией влияния нанесения имазапира на накопление биомассы через 14 дней после обработки двух мутантов подсолнечника. Среднее значение сухой биомассы (% необработанных участков) представлено в виде квадратов и планок погрешностей, которые представляют собой стандартное отклонение средних значений.
Фиг. 12 является графической иллюстрацией влияния нанесения имазапира на корневую биомассу через 14 дней после обработки двух мутантов подсолнечника. Среднее значение сухой массы корней (% от необработанных участков) представлено в виде квадратов и планок погрешностей, которые представляют собой стандартное отклонение средних значений.
Перечень последовательностей
Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, приведенные в приложенном перечне последовательностей, указаны с использованием стандартных буквенных сокращений для нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода для аминокислот. При изображении нуклеотидных последовательно- 6 020462 стей придерживаются стандартного метода, в соответствии с которым начало находится на 5' конце последовательности и далее движутся вперед (то есть, слева направо в каждой линии) до 3' конца. Показана только одна цепь каждой последовательности нуклеиновых кислот, тем не менее понятно, что комплементарная цепь должна быть включена путем какой-либо ссылки на указанную цепь. При изображении аминокислотных последовательностей придерживаются стандартного метода, в соответствии с которым начало находится на конце последовательности с аминогруппой, и далее движутся вперед (то есть, слева направо в каждой линии) до конца с карбоксигруппой.
§ЕО ГО №: 1 представляет собой неполную нуклеотидную последовательность, кодирующую резистентный к гербицидам ЛНЛ§Ь1 белок из линии подсолнечника §4897.
§ЕО ГО №: 2 представляет собой неполную аминокислотную последовательность резистентного к гербицидам ЛНЛ§Ь1 белка, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в §ЕО ГО №: 1.
§ЕО ГО №: 3 представляет собой неполную нуклеотидную последовательность, кодирующую АНЛ§Ь1 белок дикого типа из линии подсолнечника ВТК47.
§ЕО ГО №: 4 представляет собой неполную аминокислотную последовательность АНА§Ь1 белка дикого типа, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной у §ЕО ГО №: 3.
§ЕО ГО №: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность, СеиБаик Лссе88юп Νο. И16280.
§ЕО ГО №: 6 представляет собой аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью СепВапк Лссеккюи Νο. И16280.
§ЕО ГО №: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность НЛ1И409 праймера, описанного в примере 2.
§ЕО ГО №: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность НЛ1Ы379 праймера, описанного в примере 2.
§ЕО ГО №: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность НЛ1Ш313 праймера, описанного в примере 2.
§ЕО ГО №: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность НЛ1Ь2131 праймера, описанного в примере 2.
§ЕО ГО №: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность СепВапк Лссеккюи Νο. ЛУ541451.
§ЕО ГО №: 12 представляет собой аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью СепВапк Лссе88юп Νο. ЛУ541451.
§ЕО ГО №: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность СепВапк Лссе88юп Νο. ЛУ124092.
§ЕО ГО №: 14 представляет собой аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью СепВапк Лссе88юп Νο. ЛУ124092.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к растениям подсолнечника, обладающим повышенной резистентностью к гербицидам по сравнению с растением подсолнечника дикого типа. Резистентные к гербицидам растения подсолнечника получали, как описано в данной заявке ниже, подвергая растения подсолнечника дикого типа (по отношению к резистентности к гербицидам) действию мутагена, позволяя растениям дозревать и размножаться и выбирая потомственные растения, которые показали повышенную резистентность к гербициду на основе имидазолинона, по сравнению с резистентностью растения подсолнечника дикого типа. Данное изобретение обеспечивает резистентные к гербицидам линии подсолнечника, которые в данной заявке имеют названия §4897, СМ40 и СМ1606.
Из §4897 гербицид-резистентных растений подсолнечника и растений подсолнечника дикого типа ВТК47, кодирующий участок большой субъединицы гена ацетогидроксикислотной синтазы (которая обозначается как ЛНЛ§Ы) выделяли при помощи амплификации путем полимерной цепной реакции (ПЦР) и секвенировали. Путем сравнения полинуклеотидных последовательностей резистентных к гербицидам и дикого типа растений подсолнечника было открыто, что кодирующий участок ЛНЛ§Ь1 полинуклеотидной последовательности из резистентного к гербицидам растения подсолнечника отличался от ЛНЛ§Ь1 полинуклеотидной последовательности растения дикого типа на один нуклеотид, транзицию С на А в нуклеотиде 21 (§ЕО ГО №: 1). Указанная транзиция С на А в АНЛ§^1 полинуклеотидной последовательности приводит к замещению аланина на треонин в аминокислоте 7 (§ЕО ГО №: 2) в консервативном участке предполагаемой аминокислотной последовательности гербицид-резистентного АНЛ§^1 белка подсолнечника (§ЕО ГО №: 2), по сравнению с эквивалентным аминокислотным положением АНЛ§^1 белка дикого типа линии подсолнечника ВТК47 (то есть, аминокислоты 7 §ЕО ГО №: 4).
Из-за того, что нуклеотидная последовательность, представленная в §ЕО ГО №: 1, не соответствует полновесному кодирующему участку АНЛ§^ белка, аминокислотная последовательность, которая кодируется таким образом, как представлено у §ЕО ГО №: 2, также является меньшей, чем полновесная. Для облегчения сравнения с другими АНЛ§^ аминокислотными последовательностями подсолнечника, аминокислотные положения АНЛ§^ белков подсолнечника, приведенные в данной заявке, если иное не ука- 7 020462 зано или не следует из контекста, где такие последовательности имеются, отвечают аминокислотным положениям полновесной аминокислотной последовательности АНА8Ь1 белка подсолнечника, который кодируется нуклеотидной последовательностью с ОеиБаик Лсееккюи Νο. ΑΥ541451 (8ЕО ΙΌ №: 12). Соответственно, замещение аланин на треонин в аминокислотном положении 7 8ЕО ГО №: 2 соответствует аминокислотному положению 107 в аминокислотной последовательности 8ЕО ГО №: 12.
Таким образом, данное изобретение описывает аминокислотное замещение, которое может быть применено для получения гербицид-резистантных АНА8Ь белков подсолнечника, полинуклеотидов, которые кодируют такие белки, и гербицид-резистантных растений, растительных тканей, растительных клеток и семян. Из-за того, что аланин, который находится в аминокислотном положении 107 в полновесных АНА8Ь1 белках подсолнечника дикого типа или эквивалентном положении, находится на участке аминокислот, который является консервативным во всех видах растений, то ожидается, что замещение другой аминокислоты, преимущественно, треонина, для этого же консервативного аланина в других АНА8Ь белках подсолнечника (например, АНА8Ь2 и АНА8Ь3) также будет придавать устойчивость к гербицидам. Таким образом, полинуклеотид, кодирующий АНА8Ь белок подсолнечника, может быть подвергнут мутациям в соответствии с каким-либо способом, известным из уровня техники, таким, как, например, сайт-направленый мутагенез, для получения полинуклеотида подсолнечника, кодирующего АНА8Ь белок, где треонин находится в положении 107 или в эквивалентном положении. Полинуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности, кодирующиеся таким образом, отвечают АНА8Ь1, АНА8Ь2 и АНА8Ь3 генам подсолнечника, представленным в ОеиБаик Ассеккюи №№. ΑΥ541451 (НЕС) ГО №№: 11 и 12), ΑΥ541452, ΑΥ541453, ΑΥ541454, ΑΥ541455, ΑΥ541456, ΑΥ541457 и ΑΥ541458; все из которых приведены в данной заявке путем ссылок. Соответственно, такие полинуклеотиды и гербицид-резистентные АНА8Ь белки, кодирующиеся таким образом, применяют для получения гербицид-резистентных растений, растительных клеток, растительных тканей и семян при помощи способов, описанных в данной заявке.
Данное изобретение дополнительно охватывает изолированные АНА8Ь2 и АНА8Ь3 полинуклеотиды подсолнечника, кодирующие гербицид-резистентные АНА8Ь2 и АНА8Ь3 белки, соответственно. Каждый из таких гербицид-резистентных АНА8Ь2 и АНА8Ь3 белков содержит аминокислоту, отличающуюся от аланина, в положении 107 или в эквивалентном положении. Преимущественно, у таких гербицид-резистентных АНА8Ь2 и АНА8Ь3 белков, аминокислотой, которая находится в положении 107 или эквивалентном положении, является треонин.
Изобретение дополнительно относится к изолированным молекулам полинуклеотидов, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие большую субъединицу белков ацетогидроксикислотной синтазы (АНА8Ь) и к таким АНА8Ь белкам. Данное изобретение раскрывает выделение и нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего резистентный к гербицидам АНА8Ь1 белок подсолнечника из резистентного к гербицидам растения подсолнечника, которое получали путем химического мутагенеза растений подсолнечника дикого типа. Резистентные к гербицидам АНА8Ь1 белки в соответствии с данным изобретением имеют замещение аланин на треонин в положении 107 или в эквивалентном положении в их соответствующих аминокислотных последовательностях по сравнению с соответственной аминокислотной последовательностью дикого типа. Данное изобретение дополнительно описывает выделение и нуклеотидную последовательность полинуклеотидной молекулы, кодирующей АНА8Ь1 белок подсолнечника дикого типа.
Данное изобретение обеспечивает изолированные полинуклеотидные молекулы, кодирующие АНА8Ь белки подсолнечника (НеНайЪик аипиик Ь.). В частности, данное изобретение обеспечивает изолированные полинуклеотидные молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, представленные в 8ЕО ГО №№: 1 и 3, нуклеотидные последовательности, кодирующие АНА8Ь белки, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕО ГО №№: 2 и 4, и фрагменты и варианты таких нуклеотидных последовательностей, кодирующие функциональные АНА8Ь белки.
Изолированные резистентные к гербицидам АНА8Ь полинуклеотидные молекулы в соответствии с данным изобретением содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие резистентные к гербицидам АНА8Ь белки. Такие полинуклеотидные молекулы могут быть применены в полинуклеотидных конструкциях для превращения растений, особенно сельскохозяйственных растений, для повышения резистентности указанных растений к гербицидам, в частности гербицидам, которые, как известно, ингибируют АНА8 активность, более конкретно, к гербицидам на основе имидазолинона. Такие полинуклеотидные конструкции могут быть применены в кассетах экспрессии, векторах экспрессии, векторах трансформации, плазмидах и подобных. Трансгенные растения, полученные после трансформации при помощи таких полинуклеотидных конструкций, показывают повышенную резистентность к АНА8ингибирующим гербицидам, таким как, например, гербициды на основе имидазолинона и гербициды на основе сульфонилмочевины.
Композиции в соответствии с данным изобретением включают нуклеотидные последовательности, кодирующие АНА8Ь белки. В частности, данное изобретение обеспечивает изолированные полинуклеотидные молекулы, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, приведенные в 8ЕО ГО №№: 2 и 4, и их фрагменты и варианты и кодирующие полипеп- 8 020462 тиды, имеющие ΑΗΑδ активность. Дополнительно обеспечены полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая кодируется полинуклеотидной молекулой, описанной в данной заявке, например, такую, которая представлена в δΕΟ ГО №№: 1 и 3, и ее фрагменты и варианты, кодирующие полипептиды, обладающие ΆΗΆδ активностью.
Изобретение охватывает изолированные или в значительной степени очищенные композиции нуклеиновых кислот или белков. Изолированная или очищенная полинуклеотидная молекула или белок, или их биологически активная часть, являются в значительной степени или существенно свободными от компонентов, которые обыкновенно сопровождают полинуклеотидную молекулу или белок или взаимодействуют с ними в их окружающей естественной среде. Таким образом, изолированная или очищенная полинуклеотидная молекула или белок являются в значительной степени свободными от другого клеточного материала, или культуральной среды, при получении при помощи рекомбинантных методов, или в значительной степени свободны от химических прекурсоров или других химических соединений при химическом синтезе. Преимущественно, изолированная нуклеиновая кислота является свободной от последовательностей (преимущественно, последовательностей, кодирующих белок), которые естественно окружают нуклеиновую кислоту (то есть, последовательности, расположенные на 5' и 3' концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Например, в разных вариантах воплощения изолированная полинуклеотидна молекула может содержать менее, чем, приблизительно, 5 кЬ, 4 кЬ, 3 кЬ, 2 кЬ, 1 кЬ, 0,5 кЬ или 0,1 кЬ нуклеотидных последовательностей, которые естественно окружают полинуклеотидную молекулу в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота. Белок, который являются в значительной степени свободным от клеточного материала, включает препараты белка, содержащие менее чем приблизительно, 30, 20, 10, 5 или 1% (по сухой массе) контаминирующего белка. При получении белка в соответствии с данным изобретением или его биологически активной части с помощью рекомбинантных методов, преимущественная культуральная среда содержит менее чем приблизительно 30, 20, 10, 5 или 1% (за сухой массой) химических прекурсоров или химических соединений, которые не являются рассматриваемым белком.
Данное изобретение обеспечивает изолированные полипептиды, содержащие ΑΗΑδΤ белки. Изолированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, представленных в δΕΟ ГО №№: 2 и 4, аминокислотных последовательностей, которые кодируются нуклеотидными последовательностями, представленными в δΕΟ ГО №№: 1 и 3, и функциональные фрагменты и варианты указанных аминокислотных последовательностей, которые кодируют ΑΗΑδΤ полипептид, обладающий ΑΗΑδ активностью. Под функциональными фрагментами и вариантами подразумевают фрагменты и варианты иллюстративных полипептидов, обладающих ΑΗΑδ активностью.
В конкретных воплощениях данного изобретения способы включают применение устойчивых к гербицидам или резистентных к гербицидам растений. Под термином устойчивое к гербицидам или резистентное к гербицидам растение следует подразумевать растение, которое является устойчивым или резистентным по меньшей мере к одному гербициду на уровне, который обычно разрушал бы или ингибировал бы рост нормального растения или растения дикого типа. В одном воплощении данного изобретения устойчивые к гербицидам растения в соответствии с данным изобретением содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ белок. Под термином устойчивый к гербицидам ΑΗΑδΤ белок или резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ белок следует подразумевать, что такой ΑΗΑδΤ белок проявляет более высокую ΑΗΑδ активность по сравнению с ΑΗΑδ активностью ΑΗΑδΤ белка дикого типа в присутствии по меньшей мере одного гербицида, который, как известно, препятствует ΑΗΑδ активности при концентрации или уровне гербицида, который, как известно, ингибирует ΑΗΑδ активность ΑΗΑδΤ белка дикого типа. Дополнительно ΑΗΑδ активность такого устойчивого к гербицидам или резистентного к гербицидам ΑΗΑδΤ белка может в данной заявке иметь название устойчивая к гербицидам или резистентная к гербицидам ΑΗΑδ активность.
Для данного изобретения термины устойчивый к гербицидам и резистентный к гербицидам употребляют как взаимозаменяемые и, как предполагается, имеющие эквивалентное значение и эквивалентную область. Аналогично, термины устойчивость к гербицидам и резистентность к гербицидам употребляют как взаимозаменяемые и, как предполагается, имеющие эквивалентное значение и эквивалентную область. Аналогично, термины имидазолинон-резистентный, резистентный к имидазолинону и резистентность к имидазолинону употребляют как взаимозаменяемые и, как предполагается, имеющие эквивалентное значение и эквивалентную область, что и термины имидазолинонустойчивый, устойчивый к имидазолинону и устойчивость к имидазолинону соответственно.
Данное изобретение охватывает резистентные к гербицидам ΑΗΑδΤ полинуклеотиды и резистентные к гербицидам ΑΗΑδΤ белки. Под термином резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ полинуклеотид следует подразумевать полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий гербицид-резистентной ΑΗΑδ активностью. Под термином резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ белок следует подразумевать белок или полинуклеотид, обладающий гербицид-резистентной ΑΗΑδ активностью.
Дополнительно признано, что устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ белок может быть введен в растение путем трансформирования растения или его предшественника при
- 9 020462 помощи нуклеотидной последовательности, кодирующей устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам АНА8Ь белок. Такие устойчивые к гербицидам или резистентные АНА8Ь белки кодируются устойчивыми к гербицидам или резистентными к гербицидам АНА8Ь полинуклеотидами. Альтернативно, устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам АНА8Ь белок может встречаться у растения в результате естественного происхождения или может быть вызван мутацией в эндогенном АНА8Ь гене в геноме растения или его предшественника.
Данное изобретение обеспечивает растения, растительные ткани, растительные клетки и клеткихозяева с повышенной резистентностью или устойчивостью по меньшей мере к одному гербициду, особенно гербициду на основе имидазолинона или сульфонилмочевины. Преимущественное количество или концентрация гербицида представляют собой эффективное количество или эффективную концентрацию. Под эффективным количеством и эффективной концентрацией подразумевают количество и концентрацию, соответственно, достаточные для уничтожения или ингибирования роста подобных, дикого типа, растения, растительной клетки или клетки-хозяина, тем не менее, указанное количество не уничтожает или не ингибирует в значительной степени рост гербицид-резистентных растений, растительных тканей, растительных клеток и клеток-хозяев в соответствии с данным изобретением. Типично, эффективное количество гербицида представляет собой количество, которое традиционно применяют в системах сельскохозяйственного производства для уничтожения рассматриваемых бурьянов. Такое количество известно специалистам в данной области.
Под термином подобное, дикого типа, растение, растительная ткань, растительная клетка или клетка-хозяин подразумевают растение, растительную ткань, растительную клетку или клетку-хозяин, соответственно, которая не имеет характеристик резистентности к гербицидам и/или определенному полинуклетиду в соответствии с данным изобретением, который описан в данной заявке. Поэтому при употреблении термина дикого типа не подразумевают, что растение, растительная клетка или иная клеткахозяин не содержат рекомбинантную ДНК в своем геноме, и/или не имеют характеристик резистентности к гербицидам, которые отличаются от описанных в данной заявке.
Как употребляется в данной заявке, если четко не указано иное, термин растение предназначен для обозначения растения какой-либо стадии развития, а также какой-либо части или частей растения, которая может быть прикреплена к или отделена от целого интактного растения. Такие части растения включают органы, ткани и клетки растений, но не ограничиваются ими. Примеры конкретных частей растения включают стебель, листья, корень, соцветие, цветок, цветок компактного соцветия, фрукт, цветоножку, плодоножку, тычинку, пыльник, рыльце, столбик, завязь, лепесток, чашелистик, плодолистик, концовку корня, корневой чехлик, корневую волосинку, листовые волосинки, волосинки семян, пыльцевое зернышко, микроспору, семядолю, гипокотиль, эпикотиль, ксилему, флоему, паренхиму, эндосперм, клетку-спутник, замыкающую клетку и любые другие известные органы, ткани и семена растения. Более того, признано, что семена - это растение.
Растение в соответствии с данным изобретением включают как нетрансгенные растения, так и трансгенные растения. Под термином нетрансгенное растение подразумевают растение, в геноме которого не хватает рекомбинантной ДНК. Под термином трансгенное растение подразумевают растение, геном которого содержит рекомбинантную ДНК. Такое трансгенное растение может быть получено путем введения рекомбинантной ДНК в геном растения. Когда такая рекомбинантная ДНК включена в геном трансгенного растения, потомство растения может также содержать рекомбинантную ДНК. Потомство растения, содержащее по меньшей мере часть рекомбинантной ДНК по меньшей мере одного предшествующего трансгенного растения, также представляет собой трансгенное растение.
Данное изобретение обеспечивает гербицид-резистентную линию подсолнечника, которая в данной заявке имеет название 84897, ее потомство и производные, обладающие гербицид-резистентными характеристиками 84897. Депонирование семян подсолнечника ОМ40, полученного из линии подсолнечника 84897, обладающего гербицид-резистентными характеристиками 84897, было осуществлено в патентном депозитарии американской коллекции типовых культур (Ра1сп1 Эсро511огу о! 1йс Атепсап Туре СиИите Со11есБоп -АТСС), Мапкаккак, УА 20110 И8А 17 мая 2005 р., обозначено патентным депозитарным номером американской коллекции типовых культур РТА-6716. Депонирование линии подсолнечника ОМ40 было сделано на срок по крайней мере 30 лет, и по крайней мере 5 лет после последнего запроса для обеспечения образца депозита, полученного АТСС. Дополнительно заявители удовлетворили все условия 37 С.Р.К. §§ 1.801-1.809, включая обеспечение указания жизнеспособности образца.
Данное изобретение обеспечивает гербицид-резистентную линию подсолнечника, которая в данной заявке имеет название ОМ1606.
Депонирование семян подсолнечника ОМ1606 было осуществлено в патентном депозитарии американской коллекции типовых культур (Ра1еи1 ОерокЬоту о! 1йе Атспсап Туре СиИите СоИесйоп - АТСС), Мапкаккак, УА 20110 И8А 19 мая 2006 р., обозначено патентным депозитарным номером американской коллекции типовых культур РТА-7606. Депонирование линии подсолнечника ОМ40 было сделано на срок по крайней мере 30 лет и по крайней мере 5 лет после последнего запроса для обеспечения образца депозита, полученного АТСС. Дополнительно заявители удовлетворили все условия 37 С.Р.К. §§ 1.8011.809, включая обеспечение указания жизнеспособности образца.
- 10 020462
Данное изобретение обеспечивает резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полученные путем мутационного селекционирования. Растения подсолнечника дикого типа были мутагенизированы путем воздействия на растения мутагена, особенно химического мутагена, более конкретно, этилметансульфоната (ЕМ§). Тем не менее, данное изобретение не ограничивается гербицид-резистентными растениями подсолнечника, которые получают способом мутагенеза, включая химический мутаген ЕМ§. Любой способ мутагенеза, известный из уровня техники, может быть применен для получения резистентных к гербицидам растений подсолнечника в соответствии с данным изобретением. Такие способы мутагенеза могут включать, например, применение какого-либо одного или более из таких мутагенов: излучение, такое, как рентгеновское излучение, гамма излучение (например, кобальта 60 или цезия 137), нейтроны, (например, продукт деления ядра ураном 235 в атомном реакторе), бета излучение (например, эмитированное из радиоизотопов, таких, как фосфор 32 или углерод 14), и ультрафиолетовое излучение (преимущественно, от 2500 до 2900 нм), и химические мутагены, такие, как основные аналоги (например, 5-бромурацил), родственные соединения (например, 8-этоксикафеин), антибиотики (например, стрептонигрин), алкилирующие агенты (например, сернистые иприты, азотистые иприты, эпоксиды, этиленамины, сульфаты, сульфонаты, сульфоны, лактоны), азид, гидроксиламин, азотистую кислоту или акридины. Резистентные к гербицидам растения также могут быть получены путем применения способов тканевых культур для того, чтобы выбрать растения, содержащие резистентные к гербицидам мутации, и потом восстанавливает из них резистентные к гербицидам растения. См., например, патенты США №№ 5773702 и 5859348, оба из них полностью включены в эту заявку путем ссылок. Дополнительные детали мутационного селекционирования можно найти в РттщраП οί СиШуат Эеуе1ортеп1 Рейт, 1993 МастЛ1ап РиЪШШпд Сотрапу, описание которой включено в данную заявку путем ссылки.
Анализ АНА§Ь1 гена растения подсолнечника линий §4897 и СМ1606 обнаружил ту мутацию, которая приводит к замещению треонина на аланин, найденному в аминокислотном положении 7 в АНА§Ь1 аминокислотной последовательности дикого типа для §ЕС ГО №: 4. Аминокислотное положение 7 в §ЕС ГО №№: 2 и 4 соответствует аминокислотному положению 107 в полновесной аминокислотной последовательности АНА§Ь1 белка подсолнечника, представленного в §ЕС ГО №: 12. Таким образом, данное изобретение описывает, что замещение другой аминокислоты на аланин в аминокислотном положении 107, или в эквивалентном положении, в белке АНА§Ь может привести к тому, что растение подсолнечника буде иметь повышенную резистентность к гербициду, особенно гербициду на основе имидазолинона и/или сульфонилмочевины. Как описано у примере 6 ниже, аланин в аминокислотном положении 107 встречается в консервативном участке АНА§Ь белков. Аналогично, были описаны аминокислотные замещения в других консервативных участках АНА§Ь белков, которые, как известно, придают гербицидную резистентность растению, содержащему такой АНА§Ь белок. Соответственно, гербицид-резистентные растения подсолнечника в соответствии с данным изобретением включают растения подсолнечника, содержащие в их геномах по меньшей мере одну копию АНА§Ь полинуклеотида, кодирующего гербицид-резистентный АНА§Ь белок, содержащий треонин в аминокислотном положении 107 или эквивалентном положении, но не ограничиваются ними.
Растения подсолнечника в соответствии с данным изобретением дополнительно включают растения, содержащие, по сравнению с АНА§Ь белком дикого типа, треонин или другую аминокислоту, что отличается от аланин у, в аминокислотном положении 107 или эквивалентном положении, и одну или более дополнительные аминокислотные замещения в АНА§Ь белке по сравнению с АНА§Ь белком дикого типа, где такое растение подсолнечника имеет повышенную резистентность по меньшей мере до одного гербицида по сравнению с растением подсолнечника дикого типа. Такие растения подсолнечника содержат АНА§Ь белки, содержащие треонин или другую аминокислоту, которая отличается от аланина, в аминокислотном положении 107 или эквивалентном положении и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, которая состоит из: аланина, треонина, гистидина, лейцина, аргинина, изолейцина, глутамина, или серина в аминокислотном положении 182 или эквивалентном положении; изолейцина или другой аминокислоты, которая отличается от треонина в аминокислотном положении 188 или эквивалентном положении; аспартата или валина в аминокислотном положении 190 или эквивалентном положении; лейцина в аминокислотном положении 559 или эквивалентном положении; и аспарагина, треонина, фенилаланина или валина в аминокислотном положении 638 или эквивалентном положении.
Данное изобретение обеспечивает АНА§Ь белки с аминокислотными замещениями в конкретных аминокислотных положениях в пределах консервативных участков АНА§Ь белков подсолнечника, описанных в данной заявке. Дополнительно специалист в данной области признает, что такие аминокислотные положения могут изменяться в зависимости от того, добавлены ли аминокислоты или удалены из, например, Ν-терминального конца аминокислотной последовательности. Таким образом, данное изобретение охватывает аминокислотные замещения в описанном положении или эквивалентном положении (например, аминокислотное положение 107 или эквивалентное положение). Под эквивалентным положением подразумевают положение, которое находится в пределах того же самого консервативного участка, что и иллюстративное аминокислотное положение. Такие консервативные участки известны из уровня техники (см. таблицу, приведенную ниже) или могут быть определены при помощи многоразовой линеаризации последовательностей, как описано в данной заявке, или при помощи способов, известных
- 11 020462 из уровня техники.
Дополнительно данное изобретение обеспечивает ЛНЛБЬ полипептиды, содержащие аминокислотные замещения, которые, как известно, придают растению резистентность по меньшей мере к одному гербициду, особенно гербициду на основе имидазолинона и/или гербицида на основе сульфонилмочевины. Такие ЛНЛБЬ полипептиды включают, например, те,которые содержат треонин в аминокислотном положении 107 и по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, которая состоит из аланина, треонина, гистидина, лейцина, аргинина, изолейцина, глутамина, или серина в аминокислотном положении 182 или эквивалентном положении; изолейцина или другой аминокислоты, иной, чем треонин, в аминокислотном положении 188 или эквивалентном положении; аспартата или валин у в аминокислотном положении 190 или эквивалентном положении; аспартата или валина в аминокислотном положении 190 или эквивалентном положении; лейцина в аминокислотном положении 559 или эквивалентном положении; и аспарагина, треонина, фенилаланина или валина в аминокислотном положении 638 или эквивалентном положении. Данное изобретение дополнительно обеспечивает изолированные полинуклеотиды, кодирующие такие ЛНЛ§Ь полипептиды, а также кассеты экспрессии, векторы трансформации, трансформированные клетки-хозяева, трансформированные растения и способы, включающие такие полинуклеотиды.
Данное изобретение обеспечивает способы для повышения устойчивости или резистентности растений, растительной ткани, растительной клетки или другой клетки-хозяина к по меньшей мере одному гербициду, который препятствует активности ЛНЛ§ фермента. Преимущественно, такой ЛНЛ§ингибирующий гербицид представляет собой гербицид на основе имидазолинона, гербицид на основе сульфонилмочевины, гербицид на основе триазолопиримидина, гербицид на основе пиримидинилоксибензоата, гербицид на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона или их смесь. Преимущественно, такой ЛНЛ§-ингибирующий гербицид представляет собой гербицид на основе имидазолинона, гербицид на основе сульфонилмочевины, гербицид на основе триазолопиримидина, гербицид на основе пиримидинилоксибензоата, гербицид на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона или их смесь. Для данного изобретения, к гербицидам на основе имидазолинона принадлежат, не ограничиваясь приведенными, ΡυΚδυϊΤ® (имазетапир), СЛЭКЕ* (имазапик), КАРТОЙ® (имазамокс), 8СЕРТЕК® (имазахин), ΑδδΕΚΤ® (имазетабенз), ΑΚδΕΝΑΕ® (имазапир), производные какого-либо из вышеуказанных гербицидов, или смесь двух или большего количества указанных выше гербицидов, например, таких, как имазапир/имазамокс (ΟΌΥδδΕΥ®). Более конкретно, гербицид на основе имидазолинона может быть выбран, но не ограничен, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновой кислотой, 2-(4изопропил-4 метил- 5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновой кислотой, 5-этил-2-(4-изопропил4-метил-5-оксо-2- имидазолин-2-ил)никотиновой кислотой, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислотой, 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновой кислотой и смесью метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата, но не ограничивается ними. Применение 5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2ил)никотиновой кислоты и 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты является преимущественным. Применение 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновой кислоты является особенно преимущественным.
Для данного изобретения, гербициды на основе сульфонилмочевины включают, не ограничиваясь приведенными, хлорсульфурон, метсульфуронметил, сульфометуронметил, хлоримуронэтил, тифенилсульфуронметил, трибенуронметил, бенсульфуронметил, никосульфурон, этаметсульфуронметил, римсульфурон, трифлусульфуронметил, триасульфурон, примисульфуронметил, циносульфурон, амидосульфуон, флазасульфурон, имазосульфурон, пиразосульфуронэтил, галосульфурон, азимсульфурон, циклосульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон метил, форамсульфурон, йодсульфурон, оксасульфурон, мезосульфурон, просульфурон, сульфосульфурон, трифлоксисульфурон, тритосульфурон, производное какого-либо из указанных выше гербицидов, и смесь двух или более из указанных выше гербицидов. Гербициды на основе триазолопиримидина в соответствии с данным изобретением включает, не ограничиваясь приведенными, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам и пеноксулам. Гербициды на основе пиримидинилоксибензоата в соответствии с данным изобретением включают, не ограничиваясь приведенными, биспирибак, пиритиобак, пириминобак, пирибензоксим и пирифталид. Гербициды на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона включают, не ограничиваясь приведенными, флукарбазон и пропоксикарбазон.
Известно, что гербициды на основе пиримидинилоксибензоата тесно связаны с гербицидами на основе пиримидинилтиобензоата и обобщены под заголовком названия последнего компанией \Уссб δείепсе δοείοίν οί Атепса. Соответственно, гербициды в соответствии с данным изобретением дополнительно включают гербициды на основе пиримидинилтиобензоата, включая гербициды на основе пиримидинилоксибензоата, описанные выше, но не ограничиваясь ими.
Данное изобретение обеспечивает способы повышения ΑΠΑδ активности в растениях, которые включают трансформирование растений при помощи полинуклеотидной конструкции, содержащей про- 12 020462 мотор, функционально связанный с АНА§Ь1 нуклеотидной последовательностью в соответствии с данным изобретением. Указанные способы включают введение полинуклеотидной конструкции в соответствии с данным изобретением по меньшей мере в одну растительную клетку и восстановление из трансформированного растения. Указанные способы включают применение промотора, способного запускать экспрессию гена в растительной клетке. Преимущественно такой промотор представляет собой конститутивный промотор или преимущественный для ткани промотор. Указанные способы применяют для усиления или повышения резистентности растения по меньшей мере к одному гербициду, который препятствует каталитической активности АНА§ фермента, особенно гербициду на основе имидазолинона.
Данное изобретение обеспечивает кассеты экспрессии для экспрессии полинуклеотидов данного изобретения в растениях, растительных тканях, растительных клетках и других клетках-хозяевах. Кассеты экспрессии содержат промотор, который может экспрессироваться в рассматриваемых растении, растительной ткани, растительной клетке или другой клетке-хозяине, функционально связанных с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую полновесную (то есть, содержащую транзитный пептид хлоропласта) или зрелый АНА§Ь1 белок (то есть, без транзитного пептида хлоропласта). Если экспрессия является желательной в пластидах или хлоропластах растений или растительных клеток, кассета экспрессии может также содержать функционально связанную хлоропласт-направленную последовательность, кодирующую транзитный пептид хлоропласта.
Кассеты экспрессии в соответствии с данным изобретением применяют в способе усиления устойчивости к гербициду растения или клетки-хозяина. Указанный способ включает трансформирование растения или клетки-хозяина при помощи кассеты экспрессии в соответствии с данным изобретением, где кассета экспрессии содержит промотор, который может экспрессироваться в рассматриваемых растении или клетке-хозяине, и указанный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующий резистентный к имидазолинону АНА§Ь белок в соответствии с данным изобретением.
Употребление в данной заявке термина нуклеотидные конструкции не предназначено для ограничения данного изобретения полинуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалисты в данной области признают, что полинуклеотидные конструкции, особенно полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и комбинаций рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов могут также быть применены в способах, описанных в данной заявке. Таким образом, полинуклеотидные конструкции в соответствии с данным изобретением охватывают все полинуклеотидные конструкции, которые могут быть применены в способах в соответствии с данным изобретением для трансформации растений, включая те, которые состоят из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их комбинаций, но не ограничиваются ими. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды включают как молекулы, которые встречаются в природе, так и синтетические аналоги. Полинуклеотидные конструкции в соответствии с данным изобретением также охватывают все формы полинуклеотидных конструкций, включая одно-цепочечные формы, двух цепочечные формы, шпильки, структуры стебли-и-петли и т.п., но не ограничиваясь ими. Дополнительно, специалистам в данной области понятно, что каждая нуклеотидная последовательность, описанная в данной заявке, также охватывает комплемент той приведенной нуклеотидной последовательности.
Дополнительно, каждая нуклеотидная последовательность, описанная в данной заявке, также охватывает комплемент той приведенной нуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением, может использовать полинуклеотидную конструкцию, способную направлять в трансформированном растении экспрессию по меньшей мере одного белка или по меньшей мере одной РНК, такой как, например, антисмысловая РНК, комплементарная к по меньшей мере части иРНК. Типично, такая полинуклеотидная конструкция состоит из кодирующей последовательности для белка или РНК, функционально связанной с 5' и 3' транскрипционными регуляторными участками.
Альтернативно, также признано, что способы в соответствии с данным изобретением могут использовать полинуклеотидную конструкцию, не способную направлять в трансформированном растении экспрессию белка или РНК.
Дополнительно, признано, что для экспрессии полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением в клетке-хозяине, которая рассматривается, полинуклеотид является типично функционально связанным с промотором, способным запускать ген экспрессии в клетке-хозяине, которая рассматривается. Способы в соответствии с данным изобретением для экспрессии полинуклеотидов в клетке-хозяине не зависят от конкретного промотора. Указанные способы включают применение какого-либо промотора, известного из уровня техники и способного запускать ген экспрессии в клетке-хозяине, которая рассматривается.
Данное изобретение охватывает АНА§Ь полинуклеотидные молекулы и их фрагменты и варианты. Полинуклеотидные молекулы, которые представляют собой фрагменты этих нуклеотидных последовательностей, также включены в данное изобретение. Под термином фрагмент подразумевают часть нуклеотидной последовательности, кодирующий АНА§Ь белок в соответствии с данным изобретением. Фрагмент АНА§Ь нуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением может ко- 13 020462 дировать биологически активную часть АНА8Б белка или он может быть фрагментом, который может быть использован как гибридизационный зонд или праймер ПЦР, с использованием описанных ниже методов. Биологически активная часть АНА8Б белка может быть получена путем выделения части одной из АНА8Б нуклеотидных последовательностей в соответствии с данным изобретением, экспрессии закодированной части АНА8Б белка (например, путем рекомбинантной экспрессии ίη νίίτο), и оценки активности закодированной части АНА8Б1 белка. Полинуклеотидные молекулы, которые являются фрагментами АНА8Б нуклеотидной последовательности, содержат по меньшей мере приблизительно 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 или 1100 нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, которые присутствуют в полновесной нуклеотидной последовательности, описанной в данной заявке (например, 1178 нуклеотидов для обеих 8ЕЦ ГО №№: 1 и 3) в зависимости от предполагаемого применения.
Фрагмент АНА8Б нуклеотидной последовательности, кодирующий биологически активную часть АНА8Б белка в соответствии с данным изобретением, будет кодировать по меньшей мере приблизительно, 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 или 350 соседних аминокислот или вплоть до общего количества аминокислот, которые присутствуют в полновесном АНА8Б1 белке в соответствии с данным изобретением (например, 392 аминокислот для обеих 8ЕЦ ГО №№: 2 и 4). Фрагменты АНА8Б1 нуклеотидной последовательности, полезные как гибридизационный зонд для ПЦР праймеров, в основном, не должны кодировать биологически активную часть АНА8Б1 белка.
Полинуклеотидные молекулы, представляющие собой варианты нуклеотидных последовательностей, описанных в данной заявке, также включены в данное изобретение. Варианты АНА8Б нуклеотидных последовательностей в соответствии с данным изобретением включают те последовательности, которые кодируют АНА8Б белки, описанные в данной заявке, но которые консервативно отличаются изза вырожденности генетического кода. Указанные аллельные варианты естественного происхождения могут быть определены путем применения хорошо известных способов молекулярной биологии, например, при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методов гибридизации, как описано ниже. Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие, как последовательности, полученные, например, при применении сайтнаправленого мутагенеза, но которые все еще кодируют АНА8Б1 белок, раскрытый в данном изобретении, как описано ниже. Как правило, варианты нуклеотидных последовательностей в соответственно с изобретением будут иметь по меньшей мере приблизительно, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 , или 99%идентичности к определенной нуклеотидной последовательности, описанной в данной заявке. Вариантная АНА8Б нуклеотидная последовательность будет кодировать АНА8Б белок соответственно, содержащий аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности к аминокислотной последовательности АНА8Б белка, описанного в данной заявке.
Дополнительно, специалист далее поймет, что путем мутации могут быть введены изменения в нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением, что, таким образом, приводит к изменениям в аминокислотной последовательности закодированных АНА8Б белков без изменения биологической активности АНА8Б белков. Таким образом, изолированная полинуклеотидная молекула, кодирующая АНА8Б белок, имеющий последовательность, которая отличается от последовательности 8ЕЦ ГО №№: 1 или 3, соответственно, может быть создана путем введения одного или более нуклеотидных замещений, добавлений или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в данной заявке, таким образом, что одну или более аминокислотных замещений, добавлений или делеций вводят в закодированный белок. Мутации могут быть введены при помощи стандартных способов, таких, как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные нуклеотидные последовательности также включены в данное изобретение.
Например, преимущественно, консервативные аминокислотные замещения могут быть осуществлены в одном или более предусмотренных, преимущественно заменимых аминокислотных остатках. Заменимый аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен в последовательности дикого типа АНА8Б белка (например, последовательности 8ЕЦ ГО №№: 2 и 4, соответственно) без изменения биологической активности, в то время как незаменимый аминокислотный остаток является необходимым для биологической активности. Консервативное аминокислотное замещение представляет собой замещение, при котором аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий подобную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющие подобные боковые цепи, были определены в уровне техники. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, такие, как лизин, аргинин, гистидин), с кислотными боковыми цепями (например, такие, как аспарагиновая кислота, глютаминовая кислота), с незаменимыми полярными боковыми цепями (например, такие, как глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярными боковыми цепями (например, такие, как аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разветвленными боковыми цепями (например, такие, как треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, такие, как тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Такие замещения могли бы быть сделаны для консервативных
- 14 020462 аминокислотных остатков или для аминокислотных остатков, которые находятся в пределах консервативного фрагмента.
Белки в соответствии и изобретением могут быть изменены разными способами, включая замещения, делеции, усекания и инсерции аминокислот. Способы для таких манипуляций хорошо известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотной последовательности АНА8Ь1 белка могут быть получены путем мутаций в ДНК. Способы для мутагенеза и изменений нуклеотидной последовательности хорошо известны из уровня техники. См., например, Кипке1 (1985) Ргос. Νηΐ1. Асай. δει. υδΑ 82:488492; Кипке1 и др. (1987) Мейюйк ίη Еп/уто1. 154:367-382; Патент США № 4 873 192; \Уа1кег апй ОаакКа, ейк. (1983) ТесЬтциек ш Мо1еси1аг Вю1оду (МасМШап РиЬккШпд Сотрапу, №\у Уотк) и ссылки, приведенные в них. Инструкции относительно соответствующих аминокислотных замещений, которые не влияют на биологическую активность белка, который рассматривается, можно обнаружить в модели ЭзуНоГГ и др. (1978) АЙак оГ Рго1еш Зециепсе апй §1гис1иге (№Ш. Вютей. Кек. Роипй., ХУакЬтдЮп, И.С.), которая включена в данную заявку путем ссылки. Консервативные замещения, такие, как обмен одной аминокислоты на другую, обладающую подобными свойствами, могут быть преимущественными.
Альтернативно, вариантные АНА8Ь нуклеотидные последовательности могут быть сделаны путем введения мутаций случайным образом во всей или в части АНА8Ь кодирующей последовательности, таких, как мутагенез насыщения, и полученные мутанты могут быть отсортированы по АНАЗ активности для определения мутантов, которые сохранили АНАЗ активность, включая АНАЗ активность резистентности к гербицидам. После мутагенеза, закодированный белок может быть рекомбинантно экспрессирован, и активность белка может быть определена с использованием стандартных методов анализа.
Таким образом, нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением включают последовательности, описанные в данной заявке, а также их фрагменты и варианты. АНА8Ь нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением и их фрагменты и варианты могут быть применены в качестве зондов и/или праймеров для определения и/или клонирования АНА8Ь гомологов в других растениях. Такие зонды могут быть применены для выявления транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же самые или идентичные белки.
Таким образом, такие способы, как ПЦР, гибридизация и подобные, могут быть применены для определения таких последовательностей, обладающих значительной идентичностью с последовательностями в соответствии с данным изобретением. См., например, ЗатЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1ошп§: ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (2й ей., Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬотаШгу Ргекк, Р1ату1е№, ΝΥ) и 1птк, и др. (1990) РСК РтоЮсок: А Ошйе Ю Мейюйк апй Аррйсайопк (Асайепис Ргекк, ΝΥ). АНА8Ь нуклеотидные последовательности, изолированные на основании идентичности их последовательностей к АНА8Ь1 нуклеотидных последовательностей, представленных в данной заявке, или к их фрагментам и Вар1аНТаМ, включены в данное изобретение.
В способе гибридизации все или часть из известных АНА8Ь нуклеотидных последовательностей могут быть применены для отсортировки кДНК или геномных библиотек. Способы для конструирования таких кДНК и геномных библиотек, в основном, известны из уровня техники и описаны у ЗатЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаФгу Мапиа1 (2й ей., Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬотаФгу Ргекк, Р1ату1е№, ΝΥ). Так называемые гибридизационные зонды могут представлять собой геномные ДНК фрагменты, кДНК фрагменты, РНК фрагменты или другие олигонуклеотиды, и могут быть мечеными при помощи групп, которые обнаруживаются, таких как 32Р, или какой-либо иной маркер, который обнаруживается, такой, как другие радиоизотопы, флуоресцентное соединение, фермент, или ферментный кофактор. Зонды для гибридизации могут быть получены путем меток синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной АНА8Ь нуклеотидной последовательности, описанной в данной заявке. Дополнительно могут быть использованы вырожденные праймеры, разработанные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатках в известной АНА8Ь нуклеотидной последовательности или закодированной аминокислотной последовательности. Зонд обычно включает участок нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере приблизительно до 12, преимущественно приблизительно 25, более преимущественно приблизительно 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 или 1178 последовательных нуклеотидов АНА8Ь нуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением, их фрагмента или варианта. Получение зондов для гибридизации, в основном, известное из уровня техники, описано у ЗатЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬотаШгу Мапиа1 (2й ей., Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Р1ату1е\у, №ν Υо^к), которое включено в данную заявку путем ссылки.
Например, целая АНА8Ь последовательность, описанная в данной заявке, или одна или более ее частей может быть применена в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться к соответствующим АНА8Ь последовательностям и деформационным РНК. Способы гибридизации включают гибридизационный скрининг покрытых библиотек ДНК (или пятна или колонии; см., например, ЗатЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬотаШгу Мапиа1 (2й ей., Со1й §ргшд НагЬог ЬаЬотаФгу Ргекк, Р1ашу1е\у, №ν Υо^к).
Г ибридизация таких последовательностей может быть выполнена в жестких условиях. Под жесткими условиями или жесткими условиями гибридизации подразумевают условия, при которых зонд
- 15 020462 гибридизуется к его целевой последовательности в ощутимо большей степени, чем к другим последовательностям (например, по меньшей мере, 2-кратно по сравнению с базовым уровнем).
Жесткие условия зависят от последовательности и будут разными при разных обстоятельствах.
Как правило, жесткие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,5 М ионов Ыа, обычно, приблизительно, от 0,01 до 1,0 М ионов Να (или других солей) при рН 7,0-8,3 и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, более чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия могут также быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Иллюстративные слабые условия жесткости включают гибридизацию с буферным раствором, содержащим 30-35% формамида, 1 М ЫаС1, 1% 8Ό8 (натрия додецилсульфата) при 37°С, и промывание 1Х до 2Х 88С (20Х 88С = 3,0 М ЫаС1/0,3 М тринатрия цитрата) при 50-55°С. Иллюстративные умеренные условия жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С, и промывание 0,5Х до 1Х 88С при 55 до 60°С. Иллюстративные сильные условия жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М ЫаС1, 1% 8Ό8 при 37°С, и промывание в 0,1Х 88С при 60-65°С. Необязательно, промывные буферы могут содержать приблизительно от 0,1 до 1% 8Ό8. Продолжительность гибридизации обычно составляет менее чем приблизительно 24 ч, обычно приблизительно от 4 до 12 ч.
Специфичность типично является функцией постгибридизационных промывок, критическими факторами являются ионная сила и температура концевого промывочного раствора. Для гибридов ДНК-ДНК Тт может быть приблизительно определена из уравнения Меткой и \УаП1 (1984) Апа1. Вюскет. 138:267284: Тт = 81,5°С + 16,6 (1од М) + 0,41 (% ГЦ) - 0,61 (% форм) - 500/Ь; где М - молярность одновалентных катионов, % ГЦ - процент гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм - процент формамида в растворе для гибридизации и Ь - длина гибрида в парах оснований, Тт - температура (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% комплементарной целевой последовательности гибридизуется до прекрасно подобранного зонда. Тт уменьшается приблизительно на 1°С для каждого 1% несоответствия; таким образом, Тт, гибридизация, и/или условия промывки могут быть подобраны таким образом, чтобы гибридизоваться до последовательностей желаемой идентичности. Например, если ищут последовательности с > 90% идентичностью, Тт можно уменьшить на 10°С. Вообще, жесткие условия выбирать таким образом, чтобы температура составляла приблизительно на 5°С ниже, чем температура плавления (Тт) для определенной последовательности и ее комплемента при конкретной ионной силе и конкретном рН. Однако в сильно жестких условиях можно использовать гибридизацию и/или промывку при 1, 2, 3, или 4°С ниже, чем температура плавления (Тт); в условиях средней жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже, чем температура плавления (Тт); в низких условиях жесткости можно использовать гибридизацию и/или промывку при 11, 12, 13, 14, 15 или 20°С ниже, чем температура плавления (Тт). При помощи уравнения, гибридизации и состава растворов для промывки и желательной Тт специалисты в данной области поймут, что изменения в жесткости гибридизации и/или растворах для промывки неразделимо связаны. Если желательная степень несоответствия приводит к Тт менее, чем 45°С (водный раствор) или 32°С (раствор формамида), желательно увеличить концентрацию 88С таким образом, чтобы могла быть использована более высокая температура. Исчерпывающее руководство по гибридизации нуклеиновых кислот найдено у Туккеп (1993) ЬаЬота1оту ТесНп1циек ίη Вюскетййу апй Мо1еси1аг Вюйду-НуЬпй/аОоп \\ί11ι Ыис1ею Ашй РгоЬек, Рай I, Скар1ег 2 (Е1кеу1ет, Ыеу Уогк); и АикиЬе1 и др., ейк. (1995) Сиггей: Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1о§у, Скар1ет 2 (Отеепе РиЬИкйпд апй УйеуЧйеткаепсе, Ыеу Уогк). См. 8атЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1ойпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (2й ей., Со1й 8рйпд НагЬог ЬаЬотайгу Ргекк, Р1ашу1еу, Ыеу Уогк).
Признано, что полинуклеотидные молекулы и белки в соответствии с данным изобретением охватывают полинуклеотидные молекулы и белки, содержащие нуклеотид или аминокислотную последовательность, которая в достаточной степени идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО №№: 1 и/или 3, или аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО №№: 2 и/или 4. Термин в достаточной степени идентичный употребляют в данной заявке для того, чтобы отнести первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность, содержащую достаточное или минимальное количество идентичных или эквивалентных (например, с одинаковой боковой цепью) аминокислотных остатков или нуклеотидов, ко второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, таким образом, чтобы первая и вторая аминокислотная или нуклеотидная последовательности имели одинаковый структурный домен и/или одинаковую функциональную активность. Например, аминокислотные или нуклеотидные последовательности, содержащие одинаковый структурный домен, имеющий, по меньшей мере, приблизительно 45, 55 или 65% идентичности, преимущественно 75% идентичности, более преимущественно 85, 95 или 98% идентичности, определены в данной заявке как в достаточной степени идентичные.
Для определения процента идентичности между двумя аминокислотными последовательностями или двумя нуклеиновыми кислотами, последовательности линеаризуют в целях оптимального сравнения. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества одинаковых положений, поделенную на последовательности (то есть процент идентичности = количест- 16 020462 во одинаковых положений/общее количество положений (например, положений, которые перекрываются) х 100). В одном воплощении, две последовательности имеют одинаковую длину. Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен с использованием технологии, подобной описанным ниже, с разрешительными интервалами или без них. При расчете процента идентичности обычно рассчитывают точные пары совпадений.
Определения процента идентичности последовательности между двумя последовательностями может быть произведено, используя математический алгоритм. Преимущественный, не ограничивающий пример математического алгоритма, который используют для сравнения двух последовательностей, представляет собой алгоритм Каг1ш и АЙ8сйи1 (1990) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. δα. ЩА 87:2264, модифицированный как у Кагйп и АЙ8сйи1 (1993) Ргос. Ыаб. Асаб. δ^. 90:5873-5877. Такой алгоритм включен в
NΒ^АδΤ и XΒ^АδТ программы АЙ8сйи1 и др. (1990) 1. Мо1. Вю1. 215:403. Нуклеотидные поиски Β^АδТ можна производить при помощи программы NΒ^ΛδТ. балл = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных полинуклеотидным молекулам в соответствии с данным изобретением. Поиски нуклеотида Β^АδТ могут быть выполнены при помощи программы NΒ^ΛδТ. балл = 50, длина = 3, с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка в соответствии с данным изобретением. Чтобы получить выравнивания с промежутками в целях сравнения, можна применять Сарреб Β^ΛδТ. как описано в АЙ8сйи1 и др. (1997) Ыис1ею Ас1б8 Ре8. 25:3389. Альтернативно, можно применять Γδ^^δ^ чтобы выполнить повторный поиск, который выявляет отдаленные взаимоотношения между молекулами. См. А118сйи1 и др. (1997) выше. При применении Β^ΛδТ. Сарреб Β^ΛδТ. РδI-Β^АδТ программ, можно использовать параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XΒ^АδТ и NΒ^АδΤ). См. 1Шр://\у\у\у.псЫ.п1т.шЙ8оу. Другой преимущественный, не ограничивающий пример математического алгоритма, который используют для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм Муег8 и Мб1ег (1988) СΛΒIОδ 4:11-17. Такой алгоритм включен в АЬЮЫ программу (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения для линеаризации последовательностей ССС. При использовании АЬЮЫ программы для сравнения аминокислотных последовательностей, РАМ 120 таблица масс остатков, может быть использован штраф длины промежутка 12, и штраф промежутка 4. Выравнивания могут также быть осуществлены вручную путем проверки.
Если не указано иное, значения идентичности/схожести последовательности, представленные тут, относятся к значению, полученному с использованием всей длины последовательностей в соответствии с изобретением и линеаризации при помощи алгоритма С1и81а1 А (Ыис1ею Ааб Ре8еагсй, 22(22): 46734680, 1994), при помощи программы АИдпХ, включенной в пакет программного обеспечения Уеског ΝΤΙ 8ш1е Версия 7 (1пГогМах, 1пс., Ве1йе8ба, МО, ЩА) с использованием параметров по умолчанию; или любой эквивалентной программы. Под эквивалентной программой подразумевают любую программу сравнения последовательности, которая для любых двух рассматриваемых последовательностей производит выравнивание, имеющее идентичные пары нуклеотидных или аминокислотных остатков и идентичный процент идентичности последовательности при сравнении с соответствующим выравниванием, сделанным при помощи АНдпХ в пакете программного обеспечения УесЮг ΝΤΙ δωίΌ Версия 7.
ΛНАδ^ нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением включают как последовательности естественного происхождения, так и мутантные формы, особенно мутантные формы, кодирующие ΛНАδ^ белки, обладающие гербицид-резистентной ΛНАδ активностью. Аналогично, белки в соответствии с данным изобретением охватывают как белки, которые встречаются в природе, так и их варианты и модифицированные формы. Такие варианты продолжают иметь желательную активность ΛНАδ. Очевидно, мутации, которые будут осуществлены в последовательности ДНК, кодирующей этот вариант, не должны содержать последовательность вне рамки считывания и, желательно, не будут создавать комплементарные участки, которые могли создать вторичную структуру иРНК. См., публикацию патентной заявки ЕР № 75444.
Делеции, инсерции и замещения последовательностей белков, включенные в данную заявку, как ожидается, не вносят радикальных изменений в характеристики белка. Тем не менее, в случае, если тяжело заранее предвидеть точный эффект замещения, делеции или инсерции, для специалиста в данной области будет очевидным, что эффект будет оцениваться при помощи рутинных скрининговых анализов. Таким образом, активность может быть оценена при помощи анализов ΛНАδ активности. См., например, δίη§1 и др. (1988) Апа1. Вюсйет. 171:173-179, включенную в данную заявку путем ссылки.
Вариантные нуклеотидные последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные мутагенными и рекомбинантными методами, такими, как тасование ДНК. По такому методу можно манипулировать одной или большим количеством разных ΛНАδ^ кодирующих последовательностей, чтобы создать новый ΛНАδ^ белок, имеющий преимущественные свойства. Таким образом, получают библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов из совокупности полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащие участки последовательности, имеющие существенную идентичность последовательности и могут быть гомологично рекомбинированы ίη уйго или ίη У1уо. Например, используя данный подход, мотивы последовательности, кодирующие домен, который рассматривается, могут быть перетасованы между геном ΛНАδ^ в соответствии с данным изобретением и дру- 17 020462 гими известными генами АНАБЬ для получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, который рассматривается, как, например, увеличение Кт в случае фермента. Стратегии для такого тасования ДНК известны из уровня техники. См., например, Б1еттег (1994) Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. Бс1. ИБА 91:10747-10751; Б1еттег (1994) №Дигс 370:389-391; Сгатеп и др. (1997) №Дигс Вю1есй. 15:436-438; Мооге и др. (1997) 1. Мо1. Вю1. 272:336-347; /Папу и др. (1997) Ргос. №11. Асаб. 8ά. ИБА 94:4504-4509; Сгатеп и др. (1998) Апаге 391:288-291; и Патенты США № 5 605 793 и № 5 837 458.
Нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением можно применять для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, особенно других растений, более конкретно других двудольных. Таким образом, можно применять такие способы, как ПЦР, гибридизация и т.п., для идентификации таких последовательностей на основании гомологичности последовательностей к последовательностям, представленным в данной заявке. Последовательности, выделенные на основании их идентичности ко всем полинуклеотидным последовательностям АНАБЬ, представленным в данной заявке, или к их фрагментам, охвачены данным изобретением. Таким образом, изолированные последовательности, кодирующие ЛНАБЬ белок, которые гибридизуются в жестких условиях до последовательности, описанной в данной заявке, или ее фрагментов, охвачены данным изобретением.
В методе ПЦР могут быть разработаны олигонуклеотидные праймеры для использования в реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК из кДНК или геномной ДНК, извлеченной из какого-либо растения, которое рассматривается. Способы разработки ПЦР праймеров и ПЦР клонирования являются общеизвестными из уровня техники и описаны БатЬгоок и др. (1989) Мо1еси1аг С1отпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1 (2б еб., Со1б Бргшу НагЬог ЬаЬога1огу Рге§5, Р1а1ПУ1е^. Νον Уогк). См., также Ιηηίδ и др., ебк. (1990) РСК Рго1осо1к: А Ошбе 1о Ме1йобк апб АррНсайопк (Асабетю Ргекк, Νν Уогк); Ιηηΐδ и ОеИапб, ебк. (1995) РСК Б1га1ед1е8 (Асабетю Ргекк, Νν Уогк); и 1птк и ОеИапб, ебк. (1999) РСК Ме1йоб8 Мапиа1 (Асабетю Ргекк, Νν Уогк). Известные способы ПЦР включают способы, где используют парные праймеры, гнездовые (пек1еб) праймеры, отдельные специфические праймеры, вырожденные праймеры, ген-специфические праймеры, вектор-специфические праймеры, частично-несогласованные праймеры и т.п., но не ограничиваются ими.
АНАБЬ полинуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением обеспечиваются в кассетах экспрессии для экспрессии в растении, которое рассматривается. Кассета буде содержать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью АНАБШ в соответствии с данным изобретением. Под термином функционально связанный подразумевают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, причем последовательность промотора инициирует и опосредствует транскрипцию последовательности ДНК, которая соответствует второй последовательности. Обычно функционально связанный означает, что последовательности нуклеиновых кислот, будучи связанными, являются заменимыми и, в случае необходимости, присоединяются к двум кодирующим белки участкам, заменимым в той же самой рамке считывания. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, для котрансформации в организме. Альтернативно, дополнительный ген(ы) могут быть представлены на многоразовых кассетах экспрессии.
Такая кассета экспрессии предлагается с великим множеством сайтов рестрикции для вставки АНАБТ полинуклеотидной последовательности, чтобы пребывать под транскрипционным регулированием регуляторных участков. Кассета экспрессии может дополнительно содержать выбираемые генымаркеры.
Кассета экспрессии будет включать в 5'-3' направлении транскрипции, транскрипционный и трансляционный участок инициирования (то есть промотор), АНАБЬ полинуклеотидную последовательность в соответствии с данным изобретением, и транскрипционный и трансляционный участок терминации (то есть, участок терминации), функциональный в растениях. Промотор может быть нативным или аналогичным, или посторонним или гетерологичным, к растению-хозяину и/или к АНАБШ полинуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением. Дополнительно, промотор может быть естественной последовательностью или, альтернативно, синтетической последовательностью. В случае, когда промотор является посторонним или гетерологичным к растению-хозяину, считается, что промотор не найден в нативном растении, в которое вводится промотор. В случае, когда промотор является посторонним или гетерологичным к АНАБЬ полинуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением, считается, что промотор не является нативным промотором или промотором, который встречается в природе, для функционально связанной АНАБЬ полинуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением. Как используется в данной заявке, химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициирования транскрипции, которая является гетерологичной к кодирующей последовательности.
В то время как преимущественной является экспрессия АНАБЬ полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением при помощи гетерологичных промоторов, можно использовать нативные промоторные последовательности. Такие конструкции изменили бы уровни экспрессии АНАБЬ белка в соответствии с изобретением или в растении или растительной клетке. Таким образом, изменяется фенотип растения или растительной клетки.
- 18 020462
Участок терминации может быть нативным к участку инициирования транскрипции, может быть нативным к функционально связанной ЛНЛ§Ь последовательности, которая рассматривается, может быть нативным к растению-хозяину или может быть получен из другого источника (то есть, посторонней или гетерологичной к промотору, ЛНЛ§Ь полинуклеотидной последовательности, которая рассматривается, растения-хозяина или какой-либо их комбинации). Ручные участки терминации получают из Τίплазмид А. кнпеГааепк, таких, как участки терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Оиегтеаи и др. (1991) Мо1. Сей. Оеиек 262:141-144; РгоиДГоо! (1991) Се11 64:611-614; §аиГасои и др. (1991) Оеиек 1)е\. 5:141-149; Моден и др. (1990) Р1ай Се11 2:1261-1272; Мипгое и др. (1990) Сепе 91:151158; Ва11ак и др. (1989) Ыис1е1с Ас1Дк Кек. 17:7891-7903; и 1окй и др. (1987) Ыисйею Ас1Д Кек. 15:96279639.
Там, где это целесообразно, ген(ы) может быть оптимизирован для увеличения экспрессии в трансформированном растении. Таким образом, гены могут быть синтезированы с использованием преимущественных для растений кодонов для улучшения экспрессии. См., например, СатрЬе11 и Оо\уп (1990) Р1ап1 РЬукю1. 92:1-11 для обсуждения использования преимущественного для хозяина кодона. В уровне техники известны способы синтеза преимущественных для растений генов. См., например, патенты США № 5 380 831 и 5 436 391, и Миггау и др. (1989) ШсШс АаДк Кек. 17:477-498, включенные в данную заявку путем ссылки.
Дополнительные модификации последовательности, как известно, усиливают экспрессию генов в клеточном хозяине. К ним принадлежат извлечения последовательностей, кодирующих поддельные сигналы полиадениляции, экзон-интронные сигналы сайтов соединения, транспозон-подобные повторения и др. такие хорошо охарактеризованные последовательности, которые могут быть вредными для экспрессии генов. Содержание Г -Ц последовательности может быть приспособлено к уровням, средним для данного клеточного хозяина, как вычислено относительно известных генов, которые экспрессируются в клетке-хозяине. При возможности, последовательность модифицируют, чтобы чтобы избежать предполагаемых шпильковых вторичных структур иРНК.
Нуклеотидные последовательности для повышения генной экспрессии также могут быть применены в векторах экспрессии растений. Они включают интроны кукурузного АДЫ, интронный ген (СаШк и др. Оепек апД Эеуе1ортеп1 1:1183-1200, 1987), и лидерные последовательности, (^-последовательность) из вируса табачной мозаики (ВТМ), вируса хлоротичной пятнистости кукурузы и вируса люцерновой мозаики (ОаЫе и др. ЫисШс АсЫ Кек. 15:8693-8711, 1987 и 5>ки/ек1Д и др. Р1ай Мо1. Вю1. 15:65-79, 1990). Первый интрон из неразвитого ΐ-1 локуса кукурузы, как показано, повышает экспрессию генов в химерных генных конструкциях. Патенты США №№ 5424412 и 5593874 раскрывают применение специфических интронов в конструкциях генной экспрессии, и ОаШе и др. (Р1ап1 РЬукю1. 106:929-939, 1994) также показали, что интроны являются полезными для регулирования генной экспрессии на тканеспецифической основе. Для дополнительного повышения или для оптимизации АНА§ большой субъединицы генной экспрессии, векторы экспрессии растения в соответствии с данным изобретением также могут содержать ДНК последовательности, имеющие матричные участки прикрепления (МАК - тайт\ аОасктеШ гедюи). Растительные клетки, трансформированные при помощи таких модифицированных систем экспрессии, далее могут показывать сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности в соответствии с данным изобретением.
Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5' лидерских последовательностей в конструкции кассеты экспрессии. Такие лидерские последовательности могут функционировать для увеличения трансляции. Лидеры трансляции известны в данной области и включают: лидеров пиконавируса, например, лидера ЕМСУ (5' некодирующий участок ЕпсерЬа1отуосагДЫк) (Е1гоу-81еш и др. (1989) Ргос. ЫаД. АсаД. 8сЕ И8А 86:6126-6130); лидеров потавируса, например, лидера ТЕУ (вирус гравировки табака - ТоЬассо Е1ск Уник) (ОаЫе и др. (1995) Сепе 165(2):233-238), лидера МОМУ (вирус карликовой мозаики кукурузы - М;ц/е Э\уагГ Мокаю Уник) (Уио1о§у 154:9-20), и белок, связывающий тяжелую цепь человеческого иммуноглобулина, (ВтР) (Масе)ак и др. (1991) ЫаЫге 353:90-94); нетранслированого лидера из иРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (АМУ ΒΝΛ 4) (1оЬ1ш§ и др. (1987) ЫаЫге 325:622-625); лидера вируса мозаики табака (ТМУ) (ОаЫе и др. (1989) у Мо1еси1аг Вю1о§у оГ ^А, еД. Сеск (Ыкк, №\у Уогк), рр. 237-256); и лидера вируса хлоротичной пятнистости кукурузы (МСМУ - птн/е сЫогойс той1е У1гик) (Ьотте1 и др. (1991) Уио1о§у 81:382-385). См. также, Ое11а-Сюрра и др. (1987) Р1ап1 РЬукю1. 84:965-968. Могут также быть применены другие способы, известные для увеличения трансляции, например интроны и т.п.
При получении кассеты экспрессии можно манипулировать различными фрагментами ДНК, для обеспечения последовательностей ДНК должной ориентации и, если это целесообразно, в должной рамке считывания. Для этого, можно применять адаптеры или линкеры для присоединения фрагментов ДНК или можно осуществлять другие манипуляции для того, чтобы обеспечить удобные сайты рестрикции, удаления лишней ДНК, удаления сайтов рестрикции и т.п. С этой целью можно применять ш уДго мутагенез, репарацию праймера, рестрикцию, отжиг, повторные замещения, например, транзиции и трансверсии.
В практике изобретения может быть использован ряд промоторов. Промоторы можно выбирать на
- 19 020462 основании желательного результата. Нуклеиновые кислоты можна комбинировать с конститутивными. желательными для тканей, или другими промоторами для экспрессии в растениях.
К таким конститутивным промоторам принадлежат, например, промотор оболочки К8уп7 промотора и другие конститутивные промоторы, описанные в \УО 99/43838 и патенте США № 6072050; промотор СаМУ 35§ оболочки (Обе11 и др. (1985) №1иге 313:810-812); рисовый актин (МсЕ1гоу и др. (1990) Р1ап1 Се11 2:163-171); убиквитин (СНп81еп8еп и др. (1989) Р1ап1 Мο1. Вю1. 12:619-632 и СНп81еп8еп и др. (1992) Р1ай Мс1. Вю1. 18:675-689); рЕМИ (1.381 и др. (1991) ТЬесг. Лрр1. СепеР 81:581-588); МЛ§ (УеИеп и др. (1984) ЕМВО 1. 3:2723-2730); промотор ЛЬ§ (патент США № 5 659 026) и т.п. К другим конститутивным промоторам принадлежат, например, описанные в патентах США №№ 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680;5268463,5608142 и 6177611.
Чтобы направить увеличенную экспрессию АНЛ§^1 в пределах определенной растительной ткани можно использовать преимущественные для тканей промоторы. Такие преимущественные для тканей промоторы включают, не ограничиваясь приведенными, преимущественные для листьев промоторы, преимущественные для корней промоторы, преимущественные для семян промоторы и преимущественные для стеблей промоторы. К преимущественным для тканей промоторов относятся Υататοΐο и др. (1997) Р1ай 1. 12(2):255-265; Каманина и др. (1997) Р1ай Се11 РЬу8ю1. 38(7):792-803; 11ап8еп и др. (1997) Мο1. Сеп СепеР 254(3):337-343; Ки88е11 и др. (1997) Тгащдетс Ке8. 6(2): 157-168; КтеЬай и др. (1996) Р1ап1 РЬу8ю1. 112(3): 1331-1341; Уап Сатр и др. (1996) Р1ап1 РЬу8ю1. 112(2):525-535; Сапеуа8сий и др. (1996) Р1ай РЬу8ю1. 112(2):513-524; Υататοΐο и др. (1994) Р1апР Се11 РЬу8ю1. 35(5):773-778; Ьат (1994) Ке8н1(8 РгоЪ1. Се11 Όίίίετ. 20:181-196; Ого/от и др. (1993) Р1ап1 Мο1 Вю1. 23(6): 1129-1138; Маΐ8иοка и др. (1993) Ргос №И. Лсаб. δοΐ. и§Л 90(20):9586-9590; и Сиеуата-Сатаа и др. (1993) Р1апР 1. 4(3):495-505. Такие промоторы могут быть модифицированы, если необходимо, для слабой экспрессии.
В одном варианте воплощения рассматриваемые нуклеиновые кислоты направлены на хлоропласт для экспрессии. В таком способе, при котором нуклеиновая кислота, которая рассматривается, непосредственно не вводится в хлоропласт, кассета экспрессии будет дополнительно содержать направленную на хлоропласт последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую хлоропластный транзитный пептид для направления генного продукта, который рассматривается, на хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны из уровня техники. Что касается направленных на хлоропласт последовательностей, то функционально связанный означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (то есть, направленная на хлоропласт последовательность), связывается с полинуклеотидом АНЛ§^ в соответствии с данным изобретением таким образом, что эти две последовательности являются заменимыми и находятся в той же рамке считывания. См., например, Уοи Нерпе и др. (1991) Р1апР Мс1. Вю1. Кер. 9:104-126; С1агк и др. (1989) 1. Вю1. СЬет. 264:17544-17550; РеПа-Сгорра и др. (1987) Р1ап1 РЬу8го1. 84:965-968; Ροηκγ и др. (1993) ВюсЬет. ВюрЬу8. Ке8. ^тти^ 196:1414-1421; апб §ЬаЬ и др. (1986) §аепсе 233:478-481. В то время как АНЛ§^ белки в соответствии с данным изобретением включают нативный хлоропластовый транзитный пептид, какой-либо хлоропластовый транзитный пептид, известный из уровня техники, может быть связан с аминокислотной последовательностью зрелого АНЛ§^ белка в соответствии с данным изобретением путем функционального связывания направленной на хлоропласт последовательности к 5'-концу нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый АНЛ§^ белок в соответствии с данным изобретением.
Направленные на хлоропласт последовательности известны из уровня техники и включают хлоропластную малую субъединицу рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилазы (Ριώί8^) (бе Са81го §буа Ρί1Ηο и др. (1996) Р1ай Мс1. Вю1. 30:769-780; §сЬпе11 и др. (1991) 1. Вю1. СЬет. 266(5):3335-3342); 5(энолпирувил)шикимат-3-фосфатсинтазу (ЕЧЧ) (ЛгсЬег и др. (1990) 1. Вюепегд. ВютетЪ. 22(6):789810); триптофансинтазу (Ζΐκιο и др. (1995) 1. Вю1. СЬет. 270(11):6081-6087); пластоцианин (Ъа\\тепсе и др. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272(33):20357-20363); хоризматсинтазу (§сНт1б1 и др. (1993) 1. Вю1. СЬет. 268(36):27447-27457); и белок, связывающий легкий хлорофилл а/Ъ (ЬНВР) (Ьатрра и др. (1988) 1. Вю1. СЬет. 263:14996-14999). См. также Уοи Нерпе и др. (1991) Р1ап1 Мο1. Вю1. Кер. 9:104-126; С1агк и др. (1989) 1. Вю1. СЬет. 264:17544-17550; Ре11а-Сюрра и др. (1987) Р1ап1 РЬу8ю1. 84:965-968; Ροιι^γ и др. (1993) ВюсЬет. ВюрЬу8. Ке8. Οοη™. 196:1414-1421; и §ЬаЬ и др. (1986) §аепсе 233:478-481.
Способы трансформации хлоропластов известны из уровня техники. См., например, §уаЪ и др. (1990) Ргос. №И. Лсаб. δοΐ. и§Л 87:8526-8530; §уаЪ и МаИ§а (1993) Ргос. Ν8ί1. Лсаб. δοΐ. и§Л 90:913917; §уаЪ и МаПда (1993) ЕМВО 1. 12:601-606. Способ основан на частичной поставке ДНК, содержащей выбираемый маркер и направленные ДНК на геном пластиды через гомологичную рекомбинацию. Дополнительно, можно достигнуть трансформации пластиды трансактивацией молчаливого пластидного трансгена путем экспрессии в определенной ткани ядерно-закодированной и пластид-направленной РНК-полимеразы. Про такую систему сообщалось в МсВпбе и др. (1994) Ргос. №6. Лсаб. §ст и§Л 91:7301-7305.
Нуклеиновые кислоты, которые рассматриваются, которые могут быть направлены на хлоропласт, могут быть оптимизированы для экспрессии в хлоропласты с учетом отличий в использовании кодона между ядром растения и эти органоидом. Таким способом, рассматриваемые нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием кодонов, преимущественных для хлоропластов. См., например, па- 20 020462 тент США № 5380831, включенный в данную заявку путем ссылки.
Как описано в данной заявке, ΑΗΑδΕ нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением применяют для повышения устойчивости растений к гербицидам, содержащие в их геномах ген, кодирующий устойчивый к гербицидам ΑΗΑδΕ белок. Такой ген может представлять собой эндогенный ген или трансген. Дополнительно, в конкретных воплощениях последовательности нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением могут быть собраны с любой комбинацией рассматриваемых полинуклеотидных последовательностей для создания растения с желательным фенотипом. Например, полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением могут быть скомпонованы с какими-либо другими полинуклеотидами, кодирующими полипептиды, обладающие пестицидной и/или инсектецидной активностью, такими как, например, белки ВасШи8 11шппд1еп818 токсина (описанные в патентах США №№ 5366892; 5747450; 5737514; 5723756; 5593881 и Ое18ег и др. (1986) Оепе 48:109). Полученные комбинации также могут включать множественные копии какого-либо одного из рассматриваемых полинуклеотидов.
Признано, что при помощи этих нуклеотидных последовательностей могут быть сконструированы антисмысловые конструкции, комплементарные по меньшей мере к части информационной РНК (иРНК) для ΑΗΑδΕ полинуклеотидных последовательностей. Антисмысловые нуклеотиды конструируют для гибридизации с соответствующей иРНК. Можно создать модификации антисмысловых последовательностей, пока последовательности гибридизуются из и взаимодействуют с экспрессией соответствующей иРНК. Таким способом можно использовать антисмысловые конструкции, имеющие 70%, преимущественно 80%, более преимущественно 85% идентичности последовательности к соответствующим антисмысловым последовательностям. Дополнительно можно использовать части антисмысловых нуклеотидов для того, чтобы запустить экспрессию целевого гена. Обычно можно использовать последовательности по меньшей мере с 50 нуклеотидами, 100 нуклеотидами, 200 нуклеотидами или более.
Нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением можно также использовать в смысловой ориентации для того, чтобы подавить экспрессию эндогенных генов в растениях. Способы подавления генной экспрессии в растениях с использованием нуклеотидных последовательностей в смысловой ориентации известны из уровня техники. Способы, как правило, включают трансформацию растений при помощи ДНК конструкции, содержащей промотор, который запускает экспрессию в растении, функционально связанный по меньшей мере с частью нуклеотидной последовательности, которая соответствует транскрипта эндогенного гена. Как правило, такая нуклеотидная последовательность имеет существенную идентичность последовательности к последовательности транскрипта эндогенного гена, преимущественно более, чем приблизительно 65% идентичности последовательности, более преимущественно более чем приблизительно 85% идентичности последовательности, наиболее преимущественно более чем приблизительно 95% идентичности последовательности. См., патенты США №№ 5283184 и 5034323; включенные в данную заявку путем ссылки.
В то время как резистентные к гербицидам ΑΗΑδΕ1 полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением применяют как выбираемые гены-маркеры для трансформации растений, кассеты экспрессии в соответствии с данным изобретением могут включать другой выбираемый ген-маркер для выбора трансформированных клеток. Выбираемые гены-маркеры, включая такие из данного изобретения, используют для выбора трансформированных клеток или тканей. Гены-маркеры включают гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, такие, как гены, кодирующие неомицинфосфотрансферазу II (ΝΕΟ) и гигромицинфосфотрансферазу (НРТ), а также гены, обусловливающие резистентность к гербицидным соединениям, таким, как глюфозинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4дихлорофеноксиацетат (2,4-Ό). См., вообще, Уаттайоп (1992) Сигг. Орш. Вю1есЬ. 3:506-511; СЬт181орЬег8оп и др. (1992) Ргос. №11. ^ай. 8с1. υδΑ 89:6314-6318; Уао и др. (1992) Се11 71:63-72; Ке/шкоН' (1992) Мо1. МютоЪю1. 6:2419-2422; Вагк1еу и др. (1980) у ТЬе Орегоп, рр. 177-220; Ηυ и др. (1987) Се11 48:555566; Вгоуп и др. (1987) Се11 49:603-612; Пдде и др. (1988) Се11 52:713-722; 1)еи8ск1е и др. (1989) Ргос. №11. Άсай. Αα. υδΑ 86:5400-5404; Риет81 и др. (1989) Ргос. №11. Άсай. δα. υδΑ 86:2549-2553; Оеи8сЬ1е и др. (1990) δαοικο 248:480-483; Оо88еп (1993) РЬЛ. ТЬе818, итуегейу оГ Ηο^^γ^; Кете8 и др. (1993) Ргос. №11. ^ай. δ^. υδΑ 90:1917-1921; ЬаЪоу и др. (1990) Мо1. Се11. Вю1. 10:3343-3356; 2атЪгеШ и др. (1992) Ргос. №11. ^ай. 8с1. υδΑ 89:3952-3956; Ва1гп и др. (1991) Ргос. №11. ^ай. 8с1. υδΑ 88:5072-5076; \уЪог8к1 и др. (1991) №с1ею Αα68 Ке8. 19:4647-4653; Η^11еηаηй-\V^88таη (1989) Торю8 Мо1. 81тис. Вю1. 10:143-162; ЭедепкоШ и др. (1991) Αηΐ^т^с^οЪ. ΑΕ0ώ8 СЬетоИег. 35:1591-1595; К1ет8сЬтй1 и др. (1988) ВюсЬет181ту 27:1094-1104; Вотп (1993) РЬ.О. ТЬе818, υπί\ΌΓ8ίΙν оГ ΗοΗοΦογε; Оо88еп и др. (1992) Ргос. №11. ^ай. 8с1. υδΑ 89:5547-5551; О1№ и др. (1992) Άηΐ^т^с^οЪ. Αεοπ18 СЬетоИег. 36:913-919; Η1аνка и др. (1985) ШпйЪоок оГ Ехрептейа1 РЬагтасо1оду, Уо1. 78 ^ртшдег-Уепад, Вег1ш); Ой1 и др. (1988) №1ите 334:721-724. Такие описания включены в данную заявку путем ссылки.
Вышеуказанный перечень генов-маркеров не является ограничивающим. Любой выбираемый генмаркер может быть использован в данном изобретении.
Изолированные полинуклеотидные молекулы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую ΑΗΑδΕ белки в соответствии с данным изобретением могут быть использованы в векторах для трансформации растений, таким образом, чтобы созданные растения имели повышенную резистент- 21 020462 ность к гербицидам, особенно к гербицидам на основе имидазолинона. Изолированные АНАЗЬ полинуклеотидные молекулы в соответствии с данным изобретением могут быть использованы в векторах отдельно или в комбинации с нуклеотидной последовательностью, кодирующей малую субъединицу АНАЗ (АНАЗЗ) фермента, в придании растениям резистентности к гербицидам. См. патент США № 6348643; включенный в данную заявку путем ссылки.
Данное изобретение также относится к вектору экспрессии растений, содержащему промотор, направляющий экспрессию в растении, функционально связанный с изолированной полинуклеотидной молекулой в соответствии с данным изобретением. Изолированная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую АНАЗЬ белок, особенно АНАЗЬ белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕС ГО №: 2 или 4, или ее функциональный фрагмент и вариант. Вектор экспрессии растений в соответствии с данным изобретением не зависит от конкретного промотора, за исключением того, что такой промотор способен запускать экспрессию гена в растительной клетке. Преимущественные промоторы включают конститутивные промоторы и преимущественные для тканей промоторы.
Векторы трансформации в соответствии с данным изобретением могут быть применены для получения растений, трансформированных при помощи рассматриваемого гена. Вектор трансформации будет содержать выбираемый ген-маркер в соответствии с данным изобретением и ген, который рассматривается, который будет введен и типично экспрессирован в трансформированном растении. Такой выбираемый ген-маркер содержит гербицид-резистентный АНАЗЬ полинуклеотид в соответствии с данным изобретением, функционально связанный с промотором, направляющим экспрессию гена в растительной клетке. Для применения в растениях и растительных клетках, вектор трансформации содержит выбираемый ген-маркер, содержащий гербицид-резистентный АНАЗЬ полинуклеотид в соответствии с данным изобретением, функционально связанный с промотором, направляющим экспрессию гена в растительной клетке.
Гены, рассматриваемые в данном изобретении, отличаются в зависимости от желаемого результата. Например, могут представлять интерес различные изменения в фенотипе, включая изменение состава жирных кислот в растении, изменение содержания аминокислот растения, изменение защитных механизмов растения к насекомым и/или патогенам и т.п. Этих результатов можно достичь путем обеспечения экспрессии гетерологичных продуктов или увеличения экспрессии эндогенных продуктов в растениях. Альтернативно, указанных результатов можно достичь путем обеспечения снижения экспрессии одного или нескольких эндогенных продуктов, особенно ферментов или кофакторов в растении. Эти изменения приводят к изменению в фенотипе трансформированного растения.
В одном воплощении данного изобретения, рассматриваемые гены включают гены резистентности к насекомым, таких, как, например, гены токсичного белка ВасШиз ЙшгтщегМз (патенты США №№ 5366892; 5747450; 5736514; 5723756; 5593881 и Се15ег и др. (1986) Сеие 48: 109).
АНАЗЬ белки или полипептиды в соответствии с данным изобретением могут быть выделены, например, из растений подсолнечника и могут быть применены в композициях. Также изолированная полинуклеотидная молекула, кодирующая АНАЗЬ белок в соответствии с данным изобретением, может быть изменена для экспрессии АНАЗЬ белка в соответствии с данным изобретением в микробе, таком, как Е. сο1^ или дрожжи. Экспрессированный АНАЗЬ белок может быть очищен от экстрактов Е. сο1^ или дрожжей при помощи какого-либо способа, известного специалисту в данной области.
Данное изобретение также относится к способу создания трансгенного растения, являющегося резистентным к гербицидам, который включает трансформирование растения при помощи вектора экспрессии растения, содержащего промотор, направляющий экспрессию в растении, функционально связанный с изолированной полинуклеотидной молекулой в соответствии с данным изобретением. Изолированная полинуклеотидная молекула содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую АНАЗЬ белок в соответствии с данным изобретением, в частности АНАЗЬ белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в ЗЕС ГО №: 2, аминокислотную последовательность, которая кодируется ЗЕС ГО №: 1, или функциональный фрагмент и вариант указанных аминокислотных последовательностей.
Данное изобретение также относится к нетрансгенным растениям подсолнечника, трансгенным растениям, полученным в соответствии со способами данного изобретения, и прямого потомства и другого потомства таких нетрансгенных и трансгенных растений, где указанные растения проявляют усиленную или повышенную резистентность к гербицидам, которые препятствуют АНАЗ ферменту, особенно гербицидам на основе имидазолинона и сульфонилмочевины.
АНАЗЬ полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением, особенно те, что кодируют гербицид-резистентные АНАЗЬ белки, применяют в способах повышения резистентности устойчивых к гербицидам растений. В одном воплощении данного изобретения, устойчивые к гербицидам растения содержат устойчивый к гербицидам или резистентный к гербицидам АНАЗЬ белок. Устойчивые к гербицидов растения включают как растения, трансформированные при помощи устойчивых к гербицидам АНАЗЬ нуклеотидных последовательностей, так и растения, содержащие в их геномах эндогенный ген, кодирующий устойчивый к гербицидам АНАЗЬ белок. Нуклеотидные последовательности, кодирующие
- 22 020462 устойчивые к гербицидов ΑΗΑδΤ белки и устойчивые к гербицидам растения, содержащие эндогенный ген, кодирующий устойчивый к гербицидам ΑΗΑδΤ белок, включают полинуклеотиды и растения в соответствии с данным изобретением и полинуклеотиды и растения, известные из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5013659, 5731180, 5767361, 5545822, 5736629, 5773703, 5773704, 5952553 и 6274796; все из которых включены в данную заявку путем ссылки. Такие способы повышения резистентности устойчивых к гербицидам растений включают трансформирование устойчивого к гербицидам растения при помощи по меньшей мере одной полинуклеотидной конструкции, содержащей промотор, направляющий экспрессию в растительной клетке, и функционально связанный с резистентным к гербицидам ΑΗΑδΤ полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением, особенно таким как полинуклеотид, кодирующий резистентный к гербицидам ΑΗΑδΤ белок, представленный в δΕΟ ΙΌ №: 1, полинуклеотиды, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ №: 2, и фрагменты и варианты указанных полинуклеотидов, кодирующие полипептиды, обладающие гербицидрезистентной ΑΗΑδ активностью.
Имеются многочисленные векторы трансформации растений и способы трансформирования растений. См., например, Αη, С. и др. (1986) Р1ап! Ру8ю1, 81:301-305; Ргу, ί. и др. (1987) Р1ап! Се11 Кер. 6:321325; В1оск, М. (1988) ТЬеог. Αρρ1 СепеР76:767-774; ШпсЬее, и др. (1990) δΐ3άΚΓ. Сепе! δутρ.203212.203212; Сои5Ш5, и йр. (1991) Αη8ϊ. ί. Р1ап! РЬузю1. 18:481-494; СЬее, Р. Р. и δ1^дЬΐот, ί. Ь. (1992) Сепе. 118:255-260; СНг181ои, и др. (1992) Тгепй8. Вю£есЬпо1. 10:239-246; Ό'Ηα11υίη, и др. (1992) Вю/ТесЬпо1. 10:309-314; Шпг и др. (1992) Р1ай РЬу8ю1. 99:81-88; Сазаз и др. (1993) Ргос. Ναί. Αсай 8с1. υδΑ 90:1121211216; СЬг181ои, Р. (1993) Ιη Уйго Се11. 1)е\. Вю1.-Р1аШ; 29Р:119-124; Пау1е8, и др. (1993) Р1ай Се11 Кер. 12:180-183; Поп§, ί. Α. апй МсЬидЬеп, Α. (1993) Р1ап1 δά. 91:139-148; Ргапкйп, С I. и Тпеи, Т. N. (1993) Р1апк РЬу8ю1. 102:167; Со1оукш, и др. (1993) Р1ай 8οϊ. 90:41-52; Сио С1ип 8с1. Ви11. 38:2072-2078; Α8аηо, и др. (1994) Р1ап! Се11 Кер. 13; Αуе^е8 Ν. М. и Рагк, Ό. (1994) Сгй. Кеу. Р1ап1. 8ск 13:219-239; Вагсе1о, и др. (1994) Р1ап! ί. 5:583-592; Вескег, и др. (1994) Р1ап1. ί. 5:299-307; Вогко\У8ка и др. (1994) Α^3. РЬу8ю1 Р1ап1. 16:225-230; СЬпзЮи, Р. (1994) Α§ιό. Роой. 1пй. Ηί ТесЬ. 5: 17-27; Тареп и др. (1994) Р1ап! Се11 Кер. 13:582-586; Η-ιΠπη-ηι, и др. (1994) Вю-ТесЬпо1о§у 12: 919923; Кйа1а, и др. (1994) Р1ап1. Мо1. Вю1. 24:317325; и Уап. Υ. С. и Ьетаих, Р. С. (1994) Р1ап1 РЬу8ю1. 104:3748.
Способы в соответствии с данным изобретением включают введение полинуклеотидной конструкции в растение. Под введением подразумевают предоставление растению полинуклеотидной конструкции таким образом, что конструкция получает доступ к внутренней части растительной клетки. Способы в соответствии с данным изобретением не зависят от конкретного способа введения нуклеотидной конструкции в растение, а состоят только в том, что нуклеотидная конструкция получает доступ к внутренней части по меньшей мере одной растительной клетки. Способы для введения нуклеотидной конструкции в растение известны из уровня техники, включая способы стабильной трансформации, способы транзиторной трансформации и опосредованные вирусом способы, но не ограничиваясь ими.
Под термином стабильная трансформация подразумевают, что нуклеотидная конструкция, введенная в растение, интегрируется в геном растения и способна к унаследованию ее потомством. Под термином транзиторная трансформация подразумевают, что нуклеотидная конструкция, веденная в растение, не интегрируется в геном растения.
Для трансформирования растений и растительных клеток нуклеотидные последовательности в соответствии с данным изобретением вставляют с использованием стандартных технологий в любой вектор, известный из уровня техники, который является приемлемым для экспрессии нуклеотидных последовательностей в растении или растительной клетке. Выбор вектора зависит от преимущественного способа трансформирования и вида целевого растения, которое трансформируют. В воплощении данного изобретения ΑΗΑδΤ1 нуклеотидная последовательность является функционально связанной с растительным промотором, известным для высокоуровневой экспрессии в растительной клетке, и эту конструкцию далее вводят в растение, чувствительное к гербициду на основе имидазолинона, и трансформированное растение регенерируют. Трансформированное растение является устойчивым к действию того уровня гербицида на основе имидазолинона, который бы уничтожал или значительно поражал нетрансформированное растение. Указанный способ может быть применен к растению какого-либо вида; однако наиболее полезно, когда этот способ применяют к сельскохозяйственным растениям.
Методологии для конструирования кассет экспрессии растений и введения посторонних нуклеиновых кислот в растения, в основном, известны из уровня техники и были описаны ранее. Например, посторонняя ДНК может быть введена в растение, используя плазмидные векторы, вызывающие опухоли (Т1). Другие способы, которые используют для доставки посторонней ДНК, включают применение РТС опосредованного протопластного трансформирования, електропорацию, микроинъекции и биолистику или бомбардирование микрочастицами для прямого ДНК введения. Такие способы известны из уровня техники, (патент США № 5405765, Уа8Й и др.; Вйапд и др. (1991) Сепе 100: 247-250; δ^ίά и др., (1991) Мо1. Сеп. Сепе!., 228: 104-112; СиегсЬе и др., (1987) Р1ап! δ^ι^ 52: 111-116; №иЬаи8е и др., (1987) ТЬеог. Αρρ1 Сепе!. 75: 30-36; К1еш и др., (1987) №-11иге 327: 70-73; ^1x^11 и др., (1980) δ^ιτ^ 208:1265; ^гесЬ и др., (1985) δ^ι^ 227: 1229-1231; ЭеВ1оск и др., (1989) Р1ап! РЬу8ю1о§у 91: 694-701; Ме!ЬоЙ8 £ог Р1ап! Мо1еси1аг Вю1о§у (\Уе188ЬасН апй \Уе188ЬасН. ей8.) Αсайет^с Рге88, 1пс. (1988) и Мейюй8 ш Р1ап!
- 23 020462
Мо1еси1аг Вю1о§у (§сЬи1ег апй 21е1шкк1, ейк.) Асайенис Ргекк, 1пс. (1989). Способ трансформирования зависит от растительной клетки, которую трансформируют, приемлемости использованных векторов, уровня экспрессии генных продуктов и других параметров.
Другие приемлемые способы введения нуклеотидных последовательностей в растительные клетки и последующей инсерции в геном растения включают: микроинъекцию, как описано в Сгокк\уау и др. (1986) Вю1ес1тк|иек 4:320-334, электропорацию, как описано Шддк и др. (1986) Ргос. №ιΐ1. Асай. §ск и§А 83:5602-5606, А§гоЬас1егшт-опосредованную трансформацию, как описано То\\пкепй и др., патент США № 5563055, 2Ьао и др., патент США № 5981840, прямую передачу гена, как описано Рак/ко\укк1 и др. (1984) ЕМВО ί. 3:2717-2722, и баллистическое ускорение частиц, как описано, например, у §апГогй и др., патент США № 4945050; Тотек и др., патент США №. 5 879 918; Тотек и др., патент США №. 5886244; ВМпеу и др., патент США № 5932782; Тотек и др. (1995) Эпес! ОЫА ТгапкГег 1п1о 1п1ас1 Р1ап( Се11к У1а МюгоргсдесШе ВотЬагйтеШ, в Р1ап( Се11, Тккие. апй Огдап СиНиге: Рипйатеп1а1 МеНюйк, ей. ОатЬогд и РЫШрк (§ргтдег-Уег1ад, ВегНп); МсСаЬе и др. (1988) Вю1есНпо1о§у 6:923-926); и трансформацию Ьес1 (ЛУО 00/28058). Также см. Уеккшдег и др. (1988) Апп. Реу. Оепек 22:421-477; §апГогй и др. (1987) Ратси1а1е §с1епсе апй ТесЬпо1оду 5:27-37 (цибуля); СНпкЮн и др. (1988) Р1ап( РЬукю1. 87:671-674 (соя); МсСаЬе и др. (1988) Вю/ТесЬпо1о§у 6:923-926 (соя); Ршег апй МсМи11еп (1991) 1п УНго Се11 Эеу. Вю1. 27Р:175-182 (соя); §ш§Ь и др. (1998) ТЬеог. Арр1. Оепек 96:319-324 (соя); ЭаПа и др. (1990) Вю1есНпо1о§у 8:736-740 (рис); К1еш и др. (1988) Ргос. ЫаН. Асай. §ск и§А 85:4305-4309 (кукуруза); К1ет и др. (1988) Вю1есЬпо1о§у 6:559-563 (кукуруза); Тотек, Патент США №. 5240855; Вшкшд и др., патента США №№ 5322783 и 5324646; Тотек и др. (1995) ОЫА ТгапкГег иНо 1п1ас1 Р1ап( Се11к У1а Мюгорго.)есН1е ВотЬагйтеп!, в Р1ап( Се11, Тккие, апй Огдап СиНиге: Рипйатеп1а1 МеНюйк, ей. ОатЬогд (§ргтдег-Уег1ад, ВегНп) (кукуруза); К1ет и др. (1988) Р1ап( РЬукю1. 91:440-444 (кукуруза); Рготт и др. (1990) Вю1есНпо1о§у 8:833-839 (кукуруза); Нооукаак-Уап §1о§1егеп и др. (1984) ЫаШге (Ьопйоп) 311:763-764; Во\уеп и др., патент США №.5 736 369 (зерновые культуры); Ву1еЫег и др. (1987) Ргос. ЫаН. Асай. §сь и§А 84:53455349 (лилейные); Эе \Уе1 и др. (1985) в ТЬе Е\рептеп1а1 Матри1аНоп оГ Оуи1е Нккиек, ей. СЬартап и др. (Ьопдтап, Ыете Уогк), рр. 197-209 (пыльца); Каерр1ег и др. (1990) Р1ап( Се11 РероПк 9:415-418 и Каерр1ег и др. (1992) ТЬеог. Арр1. Сепе(. 84:560-566 (нитковидно-опосредованная трансформация); П'НаПшп и др. (1992) Р1ап( Се11 4:1495-1505 (электропорация); Ы и др. (1993) Р1ап( Се11 РероПк 12:250-255 и СЬпкЮн апй Рогй (1995) Аппа1к оГ Во(апу 75:407-413 (рис); Ок)ойа и др. (1996) ЫаШге Вю1есНпо1о§у 14:745-750 (кукуруза через АдгоЬасЮгшт ШтеГааепк); все из них включены в данную заявку путем ссылки.
Полинуклеотиды в соответствии с данным изобретением могут быть введены в растения при контакте растений с вирусами или вирусными нуклеиновыми кислотами. Обычно такие способы включают введения полинуклеотидной конструкции в соответствии с данным изобретением в вирусную молекулу ДНК или РНК. Признано, что АНА§Ь белок в соответствии с данным изобретением может сначала синтезироваться как часть вирусного полипротеина, а позднее вследствие протеолиза ш У1уо или ш уЬго может образовываться желательный рекомбинантный белок. Дополнительно признано, что промоторы в соответствии с данным изобретением также охватывают промоторы, которые используют для транскрипции вирусными РНК полимеразами. Способы для введения полинуклеотидных конструкций в растение и экспрессии белка, закодированного в них, с участием вирусных молекул ДНК или РНК, известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5889191, 5889190, 5866785, 5589367 и 5316931; включенные в данную заявку путем ссылки.
Клетки, которые были трансформированы, могут быть выращены в растении в соответствии с традиционными способами. См., например, МсСогтюк и др. (1986) Р1ап( Се11 РероПк 5:81-84. После этого такие растения можно выращивать и опылять при помощи той же трансформированной линии или различных линий, и идентифицировать полученный гибрид, имеющий конститутивную экспрессию определенной фенотипной характеристики. Можно вырастить два или более поколений, чтобы гарантировать стабильную поддержку и унаследование экспрессии желательной фенотипной характеристики, а потом собрать семена, чтобы гарантировать достижение экспрессии желательной фенотипной характеристики. Таким образом, данное изобретение обеспечивает трансформированные семена (также имеющие название трансгенные семена), которые содержат полинуклеотидную конструкцию в соответствии с данным изобретением, например кассету экспрессии в соответствии с данным изобретением, устойчиво включенное в их геном.
Данное изобретение может быть применено для трансформации каких-либо видов растений, включая однодольные и двудольные, но не ограничиваясь ими. Примеры рассматриваемых видов растений, включают кукурузу или маис (2еа таук), Вгаккюа кр. (например, В. парик, В. гара, В..|ипсеа), особенно те виды Вгаккюа, которые используют как источники масла семян, люцерну (Мейюадо каНуа), рис (Огу/а каНуа), рожь (§еса1е сегеа1е), сорго (§огдЬит Ысо1ог, §огдЬит уи1даге), просо (например, просо африканское (РеиткеШт д1аисит), просо культурное (Ратсит пиНасеит), просо итальянское §е1апа НаНса), дагуссу (Е1еикте согасапа)), подсолнечник(НеНап)Ьик аппиик), сафлору (СаПЬатик ПпсЮпик), пшеницу (ТпНсит аекНуит, Т. Тигщйит ккр. йигит), сою (О1усше та\), табак (№соНапа (аЬасит), картофель (§о1апит (иЬегокит), арахис (АгасЫк Ьуродаеа), хлопок (Ооккуршт ЬагЬайепке, Ооккуршт ЫгкиШт), батат (1ротоеа Ьа1а1пк), маниоку (МатЬо) екси1еп)а), кофе (СоГГеа крр.), кокосовый орех (Сосок писНега), ананас
- 24 020462 (Апапак сотокик), цитрусовые деревья (Сйгик крр.), какао (ТНеоЬгота сасао), чай (СатеШа ктепмк), банан (Мика крр.), авокадо (Регкеа атепсапа), фигу (Рюик самса), гуаву (Рмбшт диа)ауа), манго (МапдЛега тбюа), оливу (О1еа еигораеа), папайю (Санса рарауа), орех кешью (Апасагбтт осс1беп1а1е), макадамию (Масабатпа ^пιед^^Γо1^а). миндаль (Ргпппк атудба1ик), сахарную свеклу (Ве1а уи1дапк), сахарный тростник (8ассНагит крр.), овес, ячмень, овощи, декоративные и хвойные растения, но не ограничиваются ими. Преимущественно, растения в соответствии с данным изобретением представляют собой сельскохозяйственные растения (например, такие, как подсолнечник, Вгакмса кр., хлопок, сахарная свекла, соя, арахис, люцерна, сафлора, табак, кукуруза, рис, пшеница, рожь, ячмень, тритикале, сорго, просо, и т.д.).
Резистентные к гербицидам растения в соответствии с данным изобретением применяют в способах борьбы с бурьянами. Таким образом, данное изобретение дополнительно обеспечивает способ борьбы с бурьянами поблизости резистентного к гербицидам растения в соответствии с данным изобретением. Способ включает применение эффективного количества гербицида к бурьянам и к резистентному к гербицидам растению, причем указанное растение имеет повышенную резистентность по меньшей мере к одному гербициду, особенно к гербициду на основе имидазолинона или сульфонилмочевины, по сравнению с растением дикого типа. В таком способе борьбы с бурьянами, резистентные к гербицидам растения в соответствии с данным изобретением представляют собой преимущественно сельскохозяйственные растения, включая такие, как подсолнечник, люцерна, Вгакмса кр., соя, хлопок, сафлор, арахис, табак, помидоры, картофель, пшеница, рис, кукуруза, сорго, ячмень, рожь, просо, и сорго, но не ограничиваясь приведенными.
При обеспечении растений, обладающими повышенной резистентность к гербицидам, особенно гербицидам на основе имидазолинона и сульфонилмочевины, можно использовать целый ряд препаратов для защиты растений от бурьянов таким образом, чтобы увеличить рост растения и уменьшить конкуренцию по питательным веществам. Гербицид может быть применен отдельно для до-экстренного, постэкстренного контроля бурьянов, контроля бурьянов перед посадкой и при посадке на площадях, окружающих растение, описанные тут, или может быть применена гербицидная композиция на основе имидазолинона, содержащая другие добавки. Гербицид может также быть применен для обработки семян. К добавкам, содержащимся в составе гербицидной композиции или составе на основе имидазолинона и сульфонилмочевины, относятся другие гербициды, детергенты, адьюванты, средства для распространения, средства прикрепления, стабилизаторы и т.п. Гербицид может быть влажным или сухим препаратом и может содержать сыпучие порошки, эмульгирующие концентраты и жидкие концентраты, но не ограничивается ими. Гербициды и препараты гербицидов могут быть применены в соответствии с традиционными способами, например, путем распыления, орошения, распорошения, покрытия или аналогичным образом.
Данное изобретение обеспечивает нетрансгенные и трансгенные семена с повышенной резистентностью по меньшей мере к одному гербициду, особенно АНА8-ингибирующему гербициду. Более конкретно, гербицидам на основе имидазолинона и сульфонилмочевины. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена подсолнечника, обладающие характеристиками резистентности к гербицидам растения подсолнечника 84897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716, или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606, и трансгенные семена, содержащие полинуклеотидную молекулу в соответствии с данным изобретением, кодирующую гербицид-резистентный АНА8Ь белок.
Данное изобретение обеспечивает способы получения резистентного к гербицидам растения, особенно резистентного к гербицидам растения подсолнечника, путем обыкновенного селекционирования растений, которые включают половое размножение. Указанные способы включают скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, с другим растением, которое не является резистентным к гербициду. Первое растение может представлять собой какое-либо из резистентных к гербицидам растений в соответствии с данным изобретением, включая, например, трансгенные растения, содержащие по меньшей мере один из полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением, кодирующих гербицид-резистентный АНА8Ь белок, и нетрансгенные растения подсолнечника, обладающие характеристиками устойчивости к гербицидам растения подсолнечника 84897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716 или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606. Другое растение может представлять собой любое растение, способное давать жизнеспособные потомственные растения (то есть, семена) при скрещивании с первым растением. Как правило, но не обязательно, первое и второе растения являются растениями одного вида. Способы в соответствии с данным изобретением могут дополнительно включать одно или более поколений обратного скрещивания потомственных растений первого кросса с растением той же линии или генотипа, что и первое или второе растение. Альтернативно, потомство первого кросса или любого последующего кросса может быть скрещено с третьим растением, которое является растением линии или генотипа, иных, чем первое или второе растение. Способы в соответствии с данным изобретением могут дополнительно включать отбор растений, обладающих характеристиками устойчивости к гербицидам первого растения.
- 25 020462
Данное изобретение дополнительно обеспечивает способы повышения резистентности к гербицидам растения, особенно гербицид-резистентного растения подсолнечника, путем обыкновенного селекционирования растений, содержащие половое размножение. Указанные способы включают скрещивание первого растения, которое является резистентным к гербициду, со вторым растением, которое может быть резистентным или не резистентным к гербициду, или может быть резистентным к другому гербициду или гербицидам, чем первое растение. Первое растение может представлять собой любое из резистентных к гербицидам растений в соответствии с данным изобретением включая, например, трансгенные растения, содержащие, по меньшей мере, один из полинуклеотидов в соответствии с данным изобретением, кодирующие гербицид-резистентный ΑΒΑδΕ и нетрансгенные растения подсолнечника, обладающие характеристиками устойчивости к гербицидам растения подсолнечника δ4897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716 или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА7606. Второе растение может представлять собой любое растение, способное давать жизнеспособные потомственные растения (то есть, семена) при скрещивании с первым растением. Как правило, но не обязательно, первое и второе растения являются растениями одного вида. Потомственные растения, полученные этим способом в соответствии с данным изобретением, имеют повышенную резистентность к гербициду по сравнению с первым или вторым растением или обоими. Если первое или второе растения являются резистентными к разным гербицидам, потомственные растения будут иметь объединенные характеристики устойчивости к гербицидам первого или второго растения. Способы в соответствии с данным изобретением могут дополнительно включать одно или более поколений обратного скрещивания потомственных растений первого кросса с растением той же линии или генотипа, что и первое или второе растения. Альтернативно, потомство первого кросса или какого-либо последующего кросса может быть скрещено с третьим растением, которое является растением линии или генотипа, иных, чем первое или второе растения. Способы в соответствии с данным изобретением могут дополнительно включать отбор растений, обладающих характеристиками устойчивости к гербицидам первого растения, другого растения или как первого, так и второго растения.
Растения в соответствии с данным изобретением могут быть трансгенными или не-трансгенными. Пример не-трансгенного растения подсолнечника с повышенной резистентностью к имидазолинону представляет собой растение подсолнечника δ4897, растение подсолнечника ОМ40, растение подсолнечника ОМ1606, растение подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716, или растение подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606; или мутантное, рекомбинантное или созданное методами генной инженерии производное растения подсолнечника δ4897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716, или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606; или какого-либо потомства растения подсолнечника δ4897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716, или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606; или растения, которое является потомством какого-либо из этих растений; или растения, обладающего характеристиками устойчивости к гербицидам растения подсолнечника δ4897, растения подсолнечника ОМ40, растения подсолнечника ОМ1606, растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-6716, или растения подсолнечника с патентным депозитарным номером АТСС РТА-7606.
Данное изобретение также обеспечивает растения, органы растений, растительные ткани, растительные клетки, семена и нечеловеческие клетки-хозяева, трансформированные по меньшей мере одной молекулой полинуклеотида, кассетой экспрессии, или вектором трансформации в соответствии с данным изобретением. Такие трансформированные растения, органы растений, растительные ткани, растительные клетки, семена и нечеловеческие клетки-хозяева имеют повышенную устойчивость или резистентность по меньшей мере к одному гербициду, при уровнях последнего, которые уничтожают или ингибируют рост нетрансформированного растения, растительной ткани, растительной клетки и нечеловеческой клетки-хозяина, соответственно. Преимущественно трансформированными растениями, растительными тканями, растительными клетками и семенами в соответствии с данным изобретением являются Απιόίάορδίδ ШаПапа и сельскохозяйственные культуры.
Данное изобретение обеспечивает способы, которые включают применение ΑНΑδ-ингибирующего гербицида, который выбирают из группы, состоящей из гербицидов на основе имидазолинона, гербицидов на основе сульфонилмочевины, гербицидов на основе триазолопиримидина, гербицидов на основе пиримидинилоксибензоата, гербицидов на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона и их смесей. В указанных способах ΑНΑδ-ингибирующий гербицид может быть применен любым из способов, известных из уровня техники, включая обработку семян, обработку почвы и обработку листьев, но не ограничиваясь этим.
Перед применением ΑНΑδ-ингибирующий гербицид может быть превращен в обычно используемые композиции, например, растворы, эмульсии, суспензии, пудры, порошки, пасты и гранулы. Форма применения зависит от определенной предполагаемой цели; в каждом случае, она должна обеспечивать тонкодисперсное и равномерное распределение соединений в соответствии с изобретением.
- 26 020462
Композиции получают известным способом (см., например, обзор и§ 3060084, ЕР-А 707445 (для жидких концентратов), Вгоутпд, А§§1отегаЛоп, Сйет1са1 Епдшеегтд, Эес. 4, 1967, 147-48, Реггу'8 СЛетюа1 Епдтеег'8 НапЛЪоок, 41й ЕЛ., МсСгау-НЛ1, Νον Уогк, 1963, стр. 8-57 и последующие. \УО 91/13546, и§ 4172714, и§ 414, КЛпдтап, \УееЛ Соп1го1 аз а 8аепсе, ШЬп ^Леу апЛ §оп8, 1пс., №ν Уогк, 1961, Напсе и др., \УееЛ Соп1го1 НапЛЪоок, 81й ЕЛ., В1аскуе11 §аепЛйс РиЪЛсаЛопз, ОхГогЛ, 1989 и Мо11е1, Н., СгиЪетапп, А., Рогти1аЛоп 1есйпо1о§у, ^Леу УСН Уег1ад СтЪН, ХУеиШеип (Сегтапу), 2001, 2. Ό. А. Кпо\у1е5, СНетЖгу апЛ Тесйпо1оду оГ Адгосйетюа1 Рогти1аЛоп8, К1и\уег АсаЛепис РиЪЛзЛегв, ОогЛгесЫ, 1998 (Ι§ΒΝ 0-7514-0443-8), например, путем увеличения объема активного соединения при помощи вспомогательных веществ, приемлемых для формулирования агрохимикалий, таких как растворители и/или носители, по желанию, эмульгаторы, поверхностно-активные вещества и диспергирующие агенты, консерванты, противовспенивающие агенты, средства от замерзания, копозиции для обработки семян, а также необязательно красители и/или связующие вещества и/или гелеобразующие агенты.
Примерами приемлемых растворителей являются вода, ароматические растворители (например, такие, как §о1уе88о продукты, ксилол), парафины (например, минеральные фракции), спирты (например, такие, как метанол, бутанол, пентанол, бензиловый спирт), кетоны (например, такие как циклогексанон, гамма-бутиролактон), пирролидоны (ЫМР, ΝΟΡ), ацетаты (гликоля диацетат), гликоли, диметиламиды жирных кислот, жирные кислоты и сложные эфиры жирных кислот. В принципе, также можно применять смеси растворителей.
Примерами приемлемых носителей являются почвенные природные минералы (например, такие, как каолины, глины, тальк, мел) и почвенные синтетические минералы (например, високодиспергированный кремнезем, силикаты).
Приемлемыми эмульгаторами являются неионные и анионные эмульгаторы (например, такие, как полиоксиэтиленовые эфиры жирных спиртов, алкилсульфонаты и арилсульфонаты).
Примерами диспергирующих агентов являются лигнинсульфитные отработанные щелочи и метилцеллюлоза.
Приемлемыми применяемыми поверхностно-активными веществами являются щелочные, щелочноземельные, аммониевые соли лигно-сульфониевой кислоты, нафталинсульфониевой кислоты, фенолсульфониевой кислоты, дибутил-нафталинсульфониевой кислоты, алкиларилсульфонаты, алкилсульфаты, алкилсульфонаты, сульфаты спиртов жирного ряда, жирные кислоты и сульфатированные гликольэфиры спиртов жирного рядя, дополнительно, продукты конденсации сульфонированного нафталина или производных нафталина с формальдегидом, продукты конденсации нафталина или нафталинсульфоновой кислоты с фенолом и формальдегидом, полиоксиэтиленоктилфенольные эфиры, этоксилированные изооктилфенол, октилфенол, нонилфенол, алкилфенил-полигликолевые эфиры, трибутилфенилполигликолевый эфир, тристеарилфенил-полигликолевый эфир, алкиларилполиэфирные спирты, конденсаты окиси этилена/ спирта жирного ряда и спирта, этоксилированное касторовое масло, полиоксиэтиленалкиловые эфиры, этоксилированный полиоксипропилен, полигликольэфирный ацетат лауриловых спиртов, сложные эфиры сорбита, лигнинсульфитные отработанные щелочи или метилцеллюлоза.
Вещества, приемлемые для получения растворов, которые могут быть непосредственно распылены, эмульсий, паст или масляных дисперсий, представляют собой фракции минерального масла и точкой кипения от средней до высокой, такие, как керосин или дизельное топливо, дополнительно, каменноугольные масла и масла растительного или животного происхождения, алифатические, циклические и ароматические углеводороды, например, такие, как толуол, ксилол, парафин, тетрагидронафталин, алкированные нафталины или их производные, метанол, этанол, пропанол, бутанол, циклогексанол, циклогексанон, изофорон, очень полярные растворители, например диметилсульфоксид, Ν-метилпирролидон и вода.
Средства от замерзания, такие как глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, и бактерицидные агенты также могут быть добавлены к копозиции.
Приемлемые противовспенивающие агенты представляют собой, например, противовспенивающие агенты на основе кремния или стеарата магния.
Приемлемые консерванты представляют собой, например, дихлорофен и ензилалкохолполуформаль.
Копозиции для обработки семян могут дополнительно содержать связующие вещества и, необязательно, красители.
Связующие вещества могут быть добавлены для улучшения прилипания активных материалов к семенам после обработки. Приемлемые связующие вещества представляют собой блок-кополимеры ЕО/РО поверхностно-активных веществ, но также поливиниловые спирты, поливинилпирролидоны, полиакрилаты, полиметакрилаты, полибутены, полиизобутилены, полистирол, полиэтиленамины, полиэтиленамиды, полиэтиленимины (Ьира8о1®, Ро1утш®), полиэфиры, полиуретаны, поливинилацетат, тилозу и кополимеры, которые получают из указанных полимеров.
Необязательно, композиция также может содержать красители. Приемлемыми красителями или пигментами композиций для обработки семян являются родамин В, С.1. красный пигмент 112, С.1. красный растворитель 1, голубой пигмент 15:4, голубой пигмент 15:3, голубой пигмент 15:2, голубой пиг- 27 020462 мент 15:1, голубой пигмент 80, желтый пигмент 1, желтый пигмент 13, красный пигмент 112, красный пигмент 48:2, красный пигмент 48:1, красный пигмент 57:1, красный пигмент 53:1, оранжевый пигмент 43, оранжевый пигмент 34, оранжевый пигмент 5, зеленый пигмент 36, зеленый пигмент 7, белый пигмент 6, коричневый пигмент 25, основной фиолетовый 10, основной фиолетовый 49, кислотный красный 51, кислотный красный 52, кислотный красный 14, кислотный голубой 9, кислотный желтый 23, основной красный 10, основной красный 108.
Примером приемлемого гелеорбразующего агента является караген (8аЕаде1®).
Порошки, материалы для рассеивания и продукты для распыления могут быть получены путем смешивания или одновременного измельчения активных веществ с твердым носителем.
Гранулы, например покрытые гранулы, импрегнированные гранулы и гомогенные гранулы, могут быть получены путем связывания активных соединений к твердым носителям. Примерами твердых носителей являются минеральные земли, такие, как силикагели, силикаты, тальк, каолин, атаклей, известняк, известь, мел, болюс, лесс, глина, доломит, диатомовая земля, кальция сульфат, магния сульфат, магния оксид, грунтовые синтетические материалы, удобрения, такие как, например, аммония сульфат, аммония фосфат, аммония нитрат, мочевины, и продукты растительного происхождения, такие, как мука из злаковых растений, мука из древесной коры, древесная мука и мука из гороховой скорлупы, целлюлозные порошки и другие твердые носители.
В основном, копозиции содержат от 0,01 до 95 мас.%, преимущественно от 0,1 до 90 мас.%, АНА8ингибирующего гербицида. В этом случае, АНА8-ингибирующие гербициды применяют с чистотой от 90 до 100%, преимущественно от 95 до 100% (в соответствии со спектром ЯМР). С целью обработки семян соответствующие копозиции могут быть разведены в 2-10 раз с получением концентраций в готовых к применению препаратах от 0,01 до 60 мас.% активного соединения, преимущественно от 0,1 до 40 мас.%.
АНА8-ингибирующий гербицид может быть применен отдельно в форме его композиций или формах применения, полученных из него, например, в форме растворов, которые непосредственно распыляют, порошков, суспензий или дисперсий, эмульсий, масляных дисперсий, паст, продуктов, которые распыляют, материалов для распространения, или гранул, путем разбрызгивания, распыления, опыления, рассеивания или поливания. Формы применения полностью зависят от намеченных целей; они должны обеспечить в каждом случае наилучшее возможное распространение АНА8-ингибирующего гербицида в соответствии с изобретением.
Водные формы применения могут быть получены из эмульсионных концентратов, паст или смачиваемых порошков (порошки, которые могут быть разбрызганы, масляные дисперсии) путем добавления воды. Для получения эмульсий, паст или масляных дисперсий, вещества, в чистом виде или растворенные в масле или растворителе, могут быть гомогенизированы в воде при помощи увлажняющего средства, вещества для повышения клейкости, диспергирующего вещества или эмульгатора. Также можно получить концентраты, состоящие из активного вещества, увлажняющего средства, вещества для повышения клейкости, диспергирующего вещества или эмульгирующего вещества и, если приемлемо, растворителя или масла, такие концентраты являются приемлемыми для разведения водой.
Концентрации активного соединения в готовых к применению препаратах могут быть изменены в относительно широких пределах. В основном, они составляют от 0,0001 до 10%, преимущественно от 0,01 до 1 мас.%.
АНА8-ингибирующий гербицид также может быть успешно применен в процессе сверхмалого объема (ИЬУ), можно применять копозиции, содержащие более 95 мас.% активного соединения, или даже применять активное соединение без вспомогательных веществ.
Далее приведены примеры композиций:
1. Продукты для разбавления водой для нанесения на листья. С целью обработки семян, такие продукты можно применять к семенам разбавленными или неразбавленными.
A) Водорастворимые концентраты (8Ь, Ь8)
Десять частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида растворяли в 90 частях по массе воды или водорастворимого растворителя. Альтернативно, добавляли увлажняющие агенты или другие вспомогательные агенты. АНА8-ингибирующий гербицид растворяли при разбавлении водой, в соответствии с чем получали композицию с 10% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида.
B) Диспергируемые концентраты (ЭС)
Двадцать частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида растворяли в 70 частях по массе циклогексанона с добавлением 10 частей по массе диспергирующего вещества, например поливинилпирролидона. Разбавление водой приводило к получению дисперсии, в соответствии с чем получали композицию с 20% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида.
C) Эмульгирующиеся концентраты (ЕС)
Пятнадцать частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида растворяли в 7 частях по массе ксилола с добавлением кальция додецилбензолсульфоната и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 частей по массе). Разбавление водой приводило к получению эмульсии, в соответствии с чем получали композицию с 15% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида.
- 28 020462
Ό) Эмульсии (Е4, ЕО, Е8)
Двадцать пять частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида растворяли в 35 частях по массе ксилола с добавлением кальция додецилбензолсульфоната и этоксилата касторового масла (в каждом случае 5 частей по массе). Указанную смесь вводили в 30 частей по массе воды при помощи эмульгирующей машины (например, ийгаШгах) и превращали в гомогенную эмульсию. Разбавление водой приводило к получению эмульсии, в соответствии с чем получали композицию с 25% (мас.) АНА8ингибирующего гербицида.
Е) Суспензии (8С, ΘΌ, Р8)
В шаровой мельнице с непрерывным перемешиванием 20 частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида измельчали с добавлением 10 частей по массе диспергирующих агентов, увлажняющих агентов и 70 частей по массе воды или органического растворителя с получением тонкодисперсной суспензии АНА8-ингибирующего гербицида. Разбавление водой приводило к получению стойкой суспензии АНА8-ингибирующего гербицида, в соответствии с чем получали композицию с 20% (мас.) АНА8ингибирующего гербицида
Р) Вододиспергируемые гранулы и водо-растворимые гранулы (4О, 8С)
Пятьдесят частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида тщательно измельчали с добавлением 50 частей по массе диспергирующих агентов и увлажняющих агентов и превращали в вододиспергируемые или водо-растворимые гранулы при помощи технических средств (например, таких, как экструзия, скруббер с распыляющим орошением, псевдоожиженный слой). Разбавление водой приводило к получению устойчивой дисперсии или раствора АНА8-ингибирующего гербицида, в соответствии с чем получали композицию с 50% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида.
О) Вододиспергируемые порошки и водо-растворимые порошки (4Р, 8Р, 88, 48)
Семьдесят пять частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида измельчали в ротор-статорной мельнице с добавлением 25 частей по массе диспергирующих агентов, увлажняющих агентов и силикагеля. Разбавление водой приводило к получению устойчивой дисперсии или раствора АНА8ингибирующего гербицида, в соответствии с чем получали композицию с 75% (мае.) АНА8ингибирующего гербицида.
I) Г елевые копозиции (ОР)
В шаровой мельнице с непрерывным перемешиванием 20 частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида измельчали с добавлением 10 частей по массе диспергирующих агентов, 1 части по массе гелеобразующих агентов, увлажняющих агентов и 70 частей по массе воды или органического растворителя с получением тонкодисперсной суспензии АНА8-ингибирующего гербицида. Разбавление водой приводило к получению устойчивой суспензии АНА8-ингибирующего гербицида, в соответствии с чем получали композицию с 20% (мас/ мас.) АНА8-ингибирующего гербицида. Указанная гелевая композиция является приемлемой для применения при обработке семян.
2. Продукты для применения неразбавленными для нанесения на листья.
С целью обработки семян, такие продукты можно применять к семенам разбавленными.
A) Распыляемые порошки (ΌΡ, Ό8)
Пять частей по массе АНА8-ингибирующего гербицида тонкодисперсно измельчали и гомогенно перемешивали с 95 частями по массе тонкоизмельченного каолина. Это приводило к получению распыляемых продуктов, содержащих 5% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида.
B) Гранулы (ОК, РО, ОО, МО)
Половину части по массе АНА8-ингибирующего гербицида тонкодисперсно измельчали и перемешивали с 95,5 частями по массе носителей, в соответствии с чем получали композицию с 0,5% (мас.) АНА8-ингибирующего гербицида. Наиболее распространенными способами являются экструзия, высушивание распылением или псевдоожиженный слой. Это приводило к получению гранул, предназначенных для применения неразбавленными для нанесения на листья.
Традиционные копозиции для обработки семян включают, например, текучие концентраты Р8, растворы Ь8, порошки для сухой обработки Ό8, водо-диспергируемые порошки для суспензионной обработки 48, водо-растворимые порошки 88 и эмульсию Е8 и ЕС и гелевую композицию ОР. Указанные копозиции могут быть применены к семенам разбавленными или неразбавленными. Применение ко семенам проводят перед посевом,или непосредственно на семена.
В преимущественном воплощении Р8 композицию применяют для обработки семян. Как правило, Р8 композиция может содержать 1-800 г/л активного ингредиента, 1-200 г/л поверхностно-активного вещества, от 0 до 200 г/л агента от замерзания, от 0 до 400 г/л связывающего агента, от 0 до 200 г/л пигмента и до 1 л растворителя, преимущественно воды.
Данное изобретение включает нетрансгенные и трансгенные семена резистентных к гербицидам растений в соответствии с данным изобретением. Такие семена включают, например, нетрансгенные семена подсолнечника, обладающие характеристиками устойчивости к гербицидам растения с патентным депозитарным номером АТСС ЫС1МВ 41262, и трансгенные семена, содержащие полинуклеотидную молекулу в соответствии с данным изобретением, кодирующую 1М1 белок.
Для обработки семян, резистентных к гербицидам растений в соответствии с данным изобретением
- 29 020462 обрабатывают гербицидами, преимущественно, гербицидами, выбранными из группы, включающей АНА8-ингибирующие гербициды, такие как амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенилсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид, пиритиобак, и их смеси, или композицию, содержащую АНА8-ингибирующий гербицид.
Термин обработка семян включает все технологии приемлемой обработки семян, известные в данной области техники, такие как протравление (дезинфекция) семян, дражирование семян, опудривание семян, влажное протравление семян и удобрение семян.
В соответствии с одним вариантом данного изобретения дополнительный объект данного изобретения представляет собой способ обработки почвы путем применения, в частности, в рядовой сеялке, какой-либо гранулированной копозиции, содержащей АНА8-ингибирующий гербицид в виде копозиции/состава (например, гранулированная композиция, необязательно с одним или более твердыми или жидкими сельскохозяйственными носителями и/или необязательно с одним или более сельскохозяйственно приемлемыми поверхностно-активными веществами. Указанный способ преимущественно применяют, например, в грядках злаков, кукурузы, хлопка и подсолнечника.
Данное изобретение также включает семена, покрытые при помощи или содержащие композицию для обработки семян, содержащее по меньшей мере один АНА8-ингибирующий гербицид, выбранный из группы, включающей амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфурон, хлоримурон, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфурон, этоксисульфурон, флазасульфурон, флупирсульфурон, форамсульфурон, галосульфурон, имазосульфурон, йодсульфурон, мезосульфурон, метсульфурон, никосульфурон, оксасульфурон, примисульфурон, просульфурон, пиразосульфурон, римсульфурон, сульфометурон, сульфосульфурон, тифенилсульфурон, триасульфурон, трибенурон, трифлоксисульфурон, трифлусульфурон, тритосульфурон, имазаметабенз, имазамокс, имазапик, имазапир, имазаквин, имазетапир, клорансулам, диклосулам, флорасулам, флуметсулам, метосулам, пеноксулам, биспирибак, пириминобак, пропоксикарбазон, флукарбазон, пирибензоксим, пирифталид и пиритиобак.
Термин семена охватывает семена и растительный ростки всех видов, включая, но не ограничиваясь приведенным, действительные семена, черенки, корневые ростки, клубнелуковицы, луковицы, фрукт, клубни, зерна, отводки, ростковые черенки и подобное и, в преимущественном воплощении, обозначает действительные семена.
Термин покрытое при помощи и/или содержащее в основном, означает, что активный ингредиент находится, главным образом, на поверхности продукта размножения во время применения, хотя большая или меньшая часть этого ингредиента может проникать в продукт размножения, в зависимости от способа применения. Когда указанный продукт размножения сажают (пересаживают), он может поглощать активный ингредиент.
Применение для обработки семян АНА8-ингибирующим гербицидом или композицией, содержащей АНА8-ингибирующий гербицид, проводят путем опрыскивания или опыления семян перед посевом растений и перед прорастанием растений.
При обработке семян соответствующие копозиции применяют путем обработки семян при помощи эффективного количества АНА8-ингибирующего гербицида или композиции, содержащей АНА8ингибирующий гербицид. При этом, нормы применения составляют, в основном, от 0,1 г до 10 кг активного ингредиента (или смеси активного ингредиента или копозиции) на 100 кг семян, преимущественно, от 1 г до 5 кг на 100 кг семян, в частности от 1 г до 2,5 кг на 100 кг семян. Для специфических сельскохозяйственных культур, таких как латук, указанная норма может быть выше.
Данное изобретение обеспечивает способ борьбы с нежелательной растительностью или борьбы с бурьянами, который включает приведение в контакт семян резистентных растений в соответствии с данным изобретением перед посевом и/или после предварительного проращивания при помощи АНА8ингибирующего гербицида. Указанный способ может дополнительно включать посев семян, например, в почву или в поле, или в горшки в теплице. Способ находит определенное применение в борьбе с нежелательной растительностью или в борьбе с бурьянами в непосредственной близости к семенам.
Под борьбой с нежелательною растительностью подразумевают уничтожение бурьянов и/или другое замедление или ингибирование нормального роста бурьянов. Бурьяны, в самом широком смысле, подразумевается в значении всех растений, которые растут в местах, где они нежелательны.
Бурьяны в соответствии с данным изобретением включают, например, двудольные и однодольные бурьяны. Двудольные бурьяны включают, не ограничиваясь приведенными, бурьяны рода: 81пар1к, Ьерйшт, ОаПит, 81е11апа, Мйпсапа, АтНеппк, ОаПпкода, СНепоройшт, ИШса, 8епесю, АтатайБик, Рог1п1аса, Хаййит, Сопуокйик, 1ротоеа, Ро1удопит, 8екЬайа, АтЬгоыа, Сагкшт, Сагйиик, 8опс1шк, 8о1апит, Ропрра, Ро1а1а, Ппйегйа, Ьатшт, Уегойса, АЬйПоп, Етех, Эа1ига, Ую1а, Оа1еорык, Рарауег, Сеп- 30 020462
1аигеа, ТсйоПит, и Тагахасит. Однодольные бурьяны включают, не ограничиваясь приведенными, бурьяны рода: Β^Μ^οα, ЗеИпа, Ратсит, Οίβίΐιηα, РЫеит, Ροα, Ее51иса, Е1еи5ше, ВгасЫапа, Εο1ίιιιη, Вготиз, Дуема, Сурегиз, Зο^д1шт, ΛβΐΌρνίΌΐΊ, Сут^и, Μοί'ΐοΟιοπα, ЕппЬп51у5П5, ЗадЮапа, Ξ^οсНапз, Зс1гри5, Ра5ра1ит, ЕсНаетит, ЗрИегюсЕа, ^ас1у1οс1еи^ит, Адго5Й5, А^ресин.^, Арега.
Дополнительно бурьяны в соответствии с данным изобретением могут включать, например, сельскохозяйственные растения, растущие в нежелательном месте. Например, самосев растений кукурузы, то есть в поле, который преимущественно включает соевые растения, может рассматриваться как бурьян, если растение кукурузы является нежелательным в поле растений сои.
Форму единственного числа используют в данной заявке для обозначения одного или более чем одного (то есть, по меньшей мере одного) грамматического объекта. Например, элемент обозначает один или более элементов.
Как употребляется в данной заявке, словосочетание который включает или варианты, такие, как включающий или который включает следует подразумевать в значении включения указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключения какого-либо иного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Следующие примеры представлены для иллюстрации и не ограничивают данное изобретение.
Пример 1. Мутагенез НеПаШ1ш5 аииит линии ВТК47 и выбор имидазолинон-резистентных растений
ВТК47, НеПаШ1ш5 аииит Ь. селекционную линию подвергали химическому мутагенезу таким образом. Шестьдесят тысяч семян ВТК47 линии обрабатывали раствором этил метансульфоната (ЕΜЗ) на протяжении 15 ч. Потом обработанные семена высевали в полевых условиях 16 декабря 2002 г. в №бета ЕхрептеШа1 З1а1юг1 в Уеии^ ТиегГО, Заи1а Ее, АтдеШта. Приблизительно 30000 Μ1 растений запаковывали в мешок перед цветением для самоопыления каждого растения. Каждое растение собирали и молотили вручную. 10 мая 2003 г. в №бета ЕхрептеШа1 З1а1ю1г в Εοηηο5α, 20 М2 семян из каждой семенной шапки высевали в оранжерейных условиях. Приблизительно 590000 растений обрабатывали путем распыления имазапира на У2-У4 в количестве 80 г аРга. Восемь растений, которые выжили после обработки гербицидами и были самоопылены, собирали. Оценивали резистентность к имазапиру М3 семян из каждого из этих восьми растений. Кроме этих восьми М3 семейств, одно семейство (З4897) отделяли для того, чтобы оценить резистентность к гербицидам в соотношении 1 резистентная (то есть, придающая устойчивость к коммерческим количествам гербицидов на основе имидазолинона): 2 промежуточная (то есть, частично резистентная): 1 чувствительная. Полностью фертильные резистентные растения были самоопылены и собраны для того, чтобы размножить линию З4897.
Листовую ткань из М3 З4897 растений как резистентного, так и промежуточного классов использовали как источник для анализа ДНК последовательности АНАЗЬ1 гена, как описано в примере 2.
Пример 2. ПЦР амплификации и секвенирования полинуклеотидов подсолнечника, кодирующих имидазолинон-резистентные и дикого типа АНАЗЬ1 белки.
АНАЗЫ ген подвергали ПЦР-амплификации с ДНК, изолированной из М3 З4897 и ВТК47 (дикого типа) растений подсолнечника как два фрагмента, которые перекрываются. ПЦР амплификацию сопровождали №151)4 Тац ДНК полимеразными и связанными реагентами (С|адеи Шс, Уа1егкаа, СаП&тта, СЗА; Са1. Νο. 203205) с использованием стандартных способов. ПЦР праймеры для этих двух фрагментов представлены в табл. 1 и в перечне последовательностей. НАШ409 (ЗЕС ГО №: 7) представляет собой прямой праймер для первого фрагмента и соответствует паре оснований 254 СеиВаик Λссе55^οη Νο. ΑΥ541451. НА1Ы379 (ЗЕС ГО №: 8) является обратным праймером для первого фрагмента и соответствует паре оснований 1215 СеиВаик Λссе55^οη Νο. ΑΥ541451. НА1Ш313 (ЗЕС ГО №: 9) и представляет собой прямой праймер для второго фрагмента и соответствует паре оснований 1149 СеиВаик Λссе55^οη Νο. ΑΥ541451. НА1Ь2131 (ЗЕС ГО №: 10) является обратным праймером для фрагмента и соответствует паре оснований 1962 СеиВаик Λссе55^οπ Νο. ΑΥ541451. Пара праймеров НАШ409-НА1Ь1379 продуцировала фрагмент пары оснований 962. Пара праймеров НА1Ш313-НА1Е2131 продуцировала фрагмент пары оснований 814.
Полученные в результате ПЦР продукты секвенировали с получением АНАЗЬ1 последовательностей для З4897 и ВТК47. Линеаризация этих нуклеотидных последовательностей и нуклеотидная последовательность ХаШЫит 5р. АЬЗ гена (СеиВаик Λссе55^οπ Νο. Ш6280; ЗЕС ГО №: 5) приведены на фиг. 1. Линеаризация выявила, что АНАЗЬ1 ген из З4897 имел однократную мутацию по отношению к АНАЗЬ1 ВТК47. Сайт мутации обозначен звездочкой на фиг. 1. Эта мутация представляет собой транзицию С на А, которая соответствует нуклеотиду 21 ЗЕС ГО №: 1.
Линеаризация предполагаемых аминокислотных последовательностей АНАЗЬ1 нуклеотидных последовательностей З4897, ВТК47 и ХайЫит 5р. приведена на фиг. 2. По сравнению с АНАЗЬ1 аминокислотной последовательностью ВТК47, АНАЗЬ1 аминокислотная последовательность З4897 содержит замещение аланин на треонин в аминокислотном положении 7 (ЗЕС ГО №: 2). Это аминокислотное положение в ЗЕС ГО №: 2 соответствует аминокислотному положению 107 в полновесной аминокислотной последовательности, кодированной АНАЗЬ1 нуклеотидной последовательностью подсолнечника СеиВаик Λссе55^οπ Νο. ΑΥ541451 (ЗЕС ГО №: 11) и аминокислотному положению 122 в полновесной амино- 31 020462 кислотной последовательности, кодированной АгаЫбор818 (НаПапа ΛНАδ^ нуклеотидной последовательностью СепВапк Ассе881оп Ыо. Х51514.
Таблица 1. ПЦР праймеры для амплификации кодирующей области АНАБЫ гена подсолнечника
Название праймера Последовательность праймера
НАШ409 САОАСОТОТТООТООААОС (ЗЕ<2 ГО №: 7)
НА1Ы379 СТОТААСОСОАССТТААТАТС (ЗЕЦ ГО №: 8)
НА1Ш313 ТОСТОАААТТОООААОААТААО (8ЕЦ ГО №: 9)
НА1Е2131 ТТТСОТТСТОССАТСАССС (ЗЕЦ ГО№: 10)
Пример 3. Продуцирование линии подсолнечника, которая является гомозиготной для характеристик резистентности к гербицидам δ4897
Линию подсолнечника, которая является гомозиготной для признаков резистентности к гербицидам, получали из δ4897 путем самоопыления и тестирования на резистентность к имазапиру. Эту линию подсолнечника и ее растения обозначали как СМ40. После подтверждения гомозиготности потомства относительно резистентности к гербицидам, растения из СМ40 линии подсолнечника пересаживали в оранжерейных условиях и подвергали самоопылению для получения семян.
Пример 4. Резистентность δ4897 к имазапиру
В полевых исследованиях, проведенных в Аргентине, δ4897 растения анализировали на резистентность к имазапиру. Резистентность к имазапиру, очевидно, была выше, чем у ГМ18ЦЫ-1 (мутация А1а190 на Уа1; эквивалентное положение в Λ^аЬ^бορ8^8 (НаПапа - 205; см. табл. 4, приведенную ниже). Это испытание было проведено на участках с одной грядкой, а обработку проводили в ветреный день, таким образом, реальная доза гербицидов, достигавшая растений, возможно, была меньшей, чем использованная. Тем не менее, δ4897 проявила гораздо лучшую устойчивость к имазапиру, чем замещение А1а190 на Уа1, мы не приводим данные, полученные для этого полевого исследования.
Растения δ4897 и ГМКИЫ-1 также подвергали обработке имазапиком в оранжерейных условиях. На фотографии, приведенной на фиг. 5, показано такое сравнение, когда растения обрабатывали 100 г айга имазапика.
Пример 5. Итоговые результаты устойчивости ΛНАδ активности для линии подсолнечника δ4897 и других видов С1еатйе1б® гербицид-резистентного подсолнечника
Способы: линии подсолнечника δ4897, виды подсолнечника С1еатйе1б® А, В, С и традиционный вид не-С1еагйе1б были обработаны путем распыления трех количеств имазамокса (Рар(от™), 100, 200 и 300 гм айга плюс 0,5% δиη Й II и двумя количествами имазапира (Аг8епа1™) 160 и 360 гм айга плюс 0,5% δиη Й II, когда растения находились на второй-третьей стадии роста листьев. Оценку поражения проводили через 14 дней после применения (ИАТ). Поражение оценивали по шкале от 0 до 9, где 0 = отсутствие поражения, а 9 = засохшее растение. Двенадцать растений обрабатывали путем распыления различного количества гербицида. Статистический анализ проводили при помощи программы δΤАΤСРΛРНIСδ Р1и8 5.0 с использованием процедур АЫОУА и ΕδΌ.
Анализ ΛНАδ активности также проводили путем отбора молодых листьев, которые активно росли, из растений, на которые не был распылен гербицид, через приблизительно четыре недели после выращивания.
Результаты. После обработки растений путем распыления, было понятно, что разница в высоте между δ4897 и другими видами подсолнечника могла повлиять на фактическую дозу гербицида, которая была распылена. Высота распылительного шланга была откалибрована по δ4897 и, поскольку другие виды были более высокими и находились ближе к шлангу, они могли получить большую дозу гербицида. Количества откалибровывали повторно для других видов для того, чтобы определить приблизительную дозу, которую они могли бы получить. Оценку проводили так, как показано в табл. 2, поскольку было невозможно осуществить непосредственное сравнение количества из-за влияния высоты. Например, баллы поражения были сравнены для δ4897, обработанного имазамоксом в количестве 100 гм айга и для других видов, обработанных при 75 гм айга. Доза обработки, которая составляла 300 гм айга для линии δ4897 была эквивалентной обработке 200 гм айга для других видов, которая приблизительно составляла 300 гм айга.
- 32 020462
Таблица 2. Поправка надлежащей/полученной дозы гербицидов
Линия 84897 была значительно менее поражена при всех обработках гербицидами (табл. 3). Фактически, наблюдали очень незначительное поражение при наибольшем количестве имазамокса или имазапира. Другие виды показали увеличение поражения для всех количеств гербицидов, как могло бы ожидаться. На фиг. 6 приведено сравнение поражения при 200/150 гм ;п/га для линии 84897 вида С1еатйе1б® А и контрольного вида не-С1еагПе1б. Увеличивающаяся верхушка 84897 не была поражена или была поражена незначительно, в то время как вид С1еатйе1б® А был поражен в значительной степени и прекратил расти.
Таблица 3. Данные о поражении при 14 ЭЛТ для трех 1М18иЫ1 линий и 84897, обработанных путем распыления имазамокса и имазапира.
Имазамокс (гм Имазапир (гм аРга) аРга)
Линии 100/75 200/150 300 360/240
34897 0,5 а 0,8 а 0,8 а 0,8 а
ОеагПеИ-подсолнечник вид А 4,3 с 4,6 с 6,5 а 5,0 с
ОеагЛеМ- подсолнечник вид В 1,9 Ь 4,8 с 5,3 с 4,3 Ь
С1еаг(1е1(1- подсолнечник вид С 1,8 Ь 2,9 Ь 4,6 Ь 4,9 с
Традиционный не- С1еагйе1<1 7,2 а 8,2 а 8,7 е 8,2 а
Ь8О = Ε8ϋ =
0,7 1,80 = 0,7 0,6 1,30 = 0,7
Имазамокс (гм Имазапир (гм а|/га) аРга)
Линии 100/75 200/150 300 360/240
Статистический анализ был проведен при помощи ОКАРН1СЗ Р1из 5.0
Каждое значения представляет собой среднее значение, приблизительно, 12 наблюдений
Результаты АНА8 активности также продемонстрировали меньшее ингибирование при более высоких концентрациях имазамокса по сравнению с подсолнечником С1еатйе1б® и традиционным видом неС1еатйе1б (фиг. 7). Ингибирование О1еап™ было подобным для всех трех видов подсолнечниковых (фиг. 8). Обратная связь не была представлена, поскольку родительский фон линии 84897 отсутствовал. Поскольку обе мутации произошли в одном и том же локусе ΛНА8^1 и все проанализированные виды были гомозиготными, существует количественная разница в устойчивости, предоставленной аминокислотным замещением в ЛНА8^1 белке 84897. Таким образом, такое же количество АНА8 фермента с этим новым замещением (то есть, А1а107 на ТЬт) способно катализировать получение большего количества
- 33 020462 продуктов в присутствии гербицида, чем АНАБ с замещением А1а1до на Уа1. Это является признаком того, что АНАБ замещение А1а107 на ТПг имеет лучшую устойчивость к гербицидам на основе имидазолинона, чем АНАБ с замещением А1а190 на Уа1.
Пример 6. Гербицид-резистентные АНАБЬ белки подсолнечника
Данное изобретение описывает как нуклеотидные, так и аминокислотные последовательности дикого типа и гербицид-резистентных подсолнечниковых АНАБЬ полипептидов. Предварительно были идентифицированы растения, содержащие гербицид-резистентные АНАБЬ полипептиды, и было описано количество консервативных участков АНАБЬ полипептидов, которые являются сайтами аминокислотных замещений, придающих резистентность к гербицидам. См., Эе\тпе апб ЕЬег1еш (1997) Рйукю1ощса1, Ьюсйетюа1 апб то1еси1аг акресЦ о£ НегЫабе ге8181апсе Ьакеб оп аНегеб 1агуе1 кНек, в НегЫабе АсПуйу: Тохюо1о§у, ВюсПетЫгу апб Мо1еси1аг Вю1о§у, Кое и др. (ебк.), рр. 159-185, 1ОБ Ргекк, АткЮгбат; апб ЬетЫе апб БйиИа, (2000) Сгор РгоЮсПоп 19: 881-889.
При помощи АНАБЬ последовательностей в соответствии с данным изобретением и способов, известных специалистам в данной области, можно получить дополнительные полинуклеотиды, кодирующие гербицид-резистентные АНАБЬ полипептиды, обладающие 1, 2, 3 или 4 аминокислотными замещениями в определенных сайтах в этих консервативных участках. Табл. 4 обеспечивает консервативные участки АНАБЬ белков, аминокислотные замещения, которые, как известно, придают резистентность к гербицидам в этих консервативных участках, и соответствующие аминокислоты в АНАБШ белке подсолнечника, представленном в БЕЦ ГО №: 4.
Таблица 4. Мутации в консервативных участках АНАБЫ полипептидов, которые, как известно, придают резистентность к гербицидам, и их эквивалентные положения в АНАБЬ 1 подсолнечника
Консервативный участок1 Мутация2 Ссылки Аминокислотное положение в подсолнечнике
νΡΑΥΡΟΟΑδΜΕΙΗφΑΕΤΚ. 53 А1а|22 на ТЬг Вегпазсогп и др. 1 А1а|07
1УпдЬ1 & Реппег1
ΑΙΤΟφνΡΚΚΜΙΟΤ4 Рго [«ν на А1а Вои1заН® и др. 7 Рго 182
Рго[97 на ТЬг ОшНеп и др. *
Рго |97 на ΗΪ5 ОШНеп и др. 9
Рго 197 на Ьеи ОшПеп и др. 8 Ко1ктап и др. 15
Рго 197 на Агд Ошйеп и др. 8
Рго 197 на Пе ВоШааН® и др. 7
- 34 020462
Консервативный участок1 Мутация2 Ссылки Аминокислотное положение в подсолнечнике
Рго 197 на О1п ОиЫеп и др. 8
Рго ί?? на 8ег Ои(йеп и др. 8
АРрЕТР4 А1аю5 на Азр Найпей и др. 10 А1а|9о
А1а2о; на Уа1 δΐιηρΒοη11 Ко1ктап и др. 15 ΨΗίΙε и др. 16
<3\νΕϋ4 Тгр574 на Ьеи ВоиГзайз н др. 7 Тгр559
ΙΡ8ΟΟ5 8егб53 на Азп ϋενϊηε & ЕЬег1ет13 АНбзв
8егбзз на ТЬг СЬап§ & О觧1еЬу17
8ег653 на РЬе
'Консервативные участки от Эеуте и ЕЪег1еш (1997) Рйу5ю1одюа1, Ъюсйетюа1 апй то1еси1аг а5рес(5 оГ ЬегЪюЫе ге8181апсе Ъа5ей оп айегей 1агде1 5Йе5. У: НегЫайе ΑΥνίΙχ: Тох1со1о§у, ВюсНепГОйу апй Мо1еси1аг Вю1о§у, Кое и др. (ей5.), ρρ. 159-185, ΙΟδ Рге55, Αт5ΐе^йат и Эе\'те и δйик1а (2000)б Сгор Рго!есйоп 19:881-889.
2Нумерация аминокислот соответствует последовательности аминокислот Α^аЪ^йορ5^5 (Найапа ΑΒΑδΕΊ полипептида.
3ΑΒΑδΕ1 аминокислотные последовательности подсолнечника, представленные в δΕ^ ГО №№: 2 и 4 являются неполными и начинаются с аминокислотных последовательностей ЕΑΥΡООΑδМΕIΒ^Α^ΤКδ и ЕΑΥΡООΤδМΕIΒ^Α^ΤКδ, соответственно.
4ΑНΑδ^ аминокислотные последовательности подсолнечника, представленные в δΕ^ ГО №№: 2 и 4 содержат консервативный участок.
5 Область подсолнечникового ΑНΑδ^1 (ОеиВаик Αссе55^οη №. ΑΥ541451), которая соответствует этому консервативному участку, имеет последовательность IΡΑΟΟ.
6Вета5соп1 и др. (1995) 1. ВЫ. Сйет. 270(29): 17381-17385.
7Вои18а118 и др. (1999) Ре5Йс. δ^.. 55: 507-516.
УлППеп и др. (1995) Ееей δοΐ. 43: 143-178.
ОпППеп и др. (1992) Ееей δοΐ. 40: 670-678.
10Найпей и др. (1990) НегЫс1Йе-ге5151ап1 р1ап15 саггушд ти1а1ей асеЮ1ас1а1е 5уп1йа5е депе5,У: Мападтд Ке5151апсе (о Αд^οсйет^са15: Еипйатеп1а1 Ке5еагсй (о Ргасйса1 δΙπιΕ^5. Огееп и др. (ей5.), ΑιικγΕ;πι Сйетюа1 δοс. δутρ., δе^^е5 №. 421, Еа5Ыпд!оп, ЭС. υδΑ.
1Э1тр5оп (1998) Эо\уп (о Еайй 53(1): 26-35.
12Вгитагй (2001) 1пНегйапсе оГ шнйа/оПпопе ге5151апсе, сйагасЮп/айоп оГ сго55-ге5151апсе райет, апй Ыепййсайоп оГ то1еси1аг тагкег5 ш 5ипЛо\уег (Нейаййш аппии5 Ь.). Рй.Э. Тйе515, №г1й Эако1а δΕιΕ ит\'ег5Йу. Еагдо, ΝΌ, υδΑ, рр 1-78.
вЭе\апе и ЕЪег1еш (1997) Рйу5ю1одюа1, Ъюсйетюа1 апй то1еси1аг а5рес(5 оГ ЬегЫайе ге5151апсе Ъа5ей оп айегей 1агде1 5Йе5. 1п: НегЪЮйе ΑΜίνίΙχ: Тохюо1о§у, Вюсйет15йу апй Мо1еси1аг Вю1о§у, Кое и др. (ей5.), рр. 159-185, ΙΟδ Рге55, Αт5ΐе^йат 14Ег1§Ы апй Реппег (1998) Тйеог. Αρρ1. ОепеЕ 96: 612-620.
15Ко1ктап и др. (2004) Тйеог. Αρρ1. ОепеЕ 109: 1147-1159.
1 ЛЕНпе и др. (2003) Е еей δοΐ. 51: 845-853.
17Сйапд апй Эидд1еЪу (1998) Вюсйет 1. 333: 765-777.
Пример 7. Получение ОМ1606 линии подсолнечника
Вторая гербицид-резистентная линия подсолнечника была получена путем мутагенеза подсолнечниковых семян дикого типа, что относится к резистентности к гербицидам способом, суть которого опи- 35 020462 сана в примере 1. Новая линия и растения этой линии имеют в данной заявке название ОМ1606. ОМ1606 линия подсолнечника содержит такие же самые мутации в гене АНА§Ь1, что и §4897 линия подсолнечника. Эта мутация в ОМ1606 представляет собой транзицию О на А, которая соответствует нуклеотиду 21 §ЕЦ ГО №: 1. Такая мутация приводит к замещению аланина на треонин в аминокислотном положении 7 (§ЕЦ ГО №: 2). Это аминокислотное положение в §ЕЦ ГО №: 2 соответствует аминокислотному положению 107 в полновесной аминокислотной последовательности, кодированной АНА§Ь1 нуклеотидной последовательностью подсолнечника ОепВапк Ассеккюп №. ΑΥ541451 (§ЕЦ ГО №: 11) и аминокислотному положении 122 в полновесной аминокислотной последовательности, кодированной АгаЫйоркк ШаПапа АНА§Ь нуклеотидной последовательностью ОепВапк Ассеккюп №. Х51514.
Пример 8. Реакция мутантных событий А122Т и А205У на имазапир
Для количественной оценки и сравнения чувствительности к имазапиру мутантов А122Т и А205У в разных генетических основах на уровне всего растения для подсолнечника было проведено оранжерейное исследование. Семена разных подсолнечниковых линий, которые были использованы в этих исследованиях, получали в полевых условиях. Линии, которые были использованы в исследовании, приведены в табл. 5.
Таблица 5. Материалы подсолнечника
Код гибрида/линии Вид материала Мутационное событие
ТН1 Г ибрид А205У
ТН9 Гибрид А205У
ТН10 Линия Кб5(ОГСГ А205У
ΟΙΜ 5-7 Линия МагПетег А205У
1В920 Линия МаШешег А205У
ΙΚ.79 Линия КеИотег А205У
ТН6 Г ибрид А122Т
ТН11 Гибрид А122Т
ТН12 Линия Кеаюгег А122Т
ОМ40 Линия МагПетег А122Т
ОМ 1606 Линия МагПетег А122Т
ΟΙΜ 5-6 Линия КезЮгег А122Т
ТН13 Линия Мап1егпег Дикого типа
Способы
Семена высеивали в чашки Петри и после проращивания ростки пересаживали в горшки диаметром 10 см в среде, которая состояла из равных частей вермикультуры, почвы и песка. Растения выращивали в оранжереи в природных условиях освещения, дополнительно применяли натрий-галогенидные лампы на 400 Вт для обеспечения продолжительности дня в 16 ч. Дневные/ночные температуры составляли 25 и 20°С, соответственно. На стадии развития У2 10 растениям каждого генотипа назначали по случайной схеме обработку, которая состояла из семи доз имазапира (0, 40, 80, 160, 240, 320, 400 и 480 г аГга), и определяли биомассу в начальный момент времени. Эксперимент был организован как рандомизированная блочная конструкция с полной факториальной (линия подсолнечника х лечение) схемой обработок и 10 репликаций.
День нанесения гербицида, когда десять растений каждого генотипа срезали на семядольном узле и высушивали при 60°С в течение 48 ч, был начальным моментом времени для определения сухой массы. Остатки растений сохраняли в течение 10 дней после обработки имазапиром (ЭАТ), фиксировали их рост и корни и вышеуказанную сухую биомассу. Рост определяли как расстояние между семядольным узлом и верхушкой каждого растения. Для определения корневой биомассы каждое растение извлекали
- 36 020462 из горшка и среду отмывали от корней. Вышеуказанные данные относительно живой биомассы, полученные для каждой линии, преобразовывали в накопление биомассы после применения, путем отнятия соответственной средней биомассы в начальный момент времени от каждой пробы. Данные относительно сухой биомассы превращали в проценты от необработанных контрольных растений в пределах линии для непосредственного сравнения групп.
Результаты
1. Рост
Рост подсолнечниковых линий с мутацией А205У не отличался от контрольных линий при применении имазапира в количестве 0,5Х или IX. От 2Х до 6Х эти линии показали значительное уменьшение роста, которое достигало 68,9% +/- 3,1 необработанных контрольных линий (табл. 6 и фиг. 9). Наоборот, линии подсолнечника с мутацией А122Т показали меньшее снижение роста (от 0,6 до 15,8% от необработанных контрольных линий при применении 0,5Х и 6Х имазапира, соответственно). Обе группы линий показали значительную разницу между ними по отношению к реакциям на увеличение количества гербицида от 2Х до 6Х (табл. 6, фиг. 9).
2. Индекс фитотоксичности
Оба мутанта показали большую разницу в их реакциях на увеличение количества гербицида от 0,5Х до 6Х (фиг. 10). Линии подсолнечника с мутацией А122Т показали незначительное уменьшение размера листьев и более слабое зеленое окрашивание, чем контрольные растения, при увеличении количества гербицида (табл. 7). Наоборот, растения с мутацией А205У не показали каких-либо поражений при количествах, которые составляли 0,5Х или IX, тем не менее уровень поражения (пожелтение, деформация и некроз листьев) быстро возрастал при количествах от 2Х до 6Х (табл. 7). Оба мутанта значительно отличались по индексу фитотоксичности при количествах от 2Х до 6Х (табл. 7).
3. Живая сухая масса биомассы
Кривые доза-реакция для сухой массы мутантов А122Т и А205У приведены на фиг. 11. Масса биомассы события А122Т была уменьшена по сравнению с контрольными растениями при количествах 4Х, 5Х и 6Х, и это уменьшение достигало 25% для более высокой дозы. В то время, сухая масса события А205У была уменьшена по сравнению с контрольными растениями при количествах от 0,5Х (40 г αί/га) до 6Х. Оба мутанта показали значительную разницу между ними относительно этой переменнной от 0,5Х до 6Х (табл. 8). Подобные тенденции были получены для накопления сухой массы (не показано), но без эффектов смешивания начальной разницы между генотипами для их массы в начальный момент времени.
4. Корневая биомасса
При увеличении доз имазапира сухая корневая биомасса обоих мутантов была уменьшенной по сравнению с контрольными растениями, тем не менее скорость уменьшения в А122Т и А205У была очень разной (фиг. 12). Фактически, А205У показал значительное уменьшение сухой массы корневой биомассы от 12,8% при 0,5Х (40 г αί/га) до 75,6% при 6Х (табл. 9). Наоборот, А122Т носители показали значительное уменьшение корневой массы биомассы, от 3Х до 6Х, а при более высокой дозе уменьшение достигало 38,3% (табл. 9). Оба мутанта показали значительную разницу между ними в реакциях их сухой корневой массы на количества гербицидов от 0,5Х до 6Х (табл. 9 и фиг. 12).
Таблица 6. Влияние различных доз имазапира на рост растений через 14 дней после обработки шести подсолнечниковых генотипов с А205У мутационным событием и шести генотипов с А122Т мутационным событием
А205У разность по сраане- ннм А122Т разность по сравнению Ревность
Дн» ТНГ ТН9 тню С1М5-7 ΙΒ920 ΙΚ79 среднее значение сред- нее откло* с контролен Р- вначенне ТН6 ΤΗΙ1 тшг СМ40 С1М5-6 СМ1606 среднее виачение среднее откло- нение с контролен Р- течение ΑΙ22Τ- Α20$ν Р- вначенне
0 100 100 100 100 100 ιο-ο 100 0.0 100 100 100 100 100 100 100 0
ол 99,5 100,0 99,2 79,] 96,2 92,8 94,4 8,0 5,6 0,15070 99,2 100,4 100,0 99,6 100,0 97,0 99,4 1,2 0.6 0,25170 4,9 0,19611
99.5 100,0 98,1 76,7 80,0 80.9 89,2 11.1 10.8 0.06194 98,6 99,9 100,0 97,4 100,0 95.7 98.6 1,8 1,- 0,10824 9.4 0,09183
78,6 78,9 63,6 57,7 61,5 74,9 69,2 9,4 30.8 0.00048 100,3 92.0 101,8 95,2 99.1 95,2 97.3 3,7 2.7 0,13184 28.0 О.ОООЗЗ
48,4 50.0 ί».-9 55,3 40,9 55.7 50,4 5,5 49.6 0,00000 99,6 90,5 97,0 93,0 98,1 95.7 95.6 3,4 4.4 0,02466 45,3 0.00000
28,9 38,1 27,5 27,3 27,9 52,8 33,7 10,2 66,3 0,00002 101,0 90,8 92,1 93,0 91,0 94,1 93,7 3,8 6Д 0,00970 59.9 0,00001
25.1 31.6 26,0 37.2 30,0 41.7 32,0 6.4 68.0 0.00000 87,0 84,4 84.8 93,9 94.) 94,3 89,8 4,9 10,2 0,00371 57,8 0.00000
27,1 34,7 29,1 30,0 27,1 33,2 30.2 3,1 69.8 0,00000 79.6 84,4 79,8 84,1 85.8 91,4 84,2 4,4 15.8 0,0003 Г 54,0 0,00000
- 37 020462
Таблица 7. Влияние различных доз имазапира на индекс фитотоксичности через 14 дней после обработки трех подсолнечниковых генотипов с А205У мутационным событием и трех генотипов с А122Т мутационным событием
ΛΙ05Υ Α1Ι1Τ Разность
Доэа ΤΗΙ ТН9 ТНЮ среднее »нече- нне среднее откло- нение Р- Значение ТН6 ТН11 ТИП среднее значе- ние среднее отклоне- ние Р- значение А205У-АП2Т Р- значенне
0 О 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0,5 0 0 0 0 0 л» ОД 0,4 0,0 0,3 0,3 0,1917] -0,29 0,19171
1 0 0 0 0 0 В 5 0,5 0,4 0,0 0,3 од □г 19-1Ы -0,29 0,19461
2 и ] .6 3,1 2.2 0,1 0.04648 0.5 0,4 0,0 0,3 од 0.1 »981 1,87 0,05030
3 64 5,1 5.9 5.1 1,2 0.01793 0,5 0,5 0,0 0,3 од 0,18350 4,61 0,01622
4 8,0 3.4 5,9 7,4 1.3 0,01014 0,5 1,0 0,0 0,5 0,5 0,22540 6,92 0,00657
! »,9 1,9 6.9 8,2 и 0,00601 ОЛ 2,0 0,0 0,8 1.0 0,29986 ’,38 0,00111
6 9,0 1,9 6,7 ВД 1,3 0,00799 0,5 2,5 0г5 1,2 12 0,22222 7,03 0,00219
ционным событием
Таблица 8. Влияние различных доз имазапира на накопление биомассы через 14 дней после обработки шести подсолнечниковых генотипов с А205У мутационным событием и шести генотипов с А122Т мута-
А2«У разность ло сраене- Α1Ϊ2Τ разность ПО «равне- нию Разность
Доза ТН1 ТН9 тню С1М5-7 1В920 ΙΗ79 среднее значе- сред* нее откло- нение с контролен р. значение ТВ 6 тнц ТН12 <}М40 С1М5-6 СМ1606 среднее жаченнс сред- нее откло < контролем Р- зиачеыне А1ИТ- Α205ν р. значение
0,0 100 100 100 100 300 100 100 0.0 100 им 100 100 100 100 100 0
0,5 95,0 91,7 99,2 92.9 93.9 94.4 94,5 2,6 5.5 0,00338 100 96,6 100,0 96,5 100.0 100,0 98,9 1.8 1.1 0.18453 4.3 0,00823
3,0 89,6 81,7 85.0 75,1 87,9 74.0 82,2 6,5 17,8 0,00116 97,2 93,9 99,1 94,1 96,4 100,0 96.8 2.5 3,2 0,02634 14,5 0,00182
2,0 75,5 54,7 58.1 55,1 58.8 67,7 61,6 8,2 38,4 0,00009 97.9 81,6 97,0 97.6 97,7 97.6 94,9 6,5 5.1 0,11375 33,2 0,00002
3,0 60,4 35,7 48.1 45.6 46.4 49.1 47,6 7.9 52.4 0,00002 98.2 75,8 96,1 95,8 95.8 95,4 92,8 8.4 7,2 0.09241 45.3 0,00000
4,0 46,5 25,3 28.8 31,8 35.5 44.5 35,4 8.5 64,6 0,00001 97,8 75,0 84.3 88,3 90,8 90,5 87,8 7,6 12,2 0.01127 52.4 0,00000
5,0 38,9 19,8 27,4 34,2 33,9 40,1 32,4 7.6 67,6 0,00000 85.1 60,1 77.5 85,6 81.9 85,3 79,3 9,9 20,7 0.00362 46,9 0,00001
6,0 33,9 19,5 24.9 36.8 29,4 35.3 30,0 6,7 70.0 0,00000 79,5 59,6 70,7 76.8 78,0 83.0 74,6 8,4 25,4 0,00070 44,6 0,00000
Таблица 9. Влияние различных доз имазапира на корневую сухую массу через 14 дней после обработки шести подсолнечниковых генотипов с А205У мутационным событием и шести генотипов с А122Т мутационным событием
А205У разность по сравнению контролен А122Т разность по сравнению с контролем РазнФсть ΑΙ22Τ- Α20ίΫ
ТН1 ТН9 ТНЮ С1М5-7 №920 ΙΚ79 сред- нее значе- ние сред- нее еткло пение Р- значение ТНб ТИП тип СМ40 С1М5-6 СМ1606 среднее значе- сред- нее откло ненн< Р- зкачение Р- ЗиВчспке
100 100 100 100 100 [00 100 0,0 о.о 100 100 100 100 100 100 100 0,0 о.о 0,0
79,4 81,5 90,3 79,2 94,0 98,6 87.2 «.3 12,8 0,01281 100 100 99.4 100 100 100 99,9 0.2 0,1 0.36322 12,7 0,01314
70,7 84.9 69,9 56,3 89,6 53,4 70,8 14,6 29,2 0,00447 98,1 99,0 100 100 88.0 100,0 97,5 4,7 2,5 0,25371 26,7 0,00520
69,6 58,8 41.3 40,6 50,7 42,5 50,6 Н.7 49,4 0.00014 96,2 86,1 100 100 90.0 92.5 94,1 5.6 5,9 0,05070 43,6 0.00006
42,3 34.1 42.8 40.2 37,3 38.4 39,2 3,3 60.8 0,00000 79,3 81,5 100.0 92,2 98.0 85.2 89,4 8,7 Ю.6 0,02997 50,2 0,00001
38,6 27,3 22,3 34,0 32,8 31,5 зи 5,7 68,9 0,00000 78.4 72.6 74.5 96.! 80,0 87,0 81,4 8.7 18.6 0,00346 50,3 0.00000
34,7 29,9 22,7 48,5 25,4 23,3 30.7 9.8 69,3 0,00001 85,8 68,9 65,0 84,2 80.0 88,1 78,7 9,5 21.3 0,00273 47,9 0,00001
23,1 22,1 16.4 43,1 19.4 21,9 24.4 9.5 75,6 0,00001 57,3 45,3 57,8 74,3 65,8 69,5 61,7 10,4 38,3 0,00028 37,3 0,00007
Все публикации и патентные заявки, указанные в данной заявке, являются признаком уровня специалистов в данной области, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данную заявку путем ссылки в том же объеме, что и каждая отдельная публикация или патентная заявка, конкретно и отдельно показанные для включения в данную заявку путем ссылки.
Хотя представленное выше изобретение описано в некоторых деталях путем иллюстрации и примера в целях ясности понимания, будет очевидным, что определенные изменения и модификации могут быть сделаны в объеме приведенной формулы изобретения.
- 38 020462
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> За1а, Саг1оз
ЕсЬагЛе, Магге1 Ви1оз, Маг1апо «Ыъе, ЗЬеггу К,
Азсепгх, РоЬегС <120> РЕЗИСТЕНТНЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ РАСТЕНИЯ ПОДСОЛНЕЧНИКА, ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ РЕЗИСТЕНТНЫЕ К ГЕРБИЦИДАМ БОЛЬШИЕ СУБЪЕДИНИЦЫ БЕЛКОВ АЦЕТОГИДРОКСИКИСЛОТНОЙ СИНТАЗЫ, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ <130> 038867/310344 <150> из 60/695,952 <151> 2005-07-01 <160> 14 <170> ГазЬБЕО для НГпДомз версия 4,0 <210> 1 <211> 1178 <212> ДНК <213 > неПапьЬиз аппиз <220>
<221> СПЗ <222> (3)...(1178) <400> 1
Сс ССс дсс Ьас ссс ддс ддс асд Ьса асд дад аСс сас саа дсС сСс РЬе А1а Туг Рго С1у С1у ТЬг Зег МеС С1и Не ΗΪ3 С1п А1а Ьеи 15 10 15 асд сдс Сса аде асе аСс сдс ааС дСд сСс ссс сдС сас даа сад ддс ТЬг Агд Зег Зег ТЬг 11е Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Йа С1и О1п <31у
25 30 ддс дед ССс дсс дсс даа ддс Сас дед сдс дсс Ссс ддс есс ссс ддс С1у Уа1 РЬе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд А1а Зег С1у Ьеи Рго С1у
40 45 дед сдс аСс дсс асС Ссс ддс ссс дда дсС асд аас сСа дсс аде ддс Уа1 Суз Пе А1а ТЬг Бег <31у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег С1у
55 60 сСС дсС дас дед сед па дас аде дсс ссс аСд дед дса аСс асе ддс Ьеи А1а Азр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег А/а1 Рго МеС Уа1 А1а Не ТЬг С1у
70 75 саа ди ссс едд ада аСд аСс дда асе дас дед ССС саа даа асе сса С1п Уа1 Рго Агд Агд МеС Не О1у ТЬг Азр А1а РЬе С1п С1и ТЬг Рго
85 90 95 аИ дСЪ дад дСа аса сдС Сед аСс асе ааа саС ааС СаС сП дСд Ид Не Уа1 С1и Уа1 ТЬг Агд Зег Не ТЬг Ьуз Нхз Азп Туг Ьеи Уа1 Ьеи
100 105 110 даС дСС дад даС аН ссс ада аИ дСС сдС дад дсЬ СИ СаС сИ дед Азр Уа1 <31и Азр Пе Рго Агд Пе Уа1 Агд С1и А1а РЬе Туг Ьеи А1а
143
191
9
287
335
383
- 39 020462
115 120 125
аде есд дде еда ссс дде ссд дее еед аСа дае дСа ссд ааа дае аса 431
Зег Зег С1у 130 Агд Рго С1у Рго 17а1 135 Ьеи Не Азр Уа1 Рго 14 0 Ьуз Азр Не
сад саа сад ееа дед дед ссд ааа едд дае даа ссд асд адд ееа ссд 479
<31п О1л 145 01 η Ьеи Уа1 Уа1 Рго 150 Ьуз Тгр Азр С1и Рго 155 МеС Агд ьеи Рго
дде СаС еед есе ада аед ссд аад ссе саа еае дае ддд сае еед даа 527
С1у 160 Туг Ьеи Зег Агд Мее 165 Рго Ьуз Рго <31п Туг 170 Азр 61у Н1з Ьеи С1и 175
сад асе дее адд еед дед ддд даа дед аад адд ссд дее еед Сае дед 57 5
<31п Не Уа1 Агд Ьеи 180 Уа1 О1у 61и А1а Ьуз 185 Агд Рго 1/а1 Ьеи Туг 190 Уа1
дде дде ддд еде еед аае Ссд дае дае дад еед адд едд еее дед дад €23
С1у С1у е1у Суз 195 Ьеи Азп Зег Азр Азр 200 С1и Ьеи Агд Агд РЬе 205 Уа1 С1и
сее асд ддд аее ссд дее дед аде асе еед аЬд ддд сСс дда дед Сае 671
Ьеи ТЬг О1у 210 Не Рго Уа1 А1а Зег 215 ТЬг Ьеи мее О1у Ьеи 220 С1у А1а Туг
ссе дсе есд аде дае еед есд сее сае аед сее ддд аед сае дде асд 719
Рго А1а 225 5ег Зег Азр Ьеи Зег 230 Ьеи Шз мее Ьеи С1у 235 Мее ΗΪ3 С1у ТЬг
дее СаС дед аае еае дед дее дае аад аде даС еед сед сее дед сее 767
Уа! 240 Туг А1а Азп Туг А1а 245 17а1 Азр Ьуз Зег Азр 250 Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе 255
ддд дед едд еее дае дае еде дед асд ддд аад сее дад дед еее дсС 615
О1у Уа1 Агд РЬе Азр 260 Азр Агд Уа1 ТЬг О1у 265 Ьуз Ьеи С1и А1а РЬе 270 А1а
аде адд дед аад аее дее сае аее дае аее дае ссе дсе даа аее ддд 863
Зег Агд А1а Ьуз 275 Не 17а 1 ΗΪ3 Не Азр 280 Не Азр Рго А1а С1и 285 Не б1у
аад а. а с аад сад ссе сае дСд есд аее еде дде даС аее аад дСс дед 911
Ьуз Аеп Ьуз 290 С1п Рго Н1з Уа1 Зег 295 Не Суз 61у Азр Не 300 Ьуз Уа1 А1а
ееа сад дде еед аас аад аее еед дад даа аад аае есд дед асе ааС 959
Ьеи С1п 305 61у Ьеи Азп Ьуз 11е 310 Ьеи С1и С1и Ьуз Азп 315 Зег Уа1 ТЬг Азп
сее дае еее есд асе едд ада аад даа еед даС даа саа ааа асд аад 1007
Ьеи 320 Азр РЬе Зег ТЬг Тгр 325 Агд Ьуз С1и Ьеи Азр 330 <31и С1п Ьуз МеС Ьуз 335
еес сед еед аде еее ааа асд еес дде даа дед аее ссе сса сад еае 1055
РНе Рго Ьеи Зег РЬе 340 Ьуз ТЬг РЬе О1у 61и 345 А1а Не Рго Рго С1п 350 Туг
дсе аее саа дее сее дае дад ееа асд дде ддд аае дса аее аСС аде 1103
А1а Не <31п Уа1 355 Ьеи Азр С1и Ьеи ТЬг 360 О1у <31у Азп А1а 11е 365 11е Зег
- 40 020462
асе 39Ϊ дгс 333 саа саТ сад атд сдд
ТЬг О1у Уа1 370 С1у О1п Шз С1п МеТ 375 Тгр
аас ааа сот ада саа сдд стд асд Гсд
Азп Ьуз Рго Агд С1п Тгр Ьеи ТЬг Зег
385 390 дсТ дет сад ТТТ Тас ааа Гас 1151 А1а А1а С1п РНе Туг Ьуз Туг
380
1178
<210> 2 <211> 392 <212> РКТ <213> НеНапТНиз аппиз
<400> 2
РНе А1а Туг Рго □ 1у □ 1у ТНг Зег МеТ С1и Т1е Шз С1п А1а Ьеи ТНг
1 5 10 15
Агд Зег Зег ТЬг Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Шз С1и □1п □ 1у С1у
20 25 30
Уа1 РНе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд А1а Зег □1у Ьеи Рго О1у Уа1
35 40 45
Суз Не А1а ТНг Зег □ 1у РГО С1у А1а ТНг АЗП ьеи Уа1 Зег С1у Ьеи
50 55 60
А1а Азр А1а ьеи Ьеи АЗр Зег Уа1 Рго МеТ Уа1 А1а Не ТЬг С1у О1п
65 70 75 80
Уа1 Рго Агд Агд мет Не □1у ТНг Азр А1а РНе С1п С1и ТНг Рго Не
85 90 95
Уа1 □ 1и Уа1 ТЬг Агд Зег Не ТНг Ьуз Шз Азп Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр
100 105 110
Уа1 С1и Азр 11е Рго Агд Не Уа1 Агд С1и А1а РНе Туг Ьеи А1а Зег
115 120 125
Зег □ Гу Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Не Азр Уа1 Рго Ьуз Азр Не □1п
130 135 140
С1п С1п Ьеи Уа1 Уа1 Рго Ьуз Тгр Азр С1и Рго МеТ Агд Ьеи Рго <31у
145 150 155 160
Туг Ьеи Зег Агд МеТ Рго Ьуз Рго □ 1п Туг Азр С1у Шз Ьеи □ 1и □1п
165 170 175
Не Уа1 Агд Ьеи Уа1 <31у □1и А1а Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Туг Уа1 <31у
180 185 190
□1у □1у Суз Ьеи Азп Зег Азр Азр О1и Ьеи Агд Агд РНе ν»ι □ 1и Ьеи
195 200 205
ТНг О1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТНг Ьеи МеТ <31у Ьеи □ 1у А1а Туг Рго
210 215 220
А1а Зег Зег Азр Ьеи Зег Ьеи Н13 мет Ьеи □ 1у мет Шз □ 1у ТЬг Уа1
225 230 235 240
Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 Азр Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе □1у
245 250 255
Уа1 Агд РНе Азр Азр Агд 7а1 ТНг С1у ьуз Ьеи □1и А1а РНе А1а Зег
260 265 270
Агд А1а Ьуз Не Уа1 Шз Не Азр Не Азр Рго А1а С1и Не С1у Ьуз
275 280 285
Азп Ьуз С1п Рго ΗίΒ Уа1 Зег Не Суз <31у Азр Не Ьуз Уа1 А1а Ьеи
290 295 300
С1п С1у Ьеи Азп Ьуз Не Ьеи О1и С1и Ьуз Азп Зег Уа1 ТНг Азп Ьеи
305 310 315 320
Азр РНе Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз □1и Ьеи Азр С1и С1п Ьуз МеТ Ьуз РЬе
325 330 335
Рго Ьеи Зег РНе Ьуз ТНг РЬе 61у С1и А1а Не РГО Рго □ 1п Туг А1а
340 345 350
Не С1п Уа1 Ьеи Азр С1и Ьеи ТНг □1у □1у Азп А1а Не Не Зег ТНг
- 41 020462
355 360 365
С1у Уа1 С1у О1п Ηίβ С1п Мер Тгр А1а А1а σΐη РЬе Туг Ьуз Туг Азп
370 375 380
Ьуз Рго Агд Θΐη Тгр Ьеи ТЬе Зег
385 390
<210> 3 <211> 1178 <212> ДНК <213 > НеНапСЬиз аппиз <220>
<221ϊ С03 <222> (3)...(1178) <400> 3 ес еес дсс еас ссс ддс ддс дед ееа аед дад аес сас саа дсе сес 47
РЬе А1а Туг Рго С1у О1у А1а Зег МеС С1и Не Над С1п А1а Ьеи
1 5 10 15
асд сдс еса аде асе аес сде аае дед сес ссс сде сас даа сад ддс
ТЬг Агд Зег Зег ТЬг 20 Не Агд Азп Уа1 Ьеи 25 Рго Агд Н1з С1и С1п 30 С1у
ддс дед еес дсс дсс даа ддс еас дед сдс дсс Ссс ддс сее ссс ддс
О1у Уа1 РЬе А1а 35 А1а С1и С1у Туг А1а 40 Агд А1а Зег С1у Ьеи 45 Рго С1у
дед еде аес дсс асе есс ддс ссс дда дсе асд аас сСа дее аде ддс
Уа1 Суз 11е 50 А1а ТЬг Зег С1у Рго 55 С1у А1а ТЬг Азп Ьеи 60 ν*ΐ Зек <31у
сее дсе дас дед сед ееа дас аде дЬс ссс аСд дед деа аес асе ддс
Ьеи А1а 65 Аер А1а Ьеи Ьеи Азр 70 Зег Уа1 Рго Мее Уа1 75 А1а Не ТЬг С1у
саа дее ссс едд ада аед аес дда асе дае дед еее саа даа асе сса
С1п 80 Ча1 Рго Агд Агд Мее 85 Не 01у ТЬг Авр А1а 90 РЬе С1п С1и ТЬг Рго 95
асе дее дад деа аса еде есд аСс асе ааа сае аае ЪаС сее дед еед
Не Уа1 01и Уа1 ТЬг 100 Агд Зег Не ТЬг Ьуз 105 ΗΪ3 Азп Туг Ьеи Уа1 110 Ьеи
дае дее дад дае аее ссс ада аее дее сдС дад дсе еее еае сее дед
Азр Уа1 01и Азр 115 11е Рго Агд Не νθΐ 120 Агд 01и А1а РЬе Туг 125 Ьеи А1а
аде Сед дде еда ссс ддс ссд дее есд аса дае деа ссд ааа дае аеа
Зег Зег С1у 130 Дед Рго е1у Рго Уа1 135 Ьеи Не Азр Уа1 Рго 140 Ьуз Азр Не
сад саа сад ееа дед дед ссд ааа едд даС даа ссд аСд адд ееа ссд
С1п С1п 145 О1п ьеи ча! Уа1 Рго 150 Ьуз Тгр Азр <31и Рго 155 мее Агд Ьеи Рго
ддс СаС сед есе ада аед ссд аад ссе саа СаС дае ддд сае еед даа
61у 160 Туг Ьеи Зег Агд Мее 165 Рго Ьуз Рго С1п Туг 170 Азр СТу ΗΪ8 Ьеи С1и 175
- 42 020462
сад асе 61п Не дее Уа1 адд Агд сед дед ддд даа С1у С1и дед А1а аад Ьуз 185 адд Агд ссд Рго дее Уа1 сед Ьеи Сае Туг 190 дбд νβΐ 575
Ьеи 180 Уа1
ддс ддс 999 еде сед аае Ссд дае дае дад сед адд сдд еее дьд дад 623
С1у С1у С1у Суз Ьеи Азп Бег Азр Азр С1и Ьеи Агд Агд РЬе νβΐ С1и
195 200 205
сее асд ддд асе ссд дее дед аде асе еСд аСд ддд сСс дда дед Сас 671
Ьеи ТЬг С1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи МеС С1у Ьеи С1у А1а Туг
210 215 220
ссС дсС Сед аде дае сед Ссд сее саС аСд сее ддд аСд саС ддь асд 719
Рго А1а Зег Зег Азр Ьеи Зег Ьеи Ηίε МеС Ьеи <31у МеС Нгз С1у ТЬг
225 230 235
дее сае дед аае СаС дед дее дае аад аде дае сед сед сее дед еее 767
Уа1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 Азр Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе
240 245 250 255
ддд дЬд едд еес дае дае еде дСд асд ддд аад сее дад дед еее дее 815
С1у Уа1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьеи С1и А1а РЬе А1а
260 265 270
аде адд дед аад асе дее саС асе дае асе дае ссе дее даа асе ддд 863
Зег Агд А1а Ьуз Не Уа1 Ηίε Не Азр Не Азр Рго А1а 61и Не С1у
275 280 285
аад ааС аад сад ссС саС дед Ссд аЪС еде ддс дае асе аад дСс дед 911
Ьуз Азп Ьуз С1п Рго Ηίβ Уа1 Зег Не Суз С1у Азр Пе Ьуз Уа1 А1а
290 295 300
ССа сад ддс ССд аас аад асе сед дад даа аад аае сед дед асе аае 959
ьеи С1п <31у Ьеи Азп Ьуз Не Ьеи С1и С1и Ьуз Азп Бег Уа1 ТЬг Авп
305 310 315
сСС дае ссс Сед асе Сдд ада аад даа еСд даС даа саа ааа аСд аад 1007
Ьеи Азр РЬе Бег ТЬг Тгр Агд Ьуз С1и Ьеи Азр С1и С1п Ьуз МеС Ьуз
320 325 330 335
ССс ссд ССд аде еее ааа асд еее ддс даа дед асе ссе сса сад сае 1055
РЬе Рго Ьеи Бег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у С1и А1а Пе Рго РГО С1п Туг
340 345 350
дее асе саа дее сее дае дад ССа асд ддс ддд ааЬ дса асе асе аде 1103
А1а Не С1п Уа1 Ьеи Авр С1и Ьеи ТЬг С1у <31у Азп А1а Пе Пе Бег
355 360 365
асе ддс дСс ддд саа саС сад аСд бдд дее дее сад еее Сас ааа Сас 1151
ТЬг <31у Уа1 <31у С1п Н1з С1п МеС Тгр А1а А1а С1п РЬе Туг Ьуз Туг
370 375 380
аас ааа ССС ада саа Сдд сСд асд Ссд 1178
Άδη Ьуз РГО Агд С1п Тгр Ьеи ТЬг Зег
385 390
<210> 4 <211> 392 <212> РЕТ с213> НеПапсЬиз аппиз
- 43 020462 <400> 4
РЬе А1а Туг Рго С1у С1у А1а Зег Мее С1и Не П1з С1п А1а Ьеи ТЬг
1 5 10 15
Агд Вег Бег ТЬг 11е Агд Азп Ца1 Ьеи Рго Агд Н1з С1и С1п С1у <31у
20 25 30
Уа1 РЬе А1а А1а С1и С1у Туг А1а Агд А1а Зег 01у Ьеи Рго С1у Уа1
35 40 45
Суз Пе А1а ТЬг Зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег С1у Ьеи
50 55 60
А1а Азр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 Рго МеС т/а1 А1а Пе ТЬг С1у С1п
65 70 75 80
Уа1 Рго Агд Агд МеС Пе С1у ТЬг Азр А1а РЬе <31п С1и ТНг Рго Пе
85 90 95
Уа1 <31и Уа1 ТЬг Агд Зег Пе ТЬг Ьуз Н1з Азп Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр
100 105 110
Уа1 01и Азр Пе Рго Агд Пе Уа1 Агд С1и А1а РЬе Туг Ьеи А1а Зег
115 120 125
Зег С1у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Пе Азр Уа1 Рго Ьуз Азр Пе О1п
130 135 140
С1п С1п Ьеи Уа1 Уа1 Рго Ьуз Тгр Азр <31и Рго мес Агд Ьеи Рго О1у
145 150 155 160
Туг Ьеи Зег Агд МеС Рго Ьуз Рго С1п Туг Азр С1у Н1з Ьеи С1и Θΐη
165 170 175
Не Уа1 Агд Ьеи Уа1 С1у С1и А1а Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Туг Уа1 О1у
180 185 190
С1у С1у Суз Ьеи Азп Зег Азр Азр С1и Ьеи Агд Агд РЬе Уа1 С1и Ьеи
195 200 205
ТЬг С1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи Мес С1у Ьеи С1у А1а Туг Рго
210 215 220
А1а Зег Зег Азр Ьеи Зег Ьеи Ηίδ Мес ьеи 61у мес Ηίε С1у ТЬг Уа1
225 230 235 240
Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 Азр Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе С1у
245 250 255
Уа1 Агд РЬе Аэр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуз Ьеи <51и А1а РЬе А1а Зег
260 265 270
Агд А1а Ьуз 11е Уа1 Ηί3 Пе Азр Не Азр Рго А1а С1и Пе С1у Ьуз
275 280 285
Азп Ьуз С1п Рго Н1з Уа1 Зег Х1е Суа С1у Азр Пе Ьуз Уа1 А1а Ьеи
290 295 300
<31п е1у Ьеи АЗП Ьуз Х1е Ьеи С1и С1и Ьуз Азп Бег Уа1 ТЬг Азп Ьеи
305 310 315 320
Азр РЬе Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз <31и Ьеи Азр С1и 01п Ьуз МеС Ьуз РЬе
325 330 335
Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у 01и А1а Пе Рго Рго С1п Туг А1а
340 345 350
Пе <31п Уа1 Ьеи Азр С1и Ьеи ТЬг 01у <31у АЗП А1а Пе Пе Зег ТЬг
355 360 365
01у Уа1 С1у С1п Н±д С1п МеС Тгр А1а А1а <31п РЬе Туг Ьуз Туг Азп
370 375 380
ьуз РГО Агд С1п Тгр Ьеи ТЬг Зег
385 390
<210> 5 <211> 2156 с212> ДНК <213> ХапСЫит зр
<220> <221> СЬЗ
- 44 020462 <222> (111)...(2057) с221> т1зс_£еаСиге <222> (0)...(0) <223> № каталога СепВапк К16280 <400> 5 даасаасадс сасаСдСССс сддассаСсд СсдССсасас аадСасааас аСаасаСаас аСаасссСад СасаСаасас
116 дсс асе ссС саС аса аас ссС Ссс асе асе асе
А1а Не Рго Ηΐδ ТНг Азп Рго Зег 11е ТНг ТНг
10 сса сса сдС ссс асе ССс сСс дсс еде ссс аса
Рго Рго Агд Рго ТНг РНе Ьеи А1а Агд РНе ТНг
25 асС Ссс саС ааа еда сас сдС сСс сас аСс Ссс
ТНг Зег ΗΪ3 Ьуз Агд Нхз Агд Ьеи Ηίβ Не Зег
40 45
Ссс ааа есс асе аСс асе саС Сса сса сса сса
Зег Ьуз Рго ТНг Не ТНг Н1з Зег Рго Ьеи Рго
60
Ссс сдС Сас дсС сса дас саа сса ада ааа ддс
Зег Агд Туг А1а Рго Азр О1п Рго Агд Ьуз (Лу
75 даа дсС сСд даа сдС даа ддс дСС аса дас дСс
О1и А1а Ьеи С1и Агд С1и С1у Уа1 ТНг Азр Уа1
30 ддС дсс Ссс аСд дад аСс сас саа дсС сСс асд
С1у А1а Зег МеС (Ли Не Н1з О1п А1а Ьеи ТНг
100 105 сдс аас дСС сСс сса сдС сас даа сад ддс ддс
Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд №з С1и <31п <Лу (Лу
115 120 125 ддс Сас дса сдС дсс Ссс ддс сСС ссс ддс дСс
С1у Туг А1а Агд А1а Зег С1у Ьеи Рго О1у Уа1
135 140 ддС ссС дда дсс асд аас сСа дса аде ддс ссс
О1у Рго С1у А1а ТНг Азп Ьеи Уа1 Зег С1у Ьеи
150 155 дас адС дСС сса аСд дСС дсС асе асе ддс саа
Азр Зег Уа1 Рго МеС ν3ΐ А1а Не ТНг С1у С1п
165 170 аСС дда аса даС дед ССС саа даа асе ссС аСС
11е С1у ТНг Азр А1а РНе О1п <Ли ТНг Рго Не
180 185
Ссс аСС асС аад саС ааС СаС ССа дСС ссд даС сСаССССааС садаСаааса асаССсааса аСд дед
МеС А1а 1 ааа сса ссс Сса СсС
Ьуз Рго Рго Зег Зег
ССс сса аса асе Ссс
РНе Рго 11е ТНг Зег аас дСс сСс Ссс дас Азп \га1 Ьеи Зег Азр асе ааа Сса ССС аСс ТНг Ьуз Зег РНе Не дсС даС дСС сСс дСс А1а Азр Уа1 Ьеи Уа1
ССс дсС Сас сса ддС РНе А1а Туг Рго С1у сдс Сса асе асе аСс Агд Зег ТНг ТНг Не 110 дСс ССС дсС дсс даа ν^Ι РНе А1а А1а (Ли
130
СдС аСС дса асе СсС Суз Не А1а ТНг Зег
145 дсС даС дсС ССа ССа А1а Азр А1а Ьеи Ьеи
160 дСС ссс адд ада асд !7а1 Рго Агд Агд МеС
175 дСС дад дСа аса сдС Уа1 (Ли Уа1 ТНг Агд 190 дСс дад даС аСС ссс
164
212
260
308
356
404
452
500
548
596
644
692
740
- 45 020462
788
Зег Не ТНг Ьуз Н1з Азп Туг Ьеи УаТ Ьеи Азр УаТ ОТи Азр Не Рго
195
200
205
210 адд аРР дРР адд даа дсР РРР РаР сРР дед РсР РсР ддр еда ссс дда Агд Не УаТ Агд СТи А1а РНе Туг Ьеи А1а Зег Зег СТу Агд Рго С1у
215
220
225 ссд дРР РРа аРР дар дра ссР аад дар аРа сад сад сад РРд дРа дрд Рго Уа1 Ьеи Не Авр УаТ Рго Ьуз Азр Не СТп СТп СТп Ьеи УаТ УаТ
836
230
235
240 ссР ааа Рдд дар дад ссР аРР адд РРа ссР ддд РаР РРд РсР адд РРс Рго Ьуз Тгр Азр ОТи Рго Не Агд Ьеи Рго СТу Туг Ьеи Зег Агд РЬе
884
245
250
255 ссР ааа асд дад ааР ааР ддд сад РРд даа сад аРР дРР адд РРд дрд Рго Ьув ТЬг ОТи Авп Авп СТу СТп Ьеи СТи СТп Не УаТ Агд Ьеи УаТ
932
250
265
270 адр дад дсс аад адд ссд дРР РРд РаР дрд ддд ддр ддд РдР РРд ааР Зег С1и АТа Ьув Агд Рго УаТ Ьеи Туг УаТ СТу СТу СТу Сув Ьеи Азп
980
275
260
285
290
Рсд дда даР дад РРд адд едд РРР дрд дад сРР асд ддд аРа ссд дРР Зег СТу Азр С1и Ьеи Агд Агд РЬе УаТ СТи Ьеи ТЬг СТу Пе Рго УаТ
1028
295
300
305 дед адр асд РРд ард ддд сРР дда дед Рас ссР дсР РсР адр дар РРд АТа Зег тЬг ьеи Мер СТу ьеи СТу АТа Туг Рго АТа Зег Зег Азр Ьеи
1076
310
315
320
Рсд ерд саР ард сРР ддд ард сар ддд асе дРР РаР дед ааР РаР дед Зег Ьеи НТз Мер Ьеи СТу Мер ΗΪ3 СТу ТНг УаТ Туг АТа Азп Туг АТа
1124
325
330
335 дРР дар аад адр дар РРд РРд сРР дед РРР ддд дра адд РРР дар дас УаТ Аар Ьув Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи АТа РЬе СТу УаТ Агд РЬе Азр Азр
1172
0
345
350 сдр дрд асд ддд аад сРР дад дсР РРР дсР аде ада дсР аад аРР дРР Агд УаТ ТЬг СТу Ьуз Ьеи ОТи АТа РЬе АТа Зег Агд АТа Ьуз Пе УаТ
1220
355
360
365
370 сар арр даР аРР дар РсР дед даа аРР ддд аад ааР аад сад ссР сар нТв Пе Азр Пе Азр Зег АТа СТи Пе СТу Ьуз Азп Ьуз ОТп Рго Н±в
1268
375
380
385 дрд Рсд аРР РдР ддр дар аРР аад дрс дед РРа сад ддр срд аас аад УаТ Зег ТТе Суз СТу Азр Пе Ьуз УаТ АТа Ьеи СТп СТу ьеи Азп Ьуз
1316
390
395
400 аРР РРд дад дра аад ааР Рсд дрд асР ааР сРР дар РРс Рсд аас Рдд ТТе Ьеи СТи УаТ Ьув Азп Зег УаТ ТЬг Азп Ьеи Авр РЬе Зег Азп Тгр
1364
405
410
415 адд аад даа РРд дар дад саа аад дРР аад РаР ссд РРд адр РРР ааа Агд Ьуз С1и Ьеи Азр С1и С1п Ьуз Уа1 Ьуз Туг Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз
420 425 430
1412 аса РСР ддс даа дсР аРР ссР ссд сад Рас дсс аРР саа дрд сРР дар ТЬг РЬе СТу СТи АТа ТТе Рго Рго СТп Туг АТа Пе СТп УаТ Ьеи Азр
1460
- 46 020462
435 440 445 450
дад сса асд ддс ддд аае дед аСС аСС аде асС ддд дСс ддд сад саС 1508
С1и Ьеи ТНг С1у С1у Азп А1а 11е 11е 5ег ТЬг С1у Уа1 О1у С1п ΗΪ3
455 460 465
сад аСд Ьдд дсС дсс сад ССС Сас ааа Сас аае аад ссС ада саа Сдд 1556
С1п МеС тгр А1а А1а С1п РНе Туг Ьуз Туг Азп Ьуз Рго Агд σΐη Тгр
470 475 480
сСд асд Ъса ддс дда сеа ддд дед аСд дд* ССС ддд ССд ссс дсС дсС 1604
Ьеи ТЬг Зег С1у С1у Ьеи С1у А1а Мес С1у РНе С1у Ьеи Рго А1а А1а
485 490 495
асе ддд дсс дсС дсс дса ада ссС дас дед дса дса дсс дас асе да С 1652
Не <31у А1а А1а Уа1 А1а Агд Рго Азр А1а Уа1 Уа1 ¥а1 Азр 11е Азр
500 505 510
дць даС дда аде ссс аеа аСд аае дСС саа дад ССа дсс аса аСс сдЬ 1700
С1у Азр С1у Зег РНе 11е МеС Азп Уа1 С1п С1и Ьеи А1а ТНг 11е Агд
515 520 525 530
дЬС даа аае сСС ссС деь аад аСС ССд ССа сСС аае ааС сад саС ССд 1748
Уа1 С1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз 11е Ьеи Ьеи Ьеи Азп АЗП С1п ΗΪ3 Ьеи
535 540 545
ддь аСд дед дсс сад едд дад дас едд ССС Сас аад дед ааС едд дсс 1796
<31у МеС Уа1 Уа1 С1п Тгр С1и Азр Агд РНе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а
550 555 560
саЬ асе Сас ССа дд& аае ссд Сса ааа дад СсС даа аСа ССс ссС аае 1344
Н±Е ТНг Туг Ьеи С1у Азп Рго бег Ьуз СТи бег С1и 11е РНе Рго Азп
565 570 575
аЬд **д аад ССС дсС даа дед СдС да с аСс сса дсС дсс еда д*э асе 1892
Нее Ьеи Ьуз РЬе А1а С1и А1а Суз Азр 11е Рго АТа А1а Агд Уа1 ТНг
580 585 590
едд аад дса да С сСа еда дса дсс аСС сад аад аСд ССд даС аса сед 1940
Агд Ьуз А1а Азр Ьеи Агд А1а А1а 11е СТп Ьуз МеС Ьеи Азр ТЬг Рго
595 600 605 610
дня ссС Нас ССд ССд дае дед аСс дьд ссс саС саа даа саС з*д ССд 1988
Я1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 11е Уа1 РГО Н13 <31п С1и Н13 Уа1 Ьеи
615 620 625
ссс аСд асе сед дсс дде дда ддс ССс аСд дас дед аСс асе даа ддс 2036
Рго МеС Не Рго А1а С1у 01у С1у РНе МеС Азр Уа1 11е ТНг С1и СТу
630 635 640
дас ддс ада аСд ааа еае С да дсССсааСдС сасаСаСадС дСдССсСдСа 2087
Азр СТу Агд МеС Ьуз Туг *
€45 адсадСССде сддССаСдаа дССаааСдСС ССдССдСдСа аСССсдССсс СддССааааа 2147 аСсаадсСС 2156 <210> 6 <211> 648 <212> РЕТ <213> ХапСЫит зр.
- 47 020462 <400> 6
Мес А1а 1 А1а Не Рго 5 Н1з ТЬг Азп Рго Зег 10 Пе ТЬг ТЬг Ьуз Рго 15 Рго
Зег Зег Рго Рго Агд Рго ТЬг РЬе Ьеи А1а Агд РЬе ТЬг РЬе Рго Пе
20 25 30
ТЬг Зег ТЬг Зег Ηί8 ьуе Агд ΗΪ3 Агд Ьеи Ηίδ Пе зег Αδη Уа1 Ьеи
35 40 45
Зег Авр Зег Ьуе Рго ТЬг Пе ТЬг Ηίδ Зег Рго Ьеи Рго ТЬг Ьуз Зег
50 55 60
РЬе Пе Зег Агд Туг А1а Рго Азр С1п Рго Агд Ьуз С1у А1а Азр Ца1
65 70 75 80
Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи 01и Агд 01и 01у Уа1 ТЬг Азр Уа1 РЬе А1а Туг
85 90 95
Рго С1у <31у А1а Зег МеС С1и Пе Н1з 01п А1а Ьеи ТЬг Агд Зег ТЬг
100 105 ПО
ТЬг Пе Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд ΗΪ8 С1и С1п С1у С1у Па1 РЬе А1а
115 120 125
А1а С1и 61у Туг А1а Агд А1а Зег С1у Ьеи Рго С1у Па1 Суз Пе А1а
130 135 140
ТЬг Зег С1у Рго 61у А1а ТЬг Азп Ьеи Уа1 Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а
145 150 155 160
Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 Рго мес νβΐ А1а Пе ТЬг С1у <31п Уа1 Рго Агд
165 170 175
Агд МеС 11е С1у ТЬг Азр А1а РЬе О1п С1и ТЬг Рго Пе Уа1 «1и Уа1
180 185 190
ТЬг Агд Зег Пе ТЬг Ьуз Ηίδ Азп Туг Ьеи Уа1 Ьеи Азр Уа1 С1и Азр
195 200 205
Не Рго Агд Пе Уа1 Агд 01и А1а РЬе туг Ьеи А1а Зег Зег С1у Агд
210 215 220
Рго 01у Рго ν&1 Ьеи Пе Азр Уа1 Рго Ьув Азр 11е <31п 01п С1п Ьеи
225 230 235 240
Уа1 Уа1 Рго Ьуэ Тгр Азр 61и Рго Пе Агд Ьеи Рго С1у Туг Ьеи Зег
245 250 255
Агд РЬе Рго Ьуз ТЬг О1и Азп Азп С1у С1п Ьеи <31и С1п Пе Уа1 Агд
260 265 270
Ьеи Уа1 Зег С1и А1а Ьуз Агд Рго Уа1 Ьеи Туг Уа1 <31у □1у С1у Суз
275 280 285
Ьеи Азп Зег С1у Азр С1и Ьеи Агд Агд РЬе иа1 О1и Ьеи ТЬг С1у Пе
290 295 300
Рго па1 А1а Зег ТЬг Ьеи МеС 51у Ьеи 01у А1а Туг Рго А1а Зег Зег
305 310 315 320
Азр Ьеи Зег Ьеи ΗΪ3 МеС Ьеи О1у МеС Н1з О1у ТЬг Уа1 Туг А1а Азп
325 330 335
Туг А1а Уа1 Азр Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи А1а РЬе С1у Уа1 Агд РЬе
340 345 350
Авр Азр Агд Уа1 ТЬг С1у Ьуе Ьеи 01и А1а РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз
355 360 365
Х1е Уа1 ΗΪ3 Пе Азр Пе Аер Зег А1а Й1и Пе С1у Ьуз Азп Ьуз О1п
370 375 380
Рго ΗΪ3 Уа1 Зег Пе Суз <31у Азр 11е Ьуз Уа1 А1а Ьеи С1п С1у Ьеи
385 ЗЭО 395 400
АЗП Ьуе Не Ьеи С1и Уа1 Ьуе Азп Зег Уа1 ТЬг Авп Ьеи Азр РЬе Зег
405 410 415
АзП Тгр Агд Ьуз 01и Ьеи Азр О1и С1п Ьув Уа1 Ьуз Туг Рго Ьеи Зег
420 425 430
РЬе ьуз ТЬг РЬе О1у О1и А1а Пе Рго Рго С1п Туг А1а Пе С1п Уа1
435 440 445
ьеи Аер С1и Ьеи ТЬг 61у С1у Азп А1а Пе Пе Зег ТЬг 61у Иа1 О1у
450 455 460
С1п Шз С1п МеС Тгр А1а А1а С1п РЬе Туг Ьуз Туг Азп Ьуз Рго Агд
- 48 020462
4 65 470 475 480
О1п Тгр Ьеи ТЬг Зег О1у О1у Ьеи С1у А1а Мер С1у РЬе С1у Ьеи Рго
485 490 495
А1а А1а 11е О1у А1а А1а Уа1 А1а Агд РГО Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 Αερ
500 505 510
Не Αερ С1у Αερ 61у Зег РЬе 11е Мер Азп Уа1 С1п С1и Ьеи А1а ТЬг
515 520 525
11е Агд Уа1 О1и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз Не Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп О1п
530 535 540
Ηίβ ьеи О1у Мер Уа1 Уа1 01 п Тгр С1и Азр Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп
545 550 555 560
Агд А1а Ηίβ ТЬг Туг ьеи 01 у Азп Рго Зег Ьув С1и Зег О1и Не РЬе
565 570 575
Рго Азп Мер Ьеи Ьув РЬе А1а С1и А1а Суз Азр Не РгО А1а А1а Агд
580 585 590
Уа1 ТЬг Агд Ьуз А1а Азр Ьеи Агд А1а А1а Не О1п Ьуз Мер Ьеи Авр
595 600 605
ТЬг Рго О1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 Не Уа1 Рго Ηίε οίη С1и ΗΪ3
610 615 620
νβΐ Ьеи РГО Мер Пе Рго А1а С1у О1у С1у РЬе Мер Авр Уа1 Не ТЬг
625 630 635 640
С1и С1у Азр С1у Агд Мер Ьуз Туг
645
<210> 7 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер НА1П409 <400> 7 садасдрдрр ддеддаадс 19 <210> 8 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер НА1Д1379 <400> 8 сРдРаасдсд ассрРааРаР с 21 <210> 9 <211> 22 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Праймер НА1Д1313 <400> 9 рдсРдаааРР дддаадааРа ад 22 <210> 10 <211> 19 <212> ДНК
- 49 020462 <213> Искусственная последовательность <220?
<223> Праймер НА1Ь2131 <400? ю
СССсдССсСд ссаСсассс 19 <210? 11 <211? 1968 <212? ДНК <213? Не11апСЬиз аппиз <220?
<221? СОЕ <222? (1) , . ,(1965) <221? т1зС_£еаСиге <222? (0)...(0) <223> № каталога СепВапк ΑΥ541451 <400? 11
аСд дед дсС ссС ссс аас ссС Ссс аСс Ссс ССс ааа сса ссд Сса ссс
МеС 1 А1а А1а Рго Рго 5 АЗП РГО Зег 11е Зег 10 РЬе Ьуз Рго Рго Зег 15 Рго
дсс дсс дса сСд сса сса сдс Ссс дсс ССС сСс ссс сдС ССс дса ССа
А1а А1а А1а Ьеи 20 Рго Рго Агд Зег А1а 25 РЬе Ьеи Рго Агд РЬе 30 А1а Ьеи
ссс аСс асС Ссс асС асе саа ааа еда сас сдс ССС сас аСс Ссс аас
Рго Не ТЬг 35 5ег тЬг ТЬг <31п Ьуз 40 Агд ΗΪ3 Агд ьеи Ηίε 45 11е Зег Азп
дСС сСс Ссс дас Ссс ааа Ссс асе асе асе асе асе асе асе асС саа
Уа1 ьеи 50 Зег Азр Зег ьуз Зег 55 ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг 60 ТЬг ТЬг ТЬг <31п
еда ссд ССа ссд дьд сад ссС ССС дСс Ссс сдС сас дед сса дас саа
Агд 65 Рго Ьеи Рго Уа1 βΐη 70 Рго РЬе Уа1 Зег Агд 75 Туг А1а Рго Азр С1п 80
ссд ада ааа ддс дса дас дед ССд дед даа дсС сСд даа едд даа ддс
Рго Агд Ьуз О1у А1а 85 Азр Уа1 Ьеи Уа1 С1и 90 А1а Ьеи <31и Агд О1и 95 О1у
дсс асе дас дСс ССс дсс Сас ссс ддс дде дед Сса аСд дад аСс сас
Уа1 ТЬг Азр Уа1 100 РЬе А1а Туг Рго 31у 105 О1у А1а Зег МеС <31и 110 11е Н1з
саа дсС сСс асд сдс Сса аде асС аСс сдс аас дед сСс ссс сдС сас
О1п А1а Ьеи 115 ТЬг Агд Зег Зег ТЬг 120 Не Агд Азп Уа1 Ьеи 125 Рго Агд Шз
даа сад ддс ддс дед ССс дсс дсс даа ддс Сас дед сдс дсс Ссс ддс
С1и С1п 130 С1у С1у Уа1 РЬе А1а 135 А1а С1и <31у Туг А1а 140 Агд А1а Зег С1у
сСС ссс ддс дед сдс асе дсс асС Ссс ддь ссс дда дсс асд аас сСа
Ьеи 145 Рго Э1у Уа1 Суз Не 150 А1а ТЬг Зег С1у Рго 155 О1у А1а ТЬг Азп ьеи 160
- 50 020462
9СС Уа1 адк £ег ддЬ <31у сСС Ьеи дсс А1а 165 дао Азр дед А1а сЬд Ьеи сса Ьеи дас АЗр 170 аде Зег дЬс Уа1 ССС Рго аЬд МеС дъд Уа1 175 дса А1а 528
асе асе дде саа ди ссс едд ада асд аСс дда асе да£ дед ЪЪГ саа 576
Не ТЬг С1у (31п 180 Уа1 Рго Агд Агд МеС 185 Пе С1у ТЬг Азр А1а 190 РЬе <31п
даа асе сеа аСС дсс дад дСа аса сде Ссд асе асС ааа саС аа£ СаС 624
<31и ТЬг Рго 195 Не Уа1 <31и Уа! ТЬг 200 Агд Зег Пе ТЬг Ьуз 205 Нгз Азп Туг
сСС дьд ССд дас дсс дад даъ асе ссс ада аЬС дсс едк дад дек. ССС 672
Ьеи νβΐ 210 Ьеи Аар Уа! С1и Абр 215 Не Рго Агд Пе Уа1 220 Агд С1и А1а РЬе
СаС сеь дед аде Ссд дде еда ссс дде ссд дсс ССд ака да С дка ссд 720
Туг 225 Ьеи А1а Зег Зег О1у 230 Ахд Рго С31у Рго Уа1 235 Ьеи 11е Азр Уа1 Рго 240
ааа даЬ аСа сад саа сад ЬЬа дЬд дед ссд ааа сдд даЬ даа ссд аСд 768
Ьув Авр Не <31п 61п 245 С1п Ьеи Уа1 Уа1 Рго 250 Ьуз Тгр Азр <31и Рго 255 МеС
адд СЬа сед 99 С СаС ССд Гек ада асд ссд аад ссС саа СаС даЪ ддд 816
Агд Ьеи Рго <31у 260 Туг Ьеи Зег Агд МеС 265 Рго Ьуз Рго С1п Туг 270 Азр О1у
саС ГЬд даа сад аСС дЬЬ адд еСд дед ддд даа дед аад адд ссд дСС 864
ΗΪΒ Ьеи С1и 275 С1п Не Уа1 Агд Ьеи 280 Уа1 <31у <31и А1а Ьуз 285 Агд Рго Уа1
сед ίβϋ дЬд дде дде ддд Ъд£ ссд ааС Ссд да С дао 9*9 ССд адд сдд 912
Ьеи Туг 290 Уа1 С1у С1у С31у Суз 295 Ьеи Азп Зег Азр Азр 300 С1и Ьеи Агд Ахд
ССС дед дад есс асд ддд аеъ сед дсс дед адС асС еьд аСд 999 ссс 960
РЬе 305 Уа1 С1и Ьеи тЬг <31у 310 Не Рго Уа1 А1а Зег 315 ТЬг Ьеи МеС О1у Ьеи 320
дда дед Сас ССС дсС Ссд адС даС ССд Ссд есс саС а£д есс 999 асд 1008
<31у А1а Туг Рго А1а 325 Зег Зег Азр ьеи Зег 330 Ьеи Н1з ме! ьеи О1у 335 Мес
саС дде асд дСС СаС дед аак СаС дед дсс дао аад адк дас £^9 ССд 1056
Шз <31у ТЬг Уа1 340 Туг А1а Азп Туг А1а 345 Уа1 Азр Ьуз Зег Азр 350 Ьеи Ьеи
сСС дед ССС ддд дьд едд даС да С сдС дед асд 999 аад си дад 1104
Ьеи А1а РЬе 355 С1у Уа1 Агд РЬе Азр 360 Азр Агд Уа1 ТЬг С1у 365 Ьуз Ьеи С1и
дед ссс дсс аде адд дед аад аСС дсс саС асе даЬ а££ дас ссС дсС 1152
А1а РЬе 370 А1а Зег Агд А1а Ьуз 375 Не Уа1 Шв Пе Азр 380 Не Авр Рго А1а
даа аСЬ 99Ή аад ааС аад сад ССС саС дед Ссд аСС иде дде даС аСС 1200
<31и 385 Пе С1у Ьуз Азп Ьуз 390 С1п Рго Нйз Уа1 Зег 395 Пе Суз О1у Аэр Пе 400
- 51 020462 аад дрс дед РРа сад ддр РРд аас аад аРР РРд дад даа аад ааР Рсд Ьуз Уа1 АТа Ьеи СТп СТу Ьеи Азп Ьуз 11е Ьеи СТи С1и Ьуз Азп Зег
1246
405
410
415 дрд асР ааР сРР дар РРР Рсд асе Рдд ада аад даа РРд даР даа саа УаТ ТЬг Азп Ьеи Аар РЬе Зег ТЬг Тгр Агд Ьуз С1и Ьеи Азр С1и 61п
1296
420
425
430 ааа ард аад РРс ссд РРд аде РРР ааа асд РРР ддс даа дед аРР ссР Ьуз Мер Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе СТу С1и АТа 1Те Рго
1344
435
440
445 сса сад РаР дсР аРР саа дРР сРР даР дад РРа асд ддс ддд ааР дса Рго СТп Туг АТа Не СТп УаТ Ьеи Азр ОТи Ьеи ТЬг СТу СТу Азп АТа
1392
450
455
460 аРР аРР аде асе ддр дрс ддд саа сар сад ард Рдд дсР дсР сад РРР Не Не Зег ТЬг СТу УаТ СТу СТп Ηίβ СТп Мер Тгр АТа АТа СТп РЬе
1440
465
470
475
460
Рас ааа Рас аас ааа ссР ада саа Рдд срд асд Рсд ддс ддд сРа ддд Туг Ьуз Туг Азп ьуз Рго Агд СТп тгр Ьеи ТЬг Зег СТу СТу Ьеи С1у
1486
465
490
495 дса ард ддс РРс ддс срд ссс дсР дсР аРс ддд дед дсс дРР дса ада АТа Мер СТу РЬе СТу Ьеи Рго АТа АТа 11е СТу АТа АТа УаТ АТа Агд
1536
500
505
510 ссР дар дед дра дра дРР дас асе дас ддр дас дда аде РРР ард ард Рго Азр АТа УаТ УаТ УаТ Азр 1Те Азр СТу Азр СТу Зег РЬе МеС Мер
1584
515
520
525 ааР дРР саа дад сса дсс аса асе сдр дРР даа аас срд ссд дРР аад Азп Уа1 СТп СТи Ьеи АТа ТЬг 11е Агд УаТ С1и Азп Ьеи Рго УаТ Ьуз
1632
530
535
540 аРР РРа СРа сРР аас аас сад сар ссд ддр ард дрд дер сад Рдд дад 1Те Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп СТп НТз Ьеи СТу МеР УаТ УаТ СТп Тгр СТи
1680
545
550
555
560 дар едд РРС Рас аад дед ааР едд дсР сар асе Рас РРа дда аас ссд Азр Агд РЬе Туг Ьуз АТа Азп Агд АТа ΗΪ3 ТЬг Туг Ьеи СТу Азп Рго
1726
565
570
575
Рса ааа дад Рсд даа ара РРс ссР аас ард дрд аад РРР дсР даа дсс Зег Ьуз С1и Зег ОТи 11е РЬе Рго Азп Мер УаТ Ьуз РЬе АТа СТи АТа
1776
580
565
590
РдР дар аРс ссд дсР дсР еда дрд асе саа аад дед дар сРа еда дса Суз Азр 11е Рго АТа АТа Агд УаТ ТЬг СТп Ьуз АТа Азр Ьеи Агд АТа
1824
595
600
605 дсР аРР сад аад ард РРд даР аса ссс ддд ссР Рас РРд РРд дар дрд АТа 11е СТп Ьуз Мер Ьеи Азр ТЬг Рго СТу Рго Туг Ьеи Ьеи Азр УаТ
1872
610
615
620 аРР дРд ссд сар саа даа сас дрд РРд ссс ард аРс ссд дсР ддс дда Не Уа1 Рго Н1з СТп С1и Ηίδ УаТ Ьеи Рго Мер Не Рго АТа СТу СТу
1920
625
630
635
640 ддр РРс Рсд даР дрд аРс асе дад ддр даР ддс ада асд ааа РаР
1965
- 52 020462 <31у РЬе Зег Азр ’7а1 Не ТЬг С1и С1у Азр С1у Агд ТЬг Ьуз Туг 645 650 655
Гда 1568 <210> 12 <211> 655 <212> РЕТ <213> НеНаЫЬиз аппиз <400> 12
МеГ 1 А1а А1а РГО Рго 5 Азп Рго Зег Не Зег 10 РЬе Ьуз рго Рго Зег 15 Рго
А1а А1а А1а Ьеи Рго Рго Агд Зег А1а РЬе Ьеи Рго Агд РЬе А1а Ьеи
20 25 30
Рго Не ТЫ Зег ТЬг ТЬг С1п Ьуз Агд Нгз Агд Ьеи Ηί3 11е Зег Азп
35 40 45
Уа1 Ьеи Зег Азр зег Ьуз зег ТЫ ТЬг ТЬг ТЫ ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг С1п
50 55 60
Агд Рго Ьеи Рго νβΐ С1п Рго РЬе Уа1 Зег Агд Туг А1а Рго Азр 61п
65 70 75 80
Рго Агд Ьуз О1у А1а Азр Уа1 Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи С1и Агд С1и С1у
85 90 95
Уа1 ТЬг Азр Уа1 РЬе А1а Туг Рго С1у 01у А1а Зег МеГ О1и Не ΗΪ3
100 105 110
С1п А1а Ьеи ТЬг Агд Зег Зег ТЫ Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд ΗΪ3
115 120 125
С1и αϊπ еху С1у Уа1 РЬе А1а А1а <31и С1у Туг А1а Агд А1а Зег С1у
130 135 140
Ьеи Рго <31у \Га1 Суз Не А1а ТЬг зег С1у Рго С1у А1а ТЬг Азп Ьеи
14 5 150 155 160
Уа1 Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 Рго МеГ Уа1 А1а
165 170 175
Не ТЬг О1у Θΐη Уа1 Рго Агд Агд МеГ Не С1у ТЬг Азр А1а РЬе Θΐη
180 185 190
С1и ТЬг Рго Не Уа1 С1и Уа1 ТЫ Агд Зег Не ТЬг Ьуз НгЗ Азп Туг
195 200 205
ьеи ца1 Ьеи Азр Уа1 С1и Азр 11е Рго Агд Не Уа1 Агд С1и А1а РЬе
210 215 220
туг Ьеи А1а Зег зег <31у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Не Азр Уа1 Рго
225 230 235 240
Ьуз Азр Не С1п σΐη <31п Ьеи Уа1 Уа1 Рго Ьуз Тгр Азр <31и Рго МеГ
245 250 255
Агд Ьеи Рго С1у Туг Ьеи Зег Агд МеГ Рго Ьуз Рго О1п Туг Азр 01у
260 265 270
Н1В Ьеи С1и αΐη 11е Уа1 Агд Ьеи Уа1 <31у <31и А1а Ьуз Агд Рго Уа1
275 280 285
Ьеи Туг Уа1 01у <31у О1у Суз Ьеи Абп Зег Азр Азр О1и Ьеи Агд Агд
290 295 300
РЬе Уа1 <31и Ьеи ТЬг С1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи Мег С1у Ьеи
305 310 315 320
С1у А1а Туг Рго А1а Зег Зег Азр Ьеи Зег Ьеи Н1з Мег Ьеи С1у мег
325 330 335
ΗΪΞ О1у ТЬг Уа1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1 Азр Ьуз Зег Азр Ьеи Ьеи
340 345 350
Ьеи А1а РЬе С1у Уа1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг 61у Ьуз Ьеи С1и
355 360 365
А1а РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз Не Уа1 ΗΪ3 Не Азр Не Азр Рго А1а
370 375 380
<31и Не 01у Ьуз Азп Ьуз С1п Рго Нгз Уа1 Зег Не Суз <31у Азр Не
385 390 395 400
Ьуз Уа1 А1а Ьеи <31 п 405 С1у Ьеи Азп Ьуз Пе ьеи С1и <31и ьуз Азп Зег
410 415
Уа1 ТЬг Азп Ьеи Азр РЬе Зег ТЬг Тгр Агд ЬуЗ С1и Ьеи Азр □1и С1п
420 425 430
Ьуз Мер Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у 01и А1а Пе Рго
435 440 445
Рго С1п Туг А1а Не 61п Уа1 Ьеи Азр О1и Ьеи ТЬг <31у С1у Азп А1а
450 455 460
Пе Не Зег ТЬг С1у Уа1 С1у С1п Ηί3 С1п мер Тгр А1а А1а С1п РЬе
465 470 475 480
Туг Ьуз Туг АЗП Ьуз Рго Агд О1п Тгр Ьеи ТЬг Зег <31у <31у Ьеи С1у
485 490 495
А1а Мер О1у РЬе С1у Ьеи Рго А1а А1а Пе С1у А1а А1а Уа1 А1а Агд
500 505 510
Рго Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 Αερ Не Αερ <31у Азр <31у Зег РЬе Мер Мер
515 520 525
Азп Уа1 αΐη <31и Ьеи А1а ТЬг Не Агд Уа1 <31и Азп Ьеи Рго Уа1 Ьуз
530 535 540
Не ьеи Ьеи ьеи Азп Азп С1п Ηί3 Ьеи С1у мер Уа1 Уа1 С1п Тгр О1и
545 550 555 560
Азр Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а Ηί3 ТЬг Туг Ьеи О1у Азп Рго
565 570 575
Зег Ьуз <31и Зег <31и Не РЬе Рго Αεη Мер Уа1 Ьуз РЬе А1а С1и А1а
580 585 590
Суз Азр Не Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг <31п Ьуз А1а Αερ Ьеи Агд А1а
595 600 605
А1а Не <31п Ьуз Мер Ьеи Азр ТЬг Рго 31у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1
610 615 620
Не Уа1 Рго ΗΪ3 С1п <31и Ηίε Уа1 Ьеи Рго Мер Пе Рго А1а С1у С1у
625 630 635 640
С1у РЬе Зег Азр Уа1 Не ТЬг С1и С1у Азр 61у Агд ТЬг Ьуз Туг
645 650 655
<210> 13 <211> 2013 <212> ДНК <213> АгаЬШорзгз РЬаНапа <220>
<221> СЬЗ <222> (1).. <400> 13 .(2013)
аРд дед дед дса аса аса аса аса аса аса РсР РсР Рсд аРс Рсс РРс 48
Мер 1 А1а А1а А1а ТЬг 5 ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг ТЬг 10 Зег Зег Зег Пе Бег 15 РЬе
Рсс асе ааа сса РСР ССР Рсс Рсс Рсс ааа Рса сса РРа сса аРс Рсс 96
Зег ТЬг Ьуз Рго 20 Зег Рго Зег Зег Зег 25 Ьуз Зег Рго Ьеи Рго 30 Пе Зег
ада РРс Рсс сРс сса РРс Рсс сРа аас ссс аас ааа Рса Рсс Рсс Рсс 144
Агд РЬе Зег 35 Ьеи Рго РЬе Зег Ьеи 40 Азп Рго Азп Ьуз Зег 45 Зег Бег Зег
Рсс сдс сдс сдс ддр аРс ааа Рсс аде ссс Рсс Рсс аРс Рсс дсс 192
Зег Агд 50 Агд Агд С1у Пе Ьуз 55 Зег Зег 5ег Рго Зег 60 Зег 11е Зег А1а
дрд сРс аас аса асе асе ааР дРс аса асе асР ссс РсР сса асе ааа
240
Уа1 Ьеи Азп ТНг ТНг ТНг Азп 7э1 ТНг ТНг ТНг Рго Зег Рго ТНг Ьуз 65 70 75 80 ссЕ асе ааа ссс даа аса ЕЕс аЕс Есс еда ЕЕс дсЕ сса даЕ саа ссс
Рго ТНг Ьуз Рго С1и ТНг РНе Пе Зег Агд РНе А1а Рго Азр СХп Рго
90 95 сдс ааа ддс дсЕ даЕ аЕс сЕс дЕс даа дсЕ ЕЕа даа сдЕ саа ддс дЕа
Агд Ьуз СХу А1а Азр Не Ьеи Уа1 С1и АХа Ьеи С1и Агд С1п С1у Уа1
100 105 110 даа асе дЕа ЕЕс дсЕ Еас ссЕ дда ддЕ дса Еса аЕд дад аЕЕ сас саа
С1и ТНг Уа1 РНе А1а Туг Рго С1у С1у А1а Зег МеЕ С1и 11е Шз С1п
115 120 125 дсс ЕЕа асе сдс ЕсЕ Есс Еса аЕс сдЕ аас дЕс сЕЕ ссЕ сдЕ сас даа
А1а Ьеи ТНг Агд Зег Зег Зег Пе Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Нгз О1и
130 135 140 саа дда ддЕ дЕа ЕЕс дса дса даа дда Сас дсЕ еда Есс Еса ддЕ ааа <31п О1у О1у 7а1 РНе АХа А1а <31и С1у Туг А1а Агд Зег Зег <31у Ьуз
145 150 155 160 сса ддЕ аЕс ЕдЕ аЬа дсс асЕ Еса ддЕ ссс дда дсЕ аса ааЕ сЕс дЕЕ
Рго С1у Пе Суз Не А1а ТНг Зег С1у Рго СХу А1а ТНг Азп Ьеи Уа1
165 170 175 аде дда ЕЕа дсс даЕ дед ЕЕд ЕЕа даЕ адЕ дЕЕ ссЕ сЕЕ дЕа дса аЕс
Зег С1у Ьеи А1а Азр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег 7а1 Рго Ьеи 7а1 А1а Не
180 185 190 аса дда саа дЕс ссЕ сдЕ сдЕ аЕд аЕЕ ддЕ аса даЕ дед ЕЕЕ саа дад
ТНг С1у С1п УаХ Рго Агд Агд МеЕ Не С1у ТНг Азр А1а РНе С1п С1и
195 200 205 асЕ сед аЕЕ дЕЕ дад дЕа асд сдЕ Есд аЕЕ асд аад саЕ аас сас сЕЕ
ТНг Рго Не Уа! С1и Уа1 ТНг Агд Зег 11е ТЬг Ьуз Ηίβ Азп Туг Ьеи
210 215 220 дЕд аЕд даЕ дЕЕ даа даЕ аЕс ссЕ адд аЕЕ аЕЕ дад·даа дсЕ ЕЕс ЕЕЕ
Уа1 МеЕ Азр Уа1 С1и Азр Не Рго Агд Не Не С1и С1и А1а РНе РНе
225 230 235 240
ЕЕа дсЕ асЕ ЕсЕ ддЕ ада ссЕ дда ссЕ дЕЕ ЕЕд дЕЕ даЕ дЕЕ ссЕ ааа
Ьеи А1а ТНг Зег С1у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Азр Уа1 Рго Ьуз
245 250 255 даЕ аЕЕ саа саа сад сЕЕ дед аЕЕ ссЕ ааЕ Едд даа сад дсЕ аЕд ада
Авр 11е С1п С1п СХп Ьеи А1а Не Рго Азп Тгр <31и С1п А1а МеЕ Агд
260 265 270
ЕЕа ссЕ ддЕ ЕаЕ аЕд ЕсЕ адд аЕд ссЕ ааа ссЕ ссд даа даЕ ЕсЕ саЕ
Ьеи Рго С1у Туг МеЕ Зег Агд МеЕ Рго ьуз Рго рго С1и Азр Зег нХз
275 280 285
ЕЕд дад сад аЕЕ дЕЕ адд ЕЕд аЕЕ ЕсЕ дад ЕсЕ аад аад ссЕ дЕд ЕЕд
Ьеи С1и СХп Пе т/аХ Агд Ьеи Пе Зег С1и Зег Ьуз Ьуз Рго Уа1 Ьеи
290 295 300
238
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912
ЕаЕ дЕЕ ддЕ ддЕ ддЕ ЕдЕ ЕЕд ааЕ ЕсЕ аде даЕ даа ЕЕд ддЕ адд ЕЕЕ Туг Е'а! СХу СХу СХу Суз Ьеи Азп Бег Бег Азр С1и Ьеи С1у Агд РНе
960
- 55 020462
305 310 дее дад сее асд ддд аес ссе дее дед
Уа1 <31 и Ьеи ТЬг б1у Не Рго Уа1 А1а
325
Ъсе еае ссЬ еде дае дае дад еед еед
Зег Туг Рго Суз Азр Азр С1и Ьеи Зег
340 345 ддд асд дед еас дед аае Сас дек дед <51у ТЬг 7а1 Туг А1а Азп Туг А1а Уа1
355 360 дед ССС ддд дСд адд есе дае дае еде
А1а РЬе С1у Уа1 Агд РЬе Азр Аер Агд
370 375
ССС дсЬ адС адд дсС аад аСС дее сае
РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз 11е Уа1 Н1з
385 390 аСС ддд аад аае аад асе ссе сае дед
Не О1у Ьуз Азп Ьуз ТЬг Рго Н1з Уа1
405 сед дсе сед саа ддд аед аае аад дСС
Ьеи А1а Ьеи С1п <31у Мее Азп Ьуе Уа1
420 425 сее аад сее дае еее дда дее едд адд
Ьеи Ьуз Ьеи Азр РЬе С1у Уа1 Тгр Агд
435 440 сад аад еее ссд ССд аде еее аад асд <31п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг
450 455 сад еаС дед асе аад дСс сее дае дад
Θΐη Туг А1а 11е Ьуз Уа1 Ьеи Азр С1и
465 470 аСа адС асе дде дес ддд саа сае саа
Не Зег ТЬг О1у Уа1 <31у О1п Нхз С1п
485 аае еас аад аад сса адд сад едд сеа
Азп Туг Ьуз Ьуз Рго Агд О1п Тгр Ьеи
500 505 аСд дде еее дда сее ссС дсе дсс аСС
Мее Пу РЬе Пу Ьеи Рго А1а А1а 11е
515 520 даС дса аса дее дед дае асе дас дда
Азр А1а 11е Уа1 Уа1 Азр 11е Азр С1у
530 535 дСд саа дад сед дсс аса аес еде деа
Уа1 О1п Ии Ьеи А1а ТЬг 11е Агд Уа1
545 550
315 320
адь асд еед аед ддд срд дда 1008
Зег 330 ТЬг Ьеи Мее <31у Ьеи 335 Пу
РРа сае аед сее дда аРд сае 1056
Ьеи ΗΪ3 мее Ьеи О1у 350 Мер ΗΪ3
дад сае аде дае ррд ррд еед 1104
С1и Н±з Зег Азр 365 Ьеи Ьеи Ьеи
дрс асд ддр аад сРР дад дсе 1152
Уа1 ТЬг <31у 380 Ьуз Ьеи <31и А1а
аРР дае аее дас РсР дсР дад 1200
11е Азр 395 Не Азр Зег А1а Пи 400
РсР дрд еде ддр даР др= аад 1248
Зег 410 Уа1 Суз С1у Азр Уа1 415 Ьуз
сРР дад аас ода дсР дад дад 1296
Ьеи С1и Азп Агд А1а 430 С1и Ни
ааР дад еед аас дра сад ааа 1344
Азп С1и Ьеи Азп 445 Уа1 <31п Ьуз
РРР ддд даа дсР аРР ссР сса 1392
РЬе О1у Пи 460 А1а Не Рго Рго
ррд асР дае дда ааа дсс аеа 1440
Ьеи ТЬг 475 Азр О1у Ьуз А1а 11е 480
ард рдд дед дед сад РРс еас 1488
МеР 490 Тгр А1а А1а С1п РЬе 4 95 Туг
Рса Рса дда ддс СРР дда дсР 1536
Зег Зег б1у С1у Ьеи 510 С1у А1а
дда дед есе дРР дсР аас ссР 1584
<31у А1а Зег Уа1 525 А1а Азп Рго
даР дда аде РРР аРа ард аае 1632
Азр О1у Зег 540 РЬе 11е МеР Азп
дад саа сее сса дрд аад аСа 1680
С1и С1п 555 Ьеи Рго Уа1 Ьуз Не 560
- 56 020462 сСс ССа сса аас аас сад сас сСС ддс аСд дСС аСд саа Сдд даа даС Ьеи Ьеи Ьеи Азп Абп С1п ΗΪ3 Ьеи С1у МеС \7а1 МеС 01п Тгр С1и Азр
565 570 575
1728
едд ССс Сас аад дсС аас еда дсС сас аса ССС сСс ддд даС ссд дсс 1776
Агд РНе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а ΗΪ3 ТНг РЬе Ьеи С1у Азр Рго А1а
580 585 590
сад дад дас дад аСа ССс ссд аас аСд ССд ссд ССС дса дса дсС Сдс 1324
С1п С1и Азр <31и Не РНе Рго Азп МеС Ьеи Ьеи РЬе А1а А1а А1а Суз
595 600 605
1872 ддд аСС сса дед дед адд дСд аса аад ааа дса даС сСс еда даа дсС С1у 11е Рго А1а А1а Агд Уа1 ТНг Ьуз Ьуз А1а Авр Ьеи Агд <31и А1а
610 615 620 аСС сад аса аСд сСд даС аса сса дда ссС Сас сСд ССд даС дСд аСС Не С1п ТНг МеС Ьеи Аер ТНг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Уа1 11е 625 630 635 640
СдС ссд сас саа даа саС дед ЬЪд ссд аСд аСс ссд адС ддЬ ддс асъ 1968
Суз Рго ΗΪ3 (31п С1и Н±3 νβΐ Ьеи Рго Мес 11е Рго Зег С1у <31у ТЬг
645 650 655
ССс аас даС дЬс аСа асд даа дда даС ддс едд аСС ааа Сас Сда 2013
РНе Азп Азр Уа1 Не ТЬг С1и С1у Азр <51у Агд 11е Ьуз Туг *
660 665 670
<210> 14 <211> 670 <212> РКТ <213> АгаЫйорзгз СНаПапа <400> 14
МеС А1а А1а А1а ТЬг ТЬг ТНг ТЬг ТЬг ТНг Зег Зег Зег Не Зег РЬе
1 5 10 15
Зег ТЬг Ьуз Рго Зег Рго 5ег Зег Зег ьуз Зег Рго Ьеи Рго Не Зег
20 25 30
Агд РЬе Зег Ьеи Рго РЬе Зег ьеи Азп Рго Азп Ьуз Зег Зег Зег Зег
35 40 45
Зег Агд Агд Агд <31у Не Ьуз Зег Зег Зег Рго Зег Зег Не Зег А1а
50 55 60
Уа1 Ьеи Αεη ТНг ТЬг ТЬг Азп Уа1 ТЫ ТНг ТНг Рго Зег Рго ТЬг Ьуэ
65 70 75 80
Рго ТЬг Ьуз Рго С1и ТЬг РНе Не Зег Агд РНе А1а Рго Азр С1п Рго
85 90 95
Агд Ьуз <31у А1а Азр Не Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи О1и Агд О1п О1у Уа1
100 105 110
С1и ТЫ Уа1 РНе А1а Туг Рго О1у О1у А1а Зег МеС С1и 11е Ηίε <31п
115 120 125
А1а Ьеи ТЬг Агд Зег Зег Зег Не Агд Азп Уа1 Ьеи Рго Агд Ηίε С1и
130 135 140
О1п С1у С1у 7а1 РЬе А1а А1а <31и С1у Туг А1а Агд Зег Зег С1у Ьуз
145 150 155 160
Рго С1у Не Суз Не А1а ТНг Зег <31у Рго С1у А1а ТЫ Азп Ьеи Уа1
165 170 175
5ег С1у Ьеи А1а Авр А1а Ьеи Ьеи Азр Зег Уа1 Рго Ьеи Уа1 А1а Не
180 185 190
- 57 020462
ТЬг С1у <31п Уа1 Рго Агд Агд Мее 200 Не С1у ТЬг Азр А1а 205 РЬе Θΐη С1и
195
ТЬг Рго Не νβΐ С1и Уа1 ТЬг Агд Зег Не ТЬг Ьуз Ηίβ Азп Туг Ьеи
210 215 220
Ча1 мее Азр Уа1 61и Азр Не Рго Агд 11е 11е С1и О1и А1а РЬе РЬе
225 230 235 240
Ьеи А1а ТЬг Зег О1у Агд Рго С1у Рго Уа1 Ьеи Уа1 Азр Уа1 Рго Ьуз
245 250 255
Аэр Не С1п С1п <31п Ьеи А1а Не Рго Азп Тгр С1и С1п А1а Мее Агд
260 265 270
Ьеи Рго С1у Туг Мее Зег Агд мее Рго Ьуз Рго Рго <31и Азр Зег Ηίβ
275 280 285
Ьеи С1и σΐη Не Уа1 Агд Ьеи Не Зег <31и Зег Ьуз Ьуз Рго Уа1 Ьеи
290 2 95 300
Туг Уа1 С1у С1у <31у Суз Ьеи Азп Зег Зег Азр <31и Ьеи С1у Агд РЬе
305 310 315 320
Уа1 □1и Ьеи ТЬг С1у Не Рго Уа1 А1а Зег ТЬг Ьеи мее С1у Ьеи С1у
325 330 335
Зег Туг Рго Суз Азр Азр С1и Ьеи Зег Ьеи Ηί3 Мее Ьеи С1у Мес ΗΪ3
340 345 350
<31у ТЬг 57а 1 Туг А1а Азп Туг А1а 17а 1 С1и ΗΪ3 Зег Азр Ьеи Ьеи Ьеи
355 360 365
А1а РЬе С1у 17а 1 Агд РЬе Азр Азр Агд Уа1 ТЬг 61у Ьуз Ьеи 61и А1а
370 375 380
РЬе А1а Зег Агд А1а Ьуз Не νβΐ Н13 Не Азр Не Азр Зег А1а С1и
385 390 395 400
Х1е С1у Ьуз Азп Ьуз ТЬг Рго ΗΪ8 Уа1 Зег 17а 1 Суз 61у Азр Уа1 Ьуз
405 410 415
Ьеи А1а Ьеи С1п С1у Мее Азп Ьуз Уа1 ьеи С1и Азп Агд А1а С1и С1и
420 425 430
Ьеи Ьуз Ьеи Авр РЬе <31у Уа1 Тгр Агд Азп С1и Ьеи Азп Уа1 С1п Ьуз
435 440 445
<31п Ьуз РЬе Рго Ьеи Зег РЬе Ьуз ТЬг РЬе С1у <31и А1а Не Рго Рго
450 455 460
С1п Туг А1а Не Ьуз Уа1 Ьеи Азр 61и Ьеи ТЬг Азр 61у Ьуз А1а Не
465 470 475 480
Не Зег ТЬг □1у Уа1 □1у <31п Ηί3 <31п Мее Тгр А1а А1а <31п РЬе Туг
485 490 495
Азп Туг Ьуз Ьуз Рго Агд αΐη Тгр Ьеи Зег Зег С1у С1у Ьеи <31у А1а
500 505 510
мее <31у РЬе <31у Ьеи Рго А1а А1а Не С1у А1а Зег Уа1 А1а Азп Рго
515 520 525
Аэр А1а Не Уа1 17а 1 Азр Не Авр С1у Азр С1у Зег РЬе Не Мее Азп
530 535 540
Уа1 О1п О1и Ьеи А1а ТЬг Не Агд 17а 1 С1и О1п Ьеи Рго 17а1 Ьуз Не
545 550 555 560
Ьеи Ьеи Ьеи Азп Азп Θΐη Н1з Ьеи О1у Мее Уа1 Мес б1п Тгр С1и Азр
565 570 575
Агд РЬе Туг Ьуз А1а Азп Агд А1а Н13 ТЬг РЬе Ьеи О1у Азр Рго А1а
580 585 590
С1п С1и Азр С1и Не РЬе Рго Азп нее Ьеи Ьеи РЬе А1а А1а А1а Суз
595 600 605
С1у Не Рго А1а А1а Агд Уа1 ТЬг Ьуз Ьуз А1а Азр Ьеи Агд С1и А1а
610 615 620
Не О1п ТЬг Мее Ьеи Азр ТЬг Рго С1у Рго Туг Ьеи Ьеи Азр Ца1 Не
625 630 635 640
Суз Рго Нее С1п 61и Ηίβ ча1 ьеи Рго мее 11е Рго Зег С1у С1у ТЬг
645 650 655
РЬе Азп Авр Уа1 Не ТЬг <31и О1у Азр <31у Агд Не Ьуз Туг
660 665 670
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (52)

1. Растение подсолнечника, содержащее обработанный мутагеном рекомбинантный или синтетический полинуклеотид большой субъединицы ацетогидроксикислотной синтазы (ЛНЛ§Е) подсолнечника или потомство этого растения подсолнечника, где указанный ЛНЛ§Ь полинуклеотид подсолнечника кодирует ЛНЛ§Ь полипептид подсолнечника, имеющий аминокислотную последовательность §Е0 ГО №: 2, в которой по сравнению с последовательностью дикого типа аланин в положении 7 замещен треонином, причем указанный ЛНЛ§Ь полипептид подсолнечника обеспечивает ферменту ЛНЛ§ устойчивость к гербициду на основе имидазолинона, поэтому указанное растение или его потомство имеет повышенную толерантность к гербициду на основе имидазолинона, по сравнению с растением подсолнечника дикого типа.
2. Растение подсолнечника по п.1, где указанное растение дополнительно толерантно по меньшей мере к одному гербициду, выбранному из группы, которая состоит из гербицидов на основе сульфонил- 58 020462 мочевины, гербицидов на основе триазолопиримидина, гербицидов на основе пиримидинилоксибензоата и гербицидов на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона.
3. Растение подсолнечника по п.1 или 2, где указанный АНА§Ь полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, представленную в §ЕЦ ГО №: 1.
4. Растение подсолнечника по любому из пп.1-3, где указанное растение является трансгенным.
5. Растение подсолнечника по любому из пп.1-3, где указанное растение является нетрансгенным.
6. Семена растения подсолнечника по любому из пп.1-5, где указанные семена содержат указанный АНА§Ь полинуклеотид.
7. Растение подсолнечника по любому из пп.1-5, где указанное растение:
(а) является несортовым потомством линии ОМ40 или ОМ1606, причем репрезентативный образец семян указанной линии задепонирован под номером АТСС РТА-6716 или РТА-7606;
(б) является мутантным, рекомбинантным или созданным методами генной инженерии несортовым производным линии ОМ40 или ОМ1606, (в) является растением, которое является потомством какого-либо одного из растений (а), (б).
8. Растение по п.7, где указанное растение подсолнечника является несортовым потомством линии ОМ40 или ОМ1606, поскольку оно является гибридным растением.
9. Выделенная, обработанная мутагеном рекомбинантная или синтетическая молекула АНА§Ь полинуклеотида подсолнечника, кодирующая АНА§Ь полинуклеотид, имеющий аминокислотную последовательность §ЕЦ ГО №: 2, в которой аланин в положении 7 последовательности дикого типа замещен треонином, что обеспечивает ферменту АНА8 устойчивость к гербициду на основе имидазолинона, или последовательность, комплементарную указанному полинуклеотиду.
10. Кассета экспрессии, содержащая промотор, функционально связанный с молекулой полинуклеотида по п.9.
11. Кассета экспрессии по п.10, где указанный промотор способен запускать экспрессию генов в бактерии, грибковой клетке, животной клетке или растительной клетке.
12. Нечеловеческая клетка-хозяин, трансформированная кассетой экспрессии по п.10 или 11.
13. Клетка-хозяин по п.12, где указанную клетку-хозяина выбирают из группы, которая состоит из бактерии, грибковой клетки, животной клетки или растительной клетки.
14. Вектор, содержащий промотор, функционально связанный с молекулой полинуклеотида по п.9, причем указанный промотор запускает экспрессию в клетке-хозяине.
15. Вектор по п.14, где указанный промотор активируется в растительной клетке.
16. Вектор по п.14 или 15, где указанный промотор является конститутивным промотором.
17. Вектор по любому из пп.14-16, где указанный полинуклеотид дополнительно содержит функционально связанную последовательность, кодирующую пептид, направленный на хлоропласт.
18. Вектор по п.16, где указанный промотор может экспрессироваться в бактерии или дрожжах.
19. Нечеловеческая клетка-хозяин, содержащая вектор по любому из пп.14-18.
20. Трансформированное растение, содержащее стабильно включенную в его геном полинуклеотидную конструкцию, содержащую молекулу полинуклеотида по п.9, функционально связанную с промотором, который способен инициировать экспрессию в растительной клетке, где устойчивость указанного трансформированного растения к гербициду на основе имидазолинона повышена по сравнению с нетрансформированным растением.
21. Трансформированное растение по п.20, где указанный промотор выбирают из группы, состоящей из конститутивных промоторов и специфичных для тканей промоторов.
22. Трансформированное растение по п.20 или 21, где указанная полинуклеотидная конструкция дополнительно содержит функционально связанную последовательность, кодирующую пептид, направленный на хлоропласт.
23. Трансформированное растение по п.20, где указанный гербицид на основе имидазолинона включает
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту,
5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту, смесь метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата или смесь любых вышеуказанных соединений.
24. Трансформированное растение по п.20, где указанное растение дополнительно устойчиво к гербициду на основе сульфонилмочевины, включающему по крайней мере одно соединение из хлорсульфурона, метсульфуронметила, сульфометуронметила, хлоримуронэтила, тифенилсульфуронметила, трибенуронметила, бенсульфуронметила, никосульфурона, этаметсульфуронметила, римсульфурона, трифлусульфуронметила, триасульфурона, примисульфуронметила, циносульфурона, амидосульфурона, флузасульфурона, имазосульфурона, пиразосульфуронэтила, галосульфурона или смесь любых вышеуказан- 59 020462 ных соединений.
25. Трансформированное растение по любому из пп.20-24, где указанное трансформированное растение является двудольным или однодольным.
26. Трансформированное растение по п.25, где указанное растение выбирают из группы, состоящей из подсолнечника, сои, хлопка, Вгакмса крр., АтаЫбормк (Найапа, табака, картофеля, сахарной свеклы, люцерны, сафлоры, арахиса, пшеницы, риса, кукурузы, ячменя, ржи, овса, тритикале, проса и сорго.
27. Трансформированное растение по п.26, где указанное однодольное растение выбирают из группы, состоящей из пшеницы, риса, кукурузы, ячменя, ржи, овса, тритикале, проса и сорго.
28. Семена трансформированного растения по любому из пп.20-27, где указанные семена содержат указанную полинуклеотидную конструкцию.
29. Клетка трансформированного растения, содержащая стабильно включенную в ее геном полинуклеотидную конструкцию, содержащую молекулу полинуклеотида по п.9, функционально связанную с промотором, который запускает экспрессию в растительной клетке.
30. Способ получения растения, которое обладает повышенной толерантностью к гербициду на основе имидазолинона, где способ включает:
(a) трансформацию растительной клетки при помощи полинуклеотидной конструкции, содержащей молекулу полинуклеотида по п.9, функционально связанную с промотором, который инициирует экспрессию указанной молекулы в растительной клетке, и (b) регенерацию растения из указанной клетки трансформированного растения, где толерантность регенерированного растения к гербициду на основе имидазолинона повышена в сравнении с нетрансформированным растением.
31. Способ по п.30, где указанный промотор выбирают из группы, состоящей из конститутивных промоторов и специфичных для тканей промоторов.
32. Способ по п.30 или 31, где указанная полинуклеотидная конструкция дополнительно содержит функционально связанную направленную на хлоропласт последовательность.
33. Способ по п.30, где указанный гербицид на основе имидазолинона включает
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту,
5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту, смесь метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата или смесь любых вышеуказанных соединений.
34. Способ по любому из пп.30-33, где указанное трансформированное растение дополнительно толерантно к гербициду на основе сульфонилмочевины, включающему по крайней мере одно соединение из хлорсульфурона, метсульфуронметила, сульфометуронметила, хлоримуронэтила, тифенилсульфуронметила, трибенуронметила, бенсульфуронметила, никосульфурона, этаметсульфуронметила, римсульфурона, трифлусульфуронметила, триасульфурона, примисульфуронметила, циносульфурона, амидосульфурона, флузасульфурона, имазосульфурона, пиразосульфуронэтила, галосульфурона или смесь любых вышеуказанных соединений.
35. Способ по любому из пп.30-34, где указанное трансформированное растение является двудольным или однодольным.
36. Способ по п.35, где указанное растение выбирают из группы, состоящей из подсолнечника, сои, хлопка, Вгакмса крр., АтаЫбормк (НаПапа, табака, картофеля, сахарной свеклы, люцерны, сафлоры, арахиса, пшеницы, риса, кукурузы, ячменя, ржи, овса, тритикале, проса и сорго.
37. Способ по п.36, где указанное однодольное растение выбирают из группы, состоящей из пшеницы, риса, кукурузы, ячменя, ржи, овса, тритикале, проса и сорго.
38. Способ по любому из пп.30-37, где указанная растительная клетка обладает гербицидной толерантностью по меньшей мере к одному гербициду, ингибирующему АНА8, перед указанной стадией трансформации.
39. Способ отбора клетки трансформированного растения по п.29, причем этот способ включает стадии:
(a) воздействия на указанную клетку трансформированного растения гербицидом на основе имидазолинона с концентрацией, которая ингибирует рост клетки нетрансформированного растения, и (b) идентификации указанной клетки трансформированного растения по ее способности расти в присутствии указанного гербицида на основе имидазолинона, причем толерантность указанной клетки трансформированного растения к гербициду на основе имидазолинона повышена в сравнении с клеткой нетрансформированного растения.
40. Способ борьбы с сорной растительностью в непосредственной близости к растению по любому из пп.1-8 и 20-27, который включает нанесение композиции, включающей эффективное количество одного или более гербицидов на основе имидазолинона, гербицида на основе сульфонилмочевины, герби- 60 020462 цида на основе триазолопиримидина, или их смеси на сорную растительность и указанное растение.
41. Способ по п.40, где указанный гербицид на основе имидазолинона включает
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидиазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-3-хинолинкарбоновую кислоту,
5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-(метоксиметил)никотиновую кислоту,
2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-5-метилникотиновую кислоту, смесь метил 6-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-м-толуата и метил 2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2-имидазолин-2-ил)-п-толуата или смесь любых вышеуказанных соединений.
42. Способ по п.40, где указанный гербицид на основе сульфонилмочевины включает по крайней мере одно соединение из хлорсульфурона, метсульфуронметила, сульфометуронметила, хлоримуронэтила, тифенилсульфуронметила, трибенуронметила, бенсульфуронметила, никосульфурона, этаметсульфуронметила, римсульфурона, трифлусульфуронметила, триасульфурона, примисульфуронметила, циносульфурона, амидосульфурона, флузасульфурона, имазосульфурона, пиразосульфуронэтила, галосульфурона или смесь любых вышеуказанных соединений.
43. Изолированный АНА§Ь полипептид подсолнечника, содержащий:
(а) аминокислотную последовательность, представленную в §Е0 ГО №: 2, в которой по сравнению с последовательностью дикого типа аланин в положении 7 замещен треонином; или (б) аминокислотную последовательность, которая кодируется нуклеотидной последовательностью по п.9, причем указанный полипептид определяет повышенную толерантность растения к гербициду на основе имидазолинона по сравнению с растением дикого типа.
44. Способ получения растения, которое обладает повышенной толерантностью к гербициду на основе имидазолинона, где способ включает скрещивание первого растения с другим растением, где первое растение является растением по любому из пп.1-8 и 20-27.
45. Способ по п.44, который дополнительно включает выбор потомственного растения, которое обладает повышенной толерантностью к гербициду на основе имидазолинона.
46. Растение, которое обладает повышенной толерантностью к гербициду на основе имидазолинона, полученное способом по п.44 или 45.
47. Семена растения по п.46, где указанные семена обладают такой же толерантностью к гербициду на основе имидазолинона, как и первое растение.
48. Семена растения по любому из пп.1-8, 20-27 и 46, где указанные семена обработаны при помощи АНА§-ингибирующего гербицида.
49. Семена по п.48, где указанный АНА§-ингибирующий гербицид является гербицидом на основе имидазолинона, гербицидом на основе сульфонилмочевины, гербицидом на основе триазолопиримидина или их смесью.
50. Способ борьбы с нежелательной растительностью, который включает приведение в контакт семян растения по любому из пп.1-8, 20-27 и 46 перед посевом и/или после предварительного проращивания, с АНА§-ингибирующим гербицидом.
51. Способ по п.50, где указанный АНА§-ингибирующий гербицид является гербицидом на основе имидазолинона, гербицидом на основе сульфонилмочевины, гербицидом на основе триазолопиримидина или их смесью.
52. Способ по п.50, где указанный АНА§-ингибирующий гербицид является гербицидом на основе имидазолинона.
EA200800174A 2005-07-01 2006-06-29 Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов EA020462B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69595205P 2005-07-01 2005-07-01
PCT/US2006/025534 WO2007005581A2 (en) 2005-07-01 2006-06-29 Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide=resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200800174A1 EA200800174A1 (ru) 2008-08-29
EA020462B1 true EA020462B1 (ru) 2014-11-28

Family

ID=37605027

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800174A EA020462B1 (ru) 2005-07-01 2006-06-29 Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
EA201301103A EA201301103A1 (ru) 2005-07-01 2006-06-29 Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201301103A EA201301103A1 (ru) 2005-07-01 2006-06-29 Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов

Country Status (21)

Country Link
US (4) US20110209232A1 (ru)
EP (3) EP2400022B1 (ru)
JP (2) JP5265356B2 (ru)
CN (2) CN101287836B (ru)
AR (2) AR058429A1 (ru)
AT (1) ATE541939T1 (ru)
AU (1) AU2006265984C9 (ru)
BR (1) BRPI0612384B1 (ru)
CA (2) CA3006126C (ru)
EA (2) EA020462B1 (ru)
ES (2) ES2581478T3 (ru)
HR (1) HRP20120294T2 (ru)
HU (2) HUE035307T2 (ru)
PL (1) PL1902136T3 (ru)
PT (1) PT1902136E (ru)
RS (1) RS54931B1 (ru)
SI (1) SI1902136T1 (ru)
TR (2) TR200907590T2 (ru)
UA (1) UA99091C2 (ru)
WO (1) WO2007005581A2 (ru)
ZA (1) ZA200800947B (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2692594T1 (es) * 2005-03-02 2018-12-04 Instituto Nacional De Tecnologia Agropecuaria Plantas de arroz resistentes a herbicidas, polinucleótidos que codifican proteínas de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa resistentes a herbicidas y métodos para su uso
EA020462B1 (ru) * 2005-07-01 2014-11-28 Басф Се Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
PT2511373T (pt) 2006-12-07 2017-10-03 Univ Kansas State Sorgo resistente aos herbicidas de sintase de acetolactato
UA108733C2 (uk) 2006-12-12 2015-06-10 Толерантна до гербіциду рослина соняшника
SI2134839T1 (en) * 2007-04-04 2018-05-31 Basf Agrochemical Products, B.V. HERBICID-RESISTANT SOLUBLE SOLIDS WITH MULTIPLY HERBICID RESISTANCE OF AHSL1 ALELES AND METHODS OF APPLICATION
US10017827B2 (en) 2007-04-04 2018-07-10 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of AHASL1 and methods of use
EP2574233A1 (en) * 2007-04-04 2013-04-03 BASF Plant Science GmbH AHAS mutants
AU2013270631C1 (en) * 2007-04-04 2016-09-29 Basf Plant Science Gmbh AHAS mutants
WO2009031031A2 (en) * 2007-04-04 2009-03-12 Basf Se Herbicide-resistant brassica plants and methods of use
BRPI0818295B1 (pt) * 2007-10-05 2022-10-11 Cibus Europe B.V. Método para produção de planta resistente à herbicida
BRPI0908317B1 (pt) * 2008-05-06 2020-10-20 Agriculture Victoria Services Pty Ltd ácido nucléico isolado, método para maximizar a produção de plantas de cevada e método para o cultivo de cevada
AU2009277239B2 (en) * 2008-07-31 2015-08-06 Nidera Seeds Holding B.V. Herbicide resistant sunflower plants
BRPI0919380A2 (pt) * 2008-09-26 2015-08-18 Basf Agrochemical Products Bv Moléculas de ácido nucleico, vetores de expressão, bom como métodos para controlar ervas daninhas e para produzir uma planta brassica
AU2010335573A1 (en) * 2009-12-22 2012-06-21 Bayer Cropscience Nv Herbicide tolerant plants
PL2547766T3 (pl) * 2010-03-17 2018-08-31 Basf Agrochemical Products B.V. Rośliny tolerancyjne względem herbicydów
PL2627168T3 (pl) * 2010-10-15 2021-11-02 Bayer Intellectual Property Gmbh Mutanty Beta vulgaris tolerujące herbicydy będące inhibitorami ALS
MA34606B1 (fr) † 2010-10-15 2013-10-02 Bayer Ip Gmbh Utilisation d'herbicides inhibiteurs d'als pour la lutte contre une vegetation non souhaitee chez des plantes beta vulgaris tolerentes aux herbicides inhibiteurs d'als
EP2786146A4 (en) * 2011-11-29 2015-08-26 Agrigenetics Inc SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISM ASSAY HIGH-PERFORMANCE
US20140336051A1 (en) 2011-12-05 2014-11-13 Basf Agrochemical Products B.V. Methods of Controlling Undesirable Vegetation with Imidazolinone Herbicides and Adjuvants in Herbicide Resistant Crop Plants
AU2012376012B2 (en) * 2012-04-05 2018-12-06 Advanta Holdings B.V. Sorghum plants having a mutant polynucleotide encoding the large subunit of mutated acetohydroxyacid synthase protein and increased resistance to herbicides
PL2931034T5 (pl) * 2012-12-13 2022-09-12 Bayer Cropscience Ag Zastosowanie herbicydów inhibitorów ALS do kontroli niepożądanej roślinności w roślinach Beta vulgaris z tolerancją herbicydów inhibitorów ALS
US20150148235A1 (en) * 2013-11-22 2015-05-28 Nidera S.A. Herbicide-resistant sunflower plants with multiple herbicide resistant alleles of ahasl1 and methods of use
EA201692565A1 (ru) * 2014-06-12 2017-05-31 Сесвандерхаве Н.В. Способ трансформации протопластов сахарной свеклы на платформе технологии talen
EP3569067A3 (en) * 2014-06-26 2020-01-22 BASF Agrochemical Products B.V. Seed treatment with acetolactate synthase (als) inhibitors
CN105746255B (zh) * 2016-03-22 2019-01-11 北京大北农科技集团股份有限公司 除草剂耐受性蛋白质的用途
JP2017118878A (ja) * 2017-01-16 2017-07-06 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物
JP2019141045A (ja) * 2019-03-04 2019-08-29 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物
KR102147381B1 (ko) * 2019-11-22 2020-08-24 씨제이제일제당 주식회사 아세토하이드록시산 신타제 신규 변이체 및 이를 포함하는 미생물
CN111996204B (zh) * 2020-08-24 2023-04-18 浙江师范大学 烟草GSNOR1a/1b在植物抗逆中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030097692A1 (en) * 2000-12-21 2003-05-22 Georg Jander Plants with imidazolinone-resistant ALS
WO2005020673A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
WO2006024351A1 (en) * 2004-07-30 2006-03-09 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant sunflower plants, plynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use
WO2006060634A2 (en) * 2004-12-01 2006-06-08 Basf Agrochemical Products, B.V. Novel mutation involved in increased tolerance to imidazolinone herbicides in plants

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3060084A (en) 1961-06-09 1962-10-23 Du Pont Improved homogeneous, readily dispersed, pesticidal concentrate
US3299566A (en) 1964-06-01 1967-01-24 Olin Mathieson Water soluble film containing agricultural chemicals
US4144050A (en) 1969-02-05 1979-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Micro granules for pesticides and process for their manufacture
US3920442A (en) 1972-09-18 1975-11-18 Du Pont Water-dispersible pesticide aggregates
US4172714A (en) 1976-12-20 1979-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Dry compactible, swellable herbicidal compositions and pellets produced therefrom
US4443971A (en) * 1979-10-16 1984-04-24 Cornell Research Foundation, Inc. Herbicide-tolerant plants
HU187284B (en) * 1980-12-11 1985-12-28 Mta Koezponti Kemiai Kutato In Herbicide compositions containing antitoxines of aldehyde- and ketone-derivatives
GB2095558B (en) 1981-03-30 1984-10-24 Avon Packers Ltd Formulation of agricultural chemicals
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US5380831A (en) 1986-04-04 1995-01-10 Mycogen Plant Science, Inc. Synthetic insecticidal crystal protein gene
US4774381A (en) * 1983-09-30 1988-09-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Herbicide resistant tobacco
US5331107A (en) * 1984-03-06 1994-07-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US5304732A (en) * 1984-03-06 1994-04-19 Mgi Pharma, Inc. Herbicide resistance in plants
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US6211439B1 (en) 1984-08-10 2001-04-03 Mgi Pharma, Inc Herbicide resistance in plants
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US5013659A (en) * 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5605011A (en) * 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5378824A (en) * 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US5821126A (en) * 1986-11-19 1998-10-13 The Regents Of The University Of California Method for clonal propagation of gymnosperms by somatic polyembryogenesis
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
FR2617167B1 (fr) * 1987-06-25 1989-11-24 Rhone Poulenc Agrochimie Herbicides de type sulfonyluree, leur preparation, les compositions les contenant et leur utilisation
US5316931A (en) 1988-02-26 1994-05-31 Biosource Genetics Corp. Plant viral vectors having heterologous subgenomic promoters for systemic expression of foreign genes
IE61148B1 (en) * 1988-03-10 1994-10-05 Ici Plc Method of detecting nucleotide sequences
US5990387A (en) 1988-06-10 1999-11-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Stable transformation of plant cells
US5180587A (en) 1988-06-28 1993-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Tablet formulations of pesticides
US5858652A (en) * 1988-08-30 1999-01-12 Abbott Laboratories Detection and amplification of target nucleic acid sequences
US5084082A (en) * 1988-09-22 1992-01-28 E. I. Du Pont De Nemours And Company Soybean plants with dominant selectable trait for herbicide resistance
GB8825402D0 (en) * 1988-10-31 1988-11-30 Cambridge Advanced Tech Sulfonamide resistance genes
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5879918A (en) 1989-05-12 1999-03-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Pretreatment of microprojectiles prior to using in a particle gun
US5240855A (en) 1989-05-12 1993-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Particle gun
EP0777964B1 (en) 1989-08-30 2001-11-14 Kynoch Agrochemicals (Proprietary) Limited Preparation of a dosage device
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
HU210697B (en) 1990-03-12 1995-06-28 Du Pont Water-dispersible or water-soluble pesticide granular composition containing heat-activated binders
ES2187497T3 (es) 1990-04-12 2003-06-16 Syngenta Participations Ag Promotores preferentemente en tejidos.
ES2171391T3 (es) 1990-04-26 2002-09-16 Aventis Cropscience Nv Nueva cepa de bacillus thuringiensis y su gen de codificado de toxina insecticida.
US5198599A (en) * 1990-06-05 1993-03-30 Idaho Resarch Foundation, Inc. Sulfonylurea herbicide resistance in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
EP0480679B1 (en) 1990-10-11 1996-09-18 Sumitomo Chemical Company Limited Pesticidal composition
US5932782A (en) 1990-11-14 1999-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant transformation method using agrobacterium species adhered to microprojectiles
DE4038430A1 (de) * 1990-12-01 1992-06-04 Basf Ag Herbizide n-((1,3,5-triazin-2-yl)-aminocarbonyl) benzolsulfonamide
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5767366A (en) * 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
ES2146202T3 (es) * 1991-04-08 2000-08-01 American Cyanamid Co Trigo resistente a herbicidas de inhibidores de ahas y procedimiento para su seleccion.
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
US5731180A (en) 1991-07-31 1998-03-24 American Cyanamid Company Imidazolinone resistant AHAS mutants
CA2112676C (en) 1991-08-02 2007-07-03 Michio Ohba Novel microorganism and insecticide
WO1993004178A1 (en) 1991-08-23 1993-03-04 University Of Florida A novel method for the production of transgenic plants
JPH06510187A (ja) 1991-08-27 1994-11-17 ノバルティス　アクチエンゲゼルシャフト 同翅類昆虫に対する殺虫性質を有したタンパク質及び植物保護におけるそれらの用法
TW261517B (ru) 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
US5324646A (en) 1992-01-06 1994-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of regeneration of Medicago sativa and expressing foreign DNA in same
DE4206146A1 (de) * 1992-02-28 1993-09-02 Basf Ag Herbizide n-((1,3,5-triazin-2-yl)aminocarbonyl)benzolsulfonamide
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
JP2952041B2 (ja) 1992-07-27 1999-09-20 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル，インコーポレイテッド 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法
US5545822A (en) * 1992-08-21 1996-08-13 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
FR2696190B1 (fr) * 1992-09-25 1994-12-09 Agronomique Inst Nat Rech Acide nucléique codant pour une alpha-acétolactate synthase et ses applications.
US5539092A (en) * 1992-10-02 1996-07-23 Arch Development Corporation Cyanobacterial and plant acetyl-CoA carboxylase
DE4238175A1 (de) * 1992-11-12 1994-05-19 Basf Ag Herbizide Sulfonylharnstoffe, Verfahren zur Herstellung und ihre Verwendung
IL108241A (en) 1992-12-30 2000-08-13 Biosource Genetics Corp Plant expression system comprising a defective tobamovirus replicon integrated into the plant chromosome and a helper virus
DE4322211A1 (de) 1993-07-03 1995-01-12 Basf Ag Wäßrige, mehrphasige, stabile Fertigformulierung für Pflanzenschutz-Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung
JP3339655B2 (ja) * 1993-10-04 2002-10-28 花王株式会社 水素化反応用触媒前駆体、その製造法、及びアルコールの製造法
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5633437A (en) * 1994-10-11 1997-05-27 Sandoz Ltd. Gene exhibiting resistance to acetolactate synthase inhibitor herbicides
EP0711834A3 (en) 1994-10-14 1996-12-18 Nissan Chemical Ind Ltd New Bacillus strain and product for the control of harmful organisms
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
US5853973A (en) * 1995-04-20 1998-12-29 American Cyanamid Company Structure based designed herbicide resistant products
EP0821729B1 (en) * 1995-04-20 2006-10-18 Basf Aktiengesellschaft Structure-based designed herbicide resistant products
DE19518505A1 (de) * 1995-05-19 1996-11-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Genexpressionsanalyse
DE19534910A1 (de) * 1995-09-20 1997-03-27 Basf Ag Herbizide Mischungen mit synergistischer Wirkung
US5737514A (en) 1995-11-29 1998-04-07 Texas Micro, Inc. Remote checkpoint memory system and protocol for fault-tolerant computer system
US5773704A (en) 1996-04-29 1998-06-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5859348A (en) * 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
US5773702A (en) 1996-07-17 1998-06-30 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US6114116A (en) * 1996-12-02 2000-09-05 Lemieux; Bertrand Brassica polymorphisms
US6358686B1 (en) * 1996-12-02 2002-03-19 Affymetrix, Inc. Brassica polymorphisms
DE19650955A1 (de) * 1996-12-07 1998-06-10 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel mit N- [(4,6-Dimethoxypyrimidin-2-yl)aminocarbonyl] -5-methylsulfonamidomethyl-2-alkoxycarbonylbenzolsulfonamiden
AU6024598A (en) * 1997-01-10 1998-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Hybridization-based genetic amplification and analysis
US5866766A (en) * 1997-01-17 1999-02-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred sunflower line PHA262
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US6207425B1 (en) * 1997-09-11 2001-03-27 City Of Hope Bidirectional PCR amplification of specific alleles
DE69932868T2 (de) 1998-02-26 2007-03-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz für einen Promotor
US6696294B1 (en) * 1998-06-19 2004-02-24 Northwest Plant Breeding Co. Methods for generating and identifying mutant polyploid plants, and uses therefor
US6348643B1 (en) * 1998-10-29 2002-02-19 American Cyanamid Company DNA sequences encoding the arabidopsis acetohydroxy-acid synthase small subunit and methods of use
US7019196B1 (en) * 1998-11-05 2006-03-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herbicide resistant rice
EP1131454A2 (en) 1998-11-09 2001-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transcriptional activator nucleic acids, polypeptides and methods of use thereof
US6175065B1 (en) * 1999-04-14 2001-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Inbred sunflower line PHA344
GB9917307D0 (en) * 1999-07-23 1999-09-22 Sec Dep Of The Home Department Improvements in and relating to analysis of DNA
US20010044939A1 (en) * 2000-01-04 2001-11-22 Abell Lynn M. Small subunit of plant acetolactate synthase
US6613963B1 (en) * 2000-03-10 2003-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Herbicide tolerant Brassica juncea and method of production
US6936467B2 (en) * 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
PT1280928T (pt) * 2000-05-10 2017-01-30 Univ Louisiana State Resistência a herbicidas inibidores de aceto-hidroxiácido sintase
US6475736B1 (en) * 2000-05-23 2002-11-05 Variagenics, Inc. Methods for genetic analysis of DNA using biased amplification of polymorphic sites
CA2326283C (en) * 2000-11-17 2008-04-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica napus with early maturity (early napus) and resistance to an ahas-inhibitor herbicide
CA2326285C (en) * 2000-11-17 2008-05-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Brassica with resistance to an ahas-inhibitor herbicide and blackleg disease
US6627401B2 (en) * 2000-12-28 2003-09-30 Council Of Scientific And Industrial Research Method for detecting a single nucleotide polymorphism in p21waf1/cip1 gene as an indicator of risk of esophageal cancer
US6492582B2 (en) * 2001-01-11 2002-12-10 California Cooperative Rice Research Foundation, Inc. Rice cultivar M-205
US7232942B2 (en) * 2001-05-14 2007-06-19 University Of Saskatchewan Lentil plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
WO2003001436A1 (en) 2001-06-20 2003-01-03 Paul Peterson Methods and apparatus for generating a multiple composite image
RU2004106631A (ru) * 2001-08-09 2005-05-10 Нортвест Плант Бридинг Компани (Us) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидозалиновым гербицидам
CA2790951C (en) 2001-08-09 2016-08-30 University Of Saskatchewan Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
RU2337532C2 (ru) * 2001-08-09 2008-11-10 Юниверсити Оф Саскачеван Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
WO2003020983A1 (en) * 2001-08-30 2003-03-13 Virginia Commonwealth University Allele specific pcr for genotyping
WO2003048319A2 (en) * 2001-11-30 2003-06-12 Syngenta Participations Ag Nucleotide sequences encoding proteins conferring abiotic stress tolerance in plants
US7829762B2 (en) * 2002-07-10 2010-11-09 Department Of Agriculture Wheat plants having increased resistance to imidazolinone herbicides
AU2003275857B2 (en) * 2002-10-29 2009-06-11 Advanta Canada Inc. Assay for imidazolinone resistance mutations in Brassica species
AU2003275859A1 (en) * 2002-10-29 2004-05-25 Basf Plant Science Gmbh Compositions and methods for identifying plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
US6953880B2 (en) * 2003-02-28 2005-10-11 University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar ‘Francis’
RU2425152C2 (ru) * 2003-05-28 2011-07-27 Басф Акциенгезельшафт Растения пшеницы с повышенной толерантностью к имидазолиноновым гербицидам
US7432082B2 (en) * 2004-03-22 2008-10-07 Basf Ag Methods and compositions for analyzing AHASL genes
CN101006178A (zh) * 2004-06-16 2007-07-25 巴斯福种植科学有限公司 用于建立咪唑啉酮耐受性的植物的编码成熟的ahasl蛋白质的多核苷酸
US7355098B2 (en) * 2004-06-22 2008-04-08 Saskatchewan Wheat Poo1 Brassica AHAS genes and gene alleles that provide resistance to imidazolinone herbicides
EA020462B1 (ru) * 2005-07-01 2014-11-28 Басф Се Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
US7786360B2 (en) * 2005-09-09 2010-08-31 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Rice cultivar designated ‘CL131’
US20070118920A1 (en) * 2005-11-09 2007-05-24 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant sunflower plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US7642434B2 (en) * 2007-05-02 2010-01-05 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, N.A. Rice cultivar CL171-AR

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030097692A1 (en) * 2000-12-21 2003-05-22 Georg Jander Plants with imidazolinone-resistant ALS
WO2005020673A1 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Instituto Nacional De Technologia Agropecuaria Rice plants having increased tolerance to imidazolinone herbicides
WO2006024351A1 (en) * 2004-07-30 2006-03-09 Basf Agrochemical Products B.V. Herbicide-resistant sunflower plants, plynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxy acid synthase large subunit proteins, and methods of use
WO2006060634A2 (en) * 2004-12-01 2006-06-08 Basf Agrochemical Products, B.V. Novel mutation involved in increased tolerance to imidazolinone herbicides in plants

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AL-KHATIB K. ET AL: "IMAZETHAPYR RESISTANCE IN COMMON SUNFLOWER (HELIANTHUS ANNUUS)", WEED SCIENCE, WEED SCIENCE SOCIETY OF AMERICA, CHAMPAIGN, IL, US, vol. 46, no. 4, 1998, pages 403-407, XP001024427, ISSN: 0043-1745, the whole document *
KOLKMAN JUDITH M. ET AL.: "Acetohydroxyacid synthase mutations conferring resistance to imidazolinone or sulfonylurea herbicides in sunflower." TAG. THEORETICAL AND APPLIED GENETICS. THEORETISCHE UND ANGEWANDTE GENETIK, OCT 2004, vol. 109, no. 6, October 2004 (2004-10), pages 1147-1159, XP002417954, ISSN: 0040-5752, cited in the application, abstract *
MILLIMAN LESLIE D. ET AL.: "CHARACTERIZATION OF TWO BIOTYPES OF IMIDAZOLINONE-RESISTANT EASTERN BLACK NIGHTSHADE (SOLANUM PTYCANTHUM)", WEED SCIENCE, WEED SCIENCE SOCIETY OF AMERICA, CHAMPAIGN, IL, US, vol. 51, no. 2, March 2003 (2003-03), pages 139-144, XP009078200, ISSN: 0043-1745, abstract; fig. 1 *
WHITE A. D. ET AL.: "ISOLATION OF ACETOLACTATE SYNTHASE HOMOLOGS IN COMMON SUNFLOWERS", WEED SCIENCE, WEED SCIENCE SOCIETY OF AMERICA, CHAMPAIGN, IL, US, vol. 51, no. 6, November 2003 (2003-11), pages 845-853, XP009058786, ISSN: 0043-1745, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013121349A (ja) 2013-06-20
TR200907590T2 (tr) 2010-06-21
AU2006265984C1 (en) 2013-02-28
BRPI0612384B1 (pt) 2021-10-13
TR200709185T2 (tr) 2008-02-21
WO2007005581A8 (en) 2007-12-13
CA2613087C (en) 2018-06-19
EP2400022A1 (en) 2011-12-28
PL1902136T3 (pl) 2012-08-31
HRP20120294T1 (hr) 2012-05-31
AU2006265984B2 (en) 2012-08-16
UA99091C2 (ru) 2012-07-25
US20160222403A1 (en) 2016-08-04
EA200800174A1 (ru) 2008-08-29
EA201301103A1 (ru) 2014-02-28
CN101287836B (zh) 2013-02-20
ATE541939T1 (de) 2012-02-15
HUE035307T2 (en) 2018-05-02
EP2400022B1 (en) 2017-06-14
EP2532750B1 (en) 2016-04-27
JP2009504137A (ja) 2009-02-05
PT1902136E (pt) 2012-04-13
US20110209232A1 (en) 2011-08-25
CN101287836A (zh) 2008-10-15
CA3006126C (en) 2022-04-19
RS54931B1 (sr) 2016-10-31
CA3006126A1 (en) 2007-01-11
HUE029181T2 (en) 2017-02-28
ES2581478T3 (es) 2016-09-06
AU2006265984C9 (en) 2013-04-11
US20180016593A1 (en) 2018-01-18
SI1902136T1 (sl) 2012-05-31
JP5265356B2 (ja) 2013-08-14
WO2007005581A3 (en) 2007-08-02
CA2613087A1 (en) 2007-01-11
ZA200800947B (en) 2010-06-30
EP1902136B1 (en) 2012-01-18
AR097201A2 (es) 2016-02-24
BRPI0612384A2 (pt) 2009-01-27
EP2532750A1 (en) 2012-12-12
CN103484531A (zh) 2014-01-01
AU2006265984A1 (en) 2007-01-11
WO2007005581A2 (en) 2007-01-11
ES2380867T3 (es) 2012-05-21
HRP20120294T2 (hr) 2024-06-07
AR058429A1 (es) 2008-02-06
JP5789249B2 (ja) 2015-10-07
US20160230184A1 (en) 2016-08-11
EP1902136A2 (en) 2008-03-26
CN103484531B (zh) 2015-10-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020462B1 (ru) Резистентные к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие резистентные к гербицидам большие субъединицы белков ацетогидроксикислотной синтазы, и применение растений и полинуклеотидов
RU2415566C2 (ru) Устойчивые к гербицидам растения подсолнечника, полинуклеотиды, кодирующие устойчивые к гербицидам белки большой субъединицы ацетогидроксиацидсинтазы, и способы применения
RU2337531C2 (ru) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
EA028486B1 (ru) Рекомбинантный или мутантный полинуклеотид для придания растениям толерантности к гербицидам, ингибирующим ацетогидроксикислотную синтазу (ahas), растение, содержащее указанный полинуклеотид, и способы получения и применения растений
JP5965582B2 (ja) 除草剤抵抗性のアブラナ属植物および使用方法
RU2525933C2 (ru) Новая мутация, вовлеченная в повышенную толерантность растений к имидазолиноновым гербицидам
ES2379553T3 (es) Plantas de arroz que tienen tolerancia aumentada a herbicidas de imidazolinona
RU2337532C2 (ru) Растения пшеницы с повышенной устойчивостью к имидазолиноновым гербицидам
EA023348B1 (ru) Способ определения генотипа ahasl1, набор для определения генотипа ahasl1 и изолированные полинуклеотиды устойчивых к гербицидам растений подсолнечника с множественными устойчивыми к гербицидам аллелями ahasl1
EA025732B1 (ru) Резистентные к гербицидам ahas-мутанты и способы применения
CN101657090B (zh) 抗除草剂的向日葵植物和使用方法
US10674690B2 (en) Acetolactate synthase herbicide resistant sorghum
US20190032029A1 (en) Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
BRPI0608264A2 (pt) planta, semente da planta, método para controlar ervas daninhas na vizinhança de uma planta, molécula de polinucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula hospedeira não humana, vetor de transformação, semente transformada, célula vegetal transformada, métodos para aumentar atividade de ahas resistente a herbicida em uma planta, para produzir uma planta resistente a herbicida, para aumentar toleráncia a herbicida em uma planta, e para selecionar para uma célula vegetal transformada, polipeptìdeo isolado, e, métodos para aumentar a resistência a herbicida de uma planta, e para combater vegetação indesejada

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG TJ TM