CN109810920B - 一株苏云金芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株苏云金芽胞杆菌及其应用，本发明之苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌X023，Bacillus thuringiensisX023，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018283。本发明还包括苏云金芽胞杆菌的应用，苏云金芽胞杆菌发酵菌液对棉铃虫和小菜蛾有杀虫活性。

Description

一株苏云金芽胞杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis X023)及其应用，对筛选的一株高杀虫毒力野生型苏云金芽胞杆菌发酵液进行生物学测定。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)产生的杀虫晶体蛋白(ICP)是一种生态友好型生物农药，具有高效特异性，是最广泛使用的微生物杀虫剂之一。目前苏云金芽胞杆菌(Bt)杀虫晶体蛋白基因已成功转入植物中，随着转基因品种增加和杀虫制剂的施用，昆虫对杀虫晶体蛋白的抗性将不可避免地增强。不断分离筛选出一些新的血清型和高毒力Bt新菌株则是目前解决该问题最重要最可行的方法之一。

早期研究表明：Bt杀虫晶体蛋白(ICP)与芽胞相伴形成，因此它们也被命名为伴胞晶体，这意味着杀虫晶体蛋白与芽胞的形成有某种关联。有很多因素会影响ICP的产生，不同的杀虫晶体蛋白杀虫毒性有一定的差异并具有特异的杀虫谱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一株苏云金芽胞杆菌及其应用，有效的对小菜蛾和棉铃虫进行生物防治。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，本发明之苏云金芽胞杆菌，为苏云金芽胞杆菌X023(Bacillus thuringiensis X023，简称Bt X023)，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2018283。

本发明之苏云金芽胞杆菌16S rRNA序列为：

TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAATCATCTGTCCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCAACTAGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGACGCGGGTCCATCCATAAGTGACAGCCGAAGCCGCCTTTCAATTTCGAACCATGCGGTTCAAAATGTTATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACTTCATAAGAGCAAGCTCTTAATCCATTCGCTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCATCCTGAGCCAGGATCAAACTCT

即为

本发明之苏云金芽胞杆菌X023(Bt X023)的分离鉴定：采用水浴加热和稀释平板涂布等方法，从湖南湘潭地区湘潭县金霞山林地采集的土样中直接分离得到一株具有苏云金芽胞杆菌性状的细菌，经菌落形态观察、革兰氏染色、生理生化特征、16S rRNA基因同源性分析，鉴定该菌株为Bacillus属，thuringiensis种，命名为苏云金芽胞杆菌X023(BtX023)。

杀虫活性：

将苏云金芽胞杆菌X023接种到发酵培养基中,26-30℃，120-180rpm发酵培养48-60h后，取发酵菌液，进行棉铃虫和小菜蛾的毒性生测实验。

发酵培养基的成分优选为：葡萄糖14-17g/L，蛋白胨12-15g/L，KH₂PO₄·3H₂O1.2-1.6g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02-0.03g/L，MnSO₄·H₂O 0.02-0.03g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25-0.30g/L，pH 6.8-7.2。

苏云金芽胞杆菌作为重要生防菌，其作用范围涵盖多种鳞翅目、鞘翅目农业害虫，本发明分离得到的苏云金芽胞杆菌对鳞翅目的靶标昆虫小菜蛾和棉铃虫有很好的毒性，对农业生产作物害虫生物防治具有重要的应用价值。

附图说明

图1为菌株Bt X023经分离纯化后的相差显微镜形态特征图；

图2为菌株Bt X023芽胞晶体混合物经分离纯化后的扫描电镜形态特征图；

图3为Bt X023菌株16S rRNA序列进化树；

图4为Bt X023菌株在发酵培养基中的生长曲线图；

图5为Bt X023培养36h后提取全蛋白进行SDS-PAGE的结果图；M:蛋白Marker；1-3:三组生物学重复。

微生物菌株保藏情况说明

苏云金芽胞杆菌X023(Bacillus thuringiensis X023)，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018283。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

①本实施例之苏云金芽胞杆菌X023(简称Bt X023)，该菌种于2018年5月16日在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学)保藏，菌种保藏号为CCTCCNO：M 2018283。

②本实施例之苏云金芽胞杆菌X023菌株分离过程：从湖南湘潭地区湘潭县金霞山林地采集土样，加入无菌水，混匀，80℃加热30min，梯度稀释，取100微升(μL)均匀涂布于LB平板上，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，26-30℃条件下培养48h，将重复分离纯化的单菌落接种到LB液体培养基摇瓶中，26-30℃，120-180rpm/min，培养12h，50％甘油混匀，-80℃冰箱中长期保藏。

③光学显微镜和电子显微镜观察：

具体实施过程：取Bt X023培养36h的菌液1.5mL，9000rpm/min，3min，离心，去上清，双蒸水清洗两遍，用200μL双蒸水重悬菌体，吸取10μL菌液滴于载玻片中央，盖上盖玻片，在100倍油镜下观察菌体的形态。取Bt X023培养60h菌液1.5mL，9000rpm/min，3min，离心，去上清，用生理盐水和5％的丙酮各清洗3次，PBS缓冲液洗涤6-8次，最后用200μL PBS缓冲液重悬菌体，洗涤后的沉淀加入2.5％的戊二醛固定液固定12h，用无菌超纯水洗涤2次后，再依次用30％、50％、70％、80％、90％质量浓度梯度的乙醇脱水，每个梯度中需静置15min，脱水完毕，用无水乙醇脱水2次，每次静置15min，最后吸取混匀的样品-乙醇悬浮液滴在覆有盖玻片的样品台上，在扫描电子显微镜下观察菌体形态。

图1是菌株Bt X023培养至36h的相差显微镜图片，图中显示该菌株为杆状产芽胞与菱形晶体的细菌。图2是对芽胞晶体混合物的扫描电镜观察。

④Bt X023菌株16S rRNA基因同源序列分析：

具体实施过程：从LB平板上挑取单菌落，转接到含有1.2mL LB液体培养基的1.5mLEp管中，在管盖上用注射器针头扎小孔，30℃，850rpm/min，振荡培养24h后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒，按操作步骤进行全基因组提取。根据细菌16S rRNA基因序列设计通用引物(Bf-F，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；Bf-R，ACGGCTACCTTGTTACGACTT)并由生工(上海)生物技术有限公司合成。

按以下反应体系和反应条件进行16S rRNA基因扩增：

反应体系(20μL)：无菌双蒸水，12μL；5×Buffer，4μL；dNTP，1.6μL；Bf-R(10μM)，0.6μL；Bf-F(10μM)，0.6μL；基因组模板，1μL；PrimerSTAR DNA Polymerase(Takara)，0.2μL；

反应程序：预变性94℃4min，变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃90s，30次循环，延伸72℃10min。

PCR产物经多功能DNA纯化回收试剂盒纯化，与适量引物一起送交上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果显示分离菌株Bt X023的16S rRNA基因序列长度为1516bp。将测得的Bt X023的16SrRNA基因序列进行在线BLAST(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)比对,16S rRNA基因序列的同源性比较分析显示，该菌株分别与Bcillus thuringiensisknu-07(CP016588.1)、Bcillus thuringiensis C25(CP022345.1)、Bcillusthuringiensis YWC-28(CP013055.1)、Bcillus thuringiensis tolworthi(AP014864.1)、Bcillus thuringiensis HD-1(CP010005.1)等的相似性均为99％。根据BLAST所得结果以及相差显微镜观察推测该菌株属于Bcillus thuringiensis亚种，命名为Bacillusthuringiensis X023并构建了如图3的系统发育树(Replications＝1000，Bootstrap值取百分比)。

LB培养基(/L)：10g氯化钠，10g蛋白胨，5g酵母粉，20g琼脂(液体培养基不加)，pH6.8-7.2；

发酵培养基的成分为：葡萄糖16g/L，蛋白胨14g/L，KH₂PO₄·3H₂O 1.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，MnSO₄·H₂O 0.02g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，pH 6.8-7.2。

具体实施过程：从LB平板上挑取单菌落，转接到含有1.2mL LB培养基的1.5mL Ep管中，在管盖上用注射器针头扎小孔，26-30℃，850rpm/min，振荡培养12h后，按1％转接于30mL发酵培养基中，26-30℃,120-180rpm振荡培养，每2h取样，测定OD₆₀₀值。

苏云金芽胞杆菌X023菌株在发酵培养基的生长曲线如图4所示，结果表明，同一株菌延滞期均为初始的2小时，对数生长期均在发酵开始后的2h～16h，其中菌体进入稳定期的时间18h。此外进入衰退期的时间36h，但菌株在稳定期持续的时间基本保持一致。

⑥Bacillus thuringiensis X023菌株的杀虫活性测定：

具体实施过程：Bt X023菌株在LB培养基中活化12h后，以1％的接种量分别接种到发酵培养基中，培养48-60小时，收集发酵液。取一定量发酵液加入发酵培养基稀释，使其形成具有不同稀释浓度、总体系为600μL的发酵液，将稀释后的发酵液加入30mL的人工饲料并充分混合，最终使其中发酵液被分别稀释为20、10、5、2.5、1.25uL/mL五种浓度梯度。将30mL的饲料平均加到3个平行的24孔生测板，即72个培养孔中，每个孔中添加一条幼虫，共72条。在28±1℃的培养箱中喂饲，每24小时记录死虫的数量和总虫数，培养时间不超过96小时。记录数据通过SPSS软件的prohibit分析以计算不同条件下X023发酵液的LC₅₀(半致死浓度)，使用LC₅₀的非重叠95％置信区间作为确定毒性显着差异的标准。

表1是Bt X023在发酵培养基中培养60h后的发酵液对小菜蛾的生测结果

表2是Bt X023在发酵培养基中培养60h后的发酵液对棉铃虫的生测结果

⑦Bacillus thuringiensis X023菌株的全蛋白提取与SDS-PAGE：

具体实施过程：根据苏云金芽胞杆菌X023的生长曲线，选择发酵培养36h后的菌液，9000rpm/min，10min收集细胞沉淀，用PBS(20mM)洗涤2次。加入适量细胞裂解液(0.5MpH 8.0Tris-Cl、8M尿素、65mM CHAPS、75mM NaCl、2M硫脲、1mM PMSF、10mM蛋白酶抑制剂)，然后进行超声破碎处理(130W，3S，3S，10min)，13000r/min，20min，获取上清，通过酶标仪进行蛋白质定量后，进行SDS-PAGE检测。图5是不同发酵条件下培养36h后提取Bt X023全蛋白进行SDS-PAGE，M.蛋白Marker，1-3为三个生物学重复。

BtX023菌株36h全蛋白SDS-PAGE中，其产生有明显大量的130KDa的杀虫晶体蛋白条带。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株苏云金芽胞杆菌及其应用

<130>

<140>

<141>

<150>

<151>

<160> 1

<210> 1

<211> 1516

<212> DNA/RNA

<213>苏云金芽胞杆菌 X023（Bacillus thuringiensis X023）（CCTCC NO：M 2018283）

<220>

<400>1

tacggctacc ttgttacgac ttcaccccaa tcatctgtcc caccttaggc ggctggctcc 60

aaaaaggtta ccccaccgac ttcgggtgtt acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg 120

tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcagc atgctgatcc gcgattacta gcgattccag 180

cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc cgaactgaga acggttttat gagattagct 240

ccacctcgcg gtcttgcagc tctttgtacc gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc 300

ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca 360

ccttagagtg cccaacttaa tgatggcaac taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac 420

ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt cactctgctc 480

ccgaaggaga agccctatct ctagggtttt cagaggatgt caagacctgg taaggttctt 540

cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt 600

tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggagtgc ttaatgcgtt aacttcagca 660

ctaaagggcg gaaaccctct aacacttagc actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg 720

tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcgcctcagt gtcagttaca gaccagaaag 780

tcgccttcgc cactggtgtt cctccatatc tctacgcatt tcaccgctac acatggaatt 840

ccactttcct cttctgcact caagtctccc agtttccaat gaccctccac ggttgagccg 900

tgggctttca catcagactt aagaaaccac ctgcgcgcgc tttacgccca ataattccgg 960

ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc gtggctttct 1020

ggttaggtac cgtcaaggtg ccagcttatt caactagcac ttgttcttcc ctaacaacag 1080

agttttacga cccgaaagcc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag actttcgtcc 1140

attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1200

tgtggccgat caccctctca ggtcggctac gcatcgttgc cttggtgagc cgttacctca 1260

ccaactagct aatgcgacgc gggtccatcc ataagtgaca gccgaagccg cctttcaatt 1320

tcgaaccatg cggttcaaaa tgttatccgg tattagcccc ggtttcccgg agttatccca 1380

gtcttatggg caggttaccc acgtgttact cacccgtccg ccgctaactt cataagagca 1440

agctcttaat ccattcgctc gacttgcatg tattaggcac gccgccagcg ttcatcctga 1500

gccaggatca aactct 1516

Claims (4)

1.一种苏云金芽胞杆菌，其特征在于，为苏云金芽胞杆菌 X023，Bacillus thuringiensis X023，该菌种于2018年 5 月16日在中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号为 CCTCC NO：M 2018283。

2.如权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌的发酵菌液，其特征在于，制备方法为：将苏云金芽胞杆菌X023接种到发酵培养基中, 26-30℃，120-180 rpm 发酵培养48-60 h，即得。

3.根据权利要求2所述的苏云金芽胞杆菌的发酵菌液，其特征在于，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖14-17g/ L，蛋白胨12-15 g/ L，KH₂PO₄•3H₂O1.2-1.6 g/ L，FeSO₄•7H₂O0.02-0.03 g/ L，MnSO₄•H₂O 0.02-0.03 g/ L，MgSO₄•7H₂O 0.25-0.30g/ L，pH 6.8-7.2。

4.如权利要求2或3所述的苏云金芽胞杆菌的发酵菌液用于防治棉铃虫或小菜蛾。

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