CN101984045A - 苏云金芽孢杆菌cry8Nal基因,表达蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及“苏云金芽孢杆菌cry8Na1基因，表达蛋白及其应用”，属于生物防治技术领域。苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7，其保藏编号为CGMCC No.4188。杀虫蛋白，具有如SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列，及编码该杀虫蛋白的基因，优选所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。上述基因对鞘翅目害虫具有高毒力，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，特别是进一步，本发明涉及对鞘翅目害虫具有高毒力的Bt cry8Na1基因及由该基因所编码的蛋白质。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布广泛的革兰氏阳性细菌，是一种对害虫毒力强且对天敌无毒性的昆虫病原微生物，对高等动物和人无毒性。它是目前研究最为深入、使用最为广泛的微生物杀虫剂，对16个目3000多种害虫有活性。Bt在芽孢形成期可形成杀虫晶体蛋白(Insecticidal CrystalProteins，ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，它的形状、结构和大小均与其毒力有着密切关系[Schnepf.E，Crickmore.N，Van Rie.J.，Lereclus.D，Baum.J，Feitelson.J，Zeigler.D.R.，Dean.D.H.Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystalproteins.Microbiol.Mol.Biol.Rev，1998，62(3)：775-806.]。自1981年Schnepf等克隆了Bt的第一个ICPs基因，并于1985年发表了它的DNA碱基序列及其编码蛋白的氨基酸序列起，目前(2010年7月)已发现种杀虫晶体蛋白530种，被分为67类cry蛋白和2类cyt蛋白。当今，采用喷施化学农药防治手段固然可以减轻害虫对农作物的为害，但化学农药造成环境污染，长期以来，大量喷施化学杀虫剂，不仅会增强害虫的抗药性，使益虫及其它生态区系遭受破坏，而且严重污染环境，提高生产成本，破坏生态平衡。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白因其杀虫效果好、安全、高效等优点而被广泛的应用于虫害防治。苏云金芽胞杆菌除了直接作为生物农药以外，1996年全世界第一例转基因抗虫植物在美国获准应用，它使用的基因来自Bt cry1Ac。在接下来的几年里，转cry1Ab基因的抗虫玉米，转cry3Aa基因的抗虫土豆等相距问世。在中国，自1998年开始正式推广含有cry1Ac/cry1Ab基因的抗虫棉以来，已经被普遍种植。在转基因作物商业化的第一个12年(1996-2007)中，由于能得到持续稳定的收益，农民种植转基因作物量逐年增加。2009年，25个国家种植了1.34亿公顷的转基因作物，比2008年增长了7％。美国仍然是最大的生物技术作物种植国，种植面积为6400万公顷，中国，370万公顷。第一个12年，转基因作物商业化给工业化国家和发展中国家的农民都带来了经济和环境效益。苏云金芽胞杆菌及其基因发掘已成为可持续发展农业中重要课题。
苏云金芽胞杆菌cry8类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有特异的杀虫活性。cry8类基因由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。1992年，Ohba等人首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.thuringiensis subsp.japonensis BuiBui)(Ohba M.，Iwahana H.，Asano S.，Sato R.and Hori H..A unique isolate of Bacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeidbeetles，Letters in Applied Microbiology 1992，14：54～57)，该菌株主要对赤铜丽金龟、日本金龟子等丽金龟科的害虫有毒杀作用。1994年，Hori等证明菌株的毒性来自细菌内的130kDa的蛋白质，Sato等从中克隆了一种新的杀虫基因cry8Ca1(Sato R.，Takeuchi K.，Ogiwara K.，Masayosi Minami，Kaji Y.，Suzuki N.，Hor H.i，Asan S.O，Ohba M.and Iwahana H..Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystal protein gene from Bacillus thuringiensisserovar japonensis strain Buibui toxic to Scarabaeid insects.Current Microbiology 1994，28：11～15)，该基因已经用于生物杀虫剂的开发。由于cry8类基因具有很大的潜在应用价值，大多数基因都已经申请专利，美国Mycogen公司分离的cry8Aa1和cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性；美国杜邦公司克隆的cry8Bb1、cry8Bc1基因对西方玉米根叶甲(Westerncorn rootworm)具有显著杀虫效果(Abad，Andre，R.，Duck Nicholas，B.，Feng，Xiang，FlannaganRonald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E..Genes encoding novel proteins with pesticidalactivity against Coleopterans.2002，WO 02/34774A2)，并已用于转基因抗虫玉米的开发；日本Asano等克隆的cry8Da1、cry8Da2和cry8Da3也已在日本申请专利(Asano S.，Yamashita C.，Iizuka T.，Takeuchi K.，Yamanaka S.，Cerf D.and T.Yamamoto..A strain of Bacillus thuringiensissubsp.Galleriae containing a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea(Coleoptera：Scarabaeidae).Biological Control 2003，28：191～196)。目前，我国河北省农林科学院植物保护研究所和河北农业大学近年来先后筛选获得多株对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)和铜绿丽金龟(A.corpulenta)幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株(冯书亮等.一株对金龟子类幼虫具有杀虫活性的苏云金杆菌新分离株.中国生物防治，2000，16(2)：74～78)。2006年，中国农业科学院植物保护研究所发现了对暗黑鳃金龟具有杀虫活性的第一株Bt菌株Bt185，随后他们克隆了分别对暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)和大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)有特异的杀虫活性的cry8Ea1、cry8Fa1(Yu H.，Zhang J.，Huang D.，Gao J.and Song F..Characterization ofBacillus thuringiensis strain Bt185 toxic to the Asian cockchafer：Holotrichia parallela.CurrentMicrobiology 2006，53：13～17。Shu C.，Yu H.，Wang R.，Fen S.，Su X.，Huang D.，Zhang J.，Song F..Characterization of two novel cry8 genes from Bacillus thuringiensis strain BT185.Current Microbiology 2009，58(4)：389-92.)和cry8Ga1基因(Shu C.L.，Yan G.X.，Wang R.Y.，ZhangJ.，Feng S.L.，Huang D.F.，Song F.P..Characterization of first cry8 gene specific to Melolonthidaepests：Holotrichia oblita and Holotrichia parallela.Applied Microbiology and Biotechnology.2009.3.17)。目前，全球克隆的cry8类基因已有33种。
由于目前商品化的转基因抗虫作物的抗虫基因种类比较单一，如此大面积推广种植存在 害虫避难所减少与害虫抗药性上升的风险。因此需要不断分离高毒力的或者新的基因组合来避免害虫抗药性上升的风险。因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫基因，可以丰富杀虫基因资源，为转基因作物与工程菌株提供新的基因来源，提高Bt转基因产品的抗虫效果，并且可以降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，避免新的生态灾难降临，具有重要的经济、社会和生态效益。
发明内容
本发明提供一种对金龟甲科害虫暗黑鳃金龟高毒力苏云金芽胞杆菌Q52-7，及其杀虫新基因cry8Na1基因和其晶体杀虫蛋白，以应用于转化微生物和植物，使之表现出对相关害虫的毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物的抗药性产生。
苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7，其保藏编号为：CGMCC No.4188。
苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7在杀灭鞘翅目害虫中的应用。
一种从苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7中分离得到的cry8Na1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO1所示。
编码该基因的杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
一种表达载体，其特征是含有上述基因。
所述表达载体为pEB 8，其骨架载体为pEB，其结构如图6所示。
一种微生物转化体，其特征是含有上述基因。
上述基因在抗鞘翅目害虫中的应用。
所述应用是将该基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。
所述应用是将该基因转入到微生物或植物，使之表达对鞘翅目的毒性蛋白。
本发明从辽宁千山圆通观附近土壤中分离得到一株苏云金芽孢杆菌菌株BTQ52-7，其保藏编号为CGMCC No.4188，该菌株生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀鞘翅目害虫作用的伴胞晶体，其对暗黑鳃金龟具有很强的杀灭能力；从该菌株中得到一个新基因的阳性克隆，即pEB8(见图6)，对其进行测序分析，发现克隆pEB 8中含有3519个碱基，见SEQ ID NO1，编码1174个氨基酸，见SEQ ID NO2。与已发表的基因相比，与cry8Ca相似性最高，相似性为70％，是一个新基因；从上述阳性克隆提取质粒，转入受体菌，得到表述菌株，测定基因的表达蛋白的活性，基因cry8Na1表达的蛋白对暗黑鳃金龟的初筛生测结果为校正死亡率为100％见表1，对华北大黑鳃金龟幼虫有一定活性见表2，对鞘翅目害虫榆蓝叶甲幼虫和铜绿丽金龟幼虫无杀虫活性见表3，表4。
cry8Na1基因可按生物技术的常规方法转化微生物、植物，表现出对相关鞘翅目害虫的毒性。
将上述基因转化菌株，表达得到的蛋白可以制成生物农药用于杀死鞘翅目害虫。同时，可以转入植物构建抗虫转基因植物，用于害虫的防治。
本发明分离克隆的Bt cry8Na1基因序列及其基因表达产物能够对鞘翅目害虫产生强毒力，特别是对暗黑鳃金龟有高活性，是很好的生物杀虫基因，有很广泛的应用前景。通过该cry8Na1基因与cry1Ab、cry1Ba、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目、鞘翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
菌株保藏信息：
菌种分类命名：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏日期：2010年09月20日
保藏编号：CGMCC No.4188
附图说明
图1光学显微镜下观察菌株BTQ52-7菌体的形态，
图2电镜下菌株BTQ52-7菌体形态
图3含有目的基因的基因组PCR鉴定，
其中1：阴性对照2：菌株BTQ52-7 S5un8/S3un8 PCR扩增产物
M：Marker(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500bp
图4cry8Na1基因全长PCR结果
1：阴性对照M：Marker(300、500、800、1000、1500、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10000bp)2：cry8类基因全长扩增产物
图5cry8Na1基因在大肠杆菌中表达蛋白的SDS-PAGE
M：蛋白高分子量marker(200，116，97，66，44kDa)1：BTQ52-7菌株的晶体蛋白2：pEB8在大肠杆菌中表达的蛋白3：pEB空载体
图6pEB8结构示意图，
图7同源性分析图。
具体实施方式
实施例1、分离得到苏云金芽孢杆菌菌株BTQ52-7
本申请人的实验室工作人员从辽宁千山圆通观附近土壤中分离的得到一株苏云金芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌的芽孢由外向内依次为芽孢外壁、芽孢衣、皮层、芽孢内壁，原生质膜和原生质体。其中皮层的主要成分是肽聚糖，不含营养细胞的多聚糖磷壁酸，它保持着芽孢 的脱水状态和耐热性，另一方面，芽孢形成过程中，会产生大量DPA-Ca鳌合物，使得芽孢中的生物大分子形成耐热凝胶，在80℃下热处理20min，苏云金芽孢杆菌芽孢也不会死亡并且休眠的芽孢在75℃的亚致死温度下处理15min，活化效果最好，不但促其快速萌发，还可提高芽孢的成活率(喻子牛1990)。依据这一特性，可实施温度筛选(Knowles B H，EllarD J.Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillusthuringiensis d-endotoxins with different specificity[J].Biochimica et biophysicaacta，1987，924：509-518.；戴莲韵，王学聘等.中国八个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆的分布[J].微生物学报，1994，30(2)117-121)。
1、1菌株的分离
1)取分装的土样加入到50ml大离心管中，至锥形管锥形处。
2)加灭菌水至15ml处，放入玻璃珠5～10颗。
3)用振荡器将土样打碎。
4)放入水浴锅中80℃，20分钟。
5)取1.5ml的EP管，每个管中加1ml灭菌水，再从50ml管中取10微升菌液加入到EP管中混匀。
6)从EP管中取100微升喷到1/2LB培养基中，涂匀。
7)放入到30℃温箱中培养2～3天。
8)镜检观察。
晶体观察
光学显微镜：
将胞晶混合液滴于载玻片上，涂抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色3min，清水冲洗，100x油镜进行镜检，石炭酸复红染液配制方法参见文献(Baroy F，Lecadet M M，Deleluse A.Cloning and sequencing of three new putative toxin genes from Clostridiumbifermentans[J].Gene，1998，211：293-295)。见图1所示。在1/2LB培养基上培养48h后形成单菌落，光学显微镜下观察到菌株BTQ52-7菌体为长杆状，芽孢为长圆棒状，晶体为球形。
电镜显微观察：
扫描电镜制样：孢晶混合液滴于玻璃片上，干燥，经锇酸固定，而后经酒精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金(2nm厚)，New Bio-TEM H-7500扫描电镜观察拍照。如图2所示。
生物学测定表明，对暗黑鳃金龟的初筛生测结果为校正死亡率为100％见表1，对华北大黑鳃金龟幼虫有一定的生物活性见表2。对鞘翅目害虫榆蓝叶甲、铜绿丽金龟无杀虫活性。
实施例2.获得新基因
2.1利用cry8类基因通用引物检测菌株BTQ52-7，引物如下
扩增循环：94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果如图3所示，测序以后进行核酸、氨基酸比较发现是新的基因。
2、1BTQ52-7菌株中cry8类基因的克隆
采用快速克隆方法对该菌株中的新cry基因进行分离克隆。
参考GenBank中公布的cry8类的基因编码区的5’端和3’端序列，设计了扩增全长cry8类基因的一对引物，引物序列如下：
cry8N5：5′-3′：TTACTCTTCTTCTAACACGAGTTCTACAC
cry8N3：5′-3′：ATGAGTCCGAATAATCAAAACGAAT
以菌株BTQ52-7的质粒DNA为模板，用上述设计的全长引物进行PCR全长扩增，扩增出了全长为3.5kb cry8全长基因，(见图4)，与已知cry8类基因的图谱不同，表明该菌株中可能含有新的cry8杀虫基因。
经过DNA回收与表达载体pEB进行连接，获得重组质粒命名为pEB8，其结构图如6所示。
用pfuDNA聚合酶，用如下体系进行PCR扩增。
10×PCR buffer 5μL
dNTP(10mM) 1μL
引物对(10mM) 1μL/个
模板 1uL
pfuDNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
超纯水补至50μL，混匀离心。
扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，25个循环，最后72℃延伸10分钟。
将纯化片段与载体pEB连接转化大肠杆菌JM109，得到阳性转化子。对转化子进行酶切，结果得到约3.5kb条带，表明cry8类新基因序列已经成功插入。对插入片断进行测序分析， 得到序列SEQ ID NO 1，序列全长3522bp，编码1173个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。
2.2连接方案
载体 0.1-0.2μg
目的片段DNA 0.5-1.0μg
5×Ligation Buffer 2μL
T4 DNA Ligase 1μL
用超纯水补足体积到10μL，充分混匀，16℃连接4h或4℃连接过夜。
2.3转化方案
1.挑取单菌落于5ml LB震荡培养过夜；
2.按1％接种量接种于LB液体培养基中，37℃，230rpm培养2-2.5hr，(OD600＝0.5-0.6)；
3.4℃，4,000rpm离心10min；
4.弃上清，加入预冷的0.1M CaCl250ml悬浮细胞，置于冰上30min以上；
5.4℃，4,000rpm离心10min，回收细胞；
6.用2-4ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细胞，分装成200μl/0.5mL离心管中，于4℃保存(可保存一周)。
7.取200μl感受态细胞与5μL连接产物充分混匀，冰浴30min。
8.42℃热激1.5min，冰浴3min。
9.加入800μl LB培养基37℃培养45min。
10.取200μl涂板，加入相应的抗生素，及IPTG，X-gal，37℃培养。
2.4同源性分析
SEQ ID NO2与cry8类基因遗传距离与同源性分析：表明SEQ遗传距离与cry8Ca最近为0.297，氨基酸同源性为70.3％，数据如下，根据苏云金芽孢杆菌分类标准(Crickmore N，D RZeigler，J Feitelson，et al.1998.Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensispesticidal crystal proteins.Microbiol.Mol Biol Rev.62：807～813)为新基因，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为cry8Na1基因。蛋白性质如下：
蛋白质长度Protein Length＝1173，
蛋白质分子量为MW＝132697.5，
等电点pI＝4.74。
cry8Aa.txt 0
cry8Ab.txt 0.233 0
cry8Ba.txt 0.334 0.345 0
cry8Bb.txt 0.311 0.336 0.175 0
cry8Bc.txt 0.313 0.332 0.175 0.089 0
cry8Ca.txt 0.475 0.485 0.476 0.464 0.464 0
cry8Da.txt 0.356 0.393 0.456 0.441 0.442 0.353 0
cry8Ea.txt 0.340 0.323 0.281 0.260 0.266 0.459 0.432 0
cry8Fa.txt 0.349 0.338 0.354 0.349 0.353 0.481 0.452 0.307 0
cry8Ga.txt 0.435 0.454 0.436 0.448 0.452 0.346 0.373 0.447 0.436 0
cry8Ka.txt 0.372 0.374 0.376 0.363 0.363 0.446 0.461 0.371 0.369 0.388 0
cry8Ma.txt 0.464 0.477 0.507 0.482 0.490 0.513 0.490 0.491 0.486 0.514 0.498 0
SEQ.txt 0.453 0.456 0.467 0.449 0.450 0.297 0.371 0.453 0.449 0.320 0.425 0.509 0
Homology matrix of 13 sequences
cry8Aa.txt 100％
cry8Ab.txt 76.7％ 100％
cry8Ba.txt 66.6％ 65.5％ 100％
cry8Bb.txt 68.9％ 66.4％ 82.5％ 100％
cry8Bc.txt 68.7％ 66.8％ 82.5％ 91.1％ 100％
cry8Ca.txt 52.5％ 51.5％ 52.4％ 53.6％ 53.6％ 100％
cry8Da.txt 64.4％ 60.7％ 54.4％ 55.9％ 55.8％ 64.7％ 100％
cry8Ea.txt 66.0％ 67.7％ 71.9％ 74.0％ 73.4％ 54.1％ 56.8％ 100％
cry8Fa.txt 65.1％ 66.2％ 64.6％ 65.1％ 64.7％ 51.9％ 54.8％ 69.3％ 100％
cry8Ga.txt 56.5％ 54.6％ 56.4％ 55.2％ 54.8％ 65.4％ 62.7％ 55.3％ 56.4％ 100％
cry8Ka.txt 62.8％ 62.6％ 62.4％ 63.7％ 63.7％ 55.4％ 53.9％ 62.9％ 63.1％ 61.2％ 100％
cry8Ma.txt 53.6％ 52.3％ 49.3％ 51.8％ 51.0％ 48.7％ 51.0％ 50.9％ 51.4％ 48.6％ 50.2％ 100％
SEQ.txt 54.7％ 54.4％ 53.3％ 55.1％ 55.0％ 70.3％ 62.9％ 54.7％ 55.1％ 68.0％ 57.5 49.1％ 100％
实施例3、基因表达与活性测定
3.1在上述克隆提取质粒DNA，转入受体菌Rosetta(DE3)中，获得表达菌株。
IPTG诱导表达后，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。
诱导表达过程如下：
1)活化菌种(37℃、12hr)；
2)10％接种于LB培养基中(37℃、2hr)；
3)加入诱导物IPTG，150rpm，18-22℃低温诱导4-20h；
4)离心收集菌体，加入10mM Tris·Cl(pH 8.0)悬浮；
5)破碎菌体(超声波破碎完全)；
离心12,000rpm 10min 4℃；
收集上清及沉淀各10-15μL，分别电泳检测。
聚丙烯酰胺凝胶配置如下。
分离胶8％(ml) 堆积胶5％(ml)
Distilled water 4.6 2.7
30％Degassed Acrylamide 2.7 0.67
1.5M Tris(pH8.8) 2.5
1.0M Tris(pH6.8) 0.5
10％SDS 0.1 0.04
10％APS 0.1 0.04
TEMED 0.006 0.004
上样：上样10-15μl，电泳：130-150V恒压。
染色与脱色：电泳后取出凝胶，用蒸馏水冲洗后，放入染色液中，60rpm振荡染色1hr左右，脱色液中脱色2hr左右，脱色至凝胶背景透明，清水中漂洗至蛋白带清晰。
检测结果表明表达的蛋白分子量约为130kD，结果见图5。
3.2基因编码蛋白的杀虫活性测定
将cry8Na1基因表达蛋白，用水稀释到不同浓度，测定对鞘翅目害虫的杀虫活性。
暗黑鳃金龟(H.parallela)、大黑鳃金龟(H.oblita)铜绿丽金龟(A.corpulenta)的生物活性测定：
按照Bt干粉所含蛋白量，以一定量悬浮于无菌水中，将上述悬浮液按照2倍等比级差梯度浓度稀释，加入到均匀粗细土豆丝的灭菌细土中混匀，以5-7日龄暗黑鳃金龟及大黑鳃金龟幼虫作为供试虫种，每个处理接虫30头，重复三次，以加入清水的处理作为空白对照，感染饲养7天、14天检查死虫数，计算校正死亡率。
对榆蓝叶甲(P.aenescens)室内杀虫活性测定：
剪取合适的榆树叶片，清洗，晾干，用预先稀释好的Bt菌液浸润10s，取出，自然晾干，放入培养皿中，预先在培养皿的底部铺一层浸湿的滤纸用于保湿。用清水处理作为对照。在每个培养皿中分别接入2～3龄的榆蓝叶甲幼虫(黑褐色)30头，每个处理重复三次，用培养皿盖盖好，室温放置(25～28℃)，96h调查幼虫死亡情况。
表1Cry8Na1蛋白对暗黑鳃金龟测结果
表2Cry8Na1蛋白对大黑鳃金龟测结果
表3Cry8Na1蛋白对榆蓝叶甲测结果
表4Cry8Na1蛋白对铜绿丽金龟测结果
本发明的有益效果：本发明分离克隆的Bt cry8Na1基因序列及其基因表达产物能够对鞘翅目害虫产生强毒力，通过cry8Na1基因与cry8Na1、cry8Na1、cry8Na1等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目、鞘翅目害虫的杀虫谱。通过应用于转化微生物和植物，使它们表现出对相关害虫的毒性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。
序列表
Claims (10)
1.苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7，其保藏编号为CGMCC No.4188。
2.权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7在杀灭鞘翅目害虫中的应用。
3.一种从权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌菌株BTQ52-7中分离得到的cry8Na1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
4.权利要求3所述的cry8Na1基因编码的杀虫蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
5.一种表达载体，其特征是含有权利要求3所述的cry8类基因。
6.权利要求5所述的表达载体为pEB 8，其骨架载体为pEB。
7.一种微生物转化体，其特征是含有权利要求3所述的cry8Na1基因。
8.权利要求3所述的cry8Na1基因在抗鞘翅目害虫中的应用。
9.权利要求8所述的应用，是将权利要求3所述的cry8Na1基因表达的蛋白作为生物杀虫剂的有效成分。
10.权利要求8所述的应用，是将权利要求3所述的cry8Na1基因转入到微生物或植物，使之表达对鞘翅目的毒性蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102951183A CN101984045B (zh) | 2010-09-29 | 2010-09-29 | 苏云金芽孢杆菌cry8Na1基因，表达蛋白及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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