CN101413007B - 对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8Ⅰ基因、蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8I基因、蛋白及其应用”属于生物技术领域。从发明从野生菌株BT-SU4菌株中分离得到对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8I基因，其序列如SEQ ID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。该基因表达产物对鞘翅目害虫具有较高毒力，可以解决现在世界上防治鞘翅目害虫所使用的Bt制剂产品以及基因品种单一、害虫易于产生抗性、杀虫谱较窄和毒力较低等不足，这种新的基因可以应用于转化微生物和植物，使之表现对相关害虫的高毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

Description

对鞘翅目害虫高效的苏云金芽胞杆菌cry8Ⅰ基因、蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，涉及对鞘翅目害虫高毒力的cry8I基因的核苷酸序列，涉及对鞘翅目害虫高毒力的蛋白质的氨基酸序列，涉及含有cry8I基因的重组菌株，涉及使用该基因构建表达载体。

背景技术

金龟子属于鞘翅目金龟总科(Scarabaeidae)，其幼虫(俗称蛴螬，本发明以下也简称为“蛴螬”)是一类重要的世界性分布地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、糖料作物、烟草、牧草、花卉、草坪草、果树等多种植物。大量调查表明，蛴螬在地下害虫中的危害居首位，其中主要以鳃金龟科和丽金龟科幼虫为主，占总地下害虫量的70-80％以上。据统计每年全国蛴螬发生面积约1亿亩，严重年份曾达3亿2千万亩，产量损失高达20％以上，有些地块甚至绝产。近年发生面积最大、发生量最多的为黄淮海地区，主要危害粮食、油料等作物；其它地区的危害情况也很严重，如危害甘蔗的蛴螬，在广东、广西、云南、四川、福建等地普遍发生；在西藏、青海、甘肃、新疆等西部地区，蛴螬的发生也很严重(魏鸿钧等，《中国地下害虫》，上海：上海科学技术出版社，1989，1-41；王永祥等，“冀中平原区蛴螬种类及综合防治技术”，《河北师范大学学报》(自然科学版)，1998，22(2)：268-270)。我国多年来为控制蛴螬的危害，一般采用农业、化学、物理等综合防治策略，在一定程度上起到了积极的作用，已经将这类害虫危害控制在较低水平。自2005年起，国内高毒力、高残留剧毒化学农药的禁用，使得地下害虫的防治面临新的问题，蛴螬等过去为害较轻的次要害虫逐渐发展成主要害虫，在局部地区猖獗危害，直接威胁到我国粮食、油料等作物的安全生产。

目前我国油料作物中种植面积居第二位的花生，占世界花生总产量的35％左右，居世界首位，年出口收入达207亿美元，仅2006年全国花生种植面积达到467万公顷，总产量为1434万吨。随着近两年来全球粮油价格飞涨，花生等重要油料作物的高产稳产是关系到社会稳定、粮食和食品安全的头等大事。当前对花生生产威胁最大的就是虫害—蛴螬，直接造成减产和影响花生籽粒品质，危害十分严重。因此，开辟新的有效防治途径，已成为当务之急。

发现和利用对蛴螬高毒力的Bt杀虫基因将是解决这个问题的关键。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌。它在形成芽孢的同时，能产生蛋白性质的伴孢晶体(parasporal crystal)，对鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物具有特异性的杀虫活性(Schnepf，E.N.et al，Microbiol.And Molecular BiologyReview，1998，62：3775-806)。这种杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)又称δ-内毒素(delta-endotoxin)，对人畜无害，不污染环境，因而Bt在害虫的生物防治中得到了最广泛的应用。

目前人们已经克隆了425多种编码杀虫晶体蛋白的Bt杀虫基因(可参见http://www.biols. susx.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/list.html)，它们分属180种模式基因。近年国际上cry8类基因的研究动向引人瞩目。研究表明，这类基因对金龟子科、象甲科、叶甲科等多种鞘翅目害虫具有杀虫作用。1992年，Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有特异杀虫活性的新菌株(B.t.subsp.Japonensis BuiBui)(Ohba，M.et al.，A unique isolate ofBacillus thuringiensis serovar japonensis with a high larvicidal activity specific for scarabaeidbeetles，Letters in Applied Microbiology，1992.14：54-57)，1994年Sato等从中克隆出一种新的杀虫基因cry8C(Sato，R.et al，Cloning，heterologous expression，and localization of a novel crystalprotein gene from Bacillus thuringiensis serovar japonensis strain buibui toxic to scarabaeid insects，Curr.Microbiol.1994.28：15-19.4)。目前已发现20种cry8类基因，编码的蛋白由1160-1210个氨基酸组成，分子量在128-137kDa之间。其中模式基因详细的信息见表1(Asano，S.，Yamanaka，S.and Takeuchi，K.，Protein having insecticidal activity，DNA encoding the protein，andcontrolling agent and controlling method of noxious organisms，2002，JP 2002045186-A and JP2002045186-A/2))。其中美国Mycogen公司分离的Cry8Aa1和Cry8Ba1对金龟科的多种害虫具有明显的杀虫活性(Tracy E.Michaels，et al.，Bacillus thuringiensis toxins active againstscarab pests，1994，USP5554534)。美国从Bt菌株中分离了两种基因cry8Bb1和cry8Bc1基因，发现对西方玉米根叶甲(Western corn rootworm)具有显著的杀虫效果并已用于转基因抗虫玉米的开发(Abad，Andre，R.，Duck Nicholas，B.，Feng，Xiang，Flannagan Ronald，D.，Kahn，Theodore，W.，Sims，Lynne，E.Genes encoding novel proteins with pesticidal activity againstcoleopterans，2002，WO02/34774A2)。在我国筛选获得了对黄褐丽金龟(Anomala exoleta)、铜绿丽金龟(A.corpulenta)、四纹丽金龟(Popillia quadriguttata)、蒙古丽全龟(A.mongolica)、和苹毛丽金龟(Proagopertha lucidula)等害虫幼虫具有特异杀虫活性的Bt菌株HBF-1(冯书亮等，《中国生物防治》，2000，16(2)：74-78)；《植物保护》2006，33(4)：417-422)。中国农业科学院植物保护研究所从HBF-1中克隆到cry8Ca2基因(Shu C，Liu R，Wang R，Zhang J，Feng S，Huang D，Song F.2007.Current Microbiology.55：492-496)。随后该研究所发现了对暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)高活力的、含有cry8Ea1、cry8Fa1两个基因的Bt185菌株(Yu H，Zhang J，Huang D，Song F.Current Microbiology.2006，53：13-17)。目前，cry8Ca2基因(专利号：ZL200410009807.8)、cry8Ea1、cry8Fa1(专利号：ZL200410009808.2)基因已经获得国家发明专利保护，cry8G(申请号：200710118289)和cry8H(申请号：200710120020)基因正在申请专利保护。

因此，筛选分离克隆新的、高毒力的Bt杀虫蛋白基因，将丰富杀虫基因资源，为转基因工程菌和抗虫植物的研制提供新的基因来源，进而提高Bt转基因产品的抗虫效果，并有望降低害虫对Bt毒蛋白的抗性风险，保护和延长转基因产品的使用寿命，具有重要的经济、社会和生态效益。

表1 苏云金芽孢杆菌Cry8类杀虫晶体蛋白的模式基因

发明内容

针对目前世界上防治鞘翅目害虫所使用的Bt制剂产品以及基因品种单一、害虫易于产生抗性、杀虫谱较窄和毒力较低等不足，本发明从国内Bt菌株中分离克隆了新的基因cry8I，该基因表达产物对鞘翅目害虫具有较高毒力，而本发明提供的该基因表达产物的氨基酸序列与已知的Bt Cry蛋白存在显著差异。这种新的基因可以应用于转化微生物和植物，使之表现对相关害虫的高毒性，并克服、延缓害虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生。

对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ia1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。

一种工程菌菌株BioT8I，其特征在于含有cry8Ia1基因。

一种表达载体pSTK-8I，其特征是由cry8Ia1基因序列和穿梭载体pSTK所构建。

对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ia1蛋白，由cry8Ia1基因所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

cry8Ia1基因在植物抗鞘翅目害虫中的应用。

所述的应用，其特征是将cry8Ia1基因转化植物或微生物，使之产生抗鞘翅目害虫的毒性。

所述的应用，其特征是将cry8Ia1基因表达的蛋白制成药剂，用于杀害鞘翅目害虫。

本发明从河北土壤分离得到野生菌株BT-SU4，其保藏编号为CGMCC2071(见专利申请200710120020.2)，其生物学特性为在生长周期中可以产生芽胞，并且同时产生有毒杀作用的伴胞晶体。

根据cry8类基因保守区设计了两对通用引物，两对引物的5-端引物相同：

S8Ca5：5`-GATGAGTCCGAATAATCAGAATGAAT-3`

S8Ca3：5`-TTACTCTTCTTCTAACACGAGTTC-3`

S8Ea3：5`-TTACTCTACGTCAACAATCAATTC-3`

PCR扩增鉴定野生菌株BT-SU4菌株，用S8Ca5与S8Ea3引物对扩增出条带，并用ScaI进行酶切分析，PCR-RFLP结果，其显示条带与已知cry8类基因均不同，表明野生菌株BT-SU4中含有一种新的cry8杀虫基因。

设计一对全长基因引物cry8I5/cry8I3用来扩增全长基因，并且cry8I5引物引入EcoRI用于克隆与表达，引物对cry8I5/cry8I3的序列如下：

cry8I5：5-G ATG AGT CCG AAT AAT CAG AAT

cry8I3：CTC ATT TCT TCT ACA ATC AAT TCT ACA CTG TC

以野生菌株BT-SU4的总DNA为模板，用高保真性能的DNA聚合酶KOD-PLUS(日本TOYOBO产品，购于北京鼎国生物技术有限责任公司)，进行PCR扩增，结果显示扩增出约3.6kb的条带，与克隆载体pBluescrip平端连接，转化大肠杆菌JM110，得到重组质粒pB8I。

对插入片断进行测序分析(如SEQ ID NO 1所示)，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3585 bp，GC含量为38％，编码1195个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有55％(Cry8Ha1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ia1。

根据cry8Ia1全长基因3585bp的核苷酸序列设计一对引物，引物cry8I5引入EcoRI位点，cry8I3由KOD-PLUS扩增平末端，以野生菌株BT-SU4质粒DNA为模板，扩增得到全长基因，插入EcoRI、Eco1CR I(产生平末端)双酶切的Bt表达载体pSTK(8.5kb)中，(该质粒来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可向公众提供)，得到重组质粒pSTK-8I，转化大肠杆菌SCS110，提取质粒，采用Lereclus等转化方法(Lereclus，D.etal，FEMS Microbiology Letters，1989，60：211-217)，转化Bt无晶体突变株HD-73^-(该菌株来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，见李海涛等，农业生物技术学报2005 Vol.13No.6P.787-791，可向公众提供)。对能在卡那霉素抗性平板上生长出的阳性转化子进行多种分子检测，证明转化成功，得到工程菌BioT8I。

将上述工程菌BioT8I于牛肉膏培养基中培养，提取蛋白进行SDS-PAGE电泳分析结果表明工程菌BioT8I中的cry8Ia1基因获得了表达，表达物的分子量为135kDa左右，且能形成椭球形晶体。经Western blot分析结果，cry8Ia1基因在野生菌株BT-SU4亦可以正常表达目的蛋白。

将Bt工程菌株BioT8I接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基培养2天，将野生菌株BT-SU4接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基上培养3天。将菌体离心冷冻干燥，2倍梯度浓度稀释，将90ml菌悬液加入到500g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％，接入金龟子龄幼虫45头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算死亡率。Cry8Ia1蛋白的活性测定表明，表达的Cry8Ia1具有杀暗黑鳃金龟幼虫的活性。

按照本领域技术人员的常规方法，可按该cry8Ia1基因转化相关的微生物和植物，特别是易遭受鞘翅目害虫侵犯的农作物，使之产生抗性，可克服或延缓昆虫对工程菌和转基因植物抗药性的产生，以提高农作物的产量。通过cry8Ia1基因与cry1Ah、cry1Ba、cry3Aa7、cry2Ab等基因表达产物组合，可扩大对鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫的杀虫谱。

附图说明

图1：野生菌株BT-SU4的PCR-RFLP图谱。其中：

M：Lambda DNA/Eco130I(bp)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421；

1-5：野生菌株BT-SU4，cry8Ca2，cry8Ea1，cry8Fa1和cry8Ga1的PCR-RFLP

图2：重组质粒pB8I酶切图谱。其中：

M：Lambda DNA/Eco130I(bp)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421；

1：8I PCR产物

2：重组质粒pB8I EcoR I酶切

3：载体pBluscrip EcoR V酶切

图3：重组质粒pSTK-8I酶切图谱。其中：

M：Lambda DNA/Eco130I(bp)：19329、7743、6223、4254、3472、2690、1882、1489、925、421；

1：cry8Ia1全长基因PCR产物

2：重组质粒pSTK-8I的EcoR I单酶切

3：pSTK空载体EcoR I单切

4：重组质粒pSTK-8I的EcoR I、Sal I双酶切

5：pSTK-8I重组质粒

图4：cry8Ia1基因在Bt无晶体突变株中的表达。其中：

M：蛋白质分子量标准(high range-212kDa，116kDa，97kDa，66kDa，45kDa)

1：HD-73^-

2：BioT8H

3：BioT8I

4：BT-SU4

图5：野生菌株BT-SU4与工程菌Bt BioT8I芽孢晶体的扫描电镜结果，

A为野生菌株BT-SU4，B为工程菌Bt BioT8I；

图6：Western杂交检测cry8I基因在BT-SU4菌株中的表达情况

A：SDS-PAGE；

B：Western blot；

H：蛋白质分子量标准(high range-212_kDa，116_kDa，97_kDa，66_kDa，45_kDa)；

1：野生菌株BT-SU4；

2：Cry8H；

3：HD-73^-；

4：纯化的经蛋白酶消化的Cry8I；

具体实施方式

以下叙述本发明的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。

实施例1、野生菌株BT-SU4中cry基因鉴定

根据cry8类基因保守区设计了两对通用引物，据目前的数据库分析所有的cry8类基因都可以用S8Ca5/S8Ca3，S8Ca5/S8Ea3两对引物扩增得到，引物序列如下：

S8Ca5：5`-GATGAGTCCGAATAATCAGAATGAAT-3`

S8Ca3：5`-TTACTCTTCTTCTAACACGAGTTC-3`

S8Ea3：5`-TTACTCTACGTCAACAATCAATTC-3`

表2是这些基因与引物的同源序列，表3是用这对引物预测的cry8基因扩增产物酶切片段大小，通过这种PCR-RFLP方法可以分别鉴定出将这些基因。

表2 引物与cry8各基因的保守区配对情况及配对区在基因上的位置

表3 cry8的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，30个循环，最后72℃延伸10分钟。

对PCR产物利用ScaI酶切分析，结果(附图1)显示条带是3585bp，与已知cry8类基因的图谱(表3)不同，表明菌株野生中可能含有新的cry8杀虫基因.实施例2、野生菌株BT-SU4中cry8I基因的克隆

设计了一对全长基因引物cry8I5/cry8I3用来扩增全长基因。并且引入在5-端加EcoRI酶切位点用于克隆与表达，引物对cry8I5/cry8I3的序列如下：

cry8I5：gg aat tcg atg agt ccg aat aat cag aat

cry8I3：cgc gtc gac tta cat ttc ttc tac aat caa ttc

以野生菌株BT-SU4的总DNA为模板，用KOD-PLUS DNA聚合酶(日本TOYOBO产品，购于北京鼎国生物技术有限责任公司)，用如下体系进行PCR扩增：

 

10×PCR buffer	5μL
		dNTP(10mM)	1μL
引物对(10mM)	1μL/个
		模板	1uL
KOD-PLUS DNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL

超纯水补至50μL，混匀离心，加石蜡油30μL。

扩增循环：95℃变性5分钟，54℃退火1分钟，68℃延伸3min50s，30个循环，最后68℃延伸10分钟，结果(见附图2)显示扩增出约3.6kb左右的条带，与载体pBluscrip平端连接转化大肠杆菌JM110，得到阳性转化子pB8I。对转化子pB8I进行EcoRI酶切，结果得到约3kb、3.6kb两条带，表明cry8I已经成功插入pBluscrip载体，且是正向插入的。对插入片断进行测序分析，得到序列SEQ ID NO 1，序列全长3585bps，分析表明其含有开放阅读框，ORF1的位置是1-3585，GC含量为51％，编码1195个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2所示。通过Blast结果显示，Cry8Ia1具有Cry类蛋白保守的三个结构域及loop，所对应的序列如下：

Domain I(70-291)：

FAGLSITAKI MDAFDVPGGDIFNGLLEIIG ILWDLQDDTW EAFMEQVEVL IDQKIAEYAR

NLALTNLKGL ENSYKLYLEA LADWKQNPTS SSQERVRTR FRDTDDSLTV FMPSFAVKGY

EVPLLAVYAQ AANLHLLLLR DSVAYGLGWG LSQLNVNDNY NRQVRLTGEY TNHCVSWYTT

GLEKLRGSNA QSWIKFNRYR REMTVMVLDI VALFPNYDAR R

Loop I：YPQ

Domain II(296-516)：

ATTTEL TRLIYTDPHG YTIYSPTSQT TIPWYEYGQS FSEIENVAIQ APRLFRWAQE MQIYTKFVRH

APQESHYWSA HTFSFHHTRD NTKTTLTYGD TSDPISVGTA DLSDLDIYKV SSLVASSWGS

GVRLLVTKAK FEVIYTFNQL WEFNYEPPGI SNFFNQWKNT DTELPIQIVD PPTFGDPNQY

SHRVAYISHA PIQPYSGAFR NYGLVPVFGW SHVSVD

LoopII：RNNT LYADRI

DomainIII(526-665)：

TQIP AVKAVQLSGE PYPVVRGPGF TGGDIARLPN NPNVGLLFNS KVESPSENKR YRVRIRYACA

SGARAIFGGL

601 YLPITVQFNQ TMSTTTPTRY EDFQYVDVSG SFILGNTNVS FSLVPQSANQ TNNLFIDKIE FIPEN同源分析表明该蛋白与Cry8类蛋白具有较高同源性，表4为其同源性数据。由于与已知的Cry8类蛋白氨基酸同源性均低于78％，最高只有55％(Cry8Ha1)，被Bt杀虫晶体蛋白命名委员会命名为Cry8Ia1。

表4 Cry8Ia1与Cry8蛋白同源比较数据

 

Cry8Aa1

Cry8Ba1

Cry8Ca1

Cry8Da1

Cry8Ea1

Cry8Fa1

Cry8Ga1

Cry8Ha1

Cry81a1

48％

48％

48％

47％

49％

49％

50％

55％

本发明进一步分析了Cry8Ia1蛋白的氨基酸组成(见表6)，得知其分子量为135.51kDa，等电点为pH4.93(见表5)，分析了蛋白的生化指标(见表5)

表5 Cry8Ia1蛋白的生化特性

 

分析内容	数据
		蛋白全长	1195aa
分子量	135514.11m.w.
		1毫克蛋白摩尔数	7.379pMoles
1摩尔蛋白消旋系数	189470
		1od A<sub>280</sub>的蛋白浓度	0.72mg/ml
1mg/ml A<sub>280</sub>吸收值	1.40AU
		等电点	4.93
pH7时带电荷值	-41.55

表6 Cry8Ia1蛋白的氨基酸组成

 

氨基酸	数目	质量百分数	频率百分数
				Charged(RKHYCDE)	332	32.90	27.78

 

Acidic(DE)	144	12.87	12.05
				Basic(KR)	101	10.53	845
Polar(NCQSTY)	409	34.57	34.23
				Hydrophobic(AILFWV)	384	31.42	32.13
A Ala	68	3.86	5.69
				C Cys	6	0.46	0.50
D Asp	70	5.93	5.86
				E Glu	74	6.93	6.19
F Phe	49	5.15	4.10
				G Gly	68	3.25	5.69
H His	18	1.78	1.51
				I Ile	68	5.68	5.69
K Lys	38	3.54	3.18
				L Leu	93	7.77	7.78
M Met	17	1.62	1.42
				N Asn	94	7.91	7.87
P Pro	53	3.89	4.44
				Q Gln	62	5.77	5.19
R Arg	63	6.99	5.27
				S Ser	89	5.96	7.45
T Thr	95	7.21	7.95
				V Val	87	6.49	7.28
W Trp	19	2.47	1.59
				Y Tyr	63	7.27	5.27
B Asx	164	13.84	13.72
				ZGlx	136	12.70	11.38

实施例3、cry8Ia1全长基因穿梭载体的构建

设计引物cry8I5/cry8I3，其中5-引物并加上EcoR I酶切位点，3-端由高保真性能的KOD-PLUS聚合酶扩增平末端，PCR扩增条件为94℃1分钟，54℃1分钟，68℃3分钟，30个循环，68℃延伸10分钟，采用高保真性能的KOD-PLUS聚合酶进行扩增。获得了3.6kbcry8Ia1全长片段，如附图3中的泳道1所示。经EcoR I酶切完全反应后，进行电泳，从凝胶中回收该片段，与EcoR I、Eco1CR I(产生平末端)酶切的Bt-E.Coli穿梭载体pSTK载体(该质粒来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，可向公众提供)连接反应，4℃，12小时；取连接产物5μL转化E.coli受体菌JM110，以卡那霉素抗性平板筛选阳性重组质粒。将所获得的阳性重组质粒分别接种于液体LB试管中，37℃230rpm培养12小时，以常用的碱解法提取质粒，经EcoR I、Sal I双酶切后出现8.5kb、749bp、43Ibp(见附图3)，酶切结果与软件对序列的预测结果一致，说明为阳性转化子，对该克隆进行测序，结果表明所构建的表达载体正确，命名为pSTK-8I。

实施例4、Bt工程菌BioT8I的构建与表达蛋白检测

将来自JM110的重组表达克隆pSTK-8I用电激方法转化E.coli甲基化突变株SCS110，电激条件为：2500V，400Ω，25μF，100μL感受态细胞，1μL质粒DNA。37℃温浴1小时，100rpm；从SCS110中提取去甲基化的pSTK-8I质粒。

制备Bt无晶体突变株HD-73^-感受态(该菌株来自于中国农业科学院植物保护研究所生物技术实验室，见李海涛等，农业生物技术学报2005Vol.13No.6P.787-791，可向公众提供)，用电激转化方法将去甲基化的pSTK-8I质粒导入其中。电激条件：2200V，1000Ω，25μF，100μL感受态细胞，1μL质粒DNA。30℃温浴2小时，100rpm；以50μg/mL的卡那霉素平板筛选阳性转化子。经过提取质粒、酶切分析、PCR扩增等分子检测，获得了含有pSTK-8I表达质粒的Bt阳性转化子，将该转化子命名为工程菌BioT8I。

分别将Bt工程菌株BioT8I接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基培养48h，将野生菌株BT-SU4接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基上培养，观察到芽孢的释放和晶体的形成时，取1000μL菌液离心集菌体，超纯水洗一次后悬浮，取10μL胞晶混合物进行扫描电镜的观察和记录，结果(附图5)显示，cry8I基因在Bt无晶体突变株HD-73^-中能正常表达，形成椭球形晶体。其它悬浮物再次离心沉淀，加入50μL超纯水悬浮，加入25μL3×样品缓冲液(925μL上样缓冲液+75μLβ-巯基乙醇)，100℃煮沸10分钟。离心除去沉淀。上样10uL进行SDS-PAGE电泳分析结果。结果(附图4)表明，工程菌BioT8I中的cry8Ia1基因均获得了表达，表达物的分子量为135kDa左右。

为了进一步证明cry8Ia1基因在野生菌株BT-SU4中表达，进行了Western杂交分析。野生菌株BT-SU4、工程菌株BioT8I和对照菌株在100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE，用制备并纯化的Cry8I蛋白的抗体进行Western杂交。Western杂交结果显示BT8菌株中有杂交条带，而作为阴性对照的Cry8H和HD-73^-没有杂交条带。此实验结果表明cry8Ia1基因，在野生菌株BT-SU4中能够表达表达135kDa的蛋白(附图6)。

实施例5、Cry8I蛋白的杀虫活性测定

将Bt工程菌株BioT8I接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基培养2天，将野生菌株BT-SU4接种在牛肉膏蛋白栋液体培养基上培养3天。将菌体离心冷冻干燥，2倍梯度浓度稀释，将90ml菌悬液加入到500g有均匀粗细土豆丝的细土(紫外线灭菌)中，混匀，使土壤含水量保持在18％，接入金龟子龄幼虫45头，以加入清水的处理为空白对照，28℃感染饲养，14天检查死虫数，计算死亡率。结果(见表7)表明工程菌株暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)具有极高的毒杀活性。

表7 Bt工程菌和野生菌株BT-SU4菌株对暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)幼虫杀虫活性测定

注：在结果的浓度单位中，浓度是X毫克菌粉每克土。

附：本发明所涉及的DNA序列和蛋白质序列

SEQ ID NO 1(cry8Ia1基因的核苷酸序列)

1    

 AGTCCGA ATAATCAGAA TGAGTTTGAT ATTATAGATG TACCATCTAA TATTTCTGTA

61   TCCAATAGTT TTGTTAGATA TCCTTTCGCA AATGATCCCA ATCGTACATT ACAAAATACA

121  AATTATAAAG ATTTTTTAAC AATGTCTGAA AAATCTAATT CTGGATATTT AACAGATCCT

181  GAAGCTTTTG ATGATGTCGG TTCAGCGATT TTTGCTGGAC TTAGTATTAC TGCTAAAATC

241  ATGGATGCTT TCGATGTTCC TGGGGGAGAC ATATTTAATG GGTTACTTGA AATCATTGGT

301  ATCCTCTGGG ATCTTCAAGA TGACACATGG GAAGCTTTTA TGGAACAAGT AGAAGTACTG

361  ATTGATCAAA AAATAGCAGA GTATGCAAGA AATCTTGCAC TTACAAATTT AAAAGGATTA

421  GAAAATAGTT ATAAATTATA TTTAGAAGCA CTAGCAGATT GGAAACAAAA TCCTACTAGT

481  CCAAGTTCTC AAGAACGTGT AAGAACAAGG TTCCGCGATA CTGATGATTC TTTAACAGTA

541  TTTATGCCAT CTTTTGCAGT TAAGGGATAT GAAGTTCCCT TATTAGCAGT ATATGCGCAA

601  GCTGCGAATC TGCATTTATT GTTATTGAGA GATTCCGTTG CTTATGGATT AGGATGGGGG

661  CTTTCCCAAC TTAATGTGAA TGATAATTAT AATCGACAAG TACGACTCAC AGGGGAATAT

721  ACAAATCATT GTGTATCATG GTATACAACG GGTTTAGAAA AATTAAGAGG TTCGAATGCT

781  CAGAGTTGGA TTAAATTTAA TCGTTATCGT AGGGAAATGA CAGTGATGGT ACTAGATATA

841  GTTGCTTTAT TTCCTAATTA TGATGCGCGT AGATACCCTC AAGCAACGAC TACAGAACTA

901  ACCAGATTAA TTTATACGGA TCCACATGGT TATACAATTT ATTCACCAAC TTCTCAAACA

961  ACCATACCGT GGTATGAGTA TGGCCAATCT TTCTCAGAAA TAGAAAATGT TGCAATTCAG

1021 GCGCCTAGAC TTTTTAGGTG GGCGCAAGAA ATGCAGATTT ATACAAAATT TGTAAGACAC

1081 GCCCCACAAG AATCTCATTA TTGGTCAGCC CATACCTTTT CATTTCATCA TACTAGAGAT

1141 AATACCAAAA CCACACTAAC ATATGGAGAT ACTTCAGATC CTATATCTGT GGGTACAGCT

1201 GATCTAAGCG ATTTAGATAT ATATAAAGTT TCATCATTGG TTGCATCGAG TTGGGGGTCA

1261 GGAGTTAGAT TACTTGTTAC TAAAGCTAAA TTTGAGGTTA TTTATACATT TAACCAATTA

1321 TGGGAATTTA ATTATGAACC TCCAGGCATA TCCAATTTTT TTAATCAATG GAAAAATACT

1381 GACACAGAAT TACCTATCCA GATAGTCGAC CCACCTACTT TTGGAGACCC TAATCAGTAT

1441 AGTCATAGGG TAGCTTATAT TTCCCACGCT CCAATACAAC CATATTCAGG GGCTTTTAGA

1501 AATTATGGGT TGGTTCCTGT ATTTGGATGG TCGCATGTGA GTGTGGATAG AAATAATACA

1561 CTTTATGCAG ACAGAATTAC TCAAATTCCT GCGGTGAAAG CTGTACAGTT AAGTGGTGAA

1621 CCATATCCAG TTGTACGTGG ACCTGGATTT ACTGGAGGAG ATATAGCCCG ATTACCTAAT

1681 AATCCAAACG TAGGATTATT GTTTAATAGT AAAGTAGAAT CACCTTCAGA AAATAAGAGA

1741 TATCGTGTAC GAATAAGGTA CGCTTGTGCT TCTGGAGCTC GAGCAATTTT TGGTGGATTA

1801 TACTTACCTA TAACAGTCCA ATTTAACCAA ACCATGTCGA CTACTACTCC TACAAGATAT

1861 GAAGATTTTC AATATGTAGA TGTAAGTGGC TCTTTTATAT TAGGAAATAC TAATGTAAGT

1921 TTTTCTTTAG TACCCCAAAG TGCTAATCAA ACTAATAATT TATTTATTGA TAAAATTGAA

1981 TTTATTCCAG AAAACCCAGC ACTTGAAGCA GAAAGCGATT TAGAGGCTGC AAAGAAAGCA

2041 GTAAATGCCT TGTTTACGAA TAGTAAAGAT ACTTTACAGA TAGGTGTGAC AGACTATCAA

2101 ATCAATCAAG CTGCAAATTT AATTGAATGC GTATCCGATG AGGTATATCC AAATGAAAAG

2161 CGATTGTTAT TTGATGCAGT AAAAGAGGCA AAACGACTTA GTACGGCACG TAACTTGCTT

2221 GAAGATACGG ATTTTCATAC AATAAATGGG GGAAATGGAT GGACGGGAAG TACGGGTATT

2281 GAAATTGTGG AAGGAGATAT TCTCTTTAAA GATCGCTCGC TTCGACTTCC AAGTGCGAGA

2341 GAAATAGAGA GAGAAACTTA TCCAACATAT ATCTATCAAA AAATAGAGGA ATCACGATTA

2401 AAACCAAATA CAAGATATAG TTTGAGAGGG TTTATCGGAA GTAGCCAAGA TTTAGAGATA

2461 TATGTCCTTC GTCATCAGGC ATATCGTGTT ATTAAAAATG TTTCAGATAA TCTGTTACCA

2521 AATATGCGCC CTATCAACGC TTGTGGAGGA GTTGACCGAT GCAGTCAACA AAAATATGTG

2581 AATAATTCAT TAGAAGTGAA TAGCGGTTTA TCAAATGGAA TTGGAGCGGC TGACTCTCAT

2641 GAGTTTTCAA TTCATGTGGA TACAGGAGAA CTGAATTATA ATGAGGATAT GGGTATTGGG

2701 GTTGTATTTA AAATCACAAC TACAGATGGG TACGCAACAG TAGGGAATAT TGAATTGGTG

2761 GAAGTGGAAA CGTTATCCGG AGAAGCATTA GAACGTGTGC AAAGACAAGA AAAGCAGTGG

2821 CAGGGCCAAT TGGCGACAAG ACGTAAAGAA ACAGAAACGA GATACGGGCC AGCAAAACAA

2881 GCTATTGATC GTTTATTCGT AGATTTTCAA GATCAACAAC TATCTCGTAG TACAGAAATC

2941 TCAGATTTGA CGGAAGCGCA AAATCTAGTA CAGTCTATTC CTTACGTATA CAATGATATG

3001 TTACCAGAAA TCCCGGGAAT GAACTATACC AGTGTTACAG AGTTAACAAA CAGACTTCAA

3061 CAAGCATGGA ATTTGTATGA CCAGAGAAAT AGCATACAAA ATGGTGATTT CCGAAATGAT

3121 GTAAGTAATT GGAATGTTAC AACTGAAGTC AATATTCAAC AAATGAATGA TACGTCTGTC

3181 CTTGTGATTC CAAATTGGGA TTCGCAAGTG TCACAACAAA TTACCGTTCA ACCAAATCGA

3241 AGATATGTGT TACGTGTTAC CGCAAGAAAA GAAGGAAATG GAGATGGCTA TGTAACCATC

3301 CGTGATGGAG CAAACCATAC AGAAACGCTG ACATTTAATA CATGTGATTA TGATGGAAAT

3361 AGTGTATATA ATAATCAACC ATTAAATGCA AATAATAATG TATATACTAC AAAATCATCA

3421 AATACCAATA GCTATCATAC AAATGGTGTG TATCATGACC AAACTAGCTA TGTTACAAAA

3481 ACAATGGAAT TTACTCCGTA TACGGAGCAA GTCTGGGTTG AGATGAGTGA AACAGAAGGA

3541 GTATTTTATA TAGACAGTGT AGAATTGATT GTAGAAGAAA TGTAA

SEQ ID NO 2(Cry8Ia1蛋白的氨基酸序列)：

1    MSPNNQNEFD IIDVPSNISV SNSFVRYPFA NDPNRTLQNT NYKDFLTMSE KSNSGYLTDP

61   EAFDDVGSAI FAGLSITAKI MDAFDVPGGDIFNGLLEIIG ILWDLQDDTW EAFMEQVEVL

121  IDQKIAEYAR NLALTNLKGL ENSYKLYLEA LADWKQNPTS SSQERVRTR FRDTDDSLTV

181  FMPSFAVKGY EVPLLAVYAQ AANLHLLLLR DSVAYGLGWG LSQLNVNDNY NRQVRLTGEY

241  TNHCVSWYTT GLEKLRGSNA QSWIKFNRYR REMTVMVLDI VALFPNYDAR RYPQATTTEL

301  TRLIYTDPHG YTIYSPTSQT TIPWYEYGQS FSEIENVAIQ APRLFRWAQE MQIYTKFVRH

361  APQESHYWSA HTFSFHHTRD NTKTTLTYGD TSDPISVGTA DLSDLDIYKV SSLVASSWGS

421  GVRLLVTKAK FEVIYTFNQL WEFNYEPPGI SNFFNQWKNT DTELPIQIVD PPTFGDPNQY

481  SHRVAYISHA PIQPYSGAFR NYGLVPVFGW SHVSVDRNNT LYADRITQIP AVKAVQLSGE

541  PYPVVRGPGF TGGDIARLPN NPNVGLLFNS KVESPSENKR YRVRIRYACA SGARAIFGGL

601  YLPITVQFNQ TMSTTTPTRY EDFQYVDVSG SFILGNTNVS FSLVPQSANQ TNNLFIDKIE

661  FIPENPALEA ESDLEAAKKA VNALFTNSKD TLQIGVTDYQ INQAANLIEC VSDEVYPNEK

721  RLLFDAVKEA KRLSTARNLL EDTDFHTING GNGWTGSTGI EIVEGDILFK DRSLRLPSAR

781  EIERETYPTY IYQKIEESRL KPNTRYSLRG FIGSSQDLEI YVLRHQAYRVIKNVSDNLLP

841  NMRPINACGG VDRCSQQKYV NNSLEVNSGL SNGIGAADSH EFSIHVDTGE LNYNEDMGIG

901  VVFKITTTDG YATVGNIELV EVETLSGEAL ERVQRQEKQW QGQLATRRKE TETRYGPAKQ

961  AIDRLFVDFQ DQQLSRSTEI SDLTEAQNLV QSIPYVYNDM LPEIPGMNYT SVTELTNRLQ

1021 QAWNLYDQRN SIQNGDFRND VSNWNVTTEV NIQQMNDTSV LVIPNWDSQV SQQITVQPNR

1081 RYVLRVTARK EGNGDGYVTI RDGANHTETL TFNTCDYDGN SVYNNQPLNA NNNVYTTKSS

1141 NTNSYHTNGV YHDQTSYVTK TMEFTPYTEQ VWVEMSETEG

1181 VFYIDSVELI VEEM^*

Claims (5)

1.对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌cry8Ia1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种工程菌菌株BioT8I，其特征在于含有权利要求1所述的cry8Ia1基因。

3.一种穿梭表达载体pSTK-8I，其特征是由权利要求1所述的cry8Ia1基因序列和穿梭载体pSTK所构建。

4.对鞘翅目害虫高效的苏云金芽孢杆菌Cry8Ia1蛋白，由权利要求1所述的cry8Ia1基因所编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.权利要求1所述的cry8Ia1基因在植物抗鞘翅目害虫中的应用，其特征是将所述的cry8Ia1基因表达的蛋白制成药剂，用于杀害鞘翅目害虫，所述鞘翅目害虫指暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)。

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