KR20010034554A - 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명에서 본원 발명자들은 T 세포, B 세포 및/또는 단핵구와 같은 특정 세포 상에 발현되는 분자 CD147을 다양한 질병 치료에 이용할 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 본원 발명자들은 CD147에 결합하고, 예컨대, 보체의 결합을 통해 그러한 세포의 사멸을 초래하는 항체들이 질병 치료에 효과적임을 입증하였다. 그러한 치료가 효과적인 것으로 보이는 질병으로는 대숙주성 이식편병(GVHD), 기관 이식 거부 질병(예컨대, 신장 이식, 눈 이식 및 기타 이식 거부 질병), 암(예컨대, 혈암(즉, 백혈병 및 림프종), 췌장암 및 기타), 자동 면역 질병, 염증성 질병 및 기타가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.

Description

치료제로서의 ＣＤ147 결합 분자{CD147 BINDING MOLECULES AS THERAPEUTICS}

1982 년경, UCLA의 한 단체는 급성 백혈병 세포를 사용한 면역화를 통해 마우스에게서 사람 백혈병 세포에 대한 세포독성을 지닌 항체의 생성후, 하이브리도마를 형성하고, 면역화된 세포 및 정상의 림프구에 대항하는 항체의 독성을 분석하는 미소세포독성 분석에서 하이브리도마를 스크리닝한 것을 보고하였다. 본 명세서에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,330,896호 및 제5,643,740호를 참조한다. 종양 세포에 대해서는 세포독성을 지니나, 정상의 세포에 대해서는 비독성인(활성 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구가 사멸된 것은 제외함) 하나의 하이브리도마를 회수하였다. 이러한 하이브리도마를 클로닝하고, 분리한 후, HB 8214로서 ATCC에 기탁하였다. 이러한 하이브리도마에 의해 형질발현된 단일클론 항체를 CBL1으로 표시하였으며, 이는 쥐 IgM이다. UCLA 단체는 추가로 항체가, 활성 세포 및 불활성 세포 모두의 세포질내에 존재하는 것으로 나타난 항원성 결정인자와 반응성을 갖는다는 것을 입증하였다. 그러나, 항원성 결정인자는 활성 T 세포, 활성 B 세포, 휴지 단핵구 및 활성 단핵구를 비롯한 특정의 순환 중인 세포만의 세포외막에 존재하는 것으로 나타났으나, 기타의 순환중인 비활성화 세포 상에는 세포외적으로 존재하지 않는다.

또한, 이 단체는 관찰에 대해 타당한 항원의 분리를 시도하였었다. 분자로서 존재하는 CBL-1 항체에 의해 인식되는 항원성 결정인자는

(i) 종양 세포 및 활성화된 림프구의 세포질 내에 그리고 세포막상에 존재하며,

(ii) 무자극 정상 말초 혈액 림프구의 세포질내에는 존재하나 이들 세포가 항원에 의해 또는 마이토젠에 의해 자극될 경우, 이러한 항원은 세포막상에 존재하고,

(iii) 마이토젠에 의해 시험관내에서 활성화된 림프구상에 존재하며,

(iv) ATCC 번호 HB8214의 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 CBL1 단일클론 항체에 결합 가능하고,

(v) 종양 세포 및 활성 림프구에 의해 생성된 오토크린 성장 인자로서 작용하며,

(vi) 종양 세포의 표면막에 결합하고, 이들 세포 및 림프계 세포의 성장을 자극하고,

(vii) 암 세포를 성장시킨 배지 및, 활성화된 림프구가 존재하는 질환 및 암을 가진 환자의 혈청 중에 존재하며,

(viii) 분자량이 약 15,000 달톤인 것을 특징으로 한다.

CBL1 항체가 결합하는 항원의 식별은 UCLA 단체의 논문 및 특허 문헌과 관련하여 어떠한 개선도 이루지 못하였다. 그럼에도 불구하고, CBL1 항체는 대숙주성 이식편 질환 및 신장 이식편 거부 반응을 비롯한 각종 질환의 치료에 있어서 환자에게 유용하다. 참고 문헌[Heslop et al. The Lancet 346:805-806 (1995)(GVHD); Benamin Clinical Trial Monitor Abstract No. 13385 (1995); Takahashi et al. The Lancet 2:1155-1158 (1983)(신장 동종이식편 거부 반응); Takahashi Transplantation Proceedings 17:10-12 (1985)(신장 동종이식편 거부 반응); Oei et al. Transplantation Proceedings 17:13-16 (1985)(신장 동종이식편 거부 반응)]. 이와 같은 연구와 관련하여, 안전성이라든지 또는 교차반응성을 입증하지는 못하였다. 하기의 논문은 CBL1 항체의 추가의 특성화와 관련되어 있다. 참고 문헌[Billing et al. Hybridoma 1:303-311 (1982); Billing et al. Clin. Exp. Immunol. 49:142-148 (1982); Chatterjee et al. Hybridoma 1:369-377 (1982); Billing R. 및 Chatterjee S. Transplantation Proceedings 15:649-650 (1983); Kinukawa T. 및 Terasaki P.I. Transplantation Proceedings 1:993-998 (1985); Billing, Monoclonal Antibodies: Diagnostic and Therapeutic Use in Tumor and Transplantation Ch. 9. 85-90(Chatterjee ed., PSG Publ. Co., Inc. (1985)); Billing et al. Monoclonal Antibodies: Diagnostic and Therapeutic Use in Tumor 및 Transplantation Ch. 2, 11-19(Chatterjee ed., PSG Publ. Co., Inc. (1985)].

사람의 대숙주성 이식편 질환(GVHD)은 최초로 참고 문헌[Mathe et al. "Nouveaux essais de greffe de moelle osseuse homologue apres irradiation totale chez des enfants atteints de leucemie aigue en remission. Le probleme du syndrome secondaire chez l'homme" Rev Fr Etud Clin Biol 15:115-161 (1960)]에 기재되어 있다. 본질적으로 GVHD는 공여체 세포와 숙주 조직 간의 면역 반응의 임상적 증상이다. 임상적 증후는 동종이계 골수 이식 2 주내에 일반적으로 나타나는 피부 발진, 위장 증후 및 간기능 장애로 구성된다. 면역병인론은 면역적격성 공여체 세포, 면역억제된 숙주(수용체); 및 공여체와 수용체 사이에 존재하는 알로항원 차이에 의한 숙주 항원의 인지를 요구한다. 면역적격성 공여체 세포는 성숙한 T 세포(Ferrara JL 및 Deeg HJ "Graft versus Host Disease" NEJM 324:667 (1991))이고, 질환의 임상적 경중도는 환자에게 감염된 T 세포의 수와 상관 관계를 갖는다(Ferrara JL 및 Deeg HJ "Graft versus Host Disease" NEJM 324:667 (1991)).

급성 GVHD의 임상적 징후는 피부염, 황달 및 위장 침습 등이 있다. 이러한 징후는 단독으로 또는 임의의 조합으로 발생할 수가 있으며, 그 강도는 중간 정도로부터 생명을 위협하는 정도가 될 수 있다. 피부 침습은 가장 흔한 징후이다. 피부 침습의 가장 심각한 증상은 3 도 화상과 유사한 수포성 병변 등이 있다. 황달은 기타의 간 효소를 사용하거나 또는 사용하지 않고도 증가된 빌리루빈으로부터 발생한다. 위장 침습은 장액성 설사 등이 있다. 이러한 설사는 다량의 혈액이 섞일 수도 있으며, 이는 감염에 대한 침입의 발단 뿐 아니라, 생명을 위협하는 체액 및 전해질 손실을 야기하게 된다. 기타의 환자는 심각한 장폐쇄증을 경험할 수도 있을 것이다. 상부 GI 침습은 그리 흔하지 않다. 이러한 것은 식욕감퇴, 소화불량, 음식 내성 및 메스꺼움/구토로 나타난다. GI 침습을 갖는 대부분의 환자는 전비경구적 영양(TPN) 지지를 요한다.

예방 및 가능한 치료에 대한 전략이 존재하여야만 하며, 때에 따라서는 공여체 골수로부터의 T 세포 제거 또는 이의 활성화 방지와 직결되어야 한다. 그러나, T 결핍된 골수의 경우 일반적으로는 치명적인 이식편 기능부전의 비율이 높게 된다. T 결핍된 골수와 관련된 추가의 문제는 백혈병의 1차 진단을 받은 골수 수용체에서의 재발율이 증가된다는 점이다. 대백혈병 이식편 효과는 공여체의 T 세포에 의해 매개되며, 이는 동종이계 골수 이식에서의 T 결핍된 골수를 사용하는 것을 완화시킨다.

임상적으로 유의적인 급성 GVHD(등급 II-IV)은 HLA 유전자형으로 동일한 혈육으로부터의 골수를 수용한 환자의 최고 50%에서 발생한다. 관련성이 없는 공여체를 한 조로 사용할 경우에는 발생 빈도가 일부 연구에서는 80%까지 증가한다. HLA 부적합성이 클수록 GVHD의 발생 빈도와 경중도가 더 커지게 된다.

급성 GVHD의 1차적인 치료는 예방이다. 예방 섭생은 면역억제 요법 및 공여체 세포의 T 세포 결핍의 사용이 있다. "표준" 최선의 요법은 글루코코르티코이드로 구성된다. 환자의 약 20∼25%는 완전 반응을 나타내며, 응답하지 않은 환자는 결과가 불량하다. 스테로이드를 사용한 치료를 지속적으로 실시한 환자는 스테로이드 사용의 모든 부작용에 걸리기가 쉬워진다. 이러한 부작용의 예로는 감염, GI 출혈, 변형된 대사 부위, 고혈압 등이 있다.

글루코코르티코이드, 시클로스포린, 메토트렉세이트, 시클로포스파미드는 모두 GVHD의 치료 뿐 아니라, 예방에도 사용되어 왔다. 항-흉선세포 글로불린(ATG)이 수년간 사용되어 왔었다. 이들 제제 모두는 잠재적으로 독성을 지닌다. 항-인터류킨-2와 같은 단일클론 항체 및 항-CD5-리신과 같은 면역독소를 사용하여 왔으며, 이는 제한된 성공을 이루어 왔다. 인간화된 항-TAC는 GVHD의 예방에 사용되었으나, 치료 프로토콜에서는 실패하였다.

CBL1이 GVHD의 치료에 유효하다는 징후로 인해서, 본 출원인은 CBL1 항체에 대한 추가의 조사에 착수하였다. 이와 같은 추가의 연구와 관련하여, 이제 본 출원인은 사실상 CBL1 항체가, 예컨대 T 세포, B 세포와 같은 특정의 세포 및/또는 단핵구를 보체 의존성 세포독성(사멸)의 과정을 통해 형질발현되는 바와 같은 CD147 항원에 결합되며, 이와 관련하여 유효하다는 것을 입증하고자 한다.

CD147은 각종 조직 중의 다수의 각종 세포상에서 형질발현되는 면역글로불린(Ig) 상과의 구성원이다. 이는 본래 사람 Basigin(기본적인 면역글로불린 상과의 약어)으로 불리우며, 이는 약 1991 년경에 최초로 클로닝되었다(Miyauchi et a1. J Biochem (도쿄) 110:770-774 (1991); Kanekura et al. Cell Struct Funct 16:23-30 (1991), Miyauchi et al. J Biochem (도쿄) 110:770-774 (1991)). 분자는 약 269개의 아미노산으로 구성되며(Miyauchi et al. J Biochem (도쿄) 110:770-774 (1991)), 글리코실 제거된 분자량 예상값이 약 27 KD이고, 완전 글리코실화된 분자량이 43-66 KD 사이인, 분자량의 약 40%가 탄수화물로 이루어진 당단백질이다(Kanekura et al. Cell Struct Funct 16:23-30 (1991)]. Basigin 유전자는 크로모좀 19p13.3으로 지도가 형성된다[참고 문헌: Kaname et al. Cytogenet Cell Genet 64:195-197 (1993)).

분자는 하기의 것을 비롯한 기타의 분자 구성원과의 동종성을 갖거나 또는 동일성을 갖는 것으로 식별될 수 있다.

마우스 Basigin(Miyauchi et al. J Biochem (도쿄) 107:316-323 (1990); Joseph et al. Adv Exp Med Biol 342:389-391 (1993); Kaname et a1. J Biochem (도쿄) 118:717-724 (1995));

토끼 Basigin(Schuster et al. Biochim Biophys Acta 1311:13-19 (1996));

마우스 gp42(Mtruda et al. Gene 85:445-451 (1989), Imboden et a1. J Immuno1 143:3100-3103 (1989); Cheng et al. Biochim Biophys Acta 1217:307-311(1994));

닭 HT7 또는 5A11(Albrecht et al. Brain Res 535:49-61 (1990); Seulberger et al. EMBO J 9:2151-2158 (1990); Miyauchi et al J Biochem (도쿄) 110:770-774 (1991); Janzer et al. Adv Exp Med Biol 331:217-221 (1993); Lobrinus et aI. Brain Res Dev Brain Res 70:207-211 (1992); Seulberger et al Neurosci Lett 140:93-97 (1992); Fadoo1 JM ＆ Linser PJ J Neurochem 60:1354-I36 (1993); FadoolJM ＆ Linser PJ Dev Dyn 196:252-262 (1993); Unger et al. Adv Exp Med Biol 331:211-215 (1993); Rizzolo LJ ＆ Zhou S J Cell Sci 108:3623-3633 (1995), Ikeda et al. Neurosci Lett 209:149-152 (1996); Fadool JNl ＆ Linser PJ Biochem Biophys Res Commun 229:280-286 (1996));

뉴로텔린(SchIosshauer B ＆ Herzog KH J Cell Biol 110:1261-1274 (1990); Schlosshauer B Development 113:129-140 (1991); Schlosshauer B BioEssays 15:341-346 (1993); Schlosshauer et al. Eur J Cell Biol 68:159-166 (1995));

M6 백혈구 활성화 항원(Felzmann et al. J Clin lmmunol 11:205-212 (1991); Gadd et al. Rheumatol Int 12:153-157 (1992); Kasinreck et al. J Immunol 149:847-854 (1992));

OX-47(Fossum et al. Eur J Immuno1 21:671-679 (1991), Fossum et al. Eur J Immunol 21:671-679 (1991); Cassella et al. J Anat 189:407-415 (1996));

Mo3(Mizukami et al. J Immuno1 147:1331-1337 (1991));

CE9(Petruszak et aI. J Cel1 Biol 114:917-927 (1991); Scott LJ ＆ Hubbard AL J Biol Chem 267:6099-6106 (1992); Nehme et al. J Cell Biol 120:687-694 (1993); Cesario MM ＆ Bartles JR J Cel1 Sci 107:561-570 (1994); Cesario et al. Dev Biol 169:473-486 (1995); Nehme et al. Biochem J 310:693-698 (1995));

EMMPRIN(Biswas et al. Cancer Res 55:434 (1995); DeCastro et al. J Invest Dermato1 106: 1260-1265 (1996));

RET-PE2(Finnemann et a1. Invest Ophthalmol Vis Sci 38:2366-2374 (I997));

Ok^a혈액형 항원(Spring et al. Eur J Immuno1 27:891-897 (1997)); 및

1W5(Seulberger et al. EMBO J 9:2151-2158 (1990)).

사실상, (Seulberger et al. Neurosci Lett 140:93-97 (1992))는 H7, 뉴로텔린, Basigin, gp42 및 OX-47은 각각 혈액-뇌 장벽 내피, 상피성 조직 장벽 및 뉴런 상에 존재하는 발생상 조절된 면역글로불린형 표면 당단백질인 한 분자에 대한 명칭이다. 또한, 참고 문헌[Kasinrerk et aI. J Immunol 149:847-854 (1992)]에는 사람 백혈구 활성화 항원 M6이 상과의 구성원이고, 래트 OX47, 마우스 Basigin 및 닭 HT7 항원의 종 유사성을 갖는 것으로 입증되었다. EMMPRIN은 M6 항원 및 사람의 Basigin과 동일한 것으로 입증되었다(Biswas et al. Cancer Res 55:434 (1995)). 또한, (Guo et al. "Characteiation ofthe gene for human EMMPRIN, a tumor cell surface inducer of matrix metalloproteinases" Gene 220:99-108 (1998))에는 사람의 EMNlPRIN에 대한 유전자의 추가의 특성화가 수행되어 있다.

관련 분자와의 상동성을 통해, CD147은 다수의 생리적 처리, 질환 및/또는 증상에서의 역할을 하는 것으로 나타나거나 또는 추정된다. 예를 들면, 분자에 대해 예상된 초기 역할은 혈액-뇌 장벽에서의 활성이다. 이러한 관계는 최초로 닭 HT7 항원과 관련하여 입증되었다(Risau et al. EMBO J 5:3179-3183 (1986); Albrecht et al. Brain Res 535:49-61 (1990); Seulberger et al. EMBO J 9:2151-2158 (1990); Janzer et al. Adv Exp Med Biol 331:217-221 (1993); Lobrinus et al. Brain Res Dev 70:207-211 (1992); Unger et al. Adv Exp Med Biol 331:2l1-215 (1993)). 뉴로텔린과 관련하여서도 유사한 관계가 관찰된다(Schlosshauer B ＆ Herzog KH J Cell Biol 110:1261-1274 (1990); Schlosshauer B Development 113:129-140 (1991); Schlosshauer B BioEssays 15:341-346 (1993); Schlosshauer et al. Eur J Cell Biol 68:159-166 (1995)). 이러한 분자는 백혈구 활성화된 킬러(LAK) 세포 활성화(Imboden et al. J Immunol 143:3 100-3 103 (1989));, T 세포 활성화(Paterson et al. Mol Immunol 24:1281-1290 (1987); Kirsch et al. Tissue Antigens 50:147-152 (1997)), 백혈구 활성화(Fossum et al. Eur J Immunol 21:671-679 (1991); Fossum et al. Eur J Immunol 21:671-679 (1991)), 단핵 식세포 활성화(Mizukami et al. J lmmunol 147:133l-1337(1991))와 같은 각종 세포의 발달 및 활성화에 관여하는 것으로 예상된다. 기타의 조절, 시그날 및 인지 작용 또한 예를 들면 MHC 작용(Miyauchi et al. J Biochem (도쿄) 107:316-323 (1990)), 시그날 변환 및 막 수송(Kasimerk et al. J Immunol 149:847-854 (1992); Berditchevski et al. J Biol Chem 272:29174-29180 (1997)), 세포성 인지(Fadool JM ＆ Linser PJ Dev Dyn 196:252-262 (1993); Kaname et al. Cytogenet Cell Genet 64:195-197 (1993)), 세포 유착(Miyauchi et a1. J Biochem (도쿄) 110:770-774 (1991), Seulberger et al. Neurosci Lett 140:93-97(1992); Joseph et a1. Adv Exp Med Biol 342:389-391 (1993); Sudou et a1. J Biochem (도쿄) 117:271-275 (1995)), 세포간 자극 및 기질 금속단백분해효소(Biswas et al. Cancer Res 55:434 (1995)), 조직 리모델링(Guo et al. J Biol Chem 272:24-27 (1997)), 대사 및 정자 발달 및 성숙화(Petruszak et al. J Cell Biol 114:917-927 (1991); Nehme et a1. J Cell Biol 120:687-694 (1993); Cesario MM ＆ Bartles JR J Cell Sci 107:561-570 (1994); Cesario et al. Dev Biol 169:473-486 (1995))로 예상할 수 있다. 또한, CD147은 망막 발달 및 질환에서의 역할을 하며, 참고 문헌(Marmorstein et al. "Morphogenesis of the retina1 pigment epithelium: toward underst및ing retinal degenerative diseases" Ann N Y Acad Sci 857:1-12 (1998))을 참고한다( N-CAM 및 EMMPRIN은 광수용체 생존에 필수적인 기타의 RPE 작용에서의 잠재적으로 중요한 분자임을 암시함). 또한, 참고 문헌[Marmorstein et al. "Apical polarity of N-CAM 및 EMMPRIN in retinalpigment epithelium resulting from suppression of basolateral signal recognition" J Cell Biol 142:697-710 (1998)].

또한, 분자는 류마토이드 및 반응성 관절염 모두에서의 잠재적인 관련성에 대해 조사하였다(Felzmann et al. J Clin Immunol 11:205-212 (1991); Gadd et al. Rheumato1 Int 12.153-157 (l992)) 및 망막 질환(Schuster et al. Biochim Biophys Acta 1311 : 13-19 (1996)). 더욱이, 분자와 암 사이의 뚜렷한 관계가 있는 것으로 나타났다(Biswas Biochem Biophys Res Commun l09:1026 (1982); Miyauchi et al. J Biochem (도쿄) 110:770-774(1991); Biswas et al. Cancer Res 55:434 (1995); Guo et al. J Biol Chem 272:24-27 (I997); Guo et aI. J Biol Chem 272:24-27 (1997)). 또한, 참고 문헌[Lim et al "Tumo-derived EMMPRIN(extracellular matrix metalloproteinase inducer) stimulates MAPK p38" FEBS Lett 441:88-92 (1998), van den Oord et al. "Expression of gelatinase B 및 the extracellu1ar matrix metalloproteinase inducer EMMPRIN in benign 및 malignant pigment cell lesions of the skin" Am J Pathol 151:665-70 (1997); Polette et al. "Tumor collagenase stimulatory factor(TCSF) expression 및 localization in human lung and breast cancers" J Histochem Cytochem 45:703-9 (1997)].

Basigin 유전자를 녹아웃시키는 마우스 모델을 검사하였다(Igakura et al. Biochem Biophys Res Commun 224:33-36 (1996)). 이러한 연구에 의하면, 혈액-뇌 장벽에서 분자가 반드시 활성을 띠지는 않는 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 연구에 의하면, 자극적인 냄새에 대한 비정상적인 반응 뿐 아니라 림프구와 관련한 상호 반응이 개선된 것으로 나타났다. 차후의 연구에 의하면, 이러한 모델에서의 감각 및 기억 기능이 비정상적인 것으로 나타났다(Naruhashi et al. Biochem Blophys Res Commun 236:733-737 (1997)).

CD147의 형질발현과 관련하여 참고 문헌[Woodhead et al "From sentinel to messenger: an extended phenotypic analysis of the monocyte to dendritic cell transition" Immunology 94:552-9 (1998)]에는 CD147이 수상 세포상에서 형질발현되는 것으로 입증되어 있으며, 참고 문헌[Ghannadan et al. "Phenotypic chaacterization of human skin mastcel1s by combined staining with to1uidine b1ue 및 CD antibodies" J Invest Dermatol 111:689-95 (1998)]에는 군락을 이룬 CD 항원(CD147 포함)이 포피 비만 세포를 검출가능하고, 참고 문헌[Mutin et al. "Immunologic phenotype of cultured endothelial cel1s quantitative analysis of cell surfiace mo1ecules" Tissue Antigens 50:449-58 (1997)]에는 배양된 내피 세포(HUVEC)상에서의 세포 표면 분자의 정량적 분석에 대해 논의되어 있다.

전술한 바와 같이, CDl47은 질환의 치료에 대해 잠정적으로 유용한 표적으로서 관련되어 있다. 그러나, 동시에 CD147는 많은 질환 중에서도 광범위하게 분포되어 있는 많은 세포 중에서 그리고 세포 상에서 형질발현된다. 예를 들면, OK^a혈액형 항원은 실질적으로 모든 세포 상에서 형질발현된다(Williams et al. Immunogenetics 27:322-329 (1988)). OX-47은 대부분의 미숙한 세포, 내피 세포 및 여기 가능한 막을 갖는 세포 상에 존재하는 것으로 개시되어 있다(Fossum et al. Eur J Immunol 21:671-679 (1991)). 유사하게, Basigin은 내피 세포 내에서 형질발현될 뿐 아니라, 비교적 고농도로 그리고, 테스트 중에서 소량으로 비장, 소장, 신장 및 간을 비롯한 각종의 조직 중에 발견되는 것으로 입증되었다(Kanekura et al. Cell Struct Funct 16:23-30 (1991)). CE9은 래트의 간세포상에 광범위하게 형질발현된다(Scott U ＆ Hubbard AL J Biol Chem 267:6099-6106 (1992)). 참고 문헌[Seulberger et al. Neuroscl Lett 140:93-97(1992)]에는 HT7 분자(뉴로텔린, Basigin, gp42 및 OX-47)가 혈액-뇌 장벽, 클로로이드 총(혈액-CNS 유체 장벽), 망막 내피(혈액-안구 장벽), 뉴런, 신장 세관, 특정의 내피 및 상피상에서 형질발현되는 것으로 입증되었다. CE9 항원(0X-47 항원에 대한 동일성을 갖는 것으로 입증됨)을 어느 정도로 모든 래트 조직 내에서 형질발현시켰다(Nehme et a1. Biochem J 310:693-698 (1995)). 세포가 광범위하게 분포되어 있기 때문에, 억제되거나 또는 사멸된 세포가 이를 발현시키는 임의의 요법의 안전성과 관련된 수많은 중요점들이 존재한다.

분자의 교호 스플라이싱 또는 특이형 글리코실화 반응으로부터 발생한 CD 147의 각종 형태가 될 수 있다는 증가가 존재한다(Kanekura et a1. Cel1 Struct Funct 16:23-30 (1991) (Basigin); Schlosshauer B Development l13:l29-140 (1991) (Neurothelin); Fadool JM ＆ Linser PJ J Neurochem 60:1354-136 (1993) (5Al1/Fff7); Nehme et al. J Cell Biol 120:687-694 (1993)(CE9); DeCastro et al. J Invest Dermatol 106:1260-1265 (1996)(EMMPRIN); Spring et al. Eur Immuno127:891-897 (1997) (Ok^a)).

본 발명에 의하면, T 세포, B 세포 및/또는 단핵구와 같은 특정 세포상에서 형질발현되는 분자 CD147이 각종 질병의 치료에 대한 표적으로서 유용할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히, 본 출원인은 CD147에 결합하고, 예를 들면 보체의 결합을 통해 이들 세포를 사멸시키게 되는 항체가 질환의 치료에 있어서 유효하다는 사실을 입증하였다. 이러한 치료가 유효한 것으로 나타난 질환의 비제한적인 예로는 대숙주성 이식편 질환(GVHD), 장기 이식편 거부 질환(비제한적인 예로서, 신장 이식편, 안구 이식 거부 질환 등), 암[비제한적인 예로는 혈암(즉 백혈병 및 림프종), 및 췌장암 등], 자가면역 질환(비제한적인 예로는 낭창), 면역 질환(비제한적인 예로는 관절염) 등이 있다.

도 1은 CEM 세포막 추출물 용해물에 대해 특정 항체가 결합하는 것을 나타내는 12% SDS-PAGE/웨스턴 블롯을 도시한다. 레인 A: 토끼-항-마우스-hn-RNP-K 단백질 항체; 레인 B: ABX-CBL 항체; 레인 C. 2.6.l 항체 (본 명세서에서 cem2.6 및 ABX-Rb2로도 언급함); 레인 D: 항-CD147 항체(파밍겐); 및 레인 B: 항-CD147 항체(RDI). 시료: 5 ㎕ CEM 세포 추출물.

도 2A-2B는 ATCC 기탁 번호 HB 8214인 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 CBL1 항체로부터 얻은 성분의 분석이다. 이러한 데이터에 의하면, HB 8214 하이브리도마에 의해 생성된 CBL1 IgM 항체가 보체의 존재하에 MLR을 억제하는 활성 성분이 된다는 것을 입증하였다.

도 3은 CBL1과 비교한 각종 CBL1으로부터의 항체를 사용한 MLR의 억제를 비교한 그래프이다.

도 4는 토끼 및 사람의 보체의 존재하에 ABX-CBL을 사용한 MLR 억제를 비교하는 그래프이다.

도 5는 MLR 분석을 억제하는데 있어서의 ABX-CBL 항체 및 2.6.l 항체(또한, 이를 이하에서 cem 2.6으로 칭함)의 활성을 비교하는 그래프이다. 이러한 데이타에 의하면, 2.6.1 항체는 유효한 억제제가 아님을 입증한다.

도 6A-6B: CD 147 및 CD25의 동시형질발현을 예시하는 활성 림프구의 FACS 분석.

도 7A-7D: 자극하의 CD25의 선택적 업레귤레이션 및, ABX-CBL 및 보체를 사용한 처치후 동일한 세포의 특이성 결여를 나타내는 PBMC의 FACS 분석. 도 7A: 미처치된 PBMC. 도 7B 및 7D: ConA로 자국된 PBMC. 도 7C: ConA로 자극시킨 후, ABX-CBL 및 보체로 처치한 PBMC.

도 8A-8D는 자극하의 CD25의 선택적 업레귤레이션 및, ABX-CBL 및 보체를 사용한 처치후 동일한 세포의 특이성 결여를 나타내는 PBMC의 FACS 분석을 비교한다. 도 8A: PBMC+ConA; 도 8B: CBL-l 단독/배지; 도 8C: 보체 단독 /배지; 도 8D: CBL1+보체/배지. Ml: CD25 고(고갈됨); M2: CD25 저(미고갈); M3:CD25 제로(미고갈).

도 9A-9D는 자극 시의 CD25 및 CD147의 선택적 업레귤레이션을 도시하는 PBMC의 일련의 FACS 분석을 도시한다.

도 10A-10F는 ABX-CBL 및 보체를 사용한 처치 전후 활성화된 T 세포(도 10A-10B), 활성화된 단핵세포(도 10C-10D) 및 활성화된 B 세포(도 10E-10F)의 비교를 도시하며, ABX-CBL 및보체를 사용한 처치시의 동일한 세포의 특이적 고갈을 도시한다.

도 1lA-11F는 ABX-CBL 및 보체를 사용한 처치 전후 활성화된 T 세포(도 11A-11B), 활성화된 B 세포(도 11C-11D) 및 활성화된 단핵세포(도 11E-11F)의 비교를 도시하며, ABX-CBL 및 보체를 사용한 처치시의 동일한 세포의 특이적 고갈을 도시한다.

도 12는 ABX-CBL의 작용 방식이 백혈구 아군의 고갈에 의한 것임을 예시한다. 이 표는 백혈구 아군의 보체 의존성 세포독성(CDC), 표면 마커 및 세포 유형의 고갈을 비교한다.

도 13는 ABX-CBL 및 보체를 사용한 세포의 처치후 세포, 세포 유형, CD147 형질발현 및 CDC를 비교하는 표이다. 이러한 데이터에 의하면, CD147을 형질발현시키는 모든 세포가 처치시에 사멸되지는 않는다는 것을 알 수 있다.

도 14는 CBL-1⁺세포 상의 CDC 내성 분자의 형질 발현을 나타내는 표이다. 이 차트는 세포, 세포 유형, CD147 형질발현, ABX-CBL 및 보체를 사용한 세포의 처치후의 CDC 및, 보체 억제성 CD55 및 CD59의 형질발현을 비교한다. 이러한 데이타는 이들 세포 중에서, CD55 및 CD59 모두를 형질발현시키지 않는 세포 만이 이러한 처치시에 사멸된다는 것을 도시한다.

도 15A-15C는 사람의 내피 세포주 ECV-304 상에서의 CD147의 형질발현을 나타내는 FACS 분석을 나타낸다.

도 16A-16C는 사람의 내피 세포주 HUVEC-C 상에서의 CD147의 형질발현을 나타내는 FAC 분석을 나타낸다.

도 17은 CEM 세포상에서의 효과와 비교하는 사람의 내피 세포주 ECV-304에서의 ABX-CBL 및 보체의 효과를 도시하는 그래프이다.

도 18은 CEM 세포상에서의 효과와 비교하는 사람의 내피 세포주 HUVEC-C에서의 ABX-CBL의 효과를 도시하는 그래프이다.

도 19A-19C는 사람 내피 세포 ECV-304 상에서의 보체 억제성 분자 CD46, CD55 및 CD59의 형질발현을 나타내는 FACS 분석을 나타낸다.

도 20A-20C는 사람 내피 세포 HUVEC-C 상에서의 보체 억제성 분자 CD46, CD55 및 CD59의 형질발현을 나타내는 FACS 분석을 나타낸다.

도 21은 COS 세포에서의 CD147 cDNA의 형질발현 및 클로닝에 사용되는 벡터의 개략도이다.

도 22는 COS 및 E. 콜리 세포에서의 CD147 cDNA의 형질발현 및 클로닝에 사용되는 pBK-CMV 파지미드 벡터의 개략도이다.

도 23은 COS 세포(도 23A) 및 E. 콜리(도 23B)에서 형질발현되는 CD147의 SDS-PAGE/웨스턴 블롯이다. 도 23A-23B: 항체: 파밍겐(패널 A), 2.6.1 (패널 B), 및 ABX-CBL (패널 C). 도 23A: 5 ㎕ CEM 세포막 추출물(레인 l); 7.5 ㎕ 대조군 벡터 형질감염된 COS 세포 추출물(레인 2); 7.5 ㎕ CD147 형질감염된 COS 세포 추출물(레인 3). 도 23B: 클론 1: CD147-형질감염, 미유도(레인 1); 클론 1: CD147-형질감염, 유도(레인 2); 클론 5: 대조군 벡터 형질감염, 미유도(레인 3); 클론 5: 대조군 벡터 형질감염, 유도(레인 4).

도 24-33은 항체 CEM l0.1 C3 (도 24), CEM l0.l Gl0 (도 25), CEM l0.12 F3(도 26), CEM 10.12 G5 (도 27), CEM 13.12 (도 28), CEM 13.5 (도 29), 2.4.4 (도 30), 2 1.1 (도 31), 2.3.2 (도 32), 및 2.6.1 (도 33)의 그리고 이들 항체에 대한 단백질 서열 및 중 알파 및 카파 쇄 cDNA를 도시한다.

도 34-43은 CDR 위치를 나타내는 항체 CEM l0.1 C3 (도 34), CEM l0.l G10 (도 35), CEM l0.12 F3 (도 36), CEM l0.12 G5 (도 37), CEM 13.12 (도 38), CEM 13.5 (도 39), 2.4.4 (도 40), 2.1.1(도 41), 2.3.2 (도 42) 및 2.6.1 (도 43)의 그리고 이들 항체에 대한 중 알파 및 카파 쇄 단백질 서열을 도시한다.

도 44A-44B는 배선 V-분절 유전자에 대한 배열을 도시하는 CBL-1 특이성 하이브리도마로부터 유도된 사람의 중쇄의 구조 및 아미노산 서열을 도시한다.

도 45A-45C 및 도 46은 배선 V-분절 유전자에 대한 배열을 도시하는 CBL1 특이성 하이브리도마로부터 유도된 사람 중쇄의 구조 및 아미노산 서열을 도시한다.

도 47은 본 발명에 의한 특정 구조물의 작제 및 클로닝에 이용된 벡터 pWBFNP MCS의 제한 지도를 도시한다.

도 48은 본 발명에 의한 특정 구조물의 작제 및 클로닝에 이용된 벡터 IK6.1+Puro의 개략적 제한 지도를 도시한다.

도 49는 2.6.l 다량체 IgM 항체가 MLR.C: 토끼 보체의 억제에 유효하다는 것을 입증하는, MLR 분석을 억제하는 2.6.l 다량체 IgM 항체(이는 ABX-Rb2로 공지됨) 및 ABX-CBL 항체의 활성을 비교한다.

도 50A-50F는 동물 모델에 사용하기 위한 대용 항체의 생성과 관련하여 사용하기 위한 CD147-IgG2 및 gp42-IgG2 융합 단백질의 생성과 관련되어 사용된 클로닝 전략을 상세히 설명한다.

발명의 개요

본 발명의 제1의 측면에 따르면, 보체를 고정시키는 아이소타입과 IgM 단일클론 항체 ABX-CBL이 결합하는 CD147 상의 에피토프에 결합하는 가변부를 가진 분리된 단일 클론 항체(단, CBL1이 아님)가 제공된다. 바람직한 양태에서, 보체의 존재하의 항체는 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구로 구성되는 구선에서 선택되는 세포를 선별하여 사멸시키는 작용을 하나, 휴지 T 세포 및 휴지 B 세포에는 실질적으로 비독성이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 아이소타입을 가진다.

본 발명의 제2의 측면에 따르면, 보체를 고정시키는 아이소타입과 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포, 휴지 단핵구 및 활성화된 단핵구의 군집 상의 CD147에 결합하는 가변부를 가진 분리된 단일 클론 항체(단, CBL1이 아님)가 제공되는데, 이 항체는 보체의 존재 하에 다른 세포에는 실질적으로 비독성이면서 보체 매개의 사멸을 통해 상기 군집을 선별적으로 고갈시킨다. 바람직한 양태에서, 항체는 인간 항체이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 아이소타입을 가진다.

본 발명의 제3의 측면에 따르면, 다음과 같은 특성을 갖는 분리된 단일클론 항체가 제공된다: CD147에 결합하며; 도 1에 제시한 것과 유사한 웨스턴 블롯 상의 CEM 세포 용해물에 대한 결합을 나타내고; 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 아이소타입; CD147에의 결합에 대해 ABX-CBL과 경쟁하며; hn-RNP-k 단백질과 상호 작용하고; RVRS를 포함하는 CD147 상의 일치 서열에 결합하며; 보체의 존재 하에서만 MLR 분석에서 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구를 선별하여 사멸시키고; 보체의 존재하에 또는 부재하에 CD55 및 CD59를 형질발현시키는 세포에 대해 실질적으로 비독성이며; 단, 항체는 CBL1이 아니다.

본 발명의 제4의 측면에 의하면, CD147에 결합되고, 보체를 결합시킬 수 있는 항체를 생성하고; CD 147에 결합시키기 위한 ABX-CBL과의 경쟁력, 보체 단독의 존재하에서 MLR 분석에서의 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵세포를 선택적으로 사멸시키는 능력 및, 보체의 존재 및 부재하에 CD55 및 CD59를 형질발현시키는 세포에 대해 거의 비독성인(단, 항체가 CBL1이 아님) 특성중 1 이상에 대한 항체를 분석하는 것을 포함하는, 질환의 처치에 대한 항-CD147 항체를 선택하는 방법이 제공된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 이러한 방법은 도 1에 제공된 것과 유사한 방식으로 웨스턴 블롯상에서의 CEM 세포 용해물의 결합에 대한 항체를 분석하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에 잇어서, 이러한 방법은 펩티드 RXRS에서의 콘센서스 서열에 결합시키기 위한 항체를 분석하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에 있어서, 이러한 방법은 hn-RNP-k 단백질과 교차 반응하기 위한 항체를 분석하는 것을 포함한다. 또다른 바람직한 실시태양에 잇어서, 이러한 방법은 COS 세포 및 E. 콜리 세포에 의해 형질발현된 CD147의 형태에 결합시키기 위한 항체를 분석하는 것을 포함한다.

본 발명의 제5의 측면에 의하면, 항체가 CBL1이 아니라는 전제하에 보체의 존재하에서 기타의 세포에 대해서는 거의 무독성이면서 보체 매개 사멸을 통해 이러한 군집을 선택적으로 고갈시키는 휴지 또는 활성화된 단핵세포, 활성화된 T 세포 및 활성화된 B 세포의 군집에 대한 CD147에 결합하는 가변 부위 및 보체를 고정시키는 이소타입을 갖는 항체를, 이러한 처치를 요하는 환자에게 제공하는 것을 포함하는, 질환의 경중도를 약화시키거나 또는 예방하는 방법이 제공된다. 바람직한 방법에서, 항체는 사람의 항체이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 사람 IgM, 사람 IgG1 및 사람 IgG3로 구성된 군에서 선택된 이소타입이다.

본 발명의 제6의 측면에 의하면, 항체가 CBL1이 아니라는 전제하에 보체의 존재하에서 기타의 세포에 대해서는 거의 무독성이면서 보체 매개 사멸을 통해 이러한 군집을 선택적으로 고갈시키는 휴지 또는 활성화된 단핵세포, 활성화된 T 세포 및 활성화된 B 세포의 군집에 대한 CD147에 결합하는 가변 부위 및 보체를 고정시키는 이소타입을 갖는 항체를, 이러한 처치를 요하는 환자에게 제공하는 것을 포함하는, GVHD의 경중도를 약화시키거나 또는 예방하는 방법이 제공된다. 바람직한 방법에서, 항체는 사람의 항체이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 항체는 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 사람 IgM, 사람 IgG1 및 사람 IgG3로 구성된 군에서 선택된 이소타입이다.

본 발명의 제7의 측면에 의하면, 항체가 CBL1이 아닌, 일치 서열 RVRSH를 포함하는 CD147상의 에피토프에 결합되는 단일클론 항체가 제공된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 항체는 사람 항체이다.

본 발명의 제8의 측면에 의하면, RXRS, RXRSH, RVRS 및 RVRSH로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 유리 펩티드가 제공된다. 바람직한 실시태양에 있어서, 펩티드는 항체의 생성에 사용된다.

본 발명의 제9의 측면에 의하면, CD147에 결합하는 사람 단일클론 항체가 제공된다.

바람직한 실시태양에 대한 상세한 설명

본 발명에 대한 논의

약학적 제제 ABX-CBL는 CBL1 항체를 형질발현하는 하이브리도마 세포주로부터 유도된다. CBL1은 쥐 IgM, 항-사람 림프아구 단일클론 항체로서, 이는 T 세포 급성 림프아구 백혈병 세포주(T-ALL) CEM으로 면역화된 Balb/c 마우스에서 생성된다(Billing et a1, "Monoclonal and heteroantiobody reacting with different common antigens common to human blast cel1s and monocytes" Hybridoma 1:303-311 (1982)). 비(脾)세포 융합 및 HAT 배지 중에서의 선택후, 하이브리도마 함유 웰로부터의 상청액을 CEM 세포와의 반응성에 대해 미소독성 분석으로 스크리닝시켰다. 이러한 분석에서 양성을 띠는 것으로 나타난 하이브리도마를 휴지 림프구 및 아세포를 식별하는 능력에 대해 추가로 스크리닝하였다. CBL1은 아세포에 대한 선택도를 갖기 때문에 추가의 연구를 위해 이를 선택하였다(Bil1ing et al. "Monoclonal and heteromtibody reacting with diffierent common antigens common to human blast cells and monocytes" Hybridoma 1:303-311 (1982)). CBL1 항체는 HB 8214로서 ATCC에 기탁되어 있다.

캐나다 프리몬트에 소재하는 아브게닉스, 인코포레이티드에 소재하는 본 출원인의 양수인은 1997년 CBL1을 입수하였으며, HB 8214로서 ATCC를 사용하여 부착된 하이브리도마 주가 완전히 순수하지 않다는 것을 측정하였다. 그 대신에, 이는 2 개의 색다른 하이브리도마 주, 하나는 IgG를 생성하고, 다른 하나는 IgM을 생성하는 것의 혼합물이다. 서브클로닝후, 순수한 IgG 생성체 뿐 아니라, IgM 생성체를 유도하였다. 본 명세서에 기재된 일련의 시험관내 실험을 통해, CBL1 하이브리도마로 인한 활성을 IgM 항체가 매개한다는 것이 입증되었다. IgM 만이 혼합된 림프구 반응 분석(MLR) 중의 세포의 보체 매개된 용해의 억제에 있어서 생물학적으로 활성을 갖는다. 억제 메카니즘은 본 명세서에 기재된 바와 같이 이러한 억제가 특이성을 지니고, 보체 의존성을 갖기 때문에 항체를 통해 매개된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖는다. 그러므로, 통상의 기법을 사용하여 본 명세서에 기재된 본 출원인의 연구와 관련하여서, 본 출원인은 상기 주를 서브클로닝시켜 IgM만을 생성하는 세포주를 생성한다. 추가로, CBL1 항체를 형질발현시키는 HB 8214 세포주는 제2의 카파 경쇄(MOPC-21)를 지니며, 이는 초기 하이브리도마 세포주를 제조하는데 사용되는 초기 골수종 세포주, P3 골수종 세포주로부터 유도된 것이다. 본 출원인의 서브클로닝 하이브리도마 세포주는 경쇄를 모두 포함하며 이를 형질발현시키며, ABX-CBL 항체는 경쇄 모두를 포함하는 것으로 밝혀졌다. IgM 항체는 일반적으로 5량체 구조를 가지며, 여기서 5 개의 중쇄 및 경쇄 이량체가 결합되어 있다. ABX-CBL 항체 중의 2 개의 경쇄를 포함할 경우, 본 출원인은 ABX-CBL 항체의 IgM 5량체 구조가 다양한 비율의 경쇄 중의 경쇄 모드를 포함하여 단독이량체, 이종이량체 및, 단독이량체와 이종이량체의 조합물을 포함하는 5량체를 형성한다.

잠복기 및 임상적 발단기에 사용하기 위한 ABX-CBL 항체를 제조하기 위해, 본 출원인은 플로리다주 플랜테이션 소재의 굳윈 바이오테크놀러지와의 제조 계약을 통해 중공 섬유 세포 배양 기법을 사용하였다. 성장 배지는 깁코 라이프 테크놀러지즈에서 공급하는 무혈청 제제 HYBRIDOMA-SFM이다.

ABX-CBL의 마스터 셀 뱅크(MCB)의 안정도는 단일 세포 서브클로닝에 의해 측정하였다. 세포를 서브클로닝하여 단일 세포 콜로니 생성체에 대해 안정도가 ＞95%인 것으로 나타났다. ABX-CBL MCB 또한 배양액 중의 130 개 이상의 세대에 대해 안정한 항체 생성을 나타낸다. 중공 섬유 생반응체에서의 제조 방법은 약 130 세대에 상응하는 약 40 일 성장 프로세스이다.

세포 배양액 상청액으로부터의 단일클론 항체의 1차 정제는 프로테인 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 수행하였다. 용리후 낮은 pH에서의 항온배양은 바이러스성 불활성화 단계로서 수행된다. 이러한 물질은 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 이는 잔류 단백질 A 및 DNA 제거를 제공한다. 정제 프로세스에서의 최종 단계는 추가의 바이러스 제거를 제공하게 되는 물질의 여과 단계이다.

바이알에 넣기 전에 제제화된 벌트 약물 물질을 2℃∼8℃에서 보관하였다. 무균 기법을 사용하여 항체를 벌크 용기로부터의 액체 형태로 5 ㎖ 유리 바이알에 충전시켰다. 바이알을 2℃∼8℃에서 보관 및 선적하였다. ABX-CBL는 T-ALL (급성 림포블라스틱 백혈병) 세포주(CEM)에서 키운 쥐 IgM, 항-사람 림프아구 단일클론 항체이다. ABX-CBL은 구연산나트륨 20 mM 및 염화나트륨 120 mM 중에서 pH 6.0에서 제제화하였다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 용어 "ABX-CBL"은 ATCC HB 8214로 기탁왼 초기 세포주로부터 유도된 정제되고 반응성을 갖는 IgM 항체를 의미한다. ABX-CBL 중쇄 및 경쇄의 서열은 전술한 바와 같으며, 각각 서열 번호 18 및 서열 번호 19로 나타낸다.

본 출원인은 특정의 세포, 예컨대 T 세포, B 세포 및/또는 단핵구상에서 형질발현되기 때문에 CBL1 항체 및 ABX-CBL의 활성제가 CD147 항원에 결합된다는 것을 입증하였다. 따라서, CD147 항원은 각종 질환의 처치에 대한 표적으로서 사용될 수 있을 것으로 예상된다. CBL1 항체가 전술한 질환의 처치 중인 환자에게서 유효하고, 전술한 바와 같은 결과를 토대로 하여 추가의 CD147을 사용한 치료도 유사하게 유효할 것으로 예상된다. 그러므로, 본 발명에 의하면, 본 출원인은 분자 CD147가 T 세포, B 세포, 및/또는 단핵구와 같은 특정의 세포상에서 형질발현되므로 각종 질환의 처치에 사용될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 특히, 본 출원인은 CD147에 결합하고, 보체의 활성화를 통해 상기의 세포를 사멸시키게 하는 항체가 각종 질환의 처치에 유용하다는 것을 밝혀냈다. 이러한 질환의 비제한적인 예로는 대숙주성 이식편 질환(GVHD), 장기 이식편 거부 질환(비제한적인 예로서, 신장 이식편, 망막 이식 등), 암[비제한적인 예로는 혈액암(즉 백혈병 및 림프종), 및 췌장암 등], 자가면역 질환, 면역 질환 등이 있다.

전술한 바와 같이, CBL1은 상기에서 CD147에 결합되는 것으로 기재되지는 않았었다. 또한, CBL1 항체 결합된 특정의 에피토프 또는 항체는 공지되어 있지 않거나 또는 적어도 비특성화되어 있다. 그래서, CBL1 항체의 외관상의 안정성 및 치료 효과로 인해서, 본 출원인은 CBL1 및 본 발명의 ABX-CBL 항체가 결합된 정확한 항원 또는 에피토프를 측정하고자 한다. 또한, 추가로, CBL1 항체가 GVHD의 치료와 관련하여 특이 유용하다는 것이 특히 주목한다.

참고로, ATCC HB 8214로 기탁된 하이브리도마 주는 완전하게 순수한 것은 아니다. 이러한 주는 IgG 항체 및 IgM 항체로 생성된다. IgM은 혼합 림프구 반응 분석(MLR)에서의 세포의 보체 매개된 용해를 억제하는데 있어서 생물학적 활성을 갖는다. 억제 메카니즘은 억제가 전술한 바와 같이 특이성을 갖고 보체 의존성을 갖기 때문에 항체 매개된 보체 의존성 세포독성(CDC)에 의한 것이다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 본 출원인의 연구와 관련하여 본 출원인은 주를 서브클로닝시켜 IgM만을 생성하는 세포주를 생성하였다. 또한, CBL1 항체를 형질발현시키는 HB 8214 세포주는 제2의 카파 경쇄(MOPC-21)를 지니며, 이는 초기의 하이브리도마 세포주를 생성하는데 사용되는 골수종 융합 파트너, P3 골수종 세포주로부터 유도된 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 서브클로닝 처리된 하이브리도마 세포주는 경쇄 모두를 갖고 이를 형질발현시키며, ABX-CBL 항체는 경쇄 모두를 포함하는 것으로 밝혀졌다. IgM 항체는 일반적으로 5량체 구조를 가지며, 여기서 이 5량체는 5 개의 중쇄 및 경쇄 이량체가 결합되어 있다. ABX-CBL 항체 중의 2 개의 경쇄에 의해, 본 출원인은 ABX-CBL 항체의 IgM 5량체 구조가 다양한 비율의 경쇄 중의 경쇄를 함유하여 단독이량체, 이종이량체 및, 단독이량체와 이종이량체의 조합물을 갖는 5량체를 형성한다.

CBLl 및 ABX-CBL 결합에서의 MOPC-21 경쇄의 역할은 알려져 있지 않다. 본 출원인의 연구에 의해, 본 출원인은 ABX-CBL 경쇄 또는 MOPC-21 경쇄만을 형질발현시키는 하이브리도마 서브클론의 제조에 의해 M0PC-21 경쇄의 역할을 규명하고자 하였다. 본 출원인이 사용한 하나의 접근법으로는 경쇄 혼합(shuffling)을 얻기 위해 마우스 골수종 세포주를 갖는 ABX-CBL 하이브리도마를 융합시키는 방법이다. MOPC-21 경쇄 또는 ABX-CBL 경쇄만을 형질발현시키는 하이브리도마의 생성으로, 본 출원인은 ABX-CBL 결합에서 2 개의 경쇄의 역할을 식별하는 특성화를 실시할 수 있었다.

용어 정의

특별한 언급이 없는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 용어 및 기술적 용어는 당업자라면 통상적으로 이해할 수 있는 의미를 갖는다. 또한, 문맥상 단수의 용어는 복수를 포함하며, 복수의 용어는 단수를 포함할 수 있다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자생물학, 단백질 및 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이의 기법은 당업계에서 통상적으로 사용되며, 널리 주지되어 있는 것들이다. 재조합 DNA, 올리고뉴클레오티드 합성 및 조직 배양 및 형질전환(예, 전기사출, 리포펙션 등)에 대한 표준 기법을 사용한다. 효소 반응 및 정제 기법을 제조업자의 지시사항에 따라 수행하거나 또는 당분야에 공지되거나 또는 기재된 바와 같이 수행하였다. 전술한 기법 및 절차는 일반적으로 당업계에 통상의 기법에 의해 수행하거나 또는 본 명세서를 통해 인용되고 논의된 다양한 문헌 및 더욱 특수한 참고 문헌에 기재된 바와 같이 수행하였다. 예를 들면, 참고 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2판, 콜드 스프링 하버 래버로토리 프레스, 미국 뉴욕 콜드 스프링 하버 (l989))]을 참고하며, 이 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용한다. 본 명세서에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약학 화학의 실험실 절차 및 기법 및 이들과 관련하여 사용된 명명법은 당업자에게 공지되어 있고, 통상적으로 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학적 제조, 제제 및 전달 및 환자의 치료에는 표준의 기법을 사용하였다.

본 발명의 개시에 의해 사용된 바와 같이, 이하의 용어는 특별한 언급이 없는한, 이하와 같은 의미를 갖는 것으로 이해한다.

용어 "분리된 폴리뉴클레오티드"라는 것은 "분리된 폴리뉴클레오티드"라는 것이 (1) 자연 상태에서 "분리된 폴리뉴클레오티드"가 발견되는 폴리뉴클레오티드 전부 또는 일부분과 관련되어 있지 않으며, (2) 자연 상태에서 결합되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 결합되어 있지 않거나 또는 (3) 커다란 서열의 일부분으로서 자연 상태에서 발생하지 않는 본래의 의미에 의하여, 게놈의 폴리뉴클레오티드, cDNA 또는 합성 기원 또는 이들의 조합을 의미한다.

용어 "분리된 단백질"이라는 것은 "분리된 단백질"이라는 것이 (1) 자연 상태에서 발견되는 단백질과 관련되어 있지 않으며, (2) 예를 들면 쥐의 단백질이 없는 것과 같은, 동일한 공급원으로부터의 기타의 단백질이 없거나, 또는 (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 형질발현되거나, 또는 (4) 자연 상태에서 발생하지 않는 본래의 의미에 의하여, cDNA, 재조합 RNA 또는 합성 기원 또는 이들의 조합의 단백질을 의미한다.

용어 "폴리펩티드"라는 것은 폴리펩티드 서열의 유사체, 분절, 천연 단백질을 의미하는 속명으로서 본 명세서에서 사용하였다. 그래서, 천연 단백질, 분절 및 유사체는 폴리펩티드 속의 종이다.

용어 "자연 발생"이라는 것은 물질이 자연중에 발견될 수 있다는 사실을 의미하는 물질로서 본 명세서에서 사용되었다. 예를 들면, 자연의 공급원으로부터 분리될 수 있으며, 실험실 내에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 자연 중의 공급우너으로부터 분리되거나 또는 또는 천연 발생되는 것이 될 수 있는 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 등이 있다.

용어 "작동 가능하게 결합된"이라는 것은 이와 같이 기재된 성분의 위치가 의도한 방법으로 기능하도록 할 수 있는 관계의 것으로서 본 명세서에 사용되었다. 암호화 서열에 "작동 가능하게 결합된" 대조용 서열은 암호화 서열의 형질발현이 대조용 서열과 혼화성을 갖는 조건하에서 얻을 수 있는 방식으로 결찰된다.

용어 "조절 서열"이라는 것은 결찰되는 암호화 서열의 형질 발현 및 프로세싱을 수행하는데 있어서 필수적인 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 사용되었다. 이러한 조절 서열의 특성은 숙주 유기체에 따라서 상이하며, 원핵생물에서, 이와 같은 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종격 서열; 진핵생물의 경우 일반적으로 이러한 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 용어 "조절 서열"이라는 것은 이의 존재가 형질전환 및 프로세싱에 필수적인 모든 성분을 포함하고, 또한 예를 들면 리더 서열 및 융합 파트너 서열의 존재가 이로운 추가의 성분을 포함할 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들 유형의 뉴클레오티드의 변형 형태인 길이가 10 이상의 염기의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 이 용어는 DNA의 단일 또는 이중 스트랜드를 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오티드"라는 것은 천연 또는 비천연 올리고뉴클레오티드 결합에 의해 함께 결합된 천연 및 변형된 뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 200 개 이하의 염기인 폴리뉴클레오티드 서브세트이다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 10∼60 개의 염기인 것이 바람직하고, 길이가 12, 13, l4, 1 5, 16, 17, 18, 19, 또는 20∼40 개의 염기인 것이 가장 바람직하다. 올리고뉴클레오티드가 유전자 돌연변이의 작제에 사용하는 경우처럼 이본쇄일 수 있지만, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 프로브의 경우처럼 일본쇄이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 될 수도 있다.

용어 "자연 발생의 뉴클레오티드"라는 것은 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"라는 것은 변형되거나 또는 치환된 당 기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오티드 결합"이라는 것은 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티올에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등과 같은 올리고뉴클레오티드 결합을 의미한다. 본 명세서에 참고로 인용하는 참고 문헌[LaP1anche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et a1. J Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et a1. Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et a1. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 옥스퍼드 유니버시티 프레스, 영국 옥스퍼드 (1991)); Stec et a1. 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann 및 Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)]을 참고한다. 올리고뉴클레오티드는 필요할 경우 검출용 표지를 포함할 수도 있다.

용어 "선택적으로 하이브리드화한다"라는 것은 검출가능하게 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. 본 발명에 의한 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 분절은 비특이적 핵산에 검출가능하게 결합할 수 있는 허용량을 최소화하는 세척 및 하이브리드화 조건하에서 핵산 가닥으로 선택적으로 하이브리드화 처리하는 것을 의미한다. 매우 엄중한 조건을 사용하여 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 논의되어 있는 바와 같은 선택적 하이브리드화 조건을 얻을 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 이의 분절과 해당 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 80% 이상으로, 통상적으로는 85%, 90%, 95%, 97%, 및 100% 이상으로 상동성이 증가되는 것이 바람직하다. 이들 서열 사이의 부분적이거나 또는 완전 동일상이 존재하는 경우 이 2 개의 아미노산 서열은 상동성을 지는다. 예를 들면, 85%의 상동성이라는 것은 2 개의 서열이 최대의 매칭을 위해 배열되는 경우 아미노산의 85%가 동일하다는 것을 의미한다. 2 개의 서열이 일치하는 것에서의 갭은 최대의 매칭이 가능하게 되며, 5 미만의 갭 길이가 더욱 바람직하다. 이러한 용어가 사용된 바와 같이 2 개의 단백질 서열이 돌연변이 데이타 매트릭스 및 6 이상의 갭 페널티를 갖는 프로그램 ALIGN을 사용하여 배열 스코어가 5 이상(표준 편차 단위로)일 경우 2 개의 단백질 서열(또는 길이가 30 이상의 아미노산으로부터 유도된 폴리펩티드 서열)이 상동성을 갖는 것이 바람직하다. 참고 문헌[Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 10l-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) 및 Volume 5의 보충판 2, pp. 1-10]을 참고한다. ALIGN 프로그램을 사용하여 최적으로 배열할 경우 아미노산이 50% 이상이 동일하면 이 2 개의 서열 및 이의 일부는 상동성을 갖는 것이 더욱 바람직하다. 용어 "해당한다"라는 것은 폴리뉴클레오티드 서열이 대조 폴리뉴클레오티드 서열 전부 또는 일부와 상동성을 갖고(죽, 동일하며, 엄격히 전개식으로 관련되지는 않음), 폴리펩티드 서열은 대조 폴리펩티드 서열과 동일한 것을 의미한다. 이와 같은 모순된 사실에서, 용어 "상보성"을 갖는다라는 것은 상보성 서열이 대조 폴리뉴클레오티드 서열 전부 또는 일부와 상동성을 갖는다는 것을 의미한다. 예로서, 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 대조 서열 "TATAC"에 해당하며, 이는 대조 서열 "GTATA"에 대해 상보성을 갖는다.

"대조 서열", "비교 윈도우", "서열 확인", "서열 확인율" 및 "실질적인 확인"과 같은 용어는 2 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 서열 관계를 기재하는 경우에 사용한다. "대조 서열"은 서열 비교를 기준으로 사용하여 확정된 서열로서, 대조 서열은 서열 리스트에 주어진 전장 cDNA 또는 유전자 서열의 분잘로서 커다란 서열의 서브세트가 될 수 있거나 또는 완전 cDNA 또는 유전자 서열을 포함할 수도 있다. 일반적으로 대조 서열은 길이 적어도 24의 뉴클레오티드 또는 8의 아미노산에서 길이 적어도 18 뉴클레오티드 또는 6 아미노산이 된다. 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 각각 (1) 2 개의 분자 사이에서 유사한 서열(즉, 완전 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부분)을 포함할 수 있거나 또는 (2) 2(이상)개의 분자 사이의 서열 비교를 통상적으로 "비교 윈도우"와 2 개의 분자의 서열과 비교하여 통상적으로 수행하여 서열 상과의 국소 부위를 확인하고 비교하는, 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에서 발산되는 서열을 추가로 포함할 수도 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"라는 것은 18 이상의 인접 뉴클레오티드 위치 또는 6 개의 아미노산의 개념상의 분절을 의미하며, 여기서, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 적어도 6 개의 아미노산 서열 또는 18 개의 인접 뉴클레오티드의 비교 서열과 비교하며, 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 2 개의 서열의 최적의 배열에 대해 대조 서열(추가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 20% 미만의 추가, 결실, 치환 등(즉 갭)을 포함할 수도 있다. 비교 윈도우를 배열하기 위한 서열의 최적의 배열은 Smith 및 Waterman의 문헌[Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman 및 Wunsch의 문헌[J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 배열 알고리즘에 의해, Pearson 및 Lipman의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. (미국) 85:2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 검색에 의해, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Goup, 575 Science Dr., 미국 위스턴신주 매디슨), Geneworks, 또는 MacVector 소프트웨어 팩키지)의 컴퓨터화 실행에 의해, 또는 검사에 의해 수행될 수 있으며, 각종 방법에 의해 생성된 최적의 배치(즉, 비교용 윈도우에 대한 최고치의 상동성을 생성함)를 선택한다.

용어 "서열 확인"은 비교 윈도우 상에서 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 동일한(즉, 뉴클레오티드-뉴클레오티드 또는 잔기-잔기 기준으로)것을 의미한다. 용어 "서열 확인율"이라는 것은 비교용 윈도우 상에서의 2 개의 최적으로 배열된 서열을 비교하고, 동일한 핵산 염기(예, A, T, C, G, U 또는 I) 또는 잔기가 두 서열 내에서 생성되어 일치하는 부위의 수를 얻고, 일치한 부분의 수를 비교 윈도우내에서의 부위의 총수(즉, 윈도우 크기)로 나누며, 그 결과를 100으로 곱하여 서열 확인율을 얻어서 계산한다. 용어 "실질적인 확인"이라는 것은 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 특성을 나타내는 것으로 사용하였으며, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산은 18 이상의 뉴클레오티드(6 개의 아미노산) 부위의 비교 윈도우, 흔하게는 적어도 24-48 뉴클레오티드(8-16 아미노산) 부위의 윈도우에 대해, 대조 서열과 비교하여 서열 확인율 85% 이상의 서열 확인율, 바람직하게는 적어도 90∼95%의 서열 확인율, 더욱 일반적으로는 99% 이상의 서열 확인율을 갖는 서열을 포함하며, 서열 확인율은 비교 윈도우에 대해서 총 20% 이하의 대조 서열을 포함하는 결실 또는 추가를 포함할 수도 있는 서열과 대조 서열을 비교하여 계산한다. 대조 서열은 커다란 서열의 서브세트가 될 수도 있다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 20 개의 통상의 아미노산 및 이의 약어는 통상의 용도에 준한다. 참고 문헌[Immuno1ogy - A Synthesis (2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren, 편저, 시노어 어쏘시에이츠, 미국 매사츄세츠주 선더랜드 소재 (1991)]을 참고하며, 이는 본 명세서에서 참고로 인용한다. 20 개의 통상의 아미노산, 비천연 아미노산, 예컨대 α-, α-이중 치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 기타의 비통상의 아미노산의 입체이성체(예, D-아미노산)은 본 발명의 폴리펩티드에 대해 적절한 성분이 될 수도 있다. 이러한 비통상의 아미노산의 예로는 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히드티딘, 5-히드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 기타의 유사 아미노산 및 이미노산(예, 4-히드록시프롤린)이 있다. 본 명세서에 사용한 폴리펩티드의 개념은 표준 사용 및 관례에 따라 좌선성은 아미노 말단 방향이고, 우선성은 카르복시 말단 방향이다.

유사하게, 특별한 언급이 없는한, 단일 스트랜드 폴리뉴클레오티드 서열의 좌선성 말단은 5' 말단이고, 이중 스트랜드 폴리뉴클레오티드 서열의 좌선성 방향은 5' 방향으로서 불리운다. 초기의 RNA 전사의 5'에서 3'로의 방향은 전사 방향으로 불리우며, RNA와 동일한 서열을 가지며, RNA 전사의 5' 단부에서의 5'인 DNA 스트랜드상의 서열 부위는 "상류 서열"로 칭하며, RNA와 동일한 서열을 가지며, RNA 전사의 3' 단부에서의 3'인 DNA 스트랜드상의 서열 부위는 "하류 서열"로 칭한다.

폴리뉴클레오티드에서와 같이, 용어 "실질적인 확인"이라는 것은 디폴트 갭 중랭을 사용하하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의한 것과 같이 최적으로 배열되는 경우 80% 이상의 서열 확인, 바람직하게는 90% 이상의 서열 확인, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 확인, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 확인을 공유하는 2 개의 펩티드 서열을 의미한다. 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환과는 상이한 것이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환은 유산 측쇄를 갖는 잔기의 상호교환 가능성을 의미한다. 예를 들어 지방족 측쇄를 갖는 아미노산기는 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 등이 있으며, 지방족 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산기는 세린 및 트레오닌이 있으며, 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산기로는 아스파라긴 및 글루타민이 있고, 방향족 측쇄를 갖는 아미노산기로는 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이 있고, 염기성 측쇄를 갖는 아미노산기로는 리신, 아르기닌 및 히스티딘이 있으며, 황 함유 측쇄를 갖는 아미노산기로는 시스테인 및 메티오닌 등이 있다. 조전적 아미노산 치환기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루탐산-아스파르트산 및 아스파라긴-글루타민 등이 바람직하다.

본 명세서에서 논의된 바와 같이, 항체 또는 면역글로불린의 아미노산 서열에서의 약간의 변형은 본 발명에 포함되는 것으로 간주하며나, 아미노산 서열의 변형은 75% 이상, 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 90%, 95%, 가장 바람직하게는 99% 이어야 한다. 특히, 보존적 아미노산 치환을 고려할 수도 있다. 보존적 치환은 이들의 축쇄에서 관련이 있는 아미노산 과(family)내에서 발생하는 것이다. 유전적으로 암호화된 아미노산은 일반적으로 (1) 산성=아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성=리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성=알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토파네; 및 (4) 비하전 극성=글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신 등의 4 가지의 과로 분류된다. 이러한 과는 세린 및 트레오닌이 지방족 히드록시과; 아스파라긴 및 글루타민이 아미드 함유 과; 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신이 지방족과; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 방향족 과인 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면, 특히 대체가 골격 부위 내의 아미노산을 포함하지 않는 경우, 류신 대신에 이소류신 또는 발린, 아스파르테이트 대신에 글루타메이트, 트레오닌 대신에 세린의 분리 대체물 도는 아미노산 대신에 구조적으로 관련성이 있는 아미노산의 유사 대체물이 생성된 분자상의 결합 또는 특성에 커다란 영향을 미치지 않는 것으로 예상하는 것이 타당하다. 아모산 변화가 작용성 펩티드를 생성하는지의 여부는 폴리펩티드 유도체의 특이성 활성을 분석하여 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 분석은 본 명세서에 상세히 기재되어 있다. 항체 또는 면역글로불린 분자의 분절 또는 유사체는 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 분절 또는 유사체의 아미노 말단 또는 카르복시 말단은 작용성 도메인의 경계 부근에서 발생한다. 구조적 및 작용적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이티를 공공의 또는 독점의 서열 데이타베이스와 비교하여 확인할 수 있다. 컴퓨터를 사용한 비교 방법을 사용하여 공지의 구조 및/또는 기능의 기타의 단백질중에 존재하는 서열 모티브 또는 예상 단백질 입체구조 도메인을 확인한다. 공지의 3차원 구조로 폴딩된 단백질 서열을 확인하는 방법은 공지되어 있다[Bowie et al. Science 253:164(1991)]. 그래서, 전술한 예들은 당업자라면 본 발명에 의한 구조적 및 작용적 도메인을 형성하는데 사용될 수 있는 서열 모티브 및 구조적 입체구조를 인식할 수 있다는 것을 입증하였다.

아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화 반응에 대한 감수성을 감소시키며, (3) 단백질 착체를 형성시키기 위한 결합 친화도를 변경시키고, (4) 결합 친화도를 변경시키며, (5) 이러한 유사체의 기타의 물리화학적 또는 작용성 특성을 부여하거나 또는 변형시키는 것이 바람직하다. 유사체는 천연 발생 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들면 단일 또는 다수의 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 아미노산 치환)은 천연 발생 서열에서 생성될 수 있으며, 바람직하게는 분자간 접촉을 형성하는 도메인의 외부에서 폴리펩티드의 일부분중에 생성될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예를 들면 아미노산의 대체는 모서열 중에 생성되는 나선을 파괴하거나 또는 모서열을 특성화하는 2차 구조의 기타 유형을 분열시키지 않아야 한다). 당업계에 인지된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예로는 참고 문헌[Protein, Structure and Molecular Princlples(Creighton 편저, W.H. 프리맨 앤드 컴패니, 뉴욕 (1984)); Introdhction to Protein Structure(C. Branden 및 J. Tooze 편저, 갈랜드 퍼블리슁, 뉴욕 (1991)); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]을 참조하며, 이는 본 명세서에서 참고로 인용한다.

용어 "폴리펩티드 분절"은 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단 결실을 포함하나, 나머지 아미노산 서열은 예를 들면 전장 cDNA 서열로부터 추론된 자연 발생의 서열에서의 해당 부분이 잔류 아미노산 서열과 동일한 폴리펩티드를 의미한다. 분절은 통상적으로 5, 6, 8 또는 lO 아미노산 길이, 바람직하게는 14 이상의 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 약 20 이상의 아미노산 길이, 일반적으로 50 이상의 아미노산 길이 및 더더욱 바람직하게는 70 이상의 아미노산 길이를 갖는다. 용어 "유사체"라는 것은 추론 아미노산 서열의 일부분과 실질적으로 동일한 25 개 이상의 분절을 포함하고, (1) 적절한 결합 조건하에서 CD147에 특이적 결합하고, (2) CD147의 결합을 이의 리간드 또는 수용체로 변형시키는 능력 또는 (3) CD147의 성장을 시험관내 도는 생체내에서 사멸 또는 억제시키는 능력 중 1 이상을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로 폴리펩티드 유사체는 자연 발생 서열과 관련하여 보존적 아미노산 치환(또는 첨가 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상적으로 20 이상의 아미노산 길이, 바람직하게는 50 이상의 아미노산 길이를 가지며, 전장 천연 발생 폴리펩티드 정도로 길게 될 수도 있다.

펩티드 유사체는 통상적으로 약학업계에서 이들 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비펩티드 약물로서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드 화합물을 "펩티드 모사체" 또는 "펩티도모사체"로 칭한다. 참고 문헌[Fauchere, J Adv Drug Res. 15:29 (1986); Veber 및 Freidinger TINS p.392 (1985); 및 Evans et al. J Med Chem. 30:1229 (1987)]을 참조하며, 이는 본 명세서에서 참고로 인용한다. 이러한 화합물은 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발되었다. 치료학적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모사체를 사용하여 동등한 치료 또는 예방 효과를 얻을 수도 있다. 일반적으로, 펩티도모세체는 사람의 항체와 같이 파라다임 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약물학적 특성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하나, 당업계에 공지된 방법에 의해 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂-CH₂--, -CH=CH--(cis 및 trans), --COCH₂-, --CH(OH)CH₂--, 및 -CH₂SO--으로 구성된 군에서 선택된 결합에 의해 임의로 대체될 수 있는 펩티드 1 이상을 포함한다. 동일한 유형의 D-아미노산(예, L-리신 대신에 D-리신)을 갖는 일치 서열의 1 이상의 아미노산의 전체 치환을 사용하여 더욱 안정한 펩티드를 생성할 수도 있다. 또한, 일치 서열 또는 실질적으로 동일한 일치 서열 변형을 포함하는 구속 펩티드는 예를 들면 펩티드를 고리화하는 분자내 디설피드 가교를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가하므로써 당업계의 공지된 방법에 의해 생성될 수도 있다(Rizo 및 Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), 본 명세서에서 참고로 인용함).

"항체" 또는 "항체 펩티드(들)"는 무상해 항체, 또는 특이성 결합에 대한 무상해 항체와 경쟁하는 이의 결합 분절을 의미한다. 결합 분절은 재조합 DNA 기법에 의해 또는 효소 또는 무상해 항체의 화학적 분열에 의해 생성된다. 결합 분절의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 단쇄 항체 등이 있다. "이중특이성" 또는 "이중작용성" 항체 이외의 항체는 각각의 결합 부위가 동일한 것으로 이해한다. 과도한 항체가 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80% 및, 더욱 일반적으로는 약 85% (시험관내 경쟁적 결합 분석으로 측정함)로 대항수용체에 결합된 수용체의 함량을 감소시키는 경우, 항체는 실질적으로 수용체의 유착을 억제하게 된다.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정인자 등이 있다. 에피토프 결정인자는 일반적으로, 아미노산, 당 또는 기타의 탄수화물 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 구성되며, 일반적으로 특이성 하전 특성 뿐 아니라, 특이성 3차원 구조적 특성을 갖는다. 항체는 해리 상수가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 nM , 가장 바람직하게는 ≤10 nM인 경우 항원에 특이적으로 결합되는 것을 의미한다.

용어 "제제"라는 것은 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대 분자 또는 생물학적 물질로 이루어진 추출물 등을 의미한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "표지" 또는 "표지된"이라는 것은 표시된 아비딘(예, 광학적 또는 비색적 방법으로 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)에 의해 검출될 수 있는 비오티닐화 부분의 폴리펩티드에 부착되거나 또는 방사능 표지된 아미노산의 혼입에 의한 검출 가능한 마커의 혼입을 의미한다. 이와 같은 상황에서, 표지 또는 마커는 치료적 특성을 지닐 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이를 사용할 수도 있다. 폴리펩티드의 표지의 비제한적인 예로는 방사성동위체 또는 방사핵종(예,³H,¹⁴C,¹⁵N,³⁵S,⁹⁰Y,⁹⁹Tc,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I), 형광 표지(예, FITC, 로다민, 란타니드 인), 효소 표지(예, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학적발광, 비오티닐기, 2차 리포터에 의해 인지되는 소정의 폴리펩티드 에피토프(예, 류신 지퍼쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 표지) 등이 있다. 몇몇의 실시태양의 경우, 표지는 다양한 실이의 스페이서 아암에 의해 부착되어 잠재적인 입체 장애를 감소시키게 된다.

용어 "약학적 제제 또는 약물"은 환자에게 적절하게 투여되었을 경우 소정의 치료 효과를 유발할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 의미한다. 기타의 화학적 용어는 당업계에서의 통상의 의미로 사용하였으며, 그 예로는 본 명세서에서 참고로 인용하는 참고 문헌(Parker, S. 편저, The McGraw Hill Dictionary of Chemical Terms, 맥그로힐, 샌프란시스코 (1985))을 참조한다.

용어 "휴지 T 세포 및 휴지 B 세포에 실질적으로 비독성이다"라는 것은 바람직하게는 활성화된 T 세포 및 B 세포의 고갈도보다 휴지 세포의 고갈도가 2 배 이상으로 낮게 보체의 존재하의 항체가 발생하는 것을 의미한다. 활성화된 세포의 고갈도와 비교하여 휴지 세포의 세포 고갈도가 5 배 이상 낮은 것이 더욱 바람직하다.

ABX-CBL 항원 확인 및 특성화

본 출원인은 ABX-CBL 항체를 (i) 면역친화도 정제 접근법 및 (ii) 통상의 단백질 정제 접근법에 결부하여 항원의 확인 및 특성화에 대한 주요 접근법 2 가지에 대해 논의하고자 한다.

면역친화성 정제

본 출원인은 CBLl 항체가 결합된 항원의 면역친화성 정제에 대해 논의하고자 한다. CBL1 항체가 결합되어 있는 항원은 참고문헌[Foley et al. Cancer 18:522-529 (1965)]으로부터 유도되고, 미국 매릴랜드 록빌에 소재하는 ATCC(ATCC No. CCL-119)로부터 입수가능한 T 림프아구 세포주인 CEM 세포상에서 크게 형질발현되는 것으로 나타났다. 천연의 ABX-CBL 항체를 사용하는 면역친화성 정제는 ABX-CBL 항체가 5량체 구조를 갖는 IgM 항체이고, 시험관내 비특이적 상호반응을 일으키기가 쉽다는 사실에 직면하게 된다. 그러므로, 본 출원인은 CEM 세포에 대항한 사람의 IgG2 항체를 제조하고, CEM 세포를 사용한 결합 분석에서 ABX-CBL 항체와의 경쟁에 대해 테스트하였다. 이와 같은 사람 항체는 본 명세서에서 참고로 인용하는 참고 문헌[Mendez et al. Nature Genetics 15:1466-156 (1997)] 및 1996년 12월 3일자로 제출된 미국 특허 출원 제08/759,620호에 의해 CEM 세포를 사용한 면역화 XemoMouse^TM동물을 통해 제조한 후, 융합시키고, ABX-CBL 항체를 사용하는 FACS 경쟁 분석으로 CEM 세포에 대항하는 하이브리도마 상청역을 스크리닝하였다. FACS 경쟁 불석에서, FITC를 사용하여 표지된 ABX-CBL 항체의 결합 억제를 단독으로 그리고 CEM 세포와 반응성을 갖는 사람 항체를 포함하는 하이브리도마 상청액의 존재하에 분석하였다.

이와 같은 방법으로 4 개의 하이브리도마 클론을 분리하고, 이를 CEM 세포로의 결합에서의 ABX-CBL 항체와 경쟁력이 큰 것으로 측정되었다. 2.6.1로 표기된 하나의 하이브리도마를 추가의 분석에 대해 선택하였다. 본 출원인은 SCID 마우스에서의 2.6.1 하이브리도마를 포함하는 각각의 하이브리도마에 복수(ascite)를 생성하였으며, 표준의 조건을 사용하여 단백질 A 친화도 정제 기법을 사용하여 2.6.1 항체를 정제하였다. 정제된 2.6.1 항체로부터 본 출원인은 면역친화성 컬럼을 제조하였다. 컬럼을 제조하기 위해, 정제된 2.6.1 항체를 제조업자의 지시사항에 따라서 CNBr 활성화된 세파로스-4B로 콘쥬게이트시켰다. 항체 약 8.4 ㎎을 활성화된 세파로스 약 2.0 g에 콘쥬게이트시켰다. 본 출원인은 컬럼을 통해 CEM 세포의 세포 용해물을 통과시키고, 결합된 성분을 용리시켰다. 용리 생성물을 웨스턴 블롯팅으로 분석하고, ABX-CBL 항체 및 2.6.1 항체 모두를 사용하여 프로빙하였다. 1차적인 데이타를 기준으로 하여 2.6.1 항체는 약 45∼55 KD의 확산 밴드내에 함유된 분자(들)에 가장 강력하게 결합되며, ABX-CBL 항체는 약 45∼55 KD의 유사 확산 밴드에 낮은 강도로 결합하는 것으로 나타났다. 정제 겔 전기영동 및 일렉트로블로팅 기법을 사용하므로써, 본 출원인은 45∼55 KD 뱐드의 부분을 분리하고, 분자의 부분 아미노산 서열(35/40 잔기)을 얻었다. 생성된 서열 정보를 단백질 데이터베이스 검색(Protein Identification Resourse(PIR) R47.0, 1995년 12월)로 분석하고, 서열 비교 데이타에 의해 분자가 CD147이라는 것을 알아냈다.

단백질 정제 및 서열화

ABX-CBL 항체가 결합된 항원의 특성화와 관련한 본 출원인의 연구에 있어서, 본 출원인은 35 KD 및 62 KD에서 웨스턴 블롯상에서 비교적 날카로운 밴드가 편재된 분자에 ABX-CBL이 상당량 결합되어 있다는 것을 알았다. 이러한 35 KD 밴드의 강도는 배양 기간 및 기타의 완전하게 이해되지 않는 조건에 따라서 준비 조건에 따라 변화되는 것으로 나타났다. 그러므로, 본 출원인은 초기에 62 KD 물질을 정제하였다. N-말단이 차단되어 있기 때문에, 본 출원인은 CNBr을 사용하여 단백질을 분해하고, 분해로부터 생성된 펩티드 2 개를 서열화하였다. 생성된 서열 정보를 단백질 데이타베이스 검색(Protein Identification Resourse (PIR) R47.0, 1995년 12월)으로 분석하고, 서열 비교 데이타에 의하면, 분자는 이종 리보핵 단백질 k(hnRNP-k)인 것으로 나타났다. 이러한 분자는 세포내 성분이며, 이에 따라서 ABX-CBL 항체가 세포외 성분을 인식하는 것으로 나타난 관찰에 부합되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분자의 확인은 예를 들면 에피토프 규명과 관련하여 ABX-CBL의 CD147로의 결합에 대한 추가적인 이해와 관련하여 유용할 수도 있다.

또한, 35 KD 밴드의 특성화는 유사한 이유로 취급될 수 있다. 이와 같은 접근법에서, 35 KD 분자는 전술한 62 KD 밴드와 관련하여 사용되는 것과 유사한 방식으로 정제될 수 있다. 35 KD로부터 정제된 물질을 특성화하여 45-55 KD CD147 밴드에 함유된 물질 사이의 임의의 잠재적인 구조상 차이점에 대한 추가의 이해를 돕는다. 35 KD에 함유된 물질을 서열화하여 이러한 물질이 CD147이라는 것을 입증하거나 또는 ABX-CBL의 CD 147로의 결합과 관련한 에피토프 정보를 결정한다.

CD147 결합의 추가의 규명 및 ABX-CBL의 에피토프 분석

전술한 바와 같이, 또다른 연구 분야는 ABX-CBL 항체의 CD 147 분자에 대한 결합의 규명과 관련되어 있다. ABX-CBL 항체의 안전성 및 효율로 인해서, 본 출원인은 ABX-CBL 항체의 CD147로의 결합을 모사하는 분자, 특히 항체는 유사한 안전 프로파일을 지녀야할 것으로 예상한다. 그래서, ABX-CBL 항체의 CD147로의 결합에 대한 추가의 이해를 돕기 위해, 본 출원인은 이를 규명하기 위한 실험에 착수하거나 또는 디자인하였다. 본 출원인의 실험은 (i) CD147의 클로닝 및 진핵성 (COS) 세포의 형질발현, (ii) 원핵성(E. 콜리) 세포에서의 형질발현 및 (iii) 파지 디스플레이 기법을 사용하는 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝 등이 있다.

CD147의 클로닝 및 COS 세포의 형질발현

본 출원인은 감염을 위한 구조물을 생성하는 쥬르캇 라이브러리(Stratagene)으로부터의 CD 147 cDNA를 클로닝시키고, CD147 cDNA를 사용하여 COS 세포를 감염시켰다. 감염된 세포를 ABX-CBL 항체, 2.6.1 항체 및 전술한 파밍겐 항체와 관련하여 FACS 분석 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 CD147의 형질발현에 대해 분석하였다. CD147 cDNA로 감염된 COS 세포는 FACS 및 웨스턴 블롯 분석 각각에서 항체 각각에 결합된 것으로 나타났다. 반대로, 대조군 벡터로 감염된 COS 세포는 2.6.l 및 ABX-CBL 항체 각각과의결합에 대해 음성을 나타내었다. 파밍겐 항체와 관련하여서는, FACS에서 대조군 벡타로 감염된 세포에서 특정의 배경 염색이 관찰되었으며, 웨스턴 블롯 분석에서는 결합이 없는 것으로 나타났다. 감염된 세포는 FACS에서의 배경에 대해 상당한 결합이 형성된 것으로 나타났으며, 웨스턴 블롯 분석에서는 양성으로 나타났다. 이러한 결과에 의하면, ABX-CBL 및 2.6.1 항체는 CD147에 결합되는 것으로 확인되었다.

E. 콜리 세포에서의 CD147

약간 변형된 벡터를 사용하여 본 출원인은 CD147 cDNA를 사용하여 E. 코리를 감염시켰다. 이와 같이 하여 감염된 E. 콜리 세포는 ABX-CBL, 2.6.1 및 파밍겐 항체 각각의 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 입증된 바와 같이 CD147 분자의 형질발현이 가능하였다. 원핵성 E. 콜리 세포가 형질발현된 CD147를 글리코실화하지 않았기 때문에, E. 콜리에 의해 형질발현된 CD147의 분자량은 CD147의 글리코실화되지 않은 예상 분자량 약 27 KD에 근접하여야 한다. 실제로, 각각의 경우에 있어서, 웨스턴 블롯 분석에서의 3 종의 항체의 결합은 약 27 및 30 KD 사이의 밴드에서 관찰되었다.

이러한 데이터는 ABX-CBL 및 2.6.l 항체가 추가로 CD147에 결합된다는 것을 확인할 수 있다. 추가로, CD147로의 ABX-CBL 결합은 탄수화물 결합과 직접적으로관현되지 않았으며, 즉 ABX-CBL은 CD147 상의 탄수화물 에피토프에 직접적으로 결합되지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, 이러한 데이타는 CD147로의 결합이 탄수화물 또는 글리코실화 반응의 존재에 의해 영향받을 수도 있는 가능성을 배제하지는 않았다.

파지 디스플레이를 이용한 스크리닝

CD147로의 ABX-CBL 항체의 결합을 추가로 규명하기 위해, 본 출원인은 파지 디스플레이 실험에 착수하였다. 이러한 실험은 결합된 펩티드를 분리할 수가 있나 하는 것을 결정하기 위해 ABX-CBL 및 2.6.l 항체를 사용한 결합에 대해 파지 라이브러리 형질발현 랜덤 펩티드를 패닝하여 실시하였다. 이것이 성공적일 경우, 특정의 에피토프 정보는 결합된 펩티드로부터 수집될 수 있다.

일반적으로, 파지 라이브러리 형질발현 랜덤 펩티드는 박테리오파지 M13 시스템을 기준으로 하여 뉴 잉글런드 바이오랩스에서 시판된다(7-mer 및 12-mer 라이브러리, Ph.D.-7 펩티드 7-mer 라이브러리 키트 및 Ph.D.-12 펩티드 12-mer 라이브러리 키트 각각). 7-mer 라이브러리는 약 2.0×10⁹독립적 클론의 다양성을 나타내며, 전부다는 아니지만, 대부분의 20⁷= 1.28×10⁹이 가능한 7-mer 서열을 나타낸다. 12-mer 라이브러리는 약 l.9×10⁹독립적 클론을 함유하며, 이는 20¹²=4.1×10¹⁵12-mer 서열의 잠재적 서열 스페이스의 매우 작은 샘플링을 나타낸다. 각각의 7-mer 및 12-mer 라이브러리는 제조업자의 추천사항에 따라 패닝 및 스크리닝하는데, 여기서, 평판을 항체로 코팅시켜 적절한 항체(2.6.l 항체의 경우 염소 항-사람 IgG Fc 및 ABX-CBL 항체의 경우 염소 항-마우스 μ쇄)를 포획시킨 후, 세척하였다. 결합된 파지를 0.2 M의 글리신-HC1, pH 2.2로 용출하였다. 일정한 엄증도 (0.5% Tween)에서의 선택/증폭 3 회후, DNA 서열화를 이용하여 본 출원인은 ABX-CBL 항체와 반응성이 있는 12-mer 라이브러리로부터의 6 개의 클론 및 7-mer 라이브러리로부터의 5 개의 클론 및 2.6.1 항체와 반응성이 있는 7-mer 및 12-mer 라이브러리 각각으로부터의 총 6 개의 클론을 특성화하였다. 펩티드의 반응성을 ELISA로 측정하였다. 펩티드의 에피토프 분석의 추가의 논의에 대해서는 참고 문헌[Scott, J.K. 및 Smith, G.P. Science 249:386-390 (1990); Cwirla et al. RNAS USA 87:6378-6382 (1990); Felici et al. J Mol Biol 222:301-310 (1991) 및 Kuwabara et al. Nature Biotechnology 15:74-78 (1 997)]을 참고한다.

어떠한 일치 서열도 CD147을 갖는 2.6.1 항체와의 반응성에 대해 명확하지 않았다. 그러나, CD147의 아미노산 서열에 대한 특성화된 7-mer 및 12-mer 서열의 서열 배열로 인해서 잔기 번호 177에서 잔기 번호 188(ITLRVRSH (서열 번호: l))의 CD147내의 단일 서열에 대해 다수가 일치하였다. 특히 7-mer 포함 서열 각각은 이러한 CD 147의 서열내의 3 이상의 잔기에 일치한다(*로 표시함).

추가로, 12-mer 함유된 서열의 4는 CD147의 서열 내에서의 3 이상의 잔기와 일치하고(*로 표기함) 12-mer 펩티드 번호 1은 4가 일치하고, 12-mer 펩티드 번호 2는 6이 일치한다.

이러한 결과는 서열화된 클론의 10에 존재하는 RXRS (서열 번호: 11)의 일치 서열을 나타낸다. 따라서, 본 출원인은 하기의 서열(-OH는 카르복시 말단을 나타냄)을 갖는 잔기 169-183이 이르는 합성 펩티드(미국 캘리포니아주 새너제이에 소재하는 애너스펙 인코포레이티드)를 생성하였다.

이하에서, CD147의 아미노산 서열은 2중의 밑줄로 나타낸 15-mer 펩티드 서열 및 굵은 체로 나타낸 RXRSH (서열 번호:13) 일치 서열이 제공된다. 또한, CD147의 추정의 N-결합된 글리코실화 부위는 밑줄 및 이택릭체로 나타내었다.

15-mer 펩티드를 ELISA를 사용하여 분석하였으며, 이는 ABX-CBL 항체가 펩티드에 특이적으로 결합되었다는 것을 측정하였다. 추가로, 2.6.l 항체 또는 대조군 쥐의 IgM 항체 어느 것도 펩티드에 결합되지 않았다. 그러나, CD147 항원 및 15-mer 펩티드 사이의 경쟁 연구를 토대로 하여, ABX-CBL 항체의 15-mer 펩티드에 대한 결합은 15-mer 펩티드가 평판상에 코팅되고, 펩티드가 용액중에는 존재하지 안는 경우에만 측정하였다. 사실상, ABX-CBL 항체가 평판에 코팅된 CD147 항원 또는 펩티드에 결합되는 경쟁 실험에서, ABX-CBL 항체는 고농도에서조차 용액중의 펩티드를 제거하거나 또는 이를 대체하지 않았다. 그럼에도 불구하고, 15-mer 펩티드에의 ABX-CBL 항체의 결합은 CD147 항원 및 비특이적 항원(예, 세포막 또는 사람 혈장으로부터 분리된 L-셀렉틴)이 아닌 전술한 양성의 파지 제제 또는 전술한 음성의 파지 제제에 의해 특이적으로 경쟁할 수도 있다. 유사하게, CD147 항원에의 ABX-CBL 항체의 결합은 예비항온처리를 사용한 경쟁 분석에서의 음성의 파지 제제와 비교하여 양성의 파지 제제와 특이적으로 경쟁할 수 있다.

이러한 결과는 일치 서열 RXRSH를 함유하는 CD147내의 서열이 CD147로의 ABX-CBL 항체의 결합에 중요하기는 하나, 이는 CD147에의 ABX-CBL의 결합을 완전하게 설명하지는 않는다. 사실상, 이러한 데이타는 평판에 결합시의 15-mer 펩티드 중에서 또는 파지 코팅 단백질에 구속된 경우 반응성 파지 물질에 함유된 일치 서열은, 용액중의 유리 펩티드보다 훨씬 강하게 ABX-CBL 항체에 결합된다는 것을 암시한다. 특정한 임의의 이론 또는 작동 모드에 국한시키고자 하는 것은 아니나, CD147은 용액 중의 15-mer 펩티드 내에서 잘 모사되지 않는 특정의 입체구조를 갖는다. 그럼에도 불구하고, 전술한 에피토프 정보는 ABX-CBL 항체가 CD147에 결합되는 방식에 대한 이해 및 치료 표적으로서 CD147에 대한 기타의 후보 분자를 생성하는데 있어서 중요하게 된다.

CD147내의 RXRSH 일치 서열의 존재와 관련한 상기의 결과 이외에도, 본 출원인이 ABX-CBL 항체가 CD147에 결합되는 것으로 나타난 hn-RNP-k 단백질 내의 컨센서스 서열의 존재를 찾았다는 것은 흥미로운 일이다. 이러한 분석은 전술한 파지 유도된 펩티드에 대항한 서열 배열에 의해 수행된다. 2 가지의 서열은 통계학적으로 흥미로운 일치를 갖는 것으로 밝혀졌다.

우선, 7-mer 펩티드 번호 4를 갖는 5 아미노산의 일치(*로 표시)가 있다.

두번째로, 12-mer 펩티드 번호 1를 갖는 5 아미노산의 일치(*로 표시)가 있다.

hn-RNP-k 단백질의 아미노산 서열은 하기에 2중의 밑줄로 나타낸 서열로 제공된다. 또한, 다수의 RXR 서열 모티브는 밑줄로 표시한 hn-RNP-k 단백질 서열내에 존재한다.

특정의 이론과 작동 모드에 국한시키고자 하는 의도는 아니나, hn-RNP-k 단백질에의 ABX-CBL 항체의 결합이 단백질 내의 이들 모티브의 존재에 의해 부분적으로 설명될 수도 있다.

항원 식별 및 분석 결과의 토의

ABX-CBL 항체는 CEM 세포 용해물 중의 35 KD 밴드보다도 더 적은 강도를 갖는 45-55 KD 밴드에 결합하는 것으로 나타났다는 사실이 흥미롭다. 그러나, ABX-CBL 항체의 특정의 이론과 작동 모드에 국한시키고자 하는 의도는 아니나, 35 KD 밴드는 또다른 에피토프를 나타낼 수 있거나 또는 CD147의 대체의 형탸가 될 수 있다, 사실상, 전술한 바와 같이, CD147의 대체 스플라이싱 또는 차동 글리코실화 반응에 대해서는 문헌에서 입증되어 잇다. 참고 문헌[Kanekura et al. Cel1 Struct Funct 16:23-30 (1991) (Basigin); Schlosshauer B Development l13:129-140 (l991)(뉴로텔린); Fadool JM ＆ Linser PJ J Neurochem 60:1354-136 (1993) (5Al1/HT7), Nehme et a1. J Cell Biol 120:687-694(1993) (CE9); DeCastro et al. J Invest Dermato1 106:1260-1265 (1996)(EMMPRIN); Spring et al. Eur J Immuno1 27:891-897 (1997) (Ok^a)]. 이와 같은 일화거리가 많은 증거는 35 KD의 밴드가 CD147의 단일 글리코실화에 해당할 수 있다는 것을 나타낸다. 참고 문헌[Kanekura et al. Cel1 Struct Funct 16:23-30 (1991)]. 추가로, ABX-CBL 및 2.6.l 항체에 대한 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 파밍겐에서 입수가능한 36901A(항-CD147 IgGl 항체) 및 미국 뉴저지주 플랜더즈에 소재하는 RDI에서 입수한 항-CD147 항체(RDI-CBL535(항-CD147 IgG2 항체)의 2 가지의 통상적 입수가 가능한 것에 의해 생성된 웨스턴 블롯의 비교에서, 상업적으로 입수가 가능한 각각의 항체는 ABX-CBL 항체에 의해 인식되는 35 KC 밴드와 유사한 것으로 나타났고 분자량이 약 35 KD인 문자를 인식하는 것으로 나타난 사실이 흥미롭다. 그러나, 45-55 KD 확산 밴드는 더 강력하다. 도 l 참조.

예비적인 데이타를 기준으로 하여 또 다른 흥미로운 관찰로는 2.6.l 항체로부터의 유출물 생성물이 ABX-CBL 항체를 사용하여 프로빙할 경우의 전술한 면역친화성 정제의 경우 35 KD 밴드는 더이상 웨스턴 블롯에 의해 가시화되지 않는다는 점이다. 그대신, ABX-CBL 항체는 비교적 낮은 강도를 갖는 45-55 KD로부터의 확산 밴드에 결합하는 것으로 나타났다.

추가로, 파지 디스플레이 실험에서의 결과에 의하면, ABX-CBL 항체 및 2.6.l 항체가 상이한 에피토프에 결합된다는 것을 나타낸다. 그러나, E. 콜리에서의 CD147의 형질발현과 관련하여 그리고 파지 디스플레이 연구를 토대로 하면, ABX-CBL 항체는 CD147 및 글리코실화의 단백질 에피토프를 단독으로 인식하지만, CD147로의 ABX-CBL 결합에 대해서는 그 원인이 되는 것으로 보이지는 않는다.

그럼에도 불구하고, 전술한 사항을 모두 고려하면, 이러한 결과 및 데이타에 의해 ABX-CBL 항체가 CD147 항원에 결합된다는 것을 알 수 있다. 그러나, ABX-CBL 항체는 2.6.1 또는 상업적으로 입수가 가능한 항체에 의해 인지되는 것과는 상이한 에피토프를 선택적으로 인식하는 것으로 나타났다. ABX-CBL 항체가 CD147 항원에 결합한다는 이와 같은 발견은 특정의 세포 상에서 형질발현된 CD147의 형태가 질환의 치료에 대한 생존가능한 치료적 표적이 된다는 것을 암시한다.

CD147 요법의 모드에 대한 작용적 이해

전술한 바와 같이, CBL1 항체는 환자의 GVHD의 치료에 광범위하게 사용된다. 사실상, 수많은 GVHD 환자들은 높은 성공율을 갖는 CBL1 항체를 사용하여 처치되어 왔었다. 각막 및 신장 이식편 연구에서도 유사한 효능을 갖는 것으로 나타났다. 추가로, 안전성 문제 또는 부작용에 대한 어떠한 징후도 나타나지 않았다. 전술한 바와 같이 CD147가 사람의 다양한 조직 및 세포 중에서 폭넓게 형질발현된다는 것은 놀라운 일이다. CD147에 대한 항체는 다양한 부작용을 야기할 수 있다는 점이 우려된다. 따라서, 본 출원인은 GVHD의 반전과 관련성이 있는 모델에 집중된 CBL1 항체가 작동하게 되어 질환을 처치하는 메카니즘을 연구하고자 하였다. 이러한 메카니즘의 이해는 어째서 CBL1 항체가 환자에게 있어서 효능이 있는지에 대한 원인을 규명하고, 질환의 치료시에 CBL1 항체가 결합되는 항원 CD147을 사용하는 방법에 대한 이해를 제공하는 것을 도울 수 있다.

질환의 치료에서의 CBL1 항체의 안전성 및 특이성과 관련된 가능한 설명이 수개 존재한다. 이의 비제한적인 예로서는 (i) 보체 매개된 세포 사멸(보체 의존성 세포독성, CDC)의 독특한 역할, (ii) 특정 세포의 활성화시에 CBL1 결합 및 세포 사멸에 민감해지는 것, (iii) 세포가 CBL1 유발된 CDC에 내성을 갖게 되는 특정의 세포 군집에서의 특정의 보호 요소가 존재하는 것, (iv) CD147 형질발현도는 주어진 세포의 군집에서 높은 것(이는 CDC와 관련이 있음) 및 (v) 전술한 바와 같은 특정의 세포 군집에서 형질발현되는 CD147의 특정 형태에 CBL1 항체가 결합하는 것 등이 있다.

세포의 보체 매개된 사멸

CBL1 항체와 관련된 보체 매개 세포 사멸(보체 의존성 세포독성, CDC)의 역할은 상기에서 연구하였으며, 본 출원인은 이의 역할을 광범위하게 추가로 연구하고자 한다.

CBL1을 사용한 과거의 연구

전술한 UCLA 그룹(예, 미국 특허 제5,339,896호 및 동제5,643,740호)은 항체가 비활성화된 세포와 반응하지 않으면서, CBL1 항체가 특정의 활성화된 세포 군집의 사멸에 의해 작동하는 확실한 증거를 제시하였다. 예를 들면, 미소세포독성 분석에서, CBL1 항체는 활성화된 림프구를 사멸시키나, 비활성화된 림프구 또는 기타의 정상 세포는 사멸시키지 못하는 것으로 개시되었다. 또한, 이 특허 문헌에서는 세포 사멸이 세포의 보체 매개 사멸에 의해 작동되는 것으로 개시되어 있다.

CDC의 역할의 추가의 입증

사실상, 본 출원인의 연구에서, CBL1 및 ABX-CBL는 보체 매개된 세포 사멸을 통해 작동되는 것으로 입증되었다. 이러한 연구에서는 혼합된 림프구 반응(MLR) 분석 또는 변형된 MLR 분석을 사용하였다. MLR 분석은 이위치에서 활성을 갖는(alloreactive) T 림프구의 증식을 분석하는 시험관내 시스템을 제공한다. 이와 같은 방법으로, MLR 분석은 골수 이식편(BMT)을 수용하는 환자에게서의 GVHD의 우수한 모델이 된다. MLR 분석에서, 2 명의 환자로부터의 MHC 불일치 림프구를 동시 배양하였다. 통상적으로 분석은, 한 환자로부터의 림프구는 예를 들면 방사("자극체")에 의해 불활성화되고, 다른 환자로부터의 림프구는 "반응체"로서 작용하고, 증식하며, 광범위한 블래스트 변형을 겪게 되도록 설정한다. 적절한 동시배양 기간 경과후, 세포의증식도는 3중수소 표지된 티미딘([³H]티미딘)을 배양 뱌지에 첨가하고, 반응체 림프구의 DNA로의 표지의 흡수를 모니터하므로써 정량화시킬 수 있다.

이러한 연구에서, CBL1 항체 단독으로, 아이소타입 일치된 대조균 마우스 IgM 항체 단독으로(도 2) 도는 보체(시람 또는 토끼) 단독의 MLR 또는 ConA 유발된 림프구 증식 분석에서의 사용은 T 세포의 증식 억제에 효과적이지가 않았다. 도 2∼5 참조. 그러나, 보체 및 CBL1 및/또는 ABX-CBL 항체가 모두 존재하는 경우에는 T 세포 증식이 투여량 의존 방식으로 억제된다. 도 2∼5 참조. 사람의 IgG2 항체 2.6.l은 단독으로 또는 보체와의 조합으로 동일한 분석에서 T 세포 증식을 억제하는데 효과적이지가 않다. 도 5 참조. 이는 감마-2 아이소타입으로서 2.6.l 항체가 CBL1 또는 ABX-CBL 항체와 같은 IgM 항체보다 상당 효율이 낮기 때문인 것으로 예상된다.

세포 활성도의 역할

또한, 본 출원인은 특정의 세포가 활성화될 경우 ABX-CBL 결합 및 세포 사멸에 민감해지는지의 여부에 대하여 연구하였다.

사실상, 본 출원인은 T 세포 활성화 마커, CD25(IL-2 수용체의 알파-2 서브유닛)는, ABX-CBL 항체가 결합되는 항원을 형질발현시키는 것과 동일한 세포성 군집 중에서 고도로 형질발현되는 것으로 나타난 것을 입증하였다. 도 6 참조. 이러한 발견은 MLR 분석과 관련하여 활성 세포가 결실되었는지의 여부를 측정하는 마유용한 마커를 제공한다. MLR 분석이 ABX-CBL 단독으로, 보체 단독으로, 또는 ABX-CBL와 보체의 조합을 사용하여 수행하는 경우, ABX-CBL 및 보체를 조합하여 사용하는 실험에서만이 세포 군집을 형질발현시키는 CD25가 결실되어 있다. 도 7∼11 참고. 특히 도 8은 CD25를 낮은 정도로 형질발현시키는 것을 도시한다. 상이한 세포 군집의 선택적 사멸은 도 10∼12에 도시되어 있다.

CDC에서의 CDl47의 형질발현도 또는 밀도의 역할

본 출원인은 CD147 형질발현도가 CDC와 상관관계를 지닐 수 있는 세포의 소정 군집에서 높은지의 여부를 고려하였다.

ABX-CBL 항체를 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)을 사용한 유동 세포계산 연구에서, 본 출원인은 보체를 첨가하기 이전에, CD147을 크게 또는 낮게 형질발현시키는 것으로 나타난 세포의 군집이 존재한다. 보체를 첨가한 후에는 전술한 낮은 형질발현에 해당하는 세포 군집이 존재한다. 이러한 결과는 세포 표면 상에서의 CD147 형질발현도의 밀도를 나타내는 것이다. 밀도는, 보체 다단계를 개시하는 제1의 단계인 세포 염좌가 발생하는 추가의 항원 결합 부위를 제공하므로써 CDC에서 작용하게 되는 것이다. 항체의 염좌시에는, 인자 c l가 우선 결합하게 되고, 다단계가 진행된다.

세포성 군집 중의 CD147의 형질발현도(또는 밀도)가 ABX-CBL 항체의 치료 효능에 작용하는지의 여부는 다양한 세포성 군집에서의 CD147 분자의 형질발현도의 분석을 통해 분석할 수있다. 일반적으로 표면 상에서의 각종 기지의 함량의 CD147을 포함하는 비이드를 제조하고, FACS상에서 분석하여(즉, FITC 표지된 항-CD147 IgG 항체를 사용함) 비이드 상에서의 상이한 함량의 항원의 약 10∼20개의 데이타 포인트를 생성하는 실험을 수행하였다. 이러한 데이터로부터 선형 회귀 곡선을 작성하였다. 그후, CD147 항원을 형질발현하는 세포를 FACS를 통해 수행할 수 있으며, 세포의 표면의 항원의 상대량을 선형 회귀 곡선으로부터 계산할 수 있다.

세포성 군집에서의 보호 요소의 존재 및 역할

본 출원인은 보체의 고정 및 ABX-CBL 결합에 의해 야기되는 CDC를 억제하는 특정 세포성 군집에서의 특정 세포성 보호 요소 사이의 상관관계의 존재 여부에 대해 연구하였다.

이와 같은 연구와 관련하여, 본 출원인은 이러한 세포가 (i) 사멸하였는지, (ii) 그러할 경우 보체 개입된 용해와 유사한 메카니즘이 존재하는지를 고려하고 ABX-CBL 항체가 결합하는 다양한 세포에 대해 연구하였다. 이러한 실험에서, 다수의 세포에 결합되는 ABX-CBL 항체(그리고, ABX-CBL 항체가 이러한 세포상에서 형질발현되는 항체)를 찾았다. ABX-CBL 항체가 결합되는 세포를 ABX-CBL 항체 및 보체를 사용한 처치를 통해 보체 매개된 용해에 대해 테스트하였다. 각각 ABX-CBL 항체를 결합시키는 2 개의 T 세포주(CEM 및 주르캇 세포), 단핵구 주(U937 세포) 및 3 개의 종양 세포주(A431(상피암), SW9118 (결장암), 및 MDA468 (유방암))를 조사하였다. 이러한 세포주에 대한 형질발현에도 불구하고, ABX-CBL 항체는 CEM T 세포주 및 U937 단핵세포주에 국한된 세포가 사멸하는 것에 대해 특이성이 크다. 도 13 참조. 본 출원인은 하기와 같은 2 개의 내피 세포주를 분석하였다. (i) ECV-30z1 (ATCC CRL-1998)이 EC 특성을 수반하며, 외형상 정상의 사람의 제대의 정맥으로부터 형성된 순간 변형된 불사의 EC이고, (ii) HUVEC-C (ATCC CRL-1730)는 정상의 사람 제대의 정맥으로부터 유도된 EC 주이다. FACS를 사용하여 각각 2.6.1, 파밍겐 및 ABX-CBL 항체에 대해 각각 양성 염색된 ECV-304 및 HUVEC-C 주는, 이러한 EC가 표면 상에서 CD147울 형질발현한다는 것을 암시한다. 그후, 본 출원인은 시험관내 알라마 블루계 CDC 분석을 수행하였으며, 두 EC 세포주는 사람 보체의 존재하에 ABX-CBL 매개 CDC에 대해 내성을 갖는 것으로 입증되었다. 도 17 및 18 참조.

모두 CD147을 형질발현시키는 것으로 나타난 세포가 보체의 존재하에 ABX-CBL 항체에 의해 사멸되지 않은 이유를 명확히 이해하기 위해, 본 출원인은 이러한 세포 중에서의 CD46, CD55 및 CD59 형질발현을 조사하였다. 각각의 CD46(막 보조인자 단백질, MCP), CD55 (분해 촉진 인자, DAF), 및 CD59 (막 공결 착체 억제제, MACI)는 보체 억제성 분자로서 관련되어 있다. 참고 문헌[Liszewski et a1. Annu. Rev. Immuno1. 9:431 (1991) 및 Loveland et al. "Coordinate functions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59" Transpl. Proc. 26:1070 (1994)]는 CD46과 연관되어 있으며, 참고 문헌[Kinoshita et a1. "Distribution of decay-accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal noctumal hemoglobinuria" J Exp. Med. 162:75 (1985) 및 Loveland et al. "Coordinate functions of multiple comp1ement regulating molecules, CD46, CD55 및 CD59" Transp1. Proc. 26:1070 (1994)]는 CD55와 관련되어 있으며, 참고 문헌[Whit1ow et al. "H19, a surface membrane molecule involved in T-cell activation, inhibits channel formation byhuman complement" CelI. Immuno1. 126:176 (1990), Loveland et a1. "Coordinate fuinctions of multiple complement regulating molaules, CD46, CD55 and CD59" Transpl. Proc. 26:1070 (1994) 및 Davies, A. 및 Lachmann, P.J. "Membrane defense against complement lysis: the structure and biological propmies of CD59" Immuno1. Res. 12:258 (1993)]은 CD59와 관련 있다. 따라서, 본 출원인은 상기에서 테스트한 세포주에 대한 이들 분자 중 하나 또는 둘다가 차동 형질발현됐는지의 여부를 고려하였다. 사실상, CEM 주 및 U937 주를 제외한 모든 세포는 분자 모두에서 형질발현되었다. 그리고, 사실상, 내피 세포주 ECV-304는 CD46, CD55 및 CD59 모두를 형질발현시켰다. 도 19 및 20 참조. 반대로, CEM 주는 CD59만을 형질발현시키고, U937 주는 CD55만을 형질발현시켰다. 도 l4 참고. 이러한 데이타는 ABX-CBL에 의해 선택적으로 근절시킬 수 있고, 본 발명에 의한 항-CD147과 관련하여 표적화될 수 있는 세포의 예측과 관련하여 유효하다.

ABX-CBL/CD147계 요법의 기능 토의

전술한 사항으로부터, CBL1 및 ABX-CBL은 보체의 활성화를 통해 세포를 사멸시키는 것으로 작용한다. ABX-CBL 및 보체의 조합은 활성화된 T 세포(CD4⁺및 CD8⁺모두), 활성화된 B 세포 및 단핵구만을 사멸시키나, 휴지 T 세포 및 B 세포에는 작용하지 않는데, 이는 이러한 세포가 활성화된 세포와 동일한 정도로 CD147를 형질발현시키지 않기 때문이다. 단핵구는 또한 ABX-CBL 및 보체에 의해 사멸되는 것이 중요하다. 이러한 데이터는 GVHD와 같은 질환에서의 ABX-CBL 요법의 작용에 대한 설명을 제공하나, 이는 ABX-CBL이 추가의 T 세포 활성화를 야가하는 세포(단핵구 및 B 세포)를 나타내는 항원 및 작용체 세포(활성화된 T 세포 및 B 세포)를 선택적으로 결실시키기 때문이다.

이와 관련하여 ABX-CBL 항체 및 CD147에 대항하는 미래의 치료적 분자의 작용 모드는 (i) 보체 매개된 용해, (ii) 세포성 활성화, (iii) 세포 표면 상에서의 CD147의 밀도 및/또는 CD147의 형질발현도 및 (iv) 세포 표면 상에서의 보체 억제성 분자 1 이상의 형질발현의 부재와 같은 작용 특성과 관련이 있으며, 이에 의해 결정되는 것으로 나타났다.

사실상, ABX-CBL 결합을 모사하는 적합성 및 효율은 ABX-CBL 항체의 예비 조직 분포 연구를 기준으로 하여 강조될 것이다. 이러한 연구에서, ABX-CBL은 다양한 조직을 통해 광범위하게 분포된다. 그러나, 대부분의 분포는 비특이적 결합으로 인한 것으로 생각된다. 그럼에도 불구하고, 내피 세포(소정맥, 소동맥, 그러나 모세모세혈관상은 제외), 평활근 및 약간의 중피에서 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 특히, 림프세망내피성 조직은 결합되는 것으로 나타났으나, 염색은 커다란 림프구, 아마도 활성 아세포로 한정된 것으로 나타난다. 실시된 연구로부터, 세포외 염색으로부터의 세포내를 식별하는 것은 곤란하다. 소정량의 세포질 염색이 분명하게 나타났으며, 이는 hn-RNP-k 결합과 관련있다.

결과 토의: 치료제의 디자인에 대한 ABX-CBL 항체의 활용

CD147 항원과 ABX-CBL 항체를 결합하여 조합한 ABX-CBL 항체를 사용한 시험관내 연구에 의해, 보체 매개된 사멸 가능한 CD147에 대한 항체가 질환의 치료에 대한 유효한 접근법을 제공한다는 1차적 증거를 제공하였다. 또한, CBL1과 ABX-CBL 항체가 많은 조직과 결합하였다는 조직 결합 정보 및 신체 내의 CD147의 광범위한 분포 및 형질발현으로 인해서, CBL1 항체를 사용한 종래의 우수한 임상적 경험은, CBL1 및 ABX-CBL이 특정 세포 상에서 형질발현된 CD147의 형태에 대해 특이성을 갖지 않는 경우 이를 충족시키기가 곤란하며, 보체 매개 세포 사멸과 관련된 기타의 인자는 CBL1 및 ABX-CBL 항체의 효과를 특정 조직 또는 이의 조합 정도로 한정하게 된다.

CDl47계 요법의 일반적인 기준

전술한 사항으로부터, ABX-CBL 항체는 기타의 CD147계 요법의 발단에 대한 강력한 수단을 제공하는 것이 명백하다. 우선, CBL1 및 ABX-CBL 항체를 사용하는 것이 현재까지 매우 안전하기 때문에, ABX-CBL 항체의 결합을 가능한한 근접하게 모사하는 것이 바람직하다. 두번째로는 CBL1 항체의 표면적인 효능으로 인해서, 적어도 초기에는 임의의 신규한 요법이 보체 정착 및 용해를 매개하는 것이 바람직하다. 따라서, 기타의 CD147계 요법의 디자인과 관련하여 치료 후보에서의 ABX-CBL의 작동 모드(또는 작용상의 특성) 및 결합을 모의 실험하는 것을 통해 안전성 및 효능을 얻을 수 있을 것으로 예상된다.

구조 고찰

ABX-CBL 결합의 구조적 측면을 흉내내거나 모방하는 것과 관련하여, 본 발명자들은 ABX-CBL과 유사한 방식으로 CD147에 결합하는 항체를 쉽게 형성할 수 있을 것으로 예측하였다. 전술한 정보와 함께, 본 발명자들은 CD147에 대한 ABX-CBL의 결합에 관련된 3개 이상 세분 레벨을 알고 있다. (i) ABX-CBL은, 우선적으로는 아니더라도, 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구로 구성된 군에서 선택된 세포군에서 발현되는 CD147의 형태에 결합하는 것으로 보이고; (ii) ABX-CBL은 웨스턴 블롯 분석에서 62 KD 및 35 KD 분자 종류에 분명하고 특이적인 결합을 나타내며; (iii) ABX-CBL은 공통 서열 RXRSH가 한정하는 CD147상의 에피토프(및 가능하게는 hn-RNP-k 단백질상의 유사 에피토프)에 매우 특이적인 것으로 보인다. 또한, ABX-CBL은 "구조적으로" 비교하거나, 검색하거나, 또는 경쟁 연구를 통한 CD147에 대한 추가의 항체 후보를 위한 기능 분석으로서 작용하는데 이용할 수 있다.

인식되는 바와 같이, 상기 정보는 추가의 항체 후보의 형성에 대한 고도로 유용한 정보를 제공한다. 또한, 하나 이상의 상기 특성을 보유하는 형성된 항체 후보는 ABX-CBL 항체에 대한 유사한 활성을 더 보유할 것 같다. 다수의 유사한 특성을 보유하는 항체 후보는 ABX-CBL 항체와 매우 유사할 것 같으며, 따라서 ABX-CBL 항체와 유사한 안전성 및 효능 데이타를 나타낼 것이다.

또한, 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 ABX-CBL 결합을 해명하도록 고안된 일부 실험을 통해서 CD147에 대한 ABX-CBL 항체의 결합과 관련된 추가의 정보를 얻을 수 있을 것으로 기대하고 있다. 상기 일부 실험의 예로는 다음과 같은 것들이 있다.

·ABX-CBL 항체에 대한 CD147 결합과 관련된 추가의 지도작성 실험. 이러한 실험 세트 중 하나는 CD147에 결합된 ABX-CBL 항체를 프로테아제로 절단하고, 그 결과의 생성물을 질량 분광기로 검색하고 필요에 따라 이 공정을 반복하는 소모 실험과 관련되어 있다. 또 다른 실험 세트는 ABX-CBL 항체가 인식하는 35 KD 종의 분리, 정제 및 이해에 관한 것이다. 이를 수행하는 한 방법은 62 KD 종(hn-RNP-k 단백질)과 연관된 전술한 35 KD 분자의 고전적인 정제법이다. 또 다른 접근법은, 예컨대 ABX-CBL 항체의 Fab 단편을 형성하고, 2.6.1 항체로 수행된 면역친화 정제와 연관하여 전술한 바와 같이 컬럼에 그 단편을 결합시키는 35 KD 밴드의 면역친화 정제법이다.

·CD147 세포 형성의 이해에 관한 실험. 예를 들어, 세포 표면에 CD147의 형성은 '펄스-추적" 실험을 수행하여 알 수 있다. 이 실험에서, 배양물(Met^(-)배지)내에서 증식하는 세포(예, CEM 세포)는 세포 단백질 합성내로 도입하고자 하는 표지를 위해 충분한 시간 동안 (및 다양한 시간 동안) S³⁵-Met으로 "펄스"시킨다. 이 후, 세포를 "냉" 배지로 세척하고, 세포 표면상에 CD147을 면역침전시켜 자가방사선 사진을 얻을 수 있다. 유효한 대안의 스플라이싱, 글리코실화 레벨 및 기타 발현된 CD147 분자의 형성 차이에 관련된 정보를 얻을 수 있다.

·CD147에 대한 ABX-CBL의 결합력에 있어서 글리코실화 레벨의 역할에 관련된 실험은 각종 글리코시다제와 CD147의 반응[참고: Mizukami 등, J.Immunol. 147:1331-1337 (1991), Schlosshauer Development 113:129-140 (1991), Fadool and Linser J.Neurochemistry 60: 1354-1364 (1993)]과 각종 형태에 대한 ABX-CBL 결합을 고려하여 의문을 해소할 수 있다.

기능 고찰

본 발명에 따라서, 일시에 또는 동시에 항체 후보의 "구조"를 만족시키는지 여부를 결정하면서, 본 발명자들은 항체 후보가 ABX-CBL 항체의 경우와 유사한 방식으로 작동하는지 여부를 결정하는데 사용할 수 있는 세밀한 기능 기준을 제공하는데, 이 기준은 ABX-CBL 항체의 생체내 효능에 중요한 것으로 보인다. 이러한 특징은 (i) CDC를 통한 세포 사멸, (ii) 세포군에서 CD147 분자의 발현 또는 밀도의 겉보기 효과, 및 (iii) 세포군에서 보호성 인자(예, CD46, CD55 및 CD59)의 역할을 포함한다.

인지되는 바와 같이, 상기 정보는 추가의 항체 후보의 형성에 대한 매우 유용한 정보를 제공한다. 또한, 하나 이상의 상기 특성을 보유하는 형성된 항체 후보는 ABX-CBL 항체와 유사한 활성을 보유할 것 같다. 다수의 유사한 특성을 보유하는 항체 후보는 ABX-CBL 항체와 매우 유사하며, 따라서 ABX-CBL 항체와 동일한 안전성 및 효능 데이타를 나타낼 것이다.

생체내 모델

각각의 전술한 특징, 즉 구조 또는 기능 특징을 실질적으로 시험관내에서 수행할 수 있다. 그러나, 물론 치료법 후보로 인간을 처리하기 전에, 항체 후보 작용의 생체내 안전성 및 효능을 확인할 수 있는 생체내 데이타를 얻는 것이 바람직하다. GVHD와 관련하여, 인간에서 치료법 후보의 작용을 고도로 예측할 수 있는 것으로 확인된 일부 동물 모델이 있다. 이러한 모델의 예는 다음과 같다.

·쥐과 모델(Hakim FT ＆ Mackall CL "The Immune System: Effector and Target of Graft-Versus-Host Disease" in Graft-vs.Host Disease(Ferrara et al., eds, 2판, 미국 뉴욕주 마셀 덱커 인코포레이티드(1997))

·개과 모델(Storb et al., Blood 89:3048-3054 (1997); Yu et al., Bone Marrow Transplantation 17:649-653 (1996); Raff et al., Transplantation 54:813-820(1992); and Deeg et al., Transplantation 37:62-65 (1984))

·영장류 피부 이식 모델(Chatterjee et al. Hybridoma 1:369-377(1982) and Billing R. and Chatterjee S. Transplantation Proceedings 15:649-650 (1983))

인지되는 바와 같이, 이러한 모델에서 예측하기 위해서, 항체 후보는 동물의 CD147의 내인성 형태와 반응성이 있어야 한다.

항체의 작제

CD147을 표적으로 하는 치료 분자의 형성이 항체의 형성과 연관되어 있는 우수한 모델. 항체는 비교적 쉽게 형성될 수 있고 용이하게 검색할 수 있다. 최근, 변이 동물로부터 형성된 인간 항체를 통해 통상적인 쥐 항체로부터 상이한 "종류"의 항체를 형성할 수 있게 되었다. 그 범위내에서, 항체는 디스플레이 기법(예, 파지)을 통해 형성할 수 있으며, 쥐 항체 또는 기타 항체를 인간화시킬 수 있다. 이들 기법 중 일부는 하기에 개시되어 있다.

면역화 기법을 통한 항체 형성과 관련하여, 고전적이고 진보된 면역화 기법을 사용할 수 있다. 고전적인 기법에 의해서, 본 발명자들은 동물을 항원, 골수종 세포와 융합된 림프구 세포 및 이로부터 선별된 하이브리도마로 간단히 면역화시킬 수 있다. 진보된 면역화 기법에 의해서, 본 발명자들은 면역화 계획을 편중되게 하거나, 또는 단순히 하이브리도마를 형성하는 대신에 림프구 세포를 사용하여 디스플레이 라이브러리를 직접 형성하고, 예컨대 파지 또는 기타 디스플레이 기법을 사용하여 검색할 수 있다. 이러한 기법은 당업계에서 통상적인 것이며, 하기에 추가로 논의되어 있다. 편중 면역화와 관련하여, CD147로 면역화시킨 다음 펩티드, 예컨대 전술한 15량체 펩티드로 면역화시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어 선택된 에피토프에 대한 특이성 및 친화성을 보유하는 항체를 형성할 확률이 더 높다. 따라서, 전술한 바와 같이 CD147에서 RXRSH 공통 서열에 대한 특이성을 갖는 항체를 더욱 쉽게 형성할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 면역화 기법은 표준 융합 및 검색 절차 또는 진보된 검색 절차와 관련하여 이용할 수 있다. 또 다른 세트의 진보된 면역화 기법은 면역화가 개시된 동물에서 항원 표시 기법(즉, DEC 시스템) 및 면역 반응을 증대시키는 기법(즉, CD140 시스템)에 관한 것이다.

변이 동물로부터 인간 항체 형성

완전한 인간 항체를, 예컨대 변이 동물로부터 형성하는 것은 매우 흥미가 있는 일이다. 완전한 인간 항체는 마우스 또는 마우스 유래의 맵(Mabs)에 대해 본질적인 면역원 및 알러지 반응을 최소화시켜, 투여된 항체의 효능 및 안전성을 증가시키는 것으로 예상된다. 완전한 인간 항체의 사용은 만성 및 재발 인간 질병, 예컨대 염증, 자가면역 및 암의 치료에 실질적인 장점을 제공할 것으로 예상되며, 종종 반복적으로 항체를 투여해야 한다.

인간 항체의 형성과 관련하여 이용되고 있는 한 방법은 마우스 항체 생성이 결핍되어 있지만 인간 Ig 위치의 거대 단편을 보유하는 마우스 종을 제조하여 이러한 마우스가 마우스 항체의 부재하에 인간 항체의 거대 레퍼토리를 생성한다. 거대 인간 Ig 단편은 항체 생성 및 발현의 적절한 조절 뿐 아니라 거대 가변성 유전자 다양성을 보존한다. 항체 변화 및 선별에 대한 마우스 기구와 인간 단백질에 대한 면역학적 용인성 결핍을 이용하여, 이들 마우스 종에서 재생된 인간 항체 레퍼토리는 인간 항원을 비롯하여 임의의 해당 항원에 대한 높은 친화도를 갖는 항체를 산출한다. 하이브리도마 기법을 사용하여, 소정의 특이성을 갖는 항원 특이적 인간 맵을 쉽게 생성하여 선별할 수 있다.

이러한 일반적인 전략은 1994년에 공개된 제1 제노마우스 종의 형성과 연관된 것으로 입증되었다. Green et al., nature Genetics 7:13-21(1994). 제노마우스 종은, 각각 코어 가변부와 불변부 서열을 포함하는 인간 중쇄 위치 및 카파 경쇄 위치의 245 kb 및 190 kb 크기의 배선 형상 단편으로 공학적으로 조작하였다. 인간 Ig를 함유하는 효모 인공 염색체(YAC)는 항체의 재배열 및 발현에 대한 마우스 시스템에 적합한 것으로 판명되었으며, 불활성화된 마우스 Ig 유전자 대신 치환할 수 있었다. 이는 B 세포 형성을 유발하고 완전한 인간 항체의 성인 유사 인간 레퍼토리를 생산하며 항원 특이적 인간 맵을 형성하는 능력에 의해 입증된다. 이들 결과는 인간 Ig 위치를 함유하는 다수의 V 유전자의 거대 부분, 추가의 조절 성분 및 인간 Ig 불변부를 도입하여 감염 및 면역화에 대한 인간 체액 반응의 특성인 거의 전체 레퍼토리를 반복한다는 것을 제안한다.

이러한 방법은 미국 특허 출원 일련 번호 07/466,008호(1990년 1월 12일 출원), 07/610,515호(1990년 11월 8일 출원), 07/919,297호(1992년 7월 24일 출원), 07/922,649(1992년 7월 30일 출원), 08/031,801호(1993년 3월 15일 출원), 08/112,848호(1993년 8월 27일 출원), 08/234,145호(1994년 4월 28일 출원), 08/376,279호(1995년 1월 20일 출원), 08/430,938호(1995년 4월 27일 출원), 08/464,584호(1995년 6월 5일 출원), 08/464,582호(1995년 6월 5일 출원), 08/463,191호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,853호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,857호(1995년 6월 5일 출원), 08/486,859호(1995년 6월 5일 출원), 08/462,513호(1995년 6월 5일 출원), 08/724,752호(1996년 10월 2일 출원) 및 08/759,620호(1996년 12월 3일 출원)에 추가로 논의되고 서술되어 있다. 또한, 유럽 특허 EP 0 463 151 B1(1996년 6월 12일 공개), 국제 특허 출원 WO 94/02602호(1994년 2월 3일 공개), 국제 특허 출원 WO96/34096(1996년 10월 31일 공개) 및 PCT 출원 PCT/US96/05928호(1996년 4월 29일 출원) 참고. 상기 인용 특허 및 출원은 그 전문을 참고로 인용하였다.

대안적인 방법으로서, 겐팜 인터내쇼날 인코포레이티드를 비롯한 회사들은 "미니유전자좌(minilocus)" 방법을 이용한다. 미니유전자좌 방법에서, 외인성 Ig 위치는 Ig 위치 유래의 조각(개별 유전자)을 포함시켜 모방한다. 따라서, 하나 이상의 V_H유전자,하나 이상의 D_H유전자, 하나 이상의 J_H유전자, mu 불변부와 제2 불변부(바람직하게는 감마 불변부)를 동물에게 삽입하기 위한 작제물내로 형성시킨다. 이 방법은 미국 특허 제5,545,807호(Surani 등), 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호, 제5,661,016호, 제5,633,425호 및 제5,625,126호(Lonberg 및 Kay), 미국 특허 제5,643,763호(Dunn 및 Choi), 미국 특허 제5,612,205호(Kay 등), 미국 특허 제5,591,669호(Krimpenfort and Berns)와, 겐팜 인터내쇼날 미국 특허 출원 일련 번호 07/574,748호(1990년 8월 29일 출원), 07/575,962호(1990년 8월 31일 출원), 07/810,279호(1991년 12월 17일 출원), 07/853,408호(1992년 3월 18일 출원), 07/904,068호(1992년 6월 23일 출원), 07/990,860호(1992년 12월 16일 출원), 08/053,131호(1993년 4월 26일 출원), 08/096,762호(1993년 7월 22일 출원), 08/155,301호(1993년 11월 18일 출원), 08/161,739호(1993년 12월 3일 출원), 08/165,699호(1993년 12월 10일 출원), 08/209,741호(1994년 3월 9일 출원), 08/544,404호(1995년 10월 10일 출원)에 개시되어 있으며, 본원에서 참고로 인용하였다. 또한, 본원에서 전문을 참고로 인용한 국제 특허 출원 WO 97/13852호(1997년 4월 17일 공개), WO 94/25585호(1994년 11월 10일 공개), WO 93/12227호(1993년 6월 24일 공개), WO 92/22645호(1992년 12월 23일 공개), WO 92/03918호(1992년 3월 19일 공개) 참조. 또한, 본원에서 참고로 인용한 Taylor 등(1992), Chen 등(1993), Tuaillon 등(1993), Choi 등(1993), Lonberg 등(1994), Taylor 등(1994) 및 Tuaillon 등(1995) 참조.

메디칼 리서치 카운셀("MRC")에게 양도된 상기 인용한 Surani 등의 발명자들은 미니유전자좌 방법을 사용하여 Ig 위치를 보유하는 변이 마우스를 생성하였다. 본 발명자들의 지도에 따라 상기 인용한 겐팜 인터내쇼날 작업에 참여한 발명자 Lonberg 및 Kay는 Surani 등의 연구를 실질적으로 반복하여 커플링된 내인성 마우스 Ig 위치의 불활성화를 제안하였다.

미니유전자좌 방법의 장점은 Ig 위치 부분을 포함하는 작제물을 형성하고 동물내로 도입하여 신속하게 수행할 수 있다는 것이다. 그러나, 이러한 장점을 상쇄하는 미니유전자좌 방법의 중요한 단점은, 이론적으로 소수의 V, D 및 J 유전자의 봉입을 통하여 불충분한 다양성이 도입된다는 것이다. 실제로, 공개된 연구는 이러한 개념을 뒤받침하는 것으로 보인다. 미니유전자좌 방법의 사용을 통해 생성된 동물의 B 세포 형성 및 항체 제조는 정지된 것으로 보인다. 따라서, 본 발명자들은 Ig 위치의 거대 부분을 도입하여 다양성을 더욱 크게하고 동물의 면역 레퍼토리를 재구성하려는 노력을 일관되게 주장해 왔다.

상기 기법을 사용하여, 변이 마우스를 면역화시키고 하이브리도마를 형성하고 전술한 바와 같은 활성에 대해 생성 하이브리도마를 검색함으로써 예컨대 CD147 발현 세포, CD147 자체, CD147의 형태, 이의 에피토프 또는 펩티드와, 발현 라이브러리(예, 미국 특허 제5,703,057호 참고)에 대한 인간 항체를 형성하였다.

실제로, 미국 캘리포니아주 프레몬트에 소재하는 압게닉스 인코포레이티드에서 입수가능한 변이 마우스 XenoMouse^TM종(Mendez 등(1997) 상기 문헌 참조, 및 미국 특허 출원 제08/759,620호, 1996년 12월 3일 출원)의 면역화를 통해 CD147을 결합시키는 인간 모노클로날 항체의 패널을 제조하였다. 이러한 항체는 CD147과의 결합에 대하여 ABX-CBL과 경쟁하는 능력에 대해 검색하였다. 이러한 패널에서 CD147에 결합되는 인간 IgG2 및 인간 IgM 항체를 검출하고, CD147에의 결합에 대하여 ABX-CBL과 경쟁할 수 있었다. 이러한 항체를 발현하는 하이브리도마는 다음과 같이 고안하였다.

IgM:CEM 10.1 C3, CEM10.1 G10, CEM 10.12 F3, CEM 10.12 G5 CEM 13.12, CEM 13.5; 및

IgG2s:2.4.4, 2.1.1, 2.3.2, 2.6.1.

상기 항체 각각은 RT-PCR을 통해 해당 하이브리도마로부터 이들을 암호화하는 cDNA를 분리하여 서열 결정하였다. 배선 유전자를 확인하고, 항체의 서열과 배선 서열을 비교하였다. 배선 유전자 확인은 하기 표에 제공되어 있다.

항체	중쇄/경쇄	VH또는 VK	D	JH또는 JK
CEM 10.1 C3	중쇄	V4-34	D2/D2-15	JH6b
	경쇄	A3/A19/DPK15		JK1
CEM 10.1 G10	중쇄	DP71(V4-59)	D1-26	JH6b
	경쇄	A30		JK1(동일 서열 아님)
CEM 10.12 F3	중쇄	DP15(V1-8)	D1-26	JH6b
	경쇄	B3/DPK24		JK1
CEM 10.12 G5	중쇄	DP15(V1-8)	D6-19	JH6b
	경쇄	A30		JK1
CEM 13.12	중쇄	V4-34	D2-2/D4	JH6b
	경쇄	A3/A19/DPK15		JK3
CEM 13.5	중쇄	DP77-WH16(3-21)	D6-19	JH4b
	경쇄	B3/DPK24		JK1(동일 서열 아님)
2.4.4	중쇄	VII-5	D21-9/D3-22	JH4b
	경쇄	A2 DPK12		JK4
2.1.1	중쇄	DP77	D6-19	JH4b
	경쇄	LFVK431		JK3
2.3.2	중쇄	VII-5	D21-9/D3-22	JH4b
	경쇄	A2 DPK 12		JK3
2.6.1	중쇄	DP47	DXP4	JH4b
	경쇄	LFVK431		JK3

V_H, D, J_H, V_K및 J_K의 배선 서열은 젠뱅크에서 입수할 수 있다. 항체의 일부 서열은 배선 V-유전자 분절의 전사체와 비교하여 아미노산 서열에 있어서의 체세포 변이를 관찰하였다. 이러한 서열 비교는 도 44 내지 도 46에 제시되어 있다. 각 항체에 대한 cDNA 서열 및 이의 단백질 전사체는 도 24 내지 도 33에 제시되어 있다. 또한, 카벳(Kabet) 번호 매김 방법에 따라 항체의 중쇄 및 카파 경쇄의 CDR을 도 34 내지 도 43에 제시하였다.

상기 항체의 CDR은 항원에 대한 항체 결합과 관련하여 일반적으로 매우 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서, 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 변형시키지 않는 각종 FR 및 기타 변형을 항체에 가할 수 있음을 인지해야 한다. 따라서, 항체 활성의 중요한 인자는 항원상의 에피토프이며, 여기에 항체가 결합한다. 에피토프 결합이 보존되는 한, 여러 방식으로 항체의 1차 서열을 변형시키는 것은 거의 문제가 되지 않을 수 있다. 따라서, 서열이 본원에 개시되어 있지만 항체의 서열이 항원상의 유효 에피토프를 초기에 규정할 수 있고, 일단 에피토프가 항원에 의해 확인되면, 동일한 에피토프에 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다는 것을 제안한다.

수행된 다수의 시험에서, 추가의 형성을 위해 2.6.1 IgM 항체를 선별하였다. 인지되는 바와 같이, 형성된 모든 IgM은 1가이다. 따라서, 완전한 인간 다량체 IgM 항체를 제조하기 위해서, 본 발명자들은 인간 백혈구 연층 세포 유래의 인간 J쇄 유전자를 클로닝하고, 2.6.1 카파 경쇄 cDNA 및 J쇄 DNA를 함유하는 제1 벡터와 2.6.1 중쇄 cDNA를 함유하는 제2 발현 벡터를 제조하고, DHFR^-중국산 햄스터 난소 세포를 2개의 벡터로 동시 감염시키고, 다량체 IgM을 발현하는 클론을 선별하였다.

2.6.1 IgM+J쇄 항체는 도 50에 도시된 바와 같이 ADCC에서 작용할 수 있었다.

인간화 기법 및 디스플레이 기법

인간 항체 형성과 관련하여 상기 논의된 바와 같이, 면역원성이 감소된 항체를 생성하는 것은 장점이 있다. 어느 정도, 적절한 라이브러리를 사용한 인간화 기법 및 디스플레이 기법으로 면역원성이 감소된 항체를 생성할 수 있다. 기타 종에서 유래한 쥐 항체(들)를 당업계에 공지된 기법을 사용하여 인간화시키거나 또는 영장화시킬 수 있음을 인지해야 한다. Winter 및 Harrris의 문헌[Immunol Today 14:43-46(1993)] 및 Wright 등의 문헌[Crit, Reviews in Immunol, 12125-168(1992)] 참고. 또한, 기타 종으로부터 유래한 인간 항체(들)는 디스플레이형 기법, 비제한적인 예로서 파지 디스플레이, 레트로바이러스 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 당업계에 공지된 기법을 사용한 기타 기법으로 형성할 수 있으며, 생성 분자에 대해, 예컨대 친화 성숙법과 같은 추가의 성숙 방법을 수행하며, 이들 기법은 당업계에 공지되어 있다. Wright 및 Harris 등의 문헌[상기 참조], Hanes 및 Plucthau 등의 문헌[PNAS USA 94:4937-4942(1997) (리보좀 디스플레이)], Parmley 및 Smith 등의 문헌[Gene 73:305-318(1988) (파지 디스플레이)], Scott의 문헌[TIBS 17:241-245 (1992)], Cwirla 등의 문헌[PNAS USA 87:6378-6382(1990), Russel 등의 문헌[Nucl. Acids Research 21: 1081-1085(1993), Hoganboom 등의 문헌[Immunol. Reviews 130:43-68(1992)] 및 Chiswell 및 MaCafferty 등의 문헌[TIBTECH 10:80-84(1992)] 참고. 디스플레이 기법을 이용하여 인간이 아닌 항체를 생성하는 경우, 이 항체는 전술한 바와 같이 인간화시킬 수 있다.

이들 기법을 사용하여, CD147 발현 세포, CD147 자체, CD147의 형태, 이의 에피토프 또는 펩티드와 발현 라이브러리(미국 특허 제5,703,057호 참조)에 대한 항체를 형성할 수 있으며, 이들은 이후 전술한 활성에 대해 상기 논의된 바와 같이 검색할 수 있다.

또한, ABX-CBL 항체를 발현하는 기탁된 하이브리도마 세포주에서 유래한 활성 항체에 대한 서열은 아직 알려지지 않았다. IgM 항체가 CBL1 항체의 활성을 전적으로 담당한다는 상기 논의된 발견 내용과, MOPC21 경쇄의 존재 또는 부재가 항체의 활성에 유용하지도 결정적이지도 않은 것으로 보인다는 사실에 비추어, 본 발명자들은 RT-PCR을 통하여 IgM(ABX-CBL) 생성 하이브리도마 유래의 중쇄 및 카파 경쇄를 클로닝하고, cDNA를 서열 결정하였다. 중쇄 및 카파 경쇄의 cDNA 서열과 이의 단백질 전사체를 비롯하여, 이러한 서열 결정 연구 결과는 다음과 같다.

ABX-CBL 중쇄 뉴클레오티드 서열

(서열 번호 81)

ABX-CBL 중쇄 단백질 서열

(서열 번호 18)

ABX-CBL 경쇄 단백질 서열

(서열 번호 19)

인지되는 바와 같이, 서열을 사용하여 ABX-CBL 항체의 인간화된 형태를 제조할 수 있다. 일반적으로, CDR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 종래의 기법으로 인간 프레임구조(FR) 서열에 이식한다. 대안적으로, CDR 주변 프레임구조 영역내 아미노산 잔기(CDR1 주변의 FR1 및 FR2, CDR2 주변의 FR2 및 FR3 및/또는 CDR3 주변의 FR3 및 FR4내 잔기)는 종래의 기법을 사용하여 동일한 아미노산을 암호화하는 cDNA의 돌연변이 발생을 통하여 변형시킨다. 이 경우, 일반적으로 인간화된 카파 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 변형된 cDNA는, 미국 특허 출원 일련번호 08/730,639호(1996년 10월 11일 출원) 또는 국제 특허 출원 번호 WO 98/16654(1998년 4월 23일 공개)에 개시된 세포-세포 융합 기법을 사용하여 또는 동시 형질감염을 통해서 직접 발현용 세포주(예, NSO, CHO 등)내로 도입할 수 있다. 이 후, 인간화된 항체를 발현시키고, 결합 및 기타 작용 특성에 대하여 분석하였다. 분자는 항체의 개선된 결합 또는 기타 작용 특성을 얻는데 필요하거나 또는 목적에 따라 DNA 레벨에서 반복적으로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 경우, 인간 FR내 쥐 서열을 재도입하여 결합을 개선시켜야 한다. 인간화에 대한 우수한 단계적인 도입과 당업계에 알려진 종래의 인간화 방법에 대한 입증은 인터넷 http://www.cryst.bbk.ac.uk/∼ubcg07s/에 제공되어 있다.

일반적으로, 이 공정과 동시에, 또는 이 공정을 수행하는 과정에서, 불변부는 쥐 IgM을 또 다른 인간 불변부(예, 전술한 바와 같이 J쇄 존재 또는 부재하에 인간 IgM 불변부)로 전환시켜 인간화된 키메라 항체를 제조할 수 있다.

항체 치료법에 대한 추가의 기준

전술한 바와 같이, ABX-CBL 항체의 기능은 적어도 일부 작용 방식에 중요한 것으로 보인다. 기능에 의해서, 본 발명자들은 예를 들어 ABX-CBL 항체의 활성은 CDC임을 의미한다. 따라서, CD147에 대한 치료 후보로서 항체의 생성과 관련하여 항체는 보체를 고정할 수 있고 CDC에서 침전시킬 수 있는 것이 바람직하다. 비제한적인 예로서, 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3을 비롯하여 상기와 같은 능력이 있는 항체의 아이소타입이 다수 있다. 생성된 항체는 초기에 이러한 아이소타입을 보유하지 않아도 되지만, 생성된 그대로의 항체는 임의의 이소 타입을 보유할 수 있고 이 후 당업계에 공지된 임의의 종래 기법을 사용하여 아이소타입을 전환시킬 수 있음을 인지해야 한다. 이러한 기법은 직접적인 재조합 기법(예컨대 미국 특허 제4,816,397호 참조), 세포-세포 융합 기법(예컨대 1996년 10월 11일에 출원된 미국 특허 출원 제08/730,639호)을 사용한다.

세포-세포 융합 기법에서, 목적하는 아이소타입의 중쇄를 보유하는 골수종 또는 기타 세포주를 제조하고, 경쇄를 보유하는 또 다른 골수종 또는 기타 세포주를 제조한다. 그 후 이러한 세포를 융합시켜, 완전한 항체를 발현하는 세포주를 분리할 수 있다.

예로서, 본원에서 논의된 2.6.1 항체는 인간 CD147 IgG2 항체이다. 이러한 항체가 CD147 분자에 대한 목적하는 결합력을 보유하는 경우, 쉽게 아이소타입을 전환시켜 인간 IgM, 인간 IgG1 또는 인간 IgG3 아이소타입을 형성할 수 있지만, 여전히 동일한 가변부(항체 특이성 및 일부 친화도로서 규정됨)를 보유한다. 이러한 분자는 ABX-CBL 항체와 유사한 방식으로 보체를 고정하고 CDC에서 침전시킬 수 있다.

따라서, 전술한 목적하는 "구조" 특성에 부합하는 항체 후보가 생성되기 때문에, 일반적으로 아이소타입 전환을 통해서 목적하는 적어도 일부의 "기능" 특성을 갖는 항체 후보를 제공할 수 있다.

기타 치료법의 고안 및 형성

본 발명에 따라서 CD147에 대한 ABX-CBL 항체의 활성을 기초로 하여, 본래 항체 부분을 벗어나는 기타 치료 양식, 비제한적인 예로써 진보형 항체 치료법, 예컨대 2특이적 항체, 면역독소 및 방사능 표지된 치료법, 펩티드 치료법의 형성, 유전자 치료법, 특히 체내 치료법, 안티센스 치료법 및 소분자를 고안할 수 있다.

진보형 항체 치료법 개발과 관련하여, 예컨대 2특이성, 면역 독성 또는 방사능 표지를 사용하여 ABX-CBL 항체의 기능에 필요한 것으로 본 발명자들이 입증한 세포 사멸용 보체에 대한 의존성을 피할 수 있다.

예를 들어, 2특이적 항체와 관련하여, (i) CD147과 함께 접합된 또 다른 제2 분자에 특이적인 2개의 항체, (ii) CD147에 특이적인 한 사슬을 갖고 제2 분자에 특이적인 제2 사슬을 갖는 단일 항체, 또는 (iii) CD147 및 기타 분자에 특이성이 있는 1본쇄 항체를 포함하는 2특이적 항체를 형성할 수 있다. 이러한 2 특이적 항체는 예컨대, (i) 및 (ii)와 관련하여서는 Fanger 등의 문헌[Immunol Methods 4: 72-81(1994)]과 Wright 및 Harrris 등의 문헌[상기 참조]에 공지되어 있고, (iii)과 관련하여서는, 예컨대 Traunecker 등의 문헌[Int.J.Cancer(Suppl.) 7:51-52 (1992)]에 개시되어 있다. 이 경우, 제2 특이성은 중쇄 활성화 수용체에 대해 생길 수 있는데, 중쇄 활성화 수용체의 비제한적인 예로는 CD16 또는 CD64(예컨대 Deo 등의 문헌 18:127 (1997) 참조) 또는 CD89(예컨대 Valerius 등의 문헌[Blood 90:4485-4492 (1997)] 등이 있다. 이에 따라 제조된 2특이적 항체는 CD147을 발현하는 세포, 특히 ABX-CBL 항체가 유효한 세포들을 사멸시킬 것이다.

면역독소와 관련하여, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 면역독소로서 작용하도록 항체를 변형시킬 수 있다. 예컨대 Vitetta의 문헌[Immunol Today 14:252(1993)] 참조. 또한, 미국 특허 제5,194,594호 참조. 방사능 표지된 항체의 제조와 관련하여, 이러한 변형 항체는 당업게에 공지된 기법을 사용하여 쉽게 제조할 수 있다. Junghans 등의 문헌[Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2판, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)] 참조. 또한, 미국 특허 제4,681,581호, 제4,735,210호, 제5,101,827호, 제5,102,990호(RE 35,500), 제5,648,471호 및 제5,697,902호 참조. 각각의 면역독소 및 방사능 표지된 분자는 CD147을 발현하는 세포, 특히 ABX-CBL 항체가 유효한 세포들을 사멸시킬 것이다.

치료 펩티드의 형성과 관련하여, CD147 및 이에 대한 항체, 예컨대 ABX-CBL 항체와 관련된 구조 정보를 이용하거나(소분자와 관련하여 하기에 기술됨), 또는 펩티드 라이브러리를 검색하여, CD147에 대한 치료 펩티드를 형성시킬 수 있다. 펩티드 치료법의 고안 및 검색은 Houghten 등의 문헌[Biotechniques 13:412-421 (1992)], Houghten의 문헌[PNAS USA 82:5131-5135 (1985)], Pinalla 등의 문헌[Biotechniques 13:901-905(1992)], Blake 및 Litzi-Davis[BioConjugate Chem. 3:510-513(1992)]에 논의되어 있다. 항체와 관련하여 전술한 펩티드 분자와 유사한 방식으로 면역독소 및 방사능 표지된 분자를 제조할 수 있다.

CD147 분자(또는 형태, 예컨대 스플라이스 변형체 또는 대안 형태)는 질병 과정에서 기능적으로 활성이라는 가정하에, 종래의 기법으로 유전자 및 안티센스 치료법을 고안할 수 있다. 이러한 방식은 CD147의 기능을 조절하는데 이용할 수 있다. 본 발명의 발견으로 인하여 이와 연관된 기능 분석을 디자인하고 사용할 수 이있다. 안티센스 치료법에 대한 디자인 및 전략은 국제 특허 출원 WO 94/29444호에 상세히 개시되어 있다. 그러나, 구체적으로 체내 치료법을 비롯한 유전자 치료법을 사용하면 특히 유용한 것으로 판명되었다. 예컨대 Chen 등의 문헌[Human Gene Therapy 5:595-601 (1994)] 및 Marasco 등의 문헌[Gene Therapy 4:11-15 (1997)] 참조. 일반적인 유전자 치료법의 고안 및 이와 관련된 고찰은 국제 특허 출원 97/38137호에 개시되어 있다.

소분자 치료법은 본 발명에 따라 계획할 수 있다. 약물은 본 발명을 기초로 CD147의 활성을 조절하도록 고안할 수 있다. ABX-CBL 항체, CD46, CD55, CD59 등을 비롯하여 본 발명에 따라 기타 분자와 CD147의 상호작용 및 CD147 분자의 구조로부터 수집한 지식은 추가의 치료 양식을 고안하는데 이용할 수 있다. 이러한 측면에서, 합당한 약물 고압 기법, 에컨대 X선 결정사진법, 컴퓨터 조력형(또는 보조형) 분자 모델링(CAMM), 정량 또는 정성 구조-활성 관계(QSAR), 및 유사 기법을 이용하여 약물 개발 노력에 총력을 기울일 수 있다. 합당한 고안으로 CD147의 활성을 변형 또는 조절하는데 사용할 수 있는 단백질 또는 합성 구조를 예측할 수 있다. 이러한 구조는 생물학적 시스템에서 화학적으로 합성되거나 또는 발현될 수 있다. 이러한 방법은 Capsey 등의 문헌[Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs(스톡턴 프레스, 뉴욕(1988)]에 검토되어 있다. 또한, 조합 라이브러리를 고안하고, 합성하여, 고 처리량 검색과 같은 검색 프로그램에 사용할 수 있다.

치료제 투여 및 제제

본 발명에 따른 치료제 투여는 적절한 담체, 부형제 및 개선된 이동, 전달, 용인성 등을 제공하도록 제제내로 도입된 기타 제제와 함께 투여하여 할 수 있다. 다수의 적절한 제제는 모든 제약 화학자에게 알려진 처방서에서 발견할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences(15판, 맥 퍼블리싱 캄파니, 미국 펜실베니아주 이스톤(1975) 문헌 내부의 Blaug, Seymour의 87장. 이들 제제로는, 예컨대 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온 또는 음이온) 함유 부형제(예, Lipofectin^TM), DNA 접합체, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카르보왁스(각종 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔 및 반고체 혼합물을 함유하는 카르보왁스가 있다. 전술한 임의의 혼합물은 본 발명의 치료 및 처치에 적절할 수 있다. 단 제제내 활성 성분은 제형화에 의해서 불활성화되지 않고 제제는 투여 경로에 대하여 생리학적으로 적합하며 허용가능해야 한다. 제약 화학자들에게 공지된 부형제 및 담체와 관련된 추가의 정보에 관하여 Powell 등의 문헌["Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311(1998)] 및 그 문헌내의 인용 문헌 참조.

수행된 실험 및 달성된 결과를 포함하는 하기 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.

실험 1

인간 항체 형성

인간 항체는, 그 전문을 참고로 인용한 Mendez 등의 문헌[Nature Genetics 15:146-156 (1997)] 및 미국 특허 출원 일련 번호 08/759,620호(1996년 12월 3일 출원)에 따라 CEM 세포를 보유한 XenoMouse^TM동물을 면역화시켜 제조하고, 융합시키고, ABX-CBL 항체를 사용한 경쟁 분석에서 CEM 세포에 대한 생성 하이브리도마 상징액을 검색하였다(실시예 2).

실험 2

ABX-CBL 항원의 면역 친화 정제

본 발명자들은 ABX-CBL 항체가 결합하는 항원을 면역친화 정제하였다. CBL1 및 ABX-CBL 항체가 결합된 항원은 CEM 세포상에서 고도로 발현되는 것으로 보인다. 천연 ABX-CBL 항체를 사용한 면역친화 정제는 ABX-CBL 항체가 5량체 구조를 갖는 IgM 항체라는 사실 때문에 실패하였다. 따라서, 본 발명자들은 인간 IgG2 항체(실시에 1)를 제조한 다음, 융합시키고, CEM 세포에 대한 생성 하이브리도마 상징액을 검색하고, FACS를 사용한 CEM 세포와의 결합 분석에서 ABX-CBL 항체와의 경쟁에 대해 시험하였다. FACS 경쟁 분석에서, FITC로 표지된 CEM 세포에 대한 ABX-CBL 항체의 결합 억제를 단독으로 및 항CEM 인간 항체의 존재하에 분석하였다.

본 발명자들은 CEM 세포에 결합하는 단일클론 항체를 생성하고 CEM 세포에 대한 결합에 있어서 ABX-CBL 항체와 고도로 경쟁하는 융합체로부터 4개의 하이브리도마를 얻었다. 2.6.1로 명명한 1개의 하이브리도마 클론이 가장 경쟁적이었다.

본 발명자들은 SCID 마우스내 2.6.1 하이브리도마를 비롯하여 4개의 하이브리도마 클론 각각에 대한 복수를 생성하고, 표준 조건을 사용하여 단백질 A 친화도 정제 과정으로 2.6.1 항체를 정제하였다. 정제된 2.6.1 항체로부터, 본 발명자들은 면역친화 컬럼을 제조하였다. 컬럼을 제조하기 위해서, 정제된 2.6.1 항체를 제조업자의 지시에 따라서 CNBr 활성화된 세파로스-4B에 접합시켰다. 대략 8.4 ㎎의 항체를 활성화된 세파로스 약 2.0 g에 접합시켰다. 본 발명자들은 컬럼을 통해 CEM 세포의 세포 용해물을 통과시키고 결합된 성분을 용출시켰다. 용출 생성물은 SDS-PAGE 전기 영동, 웨스턴 블롯, ELISA 및 CEM 세포 용해물에 대한 BiaCore 반응성으로 분석하였다.

CEM 세포 용출물로부터 정제된 용출 생성물은, 각 2.6.1 항체 및 ABX-CBL 항체와 반응한 후에 웨스턴 블롯 분석으로 관찰할 수 있는 45∼55 KD에 해당하는 확산 밴드의 서열 결정 분석시 CD147임을 입증하였다. 도 1에서 관찰되는 바와 같이, 2.6.1 항체는 45∼55 KD의 확산 밴드내 포함된 분자(들)에 가장 강하게 결합하는 반면, ABX-CBL 항체는 약 45∼55 KD의 유사한 밴드에 대한 결합 강도가 약한 결합을 나타내었다.

서열 결정은 퍼킨 엘머 서열 분석기를 사용하여 정제용 겔 전기영동 및 전기 블롯 기법으로 분리된 45∼55 KD 밴드의 일부에서 수행하였다. 본 발명자들은 분자(35∼40 잔기)의 부분 아미노산 서열을 얻었다. 생성 서열 정보는 단백질 데이타 베이스 조사(Protein Identification Resourse(PIR) R47.0, 1995년 12월)를 통해 분석하고, 서열 비교 데이타로부터 분자가 CD147임을 알 수 있다.

CEM 용해물의 웨스턴 블롯은 일반적으로 다음과 같이 수행하였다.

CEM 세포를 10 mM 트리스 pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100 및 프로테아제 억제제내에서 균질화하여 CEM 추출물 5 ×10⁸세포/㎖를 얻었다. 추출물(5 ㎕)을 12% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고 PVDF 상에서 블롯팅하였다. 블롯을 항체 염색용 제제내에서 5개의 스트립으로 절단하였다. 모든 제1 항체 염색은 1% 젤라틴/PBST 완충액에서 1 ㎍/㎖에서 수행하였다. 모든 AP 표지된 제2 항체는 동일한 완충액에서 1:1000 희석액으로 수행하였다. 토끼-항마우스-hnRNP-k 단백질 항체는 워싱톤 대학의 Dr. Karol Bomstzyk가 공급하였다. 각 ABX-CBL, 파미겐, 및 2.6.1 항체를 추가로 본원에 개시하였다.

실험 3

62 KD 밴드의 정제

62 KD 밴드에 포함된 물질을 정제하기 위해서, CEM 전체 세포 용해물을 약 3 ×10¹⁰세포로부터 제조하였다. 용해물을 추출하고, 농축하여 약 3.8 ㎎의 단백질을 제공하였다. 회수된 단백질의 일부에 대해 일련의 크로마토그래피 단계, 즉 크기 배제 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 마이크로보어 역상 크로마토그래피를 수행하였다. 각 단계에서, 웨스턴 블롯에서 ABX-CBL 항체에 대한 결합을 보여주는 분획에 대해 다음 단계를 수행하였다. 마이크로보어 역상 크로마토그래피 후에, 대략 5 ×10^-6g 단백질을 회수하고, 단백질의 일부에 대해 겔 전기영동과 전기 블롯팅을 수행하여 약 90% 순수한 62 KD 단백질을 형성하였다.

직접적인 N-말단 서열 분석을 시도하였으나, 분자는 차단형 N-말단을 보유하였다. 따라서, 재료는 CNBr로 분해하고 정제용 겔 전기영동 및 전기블롯팅을 수행하여, 약 12 KD 및 32.5 KD 밴드를 산출하였다. 블롯팅 단편을 서열 결정하고, 생성 서열 결과물을 단백질 데이타베이스 조사(Protein Identification Resourse(PIR) R47.0, 1995년 12월)를 통해 분석하였다. 서열 비교 데이타로부터 분자가 이종성 리보핵 단백질 k(hnRNP-k)를 갖으며, 12 KD 밴드는 잔기 360 이상(메티오닌; 359 후)을 갖고, 32.5 KD 밴드는 잔기 43 이상(메티오닌; 42 후)을 갖는다는 것을 알 수 있다.

실험 4

CD147 ELISA 분석

본 발명자들은 분비된 형태 또는 막 결합 형태로 CD147의 발현 검출을 위한 특이적 ELISA 분석을 개발하여 CEM 세포 용해물로부터 얻은 농축된 정제 항원을 이용하였다. 이 분석에서, 본 발명자들은 평판의 웰내 CD147 항원(예, CEM 세포 용해물로부터 친화도 정제된 CD 147 항원)을 고정하였다. 항원 결합은 종래의 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 그 후, 항원을 함유하는 평편을 종래 기법을 사용하여 이와 반응성이 있는 항체 검출에 사용할 수 있다. 본 발명자들은 시판용 항CD147 항체[미국 뉴저지주 플란더에 소재하는 RDI에서 입수가능한 RDI-CBL535(쥐 항CD147 IgG2b 항체) 및 미국 캘리포니아주 샌디에고 파미겐에서 입수한 36901A(쥐 항CD147 IgG1 항체)], ABX-CBL 항체 및 실시예 2에서 형성된 인간 항체가 이 분석에서 특이적으로 반응할 수 있음을 확인하였다.

본 ELISA 분석은 CD147 항원에 결합하는 항체를 검출하기 위한 검색 시스템으로서 유용하다.

실험 5

35 KD 밴드의 역할과 관련된 증거

전술한 바와 같이, 증거는 35 KD 밴드가 CD147의 단일 글리코실화 형태에 해당할 수 있음을 제시한다. Kanekura 등의 문헌[Cell Struct Funct 16:23-30 (1991)]. 또한, 본 발명자들은 2개의 시판용 ABX-CBL에 대한 항CD147 항체[미국 뉴저지주 플란더에 소재하는 RDI에서 입수가능한 RDI-CBL535(쥐 항CD147 IgG2b 항체) 및 미국 캘리포니아주 샌디에고 파미겐에서 입수한 36901A(쥐 항CD147 IgG1 항체)], 및 2.6.1 항체에 의해 생성된 웨스턴 블롯 비교에서 시판용 항체 각각은 분자량이 약 35 KD이고 ABX-CBL 항체가 인지하는 35 KD 밴드와 유사하게 보이는 분자를 인식함을 알 수 있게 된 것은 매우 흥미로운 일이다. 도 1 참조. 또 다른 흥미로운 관찰 결과는 상기 면역친화 정제에서 2.6.1 항체로부터의 용출 생성물을 ABX-CBL 항체로 프로브한 경우, 35 KD 밴드는 웨스턴 블롯에서는 더 이상 보이지 않았다는 것이다. 그 보다는 ABX-CBL 항체는 비교적 밀도가 낮은(도 1에 도시된 바와 유사함) 45∼55 KD에서 얻은 확산 밴드에 결합하는 것으로 보인다. 이 증거는 ABX-CBL 항체는 2.6.1 항체 및 시판용 항체보다 CD147상의 상이한 에피토프 또는 CD147의 상이한 형태에 우선적으로 결합할 수 있다는 것을 제시한다.

실험 6

보체 매개형 세포 사멸

상기 언급한 UCLA 그룹(예컨대 미국 특허 제5,330,896호 및 제5,643,740호 참고)은 CBL1 항체가 일부 활성화된 세포군의 사멸을 통해 작동하는 반면 비활성화된 세포와는 항체가 반응하지 않는다는 일부 증거를 제공하였다. 예를 들어, 마이크로세포독성 분석에서 CBL1 항체는 활성화된 림프구 세포를 사멸시키고, 기타 정상 세포는 사멸시키지 않는 것으로 밝혀졌다.

이 실험과 관련하여, 하기 재료 및 절차를 사용하였다.

혼합형 림프구 반응

혼합형 림프구 반응(MLR)은 세포 매개 반응에서 T 림프구 증식을 분석하기 위한 시험관내 시스템이다. 세포 매개된 반응은 작동기 세포독성 작용의 시험관내 분석으로서, 실험 동물의 이식편 대 숙주 반응으로 시험관내에서도 분석할 수 있다. MLR에서 동종이계 림프구를 동시 배양하는 경우, 세포는 광범위한 아세포 형질전환 및 세포 증식을 진행한다. 따라서, MLR은 3중 수소 표지된 티미딘([³H]티미딘)을 배양 배지에 첨가하고 분열 림프구 DNA내로의 표지 흡수를 모니터링하여 정량할 수 있다.

CBL-1 및 ABX-CBL 항체의 기능 및 특성을 결정하기 위해서, 본 발명자들은 MLR을 사용하여 CBL-1 및 ABX-CBL이 림프구 증식 반응을 억제하는 능력을 시험하였다. 말초 혈액 단핵 세포는 2개의 HLA 부정합 개체로부터 피콜-플라크 구배 원심분리를 이용하여 분리하였다. 동종이계 림프구를 혼합하고(1:1), 6일 동안 시험관내에서 동시 배양하였다(총 5 ×10⁵세포/96웰 평판의 웰). 한 개체로부터 얻은 림프구에게 배양전에 3000 라드를 조사하였다. CBL-1 및 ABX-CBL 항체와 10% 토끼 또는 25% 인간 보체를 배양 종결 24시간 전에 배양물에 첨가하였다. 배양물을 [³H]메틸-티미딘(아머샴)으로 밤새 펄스시키고, 6일 째 수거하였다. 림프구 증식 반응은 [³H]티미딘 혼입을 측정하여 결정하였다. 억제율(%)은 항체의 부재하의 cpm에서 항체의 존재하의 cpm을 뺀 후 항체의 부재하의 cpm으로 나누어 계산하였다.

ConA 자극된 림프구 증식

인간 PMBC는 전술한 바와 같이 분리하고, 48 시간 동안 5 ㎍/㎖에서 미토겐 콘카나발린 A(ConA)으로 자극하였다. 10% 보체의 유무하에 항체를 배양물에 첨가하고, 24시간 후에 배양을 종결하였다. 배양물을 [³H]메틸-티미딘(아머샴)으로 밤새 펄스시키고, 다음 날 수거하였다. 림프구 증식 반응은 [³H]티미딘 혼입을 측정하여 결정하였다. 억제율(%)은 항체의 부재하의 cpm에서 항체의 존재하의 cpm을 뺀 후 항체의 부재하의 cpm으로 나누어 계산하였다.

세포 표면 분자의 FACS 분석

상이한 표면 분자의 세포 표면 발현을 위해서, FACSvantage(미국 캘리포니아주 샌 조세 벡톤 디킨슨)에서 면역형광 염색 및 분석에 대하여 개시되어 있다(FACScan Manual. 미국 캘리포니아주 샌 조세 벡톤 디킨슨). 단일클론 항체 항CD3-PE, 항CD4-PE, 항CD8-PE, 항CD14-PE, 항CD20-PE, 항CD25-FITC 및 항CD25-PE를 벡톤 디킨슨으로부터 얻었다. 항CD55-FITC 및 항CD59-FITC를 파미겐(미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재)으로부터 구입하였다. ABX-CBL 및 cem2.6.1을 각각 Abegenix에서 FITC 및 PE와 접합시켰다.

알라마블루를 사용한 보체 의존성 세포독성 분석

보체 의존성 세포독성(CDC) 분석은 전술한 바와 같이 수행하였다(Gazzano-Santoro 등의 문헌["A non-radioactive complement-dependent cytotoxicity assay for anti-CD20 monoclonal antibody" J.Immnol. Methods 202:163-171(1997)]. 10⁶세포/㎖의 세포 현탁액 50 ㎕, 각종 농도의 항체 50 ㎕ 및 10% 토끼 또는 인간 보체 50 ㎕를 저부가 평편한 96웰 조직 배양판에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂에서 2 시간 동안 배양하였다. 알라마블루(어큠드 인터내쇼날) 50 ㎕를 첨가하고(최종 10%) 추가의 5 시간 동안 계속 배양하였다. 진탕기에서 평판을 10분 동안 실온으로 냉각시키고 530 nm에서 여기시키고 590 nm에서 방출시킨 96-웰 플루오로미터를 사용하여 형광을 판독하였다. 결과는 상대적 형광 유닛(RFU)으로 표현하였다.

우리의 연구에서, 본 발명자들은 CBL1 및 ABX-CBL이 보체 매개된 세포 사멸을 통해서 작동함을 입증하였다. CBL1 항체 자체를 사용하여 아이소타입이 일치하는 대조군 마우스 IgM 항체(도 2), 또는 MLR이나 변형 MLR 분석(ConA 유도된 림프구 증식 분석)에서 보체(인간 또는 토끼)는 T 세포 증식을 억제하는데 비효과적이다. 도 2 내지 5 참조. 그러나, 모든 보체와 CBL1 또는 ABX-CBL 항체가 존재하는 경우, T 세포 증식은 용량 의존 방식으로 억제된다. 도 2 내지 5 참조. 인간 IgG2 항체 2.6.1은 그 자체 또는 보체와 함께 동일한 분석에서 T 세포 증식을 억제하는 데 비효과적이다. 도 5 참조. 이는 감마 2로서 2.6.1 항체가 ABX-CBL 항체와 같은 IgM 항체보다 보체 매개된 세포 용해에 있어서 덜 효과적이기 때문으로 추정된다.

CBL-1 또는 ABX-CBL과 보체의 조합은 활성화된 T 세포(CD4⁺또는 CD8⁺), 활성화된 B 세포 및 단핵구를 사멸시키지만 휴지 T 세포 및 B 세포에는 영향을 미치지 않는다. 그 이유는 이러한 세포는 CD147을 발현하지 않기 때문이다. 단핵구는 ABX-CBL 및 보체에 의해 사멸됨에 유의하는 것이 중요하다. 이 데이타는 ABX-CBL이 이들 작동기 세포(활성화된 T 세포 및 B 세포)와 보통 추가의 T 세포 활성화를 유도하는 항원 공여 세포(단핵구 및 B 세포)를 선택적으로 고갈시키기 때문에 질병, 예컨대 GVHD에서 ABX-CBL 치료의 조작에 대한 설명을 제공한다.

실험 7

세포 활성화와 관련된 증거

실험 6에 사용된 기법을 사용하여, 본 발명자들은 CD25 마커가 ABX-CBL 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포와 동일한 세포군에서 다량으로 발현하는 것으로 보인다는 것을 입증하였다. 도 6 참조. 이러한 발견으로부터 CD25를 발현하는 세포가 MLR 분석과 관련하여 고갈되는지 여부를 검출하는 유용한 마커를 제공하였다. 각종 활성화된 세포군을 사용하여 MLR 분석을 수행하는 경우, CD25 발현 세포군은 ABX-CBL 항체 + 보체로 처리한 세포에서만 고갈된다. 도 7 내지 도 11 참조. 상이한 세포군의 선택적 사멸은 도 10 내지 12에 도시되어 있다.

실험 8

CD147의 발현 레벨의 역할과 관련된 증거

본 발명자들은 CD147 발현 레벨이 제공된 세포군(CDC와 관련된 군)에서 더 높다고 생각하여 왔다.

ABX-CBL 항체와 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 이용한 유동 세포계수법 연구에서, 본 발명자들은 보체의 첨가전에 고 레벨 및 저 레벨의 CD147을 발현하는 것으로 보이는 세포군이 있음에 주목하였다. 보체를 첨가한 후에, 상기 언급한 저 레벨을 발현하는 세포에 해당하는 것으로 보이는 세포군이 있다. 이들 결과는 세포 표면에서 CD147이 발현되는 레벨 밀도의 지표이다. 밀도의 CDC에서의 역할은 보체 캐스케이드를 촉발하는 제1 단계에서 항체를 변형시키는 추가의 항원 결합 부위를 제공하는 것이다. 항체 변형시, 인자 c1q는 제1 및 캐스케이드 공정에서 결합한다.

세포군내 CD147의 발현 레벨(또는 밀도)이 ABX-CBL 항체의 치료 효과에 있어서 역할을 하는지 여부는 각종 세포군내 CD147 분자의 발현 레벨을 분석함으로써 평가하였다. 일반적으로, 각종 공지된 양의 CD147 항원을 그 표면상에 보유하는 비이드를 제조하고, FACS(즉, FITC 표지된 항CD147 IgG 항체 이용)에서 분석하여 비이드 상에 상이한 양의 항원의 대략 10∼20 데이타점을 형성하는 실험을 수행하였다. 이 데이타로부터 선형 회귀 곡선을 만들었다. 이 후, CD147 항원을 발현하는 세포를 FACS를 통해 조작하고, 세포 표면에서 항원의 상대적 양은 선형 회귀 곡선으로부터 계산할 수 있다.

실험 9

보체 억제 분자의 역할과 관련된 증거

또한, ABX-CBL 항체의 조작 방식의 세포 특이성을 고려하기 위해서, 본 발명자들은 ABX-CBL 항체가 결합하는 각종 세포를 조사하고, 이러한 세포가 보체 매개된 세포 용해와 유사한 방식으로 사멸되는지 여부를 고려하였다. 이 연구와 관련하여, 본 발명자들은 ABX-CBL 항체가 결합하는 각종 세포를 조사하고, 이러한 세포가 (i) 사멸되는지 여부와, (ii) 만약 그렇다면 보체 매개된 세포 용해와 유사한 기작인지 여부를 연구하였다. 이 실험에서, 본 발명자들은 다수의 세포에 결합하는 ABX-CBL 항체를 찾았다(따라서, ABX-CBL 항체가 결합하는 항원은 이러한 세포상에서 발현된다). ABX-CBL 항체가 결합하는 세포는 ABX-CBL 항체 및 보체로 처리하여 보체 매개된 세포 용해에 대하여 시험하였다. 2개의 T 세포주(CEM 및 쥬르카트 세포), 단핵구 종(U937 세포) 및 3개의 종양 세포주(A431(표피)), SW948(결장) 및 MDA468(흉부)을 검사하였으며, 이들은 ABX-CBL 항체를 결합시킨다. 이러한 세포주에서의 발현에도 불구하고, ABX-CBL 항체는 세포가 사멸되는지에 관해 매우 특이적이며, CEM T 세포주 및 U937 단핵구주에 제한된다. 도 13 참조. 본 발명자들은 2개의 내피 세포주를 분석하였다. (i) ECV-304(ATCC CRL-1998)는 EC 특성을 보유하고 겉보기에 정상인 인간 탯줄의 정맥으로부터 설정된 자발적으로 형질전환된 무한 증식 EC이고 (ii) HUV-EC-C(ATCC CRL-1730)은 인간 정상 인간 탯줄의 정맥에서 유도된 EC주이다. FACS를 사용하여, 본 발명자들은 ECV-304 및 HUVEC-C 주 각각이 2.6.1, 파미겐 및 ABX-CBL 항체에 대해 양성으로 염색되었음을 발견하였는데, 이는 이들 EC가 표면상에 CD147을 발현함을 제안하는 것이다. 각각 도 15 및 도 16. 본 발명자들은 시험관내 알라마블루계 CDC 분석을 수행하고, EC 주가 인간 보체의 존재하에 ABX-CBL 매개된 CDC에 내성이 있음을 입증하였다. 각각 도 17 및 도 18 참조.

CD147을 발현하는 것으로 보이는 세포가 보체의 존재하에 ABX-CBL 항체에 의해 사멸되지 않는 이유를 이해하기 위해서, 본 발명자들은 이러한 세포에서 CD46, CD55 및 CD59 발현을 연구하였다. CD46(막 조인자 단백질, MCP), CD55(부식 가속 인자, DAF) 및 CD59(막 공격 착물 억제제, MACI) 각각을 보체 억제 분자로서 포함한다. C46과 관련하여 Liszewski 등의 문헌[Annu.Rev.Immunol. 9:431(1991) 및 Loveland 등 "Coordinate functions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 및 CD59", Transpl. Proc. 26:1070(1994)], CD55와 관련하여 Kionshita 등의 문헌["Distribution of decay-accerlerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal noctumal hemoglobinuria" J.Exp.Med. 162:75(1985)] 및 Loveland 등의 문헌[Coordinate functions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59", Transpl.Proc. 26:1070 (1994)], CD59와 관련하여 Whitlow 등의 문헌["H19, a surface membrane molecule involved in T-cell activation, inhibits channel formation by human complement" Cell Immunol. 126: 176(1990), Loveland 등의 문헌["Coordinate functions of multiple complement regulating molecules, CD46, CD55 and CD59", Transpl.Proc. 26:1070 (1994)], Davids, A 및 Lachmann P.J.의 문헌["Membrane defense against complement lysis: the structure and biological properties of CD59" Immunol.Res. 12:258(1993)] 참조. 따라서, 본 발명자들은 상기 시험한 세포주상에서 이들 분자 중 하나 또는 둘의 차등 발현 여부를 고려한다. 실제로, CEM주 및 U937주를 제외한 모든 세포는 양 분자를 발현한다. 또한, 실제로 내피 세포주 HUVEC-C 및 ECV-304는 모두 3종, 즉 CD46, CD55 및 CD59를 발현하였다. 도 19 및 도 20에 각각 도시되어 있다. 대조적으로, CEM 세포주는 단지 CD59만을 발현하고, U937주는 CD55만을 발현하였다. 도 14 참조. 이 데이타는 ABX-CBL에 의해 선택적으로 제거되고 본 발명에 따른 항CD147과 관련하여 표적화되는 세포를 예측하는데 유용하다.

실험 10

진핵세포에 있어서 CD147의 클로닝 및 발현과 항체 결합

본 실험에서, 본 발명자들은 쥬르카트 잽 발현 플라스미드 DNA(스트라타젠)와 관련하여 PCR을 사용하여 전 길이 CD147 cDNA를 클로닝하였다.

Miyauchi 등의 문헌[J.Biochem. 110: 770-774(1991)]에 보고된 CD147 서열을 기준으로 다음 PCR 프라이머를 이용하였다(젠뱅크 수탁 번호 D45131):

(서열 번호 42)

(서열 번호 43)

오픈 리딩 프레임이 269 아미노산 CD147 단백질을 암호화하는 949 염기쌍 PCR 생성물을 분리하였다. PCR 생성물을 EcoR1 및 Apa1로 PCR 생성물을 분해하고, 포유류 발현 벡터 pWBFNP(도 21) 및 pBKCMV(스트라타젠)(도 22)(1300 내지 1098 위치 사이의 lac 프로모터 및 lacZ ATG를 제거하기 위해서 NheI/SpeI로 분해됨)의 EcoRI 및 Apa1 부위내로 결찰시켜 벡터 CD147/pWBFNP 및 CD147/pBKCMV(델타-NheI/SpeI)를 각각 형성하였다. 작제물에서, CD147의 진핵세포 발현은 시토메갈로바이러스(CMV) 직초기 프로모터로부터 유도된다. CD17/pWBFNP, CD147/pBKCMV(델타-NheI/SpeI) 및 대조 벡터 pWBFNP 및 pBKCMV를 일시적으로 원숭이 신장(COS-7) 세포내로 CAPO₄방법으로 형질감염시켰다. 세포를 60 시간 후에 수거하고, PBS 중에서 세척하고, 항-ABX-CBL-FITC, 항CEM2.6.1/항-HuIgG-FITC 또는 항-CD147-FITC(파미겐)로 염색하고, FACS 분석 및 웨스턴 블롯 분석으로 분석하였다(도 23A 참조). 실시예 3에 기재된 절차를 사용하여 블롯을 수행하였다.

FACS 분석으로 CD147 cDNA를 발현하는 벡터(CD147/pWBFNP 및 CD147/pBKCMV(델타-NheI/SpeI))로 형질감염된 COS 세포에서만 모두 3개의 항체로 염색한 특이적 세포 표면에 있어서의 증가를 밝혀내었다. CD147 cDNA로 형질감염된 COS 세포는 각 FACS 및 웨스턴 블롯 분석에서 항체 각각에 대한 결합을 나타내었다. 대조적으로, 대조 벡터로 형질감염된 COS 세포는 각 2.6.1 및 ABX-CBL 항체와의 결합에 대해 음성이었다. 파미겐 항체와 관련하여, 일부 배경 염색을 FACS상에서 대조 백터로 형질감염된 세포에서 관찰하였으며, 웨스턴 블롯 분석에서는 염색되지 않았다. 형질감염된 세포는 FACS에서 배경보다 상당한 결합력을 보여주며, 웨스턴 블롯 분석에서는 양성이었다. 우리의 결과로부터 ABX-CBL 및 2.6.1 항체가 CD147에 결합함을 확인하였다.

실험 11

진핵 세포에서 CD147의 클로닝 및 발현과 항체 결합

약간 변형된 벡터를 이용하여, 본 발명자들은 CD147 cDNA로 이.콜리 세포를 형질감염시켰다. 실험에서, 전술한 바와 같이 형성된 CD147 cDNA를 pBKCMV(스트라타젠)내로 서브클로닝하였다(도 22). CD147/pBKCMV 플라스미드 DNA를 이.콜리 균주 XL1-블루 MRF(스트라타젠)내로 형질전환시켰다. 1 mM 이소프로필-B-D-티오-갈락토피라노사이드(IPTG)의 존재하에 추가의 3 시간 동안 OD₆₀₀이 0.7인 50 ㎍/㎖에서 카나마이신으로 보충한 LB 배지에서 배양물을 증식시켰다. 원심분리로 세포를 수거하고 -20℃에서 냉동 저장하였다. ABX-CBL, 2.6.1 및 파미겐 항체 각각의 웨스턴 블롯 분석으로 입증되는 바와 같이, 이렇게 형질감염된 이.콜리 세포는 CD147 분자를 발현시킬 수 있다. 원핵 이.콜리 세포는 발현된 CD147을 글리코실화시키면 안되기 때문에, 이.콜리가 발현한 CD147의 분자량은, 약 27 KD의 CD147의 추정형 비글리코실화된 분자량에 근접할 것으로 예측된다. 실제로, 이 경우, 웨스턴 블롯 분석에서 3개의 항체의 결합은 약 27 내지 30 KD 범위의 밴드에 대하여 관찰되었다. 도 23B. 실시예 3에 개시된 절차를 이용하여 블롯을 수행하였다.

이 데이타는 ABX-CBL 및 2.6.1 항체가 CD147에 결합한다는 것을 추가로 확인한다. 또한, 이 증거는 CD147에 대한 ABX-CBL 결합은 탄수화물 결합을 주로 하지 않음을 제시한다. 즉, ABX-CBL은 CD147상의 탄수화물 에피토프에 직접 결합하지 않는다. 그러나, 이러한 데이타는 CD147에 대한 결합이 탄수화물 또는 글리코실화의 존재에 의해 영향을 받을 가능성을 배제하지 않는다.

실험 12

에피토프 분석

추가로 CD147에 대한 ABX-CBL 항체의 결합을 설명하기 위해서, 본 발명자들은 파지 디스플레이 실험을 수행하였다. 이러한 실험은 ABX-CBL 및 2.6.1 항체와의 결합에 대해 랜덤 펩티드를 발현하는 파지 라이브러리 선별을 통하여 결합되는 펩티드를 분리할 수 있는지 여부를 결정하였다. 성공적인 경우, 일부 에피토프 정보는 결합된 펩티드로부터 얻을 수 있다.

일반적으로, 랜덤 펩티드를 발현하는 파지 라이브러리를 박테리오파지 M13 시스템을 주로 하는 뉴 잉글랜드 바이오랩(각각 7량체 및 12량체 라이브러리, Ph.D.-7 펩티드 7량체 라이브러리 키트 및 Ph.D.-12 펩티드 12량체 라이브러리 키트)으로부터 구입하였다. 7-량체 라이브러리는 대략 2.0 ×10⁹독립 클론의 다양성을 나타내고, 전부는 아니라고 해도 대부분은 20⁷=1.28×10⁹가능한 단량체 서열을 나타낸다. 12량체 라이브러리는 대략 1.9 ×10⁹독립 클론을 포함하고, 20¹²=4.1 ×10¹⁵12량체 서열의 유효 서열 공간의 매우 작은 샘플링을 나타낸다. 7량체 및 12량체 각각의 라이브러리를 제조업자의 지시에 따라 선별 또는 검색하였다. 평판을 항체로 피복하여 적절한 항체를 포집하고(2.6.1 항체에 대한 염소 항인간 IgG Fc, ABX-CBL 항체에 대한 염소 항마우스 μ쇄) 세척하였다. 결합된 파지는 0.2 글리신-HCl, pH2.2로 용출시켰다. 일정한 엄중 조건(0.5% 트윈)에서 3회의 선별/증폭시킨 다음 DNA 서열 분석을 통하여, 본 발명자들은 ABX-CBL 항체와 반응하는 7량체 라이브러리로부터 총 5개의 클론을, 12량체 라이브러리로부터 6개의 클론을 특성 규명하고, 2.6.1 항체와 반응성이 있는 7량체 및 12량체 라이브러리로부터 총 6개의 클론을 특성 규명하였다. 이 펩티드의 반응성은 ELISA로 측정하였다. 펩티드의 에피토프 분석의 추가 논의는 문헌[Scott, J.K. 및 Smith, G.P. Science 249:386-390(1990); Cwirla 등 PNAS USA 87:6378-6382 (1990); Felich 등 J.Mol.Biol. 222:301-310(1991) 및 Kuwabara 등, Nature Biotechnology 15:74-78 (1997)] 참조.

공통 서열은 CD147과 2.6.1 항체의 반응성에 대해 명백하지 않다. 그러나, CD147의 아미노산 서열에 대한 특성 규명된 7량체 및 12량체 서열의 서열 정렬은 잔기 번호 177로부터 잔기 번호 188(ITLRVRSH(서열 번호 1))의 CD147내의 단일 서열에 대해 정합되는 수를 산출하였다. 특히, 각 7량체는 CD147의 이 서열내에 3개 이상의 잔기에 정합되는 서열(*로 표시)을 포함한다.

7량체 서열

(서열 번호 2)

(서열 번호 3)

(서열 번호 4)

(서열 번호 5)

(서열 번호 6)

또한, 12량체 중 4개는 CD147의 서열내 3개 이상의 잔기에 대한 서열 정합(*로 표시)을 포함하는데, 12량체 펩티드 번호 1의 경우 4개의 정합, 12량체 펩티드 번호 2에 대해 6개의 정합이 있다.

12량체 서열

(서열 번호 7)

(서열 번호 8)

(서열 번호 9)

(서열 번호 10)

(서열 번호 11)

(서열 번호 12)(결합 없음)

이들 결과는 서열 결정된 클론의 10개 중 존재하는 RXRS(서열 번호 11)의 공통 서열을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 하기 서열(-OH는 카르복시 말단을 나타냄)로 잔기 169-183을 선별하여 제조된 합성 펩티드를 얻었다(미국 캘리포니아주 산 조세에 소재하는 아나스펙 인코포레이티드).

(서열 번호 12)

하기, CD147의 아미노산 서열은 이중 밑줄선으로 표시된 15량체 펩티드 및 굵은 글시로 표시된 RXRSH(서열 번호 13) 공통 서열과 함께 제공되어 있다.

CD147 서열

(서열 번호 14)

15량체 펩티드는 ELISA를 사용하여 분석하고, ABX-CBL 항체가 펩티드에 특이적으로 결합함을 결정하였다. 또한, 2.6.1 항체와 대조 쥐 IgM 항체는 펩티드에 결합하지 않았다. 그러나, CD147 항원과 15량체 펩티드간의 경쟁 연구를 기초로 하여, 15량체 펩티드가 평판상에 피복되어 있고 펩티드가 용액내에 있지 않은 경우 ABX-CBL 항체의 15량체 펩티드에 대한 결합을 측정할 수 있다. 실제로, ABX-CBL 항체가 평판에 피복된 펩티드 또는 CD147 항원에 결합하는 경쟁 실험에서, ABX-CBL 항체는 고 농도에서 용액내 펩티드에 의해 제거되거나 대체되지 않는다. 그럼에도 불구하고, ABX-CBL 항체의 15량체 펩티드에 대한 결합은 CD147 항원 및 상기 양성 파지 제제와 특이적으로 경쟁할 수 있지만 비특이적 항원(즉, 세포막 또는 인간 혈장으로부터 분리된 L셀렉틴) 또는 상기 언급한 음성 파지 제제와는 경쟁하지 않는다. 유사하게, ABX-CBL 항체의 CD147 항원에 대한 결합은 예비 항온처리를 사용한 경쟁 분석에서 음성 파지 제제와 비교하여 양성 파지 제제와 특이적으로 경쟁할 수 있다.

이들 결과는 공통 서열 RXRSH를 포함하는 CD147내 서열이 CD147에 대한 ABX-CBL 항원의 결합에 중요하지만, CD147에 대한 ABX-CBL 결합을 완전히 설명할 수 없다. 실제로, 이 데이타는 평판에 결합된 경우 15량체 펩티드 또는 파지 피막 단백질에 고정된 경우 반응성 파지 물질내 포함된 공통 서열은 용액내 유리 펩티드에서보다 ABX-CBL 항체에 더욱 단단하게 결합된다. 임의의 특정 이론 또는 작용 방식에 구애받고자 하는 것은 아니지만, CD147은 용액내 15량체 펩티드와 유사하지 않은 일부 구조를 보유할 수 있다. 그렇지만 상기 에피토프 정보는 ABX-CBL 항체가 CD147에 결합하는 방식을 이해하고, 치료 표적으로서 CD147에 대한 기타 후보 분자를 생성하는데 중요하다.

CD147내 RXRSH 공통 서열의 존재와 관련하여 상기 결과 외에, 본 발명자들은 ABX-CBL이 결합하는 것으로 보이는 hn-RNP-k 단백질내 공통 서열의 존재를 찾았다는 것은 흥미로운 일이다. 이러한 분석은 전술한 파지 유도된 펩티드에 대한 서열 정렬로 수행하였다. 2개의 서열은 통계학적으로 흥미로운 정합을 보유하는 것으로 밝혀졌다.

첫번째, 7량체 펩티드 4와 5개 아미노산 정합(*로 표시)이 있었다.

(서열 번호 15)

두번째, 12량체 펩티드 1과 5개 아미노산 정합(*로 표시)이 있었다.

(서열 번호 16)

hn-RNP-k 단백질의 아미노산 서열은 이중 밑줄로 표시된 서열과 함께 하기에 제공되어 있다. 또한, RXR 서열 모티프의 수는 밑줄로 표시된 hn-RNP-k 단백질 서열내 존재한다.

hn-RNP-k 단백질 서열

(서열 번호 17)

임의의 이론 및 작용 방식에 구애받고자 하는 것은 아니지만, hn-RNP-k 단백질에 대한 ABX-CBL 항체의 결합은 단백질내 이들 모티프의 존재에 의해 부분적으로 설명될 수 있다.

실험 13

CD147의 발현 및 항체 결합

실제로, ABX-CBL 항체의 예비적 조직 분포 연구를 기초로 한 ABX-CBL 결합 및 효능의 모방은 바람직하다. 이 연구에서, ABX-CBL은 각종 조직에 널리 분포되어 있다. 그러나, 대부분의 분포는 비특이적 결합에 기인하는 것 같다. 그럼에도 불구하고, 내피 세포(소정맥, 소동맥, 그러나 모세층은 제외), 평할근 및 일부 소피에서 특이적 결합을 나타낸다. 또한, 림프망 조직은 결합되는 것 같지만, 염색은 거대 림프구, 활성화된 아세포에 제한되는 것 같다. 수행된 연구로부터, 세포외 염색과 세포내 염색을 구별하기 어렵다. 일정량의 세포질 염색은 명백한 증거이며 hn-RNP-k 결합과 관련되어 있다.

실험 14

ABX-CBL 항체 중 MOPC21 경쇄 활성의 활성 분석

2개의 상이한 기법을 사용하여 ABX-CBL 활성내 MOPC21 경쇄의 역할을 연구하고자 하였다. 이 기법에서, IgM 항체를 생산하는 세포주로부터 MOPC21 경쇄를 분리하고자 하였다. 제1 기법에서는, ABX-CBL IgM 생산 세포주와 또 다른 세포주(NSO)를 융합시켜 분리하였다. 제2 기법에서는, 자발적 손실 변형체로 분리하고자 하였다. 융합 기법은 성공적이었으며, 연구는 제2 기법에서 종결하였다.

융합 기법에서, 일반적으로 NSO 세포는 푸로마이신 함유 벡터로 형질감염시켜 푸로마이신⁺NSO 세포주를 형성하였다. ABX-CBL IgM 생산 세포주는 HAT 배지에서 증식시키고, 푸로마이신⁺NSO 세포주와 융합시켰다.

일반적으로, 융합은 다음 기법 및 절차에 따라 수행하였다.

세포의 제조

융합 전에, 융합에 사용하기 위한 모세포주를 DMEM 다량, 10% FBS, 1% 비필수 아미노산, 1% 펜스트렙, 1% L-글루타민을 포함하는 배지에서 증식시키고 유지하였다.

융합 전날, 각 모세포주를 제조하고, 분할하여 약 10⁵세포/㎖의 세포 밀도를 얻었다. 융합 당일, 세포를 계수하고, 각 모세포주에 대한 계수가 약 1.5∼2.5 ×10⁵세포/㎖의 범위내에 있다는 가정하에 융합을 개시하였다. 5 ×10⁶세포를 구성하는 충분한 양의 각 모세포주 각각을 배양물로부터 배출시키고, 50 ㎖ 원심분리관에 첨가하고, 세포를 대략 5분 동안 1200 rpm에서 펠렛화시켰다. 세포의 제조와 동시에, 불완전 DMEM, PEG 및 이중 선별 배지를 항온조에서 예비가열하였다. 펠렛화시킨 후, 세포를 20 ㎖의 불완전 DMEM에 재현탁시키고, 다시 펠렛화시켰다. 이 후, 세포를 5 ㎖의 불완전 DMEM내 재현탁시키고, 2개의 모세포주를 단일 튜브에 모으고, 다시 펠렛화시켜 두개의 모세포주를 포함하는 공동 펠렛을 형성한다. 공동 펠렛은 불완전 DMEM 10 ㎖내 재현탁시키고, 다시 펠렛화한다. 모든 상징액을 공동 펠렛으로부터 제거하고, 세포를 융합시킬 준비를 한다.

융합

모든 상징액을 제거한 후에, 1 ㎖ PEG를 1분 동안 교반하면서 공동 펠렛에 첨가한다. PEG 첨가가 끝난 후에, 피펫으로 1분 동안 계속 살며시 교반하거나, 또는 현탁된 공동 펠렛을 1분 동안 정치시킬 수 있다. 이 후, 불완전한 DMEM 10 ㎖를 5분 동안 서서히 교반하면서 공동 펠렛에 첨가하였다. 그 다음 혼합물을 5분 동안 약 1200 rpm에서 원심분리하고, 원심 분리 후, 상징액을 흡입 제거하고, 완전 이중 선별 배지 10 ㎖에 세포를 첨가한 뒤 살며시 교반하였다. 이어서, 세포를 10개의 96웰 미량역가판에 100 ㎕/웰에서 평판배양하여, 항온기(37℃, 10% CO₂)에 두고 1주일 동안 방치한다. 일주일의 계대 배양 후에, 100 ㎕의 불완전 이중 선별 배지를 각 웰에 첨가하여 평판을 공급한다.

이중 선별 배지는 모세포주와 함께 이용되는 마커 유전자에 따라 제조한다. 대다수의 실험에서, 히포크산틴 및 티미딘 내성의 푸로마이신 및 히그로마이신을 부여하는 선별 마커를 이용한다. NO/0 세포의 완전한 세포 사멸을 얻는데 필요한 농도는 사멸 곡선을 통하여 측정하였으며, 푸로마이신 6 ㎍/㎖ 및 히그로마이신 350 ㎍/㎖를 사용하였다. HPRT 내성과 관련하여, 본 발명자들은 표준 조건을 사용한 시그마에서 입수한 HAT 배지 보충물을 사용하였다.

본 실험의 경우, 세포는 푸로마이신⁺/HAT 내성에 대해 선별하였다. 개별 클론을 선별을 기초로 취하고, 클론을 96웰 평판에서 확장시켰다. 평판을 분할(냉동 저장물의 경우 1/2, 성장하는 경우 1/2)하였다. 총 RNA는 제조업자의 지시에 따라 퀴아겐 96-웰 RNA 분리 키트를 사용하여 증식 평판으로부터 분리하였다. 프라이머는 각 쇄에서 고유의 제한 부위를 포함하는 쇄의 단편을 증폭시킨 MOPC21 및 ABX-CBL 카파쇄의 보존 부위를 기초로 고안하였다.

제한 부위	쇄	위치
AgeI(BsrFI)	MOPC21	135
BstYI	MOPC21	173
KpnI	ABX-CBL	85
NsiI	ABX-CBL	130
XcmI	MOPC21	58

5 프라이머:(서열 번호 44)

위치 99-116은 BstY1 제한 부위를 분석할 수 있거나; 또는

5 프라이머:(서열 번호 45)

위치 40-54는 NsiI 및 KpnI 제한 부위를 분석할 수 있으며,

3 프라이머:(서열 번호 46).

따라서, 상기 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 적절한 제한 효소로 분해하여 MOPC21 또는 ABX-CBL의 존재 또는 부재를 아가로스 겔 전기영동에서 쉽게 검출할 수 있다. 상기 기법을 사용하여 MOPC21 경쇄가 발현되지 않지만 ABX-CBL 카파는 보유하는 6개 이상의 변형체를 얻었다. ABX-CBL 카파쇄는 발현하지 않지만 MOPC21 쇄는 보유하는 변형체는 직접 얻지 못하였다. 그러나, 본 발명자들은 ABX-CBL 경쇄의 최소 생산자인 것으로 보이고 세포주를 분리하여 서브클로닝하였다. 이는 이종 MOPC21/ABX-CBL 경쇄 생산자 및 MOPC21 경새 생산자의 혼합형 세포주로 판명되었다. 따라서, 본 발명자들은 서브클로닝 후에 MOPC21만을 생산하는 생산자를 분리하였다.

MOPC21 경쇄를 함유하는 항체와 ABX-CBL 경쇄 함유 항체를 비교하여, MOPC21 경쇄의 존재 또는 부재가 실질적으로 밀착된 항체 결합 또는 항체 특성을 나타내지 않는다는 결론을 뒷받침하였다. MOPC21 경쇄를 포함하는 항체는 웨스턴 블롯에서 CEM 세포 또는 CD147에 대해 강하게 결합하지 않는 것으로 나타났다.

실험 15

CD147에 대한 인간 항체의 형성 및 특성 결정

실험 1에 따라서, 본 발명자들은 완전한 인간 항CD147 항체의 패널을 형성하였다. CD147과의 결합에 대한 ELISA 분석과 ABX-CBL과 경쟁하는 능력에 대한 FAC로 항체를 검색하였다. 일부 항체를 서열 결정하였다. 일부 항체의 서열을 아미노산 서열에서 체세포 변이에 대한 배선 V 유전자 분절의 전사체와 비교하였다. 이러한 서열 비교는 도 44 내지 도 46에 제시되어 있다. 항체 각각의 cDNA 서열 및 단백질 전사체를 도 24 내지 도 33에 도시하였다. 또한, 카벳 번호 매김 방법에 따라 항체의 중쇄 및 카파 경쇄의 CDR을 도 34 내지 도 43에 도시하였다.

수행된 다수의 시험, 특히 ABX-CBL과 일부 항체의 경쟁 연구에서, 추가의 형성에 대한 2.6.1 IgM 항체를 선별하였다.

실험 16

IgG1, IgM 및 다량체 IgM 항체의 형성을 위한 2.6.1 발현 벡터의 형성

CBL1 및 ABX-CBL 항체와 유사한, ADCC에서 작동하는 2.6.1 항체의 능력을 조사하기 위해서, 본 발명자들은 2.6.1 항체의 IgM 및 IgG1 아이소타입 제조에 관심을 갖게 되었다. 2.6.1 항체가 IgG2를 IgG1으로 아이소타입 전환시키는 것은 비교적 간단하다. 반면에, 2.6.1 항체를 다량체 IgM으로 전환시키는 것은 일부 추가의 단계가 필요하다.

인지되는 바와 같이, 제노마우스 동물로부터 형성된 모든 IgM은 1가이다. 따라서, 완전한 인간 다량체 IgM 항체를 제조하기 위해서, 본 발명자들은 인간 백혈구 연층 세포로부터 인간 J쇄 유전자를 클론하였다. 인간 J쇄 cDNA의 서열은 하기에 도시되어 있는데, 5' 비해독형 부분은 밑줄 친 굵은 이태릭체로 표시되어 있다.

(서열 번호 47)

다음 서열을 갖는 J쇄 유전자는 인간 J쇄를 암호화한다.

(서열 번호 22)

추가의 클로닝을 위해 제시된 제한 부위로 갱신한 하기 프라이머는 인간 백혈구 연층 세포로부터 RT-PCR 제조된 물질 중 인간 J쇄 cDNA를 증폭시키기 위해서 고안하였다.

(서열 번호 48)

(서열 번호 49)

RT-PCR을 통해 분리된 J쇄 cDNA 및 2.6.1 카파 유전자를 상기 프라이머를 사용하여 증폭하고, 오픈 리딩 프레임이 159 아미노산 J쇄 단백질을 암호화하는 500 염기쌍 PCR 생성물을 분리하였다. PCR 생성물은 TA 클로닝 키트(인비트로겐)로 클로닝하고, 각 말단에 EcoRI 제한 부위를 두었다. 이 벡터를 EcoRI로 분해하고, 분해물을 EcoRI로 절단된 pWBFNP MCS(도 47)내로 클로닝하고 CIP로 처리하였다. 삽입체의 방향은 방향을 기준으로 상이한 크기의 단편을 형성하는 PvuII로 분해하여 결정하였다(PvuII 부위는 도 47에 도시된 바와 같이 pWBFNP MCS 벡터내 J쇄 삽입체 중 421 위치에 존재한다.) 이 벡터를 pWBJ1이라고 불렀다.

2.6.1 카파쇄는 VJCK 삽입체의 각 말단에 EcoRI 부위를 제공하는 TA 클로닝 키트와 다음과 같은 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰다.

5 프라이머:(서열 번호 50)

3 프라이머:(서열 번호 51)

카파쇄를 서열 결정하였다. 카파 cDNA는 EcoRI 분해하고 pWBFNP MCS내 EcoRI 부위내로 클로닝하였다. 도 33에 도시된 바와 같이 pWBFNP MCS내 NotI 부위와 카파 삽입체의 243번 위치에 포함된 PstI 부위의 NotI 및 PstI 분해에 의한 단편 크기를 기초로 방향을 결정하였다. 이 벡터를 pWBK1이라고 명명하였다.

pWBJ1으로부터 pWBK1내로 J쇄 발현 카세트를 삽입하기 위해서, pWBK1을 PacI으로 절단하고 평할 말단으로 만든 다음 AvrII로 재절단하고, pWBJ1은 SpeI로 절단하고 평할 말단을 만든 다음 AvrII로 재절단하고, 평할 말단을 갖는 SpeI/AvrII 단편을 pWBK1 평할 말단 PacI/AvrII내로 클로닝하여 pWBK1(J)를 산출하였다. pWBK1(J)는 2.6.1 카파쇄 및 J쇄에 대한 발현 카세트를 포함하였다.

또한, pWBK1(J)은 NotI 분해를 통해 pWB DHFR(NotI에서 DHFR 함유)로부터 pWBK1(J)내로 NotI 부위에서 DHFR을 클로닝시켜 DHFR 내성을 함유하도록 변형시켰다. 이 벡터를 pWBK1(J) DHFR이라고 명명하였다.

IgG1 발현 벡터를 제조하기 위해서, 2.6.1 중쇄는 다음 프라이머와 TA 클로닝 벡터(인비트로겐)를 사용하여 RT-PCR을 통하여 증폭시켰다.

5 프라이머:(서열 번호 52)

3 프라이머:(서열 번호 53)

3' 감마 1 NheI(NheI 제한 부위를 도입시킴)

생성물은 VDJ cDNA 서열을 포함하지만 불변부는 포함하지 않는다. 서열은 서열 결정으로 확인하였다. 이 벡터는 하기와 같이 IgG1 발현 벡터를 제조하는데 이용하였다.

pWBFNP MCS를 EcoRI로 분해하고 CIP로 처리하였으며, 상기 TA 벡터 유래의 EcoRI 분해물을 벡터내로 클로닝하였다. 방향은 삽입체를 확인하는 NheI로 분해 후 NotI로 분해하여 크기에 의해 결정하였다. 이 벡터를 pWBVDJ261NheI라고 불렀다. PWBVDJ261NheI를 XhoI로 절단하고, 말단을 평할화시킨 다음 NheI로 재절단하였다. 인간 감마1 작제물을 감마1을 포함하는 pWBFNP 벡터로부터 클로닝하고, NheI 및 EcoRI 부위 사이의 불변부를 EcoRI로 절단하고 평활 말단화한 다음 NheI로 재절단하였다. 이 벡터를 pWBVDJ261G1(또는 pWBIgG1)이라고 명명하였다. HindIII으로 절단하고, 평활 말단화한 후 AvrII로 재절단시킨 pIK6.1+푸로 벡터(도 48)로부터 푸로마이신 카세트를 클로닝하였다. pWBIgG1을 PacI로 절단하고, 평할 말단화시킨 후, AvrII로 재절단하여 푸로 카세트를 그 내부에 클로닝하였다. 이 벡터를 pWBIgG1 푸로라고 명명하였다.

IgM 발현 벡터를 제조하기 위해서, 2.6.1 중쇄는 하기 프라이머와 TA 클로닝 벡터(인비트로겐)을 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰다.

5 프라이머:(서열 번호 54)

3 프라이머:(서열 번호 55)

3' Mu BamHI(BamHI 제한 부위를 도입시킴)

생성물은 VDJ cDNA 서열을 포함하지만 불변부는 포함하지 않았다. 서열은 서열 결정으로 확인하였다. 벡터를 이용하여 IgM 발현 벡터를 하기와 같이 제조하였다.

pWBFNP MCS는 EcoRI로 분해하고 CIP로 처리하였으며, 상기 TA 벡터 유래의 EcoRI 분해물을 벡터내로 클로닝하였다. 방향은 삽입체를 확인하는 BamHI로 분해 후 NotI로 분해하여 크기에 의해 결정하였다. 이 벡터를 pWBVDJ261BamHI라고 불렀다.

인간 Mu 작제물은, Mendez 등의 문헌[(1997), 상기 참조] 및 미국 특허 출원 08/759,620호(1996년 12월 3일)에 기재된 바와 같이 하기 프라이머와 TA 클로닝 벡터(인비트로겐)를 사용하여 RT-PCR을 통해 효모 인공 염색체 작제물인 YAC 2CM으로부터 PCR 증폭시켰다.

5 프라이머:(서열 번호 56)

(5' 말단에 BamHI 제한 부위를 도입시킴)

3' 프라이머:(서열 번호 57)

벡터 pWBVDJ261BamHI을 BamHI으로 절단하고 XhoI로 재절단하였다. Mu 삽입체를 함유하는 TA 클로닝 벡터를 BamHI 및 XhoI(TA 벡터내 또 다른 부위임)로 절단하고 pWBVDJ261BamHI의 BamHI/XhoI 부위내로 클로닝하였다. 생성 벡터를 pWBVD1261IgM(또는 pWBIgM)이라고 명명하였다. 또한, 벡터에, pWBIgG1 푸로의 작제와 연관하여 전술된 바와 동일한 방식으로 푸로마이신 카세트를 구비시켰다. 생성 벡터를 pWBIgM 푸로로 명명하였다.

실험 17

2.6.1 IgG1 항체를 발현하는 세포주 형성

2.6.1 IgG1 항체를 발현하는 세포주를 형성하기 위해서, 본 발명자들은 전기사출법으로 pWBIgG1 푸로 벡터와 pWBK1 DHFR 벡터를 이용하여 DHFR^-CHO 세포를 동시 형질감염시켰다. 동시 형질감염은 약 2 ×10⁷DHFR^-CHO 세포 저장물을 취하고, 선형 플라스미드 DNA 200 ㎍과 캐리어 DNA 200 ㎍을 290 V, 960 μFD에서 전기사출시켜 수행하였다. 세포는 α⁺배지에 접종하고, 2일 동안 증식시켰다. 8 ×10⁵세포를 4 ㎍/㎖ 푸로마이신 선별배지의 α^-배지에서 10 cm 접시에 접종하였다. 세포를 4 내지 5일 동안 항온 처리하고, 10 cm 접시 당 5 ×10⁵세포에서 0.5 μM MTX를 사용하여 α^-배지로 이전시켰다. 세포를 약 14일 동안 선별을 위해 항온 배양하고, 그 후 클론을 취하여 증식시키고, CD147에 대한 결합 능력과 IgG1의 존재에 대해 분석하였다.

본 발명자들은 CD147에 특이적으로 결합하는 감마-1 아이소타입을 갖는 2.6.1 항체를 발현하는 다수의 클론을 회수하였다.

실험 18

2.6.1 다량체 IgM 항체를 발현하는 세포주 형성

2.6.1 다량체 IgM 항체를 발현하는 세포주를 형성하기 위해서, 본 발명자들은 전기사출로 pWBIgM 푸로 벡터 및 pWBK1(J) DHFR 벡터로 DHFR^-CHO 세포를 동시 형질감염시켰다. 실시예 18에 개시된 동일한 기법을 사용하였다.

본 발명자들은 CD147에 특이적인 다량체 Mu 아이소타입을 갖는 2.6.1 항체를 발현하는 다수의 클론을 회수하였다.

실험 19

2.6.1 IgG1 및 다량체 IgM 항체의 특성 규명

2.6.1 IgG1 및 다량체 IgM 항체의 기능을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 일부 분석에서 항체를 평가하였다. 각 2.6.1 IgG1 및 다량체 IgM을 각각 CBL1 및 ABX-CBL과 유사한 방식으로 CEM 세포에 결합시키고, CD25⁺활성화된 인간 말초 혈액 세포에 결합시켰다. 항체는 전술한 바와 유사한 방식으로 효능 및 세포 용해 분석에서 분석하였다. 이들 실험과 관련하여, 2.6.1 다량체 IgM 항체는 CBL1 및 ABX-CBL과 활성이 유사한 것으로 보이다. 또한, 2.6.1 다량체 IgM 항체는 도 50에 도시된 바와 같이 ADCC에서 작용할 수 있었다.

실험 20

2.6.1 다량체 IgM 항체의 친화도 측정

본 발명자들은 ABX-CBL 및 2.6.1 항체의 일부 기타 형태와 비교하여 2.6.1 다량체 IgM 항체의 친화도를 조사하였다. 친화도 측정은 Mendez 등의 문헌[(1997), 상기 참조] 및 미국 특허 출원 제08/759,620호(1996년 12월 3일 출원)에 개시되어 있다. 결과는 하기 표에 제시되어 있다.

항체	Ig 종류	개시 속도ka(M-1s-1)	종결 속도kd(s-1)	KAkd/ka(M)	KDkd/ka(M)	BIA코어 표면Hu rCD147-IgG[RU]
ABX-CBL	M IgM	7.25×105	3.76×10-4	1.39×109	5.18×10-10	791
ABX-CBL	M IgM단량체	6.34×104	4.94×10-3	1.28×107	7.84×10-8	791
CEM 2.6.1	Hu IgG2	8.20×105	3.75×10-4	2.19×109	4.57×10-10	791
CEM 2.6.1	Hu IgG2	7.17×105	4.03×10-4	1.78×109	5.61×10-10	242
CEM 2.6.1	Hu IgM	6.52×105	2.03×10-4	3.21×109	3.12×10-10	242
CEM 2.6.1	Hu IgM단량체	2.63×105	1.67×10-3	1.57×108	6.39×10-9	242
CEM 2.6.1	Hu IgG1	3.13×105	2.01×10-4	1.55×109	6.43×10-10	242

실험 21 ABX-CBL 항체를 이용한 인간 임상 시험

ABX-CBL의 단계 II 임상 시험

A. 배경

전술한 바와 같이 CBL1 항체에 대하여 관찰한 양성 결과를 기초로 하여 ABX-CBL를 이용한 임상 시험을 실시하였다. 이러한 시험 중 제1 단계는 스테로이드 내성 GVHD를 앓는 환자에게 4회 용량의 ABX-CBL을 복수회 정맥내 주입하여 조사하는 단계 II 복수센터, 공개 라벨, 용량 단계적 상승 임상 시험이다. 이 시험에는 코르티코스테로이드로 최소 3일간 처리한 후에도 무반응성이고, 변형 IBMTR 중증도 지수[Rowlings et al. "IBMTR severity index for grading acute graft-versus-host disease: retrospective comparison with glucksberg grade" British Journal of Haematology 97: 855-864(1997)]에 따라 측정된 중증도 지수가 최소 B인 급성 GVHD를 앓는 환자를 등록시켰다. 이 시험에서는, 4가지 다른 용량을 7일간의 유도 섭생 후 유지 용량을 주마다 2회씩 2주 동안 투여하는 용량의 점진적 상승 디자인으로 정맥내 투여하였다. 치료 과정이 완료된 후 8주 동안 환자를 관찰하였다. 그 다음, 장기 안전성의 추적조사를 실시하였다.

본 연구는 다음과 같이 검토 중인 3가지 1차 목표와 4가지 2차 목표를 가지고 디자인하였다.

1차 목표는 (i) 스테로이드 내성의 급성 GVHD 환자에 대한 ABX-CBL의 복수 용량의 안전성을 평가하고, (ii) 스테로이드 내성의 급성 GVHD 환자에 대하여 ABX-CBL의 최대 내성 IV 용량을 결정하며, (iii) 스테로이드 내성의 급성 GVHD 환자에 대한 복수 용량의 ABX-CBL의 약물동력학을 측정하는 것이다.

2차 목표는 (i) 스테로이드 내성의 급성 GVHD 환자에 대한 4가지 상이한 용량의 ABX-CBL의 임상 효능을 측정하고, (ii) ABX-CBL의 용량 응답 반응을 평가하며, (iii) 복수 용량의 ABX-CBL을 투여한 급성 GVHD 환자의 장기간 안전성을 평가하고, (iv) 복수 용량의 ABX-CBL을 투여한 급성 GVHD 환자의 장기간 존재성을 측정하는 것이다.

ABX-CBL의 용량을 결정하는 일은 필수적인 사항으로 간주된다. 전술하였듯이, 1차 임상 시험은 정제하지 않은 복수액을 이용한 CBL1 항체를 사용하여 수행하였다. 따라서, 환자에게 제공된 물질 중에 존재하는 항체의 농도는 알 수 없다. 또한, CBL1은 IgM 뿐만 아니라 IgG도 생성하는 세포주에서 생성되기 때문에 환자에게 제공되는 IgM 항체의 농도는 다소 명확하지 않았다.

상기 목표를 측정하기 위하여, 다음과 같은 용량의 환자 코호트를 이용하여 4 코호트의 시험 계획을 세웠다.

코호트 1 : 0.01 ㎎/㎏

코호트 2 : 0.1 ㎎/㎏

코호트 3 : 0.3 ㎎/㎏

코호트 4 : 1.0 ㎎/㎏

모든 코호트의 환자들에게 ABX-CBL을 최고 11회의 정맥내 주입액으로 투여하였다. ABX-CBL은 주사기 펌프를 통해 2시간 동안 주입하였다. 투여는 7일 동안 매일 투여한 다음, 2주 동안은 주당 2회씩 투여하도록 계획하였다. 안전성 평가는 다음 용량의 코호트로 진행하기 전에 실시하였다. 총 4가지 용량 코호트에 대하여 27명의 환자를 이용하였다.

연구 수행 중, ABX-CBL 0.3 ㎎/㎏을 투여한 코호트 3의 환자에서는 부작용이 관찰되었다. 즉, 환자 몇 명에서 근육통 또는 근육통 유사 증후군이 관찰되었다. 결과적으로, 코호트 3의 용량(0.3 ㎎/㎏)이 최대 허용 용량으로서 결정되었다. 따라서, 코호트 4의 용량은 0.2 ㎎/㎏으로 감소시켰다, 결과적으로, 본 연구에 사용된 실제 용량은 다음과 같다.

코호트 1 : 0.01 ㎎/㎏

코호트 2 : 0.1 ㎎/㎏

코호트 3 : 0.3 ㎎/㎏

코호트 4 : 0.2 ㎎/㎏

본 연구에 등록할 수 있는 환자의 자격 요건은 다음과 같다.

* 1 년령 또는 그 이상인 환자

* 100일 내 간(幹) 세포 이식한 환자

* 중증도 지수가 B, C 또는 D인 스테로이드 내성 급성 GVHD 환자

* 연구자, 보증인의 의학적 모니터 및 FDA에 의한 상호 협정이 없는 한, 등록하기 30일 내에 실험 약물이나 장치를 사용한 적이 없는 환자

* GCSF 또는 GMCSF의 존재 유무에 관계없이 ANC ＞500/㎣인 환자

환자가 자격 기준에 부합하면 치료 코호트로 선발하여 두었다. 그 다음, 표준 간 세포 이식 처리 후 방법으로 계속 처리하였다.

투여가 개시되면, 환자에게 7일 동안 각 용량 코호트의 해당 용량의 ABX-CBL을 매일 주입(유도 섭생이라 함)한 다음 2주 동안 매주 2회씩 주입(유지 섭생이라 함)하였다. 이와 같이 주입한 후 8주 동안 환자를 안전성과 임상 효과에 대하여 조사하였다(4주간은 매주 방문하고, 그 다음 4주 후에는 1회 방문함). 또한, ABX-CBL을 1회 이상 주입한 환자를 장기간 후속 프로그램으로 처리하여 ABX-CBL의 장기간 안전성 및 장기간 존재성을 평가하였다.

안전성은 ABX-CBL 주입 동안의 생명 신호 뿐만 아니라 연구 중의 부작용을 모니터하여 평가하였다. 또한, 종종 환자의 신체 검사를 수행하고 실험실 연구를 충분히 실시하였다. 실험실 연구로는 하기 개략한 바와 같은 일정 주기 마다 실시되는 소변 검사, 전혈액 계수, T 세포 서브세트 및 혈청 화학을 포함한다. 모든 환자들에 대하여 동형효소를 가진 기본 CPK를 얻고, 임의의 주입 관련 부작용을 나타내는 환자에 대해서는 CPK 및 동형효소로 재분석하였다. 또한, ELISA를 통해 인간의 항마우스 항체(HAMA) 반응에 대하여 조사하였다. 각 코호트 중 5명의 환자에게서 pK 프로필의 약물동력학적 혈액 샘플을 채취하였다.

ABX-CBL의 임상 효과는 변형 IBMTR 중증도 지수[Rowlings et al. "IBMTR severity index for grading acute graft-versus-host disease: retrospective comparison with glucksberg grade" British Journal of Haematology 97: 855-864(1997)], 응답 시간, 응답반응의 기간, 급성 GVHD 돌발 시간과 빈도 및 입원 기간에 기초하여 급성 GVHD의 총 스코어의 변화를 평가하여 측정하였다.

B. 프로토콜 절차

임상 시험과 관련하여, 이용된 테스트, 관찰 계획, 시험 약물의 제조는 다음과 같다.

＾ 이 방문은 시험 약물의 주입후의 방문이 아니라 동종 간세포 이식 100일 후의 방문이다.

* 무작위화 7일 이내에 수행되지 않은 경우에 수득함(ECG는 환자가 ≥16세인 경우에만)

C/A C=완전 PE, A=개략적 PE

1 최초 방문시에만 신장 측정

2 무작위화 요구 48 시간이내에 측정

3 환자가 임의의 주입 관련 AE를 나타내는 경우 기준시점에서 수득(프로토콜 참조)

4 혈청 임신성은 임신의 가능성이 있는 여성에 대해서만 수득(프로토콜 참조)

5 시험 약물 주입 개시 시점에서 8 시간 이내의 결과가 없다면 수득함

6 주입 개시 이전(최대 10 분), 처음 주입 1시간 동안 15분 마다, 그 다음 주입 개시 후 90분, 120분, 180분, 240분, 300분 및 360분에 생명 신호(T, P, R, BP) 수득

7 주입 개시 이전(최대 12시간)에 수득

8 처음 주입 개시 바로 이전과 제1 주입 완료후의 다음과 같은 시점, 즉 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 및 24시간(2차 주입 이전) 및 9일째와 20일째 주입을 완료한지 4 시간 후(지정된 환자에 대해서만) 수득

9 단지 4주 및 6주째 수득

10 연구 말기에 +인 경우 장기 후속 처리 동안 수득

11 GVHD 상태 및 통상적인 처리

12 진행되는 모든 AE 해소

13 쥐 유래 생성물을 환자에게 사전 주입한 경우 선발 동안 HAMA 수득. 이것은 유효한 결과를 얻을 수 있도록 음성일 필요가 있다. 쥐 생성물 주입받은 적이 없는 환자인 경우에는 주입 개시 이전 0일째 수득해야 함

임상 시험에 있어서, 변형 IBMTR 중증도 지수의 측정은 한 의사가 실시하는 것이 바람직하다.

다음과 같은 실험들은 각 임상 구역에서 실험실적으로 완료되어야 한다(국소 실험).

혈액학	혈청 화학
CBC 차백혈구세포수(WBC)WBC차(diff)- 밴드/천자(bands/stabs)- 호중구- EOS- 호염기구- 림프구- 단핵구적혈구 세포수(RBC)헤모글로빈(Hgb)헤마토크리트(Hct)혈소판수(Plt)소변 검사비중PH단백질글루코스케톤	나트륨(Na)칼륨(K)염화물(Cl)중탄산염(HCO3)글루코스혈뇨 질소(BUN)크레아티닌(Cr)요산알부민총 단백질총 빌리루빈(bili)알칼리 포스파타제(alk phos)알라닌 아미노트란스퍼라제(ALT, SGPT)아스파테이트 아미노트란스퍼라제(AST, SGOT)칼슘(Ca)인산염(PO4)CPK-III 동형효소*(mm)(골격근)여성 : 혈청 임신(적용되는 경우)
* 주입 관련 AE 환자에 대하여 초기 및 주입후 동형효소를 보유한 CPK를 얻음

또한, 중앙 시험 실험실에서 다음과 같은 실험실적 평가를 수행하였다.

●T 세포 아군(CD3,4,8) 및 CD19 : 림프구 수, % 및 CD4:CD8 비.

또한, 아브게닉스, 인크사에서 다음과 같은 실험 평가를 수행하였다.

● HAMA 용 ELISA

● pK(쥐 생성물을 투여받은 환자를 포함하여 최소 환자 5명/코호트)

연구 약물(ABX-CBL)을 다음과 같이 제조하여 투여하였다.

ABX-CBL은 단백질로서, 기포가 발생하지 않도록 조심스럽게 다루어야 한다. 생성물 취급, 제조 및 투여 동안의 기포 발생 방지는 기포가 단백질 생성물의 변성을 유도할 수 있기 때문에 중요하다. 제약학자가 연구 약물의 각 용량을 제조하게 하였다. 용량은 무작위적이고 환자의 코호트 지정 이전에 환자의 체중에 기초하여 결정하였고, 따라서 환자는 총 11회의 주입 동안 동일 용량을 투여받게 된다. 그 다음, 주사기와 필터(아브게닉스 제품)를 준비하고 투여를 위하여 환자에게 전달하였다.

주입 준비 : 무균 기법을 사용하여 주입 주사기를 준비하였다. 시험 약물을 적당량 주사기에 충전한 뒤, 그 다음 발열원 제거된 0.9% 염화나트륨 용액, USP(식염수 용액)을 계산된 용량으로 주입하였다. 0.22 마이크론의 저단백질 결합 필터를 부착시키고 제조자의 지시에 따라 유체 손실이 최소가 되도록 튜브를 설치하였다.

주입 용량 : 각 주입시 마다 주입될 총 주입 용량(시험 약물 + 식염수 용액)은 환자의 체중(㎏)과 동일하다. 그 예는 다음과 같다.

환자 체중(㎏)	코호트 분류	총 주입 용량(㎖)
70 ㎏	0.01	70 ㎖
70 ㎏	0.1	70 ㎖
70 ㎏	0.3	70 ㎖
70 ㎏	0.2	70 ㎖

하기 식을 사용하여 각 용량마다 시험 약물 및 식염수 용액의 용량을 결정하였다.

a. 필요 용량 = 환자 체중 x ㎎/㎏(㎎/㎏을 코호트 분류의 기준으로 삼았다).

b. ABX-CBL 필요 용량 = 용량/시험 약물 농도(1 ㎎/㎖)

c. 필요 바이얼 수 = ABX-CBL 필요 용량(상기 b)/5 ㎖(각 바이얼은 ABX-CBL 5 ㎖를 포함함).

d. 총 투여 용량 : 모든 처리 코호트당 환자에게 체중(㎏)과 동일한 총 용량을 투여하였다(예컨대, 15 ㎏ 환자에게는 총 15 ㎖를 투여하고, 70 ㎏ 환자에게는 70 ㎖를 투여함).

예:70 ㎏ 환자에게 0.3 ㎎/㎏ 투여함a. 70 ㎏ x 0.3 ㎎/㎏ = 21 ㎎b. 21 ㎎ = 21 ㎖c. 21 ㎖/5 ㎖/바이얼 = 4.2 바이얼, 따라서 5개 바이얼이 필요함.d. 70 ㎖(총 용량) - 21 ㎖(시험 약물 용량) = 49 ㎖(식염수 용액)

표지하여 충전된 주입 주사기를 주입용 환자 유닛으로 전달하고, 주입 세트에 존재하는 모든 클램프를 조여 시험 약물 및/또는 일반 식염수의 누출을 방지하였다. 모든 캡을 제위치에 고정시켜 밀폐계를 유지시켰다. 주입 주사기 마다 라벨을 부착시켰으며, 이 라벨은 다음을 포함한다.

● 환자 연구 ID와 머리글자를 기록할 공간.

●사용기한 날짜 및 시간과 함께 시험 약물을 제조한 날짜와 시간을 기록할 공간.

● 시험 약물 및 주입 세트를 제조한 사람의 머리글자를 기록할 공간.

● 주입 지시문 :

"주 : 연방정부법에 따른 연구용에 대한 신규 약물 규정"

주입액을 주사기 펌프를 통해 2 시간에 걸쳐 투여함

다른 약물과 혼합 금지*

● 총 용량에 기초하여 주입 속도를 기재할 공간. 70 ㎖ 용량인 경우, 주입 속도는 35 ㎖/시간이어야 한다.

시험 약물 제조자는 라벨 상의 상기와 같은 지시문을 이행할 책임이 있다.

주입시, 대부분의 환자는 내재성 주선을 갖고 있어, ABX-CBL 주입을 위한 전용선이 있다면 새로 카테터가 필요하지 않을 것이다. ABX-CBL 투여시에는 다른 약물이 특정 입구 또는 IV선을 통해 주입되지 않아야 한다. 주선을 이용할 수 없다면, ABX-CBL은 말초 정맥선으로 주입할 수 있다. 이것은 하나의 시험이기 때문에 ABX-CBL을 다른 약물과 혼합하지 않았다. 다른 약물이 입구에서 사전에 주입되었다면, 일반 식염수 3 내지 5cc(카테터 크기, 사용된 관강 및 환자의 크기에 따라 달라짐)로 관강을 세정하여 그 선에 존재하는 임의 약물을 제거하고, 약제사에게서 새로운 주입 장치를 얻어 주입용 입구 또는 3방향 콕마개(다른 선 위에는 장착되지 않음)에 부착시켰다.

프로토콜은 다음과 같은 4단계 연구 기간, 즉 선발, 처리, 후속 처리 및 장기간 후속 처리로 구성하였다.

1. 선발 기간

선발 기간은 환자 또는 환자의 법적 보호자가 통지받은 동의서에 서명한 날부터 시작하여 마지막으로 처리 지정 통지시 까지로 한다. 본 연구에는 간세포 이식후 최고 100일 이내인 환자를 선발하여 본 연구에 등록시킬 수 있다. 스테로이드 내성의 급성 GVHD가 발생되지 않는 환자는 본 연구에 등록시키지 않았다.

각 환자는 IRB에서 승인하여 통지한 동의서를 이해하고 서명해야만 한다. 환자가 미성년이면 환자의 법적 보호자가 그 동의서에 서명해야만 한다.

그 동의서에 서명을 한 후 치료 지시를 요구하기 전에 다음과 같은 절차를 이행해야만 한다. 이 절차의 결과는 별다른 지시가 없는 한 8 시간 이내의 것이어야 한다. 이 절차는 다음을 포함한다.

a. 완전한 의학적 이력

b. 체중(이것은 연구중 시험 약물의 필요 용량을 결정하는데 사용되는 중량이다) 및 신장을 비롯한 완전한 신체 검사

c. 생명 신호(구강 온도, 휴면시의 맥박, 호흡 및 혈압)

d. 처리 지시 요구 이전 30 일 동안의 약물 처리 이력 및 간세포 이식 처리 이력

e. 급성 GVHD에 대한 변형 IBMTR 중증도 지수

f. 병발증의 평가

g. 카노프스키 수행 등급(KPS)(16세 이상) 또는 랭스키 등급(16세 미만)

h. 무작위 선발 이전 48 시간 이내에 얻은 다음과 같은 실험 결과가 없다면 다음과 같은 처리를 하였다.

- CBC 차 및 혈소판

- 혈청 화학(부록 V 참조)

- 기준 CPK-III 동형효소(mm)

- 혈청 임신 시험. 이것은 임신가능성이 없는 여성이나 연구가의 견해상 간세포 이식의 사전처리로 인하여 불임이 될 여성에 대해서는 제외될 수 있다.

- 소변 검사

i. 사전 7일 이내에 검사되지 않은 경우 CXR 처리.

j. 16세 이상의 모든 환자의 경우에 사전 7일 이내에 검사되지 않은 경우 ECG 처리.

k. 쥐의 키메라 생성물 또는 완전 쥐 생성물을 사전 투여한 모든 환자에 대하여 양성 HACA/HAMA를 측정하기 위한 아브게닉스에 의해 분석될 혈청 표본 채취. 이 시료는 드라이 아이스 상에서 하룻밤에 아브게닉스로 운송되어야 하고, 시험 결과는 일반적으로 아브게닉스가 시료를 수령한지 24 시간내에 얻을 수 있음.

상기 절차를 수행하여 환자가 치료에 적합한지를 연구자가 결정한 후, 임상 센터는 스폰서를 통해 코호트 지정을 신청한다(팩스를 통해). 일반적으로, 임상 센터는 신청 3 시간 이내에 팩스로 치료 지정의 통지를 받는다.

2. 처리 기간

처리 기간은 임상 부서가 환자의 치료 지시를 받으면 시작하고, 주입 섭생(11회 용량)을 완료하면 종결지었다. 이 기간은 일반적으로 최대 3주이다. 환자에게 투여를 시작하면 환자를 "연구하(on study)"로 간주하고, 10주 동안 방문 절차를 완료한 후나 또는 환자를 연구에서 이탈시킨 경우에는 "비연구하(off study)"로 간주한다.

3. 0 주, 0 일째

주입전 절차

약제사에게 주입용 시험 약물을 제조하게 하고, 다음과 같은 방문 절차를 이행하였다.

a. 보조 약물이나 병발증의 임의의 변화를 갱신한다.

b. 주입을 개시하기 8 시간 보다 훨씬 이전에 스코어가 얻어진 경우, 변형 IBMTR 중증도 지수.

c. 다음과 같은 연구를 위한 혈액 채취.

●CBC 차 및 혈소판(사전 결과가 시험 약물의 주입 개시시부터 8 시간 이상 전에 얻어진 경우).

● 혈청 화학(사전 결과가 시험 약물의 주입 개시시부터 8 시간 이상 전에 얻어진 경우).

●CD 3,4,8 및 19

●기준 HAMA(적합성 선발 절차의 일부로서 HAMA를 위해 혈액 채취한 환자의 경우에는 이 샘플을 얻기 위한 절차가 필요없다).

● 주입을 시작하기 최소 10분 전의 기준 pK 샘플(환자가 지정된 경우에만).

시험 약물 주입 절차

최대 총 주입량이 환자의 체중과 코호트 지정(시험 약물 및 일반 식염수의 총 용량)에 따라 다르게 약제사를 통해 시험 약물을 준비한다. 시험 약물은 보통 2 시간에 걸쳐 주입하고, 주입에 대한 어떤 부적당한 반응을 조사하기 위하여 주입 동안과 이후 4 시간 동안 환자를 면밀히 모니터한다. 시험 약물을 주입하기 시작한 경우, 진행되는 반응에 기초하여 부작용을 모니터한다. 의심을 불러 일으키는 주입 관련 부작용(시토킨 방출 증후군; 열병, 감기, 오한/전율, 저혈압 및 발진이나 과민 반응; 열병, 감기, 서맥/심장 정지, 호흡 정지, 급성 호흡 곤란증, 발진/두드러기, 범혈구 감소증, 간 트란스아미나제의 증가 및 관절통/근육통)은 스폰서에게 즉시 알린다. 주입 반응이 의심스럽고 환자가 근육통이나 기타 다른 근육 이상을 느끼게 되면 CPK-III 동형효소(mm)를 얻는다.

주입 동안의 생명 신호

주입을 시작하기 이전(주입을 개시하기 최대 10분 전), 처음 주입 1 시간 동안에는 매 15분마다(4 세트), 그 다음 주입 개시 90분 후, 및 주입 완료시(주입 개시 120 분후), 생명 신호(T, P, R, BP)를 측정한다. 생명 신호는 다음 4 시간 동안 보통 시간마다 측정하였다(즉, 주입 개시 후 180분, 240분, 300분 및 360분째 4 세트). 주입 동안의 생명 신호를 측정한 후, 임상 센터에서 사용하는 소정의 가이드라인에 따라 생명 신호를 모니터하였다.

약물동력학적 혈액 샘플:

pK 분석용 혈액은 각 코호트 중의 최소 5명의 환자로부터 채취하였다. 쥐의 생성물을 사전에 투여한 연구 명부에 올린 모든 환자에 대하여 pK 평가를 실시하였다. 혈액 샘플은 1차 주입 완료 후 일반적으로 다음과 같은 시기에 채취하였다: 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 18시간 및 24시간. 주입 24 시간 후, ABX-CBL을 2차 주입하기 전에 샘플을 얻었다.

4. 0주, 1 내지 6일째

환자에게 연속 7일 동안 시험 약물을 매일 주입하였다(유도 섭생). 각각의 후속 주입은 일반적으로 1차 주입과 동시에 개시하였다(±60분). 사전 등재된 중량에 기초하여 용량을 결정하고, 따라서 치료 기간 동안 그 환자에게는 동일 용량을 투여한다. 치료 기간 동안 임의 시기에 ECG 또는 CXR을 실시한 모든 환자에 대해 데이터를 수집한 반면, 통상적인 ECG 및 CXR은 수행하지 않았다. 이것은 이 기간 동안 수행한 모든 생검의 경우에도 마찬가지이다.

별다른 표시가 없는 한 각 주입을 개시하기 전 12 시간 이내에 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 개략적 신체 검사(부록 II 참조)

b. 체중

c. KPS 또는 랭스키 등급

d. 변형 IBMTR 중증도 지수

e. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

f. 부작용 측정

g. 다음을 위한 채혈(국부 실험실에서 처리되는 시험과 중앙 실험실에서 처리되는 시험에 대해서는 부록 V 참조).

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학

●CD 3, 4, 8 및 19

●지정된 환자에 대해서만 약물동력학적 샘플을 1일 주입 개시 전에 채취(이것은 주입 1 샘플 24 시간 후이다).

시험 약물 주입:

상기 절차 이후 시험 약물을 2 시간 동안에 걸쳐 주입하였다. 주입 반응이 의심스럽고 환자가 근육통이나 기타 근육 이상을 느끼게 되면 CPK-III 동형효소(mm)를 얻었다.

주입 동안의 생명 신호 :

생명 신호(T, P, R, BP)는 1차 주입에 대하여 설명된 계획에 따라 얻었다.

5. 1주 (연구 9일 내지 13일째)

유도 섭생 완료시, 환자에게 2주 동안 1주에 2회씩 시험 약물을 주입하였다(유지 섭생). 유지 섭생 중 각 주입의 개시 시기는 1차 주입의 개시 시간(0일)으로부터 ±60분이다. 다음과 같은 절차는 별다른 표시가 없는 한 각각의 주입을 시작하기 12시간 전에 완료하였다.

a. 개략적 신체 검사

b. 체중

c. KPS 또는 랭스키 등급

d. 변형 IBMTR 중증도 지수

e. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

f. 부작용 측정

g. 소변 검사(단지 연구 9일째)

h. 다음을 위한 채혈(국부 실험실에서 처리되는 시험과 중앙 실험실에서 처리되는 시험에 대해서는 부록 V 참조).

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학

●CD 3, 4, 8 및 19(단지 9일째)

●HAMA(단지 9일째)

시험 약물 주입:

시험 약물을 2 시간 동안에 걸쳐 주입하고, 전술한 절차를 다시 반복하였다. 주입 반응이 의심스럽고 환자가 근육통이나 기타 근육 이상을 느끼게 되면 CPK-III 동형효소(mm)를 얻었다.

주입 동안의 생명 신호 :

전술한 생명 신호 섭생을 이용하였다.

약물동력학적 샘플:

9일째 주입을 완료한 지 약 4 시간 후 pK 분석용 혈액 샘플을 채취하였다.

6. 2주(연구 16일 내지 20일째)

이 시기는 유지 섭생의 2주째이다(용량은 연속 2주 동안 1주에 2회씩 투여함). 각 주입의 개시 시기는 일반적으로 주입 0일째의 개시 시기부터 ±60분이다. 다음과 같은 절차는 별다른 표시가 없는 한 각각의 주입을 시작하기 12시간 전에 완료하였다.

a. 개략적 신체 검사

b. 체중

c. KPS 또는 랭스키 등급

d. 변형 IBMTR 중증도 지수

e. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

f. 부작용 측정

g. 소변 검사(단지 연구 16일째)

h. 다음을 위한 채혈(국부 실험실에서 처리되는 시험과 중앙 실험실에서 처리되는 시험에 대해서는 부록 V 참조).

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학

●CD 3, 4, 8 및 19(단지 16일째)

시험 약물 주입:

시험 약물을 2 시간 동안에 걸쳐 주입하고, 전술한 절차를 다시 반복하였다. 주입 반응이 의심스럽고 환자가 근육통이나 기타 근육 이상을 느끼게 되면 CPK-III 동형효소(mm)를 얻었다.

주입 동안의 생명 신호 :

전술한 생명 신호 섭생을 이용하였다.

약리역학적 샘플:

20일째 주입을 완료한 지 약 4 시간 후 pK 분석용 혈액 샘플을 채취하였다.

7. 처리 후속 기간(연구 3주 내지 10주째)

처리 후속 기간은 20일째 방문 완료 후부터 시작하여 10주째 방문 이행시 종결하였다. 이 기간 동안에는 5회 방문을 실시하였다. 10주째 방문을 완료하였을 때, 환자는 "비연구하"로 간주한다. 이 연구 기간 동안 환자가 임상 센터에서 퇴원하게 되면 직접 방문 대신에 전화 평가를 완료할 수 있도록 모든 시도가 이루어져야 한다. 3주, 4주, 5주, 6주 및 10주째에는 처리 후속 방문을 실시하였다. 이 방문에서 재발의 안전성, 효능 또는 신호를 평가하였다. 완전 또는 부분 응답반응자이고 GVHD 돌발된 환자는 본 연구에서 제외시키고 별도의 공개 라벨을 보유한 특별 처리 프로토콜에 등록시켰다. 처리 후속 기간 동안 실시한 모든 생검, ECG 및/또는 CXR은 각 임상 센터에서 명시한 바와 같이 일반 환자의 주의하에 수행하고, 이들 절차의 데이터를 수집하였다. 근육통이나 기타 근육 이상과 함께 주입 관련 부작용이 있고 상승된 mm(근육 괴사 또는 염증이 있는 경우 상승되는 동형효소) 농도를 갖고 있는 모든 환자는 일반적으로 나머지 연구 과정 동안 얻어진 통상의 CPK-III(mm) 샘플을 갖고 있었다.

8. 3주(연구 23일째)

이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 완전한 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화를 갱신한다.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(입원시 또는 퇴원시)

g. 소변검사

h. 다음을 위한 채혈:

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학(부록 V 참조)

●CD3,4,8 및 19

9. 4주(연구 30 ±1일째)

이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 완전한 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(임상 센터에 입원 또는 퇴원)

g. 다음을 위한 채혈:

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학(부록 V 참조)

●CD 3,4,8 및 19

●HAMA

10. 5주(연구 37 ±1일째)

이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 완전한 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(임상 센터에 입원 또는 퇴원)

g. 다음을 위한 채혈:

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학(부록 V 참조)

●CD3,4,8 및 19

11. 6주(연구 44 ±1일째)

이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 완전한 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(임상 센터에 입원 또는 퇴원)

g. 소변검사

h. 다음을 위한 채혈:

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학(부록 V 참조)

●CD 3,4,8 및 19

●HAMA

12. 10주(연구 72 ±2일째)

이 방문검사의 완료시에는 "비연구하"로 간주한다.

이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다.

a. 완전한 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물이나 병발증의 모든 변화 갱신.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(임상 센터에 입원 또는 퇴원)

g. 소변검사

h. 다음을 위한 채혈:

●CBC 차 및 혈소판

●혈청 화학(부록 V 참조)

●CD 3,4,8 및 19

●HAMA(환자가 HAMA 양성 반응인 경우에는, 장기 후속 처리 기간 동안에 실시될 HAMA용 혈액을 채혈해야 한다).

13. 추가 방문 시점(간세포 이식 100일 후)

대부분 환자의 평가는 간세포 이식 100일 후 실시하였다. 프로토콜과 관련하여 방문을 실시하는 순서는 간세포 이식 후 급성 GVHD가 발생하는 시기에 따라 환자 마다 달라진다. 100일째 발생하는 경우에 관계없이 이 방문시기에는 다음과 같은 절차를 완료하였다(환자가 임상 센터에서 퇴원한 경우에는 환자 및 환자의 개인 의사에게 전화를 걸어 이 정보를 입수하였다).

a. 개략적인 신체 검사, 생명 신호 및 체중

b. KPS 또는 랭스키

c. 변형 IBMTR 중증도 지수

d. 보조 약물 또는 병발증의 모든 변화 갱신.

e. 부작용 평가

f. 입원 상태(임상 센터에 입원 또는 퇴원)

g. 다음 분석을 위한 혈액 채취:

● CBC 차와 혈소판

● 혈청 화학(부록 V 참조).

14. 장기 후속 처리 기간

장기 후속 처리 기간은 10주 방문 완료후부터 시작하여 10년 동안 지속하거나 또는 환자가 동의서를 취하할 때까지 실시한다. 장기 후속 처리 기간의 주요 목적은 ABX-CBL의 장기 안전성을 측정하고 장기간 존재성을 측정하는 것이다. 환자는 10주째 방문 시기부터 6개월마다 평가한다. 이 평가는 전화 상담이나 사무실 방문을 통해 실시한다. 장기 후속 데이터는 환자/법적 보호자의 동의서만 있으면 스폰서인 아브게닉스 인크 사는 담당 의사에게서 얻을 수도 있다. 환자의 고유 연구 ID를 사용하여 모든 데이터를 데이터베이스에 입력한다. 전화 상담이나 방문 시 얻어야 하는 정보는 다음과 같다.

a. 건강 상태에 대한 환자의 평가 측정. 이것은 최종 "연구하"의 방문시 진행되는 최종 AE를 포함한다.

b. 다음과 같은 상태에 대한 개시 여부를 측정한다.

● 사망

● 기회성 감염

● 다른 면역 손상

● 기타 암

● 선천성 기형

● 여성이고, 임신한 경우 아기 상태(임신 후)

c. 이전 방문/전화 상담 이후 환자가 다른 연구(연구 제품 및/또는 장치)에 활동하는지의 여부.

임상 센터의 이식 팀에서 장기 후속 방문 데이터를 입수한 경우에는 전화/방문일로부터 10일 이내에 스폰서에게 각 방문 평가 기록의 사본을 송달하여야 한다.

C. HAMA의 측정

이 분석법은 인간 혈청 중에 존재하는 ABX-CBL에 대한 인간 항체(인간 항mCBL 항체)를 검출하여 인간 검체 중의 ABX-CBL에 대한 면역원성을 연구하기 위한 것이다(인간 항쥐 항체, HAMA, 반응).

재료 :

음성 대조군 - 시험 및 수집하여 -20 ℃에 보관되는 HAMA 음성 혈청 수집물(미국 캘리포니아주 샌프란시스코에 소재하는 Blood Centers of the Pacific, Irwin Blood Center에서 입수).

양성 대조군 - -20 ℃에 보관되는 HAMA 양성 혈청의 수집물(ABX-CBL로 제노마우스 쥐(아브게닉스, 인크)를 면역화하고, 혈청을 분리 수집하여 얻음).

ABX-CBL, 5 ㎍/50 ㎕(100 ㎍/㎖), 아브게닉스 제품, 품목 번호 097-104-1, -20 ℃에 보관함, 또는 그 등가물.

비오틴화된 ABX-CBL(ABX-CBL-비오틴), 아브게닉스 제품, 품목 번호 J090-112, 또는 그 등가물.

스트렙트아비딘-HRP, 서던 바이오테크놀로지 제품, 품목 번호 7100-05 또는 그 등가물.

O-페닐렌디아민 이염산염(OPD) 기질 정제 20 ㎎, 시그마 제품, 카달로그 번호 P-7288 또는 그 등가물.

O-페닐렌디아민 이염산염(OPD) 기질 정제 10 ㎎, 시그마 제품, 카달로그 번호 P-8287 또는 그 등가물.

과산화수소, 30%, 시그마 제품, 카달로그 번호 H-1009, 또는 그 등가물.

탈이온화 역삼투압 정제수(DiH₂O) 또는 그 등가물.

ELISA 평판의 코팅 : 실온에서 2 내지 5 분 동안 ABX-CBL 5 ㎍/50㎕(100 ㎍/㎖) 1 바이얼을 해동시킨다. 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍싱한다. 15 ㎖ 원추형 튜브에 주입된 코팅 완충액 12 ㎖(NaHCO₃16.8 g/1.8 L 중수, 5N NaOH로 pH 9.6으로 조정)에 ABX-CBL 5 ㎍/50 ㎕(100 ㎍/㎖) 48 ㎕를 첨가한다. 이 코팅 용액을 저속으로 3 내지 5초 동안 볼텍싱한다. 코팅 용액을 시약 보관병에 쏟아붓는다. 다중 채널 피펫팅기를 사용하여 코팅 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 이 평판을 플라스틱 평판 밀봉제로 피복한다. 평판을 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 항온처리한다. 평판을 평판 세척기를 사용하여 1x 세척 완충액(10배 희석한 10xPBS 10 L 중의 Tween20 50 ㎖)으로 세척한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 차단 완충액(10x PBS 400 ㎖ 중의 BSA 20 g, 티메로살 0.4 g, Tween 20 4 ㎖, 4L 중수로 희석함) 100 ㎕를 첨가한다. 평판 밀봉제로 평판을 피복하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다.

양성 대조군의 제조 : 양성 대조군(HAMA 양성 혈청) 1 바이얼을 실온에서 10 내지 20 분 동안 해동시킨다. 양성 대조군을 저속으로 3 내지 5초 동안 볼텍싱한다. 기포가 발생되지 않도록 주의한다. 미량원심분리 튜브에 주입된 차단 완충액 180 ㎕에 양성 대조군 20 ㎕를 첨가한다. 저결합성의 96웰 평판의 웰 A1 및 A2에는, 차단 완충액 180 ㎕에 상기 희석된 양성 대조군 20 ㎕를 첨가한다. 이 용액을 5회 흡인 및 분배하여 잘 혼합한다. 기포가 발생되지 않도록 주의한다. 양성 대조군의 2배 연속 희석물을 제조한다. 각 평판의 컬럼 1과 2에는 이반복으로 양성 대조군을 만든다. 하나의 평판에 대하여 다음과 같은 절차를 실시하였다. 전술한 바와 같은 평판 상의 웰 B3, B4 내지 H3, H4에 차단 완충액 100 ㎕를 첨가한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 상기 용액 100 ㎕를 웰 A1 및 A2 내지 B1 및 B2에 각각 전달한다. 상기 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배하여 잘 혼합한다. 기포 발생을 주의한다. 이 용액 100 ㎕를 웰 B1 및 B2에서 웰 C1 및 C2로 각각 전달한다. 그 다음, 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배하여 잘 혼합한다. 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 평판의 열마다 계속 희석하여 G열(웰 G1 및 G2)에서 희석을 종료한다. H열의 차단 완충액은 대조군으로 유지한다.

음성 대조군의 제조 : 음성 대조군을 실온에서 20 내지 30분동안 해동시킨다. ELISA 평판으로 전달하기 전에 음성 대조군을 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍싱한다. 차단 완충액 980 ㎕에 음성 대조군 20 ㎕를 첨가하여 희석한다.

샘플 제조 :

주 1 : 혈청 샘플은 일정 장소에서 제조해야 한다.

주 2 : 혈청 취급시 장갑을 착용하고 유니버설 경고문에 따른다. 혈청 샘플을 실온에서 20 내지 30 분 동안 해동시킨다. 혈청 샘플을 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍싱한다. 적정 튜브 중에 주입한 차단 완충액 980 ㎕에 혈청 샘플 20 ㎕를 첨가하여 혈청 샘플을 1:50으로 희석한다. 이 용액 50 ㎕를 5회 흡인 및 분배하여 희석 샘플을 혼합한다. 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 평판 세척기를 사용하여 단계 7.3.2에서 얻은 코팅된 ELISA 평판을 세척한다. 이 ELISA 평판에 양성 대조군, 음성 대조군, 샘플 및 대조군 50 ㎕를 전이시킨다. ELISA 평판을 플라스틱 평판 밀봉제로 피복하고 실온에서 2 시간 동안 항온처리한다. 평판을 저속으로 진탕시킨다.

ABX-CBL-비오틴의 제조 :

주 : 각 ELISA 평판에는 희석 ABX-CBL-비오틴이 최소 10 ㎖ 필요하다. 시약의 효능에 따라 최종 희석률을 조정할 수 있다. ABX-CBL-비오틴을 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 미량원심분리 튜브 중의 차단 완충액 1.485 ㎖에 ABX-CBL-비오틴 15 ㎕를 희석한다. 총 희석률은 1:100이다. 1:100 희석된 ABX-CBL-비오틴 1200 ㎕를 차단 완충액 10.80 ㎖로 희석한다. 총 희석률은 1:1000이다. 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 코팅된 ELISA 평판을 평판 세척기를 사용하여 세척한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 ELISA 평판의 각 웰에 1:1000 희석된 ABX-CBL-비오틴 100 ㎕를 첨가한다. 평판을 플라스틱 평판 밀봉제로 피복하고 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다.

스트렙트아비딘-HRP의 제조 :

주 : 각 ELISA 평판에는 희석된 스트렙트아비딘-HRP가 최소 10 ㎖ 필요하다. 시약의 효능에 따라 최종 희석률을 조정할 수 있다. 스트렙트아비딘-HRP를 저속으로 3 내지 5초 동안 볼텍스한다. 미량원심분리 튜브 중의 차단 완충액 990 ㎕에 스트렙트아비딘-HRP 10 ㎕를 희석한다. 총 희석률은 1:100이다. 1:100 희석된 스트렙트아비딘-HRP 250 ㎕를 차단 완충액 12.25 ㎖에 희석한다. 총 희석률은 1:5000이다. 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 이 ELISA 평판을 평판 세척기를 사용하여 세척한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 ELISA 평판의 각 웰에 1:5000 희석된 스트렙트아비딘-HRP 100 ㎕를 첨가한다. 평판을 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다.

기질 용액의 제조 :

주 1 : 각 ELISA 평판에는 기질 용액 최소 10 ㎖가 필요하다. 기질 용액은 사용하기 전에 즉시 제조한다. 기질 용액 12 ㎖를 제조하기 위하여, 원추형 튜브 중의 기질 완충액 12 ㎖에 OPD 정제 10 ㎎과 30% H₂O₂12 ㎕를 첨가한다. 튜브를 실온에서 3 내지 5 분 동안 방치하여 정제를 용해시킨다. 이 용액을 평판에 첨가하기 전에 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 상기 ELISA 평판을 평판 세척기를 사용하여 세척한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 기질 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 15 분 동안 항온처리한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 종결 용액(2M H₂SO₄) 50 ㎕를 각 웰에 첨가한다.

ELISA 평판의 판독 : 파장을 492 nm로 고정하고, 판독 전 평판을 5초 동안 예비혼합하도록 자동혼합 기능을 점검한다. 분석시 블랭크의 계산치를 감하도록 감산 기능을 사용한다(체크 L1). 샘플과 대조군은 완충액 대조군에 대하여 블랭크화한다. 분석을 중지한 후 30 분 이내에 SPECTRAmax 250 분광광도계를 사용하여 평판을 판독한다.

전술하였듯이, 본 분석법은 본 발명의 임상 시험에 관계된 환자의 샘플을 사용하여 실시하였고 HAMA 응답 반응에 양성으로 나타나는 환자는 없었다.

D. pK의 측정

본 분석법은 인간 혈청 중의 ABX-IL8의 존재를 측정하기 위하여 약리역학적(pK) 연구와 함께 이용되었다.

재료 :

ABX-CBL, 항마우스 CBL 항체, 5 ㎍/50 ㎕(100 ㎍/㎖), 아브게닉스, 품목번호 69-21-4 또는 그 등가물.

고, 중 및 저 양성 대조군, ABX-CBL: 69-21-3, 69-21-2, 69-21-1 또는 그 등가물.

염소 항마우스 IgM, 칼태그, 카달로그 번호 M31500, 품목 번호 3501 또는 그 등가물.

염소 항마우스 IgM-HRP, 칼태그, 카달로그 번호 M31507, 품목 번호 2301 또는 그 등가물.

정상인 혈청

O-페닐렌디아민 이염산염(OPD) 기질 정제, 20 ㎎, 시그마, 카달로그 번호 P-7288, 또는 그 등가물.

O-페닐렌디아민 이염산염(OPD) 기질 정제, 10 ㎎, 시그마, 카달로그 번호 P-8287 또는 그 등가물.

과산화수소, 30%, 시그마, 카달로그 번호 H-1009 또는 그 등가물.

탈이온화 역삼투압 정제수(DiH₂O) 또는 그 등가물.

본 명세서에 사용되는 완충액 및 용액은 다른 표시가 없는 한 HAMA 분석과 관련하여 기재한 완충액 및 용액과 동일한 것이다.

ELISA 평판의 코팅 : 각 ELISA 평판의 코팅에는 코팅 용액이 최소 10 ㎖ 필요로 된다. 염소 항마우스 IgM(1 ㎎/㎖)의 바이얼을 2 내지 8 ℃의 냉각기에서 꺼낸다. 실온에서 2 내지 5 분 동안 방치한다. 저속으로 3 내지 5초 동안 볼텍싱한다. 15 ㎖ 원추형 튜브에 주입된 코팅 완충액 15 ㎖에 염소 항마우스 IgM(1 ㎎/㎖) 3 ㎕를 첨가한다. 코팅 용액을 저속으로 3 내지 5초 동안 볼텍싱한다. 코팅 용액을 시약 보관병에 붓는다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 코팅 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 평판을 플라스틱 평판 밀봉제로 피복한다. 2 내지 8 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 항온처리한다. 평판 세척기를 사용하여 1x 세척 완충액으로 평판을 세척한다.

ELISA 평판의 차단 : 다중채널 피펫팅기를 사용하여 차단 완충액 200 ㎕를 각 웰에 첨가한다. 플라스틱 평판 밀봉제로 평판을 피복하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다.

표준물 제조 : 주 1 : 섹션 8.4와 8.6(8.4.4.1 및 8.6.3)에서 사용된 차단 완충액은 미처리 인간 검체의 혈청을 1% 포함한다. 각 평판에는 차단 완충액이 최소 9 ㎖가 필요로 된다. 1% 혈청을 함유하는 차단 완충액 10 ㎖를 제조하기 위하여, 원추형 튜브 중의 차단 완충액 9.9 ㎖에 혈청 100 ㎕를 첨가한다. 그 다음, 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. ABX-CBL 표준물(100 ㎍/㎖) 1 바이얼을 실온에서 10 내지 20 분 동안 해동시킨다. ABX-CBL 100 ㎍/㎖를 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 기포가 발생되지 않도록 주의한다.

표준물의 1차 희석 : 단일 채널 피펫을 사용하여 1.7 ㎖ 미량원심분리 튜브 중의 차단 완충액 360 ㎕에 100 ㎍/㎖의 모액 40 ㎕를 첨가한다. 잘 혼합한다. 이것은 10 ㎍/㎖에 해당하는 1:10의 희석물이다. 단일 채널 피펫을 사용하여 상기 1:10 희석물(10 ㎍/㎖) 40 ㎕를 1.7 ㎖ 미량원심분리 튜브 중의 차단 완충액 460 ㎕에 첨가한다. 잘 혼합한다. 이 희석물은 800 ng/㎖의 농도와 동일하다. 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스하여 희석 표준물을 혼합한다. 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 표준물의 2배 연속 희석물을 준비한다. 주 : 각각의 블랭크 저결합 ELISA 평판은 컬럼 1 및 2에 이반복으로 표준물을 포함해야 한다. 평판 1개에 대해서 다음과 같은 절차를 실시한다. 차단 완충액 100 ㎕를 웰 B1, B2 내지 H1, H2에 첨가한다. 표준물 800 ng/㎖ 200 ㎕를 웰 A1 및 A2에 전이시킨다. 다중채널 피펫을 사용하여 웰 A1 및 A2 중의 용액 100㎕를 웰 B1 및 B2에 각각 전이시킨다. 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배시켜 잘 혼합한다. 용액 100 ㎕를 웰 B1 및 B2에서 웰 C1 및 C2로 각각 전이시킨다. 이 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배시켜 잘 혼합한다. 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 평판의 아래 열로 갈수록 연속 희석하여 웰 H1 및 H2에서 희석을 마친다.

양성 대조군의 제조 : 주 : 각 분석 평판에는 고, 중 및 저 대조군 1 바이얼을 필요로 한다. 고, 중, 저 대조군 1 바이얼을 실온에서 10 내지 20 분 동안 해동시킨다. ELISA 평판으로 전이하기 전에 대조군을 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다.

샘플 제조 : 혈청 샘플을 실온에서 30 분 동안 해동시킨다. 희석하기 전에 혈청 샘플을 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 블랭크 평판의 A열에 함유된 차단 완충액 180 ㎕에 혈청 샘플 20 ㎕를 첨가하여 혈청 샘플을 1:10으로 희석한다. 이 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배하여 잘 혼합한다. 기포가 발생하지 않도록 주의한다. 샘플의 2배 연속 희석물을 준비한다. 다중 채널 피펫을 사용하여 B열에서부터 H열에 차단 완충액 100 ㎕를 첨가한다. 단계 8.6.3에서 얻은 희석 샘플 100 ㎕를 B열에 전이시킨다. 전술한 바와 같이 혼합한다. 샘플 100 ㎕를 B열에서 C열로, C열에서 D열로, 최종적으로 H열까지 연속 전이시킨다. 각각 전이할 때마다 용액 100 ㎕를 5회 흡인 및 분배하여 샘플을 혼합한다. 기포가 발생되지 않도록 주의한다. 평판을 평판 세척기를 사용하여 1x 세척 완충액으로 세척한다. 블랭크 평판 유래의 희석 표준물, 대조군 및 샘플 50 ㎕를 ELISA 평판으로 전이시킨다. H열에서부터 시작하여 G열을 통해 A열까지 전이시킨다. 완충액 블랭크의 웰을 더 추가하기 위하여 평판 주형을 점검한다. 평판을 플라스틱 평판 밀봉제를 피복하고 실온에서 2 시간 동안 항온처리한다.

HRP 결합 검출 항체의 제조 : 주 : 각 평판에는 희석된 HRP 결합 항체가 최소 10 ㎖ 필요로 된다. 저속으로 3 내지 5 초 동안 볼텍스하여 염소 항마우스 IgM-HRP를 혼합한다. 염소 항마우스 IgM-HRP 8 ㎕를 15 ㎖ 원추형 튜브 중의 차단 완충액 12 ㎖에 첨가하여 염소 항마우스 IgM-HRP를 1:1500으로 희석한다. 볼텍스한다. 평판 세척기를 사용하여 평판을 1x 세척 완충액으로 세척한다. 다중채널 피펫기를 사용하여, 평판의 각 웰에 희석된 염소 항마우스 IgM-HRP(단계 8.10.2) 100 ㎕를 첨가한다. 평판을 플라스틱 평판 밀봉제를 사용하여 피복하고 실온에서 1 시간 동안 항온처리한다.

기질 용액의 제조 : 주 1 : 각 평판에는 기질 용액이 최소 10 ㎖ 필요로 된다. 기질 용액은 사용하기 전에 즉시 제조한다. 기질 용액 12 ㎖를 제조하기 위하여, 원추형 튜브 중의 기질 완충액 12 ㎖에 OPD 정제 10 ㎎과 30% H₂O₂12 ㎕를 첨가한다. 튜브를 실온에서 3 내지 5 분 동안 방치하여 정제를 용해시킨다. 이 용액을 평판에 첨가하기 전에 3 내지 5 초 동안 볼텍스한다. 상기 평판을 1x 세척 완충액으로 평판 세척기를 사용하여 세척한다. 다중채널 피펫팅기를 사용하여 기질 용액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고 15 분 동안 항온처리한다.

ELISA 반응의 정지 : 다중채널 피펫팅기를 사용하여 종결 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가한다.

ELISA 평판의 판독 : 파장을 492 nm로 고정하고, 평판의 판독 전 평판을 5초 동안 예비혼합하도록 자동혼합 기능을 점검한다. 분석시 블랭크의 계산치를 감하는 감산 기능을 사용한다(체크 L1). 표준물, 대조군 및 샘플은 완충액 대조군에 대하여 블랭크화한다. 분석(분자 장치 SPECTRAmax 250 Microplate Spectrophotometer의 작동 및 유지)을 중지한 후 30 분 이내에 SPECTRAmax 250 분광분석계 또는 그 등가 분광분석계를 사용하여 평판을 판독한다.

데이터 분석 : 표준물의 OD를 사용하여 표준 곡선을 계산하였다. 표준물이 곡선에 잘 부합하도록 "4변수 최적화"를 사용한다. 표준 곡선의 소프트웨어를 사용하여 샘플 및 대조군의 농도를 자동 계산한다. 유효한 분석이 되도록 다음과 같은 기준을 맞추어야 한다. OD가 ＜4.0인 표준물, 대조군 및 샘플 만을 사용한다. 분석 대조군에 대한 결과를 비교한다(고, 중 및 저). 대조군의 값은 예상 농도의 20% 이내이고 변화 계수(CV)의 ≤20% 이어야 한다. ST03 및 ST06 간의 표준물의 CV는 ≤20%이어야 한다. 분석의 표준 곡선에 대한 상관계수는 ≥0.990이어야 한다.

본 분석법은 본 임상 시험에서 ABX-CBL 항체의 약리역학을 측정하기 위한 것이다. 상기 분석법을 이용하여 환자의 pK를 측정하는 예비실험 결과는 도 1에 도시한 바와 같다.

E. 결과

이하, ABX-CBL을 이용하여 급성 GVHD 환자를 치료하는데 있어 관찰되는 결과에 대하여 설명한다.

본 시험에서는 4가지 용량에 따라서 환자 27명을 등록시켰다. 고용량의 코호트에 등록하기에 앞서 저용량에 등록을 완료하였다. 본래의 제3 코호트(0.3 ㎎/㎏)에서 고용량을 투여받은 환자는 근육통 또는 근육통 유사 증후를 나타내었다. 아브게닉스는 이 용량을 최대 허용 용량(MTD)으로 결정하고 최종 용량을 1.0 ㎎/㎏에서 0.2 ㎎/㎏(MTD와 MTD 이전 용량 사이의 중간 용량)으로 조정하였다.

일단, 4가지 용량의 코호트를 채운 뒤, 0.15 ㎎/㎏ 내지 0.2 ㎎/㎏ 용량에 대한 추가 환자를 등록시켰다. 1999년 1월 13일자로, 총 44명의 환자(17명의 부가 환자)가 등록되었다. 이들 추가 17명의 환자에 대한 데이터도 계속 수집하였다. 이 데이터는 유효한 것으로 보인다.

본 명세서에 제시된 심각한 부작용(SAE) 요약을 제외한 모든 데이터는 처음 27명의 환자에 대하여 기초한 것이다. SAE 요약은 1999.1.13일자 기록된 모든 환자에 대한 것이다.

환자들에게는 효능 평가를 위하여 ABX-CBL을 최소 4회 주입하였다. 등록된 27명의 환자 중에서, 23명만이 이 기준을 충족시켰다. 코호트 1 중의 환자는 제외시킨다(무효 용량). 총 응답반응률은 73%이고, 평균 지속기간은 32일이었다.

근육통 발생 외에 ABX-CBL에 대한 내성은 양호하였다. 환자는 모두 HAMA에 대하여 음성이었고, 또한 그대로 음성을 유지하였으며, ABX-CBL에 대한 과민성에 관하여 보고된 바는 없었다.

1. 인구통계학

등록된 27명의 환자 중에서, 21명은 성인(16세 또는 그 이상)이고 6명은 소아이다(표 4). 24명의 환자에게는 동종원성 골수 이식을 실시하였고, 다른 3명에게는 말초 간세포를 이식하였다. 이식일부터 본 연구에 등록한 시기까지의 평균 기간은 48 일이었다. 본 연구에는 IBMTR 등급이 B인 환자 7명, C인 환자 10명, D인 환자 10명을 등록시켰다(표 5). 표 6은 효능에 대하여 평가한 23명 환자의 기준 점수를 기재한 것이다.

성/연령 분류
	남성	여성	총합
성인	13	8	21
소아(＜16세)	4	2	6
총합	17	10	27

기준 IBMTR 중증도 스코어-모든 환자
코호트	Bn(%)	Cn(%)	Dn(%)	총합N
1(0.01 ㎎/㎏)	2(22%)	3(33%)	4(44%)	9
2(0.1 ㎎/㎏)	2(29%)	3(42%)	2(29%)	7
3(0.3 ㎎/㎏)	1(50%)	1(50%)	0	2
4(0.2 ㎎/㎏)	2(22%)	3(33%)	4(44%)	9
총합	7	10	10	27

기준 IBMTR 중증도 스코어-평가 환자
코호트	Bn(%)	Cn(%)	Dn(%)	총합N
1(0.01 ㎎/㎏)	2(25%)	3(38%)	3(38%)	8
2(0.1 ㎎/㎏)	1(17%)	3(50%)	2(33%)	6
3(0.3 ㎎/㎏)	1(50%)	1(50%)	0	2
4(0.2 ㎎/㎏)	2(29%)	2(29%)	3(43%)	7
총합	6	9	8	23

2. 효능 :

본 연구에 등록할 수 있는 적합한 환자는 IBMTR 스코어가 최소 B이어야 한다. 전체 IBMTR 스코어가 최소 2 지수 감소된 것으로 입증된 환자는 응답자로 간주하였다. 스코어의 감소를 보이지 않는 환자는 급성 GVHD를 나타내지 않는 것을 의미하고, 완전한 응답자로 간주하였다. 효능 분석에는 ABX-CBL을 4회 이상 주입한 환자 만을 포함시켰다(표 9).

효능 요약
코호트	효능 평가된 인원(n)	응답자, n(%)	응답의 평균 지속기간(n)
1(0.01 ㎎/㎏)	8	3(38%)	24일(3)
2(0.1 ㎎/㎏)	6	4(67%)	11일(3
3(0.3 ㎎/㎏)	2	2(100%)	69일(1)
4(0.2 ㎎/㎏)	7	4(57%)	41일(3)
총합	23	13(57%)	36일
*한 환자가 ABX-CB-9702 프로토콜에서 ABX-CBL로의 부가 치료법에 응답반응하였지만, 상기 표에는 포함시키지 않았다.

23명의 환자 중에서 총 13명(57%)은 ABX-CB-9701에서 ABX-CBL에 대한 응답 반응을 나타내었다. 평균 지속기간은 36일이었다. 하기 기재된 프로토콜에 등록한 추가 환자 1명은 추가 치료법에 응답반응하였다. 그 결과 총 반응률은 61%로 나타났다. 본 연구를 통해 추정되는 것은 0.01 ㎎/㎏의 용량이 유효 용량이 아니라는 점이다. 이 용량이 효과가 없는 것으로 가정하면, 응답반응률은 73%(환자 15명 중 11명)이다. 이러한 가정하에, 반응의 평균 지속 시간은 32일이다.

용량이 증가하면 반응의 지속기간도 증가하는 것으로 간주된다. 제1 코호트 중에서 한 환자 [0108]가 지속기간의 예외자이었다. 이 환자의 지속기간은 59일 이상이었다. 이 지속기간은 보다 연장될 수도 있으나, 연구는 72일째 종료하였다.

[환자 0816]은 제1 주입시 0.3 ㎎/㎏ 용량에서 상당한 근육통을 겪었다. 이후 주입시에는 0.2 ㎎/㎏으로 용량을 감소시켰다. 용량의 변화로 인하여, 이 환자에게 적합한 용량은 효능면에서는 0.2 ㎎/㎏이고, 안전성 면에서는 0.3 ㎎/㎏으로 평가되었다.

최저 용량 코호트 중의 한 환자와 최고 용량 농도에서의 두 환자에 대하여 72일간에 걸쳐 본 연구를 완료하였다. 0.1 ㎎/㎏ 용량 그룹 중의 환자 6명 중 4명에 대해서 본 연구를 수행하였고, 0.2 ㎎/㎏ 용량 그룹 중의 환자 7명 중 4명에 대해서 본 연구를 수행하였다. 완전한 응답 반응을 입증한 모든 환자는 72일 동안 본 연구를 수행하였다.

3. 안전성 :

ABX-CBL을 임의량 투여한 모든 환자에 대하여 안전성을 평가하였다. 근육통을 제외하고는 ABX-CBL에 대한 양호한 내성을 나타내었다. 그 결과 용량 한계 독성(DLT)을 얻었다. 근육통의 발생 빈도는 용량의 증가와 관련하여 증가하였다. 그 결과, 최대 내성 용량(MTD)가 0.3 ㎎/㎏으로 확인되었다. 근육통은 주입한지 20 내지 60분에 개시되어 보통 주입 완료 후 1 내지 2 시간이내에 해소되었다. 임의 등급의 근육통을 겪은 환자 14명 중에서, 2명은 근육통으로 인하여 본 연구에서 제외시켰다. 근육통이 지속된 1명의 환자를 제외하고는 모두 후유증없이 근육통이 해소되었다. 마지막 발생 환자를 추가 평가 및 해명을 위해 실험하였다. 표 6은 근육통의 발생에 있어서 중증도 및 용량에 대하여 요약한 것이다. 근육통으로 기재된 부작용이 있는 환자는 "관련없음" 또는 "가능성이 없음"으로 분류하고, 기본 근육통이 있는 환자는 이 표에 포함시키지 않았다.

근육통 발생 빈도 및 결과
	0.01 ㎎/㎏(n=9)	0.1 ㎎/㎏(n=7)	0.3㎎/㎏(n=3)	0.2㎎/㎏(n=8)
중증도	n(%)	연구상황	n(%)	연구상황	n(%)	연구상황	n(%)	연구상황
심함			1	W/D	11	계속용량감소	31	계속W/D
보통	2	계속	1	계속			1	계속
약함	1	계속	1	계속			1	계속
W/D = 근육통으로 인하여 연구에서 제외시킴

아브게닉스를 통해 근육통의 원인 및 가능한 임의의 상호관계를 계속 조사하였다. 그 결과, 근육통을 발생시키는 소인 인자로서 다음과 같은 원인이 확인되었다.

● 전해질의 변화

● 응답자 대 비응답자

● 이식체의 종류

● 공여체의 종류

● 스테로이드 용량

ABX-CBL과 관련하여 11명의 환자 중 11명에서 중증 부작용이 보고되었다. 5명의 "심함" 환자는 모두 근육통과 관련된 것으로, ABX-CBL에 대한 관계에 있어서 "가능성있음"으로 기재하였다. 환자 1명은 "미지 병인의 간손상"을 나타내어 "의심스러움"으로 나타내었다. 나머지 SAE는 "가능성없음" 또는 "무관련성"으로 기재하였다.

이 연구의 23명은 ABX-CBL과의 관련성이 가능성있음으로 평가되고, 7명은 의심스러움으로 평가되었다. 다른 모든 환자들은 "가능성없음" 또는 "무관련성"으로 확인되었다.

23명의 "가능성있는" 부작용 중에서, 2명을 제외하고는 모두 근육통계 부작용이었다. 한 환자는 후유증없이 해소되는 보통의 "피로"만을 느꼈다. 다른 환자는 해소되는 보통의 "용혈반응"과 함께 증가된 간 가능 시험(LFT)의 후유증을 나타내었다.

ABX-CBL과 관련이 있는 것으로 "의심스러움"으로 평가되는 7명의 환자 중에서, 1명은 중증도가 심함이고, 4명은 보통이며 2명은 약함이다. 이 부작용은 모두 후유증없이 해소되었다. 심한 부작용은 "부종"이다. 4가지 보통 부작용은 4명의 환자에게서 발생하는 것으로 "요산의 중간 정도의 감소", "열병/감기", "고혈압" 및 "열병"으로 구성된다. 2가지 약한 부작용은 2명의 환자에게서 발생하는 것으로, "시험 약물 이후 약간의 열병"과 "감기"로 구성된다.

총 27명의 환자에 대한 HAMA 시험은 마지막 연구 방문을 통해 음성으로 확인되었다.

1차 주입 직전과 연구 중에 일정 간격마다 모든 환자들의 림프구수를 측정하였다. ABX-CB-9701에 등록한 환자중에서 약 50%는 BMT 및 진행되는 GvHD에 부수적인 면역타협 상태 때문에 평가할 수 없었다. 간세포 이식 후인 환자는 급성 GvHD로부터 면역결핍 상태의 악화 뿐만 아니라 조정 섭생에 부수적으로 면역결핍성이었다. 현재까지, ABX-CBL은 T 세포 수에 바람직하지 않는 영향을 미치는 것으로 관찰된 적은 없었다.

ABX-CBL의 단계 II 임상 시험 -- 구제 프로토콜

전술한 단계 II 시험을 완료한 후, 이 환자들에 대하여 제2 단계 II 지속 시험을 개시하여 GVHD 돌발 환자들에게 ABX-CBL을 계속 투여하였다. 지속 시험은 ABX-CBL에 사전 노출시킨 바 있는 급성 GVHD 환자에 대하여 공개 라벨 임상 시험으로 디자인하였다. 중증도가 등급 II/III/IV인 급성 GVHD 환자들은 전술한 바와 같이 적합하였다.

이 시험에서, 모든 환자에게는 ABX-CBL을 최대 7회의 정맥내 용량(1차 처리 과정)으로 주입하거나 주입하려고 한다. 약물은 연속 7일 동안 주사기 펌프를 통해 2 시간 동안 주입하였다. 용량은 0.2 ㎎/㎏이었다(전술한 임상 시험에서 효과적으로 사용된 대략적 용량). 제1 처리 과정이 치료적 효과(완전 또는 부분 응답 반응)를 나타낸다면, 환자에게는 만성 GVHD의 개시 이전 또는 1차 처리 완료 후 1차 이식한 지 200일 후에 2차 처리 용량을 투여하였다. ABX-CBL을 이용한 2차 처리 과정은 연구가와 의학 모니터와의 토론을 통해 사례별로 다룰 수 있다.

본 연구의 목적은 다음과 같다:

급성 GVHD 환자에게 ABX-CBL을 지속 투여시의 안전성 평가.

이전에 ABX-CBL 치료의 실패 경험이 있는 환자 또는 급성 GVHD 돌발된 환자에 대한 ABX-CBL의 반복 치료의 임상적 효과 측정.

소량의 ABX-CBL에 의해 임상적 효과를 얻지 못한 환자의 치료 및/또는 급성 GVDH의 돌발을 경험한 적이 있는 ABX-CBL에 대한 이전 응답자의 치료.

ABX-CBL로 1차 처리한 후 돌발 속도의 측정.

초기 임상 연구에 관련된 전술한 모든 절차는 아주 약간의 변형을 제외하고는 본 연구에도 사용하였다.

ABX-CBL을 이용한 용량, 투여 섭생 및 치료

전술한 상세한 설명과 결과를 살펴볼 때, ABX-CBL은 GVHD 및 림프 세포가 유해하거나 바람직하지 않은 활성형인 기타 유사 질환 병인에 대하여 상당한 치료 효과를 제공한다는 것을 알 수 있다. 본 명세서에 제시된 이러한 결과는 ABX-CBL을 항체 약 0.1 ㎎/㎏ 이상 내지 약 0.4 ㎎/㎏ 이하의 용량으로 투여하므로써 상기 질환의 병인을 치료하는데 효능이 있다는 것을 입증한다. 이 용량은 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 0.3 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 특히 약 0.15 ㎎/㎏ 내지 약 0.2 ㎎/㎏ 이 바람직하다. 또한, 유도 섭생(1일당 복수회 주입, 본명세서에는 7일 동안 매일) 및 이후 유지 섭생(주기적 주입, 본 명세서에서는 2주 동안 매주 2회씩)에 관하여 본 명세서에 개시된 투여 섭생은 보조적으로 GVHD를 경감시키고, 명백하게는 질환의 돌발 사이에 환자의 GVHD의 중증도를 감소시키는 것으로 보인다.

자명하듯이, 본 발명에서 상세하게 설명한 정제된 ABX-CBL과 본 명세서에 개시된 바와 같은 기타 항CD147 항체 등은 그 효능이 유사하다.

GVHD 외에도, 본 발명에 기재된 치료법은 유해한 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 존재를 특징으로 하는 병인이 있는 질병에 대해서도 효능이 있을 수 있다. 그 일예로서, GVHD는 그러한 질병 중 하나이다. 하지만, 기타 많은 염증 질환 및 자가면역 질환 역시 이러한 병인을 공유하는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명의 치료법은 다음과 같은 질병의 병인에 효능이 있을 것이다. 즉, 이식편대 숙주 질환(GVHD), 기관 이식 거부 질환(비제한적으로, 신장 이식, 안구 이식 등), 암(비제한적으로 혈액암(즉 백혈병 및 림프종), 췌장암 등), 자가면역 질환, 염증 질환(비제한적으로 관절염, 류마티스성 관절염) 등으로, 이것에 국한되는 것은 아니다.

실험 22 동물 모델에 있어서 쥐 GP42에 결합하는 대용 항체

전술하였듯이, 본 발명과 관련된 특정 동물 모델을 사용하였다. 가장 간단한 동물 모델 중 하나는 마우스이다. 2.6.1 항체는 마우스 gp42(바시진(basigin) 또는 마우스 CD147)에 결합하지 않았다. 따라서, 이러한 모델에 사용하기 위한 2.6.1 항체 및/또는 ABX-CBL에 대한 대용 항체로서 사용될 수 있는 항마우스 gp42 항체를 제조하였다. 래트를 면역화하기 위하여 융합 단백질을 제조하는데 사용된 클로닝 전략 및 이로부터 생성된 항체의 예비 특성규명에 대해서는 이하 설명하였다. 하기 기재되는 클로닝 전략은 도 51 및 52에 상세히 설명되어 있다.

Hu-CD147IgG2 융합 단백질의 클로닝

문헌[Miyauchi et al., J.Biochem.110:770-774(1991)]에 보고된 CD174 서열(Gene Bank 수탁 번호 D45131)에 기초하여 다음과 같은 PCR 프라이머를 사용하였다.

5' : 5'-GACTACGAATTCGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATG-3'(서열 번호 58)

3' : 5'-GGATGGTGTTGGTAGCTAGCACGCGGAGCGTGATGATGGCCTG-3'(서열 번호 59)

CD147의 세포외 도메인의 아미노 말단 202 아미노산 잔기를 암호하는 CD147/pBKCMV 플라스미드 DNA 주형으로부터 626bp의 PCR 생성물을 증폭시켰다. 이 PCR 생성물을 EcoR1 및 Nhe1로 분해하고, EcoR1 및 Nhe1로 분해한 pIK1.1Hu-CD4IgG2 발현 벡터에 결찰시켰다. 얻어지는 작제물인 pIKHu-CD147IgG2는 Hu IgG2의 힌지 CH2 및 CH3 도메인과 프레임에 맞게 결합된 CD4의 세포외 도메인의 마지막 4개의 C 말단 잔기와 CD147의 N-말단 202 아미노산으로 구성되는 융합 단백질을 암호한다.

Mu-GP42IgG2 융합 단백질의 클로닝

문헌[Kanekura et al., Cell Struct.Funct. 16:23-30(1991)]에 보고된 GP42 서열(Gene Bank 수탁 번호 #Y16256)에 기초하여 다음과 같은 PCR 프라이머를 사용하였다.

5' : 5'-GACTACGAATTCACGAGGCGACATGGCGGCGGC-3'(서열 번호 60) 및

3' : 5'-GGATGGTGTTGGTAGCTAGCACACGCAGTGAGATGGTTTCCCG-3'(서열 번호 61).

659bp의 PCR 생성물은 마우스 림프절 cDNA로부터 증폭시켰고, GP42의 세포외 도메인의 아미노 말단 206 아미노산 잔기를 암호한다. PCR 생성물을 EcoR1 및 Nhe1로 분해하고, EcoR1 및 Nhe1로 분해한 pIK1.1Hu-CD4IgG2 발현 벡터에 결찰시켜 pIKMu-GP42 IgG2를 얻었다.

안정한 CHO 세포주 조작

pIKHu-CD147IgG2 및 pIKMu-GP42IgG2 유래의 EcoR1/Bgl2 단편을, EcoR1/Bgl2로 분해한 발현 벡터 pWBFNP DHFR에 클로닝하였다. PWBFNP DHFR은 DHFR cDNA가 SV40 폴리 A 및 SV40 프로모터/인헨서의 전사 조절하에서 Not1 부위에 클로닝되어 있는 pWBFNP의 유도체이다. 그 결과 얻어지는 작제물인 Hu-CD147IgG2 DHFR 및 Mu-GP42IgG2 DHFR은 CaPO₄매개 형질감염에 의해 DHFR 결손 CHO 세포주에 도입시켰다. 외인성 티미딘, 글리신 및 퓨린의 부재하에서도 성장하는 성질을 통해 안정한 세포주를 선발하였다. SDS-PAGE로 확인시, 융합 단백질의 분비 농도가 증가된 클론은 무혈청 배지 중에서 회전 플라스크로 현탁화시켰다. 배양 배지로부터 단백질 A 크로마토그래피를 통해 Mu-GP42IgG2 및 Hu-CD147IgG2 융합 단백질을 정제하였다.

융합 단백질을 얻은 다음, 래트를 통상적인 기법으로 면역화시키고, 통상적인 기법으로 하이브리도마를 제조하였다. 이러한 하이브리도마가 분비하는 항체는 특정 동물 모델, 특히 쥐 모델에서 대용 항체로서 이용할 수 있다.

참고 문헌

본 명세서에 인용된, 특허, 특허 출원, 논문, 교과서 등과 이들중에 인용된 문헌 등을 비롯한 모든 문헌은 그 전내용이 본원에 참고 인용된 것이다.

균등물

전술한 상세한 설명, 도면 및 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 구체화한 것으로, 본 발명자들에 의해 고찰된 최상의 양태를 설명한 것이다. 하지만, 상기 명세서에 세부적으로 제시되었는 지의 여부에 관계없이 본 발명은 다양한 방식으로 실시될 수 있고, 본 발명은 이하 청구의범위 및 이의 균등물에 따라 해석되어야 할 것이다.

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION

(i) APPLICANT: ABGENIX, INC.

DAVIS, C. Geoffrey

BLACHER, Russell Wayne

CORVALAN, Jose Ramon

CULWELL, Alan Rhodes

GREEN, Larry

HAVRILLA, Nancy

HALES. Joanna

IVANOV, Vladimir E.

LIPANI, John A.

LIU, Qiang

WEBER, Richard F.

YANG, Xiao-dong

(ii) TITLE OF THE

INVENTION: CD147 BINDING MOLECULES AS

THERAPEUTICS

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 81

(iv) CORRESPONDENCE ADDRESS:

(A) ADDRESSEE: Fish ＆ Neave

(B) STREET: 1251 Avenue of the Americas

(C) CITY: New York

(D) STATE: NY

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Asp

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Leu Gly Ser Lys Ile Leu Leu Thr Cys Ser Leu Asn Asp Ser Ala

Thr

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Glu

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Asp

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Thr

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Ser

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Ser

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Val

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Met

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Gly

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Ala

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Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Val Ala Glu Val Leu Val Leu Val

Thr

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Ile Ile Phe Ile Tyr Glu Lys Arg Arg Lys Pro Glu Asp Val Leu

Asp

225 230 235 240

Asp Asp Asp Ala Gly Ser Ala Pro Leu Lys Ser Ser Gly Gln His

Gln

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Asn

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Leu

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Asn

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Asp

65 70 75 80

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Asp

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Asp

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Thr

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Val

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Thr

225 230 235 240

Met Met Phe Asp Asp Arg Arg Gly Arg Pro Val Gly Phe Pro Met

Arg

245 250 255

Gly Arg Gly Gly Phe Asp Arg Met Pro Pro Gly Arg Gly Gly Arg

Pro

260 265 270

Met Pro Pro Ser Arg Arg Asp Tyr Asp Asp Met Ser Pro Arg Arg

Gly

275 280 285

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Arg Gly Gly Arg Gly Gly Ser Arg

Ala

290 295 300

Arg Asn Leu Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Gly Gly Asp

Leu

305 310 315 320

Met Ala Tyr Asp Arg Arg Gly Arg Pro Gly Asp Arg Tyr Asp Gly

Met

325 330 335

Val Gly Phe Ser Ala Asp Glu Thr Trp Asp Ser Ala Ile Asp Thr

Trp

340 345 350

Ser Pro Ser Glu Trp Gln Met Ala Tyr Glu Pro Gln Gly Gly Ser

Gly

355 360 365

Tyr Asp Tyr Ser Tyr Ala Gly Gly Arg Gly Ser Tyr Gly Asp Leu

Gly

370 375 380

Gly Pro Ile Ile Thr Thr Gln Val Thr Ile Pro Lys Asp Leu Ala Gly

385 390 395 400

Ser Ile Ile Gly Lys Gly Gly Gln Arg Ile Lys Gln Ile Arg His Glu

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Ser Gly Ala Ser Ile Lys Ile Asp Glu Pro Leu Glu Gly Ser Glu

Asp

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Arg Ile Ile Thr Ile Thr Gly Thr Gln Asp Gln Ile Gln Asn Ala Gln

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Gly

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Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn

Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp

Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala

Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser

Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile

Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Asp Tyr Asp Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

Thr

100 105 110

Val Ser Ala Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu Val

Ser

115 120 125

Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly Cys

Leu

130 135 140

Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn Tyr

Gln

145 150 155 160

Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr Leu

Arg

165 170 175

Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Ser Pro

Lys

180 185 190

Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Ile His

Tyr

195 200 205

Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val Ala

Glu

210 215 220

Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe

Ser

225 230 235 240

Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu Ala Thr Asn

Phe

245 250 255

Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys Leu

Val

260 265 270

Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu Asn Lys Gly

Ser

275 280 285

Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ile

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His Arg

Gly

305 310 315 320

Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser Pro

Ser

325 330 335

Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile

Phe

340 345 350

Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu Ala

Thr

355 360 365

Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu Pro

Leu

370 375 380

Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn Gly Thr Phe

Ser

385 390 395 400

Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Asn Asn Arg

Lys

405 410 415

Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro Ser Pro Gln

Lys

420 425 430

Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His Pro Pro Ala

Val

435 440 445

Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser

Ala

450 455 460

Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile Ser

Val

465 470 475 480

Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr Val

Thr

485 490 495

Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe Thr

His

500 505 510

Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser Gly Glu Thr

Tyr

515 520 525

Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr Glu

Arg

530 535 540

Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser

Leu

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Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr

565 570

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

Lys

1 5 10 15

Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

Pro

20 25 30

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr

Thr

35 40 45

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe

Thr

50 55 60

Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe

Cys

65 70 75 80

Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

Leu

85 90 95

Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro

Pro

100 105 110

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe

Leu

115 120 125

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp

Gly

130 135 140

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp

Ser

145 150 155 160

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys

Asp

165 170 175

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys

Thr

180 185 190

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

195 200 205

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Ser Leu Ala Pro Leu Trp Tyr Tyr Ser Arg His Gly

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1 5 10

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:22:

Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile

Lys

1 5 10 15

Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val

Asp

20 25 30

Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser

35 40 45

Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val

50 55 60

Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu

Arg

65 70 75 80

Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp

Pro

85 90 95

Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser

Asn

100 105 110

Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp

Arg

115 120 125

Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu

Thr

130 135 140

Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:23:

Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val

Tyr

1 5 10 15

Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro

Pro

20 25 30

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser

Thr

35 40 45

Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp

Thr

50 55 60

Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala

Asp

65 70 75 80

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Thr Glu Tyr Tyr Tyr

Tyr

85 90 95

Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

Ser

100 105 110

Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys

Glu

115 120 125

Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala

Gln

130 135 140

Asp Phe Leu Pro Asp Xaa Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn

Asn

145 150 155 160

Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly

Gly

165 170 175

Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val

Met

180 185 190

Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Thr Gly Ser Lys Glu

195 200 205

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Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys

Arg

1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp

Trp

20 25 30

Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu

Gly

35 40 45

Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly

Ser

50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

Val

65 70 75 80

Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Thr Arg Gln Thr Pro Arg Thr Phe

Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

Val

100 105 110

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

Ser

115 120 125

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Glu

His

130 135 140

Gln Lys Ser Pro

145

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Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser

Gly

1 5 10 15

Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro

Gly

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr

Asn

35 40 45

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr

Ser

50 55 60

Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp

Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Ala Thr Gly

Phe

85 90 95

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser

Ala

100 105 110

Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro

Ser

115 120 125

Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu

Pro

130 135 140

Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile

Ser

145 150 155 160

Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala

Ala

165 170 175

Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr

Asp

180 185 190

Glu His Lys Val Cys

195

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:26:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:26:

Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Arg Val

Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asp Glu Leu Gly Trp

Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Val Ala

Ser

35 40 45

Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

Gly

50 55 60

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Gly Tyr Pro Arg Thr Phe Gly

Gln

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Glu His

Gln

130 135 140

Lys Ser Pro

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:27:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 203 amino acids

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:27:

Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

Tyr

1 5 10 15

Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly

Gln

20 25 30

Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr

Gly

35 40 45

Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Asn Arg Asn Thr

Ser

50 55 60

Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

Thr

65 70 75 80

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly His Gly Gly Ser Tyr Phe

Tyr

85 90 95

Ser Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

Val

100 105 110

Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser

Cys

115 120 125

Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu

Ala

130 135 140

Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys

Asn

145 150 155 160

Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg

Gly

165 170 175

Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp

Val

180 185 190

Met Gln Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys

195 200

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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His Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys

Lys

1 5 10 15

Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu

Ala

20 25 30

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

Trp

35 40 45

Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Gly Gly Ser

Gly

50 55 60

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu

Asp

65 70 75 80

Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr

Phe

85 90 95

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

Ser

100 105 110

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

Ala

115 120 125

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

Glu

130 135 140

His Gln Lys Ser Pro

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:29:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 199 amino acids

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Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala

Ser

1 5 10 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala

Thr

20 25 30

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Asn Pro Asn Ser Gly

Asn

35 40 45

Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg

Asn

50 55 60

Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser

Glu

65 70 75 80

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Trp Leu Val Arg

Tyr

85 90 95

Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

Ser

100 105 110

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu

Asn

115 120 125

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln

Asp

130 135 140

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn

Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly

Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met

Gln

180 185 190

Gly Thr Asp Glu His Lys Val

195

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:30:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 147 amino acids

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:30:

Gly Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

Thr

1 5 10 15

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asp Asn Leu Gly Trp

Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala

Ser

35 40 45

Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

Gly

50 55 60

Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Lys Thr Tyr Pro Trp Thr Phe Gly

Gln

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Xaa Lys Glu His

Gln

130 135 140

Lys Ser Pro

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:31:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 202 amino acids

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:31:

Lys Leu Pro Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly

Ser

1 5 10 15

Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

Gly

20 25 30

Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr

Asn

35 40 45

Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys

Asn

50 55 60

Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

Val

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Ala Glu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

Gly

85 90 95

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

Ser

100 105 110

Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser

Pro

115 120 125

Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe

Leu

130 135 140

Pro Asp Xaa Ile Thr Phe Xaa Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp

Ile

145 150 155 160

Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr

Ala

165 170 175

Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly

Thr

180 185 190

Asp Glu His Val Val Thr Gly Ser Lys Glu

195 200

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:32:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 143 amino acids

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:32:

Met Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser

Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr

Leu

20 25 30

Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser

Asn

35 40 45

Arg Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

Thr

50 55 60

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly

Ile

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Leu Gln Ile Pro Arg Leu Phe Gly Pro

Gly

85 90 95

Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

Ile

100 105 110

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

Val

115 120 125

Cys Leu Leu Ser Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

130 135 140

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:33:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 190 amino acids

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(v) FRAGMENT TYPE: internal

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:33:

Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe

Ser

1 5 10 15

Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu

Glu

20 25 30

Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro

Ser

35 40 45

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln

Phe

50 55 60

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

Tyr

65 70 75 80

Cys Ala Arg Gly Gly Thr Thr Val Thr Phe Asp Ala Phe Asp Ile

Trp

85 90 95

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala

Pro

100 105 110

Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr

Ser

115 120 125

Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu Pro Asp Ser

Ile

130 135 140

Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr

Arg

145 150 155 160

Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser

Gln

165 170 175

Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr Asp Glu

180 185 190

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:34:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 147 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:34:

Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser

Ser

1 5 10 15

Gln Ser Val Leu Tyr Ser Phe Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp

Tyr

20 25 30

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala

Ser

35 40 45

Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val

Ala

65 70 75 80

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly

Gln

85 90 95

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

Val

115 120 125

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

Trp

130 135 140

Lys Val Ile

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:35:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 149 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:35:

Asn Pro Gln Thr Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe

Ser

1 5 10 15

Leu Ile Thr Arg Gly Val Gly Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro

Gly

20 25 30

Lys Ala Leu Gln Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys

Arg

35 40 45

Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr

Ser

50 55 60

Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp

Thr

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His His Phe Phe Asp Ser Ser Gly Tyr

Tyr

85 90 95

Pro Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser

Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

Ser

115 120 125

Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:36:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 148 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:36:

Val Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro

Ala

1 5 10 15

Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly

Lys

20 25 30

Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Gln

Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Glu Ala Phe Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg

Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg

Val

65 70 75 80

Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Ile Glu

Leu

85 90 95

Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

Arg

130 135 140

Lys Glu Arg Val

145

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:37:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 173 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:37:

Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg

Gln

20 25 30

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser

Ser

35 40 45

Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

Ser

50 55 60

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

Arg

65 70 75 80

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Gly

Trp

85 90 95

Tyr Glu Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

Cys

115 120 125

Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:38:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 101 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:38:

Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

Val

1 5 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ile

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser

Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe

Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr

Pro

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro

100

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:39:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 159 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39:

Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ile Thr Arg Gly Val

Gly

1 5 10 15

Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Gln Trp Leu

Ala

20 25 30

Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser Leu Lys

Ser

35 40 45

Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu

Thr

50 55 60

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

His

65 70 75 80

His Phe Phe Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Pro Phe Asp Ser Trp Gly

Gln

85 90 95

Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

Val

100 105 110

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

Ala

115 120 125

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

Ser

130 135 140

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Gln Leu

145 150 155

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:40:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 167 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:40:

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

Ala

1 5 10 15

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg

Gln

20 25 30

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Val Ser

Gly

35 40 45

Ile Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

Ser

50 55 60

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

Arg

65 70 75 80

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Arg Ile Phe Gly

Val

85 90 95

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

Lys

100 105 110

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

Glu

115 120 125

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

Pro

130 135 140

Val Thr Val Ser Trp Asn Leu Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

Thr

145 150 155 160

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:41:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 164 amino acids

(B) TYPE: amino acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: peptide

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE: internal

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:41:

Gly Ile Arg Leu Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

Ser

1 5 10 15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

Gly

20 25 30

Ile Ser Ile Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala

Pro

35 40 45

Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

Ser

50 55 60

Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

Asn 85 90 95

Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

Ser

145 150 155 160

Gly Lys Pro Asn

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:42:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 35 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:42:

GACTACGAAT TCTTGTAGGA CCGGCGAGGA ATAGG

35

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:43:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 37 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:43:

GACTACGGGC CCGGTGAGAA CTTGGAATCT TGCAAGC

37

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:44:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:44:

GCAGTCTCCT AAACTGCT

18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:45:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 15 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:45:

ACCTGCAAGG CCAGT

15

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:46:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 18 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:46:

CACTCATTCC TGTTGAAG

18

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:47:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 500 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:47:

TCAGAAGAAG TGAAGTCAAG ATGAAGAACC ATTTGCTTTT

CTGGGGAGTC

CTGGCGGTTT 60

TTATTAAGGC TGTTCATGTG AAAGCCCAAG AAGATGAAAG

GATTGTTCTT

GTTGACAACA 120

AATGTAAGTG TGCCCGGATT ACTTCCAGGA TCATCCGTTC

TTCCGAAGAT

CCTAATGAGG 180

ACATTGTGGA GAGAAACATC CGAATTATTG TTCCTCTGAA

CAACAGGGAG

AATATCTCTG 240

ATCCCACCTC ACCATTGAGA ACCAGATTTG TGTACCATTT

GTCTGACCTC

TGTAAAAAAT 300

GTGATCCTAC AGAAGTGGAG CTGGATAATC AGATAGTTAC

TGCTACCCAG

AGCAATATCT 360

GTGATGAAGA CAGTGCTACA GAGACCTGCT ACACTTATGA

CAGAAACAAG

TGCTACACAG 420

CTGTGGTCCC ACTCGTATAT GGTGGTGAGA CCAAAATGGT

GGAAACAGCC

TTAACCCCAG 480

ATGCCTGCTA TCCTGACTAA

500

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:48:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 21 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:48:

GAATTCAGAA GAAGTGAAGT C

21

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:49:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:49:

GTCGACTATG CAGTCAGCAA TGAC

24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:50:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 20 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:50:

TGCAGGAATC AGACCCAGTC

20

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:51:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 22 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:51:

GTCAGGCTGG AACTGAGGAG CA

22

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:52:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:52:

TCATTTGGTG ATCAGCACT

19

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:53:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 25 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:53:

GCTAGCTGAG GAGACGGTGA CCAGG

25

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:54:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 19 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:54:

TCATTTGGTG ATCAGCACT

19

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:55:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 22 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:55:

GGATCCTGAG GAGACGGTGA CG

22

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:56:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:56:

GGATTAGCAT CCGCCCCAAC CCTT

24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:57:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 24 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:57:

GTCGACGCAC ACACAGAGCG GCCA

24

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:58:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 37 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:58:

GACTACGAAT TCGGACCGGC GAGGAATAGG AATCATG

37

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:59:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 43 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:59:

GGATGGTGTT GGTAGCTAGC ACGCGGAGCG TGATGATGGC CTG

43

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:60:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 33 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:60:

GACTACGAAT TCACGAGGCG ACATGGCGGC GGC

33

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:61:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 43 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:61:

GGATGGTGTT GGTAGCTAGC ACACGCAGTG AGATGGTTTC CCG

43

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:62:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 617 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:62:

GGACTGTTGA AGCCTTCGGA GACCCTGTCC CTCACCTGCG

CTGTCTATGG

TGGGTCCTTC 60

AGTGGTTACT ACTGGAGCTG GATCCGCCAG CCCCCAGGGA

AGGGGCTGGA

GTGGATTGGG 120

GAAATCAATC ATAGTGGAAG CACCAACTAC AACCCGTCCC

TCAAGAGTCG

AGTCACCATA 180

TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC CTGAAGCTGA

GCTCTGTGAC

CGCNGCGGAC 240

ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGGCACT ACGGAATATT

ACTACTACTA

CTACGGTATG 300

GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG

GGAGTGCATC

CGCCCCAACC 360

CTTTTCCCCC TCGTCTCCTG TGAGAATTCC CCGTCGGATA

CGAGCAGCGT

GGCCGTTGGC 420

TGCCTCGCAC AGGACTTCCT TCCCGACTYC ATCACTTTCT

CCTGGAAATA

CAAGAACAAC 480

TCTGACATCA GCAGCACCCG GGGCTTCCCA TCAGTCCTGA

GAGGGGGCAA

GTACGCAGCC 540

ACCTCACAGG TGCTGCTGCC TTCCAAGGAC GTCATGCAGG

GCACAGACGA

ACACGTGGTG 600

ACGGGATCCA AAGAGTA

617

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:63:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 444 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:63:

CTCTCCCTGC CCGTCACCCC TGGAGAGCCG GCCTCCATCT

CCTGCAGGTC

TAGTCAGAGC 60

CTCCTGCATA GTAATGGATA CAACTATTTG GATTGGTACC

TGCAGAAGCC

AGGGCAGTCT 120

CCACAGCTCC TGATCTATTT GGGTTCTAAT CGGGCCTCCG

GGGTCCCTGA

CAGGTTCAGT 180

GGCAGTGGAT CAGGCACAGA TTTTACACTG AAAATCAGCA

GAGTGGAGGC

TGAGGATGTT 240

GGGATTTATT ACTGCATGCA GACTCGACAA ACTCCTCGGA

CGTTCGGCCA

AGGGACCAAG 300

GTGGAAATCA AACGAACTGT GGCTGCACCA TCTGTCTTCA

TCTTCCCGCC

ATCTGATGAG 360

CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG TGCCTGCTGA

ATAACTTCTA

TCCCAGAGAG 420

GCCAAAGAGC ATCAAAAGAG TCCA

444

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:64:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 593 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:64:

CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCACTG

TCTCTGGTGG

CTCCATCAGT 60

AGTTACTACT GGAACTGGAT CCGGCAGCCC CCAGGGAAGG

GACTGGAGTG

GATTGGGTAT 120

ATCTATTACA GTGGGAGCAC CAACTACAAC CCCTCCCTCA

AGAGTCGAGT

CACCATATCA 180

GTAGACACGT CCAAGAACCA GTTCTCCCTG AAGCTGAGCT

CTGTGACCGC

TGCGGACACG 240

GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGATAGGGGA GTGGGAGCTA

CTGGTTTTGA

CTACTGGGGC 300

CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCCTCAGGG AGTGCATCCG

CCCCAACCCT

TTTCCCCCTC 360

GTCTCCTGTG AGAATTCCCC GTCGGATACG AGCAGCGTGG

CCGTTGGCTG

CCTCGCACAG 420

GACTTCCTTC CCGACTCCAT CACTTTCTCC TGGAAATACA

AGAACAACTC

TGACATCAGC 480

AGCACCCGGG GCTTCCCATC AGTCCTGAGA GGGGGCAAGT

ACGCAGCCAC

CTCACAGGTG 540

CTGCTGCCTT CCAAGGACGT CATGCAGGGC ACAGACGAAC

ACAAGGTGTG

CGA 593

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:65:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 441 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:65:

AGCCAGTCTC CATCCTCCCT GTCTGCATCT GTAGGAGAGA

GAGTCACCAT

CACTTGCCGG 60

GCAAGTCAGG GCATTAGAGA TGAATTAGGC TGGTATCAGC

AGAAACCAGG

GAAAGCCCCT 120

AAGCGCCTGA TCTATGTTGC ATCCAGTTTG CAAAGTGGGG

TCCCATCAAG

GTTCAGCGGC 180

AGTGGATCTG GGACAGAATT CACTCTCACA ATCAGCAGCC

TGCAGCCTGA

AGATTTTGCA 240

ACTTATTACT GTCTACAGCA TAATGGTTAC CCTCGGACGT

TCGGCCAAGG

GACCAAGGTG 300

GAAATCAAAC GAACTGTGGC TGCACCATCT GTCTTCATCT

TCCCGCCATC

TGATGAGCAG 360

TTGAAATCTG GAACTGCCTC TGTTGTGTGC CTGCTGAATA

ACTTCTATCC

CAGAGAGGCC 420

AAAGAGCATC AAAAGAGTCC A

441

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:66:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 610 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

(C) STRANDEDNESS: single

(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETICAL: NO

(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:66:

AAGAAGCCTG GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT

CTGGATACAC

CTTCACCAGT 60

TATGATATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCACT GGACAAGGGC

TTGAGTGGAT

GGGATGGATG 120

AACCCTAACA GTGGTAACAC AGGCTATGCA CAGAAGTTCC

AGGGCAGAGT

CACCATGAAC 180

AGGAACACCT CCATAAGCAC AGCCTACATG GAGCTGAGCA

GCCTGAGATC

TGAGGACACG 240

GCCGTGTATT ACTGTGCGAG AGGGGGTCAT GGTGGGAGCT

ACTTCTACTC

CTAYTACGGT 300

ATGGACGTCT GGGGCCAGGG GACCACGGTC ACCGTCTCCT

CAGGGAGTGC

ATCCGCCCCA 360

ACCCTTTTCC CCCTCGTCTC CTGTGAGAAT TCCCCGTCGG

ATACGAGCAG

CGTGGCCGTT 420

GGCTGCCTCG CACAGGACTT CCTTCCCGAC TCCATCACTT

TCTCCTGGAA

ATACAAGAAC 480

AACTCTGACA TCAGCAGCAC CCGGGGCTTC CCATCAGTCC

TGAGAGGGGG

CAAGTACGCA 540

GCCACCTCAC AGGTGCTGCT GCCTTCCAAG GACGTCATGC

AGGGCACAGA

CGAACACGTG 600

GTGTGCAAAC

610

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:67:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 447 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:67:

CACTCCCTGG CTGTGTCTCT GGGCGAGAGG GCCACCATCA

ACTGCAAGTC

CAGCCAGAGT 60

GTTTTATACA GTTTTAACAA TAAGAACTAC TTAGCTTGGT

ACCAGCAGAA

ACCAGGACAG 120

CCTCCTAAGC TGCTCATTTA CTGGGCATCT ACCCGGGAAT

CCGGGGTCCC

TGACCGATTC 180

GGTGGCAGCG GGTCTGGGAC AGATTTCACT CTCACCATCA

GCAGCCTGCA

GGCTGAAGAT 240

GTGGCAGTTT ATTACTGTCA GCAATATTAT AGTACTCCTM

GGACGTTCGG

CCAAGGGACC 300

AAGGTGGAAA TCAAACGAAC TGTGGCTGCA CCATCTGTCT

TCATCTTCCC

GCCATCTGAT 360

GAGCAGTTGA AATCTGGAAC TGCCTCTGTT GTGTGCCTGC

TGAATAACTT

CTATCCCAGA 420

GAGGCCAAAG AGCATCAAAA GAGTCCA

447

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:68:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 599 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:68:

GAGGTGAAGA AGCCTGGGGC CTCAGTGAAG GTCTCCTGCA

AGGCTTCTGG

ATACACCTTC 60

ACCAGTTATG ATATCAACTG GGTGCGACAG GCCACTGGAC

AAGGGCTTGA

GTGGATGGGA 120

TGGATGAACC CTAACAGTGG TAACACAGGC TATGCACAGA

AGTTCCAGGG

CAGAGTCACC 180

ATGACCAGGA ACACCTCCAT AAGCACAGCC TACATGGAGC

TGAGCAGCCT

GAGATCTGAG 240

GACACGGCCG TGTATTACTG TGCGAGAGAG GAGTGGCTGG

TACGTTACTA

CGGTATGGAC 300

GTCTGGGGCC AAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGGGA

GTGCATCCGC

CCCAACCCTT 360

TTCCCCCTCG TCTCCTGTGA GAATTCCCCG TCGGATACGA

GCAGCGTGGC

CGTTGGCTGC 420

CTCGCACAGG ACTTCCTTCC CGACTCCATC ACTTTCTCCT

GGAAATACAA

GAACAACTCT 480

GACATCAGCA GCACCCGGGG CTTCCCATCA GTCCTGAGAG

GGGGCAAGTA

CGCAGCCACC 540

TCACAGGTGC TGCTGCCTTC CAAGGACGTC ATGCAGGGCA

CAGACGAACA

CAAGGTGTG 599

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(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 441 base pairs

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:69:

GGCCAGTCTC CATCCTCCCT GTCTGCATCT GTAGGAGACA

GAGTCACCAT

CACTTGCCGG 60

GCAAGTCAGG ACATTAGAGA TAATTTAGGC TGGTATCAGC

AGAAACCAGG

GAAAGCCCCT 120

AAGCGCCTGA TCTATGCTGC ATCCAATTTG CAAAGTGGGG

TCCCATCAAG

GTTCAGCGGC 180

AGTGGATCTG GGACAGAATT CACTCTCACA ATCAGCAGCC

TGCAGCCTGA

AGATTTTGCA 240

ACTTATTACT GTCTACAGTA TAAAACTTAC CCGTGGACGT

TCGGCCAAGG

GACCAAGGTG 300

GAAATCAAAC GAACTGTGGC TGCACCATCT GTCTTCATCT

TCCCGCCATC

TGATGAGCAG 360

TTGAAATCTG GAACTGCCTC TGTTGTGTGC CTGCTGAATA

ACTTCTATCC

CAGAGAGGMC 420

AAAGAGCATC AAAAGAGTCC A

441

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:70:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 607 base pairs

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:70:

AAGCTTCCGG AGACCCTGTC CCTCACCTGC GCTGTCTATG

GTGGGTCCTT

CAGTGGTTAC 60

TACTGGAGCT GGATCCGCCA GCCCCCAGGG AAGGGGCTGG

AGTGGATTGG

GGAAATCAAT 120

CATAGTGGAA GCACCAACTA CAACCCGTCC CTCAAGAGTC

GAGTCACCAT

ATCAGTAGAC 180

ACGTCCAAGA ACCAGTTCTC CCTGAAGCTG AGCTCTGTGA

CCGCCGCGGA

CACGGCTGTG 240

TATTACTGTG CGAGAGGGGC AGCTGAATAT TACTACTACT

ACTACGGTAT

GGACGTCTGG 300

GGCCAAGGGA CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GGGAGTGCAT

CCGCCCCAAC

CCTTTTCCCC 360

CTCGTCTCCT GTGAGAATTC CCCGTCGGAT ACGAGCAGCG

TGGCCGTTGG

CTGCCTCGCA 420

CAGGACTTCC TTCCCGACTY CATCACTTTC TYCTGGAAAT

ACAAGAACAA

CTCTGACATC 480

AGCAGCACCC GGGGCTTCCC ATCAGTCCTG AGAGGGGGCA

AGTACGCAGC

CACCTCACAG 540

GTGCTGCTGC CTTCCAAGGA CGTCATGCAG GGCACAGACG

AACACGTGGT

GACGGGATCC 600

AAAGAGT

607

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:71:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 431 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:71:

ATGCCCGTCA CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA

GGTCTAGTCA

GAGCCTCCTG 60

CATAGTAATG GATACAACTA TTTGGACTGG TACCTGCAGA

AGCCAGGGCA

GTCTCCACAG 120

CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC TCCGGGGTCC

CTGACAGGTT

CAGTGGCAGT 180

GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC AGCAGAGTGG

AGGCTGAGGA

TGTTGGGATT 240

TATTACTGCA TGCAAAGTCT ACAAATTCCC CGGCTTTTCG

GCCCTGGGAC

CAAAGTGGAT 300

ATCAAACGAA CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC

CGCCATCTGA

TGAGCAGTTG 360

AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAGTAACT

TCTATCCCAG

AGAGGCCAAA 420

GTACAGTGGA A

431

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:72:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 570 base pairs

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(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:72:

TCGGAGACCC TGTCCCTCAC CTGCGCTGTC TATGGTGGGT

CCTTCAGTGG

TTACTACTGG 60

AGCTGGATCC GCCAGCCCCC AGGGAAGGGG CTGGAGTGGA

TTGGGGAAAT

CAATCATAGT 120

GGAAGCACCA ACTACAACCC GTCCCTCAAG AGTCGAGTCA

CCATATCAGT

AGACACGTCC 180

AAGAACCAGT TCTCCCTGAA GCTGAGTTCT GTGACCGCCG

CGGACACGGC

TGTGTATTAC 240

TGTGCGAGAG GCGGGACTAC AGTAACTTTT GATGCTTTTG

ATATCTGGGG

CCAAGGGACA 300

ATGGTCACCG TCTCTTCAGG GAGTGCATCC GCCCCAACCC

TTTTCCCCCT

CGTCTCCTGT 360

GAGAATTCCC CGTCGGATAC GAGCAGCGTG GCCGTTGGCT

GCCTCGCACA

GGACTTCCTT 420

CCCGACTCCA TCACTTTCTC CTGGAAATAC AAGAACAACT

CTGACATCAG

CAGCACCCGG 480

GGCTTCCCAT CAGTCCTGAG AGGGGGCAAG TACGCAGCCA

CCTCACAGGT

GCTGCTGCCT 540

TCCAAGGACG TCATGCAGGG CACAGACGAA

570

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:73:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:73:

CTGGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA

AGTCCAGCCA

GAGTGTTTTA 60

TACAGTTTTA ACAATAAGAA CTACTTAGCT TGGTACCAGC

AGAAACCAGG

ACAGCCTCCT 120

AAGCTGCTCA TTTACTGGGC ATCTACCCGG GAATCCGGGG

TCCCTGACCG

ATTCAGTGGC 180

AGCGGGTCTG GGACAGATTT CACTCTCACC ATCAGCAGCC

TGCAGGCTGA

AGATGTGGCA 240

GTTTATTACT GTCAGCAATA TTATAGTACT CCTCGGACGT

TCGGCCAAGG

GACCAAGGTG 300

GAAATCAAAC GAACTGTGGC TGCACCATCT GTCTTCATCT

TCCCGCCATC

TGATGAGCAG 360

TTGAAATCTG GAACTGCCTC TGTTGTGTGC CTGCTGAATA

ACTTCTATCC

CAGAGAGGCC 420

AAAGTACAGT GGAAGGTGAT C

441

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:74:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 447 base pairs

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:74:

AACCCACAGA CGACCCTCAC GCTGACCTGC ACCTTCTCTG

GGTTCTCACT

CATTACCCGT 60

GGAGTGGGTG TGGATTGGAT CCGTCAGCCC CCAGGAAAGG

CCCTGCAGTG

GCTCGCACTC 120

ATTTATTGGA ATGATGATAA GCGCTACAGT CCATCTCTGA

AGAGCAGGCT

CACCATCACC 180

AAGGACACCT CCAAAAACCA GGTGGTCCTC ACAATGACCA

ACATGGACCC

TGTGGACACA 240

GCCACATATT ACTGTGCACA CCATTTCTTT GATAGTAGTG

GTTATTACCC

TTTTGACTCC 300

TGGGGCCAGG GAACCCTGGT CTCCGTCTCC TCAGCCTCCA

CCAAGGGCCC

ATCGGTCTTC 360

CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG

CGGCCCTGGG

CTGCCTGGTC 420

AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACG

447

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:75:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 445 base pairs

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:75:

GTGACTCAGT CTCCACTCTC TCTGTCCGTC ACCCCTGGAC

AGCCGGCCTC

CATCTCCTGC 60

AAGTCTAGTC AGAGCCTCCT GCATAGTGAT GGAAAGACCT

ATTTGTATTG

GTACCTGCAG 120

AAGCCAGGCC AGCCTCCACA GCTCCTGATC TATGAAGCTT

TCAACCGGTT

CTCTGGAGTG 180

CCAGATAGGT TCAGTGGCAG CGGGTCAGGG ACAGATTTCA

CACTGAAAAT

CAGCCGGGTG 240

GAGGCTGAGG ATGTTGGACT TTATTATTGC ATGCAAAGTA

TAGAGCTTCC

GTTCACTTTC 300

GGCGGAGGGA CCAAGGTGGA GATCAAACGA ACTGTGGCTG

CACCATCTGT

CTTCATCTTC 360

CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA ACTGCCTCTG

TTGTGTGCCT

GCTGAATAAC 420

TTCTATCCCA GAAAAGAAAG AGTCR

445

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:76:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 519 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:76:

GGGGAAGGCC TGGTCAAGCC TGGGGGGTCC CTGAGACTCT

CCTGTGCAGC

CTCTGGATTC 60

ACCTTCAGTA GCTATAGCAT GAACTGGGTC CGCCAGGCTC

CAGGGAAGGG

GCTGGAGTGG 120

GTCTCATCCA TTAGTAGTAG TAGTAGTTAC ATATACTACG

CAGACTCAGT

GAAGGGCCGA 180

TTCACCATCT CCAGAGACAA CGCCAAGAAC TCACTGTATC

TGCAAATGAA

CAGCCTGAGA 240

GCCGAGGACA CGGCTGTGTA TTACTGTGCG AGGGATAGCA

GTGGCTGGTA

TGAGGACTAC 300

TTTGACTACT GGGGCCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCCT

CAGCCTCCAC

CAAGGGCCCA 360

TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG

AGAGCACAGC

GGCCCTGGGC 420

TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT

CGTGGAACTC

AGGCGCTCTG 480

ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCAGCTGTC CTACAGTCA

519

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:77:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 303 base pairs

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(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:77:

CTTGACATCC AGCTGACCCA GTCTCCGTCC TCACTGTCTG

CATCTGTAGG

AGACAGAGTC 60

ACCATCACTT GTCGGGCGAG TCAGGACATT AGCATTTATT

TAGCCTGGTT

TCAGCAGAGA 120

CCAGGGAAAG CCCCTAAGTC CCTGATCTAT GCTGCATCCA

GTTTGCAAAG

TGGGGTCCCA 180

TCAAAGTTCA GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GATTTCACTC

TCACCATCAG

CAGCCTGCAG 240

CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGCCAA CAATATAATA

GTTATCCATT

CACTTTCGGG 300

CCC

303

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:78:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 477 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:78:

CTGACCTGCA CCTTCTCTGG GTTCTCACTC ATTACCCGTG

GAGTGGGTGT

GGATTGGATC 60

CGTCAGCCCC CAGGAAAGGC CCTGCAGTGG CTCGCACTCA

TTTATTGGAA

TGATGATAAG 120

CGCTACAGTC CATCTCTGAA GAGCAGGCTC ACCATCACCA

AGGACACCTC

CAAAAACCAG 180

GTGGTCCTCA CAATGACCAA CATGGACCCT GTGGACACAG

CCACATATTA

CTGTGCACAC 240

CATTTCTTTG ATAGTAGTGG TTATTACCCT TTTGACTCCT

GGGGCCAGGG

AACCCTGGTC 300

TCCGTCTCCT CAGCCTCCAC CAAGGGCCCA TCGGTCTTCC

CCCTGGCGCC

CTGCTCCAGG 360

AGCACCTCCG AGAGCACAGC GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA

AGGACTACTT

CCCCGAACCG 420

GTGACGGTGT CGTGGAACTC AGGCGCTCTG ACCAGCGGCG

TGCACACCTT

CCAGCTG 477

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:79:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 503 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:79:

GGGGGAGGCT TGGTACAGCC TGGGGGGTCC CTGAGACTCT

CCTGTGCAGC

CTCTGGATTC 60

ACTTTTAGCA GCTATGCCAT GAGCTGGGTC CGCCAGGCTC

CAGGGAAGGG

GCTGGAGTGG 120

GTCTCAACTA TTAGTGTTAG TGGTATTACC ACATACTACG

TAGACTCCGT

GAAGGGCCGG 180

TTCACCATCT CCAGAGACAA TTCCAAGAAC ATTCTGTATC

TGCAAATGAA

CAGCCTGAGA 240

GCCGAGGACA CGGCCGTATA TTACTGTGCG AAACGGATTT

TTGGAGTGGT

CTGGGGCCAG 300

GGAACCCTGG TCACCGTCTC CTCAGCCTCC ACCAAGGGCC

CATCGGTCTT

CCCCCTGGCG 360

CCCTGCTCCA GGAGCACCTC CGAGAGCACA GCGGCCCTGG

GCTGCCTGGT

CAAGGACTAC 420

TTCCCCGAAC CGGTGACGGT GTCGTGGAAC TTAGGCGCTC

TGACCAGCGG

CGTGCACACC 480

TTCCCAGCTG TCCTACAGTC CTA

503

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:80:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 494 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:80:

GGAATTCGGC TTGATATTCA GCTGACTCAG TCTCCATCCT

CACTGTCTGC

ATCTGTAGGA 60

GACAGAGTCA CCATCACTTG TCGGGCGAGT CAGGGCATTA

GCATTTATTT

AGCCTGGTTT 120

CAGCAGAGAC CAGGGAAAGC CCCTAAGTCC CTGATCTATG

CTGCATCCAG

TTTGCAAAGT 180

GGGGTCCCAT CAAAGTTCAG CGGCAGTGGA TCTGGGACAG

ATTTCACTCT

CACCATCAGC 240

AGCCTGCAGC CTGAAGATTT TGCAACTTAT TACTGCCAAC

AATATAATAG

TTACCCATTC 300

ACTTTCGGCC CTGGGACCAA AGTGGATATC AAACGAACTG

TGGCTGCACC

ATCTGTCTTC 360

ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA TCTGGAACTG

CCTCTGTTGT

GTGCCTGCTG 420

AATAACTTCT ATCCCAGAGA GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG

TGGATAACGC

CCTCCAATCG 480

GGTAAGCCGA ATTC

494

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:81:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1774 base pairs

(B) TYPE: nucleic acid

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(D) TOPOLOGY: linear

(ii) MOLECULE TYPE: cDNA

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(iv) ANTISENSE: NO

(v) FRAGMENT TYPE:

(vi) ORIGINAL SOURCE:

(xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:81:

ATGTACTTGG GACTGAACTA TGTATTCATA GTTTTTCTCT

TAAATGGTGT

CCAGAGTGAA 60

GTGAAGCTTG AGGAGTCTGG AGGAGGCTTG GTGCAACCTG

GAGGATCCAT

GAAACTCTCC 120

TGTGTTGCCT CTGGATTCAC TTTCAGTAAC TACTGGATGA

ACTGGGTCCG

CCAGTCTCCA 180

GAGAAGGGGC TTGAGTGGGT TGCTGAAATT AGATTGAAAT

CTAATAATTA

TGCAACACAT 240

TATGCGGAGT CTGTGAAAGG GAGGTTCACC ATCTCAAGAG

ATGATTCCAA

AAGTAGTGTC 300

TACCTGCAAA TGAACAACTT AAGAGCTGAA GACACTGGCA

TTTATTACTG

TACGGATTAC 360

GATGCTTACT GGGGCCAAGG GACTCTGGTC ACTGTCTCTG

CAGAGAGTCA

GTCCTTCCCA 420

AATGTCTTCC CCCTCGTCTC CTGCGAGAGC CCCCTGTCTG

ATAAGAATCT

GGTGGCCATG 480

GGCTGCCTGG CCCGGGACTT CCTGCCCAGC ACCATTTCCT

TCACCTGGAA

CTACCAGAAC 540

AACACTGAAG TCATCCAGGG TATCAGAACC TTCCCAACAC

TGAGGACAGG

GGGCAAGTAC 600

CTAGCCACCT CGCAGGTGTT GCTGTCTCCC AAGAGCATCC

TTGAAGGTTC

AGATGAATAC 660

CTGGTATGCA AAATCCACTA CGGAGGCAAA AACAGAGATC

TGCATGTGCC

CATTCCAGCT 720

GTCGCAGAGA TGAACCCCAA TGTAAATGTG TTCGTCCCAC

CACGGGATGG

CTTCTCTGGC 780

CCTGCACCAC GCAAGTCTAA ACTCATCTGC GAGGCCACGA

ACTTCACTCC

AAAACCGATC 840

ACAGTATCCT GGCTAAAGGA TGGGAAGCTC GTGGAATCTG

GCTTCACCAC

AGATCCGGTG 900

ACCATCGAGA ACAAAGGATC CACACCCCAA ACCTACAAGG

TCATAAGCAC

ACTTACCATC 960

TCTGAAATCG ACTGGCTGAA CCTGAATGTG TACACCTGCC

GTGTGGATCA

CAGGGGTCTC 1020

ACCTTCTTGA AGAACGTGTC CTCCACATGT GCTGCCAGTC

CCTCCACAGA

CATCCTAACC 1080

TTCACCATCC CCCCCTCCTT TGCCGACATC TTCCTCAGCA

AGTCCGCTAA

CCTGACCTGT 1140

CTGGTCTCAA ACCTGGCAAC CTATGAAACC CTGAATATCT

CCTGGGCTTC

TCAAAGTGGT 1200

GAACCACTGG AAACCAAAAT TAAAATCATG GAAAGCCATC

CCAATGGCAC

CTTCAGTGCT 1260

AAGGGTGTGG CTAGTGTTTG TGTGGAAGAC TGGAATAACA

GGAAGGAATT

TGTGTGTACT 1320

GTGACTCACA GGGATCTGCC TTCACCACAG AAGAAATTCA

TCTCAAAACC

CAATGAGGTG 1380

CACAAACATC CACCTGCTGT GTACCTGCTG CCACCAGCTC

GTGAGCAACT

GAACCTGAGG 1440

GAGTCAGCCA CAGTCACCTG CCTGGTGAAG GGCTTCTCTC

CTGCAGACAT

CAGTGTGCAG 1500

TGGCTTCAGA GAGGGCAACT CTTGCCCCAA GAGAAGTATG

TGACCAGTGC

CCCGATGCCA 1560

GAGCCTGGGG CCCCAGGCTT CTACTTTACC CACAGCATCC

TGACTGTGAC

AGAGGAGGAA 1620

TGGAACTCCG GAGAGACCTA TACCTGTGTT GTAGGCCACG

AGGCCCTGCC

ACACCTGGTG 1680

ACCGAGAGGA CCGTGGACAA GTCCACTGGT AAACCCACAC

TGTACAATGT

CTCCCTGATC 1740

ATGTCTGACA CAGGCGGCAC CTGCTATTGA CCAT

1774

Claims (61)

1. IgM 단일클론 항체 ABX-CBL이 결합된 CD147 상의 에피토프에 결합하는 가변부와 보체를 고정시키는 아이소타입을 가진 분리된 단일클론 항체로서, 단 CBL1이 아닌 분리된 단일클론 항체.
2. 제1항에 있어서, 보체 존재 하의 항체는 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구로 구성되는 군에서 선택되는 세포를 선별하여 사멸시키는 작용을 하지만, 휴지 T 세포 및 휴지 B 세포에는 실질적으로 비독성인 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
3. 제1항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
4. 제1항에 있어서, 아이소타입이 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
5. 제2항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
6. 제2항에 있어서, 아이소타입이 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
7. 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포, 휴지 단핵구 및 활성화된 단핵구 군집 상의 CD 147에 결합하는 가변부와 보체를 고정시키는 아이소타입을 가진 분리된 단일클론 항체로서, 보체의 존재 하에, 다른 세포에는 실질적으로 비독성이면서 보체 매개 사멸을 통해 그러한 군집을 선별적으로 고갈시키며, 단 CBL1이 아닌 분리된 단일클론 항체.
8. 제7항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
9. 제7항에 있어서, 아이소타입이 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 분리된 단일클론 항체.
10. 다음과 같은 특성을 가지며, CBL1이 아닌 분리된 단일클론 항체:

    (a) CD147에 결합하며;

    (b) 도 1에 제시된 것과 유사한 웨스턴 블롯 상의 CEM 세포 용해물에 대한 결합을 나타내고;

    (c) 아이소타입은 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되며;

    (d) CD147에의 결합을 위해 ABX-CBL과 경쟁하고;

    (e) hn-RNP-k 단백질과 교차 반응하며;

    (f) RVRS를 포함하는 CD147 상의 일치 서열에 결합하고;

    (g) 보체의 존재 하에서만 MLR 분석에서 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구를 선별적으로 사멸시키며;

    (h) 보체의 존재 여부와 무관하게 CD55 및 CD59를 발현시키는 세포에 실질적으로 비독성이다.
11. 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법으로서,

    CD147에 결합하고, 보체를 결합시킬 수 있는 항체를 생성시키는 단계;

    (a) CD147에의 결합을 위해 ABX-CBL과 경쟁하는 성질; (b) 보체의 존재 하에서만 MLR 분석에서 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 및 단핵구를 선별하여 사멸시키는 능력; 및 (c) 보체의 존재 여부에 무관하게 CD55 및 CD59를 발현시키는 세포에 실질적으로 비독성인 성질 중 하나 이상에 대해 항체를 분석하는 단계

    를 포함하며, 단 상기 항체가 CBL1이 아닌 것인 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법.
12. 제11항에 있어서, (d) 도 1에 제시된 것과 유사한 방법으로 웨스턴 블롯 상의 CEM 세포 용해물에 결합하는 성질을 추가로 포함하는 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법.
13. 제11항에 있어서, (e) RXRS의 펩티드 중의 일치 서열에 결합하는 성질을 추가로 포함하는 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법.
14. 제11항에 있어서, (f) hn-RNP-k 단백질과 교차 반응하는 성질을 추가로 포함하는 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법.
15. 제11항에 있어서, COS 세포 및 이.콜리 세포에 의해 발현되는 CD147의 형태에 결합하는 성질을 추가로 포함하는 질병 치료용 항-CD147 항체를 선별하는 방법.
16. 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포, 휴지 단핵구 및 활성화된 단핵구 군집 상의 CD 147에 결합하는 가변부와 보체를 고정시키는 아이소타입을 가진 항체로서, 보체의 존재 하에, 다른 세포에는 실질적으로 비독성이면서 보체 매개 사멸을 통해 그러한 군집을 선별적으로 고갈시키며, 단 CBL1이 아닌 항체를 제공하여 질병을 치료하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 질병의 치료 방법.
18. 제16항에 있어서, 아이소타입이 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 질병의 치료 방법.
19. 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포, 휴지 단핵구 및 활성화된 단핵구 군집 상의 CD 147에 결합하는 가변부와 보체를 고정시키는 아이소타입을 가진 항체로서, 보체의 존재 하에, 다른 세포에는 실질적으로 비독성이면서 보체 매개 사멸을 통해 그러한 군집을 선별적으로 고갈시키며, 단 CBL1이 아닌 항체를 제공하여 GVHD를 치료하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 GVHD의 치료 방법.
21. 제19항에 있어서, 아이소타입이 쥐 IgM, 쥐 IgG2a, 쥐 IgG2b, 쥐 IgG3, 인간 IgM, 인간 IgG1 및 인간 IgG3으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 GVHD의 치료 방법.
22. 일치 서열 RVRSH를 포함하는 CD147 상의 에피토프에 결합하며, CBL1이 아닌 단일클론 항체.
23. 제22항에 있어서, 항체가 인간 항체인 것이 특징인 단일클론 항체.
24. RXRS, RXRSH, RVRS 및 RVRSH로 구성되는 군에서 선택되는 서열을 포함하는 분리된 펩티드.
25. 제24항의 펩티드를 항체 생성에 사용하는 용도.
26. CD147에 결합하는 인간 단일클론 항체.
27. 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병의 치료용 키트로서, (a) 약학적 허용 담체 내에 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제 및 (b) 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병을 앓는 환자에게 상기 액제를 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량으로 투여하라는 지시문을 포함하는 질병 치료용 키트.
28. 제27항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 질병 치료용 키트.
29. 제27항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 포함하는 것이 특징인 질병 치료용 키트.
30. 제27항에 있어서, 질병이 GVHD를 포함하는 것이 특징인 질병 치료용 키트.
31. 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병의 치료에 사용하는 제품으로서, (a) 멸균 바이얼; (b) 바이얼 내에 함유된 약학적 허용 담체 중의 항-CD147 단일클론 항체; 및 (c) 그러한 질병을 앓는 환자에게 항체를 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 방식으로 투여하라는 지시문을 포함하는 제품.
32. 제31항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 제품.
33. 제31항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 제품.
34. 제31항에 있어서, 질병이 GVHD를 포함하는 것이 특징인 제품.
35. 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병 치료용 키트로서, (a) 약학적 허용 담체 내에 ABX-CBL로 명명된 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제 및 (b) 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병을 앓는 환자에게 상기 액제를 일련의 투여로 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하도록 투여하라는 지시문을 포함하는 질병 치료용 키트.
36. 제35항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 질병 치료용 키트.
37. 제35항에 있어서, 질병이 GVHD를 포함하는 것이 특징인 질병 치료용 키트.
38. 활성화된 T 세포, B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병의 치료에 사용하는 제품으로서, (a) 멸균 바이얼; (b) 바이얼 내에 함유된 약학적 허용 담체 중의 ABX-CBL로 명명된 항-CD147 단일클론 항체; 및 (c) 그러한 질병을 앓는 환자에게 항체를 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 방식으로 투여하라는 지시문을 포함하는 제품.
39. 제38항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 제품.
40. 제38항에 있어서, 질병이 GVHD를 포함하는 것이 특징인 제품.
41. (a) 약학적 허용 담체 내에 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제 및 (b) GVHD를 앓는 환자에게 상기 액제를 일련의 투여로 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하도록 투여하라는 지시문을 포함하는 GVHD 치료용 키트.
42. 제41항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 GVHD 치료용 키트.
43. 제41항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 GVHD 치료용 키트.
44. GVHD의 치료에 사용하는 제품으로서, (a) 멸균 바이얼; (b) 바이얼 내에 함유된 약학적 허용 담체 중의 항-CD147 단일클론 항체; 및 (c) GVHD를 앓는 환자에게 항체를 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 방식으로 투여하라는 지시문을 포함하는 제품.
45. 제44항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 제품.
46. 제44항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 제품.
47. (a) 약학적 허용 담체 내에 ABX-CBL로 명명된 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제 및 (b) GVHD를 앓는 환자에게 상기 액제를 일련의 투여로 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하도록 투여하라는 지시문을 포함하는 GVHD 치료용 키트.
48. 제47항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 GVHD 치료용 키트.
49. GVHD의 치료에 사용하는 제품으로서, (a) 멸균 바이얼; (b) 바이얼 내에 함유된 약학적 허용 담체 중의 ABX-CBL로 명명된 항-CD147 단일클론 항체; 및 (c) GVHD를 앓는 환자에게 항체를 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 방식으로 투여하라는 지시문을 포함하는 제품.
50. 제49항에 있어서, 상기 지시문이 투여 시마다 1 ㎏당 항체 약 0.1 ㎎ 내지 약 0.3 ㎎의 투여량을 제공하는 일련의 투여로 항체를 투여하라는 지시문을 추가로 포함하는 것이 특징인 제품.
51. 약학적 허용 희석제, 완충제 또는 부형제 중에 ABX-CBL로 명명된 항-CD147 단일클론 항체를 포함하는 약학 조성물.
52. 제51항에 있어서, 항체가 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 0.2 ㎎/㎏의 투여량으로 제공되는 것이 특징인 약학 조성물.
53. 활성화된 T 세포, 활성화된 B 세포 또는 단핵구의 유해한 존재를 특징으로 하는 병인을 갖는 질병의 치료 방법으로서, 약학적 허용 담체 중에 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제를 그러한 질병을 앓는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
54. 제53항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 치료 방법.
55. 제53항에 있어서, 투여 시마다 항체를 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 0.3 ㎎/㎏의 투여량으로 제공하도록 투여를 수행하는 것이 특징인 치료 방법.
56. 제53항에 있어서, 질병이 GVHD를 포함하는 것이 특징인 치료 방법.
57. 약학적 허용 담체 중에 항-CD147 항체를 일정량 포함하는 액제를 GVHD를 앓는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 GVHD의 치료 방법.
58. 제57항에 있어서, 항체가 ABX-CBL을 포함하는 것이 특징인 GVHD의 치료 방법.
59. 제57항에 있어서, 투여 시마다 항체를 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 0.3 ㎎/㎏의 투여량으로 제공하도록 투여를 수행하는 것이 특징인 GVHD의 치료 방법.
60. 제26항에 있어서, 중쇄가 서열번호 23, 서열번호 25, 서열번호 27, 서열번호 29, 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 39, 서열번호 40 및 서열번호 로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 것이 특징인 인간 단일클론 항체.
61. 제26항에 있어서, 경쇄가 서열번호 24, 서열번호 26, 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 34, 서열번호 36, 서열번호 38 및 서열번호 41로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 것이 특징인 인간 단일클론 항체.