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KR20190096459A - 항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 - Google Patents

항-ｖｅｇｆ／ｄｌｌ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도 Download PDF

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KR20190096459A
KR20190096459A KR1020197023545A KR20197023545A KR20190096459A KR 20190096459 A KR20190096459 A KR 20190096459A KR 1020197023545 A KR1020197023545 A KR 1020197023545A KR 20197023545 A KR20197023545 A KR 20197023545A KR 20190096459 A KR20190096459 A KR 20190096459A
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KR
South Korea
Prior art keywords
seq
binding protein
vegf
dll4
cancer
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020197023545A
Other languages
English (en)
Inventor
조나단 에이. 힉슨
디애너 엘. 하쉬
수프리아 굽타
라비 샤리
카멜리아 자미르
지지에 구
도미니크 제이. 앰브로시
수잔 이. 라페
잉춘 리
루이 나우모프스키
셴화 차오
Original Assignee
애브비 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49578592&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20190096459(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 애브비 인코포레이티드 filed Critical 애브비 인코포레이티드
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Abstract

다가이고 다중 특이적인 결합 단백질, 상기 결합 단백질의 제조 방법, 및 이상 DLL4 및/또는 VEGF 발현 또는 활성을 특징으로 하는, 암, 종양, 및/또는 다른 혈관신생-의존적 질환의 진단, 모니터링, 억제, 예방 및/또는 치료시의 상기 결합 단백질의 용도가 본원에 개시된다.

Description

항-ＶＥＧＦ／ＤＬＬ4 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도{ANTI-VEGF/DLL4 DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF}
본 출원은, 2012년 11월 1일에 출원된 U.S. 가특허출원 제61/721,072호 및 2013년 3월 15일에 출원된 U.S. 가특허출원 제61/787,927호에 대한 35 U.S.C. §119 하의 우선권의 이익을 주장하고, 이들 문헌 둘 다 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
다가이고 다특이적인 결합 단백질, 상기 결합 단백질의 제조 방법, 및 암, 종양, 및/또는 기타 혈관신생-의존적 질환의 진단, 억제, 예방 및/또는 치료에서의 이들의 용도가 본원에 개시되어 있다.
조작된(engineered) 단백질, 예를 들면, 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있는 다특이적 결합 단백질이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 다특이적 결합 단백질은, 세포 융합, 화학적 접합, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 다양한 다특이적 결합 단백질 구조가 당해 분야에 공지되어 있지만; 다수의 이러한 구조 및 방법은 독특한 난점을 갖는다.
이특이적 항체는, 쿼드로마 기술을 이용하여 생산되어 왔다. 그러나, 이러한 기술로의 미스-페어드(mis-paired) 부산물의 존재 및 유의하게 감소된 생산 수율은, 정교한 정제 절차가 요구됨을 의미한다. 또한, 이특이적 항체는 2개의 상이한 mAb들의 화학적 접합에 의해 생산될 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 균질한 제제(preparation)를 수득하지 않는다.
이전에 사용된 다른 접근법들은, 2개의 모 항체들의 이종-이기능성 가교링커와의 커플링, 탠덤 단일쇄 Fv 분자, 디아바디(diabody), 이특이적 디아바디, 단일쇄 디아바디, 및 디-디아바디(di-diabody)의 생산을 포함한다. 그러나, 각각의 이들 접근법들은 난점을 갖는다. 또한, IgG의 중쇄에 2개의 Fab 리피트(repeat)들을 포함하고 4개의 항원 분자들을 결합시킬 수 있는 다가의 항체 작제물이 기술되어 있다(PCT 공보 제 WO 0177342호 및 문헌[Miller et al. (2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61]을 참조한다).
리간드-수용체 시스템은 공동-발달하여 특이성을 유지하였다. 이들의 상호작용은, 특정 생물학적 활성을 위한 특이적 신호전달을 활성화시킨다. 그러나, 비-리간드-수용체 결합 단백질, 예를 들면, 단일-특이적 항체, 이-특이적 또는 다-특이적 결합 단백질, 비경쟁적 항체 조합 또는 수용체의 세포외 도메인(ECD)에 대한 다른 수용체 결합 단백질은, 수용체 리간드-결합 부위와 별개인 에피토프를 인식할 수 있다. 수용체의 ECD 상의 이러한 별개의 에피토프(들)에 대한 결합은 세포내 도메인에 입체배좌 변화를 도입할 수 있고, 이는, 신규한 예측되지 않은 신호전달 캐스케이드를 초래할 수 있다.
US 특허 제7,612,181호(이의 전문이 본원에 참조로 포함됨)는, 높은 친화도를 갖는 2개 이상의 항원들을 결합시킬 수 있는 결합 단백질의 신규한 패밀리를 제공하고, 이는 이원 가변 도메인 결합 단백질(DVD 결합 단백질) 또는 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig™)이라고 칭한다. DVD 분자는, 동일한 분자 또는 2개의 상이한 분자 상의 2개의 별개의 에피토프들을 동시에 결합시킬 수 있는 4가의 이원-특이적 Ig-유사 단백질이다. DVD는, 2가 항체의 N-말단에 융합된 2개의 가변 도메인들로 이루어진 고유한 결합 단백질이다. 가변 도메인들은, 서로 직접적으로 융합되거나 다양한 길이 및 아미노산 조성의 합성 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다. DVD들은 온전하고 기능성인 Fc 도메인들을 이용하여 조작될 수 있고, 이어서, 이는 적절한 이펙터 기능을 매개하는 것을 가능하게 한다. 항체 쌍 선택의 유연성, 2개의 항원-결합 도메인의 배향 및 이들을 연결하는 링커의 길이에 기인한 DVD 포맷은, 신규한 치료학적 양상(therapeutic modality)을 가능하게 할 수 있다.
당해 분야에는 각종 구조들이 제공되지만, 이점 및 난점을 갖는 몇몇의 특정 작제물들은, 특이적 특성을 갖는 다가의 결합 단백질을 제조하기 위해 요구되고, 이는 특정 표적에 결합한다. 추가로, 새로운 가변 도메인 서열은 결합 단백질의 특성을 추가로 개선시킬 수 있다. 구체적으로, DLL4 및 VEGF에 결합하는 개선된 DVD는 이로운 것으로 증명될 수 있다. 따라서, 미국 특허 제7,612,181호(이의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있는 결합 단백질 프레임워크를 이용하고, VEGF 및 DLL4에 대한 기능성 결합 부위를 형성하는 제1 가변 도메인 서열 및 제2 가변 도메인 서열(예를 들면, 표 2에 열거된 서열들)을 각각 포함하는 특정 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 함유하는, 이원 가변 도메인 면역글로불린이 본원에 개시되어 있다. 몇몇의 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄는, 표 2에 열거된 서열들 중 하나 유래의 3개의 CDR들을 각각 함유하고 VEGF 및 DLL4에 대한 기능성 결합 부위를 형성하는, 제1 가변 도메인 서열 및 제2 가변 도메인 서열을 포함한다.
DLL4는, Notch 수용체 경로를 통해 세포-대-세포 신호전달에 관여하는 리간드이다. 이러한 세포-대-세포 커뮤니케이션(communication)은 분화, 증식 및 항상성 유지(homeostasis) 등의 다수의 생물학적 프로세스들에 요구된다. Notch-신호전달 경로는, 광범위한 진핵생물에 의해 이용되는 한 시스템이다. 이러한 경로, 특히, Notch 수용체는 기능적 종양 혈관신생에도 중요하다. 따라서, Notch 수용체 기능의 억제, Notch 수용체의 차단, 및/또는 Notch-신호전달 경로의 차단은 항암 조성물 및 치료요법을 위한 잠재적 전략이다. Notch 수용체의 소분자 억제제는, 이들이 전신에 걸쳐 Notch 수용체의 야생형 (정상) 조직 발현을 저해하므로 독성인 것으로 판명된 경우가 있다. 따라서, Notch-신호전달 경로의 상이한 구성원들은 치료제에 대한 잠재적 표적으로서 간주되어야만 한다. Notch 수용체에 대한 혈관구조 리간드는 델타 4 또는 델타-유사 4(DLL4)이다. 혈관구조에서 크게 발현되는 DLL4는 혈관 발달에 중요하다(Yan et al., Clin. Cancer Res., 13(24): 7243-7246 (2007); Shutter et al., Genes Dev., 14(11): 1313-1318 (2000); Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 14(11): 1343-1352 (2000)). DLL4에 대해 이형접합성인 마우스는, 혈관 발달에서의 주요 결함으로 인하여 배아에 치명적이다(Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Duarte et al., Genes Dev., 18(20): 2474-2478 (2004); Krebs et al., Genes Dev., 18(20): 2469-2473 (2004)).
DLL4의 발현은 VEGF에 의해 유도될 수 있다(Liu et al., Mol. Cell Biol., 23(1): 14- 25 (2003); Lobov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3219-3224 (2007)). VEGF는, 혈관신생에 관여하는 세포에 의해 생성된 신호 단백질이다. 추가로, DLL4는, 부분적으로 VEGFR2를 억압하고 VEGR1을 유도함을 통해 VEGF 신호전달을 음성적으로 조절할 수 있다(Harrington et al., Microvasc. Res., 75(2): 144-154 (2008); Suchting et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104(9): 3225-3230 (2007)). DLL4와 VEGF 사이의 정교한 배위는, DLL4 및 VEGF 둘 다를 치료학적 개입에 대한 잠재적 표적으로 하는 기능적 혈관신생에 필수적이다.
이들의 생리학적 역할 이외에도, DLL4 및 VEGF는, 또한, 종양 혈관에서 상향-조절된다(Gale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101(45): 15949-15954 (2004); Mailhos et al., Differentiation, 69(2-3): 135-144 (2001); Patel et al., Cancer Res., 65(19): 8690-8697 (2005); Patel et al., Clin. Cancer Res., 12(16): 4836-4844 (2006); Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006)). DLL4의 차단은 다중 모델에서의 원발성 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Noguera-Troise et al., Nature, 444(7122): 1032-1037 (2006); Ridgway et al., Nature, 444(7122): 1083-1087 (2006); Scehnet et al., Blood, 109(11): 4753-4760 (2007)). DLL4의 억제는, 항-VEGF 치료요법에 내성인 종양에 대해 더욱 효과적이다. 따라서, DLL4 및 VEGF 둘 다의 조합적 억제는, 향상된 항-종양 치료요법을 제공할 수 있다. 흥미롭게도, 종양 혈관 형성을 감소시키는 VEGF 억제와는 달리, DLL4 차단은 종양 혈관구조 밀도의 증가를 초래하고, 여기서, 상기 혈관은 비정상적이고, 효율적인 혈액 수송을 지지할 수 없으며, 실질적으로 비기능적이다. 따라서, VEGF 및 DLL4 둘 다의 파괴는, 잠재적 항암 치료를 위한 작용의 다양한 방법을 가능하게 한다.
항체들 및 각종 결합 작제물들이 당해 분야에 공지되어 있지만, 예를 들면, 암 및 암세포화(tumorogenesis)를 치료하기 위해서는, VEGF 및 DLL4에 대한 보다 우수한 표적화 및 결합 효율성에 대한 요구가 남아 있다. 따라서, 당해 분야에는 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있는 개선된 다가의 결합 단백질에 대한 요구가 존재한다. 따라서, 신규한 결합 단백질이 제공되고, 여기서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, 예를 들면, 개선된 결합 친화도 및/또는 중화 효력을 갖는 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다.
2개의 에피토프들을 표적화할 수 있는 결합 단백질이 제공되고, 여기서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, DLL4 및 VEGF의 에피토프들에 높은 친화도로 결합할 수 있는 결합 단백질이 제공된다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, CDR 및 표 2에 열거된 가변 도메인 서열을 함유하는 이원 가변 도메인 결합 단백질 프레임워크를 포함한다. 한 실시형태에서, 이원 가변 도메인 결합 단백질 프레임워크는 미국 특허 제7,612,181호(이의 전문이 본원에 인용에 의해 포함됨)에 개시되어 있는 프레임워크를 포함한다.
한 실시형태에서, 2개의 상이한 단백질들(VEGF 및 DLL4)의 2개의 에피토프들에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 아미노산 또는 폴리펩타이드를 나타내고, X2는 Fc 영역을 나타내고, n은 0 또는 1이다]을 포함하는, 2개의 상이한 단백질들(VEGF 및 DLL4)의 2개의 에피토프들에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질이 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질 내의 VD1 및 VD2는 중쇄 가변 도메인들이다. 소정 실시형태에서, VD1 및 VD2는 DLL4의 에피토프 및 VEGF의 에피토프에 결합 할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, C는 중쇄 불변 도메인, 예를 들면, CH1이다. 소정 실시형태에서, X1은 링커이고, 단, X1은 CH1이 아니다.
각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질은, DLL4의 에피토프 및 VEGF의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 중쇄 가변 도메인을 포함하고, VD2는 제2 중쇄 가변 도메인을 포함하고, C는 중쇄 불변 도메인을 포함하고, X1은 링커를 포함하고, X2는 Fc 영역을 포함한다]을 포함한다. 한 실시형태에서, X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인은 각각 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 내의 CDR들로부터 선택된 3개의 CDR들(이들 서열번호 중 하나 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39에 3개의 CDR들을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39를 포함한다.
각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질은, DLL4의 에피토프 및 VEGF의 에피토프에 결합하는 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 경쇄 가변 도메인을 포함하고, VD2는 제2 경쇄 가변 도메인을 포함하고, C는 경쇄 불변 도메인을 포함하고, X1은 링커를 포함하고, X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다]을 포함한다. 한 실시형태에서, X1은 링커이고, 단, 이는 CH1 또는 CL이 아니다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인은, 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54로부터 선택된 각각 3개의 CDR들(즉, 이들 서열번호 중 하나 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40에 3개의 CDR들을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40을 포함한다.
다른 실시형태에서, DLL4의 에피토프 및 VEGF의 에피토프에 결합하는 결합 단백질이 개시된다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 각각은 독립적으로 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이며, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD1 도메인은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD2 도메인은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성한다]을 포함한다. 한 실시형태에서, n=1인 경우 X2는 Fc 영역을 포함하고, n=0인 경우 X2는 Fc 영역을 포함하지 않는다. 몇몇의 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 X1 서열들은 동일하다. 다른 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 X1 서열들은 상이하다. 몇몇의 실시형태에서, 폴리펩타이드 쇄들 중 하나 이상 상의 X1은 CH1 도메인 및/또는 CL 도메인이 아니다. 한 실시형태에서, X1 서열은 짧은(예를 들면, 6, 5, 4, 3, 또는 2개의 아미노산) 링커이다. 다른 실시형태에서, X1 서열은 긴(예를 들면, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20, 25, 30개, 또는 그 이상의 아미노산) 링커이다. 다른 실시형태에서, 2개의 폴리펩타이드 쇄들 중 하나 상의 X1 서열은 짧은 링커이고, 다른 폴리펩타이드 쇄 상의 X1 서열은 긴 링커이다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 각각 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들(즉, 이들 서열번호 중 하나 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39에 3개의 CDR들을 포함하고; VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들(즉, 이들 서열번호 중 하나 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40에 3개의 CDR들을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39를 포함하고, VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40을 포함한다.
각종 실시형태에서, VEGF 및 DLL4에 결합할 수 있는 결합 단백질이 개시된다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리페타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 각각은 독립적으로 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이며, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성한다]을 포함한다. 한 실시형태에서, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인은 서열번호 41 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 42 유래의 3개의 CDR들(예를 들면, 특정 순서로 배열되고 적합한 프레임워크 서열들에 의해 분리되어 기능성 결합 부위를 형성하는 각각의 쇄 상의 CDR들과 함께, 별도의 쇄들 상에 존재하는 서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함한다. 한 실시형태에서, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인은 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들(예를 들면, 특정 순서로 배열되고 적합한 프레임워크 서열들에 의해 분리되어 기능성 결합 부위를 형성하는 각각의 쇄 상의 CDR들과 함께, 별도의 쇄들 상에 존재하는 서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 41 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 42 유래의 3개의 CDR들(예를 들면, 서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위, 및 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들(서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3)을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 41 및 서열번호 42를 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위, 및 서열번호 39 및 서열번호 40을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 56을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 서열번호 64를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 73을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 서열번호 74를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, DLL4에 대한 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들로는 US 출원 공보 제20110217237호 유래의 것들이 포함되고/되거나, VEGF에 대한 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들로는 US 출원 공보 제20100076178호 유래의 것들이 포함되고, 이들 문헌은 이들의 전문이 본원에 인용에 의해 포함된다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 h1A11.1-SL-Av를 포함한다. 한 실시형태에서, h1A11.1-SL-Av 결합 단백질은 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역을 포함한다.
사람 치료학적 제제로서, 예를 들면, 항암제/항종양제로서 사용하기에 적합한 결합 단백질의 발달 및 생산은, 원하는 표적 또는 표적들에 결합할 수 있는 결합 단백질의 동정보다 더 많은 것을 요구할 수 있다. 예를 들면, 후보물은, 이의 표적(들)에 결합하지만 이의 원하는 표적을 억제하거나 중화시키는 감소된 능력을 나타낼 수 있거나, 안정하게 제형화되기 어려운 것으로 입증될 수 있거나, 바람직하지 못한 약동학적 특성을 나타낼 수 있거나, 적합한 발현 시스템(숙주 세포, 예를 들면, CHO에서의 발현)에서 생산되기 어려운 것으로 입증될 수 있다. 따라서, 적합한 치료학적 제제의 발달에 있어서 고려되는 인자들로는 (a) 내부 및 외부 항원-결합 도메인 둘 다에 대한 결합 반응속도학(binging kinetics)(온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate) 및 친화도), (b) 각종 생화학적 및 세포 생물검정에서의 효력, (c) 관련 종양 모델에서의 생체내 효능, (d) 약동학적 및 약력학적 특성, (e) 선택된 세포주에서의 단백질 발현 수준, 확장성(scalability), 번역-후 변형, 물리화학적 특성, 예를 들면, 모노머 백분율, 용해도, 및 안정성(본질적, 냉동/해동, 보관 안정성 등)을 포함하는 제조가능성(manufacturability), (f) 제형 특성, (g) 잠재적 면역원성 위험, 및 (h) 분자의 독성학적 특성이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 결합 방식 및 결합가는 결합 특성 및 분자의 세포 효력에 영향을 미칠 수 있으므로, 결합 방식 및 결합가도 평가할 수 있다. 몇몇의 결합 단백질에 관해서, 가변 도메인, 불변 도메인, 및/또는 링커의 아미노산 서열에 있어서 작은 변화라도 이들 인자 중 하나 이상에 잠재적으로 (긍정적 또는 부정적) 영향을 미칠 수 있고, 그래서, 인자들의 조합을 평가하여 리드(lead) 후보물을 선택할 수 있다. 일단 리드 후보물이 동정되면, 동물 및 사람 대상체에서의 안전성, 효능, 및 효력의 평가를 포함하는 치료학적 특성의 추가의 생체내 평가가 수행된다.
서열번호 56 및 서열번호 64을 포함하거나 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질은, 상이한 가변 도메인 및/또는 링커 서열을 포함하는 다른 평가된 결합 단백질들과 비교하여, 이와 관련하여 우수한 조합의 특성들, 예를 들면, 치료학적으로 유용한 역치(threshold)를 능가하는 결합 반응속도(즉, 해리 상수), 개선된 중화 능력, 향상된 생체내 효능, 우수한 제형화 가능성, 바람직한 당화 패턴, 선호되는 약동학적 프로파일, 및 숙주 세포에서의 효율적인 발현을 나타내었음을 예상치 못하게 발견되었다. 비교된 결합 단백질들은, 동일한 가변 도메인 서열 및 배향을 갖지만 상이한 링커를 갖는 것들, 및 변경된 결합 도메인 배향 및/또는 다른 가변 도메인 서열(예를 들면, 친화도 성숙된 서열, 완전 사람 서열 등)을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 이들 우수한 특성들은, 특정 가변 도메인 서열(예를 들면, 서열번호 39 내지 서열번호 42), 내부 및 외부 위치에서 VEGF 및 DLL4 결합 도메인의 특정 배향(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64에 제공된 배향), 특정 링커 서열(예를 들면, 서열번호 56에서 사용된 중쇄 가변 도메인 및 짧은 링커 서열, 및 서열번호 64에서 사용된 경쇄 가변 도메인 및 긴 링커 서열), 및/또는 특정 불변 도메인 서열(예를 들면, 서열번호 73 및 서열번호 74에서 사용된 불변 도메인 서열)에 의존한다. 몇몇의 실시형태에서, 링커 서열을 거의 변화시키지 않는 것은 기능적 특성에 유의한 영향을 가질 수 있다. 예를 들면, 서열번호 73 및 서열번호 74에서 사용된 링커 서열을 (이들 서열번호에 포함된 가변 및 불변 도메인들에 따라) 선택하는 것은, 결합 단백질의 사람 치료학적 특성에 있어서 예상치 못한 개선을 제공할 수 있다. 예를 들면, 표 9는, 결장직장 선암종 및 교모세포종 이종이식체 모델에서 측정시, 생체내 항-종양 효능에 대한 상이한 링커 서열들의 효과를 입증한다. 따라서, 예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64, 또는 서열번호 73 및 서열번호 74의 서열(이들에 포함된 링커 서열 포함)을 이용하는 것은, 생체내 항-종양 효능에 있어서 예상치 못한 이점을 생성할 수 있다.
각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질은, VEGF 및/또는 DLL4에 대해 원하는 결합 친화도, 차단 능력, 및/또는 중화 효력을, 예를 들면, VEGF에 대한 항체(예를 들면, AVASTIN®) 또는 DLL4(예를 들면, 항체 h1A11.1)에 대한 항체에 대해 관찰된 것과 대략 비슷한 수준으로 나타낸다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, 다른 가변 도메인 서열 또는 링커를 포함하는 DVD-Ig 결합 단백질과 비교하여, VEGF 및/또는 DLL4에 대해 증가된 친화도, 차단 능력, 및/또는 중화 효력을 나타낸다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 41 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 42 유래의 3개의 CDR들을 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위, 및 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 포함하거나; 서열번호 41 및 서열번호 42를 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위, 및 서열번호 39 및 서열번호 40을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 포함하거나; 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함한다. 예를 들면, 결합 단백질(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 4를 포함하거나 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질)은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 7.0 x 10-10M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF에 결합할 수 있고/있거나, VEGFR1 경쟁 ELISA로 측정시, 약 3.8nM 이하의 IC50으로 VEGFR 활성을 차단할 수 있고/있거나; 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 1.0 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4에 결합할 수 있고/있거나, Notch 경쟁 ELISA로 측정시, 약 1.09nM 이하의 IC50으로 DLL4 활성을 차단할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64를 포함하거나, 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질)은, VEGF의 존재 하에 VEGF 및 DLL4 항체(예를 들면, 결합 단백질에 가변 도메인을 제공하기 위해 사용되는 모 항체들)의 혼합물과 비교하는 경우 DLL4에 대한 증가된 중화 효력을 나타낼 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, VEGF의 존재 하에 VEGF 및 DLL4 항체(예를 들면, 결합 단백질에 가변 도메인을 제공하기 위해 사용되는 모 항체들)의 혼합물과 비교하는 경우 DLL4에 대한 중화 효력에 있어서 10배(an order of magnitude) 증가를 나타낼 수 있다. 예를 들면, 표 24는, 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질이, 약 1.2nM 이상(예를 들면, 적어도 약 1.2, 1.5, 2, 2.5, 5, 10, 50, 150, 또는 그 이상)의 VEGF의 존재 하에 VEGF 및 DLL4 항체(결합 단백질에 가변 도메인을 제공하기 위해 사용되는 모 항체들)의 혼합물과 비교하는 경우에도 DLL4에 대한 중화 효력에 있어서 10배 증가를 나타낼 수 있음을 입증한다. 이러한 DLL4 중화 효력은, 종양에 대한 치료의 생체내 환경에서 VEGF 수준은 일반적으로 순환계에서보다 종양의 부근에서 더 높고, 이는, 일반적으로 종양 부위에서의 개선된 표적화 및 향상된 기능적 DLL4 중화 활성 둘 다를 가능하게 하므로 이로울 수 있다.
각종 실시형태에서, 결합 단백질(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64를 포함하거나, 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질)은, 암 및/또는 혈관 종양에 대한 다른 치료와 비교하여, 개선된 특성, 예를 들면, 개선된 안전성, 증가된 안정성, 보다 큰 효력, 감소된 염증 또는 면역 반응, 또는 다FMS 이로운 생체내 사람 치료학적 특성을 나타낸다. 비교에 적합한 치료로는, 소분자 항암제, 또는 VEGF에 대한 항체(예를 들면, AVASTIN®) 및/또는 DLL4에 대한 항체(예를 들면, 항체 h1A11.1), 또는 다른 가변 도메인 서열 및/또는 링커를 포함하는 DVD-Ig 결합 단백질의 투여가 포함될 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, 암 및/또는 혈관 종양에 대한 관리 치료(care treatment)의 현재 표준에 비해 개선된 특성을 나타낸다. 예를 들면, 결합 단백질은, 개선된 결합 반응속도, 우수한 생체내 치료학적 효능, 향상된 제형화 가능성(감소된 응집 및 개선된 보관 안정성 포함), 개선된 약동학, 감소된 염증 또는 면역 반응, 및/또는 향상된 숙주 세포 발현 수준을 나타낼 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64를 포함하거나, 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질)은, 하나 이상의 항암제와의 조합으로의 항-VEGF 항체 또는 항-DLL4 항체와 비교하여, 또는 하나 이상의 항암제와의 조합으로의 다른 가변 도메인 서열 및/또는 링커를 포함하는 DVD-Ig 결합 단백질과 비교하여, 하나 이상의 항암제와의 조합으로 우수한(예를 들면, 가성적(additive) 및/또는 초가성적(superadditive)) 효과를 나타낸다. 예를 들면, 우수한 결합 특성은 표 27 내지 표 30 및 표 34에서 확인되는 것들일 수 있다. 예를 들면, 결합 단백질은, 치료되지 않은 종양과 비교하여, 단독으로 또는 하나 이상의 항암제와의 병용 투여 후의 종양 성장에 있어서 종양 성장 또는 지연의 적어도 약 50% 또는 그 이상(예를 들면, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150% 또는 그 이상)의 억제를 나타낼 수 있다. 항암제는, 예를 들면, 이리노테칸, FOLFIRI, 테모졸로미드, 겜시타빈, 파클리탁셀, 5-FU, 및 카페시타빈, 또는 특정 암의 치료시에 사용되는 임의의 다른 소분자 또는 생물학적 제제 중 하나 이상일 수 있다. 결합 단백질은,단독으로 또는 하나 이상의 항암제와의 조합으로, 예를 들면, 결장암, 교모세포종, 췌장암, 또는 유방암을 치료하기 위한 의약으로서 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 이원 가변 도메인(DVD-Ig) 결합 단백질은, 이전 단락에서 기술된 바와 같은 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄들 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄들을 포함(즉, 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함)하고, 여기서, 폴리펩타이드 쇄의 각각은 독립적으로 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 제1 쇄는, 중쇄이고, 경쇄인 제2 쇄와 쌍을 이룬다. 이러한 DVD-Ig 결합 단백질은 4개의 기능성 표적 결합 부위를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 X1 링커는 동일하거나 상이하다. 몇몇의 실시형태에서, DVD-Ig 결합 단백질은, 임의의 배양에서, 동일하거나 상이한 단백질의 2개 이상의 에피토프들(예를 들면, 2개, 3개, 또는 4개)에 결합할 수 있는 2개 이상의 가변 도메인 서열들(예를 들면, VD1 및 VD2)을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, VD1 및 VD2는 독립적으로 선택된다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인은 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들을 각각 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39에 3개의 CDR들을 포함하고, VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40에 3개의 CDR들을 포함한다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 실시형태에서, VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 각각 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39를 포함하고, VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인은 각각 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40을 포함한다.
다른 실시형태에서, 이원 가변 도메인 결합 단백질은, 표 2에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39를 포함하고/하거나 VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 중쇄, 경쇄, 2개의 쇄, 또는 4개의 쇄 실시형태들 중 어느 하나는, 서열번호 1 내지 서열번호 38로부터 선택되는 링커들을 포함하는 하나 이상의 X1 링커를 포함한다. 한 실시형태에서, X2는 Fc 영역이다. 다른 실시형태에서, X2는 변이체 Fc 영역이다.
또 다른 실시형태에서, Fc 영역은, 제1 폴리펩타이드 내에 존재하는 경우에 본래의 서열 Fc 영역 또는 변이체 서열 Fc 영역이다. 또 다른 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1 유래의 Fc 영역, IgG2 유래의 Fc 영역, IgG3 유래의 Fc 영역, IgG4 유래의 Fc 영역, IgA 유래의 Fc 영역, IgM 유래의 Fc 영역, IgE 유래의 Fc 영역, 또는 IgD 유래의 Fc 영역이다. 소정 실시형태에서, Fc 영역은, HIV 바이러스에 대한 보호를 제공하는 b12 항체의 돌연변이체인 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역이다.
2개의 상이한 표적 단백질들에 결합하는 결합 단백질의 제조 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 결합 단백질의 제조 방법은, a) 제1 에피토프에 결합하는, 제1 모 항체, 또는 이의 항원 결합부를 얻는 단계; b) 제2 에피토프에 결합하는, 제2 모 항체, 또는 이의 항원 결합부를 얻는 단계; c) 본원에 기술되어 있는 결합 단백질들 중 임의의 단백질을 암호화하는 작제물(들)을 제조하는 단계; 및 d) 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합하는 결합 단백질이 생성되도록 폴리펩타이드 쇄들을 발현시키는 단계를 포함한다.
본원의 실시형태들 중 임의의 실시형태에서, 존재하는 경우 VD1 중쇄 가변 도메인, 및 존재하는 경우 경쇄 가변 도메인은 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 유래일 수 있고; 존재하는 경우 VD2 중쇄 가변 도메인, 및 존재하는 경우 경쇄 가변 도메인은 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부 유래일 수 있다. 제1 및 제2 모 항체는 동일하거나 상이할 수 있다.
한 실시형태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 제1 항원에 결합하고, 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는 제2 항원에 결합한다. 한 실시형태에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이한 항원들이다. 다른 실시형태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는, 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원에 결합하는 효력과 상이한 효력으로 제1 항원에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부는, 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부가 제2 항원에 결합하는 친화도와 상이한 친화도로 제1 항원에 결합한다.
다른 실시형태에서, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부, 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는, 사람 항체, CDR 절편이식된 항체, 사람화된 항체, 및/또는 친화도 성숙된 항체이다.
다른 실시형태에서, 결합 단백질은, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 의해, 또는 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부에 의해 나타나는 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 대안으로, 제1 모 항체 또는 이의 항원 결합부 및 제2 모 항체 또는 이의 항원 결합부는, 결합 단백질에 의해 나타나는 하나 이상의 바람직한 특성을 갖는다. 한 실시형태에서, 바람직한 특성은 하나 이상의 항체 매개변수이다. 다른 실시형태에서, 항체 매개변수는 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효력, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 안정성, 용해도, 생산 효율, 면역원성, 약동학, 생체 이용률, 조직 교차 반응성, 또는 이종상동성(orthologous) 항원 결합이다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 다가이다. 다른 실시형태에서, 결합 단백질은 다중 특이적이다. 본원에 기술되어 있는 다가 및 또는 다중 특이적 결합 단백질은 특히 치료학적 관점으로부터 바람직한 특성을 갖는다. 예를 들면, 다가 및 또는 다중 특이적 결합 단백질은, (1) 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 더 빠르게 내재화될(및/또는 이화작용할) 수 있고/있거나; (2) 효능제(agonist) 결합 단백질일 수 있고/있거나; (3) 다가의 결합 단백질이 결합할 수 있는 항원을 발현하는 세포의 세포 사멸 및/또는 아폽토시스를 유도할 수 있다. 다가 및 또는 다중 특이적 결합 단백질의 하나 이상의 항원 결합 특이성을 제공하는 "모 항체"는, 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 내재화될(및/또는 이화작용할) 수 있고/있거나; 효능제, 세포-사멸 유도 항체, 및/또는 아폽토시스-유도 항체일 수 있고, 본원에 기술되어 있는 다가 및 또는 다중 특이적 결합 단백질은 이들 특성 중 하나 이상의 개선(들)을 나타낼 수 있다. 또한, 모 항체에는 이들 특성 중 임의의 하나 이상이 결여되어 있지만, 본원에 기술되어 있는 다가의 결합 단백질로서 작제되는 경우에 이들 특성 중 하나 이상을 획득할 수 있다.
다른 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 하나 이상의 표적들에 대해 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상; 또는 약 106M-1s-1 이상의 온 레이트 상수(Kon)를 갖는다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 하나 이상의 표적들에 대해 약 102M-1s-1 내지 약 103M-1s-1; 약 103M-1s-1 내지 약 104M-1s-1; 약 104M-1s-1 내지 약 105M-1s-1; 또는 약 105M-1s-1 내지 약 106M-1s-1의 온 레이트 상수(Kon)를 갖는다.
다른 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 하나 이상의 표적들에 대해 약 10-2s-1 이하; 약 10-3s-1 이하; 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 또는 약 10-6s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff)를 갖는다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 하나 이상의 표적들에 대해 약 10-2s-1 내지 약 10-3s-1; 약 10-3s-1 내지 약 10-4s-1; 약 10-4s-1 내지 약 10-5s-1; 또는 약 10-5s-1 내지 약 10-6s-1의 오프 레이트 상수(Koff)를 갖는다.
다른 실시형태에서, 결합 단백질은, 하나 이상의 표적에 대해 약 10-7M 이하; 약 10-8M 이하; 약 10-9M 이하; 약 10-10M 이하; 약 10-11M 이하; 또는 약 10-12M 이하의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 결합 단백질의 표적에 대해 약 10-7M 내지 약 10-8M; 약 10-8M 내지 약 10-9M; 약 10-9M 내지 약 10-10M; 약 10-10M 내지 약 10-11M; 또는 약 10-11M 내지 약 10-12M의 평형 해리 상수(KD)를 갖는다.
몇몇의 실시형태에서, 항-DLL4/항-VEGF 결합 단백질은, 항-DLL4 또는 항-VEGF 항체와 비교하여 증가된 효력(DLL4 및/또는 VEGF 활성을 방해하고/하거나 억제하고/하거나 중화시키는 증가된 능력)을 나타낸다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질의 효력은, VEGF 및/또는 DLL4 활성을 평가하기 위한 임의의 검정, 예를 들면, VEGF 및/또는 DLL4 결합 ELISA 검정, BIACORE™ 검정, DLL4-Notch 리포터 검정, VEGF-자극된 내피 세포 증식/생존 검정, 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 임의의 다른 검정에서 평가될 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은 VEGF의 존재시 증가된 DLL4의 효력을 나타낸다.
다른 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 결합 단백질들 중 임의의 단백질을 포함하고 제제를 추가로 포함하는, 접합체가 제공된다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 면역부착 분자, 영상화제, 치료학적 제제, 또는 세포독성 제제이다. 한 실시형태에서, 영상화제는 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 또는 비오틴이다. 다른 실시형태에서, 방사성 표지는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm이다. 또 다른 실시형태에서, 치료학적 제제 또는 세포독성 제제는 항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스성 제제이다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 테모졸로미드, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 류코보린이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 및 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 테모졸로미드이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 겜시타빈이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 파클리탁셀이다.
다른 실시형태에서, 접합체는 결합 단백질 및 약물을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 접합체 중의 결합 단백질은, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커이고, X2는 Fc 영역이다]을 독립적으로 포함하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, VD1 및 VD2 도메인들은, 쌍을 이루어 VEGF 및 DLL4에 대한 기능성 결합 부위를 형성하도록 배열된, CDR들 또는 표 2에 개시되어 있는 서열들 중 임의의 서열 유래의 가변 도메인 서열들을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 접합체 중의 약물은, 유사분열 억제제, 항종양 항생물질, 면역조절제, 유전자 치료요법을 위한 벡터, 알킬화제, 항혈관신생제, 항대사물질, 붕소-함유 제제, 화학보호제, 호르몬, 항호르몬제, 코르티코스테로이드, 광활성 치료학적 제제, 올리고뉴클레오타이드, 방사성 핵종, 토포이소머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 및 방사성 증감제로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 상기 약물은, 익셈프라, 돌라스타틴 10, 돌라스타틴 15, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 PE, 모노메틸 아우리스타틴 D(MMAD 또는 아우리스타틴 D 유도체), 모노메틸 아우리스타틴 E(MMAE 또는 아우리스타틴 E 유도체), 모노메틸 아우리스타틴 F(MMAF 또는 아우리스타틴 F 유도체), 아우리스타틴 F 페닐렌디아민(AFP), 메토트렉세이트, 다우노루비신, 빈크리스틴, 메이탄신, 메이탄시놀, 메이탄시놀의 C-3 에스테르, 안사미토신 P1, 안사미토신 P2, 안사미토신 P3, 안사미토신 P4, 도세탁셀, 파클리탁셀, 나노입자 파클리탁셀, 빈데신 설페이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 악티노마이신, 악티노마이신 D, 안트라마이신, 치카마이신 A, DC-18, 마제트라마이신, 네오트라마이신 A, 네오트라마이신 B, 프로트라카르신 B, SG2285, 시바노마이신, 시비로마이신, 안트라사이클린, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 칼리케아마이신, γ1', α2', α3', N-아세틸-γ1', PSAG, θ'1, 듀오카르마이신, 아도젤레신, 비젤레신, 및 카르젤레신, 블레오마이신, 미토마이신, 플리카마이신, 바실러스 칼메트-게랭(calmette-guerin)(BCG), 레바미솔, 암 백신, 재조합 2가의 사람 유두종 바이러스(HPV) 백신 유형 6, 11, 16, 및 18 백신, 시풀류셀-T, 사이토카인, 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신, 당단백질 호르몬, 예를 들면, 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH), 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자, 프로락틴, 태반 락토겐, 종양 괴사 인자, 뮐러관(mullerian)-억제 물질, 마우스 고나도트로핀-관련 펩타이드, 인히빈, 악티빈, 혈관 내피 성장 인자, 인테그린, 트롬보포이에틴(TPO), 신경 성장 인자, 예를 들면, NGF, 혈소판-성장 인자, 형질전환 성장 인자(TGF), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II, 에리트로포이에틴(EPO), 골 유도 인자, 인터페론, 예를 들면, 인터페론 α, β, 및 γ, 콜로니 자극 인자(CSF), 과립구-대식세포-C-SF(GM-CSF), 및 과립구-CSF(G-CSF), 인터류킨(IL), 예를 들면, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, 종양 괴사 인자 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩타이드 인자, 콜로니-자극 인자, 에리트로포이에틴(에포에틴), 필그라스팀, 사르그라모스팀, 프로메가포이에틴, 오프렐베킨, 면역조절 유전자 치료요법제, 암과 관련된 돌연변이되거나 또는 그렇지 않으면 이상기능성(예를 들면, 절삭된) 유전자를 대체하기 위해 사용되는, 기능성 치료학적 유전자를 암호화하는 핵산; 암을 치료하기 위한 치료학적 단백질을 암호화하거나 암을 치료하기 위한 치료학적 단백질의 생산을 가능하게 하는 핵산, 알킬 설포네이트, 부설판, 질소 머스타드, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 및 멜팔란, 니트로소우레아, 카르무스틴, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 스트렙토조신, 티오페타, 디아지쿠온, 미토마이신 C, 메틸아민 유도체, 에폭시드, 알트레타민, 디안하이드로갈락시티톨, 디브로모둘시톨, 안지오스타틴, ABX EFG, C1-1033, PKI-166, EGF 백신, EKB-569, GW2016, ICR-62, EMD 55900, CP358, PD153035, AG1478, IMC-C225, OSI-774, 에를로티니브, 안지오스타틴, 아레스틴, 엔도스타틴, BAY 12-9566 및 w/플루오로우라실 또는 독소루비신, 칸스타틴, 카르복시아미도트리아졸 및 파클리탁셀과 함께, EMD 121974, S-24, 비탁신, 디메틸크산테논 아세트산, IM862, 인터류킨-12, 인터류킨-2, NM-3, HuMV833, PTK787, RhuMab, 안지오자임, IMC-1C11, 네오바스타트, 마림스타트, 프리노마스타트, BMS-275291, COL-3, MM1270, SU101, SU6668, SU11248, SU5416, 파클리탁셀과 함께, 겜시타빈 및 시스플라틴과 함께, 그리고 이리노테칸 및 시스플라틴과 함께, 그리고, 방사선과 함께, 테코갈란, 테모졸로미드 및 PEG 인터페론 α2β, 테트라티오몰리브데이트, TNP-470, 탈리도미드, CC-5013, 그리고 탁소테레와 함께, 툼스타틴, 2-메톡시에스트라디올, VEGF 트랩, mTOR 억제제(데포롤리무스, 에베롤리무스, 및 템시롤리무스), 티로신 키나제 억제제(예를 들면, 이마티니브, 게피티니브, 다사티니브, 수니티니브, 니롤로티니브, 라파티니브, 소라페니브, 포스포이노시티드 3-키나제(PI3K), 엽산 길항제, 메토트렉세이트, 4-아미노-엽산, 로메트렉솔, 페메트렉세드, 트리메트렉세이트, 피리미딘 길항제, 아자시티딘, 카페시타빈, 시타라빈, 데시타빈, 5-플루오로우라실, 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 5'-포스페이트, 5-플루오로우리딘 트리포스페이트, 겜시타빈, 폭스우리딘, 퓨린 길항제 아자티오프린, 클라드리빈, 메르캅토퓨린, 펜토스타틴, 6-티오구아닌, 아데노신 데아미나제 억제제, 클라드리빈, 플루다라빈, 넬라라빈, 펜토스타틴, 보로피신, 보르테조밉, 화학보호제, 아미포스틴덱스라족산, 메스나, 안드로겐, 에스트로겐, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 프로게스틴, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸, 비칼루타미드, 클로로트리아니세스, 시프로테론 아세테이트, 데가렐릭스, 엑세메스탄, 플루타미드, 풀베스트란트, 고세렐린, 레트로졸, 류프롤리드, 루프론, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트, 타목시펜, 트립토렐린, 아스파라기나제, 다카르바진, 하이드록시우레아, 레바미솔, 미토탄, 프로카르바잔, 트레티노인, 글루코코르티코이드, 프레드니손, 크로마겐, 염료, 천연 발생 또는 표준 및/또는 비-표준 뉴클레오타이드를 이용하여 합성된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(RNA 간섭(RNAi) 포함), 이중-가닥의 RNA(dsRNA), 소형 간선 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 압타머, CpG 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 안지오자임, 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au, 211Pb, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111 1, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-21 1, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 122mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201TI, 225Ac, 76Br, 169Yb, 탁산, 시스플라틴, 메트로니다졸, 미소니다졸, 데스메틸미소니다졸, 피모니다졸, 에타니다졸, 니모라졸, 미토마이신 C, RSU 1069, SR 4233, E09, RB 6145, 니코틴아미드, 5-브로모데옥시우리딘(BUdR), 5-요오도데옥시우리딘(IUdR), 브로모데옥시시티딘, 플루오로데옥시우리딘(FUdR), 하이드록시우레아, 헤마토포르피린 유도체, 포토프린(r), 벤조포르피린 유도체, NPe6, 주석 에티오포르피린(SnET2), 페오보르비드 a, 박테리오클로로필 a, 나프탈로시아닌, 프탈로시아닌, 아연 프탈로시아닌, 캄프토테신, 이리노테칸, 토포테칸, 암사크린, 다우노루비신, 옥소트루비신, 에피포도필로톡신, 엘립티신, 에피루비신, 에토포시드, 라족산, 테니포시드, 악시티니브, 보수티니브, 세디라니브, 다사티니브, 에를로티니브, 게피티니브, 이마티니브, 라파티니브, 레스타우르티니브, 닐로티니브, 세막사니브, 수니티니브, 반데타니브, 아브린, 아브린 A 쇄, 알파 독소, 알류라이트, 포르디 단백질, 아마톡신, 크로틴, 쿠르신, 디안틴 단백질, 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 데옥시리보뉴클레아제(Dnase), 겔로닌, 미토겔린, 모덱신 A 쇄, 모모르디카 차란티아 억제제, 네오마이신, 온코나제, 페노마이신, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 포키위드 항바이러스성 단백질, 슈도모나스 내독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 아에루기노사레스트릭토신 유래의 외독소 A 쇄, 레스트릭토신, 리신, 리신 A 쇄, 리보뉴클레아제(Rnase), 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 사포린, 알파-사르신, 스타필로코커스 장내독소-A, 테타누스 독소, 시스플라틴, 카르보플라틴, 및 옥살리플라틴(엘록사틴, 사노피 아벤티스), 프로테아솜 억제제, PS-341, HDAC 억제제, 보리노스태트, 벨리노스태트, 엔티노스태트, 모세티노스태트, 파노비노스태트, COX-2 억제제, 치환된 우레아, 가열 충격 단백질 억제제, 겔다나마이신, 부신 피질 저해제, 트리코테센, A12, 19D12, Cp751-871, H7C10, 알파IR3, ScFV/FC, EM/164, 마투주마브, 에르비툭스, 벡티빅스, mAb 806, 니모툭수마브, AVEO, AMG102, 5D5(OA-5d5), H244G11, Ab #14(MM 121-14), 헤르셉틴, 1B4C3; 2D1D12, NVP-AEW541-A, BMS-536,924(1H-벤조이미다졸-2-일)-1H-피리딘-2-온), BMS-554,417, 사이클로리간, TAE226, PQ401, 이렛사, CI-1033(PD183805), 라파티니브(GW-572016), 티케르브, 타르케바, PKI-166, PD-158780, EKB-569, 티르포스틴 AG 1478(4-(3-클로로아닐리노)-6,7-디메톡시퀴나졸린), PHA665752, ARQ 197, 카페시타빈, 5-트리플루오로메틸-2'-데옥시우리딘, 메토트렉세이트 나트륨, 랄티트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 사이토신, 아라비노시드(시타라빈), 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린(메르캅토퓨린, 6-MP), 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트, 클라드리빈(2-CdA, 2-클로로데옥시아데노신), 리보뉴클레오타이드 리덕타제 억제제, 사이클로포스파미드, 네오사르, 이포스파미드, 티오테파, BCNU→ 1,3-비스(2-클로로에틸)-1-니토소우레아, CCNU→ 1,-(2-클로로에틸)-3-사이클로헥실-1-니트로소우레아(메틸 CCNU), 헥사메틸멜라민, 부설판, 프로카르바진 HCL, 다카르바진(DTIC), 클로람부실, 멜팔란, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 독소루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 미토크산트론 HCL, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드, 이리노테칸 HCL(CPT-II), 빈크리스틴, 빈블라스틴 설페이트, 비노렐빈 타르트레이트, 빈데신 설페이트, 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산, 익사베필론, 이마티니브 메실레이트, 수니티니브 말레이트, 소라페니브 토슬레이트, 닐로티니브 하이드로클로라이드 1수화물, L-아스파라기나제, 알파 인터페론, 아바스틴, IL-2, 알데스류킨, 프로류킨, IL-12, 토레미펜 시트레이트, 풀베스트란트, 랄록시펜 HCL, 아나스트라졸, 레트로졸, 파드로졸(CGS 16949A), 엑세메스탄, 류프롤리드 아세테이트, 루프론, 고세렐린 아세테이트, 트립토렐린 파모에이트, 부세렐린, 나파렐린, 세트로렐릭스, 비칼루타미드, 닐루타미드, 메게스트롤 아세테이트, 소마토스타틴 유사체, 프레드니솔론, 덱사메타손, 케토코나졸, 시롤리무스, 템시롤리무스(CCI-779), 데포롤리무스(AP23573), 이리노테칸; 류코보린; 폴피리; 5-FU; 에날라프릴; 니페디핀; 클로니딘; 테모졸로미드; 겜시타빈; 카페시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브; 페르투주마브 및 에베롤리무스(RAD001)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
몇몇의 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 1개 이상의 결합 단백질 및 1개 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 화학치료요법제를 포함하는 조성물이 개시되어 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 용액 중에 1개 이상의 추가의 제제와 함께 1개 이상의 결합 단백질을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 테모졸로미드, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 류코보린이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 및 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 테모졸로미드이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 겜시타빈이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 파클리탁셀이다.
다른 실시형태에서, 상기 결합 단백질은 결정화된 결합 단백질이고 결정으로서 존재한다. 한 실시형태에서, 상기 결정은 담체-불포함 약제학적으로 제어된 방출 결정이다. 다른 실시형태에서, 상기 결정화된 결합 단백질은, 결합 단백질의 가용성 대응부(counterpart)보다 더 큰 생체내 반감기를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 결정화된 단백질은 생물학적 활성을 보유한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기술되어 있는 결합 단백질은 당화된다. 예를 들면, 당화 패턴은 사람 당화 패턴이다.
본원에 기술되어 있는 결합 단백질들 중 임의의 하나를 암호화하는 단리된 핵산도 제공된다. 추가의 실시형태는, 본원에 기술되어 있는 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공하고, 여기서, 상기 벡터는 pcDNA; pTT(Durocher et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30(2)); pTT3(추가의 다중 클로닝 부위를 갖는 pTT; pEFBOS(Mizushima and Nagata (1990) Nucleic Acids Res. 18(17)); pBV; pJV; pcDNA3.1 TOPO; pEF6 TOPO; pBOS; pHybE; 또는 pBJ이다. 한 실시형태에서, 상기 벡터는, 미국 특허 공개 제20090239259호에 개시되어 있는 벡터이다.
다른 양상에서, 숙주 세포는, 본원에 개시되어 있는 벡터로 형질전환된다. 한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예를 들면, 이. 콜라이이다. 다른 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들면, 원생동물 세포, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진균 세포이다. 한 실시형태에서, 상기 숙주 세포는, CHO, COS, NS0, SP2, PER.C6, 또는 진균 세포, 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 곤충 세포, 예를 들면, Sf9를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 포유동물 세포이다. 한 실시형태에서, 예를 들면, 상이한 특이성을 갖는 2개 이상의 결합 단백질들이, 단일 재조합 숙주 세포에서 생산된다. 예를 들면, 항체들의 혼합물의 발현은 미국 특허 제7,262,028호 및 7,429,486호에서 Oligoclonics™(Merus.B.V., 네덜란드)라고 칭하였다.
결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 본원에 개시되어 있는 숙주 세포들 중 임의의 하나를 배양함을 포함하는, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 한 실시형태에서, 이러한 방법에 의해 생산된 결합 단백질 중 50% 내지 75%는 이원 특이적 4가의 결합 단백질이다. 다른 실시형태에서, 이러한 방법에 의해 생산된 결합 단백질 중 75% 내지 90%는 이원 특이적 4가의 결합 단백질이다. 다른 실시형태에서, 생산된 결합 단백질 중 90% 내지 95%는 이원 특이적 4가의 결합 단백질이다.
한 실시형태는 결합 단백질의 방출을 위한 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 결정화된 결합 단백질, 성분(ingredient), 및 1개 이상의 중합체성 담체를 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 다가 (무수물), 폴리(뎁시펩티드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리 (b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥산), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리 (오르토 에스테르), 폴리 (비닐 알콜), 폴리 (비닐피롤리돈), 말레산 무수물-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루로닉 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 설페이트화된 폴리사카라이드, 또는 이들의 블렌드 및 공중합체이다. 한 실시형태에서, 상기 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜이다.
다른 실시형태는, 포유동물에게 본원에 개시되어 있는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에 개시되어 있는 결합 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은, 장애를 치료하기 위한 1개 이상의 추가의 치료학적 제제를 포함한다. 예를 들면, 상기 추가의 제제는 치료학적 제제, 화학치료요법제; 영상화제, 세포독성 제제, 혈관신생 억제제, 키나제 억제제(KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 공동-자극 분자 조절제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 소분자 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 또는 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 소염성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 효능제, 흡입형 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 또는 사이토카인 길항제일 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 추가의 치료학적 제제는 화학치료요법제이다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 추가의 제제는 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 테모졸로미드, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 류코보린이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 및 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 테모졸로미드이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 겜시타빈이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 파클리탁셀이다.
각종 실시형태에서, VEGF 및/또는 DLL4를 표적화함으로써 진단되고/되거나 치료될 수 있는 장애(예를 들면, 임의의 혈관신생 장애 또는 VEGF 및/또는 DLL4의 이상 발현과 관련된 임의의 다른 장애)를 앓고 있는 사람 대상체를 진단하고/하거나 치료하기 위한 방법으로서, 상기 사람 대상체에게 본원에 개시되어 있는 결합 단백질을 투여함을 포함하여 상기 대상체에서의 표적 또는 표적들의 활성이 억제되고 하나 이상의 증상이 완화되거나 치료가 달성되도록 하는, 방법이 제공된다. 본원에서 제공되는 결합 단백질을 이용하여, 유방, 결장, 직장, 폐, 인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 담낭 및 담관, 소장, 뇨관(신장, 방광 및 요로 포함), 여성 생식관(자궁경부, 자궁, 및 난소, 및 융모막 암종 및 임신성 융모성 질환 포함), 남성 생식관(전립선, 정낭, 고환 및 생식 세포 종양 포함), 내분비선(갑상선, 부신, 및 뇌하수체 포함), 및 피부의 암종, 및 혈관종, 흑색종, 육종(골 및 연조직으로부터 발생하는 육종 및 카포시 육종 포함), 뇌, 신경, 눈, 및 뇌척수막의 종양(성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반종, 및 뇌수막종 포함), 조혈 악성 종양으로부터 발생하는 고형 종양, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발상 세포 백혈병, 호지킨 및 비-호지킨 림프종, 조혈 악성 종양, 카포시 육종, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 부종양 증후군/악성 종양의 고칼슘혈증, 또는 고형 종양을 포함하는 원발성 및 전이성 암을 앓고 있는 사람을 진단하고/하거나 치료할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 환자에서의 암을 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을 투여함을 포함한다. 한 실시형태에서, 상기 암은 결장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 교모세포종이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 췌장암이다. 한 실시형태에서, 상기 암은 유방암이다. 몇몇의 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 암을 치료하는 방법은, 항-VEGF 항체 및 항-DLL4 항체의 조합의 예측되는 추가의 효과와 적어도 대략 등가인 종양 성장의 감소 또는 종양 성장의 지연을 생성시킨다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은, 첨가제 보다 더 많은 종양 성장의 감소 또는 종양 성장의 지연(예를 들면, 항-VEGF 항체 및 항-DLL4 항체의 예상된 효과를 추가함으로부터 예측된 보다 큰 감소)을 생성시킨다.
몇몇의 실시형태에서, 암을 치료하는 방법은, 본원에 기술되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 1개 이상의 추가의 제제, 예를 들면, 화학치료요법제 또는 생물학적 제제와 병용하여 투여함을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 제제는, 레고라페니브(STIVAGRA™), 페르투주마브(PERJECTA™), 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 테모졸로미드, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 류코보린이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 이리노테칸, 류코보린, 및 5-FU이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 테모졸로미드이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 겜시타빈이다. 한 실시형태에서, 상기 제제는 파클리탁셀이다. 몇몇의 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 1개 이상의 추가의 제제와 병용하여 투여함을 포함하는, 암을 치료하는 방법은, 상기 결합 단백질 및 상기 추가의 제제의 조합의 예측된 첨가 효과와 적어도 등가인 종양 성장의 감소 또는 종양 성장의 지연을 생성시킨다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은, 첨가제 보다 더 많은 종양 성장의 감소 또는 종양 성장의 지연(예를 들면, 결합 단백질 및 추가의 제제의 예상된 효과를 추가함으로부터 예측된 보다 큰 감소)을 생성시킨다.
몇몇의 실시형태에서, 결장암을 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 임의로 이리노테칸, 류코보린, 및 5-FU 중 하나 이상과 병용하여 투여함을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 교모세포종을 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 임의로 테모졸로미드와 병용하여 투여함을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 췌장암을 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 임의로 겜시타빈과 병용하여 투여함을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 유방암을 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상 또는 이들의 약제학적 조성물을, 이의로 파클리탁셀과 병용하여 투여함을 포함한다.
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 1개 이상의 항-고혈압제와 병용하여 투여될 수 있다. 1개 이상의 항-고혈압제는, 이뇨제, 아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 레닌 억제제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 혈관확장제, 및 알파-2 효능제로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 제제는 클로니딘, 에날라프릴; 니페디핀; 메틸도파, 하이드랄라진, 프라조신, 레세르핀, 목소니딘, 구안파신, 페린도프릴/인다파미드, 로펙시딘, 및 메티로신 중 하나 이상일 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 하나 이상의 항응고제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 항응고제는 와파린, 헤파린, 저분자량 헤파린, 달테파린 나트륨, 아르가트로반, 비발리루딘, 레피루딘, 및 덱스트로스 중 하나 이상일 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 하나 이상의 항-고혈압제 및 하나 이상의 항응고제와 병용하여 투여될 수 있다.
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 황반 변성(습윤 형태 포함), 당뇨병성 망막병증, 및/또는 혈관 과성장 또는 부종을 특징으로 하는 임의의 다른 질환 또는 장애를 앓고 있는 사람을 진단하고/하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
한 실시형태에서, 상기 결합 단백질, 또는 이의 항원-결합부는, 단독으로 또는 방사선치료요법 및/또는 화학치료요법제와 병용하여 사용되는 경우에, 암을 치료하거나, 본원에 기술되어 있는 종양으로부터의 전이의 예방 또는 억제시에 사용된다.
한 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질과 병용될 수 있는 화학치료요법제 또는 생물학적 제제로는 하기가 포함된다: 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 5-FU; 6-메르캅토퓨린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주마브; ALIMTA; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 전(All)-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐리드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 3산화 비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주마브; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; 카페시타빈 Carac™; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 리포솜성 시타라빈; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코젠; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티니브; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 리포솜성 다우노루비신; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 인산 나트륨; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 리포솜성 독소루비신; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티니브; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; 에티올; Etopophos®; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록스우리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티니브; 겜시타빈; 겜투주마브 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® 웨이퍼; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 인산 나트륨; 하이드로코르티손 석신산 나트륨; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브리투모마브; 이브리투모마브 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 접합체); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티니브 메실레이트; 이미다졸 카르복사미드; Intron A®; Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; 키드롤라제 (t) Lanacort®; 라파티니브; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도미드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤리드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리포솜성 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 맥시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메르캅토퓨린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; 미톡산트론 M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; 닐로티니브; 닐루타미드; Nipent®; 질소 머스타드 Novaldex®; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오티드; 옥트레오티드 아세테이트; 오파투무마브; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 단백질-결합된 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파니투무마브; Panretin®; Paraplatin®; 파조파니브; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펜토스타틴; 페닐알라닌 머스타드; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카르바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페니브; SPRYCEL™; STI-571; 스트렙토조신; SU11248; 수니티니브; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로미드 템시롤리무스; 테니포시드; TESPA; 탈리도미드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오포스포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모마브; 트라스투주마브; Treanda®; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타르트레이트; VLB; VM-26; 보리노스태트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; 또는 Zometa®; 및/또는 유사 경로를 표적화하는 여기에 구체적으로 열거되지 않은 임의의 다른 제제.
다른 실시형태에서, 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질들 중 하나 이상을 단독으로 투여하거나, 제2 제제의 투여 전에, 제2 제제의 투여와 동시에, 또는 제2 제제의 투여 후에 상기 결합 단백질(들)을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 약제학적 조성물은 환자에게 경구, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 투여에 의해 투여된다.
각종 실시형태에서, 시험 샘플 중의 하나 이상의 항원 또는 이들의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법이 제공되고, 여기서, 하나 이상의 항원 또는 이들의 단편은 DLL4 및/또는 VEGF이다. 상기 방법은, 면역검정에 의해 상기 시험 샘플을 상기 항원 또는 이의 단편에 대해 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 1개 이상의 결합 단백질 및 1개 이상의 검출가능한 표지를 사용하고, (ii) 상기 검출가능한 표지에 의해, 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적 또는 간접적 지표로서 생성된 신호를, 대조군 또는 캘리브레이터(calibrator) 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적 또는 간접적 지표로서 생성된 신호와 비교하는 단계를 포함한다. 상기 캘리브레이터는 임의로 일련의 캘리브레이터들의 일부분이고, 상기 일련의 캘리브레이터들에서, 각각의 캘리브레이터는, 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 항원 또는 이들의 단편의 농도가 상이하다. 상기 방법은, (i) 상기 시험 샘플을, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하는 1개 이상의 포획제와 접촉시켜, 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 복합체를 형성하는 단계, (ii) 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 상기 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고 상기 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하고 포획제에 의해 결합되지 않는 1개 이상의 검출제와 접촉시켜 검출 복합체를 형성하는 단계, 및 (iii) 상기 (ii)에서 형성된 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 1개 이상의 포획제 및/또는 1개 이상의 검출제는 1개 이상의 결합 단백질이다)를 포함한다.
대안으로, 시험 샘플 중의 1개 이상의 항원 또는 이들의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법은, (i) 상기 시험 샘플을, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하는 1개 이상의 포획제와 접촉시켜, 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 복합체를 형성하고, 동시에 또는 순차적으로, 어느 한 순서로, 상기 시험 샘플을, 1개 이상의 포획제에 결합하기 위해 상기 시험 샘플 중의 임의의 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 시험 샘플 중에 존재하는 임의의 항원 또는 이의 단편 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 검출 복합체를 형성한다), 및 (ii) 상기 (i)에서 형성된 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 1개 이상의 포획제는 1개 이상의 결합 단백질이고, 여기서, 상기 포획 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호는, 상기 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다)를 포함할 수 있다.
각종 실시형태에서, 상기 시험 샘플은 환자 유래일 수 있고, 이 경우, 상기 방법은, 상기 환자의 치료학적/예방학적 처치의 효능을 진단하거나, 예측진단하거나, 또는 평가함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법이, 상기 환자의 치료학적/예방학적 처치의 효능을 평가함을 추가로 포함하는 경우, 상기 방법은, 필요에 따라 상기 환자의 치료학적/예방학적 처치를 변형시켜 효능을 개선시킴을 임의로 추가로 포함한다. 상기 방법은, 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하기 위해 조정될(adapted) 수 있다. 따라서, 본원에 기술되어 있는 방법은, 또한, 대상체가, 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이러한 질환, 장애, 또는 병태를 발병할 위험이 있는지 아닌지를 측정하기 위해 사용할 수 있다. 구체적으로, 이러한 방법은,
(a) 대상체 유래의 시험 샘플 중의 1개 이상의 분석물 또는 이들의 단편의 농도 또는 양을 (예를 들면, 본원에 기술되어 있는 방법들, 또는 당해 분야에 공지되어 있는 방법들을 이용하여) 측정하는 단계; 및
(b) 상기 단계 (a)에서 측정된 상기 분석물(들) 또는 이들의 단편(들)의 농도 또는 양을 소정 수준과 비교하는 단계(여기서, 상기 단계 (a)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양이 소정 수준과 관련하여 바람직하면, 상기 대상체는, 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖지 않거나 이들 질환, 장애 또는 병태에 대한 위험이 없는 것으로 결정된다)를 포함할 수 있다. 그러나, 상기 단계 (a)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양이 소정 수준과 관련하여 바람직하지 못하면, 상기 대상체는, 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이들 질환, 장애 또는 병태에 대한 위험이 있는 것으로 결정된다.
추가로, 본원에는 대상체에서의 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은,
(a) 대상체 유래의 시험 샘플 중의 1개 이상의 분석물(들)의 농도 또는 양을 측정하는 단계;
(b) 후에 상기 동일한 대상체 유래의 시험 샘플 중의 분석물(들)의 농도 또는 양을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양을, 상기 단계 (a)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양과 비교하는 단계(여기서, 상기 단계 (b)에서 측정된 농도 또는 양이 변화되지 않거나, 상기 단계 (a)에서 측정된 농도 또는 양과 비교하는 경우에 바람직하지 못하면, 상기 대상체에서의 질환이 지속되었거나, 진행되었거나, 악화된 것으로 결정된다)를 포함한다. 비교에 의해, 단계 (b)에서 측정된 농도 또는 양은, 단계 (a)에서 측정된 농도 또는 양과 비교하는 경우에 바람직하면, 상기 대상체에서의 질환은 중단되었거나, 퇴행되었거나, 개선된 것으로 결정된다.
임의로, 질환의 진행을 모니터링하는 방법은, 단계 (b)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양을, 예를 들면, 소정 수준과 비교함을 추가로 포함한다. 또한, 임의로, 상기 비교가, 단계 (b)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양이, 예를 들면, 소정 수준과 관련하여 바람직하게 못하게 변경됨을 나타내는 경우에, 상기 방법은 상기 대상체를, 일정 시간 동안 1개 이상의 약제학적 조성물로 치료함을 포함한다.
또한, 시험 샘플을 1개 이상의 항원 또는 이들의 단편의 존재 또는 농도에 대해 검정하기 위한 키트도 제공되고, 여기서, 1개 이상의 항원은 DLL4 및/또는 VEGF이다. 상기 키트는, 상기 시험 샘플을 항원 또는 이의 단편에 대해 검정하기 위해 본원에 기술되어 있는 1개 이상의 결합 단백질, 및 상기 시험 샘플을 항원 또는 이의 단편에 대해 검정하기 위한 지침서를 포함한다. 한 실시형태에서, 1개 이상의 결합 단백질은 임의로 검출가능하게 표지된다.
도 1은, 이원 가변 도메인(DVD) 결합 단백질 작제물의 도식적 표시이고, 2개의 모 항체들로부터의 DVD 결합 단백질의 생성을 위한 전략을 나타낸다.
2개의 상이한 단백질들 상의 에피토프들에 결합할 수 있는 다가 및/또는 다중 특이적인 결합 단백질이 제공된다. 또한, 이원 가변 도메인 결합 단백질(DVD, DVD 결합 단백질, 또는 이원 가변 도메인 면역글로불린(DVD-Ig™)으로서도 나타냄), 및 이의 약제학적 조성물, 및 핵산, 재조합 발현 벡터 및 이러한 DVD 결합 단백질을 제조하기 위한 숙주 세포도 제공된다. 시험관내에서 또는 생체내에서 특정 항원을 검출하기 위해 DVD 결합 단백질을 사용하는 방법도 제공된다.
본원에 달리 정의되어 있지 않으면, 본원에 사용되는 과학적 및 기술적 용어는, 당해 분야 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의로 잠재적으로 모호한 경우에, 본원에 제공되는 정의들은 임의의 사전적 또는 외인적 정의에 대해 선례를 따른다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. "또는"의 사용은, 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는" 및 다른 형태, 예를 들면, "포함한다" 및 "포함된"의 사용은 한정되지 않는다. 본원에 기술되어 있는 임의의 범위는, 종점들 및 종점들 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 구조상의 목적만을 위한 것이고, 기술되는 대상 주제를 제한하는 것으로 구성되지 않는다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적 및 조약을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 본 출원에서 인용된 모든 문헌, 또는 문헌의 일부는, 임의의 목적을 위해 이들의 전문이 인용에 의해 본원에 명확히 포함된다. 인용에 의해 포함되는 문헌이, 본 명세서에 포함된 개시를 반박하는 정도로, 본 명세서는 임의의 모순되는 자료를 대신할 것이다.
일반적으로, 본원에 기술되어 있는 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 생물학, 유전학, 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련되어 사용되는 명명법은 익히 공지되어 있는 명명법이고, 당해 분야에 통상적으로 사용된다. 본원에서 제공되는 방법 및 기술은, 일반적으로 당해 분야에 익히 공지되어 있고, 달리 나타내지 않는 한 본 발명의 명세서에 걸쳐 인용되고 논의되는 각종 일반적인 그리고 보다 구체적인 참조문헌에 기술되어 있는 바와 같은 종래 방법에 따라 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은, 당해 분야에서 통상적으로 달성되는 바와 같거나 달리 나타내지 않는 한 본원에 기술되어 있는 바와 같은 제조업자의 명세서에 따라 수행된다. 본원에 기술되어 있는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 약학 및 약제 화학, 및 이들의 절차 및 기술과 관련하여 사용되는 명명법은, 익히 공지되어 있고 달리 나타내지 않는 한 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학적 합성, 화학적 분석, 약제학적 제제, 제형, 및 전달, 및 환자의 치료를 위해 사용된다.
따라서, 본 개시가 보다 용이하게 이해될 수 있음은, 하기에 정의된 용어를 선택한다.
용어 "항체"는, 일반적으로, Ig 분자의 에피토프 결합 특징을 보유하는, 2개의 중(H)쇄들 및 2개의 경(H)쇄들의 4개의 폴리펩타이드 쇄들, 또는 이들의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체로 이루어진 면역글로불린(Ig) 분자를 말한다. 이러한 단편, 돌연변이체, 변이체, 또는 유도체 항체 포맷은 당해 분야에 공지되어 있다. 전장 항체의 한 실시형태에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. CH는 CH1, CH2 및 CH3의 3개의 도메인들로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. CL은 단일 CL 도메인으로 이루어진다. VH 및 VL은, 프레임워크 영역(FR)이라고 칭하는 보다 보존된 영역들 사이에 간삽된 상보성 결정 영역(CDR)이라고 칭하는 초가변성 영역들로 추가로 세분될 수 있다. 일반적으로, 각각의 VH 및 VL은, 아미노-말단으로부터 카복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR들 및 4개의 FR들로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들면, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 또는 서브클래스로 이루어질 수 있다.
용어 "이특이적 항체"는, 2개의 결합 아암(arm)(HC/LC의 한 쌍) 중 하나 상의 1개의 항원(또는 에피토프)에 결합하고 제2 결합 아암(HC/LC의 다른 쌍) 상의 다른 항원(또는 에피토프)에 결합하는, 항체를 말한다. 이특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 둘 다에 있어서) 2개의 별개의 항원 결합 아암을 갖고, 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다. 이특이적 항체로는, 쿼드로마 기술(Milstein and Cuello (1983) Nature 305(5934): 537-40)에 의해, 2개의 상이한 모노클로날 항체들의 화학적 접합(Staerz et al. (1985) Nature 314(6012): 628-631)에 의해, 또는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 또는 유사한 접근법(Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(14): 6444-6448)에 의해 생성되는 항체들이 포함된다.
"친화성 성숙된" 항체는, 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도의 개선을 초래하는, 하나 이상의 CDR들에 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 예시의 친화성 성숙된 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화성 성숙된 항체는, 당해 분야에 공지되어 있는 절차에 따라 제조된다. 문헌[Marks et al. (1992) BioTechnology 10:779-783]은, VH 및 VL 도메인 셔플링(shuffling)에 의한 친화성 성숙을 기술한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이 유발은 문헌[Barbas et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813; Schier et al. (1995) Gene 169: 147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896]에 기술되어 있고, 활성 증강 아미노산 잔기에 의한 선택적 돌연변이 유발 위치, 접점 또는 과돌연변이 위치에서의 돌연변이는 미국 특허 제6,914,128호에 기술되어 있다.
용어 "CDR-절편이식된 항체"는, VH 및/또는 VL의 CDR 영역들 중 하나 이상의 서열들이 다른 항체의 CDR 서열들로 대체된, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 항체를 말한다. 예를 들면, 2개의 항체는, 뮤린 CDR들 중 하나 이상이 사람 CDR 서열들로 대체된, 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 갖는 항체와 같이 상이한 종 유래일 수 있다.
용어 "사람화된 항체"는, 보다 "사람-유사"하게, 즉, 사람 생식선 서열에 보다 유사하게 변경된 비-사람 종 유래의 항체를 말한다. 한 유형의 사람화된 항체는, 비-사람 CDR 서열이, 사람 VH 및 VL 서열에 도입되어 상응하는 사람 CDR 서열을 대체하는, CDR-절편이식된 항체이다. 또한, "사람화된 항체"는, 사람 항체 FR 서열의 아미노산 서열에 대해 실질적 동일성(예를 들면, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성)을 갖는 프레임워크 영역(FR) 서열, 및 비-사람 CDR의 아미노산 서열에 대해 실질적 동일성(예를 들면, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 동일성)을 갖는 1개 이상의 CDR들을 포함하는, 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. 사람화된 항체는, 실질적으로 모든 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인들(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 포함할 수 있고, 여기서, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역의 서열은 비-사람 면역글로불린(즉, 공여 항체)의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역의 서열은 사람 면역글로불린의 CDR 영역이다. 또한, 사람화된 항체는, 사람 항체 유래의 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 사람화된 항체는, 또한, 사람 면역글로불린 Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄의 사람화된 가변 도메인 및/또는 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및 적어도 중쇄의 가변 도메인을 함유한다. 몇몇의 실시형태에서, 사람화된 항체는 중쇄 및 적어도 경쇄 유래의 가변 도메인을 함유한다.
용어 "이원 가변 도메인 결합 단백질" 및 "이원 가변 도메인 면역글로불린"은, 2개의 결합 아암(예를 들면, HC/LC의 쌍) 각각에 2개의 가변 도메인들을 갖고, 이들의 각각이 항원에 결합할 수 있는, 결합 단백질을 말한다(PCT 공보 제 WO02/02773호 참조). 한 실시형태에서, 각각의 가변 도메인은 상이한 항원들 또는 에피토프들에 결합한다. 다른 실시형태에서, 각각의 가변 도메인은 동일한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 다른 실시형태에서, 이원 가변 도메인 결합 단백질은, 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원 결합 아암들을 갖고, 결합하는 각각의 항원에 대해 2가이다. 한 실시형태에서, DVD 결합 단백질은 단일 특이적일 수 있거나, 즉, 1개의 항원에 결합할 수 있거나, 다중 특이적일 수 있다, 즉, 2개 이상의 항원들에 결합할 수 있다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD-Ig™으로서 나타낸다. 한 실시형태에서, 4개 쇄 DVD 결합 단백질의 각각의 절반은 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 한 실시형태에서, 각각의 결합 부위는, 항원 결합 부위당 총 6개의 항원 결합에 관여하는 CDR들을 갖는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
용어 "항이디오타입 항체"는, 다른 항체의 항원 결합 부위의 아미노산 서열에 대항하여 생성된 항체를 말한다. 항 이디오타입 항체는, 항원에 대항하는 면역 반응을 향상시키기 위해서 투여될 수 있다.
용어 "생물학적 활성"은, (생체내에서 발견되는 바와 같이 자연적으로 존재하거나, 재조합 수단에 의해 제공되거나 가능해지는) 분자의 임의의 하나 이상의 생물학적 특성을 말한다. 생물학적 특성으로는 수용체에의 결합, 세포 증식의 유도, 세포 성장의 억제, 다른 사이토카인의 유도, 아폽토시스의 유도 및 효소적 활성이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "중화성"은, 결합 단백질이 항원에 특이적으로 결합하는 경우 항원의 생물학적 활성에 대응하는 것을 말한다. 한 실시형태에서, 중화성 결합 단백질은 항원(예를 들면, 사이토카인)에 결합하여 이의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85% 또는 그 이상 감소시킨다.
"특이성"은, 항원에 선택적으로 결합하는 결합 단백질의 능력을 말한다.
"친화도"는, 결합 단백질과 항원 사이의 상호작용의 강도이고, 결합 단백질의 CDR의 서열에 의해, 그리고, 항원의 특성, 예를 들면, 항원의 크기, 형태, 및/또는 전하에 의해 결정된다. 결합 단백질은, 부정적인 부작용을 최소화하면서 바람직한 치료학적 종점을 제공하는 친화도에 대해 선택될 수 있다. 친화도는, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법(US 20090311253)을 이용하여 측정할 수 있다.
용어 "효력"은, 바람직한 효과를 달성하는 결합 단백질의 능력을 말하고, 결합 단백질의 치료학적 효능의 측정값이다. 효력은, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법(US 20090311253)을 이용하여 평가할 수 있다.
용어 "교차-반응성"은, 결합 단백질에 대항하여 생성된 것 이외의 표적에 결합하는 결합 단백질의 능력을 말한다. 일반적으로, 결합 단백질은, 이의 표적 조직(들)/항원(들)에 적절하게 높은 친화도로 결합할 것이지만, 비-표적 정상 조직/항원에 대해서는 적절하게 낮은 친화도를 나타낼 것이다. 개별 결합 단백질들은 일반적으로 2개의 기준을 충족시키도록 선택된다: (1) 당해 분야에 공지되어 있는 염색법을 이용하여 가시화되는, 항체 표적의 공지의 발현에 적절한 조직에 대한 항체 결합, 및 (2) 동일한 기간 유래의 사람 및 독소 종(예를 들면, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이) 조직 사이의 유사한 염색 패턴. 교차-반응성 평가의 이들 및 다른 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다(US 20090311253).
용어 "생물학적 기능"은 결합 단백질의 특이적 시험관내 또는 생체내 작용을 말한다. 결합 단백질은 몇몇의 클래스의 항원들을 표적으로 하여 다중 작용 기작을 통해 바람직한 치료학적 결과를 달성할 수 있다. 결합 단백질을 가용성 단백질, 세포 표면 항원, 및/또는 세포외 단백질 침전물을 표적으로 할 수 있다. 결합 단백질은 이의 표적의 활성을 효능 작용하거나, 길항하거나, 중화시킬 수 있다. 결합 단백질은, 이들이 결합하는 표적의 클리어런스(clearance)를 보조할 수 있거나, 세포에 결합한 경우 세포독성을 초래할 수 있다. 2개 이상의 항체의 일부는, 단일 결합 단백질 분자에서 1개 초과의 별도의 기능을 달성하도록 다가 포맷에 포함될 수 있다. 생물학적 기능을 평가하는데 사용된 시험관내 검정 및 생체내 모델은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 20090311253).
"안정한" 결합 단백질은, 결합 단백질이, 보관시에 물리적 안정성, 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 근본적으로 보유하는 결합 단백질이다. 연장된 시간 동안 각종 온도에서 시험관내에서 안정한 다가의 결합 단백질이 바람직하다. 결합 단백질을 안정화시키고 각종 온도에서 이들의 안정성에 대해 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(US 20090311253).
용어 "용해도"는, 수성 용액 내에 분산된 상태를 유지하는 단백질의 능력을 말한다. 수성 제형 중의 단백질의 용해도는, 소수성 및 친수성 아미노산 잔기의 적절한 분포에 의존하고, 따라서, 용해도는 정확하게 폴딩된 단백질의 제조와 상호 관련되어 있다. 당해 분야 숙련가는 일상적인 HPLC 기술 및 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법(US 20090311253)을 이용하여 결합 단백질의 용해도의 증가 또는 감소를 검출할 수 있을 것이다.
결합 단백질은, 각종 숙주 세포를 이용하여 생산될 수 있거나, 시험관내에서 생산될 수 있고, 단위노력(effort)당 상대적 수율은 "생산 효율"을 결정한다. 생산 효율에 영향을 미치는 인자들로는 숙주 세포 유형(원핵생물 또는 진핵생물), 발현 벡터의 선택, 뉴클레오타이드 서열의 선택, 및 사용된 방법이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 결합 단백질 생산에 사용된 재료 및 방법, 및 생산 효율의 측정은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 20090311253).
용어 "면역원성"은, 면역 반응을 유도하는 물질의 능력을 의미한다. 치료학적 결합 단백질의 투여는 소정 발생률의 면역 반응을 초래할 수 있다. 다가의 포맷에서 면역원성을 유도할 수 있는 잠재적 요소들은, 모 항체의 선택 동안에 분석될 수 있고, 이러한 위험을 감소시키기 위한 단계는, 모 항체의 서열을 다가의 결합 단백질 포맷에 포함시키기 전에 모 항체를 최적화하는 것으로 간주될 수 있다. 항체 및 결합 단백질의 면역원성을 감소시키는 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 20090311253).
용어 "표지" 및 "검출가능한 표지"는, 특이적 결합 쌍의 구성원에 부착된 모이어티, 예를 들면, 검출가능한 특이적 결합 쌍의 구성원들 사이의 반응(예를 들면, 결합)을 가능하게 하는 항체 또는 이의 분석물을 의미한다. 특이적 결합 쌍의 표지된 구성원은, "검출가능하게 표지된" 것으로서 나타낸다. 따라서, 용어 "표지된 결합 단백질"은, 결합 단백질의 동정을 가능하게 하는 표지가 포함된 단백질을 말한다. 한 실시형태에서, 표지는, 가시적 또는 기기적 수단에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성 표지된 아미노산의 포함 또는 현저한 아비딘(예를 들면, 형광성 마커, 또는 광학적 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 효소 활성를 함유하는 스트렙트아비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩타이드에 대한 부착이다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들면, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 또는 153Sm); 크로모겐, 형광성 표지(예를 들면, FITC, 로다민, 란타니드, 인), 효소적 표지(예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광성 마커; 비오티닐 그룹; 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그), 및 자기성 제제, 예를 들면, 가돌리늄 킬레이트. 면역검정에 통상적으로 사용되는 표지의 대표적 예로는, 광을 생산하는 모이어티, 예를 들면, 아크리디늄 화합물, 및 형광성을 생산하는 모이어티, 예를 들면, 플루오레세인이 포함된다. 이와 관련하여, 모이어티 자체는 검출가능하게 표지되지 않을 수 있지만, 또 다른 모이어티와의 반응시에 검출가능해질 수 있다.
용어 "접합체"는, 제2 화학적 모이어티, 예를 들면, 치료학적 또는 세포독성 제제에 화학적으로 링크되는, 결합 단백질, 예를 들면, 항체 또는 DVD-Ig을 말한다. 용어 "제제"로는 화학적 화합물, 화학적 화합물들의 혼합물, 생물학적 거대 분자, 또는 생물학적 재료로부터 제조된 추출물이 포함된다. 치료학적 또는 세포독성 제제의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테니포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤롤, 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 상동체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 면역검정과 관련하여 사용되는 경우, 접합체는, 검출가능하게 표지된 항체 또는 검출제로서 사용된 DVD-Ig일 수 있다.
용어 "결정" 및 "결정화된"은, 결정의 형태로 존재하는 결합 단백질(예를 들면, 항체) 또는 이의 항원 결합부를 말한다. 결정은, 무정형 고체 상태 또는 액체 결정 상태와 같은 다른 형태와는 별개인 물질의 고체 상태의 한 형태이다. 결정은, 원자, 이온, 분자(예를 들면, 항체와 같은 단백질), 또는 분자 어셈블리(예를 들면, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적이며 3차원적인 어레이로 구성된다. 이들 3차원 어레이는, 당해 분야에서 잘 이해되어 있는 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위라고 칭한다. 주어진 익히 정의되어 있는 결정학적 대칭에 따른 배열 내의 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적 번역에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. 문헌[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, CRYSTALLIZATION OF NUCLEIC ACIDS AND PROTEINS, A PRACTICAL APPROACH, 2nd ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)]을 참조한다.
용어 "벡터"는, 이에 링크된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는, 이에 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥의 DNA 루프를 말한다. 벡터의 다른 유형은 바이러스성 벡터이고, 여기서, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내에 라이게이션될 수 있다. 다른 벡터들로는 RNA 벡터들이 포함된다. 소정의 벡터들은, 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(예를 들면, 세균성 복제 기원을 갖는 세균성 벡터 및 에피솜성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예, 비-에피솜성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 소정 벡터는, 이에 작동적으로 링크된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로서 나타낸다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 흔히 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 발명의 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는, 플라스미드가 가장 흔하게 사용되는 백터 형태이기 때문에 상호교환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 등가의 기능을 하는 바이러스 벡터(예, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 한 그룹의 pHybE 벡터들(미국 특허 출원 일련번호 제61/021,282)은 모 항체 및 DVD 결합 단백질 클로닝에 사용될 수 있다. pJP183으로부터 유도된 V1; pHybE-hCg1,z,비-a V2는, 야생형 불변 영역을 갖는 항체 및 DVD 중쇄의 클로닝에 사용될 수 있다. pJP191로부터 유도된 V2; pHybE-hCk V3은, 카파 QFNQUS 영역을 갖는 항체 및 DVD 경쇄의 클로닝에 사용될 수 있다. pJP192로부터 유도된 V3; pHybE-hCl V2는 람다 불변 영역을 갖는 항체 및 DVD 경쇄의 클로닝에 사용될 수 있다. 람다 신호 펩타이드 및 카파 불변 영역으로 이루어진 V4는, 람다-카파 하이브리드 V 도메인을 갖는 DVD 경쇄의 클로닝에 사용될 수 있다. 카파 신호 펩타이드 및 람다 불변 영역으로 이루어진 V5는, 카파-람다 하이브리드 V 도메인을 갖는 DVD 경쇄의 클로닝에 사용될 수 있다. pJP183으로부터 유도된 V7; pHybE-hCg1,z,비-a V2는, (234,235 AA) 돌연변이체 불변 영역을 갖는 항체 및 DVD 중쇄의 클로닝에 사용될 수 있다.
용어 "재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는, 외인성 DNA가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는, 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 후손도 의미한다. 다음 세대에서 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 소정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 후손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 한 실시형태에서, 숙주 세포는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함한다. 한 실시형태에서, 진핵생물 세포는 원생동물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, 숙주 세포로는 원핵생물 세포주 이. 콜라이; 포유동물 세포주 CHO, HEK 293, COS, NS0, SP2 및 PER.C6; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지애가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "형질감염"은, 숙주 세포에의 외인성 핵산(예를 들면, DNA)의 도입을 위해 통상적으로 사용되는 각종 기술, 예를 들면, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, 및 DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함한다.
용어 "사이토카인"은, 다른 세포 군집에 세포간 매개인자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질을 말한다. 용어 "사이토카인"은, 천연 공급원 유래 또는 재조합체 세포 배양액 유래의 단백질, 및 본래의 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
용어 "생물학적 샘플"은 살아있는 것 또는 전에 살아있던 것으로부터의 물질의 양을 의미한다. 이러한 물질로는 혈액(예를 들면, 전혈), 혈장, 혈청, 뇨, 양수, 활막액, 내피 세포, 백혈구, 단핵구, 기타 세포, 기관, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
용어 "구성성분"은 조성물의 요소를 말한다. 예를 들면, 진단학적 키트와 관련하여, 구성성분은, 시험 샘플의 검정을 위한 키트에 포함될 수 있는, 포획 항체, 검출 또는 접합체 항체, 대조군, 캘리브레이터, 일련의 캘리브레이터들, 민감성 패널, 컨테이너, 완충제, 희석제, 염, 효소, 효소에 대한 공동-인자, 검출 시약, 전처리 시약/용액, (예를 들면, 용액으로서의) 기질, 및 정지 용액 등일 수 있다. 따라서, "구성성분"은, 소정 실시형태에서, 예를 들면, 항-분석물(예를 들면, 항-폴리펩타이드) 항체에 결합함으로써 고체 지지체 상에 고정화되는, 폴리펩타이드 또는 상기와 같은 다른 분석물을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 하나 이상의 구성성분은 용액 중에 존재하거나 동결건조될 수 있다.
"대조군"은, 분석물을 포함하지 않는 조성물("음성 대조군") 또는 분석물을 포함하는 조성물("양성 대조군")을 말한다. 양성 대조군은 공지의 농도의 분석물을 포함할 수 있다. "대조군", "양성 대조군" 및 "캘리브레이터"는, 공지의 농도의 분석물을 포함하는 조성물을 나타내는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. "양성 대조군"은, 검정 수행 특성을 확립하기 위해 사용될 수 있고, 시약(예를 들면, 분석물)의 완전성(integrity)의 유용한 지표이다.
"소정의 컷오프" 및 "소정 수준"은, 일반적으로 소정 컷오프/수준에 대해 검정 결과를 비교함으로써 진단학적/예측진단학적/치료학적 효능 결과를 평가하기 위해 사용되는 검정 컷오프 값을 말하고, 여기서, 상기 소정 컷오프/수준은 이미 각종 임상학적 매개변수들(예를 들면, 질환의 중증도, 진전/비진전/개선 등)과 링크 또는 관련되어 왔다. 본 발명은 개시는 예시의 소정 수준을 제공할 수 있지만, 컷오프 값은 면역 검정의 특성(예를 들면, 사용된 항체 등)에 따라 변할 수 있음이 익히 공지되어 있다. 또한, 본 개시에 기초한 다른 면역 검정에 대한 면역검정-특이적 컷오프 값을 수득하기 위해 다른 면역검정에 대해 본원의 개시를 적용시키는 것은 당해 분야 숙련가의 역량 내이다. 반면, 소정 컷오프/수준의 정확한 값은 검정들 간에 다를 수 있고, 본원에 기술되어 있는 상호관계(존재하는 경우)는 일반적으로 적용가능할 수 있다.
본원에 기술되어 있는 진단학적 검정에서 사용되는 "전처리 시약", 예를 들면, 용출, 침전 및/또는 가용화 시약은, 시험 샘플 중에 존재하는 임의의 세포를 용출시키고/시키거나 임의의 분석물을 가용화시키는 시약이다. 전처리는, 본원에 추가로 기술되는 바와 같이 모든 샘플에 필요한 것은 아니다. 그 중에서도, 분석물(예를 들면, 목적하는 폴리펩타이드)을 가용화하는 것은, 샘플 중에 존재하는 내인성 결합 단백질로부터의 분석물의 방출을 수반할 수 있다. 전처리 시약은 균질(분리 단계 요구하지 않음) 또는 비균질(분리 단계를 요구함)일 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 비균질 전처리 시약을 이용하는 경우, 검정의 다음 단계를 진행하기 전에, 침전된 분석물-결합 단백질을 시험 샘플로부터 제거한다.
본원에 기술되어 있는 면역검정 및 키트와 관련된 "품질 제어 시약"으로는 캘리브레이터, 대조군, 및 민감성 패널이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 하나 이상의 "캘리브레이터(들)" 또는 "표준물(들)"은, 전형적으로, 항체 또는 분석물과 같은 표적 분자 농도의 보간법(interpolation)을 위한 캘리브레이션(표준) 곡선을 확립하기 위해서 사용된다. 몇몇의 실시형태에서, 소정 양성/음성 컷오프에 가까운 단일 캘리브레이터를 사용할 수 있다. 대안으로, 다른 실시형태에서, "민감성 패널" 또는 "민감성 농도구배"를 확립하기 위해서 다중 캘리브레이터들(즉, 1개 초과의 캘리브레이터 또는 변하는 양의 캘리브레이터(들))을 사용할 수 있다.
용어 "특이적 결합 파트너"는 특이적 결합 쌍의 구성원을 말한다. 특이적 결합 쌍은, 화학적 또는 물리적 수단을 통해 서로 특이적으로 결합하는 2개의 상이한 분자들을 포함한다. 각종 실시형태에서, 항원 및 항체 특이적 결합 이외에, 다른 특이적 결합 쌍은 비오틴 및 아비딘(또는 스트렙트아비딘), 탄수화물 및 렉틴, 상보성 뉴클레오타이드 서열, 이펙터 및 수용체 분자, 공동 인자 및 효소, 그리고, 효소 억제제 및 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 특이적 결합 쌍은, 몇몇의 실시형태에서, 본래의 특이적 결합 구성원의 유사체인 구성원들, 예를 들면, 분석물-유사체를 포함할 수 있다. 면역반응 특이적 결합 구성원으로는, 단리되거나 재조합적으로 생산된, 항원, 항원 단편, 및 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 포함하는 항체, 및 복합체, 이들의 단편, 및 변이체(변이체의 단편 포함)가 포함된다.
용어 "Fc 영역"은, 온전한 항체의 파파인 소화에 의해 생성될 수 있는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의한다. Fc 영역은 본래의 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인의 2개의 불변 도메인들을 포함하고, 임의로 CH4 도메인을 포함한다. 항체 이펙터 기능을 변경하기 위한 Fc 부분에서의 아미노산 잔기의 대체는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, US 특허 제5,648,260호 및 제5,624,821호). Fc 영역은 몇몇의 중요한 이펙터 기능, 예를 들면, 사이토카인 유도, 항체 의존적 세포 매개된 세포독성(ADCC), 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC), 및 항체 및 항원-항체 복합체의 반감기/청소율을 매개한다. 몇몇의 경우에, 이들 이펙터 기능은 치료학적 면역글로불린에 바람직하지만, 다른 경우에는 치료학적 대상에 따라 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다.
용어 결합 단백질의 "항원-결합부"는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 결합 단백질(예를 들면, 항체)의 하나 이상의 단편을 의미한다. 결합 단백질의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편, 및 이특이적, 이원 특이적, 또는 아중-특이적 포맷에 의해 수행될 수 있다. 용어 결합 단백질의 "항원-결합부" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가의 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에 디설파이드 가교에 의해 링크된 2개의 Fab 단편들을 포함하는 2가의 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편; 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은, 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가의 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄(단일 쇄 Fv(scFv)로서도 공지되어 있음)로서 제조되는 것을 가능하게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 또한, 이러한 단일 쇄 항체는 용어 항체의 "항원-결합부" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 단일 쇄 항체의 다른 형태, 예를 들면, 디아바디도 포함된다. 또한, 단일 쇄 항체는, 상보성 경쇄 폴리펩타이드와 함께 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fv 절편의 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 "선형 항체"도 포함한다.
용어 "다가의 결합 단백질"은, 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 의미한다. 한 실시형태에서, 다가의 결합 단백질은, 3개 이상의 항원 결합 부위들을 갖도록 조작되고, 천연 발생 항체는 아니다. 용어 "다중 특이적 결합 단백질"은, 2개 이상의 관련 또는 비관련 표적들에 결합할 수 있는 결합 단백질을 말한다. 한 실시형태에서, 본원에서 제공되는 DVD 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하고, 4가 또는 다가의 결합 단백질이다.
용어 "링커"는, 2개의 폴리펩타이드들(예를 들면, 2개의 VH 또는 2개의 VL 도메인들)을 링크하는데 사용되는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는, 아미노산 잔기 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 링커 폴리펩타이드의 예는 당해 분야에 익히 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123]을 참조한다).
용어 "캐뱃 번호매김", "캐뱃 정의" 및 "캐뱃 표지화"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당해 분야에서 인지되어 있는 이들 용어는, 항체 또는 이의 항원 결합부의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들에서 다른 아미노산 잔기보다 더 가변성(즉, 초가변성)인 아미노산 잔기의 번호매김 시스템을 말한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 및 Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역에 관해서, 초가변성 영역은, CDR1의 경우 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3의 경우 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 관해서, 초가변 영역은, CDR1의 경우 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2의 경우 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3의 경우 아미노산 89 내지 97의 범위이다.
용어 "CDR"은 면역글로불린 가변 영역 서열 내의 상보성 결정 영역을 의미한다. 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역들에는 3개의 CDR들이 있고, 중쇄 및 경쇄 가변 영역들 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 명명된다. 용어 "CDR 세트"는, 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역 내에서 발생하는 3개의 CDR들의 그룹을 말한다. 이들 CDR의 정확한 경계선은 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 문헌[Kabat(Kabat et al. (1987) 및 (1991)]에 기술되어 있는 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR들을 한정하는 정확한 잔기 경계선도 제공한다. 이들 CDR은, 캐뱃 CDR로서도 언급될 수 있다. 문헌[Chothia and colleagues(Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883)]에서는, 아미노산 서열 수준에서 다양성이 크다 할지라도 캐뱃 CDR 내의 소정 서브-부분은, 거의 동일한 펩타이드 골격 입체배좌(conformation)를 취하고 있음이 발견되었다. 이들 서브-부분은 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명되었고, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 초티아 CDR로서 언급될 수 있고, 이는 캐뱃 CDR과 중복되는 경계선을 갖는다. 캐뱃 CDR과 중복되는 CDR을 규정하는 다른 경계선은 문헌[Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45]에 기술되어 있다. 또 다른 CDR 경계선 규정은 본원의 시스템들 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있지만, 이들이, 특정 잔기 또는 잔기들의 그룹 또는 심지어 전체 CDR들이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 측면에서 단축되거나 연장될 수 있지만 그럼에도 불구하고 캐뱃 CDR들과 중복될 것이다. 비록 소정 실시형태는 캐뱃 또는 초티아 규정된 CDR을 사용하지만, 본원에 사용된 방법은 이들 시스템들 중 어느 하나에 따라 정의된 CDR들을 이용할 수 있다.
용어 "에피토프"는, 결합 단백질에 의해 결합되는 항원의 영역, 예를 들면, 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 영역을 의미한다. 소정 실시형태에서, 에피토프 결정인자로는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴, 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적 활성 표면 그룹핑(grouping)이 포함되고, 소정 실시형태에서는 특이적 3차원 구조적 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 한 실시형태에서, 에피토프는, 특이적 결합 파트너 상의 상보성 부위에 결합하는 것으로 공지되어 있는 항원(또는 이의 단편)의 영역의 아미노산 잔기들을 포함한다. 항원성 단편은 1개 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 소정 실시형태에서, 결합 단백질은, 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물 중에서 이의 표적 항원을 인식하는 경우에 항원에 특이적으로 결합한다. 결합 단백질은, 항체가 교차-경쟁하는 경우(예를 들면, 하나가 다른 하나의 결합 단백질에의 결합을 방지하거나, 다른 하나의 결합 단백질에의 결합에 대한 조절 효과를 억제시키는 경우)에 "동일한 에피토프에 결합한다". 에피토프 인식을 가시화하고 모델링하는 방법은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 20090311253).
"약동학"은, 이에 의해 약물이 흡수되고, 분포되고, 대사되고, 유기체에 의해 분비되는 프로세스를 말한다. 몇몇의 실시형태에서, 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는 다가의 결합 단백질 분자를 생성하기 위해서, 유사하게 바람직한 약동학적 프로파일을 갖는 모 모노클로날 항체가 선택된다. 선택된 모 모노클로날 항체의 PK 프로파일은, 예를 들면, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법(US 20090311253)의 설치류를 이용하여 용이하게 측정될 수 있다.
"생체 이용률"은, 투여에 따라 이의 표적에 도달하는 활성 약물의 양을 말한다. 생체 이용률은, 안정성, 용해도, 면역원성 및 약동학을 포함하는, 이전에 기술되어 있는 몇몇의 특성들의 기능이고, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 방법(US 20090311253)을 이용하여 평가할 수 있다.
용어 "표면 플라스몬 공명"은, 예를 들면, BIAcore® 시스템(BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학 현상을 의미한다. 추가의 상세한 설명에 대해 문헌[Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26]을 참조한다. 용어 "Kon"은, 결합된 복합체(예를 들면, DVD/항원 복합체)를 형성하기 위한 항원에 대한 결합 단백질(예를 들면, 항체 또는 DVD)의 회합에 관한 온 레이트 상수(on rate constant)를 의미한다. 또한, "Kon"은, 용어 "회합 속도 상수" 또는 "ka"를 의미하고, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 값은 표적 항원에 대한 결합 단백질의 결합 속도 또는 결합 단백질(예를 들면, 항체)과 항원 사이의 복합체 형성 속도를 나타낸다. 또한, 하기 등식으로도 나타낸다:
항체("Ab") + 항원("Ag") → Ab-Ag.
용어 "Koff"는, 결합된 복합체(예를 들면, DVD/항원 복합체)로부터의 결합 단백질(예를 들면, 항체 또는 DVD)의 해리에 관한 오프 레이트 상수, 또는 "해리 속도 상수"를 의미하고, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같다. 이 값은, 하기 등식으로 나타낸 바와 같이, 이의 표적 항원으로부터의 결합 단백질(예를 들면, 항체)의 해리 속도, 또는 시간 경과에 따른 Ab-Ag 복합체의 유리 항체 및 항원으로의 분리를 나타낸다:
Ab + Ag ← Ab-Ag
용어 "KD" 및 "평형 해리 상수"는, 평형 상태에서의 적정 측정으로 얻어진 값 또는 해리 속도 상수(Koff)를 회합 속도 상수(Kon)로 나눈 값을 의미한다. 회합 속도 상수, 해리 속도 상수 및 평형 해리 상수는, 항원에 대한 결합 단백질(예를 들면, 항체 또는 DVD)의 결합 친화도를 나타내는 것으로 사용된다. 회합 및 해리 속도 상수를 측정하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 형광성-기반 기술의 사용은, 고도의 민감성 및 평형 상태에서 생리학적 완충액 중의 샘플을 조사하는 능력을 제공한다. 다른 실험적 접근법 및 기기, 예를 들면, BIAcore®(생체 분자 상호작용 분석) 검정을 사용할 수 있다(예를 들면, 제조사 BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden으로부터 입수가능한 기기). 추가로, Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)로부터 입수가능한 KinExA®(동력학 배척 검정) 검정도 사용할 수 있다.
용어 "변이체"는, 아미노산의 부가(예를 들면, 삽입), 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이, 주어진 폴리펩타이드와 상이하지만, 주어진 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는, 폴리펩타이드를 의미한다(예를 들면, 변이체 VEGF 항체는, VEGF에 대해 결합하기 위해 항-VEGF 항체와 경쟁할 수 있다). 아미노산의 보존적 치환, 즉, 한 아미노산을 유사한 성질(예, 소수성 및 하전 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 대체하는 것은, 전형적으로 미소한 변화를 제공하는 것으로서 당해 분야에서 인지된다. 이들의 미소한 변화는, 당해 분야에서 이해되는 바와 같이(예를 들면, 문헌[Kyte et al. (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132]을 참조한다), 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)를 고려함으로써 부분적으로 동정될 수 있다. 한 양상에서, ±2의 수치료 지수를 갖는 아미노산들이 치환된다. 또한, 아미노산의 친수성은, 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 초래할 수 있는 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩타이드와 관련하여 아미노산의 친수성의 고려는 상기 펩타이드의 최대 국소 평균 친수성의 계산을 가능하게 하고, 이는 항원성 및 면역원성과 익히 상호관련된 것으로 보고된 유용한 측정값이다(예를 들면, 미국 특허 제4,554,101호를 참조한다). 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 당해 분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들면, 면역원성을 보유하는 펩타이드를 초래할 수 있다. 한 양상에서, 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산들로 수행된다. 아미노산의 소수성 지수와 친수성 값 둘 다는, 상기 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일치하여, 생물학적 기능과 부합되는(compatible) 아미노산 치환은, 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 성질들에 의해 밝혀지는 바와 같이 아미노산, 및 특히 이들 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 의존하는 것으로 이해된다. 또한, 용어 "변이체"는, 예를 들면, 단백질 용해, 인산화, 또는 기타 번역-후 변형에 의해 구별하여 프로세싱되었지만 여전히 생물학적 활성 또는 항원 반응성, 예를 들면, VEGF 및/또는 DLL4에 결합하는 능력을 보유하는, 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함한다. 용어 "변이체"는, 달리 정의되지 않는 한 변이체의 단편을 포함한다. 변이체는 야생형 서열에 대해 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%,85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 또는 75% 동일할 수 있다.
I. 결합 단백질의 생성
2개의 상이한 항원들에 결합할 수 있는 결합 단백질, 및 이를 제조하는 방법이 제공된다. 당해 결합 단백질은, 각종 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 발현 벡터, 숙주 세포 및 결합 단백질을 생성하는 방법도 제공된다.
A. 모 모노클로날 항체의 생성
DVD 결합 단백질의 가변 도메인들은, 목적하는 항원에 결합할 수 있는 폴리클로날 Ab 및 모노클로날 Ab(mAb)를 포함하는 모 항체(Ab)로부터 수득될 수 있다. 이들 항체는 천연적으로 발생할 수 있거나, 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 당해 분야 숙련가는, 하이브리도마 기술의 이용, 선택된 림프구 항체 방법(SLAM), 파지, 이스트, 또는 RNA-단백질 융합 디스플레이 또는 다른 라이브러리의 사용, 사람 면역글로불린 유전자좌의 적어도 일부를 포함하는 비-사람 동물의 면역화, 및 키메라, CDR-절편이식된, 및 사람화된 항체의 제조를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 항체 제조 방법과 매우 친숙하다. 예를 들면, 문헌[US 특허 공개 제20090311253 A1]을 참조한다. 또한, 가변 도메인은, 친화성 성숙 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
B. 모 모노클로날 항체를 선택하기 위한 기준
DVD 결합 단백질 분자에서 바람직한 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 모 항체를 선택함을 포함하는 한 실시형태가 제공된다. 한 실시형태에서, 바람직한 특성은 하나 이상의 항체 매개변수, 예를 들면, 항원 특이성, 항원에 대한 친화도, 효력, 생물학적 기능, 에피토프 인식, 안정성, 용해도, 생산 효율, 면역원성, 약동학, 생체 이용률, 조직 교차 반응성, 또는 이종상동성 항원 결합이다. 예를 들면, 문헌[US 특허 공개 제20090311253호]을 참조한다.
C. 결합 단백질 분자
각종 실시형태에서, 결합 단백질은, 2개의 상이한 모 모노클로날 항체들 유래의 2개의 상이한 경쇄 가변 도메인(VL)들이 탠덤에서 직접적으로 또는 재조합 DNA 기술에 의한 링커를 통해 링크되어 경쇄 불변 도메인(CL)에 이어지도록 고안될 수 있다. 유사하게, 중쇄는, 탠덤에서 직접적으로 또는 링커를 통해 링크되어 불변 도메인 CH1 및 Fc 영역에 이어지는 2개의 상이한 중쇄 가변 도메인(VH)들을 포함한다(도 1).
각종 실시형태에서, 가변 도메인들은, 본원에 기술되어 있는 방법들 중 어느 하나에 의해 생성된 모 항체로부터 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 한 실시형태에서, 가변 도메인은 뮤린 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다. 다른 실시형태에서, 가변 도메인은, CDR 절편이식된 또는 사람화된 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인이다. 한 실시형태에서, 가변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인이다.
각종 실시형태에서, 링커 서열은 단일 아미노산 또는 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 한 실시형태에서, 링커 서열의 선택은 몇몇의 Fab 분자의 결정 구조 분석에 기초한다. Fab 또는 항체 분자 구조에서 가변 도메인과 CH1/치 불변 도메인 사이에 천연 가요성 링크(natural flexible linkage)가 존재한다. 이러한 천연 링크는, 일반적으로, V 도메인의 C-말단 유래의 4 내지 6개의 잔기들 및 CL/CH1 도메인의 N-말단 유래의 4 내지 6개의 잔기들에 의해 기여되는 대략 10 내지 12개 아미노산 잔기들을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 경쇄 및 중쇄에서 각각 링커로서 CL 또는 CH1의, N-말단 5 내지 6개의 아미노산 잔기들, 또는 11 내지 12개 아미노산 잔기들을 이용하여 생성된다. CL 또는 CH1 도메인들의 N-말단 잔기들, 특히, 처음 5 내지 6개의 아미노산 잔기들은 강한 2차 구조의 부재 하에 루프 입체구조를 채택할 수 있고, 따라서, 2개의 가변 도메인들 사이의 가요성 링커들로서 작용할 수 있다. CL 또는 CH1 도메인들의 N-말단 잔기들은, 이들이 Ig 서열의 일부이므로, 가변 도메인들의 천연 연장이고, 따라서, 이들의 사용은 링커 및 연결부로부터 잠재적으로 발생하는 임의의 면역원성을 큰 정도를 최소화한다.
각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질은, 서열번호 1 내지 서열번호 38 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 링커를 포함한다(표 1). 한 실시형태에서, X2는 Fc 영역이다. 다른 실시형태에서, X2는 변이체 Fc 영역이다.
Figure pat00001
다른 링커 서열은, CL/CH1 도메인의 모든 잔기는 아닌; 예를 들면, CL/CH1 도메인의 처음 5 내지 12개 아미노산 잔기들의 CL/CH1로부터 유도된 임의의 길이의 임의의 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 경쇄 링커는 Cκ 또는 Cλ로부터 선택될 수 있고; 중쇄 링커는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는 임의의 이소형의 CH1로부터 유도될 수 있다. 또한, 링커 서열은 다른 단백질, 예를 들면, Ig-유사 단백질(예를 들면, TCR, FcR, KIR); G/SR 기반 서열(예를 들면, G4S 리피트); 힌지 영역-유도된 서열; 및 다른 단백질 유래의 다른 본래의 서열로부터 유도될 수 있다. 다른 링커 서열은 G/S 리피트(예를 들면, GGGS 모티프의 리피트를 포함하는 서열)를 포함하는 임의의 길이의 임의의 서열, 또는 임의의 다른 펩타이드 링커를 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 불변 도메인은, 재조합 DNA 기술을 이용하여 2개의 링크된 가변 도메인들에 링크된다. 한 실시형태에서, 링크된 중쇄 가변 도메인들을 포함하는 서열은 중쇄 불변 도메인에 링크되고, 링크된 경쇄 가변 도메인들을 포함하는 서열은 경쇄 불변 도메인에 링크된다. 한 실시형태에서, 불변 도메인들은 각각 사람 중쇄 불변 도메인 및 사람 경쇄 불변 도메인이다. 한 실시형태에서, DVD 중쇄는 추가로 Fc 영역에 링크된다. Fc 영역은 본래의 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 사람 Fc 영역이다. 다른 실시형태에서, Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 유래의 Fc 영역을 포함한다.
한 실시형태에서, 표 2에 열거되는 표적 항원들 중 하나에 대한 기능성 결합 부위를 갖고, 표 2에 열거된 쌍들로부터 선택되는 쌍을 이룬 VH 및 VL 영역을 포함하거나, 이들 VH 및 VL 영역의 CDR 영역들을 포함하는 항체를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 항원 결합 단편이 개시된다. 예를 들면, 항체는, DLL4에 대한 기능성 결합 부위를 형성하는 표 2로부터의 VH 및 VL 영역들을 포함할 수 있다. 한 실시형태에서, 기능성 항원 결합 단편은, 표적 항원에 결합하기에 충분한 가변 도메인 영역(예를 들면, 표 2에서의 쌍을 이룬 VH 및 VL 서열로부터 취한 CDR 영역)을 보유한다. 기능성 항원 결합 단편은, 사람화된, 완전 사람, 카멜화된, 단일쇄, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이된, 역-돌연변이된, 또는 CDR-절편이식된 항체, 또는 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH(나노바디로서도 칭함), 또는 이-특이적 또는 다중-특이적 항체를 포함하는 항원-결합 기능을 보유하는 다른 항체 단편을 포함할 수 있다.
한 실시형태에서, 표 2의 가변 도메인들로부터 선택되는 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질이 개시된다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 상기 기술되어 있는 바와 같이, 제1 쇄 및 제2 쇄 및 2개의 기능성 결합 부위를 포함하고, 여기서, 결합 단백질의 제1 쇄 및 제2 쇄는, 표 2에 열거되는 표적 항원들 중 하나 이상에 대한 2개의 기능성 결합 부위를 형성한다. 한 실시형태에서, 각각의 기능성 결합 부위는, 표 2에 열거되는 쌍들로부터 선택되거나 이들 VH 및 VL 영역의 CDR 영역들을 포함하는 쌍을 이룬 VH 및 VL 서열(예를 들면, DLL4에 대한 결합 부위를 형성하는 쌍을 이룬 VH 및 VL 서열)들을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 제1 쇄는, 표 2로부터 선택되는 제1 VH 서열 및 제2 VH 서열을 포함하거나, 이들 VH 서열들 유래의 CDR 서열들을 함유하고, 제2 쇄는, 표 2로부터 선택되는 제1 VL 서열 및 제2 VL 서열을 포함하거나, 이들 VL 서열들 유래의 CDR 서열들을 함유한다. 다른 실시형태에서, 제1 또는 제2 결합 부위의 VH-VL 배열은, 각각의 쇄가 2개의 기능성 결합 부위를 보유하면서 하나의 결합 부위 유래의 VH 도메인 및 다른 결합 부위 유래의 VL 도메인을 포함하도록, 2개의 쇄들에 걸쳐 플립핑된다(flipped).
한 실시형태에서, 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드 및 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드는 결합되어 DVD 결합 단백질을 형성한다. 표 2는, 질환을 치료하는데 유용한 예시 항체들의 VH 및 VL 영역들의 아미노산 서열들을 열거한다. 한 실시형태에서, 표 2에 열거되는 VH 및/또는 VL 영역들 중 2개 이상을 임의의 배향으로 포함하는 DVD가 제공되고, 여기서, VH 및/또는 VL 서열들 중 1개 이상은 서열번호 39 또는 서열번호 40이다. 몇몇의 실시형태에서, VD1 및 VD2는 독립적으로 선택된다. 하기에 제공되는 VH 및 VL 도메인 서열은 상보성 결정 영역(CDR)들 및 프레임워크 서열들을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, 이들 CDR 및/또는 프레임워크 서열 중 하나 이상은, 기능의 손실 없이, 동일한 항원에 결합하는 것으로 당해 분야에 공지되어 있는 결합 단백질 유래의 다른 CDR들 및/또는 프레임워크 서열들로 대체된다.
Figure pat00002
Figure pat00003
몇몇의 실시형태에서, 서열번호 55 내지 서열번호 63으로부터 선택되는 VH 영역을 포함하는, DVD 결합 단백질이 제공된다. 소정 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 서열번호 64 내지 서열번호 73으로부터 선택되는 VL 영역을 포함한다. 몇몇의 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 서열번호 55 내지 서열번호 63으로부터 선택되는 VH 영역, 및 서열번호 64 내지 서열번호 73으로부터 선택되는 VL 영역을 포함한다. 이들 VH 및 VL 도메인들에 대한 아미노산 서열들은 하기 표 3에 나타낸다.
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
[표 3a]
Figure pat00007
표 3a는, VEGF 및 DLL4에 대해 지시되는 결합 단백질에 대한 전장 중쇄 및 경쇄 서열을 제공한다. 링커 서열은 밑줄 그어져 있고, 한편, CDR들 및 불변 영역 서열들은 볼드체이다.
특정 표적들에 결합할 수 있는 특정 DVD 결합 단백질들, 및 이의 제조 방법의 상세한 설명이 하기 실시예 섹션에서 제공된다.
D. 결합 단백질의 생산
본원에서 제공되는 결합 단백질은, 당해 분야에 공지되어 있는 다수의 기술들 중 임의의 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 결합 단백질은 숙주 세포에서 발현될 수 있고, 여기서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포에 형질감염된다. 몇몇의 실시형태에서, 본원에 제공되는 DVD 결합 단백질은 원핵생물 숙주 세포에서 발현된다. 다른 실시형태에서, DVD 결합 단백질은 진핵생물 세포, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포에서 발현된다.
DVD 단백질의 재조합 발현을 위한 예시적 시스템에서, DVD 중쇄 및 DVD 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 칼슘 포스페이트-매개된 형질감염에 의해 DHFR-CHO 세포에 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, DVD 중쇄 및 경쇄 유전자들은 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동적으로 링크되어 높은 수준의 유전자 전사를 추진한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 지니고, 이는, 메토트렉세이트 선택/증폭을 이용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포의 선택을 가능하게 한다. 선택된 숙주 세포를 배양하여 DVD 중쇄 및 경쇄의 발현을 가능하게 하고, 배양 배지로부터 온전한 DVD 단백질을 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 DVD 단백질을 회수한다. 각종 실시형태에서, 적합한 배양 배지에서 단백질이 합성될 때까지 숙주 세포를 배양함으로써 DVD 단백질을 합성하는 방법도 본원에 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은, 배양 배지로부터 DVD 단백질을 단리함을 추가로 포함할 수 있다.
DVD 결합 단백질의 특성은, 종래 항체와 유사한 방식으로 생산되고 정제될 수 있다는 것이다. 몇몇의 실시형태에서, DVD 결합 단백질의 생산은, 바람직한 이원-특이적 활성을 갖고 불변 영역의 서열 변형 또는 화학적 변형에 대한 요구가 없는, 균질한 단일 주요 생성물을 초래한다. "이-특이적", "다중-특이적", 및 "다중-특이적 다가의" 전장 결합 단백질을 생성하는 다른 이전에 기술되어 있는 방법들은, 상이한 결합 부위들과 병용하여, 어셈블링된 불활성, 단일-특이적, 다중-특이적, 다가의, 전장 결합 단백질, 및 다가의 전장 결합 단백질의 혼합물의 세포내 또는 분비형 생산을 초래할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 DVD 단백질의 고안은, 숙주 세포에서의 발현 후에 주로 바람직한 "이원-특이적 다가의 전장 결합 단백질"에 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 어셈블링되게 한다.
몇몇의 실시형태에서, 발현 및 어셈블링된 이원 가변 도메인 면역글로불린 분자들의 50% 이상, 75% 이상, 또는 90% 이상(또는 이들 사이의 임의의 백분율)은, 바람직한 이원-특이적 4가의 단백질이고, 따라서, 향상된 상업적 유용성을 갖는다. 따라서, 소정 실시형태에서, "이원-특이적 4가의 전장 결합 단백질"의 단일 주요 생성물을 초래하는 단일 세포에서 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키는 방법이 제공된다.
각종 실시형태에서, "이원-특이적 4가의 전장 결합 단백질"의 "주요 생성물"을 초래하는 단일 세포에서 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 발현시키는 방법이 제공되고, 여기서, "주요 생성물"은, 이원 가변 도메인 경쇄 및 이원 가변 도메인 중쇄를 포함하는 전체 어셈블링된 단백질의 50% 초과, 예를 들면, 75% 초과, 또는 90% 초과(또는 이들 사이의 임의의 백분율)이다.
II. 결합 단백질의 용도
1개, 2개, 또는 그 이상의 항원들에 결합하는 결합 단백질의 능력을 고려해보면, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 소정 실시형태에서, 종래 면역검정, 예를 들면, 효소 링크된 면역흡착 검정(ELISA), 방사선 면역검정(RIA), 또는 조직 면역조직화학을 이용하여, 샘플(예를 들면, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 샘플) 중의 항원(들)을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은, 검출가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지하여 결합 또는 비결합 항체의 검출을 가능하게 한다. 적합한 검출가능한 물질로는 각종 효소, 보결분자단, 형광성 재료, 발광성 재료 및 방사활성 재료가 포함된다. 적합한 효소의 예로는 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제가 포함되고; 적합한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙트아비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되고; 적합한 형광성 재료의 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함된다. 발광성 재료의 예로는 루미놀이 있고, 적합한 방사활성 재료의 예로는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, 및 153Sm이 포함된다.
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 이의 항원 표적의 활성을 시험관내에서 그리고/또는 생체내에서 중화시킬 수 있다. 따라서, 소정 실시형태에서, 결합 단백질은, 예를 들면, 항원을 함유하는 세포 배양액에서, 사람 대상체에서, 또는 결합 단백질이 교차-반응하는 항원을 갖는 다른 포유동물 대상체에서, 항원 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 항원이 유해한 질환 또는 장애를 앓고 있는 사람 또는 비-사람 동물 대상체에서 항원 활성을 감소시키는 방법이 제공된다. 각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은 진단학적 또는 치료학적 목적으로(예를 들면, 이상 VEGF 및/또는 DLL4 발현을 특징으로 하는 질환과 같은 질환을 검출하거나 치료하기 위해) 사람 또는 비-사람 동물 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "항원 활성이 유해한 장애"는, 장애를 앓고 있는 대상체에서의 항원의 존재가, 밝혀져 있거나, 장애의 병리생리학 및/또는 장애의 악화에 기여하는 인자에 관여하고 있는 것으로 의심되는, 질환 및/또는 다른 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 항원 활성이 유해한 장애는, 항원 활성의 감소가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시키는 것으로 기대되는 장애이다. 이러한 장애는, 예를 들면, 장애를 앓고 있는 대상체의 생물학적 유체 중의 항원 농도의 증가(예를 들면, 대상체의 혈청, 혈장, 활막액 등 중의 항원 농도의 증가)에 의해 입증될 수 있다. 본원에서 제공되는 결합 단백질로 치료될 수 있는 장애의 비-제한적 예로는, 하기에 그리고 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 섹션에서 논의되는 것들이 포함된다.
각종 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 유해한 항원에 대한 결합을 증가시키고/시키거나 동시에 2개의 상이한 항원 표적들(DLL4 및/또는 VEGF)을 차단하여 효능/안전성을 향상시키고/시키거나 환자 범위를 증가시키기 위한 치료학적 제제로서 유용하다.
추가로, 몇몇의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 DVD 결합 단백질은, (예를 들면, 향상된 국소 PK를 위해 조직 마커 및/또는 질환 매개인자를 표적으로 하고, 이에 의해 보다 높은 효능 및/또는 보다 낮은 독성을 제공하기 위한) 세포내 전달(예를 들면, DVD를 세포내 분자에 대해 표적화함)을 포함하는 조직-특이적 전달에 사용될 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 항원의 비-중화성 에피토프에 대한 결합을 통해 특정 위치에 항원을 전달하기 위한, 또한, 항원의 반감기를 증가시키기 위한, 담체 단백질로서도 작용할 수 있다. 또한, 소정 실시형태에서, DVD 결합 단백질은, 환자에게 이식되는 의료 장치에 물리적으로 링크되거나, 이들 의료 장치를 표적으로 하도록 고안될 수 있다(문헌[Burke et al. (2006) Advanced Drug Deliv. Rev. 58(3): 437-446; Hildebrand et al. (2006) Surface and Coatings Technol. 200(22-23): 6318-6324; Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu (2006) Biomaterials 27(11):2450-2467; Mediation of the cytokine network in the implantation of orthopedic devices, Marques (2005) Biodegradable Systems in Tissue Engineer. Regen. Med. 377-397]을 참조한다).
A. 각종 질환에서의 결합 단백질의 용도
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 각종 질환 또는 장애, 예를 들면, DLL4 및/또는 VEGF의 유해한 발현 또는 발현 수준과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료학적 분자로서 유용하다. 몇몇의 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은 원발성 및/또는 전이성 암을 진단하고, 치료하거나, 항-종양 치료요법을 향상시키기 위해 투여될 수 있고/있거나, 원발성 및/또는 전이성 암의 치료시에 이로울 수 있다. 각종 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 종양학적 병태를 진단하거나, 치료하거나, 이의 치료를 향상시키기 위해 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 이상 혈관신생을 특징으로 하는 임의의 다른 질환 또는 장애(예를 들면, 일반적 자가면역 및 염증성 장애, 상처 치유)를 진단하거나, 치료하거나, 이의 치료를 향상시키기 위해 투여될 수 있다. 각종 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질의 투여는 VEGF 및/또는 DLL4에 대한 결합을 초래하고, 이는, 과도한 VEGF 및/또는 DLL4 수준을 특징으로 하는 병태를 DFKG고 있는 환자에서의 VEGF 및/또는 DLL4의 수준을 중화시키거나 그렇지 않으면 이 수준을 감소시킬 수 있다.
본 개시를 제한하지 않으면서, 소정 질환 병태에 대한 추가의 정보가 제공된다.
1. 종양학적 장애
모노클로날 항체 치료요법은 암에 대한 중요한 치료학적 양식으로서 부상하고 있다(von Mehren et al. (2003) Annu. Rev. Med. 54:343-69). 2개의 별개의 종양원성 매개인자를 표적으로 하는 본원에 개시되어 있는 바와 같은 이원-특이적 항체의 사용은 단일-특이적 치료요법과 비교하여 추가의 이점을 제공할 가능성이 있다.
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법으로 진단되고/되거나 치료될 수 있는 종양학적 질환으로는, 원발성 또는 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암(신장암, 방광암, 및 요로상피암 포함), 여성 생식관암(자궁경부암, 자궁암, 및 난소암, 및 융모막암종 및 임신성 융모성 질환 포함), 남성 생식관암(전립선암, 정낭암, 고환암, 및 생식 세포 종양 포함), 내분비선암(갑상선암, 부신암, 및 뇌하수체암 포함), 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종(골 및 연조직으로부터 발생하는 육종, 및 카포시 육종 포함), 뇌의 종양, 신경의 종양, 눈의 종양, 뇌척수막의 종양(성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반종, 및 뇌수막종 포함), 조혈 악성 종양으로부터 발생하는 고형 종양, 예를 들면, 백혈병 및 림프종(호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종 둘 다), 위암, 방광암, 전립선암, 직장암, 조혈 악성 종양, 백혈병, 림프종, 무베타지질단백질혈증, 말단 청색증, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장 암종, 모발상 세포 백혈병, 호지킨 질환, 카포시 육종, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 췌장 암종, 부종양 증후군/악성 종양의 고칼슘혈증, 육종, 고형 종양, 또는 이상 DLL4 또는 VEGF 활성을 특징으로 하는 임의의 다른 혈관신생 비의존적 또는 의존적 질환이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
각종 실시형태에서, DLL4 및/또는 VEG에 결합하는 DVD 결합 단백질, 또는 이의 항원-결합부는, 단독으로 또는 방사성 치료요법 및/또는 다른 화학치료요법제와 병용하여 사용되는 경우에 암을 진단하고/하거나 치료하고/하거나 전이를 예방하기 위해 사용된다.
2. 황반 변성
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 조성물 및 방법을 이용하여, 신생혈관성 (습윤) 황반 변성을 포함하는 황반 변성을 치료할 수 있다. 황반 변성은, 망막 손상으로 인한 시야의 중점에서의 시력 손실을 초래하는 의학적 병태이다. 신생혈관성 (습윤) 황반 변성은, 광 수용체에 비가역적 손상을 야기할 수 있는, 황반 하의 혈액 및 단백질 누출을 궁극적으로 초래하는 비정상적 혈관 성장으로부터 초래된다.
각종 실시형태에서, DLL4 및/또는 VEGF에 결합하는 DVD, 또는 이의 항원-결합부는, 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와 병용하여 사용되는 경우에 황반 변성을 진단하고/하거나 치료하기 위해 사용된다.
3. 당뇨병 및 당뇨병성 망막병증
1형 진성 당뇨병은, 췌장에서의 인슐린-생산성 베타 세포의 자가면역 파괴로부터 초래되는 진성 당뇨병의 한 형태이다. 후속적인 인슐린의 부족은, 증가된 혈당 및 뇨당을 초래한다. 당뇨병성 망막병증은, 당뇨병의 합병증으로서 망막에의 손상에 관여한다.
당뇨병성 망막병증은, 고혈당증-유도된 주피세포 사멸 및 혈관벽의 약화로부터 초래되는 망막의 혈관계에서의 작은 변화의 결과이다. 질환이 진행됨에 따라, 중증의 비증식성 당뇨병성 망막병증은, 혈관이 증식하는 진전된 단계(advanced stage)에 진입한다. 치료하지 않으면, 새로운 혈관은 출혈을 일으키고, 시력을 흐리게 하고, 추가로 망막을 손상시킬 수 있다. 또한, 섬유혈관 증식도 망막 박리를 야기할 수 있다. 또한, 증식하는 혈관은 안구의 전방으로 성장하여 신생혈관 녹내장을 야기할 수 있다.
VEGF 및 DLL4 신호전달은, 당뇨병성 신경병증 및 망막병증 둘 다의 발병에서의 관여를 포함하는 당뇨병성 내피 기능이상 및 혈관병증의 매개에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. J. Exp. Med. 209(5): 1011-28 (2012); Nephrol. Dial. Transplant. 18 (8): 1427-1430 (2003); PNAS 109(27): E1868-77 (2012); US 특허 출원 제20110189176호(Skokos et al). 따라서, VEGF 및 DLL4는, (예를 들면, 환자에서 혈청 수준을 확인하고/하거나 VEGF 및/또는 DLL4의 수준을 변경하기 위한) 본 개시의 DVD를 이용한 당뇨병 및/또는 당뇨병성 망막병증에 대한 진단 및/또는 치료요법을 위한 잠재적 표적을 나타낼 수 있다. 각종 실시형태에서, DLL4 및/또는 VEGF에 결합하는 DVD, 또는 이의 항원-결합부는, 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와 병용하여 사용되는 경우에 1형 진성 당뇨병 및/또는 당뇨병성 망막병증을 진단하고/하거나 치료하기 위해 사용한다.
4. 죽상 동맥경화증
VEGF 및 DLL4는, 죽상 동맥경화증의 진행에 관여하는 것으로 생각된다. Circulation 98(20):2108-16 (1998); PNAS 109(27): E1868-77 (2012). 특히, VEGF 발현은 사람 관상 동맥 내의 죽상 동맥경화성 병변에서 나타났고, 이는 사람 관상 죽상 동맥경화증의 진행에 있어서, 그리고, 폐색성 관상 질환의 재관통(recanalization) 프로세스에 있어서의 VEGF의 역할을 시사한다. 유사하게, 중화성 항-DLL4 항체를 이용한 DLL4 신호전달의 억제는, 죽상 동맥경화증의 발병을 약화시키고 플라크 석회화(plaque calcification)를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, VEGF 및 DLL4 수준은, (예를 들면, 환자에서 혈청 수준을 확인하고/하거나 VEGF 및/또는 DLL4의 수준을 변경하기 위한) 본 개시의 DVD를 이용한 죽상 동맥경화증에 대한 진단 및/또는 치료요법에 대한 잠재적 표적을 나타낼 수 있다. 각종 실시형태에서, DLL4 및/또는 VEGF에 결합하는 DVD, 또는 이의 항원-결합부는, 단독으로 또는 다른 치료학적 제제와 병용하여 사용되는 경우에 죽상 동맥경화증을 진단하고/하거나 치료하기 위해 사용한다.
III. 약제학적 조성물
각종 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질을 단독으로 또는 예방학적 제제, 치료학적 제제, 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 병용하여 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 약제학적 조성물의 용도의 비제한적 예로는, 장애의 진단, 검출, 및/또는 모니터링, 장애 또는 이의 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 관리, 및/또는 개선, 및/또는 연구가 포함된다. 단독으로의 또는 예방학적 제제, 치료학적 제제, 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체와 병용물로의 약제학적 조성물의 제형은 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 특허 공개 제20090311253 A1호).
각종 실시형태에서, 약제학적 제형은 적어도 하나의 아미노산, 적어도 하나의 폴리사카라이드 및/또는 폴리소르베이트, 및 종점을 포함하여 약 0.1 내지 100mg/ml 농도(예를 들면, 0.1 내지 10, 1 내지 10, 0.01 내지 50, 1 내지 50, 1 내지 100, 10 내지 100, 25 내지 100, 25 내지 50, 또는 50 내지 100mg/ml)로 존재하는 결합 단백질을 포함하고, 여기서, 상기 제형은, 종점을 포함하여 약 5.0 내지 7.0의 pH(예를 들면, 약 5.0 내지 6.0, 5.5 내지 6.0, 5.0 내지 6.5, 5.5 내지 6.5, 또는 6.0 내지 7.0)로 존재한다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고, 여기서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄의 각각은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, C는 불변 도메인이고, X1은 링커이고, X2는 Fc 영역이고, n은 0 또는 1이다]을 포함하고, 여기서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 56을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 서열번호 64를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은, 서열번호 73을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 서열번호 74를 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 한 실시형태에서, 제형 중의 적어도 하나의 아미노산은 히스티딘이고, 약 10 내지 20mM, 10 내지 15mM, 15 내지 20mM, 또는 약 15mM의 농도로 존재한다. 한 실시형태에서, 제형 중의 적어도 하나의 폴리사카라이드는 슈크로스이고, 약 0 내지 8.0% 중량/체적(w/v)의 농도로 존재한다. 한 실시형태에서, 제형 중의 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이고, 약 0 내지 0.06% w/v의 농도로 존재한다. 한 실시형태에서, 제형 중의 적어도 하나의 아미노산은 아르기닌이고, 약 0 내지 1.5% w/v(예를 들면, 0.5 내지 1.5, 1.0 내지 1.5, 또는 0.5 내지 1.0 w/v)의 농도로 존재한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 제형 중에 약 0.1 내지 100mg/ml(예를 들면, 약 1 내지 100mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 2.5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 25 내지 100mg/ml, 또는 약 20 내지 60mg/ml, 또는 25 내지 50mg/ml, 또는 약 25mg/ml, 또는 약 50mg/ml, 또는 약 0.1 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 25mg/ml, 또는 약 1.0 내지 60mg/ml, 또는 0.5 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 2.0mg/ml, 또는 약 0.5 내지 2.0mg/ml, 또는 약 1 내지 5mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 0.5mg/ml, 또는 약 1.0mg/ml)의 농도로 존재한다.
각종 실시형태에서, 약제학적 제형은 수성 제형, 동결건조된 제형, 또는 동결건조되어 재수화된 제형이다. 한 실시형태에서, 수화 용액은 덱스트로스 및/또는 염수(예를 들면, 약 5% w/v 농도의 덱스트로스 및/또는 약 0.9% w/v 농도의 염수)이다. 한 실시형태에서, 약제학적 제형은 약 15mM의 히스티딘, 약 0.03%(w/v)의 폴리소르베이트 80, 약 4% (w/v)의 슈크로스, 및 약 0.1 내지 25mg/ml의 결합 단백질, 또는 약 1 내지 15mg/ml의 결합 단백질을 포함하고, 약 6의 pH로 존재하고, 여기서, 결합 단백질은 서열번호 56 및 서열번호 64 또는 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질은 h1A11.1-SL-Av를 포함한다. 한 실시형태에서, h1A11.1-SL-Av 결합 단백질은 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역을 포함한다. 한 실시형태에서, 제형은 하나 이상의 추가의 제제를 포함한다.
각종 실시형태에서, 약 25mg/ml의 결합 단백질(예를 들면, 서열번호 56 및 서열번호 64 또는 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질), 약 15mM의 히스티딘, 0.03%의 폴리소르베이트 80(중량/체적, w/v), 4.0%의 슈크로스(w/v), 및 약 6.0의 pH를 함유하는 제형이 사용된다. 몇몇의 실시형태에서, 제형은 아르기닌을 포함하지 않는다. 몇몇의 실시형태에서, 제형은, 예상치 못하게도, 다른 구성성분 또는 농도를 포함하는 다른 제형과 비교하여 개선된 냉동-해동 안정성, 액체 제형 안정성, 및/또는 동결건조된 제형 안정성을 나타낸다.
몇몇의 실시형태에서, 상기에 논의되어 있고 서열번호 56 및 서열번호 64 또는 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는 결합 단백질을 함유하는 제형은, 제형화가능성(formulatabiliy)에서 예상치 못한 개선을 나타낸다. 예를 들면, 제형은, 5℃에서 보관하는 경우에 바람직하지 못한 겔화, 또는 높은 수준의 응집물 형성을 회피한다. 몇몇의 실시형태에서, 제형은 보관(5℃) 및 가속화된(40℃) 조건 둘 다 하에 안정하다.
본원에서 제공되는 예방학적 또는 치료학적 제제를 투여하는 방법으로는, 경구 투여, 비경구 투여(예를 들면, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외 투여, 종양내 투여, 점막 투여(예를 들면, 비내 및 구강 경로) 및 폐 투여(예를 들면, 흡입기 또는 분무기로 투여되는 에어로졸화된 화합물)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 투여 경로를 위한 약제학적 조성물의 제형, 및 각종 투여 방법에 필요한 재료 및 기술은 입수가능하고, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있다(US 특허 공개 제20090311253 A1).
각종 실시형태에서, 용량 용법은, 최적의 바람직한 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 가능하게 하도록 조정될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있거나, 몇몇의 분할 용량들을 시간 경과에 따라 투여할 수 있거나, 용량은, 치료학적 상황의 긴급함에 의해 나타내어지는 것에 비례하여 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 비경구 조성물은, 용이한 투여 및 용량의 균일성을 위해 용량 단위 형태로 제형화된다. 용어 "용량 단위 형태"는, 치료되는 포유동물 대상체에 대한 단위 용량으로서 적당한 물리적으로 별개인 단위를 말하고; 각각의 단위는, 요구되는 약제학적 담체와 관련하여 바람직한 치료학적 효과를 생성하는 것으로 계산된 소정 양의 활성 화합물을 함유한다.
본원에서 제공되는 결합 단백질의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 관한 예시의 비-제한적 범위는 약 0.1 내지 100mg/kg(예를 들면, 약 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 1, 0.1 내지 10, 0.1 내지 20, 0.1 내지 50, 0.1 내지 75, 1 내지 10, 1 내지 15, 1 내지 7.5, 1.25 내지 15, 1.25 내지 7.5, 2.5 내지 7.5, 2.5 내지 15, 5 내지 15, 5 내지 7.5, 1 내지 20, 1 내지 50, 7 내지 75, 1 내지 100, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 50, 5 내지 75, 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 75, 또는 10 내지 100mg/kg, 또는 이들 사이의 임의의 농도)이다. 몇몇의 실시형태에서, 결합 단백질은 약제학적 조성물 중에 치료학적으로 유효한 농도, 예를 들면, 약 0.1 내지 100mg/ml(예를 들면, 약 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 1, 0.1 내지 10, 0.1 내지 20, 0.1 내지 50, 0.1 내지 75, 1 내지 10, 1 내지 20, 1 내지 50, 1 내지 75, 1 내지 100, 5 내지 10, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 5 내지 50, 5 내지 75, 10 내지 20, 10 내지 50, 10 내지 75, 또는 10 내지 100mg/ml, 또는 이들 사이의 임의의 농도)의 농도로 존재한다. 용량 값은, 완화되는 병태의 유형 및/또는 중증도에 따라 변할 수 있음에 주의한다. 임의의 특정 대상체에 대해 특정 용량 용법은, 개체 요구 및/또는 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감시하는 사람의 전문가적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정될 수 있음, 그리고, 본원에서 제시되는 용량 범위는 단지 예시적이고, 특허청구범위의 조성물의 범위 또는 실행을 제한하도록 의도되는 것은 아님이 추가로 이해되어야만 한다.
IV. 병용 치료요법
또한, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 단독으로 또는 하나 이상의 추가의 치료학적 제제와 병용하여 투여하여, 질환 또는 장애, 예를 들면, DLL4 및/또는 VEGF의 유해한 발현 또는 발현 수준과 관련되어 있는 질환 또는 장애를 치료할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 원발성 및/또는 전이성 암을 진단하고, 치료하거나, 항-종양 치료요법을 향상시키기 위해, 그리고/또는 원발성 및/또는 전이성 암을 치료하기 위해, 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 각종 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 종양학적 병태를 진단하거나, 치료하거나, 또는 종양학적 병태의 치료를 향상시키기 위해, 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 이상 혈관신생을 특징으로 하는 임의의 다른 질환 또는 장애(예를 들면, 일반적 자가면역 및 염증성 장애, 상처 치유)를 진단하거나, 치료하거나, 이러한 질환 또는 장애의 치료를 향상시키기 위해, 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 투여할 수 있다. 각종 실시형태에서, 하나 이상의 치료학적 제제와 병용하여 하나 이상의 결합 단백질을 투여하는 것은, 과도한 VEGF 및/또는 DLL4 수준을 특징으로 하는 병태를 DFKG고 있는 환자에서의 VEGF 및/또는 DLL4의 수준의 중화 또는 기타 감소, 및 결합 단백질 및/또는 하나 이상의 치료학적 제제의 투여로부터 얻어지는 다른 치료학적 변화를 유도한다.
각종 실시형태에서, 하나 이상의 추가의 제제는, 의도되는 목적에 따라 당해 분야 숙련가에 의해 선택된다. 예를 들면, 추가의 제제는, 암의 치료에 유용한 것으로 당해 분야에 인지되어 있는 치료학적 제제일 수 있다. 또한, 병용 치료요법은 1개 초과의 추가의 제제, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
각종 실시형태에서, 병용 치료요법제로는 항혈관신생제, 항신생물제, 방사선 치료요법, 화학치료요법, 예를 들면, DNA 알킬화제, 시스플라틴, 카르보플라틴, 항-튜뷸린제, 파클리탁셀, 도세탁셀, 탁솔, 독소루비신, 겜시타빈, 겜자르, 안트라사이클린, 아드리아마이신, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제, 5-플루오로우라실(5-FU), 류코보린, 이리노테칸, 수용체 티로신 키나제 억제제(예를 들면, 에를로티니브, 게피티니브), 및 siRNA가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본원에서 제공되는 결합 단백질과 함께 병용될 수 있는 화학치료요법제의 비제한적 예로는 하기가 포함된다: 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 5-FU; 6-메르캅토퓨린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주마브; ALIMTA; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 전(All)-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐리드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 3산화 비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주마브; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; 카페시타빈; Carac™; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 리포솜성 시타라빈; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코젠; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티니브; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 리포솜성 다우노루비신; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 인산 나트륨; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 리포솜성 독소루비신; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티니브; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; 에티올; Etopophos®; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록스우리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티니브; 겜시타빈; 겜투주마브 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® 웨이퍼; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 인산 나트륨; 하이드로코르티손 석신산 나트륨; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브리투모마브; 이브리투모마브 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 접합체); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티니브 메실레이트; 이미다졸 카르복사미드; Intron A®; Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; 키드롤라제 (t) Lanacort®; 라파티니브; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도미드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤리드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리포솜성 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 맥시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메르캅토퓨린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; 미톡산트론 M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; Nilandron®; 닐로티니브; 닐루타미드; Nipent®; 질소 머스타드 Novaldex®; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오티드; 옥트레오티드 아세테이트; 오파투무마브; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 단백질-결합된 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파니투무마브; Panretin®; Paraplatin®; 파조파니브; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펜토스타틴; 페닐알라닌 머스타드; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카르바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페니브; SPRYCEL™; STI-571; 스트렙토조신; SU11248; 수니티니브; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로미드 템시롤리무스; 테니포시드; TESPA; 탈리도미드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오포스포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모마브; 트라스투주마브; Treanda®; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타르트레이트; VLB; VM-26; 보리노스태트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; 또는 Zometa®.
한 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, Temozolomide®, 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상과 병용하여 사용한다. 한 실시형태에서, 결합 단백질 h1A11.1-SL-Av는, Temozolomide®, 이리노테칸, 류코보린, 5-FU, 겜시타빈, 및 파클리탁셀 중 하나 이상과 병용하여 사용한다.
각종 실시형태에서, 본원에서 제공되는 결합 단백질은, 제제, 예를 들면, 메토트렉세이트, 6-MP, 아자티오프린 설파살라진, 메살라진, 올살라진 클로로퀴닌/하이드록시클로로퀸, 펜실라민, 아우로티오말레이트(근육내 및 경구), 아자티오프린, 콜히친, 코르티코스테로이드(경구, 흡입 및 국소 주사), 베타-2 아드레날린 수용체 효능제(살부타몰, 테르부탈린, 살메테랄), 크산틴(테오필린, 아미노필린), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 케토티펜, 이프라트로퓸, 옥시트로퓸, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀레이트 모페틸, 류플루노미드, NSAID, 예를 들면, 이부프로펜, 코르티코스테로이드, 예를 들면, 프레드니솔론, 포스포디에트세라제 억제제, 아데노신 효능제, 항혈전제, 보체 억제제, 아드레날린제, TNF-α 또는 IL-1과 같은 전염증성 사이토카인에 의한 신호전달을 방해하는 제제(예를 들면, IRAK, NIK, IKK, p38 또는 MAP 키나제 억제제), IL-1β 전환 효소 억제제, TNFα 전환 효소(TACE) 억제제, T-세포 신호전달 억제제, 예를 들면, 키나제 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, 설파살라진, 아자티오프린, 6-메르캅토퓨린, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 가용성 사이토카인 수용체 또는 이의 유도체(예를 들면, 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체 또는 유도체 p75TNFRIgG(Enbrel™) 또는 p55TNFRIgG(레너셉트), sIL-1RI, sIL-1RII, sIL-6R), 소염성 사이토카인(예를 들면, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 및 TGFβ), 셀레콕시브, 엽산, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 로페콕시브, 에타너셉트, 인플릭시마브, 나프록센, 발데콕시브, 설파살라진, 메틸프레드니솔론, 멜록시캄, 메틸프레드니솔론 아세테이트, 티오말레이트 나트륨 금, 아스피린, 트리암시놀론 아세토니드, 프로폭시펜 나프실레이트/apap, 폴레이트, 나부메톤, 디클로페낙, 피록시캄, 에토돌락, 디클로페낙 나트륨, 옥사프로진, 옥시코돈 hcl, 하이드로코돈 2타르트레이트/apap, 디클로페낙 나트륨/미소프로스톨, 펜타닐, 아나킨라, 사람 재조합체, 트라마돌 hcl, 살살레이트, 설린닥, 시아노코발라민/fa/피리독신, 아세트아미노펜, 알렌드로네이트 나트륨, 프레드니솔론, 모르핀 설페이트, 리도카인 하이드로클로라이드, 인도메타신, 글루코사민 sulf/콘드로이틴, 아미트립틸린 hcl, 설파디아진, 옥시코돈 hcl/아세트아미노펜, 올로파타딘 hcl, 미소프로스톨, 나프록센 나트륨, 오메프라졸, 사이클로포스파미드, 리툭시마브, IL-1 TRAP, MRA, CTLA4-IG, IL-18 BP, 항-IL-18, 항-IL15, BIRB-796, SCIO-469, VX-702, AMG-548, VX-740, 로플루밀라스트, IC-485, CDC-801, 또는 메소프람과 병용할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 병용물은 메토트렉세이트 또는 레플루노미드 및 사이클로스포린을 포함할 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 본원에서 제공되는 약제학적 조성물은, 본원에서 제공되는 결합 단백질의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은, 바람직한 치료학적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량으로 필요한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 결합 단백질의 치료학적 유효량은, 당해 분야 숙련가에 의해 결정될 수 있고, 질환 상태, 개체의 연령, 성별, 및 체중, 및 개체에서 바람직한 반응을 유발하는 결합 단백질의 능력과 같은 인자들에 따라 다를 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은, 항체 또는 항체 결합부의 임의의 독성 또는 유해 효과가 치료학적으로 이로운 효과보다 적은 양이다. "예방학적 유효량"은, 바람직한 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 용량으로 필요한 시간 동안 효과적인 양을 말한다. 전형적으로, 예방학적 용량은 질환의 조기 단계 이전에, 또는 질환의 조기 단계에 대상체에게 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 것이다.
V. 진단
또한, 본원의 개시는, 하나 이상의 결합 단백질을 이용하는 진단학적 검정법, 하나 이상의 결합 단백질을 함유하는 진단학적 키트, 및 자동화 및/또는 반자동화 시스템에 사용하기 위한 방법 및 키트를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 진단학적 적용을 제공한다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법 및 키트는 개체에서의 질환 또는 장애의 검출, 모니터링, 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
A. 검정 방법
각종 실시형태에서, 하나 이상의 결합 단백질을 이용하여 시험 샘플 중의 하나 이상의 분석물 또는 이의 단편의 존재, 양 및/또는 농도를 결정하는 방법이 제공된다. 예시적 검정으로는 면역검정 및/또는 질량 분광법을 사용한 방법이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 본 개시에 의해 제공되는 면역검정으로는 그 중에서도 샌드위치 면역검정, 방사선 면역검정(RIA), 효소 면역검정(EIA), 효소-링크된 면역흡착 검정(ELISA), 경쟁적-억제 면역검정, 형광 편광 면역검정(FPIA), 효소 증폭된 면역검정 기술(EMIT: enzyme multiplied immunoassay technique), 생물 발광 공명 에너지 전이(BRET), 및 균일 화학발광 검정이 포함될 수 있다.
몇몇의 실시형태에서, 시험 샘플 중의 하나 이상의 항원, 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법이 제공되고, 여기서, 하나 이상의 항원 또는 이의 단편은 DLL4 및/또는 VEGF이다. 당해 방법은, 면역검정에 의해 시험 샘플을 항원, 또는 이의 단편에 대해 검정함을 포함한다. 면역검정은 (i) 하나 이상의 결합 단백질 및 하나 이상의 검출가능한 표지를 사용하고, (ii) 대조군 또는 캘리브레이터 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적 또는 간접적 지표로서 생성된 신호에 대해, 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도의 직접적 또는 간접적 지표로서의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호를 비교함을 포함한다. 캘리브레이터는 임의로 일련의 캘리브레이터들의 일부분이고, 상기 일련의 캘리브레이터들에서, 각각의 캘리브레이터는, 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 항원 또는 이들의 단편의 농도가 상이하다. 당해 방법은, (i) 시험 샘플을, 항원 또는 이의 단편에 결합하는 하나 이상의 하나 이상의 포획제와 접촉시켜, 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 복합체를 형성하는 단계; (ii) 상기 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 복합체를, 검출가능한 표지를 포함하고, 포획제에 의해 결합되지 않은 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 검출제와 접촉시켜, 검출가능한 복합체를 형성하는 단계; 및 (iii) 상기 (ii)에서 형성된 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 상기 하나 이상의 포획제 및/또는 하나 이상의 검출제는 하나 이상의 결합 단백질이다)를 포함할 수 있다.
대안으로, 몇몇의 실시형태에서, 시험 샘플 중의 하나 이상의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 방법은, (i) 시험 샘플을, 항원 또는 이의 단편 상의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 포획제와 접촉시켜, 포획제 및 항원 또는 이의 단편을 포함하는 복합체를 형성하고, 동시에 또는 순차적으로, 어느 한 순서로, 상기 시험 샘플을, 하나 이상의 포획제에 결합하기 위해 시험 샘플 중의 임의의 항원 또는 이의 단편과 경쟁할 수 있는 검출가능하게 표지된 항원 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 시험 샘플 중에 존재하는 임의의 항원 또는 이의 단편 및 검출가능하게 표지된 항원은 서로 경쟁하여 검출 복합체를 형성한다); 및 (ii) 상기 (i)에서 형성된 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 존재, 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 하나 이상의 포획제는 하나 이상의 결합 단백질이고, 여기서, 포획 검출 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호는 시험 샘플 중의 항원 또는 이의 단편의 양 또는 농도에 반비례한다)를 포함할 수 있다.
각종 실시형태에서, 시험 샘플은 환자 유래일 수 있고, 이러한 경우, 당해 방법은, 환자의 치료학적/예방학적 처치의 효능을 진단하거나, 예측진단하거나, 또는 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 당해 방법이 환자의 치료학적/예방학적 처치의 효능을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 경우, 당해 방법은 임의로 필요에 따라 환자의 치료학적/예방학적 처치를 변형시켜 효능을 개선시키는 단계를 추가로 포함한다. 당해 방법은 자동화 시스템 또는 반자동화 시스템에서 사용하기 위해 조정될 수 있다. 따라서, 본원에 기술되어 있는 방법은, 또한, 대상체가 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 이들 질환, 장애 또는 병태를 발병할 위험이 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다. 구체적으로, 이러한 방법은,
(a) (예를 들면, 본원에 기술되어 있는 방법 또는 당해 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여) 대상체 유래의 시험 샘플 중의 하나 이상의 분석물 또는 이의 단편의 농도 또는 양을 결정하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 결정된 분석물(들) 또는 이의 단편(들)의 농도 또는 양을, 소정 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 단계 (a)에서 결정된 분석물(들)의 농도 또는 양이, 소정 수준과 관련하여 선호되는 경우, 대상체는 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖지 않거나 주어진 질환, 장애 또는 병태의 위험이 없는 것으로 결정된다. 그러나, 상기 단계 (a)에서 결정된 분석물(들)의 농도 또는 양이 소정 수준과 관련하여 선호되지 않는 경우, 대상체는 주어진 질환, 장애 또는 병태를 갖거나 주어진 질환, 장애 또는 병태의 위험이 있는 것으로 결정된다.
추가로, 대상체에서의 질환의 진행을 모니터링하는 방법이 본원에 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 상기 방법은,
(a) 대상체 유래의 샘플 중의 하나 이상의 분석물(들)의 농도 또는 양을 측정하는 단계;
(b) 후에 동일한 대상체 유래의 시험 샘플 중의 분석물(들)의 농도 또는 양을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양을, 상기 단계 (a)에서 측정된 분석물(들)의 농도 또는 양과 비교하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 단계 (b)에서 측정된 농도 또는 양이, 단계 (a)에서 측정된 분석물의 농도 또는 양과 비교시 변화되지 않거나 비선호성인 경우, 대상체에서의 질환은 계속되거나, 진행되거나, 또는 악화되는 것으로 결정된다. 비교에 의해, 상기 단계 (b)에서 측정된 바와 같은 농도 또는 양이 상기 단계 (a)에서 측정된 바와 같은 농도 또는 양과 비교하여 선호성인 경우, 대상체에서의 질환은 중단되거나 퇴행성이거나 개선된 것으로 결정된다.
임의로, 질환의 진행을 모니터링하는 방법은, 상기 단계 (b)에서 측정된 바와 같은 분석물(들)의 농도 또는 양을, 예를 들면, 소정 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 추가로, 임의로, 당해 방법은, 상기 비교가, 상기 단계(b)에서 측정된 바와 같은 분석물(들)의 농도 또는 양이, 예를 들면, 소정 수준과 관련하여 비선호적으로 변경됨을 보여주는 경우, 일정 시간 동안 대상체를 하나 이상의 약제학적 조성물로 치료하는 단계를 포함한다.
몇몇의 실시형태에서, 분석물 또는 이의 단편의 존재, 양, 또는 농도는, 검출가능한 표지, 예를 들면, 화학발광성 표지(아크리디늄 화합물)를 이용하여 샘플 중에서 검출된다. 몇몇의 실시형태에서, 생성되는 화학발광성 신호는, 당해 분야 숙련가에게 공지되어 있는 통상적 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 생성된 신호의 강도에 기초하여, 샘플 중의 분석물의 양 또는 농도가 정량될 수 있다. 구체적으로, 몇몇의 실시형태에서, 샘플 중의 분석물의 양은 생성된 신호의 강도에 비례할 수 있다. 소정 실시형태에서, 존재하는 분석물의 양은, 분석물에 대한 표준 곡선에 대해 생성된 광의 양을 비교하거나, 참조 표준물 또는 캘리브레이터와의 비교에 의해 정량할 수 있다. 표준 곡선은, 질량 분광측정, 중력측정 방법 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 기술에 의해, 공지되어 있는 농도의 분석물의 일련의 희석액 또는 용액을 사용하여 생성될 수 있다.
분석물 면역검정은, 일반적으로, 이에 제한되지 않지만 샌드위치 포맷과 같은 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 포맷을 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 면역검정에서, 하나 이상의 결합 단백질은, 시험 샘플 중의 분석물(또는 이의 단편)을 포획하기 위해 사용될 수 있고(이들 결합 단백질은 "포획" 결합 단백질로서 칭하는 경우가 많다), 하나 이상의 결합 단백질은, 샌드위치에 검출가능한(즉, 정량가능한) 표지를 결합시키기 위해 사용될 수 있다(이들 결합 단백질은 "검출" 결합 단백질, "접합체", 또는 "접합체들"로서 칭하는 경우가 많다). 따라서, 샌드위치 면역검정 포맷과 관련하여, 본원에 기술되어 있는 바와 같은 DVD(또는 이의 단편, 변이체, 또는 변이체의 단편)를 포획 결합 단백질, 검출 결합 단백질, 또는 둘 다로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 제1 분석물(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합할 수 있는 제1 도메인, 및 제2 분석물(또는 이의 단편) 상의 에피토프에 결합할 수 있는 제2 도메인을 갖는 DVD는, 하나 이상의 분석물(예를 들면, DLL4 및/또는 VEGF)을 검출하고, 임의로 정량하기 위해 포획 및/또는 검출 결합 단백질로서 사용할 수 있다. 추가의 예에서, 샌드위치 검정 내에서 상이한 친화도를 갖는 DVD를 사용하는 것은 결합가(avidity) 이점을 제공할 수 있다. 본원에 기술되어 있는 면역검정과 관련하여, 이는, 일반적으로 DVD의 구조 내에 하나 이상의 링커를 포함시키는데 도움이 되거나, 요망될 수 있다. 존재하는 경우, 최적으로, 링커는 외부 도메인에 의한 다른 에피토프의 결합뿐만 아니라 내부 도메인에 의한 에피토프의 결합을 가능하게 하기에 충분한 길이 및 구조적 유연성(structural flexibility)을 가져야만 한다. 이와 관련하여, DVD가 2개의 상이한 분석물과 결합할 수 있고 하나의 분석물이 다른 분석물보다 큰 경우, 바람직하게 대형 분석물은 외부 도메인에 의해 결합된다.
각종 실시형태에서, 시험되는 샘플(예를 들면, 분석물 또는 이의 단편을 함유하는 것으로 의심되는 샘플)은, 동시에 또는 순찾거으로, 그리고 임의의 순서로 하나 이상의 포획 결합 단백질 및 하나 이상의 검출 결합 단백질과 접촉될 수 있다. 예를 들면, 시험 샘플은 우선 하나 이상의 포획 결합 단백질과 접촉시킬 수 있고, 이어서(순차적으로), 하나 이상의 결합 단백질과 접촉시킬 수 있다. 대안으로, 상기 시험 샘플은 우선 하나 이상의 검출 결합 단백질과 접촉시킬 수 있고, 이어서(순차적으로), 하나 이상의 포획 결합 단백질과 접촉시킬 수 있다. 또 다른 대안으로, 시험 샘플을 포획 결합 단백질 및 검출 결합 단백질과 동시에 접촉시킬 수 있다. 각종 실시형태에서, 본원에 개시되어 있는 하나 이상의 DVD를 포함하는 경쟁적 억제 면역검정을 이용하여 하나 이상의 분석물 또는 이들의 단편(예를 들면, DLL4 및/또는 VEGF)의 존재, 양 또는 농도를 검출할 수 있다.
각종 실시형태에서, 검출가능한 표지는, 직접적으로 또는 커플링제를 통해 결합 단백질에 결합될 수 있다. 사용될 수 있는 커플링제의 예로는, Sigma-Aldrich, St. Louis. MO로부터 시판되고 있는 EDAC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드, 하이드로클로라이드)가 있다. 사용될 수 있는 다른 커플링제는 당해 분야에 공지되어 있다. 검출가능한 표지를 결합 단백질에 결합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
각종 실시형태에서, 검출 검정에 있어서 분석물 및 DVD를 포함하는 복합체에 결합된 표지의 존재 또는 양은, 당해 분야에 공지되어 있는 기술을 이용하여 정량할 수 있다. 예를 들면, 효소 표지를 사용하는 경우, 표지된 복합체는, 발색으로서 정량가능한 반응을 제공하는 표지에 대한 기질과 반응할 수 있다. 표지가 방사성 표지인 경우, 표지는, 섬광 계수기(scintillation counter)와 같은 적절한 수단을 이용하여 정량할 수 있다. 표지가 형광성 표지인 경우, 표지는, 표지를 자극하여 형광성 신호를 검출함으로써 정량할 수 있다. 표지가 화학발광성 표지인 경우, 표지는, 가시적으로 방출된 광을 검출함으로써 또는 루미노미터, x-선 필름, 고속 사진 필름, CCD 카메라 등을 이용함으로써 정량할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 일단 복합체 중의 표지의 양이 정량화되었으면, 시험 샘플 중의 분석물 또는 이의 단편의 농도는, 적절한 수단에 의해, 예를 들면, 공지되어 있는 농도의 분석물 또는 이의 단편의 일련의 희석액을 이용하여 생성된 표준 곡선의 사용에 의해, 또는 임의의 다른 캘리브레이터에 의해 결정될 수 있다.
한 실시형태에서, 화학발광성 미세입자 면역검정, 특히, ARCHITECT® 자동화 분석기(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)를 사용하는 것이 이용된다.
몇몇의 실시형태에서, 질량 분광측정법을 사용하는 방법이 본 발명의 개시에 의해 제공되고, MALDI(매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화) 및 SELDI(표면-향상된 레이저 탈착/이온화)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
면역검정 및 질량 분광측정법을 이용하여 생물학적 시험 샘플을 수집하고, 취급하고, 프로세싱하고, 분석하는 방법은 당해 분야 숙련가에게 익히 공지되어 있고, 본 발명의 개시의 실행을 가능하게 한다(US 2009-0311253 A1).
B. 키트
각종 실시형태에서, 시험 샘플을 시험 샘플 중의 하나 이상의 분석물 또는 이의 단편의 존재, 양, 및/또는 농도에 대해 검정하기 위한 키트도 제공된다. 몇몇의 실시형태에서, 키트는, 시험 샘플을 분석물 또는 이의 단편에 대해 검정하기 위한 하나 이상의 구성성분, 및 시험 샘플을 분석물 또는 이의 단편에 대해 검정하기 위한 지침서를 포함한다. 시험 샘플을 분석물 또는 이의 단편에 대해 검정하기 위한 하나 이상의 구성성분은, 본원에 개시되어 있는 결합 단백질 및/또는 이의 단편, 변이체, 또는 변이체의 단편을 포함하는 조성물을 포함할 수 있다. 몇몇의 실시형태에서, 구성성분은 고체상 상에 임의로 고정화된다.
임의로, 몇몇의 실시형태에서, 키트는, 단리되거나 정제된 분석물을 포함할 수 있는 캘리브레이터 또는 대조군을 포함할 수 있다. 소정 실시형태에서, 키트는, 면역검정 및/또는 질량 분광측정법에 의해 시험 샘플을 분석물에 대해 검정하기 위한 하나 이상의 구성성분을 포함할 수 있다. 분석물, 결합 단백질, 및/또는 항-분석물 결합 단백질, 또는 이들의 단편을 포함하는 키트 구성성분들은, 임의의 당해 분야-공지의 검출가능한 표지를 이용하여 임의로 표지화될 수 있다(US 2009-0311253 A1).
C. 자동화
각종 실시형태에서, 키트(또는 이의 구성성분들) 및 시험 샘플 중의 하나 이상의 분석물의 존재, 양 및/또는 농도를 측정하는 방법은, 예를 들면, US 특허 제5,089,424호 및 제5,006,309호에 기술되어 있는 바와 같은 각종 자동화 및 반-자동화 시스템에서 그리고 ARCHITECT®로서 Abbott Laboratories에 의한 시판품으로서 사용하기 위해 조정될 수 있다.
결합 단백질과 함께 사용될 수 있는 다른 자동화 또는 반자동화 플랫폼으로는 AxSYM®, IMx®(예를 들면, 미국 특허 제5,294,404호 참조, PRISM®, EIA(비드), 및 Qiantum™ II(모든 Abbott Laboratores로부터 수득), 및 당해 분야에 공지되어 있는 다른 플랫폼들이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 추가로, 검정, 키트 및 키트 구성성분은 다른 포맷에서, 예를 들면, 전기화학 및/또는 다른 소형 또는 현장진단 검정 시스템에 대해 사용할 수 있다. 본 발명의 개시는, 예를 들면, 샌드위치 면역검정을 수행하는 전기화학 면역검정 시스템인 시판의 Abbott Point of Care(i-STATs®, Abbott Laboratories)에 적용가능하다. 단일 용도 시험 장치에서 면역 센서 및 이들의 제조 및 작동 방법은, 예를 들면, US 특허 제5,063,081호, 제7,419,821호, 및 제7,682,833호; 및 US 공개 제20040018577호, 제20060160164호 및 US 20090311253호에 기술되어 있다.
본원에 기술되어 있는 방법의 다른 적합한 변형 및 적용이 명백하고 본원에 개시되어 있는 실시형태들의 범위로부터 벗어나지 않으면서 적합한 등가범위를 이용하여 이루어질 수 있음은 당해 분야 숙련가들에게 자명할 것이다. 여기에 소정 실시형태들을 상세하게 기술하여, 상기는 하기 실시예를 참조하여 명백하게 이해될 수 있을 것이고, 이는 설명의 목적만을 위해 포함되고, 제한되도록 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 항-DLL4/항-VEGF DVD 분자의 작제
사람화된 항-DLL4 mAb(h1A11.1) 및 항-VEGF mAb(Av) 유래의 가변 도메인 서열들을 이용하여 항-DLL4/항-VEGF DVD 분자의 VH 및 VL 도메인을 고안하였다. 가변 영역은, 2-단계 PCR을 이용하여 합성되었다. 프라이머들은, 클로닝 벡터 및 각각의 DVD 가변 쌍 사이의 링커 영역에 상동성 플랭킹 영역을 갖도록 고안되었다. 세균성 형질전환을 수행하여 양성 클론을 동정하였고, 작제물을 수거하였고, 당해 분야에 공지되어 있는 표준 프로토콜을 이용하여 포유동물 형질전환에 사용하기 위해 정제하였다.
중쇄 및 경쇄의 가변 도메인들은 각각 돌연변이체 사람 IgG1(L234, 235A) 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 인프레임(in-frame) 클로닝되어 항-DLL4/항-VEGF DVD 분자들을 생성시켰다(표 4).
Figure pat00008
실시예 2: 항-DLL4/항-VEGF DVD 작제물의 친화도 측정
BIACORE 검정(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)을 이용하여, 정제된 재조합체 DLL4 세포외 도메인(ECD)에 대한 또는 VEGF165에 대한 결합을, 25℃에서 Biacore 2000, Biacore 3000 또는 Biacore T100(GE Healthcare, Piscataway, NJ)에 대해 이루어진 표면 플라스몬 공명-기반 측정값으로서 평가하였다. DLL4 결합 역학 측정을 위한 검정 완충액은 HBS-EPB: 10mM Hepes, pH 7.5, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Tween 20, 0.1mg/ml BSA(Sigma A7906)였다. VEGF 결합 역학 측정을 위한 검정 완충액은 HBS-EP+(3N01B): 10mM Hepes, pH 7.5, 300mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% Tween 20, 0.1mg/ml BSA(Sigma A7906)였다. 예를 들면, 10mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 중에 희석된 대략 9000RU의 염소 항-사람 Fc 특이적 폴리클로날 항체(Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL)는, 제조업자의 지침에 따라 표준 아민 커플링 키트를 이용하여 CM5 연구 등급 바이오센서 칩에 걸쳐 직접 고정화되고, 25ug/ml로 진행된다. 바이오센서 표면 상의 반응되지 않은 모이어티는 에탄올아민으로 차단한다. 역학 분석을 위해, 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델로부터 유도된 속도 등식은, Scrubber 2(BioLogic Software), Biacore Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어 또는 Biacore T100 Evaluation 소프트웨어의 사용과 함께 (글로벌 피트 분석을 이용하여) 다중 항원 주사에 동시에 대입된다. 정제된 항체는, 염소 항-사람 Fc 반응 표면에 걸친 포획을 위해 러닝 완충액 중에 희석시킨다. 리간드로서 포획되는 항체(1ug/ml)를 10ul/분의 유속으로 반응 매트릭스에 주사한다. 검정 동안, 모든 측정값들은 포획 표면 단독에 대해(즉, 포획된 항체 부재 하에) 인용된다. 회합 및 해리 속도 상수, Kon(M-1s-1) 및 Koff(s-1)은 80ul/분의 연속적 유속 하에 측정된다. 속도 상수들은, 1.23 내지 900nM 범위의 상이한 항원 농도에서 일련의 3배 희석으로서 역학 결합 측정을 행함으로써 유도되고, 완충액-만의 주사(이중 인용에 사용되는)를 포함한다. 이어서, 항체와 표적 항원 사이의 반응의 평형 해리 상수 KD(M)는 하기 식에 의해 역학 속도 상수로부터 계산된다: KD = Koff/Kon. 결합은 시간 및 역학 속도 상수의 함수로서 기록되고 계산된다. 이러한 검정에서, 106M-1s-1만큼 빠른 온-레이트 및 10-6s-1만큼 느린 오프-레이트가 측정될 수 있다. 항-DLL4/항-VEGF DVD의 항원 결합 친화도는 표 5 및 표 6에 요약된다.
Figure pat00009
Figure pat00010
실시예 3: 항-DLL4/항-VEGF DVD 분자의 시험관내 특성확인
실시예 3.1: 유세포 측정법(FACS)에 의해 측정된 DLL4 결합 활성
전장 DLL4를 과발현하는 안정한 HEK293G 세포주를 조직 배양 플라스크로부터 수거하고, 4회 세척하고, 1% 소 혈청 알부민 및 1mM CaCl2를 함유하는 포스페이트 완충된 염수(PBS)(FACS 완충액) 중에 재현탁시켰다. 1.5 x 105 세포를, 빙상에서 50분 동안 FACS 완충액 중의 각종 농도로의 DVD 결합 단백질과 항온배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 50uL의 R-피코에리트린-접합된 항-래트 IgG F(ab')2 단편(FACS 완충액 중의 1:200 희석)(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, Cat.#112-116-072)을 첨가하였다. 빙상(4℃, 60분)에서의 항온배양 후, 세포를 3회 세척하고, FACS 완충액 중에 재현탁시켰다. Becton Dickinson FACSCalibur-HTS(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 형광성을 측정하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였고, DLL4 발현 세포에 결합하는 최대 항체의 50%를 달성하기 위한 항체 농도로서 EC50 값이 보고되었다.
실시예 3.2: 가용성 DLL4 세포외 도메인과의 Notch-1 상호작용의 억제에 의한 측정시 항-DLL4/항-VEGF DVD 단백질의 DLL4-차단 활성
96-웰 Nunc-Immuno 플레이트(huDLL4 ELISA의 경우 #439454) 및 96-웰 Costar 플레이트(muDLL4 ELISA의 경우 #9018)를 16nM 사람 Notch-1(R&D Systems #3647-TK, D-PBS 중의 100μl/웰)로 코팅하였고, 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 이어서, 플레이트들을 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween-20)으로 3회 세척하고, 25℃에서 1시간 동안 200μl/웰 차단 완충액(D-PBS, 1% BSA, 1mM CaCl2, 0.05% Tween-20)으로 차단하였다. 차단 동안, 비오틴 표지된 DLL4 세포외 도메인(14nM)을, 진탕하면서 25℃에서 1시간 동안 항체(30pM 내지 66nM, 차단 완충액 중의 3배 일련의 희석)와 혼합하였다. 차단 후 검정 플레이트들을 세척하고, DLL4/항체 혼합물(100μl/웰, 진탕하면서 25℃에서 1시간)과 함께 항온배양하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 100μl/웰의 HRP 접합된 스트렙트아비딘(Fitzgerald #65R-S104PHRPx, 차단 완충액 중에 1:5,000 희석됨)을, 진탕하면서 25℃에서 1시간 동안 첨가하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 100μl/웰의 기질(TMB Sigma #T8665)을 이용하여 전개시켰고, 100μl/웰의 1N HCl을 이용하여 반응을 정지시켰고, 450nm에서 흡광도를 판독하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였고, Notch1에 대한 DLL4 결합의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 농도로서 IC50 값이 보고되었다.
실시예 3.3: Notch 수용체 검정을 이용한 DLL4-의존적 Notch 활성화의 억제에 의한 측정시 항-DLL4/항-VEGF DVD 단백질의 DLL4-차단 활성
96-웰 흑색 투명한-바닥 조직 배양 플레이트를 Notch-반응성 프로모터에 의해 유도된 루시페라제를 발현하는 조작된 EA.hy926 세포로 밤새 씨딩하였다. 200nM로부터의 일련의 희석된 항체를, 전장 DLL4를 발현하는 HEK293G 세포(5,000세포/웰)를 함유하는 동일한 체적의 용액과 15분 동안 혼합하였다. 293G/DLL4 세포를, 시험 항체의 존재 하에 EA.hy926 Notch 수용체 세포와 24시간 동안 공동-배양하였다. 루시페라제 활성은 Promega의 기질(Promega #E2940)을 이용하여 분석하였다. Graphpad Prism 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였고, DLL4-유도된 Notch 활성화의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 농도로서 IC50 값이 보고되었다.
실시예 3.4: 포획 ELISA에 의한 측정시 항-DLL4/항-VEGF DVD 단백질의 VEGF 결합 활성
ELISA 플레이트(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)를 4℃에서 항-사람 Fc 항체(PBS 중의 5μg/ml, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)와 함께 밤새 항온배양하였다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)에서 3회 세척하였고, 25℃에서 1시간 동안 차단 완충액(1% BSA를 함유하는 PBS)에서 차단하였다. 웰을 3회 세척하였고, 25℃에서 1시간 동안 항온배양하기 전에 각각의 항체 또는 DVD를, 0.1% BSA를 함유하는 PBS에 일련으로 희석하였다. 웰을 3회 세척하였고, 비오티닐화된 VEGF(2nM)를 플레이트에 첨가하여고, 25℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 상기 웰을 3회 세척하였고, 이어서, 스트렙트아비딘-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)와 함께 25℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 웰을 3회 세척하였고, 웰당 100μl의 ULTRA-TMB ELISA(Pierce, Rockford, IL)를 첨가하였다. 발색 후, 1M HCl을 이용하여 반응을 정지시켰고, 450nM에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3.5: VEGFR1로의 VEGF 상호작용의 억제에 의한 측정시 항-DLL4/항-VEGF DVD 단백질의 VEGF-차단 활성
ELISA 플레이트(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)를, 재조합 VEGFR1 세포외 도메인-Fc 융합 단백질을 함유하는 PBS(5μg/ml, R&D systems, Minneapolis, MN) 100μl와 함께 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 플레이트를 세척 완충액(0.05% Tween 20을 함유하는 PBS)에서 3회 세척하였고, 차단 완충액(1% BSA를 함유하는 PBS) 중에서 25℃에서 1시간 동안 차단하였다. 각각의 항체 및 DVD를, 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중에 일련으로 희석시켰고, 2nM 비오티닐화된 VEGF 50μl와 함께 25℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 이어서, 항체 및 비오티닐화된 VEGF 또는 DVD 및 비오티닐화된 VEGF의 혼합물을(100μl), VEGFR1-Fc 코팅된 웰에 첨가하였고, 25℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 웰을 3회 세척하였고, 이어서, 100μl의 스트렙트아비딘-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)와 함께 25℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 상기 웰을 3회 세척하였고, 웰당 100μl의 ULTRA-TMB ELISA(Pierce, Rockford, IL)를 첨가하였다. 발색 후, 1M HCl을 이용하여 반응을 정지시켰고, 450nM에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 3.6: VEGF-자극된 내피 세포 증식/생존의 억제에 의한 측정시 항-DLL4/항-VEGF DVD 단백질의 VEGF-차단 활성
검정을 위해 플레이팅하기 전에, TIME(ATCC) 또는 HUVEC(계대 2 내지 6) 내피 세포를, EGM-2 SingleQuots(Lonza-Clonetics, Walkersville, MD, #CC-4176)가 보충된 EBM-2(Lonza-Clonetics, Walkersville, MD) 중에 유지하였다. 성장 인자의 부재 하에 0.1% FBS를 갖는 100μl EMB-2의 콜라겐-코팅된 흑색 96-웰 플레이트 상에 세포를 10,000세포/웰로 플레이팅하였다. 다음날, 성장 인자의 부재 하에 배지를 0.1% FBS로 대체하였다. 다음날, 배지를 100μl의 EMB-2(성장 인자 또는 혈청 부재)로 대체하였고, CEGF 및 항체 또는 DVD의 첨가 전에 4시간 동안 항온배양하였다. 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 DVD를, 0.1% BSA를 갖는 EMB-2 중에 일련으로 희석하였고, 50μl 중에서 재조합 사람 VEGF165(50ng/ml)와 함께 25℃에서 1시간 동안 사전-항온배양하였다. 이어서, 항체 및 VEGF 또는 DVD 및 VEGF의 혼합물을 세포(50μl)에 첨가하였고, 플레이트를 습윤 5% CO2 대기에서 37℃에서 72시간 동안 항온배양하였다. 제조업자의 지침에 따라 ATPlite 키트(Perkin Elmer, Waltham, WA)를 이용하여 ATP 수준을 평가함으로써 세포 생존/증식을 간접적으로 측정하였다.
상기 언급된 검정들에 의해 특성확인 되는 바와 같은 항-DLL4/항-VEGF DVD의 시험관내 활성은 표 7에 요약된다.
Figure pat00011
실시예 4: 항-DLL4/항-VEGF DVD의 생체내 약동학적 결과
볼루스 정맥내 투여 후에 사이노몰거스 원숭이(각각의 투약 그룹에 대해 n=2) 및 CD1 마우스(각각의 투약 그룹에 대해 n=6)에서 h1A11.1-SL-Av DVD의 약동학적 특성을 평가하였다. CD1 마우스 및 사이노몰거스 원숭이 둘 다에서의 h1A11.1-SL-Av DVD 약동학적 프로파일은, 전통적인 모노클로날 항체의 특성이었다(표 8).
Figure pat00012
실시예 5: 항-DLL4/항-VEGF DVD의 생체내 항-종양 효능
종양 성장에 대한 항-DLL4/항-VEGF DVD의 효과는, 암컷 흉선제거 누드 마우스에서 HT-29 사람 결장직장 선암종 이종이식체 종양에 대해 처음으로 평가하였다. 간략하게, 2x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 25일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 214㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들은 4주 동안 매주 복강내 투약되었고, 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 9에 나타낸다.
후속적으로, 종양 성장에 대한 항-DLL4/항-VEGF DVD의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 U87-MG 사람 교모세포종 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 3x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 17일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 221㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들은 4주 동안 매주 복강내 투약되었고, 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 9에 나타낸다.
Figure pat00013
실시예 6: 항-DLL4/항-VEGF DVD의 생체내 병용 효율
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4/항-VEGF DVD의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 U87-MG 사람 교모세포종 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 3x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 22일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 207㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 단일 용량의 테모졸로미드® 및/또는 4회의 주당 용량의 항-DLL4/항-VEGF DVD를 복강내 투약하였고, 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 10에 나타낸다.
Figure pat00014
실시예 7: 항-DLL4/항-VEGF DVD의 전제형화(preformulation) 특성확인
하기에 열거된 제형 및 단백질 농도에서 항-DLL4/항-VEGF DVD(h1A11.1-SL-Av)의 보관 안정성(5℃) 및 가속화된 안정성(40℃)을 평가하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 안정성을 평가하였고, 응집체%, 단량체%, 단편%, 및 총 회수된 종을 정량하였다. 종합적으로, 제형은 5 내지 7의 pH 범위 및 1.0 내지 118mg/ml의 단백질 농도 범위를 포함한다.
5℃ 및 40℃ 온도에서, 그리고, 50, 30, 및 10mg/ml의 단백질 농도에서, 제형은 하기였다: 15mM 아세테이트 pH 5; 15mM 포스페이트 pH 7; 30mM 아세테이트; 80mg/ml 슈크로스, pH 5에서 0.02% Tween 80; 30mM 히스티딘, 80mg/ml 슈크로스, pH 6에서 0.02% Tween 80; PBS(포스페이트 완충된 염수). 모든 제형들은, 보관 동안의 미생물 성장을 방지하기 위해 0.02% 나트륨 아지드를 함유하였다. 5℃ 및 40℃ 온도에서, 그리고, 60, 50, 30, 및 10mg/ml의 단백질 농도에서, 제형은 15mM 히스티딘 pH 6(보관 동안의 미생물 성장을 방지하기 위해 0.02% 나트륨 아지드도 함유함)이었다. 5℃에서, 그리고, 118mg/ml의 단백질 농도에서, 제형은 15mM 히스티딘 pH 6(보관 동안의 미생물 성장을 방지하기 위해 0.02% 나트륨 아지드도 함유함)이었다. 40℃에서, 그리고, 1.0mg/ml의 단백질 농도에서, 제형은 pH 5, 6, 7에서 10mM 시트레이트 + 10mM 포스페이트였다. 단백질을 지닌 제형을 여과하여 존재가능한 미생물을 제거하였다.
냉동-해동 안정성은, 제형 중의 단백질을, 20시간 이상 동안의 -80℃에서의 냉동 및 30℃ 수욕에서의 해동의 4회 사이클을 행함으로써 수행하였다. 냉동-해동 안정성에 대해 시험된 제형은 하기에 열거된다. 안정성은 SE-HPLC에 의해 평가하였고, 응집체%, 단량체%, 단편%, 및 총 회수된 종을 정량하였다. 제형은 60mg/ml 단백질에서 15mM 히스티딘 pH 6(미생물 성장을 방지하기 위해 0.02% 나트륨 아지드도 함유함) 및 pH 5, 6, 7 및 1.0mg/ml 단백질에서 10mM 시트레이트 + 10mM 포스페이트(여과하여 존재가능한 미생물 제거함)였다.
최종적으로, pH 5, 6, 7 및 1.0mg/ml 단백질에서 10mM 시트레이트 + 10mM 포스페이트 완충액 중의 단백질에 대한 열적 안정성을 측정하기 위한 시차 주사 열량 측정법을 수행하였다. 각각의 단백질 도메인의 언폴딩(unfolding) 개시 온도 및 언폴딩의 중간점 온도(Tm)를 정량하였다.
표 11 및 표 12의 데이터에 기초하여, h1A11.1-SL-Av는 DVD-Ig 안정성에 대한 전제형화 기준을 만족시켰다.
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실시예 8: 항-DLL4/항-VEGF DVD에 대한 제형 선택
재료 및 방법. 표 15에 열거된 6개의 제형들에서 항-DLL4/항-VEGF DVD-Ig h1A11.1-SL-Av 단백질의 안정성을 평가하였다. 모든 제형들은 15mM 히스티딘 완충액에서 제조되었다. 제형 F1 내지 F4는 50mg/mL의 단백질 농도로 제조되었다. 이들 제형에서, pH는 5.5 내지 6.0의 범위였고, 폴리소르베이트 80 농도는 0 내지 0.05% w/v의 범위였고, 슈크로스 농도는 0 내지 7.5% w/v의 범위였고, 아르기닌 농도는 0 내지 1% w/v의 범위였다. 제형 F4는, 임의의 안정화제의 부재 하에 pH 6.0에서 15mM 히스티딘 완충액에서 제조되었고, 50mg/mL의 액체 제형 안정성 평가를 위한 연구 대조군으로서 작용하였다. 또한, 2개의 제형은 pH 6.0에서 25mg/mL의 단백질 농도로 제조되었다(제형 F5 및 F6). 폴리소르베이트 80 및 슈크로스의 조성은 이들 2개의 제형들에서 약간 상이하였다; 폴리소르베이트 80의 농도는 0.025% w/v 내지 0.03% w/v의 범위였고, 슈크로스의 농도는 3.8% w/v 내지 4% w/v의 범위였다. 제형 F1 내지 F5는 초기 제조 프로세스로부터의 재료를 사용하였고, 한편, F6 제형은 보다 최적화된 프로세스로부터의 재료를 이용하여 제형화되었다. 제형 F5 및 F6의 조성은 매우 유사하지만, 이들 둘 사이에서 안정성 차이가 관찰되었다. 상이한 프로세스로부터 조성물이 제조되었으므로, 이는 관찰된 안정성 차이의 원인일 수 있다.
Figure pat00021
상기 제형들에서, 15mM 히스티딘 완충액은 표적 제형 pH를 유하지기 위한 적당한 완충 능력을 제공하므로, 이를 선택하였다. 슈크로스는 냉동-해동 스트레스(동결 보호제) 및 동결건조 프로세스-유도된 스트레스(동결건조 보호제)에 대한 안정화제로서 평가되었다. 폴리소르베이트 80(계면활성제) 및 아르기닌을 첨가하여 응집체 및 입자 형성에 대해 제형을 잠재적으로 안정화시켰다.
액체 제형의 안정성은, 냉동/해동 동안에, 시각적 외형, 크기 배제 크로마토그래피(S-HPLC)에 의한 응집체%, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의한 전하 불균일성, 환원 SDS-모세관 전기영동에 의한 단편화, 및 Micro Flow Imaging(MFI) 또는 Light Obscuration(HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자를 포함하는 분석적 검정의 광범위한 패널에 따라 -80, 5, 25 및 40℃에서 평가하였다. 이들 결과는 표 16 내지 표 19에 제공된다.
Figure pat00022
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동결건조된 제형 안정성 시험. 결합 단백질 h1A11.1-SL-Av를 함유하는 선택된 제형의 안정성은, 제형이 동결건조된 후에도 평가하였다. 모든 슈크로스-함유 제형(F1, F2, F3, F5 및 F6)에 대해 동결건조된 약물 제품 안정성을 평가하였다. 55℃에서 2주 보관 후 안정성을 평가하였다. 안정성은, 시각적 외형(재구성(reconstitution) 전 및 후), 재구성 시간, 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의한 응집체%, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX-HPLC)에 의한 전하 불균일성, 환원 SDS-모세관 전기영동(CE-SDS)에 의한 단편화, Micro Flow Imaging(MFI) 또는 Light Obscuration(HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자, 및 칼 피셔(Karl Fishcer) 적정에 의한 수분 함량을 포함하는 분석적 검정의 광범위한 패널에 따라 시험하였다.
동결건조 제형 안정성 시험 결과는 표 20에 제공된다. 모든 평가된 제형에 대한 재구성 시간은 대략 1 내지 2분이었다. 55℃의 스트레스성 보관 조건 하에 모든 제형에 대해 SECD에 의한 응집 및 CEX에 의한 염기성 영역%에서 약간의 증가가 관찰되었다. 모든 다른 측정된 제품 안정성 속성(attribute)에서는 최소의 변화가 관찰되었다.
Figure pat00030
Figure pat00031
또한, 제형 F6(동결건조, 바이알당 200 결합 단백질 h1A11-SL-Av)의 안정성은 12개월 기간에 걸쳐 평가하였다. 제형은 시험 기간 동안 안정하였다.
투약 용액 안정성 시험. 항-DLL4/항-VEGF 결합 단백질은 정맥내 투여(IV)를 위해 시험된다. 투여하기 전에, 동결건조 약물 제품을 주사용 멸균수(SWFI) 중에서 재구성한다. 후속적으로, 재구성된 제품을, IV 주입에 적합한 용액 중에 희석한다. 투약 용액이 희석되는 최종 농도는, 투여되는 임상학적 용량에 기초하여 결정한다.
2개의 통상적으로 사용되는 IV 희석제들인 0.9% 염수 및 5% 덱스트로스(D5W) 중 하나를 함유하는 투약 용액의 경우, 희석된 항-DLL4/항-VEGF 결합 단백질 h1A11.1-SL-Av의 안정성을 평가하기 위한 연구를 수행하였다. 평가된 단백질 농도는 0.5 및 1mg/mL였다. 투약 용액 안정성 및 주입 구성성분과의 적합성(compatibility)을 평가하기 위해, 시험 조건당 투약 용액 제조하였고, RT/RL에서 6시간 동안 IV 백(bag)(n=2)에 보관하였고, 후속적으로, 인-라인 필터(in-line filter)를 포함하는 통상적으로 사용되는 주입 투여 구성성분을 이용하여 모의(mock) 주입 연구를 수행하였다. IV 백에서 투약 용액을 제조한 후에 상기 백으로부터 시험 샘플을 직접적으로 풀링하였다(T0). 또한, 30분 주입 프로세스의 종료시에 수집한 샘플을 시험하였다. 시각적 외형, 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의한 응집체%, 및 Light obscuration(HIAC)에 의한 육안으로 보이지 않는 입자를 포함하는 분석적 검정의 광범위한 패널에 따라 상기 샘플을 시험하였다.
투약 용액 안정성 연구 결과는 표 21에 제공된다. 출발 재료 중의 응집체 수준은 0.7%였다. 염수 중에서 투약 용액을 제조한 후, 염수 중에의 희석시(T0), 그리고, 주입의 종료시, 응집체 수준의 증가를 나타내는 투명한 경향(trend)이 관찰되었다. 또한, 이들 샘플 중의 육안으로 보이지 않는 입자 수는 높았다. 비교시, 5% 덱스트로스(D5W) 중에 제조된 투약 용액은 미립자와 관련하여 허용가능한 안정성 경향보다 더 낮은 응집체% 수준을 지속적으로 나타냈다.
Figure pat00032
실시예 9: 연장된 전제형화 특성확인
상이한 제형화 조건이 DVD의 안정성에 어떻게 영향을 미치는지를 탐구하기 위해서 항-DLL4/항-VEGF DVD에 대해 연장된 전제형화 특성확인을 수행하였다. h1A11.1-LS-Av에 대한 데이터는 표 22 및 표 23에 제시된다. DVD의 보관 안정성(5℃) 및 가속화된 안정성(40℃)은 하기 열거된 제형 및 단백질 농도에서 평가하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 안정성을 평가하였고, 응집체%, 단량체%, 단편%, 및 총 회수된 종을 정량하였다. 종합적으로, 제형은 5 내지 7의 pH 범위 및 10 내지 50mg/ml의 단백질 농도 범위를 포함한다.
5℃ 및 40℃ 온도에서, 그리고, 50, 30, 및 10mg/ml의 단백질 농도에서, 하기 제형을 평가하였다: 15mM 아세테이트 pH 5; 15mM 히스티딘 pH 6; 15mM 포스페이트 pH 7, 30mM 아세테이트, 80mg/ml 슈크로스, pH 5에서 0.02% Tween 80; 30mM 히스티딘, 80mg/ml 슈크로스, pH 6에서 0.02% Tween 80, 및 PBS(포스페이트 완충된 염수). 모든 제형들은, 보관 동안의 미생물 성장을 방지하기 위해 0.02% 나트륨 아지드를 함유하였다.
표 22 및 표 23에서의 데이터에 기초하여, h1A11.1-LS-Av는 DVD-Ig 안정성에 대한 전제형화 기준을 만족시켰다.
Figure pat00033
Figure pat00034
Figure pat00035
실시예 10: DLL4 세포 검정에서 항-DLL4/항-VEGF DVD의 중화 활성에 대한 VEGF의 효과
VEGF 결합이 항-DLL4/항-VEGF DVD의 DLL4 중화 효력에 영향을 미칠 것인지를 평가하기 위해, 실시예 3.3에 기술되어 있는 바와 같은 DLL4-Notch 리포터 검정에 VEGF를 포함시켰다. 간략하게, 사람 DLL4를 발현하는 HEK293G 세포를, h1A11.1-SL-Av DVD, 또는 300nM로부터 일련의 희석된 항-DLL4 mAb(h1A11.1) 및 항-VEGF mAb(Av)의 혼합물의 존재 하에 24시간 동안 EA.hy926 Notch 리포터 세포와 함께 공동-배양하였다. 또한, 재조합 사람 VEGF165(VEGF의 생리학적으로 관련된 사람 스플라이스 이소형) 또는 음성 대조군 단백질(BSG2)도 포함되었다. IC50 값, DLL4-유도된 Notch 활성화의 50% 감소를 달성하는데 필요한 항체의 농도를 평가함으로써 DLL4 중화 효력을 측정하였다. 표 24에 나타낸 바와 같이, 6 또는 150nM VEGF의 존재는 h1A11.1-SL-Av DVD의 DLL4 중화 효력을 크게 증가시켰다. 포함된 VEGF의 존재 또는 부재 하에 모 mAb 혼합물은 유사한 효력을 나타내었으므로, 이러한 증가된 효력은 항-DLL4/항-VEGF DVD에 고유하다.
Figure pat00036
다른 실험에서, h1A11.1-SL-Av DVD의 1가의 Fab 단편은 DLL4 중화 세포 검정에서도 평가하였다. DVD Ig와 대조적으로, 1가의 DVD Fab는, 보다 약한 DLL4 중화 효력을 갖는다. VEGF의 존재는, DVD-Ig로 보여지는 정도가 아닌 DVD-FaB의 효력을 개선시켰다(표 25).
Figure pat00037
다른 실험에서, VEGF 농도는 일련의 하향 적정하였고, 상기 기술되어 있는 DLL4-Notch 리포터 검정에 적용하였다. 표 26에 나타내는 바와 같이, VEGF는, 1.2nM만큼 낮은 농도로 h1A11.1-SL-Av DVD의 DLL4 중화 활성을 향상시킬 수 있다.
Figure pat00038
실시예 11: DLL4-VEGF DVD-Ig의 생체내 병용 효능
종양 성장에 대한 화학 치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 SW-48 사람 결장 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 5x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 13일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 211㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 표 27의 용량 및 스케쥴로 이리노테칸, 항-VEGF mAb, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 27에 나타낸다.
Figure pat00039
또한, 종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 HCT-116 사람 결장 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 5x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 14일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 192㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=9)에 할당하였다. 동물들에게 표 28의 용량 및 스케쥴로 5-FU, 류코보린, 이리노테칸, 항-VEGF mAb, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 28에 나타낸다.
Figure pat00040
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 HT-29 사람 결장 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 2x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 25일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 209㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 표 29의 용량 및 스케쥴로 이리노테칸 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 29에 나타낸다.
Figure pat00041
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 U87-MG 사람 교모세포종 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 3x106 세포를 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 13일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 207㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 표 30의 용량 및 스케쥴로 테모졸로미드, 항-VEGF mAb, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 30에 나타낸다.
Figure pat00042
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 NSG 마우스에서 PA0123 환자-유도된 사람 췌장 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 동결된 종양 단편을 우측 뒷 옆구리에 피하 이식하였다. 종양을 28일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 193㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=7)에 할당하였다. 동물들에게 표 31의 용량 및 스케쥴로 겜시타빈, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 31에 나타낸다.
Figure pat00043
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 MDA-MB-231-luc 사람 유방 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 2x106 세포를 유방의 지방체(fat pad)에 이식하였다. 종양을 13일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 150㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 표 32의 용량 및 스케쥴로 파클리탁셀, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 추가로, 암 세포의 폐 및/또는 림프절로의 자발적 전이를 모니터링하고 추적하기 위해 생물발광 화상을 획득하였다. 결과는 표 32에 나타낸다.
Figure pat00044
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 SUM149PT 사람 유방 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 1x106 세포를 유방의 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 28일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 183㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=9)에 할당하였다. 동물들에게 표 33의 용량 및 스케쥴로 파클리탁셀, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 33에 나타낸다.
Figure pat00045
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 SUM149PT 사람 유방 이종이식체 종양에 대해 평가하였다. 간략하게, 1x106 세포를 유방의 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 25일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 228㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=10)에 할당하였다. 동물들에게 표 34의 용량 및 스케쥴로 파클리탁셀, 항-VEGF mAb 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 34에 나타낸다.
Figure pat00046
종양 성장에 대한 화학치료요법과 병용한 항-DLL4-VEGF DVD-Ig의 효과는, 암컷 SCID 마우스에서 HCT-116 사람 결장 이종이식체 종양에 대해 추가로 평가하였다. 간략하게, 5x106 세포를 유방의 우측 뒷 옆구리에 피하 접종하였다. 종양을 16일 동안 확립되게 하였고, 이 시점에, 식: L x W2/2를 이용하여 전자 캘리퍼 측정을 이용하여 종양 체적을 측정하였다. 치료요법의 개시 전에 각각의 코호트가 198㎣의 동일한 평균 종양 체적을 갖도록 마우스들을 치료 그룹들(그룹당 n=9)에 할당하였다. 동물들에게 표 35의 용량 및 스케쥴로 5-FU, 카페시타빈, 및/또는 항-DLL4-VEGF DVD-Ig를 투약하였다. 실험 기간 동안 주당 2회 종양 체적을 측정하였다. 결과는 표 35에 나타낸다.
Figure pat00047
실시예 12: h1A11.1-SL-Av DVD의 종간(cross-species) 세포 효력
종들에 걸친, 고정화된 재조합 DLL4 세포외 도메인(ECD)을 이용한 세포-기반 검정에서, DLL4에 대한 h1A11.1-SL-Av DVD의 종간 중화 효력을 비교하였다. 이러한 검정을 이용하여, 사람, 래트, 마우스, 및 사이노몰거스 원숭이 종으로부터 유도된 동일한 농도의 DLL4에 대하여 h1A11.1-SL-Av DVD의 활성을 비교하였다.
투명한 저면의 웰을 갖는 흑색 96-웰 조직 배양 플레이트(Costar, #3904)를,
PBS(Invitrogen, #14190) 중에 희석된 100μL/웰의 DLL4-ECD(11nM) 또는 대조군으로서의 100μL/웰의 11nM BSA(Sigma, #A9576)로 사전-코팅하였다. 검정 플레이트를 밀봉하였고, 4℃에서 18시간 동안 항온배양하였다. 다음날, h1A11.1-SL-AV DVD를, 10% FBS를 함유하는 검정 배지 DMEM(Invitrogen, #11995) 중에 일련으로 희석하였다. 50μL/웰의 일련의 희석된 h1A11.1-SL-Av DVD 용액을 첨가하기 전에, 사전-코팅된 검정 플레이트를 검정 배지로 1회 세정하였다. 이어서, 검정 플레이트를 25℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 이러한 항온배양 동안, Notch-반응성 프로모터에 의해 유도된 대조군 레닐라 루시페라제 및 반딧불이 루시페라제를 발현하는 EA.hy926 세포를, 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen, #25200)를 이용하여 배양 플라스크로부터 분리하였고, 검정 배지 중에 3x105세포/mL로 재현탁시켰고, 이어서, 검정 플레이트에 25μL/웰로 직접 첨가하였다. 이어서, 검정 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 5% CO2로 항온배양하였다. 판매자(Dual-Glo Luciferase Assay System, Promega, #E2940)의 프로토콜에 따라 반딧불이 및 레닐라 루시페라제 검정을 수행하였다. 발광성은 플레이트 판독기(Victor, Perkin Elmer, #1420-051) 상에서 판독하였고, 생성된 데이터는 레닐라 루시페라제 발광 신호에 대해 정규화하였다.
표 36에 나타낸 바와 같이, h1A11.1-SL-Av DVD는, 비교할만한 효력으로 사람 및 사이노몰거스 원숭이 DLL4 활성을 억제한다. 또한, 사람 DLL4에 비하여 약 3배 적은 활성일지라도 h1A11.1-SL-Av DVD는 마우스 DLL4를 억제한다. h1A11.1-SL-Av DVD는 세포 검정에서 래트 DLL4 활성을 억제하지 않는다.
VEGF에 대한 h1A11.1-SL-AV DVD의 종간 중화 효력은, VEGF-자극된 NIH3T3/VEGFR-2 세포 증식 및 생존가능성 검정에서 평가하였다.
전장 사람 VEGFR-2에 대한 cDNA로 안정하게 형질감염된 NIH3T3 세포를, VEGF-자극된 증식 및 생존 검정에 사용하였다. NIH3T3/VEGFR-2 안정한 세포의 융합성(confluent) 배양물을, 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen, #25200)를 이용하여 배양 플라스크로부터 분리하였고, 검정 배지(0.1% BSA(Sigma, #A9576)를 함유하는 DEME(Invitrogen, #11995))로 1.33x105세포/mL로 재현탁시켰다. 세포를 투명한 저면을 갖는 흑색 96-웰 조직 배양 검정 플레이트(Costar, #3904)에 75μL의 총 체적 중에 10,000세포/웰로 씨딩하였다. 다음날, 재조합 VEGF 단백질 및 h1A11.1-SL-AV DVD를 검정 배지로 희석하였고, 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 혼합하였고, 25℃에서 30분 동안 항온배양하였다. 이어서, VEGF 및 h1A11.1-SL-AV DVD 칵테일(4X)을 검정 플레이트 상의 세포에 25μL/웰로 첨가하였다. 이어서, 치료된 세포를 함유하는 검정 플레이트를 37℃에서 5% CO2와 함께 항온배양하였다. 72시간 후, 판매자의 프로토콜(ATPlite 1step, Perkin Elmer, #6016739)에 따라 생존가능성 검정을 수행하였다. 발광성은 플레이트 판독기(Victor, Perkin Elmer, #1420-051) 상에서 판독하였다.
표 36에 나타낸 바와 같이, h1A11.1-SL-Av DVD는, 사람 VEGF에 비하여 유사한 효력으로 사이노몰거스 원숭이 VEGF 활성을 중화시켰다. 또한, 사람 DLL4에 비하여 약 3배 적은 활성일지라도 h1A11.1-SL-Av DVD는 마우스 DLL4를 억제한다. h1A11.1-SL-Av DVD는 세포 검정에서 마우스 래트 VEGF 활성을 억제하지 않는다.
Figure pat00048
실시예 13: 스크리닝 펀넬(screening funnel) 및 리드(lead) 후보물 선택
리드 DVD-Ig 후보물의 선택은, 최적의 기능적 특성을 제공할 것인 가변 도메인 서열 또는 다른 구조들에 관한 지도가 전혀 없이, 수백개의 잠재적 후보물 분자를 생성하고, 이어서, 치료학적 제제에 요구되는 특성을 갖는 DVD-Ig 분자를 확인하기 위한 검정의 배터리를 포함할 수 있는 스크리닝 펀넬에서 시험하는, 몇회의 사이클의 분자 조작을 필요로 할 수 있다. 전형적으로, 이들 특성으로는, (a) 내부 및 외부 항원-결합 도메인 둘 다에 대한 결합 역학(온-레이트, 오프-레이트 및 친화도), (b) 각종 생화학 및 세포 생물학적 검정에서의 효력, (c) 관련 종양 모델에서의 생체내 효능, (d) 약동학적 및 약력학적 특성, (e) 선택된 세포주에서의 단백질 발현 수준, 확장성, 번역-후 변형, 물리화학적 특성, 예를 들면, 모노머 백분율, 용해도, 및 안정성(본질적, 냉동/해동, 보관 안정성 등)을 포함하는 제조가능성, (f) 제형 특성, (g) 잠재적 면역원성 위험, 및 (h) 분자의 독성학적 특성의 평가가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 결합 방식 및 결합가는 분자의 결합 특성 및 세포 효력에 영향을 미칠 수 있으므로 이들을 평가할 수 있다. 각각의 평가된 매개변수에 대해 역치 수준을 설정하고, 각각의 매개변수에 대해 우수한 수준을 나타내는 결합 단백질에 주목한다. 수백개의 분자들의 개시 스크리닝으로부터, 추가의 평가를 위한 리드 후보물을 확인할 때 고려되는 다른 인자들 중에서, 열거된 매개변수들 모두를 만족시키는 특성을 갖는 것이 알려진 것은 종종 하나뿐이거나 없었다. 일단 리드 후보물이 확인되면, 동물 및 사람 대상체에서의 안전성, 효능, 및 효력을 포함하는 치료학적 특성의 추가의 생체내 평가를 실험한다.
실시예 14: 항-DLL4/항-VEGF DVD-Ig 리드 후보물 선택
본 발명자들은, 표 2에 열거된 VEGF 및 DLL4 서열을 이용한 작제물을 포함하는 대략 100개의 항-DLL4/항-VEGF DVD-Ig 분자, 및 CDR-절편이식된 버젼 및 친화성 성숙된 버젼의 이들 가변 도메인들 및 추가의 사람화된 가변 도메인 서열 및 완전 사람 가변 도메인 서열을 작제하고 평가하였다. 완전 사람 모 항-DLL4 mAb는, PROfusion mRNA 디스플레이 기술에 의해, 이어서, 효모 디스플레이 기술을 이용한 친화성-성숙에 의해 유도되었다. CDR-재절편이식된 모 항체는 항-DLL4 mAb E9.71에 기초하였고, 몇몇의 사람화된 항-DLL4 mAb는, h1A11.1 및 h38H12.11에 기초하여 제조하였고, 몇몇의 친화성-성숙된 h1A11 항체도 제조하였다. 또한, 본 발명자들은 DVD-Ig 결합 단백질에서의 다수의 상이한 링커 서열을 평가하였다. 상이한 링커들의 사용은, 동일한 가변 도메인 서열을 갖는 결합 단백질들 사이에 광범위하게 상이한 특성들을 초래하였다.
생성된 대략 100개의 DVD-Ig 분자들 중, 이들 중 10개는, 일시적 형질감염에 의한 HEK293 세포에서의 발현의 바람직한 수준을 달성하지 않았기 때문에 배제되었고, 22개는 DLL4에 대한 결합의 바람직한 역치 수준을 나타내지 않았고, 19개는 VEGF에 대한 결합의 바람직한 역치 수준을 나타내지 않았으며, 몇몇은, O-링크된 당화를 포함하는 최적 이하의 번역 후 변형을 나타냈다. 몇몇의 DVD-Ig는, 정의된 역치 미만의 결합 친화도를 나타내었기 때문에 배제되었다. DVD-Ig의 내부 위치에서의 항원-결합 도메인은, 항원-결합 친화도 및 효력의 감소된 수준을 나타낸다. 예를 들면, VEGF 결합 도메인이 외부 위치에 위치된 h1A11/Av 계열의 모든 DVD-Ig 분자들 및 내부 위치에서의 DLL4 결합 도메인은, 감소된 DLL4 결합 친화도를 나타냈다. 따라서, 이들 DVD-Ig는 추가의 연구를 위해 선택되지 않았다. 반대 배향(즉, 내부 위치에서의 VEGF 결합 도메인 및 외부 위치에서의 DLL4 결합 도메인)에 있어서, h1A11.1-SL-Av의 VEGF 결합 친화도는, 다른 링커 서열, 예를 들면, h1A11.1-SS-Av(중쇄 및 경쇄 둘 다 상의 VD1과 VD2 도메인들 사이의 짧은 링커들)를 이용한 것을 제외한, 동일한 가변 도메인 및 배향을 사용한 결합 단백질에 대해서도 예상치 못하게 우수한 것으로 밝혀졌다.
추가로, h1A11에 대해 친화성 성숙을 수행하여, 모노클로날 항체 형태에 있어서의 경우에 매우 높은 친화도 및 안정성을 갖는 항-DLL4 모 항체를 생성하였지만, DVD-Ig 형태에 있어서는 이들 작제물들은, 사용된 링커 또는 결합 도메인의 배향에 관계없이 h1A11.1-SL-Av에 대해 관찰된 안정성의 수준을 나타내지 않았다. 유사하게, Av(항-VEGF) 가변 도메인의 친화성 성숙은, 다시, 링커 및 배양 조작에 관계없이 감소된 수준의 안정성을 나타내는 안정한 모 모노클로날 항체를 생성시켰다. 또한, 모노클로날 항체에 대해 우수한 결합 역학을 생성시키는 경우에도 친화성 성숙은 후속적인 DVD-Ig의 활성을 예측할 수 없다. 예를 들면, h1A11.1을 이의 친화성-성숙된 변이체로 대체한 경우, 이들 새로운 DVD-Ig 분자들은 감소된 안정성, 보다 짧은 생체내 반감기, 및 종양 모델에서의 감소된 항-종양 활성을 나타냈다. 또한, 친화성-성숙된 h1A11 및/또는 Av 가변 도메인들을 함유하는 DVD-Ig도, 5℃에서의 보관 동안 높은 수준의 응집체를 겔화 또는 형성하는 증가된 경향성을 나타냈다. 특히, DVD-Ig h1A11.1-SL-Av에 대해, 유사한 조건 하에 보관한 경우, 본래 모 항체 가변 도메인(친화성 성숙되지 않은 항체 유래의 가변 도메인)을 포함하는 DVD-Ig에 대해서는 이러한 바람직하지 못한 겔화 및 응집은 관찰되지 않았다.
이는, 항원 결합 친화도가, 임상학적 후보물을 선택하는 경우에 고려할 유일한 인자가 아니고, 실제로 결합 친화도는, 약간의 구조적 변형에도 민감한 다른 단백질 특성, 예를 들면, 안정성, 제형화 가능성, 물리화학적 특성, 생체내 항-종양 효력 및/또는 약동학적 특성을 예측할 수 없음을 나타낸다. 예를 들면, h1A11.1-LS-Av, h1A11.1-LL-Av 및 h1A11.1-SL-Av DVD-Ig 분자의 VEGF 및 DLL4 중화 효력은 광범위하게 비교할 수 있지만(표 7), h1A11.1-SL-Av는 최고 수준의 종양 성장 억제 효력을 나타냈다(표 9). 또한, 결합 친화도 및 세포 효력을 보유하였던 DVD-Ig 분자들의 경우, 이들 중 몇몇은 보다 적게 선호되는 물리화학적 특성을 나타냈다. 예를 들면, h1A11.1-LL-Av는 치료학적 리드 h1A11.1-SL-Av와 매우 유사하지만, 2개의 작제물 내의 2개의 가변 도메인을 접속시키는 링커들 사이의 차이는, h1A11.1-LL-Av의 경우에 보다 적게 선호되는 물리화학적 특성을 초래한다. 이는, 예를 들면, DVD-Ig 내의 2개의 가변 도메인 사이의 링커에 대한 작은 변화라도 평가되는 치료학적 특성에 유의한 영향을 가질 수 있음을 입증한다.
상기 기술되어 있는 검정에서 측정되는 바와 같은 소정의 바람직한 특성의 존재에 기초하여, 대략 100개 또는 그 이상의 DVD-Ig 분자들 중 17개는, 마우스 모델에서 항-종양 활성 및 약동학적 특성에 대해 추가로 시험하였다. DVD-Ig h1A11.1-SL-Av는, 다른 시험된 결합 단백질들에 비하여 예상치 못하게 우수한 종양-억제 효력 및 약동학적 특성을 나타냈다. 따라서, 스크리닝 펀넬에서 사용된 배제 기준을 평가하면, DVD-Ig h1A11.1-SL-Av는, 결국, 측정된 매개변수들 각각에 있어서 선호되는(즉, 역치 초과의) 특성을 나타내는 결합 단백질로서 드러났다. 따라서, 당해 결합 단백질은 추가의 평가 및 연구를 위해 선택되었다.
실시예 15: 초기 VEGF/DLL4 DVD-Ig에 대한 비교
h1A11.1-SL-Av는, 미국 특허 출원 공개 제20100076178호(상기 출원의 표 5 참조)에 공개된 96개의 이전의 VEGF/DLL4 DVD-Ig 분자에 직접적으로 비교되지 않았고, 간접적 비교가 이루어질 수 있다. 예를 들면, h1A11.1-SL-Av는, 참조 항-VEGF mAb Av의 VEGF-결합 활성에 비교할만한 VEGF-결합 활성을 나타냈다(표 5 참조). 대조적으로, 미국 특허 출원 공개 제20100076178호에서 96개의 VEGF/DLL4 DVD-Ig 분자들 중 2/3는, 참조 항-VEGF mAb AB014보다 더 약한 VEGF-결합 활성을 가졌다. (AB014는 항체 Av에서와 동일한 가변 도메인 서열을 함유한다). 따라서, h1A11.1-SL-Av는, 초기 적용에서 시험된 대부분의 DVD-Ig 작제물에 비해 개선된 결합 역학을 나타내는 것으로 밝혀진다.
선행 실시예들은 본 발명의 개시를 설명하는 것으로 의도되고, 이를 전혀 한정하지 않는다. 개시되어 있는 장치들 및 방법들의 다른 실시형태들은, 명세서 및 본원에 개시되어 있는 장치 및 방법의 실행을 고려하여 당해 분야 숙련가에게 명백할 것이다.
인용에 의한 포함
본 출원 전체에 인용될 수 있는 모든 인용된 참조문헌(논문 참조문헌, 특허, 특허 출원, 및 웹사이트 포함)의 내용은, 임의의 목적을 위해 이들의 전문이 인용에 의해 표현적으로 본원에 이들에 인용된 참조문헌 그대로 포함된다. 본 개시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야에 익히 공지되어 있는 면역학, 분자 생물학, 및 세포 생물학의 종래 기술을 사용할 것이다.
또한, 본 발명의 개시는, 분자 생물학 및 약물 전달의 분야에 익히 공지되어 있는 이들의 전체 기술을 인용에 의해 포함한다. 이들 기술로는, 하기 출판물들에 기술되어 있는 기술이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:
Figure pat00049
Figure pat00050
등가 범위
본 개시는, 본 개시의 정신 또는 필수적 특성을 벗어나지 않으면서 다른 특정 형태들로 구현될 수 있다. 따라서, 상기 실시형태들은, 모든 관점에서, 본 개시를 한정하기 보다는 예시를 위한 것으로 간주되어야 한다. 따라서, 본 개시의 범위는, 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해서보다는 첨부된 특허청구범위에 의해 나타내어지므로, 특허청구범위의 등가인 의미 및 범위 내에 속하는 모든 변화는 본원에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ABBVIE INC. <120> ANTI-VEGF/DLL4 DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF <130> 12252.0081-00304 <150> US 61/721,072 <151> 2012-11-01 <150> US 61/787,927 <151> 2013-03-15 <160> 76 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 5 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120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 130 135 140 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 145 150 155 160 Thr Phe Ser Asn Phe Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 165 170 175 Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp Gly Thr Thr Tyr 180 185 190 Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 195 200 205 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 210 215 220 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr 225 230 235 240 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 63 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 63 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 145 150 155 160 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Pro Met Ala Trp Val Arg Gln 165 170 175 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp 180 185 190 Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 195 200 205 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 210 215 220 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Tyr Asn Ser 225 230 235 240 Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 250 255 <210> 64 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser 130 135 140 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr 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Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln 130 135 140 Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 145 150 155 160 Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro 165 170 175 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 180 185 190 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 195 200 205 Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 210 215 220 Arg 225 <210> 67 <211> 229 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 115 120 125 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 130 135 140 Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 145 150 155 160 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His 165 170 175 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 195 200 205 Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 210 215 220 Val Glu Ile Lys Arg 225 <210> 68 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 68 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 69 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 69 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser 130 135 140 Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro 195 200 205 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 210 215 220 <210> 70 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 70 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser 130 135 140 Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 180 185 190 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro 195 200 205 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 210 215 220 <210> 71 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 71 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu 130 135 140 Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 145 150 155 160 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro 165 170 175 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 180 185 190 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 195 200 205 Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 210 215 220 Arg 225 <210> 72 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 72 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 130 135 140 Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu 210 215 220 Glu Ile Lys Arg 225 <210> 73 <211> 334 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 73 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Thr Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 115 120 125 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser 130 135 140 Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 145 150 155 160 Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser 165 170 175 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 180 185 190 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 195 200 205 Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 210 215 220 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 225 230 235 240 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 245 250 255 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 260 265 270 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 275 280 285 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 290 295 300 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 305 310 315 320 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 325 330 <210> 74 <211> 577 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe 20 25 30 Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Ser Ser Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Tyr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn 165 170 175 Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe 180 185 190 Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro 210 215 220 His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 260 265 270 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 275 280 285 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 290 295 300 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 305 310 315 320 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 325 330 335 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 340 345 350 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 355 360 365 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 370 375 380 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 385 390 395 400 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 405 410 415 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 420 425 430 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 435 440 445 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 450 455 460 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 465 470 475 480 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 485 490 495 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 500 505 510 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 515 520 525 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 530 535 540 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 545 550 555 560 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 575 Lys <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 76 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Gly Gly Gly Ser 1

Claims (166)

  1. 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합하고, 여기서, VD1 및 VD2는 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중 하나 이상은 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들을 포함하는, 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, VD1 및 VD2는 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중 하나 이상은 서열번호 39를 포함하는, 결합 단백질.
  3. 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1 또는 CL이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합하고, 여기서, VD1 및 VD2는 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중 하나 이상은 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하는, 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 VD1 및 VD2는 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, VD1 및/또는 VD2 중 하나 이상은 서열번호 40을 포함하는, 결합 단백질.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 중쇄 및/또는 경쇄 상의 (X1)n이 (X1)0이고/이거나 중쇄 및/또는 경쇄 상의 (X2)n이 (X2)0인, 결합 단백질.
  6. 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄는 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH2가 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 제2 폴리펩타이드 쇄는 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1 또는 CL이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합하고, 상기 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들을 포함하고; 상기 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하는,
    제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들이 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상이 서열번호 39를 포함하고; 상기 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들이 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, 여기서, VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상이 서열번호 40을 포함하는, 결합 단백질.
  8. 제1항, 제3항, 또는 제6항에 있어서, X1이 서열번호 1 내지 서열번호 38 또는 G/S 기반 서열 중 하나를 포함하는, 결합 단백질.
  9. 제6항에 있어서, 상기 결합 단백질이 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄들 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는, 결합 단백질.
  10. 제1항, 제3항, 또는 제6항에 있어서, 상기 Fc 영역이 변이체 서열 Fc 영역인, 결합 단백질.
  11. 제1항, 제3항, 또는 제6항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 유래의 Fc 영역인, 결합 단백질.
  12. 제6항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD1 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD1이, 각각, 상이한 제1 모 항체 및 제2 모 항체, 또는 이들의 결합부 유래인, 결합 단백질.
  13. 제6항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄의 VD2 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄의 VD2가, 각각, 상이한 제1 모 항체 및 제2 모 항체, 또는 이들의 결합부 유래인, 결합 단백질.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 제1 모 항체 및 상기 제2 모 항체가, 동일한 표적 또는 상이한 표적들 상의 상이한 에피토프들에 결합하는, 결합 단백질.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 결합부가, 제2 모 항체 또는 이의 결합부가 제2 표적에 결합하는 효력과 상이한 효력으로 제1 표적에 결합하는, 결합 단백질.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 결합부가, 상기 제2 모 항체 또는 이의 결합부가 제2 표적에 결합하는 친화도와 상이한 친화도로 제1 표적에 결합하는, 결합 단백질.
  17. 4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질로서,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1 또는 CL이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합하고, 상기 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들을 포함하고; 상기 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하는,
    4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 상기 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들이 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상이 서열번호 39를 포함하고; 상기 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들이 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54를 포함하고, 상기 VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상이 서열번호 40을 포함하는, 결합 단백질.
  19. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 102M-1s-1 이상; 약 103M-1s-1 이상; 약 104M-1s-1 이상; 약 105M-1s-1 이상; 또는 약 106M-1s-1 이상의 VEGF 및/또는 DLL4에 대한 온 레이트 상수(on rate constant)(Kon)를 갖는, 결합 단백질.
  20. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 10-2s-1 이하; 약 10-3s-1 이하; 약 10-4s-1 이하; 약 10-5s-1 이하; 또는 약 10-6s-1 이하의 VEGF 및/또는 DLL4에 대한 오프 레이트 상수(off rate constant)(Koff)를 갖는, 결합 단백질.
  21. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제17항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 10-7M 이하; 약 10-8M 이하; 약 10-9M 이하; 약 10-10M 이하; 약 10-11M 이하; 또는 약 10-12M 이하의 VEGF 및/또는 DLL4에 대한 평형 해리 상수(KD)를 갖는, 결합 단백질.
  22. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제17항에 있어서, 상기 결합 단백질 접합체가 작용제(agent)를 추가로 포함하고, 상기 작용제는 면역부착 분자, 영상화제, 치료학적 작용제, 또는 세포독성 작용제인, 결합 단백질 접합체.
  23. 제22항에 있어서, 상기 영상화제가 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 또는 비오틴인, 결합 단백질 접합체.
  24. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제17항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 결정화된 결합 단백질인, 결합 단백질.
  25. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 또는 제22항의 결합 단백질 아미노산 서열을 암호화하는, 단리된 핵산.
  26. 제25항의 단리된 핵산을 포함하는, 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 상기 벡터가 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV, pcDNA3.1, TOPO, pEF6 TOPO, pHybE, pBOS 또는 pBJ인, 벡터.
  28. 제26항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 세포인, 숙주 세포.
  30. 제28항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 세포인, 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 원생동물 세포, 동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 또는 진균 세포인, 숙주 세포.
  32. 결합 단백질을 제조하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 결합 단백질의 제조 방법.
  33. 제32항의 방법에 의해 제조된 단백질.
  34. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 1개 이상의 추가의 작용제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 추가의 작용제가, 면역부착 분자, 영상화제, 치료학적 작용제, 세포독성 작용제, 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 비오틴, 항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스성 작용제, 화학치료요법제; 영상화제, 혈관신생 억제제, 키나제 억제제(KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 공동-자극 분자 조절제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 소분자 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 또는 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 소염성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 효능제, 흡입형 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 항-고혈압제, 이뇨제, 아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 레닌 억제제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 혈관확장제, 알파-2 효능제, 클로니딘, 메틸도파, 하이드랄라진, 프라조신, 레세르핀, 목소니딘, 구안파신, 페린도프릴/인다파미드, 로펙시딘, 메티로신, 항응고제, 와파린, 헤파린, 저분자량 헤파린, 달테파린, 아르가트로반, 비발리루딘, 레피루딘, 및 덱스트로스 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 추가의 작용제가, 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 5-FU; 6-메르캅토퓨린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주마브; ALIMTA; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 전(All)-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐리드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 3산화 비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주마브; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; 카페시타빈; Carac™; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 리포솜성 시타라빈; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코젠; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티니브; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 리포솜성 다우노루비신; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 인산 나트륨; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 리포솜성 독소루비신; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에날라프릴; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티니브; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; 에티올; Etopophos®; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록스우리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티니브; 겜시타빈; 겜투주마브 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® 웨이퍼; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 인산 나트륨; 하이드로코르티손 석신산 나트륨; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브리투모마브; 이브리투모마브 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 접합체); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티니브 메실레이트; 이미다졸 카르복사미드; Intron A®; Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; 키드롤라제 (t) Lanacort®; 라파티니브; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도미드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤리드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리포솜성 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 맥시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메르캅토퓨린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; 미톡산트론 M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; 니페디핀; Nilandron®; 닐로티니브; 닐루타미드; Nipent®; 질소 머스타드 Novaldex®; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오티드; 옥트레오티드 아세테이트; 오파투무마브; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 단백질-결합된 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파니투무마브; Panretin®; Paraplatin®; 파조파니브; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펜토스타틴; 페닐알라닌 머스타드; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카르바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페니브; SPRYCEL™; STI-571; 스트렙토조신; SU11248; 수니티니브; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로미드 템시롤리무스; 테니포시드; TESPA; 탈리도미드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오포스포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모마브; 트라스투주마브; Treanda®; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타르트레이트; VLB; VM-26; 보리노스태트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; Zometa®; 류코보린; 5-FU; 테모졸로미드; 겜시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브; 및 페르투주마브 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  38. 대상체의 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조시, 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항에 따른 결합 단백질의 용도.
  39. 제38항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가, 원발성 또는 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식관암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모막암종, 임신성 영양막 질환, 남성 생식관암, 전립선암, 정낭암, 고환암, 생식 세포 종양, 내분비선암, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 골 육종, 연조직 육종, 카포시 육종, 뇌의 종양, 신경의 종양, 눈의 종양, 뇌척수막의 종양, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반종, 및 뇌수막종, 조혈 악성 종양으로부터 발생하는 고형 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 위암, 방광암, 전립선암, 직장암, 조혈 악성 종양, 무베타지질단백질혈증, 말단 청색증, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장 암종, 모발상 세포 백혈병, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 췌장 암종, 부신생물 증후군, 악성 종양의 고칼슘혈증, 육종, 고형 종양, 황반 변성, 진성 당뇨병 1형, 당뇨성 망막병증, 죽상 동맥경화증, 또는 혈관 과성장, 부종, 또는 이상 DLL4 또는 VEGF 활성을 특징으로 하는 임의의 다른 혈관신생 의존적 또는 비의존적 질환인, 용도.
  40. 제38항에 있어서, 상기 대상체에게의 투여가, 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 안내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피인, 용도.
  41. VEGF 및 DLL4, 또는 이들의 단편에 결합할 수 있는 결합 단백질의 생성 방법으로서, 상기 방법은,
    a) VEGF 및 DLL4로부터 선택되는 제1 표적에 결합할 수 있는, 제1 모 항체 또는 이의 결합부를 암호화하는 핵산을 얻는 단계;
    b) VEGF 및 DLL4로부터 선택되는 제2 표적에 결합할 수 있는, 제2 모 항체 또는 이의 결합부를 암호화하는 핵산을 얻는 단계;
    c) 단계 (a) 및 (b)의 핵산을 이용하여 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드 쇄(들)을 암호화하는 핵산 작제물(들)을 제조하는 단계;
    d) VEGF 및 DLL4에 결합할 수 있는 결합 단백질이 생성되도록, 단리된 숙주 세포에서 상기 폴리펩타이드 쇄(들)을 발현시키는 단계
    를 포함하는, VEGF 및 DLL4, 또는 이들의 단편에 결합할 수 있는 결합 단백질의 생성 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 방법이 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 생성하는, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 Fc 영역이 변이체 서열 Fc 영역인, 방법.
  44. 제41항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 유래의 Fc 영역인, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 제1 모 항체 또는 이의 결합부가, 제2 모 항체 또는 이의 결합부가 제2 표적에 결합하는 친화도 및/또는 효력과 상이한 친화도 및/또는 효력으로 제1 표적에 결합하는, 방법.
  46. 면역검정에 의해 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4, 또는 이들의 단편 중 하나 이상의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 면역검정은, 상기 시험 샘플을 1개 이상의 결합 단백질 및 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 상기 1개 이상의 결합 단백질은 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 포함하는, 면역검정에 의해 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4, 또는 이들의 단편 중 하나 이상의 존재를 검출하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 1개 이상의 검출가능한 표지가 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 또는 비오틴을 포함하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 1개 이상의 검출가능한 표지가 1개 이상의 결합 단백질 상에 존재하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서,
    (i) 상기 시험 샘플을 상기 1개 이상의 결합 단백질과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 결합 단백질은, 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합하여 제1 복합체를 형성한다);
    (ii) 상기 제1 복합체를 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계(여기서, 상기 검출가능한 표지는, 상기 결합 단백질에, 또는 상기 결합 단백질에 의해 결합되지 않은 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합한다); 및
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 존재를 검출하는 단계(여기서, VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 존재는, 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호와 직접적으로 상호관련되어 있다)
    를 추가로 포함하는, 방법.
  50. 제46항에 있어서,
    (i) 상기 시험 샘플을 상기 1개 이상의 결합 단백질과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 결합 단백질은, 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합하여 제1 복합체를 형성한다);
    (ii) 상기 제1 복합체를 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계(여기서, 상기 검출가능한 표지는, 상기 결합 단백질에 결합하기 위해 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편과 경쟁한다); 및
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 존재를 검출하는 단계(여기서, VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 존재는, 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호와 간접적으로 상호관련되어 있다)
    를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 샘플이 환자 유래이고, 상기 방법이, 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치의 효능을 진단하거나, 예측진단하거나, 또는 평가함을 추가로 포함하고,
    여기서, 상기 방법이, 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치의 효능을 평가함을 추가로 포함하는 경우, 상기 방법은, 필요에 따라 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치를 변형시켜 효능을 개선시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하기 위해 조정되는(adapted), 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 샘플 중의 DLL4 및 VEGF 둘 다의 존재를 검출하는, 방법.
  54. 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4, 또는 이들의 단편의 양 또는 농도를 면역검정에 의해 측정하는 방법으로서, 상기 면역검정은,
    (a) 상기 시험 샘플을 1개 이상의 결합 단백질 및 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호를, 상기 1개 이상의 결합 단백질 및 상기 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉된 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 기지의 양 또는 농도를 포함하는 대조군 또는 캘리브레이터(calibrator)에 의해 생성된 신호와 비교하는 단계를 포함하고,
    여기서, 상기 캘리브레이터는 임의로 일련의 캘리브레이터들의 일부분이고, 상기 일련의 캘리브레이터들에서, 각각의 캘리브레이터는, VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 상이한 양 또는 농도를 가짐으로써 상기 일련의 캘리브레이터들 중의 다른 캘리브레이터들과 상이하고,
    상기 1개 이상의 결합 단백질이 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 포함하는,
    시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4, 또는 이들의 단편의 양 또는 농도를 면역검정에 의해 측정하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 1개 이상의 검출가능한 표지가, 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 또는 비오틴을 포함하는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 상기 1개 이상의 검출가능한 표지가 1개 이상의 결합 단백질 상에 존재하는, 방법.
  57. 제54항에 있어서,
    (i) 상기 시험 샘플을 1개 이상의 결합 단백질과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 결합 단백질은 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합하여 제1 복합체를 형성한다);
    (ii) 상기 제1 복합체를 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계(여기서, 상기 검출가능한 표지는, 상기 결합 단백질에 의해 결합되지 않은 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합한다); 및
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 양 또는 농도는, 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 대해 정비례한다)
    를 추가로 포함하는, 방법.
  58. 제54항에 있어서,
    (i) 상기 시험 샘플을 1개 이상의 결합 단백질과 접촉시키는 단계(여기서, 상기 결합 단백질은 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편 상의 에피토프에 결합하여 제1 복합체를 형성한다);
    (ii) 상기 제1 복합체를 1개 이상의 검출가능한 표지와 접촉시켜 제2 복합체를 형성하는 단계(여기서, 상기 검출가능한 표지는, 상기 결합 단백질에 결합하기 위해 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편과 경쟁한다); 및
    (iii) 상기 제2 복합체 중의 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 기초하여 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 양 또는 농도를 측정하는 단계(여기서, 상기 시험 샘플 중의 VEGF 또는 DLL4 또는 이들의 단편의 존재는, 검출가능한 표지에 의해 생성된 신호에 대해 반비례한다)
    를 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시험 샘플이 환자 유래이고, 상기 방법이, 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치의 효능을 진단하거나, 예측진단하거나, 또는 평가함을 추가로 포함하고,
    여기서, 상기 방법이, 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치의 효능을 평가함을 추가로 포함하는 경우, 상기 방법은, 필요에 따라 상기 환자의 치료학적 또는 예방학적 처치를 변형시켜 효능을 개선시킴을 임의로 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이, 자동화 시스템 또는 반-자동화 시스템에서 사용하기 위해 조정되는, 방법.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 샘플 중의 DLL4 및 VEGF의 양 또는 농도를 측정하는, 방법.
  62. 시험 샘플을 DLL4, VEGF, 또는 둘 다의 존재, 양, 또는 농도에 대해 검정하는데 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는,
    (a) 상기 시험 샘플을 VEGF 및/또는 DLL4 또는 이들의 단편(들)에 대해 검정하기 위한 지침서; 및
    (b) 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 또는 제33항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 포함하는 하나 이상의 결합 단백질
    을 포함하는, 시험 샘플을 DLL4, VEGF, 또는 둘 다의 존재, 양, 또는 농도에 대해 검정하는데 사용하기 위한 키트.
  63. 서열번호 55 내지 서열번호 63 및 서열번호 74로부터 선택되는 VH 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  64. 서열번호 64 내지 서열번호 73으로부터 선택되는 VL 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  65. 서열번호 55 내지 서열번호 63 및 서열번호 74로부터 선택되는 VH 서열 및 서열번호 64 내지 서열번호 73으로부터 선택되는 VL 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  66. 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 추가로, 여기서, 상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 5.42 x10-5s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 2.63 x10-3s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합하는, 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  67. 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 추가로, 여기서, 상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 5.42 x10-5s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 2.63 x10-3s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합하는, 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  68. 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 제2 폴리펩타이드 쇄는 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 추가로, 여기서, 상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 5.42 x10-5s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 2.63 x10-3s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합하는, 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  69. 4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질로서,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 추가로, 여기서, 상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 5.42 x10-5s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 2.63 x10-3s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합하는, 4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질.
  70. 4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질로서,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    2개의 폴리펩타이드 쇄들은 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고, 단, 이는 CH1이 아니고;
    X2는 Fc 영역을 포함하지 않고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하고,
    (i) 상기 결합 단백질은 VEGF 및 DLL4에 결합하고;
    (ii) 상기 VD1 및 VD2 중쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 또는 53 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 중쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들을 포함하고/하거나; 상기 VD1 및 VD2 경쇄 가변 도메인들은 독립적으로 서열번호 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 또는 54 유래의 3개의 CDR들을 포함하고, 여기서, 상기 VD1 및/또는 VD2 경쇄 가변 도메인들 중 하나 이상은 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하고;
    (iii) 상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 5.42 x10-5s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 2.63 x10-3s-1 이하의 오프 레이트 상수(Koff) 및/또는 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합하는,
    4개의 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는 결합 단백질.
  71. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 VEGF 및 DLL에 결합하고, 상기 중쇄 가변 도메인이 서열번호 55 내지 서열번호 63 및 서열번호 74를 포함하는, 결합 단백질.
  72. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 상기 경쇄 가변 도메인이 서열번호 64 내지 서열번호 73을 포함하는, 결합 단백질.
  73. 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 VEGF 및 DLL4에 결합하고, 상기 중쇄 가변 도메인이 서열번호 55 내지 서열번호 63 및 서열번호 74를 포함하고, 상기 경쇄 가변 도메인이 서열번호 64 내지 서열번호 73을 포함하는, 결합 단백질.
  74. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 또는 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, (X1)n이 서열번호 1 내지 서열번호 38로부터 선택되는, 결합 단백질.
  75. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 또는 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우에 상기 VD1 중쇄 및 VD1 경쇄 가변 도메인들, 및/또는 존재하는 경우에 VD2 중쇄 및 VD2 경쇄 가변 도메인들이 각각 서열번호 39 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들을 포함하는, 결합 단백질.
  76. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 또는 제66항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이: h1A11.1-L-AV(서열번호 55 및 서열번호 64 포함); h1A11.1-S-AV(서열번호 56 및 서열번호 65 포함); h1A11.1-GS10-AV(서열번호 57 및 서열번호 66 포함); h1A11.1-GS14-AV(서열번호 58 및 서열번호 67 포함); AV-L-h1A11.1(서열번호 59 및 서열번호 68 포함); AV-S-h1A11.1(서열번호 60 및 서열번호 69 포함); AV-GS6-h1A11.1(서열번호 61 및 서열번호 70 포함); AV-GS10-h1A11.1(서열번호 62 및 서열번호 71 포함); AV-GS14-h1A11.1(서열번호 63 및 서열번호 72 포함); 또는 h1A11.1-SL-Av(서열번호 73 및 서열번호 74 포함)인, 결합 단백질.
  77. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 유세포측정법(FACS) 검정시 약 5.04nM 이하의 EC50으로 DLL4-발현 세포에 결합하는, 결합 단백질.
  78. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, Notch 경쟁 ELISA 검정 또는 경쟁 FACS 검정시 약 3503nM 이하의 IC50으로 Notch1에 대한 DLL4 결합을 방해하는, 결합 단백질.
  79. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, Notch 리포터 검정시 약 7.47nM 이하의 IC50으로 Notch1 활성화를 방지하는, 결합 단백질.
  80. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 포획 ELISA 검정시 약 2.50nM 이하의 EC50으로 VEGF에 결합하는, 결합 단백질.
  81. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, VEGF 경쟁 ELISA 검정시 약 37.2nM 이하의 IC50으로 세포 생존/증식을 방해하는, 결합 단백질.
  82. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 내피 세포 증식 검정시 약 4.2nM 이하의 IC50으로 VEGFR에 대한 VEGF 결합을 방해하는, 결합 단백질.
  83. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 상기 결합 단백질로 치료되지 않은 마우스와 비교하여, 암컷 마우스에서 HT-29 사람 결장직장 선암종 종양 이종이식체의 약 47% 이상의 크기 감소, 및 약 42% 이상의 종양 성장 지연을 생성시키는, 결합 단백질.
  84. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 상기 결합 단백질로 치료되지 않은 마우스와 비교하여, 암컷 마우스에서 U87-MG 교모세포종 종양 이종이식체의 약 64% 이상의 크기 감소, 및 약 48% 이상의 종양 성장 지연을 생성시키는, 결합 단백질.
  85. 제1항, 제3항, 제6항, 제17항, 제22항, 제33항, 제66항 내지 제70항, 또는 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은, 테모졸로미드와 병용하여, 상기 결합 단백질로 치료되지 않은 마우스와 비교하여, 암컷 마우스에서 U87-MG 교모세포종 종양 이종이식체의 약 65% 이상의 크기 감소, 및 약 45% 이상의 종양 성장 지연을 생성시키는, 결합 단백질.
  86. 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는, 결합 단백질.
  87. 제1항, 제3항, 제6항, 또는 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역인, 결합 단백질.
  88. 적어도 하나의 아미노산,
    적어도 하나의 폴리사카라이드 및/또는 폴리소르베이트, 및
    약 0.1 내지 100mg/ml 농도의 결합 단백질
    을 포함하는 약제학적 조성물로서,
    상기 약제학적 조성물은 약 5.0 내지 7.0의 pH로 존재하고,
    상기 결합 단백질은, VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 가변 도메인이고;
    C는 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 각각 독립적으로 포함하는, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    여기서, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있는,
    약제학적 조성물.
  89. 제88항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산이 히스티딘이고, 약 10 내지 20mM, 또는 약 15mM의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 조성물의 pH가 약 5.5 내지 6.0, 또는 약 5.5, 또는 약 6.0인, 약제학적 조성물.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리사카라이드가 슈크로스이고 약 0 내지 8.0% 중량/체적(w/v)의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 80이고 약 0 내지 0.06% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌이고 약 0 내지 1.5% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  94. 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 약 1 내지 100mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 2.5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 25 내지 100mg/ml, 또는 약 20 내지 60mg/ml, 또는 약 25 내지 50mg/ml, 또는 약 25mg/ml, 또는 약 50mg/ml의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  95. 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 약 0.1 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 25mg/ml, 또는 약 1.0 내지 60mg/ml, 또는 약 0.5 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 2.0mg/ml, 또는 약 0.5 내지 2.0mg/ml, 또는 약 1 내지 5mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 0.5mg/ml, 또는 약 1.0mg/ml의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  96. 제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 동결건조된, 약제학적 조성물.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 수화되거나, 동결건조되고 재수화된, 약제학적 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이, 덱스트로스 및/또는 염수를 포함하는 수화 용액 중에 존재하는, 약제학적 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 상기 덱스트로스가 약 5% w/v의 농도로 존재하고 상기 염수가 약 0.9% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 조성물.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 약 15mM의 히스티딘, 약 0.03%(w/v)의 폴리소르베이트 80, 약 4.0%(w/v) 슈크로스, 및 약 25mg/ml의 결합 단백질, 또는 약 1 내지 15mg/ml의 결합 단백질을 포함하고, 약 6.0의 pH로 존재하고, 여기서, 상기 결합 단백질은 서열번호 73 및 서열번호 74를 포함하는, 약제학적 조성물.
  101. 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들
    을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 42 유래의 3개의 CDR들,
    서열번호 43 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 44 유래의 3개의 CDR들,
    서열번호 45 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 46 유래의 3개의 CDR들,
    서열번호 47 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 48 유래의 3개의 CDR들,
    서열번호 49 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 50 유래의 3개의 CDR들,
    서열번호 51 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 52 유래의 3개의 CDR들, 또는
    서열번호 53 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 54 유래의 3개의 CDR들
    을 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  102. 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및/또는 서열번호 40
    을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 내지 서열번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열
    을 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  103. 제88항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이, 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 결합 단백질이, 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    (X1)n에 대해 n은 0 또는 1이고;
    (X2)n에 대해 n은 0이다]을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하는, 약제학적 조성물.
  104. 제88항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42,
    서열번호 43 및 서열번호 44,
    서열번호 45 및 서열번호 46,
    서열번호 47 및 서열번호 48,
    서열번호 49 및 서열번호 50,
    서열번호 51 및 서열번호 52, 또는
    서열번호 53 및 서열번호 54
    를 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  105. 제88항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 4개의 기능성 표적 결합 부위를 형성하는, 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄들 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는, 약제학적 조성물.
  106. 제88항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 및/또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합할 수 있는, 약제학적 조성물.
  107. 제88항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 서열번호 1 내지 서열번호 38 중 어느 하나 또는 G/S 기반 서열을 포함하고/하거나,
    (b) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 CL이 아니고/아니거나,
    (c) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 변이체 서열 Fc 영역이고/이거나,
    (d) 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역이고/이거나,
    (e) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 또는 이들의 변이체 유래의 Fc 영역이고/이거나,
    (f) 상기 결합 단백질이, 결정화된 결합 단백질인, 약제학적 조성물.
  108. 제88항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이,
    서열번호 55 및 서열번호 56,
    서열번호 57 및 서열번호 58,
    서열번호 59 및 서열번호 60,
    서열번호 61 및 서열번호 62,
    서열번호 63 및 서열번호 64,
    서열번호 65 및 서열번호 66,
    서열번호 67 및 서열번호 68,
    서열번호 69 및 서열번호 70,
    서열번호 71 및 서열번호 72, 또는
    서열번호 73 및 서열번호 74
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  109. 제88항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이
    (i) 서열번호 39 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 40 유래의 3개의 CDR들
    을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 유래의 3개의 CDR들 및 서열번호 42 유래의 3개의 CDR들
    을 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  110. 제88항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는 DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42
    를 포함하는 VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 조성물.
  111. 제88항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 h1A11.1-SL-Av(서열번호 73 및 서열번호 74 포함)를 포함하는, 약제학적 조성물.
  112. 제88항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역인, 약제학적 조성물.
  113. 제88항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 추가의 작용제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  114. 제113항에 있어서, 상기 1개 이상의 추가의 작용제가, 면역부착 분자, 영상화제, 치료학적 작용제, 세포독성 작용제, 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 비오틴, 항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스성 작용제, 화학치료요법제; 영상화제, 혈관신생 억제제, 키나제 억제제(KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 공동-자극 분자 조절제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 소분자 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 또는 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 소염성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 효능제, 흡입형 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 항-고혈압제, 이뇨제, 아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 레닌 억제제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 혈관확장제, 알파-2 효능제, 클로니딘, 메틸도파, 하이드랄라진, 프라조신, 레세르핀, 목소니딘, 구안파신, 페린도프릴/인다파미드, 로펙시딘, 메티로신, 항응고제, 와파린, 헤파린, 저분자량 헤파린, 달테파린, 아르가트로반, 비발리루딘, 레피루딘, 및 덱스트로스 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 작용제가, 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 5-FU; 6-메르캅토퓨린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주마브; ALIMTA; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 전(All)-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐리드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 3산화 비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주마브; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; 카페시타빈; Carac™; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 리포솜성 시타라빈; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코젠; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티니브; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 리포솜성 다우노루비신; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 인산 나트륨; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 리포솜성 독소루비신; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에날라프릴; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티니브; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; 에티올; Etopophos®; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록스우리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티니브; 겜시타빈; 겜투주마브 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® 웨이퍼; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 인산 나트륨; 하이드로코르티손 석신산 나트륨; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브리투모마브; 이브리투모마브 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 접합체); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티니브 메실레이트; 이미다졸 카르복사미드; Intron A®; Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; 키드롤라제 (t) Lanacort®; 라파티니브; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도미드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤리드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리포솜성 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 맥시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메르캅토퓨린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; 미톡산트론 M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; 니페디핀; Nilandron®; 닐로티니브; 닐루타미드; Nipent®; 질소 머스타드 Novaldex®; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오티드; 옥트레오티드 아세테이트; 오파투무마브; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 단백질-결합된 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파니투무마브; Panretin®; Paraplatin®; 파조파니브; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펜토스타틴; 페닐알라닌 머스타드; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카르바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페니브; SPRYCEL™; STI-571; 스트렙토조신; SU11248; 수니티니브; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로미드 템시롤리무스; 테니포시드; TESPA; 탈리도미드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오포스포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모마브; 트라스투주마브; Treanda®; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타르트레이트; VLB; VM-26; 보리노스태트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; Zometa®; 류코보린; 5-FU; 테모졸로미드; 겜시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브; 및 페르투주마브 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  116. 제113항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 작용제가, 이리노테칸; 류코보린; 5-FU, 폴피리; 에날라프릴; 니페디핀; 클로니딘; 테모졸로미드; 겜시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브, 카페시타빈; 및 페르투주마브 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 조성물.
  117. 제88항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서의 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  118. 제117항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가, 원발성 또는 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식관암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모막암종, 임신성 영양막 질환, 남성 생식관암, 전립선암, 정낭암, 고환암, 생식 세포 종양, 내분비선암, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 골 육종, 연조직 육종, 카포시 육종, 뇌의 종양, 신경의 종양, 눈의 종양, 뇌척수막의 종양, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반종, 및 뇌수막종, 조혈 악성 종양으로부터 발생하는 고형 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 위암, 방광암, 전립선암, 직장암, 조혈 악성 종양, 무베타지질단백질혈증, 말단 청색증, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장 암종, 모발상 세포 백혈병, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 췌장 암종, 부신생물 증후군, 악성 종양의 고칼슘혈증, 육종, 고형 종양, 황반 변성, 진성 당뇨병 1형, 당뇨성 망막병증, 죽상 동맥경화증, 또는 혈관 과성장, 부종, 또는 이상 DLL4 또는 VEGF 활성을 특징으로 하는 임의의 다른 혈관신생 의존적 또는 비의존적 질환인, 약제학적 조성물.
  119. 제117항 또는 제118항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이, 피하, 근육내, 정맥내, 안내, 동맥내, 기관지내, 복강내, 낭내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척추내, 활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스(bolus), 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  120. 치료를 필요로 하는 대상체에게 제88항 내지 제119항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하는, 치료 방법.
  121. 제120항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을 투여하여, 원발성 또는 전이성 암, 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 비-소세포 폐암, 선암종, 구강인두암, 하인두암, 식도암, 위암, 췌장암, 간암, 담낭암, 담관암, 소장암, 요로암, 신장암, 방광암, 요로상피암, 여성 생식관암, 자궁경부암, 자궁암, 난소암, 융모막암종, 임신성 영양막 질환, 남성 생식관암, 전립선암, 정낭암, 고환암, 생식 세포 종양, 내분비선암, 갑상선암, 부신암, 뇌하수체암, 피부암, 혈관종, 흑색종, 육종, 골 육종, 연조직 육종, 카포시 육종, 뇌의 종양, 신경의 종양, 눈의 종양, 뇌척수막의 종양, 성상세포종, 신경교종, 교모세포종, 망막모세포종, 신경종, 신경모세포종, 슈반종, 및 뇌수막종, 조혈 악성 종양으로부터 발생하는 고형 종양, 백혈병, 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 위암, 방광암, 전립선암, 직장암, 조혈 악성 종양, 무베타지질단백질혈증, 말단 청색증, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), B 세포 림프종, 버킷 림프종, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 결장직장 암종, 모발상 세포 백혈병, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 다발성 골수종, 췌장 암종, 부신생물 증후군, 악성 종양의 고칼슘혈증, 육종, 고형 종양, 황반 변성, 진성 당뇨병 1형, 당뇨성 망막병증, 죽상 동맥경화증, 또는 혈관 과성장, 부종, 또는 이상 DLL4 또는 VEGF 활성을 특징으로 하는 임의의 다른 혈관신생 의존적 또는 비의존적 질환을 치료하는, 방법.
  122. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을, 임의로 이리노테칸, 류코보린, 테모졸로미드, 겜시타빈, 파클리탁셀, 카페시타빈, 및 5-FU 중 하나 이상과 병용하여 투여하여 결장암을 치료하는, 방법.
  123. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을, 임의로 테모졸로미드와 병용하여 투여하여 교모세포종을 치료하는, 방법.
  124. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을, 임의로 겜시타빈과 병용하여 투여하여 췌장암을 치료하는, 방법.
  125. 제120항 또는 제121항에 있어서, 상기 약제학적 조성물을, 임의로 파클리탁셀과 병용하여 투여하여 유방암을 치료하는, 방법.
  126. VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 가변 도메인이고;
    C는 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 각각 독립적으로 포함하는, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질로서,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있고, 여기서:
    (i) DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들은
    서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3을 포함하고,
    (ii) VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들은
    서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 43 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 44 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 45 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 46 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 47 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 48 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 49 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 50 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 51 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 52 유래의 CDR 1 내지 3, 또는
    서열번호 53 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 54 유래의 CDR 1 내지 3을 포함하는, 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 결합 단백질.
  127. 제126항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및/또는 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 내지 서열번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열
    을 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 결합 단백질.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서,
    상기 결합 단백질이,
    제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 결합 단백질이,
    제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    (X1)n에 대해 n은 0 또는 1이고;
    (X2)n에 대해 n은 0이다]을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하는, 결합 단백질.
  129. 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42,
    서열번호 43 및 서열번호 44,
    서열번호 45 및 서열번호 46,
    서열번호 47 및 서열번호 48,
    서열번호 49 및 서열번호 50,
    서열번호 51 및 서열번호 52, 또는
    서열번호 53 및 서열번호 54
    를 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들을 포함하는, 결합 단백질.
  130. 제126항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 4개의 기능성 표적 결합 부위들을 형성하는 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄들 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는, 결합 단백질.
  131. 제126항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시, 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 및/또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시, 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합할 수 있는, 결합 단백질.
  132. 제126항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 서열번호 1 내지 서열번호 38 중 어느 하나 또는 G/S 기반 서열을 포함하고/하거나,
    (b) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 CH1 또는 CL이 아니고/아니거나,
    (c) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 변이체 서열 Fc 영역이고/이거나,
    (d) 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역이고/이거나,
    (e) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 또는 이들의 변이체이고/이거나,
    (f) 상기 결합 단백질이, 결정화된 결합 단백질인, 결합 단백질.
  133. 제126항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    서열번호 55 및 서열번호 56,
    서열번호 57 및 서열번호 58,
    서열번호 59 및 서열번호 60,
    서열번호 61 및 서열번호 62,
    서열번호 63 및 서열번호 64,
    서열번호 65 및 서열번호 66,
    서열번호 67 및 서열번호 68,
    서열번호 69 및 서열번호 70,
    서열번호 71 및 서열번호 72, 또는
    서열번호 73 및 서열번호 74
    를 포함하는, 결합 단백질.
  134. 제126항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3
    을 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 결합 단백질.
  135. 제126항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42
    를 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 결합 단백질.
  136. 제126항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 h1A11.1-SL-Av(서열번호 73 및 서열번호 74 포함)를 포함하는, 결합 단백질.
  137. 제126항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역인, 결합 단백질.
  138. 적어도 하나의 아미노산,
    적어도 하나의 폴리사카라이드 및/또는 폴리소르베이트, 및
    약 0.1 내지 100mg/ml 농도의 결합 단백질을 포함하는, 약제학적 제형으로서,
    상기 약제학적 제형은, 약 5.0 내지 7.0의 pH로 존재하고,
    상기 결합 단백질은, VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 가변 도메인이고;
    C는 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 각각 독립적으로 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 결합 단백질은 DLL4 및 VEGF에 결합할 수 있는, 약제학적 제형.
  139. 제138항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산이 히스티딘이고 약 10 내지 20mM, 또는 약 15mM의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  140. 제138항 또는 제139항에 있어서, 상기 제형의 pH가 약 5.5 내지 6.0, 또는 약 5.5, 또는 약 6.0인, 약제학적 제형.
  141. 제138항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 폴리사카라이드가 슈크로스이고 약 0 내지 8.0% 중량/체적(w/v)의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  142. 제138항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리소르베이트가 폴리소르베이트 80이고 약 0 내지 0.06% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  143. 제138항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 아미노산이 아르기닌이고 약 0 내지 1.5% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  144. 제138항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 약 1 내지 100mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 2.5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 5 내지 7.5mg/ml, 또는 약 25 내지 100mg/ml, 또는 약 20 내지 60mg/ml, 또는 약 25 내지 50mg/ml, 또는 약 25mg/ml, 또는 약 50mg/ml, 또는 약 0.1 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 25mg/ml, 또는 약 1.0 내지 60mg/ml, 또는 0.5 내지 60mg/ml, 또는 약 0.1 내지 2.0mg/ml, 또는 약 0.5 내지 2.0mg/ml, 또는 약 1 내지 5mg/ml, 또는 약 1 내지 7.5mg/ml, 또는 약 1 내지 15mg/ml, 또는 약 0.5mg/ml, 또는 약 1.0mg/ml의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  145. 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제형이 동결건조된, 약제학적 제형.
  146. 제138항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제형이 수화되거나, 동결건조되고 재수화된, 약제학적 제형.
  147. 제146항에 있어서, 상기 약제학적 제형이, 덱스트로스 및/또는 염수를 포함하는 수화 용액 중에 존재하는, 약제학적 제형.
  148. 제147항에 있어서, 상기 덱스트로스가 약 5% w/v의 농도로 존재하고/하거나 염수가 약 0.9% w/v의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  149. 제138항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 제형이 약 15mM의 히스티딘, 약 0.03%(w/v)의 폴리소르베이트 80, 약 4%(w/v)의 슈크로스, 및 약 0.1 내지 25mg/ml의 결합 단백질, 또는 약 1 내지 15mg/ml의 결합 단백질을 포함하고, 약 6의 pH로 존재하고, 상기 결합 단백질은,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42
    를 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  150. 제138항 내지 제149항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하고
    서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3을 포함하는 가변 도메인들, 및
    (ii) VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하고
    서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 43 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 44 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 45 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 46 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 47 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 48 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 49 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 50 유래의 CDR 1 내지 3,
    서열번호 51 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 52 유래의 CDR 1 내지 3, 또는
    서열번호 53 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 54 유래의 CDR 1 내지 3을 포함하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  151. 제138항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하고
    서열번호 39 및/또는 서열번호 40을 포함하는 가변 도메인들, 및
    (ii) VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하고
    서열번호 41 내지 서열번호 54로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  152. 제138항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 결합 단백질이, 제1 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 중쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 중쇄 가변 도메인이고;
    C는 중쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    X2는 Fc 영역이고;
    n은 0 또는 1이다]을 포함하는 제1 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 결합 단백질이, 제2 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n[여기서,
    VD1은 제1 경쇄 가변 도메인이고;
    VD2는 제2 경쇄 가변 도메인이고;
    C는 경쇄 불변 도메인이고;
    X1은 링커이고;
    (X1)n에 대해 n은 0 또는 1이고;
    (X2)n에 대해 n은 0이다]을 포함하는 제2 폴리펩타이드 쇄를 포함하고,
    상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD1 도메인들은 제1 기능성 표적 결합 부위를 형성하고, 상기 제1 폴리펩타이드 쇄 및 상기 제2 폴리펩타이드 쇄 상의 상기 VD2 도메인들은 제2 기능성 표적 결합 부위를 형성하는,
    약제학적 제형.
  153. 제138항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42,
    서열번호 43 및 서열번호 44,
    서열번호 45 및 서열번호 46,
    서열번호 47 및 서열번호 48,
    서열번호 49 및 서열번호 50,
    서열번호 51 및 서열번호 52, 또는
    서열번호 53 및 서열번호 54
    를 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  154. 제138항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이, 4개의 기능성 표적 결합 부위들을 형성하는 2개의 제1 폴리펩타이드 쇄들 및 2개의 제2 폴리펩타이드 쇄들을 포함하는, 약제학적 제형.
  155. 제138항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시, 약 7.40 x 10-9M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF; 및/또는
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의한 측정시, 약 3.40 x 10-8M 또는 5.00 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4
    에 결합할 수 있는, 약제학적 제형.
  156. 제138항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 서열번호 1 내지 서열번호 38 중 어느 하나 또는 G/S 기반 서열을 포함하고/하거나,
    (b) 상기 결합 단백질 내의 링커 X1이 CH1 또는 CL이 아니고/아니거나,
    (c) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 변이체 서열 Fc 영역이고/이거나,
    (d) 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역이고/이거나,
    (e) 상기 결합 단백질의 Fc 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 또는 이들의 변이체 유래의 Fc 영역이고/이거나,
    (f) 상기 결합 단백질이, 결정화된 결합 단백질인,
    약제학적 제형.
  157. 제138항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    서열번호 55 및 서열번호 56,
    서열번호 57 및 서열번호 58,
    서열번호 59 및 서열번호 60,
    서열번호 61 및 서열번호 62,
    서열번호 63 및 서열번호 64,
    서열번호 65 및 서열번호 66,
    서열번호 67 및 서열번호 68,
    서열번호 69 및 서열번호 70,
    서열번호 71 및 서열번호 72, 또는
    서열번호 73 및 서열번호 74
    를 포함하는, 약제학적 제형.
  158. 제138항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 40 유래의 CDR 1 내지 3
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 유래의 CDR 1 내지 3 및 서열번호 42 유래의 CDR 1 내지 3
    을 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  159. 제138항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이,
    (i) 서열번호 39 및 서열번호 40
    을 포함하는, DLL4에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들, 및
    (ii) 서열번호 41 및 서열번호 42
    를 포함하는, VEGF에 대한 기능성 표적 결합 부위를 형성하는 가변 도메인들
    을 포함하는, 약제학적 제형.
  160. 제138항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 h1A11.1-SL-Av(서열번호 73 및 서열번호 74 포함)를 포함하는, 약제학적 제형.
  161. 제138항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 사람 IgG1 LALA 돌연변이체 유래의 Fc 영역인, 약제학적 제형.
  162. 제138항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 추가의 작용제를 추가로 포함하는, 약제학적 제형.
  163. 제162항에 있어서, 1개 이상의 추가의 작용제가, 면역부착 분자, 영상화제, 치료학적 작용제, 세포독성 작용제, 방사성 표지, 효소, 형광성 표지, 발광성 표지, 생물발광성 표지, 자기 표지, 비오틴, 항-대사물질, 알킬화제, 항생제, 성장 인자, 사이토카인, 항-혈관신생제, 항-유사분열제, 안트라사이클린, 독소, 또는 아폽토시스성 작용제, 화학치료요법제; 영상화제, 혈관신생 억제제, 키나제 억제제(KDR 및 TIE-2 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 공동-자극 분자 조절제(항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20을 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 부착 분자 차단제(항-LFA-1 항체, 항-E/L 셀렉틴 항체, 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 소분자 억제제를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편(항-IL-18, 항-TNF, 또는 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않음), 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 라파마이신, FK506, 검출가능한 표지 또는 리포터, TNF 길항제, 항류마티스제, 근육 이완제, 마약, 비-스테로이드 소염성 약물(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국부 마취제, 신경근 차단제, 항균제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화작용 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역화제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 약제, 항우울제, 항정신병약, 자극제, 천식 의약, 베타 효능제, 흡입형 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 항-고혈압제, 이뇨제, 아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제, 레닌 억제제, ACE 억제제, 안지오텐신 II 수용체 길항제, 혈관확장제, 알파-2 효능제, 클로니딘, 메틸도파, 하이드랄라진, 프라조신, 레세르핀, 목소니딘, 구안파신, 페린도프릴/인다파미드, 로펙시딘, 메티로신, 항응고제, 와파린, 헤파린, 저분자량 헤파린, 달테파린, 아르가트로반, 비발리루딘, 레피루딘, 및 덱스트로스 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 제형.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, 1개 이상의 추가의 작용제가, 13-시스-레티노산; 2-CdA; 2-클로로데옥시아데노신; 5-아자시티딘; 5-플루오로우라실; 항-VEGF mAb; 항-DLL4 mAb; 5-FU; 6-메르캅토퓨린; 6-MP; 6-TG; 6-티오구아닌; 아브락산; Accutane®; 악티노마이신-D; Adriamycin®; Adrucil®; Afinitor®; Agrylin®; Ala-Cort®; 알데스류킨; 알렘투주마브; ALIMTA; 알리트레티노인; Alkaban-AQ®; Alkeran®; 전(All)-트랜스레티노산; 알파 인터페론; 알트레타민; 아메토프테린; 아미포스틴; 아미노글루테티미드; 아나그렐리드; Anandron®; 아나스트로졸; 아라비노실사이토신; Ara-C Aranesp®; Aredia®; Arimidex®; Aromasin®; Arranon®; 3산화 비소; Arzerra™; 아스파라기나제; ATRA; Avastin®; 아자시티딘; BCG; BCNU; 벤다무스틴; 베바시주마브; 벡사로텐; BEXXAR®; 비칼루타미드; BiCNU; Blenoxane®; 블레오마이신; 보르테조밉; 부설판; Busulfex®; C225; 칼슘 류코보린; Campath®; Camptosar®; 캄프토테신-11; 카페시타빈; Carac™; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카르무스틴 웨이퍼; Casodex®; CC-5013; CCI-779; CCNU; CDDP; CeeNU; Cerubidine®; 세툭시마브; 클로람부실; 시스플라틴; 시트로보룸 인자; 클라드리빈; 코르티손; Cosmegen®; CPT-11; 사이클로포스파미드; Cytadren®; 시타라빈; 리포솜성 시타라빈; Cytosar-U®; Cytoxan®; 다카르바진; 다코젠; 닥티노마이신; 다르베포에틴 알파; 다사티니브; 다우노마이신; 다우노루비신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 리포솜성 다우노루비신; DaunoXome®; 데카드론; 데시타빈; Delta-Cortef®; Deltasone®; 데니류킨; 디프티톡스; DepoCyt™; 덱사메타손; 덱사메타손 아세테이트; 덱사메타손 인산 나트륨; 덱사손; 덱스라족산; DHAD; DIC; 디오덱스; 도세탁셀; Doxil®; 독소루비신; 리포솜성 독소루비신; Droxia™; DTIC; DTIC-Dome®; Duralone®; Efudex®; Eligard™; Ellence™; Eloxatin™; Elspar®; Emcyt®; 에날라프릴; 에피루비신; 에포에틴 알파; 에르비툭스; 에를로티니브; 에르위니아 L-아스파라기나제; 에스트라무스틴; 에티올; Etopophos®; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; Eulexin®; 에베롤리무스; Evista®; 엑세메스탄; Fareston®; Faslodex®; Femara®; 필그라스팀; 플록스우리딘; Fludara®; 플루다라빈; Fluoroplex®; 플루오로우라실; 플루오로우라실(크림); 플루옥시메스테론; 플루타미드; 폴린산; FUDR®; 풀베스트란트; 게피티니브; 겜시타빈; 겜투주마브 오조가마이신; 겜자르; Gleevec™; Gliadel® 웨이퍼; GM-CSF; 고세렐린; 과립구-콜로니 자극 인자(G-CSF); 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(G-MCSF); Halotestin®; Herceptin®; 헥사드롤; Hexalen®; 헥사메틸멜라민; HMM; Hycamtin®; Hydrea®; Hydrocort Acetate®; 하이드로코르티손; 하이드로코르티손 인산 나트륨; 하이드로코르티손 석신산 나트륨; 하이드로코르톤 포스페이트; 하이드록시우레아; 이브리투모마브; 이브리투모마브 티욱세탄; Idamycin®; Idarubicin Ifex®; 인터페론-알파; 인터페론-알파-2b(PEG 접합체); 이포스파미드; 인터류킨-11(IL-11); 인터류킨-2(IL-2); 이마티니브 메실레이트; 이미다졸 카르복사미드; Intron A®; Iressa®; 이리노테칸; 이소트레티노인; 익사베필론; Ixempra™; KADCYCLA®; 키드롤라제 (t) Lanacort®; 라파티니브; L-아스파라기나제; LCR; 레날리도미드; 레트로졸; 류코보린; 류케란; Leukine™; 류프롤리드; 류로크리스틴; Leustatin™; 리포솜성 Ara-C; Liquid Pred®; 로무스틴; L-PAM; L-사르콜리신; Lupron®; Lupron Depot®; Matulane®; 맥시덱스; 메클로레타민; 메클로레타민 하이드로클로라이드; Medralone®; Medrol®; Megace®; 메게스트롤; 메게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메르캅토퓨린; 메스나; Mesnex™; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메틸프레드니솔론; Meticorten®; 미토마이신; 미토마이신-C; 미톡산트론 M-Prednisol®; MTC; MTX; Mustargen®; 무스틴; Mutamycin®; Myleran®; Mylocel™; Mylotarg®; Navelbine®; 넬라라빈; Neosar®; Neulasta™; Neumega®; Neupogen®; Nexavar®; 니페디핀; Nilandron®; 닐로티니브; 닐루타미드; Nipent®; 질소 머스타드 Novaldex®; Novantrone®; 엔플레이트; 옥트레오티드; 옥트레오티드 아세테이트; 오파투무마브; Oncospar®; Oncovin®; Ontak®; Onxal™; 오프렐베킨; Orapred®; Orasone®; 옥살리플라틴; 파클리탁셀; 단백질-결합된 파클리탁셀; 파미드로네이트; 파니투무마브; Panretin®; Paraplatin®; 파조파니브; Pediapred®; PEG 인터페론; 페가스파르가제; 페그필그라스팀; PEG-INTRON™; PEG-L-아스파라기나제; PEMETREXED; 펜토스타틴; 페닐알라닌 머스타드; Platinol®; Platinol-AQ®; 프레드니솔론; 프레드니손; Prelone®; 프로카르바진; PROCRIT®; Proleukin®; 카르무스틴 임플란트를 갖는 프로리페프로스판 20; Purinethol®; 랄록시펜; Revlimid®; Rheumatrex®; Rituxan®; 리툭시마브; Roferon-A®; 로미플로스팀; Rubex®; 루비도마이신 하이드로클로라이드; Sandostatin®; Sandostatin LAR®; 사르그라모스팀; Solu-Cortef®; Solu-Medrol®; 소라페니브; SPRYCEL™; STI-571; 스트렙토조신; SU11248; 수니티니브; Sutent®; Tamoxifen Tarceva®; Targretin®; Tasigna®; Taxol®; Taxotere®; Temodar®; 테모졸로미드 템시롤리무스; 테니포시드; TESPA; 탈리도미드; Thalomid®; TheraCys®; 티오구아닌; Thioguanine Tabloid®; 티오포스포아미드; Thioplex®; 티오테파; TICE®; Toposar®; 토포테칸; 토레미펜; Torisel®; 토시투모마브; 트라스투주마브; Treanda®; 트레티노인; Trexall™; Trisenox®; TSPA; TYKERB®; VCR; Vectibix™; Velban®; Velcade®; VePesid®; Vesanoid®; Viadur™; Vidaza®; 빈블라스틴; 빈블라스틴 설페이트; Vincasar Pfs®; 빈크리스틴; 비노렐빈; 비노렐빈 타르트레이트; VLB; VM-26; 보리노스태트; 보트리엔트; VP-16; Vumon®; Xeloda®; Zanosar®; Zevalin™; Zinecard®; Zoladex®; 졸레드론산; 졸린자; Zometa®; 이리노테칸; 류코보린; 5-FU; 테모졸로미드; 겜시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브; 및 페르투주마브 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 제형.
  165. 제162항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1개 이상의 추가의 작용제가, 이리노테칸, 류코보린, 폴피리, 5-FU; 에날라프릴; 니페디핀; 클로니딘; 테모졸로미드; 겜시타빈; 카페시타빈; 파클리탁셀; 레고라페니브; 및 페르투주마브 중 하나 이상을 포함하는, 약제학적 제형.
  166. 제136항 또는 제160항에 있어서,
    상기 결합 단백질은,
    (a) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 7.0 x 10-10M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 VEGF에 결합하고/하거나, VEGFR1 경쟁 ELISA로 측정시, 약 3.8nM 이하의 IC50으로 VEGF 활성을 차단할 수 있고/있거나,
    (b) 표면 플라스몬 공명에 의해 측정시, 약 1.0 x 10-8M 이하의 해리 상수(KD)를 갖는 DLL4에 결합하고/하거나, Notch 경쟁 ELISA로 측정시, 약 1.09nM 이하의 IC50으로 DLL4 활성을 차단할 수 있는, 결합 단백질 또는 약제학적 제형.
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