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CN103898025A - 一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法 - Google Patents

一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法，杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日2013年11月29日、存活日期2013年11月29日，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612。培养方法，取安徽省九华山附近，东经117度29分,北纬30度39分的土壤，用无菌水悬浮，按梯浓度稀释涂平板，用LB固体培养基培养，稀释划线于LB平板上培养；单菌落接种到摇瓶中培养，与甘油混合，放冰箱保藏，单菌落转接到液体培养基中培养，涂片、结晶紫染色光学显微镜观察确定。

Description

一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法。 
背景技术
据FAO保守估计，全世界每年因线虫危害对粮食和纤维作物造成的损失大约为12%，对蔬菜、花生、烟草和某些果树造成的损失要超过20%，甚至达到50%。据权威专家报道，植物寄生线虫每年造成世界农业生产的损失约1500亿美元。我国每年因线虫造成的损失大约35亿美元。 
目前对植物有害的线虫约有3000多种，而在我国发现的有40多种，其中对作物危害最严重的线虫之一是根结线虫。根结线虫虫体微小，生活在植物体内或土壤中，会随着雨水、劳事操作及病株的转移而转移，防治极为困难。 
防治植物寄生线虫病害的主要方法有化学防治和生物防治。化学药剂大部分为剧毒药物，严重污染环境。生物防治是利用线虫的天敌来控制虫口数量和限制线虫引起的损失，且对人、动物和环境均相对安全，应用前景广阔。生物防治中目前应用最广泛的是苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt），此外还有穿刺巴氏杆菌（Psteuriapenetrans）、假单胞杆菌（Pseudomonas spp.）以及近年发现的坚强芽胞杆菌（Bacillus firmus）等。 
早在1972年，Prasad等首先发现Btβ-外毒素对根结线虫(Root-knot nematode,RKN)的卵和幼虫有很高的活性。之后发现Btβ--外毒素对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、大豆胞囊线虫和酸酱线虫(Panagrellus redivivus)等线虫具有很高的杀虫活性(Ignoff et al.,1977;Devidas et al.,1988)。20世纪80年代中期Bone等发现Bt库斯塔克亚种(subsp.kurstaki)和以色列亚种(subsp.israelensis)对动物寄生线虫蛇形毛圆线虫(Trichostronglus colubriformis)的卵和幼虫有很高的杀虫活性，1988年美国Mycogen公司发现Bt晶体蛋白对根结线虫属(Meloidogyne spp.)、矮化线虫属(Tylenchs spp.)、短体线虫属(Pratylenchus spp.)和滑刃线虫属(Aphlenchoides spp.)等植物。美国Mycogen公司筛选到很多对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，同时也申请了 专利。1993年我们初步筛选到9株对植物寄生线虫有杀虫活性的Bt菌株，这些Bt菌株对甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)、北方根结线虫(M.hapla)、和苎麻短体线虫(P.scribneri)有很高杀虫活性，其中已申请国家专利的菌株是YBT-1532(ZL00-1-16062.1)(余子全等，2007b)。 
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌及其培养方法。 
本发明目的的实现方式为，一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌,苏云金芽胞杆菌NBIN-863Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。 
一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的培养方法，具体步骤如下： 
1）取安徽省九华山附近，东经117度29分,北纬30度39分位置的土壤样品1g，在实验室用1ml无菌水悬浮，按照10-3、10-4、10-5、10-6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液28℃恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28℃条件下培养24h； 
LB固体培养液配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌； 
2）将重复分离纯化到的单菌落接种到5ml LB液体培养基摇瓶中，28℃，200rpm，培养36h， 
所述LB液体培养基配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌； 
3）先用去离子水配置甘油，121℃湿热灭菌30min，水：甘油体积比=1:1； 
4）将步骤2）培养了36h后的500μl菌液与灭菌的500μl50%的甘油等体积混合，混匀后放于-80℃冰箱中保藏； 
5）将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28℃，200rpm，培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察为苏云金芽胞杆菌菌株。 
附图说明
图1是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863在液体LB培养基里生长48h后的显微镜检测图片； 
图2是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的进化树分析图； 
图3是杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863的沉淀SDS-PAGE凝胶电泳图； 
具体实施方式
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。 
杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株形态：平板上生长的单菌落为乳白色雪花状，表面粗糙，生长24h电镜下观察为杆状，生长36h后为染不上色的芽胞和染上色的菱形晶体；生长48h后上清液产生6种蛋白，其中3种为杀虫晶体蛋白，分别是Cry9Aa蛋白（130kDa）、Cry2Aa蛋白(69kDa)及Cry1Ac蛋白(130kDa)（图3）。苏云金芽胞杆菌具有杀南方根结线虫活性。 
本申请人2012年5月10日从安徽省九华山附近，东经117度29分,北纬30度39分的位置采取土壤样品1g，在实验室用1ml无菌水悬浮，按照10-3、10-4、10-5、10-6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液（蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌），28℃恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28℃条件下培养24h。将重复分离纯化到的单菌落接种到5ml LB液体培养基摇瓶中，28℃，200rpm，培养36h。先用去离子水配置50%的甘油（水：甘油体积比=1:1，121℃湿热灭菌30min），将培养了36h后的500μl菌液与灭菌的500μl50%的甘油等体积混合，混匀后放于-80℃冰箱中保藏。将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28℃，200rpm，培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察，显微镜检测图片如图1所示，证实为苏云金芽胞杆菌菌株。 
利用分离杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株获取16S rRNA基因，构建系统发育树，具体实施过程：Bacillus thuringiensis NBIN-863菌株过夜活化培养，1%（V/V）接种量接种至新鲜LB培养基（Sambrook et al.,1989），培养至OD600=0.6,离心收集细胞，按照赛百盛树脂型TM基因组DNA提纯试剂盒操作方法提取基因组DNA。以该基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物（16S-27f：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-1429R：GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增。PCR反应体系为（25μl）：10×扩增缓冲液（含Mg2+1.5mM）2.5μl，dNTP1μl，引物各1μl，模板DNA1μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，加去离子水补足至25μl；PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，25个循环，72℃延伸5min。PCR扩增的16S rDNA经琼脂糖凝胶电泳检测，采用DNA纯化试剂盒按照操作说明进行纯化，并克隆到pMD19-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取阳性克隆，在上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。 
将测序获得的16S rDNA序列在GenBank中进行BLAST比对分析，选取同源性相近的芽胞杆菌16S rDNA序列，利用Clustal X v2.0和MEGA5.1软件进行比对分析并构建图2所示的系统进化树。 
序列表中是分离杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株16S rDNA序列，系统进化树显示NBIN-863与Bacillus thuringiensis L15亲缘关系较近，序列同源性为100%，形成一个簇群，表明从安徽省九华山附近土壤中分离到的菌株属于种Bacillus thuringiensis，进一步命名为Bacillus thuringiensis NBIN-863，提交到GenBank数据库中获得的登录号为KF935650。 
对南方根结线虫二龄幼虫进行生物测定，结果显示Bacillus thuringiensis NBIN-863菌株对南方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力，处理24h后，南方根结线虫死亡率达到了80%以上。发酵液对根结线虫的LC50值为0.1μg/ml，上清液LC50值为0.6μg/ml，沉淀LC50值为1.17μg/ml，如表格1所示。 
表格1菌株Bacillus thuringiensis NBIN-863对南方根结线虫二龄幼虫的LC50值 
在本申请人同日申请的《杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质及其应用》，文件中提到：南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的活性物质为杀南方根结线虫的晶体蛋白基因cry9Aa-like，是一种杀虫晶体蛋白，分子量为98kDa。cry9Aa-like蛋白编码区由2223个碱基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；由741个氨基酸残基组成，具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。杀南方根结线虫的芽胞杆菌活性物质用于南方根结线虫的生物防治。杀线虫晶体蛋白Cry9Aa-like对南方根结线虫半致死浓度为5.92μg/mL；经灌根后的番茄根部根结数量大大减少，根系发达，防治效果为50%。 
Figure IDA0000487440650000011
Figure IDA0000487440650000021

Claims (4)

1.一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌NBIN-863Bacillus thuringiensis NBIN-863，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏中心编号CCTCC NO：M2013612，保藏日2013年11月27日、存活日期2013年11月29日。 
2.根据权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌菌株形态：平板上生长的单菌落为乳白色雪花状，表面粗糙，生长24h电镜下观察为杆状，生长36h后为染不上色的芽胞和染上色的菱形晶体；生长48h后上清液产生6种蛋白，其中3种为杀虫晶体蛋白，分别是Cry9Aa-like蛋白(98kDa)、Cry2Aa蛋白(69kDa)及Cry1Ac蛋白(130kDa)。 
3.根据权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌，其特征在于具有杀南方根结线虫活性。 
4.培养权利要求1所述的一种杀南方根结线虫的苏云金芽胞杆菌的方法，其特征在于具体步骤如下： 
1)取安徽省九华山附近，东经117度29分,北纬30度39分位置的土壤样品1g，在实验室用1ml无菌水悬浮，按照10-3、10-4、10-5、10-6浓度进行稀释涂平板，用LB固体培养液28℃恒温培养箱中倒置培养24h，从平板上挑取单菌落再次稀释划线于LB平板上，28℃条件下培养24h； 
LB固体培养液配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌； 
2)将重复分离纯化到的单菌落接种到5ml LB液体培养基摇瓶中，28℃，200rpm，培养36h， 
所述LB液体培养基配方：蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，溶于1L蒸馏水中，121℃，30min，湿热灭菌； 
3)先用去离子水配置甘油，121℃湿热灭菌30min，水：甘油体积比＝1:1； 
4)将步骤2)培养了36h后的500μl菌液与灭菌的500μl50％的甘油等体 积混合，混匀后放于-80℃冰箱中保藏； 
5)将从LB平板上分离纯化到的单菌落转接到LB液体培养液中，28℃，200rpm，培养48h后，进行涂片、固定、结晶紫染色后，在光学显微镜油镜镜头下进行形态观察为苏云金芽胞杆菌菌株。 
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