DE69637481T2

DE69637481T2 - Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8

Info

Publication number: DE69637481T2
Application number: DE69637481T
Authority: DE
Inventors: Raju Darien KUCHERLAPATI; Aya Menlo Park JAKOBOVITS; Sue Stanford KLAPHOLZ; Daniel G. Redwood City BRENNER; Daniel J. Hillsborough CAPON
Original assignee: Amgen Fremont Inc
Current assignee: Amgen Fremont Inc
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-29
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2016-04-30
Also published as: JP2010057507A; JP2009039127A; KR19990008096A; ATE390933T1; WO1996033735A1; JPH11505523A; EP1709970A1; ES2304786T3; US20120117669A1; US20090149637A1; JP4772092B2; KR20050085971A; CA2219361C; JP2011004751A; AU5632296A; EP0822830B1; US20130117871A1; DE69637481D1; JP2013074891A; EP1978033A2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunologie und besonders die Herstellung von Antikörpern. Genauer betrifft sie die Herstellung von anti-IL-8-Antikörpern über ein Verfahren, das den Schritt der Immunisierung eines transgenen Tiers mit einem Antigen, für das die Antikörper gewünscht sind, einschließt. Das transgene Tier ist so modifiziert worden, dass es im Gegensatz zu den endogenen Antikörpern menschliche Antikörper herstellt.
HINTERGRUND
Die PCT-Anmeldung WO 94/02602 , veröffentlicht am 3. Februar 1994, beschreibt ausführlich die Herstellung von transgenen, nicht-menschlichen Tieren, die so modifiziert sind, dass sie als Antwort auf eine Antigenreizung eher vollständig menschliche Antikörper herstellen als endogene Antikörper. Kurz, die endogenen Loci, die die schweren und leichten Immunglobulinketten codieren, sind in den transgenen Wirten außer Gefecht gesetzt, und Loci, die die menschlichen Proteine für die schwere und leichte Ketten codieren, werden in das Genom eingefügt. Im Allgemeinen wird das Tier, das alle erwünschten Modifikationen aufweist, über Kreuzungszüchtung von intermediären Tieren erhalten, die weniger als den ganzen Satz der Modifikation enthalten. Die bevorzugte Ausführungsform eines nicht-menschlichen Tieres, das in der Patentschrift beschrieben wird, ist eine Maus. Daher werden besonders Mäuse beschrieben, die, wenn ihnen Immunogene verabreicht werden, eher Antikörper mit menschlichen variablen Regionen, einschließlich vollständig menschlicher Antikörper, herstellen, als murine-Antikörper, die für diese Antigene immunspezifisch sind.
Die Verfügbarkeit solcher transgenen Tiere macht neue Verfahren zur Herstellung von vollständig menschlichen Antikörpern möglich. Antikörper mit verschiedenen Immunspezifitäten sind für die therapeutische und diagnostische Verwendung gewünscht. Solche insbesondere für die therapeutische Verwendung und die in vivo-diagnostische Verwendung im Menschen vorgesehenen Antikörper, waren problematisch, da der Ursprung solcher Antikörper nach dem Stand der Technik zu Immunglobulinen führt, die charakteristische Antikörperstrukturen tragen, die von den nicht-menschlichen Wirten hergestellt werden. Solche Antikörper neigen dazu, wenn sie im Menschen verwendet werden, immunogen zu sein.
Die Verfügbarkeit der nicht-menschlichen, immunogen reagierenden transgenen Tiere, die in der vorstehend angeführten WO 94/02602 beschrieben werden, machen eine einfache Herstellung von menschlichen Antikörpern ohne die Notwendigkeit menschliche Wirte einzusetzen möglich.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf anti-IL-8-Antikörper, wie in den Ansprüchen definiert, ausgerichtet. Es wird ein Verfahren zur Herstellung eines vollständig menschlichen Immunglobulins gegen ein spezifisches Antigen oder zur Herstellung eines Analogon dieses Immunglobulins beschrieben, und zwar durch ein Verfahren, das die Immunisierung eines nicht-menschlichen Tieres mit dem Antigen unter Bedingungen, die eine Immunantwort stimulieren, umfasst. Das nicht-menschliche Tier ist dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen unfähig ist, endogene schwere oder leichte Immunglobulinketten herzustellen, aber in der Lage ist, Immunglobuline sowohl mit der menschlichen variablen als auch der konstanten Region herzustellen. In der folgenden Immunantwort stellt das Tier B-Zellen her, die Immunglobuline sezernieren, die vollständig menschlich und spezifisch für das Antigen sind. Das menschliche Immunglobulin der gewünschten Spezifität kann direkt aus dem Tier gewonnen werden, zum Beispiel aus dem Serum, oder primäre B-Zellen können aus dem Tier entnommen und immortalisiert werden. Die immortalisierten B-Zellen können direkt als Quelle der menschlichen Antikörper verwendet werden, oder in einer anderen Ausführungsform können die Gene, die die Antikörper codieren, aus den immortalisierten B-Zellen oder aus den primären B-Zellen aus dem Blut oder dem lymphatischen Gewebe (Milz, Mandeln, Lymphknoten, Knochenmark) der immunisierten Tiere hergestellt und in rekombinanten Wirten mit oder ohne Modifikationen exprimiert werden, um das Immunglobulin oder seine Analoga herzustellen. Außerdem können die Gene, die das Repertoire von Immunglobulinen, das von dem immunisierten Tier hergestellt wird, codieren, verwendet werden, um eine Bank von Immunglobulinen zu erstellen. Dadurch wird das Durchmustern nach solchen variablen Regionen, die die gewünschte Affinität aufweisen, ermöglicht. Clone aus der Bank, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, können dann als Quelle von Nucleotidsequenzen, die die gewünschten variablen Regionen codieren, zur weiteren Manipulation verwendet werden, um Antikörper oder Analoga mit diesen Eigenschaften unter Verwendung von Standardrekombinationsverfahren herzustellen.
Eine immortalisierte, nicht-menschliche B-Zelllinie, abgeleitet aus dem vorstehend beschriebenen Tier, wird offenbart. In einem noch weiteren Aspekt ist die Erfindung auf eine rekombinante Wirtszelle gerichtet, die so modifiziert ist, dass sie das Gen enthält, welches das menschliche, in den Ansprüchen definierte Immunglobulin codiert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung der Herstellung des menschlichen schwere Kette-YACs yH1C.
2 ist eine schematische Darstellung der Herstellung des menschlichen leichte kappa-Kette-YACs yK2.
3 zeigt die Serumtiter von anti-IL-6-Antikörpern einer XenoMouse^TM, die mit menschlichem IL-6 immunisiert wurde und deren Antikörper menschliche leichte κ-Ketten und/oder menschliche schwere μ-Ketten enthalten.
4 zeigt die Serumtiter von anti-TNFα-Antikörpern einer XenoMouse^TM, die mit menschlichem TNFα immunisiert wurde und deren Antikörper menschliche leichte κ-Ketten und/oder menschliche schwere μ-Ketten enthalten.
5 zeigt die Serumtiter von anti-CD4-Antikörpern einer XenoMouse^TM, die mit menschlichem CD4 immunisiert wurde und deren Antikörper menschliche leichte κ-Ketten und/oder menschliche schwere μ-Ketten enthalten.
6 zeigt die Serumtiter einer XenoMouse^TM, die mit 300.19-Zellen, die L-Selectin auf ihrer Oberfläche exprimieren, immunisiert wurde. In dem verwendeten ELISA- Test sind diese Antikörper nachweisbar, wenn sie die konstante Region der menschlichen schweren μ-Ketten tragen.
7 zeigt die Serumtiter einer XenoMouse^TM, die mit 300.19-Zellen, die L-Selectin auf ihrer Oberfläche exprimieren, immunisiert wurde. In dem verwendeten ELISA-Test sind diese Antikörper nur nachweisbar, wenn sie die menschlichen leichten κ-Ketten tragen.
8 zeigt eine FACS-Analyse von menschlichen Neutrophilen, die mit dem Serum einer XenoMouse^TM, die mit menschlichem L-Selectin immunisiert wurde, inkubiert wurden, und die mit einem Antikörper, der mit der Region der menschlichen leichten κ-Kette immunreaktiv ist, markiert wurden.
9 zeigt das Schaubild eines zur Transfektion von Säugerzellen verwendeten Plasmids, um die Herstellung des menschlichen Proteins gp39 zu bewirken.
10 stellt die Serumtitrationskurve von Mäusen dar, die mit CHO-Zellen, die menschliches gp39 exprimieren, immunisiert wurden. Die bei diesem ELISA nachgewiesenen Antikörper müssen mit gp39 immunreaktiv sein und enthalten konstante Regionen der menschlichen schweren μ-Ketten oder menschliche leichte κ-Ketten.
11 ist eine Titrationskurve mit Bezug auf monoclonale Antikörper, die von dem Hybridomclon D5.1 sezerniert werden. Dieser Clon wurde aus einer XenoMouseTM gewonnen, die mit dem Tetanustoxin C (TTC) immunisiert wurde, und enthält die menschliche leichte κ-Kette und die menschliche konstante μ-Region in der schweren Kette.
12: DNA-Sequenz der schweren Kette des monoclonalen anti-Tetanustoxin-Antikörpers D5.1.4 (ein Subclon von D5.1). Mutationen gegenüber der Keimbahn sind eingerahmt.
13: DNA-Sequenz der leichten kappa-Kette des monoclonalen anti-Tetanustoxin-Antikörpers D5.1.4. Mutationen gegenüber der Keimbahn sind eingerahmt.
14 zeigt die Serumtiter von anti-IL-8-Antikörpern einer XenoMouse^TM, die mit menschlichem IL-8 immunisiert wurde und deren Antikörper menschliche leichte κ-Ketten und/oder menschliche schwere μ-Ketten enthalten.
15: Hemmung der IL-8-Bindung an menschliche Neutrophile durch monoclonale anti-menschliches IL-8-Antikörper.
16(A–H): DNA-Sequenzen der schweren Kette und der leichten κ-Kette des anti-IL-8-Antikörpers D1.1 (16A-B), K2.2 (16C-D), K4.2 (16E-F) und K4.3 (16G-H).
AUSFÜHRUNGSWEISEN DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen werden Verfahren beschrieben, die die Verabreichung eines Antigens, für das menschliche Formen von immunspezifischen Reagenzien gewünscht werden, an ein transgenes nicht-menschliches Tier einschließen, das genetisch so verändert wurde, dass es in der Lage ist, menschliche, aber nicht endogene Antikörper herzustellen. Für gewöhnlich ist das Tier so verändert worden, dass die endogenen Loci für die schwere und/oder leichte kappa-Kette in seinem Genom inaktiviert ist, so dass diese endogenen Loci unfähig zur Umlagerung sind, die notwendig ist, um Gene, die Immunglobuline codieren, als Antwort auf ein Antigen herzustellen. Zusätzlich wird das Tier in seinem Genom mindestens einen menschlichen schwere Kette-Locus und mindestens einen menschlichen leichte Kette-Locus stabil aufgewiesen haben, so dass als Antwort auf ein verabreichtes Antigen die menschlichen Loci umgelagert werden können, um Gene zu liefern, die menschliche variable Regionen codieren, die immunspezifisch für das Antigen sind. Die Details zur Herstellung eines solchen, in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren Tieres, werden in der vorstehend angeführten PCT-Anmeldung WO 94/02602 geliefert. Beispiele von YACs für die vorliegende Erfindung können zum Beispiel in Green et al., Nature Genetics, 7:13–21 (1994) gefunden werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der XenoMouse^TM werden das menschliche schwere Kette-YAC, yH1C (1020 kb), und das menschliche leichte Kette-YAC, yK2 (880 kb), verwendet. yH1C umfasst 870 kb der menschlichen variablen Region, die vollständige D- und J_H-Region, menschliche konstante μ-, δ- und γ2-Regionen und den Maus-3'-Enhancer. yK2 umfasst 650 kb der proximalen variablen Region (V_κ) der menschlichen kappa-Kette, die gesamte J_κ-Region und C_κ mit seinen flankierenden Sequenzen, die das kappa-Deletionselement (κde, engl.: kappa deleting element) enthalten. Beide YACs enthalten auch einen menschlichen selektierbaren HPRT-Marker auf ihrem YAC-Vektorarm. Die Herstellung von yH1C und yK2 wurde über Verfahren erreicht, die auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind.
Kurz, YAC-Clone, die Segmente der menschlichen Immunglobulinloci tragen, wurden mittels Durchmustern einer YAC-Bank identifiziert (Calbertsen et al., PNAS, 87:4256 (1990)). Überlappende Clone wurden mittels Rekombination unter Verwendung von Standardtechniken aneinandergefügt (Mendez et al., Genomics, 26:294–307 (1995)). Details der Übersicht zum Zusammenbau von yH1C und yK2 sind in 1 beziehungsweise 2 gezeigt.
yK2 wurde aus den Clonen A80-C7, A210-F10 und A203-C6 der Olson-Bank, beschrieben zum Beispiel in Burke et al., Science, 236:806–812 (1987), Brownstein et al., Science, 244:1348–1351 (1989) und Burke et al., Methods in Enzymology, 194:251–270 (1991), hergestellt.
Der erste Schritt zur Herstellung eines gewünschten Antikörpers ist die Verabreichung des Antigens. Verfahren für solch eine Verabreichung sind gebräuchlich und schließen geeignete Immunisierungsprotokolle und Rezepturen ein, die per se von der Art des Antigens abhängig sind. Es kann notwendig sein, das Antigen mit einem Träger zu versehen, um seine Immunogenität zu verstärken, und/oder Rezepturen beizusteuern, die Adjuvantien enthalten, und/oder mehrfache Injektionen zu verabreichen und/oder den Weg der Immunisierung zu verändern und ähnliches. Solche Verfahren sind Standard und ihre Optimierung wird von den Eigenschaften des bestimmten Antigens, für das immunspezifische Reagenzien gewünscht werden, abhängen.
Der Begriff „immunspezifische Reagenzien", wie hierin verwendet, schließt Immunglobuline und ihre Analoga ein. In diesem Kontext hat der Begriff „Analoga" eine besondere Bedeutung. Er bezieht sich auf Einheiten, welche die vollständigen menschlichen Anteile des Immunglobulins enthalten, die für seine Immunspezifität verantwortlich sind. Insbesondere sind komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) zusammen mit ausreichenden Teilen des Gerüsts (FRs) erforderlich, um zu der geeigneten dreidimensionalen Konformation zu führen. Zu typischen immunspezifischen Analoga von Antikörpern gehören F(ab'')₂-, Fab'- und Fab-Regionen. Modifizierte Formen der variablen Regionen, um zum Beispiel Einzelnketten-F_v-Analoga mit der geeigneten Immunspezifität zu erhalten, sind bekannt. Einen Überblick über solch eine F_v-Konstruktion findet man zum Beispiel in Huston et al., Methods in Enzymology, 203:46–63 (1991). Ebenso ist die Erstellung von Antikörperanaloga mit mehrfachen Immunspezifitäten durch das Koppeln der variablen Regionen von einem Antikörper an jene eines zweiten Antiköpers möglich. Die variablen Regionen mit den vollständig menschlichen Eigenschaften können auch an eine Reihe zusätzlicher Stoffe, die Toxizität, biologische Funktionalität, alternative Bindungsspezifitäten und ähnliches liefern, gekoppelt werden. Die Reste einschließlich der vollständigen menschlichen variablen Regionen, die mittels erfindungsgemäßer Verfahren hergestellt werden, schließen Einzelkettenfusionsproteine, Moleküle, die über kovalente Verfahren gekoppelt sind, mit Ausnahme von solchen, die Peptidbindungen einschließen, und aggregierte Moleküle ein. Zu Beispielen von Analoga, die variable Regionen einschließen, welche kovalent oder nicht-kovalent an zusätzliche Moleküle gebunden sind, gehören solche der nachstehenden, nicht-einschränkenden, veranschaulichenden Liste. Traunecker, A. et al., Int. J. Cancer Supp., Erg. 7:51–52 (1992) beschreiben das bi-spezifische Reagens Janusin, in dem die F_v-Region, gerichtet gegen CD3, an lösliches CD4 oder an andere Liganden wie OVCA und IL-7 gekoppelt ist. Auf ähnliche Weise können die vollständig menschlichen variablen Regionen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt werden, in F_v-Moleküle eingebaut und an alternative Liganden, wie sie in dem angeführten Artikel veranschaulicht wurden, gekoppelt werden. Higgins, P. J. et al., J. Infect Disease, 166:198–202 (1992) beschrieben einen heterokonjugierten Antikörper, zusammengesetzt aus OKT3, das mit einem Antikörper, der gegen eine bestimmte Sequenz in der V3-Region von GP120 gerichtet ist, vernetzt ist. Solche heterokonjugierten Antikörper können auch erstellt werden, indem mindestens die menschlichen variablen Regionen verwendet werden, die in den Immunglobulinen, hergestellt nach den erfindungsgemäßen Verfahren, enthalten sind. Zusätzliche Beispiele von bi-spezifischen Antikörpern schließen jene ein, die von Fanger, M. W. et al., Cancer Treat. Res., 68:181–194 (1993) und von Fanger, M. W. et al., Crit. Rev. Immunol, 12:101–124 (1992) beschrieben wurden. Konjugate, die Immuntoxine sind, einschließlich gewöhnlicher Antikörper, sind auf dem Fachgebiet weithin beschrieben worden. Die Toxine können mittels herkömmlicher Kopplungsverfahren an die Antikörper gekoppelt werden, oder Immuntoxine, die Proteintoxinanteile enthalten, können als Fusionsproteine hergestellt werden. Die Analoga der vorliegenden Erfindung können auf entsprechendem Weg verwendet werden, um solche Immuntoxine zu erhalten. Veranschaulichende Beispiele solcher Immuntoxine sind jene, wie sie von Byers, B. S. et al., Seminars Cell Biol. 2:59–70 (1991) und von Fanger, M. W. et al., Immunol. Today 12:51–54 (1991) beschrieben wurden.
Immunglobuline und Analoga können agonistische Aktivitäten hinsichtlich der Antigene, für die sie immunspezifisch sind, aufweisen, wenn die Antigene Signalübertragungsfunktionen ausführen. Daher kann eine Untergruppe von Antikörpern oder Analoga, die gemäß der beschriebenen Verfahren hergestellt wurden und immunspezifisch für zum Beispiel einen Zelloberflächenrezeptor sind, in der Lage sein in Zellen, die diesen Rezeptor tragen, eine Antwort hervorzurufen, entsprechend der, die von einem nativen Liganden hervorgerufen wird. Des weiteren werden Antikörper oder Analoga, die immunspezifisch für Stoffe sind, die Übergangstadien von chemischen Reaktionen nachahmen, eine katalytische Aktivität aufweisen.
Kurz, die Gene, die die Immunglobuline codieren, welche von den transgenen, erfindungsgemäßen Tieren hergestellt werden, können gewonnen werden und die Nucleotidsequenzen, die die vollständige menschliche variable Region codieren, können gemäß bekannter Verfahren verändert werden, um eine Reihe von Analoga wie jene, die vorstehend beschrieben wurden, bereitzustellen. Zusätzlich können die Immunglobuline selbst, die die menschlichen variablen Regionen enthalten, unter Verwendung von Standardkopplungsverfahren modifiziert werden, um Konjugate bereitzustellen, die die immunspezifischen Regionen beibehalten.
Daher beziehen sich "Analoga" von Immunglobulinen auf die Teile, die jene Bereiche der erfindungsgemäßen Antikörper enthalten, die ihre menschlichen Eigenschaften und ihre Immunspezifität beibehalten. Diese werden genügend menschliche variable Regionen beibehalten, um die gewünschte Spezifität bereitzustellen.
Es werden Verfahren, einschließlich der Verabreichung eines passenden Antigens an transgene Tiere, beschrieben. Die Gewinnung oder Herstellung der Antikörper selbst kann über verschiedene Wege erreicht werden.
Zunächst und am einfachsten können die polyclonalen Antikörper, die von dem Tier produziert und in die Blutbahn sezerniert werden, unter Verwendung bekannter Verfahren gewonnen werden. Aufgereinigte Formen dieser Antikörper können selbstverständlich durch Standardaufreinigungsverfahren leicht aufbereitet werden, die vorzugsweise Affinitätschromatographie mit Protein A, anti-Immunglobulin oder dem Antigen selbst einschließen. Auf jeden Fall werden zur Kontrolle der erfolgreichen Immunisierung die Antikörperspiegel hinsichtlich des Antigens im Serum unter Verwendung von Standardverfahren wie ELISA, RIA und ähnliche überwacht.
Für einige Anwendungen sind nur die variablen Regionen der Antikörper erforderlich. Die Behandlung des polyclonalen Antiserums mit geeigneten Reagenzien, um Fab', Fab oder F(ab'')₂-Anteile zu erzeugen, führt zu Zusammensetzungen, die die vollständigen menschlichen Eigenschaften beibehalten. Solche Fragmente sind ausreichend für den Gebrauch zum Beispiel in immundiagnostischen Verfahren, einschließlich des Koppelns immunspezifischer Anteile von Immunglobulinen an Nachweisreagenzien wie Radioisotope.
In einer anderen Ausführungsform können Immunglobuline und Analoga mit gewünschten Eigenschaften aus immortalisierten B-Zellen hergestellt werden, die aus transgenen Tieren, wie sie in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten werden, oder aus umgelagerten Genen stammen, die diese Tiere in Antwort auf die Immunisierung liefern.
Daher können als Alternative zur Gewinnung der Antikörper direkt aus dem Tier B-Zellen gewonnen werden, normalerweise aus der Milz, aber auch, wenn gewünscht, aus den periphären Blutlymphocyten oder Lymphknoten. Diese können dann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren immortalisiert werden, am häufigsten unter Verwendung des Fusionsverfahrens, das von Köhler und Milstein, Nature, 245:495 (1975) beschrieben wird. Die so erhaltenen Hybridomen (oder auf andere Art und Weise immortalisierte B-Zellen) können dann als einzelne Kolonien gezüchtet und hinsichtlich der Sekretion von Antikörpern der gewünschten Spezifität abgesucht werden. Wie vorstehend beschrieben, kann das Absuchen auch eine Bestätigung der vollständigen menschlichen Eigenschaft des Antikörpers beinhalten. Zum Beispiel kann, wie in den Beispielen nachstehend beschrieben, ein Sandwich-ELISA eingesetzt werden, bei dem der monoclonale Antikörper im Hybridomüberstand sowohl an das Antigen als auch an eine anti-menschliche konstante Region gebunden wird. Nachdem die geeigneten Hybridomen ausgewählt wurden, können die gewünschten Antikörper gewonnen werden, wieder durch die Verwendung von herkömmlichen Verfahren. Sie können quantitativ durch das Züchten von immortalisierten B-Zellen aufbereitet werden, indem herkömmliche Verfahren, entweder in vitro oder in vivo, verwendet werden, um Aszitesflüssigkeit herzustellen. Die Aufreinigung der so erhaltenen monoclonalen Antiköperaufbereitung ist weniger beschwerlich, als im Fall von Serum, da jede immortalisierte Kolonie nur eine einzige Antiköperart sezernieren wird. Auf jeden Fall können Standardaufreinigungsverfahren eingesetzt werden, um den Antikörper von anderen Proteinen im Kulturmedium zu isolieren.
In einer anderen Ausführungsform können, um menschliche Immunglobuline direkt aus der Kultur von immortalisierten B-Zellen, die aus dem Tier stammen, zu gewinnen, die immortalisierten Zellen als Quelle von umgelagerten schwere Kette- und leichte Kette-Loci für die anschließende Expression und/oder genetische Manipulation verwendet werden. Umgelagerte Antikörpergene können von den entsprechenden mRNAs aus revers transkribiert werden, um cDNA herzustellen. Wenn gewünscht, kann die konstante Region der schweren Kette gegen die eines unterschiedlichen Isotyps ausgetauscht oder gänzlich entfernt werden. Die variablen Regionen können verbunden werden, um Einzelketten-F_v-Regionen zu codieren. Mehrere F_v-Regionen können verbunden werden, um eine Bindungsfähigkeit an mehr als ein Ziel zu verleihen, oder chimäre schwere und leichte Ketten-Kombinationen können eingesetzt werden. Sobald das genetische Material zur Verfügung steht, steht dem Aufbau der Analoga, die sowohl ihre Fähigkeit an das gewünschte Ziel zu binden als auch ihre menschlichen Eigenschaften beibehalten, wie vorstehend beschrieben, nichts mehr im Wege.
Sobald das entsprechende genetische Material gewonnen ist, und falls erwünscht modifiziert ist, um ein Analogon zu codieren, können die codierenden Sequenzen, einschließlich jener, die mindestens die variablen Regionen der menschlichen schweren und leichten Kette codieren, in Expressionssysteme eingebaut werden, die auf Vektoren, die in rekombinante Standardwirtszellen transfiziert werden können, enthalten sind. Wie nachstehend beschrieben, kann eine Reihe solcher Wirtszellen verwendet werden; für ein effizientes Prozessieren sind allerdings Säugerzellen vorzuziehen. Zu typischen Säugerzelllinien, die für diesen Zweck nützlich sind, gehören CHO-Zellen, 293-Zellen oder NSO-Zellen.
Die Herstellung des Antikörpers oder Analogons wird dann durch das Züchten des modifizierten, rekombinanten Wirts unter für das Wachstum der Wirtszellen und der Expression der codierenden Sequenzen geeigneten Kulturbedingungen durchgeführt. Die Antikörper werden dann aus der Kultur gewonnen. Die Expressionssysteme werden vorzugsweise so entwickelt, dass sie Signalpeptide enthalten, so dass die daraus entstehenden Antikörper in das Medium sezerniert werden; allerdings ist auch eine intrazelluläre Produktion möglich.
Zusätzlich zu einem rationalen Entwurf modifizierter Formen von Immunglobulingenen zur Herstellung von Analoga kann man sich außerdem Phagen-Display-Verfahren zu Nutze machen, um Banken bereitzustellen, die ein Repertoire von Antikörper mit verschiedenen Affinitäten für das gewünschte Antigen enthalten. Für die Herstellung solcher Repertoires ist es nicht nötig die B-Zellen aus dem immunisierten Tier zu immortalisieren, stattdessen können die primären B-Zellen direkt als DNA-Quelle verwendet werden. Das Gemisch von cDNAs, das aus B-Zellen, die z. B. aus der Milz stammen, erhalten wurde, wird verwendet, um eine Expressionsbank, zum Beispiel eine Phagen-Display-Bank, die in E. coli transfiziert ist, zu erstellen. Die so erhaltenen Zellen werden hinsichtlich ihrer Immunreaktivität gegenüber dem gewünschten Antigen getestet. Verfahren zur Identifizierung von hoch-affinen menschlichen Antikörpern aus solchen Banken werden von Griffiths, A. D., et al., EMBO J., 13:3245–3260 (1994); von Nissim, A. et al. ebd., 692–698 und von Griffiths, A. D., et al., ebd., 12:725–734 beschrieben. Letztendlich werden Clone der Bank, die für das Antigen Bindungsaffinitäten einer gewünschten Stärke erzeugen, identifiziert, und die DNA, die das Produkt codiert, welches für solch eine Bindung verantwortlich ist, wird gewonnen und für eine standardmäßige, rekombinante Expression verändert. Phagen-Display-Verfahren können auch unter Verwendung von zuvor veränderten Nucleotidsequenzen erstellt werden und in ähnlicher Weise durchmustert werden. Im Allgemeinen werden die cDNAs, die die schwere und leichte Kette codieren, unabhängig voneinander bereitgestellt oder werden verbunden, um F_v-Analoga für die Herstellung in der Phagen-Bank zu erzeugen.
Die Phagen-Bank wird dann hinsichtlich der Antikörper mit den höchsten Affinitäten für das Antigen durchmustert und das genetische Material aus dem entsprechenden Clon gewonnen. Weitere Runden der Durchmusterung können die Affinität des ursprünglich isolierten Antikörpers erhöhen. Die vorstehend beschriebenen Veränderungen für die rekombinante Herstellung des Antikörpers oder Modifikationen zur Erzeugung eines gewünschten Analogons können dann eingesetzt werden.
Die Kombination des Phagen-Display-Verfahrens mit der XenoMouse^TM bietet einen signifikanten Vorteil gegenüber früheren Anwendungen des Phagen-Displays. Normalerweise wird, um einen hochgradig menschlichen Antikörper mittels Phagen-Display zu erzeugen, eine kombinatorische Antikörperbank hergestellt, entweder aus menschlichem Knochenmark oder aus peripheren Blutlymphocyten, wie von Burton, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10134–10137 (1991) beschrieben. Unter Anwendung dieser Verfahrensweise ist es möglich gewesen hoch-affine Antikörper gegen menschliche Pathogene aus infizierten Personen zu isolieren, d. h. von Personen, die, wie in Burton, D. R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10134–10137 (1991); Zebedee, S. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3175–3179 (1992) und Barbas III, C. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10164–20168 (1991) beschrieben, „immunisiert" worden sind. Allerdings ist es zur Herstellung von Antikörpern, die mit menschlichen Antigenen reaktiv sind, notwendig gewesen, synthetische Banken zu erstellen (Barbas III C. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4457–4461 (1991); Crameri, A. et al., BioTechniques, 88:194–196 (1995)) oder Banken aus entweder autoimmunen Patienten (Rapoport, B. et al., Immunol. Today, 16:43–49 (1995); Portolano, S., et al., J. Immunol., 151:2839–2851 (1993) und Vogel, M., et al., Eur. J. Immunol., 24:1200–1207 (1994)) oder normalen Personen, d. h. naive Banken (Griffiths, A. D., et al., EMBO J., 13:3245–3260 (1994); Griffiths, A. D., et al., EMBO J., 12:725–734 (1993); Persson, M. A. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:2432–2436 (1991); Griffiths, A. D., Curr. Opin. Immunol., 5:263–267 (1993); Hoogenboom, H. R., et al., J. Mol. Biol., 227:381–388 (1992); Lerner, R. A., et al., Science, 258:1313–1314 (1992) und Nissim, A., et al., EMBO J., 13:692–698 (1994)), zu erstellen. Üblicherweise hat es sich als sehr schwierig erwiesen Antikörper mit hoher Affinität gegenüber menschlichen Proteinen auf diesem Weg zu isolieren. Wie bekannt ist, erfordert die Affinitätsreifung eine somatische Mutation und eine somatische Mutation wiederum ist antigengesteuert. In der XenoMouse wird die wiederholte Immunisierung mit menschlichen Proteinen zu somatischer Mutation führen und folglich zu hoch-affinen Antikörpern. Die Gene, die diese Antikörper codieren, können leicht über PCR, wie in Marks, J. D., et al., J. Mol. Biol., 581–596 (1991) beschrieben, amplifiziert werden und immunspezifische Antikörper mittels Standardpanningverfahren isoliert werden (Winter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433–55 (1994) und Barbas III, C. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978–7982 (1991)).
Wie vorstehend beschrieben, werden die modifizierten oder nicht-modifizierten, umgelagerten Loci unter Verwendung von Standardrekombinationsverfahren verändert, wobei Expressionssysteme erstellt werden, die in einer gewünschten Wirtzelle funktionieren, wie üblicherweise eine Ovarialzelle des chinesischen Hamsters, und das gewünschte Immunglobulin oder Analogon wird unter Verwendung von Standard rekombinationsexpressionsverfahren hergestellt, gewonnen und unter Verwendung herkömmlicher Verfahren aufgereinigt.
Die Anwendung des vorstehenden Verfahrens zur Antikörperherstellung hat eine Aufbereitung von menschlichen immunspezifischen Reagenzien im Hinblick auf Antigene, für die menschliche Antikörper zuvor nicht verfügbar waren, ermöglicht. Die Immunglobuline, die sich aus den vorstehend beschriebenen Verfahren ergeben, und die Analoga machen es möglich, dass neue Zusammensetzungen für den Gebrauch in der Analyse, Diagnose, Forschung und Therapie bereitgestellt werden. Die bestimmte Verwendung wird natürlich von dem hergestellten Immunglobulin oder Analogon abhängen. Im Allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen Verwendungen zeigen, die ähnlich denen von nicht-menschlichen Antikörpern, die gegen das gleiche Antigen gerichtet sind, sind. Zu diesen Verwendungen gehören zum Beispiel die Verwendung als Affinitätsliganden bei der Aufreinigung, als Reagenzien in Immuntests, als Komponenten von Immunkonjugaten und als Therapeutika für die entsprechenden Indikationen.
Insbesondere im Fall von Therapeutika oder Diagnostika für den in vivo-Gebrauch ist es höchst vorteilhaft Antiköper oder ihre Analoga mit vollständigen menschlichen Eigenschaften einzusetzen. Diese Reagenzien vermeiden die unerwünschten Immunantworten, die von Antikörpern oder Analoga hervorgerufen werden, die Eigenschaften aufweisen, die sie als von nicht-menschlichen Arten abstammend kennzeichnen. Andere Unternehmungen, um Antikörper zu „humanisieren", führen nicht zu Reagenzien mit vollständig menschlichen Eigenschaften. Zum Beispiel werden chimäre Antikörper mit murinen variablen Regionen und menschlichen konstanten Regionen leicht hergestellt, aber behalten natürlich murine Eigenschaften in den variablen Regionen. Auch die viel schwierigere Vorgehensweise die variablen Regionen durch Veränderung der Gene, die die Aminosäuresequenzen codieren, welche die Gerüstregionen erzeugen, zu „humanisieren", liefert nicht das gewünschte Ergebnis, da die CDRs, welche normalerweise nicht-menschlichen Ursprungs sind, nicht verändert werden können, ohne die Immunspezifität zu zerstören.
Menschliche Antikörper gegen IL-8 können für die Behandlung oder Vorbeugung eines pathologischen Zustandes oder eines Zustandes, der mit IL-8 in Verbindung steht, verwendet werden. Moore et al., Nature, Bd. 365, (14.10.1993), beschreibt nicht-menschliche anti-IL-8-Antikörper, die eine Reperfusionsverletzung der Lunge verhindern. WO 92/04372 beschreibt Maus-Antikörper gegen IL-8-Peptide. Von polyclonalen Antikörpern wird gezeigt, dass sie die Aktivierung der Neutrophilen hemmen. Zu solchen Leiden gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Tumormetastase, Reperfusionsverletzung, Lungenödem, Asthma, ischämische Erkrankungen wie Herzinfarkt, entzündliche Darmerkrankung (wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa), Enzephalitis, Uveitis, Autoimmunerkrankungen (wie rheumatoide Arthritis, Sjögren-Syndrom, Gefäßentzündung), Knochenentzündung, Gichtarthritis; Nierenentzündung, Nierenversagen, dermatologische Leiden wie entzündliche Dermatitis, Schuppenflechte, vaskulitische Nesselsucht und allergische Gefäßentzündung, Netzhautuveitis, Bindehautentzündung, neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, multiple Sklerose und Hirnhautentzündung, akute Lungenverletzung, Atemnot-Syndrom der Erwachsenen (ARDS), septischer Schock, bakterielle Lungenentzündung, Erkrankungen mit einer Beteiligung der Leucocyten-Diapedese, entzündliche ZNS-Erkrankungen, multiples Organversagen, Alkoholhepatitis, Antigen/Antikörper-Komplex-vermittelte Erkrankungen, Entzündung der Lunge (wie Brustfellentzündung, Alveolitis, Gefäßentzündung, Lungenentzündung, chronische Bronchitis, Bronchiektasie, cystische Fibrose), Behçet-Krankheit, Wegenersche Granulomatose und vaskuläres Syndrom.
Typische Autoimmunerkrankungen, die mit den vorstehend erwähnten Antikörpern und Analoga behandelt werden können, umfassen systemischen Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Schuppenflechte, Sjogren-Sklerodermie, gemischte Bindegewebskrankheit, Dermatomyositis, Polymyositis, Reiter-Syndrom, Behçet-Krankheit, Typ 1-Diabetes, Hashimoto-Thyreoiditis, Graves-Krankheit, multiple Sklerose, Myasthenia gravis und Pemphigus.
Für therapeutische Anwendungen können die Antiköper in einer pharmazeutisch verträglichen Dosierungsform verabreicht werden. Sie können durch jedes Mittel verabreicht werden, das es dem Wirkstoff erlaubt die gewünschte Aktionsstelle zu erreichen, zum Beispiel intravenös wie über Bolusinjektion oder eine kontinuierliche Infusion für eine gewisse Zeitdauer oder über intramuskuläre, subkutane, intraartikuläre, intrasynoviale, intrathekale, orale, topische oder inhalatorische Wege. Die Antikörper können in Form einer Einzeldosis oder während einer Reihe von Behandlungen verabreicht werden.
Für die parenterale Verabreichung können die Antikörper als Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophilisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch verträglichen, parenteralen Träger zubereitet werden. Falls der Antikörper für eine orale Verabreichung geeignet ist, kann die Rezeptur geeignete Zusatzstoffe wie beispielsweise Stärke, Cellulose, Kieselerde, verschiedene Zucker, Magnesiumcarbonat oder Calciumphosphat enthalten. Geeignete Träger werden in der neuesten Auflage von Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, einem Standardwerk auf diesem Gebiet, beschrieben.
Zur Vorbeugung oder Behandlung einer Erkrankung wird die geeignete Dosierung des Antikörpers von bekannten Faktoren abhängen, wie den pharmakodynamischen Eigenschaften des bestimmten Antiköpers, seiner Verabreichungsweise und seinem Verabreichungsweg, dem Alter, Gewicht und Gesundheitszustand des Empfängers, der Art des Zustandes, der behandelt wird, und der Schwere und dem Verlauf des Zustandes, der Häufigkeit der Behandlung, der Begleitbehandlung und der gewünschten physiologischen Wirkung. Die nachstehenden Beispiele sind zur Veranschaulichung der Erfindung vorgesehen, nicht aber dazu die Erfindung einzuschränken.
In diesen Beispielen werden Mäuse, bezeichnet als XenoMouse^TM, für die anfänglichen Immunisierungen verwendet. Eine genaue Beschreibung der XenoMouse^TM findet sich in der vorstehend zitierten PCT-Anmeldung WO 94/02602 . Geeignete Immunisierungsprotokolle für jedes Antigen werden in den spezifischen, nachstehenden Beispielen beschrieben. Die Seren der immunisierten XenoMouse^TM (oder die Überstände der immortalisierten B-Zellen) werden gegen Antigenspezifische menschliche Antikörper titriert, wobei in jedem Fall eine Standardausführung eines ELISAs verwendet wird. In dieser Ausführung wurde das für die Immunisierung verwendete Antigen auf Vertiefungen von Mikrotiterplatten immobilisiert. Die Platten wurden gewaschen und blockiert und die Seren (oder Überstände) wurden als Reihenverdünnung für eine Inkubationsdauer von 1–2 Stunden zugegeben. Nach dem Waschen wurde der gebundene Antiköper, der menschliche Eigenschaften aufweist, nachgewiesen, indem anti-menschliche κ-, μ- oder γ-Kette-Antikbrper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP), für die Dauer von einer Stunde zugegeben wurde. Nach nochmaligem Waschen wurde das chromogene Reagens o-Phenylendiamin (OPD) als Substrat und Wasserstoffperoxid zugegeben, und 30 Minuten später wurden die Platten bei 492 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät gelesen.
Soweit nicht anders angegeben, wurden die Platten mit dem Antigen unter Verwendung eines Plattenbeschichtungspuffers (0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6) beschichtet; der im Test verwendete Blockierungspuffer bestand aus 0,5% BSA, 0,1% Tween 20 und 0,01% Thimerosal in PBS; der bei der Farbentwicklung verwendete Substratpuffer bestand aus Citronensäure 7,14 g/l, Natriumhydrogenphosphat 17,96 g/l; die Entwicklungslösung (kurz vor Gebrauch hergestellt) bestand aus 10 ml Substratpuffer, 10 mg OPD plus 5 ml Wasserstoffperoxid; die Stopplösung (verwendet um die Farbentwicklung zu beenden) bestand aus 2 M Schwefelsäure. Die Waschlösung bestand aus 0,05% Tween 20 in PBS.
BEISPIEL 1
Menschliche Antikörper gegen menschliches IL-8
Drei von fünf XenoMouse^TM im Alter von 8–20 Wochen wurden altersabgestimmt und mit 50 μg menschlichem IL-6 intraperitoneal immunisiert, welches für die erste Immunisierung in unkomplettem Freundschen-Adjuvans und für die folgendem Injektion in komplettem Freundschen-Adjuvans emulgiert war. Die Mäuse erhielten im Abstand von 2–3 Wochen 6 Injektionen. Die Serumtiter wurden nach der zweiten Dosis und nach jeder darauffolgenden Dosis bestimmt. Die Blutentnahmen wurde 6–7 Tage nach den Injektionen aus dem Retrobulbärplexus durchgeführt. Man ließ das Blut für die Dauer von etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen und inkubierte es dann für die Dauer von mindestens 2 Stunden bei 4°C, bevor die Seren getrennt und gesammelt wurden.
Die ELISAs wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt, wobei 100 μl/Vertiefung des rekombinanten, menschlichen IL-6 in einer Konzentration von 2 μg/ml in Beschichtungspuffer verwendet wurden. Die Platten wurden dann bei 4°C über Nacht oder bei 37°C für die Dauer von 2 Stunden inkubiert und dann dreimal in Waschpuffer gewaschen. Der Zugabe von 100 μl/Vertiefung Blockierungspuffer folgte eine Inkubation bei Raumtemperatur für die Dauer von 2 Stunden und erneutes dreimaliges Waschen.
Dann wurden 50 μl/Vertiefung verdünnte Serumproben (und positive und negative Kontrollen) auf die Platten gegeben. Die Platten wurden dann bei Raumtemperatur für die Dauer von 2 Stunden inkubiert und erneut drei mal gewaschen.
Nach dem Waschen wurden 100 μl/Vertiefung von entweder Maus-anti-menschliche μ-Kette-Antikörper, konjugiert mit HRP, 1/2000 in Blockierungspuffer verdünnt, oder Maus-anti-menschliche κ-Kette-Antikörper, konjugiert mit HRP, 1/2000 in Blockierungspuffer verdünnt, zugegeben. Nach einer Inkubationsdauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten drei mal gewaschen und mit dem OPD-Substrat für die Dauer von 10–25 Minuten entwickelt. 50 μl/Vertiefung der Stopplösung wurden dann zugegeben und die Ergebnisse auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei 492 nm abgelesen. Die Verdünnungskurven, die sich aus der Serumtitration der XenoMouse^TM nach 6 Injektionen ergaben, sind in 3 gezeigt. Die Werte in 3 zeigen die Herstellung von anti-IL-6-Antikörper, der mit anti-menschlichem κ-Antikörper und anti-menschlichem μ-Antikörper immunreaktiv und in Serumverdünnungen über 1:1000 nachweisbar ist.
BEISPIEL 2
Menschliche Antikörper gegen menschlichen TNFα
Die Immunisierung und Serumaufbereitung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das menschliche IL-6 gegen den menschlichen rekombinanten TNFα ausgetauscht wurde. Die ELISAs wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme, dass für die anfängliche Beschichtung der ELISA-Platte 100 μl/Vertiefung rekombinanter, menschlicher TNFα in einer Konzentration von 1 μg/ml in Beschichtungspuffer eingesetzt wurde.
Die Verdünnungskurven für Serum aus der XenoMouse^TM, die nach 6 Induktionen erhalten wurden, sind in 4 gezeigt. Wieder werden signifikante Titer einer menschlichen anti-TNFα-Bindung gezeigt.

Die Serumtiter für hγ, hμ und hκ nach einer und zwei Immunisierungen der XenoMouse^TM sind in Tabelle 1 gezeigt. Nach einer Challenge mit TNFα wechselt die XenoMouse^TM die Isotypen von einer vorwiegenden IgM-Antwort in der ersten Immunisierung auf eine Immunantwort mit einer großen IgG-Komponente in der zweiten Immunisierung. TABELLE 2: Anti-TNF-alpha-Serumtiterantworten der XenoMouse-2. Blutentnahme 1: nach 2 Immunisierungen Blutentnahme 2: nach 3 Immunisierungen

XM2		ELISA Serumtiter spezifisch für TNF-alpha
XM2		Titer (via hγ)	Titer (via hμ)	Titer (via hκ)
1	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	500 10,000	3,000 8,000	1,500 15,000
2	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	200 2,700	3,000 5,000	500 1,000
3	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	< 500 15,000	2,000 24,000	1,500 25,000
4	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	₅₀₀ 70,000	2,500 4,000	1,500 72,000
5	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	< 500 1,000	2,500 10,000	1,500 7,000
6	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	1,000 10,000	13,000 24,000	4,500 25,000
7	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	< 500 5,000	2,500 4,000	1,500 9,000
8	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	< 500 2,700	1,000 5,000	500 9,000
9	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	200 40,000	6,000 80,000	4,000 80,000
10	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	200 15,000	2,000 8,000	500 60,000
11	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	1,500 24,000	1,000 2,700	1,500 72,000
12	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	200 10,000	2,000 4,000	1,000 25,000
13	Blutentnahme 1 Blutentnahme 2	500 2,000	30,000 4,000	500 12,000

BEISPIEL 3
Menschliche Antikörper gegen menschliches CD4
Das menschliche CD4-Antigen wurde, wie nachstehend beschrieben, als Oberflächenprotein hergestellt, wobei menschliches CD4ζ auf transfizierten, rekombinanten Zellen verwendet wurde. Menschliches CD4ζ besteht aus der extrazellulären Domäne von CD4, der Transmembrandomäne von CD4 und der cytoplasmatischen Domäne, die den Resten 31-142 der reifen ζ-Kette des CD3-Komplexes entspricht. Menschliches CD4-zeta (F15 LTR), wie in Roberts et al., Blond, 84:2878 (1994) beschrieben, wurde in die basophile Rattenleukämiezelllinie RBL-2H3, beschrieben von Callan, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:10454 (1993), unter Verwendung der Kat-Hochleistungstransduktion, beschrieben von Finer et al., Blond, 83:43 (1994), eingeschleust. Kurz, RBL-2H3-Zellen wurden mit 10⁶ Zellen je Vertiefung in 750 μl DMEM + 20% FBS (Gibco) und 16 μg/ml Polybren mit einem gleichen Volumen eines proviralen Überstandes für die Dauer von 2 Stunden bei 37°C, 5% CO₂ kultiviert. Ein ml Medium wurde entfernt und 750 μl Infektionsmedium und retroviraler Überstand wurden zu jeder Vertiefung zugegeben und die Kulturen über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und in DMEM^low + 10% FBS (FBS, foetal bovine serum, fötales Rinderserum) expandiert, bis genügend Zellen für die Sortierung zur Verfügung standen. Die CD4-zeta transduzierten RBL-2H3-Zellen wurden unter Verwendung des FACSTAR plus (Becton Dickinson) sortiert. Die Zellen wurden hinsichtlich menschlichem CD4 gefärbt, wofür ein Maus-anti-menschliches CD4-PE-Antikörper verwendet wurde, und die Besten 2–3% der exprimierenden Zehen wurden ausgewählt.
Immunisierungen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter Verwendung von 1 × 10 Zellen pro Maus durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Primärinjektion subkutan an der Basis des Nackens erfolgte. Die Mäuse erhielten im Abstand von 2–3 Wochen 6 Injektionen. Das Serum wurde aufbereitet und mittels ELISA, wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert, mit der Ausnahme, dass für die anfängliche Beschichtung der ELISA-Platte 100 μl pro Vertiefung des rekombinanten, löslichen CD4 in einer Konzentration von 2 μg/ml in Beschichtungspuffer verwendet wurde. Die Titrationskurve für Serum aus der XenoMouse^TM nach 6 Injektionen ist in 5 gezeigt. Titer der menschlichen anti-CD4-Reaktivität zeigten sich bei Konzentrationen, die über der einer 1:1000-Verdünnung lagen.
BEISPIEL 4
Menschliche Antiköper gegen menschliches L-Selectin
Das Antigen wurde als ein auf der Oberfläche dargebotenes Protein in C51-Zellen einem stark exprimierenden Clon, abgeleitet aus der Maus-prä-B-Zelle 300.19, die mit Lam-1-cDNA (LAM-1 ist das L-Selectin codierende Gen, Tedder et al., J. Immunol, 144:532 (1990)) transfiziert wurde, oder aus CHO-Zellen, die ähnlich transfiziert wurden, hergestellt. Die transfizierten Zellen wurden unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers sortiert, indem ein anti-Leu-8-Antikörper als Markierung verwendet wurde.
Die C51- und die transfizierten CHO-Zellen wurden in DME 4,5 g/l Glucose mit 10% FKS („FCS", foetal calf serum, fötales Kälberserum) und 1 mg/ml 0418 in 100 mm-Schalen gezüchtet. Die Negativkontrollzellen 3T3-P317 (transfiziert mit den gag/pol/env-Genen des Moloney-Virus) wurden in dem gleichen Medium ohne G418 gezüchtet.
Die primäre Immunisierung wurde ausgeführt durch subkutane Injektion in die Basis des Nackens; die folgenden Injektionen erfolgten intraperitoneal. 70–100 Millionen C51- oder transfizierte CHO-Zellen wurden pro Injektion verwendet, wobei insgesamt 5 Injektionen im Abstand von 2–3 Wochen verabreicht wurden.
Die Seren wurden gesammelt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und mittels ELISA nach einem Protokoll, das ähnlich zu dem in Beispiel 1 ist, analysiert.
Für den ELISA wurden die Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen ausplattiert und für 1–2 Tage, abhängig von der Zellzahl, zu einzelligen Zellschichten wachsen gelassen und für den ELISA verwendet, sobald sie konfluent waren. Die Zellen wurden fixiert, indem sie zuerst mit kaltem 1 × PBS gewaschen wurden und dann die Fixierungslösung (5% Eisessig, 95% Ethanol) zugegeben wurde. Die Platten wurden bei –25°C für die Dauer von 5 Minuten inkubiert und können bei dieser Temperatur aufbewahrt werden, wenn sie mit Plattenabdichtungsmittel verschlossen werden.
Der ELISA wird begonnen, indem die Platten auf Raumtemperatur gebracht und leicht geklopft werden, um die Fixierungslösung zu entfernen, und dann fünf mal mit DMEM-Medium, das 10% FKS enthält, mit 200 μl/Vertiefung gewaschen werden.
Die Vertiefungen wurden mit verschiedenen Serumverdünnungen oder mit positiven oder negativen Kontrollen behandelt. Die Vertiefungen der Positivkontrolle enthielten einen murinen monoclonalen IgG1-Antikörper gegen humanes L-Selectin.
Die Vertiefungen wurden für die Dauer von 45 Minuten inkubiert und die Unversehrtheit der Einzelzellschicht wurde unter dem Mikroskop überprüft. Die Vertiefungen wurden dann mit anti-menschlichen κ-Kette-Antikörper oder anti-menschlichen μ-Kette-Antiköper, konjugiert mit HRP, wie in Beispiel 1 beschrieben, inkubiert. Die Platten wurden dann mit 1% BSA/PBS und nochmals mit PBS gewaschen und die Unversehrtheit der Einzelzellschicht wurde überprüft. Die Platten wurden entwickelt, abgestoppt und, wie vorstehend beschrieben, abgelesen. Die Ergebnisse für das Serum aus XenoMouse^TM sind in den 6 und 7 gezeigt; es wurden menschliche Antikörper sowohl gegen L-Selectin als auch gegen die 3T3-Kontrollzellen erhalten. Allerdings sind die Serumtiter für die L-Selectinexprimierenden Zellen im Vergleich zu den parentalen 3T3-Zellen höher. Diese Ergebnisse zeigen, dass die XenoMouse^TM Antikörper spezifisch gegen L-Selectin herstellt, die menschliche schwere μ-Ketten-Regionen und menschliche leichte κ-Ketten aufweisen.
Die aus den immunisierter XenoMouse^TM gewonnenen Antiseren wurden auch hinsichtlich der Färbung von menschlichen Neutrophilen, die L-Selectin exprimieren, getestet. Die menschlichen Neutrophilen wurden wie folgt hergestellt: Peripheres Blut von normalen Freiwilligen wurde mit 100 E/ml Heparin gewonnen. Etwa 3,5 ml Blut wurden über ein gleiches Volumen eines One-step, Polymorph Gradient (Accurate Chemical, Westbury, NY) geschichtet und für die Dauer von 30 Minuten bei 450 × g und 20°C zentrifugiert. Die Neutrophilenfraktion wurde entfernt und zweimal in DPBS/2% FBS gewaschen.
Die Neutrophilen werden dann gefärbt mit entweder

(1) Antiserum einer XenoMouse^TM, die mit C51-Zellen (die L-Selectin exprimieren) immunisiert wurde,
(2) Antiserum einer XenoMouse^TM, die mit Zellen, die menschliches gp39 exprimieren, immunisiert wurde, als Negativkontrolle

Die gefärbten und gewaschenen Neutrophile wurden mittels FACS analysiert. Die Ergebnisse des Antiserums aus der XenoMouse^TM sind in 8 gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen die Anwesenheit von Antikörpern im Serum einer immunisierten XenoMouse^TM, das vollständige menschliche leichte Ketten, die mit L-Selectin immunreaktiv sind, enthält. Die Negativkontrolle, Antiserum aus Mäusen, die mit gp39 immunisiert wurden, enthält keine Antikörper, die gegenüber den menschlichen Neutrophilen reaktiv sind.
BEISPIEL 5
Menschliche Antikörper gegen menschliches gp39
Gp39 (der Ligand für CD40) wird auf aktivierten menschlichen CD4-T-Zellen exprimiert. Die Seren der XenoMouse^TM, die gemäß diesem Beispiel mit rekombinantem gp39 immunisiert wurden, enthielten vollständig menschliche Antikörper, die immunspezifisch für gp39 sind.
Das Antigen bestand aus stabilen Transfektanten von 300.19-Zellen oder CHO-Zellen, welche die gp39-cDNA, die in den Säugerexpressionsvektor P1K1.HUgp39/IRES NEO cloniert war, wie in 9 gezeigt, exprimieren. CHO-Zellen wurden vor der Transfektion 1:10 in DMEM 4,5 g/l Glucose, 10% FBS, 2 mM Glutamin, MEM, NEAA, ergänzt mit zugegebenem Glycin, Hypoxanthin und Thymidin, aufgeteilt. Die Zellen wurden mit dem gp39-Vektor in einer Konzentration von 9 μg/10 cm-Platte (6 × 10⁵ Zellen) und dem DHFR-exprimierenden Vektor pSV2DHFRs (Subranani et al., Mol. Cell. Biol., 9:854 (1981)) in einer Konzentration von 1 μg/10 cm-Platte unter Verwendung der Calciumphosphattransfektion co-transfiziert. 24 Stunden später wurden die Zellen 1:10 in das Originalmedium, das G418 in einer Konzentration von 0,6 mg/ml enthielt, aufgeteilt. Zellen, die gp39 produzierten, wurden mittels FACS unter Verwendung eines anti-gp39-Antikörpers sortiert.
Mäuse, die wie in Beispiel 1 eingeteilt wurden, wurden mit 300.19-Zellen, die gp39 exprimierten, immunisiert, indem eine primäre Immunisierung subkutan an der Nackenbasis und eine zweite intraperitoneale Injektion alle 2–3 Wochen angewendet wurden. Die Seren wurden für den ELISA-Test, wie in Beispiel 1 beschrieben, geerntet. Die Vorgehensweise beim ELISA erfolgte im Wesentlichen, wie in Beispiel 1 aufgeführt; die Mikrotiterplatten wurden mit CHO-Zellen, die gp39 exprimierten und in einer 100 mm-Platte in DMEM, 4,5 g/l Glucose, 10% FKS, 4 mM Glutamin und Lösung für MEM (100x) mit nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) gezüchtet wurden, beschichtet. Am Vortag des ELISA-Tests wurden die Zellen trypsiniert und in Vertiefungs-Filtrationsplatten mit 10⁵ Zellen/200 μl Vertiefung plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Positivkontrollen waren Maus-anti-menschliches gp39; die Negativkontrollen waren Antiseren aus Mäusen, die mit einem anderen Antigen als gp39 immunisiert waren. Für jeden Test wurden 50 μl der Probe verwendet. Der restliche Test entspricht dem, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Verdünnungskurven für die Seren, die nach 4 Injektionen aus den Mäusen erhalten wurden, die mit gp39, welches auf CHO-Zellen exprimiert wurde, immunisiert waren, sind in 10 gezeigt. Wie zu ersehen, enthielten die Seren eine anti-menschliches gp39-Immunspezifität, die mit anti-menschliche κ- und anti-menschliche μ-Kette-Antikörper, gekoppelt an HRP, nachweisbar ist.
BEISPIEL 6
Herstellung von menschlichen Mak gegen das Tetanustoxin
Die in diesem Beispiel hergestellten Antikörper wurden von Hybridomen sezerniert, die durch das Immortalisieren von B-Zellen aus Xenomäusen, die mit dem Tetanustoxin immunisiert wurden, gewonnen wurden. Das Immunisierungsprotokoll war ähnlich zu dem in Beispiel 1 dargelegten, unter Verwendung von 50 μg Tetanustoxin, das in komplettem Freundschem-Adjuvans für die intraperitoneale erste Immunisierung emulgiert vorlag, gefolgt von anschließenden intraperitonealen Injektionen mit dem Antigen, das in inkomplettem Freundschem-Adjuvans aufgenommen war. Die Mäuse erhielten insgesamt 4 Injektionen im Abstand von 2–3 Wochen.
Nachdem ausreichende Serumtiter des anti-Tetanustoxin C (anti-TTC) erreicht waren, wurde eine letzte Immunisierungsdosis des Antigens in PBS, 4 Tage bevor die Tiere geopfert wurden, gegeben und die Milzen wurden für die Fusion geerntet. Die Milzzellen wurden mit Myelomzellen P3X63-Ag8.653, wie bei Galfre, G. und Milstein, C., Methods in Enzymology, 73:3-46 (1981) beschrieben, fusioniert.
Nach der Fusion wurden die Zellen in DMEM, 15% FKS, welches HAT, ergänzt mit Glutamin, enthält, sowie pen/strep für die Kultur bei 37°C und 10% CO₂ resuspendiert. Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten ausplattiert und für die Dauer von 2 Wochen in HAT-ergänztem Medium gehalten, bevor sie in HAT-ergänztes Medium überführt wurden. Von Vertiefungen, die Hybridome enthielten, wurden die Überstände für eine erste Durchmusterung unter Verwendung eines ELISAs gesammelt.
Der ELISA wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Antigenbeschichtung aus 100 μl/Vertiefung des Tetanustoxin C (TTC)-Proteins in einer Konzentration von 2 μg/ml in Beschichtungspuffer bestand, gefolgt von einer Inkubation bei 4°C über Nacht oder bei 37°C für die Dauer von zwei Stunden. Im ersten ELISA wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, HRP-konjugiertes Maus-anti-menschliches IgM verwendet. Zwei Hybridomata, die gemäß dem ELISA-Test anti-TTC sezernierten, Clon D5.1 und Clon K4.1, wurden für die weitere Analyse verwendet.
Wie in 11 gezeigt, sezerniert der Clon D5.1 vollständiges menschliches anti-TTC, das unter Verwendung eines HRP-konjugierten anti-menschliche μ-Kette-Antikörpers und eines HRP-konjugierten anti-menschliche κ-Kette-Antikörpers nachweisbar ist. Dies wird in 11 bestätigt.
Der von D5.1 sezernierte Antikörper immunreagiert nicht in ELISAs, bei denen TNFα, IL-6 oder IL-8 als immobilisierte Antigene verwendet werden, unter Bedingungen, unter denen Positivkontrollen (Seren von Xenomäusen, immunisiert mit TNFα, IL-6 beziehungsweise IL-8) positive ELISA-Ergebnisse zeigten.
Die vollständige Nucleotidsequenz von den cDNAs, die die schweren und leichten Ketten des monoclonalen Antikörpers codieren, wurden, wie in 12 und 13 gezeigt, bestimmt. PolyA-mRNA wurde aus etwa 10⁶ Hybridomzellen isoliert und verwendet, um unter Verwendung von Zufallshexameren als Primer die cDNA zu gewinnen. Teile des Produktes wurden mittels PCR unter Verwendung entsprechender Primer amplifiziert.
Von der Zelllinie war bekannt, dass sie menschliche leichte κ-Ketten liefert. Für die PCR-Amplifizierung der leichten Kette-codierenden cDNA wurde der Primer HKP1 (5'-CTCTGTGACACTCTCCTGGGAGTT-3') für das Priming von dem Ende der konstanten Region und zwei Oligos in gleicher Menge für das Priming von den variablen Segmenten verwendet; B3 (5'-GAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC-3').
Für die Amplifizierung der schweren Kette des Antikörpers, abgeleitet aus D5.1 (der die menschliche konstante μ-Region enthält), wurde MG-24VI, um von der variablen Region das Priming zu bewirken und μP1 (5'-TTTTCTTTGTTGCCGTTGGGGTGC-3') verwendet, um von dem Ende der konstanten Region das Priming zu bewirken. Mit Bezug auf 12, welche die Sequenz für die schwere Kette des von dem Clon D5.1 sezernierten Antikörpers darlegt, wird gezeigt, dass die schwere Kette aus dem menschlichen, variablen Fragment VH6, der menschlichen Diversitätsregion DN1 und dem menschlichen Verbindungssegment (JH4), geknüpft an die menschliche konstante μ-Region, besteht. Es gab zwei Basenpaarmutation ausgehend von der Keimbahnsequenz in der variablen Region, beide in den CDRs. Zwei weitere Mutationen befanden sich im D-Segment und sechs nicht die Keimbahn betreffende Nucleotidadditionen kamen am D/J-Übergang vor.
Schließlich, mit Bezug auf 13, die die leichte Kette des von D5.1 sezernierten Antikörpers darstellt, werden die menschliche variable κ-Region B3 und die menschliche κ-Verbindungsregion JK3 gezeigt. Es gibt neun Basenpaarunterschiede zur Keimbahnsequenz, drei fallen in CDR1.
BEISPIEL 7
Menschliche Antikörper gegen PTHrp
Gruppen von XenoMouse^TM-2 wurden intraperitoneal entweder mit PTHrp (1-34), konjugiert mit BTG, wie von Ratcliffe et al., J. Immunol. Methods, 127:109 (1990) beschrieben, oder mit PTHrp (1-34), synthetisiert als ein 4-armiges MAP (mehrfach antigenes Peptidsystem, engl.: multiple antigenic peptide system), immunisiert. Die Antigene wurden in CFA (komplettes Freundsches-Adjuvans) emulgiert und i. p. in einer Dosis von 25 μg pro Tier in Intervallen von 2 Wochen injiziert und nach zwei Injektionen wurde Blut entnommen. Die aus diesen Blutentnahmen gewonnene Seren wurden mittels ELISA, wie vorstehend beschrieben, analysiert.

Die Serumtiter für hγ, hμ und hκ nach einer Immunisierung der XenoMouse^TM werden in Tabelle 2 aufgeführt. Bei einer Immunisierung mit PTHrp zeigten die XenoMouseTM bei 5 von 7 Mäusen nach der ersten Blutentnahme geringe Serumtiter, aber bei der Verwendung von PTHrp-MAP zeigten 7 von 7 Mäusen hohe Serumtiter nach der ersten Blutentnahme. TABELLE 1: Anti-PTHrp-Serumtiterantworten der XenoMouse-2. Erste Blutentnahme nach 2 Immunisierungen mit entweder PTHrp-BTG-Konjugat

XM2 PTHrp-BTG- Konjugat	Menschliche Antworten
XM2 PTHrp-BTG- Konjugat	Titer (via hγ)	Titer (via hμ)	Titer (via hκ)
1	< 30	850	100
2	< 30	3,000	50
3	< 30	7,000	1,000
4	< 30	800	200
5	< 30	400	90
6	< 30	500	50
7	< 30	300	50
XM2 PTHrp-MAP	Titer (via hγ)	Titer (via hμ)	Titer (via hκ)
1	< 30	1,000	50
2	< 30	2,500	300
3	< 30	1,200	150
4	150	1,000	270
5	100	2,500	300
6	< 30	1,000	150
7	< 30	4,000	800

BEISPIEL 8
Menschliche Antikörper gegen menschliches IL-8
Die Immunisierung und Serumaufbereitung erfolgte, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Ausnahme, dass menschliches rekombinantes IL-8 als Immunogen verwendet wurde.
ELISA-Tests wurden hinsichtlich des gewonnenen Serums durchgeführt, ebenfalls genauso wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme dass die ELISA-Platten zu Beginn beschichtet wurden, indem 100 μl/Vertiefung rekombinantes menschliches IL-8 in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in Beschichtungspuffer verwendet wurden. Die Ergebnisse der verschiedenen Serumverdünnungen, die nach 6 Injektionen aus den XenoMouse^TM gewonnen wurden, sind in 14 gezeigt. Die menschliche anti-IL-8-Bindung wurde wieder bei Serumverdünnungen mit Konzentrationen, die höher als die einer 1:1000-Verdünnung lagen, gezeigt.
BEISPIEL 9
Herstellung von hoch-affinen menschlichen monoclonalen Antikörpern gegen menschliches IL-8
Gruppen von 4 bis 6 XenoMouse^TM im Alter zwischen 8 bis 10 Wochen wurden verwendet für die Immunisierung und für die Hybridomherstellung. XenoMouseTM wurden intraperitoneal mit 25 μg menschlichem rekombinantem IL-8 (Biosource International, CA, USA) immunisiert, welches für die erste Immunisierung in kompletten Freundschem-Adjuvans (CFA, Sigma) emulgiert wurde. Alle folgenden Injektionen wurden mit dem in unkomplettem Freundschem-Adjuvans (IFA, Sigma) eingebrachtem Antigen durchgeführt. Tiere, die als Milzspender für die Hybridomherstellung verwendet wurden, wurde eine letzte Dosis Antigen in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) 4 Tage vor der Fusion gegeben. Die Serumtiter der immunisierten XenoMouse^TM wurden erstmals nach der zweiten Antigendosis analysiert und von da an, nach jeder Antigendosis. Testblutentnahmen wurden 6 bis 7 Tage nach den Injektionen durch Blutentnahme aus dem Retrobulbärplexus durchgeführt. Man ließ das Blut für die Dauer von etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur gerinnen und inkubierte es dann für die Dauer von mindestens 2 Stunden bei 4°C, bevor die Seren getrennt und gesammelt wurden.
Herstellung der Hybridomata
Milzzellen, die aus zuvor mit Antigen immunisierten XenoMouse^TM gewonnen wurden, wurden mit nicht-sekretorischen NSO-Myelomazellen, die mit bcI-2 transfiziert sind (NSO-bcI-2), wie in Galfre G., et al., Methods in Enzymology, 73:3-46 (1981) beschrieben, fusioniert. Kurz, die Fusion wurde durchgeführt, indem gewaschene Milzzellen und Myelomzellen in einem Verhältnis von 5:1 gemischt und mittels Zentrifugation bei 800 × g behutsam pelletiert wurden. Nach der vollständigen Entfernung des Überstandes wurden die Zellen mit 1 ml 50% PEG/DMSO (Polyethylenglykol MG 1500, 10% DMSO, Sigma) behandelt, welches für die Dauer von 1 Minute zugegeben wurde, das Gemisch wurde weiter für eine Minute inkubiert und graduell mit 2 ml DMEM für die Dauer von 2 Minuten verdünnt und weiter mit 8 ml DMEM für die Dauer von 3 Minuten verdünnt. Der Vorgang wurde bei 37°C unter vorsichtigem, ständigen Rühren durchgeführt. Nach der Fusion wurden die Zellen in DMEM, 15% FKS, welches HAT enthielt, und mit L-Glutamin und pen/strep ergänzt wurde, für die Kultivierung bei 37°C und 10% CO₂ in der Luft resuspendiert. Die Zellen wurden in Flachboden-Mikrotiterschalen mit 96 Vertiefungen plattiert. Die Kulturen wurden in mit HAT ergänztem Medium für die Dauer von 2 Wochen gehalten, bevor sie in mit HAT ergänztes Medium überführt wurden. Die Kulturen werden regelmäßig hinsichtlich Hybridzellwachstum untersucht, und die Überstände von solchen Hybridom-haltigen Vertiefungen wurden für eine erste Durchmusterungsanalyse hinsichtlich der Anwesenheit menschlicher μ-, menschlicher gamma 2- und menschlicher kappa-Ketten in einem Antigenspezifischen ELISA, wie vorstehend beschrieben, gesammelt. Positive Kulturen wurden in Platten mit 48 Vertiefungen überführt und, sobald sie konfluent waren, auf Platten mit 24 Vertiefungen überführt. Die Überstände wurden in einem Antigenspezifischen ELISA hinsichtlich der Anwesenheit menschlicher μ-, menschlicher gamma 2- und menschlicher kappa-Ketten getestet.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, sind mehrere Hybridome, die vollständige menschliche monoclonale Antikörper mit einer Spezifität für menschliches IL-8 sezernieren, aus repräsentativen Fusionen erzeugt worden. In all diesen menschlichen Antikörpern ist die menschliche schwere gamma 2-Kette mit der menschlichen leichten kappa-Kette verbunden. TABELLE 3: ELISA-Bestimmung der schweren und leichten Ketten-Zusammensetzung von menschlichen monoclonalen anti-IL-8 Antikörpern, hergestellt in XenoMouse^TM

Probe ID	Ig-Klasse	Reaktivität gegenüber hIL-8				GesamthIgG (ng/ml)
Probe ID	Ig-Klasse	Titer	Hκ OD (1:1)	mλ OD (1:1)	bγ OD (1:1)	GesamthIgG (ng/ml)
Bkgd			0.08	0.04	0.12
I8D1.1	hIgG2	500	4.12	0.04	4.09	1,159
I8K2.1	hIgG2	200	4.18	0.18	4.11	2,000
I8K2.2	hIgG2	1,000	4.00	0.04	4.00	4.583
I8K4.2	hIgG2	200	3.98	0.04	3.49	450
I8K4.3	hIgG2	200	3.80	0.05	4.09	1,715
I8K4.5	hIgG2	1.000	4.00	0.06	4.00	1.468

Bewertung der kinetischen Konstanten von XenoMous^TM-Hybridomata
Um die kinetischen Parameter dieser Antikörper, insbesondere ihre On- und Off-Raten und ihre Dissoziationskonstanten (KD), zu bestimmen, wurden sie auf dem BIAcore-Instrument (Pharmacia) analysiert. Das BIAcore-Instrument verwendet Plasmaresonanz, um das Binden eines Antikörpers an einen Antigen-beschichteten Gold-Chip zu messen.
BIAcore-Reagenzien und Instrumentierung
Das BIAcore-Gerät, CM5-Sensor-Chips, das grenzflächenaktive Mittel P20 und der Amin-Kopplungs-Kit, welcher N-Hydroxysuccinimid (NHS), N-Ethylen-N-(3-diethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und Enthanolamin enthält, wurden von Pharmacia Biosensor bezogen. Die Immobilisierung von menschlichem rekombinantem IL-8 auf der Sensoroberfläche wurde bei einem geringen Niveau der auf der Oberfläche immobilisierten Antigendichte durchgeführt und wurde gemäß den allgemeinen Herstellerangaben durchgeführt. Kurz, nach dem Waschen und Äquilibrieren des Gerätes mit HEPES-Puffer (HBS; 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0,05% grenzflächenaktives Mittel P20, pH 7,4) wurde die Oberfläche aktiviert und IL-8 für das nachfolgende Binden und die Kinetikstudien immobilisiert. Die Sensoroberfläche wurde mit 5 μl eines Gemisches aus gleichen Volumina NHS (0,1 M) und EDC (0,1 M) aktiviert, welche für die Aktivierung in einer Rate von 10 μl/min über die Oberfläche injiziert wurde, dann wurden 5 μl des Liganden (menschliches rekombinantes IL-8) in einer Konzentration von 12 μg/ml in 5 mM Maleatpuffer, pH 6,0, über die aktivierte Oberfläche injiziert, und schließlich wurden nicht-konjugierte aktive Stellen mit einer Injektion von 35 μl 1 M Ethanolamin blockiert. Die Oberfläche wurde, um nicht-kovalent gebundenen Liganden zu entfernen durch die Injektion von 5 μl 0,1 M HCl gewaschen. Das gesamte Immobilisierungsverfahren wurde mit einem stetigen Fluss von HBS mit 10 μl/min durchgeführt. Etwa 100 Resonanzeinheiten (RU) des Liganden (82 und 139 RU, in getrennten Experimenten) wurden auf dem Sensor-Chip immobilisiert (gemäß den Herstellerangaben entsprechen 1000 RU etwa 1 ng/mm² immobilisiertem Protein).
Diese Liganden-beschichteten Oberflächen werden verwendet, um die Hybridomüberstände hinsichtlich ihres spezifischen Bindens an den Liganden zu analysieren, und für kinetische Studien. Die beste Regenerierungsbedingung für die Dissoziation des Analyten vom Liganden in diesen Sensor-Chips stellte die Injektion von 10 μl 100 mM HCl dar, wobei nach vielen Cyclen der Bindung und Regeneration keine signifikanten Verluste in der Bindung beobachtet werden.
Bestimmung der Dissoziation- und Assoziationsrate und der scheinbaren Affinitätskonstanten der vollständigen menschlichen monoclonalen Antikörper, die spezifisch für IL-8 sind
Die Bestimmung der kinetischen Messungen unter Verwendung des BIAcore, bei dem einer der Reaktionspartner auf der Sensoroberfläche immobilisiert wird, wurde gemäß dem Herstellerprotokoll und, wie in Karlsson et al., „Kinetic analysis of monoclonal antibody-antigen interaction with a new biosensor based analytical system.", J. Immunol. Methods, 145:229 (19910) beschrieben, durchgeführt. Kurz, die Interaktion einzelner Stellen zwischen zwei Molekülen A und B wird durch nachstehende Gleichung beschrieben d[AB]/dt = ka[A][B] – kd[AB],wobei B auf der Oberfläche immobilisiert und A in einer konstanten Konzentration C injiziert wird. Die Antwort entspricht einer Messung der Konzentration des Komplexes [AB] und alle Konzentrationsbegriffe können als Response Units (RU) ausgedrückt werden: dR/dt – kaC(Rmax – R) – kdR,wobei dR/dt der Geschwindigkeit der Signaländerung entspricht, C die Konzentration des Analyten ist, Rmax die maximale Analytenbindungskapazität in RU ist und R das Signal in RU zum Zeitpunkt t ist. In dieser Analyse sind die Werte von ka und kd unabhängig von der Konzentration des immobilisierten Liganden auf der Oberfläche des Sensors. Die Dissoziationsraten (kd) und Assoziationsrate (ka) werden unter Verwendung der Software bestimmt, die vom Hersteller in BIA evaluation 2.1 bereitgestellt wird. Die konstante Dissoziationsrate wurde während der Dissoziationsphase gemessen, die sich bei einer konstanten Pufferflussrate von 45 μl/min über 10 Minuten erstreckte, und zwar nach Beendigung der Injektion der Hybridomüberstände auf die Oberfläche, welche immobilisiertes IL-8 enthielt. Die Assoziationsphase erstreckte sich über 1,25 Minuten bei einer Flussrate von 45 μl/min und der Wert wurde unter Verwendung der zuvor bestimmten kd-Werte in das Modell eingefügt. Mindestens zwei Oberflächen mit unterschiedlichen Mengen eines immobilisierten Liganden wurden verwendet, wobei unterschiedliche Konzentrationen von anti-IL-8-Hybridomüberständen hinsichtlich des Bindens getestet und hinsichtlich ihrer kinetischen Werte analysiert wurden. Die kinetischen Konstanten, die auf diesen beiden Oberflächen bestimmt wurden, sind in Tabelle 4 angegeben. Die Bestimmung der Affinität zeigt, dass diese sehr sind, mit einem Bereich von 7 × 10^–11 bis 2 × 10^–9 M. Dies ist bestens vergleichbar mit den Affinitäten der murinen monoclonalen Mausantikörper, abgeleiten aus normalen Mäusen. TABELLE 4: Kinetische Konstanten der vollständig menschlichen monoclonalen Antikörper (IgG2, kappa), abgeleitet aus XenoMouse^TM II-a, mit einer Spezifität gegen menschliches IL-8, bestimmt mittels BIAcore.
VERFAHREN ZUR ISOLATION VON MENSCHLICHEN NEUTROPHILEN UND TESTS AUF ANTIKÖRPERAKTIVITÄT
Die primäre in vivo-Funktion von II-8 ist es, Neutrophile anzulocken und zu aktivieren.
Neutrophile exprimieren auf ihrer Oberfläche zwei unterschiedliche Rezeptoren für IL-8, bezeichnet als A-Rezeptor und B-Rezeptor. Um zu bestimmen, ob die vollständigen menschlichen Antikörper die Aktivität von IL-8 neutralisieren können, wurden zwei unterschiedliche in vitro-Tests mit menschlichen Neutrophilen durchgeführt. In einem Test wurde die Fähigkeit der Antikörper getestet, die Bindung von radioaktiv-markiertem IL-8 an die neutrophilen IL-8 Rezeptoren zu blockieren. In einem zweiten Test wurden die Antikörper hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, eine IL-8-induzierte Neutrophilenantwort zu blockieren, und zwar die Hochregulation des Integrins Mac-1 auf der Neutrophilenoberfläche. Mac-1 ist aus zwei Polypeptidketten, CD11b und CD18, aufgebaut. Üblicherweise werden anti-CD11b-Antikörper für seinen Nachweis verwendet.
Isolation der Neutrophilen
Menschliche Neutrophile werden entweder aus frisch entnommenem Blut oder Leukocytenmanschette isoliert. Menschliches Blut wird mittels Venenpunktion in sterilen Röhrchen, die EDTA enthalten, gesammelt. Leukocytenmanschetten werden aus der Stanford-Blutbank gewonnen. Sie werden durch Zentrifugation von anti-koaguliertem Blut (bis zu 400 ml) in Plastikbeuteln bei 2600 × g für die Dauer von 10 Minuten bei 20°C mit abgeschalteter Bremse bereitet. Der Plasmaüberstand wird aus dem Beutel abgesaugt und die Leukocytenmanschette, d. h. die obere Zellschicht (40–50 ml/Beutel), wird gesammelt. Eine Einheit Leukocytenmanschette (40–50 ml) wird zu einem Endvolumen von 120 ml mit Ca²⁺-, Mg²⁺-freiem PBS verdünnt. 30 Milliliter Blut oder verdünnte Leukocytenmanschette werden in 50 ml-Zentrifugenröhrchen oben auf eine 20 ml-Schicht von FicoII-Paque Plus (Pharmacia Biotech) überführt. Die Röhrchen werden bei 500 × g für die Dauer von 20 Minuten bei 20°C mit abgeschalteter Bremse zentrifugiert. Der Überstand, die mononucleären Zellen in der Zwischenphase und die Schicht über dem Pellet werden vorsichtig abgezogen. Um die mononucleären Zellen vollständig zu entfernen, wird das Zellpellet, das die Neutrophilen und die Erythrocyten enthält, mit 5 ml PBS resuspendiert und in saubere 50 ml-Röhrchen überführt. Die Zellen werden in Ca²⁺-, Mg²⁺-freiem PBS gewaschen (300 × g für die Dauer von 5 Minuten bei 4°C). Die Erythrocyten werden dann mit Ammoniumchlorid lysiert. Die Zellen werden in 40 ml einer eiskalten Lösung, die 155 mM NH₄Cl und 10 nM EDTA, pH 7,2–7,4, enthält, resuspendiert. Die Röhrchen werden für die Dauer von 10 Minuten auf Eis belassen und gelegentlich wird der Inhalt gemischt und dann bei 300 × g für die Dauer von 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wird in PBS resuspendiert und einmal gewaschen (300 × g für die Dauer von 5 Minuten bei 4°C). Fall sie Erythrocytenlyse unvollständig erscheint, wird die Behandlung mit Ammoniumchlorid wiederholt. Die Neutrophilen werden nochmals gewaschen und entweder in Testmedium (RPMI- 1640, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 5 × 10^–5 2-Mercapthoethanol, 1 × nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und 10 mM HEPES) in einer Dichte von 3 × 10⁷ Zellen/ml oder in einem Bindungspuffer (PBS, welches 0,1% Rinderserumalbumin oder 0,02% NaN₃ enthält) in einer Dichte von 6 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
IL-8 Rezeptor-Bindungstest
MultiScreen-Filterplatten (96 Vertiefungen, Millipore, MADV N6550) werden mit einem PBS-Bindungspuffer, der 0,1% Rinderserumalbumin und 0,02% NaN₃ enthält, bei 25°C für die Dauer von 2 Stunden vorbehandelt. Ein Endvolumen von 150 μl, das 4 × 10⁵ Neutrophile, 0,23 nM [¹²⁵I]-menschliches IL-8 (Amersham, IM-249) und verschiedene Konzentrationen eines Antikörpers, in PBS-Bindungspuffer angesetzt, enthält, wurde zu jeder Vertiefung gegeben, und die Platen wurden für die Dauer von 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden fünf mal mit 200 μl eiskaltem PBS gewaschen, welches durch Absaugen entfernt wurde. Die Filter wurden luftgetrocknet, 3,5 ml Szintillationslösung (Beckman Ready Safe) wurden zugegeben, und Zählimpulse auf dem Filter wurden auf einem Beckman LS6000IC-Zähler bestimmt. Der erhaltene Wert wird als % spezifisch gebundenes [¹²⁵I]-IL-8 dargestellt, der berechnet wird als ZpM in Anwesenheit eines Antikörpers, geteilt durch die ZpM in Anwesenheit von nur PBS-Bindungspuffer und multipliziert mit 100 (15). Alle sechs der getesteten menschlichen monoclonalen anti-IL-8-Antikörper blockierten die IL-8-Bindung an menschliche Neutrophile.
Expressionstest von neutrophilem CD11b (Mac-1)
Menschliches IL-8 in einer Endkonzentration von 10 nM wurde mit verschiedenen Konzentrationen von monoclonalen Antikörpern bei 4°C für die Dauer von 30 Minuten und bei 37°C für weiter 30 Minuten vorinkubiert. Die Neutrophilen (4 × 10⁵/Vertiefung) wurden dem IL-8 in Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern bei 4°C für die Dauer von 90 Minuten ausgesetzt und dann mit PE-konjugiertem Maus-anti-menschliches CD11b-Antikörper (Becton Dickinson) für die Dauer von 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden mit eiskaltem PBS, das 2% fötales Kälberserum enthielt, gewaschen.
Die Fluoreszenz wurde auf einem Becton Dickinson FACscan-Zellanalysator gemessen. In den Experimenten wurde als Positivkontrolle ein monoclonaler Maus-Antikörper gegen menschliches CD11b, erhalten von R&D System, Inc., verwendet, wohingegen aufgereinigtes menschliches Myeloma-IgG2 (Calbiochem) als Negativkontrolle verwendet wurde. Die Expressionsmengen von CD11b auf den Neutrophilen wurde gemessen und als mittlerer Fluoreszenzkanal wiedergegeben. Der mittlere Fluoreszenzkanal, der sich vom Negativkontroll-Antikörper ableitet, wurde von denen der experimentellen Proben subtrahiert.

Wie in Tabelle 5 gezeigt, blockierten fünf der sechs Antikörper die Hochregulation von CD11b in gewissem Maße, wobei drei der fünf eine vollständige Blockierung ergaben. TABELLE 5: Hemmung der CD11b-Expression auf menschlichen Neutrophilen durch monoclonale Antikörper gegen IL-8

Antikörper	Konzentration (nM)	Hemmung der CD11b-Expression (%)
R&D-anti-IL8	333	100
I8K1.1	6	100
I8K2.1	10	60
I8K2.2	32	100
I8K4.2	3	10
I8K4.3	8	100
I8K4.5	5	0
Menschliches IgG2	33	0

Der Hintergrund der CD11b-Expression beträgt 670 (mittlere Fluoreszenz), wohingegen die CD11b-Expression in Anwesenheit von 10 nM menschlichem IL-8 771 beträgt.
Sequenzanalyse von Immunglobulintranskripten, abgeleitet von anti-hIL-8-Hybridomata
Alle Sequenzen stammen durch direkte Sequenzierung von PCR-Fragmenten, die über RT-PCR-Reaktionen aus RNA hergestellt wurden, welche aus den Hybridomata D1.1, K2.2, K4.2 und K4.3 bereitet wurde, wobei menschliche V_H- und menschliche V_κ-Familie spezifische Primer (Marks et al., Euro. J. Immunol., 21:985–991 (1991)) und ein Primer, der entweder für die menschliche konstante gamma 2-Region (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGACTGT-3') oder die menschliche konstante kappa-Region (HKP2; Green et al., Nature Genetics, 7:13–21 (1994)) spezifisch ist, verwendet wurden. In 16A–H wurden beide Stränge der vier Clone sequenziert und analysiert, um die vollständige Sequenz zu erstellen. Alle Sequenzen wurden mittels Alignment mit dem „V BASE sequence directory", Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, GB, analysiert. Die variablen und die Verbindungsregionen werden durch eckige Klammern [ ] angezeigt. Nucleotide, die ein „N" enthalten, weisen auf eine Unsicherheit in der erstellten Sequenz hin.
Basierend auf Sequenzalignments mit Sequenzen, die in der V-Base-Datenbank gefunden wurden, besitzt das schwere Ketten-Transkript aus dem Hybridom D1.1 eine menschliche variable V_H4-21 (DP-63)-Region (7 Punktmutationen wurden im Vergleich mit der Keimbahnsequenz beobachtet), ein menschliches 21-10rc-D-Segment, eine menschliche J_H3-Verbindungregion und eine menschliche konstante gamma 2-Region. Siehe 16A.
Das leichte kappa-Ketten-Transkript aus dem Hybridom D1.1 besteht aus einer menschlichen variablen kappa-Region mit Homologie zu V_κ 08/018 (DPK1) (16 Punktmutationen wurden im Vergleich zur Keimbahnsequenz beobachtet), einer menschlichen J_κ3-Verbinungsregion und einer menschlichen konstanten kappa-Region. Siehe 16B.
Basierend auf Sequenzalignments mit Sequenzen, die in der V-Base-Datenbank gefunden wurden, besitzt das schwere Ketten-Transkript aus dem Hybridom K2.2 eine menschliche variable V_H3-30-Region (3 Punktmutationen wurden im Vergleich mit der Keimbahnsequenz beobachtet), ein menschliches IR3rc-D-Segment, eine menschliche J_H4-Verbindungregion und eine menschliche konstante gamma 2-Region. Siehe 16C.
Das leichte kappa-Ketten-Transkript aus dem Hybridom K2.2 besteht aus einer menschlichen variablen kappa-Region mit Homologie zu V_κIV (B3; DPK24) (9 Punktmutationen wurden im Vergleich zur Keimbahnsequenz beobachtet), einer menschlichen J_κ3-Verbinungsregion und einer menschlichen konstanten kappa-Region. Siehe 16D.
Basierend auf Sequenzalignments mit Sequenzen, die in der V-Base-Datenbank gefunden wurden, besitzt das schwere Ketten-Transkript aus dem Hybridom K4.2 eine menschliche variable V_H4-34-Region (8 Punktmutationen wurden im Vergleich mit der Keimbahnsequenz beobachtet), ein menschliches K1-D-Segment, eine menschliche J_H4-Verbindungregion und eine menschliche konstante gamma 2-Region. Siehe 16E.
Das leichte kappa-Ketten-Transkript aus dem Hybridom K4.2 besteht aus einer menschlichen variablen kappa-Region mit Homologie zu V_κ 08/018 (DPK1) (6 Punktmutationen wurden im Vergleich zur Keimbahnsequenz beobachtet), eine menschliche J_κ4-Verbinungsregion und eine menschliche konstante kappa-Region. Siehe 16F.
Basierend auf Sequenzalignments mit Sequenzen, die in der V-Base-Datenbank gefunden wurden, besitzt das schwere Ketten-Transkript aus dem Hybridom K4.3 eine menschliche variable V_H5-51 (DP-73)-Region, ein menschliches M5-a/M5-b-D-Segment, eine menschliche J_H4-Verbindungregion und eine menschliche konstante gamma 2-Region. Siehe 16G.
Das leichte kappa-Ketten-Transkript aus dem Hybridom K4.3 besteht aus einer menschlichen variablen kappa-Region mit Homologie zu V_κ 02/012 (DPK9) (9 Punktmutationen wurden im Vergleich zur Keimbahnsequenz beobachtet), einer menschlichen J_κ4-Verbinungsregion und einer menschlichen konstanten kappa-Region. Siehe 16H.
Biologische Hinterlegungen
yH1C, welches in S. cerevisiae enthalten ist, wurde bei American Type Culture Collection („ATCC"), 12301 Parklaven Drive, Rockville MD 20852, USA, am 26. April 1996 hinterlegt und erhielt die ATCC-Zugangsnummer 74367. Die Hinterlegung dieses YACs dient nur einem beispielhaftem Zweck und sollte nicht als Zugeständnis des Anmelders betrachtet werden, dass solch eine Hinterlegung notwendig ist für die Umsetzung des beanspruchten Gegenstands.
In Bezug auf alle benannten Staaten, in denen ein derartiger Vorgang möglich ist, und soweit es unter der Gesetzgebung des benannten Staates legal zulässig ist, wird beantragt, dass eine Probe des hinterlegten Mikroorganismus nur durch die Herausgabe davon an einen unabhängigen Experten in Übereinstimmung mit dem maßgeblichen Patentrecht, z. B. EPC Regel 28(4) zugänglich gemacht wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Antikörper oder Antigen-bindender Bereich davon, welcher spezifisch IL-8 bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region, des D-Segments und der Binderegion wie in 16A gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region und der Binderegion wie in 16B gezeigt codiert wird; (b) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region, des D-Segments und der Binderegion wie in 16C gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region und der Binderegion wie in 16D gezeigt codiert wird; (c) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region, des D-Segments und der Binderegion wie in 16E gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region und der Binderegion wie in 16F gezeigt codiert wird; und (d) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region, des D-Segments und der Binderegion wie in 16G gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch Nucleotide der variablen Region und der Binderegion wie in 16H gezeigt codiert wird.
Antikörper oder Antigen-bindender Bereich davon, welcher spezifisch IL-8 bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16A gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16B gezeigt codiert wird; (b) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16C gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16D gezeigt codiert wird; (c) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16E gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16F gezeigt codiert wird; und (d) einem Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon, wobei die schwere Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16G gezeigt codiert wird, und wobei die leichte Kette die Aminosäuresequenz umfasst, welche durch die Nucleinsäuresequenz wie in 16H gezeigt codiert wird.
Antikörper oder Antigen-bindender Bereich davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper oder Antigen-bindende Bereich davon IL-induzierte MAC-1 (CD11b)-Expression auf Neutrophilen reduziert.
Zelle, welche den Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 produziert.
Zelle nach Anspruch 4, wobei die Zelle abgeleitet ist aus einem nicht-menschlichen Säuger, welcher mit IL-8 immunisiert wurde, wobei der Säuger in der Lage ist, einen vollständigen menschlichen Antiköper gegen ein Antigen von Interesse zu bilden.
Zelle nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei die Zelle cDNAs exprimiert, welche den Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon codieren.
Verfahren zur Herstellung des Antikörpers oder Antigen-bindenden Bereichs davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend den Schritt der Züchtung der Zelle nach einem der Ansprüche 4 bis 6 und der Gewinnung des Antikörpers oder Antigenbindenden Bereichs davon.
Nucleinsäuremolekül, welches den Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon nach den Ansprüchen 1 bis 3 codiert.
Wirtszelle, umfassend das Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 8.
Arzneimittel, umfassend den Antikörper oder Antigen-bindenden Bereich davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Verwendung des Antikörpers oder Antigen-bindenden Bereichs davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Herstellung eines Medikaments zur Reduzierung der Bindung von IL-8 an Neutrophile.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei IL-8 mit dem Antikörper oder Antigenbindenden Bereich davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in Kontakt gebracht werden soll.