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CN104471064B - 副粘病毒及其用途 - Google Patents

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CN104471064B
CN104471064B CN201380006012.9A CN201380006012A CN104471064B CN 104471064 B CN104471064 B CN 104471064B CN 201380006012 A CN201380006012 A CN 201380006012A CN 104471064 B CN104471064 B CN 104471064B
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Abstract

本文描述了分离的副粘病毒麻疹病毒(FmoPV)，编码FmoPV基因组的分离的核酸、FmoPV蛋白的分离的氨基酸序列、针对FmoPV及其蛋白的抗体，及它们的用途。在某些实施方案中，修饰的FmoPV是猫麻疹病毒。本文还提供了包含修饰FmoPV基因或基因区段的重组FmoPV和此类病毒的用途。重组FmoPV可用于预防和/或治疗与FmoPV相关的疾病，或用作递送载体。本文还描述了用于FmoPV的诊断测定。在某些实施方案中，FmoPV引起肾脏疾病。在某些实施方案中，肾脏疾病是在猫科动物中。在某些实施方案中，肾脏疾病是小管间质性肾炎(“TIN”)。本文中还描述了用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的定量测定。在某些实施方案中，定量测定是反转录和聚合酶链式反应(RT‑PCR)。本文还描述了用于预防和治疗FmoPV感染的疫苗和含有该疫苗的试剂盒。本文还提供了包含用于检测FmoPV的核酸分子的诊断试剂盒。

Description

副粘病毒及其用途
交叉引用相关申请
本申请要求2012年1月20日提交的美国专利申请序列号61/588,778的权益，所述申请在此完整地通过引用并入。
1. 技术领域
本文描述了分离的副粘病毒麻疹病毒(FmoPV)，编码FmoPV基因组的分离的核酸、FmoPV蛋白的分离的氨基酸序列、针对FmoPV及其蛋白的抗体，及它们的用途。在某些实施方案中，修饰的FmoPV是猫麻疹病毒。本文还描述了包含修饰FmoPV基因或基因区段的重组FmoPV和此类病毒的用途。重组FmoPV可用于预防和/或治疗与FmoPV相关的疾病，或用作递送载体。本文还描述了用于FmoPV的诊断测定。在某些实施方案中，FmoPV引起肾脏疾病。在某些实施方案中，肾脏疾病是在猫科动物中。在某些实施方案中，肾脏疾病是小管间质性肾炎(“TIN”)。本文中还描述了用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的定量测定。在某些实施方案中，定量测定是反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)。本文还描述了用于预防和治疗FmoPV感染的疫苗和含有该疫苗的试剂盒。本文描述了包含用于检测FmoPV的核酸分子的诊断试剂盒。
2. 发明背景
副粘病毒是有包膜、反义单链RNA病毒，其分成两个亚科，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺病毒亚科(Pneumovirinae)。在过去二十年中，副粘病毒亚科中的病毒已经与人类和各种动物中的一些新出现的疾病相关(1-9)。目前在副粘病毒亚科中有五个属，即呼吸道病毒属(Respirovirus)、风疹病毒属(Rubulavirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、亨尼病毒属(Henipavirus)和禽腮腺病毒属(Avulavirus)，尽管亚科的一些成员仍然未分类。在副粘病毒亚科的成员中，麻疹病毒、腮腺炎病毒和人类副流感病毒1至4是引起呼吸道至全身性感染的爆发的最众所周知的人副粘病毒(10-12)。新近报道了来自中国大陆果蝠的三种新型风疹病毒，Tuhoko病毒1、2和3，以及来自香港锡金大鼠的一种新型未分类副粘病毒，Tailam病毒(13,14)。尽管各种动物中存在副粘病毒，但在猫中没有自然观察到副粘病毒，尽管存在争论性的证据表明，副流感病毒5病毒可以感染猫(15,16)。
猫和狗是全世界最常见的家畜和宠物。由于它们的密切关联性，这两种动物间的病毒种间跳跃并不少见。对于冠状病毒，猫冠状病毒和犬冠状病毒被分类在相同种α冠状病毒1（Alphacoronavirus 1）下，并且猫冠状病毒II型株通过猫冠状病毒I型株和犬冠状病毒之间的双同源重组生成(17)。对于细小病毒，在1970年代出现的致命的犬细小病毒也源自猫细小病毒，猫泛白血球降低症病毒(feline panleukopaenia virus)(18,19)。至于疱疹病毒，犬疱疹病毒1和猫疱疹病毒1密切相关，都分类在水痘病毒(Varicellovirus)属下(20)。此外，对于乳头瘤病毒，犬口腔乳头瘤病毒和猫乳头瘤病毒也密切相关，并且分类在λ乳头瘤病毒属下(21)。狗是麻疹病毒属中的副粘病毒，犬瘟热病毒的众所周知的宿主(22)，但在家猫中从没有发现副粘病毒。
许多猫科动物疾病没有已知的原因。例如，猫小管间质性肾炎的大多数情况的原因是迄今未知的，因此治疗主要是支持性的，且预防是困难的。小管间质性肾炎(“TIN”)涉及对肾小管和小间隙的主要损伤，是猫中肾衰竭的最常见原因和死亡的首要原因之一。然而，猫TIN的大多数情况的原因仍然未知，因此治疗主要是支持性的，且预防是困难的。由于世界各地的家庭中有数百万只猫，来自TIN的疾病负担是巨大的。例如，在美洲的美国，据估计，有7千5百万家养猫，尽管在英国有估计有8百万家养猫 (数据来自Chomel BB, Sun B.,Zoo noses in the bedroom. Emerg Infect Dis. 2011 Feb:17(2):167-72.)。诊断、治疗或预防猫肾脏或其它疾病的能力将有很大益处。
本文中任何参考文献的引用不应被解释为承认此类参考文献可作为本申请的“现有技术”。
3. 发明概述
在一个方面，本发明提供了包含野生型或修饰的FmoPV基因区段(基因组RNA)或其互补序列(反基因组RNA)或由其组成的核酸序列。本文还描述了编码FmoPV的基因组的分离的核酸，由分离的FmoPV的部分编码的多肽，核酸，引物，载体，宿主细胞，针对FmoPV和FmoPV多肽的抗体，免疫原性组合物，诊断方法，筛选测定，治疗方法和相关用途。
在一个方面，本文描述了麻疹病毒属中的一种新型副粘病毒，来自家猫(Felis catus)的猫麻疹病毒(以下称为“FmoPV”)。本文还描述了这种新型FmoPV病毒与猫中的小管间质性肾炎(TIN)相关。
在一个方面，修饰的FmoPV基因区段包含FmoPV核酸序列，和还有异源核苷酸序列。在一些实施方案中，第一和第二异源核苷酸序列编码不同的肽或多肽。在其它实施方案中，第一和第二异源核苷酸序列编码相同的肽或多肽。在具体实施方案中，本文所述的包含修饰的FmoPV基因区段的FmoPV在细胞(例如，MDCK细胞)或含胚鸡蛋中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多代后实现了约3 x 105 pfu/ml、3.5 x 105 pfu/ml、4 x 105 pfu/ml、5 x 105 pfu/ml、1 x 106 pfu/ml、5 x 106 pfu/ml、1 x 107 pfu/ml、5 x 107 pfu/ml、1 x 108 pfu/ml、5x 108 pfu/ml、1 x 109 pfu/ml或更高的滴度。在某些实施方案中，本文所述的FmoPV包含减毒突变。在一个方面，本文提供了使用FmoPV的方法，其中FmoPV包含修饰的FmoPV基因区段。
在一个实施方案中，本文提供了在生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、粪、痰、鼻咽抽吸物等中检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的存在或表达的方法。样品中FmoPV活性或表达相对于对照样品的升高或降低可通过将生物材料与可直接或间接检测FmoPV存在或表达的试剂接触而测定。在一个具体实施方案中，检测试剂为本发明的核酸分子。
在一个具体实施方案中，本文提供了FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的诊断测定。具体地，本文提供了使用反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)检测FmoPV的核酸分子的定量测定。本发明中还提供适合与FmoPV核酸杂交的核酸分子，诸如包括但不限于PCR引物、逆转录酶引物、用于Southern分析或其它核酸杂交分析以检测FmoPV核酸的探针。所述FmoPV核酸包含以下所述的核酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、片段或部分或由其组成。
在一个方面，本发明涉及分离的FmoPV用于诊断方法的用途。在一个具体实施方案中，本发明提供在生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、粪、痰、鼻咽抽吸物等中检测本发明FmoPV 的mRNA或基因组RNA的方法。样品中FmoPV 的mRNA或基因组RNA相对于对照样品水平的升高或降低可通过将生物材料与可直接或间接检测FmoPV 的mRNA或基因组RNA的试剂接触而测定。在一个具体实施方案中，检测试剂为本发明的核酸分子。
本发明还涉及鉴定感染FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的对象的方法。在一个具体实施方案中，所述方法包括从获得自对象的生物样品获得总RNA；逆转录总RNA以获得cDNA；和用一组来源于FmoPV的核苷酸序列的引物使cDNA进行PCR测定。
本发明进一步涉及用于检测FmoPV的mRNA或基因组RNA的包含引物和核酸探针的诊断试剂盒。在一个具体实施方案中，本文提供了包含核酸分子的诊断试剂盒，其适合用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物。在一个实施方案中，本文提供的试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的核酸序列。在另一个实施方案中，本文提供的试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的FmoPV。
在另一个方面，本文提供了包含本文所述的核酸序列的基质(例如，宿主细胞和蛋)。
在一个实施方案中，本文提供了用于引发对象中针对FmoPV的免疫应答的方法，其中所述方法包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本文提供了用于预防和/治疗对象中的FmoPV感染的方法，其中所述方法包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本文提供了用于预防和/治疗对象中的FmoPV疾病的方法，其中所述方法包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。
在另一个实施方案中，本文提供了用于引发对象中针对抗原的免疫应答的方法，其包括将本文所述的FmoPV或其组合物施用于对象。在另一个实施方案中，本文提供了用于利用本文所述的FmoPV或其组合物生成或鉴定结合FmoPV的抗体的方法。
在另一个方面，本文所述的FmoPV可用于评估化合物的抗病毒活性或理解FmoPV的生命周期。
3.1 术语
如本文所用，术语“变体”是指FmoPV的天然存在的遗传突变体或重组制备的FmoPV变体，与具有Genbank登录号JQ411014、JQ411015和JQ411016中公开核酸系列的FmoPV相比，它们各自在其基因组中包含一种或多种突变。术语“变体”还可指给定肽的天然存在的变体或重组制备的特定肽或蛋白的变体，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸取代、插入或缺失进行修饰。
如本文所用，术语“突变体”是指与野生型生物体相比生物体的核苷酸序列中存在突变。
如本文所用，术语“抗体”是指单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、骆驼源化(camelised)抗体、单结构域抗体、单链Fv (scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv (sdFv)和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id抗体)和上述任何抗体的表位结合片段。具体地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即包含抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可为任何型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用，术语“抗体片段”是指免疫特异性结合FmoPV或FmoPV任何表位的抗体片段。抗体片段可通过任何本领域技术人员已知的技术产生。例如，Fab和F(ab')2片段可通过使用酶诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab')2片段)蛋白水解切割免疫球蛋白分子产生。F(ab')2片段含有完整的轻链和重链的可变区、CH1区和铰链区。抗体片段还可通过重组DNA技术产生。抗体片段可为抗体的一个或多个互补决定区(CDR)。
如本文所用，术语“免疫特异性结合本发明多肽的抗体或抗体片段”是指抗体或其片段，其免疫特异性结合FmoPV的核酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、或片段或其部分编码的多肽，或者其免疫特异性结合FmoPV或其变体、类似物、衍生物或片段的多肽，并且不非特异性结合其它多肽。免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可与其它抗原交叉反应。优选地，免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段不与其它抗原交叉反应。免疫特异性结合本发明多肽的抗体或其片段可通过例如免疫测定或其它本领域技术人员已知的技术鉴定。
如本文所用，术语“表位”是指在动物、优选哺乳动物、最优选猫科动物中具有抗原性或免疫原性活性的FmoPV肽、多肽或蛋白的片段。具有免疫原性活性的表位是在动物中引起抗体应答的多肽的片段。具有抗原性活性的表位是抗体与其免疫特异性结合的多肽或蛋白的片段，这可通过本领域已知的任何方法测定，例如通过本文所述的免疫测定法。抗原性表位不必是免疫原性的。
如本文所用，术语“抗原性”是指物质(例如外来物、微生物、药物、抗原、蛋白、肽、多肽、核酸、DNA、RNA等)在具体生物体、组织和/或细胞中引起免疫应答的能力。有时术语“抗原性的”与术语“免疫原性的”是同义的。
如本文所用，术语“免疫原性”是指物质(例如外来物、微生物、药物、抗原、蛋白、肽、多肽、核酸、DNA、RNA等)在生物体中引起免疫应答的特性。免疫原性部分取决于讨论的物质的大小，部分取决于该物质与宿主分子不相似的程度。高度保守的蛋白倾向具有较低免疫原性。
如本文所用，术语“在严格条件下杂交”描述相互之间具有至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%同一性的核苷酸序列通常保持互相杂交的杂交和洗涤条件。此类杂交条件描述于例如但不限于Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.; Basic Methods inMolecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986), pp.75-78, and 84-87; 和Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(1982), pp.387-389，且对于本领域技术人员来说是众所周知的。严格杂交条件的一个优选非限制性实例是在约68℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5% SDS中杂交，然后在室温下2X SSC、0.5% SDS中洗涤一次或多次。严格杂交条件的另一个优选的非限制性实例是在约45℃下6X SSC中杂交，然后在约50-65℃下0.2X SSC、0.1% SDS中洗涤一次或多次。
“分离的”或“纯化的”肽或蛋白基本不含来自所述蛋白衍生自的细胞来源或组织来源的细胞材料或其它污染蛋白，或当它们通过化学法合成时，基本不含化学前体或其它化学物质。措词“基本不含细胞材料”包括制备多肽/蛋白制剂，其中多肽/蛋白从其分离或重组生产的细胞的细胞成分中分离出来。因此，基本不含细胞材料的多肽/蛋白包括含少于约30%、20%、10%、5%、2.5%或1% (干重)污染蛋白的多肽/蛋白制剂。当多肽/蛋白为重组生产时，还优选基本不含培养基，即培养基占蛋白制剂的体积少于约20%,、10%或5%。当多肽/蛋白通过化学合成生产时，优选基本不含化学前体或其它化学物质，即与参与蛋白合成的化学前体或其它化学物质分离。因此，这种多肽/蛋白制剂含少于约30%、20%、10%、5% (干重)不属于目的多肽/蛋白片段之外的化学前体或化合物。在本发明优选的实施方案中，多肽/蛋白是分离的或纯化的。
如本文所用，术语“分离的”病毒是与天然病毒来源中存在的其它生物体分离的病毒，所述来源例如为生物材料诸如细胞、血液、血清、血浆、唾液、尿、粪、痰、鼻咽抽吸物等。分离的病毒可用于感染对象。
如本文所用，术语“具有本发明多肽的生物活性”是指具有共同生物活性的多肽或蛋白的特性，其与以下多肽相比具有类似或相同结构域和/或具有足够的氨基酸同一性：FmoPV的核苷酸序列或其互补序列、类似物、衍生物、片段或部分编码的多肽；或具有FmoPV的氨基酸序列或其变体、类似物、衍生物或片段的多肽。本发明多肽的这种共同生物活性包括抗原性和免疫原性。
如本文所用，术语“部分”或“片段”是指含有相关核酸分子长度的至少约25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000或更多个连续核酸，且具有所述核酸分子的至少一种功能特征(或其编码的蛋白具有所述核酸分子所编码的蛋白的一种功能特征)的核酸分子片段；或是指含有相关蛋白或多肽长度的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、500、600、800、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、9,500或更多个氨基酸残基，且具有所述蛋白或多肽的至少一种功能特征的蛋白或多肽的片段。
如本文所用，术语“类似物” (例如蛋白、多肽、肽和抗体)是指以下物质：其具有与第二种物质相似或相同的功能，但不必包含与第二种物质相似或相同的氨基酸序列，或具有与第二种蛋白类物质相似或相同的结构。在一个具体实施方案中，抗体类似物与该类似物衍生自的原初抗体免疫特异性结合相同的表位。在一个可替代实施方案中，抗体类似物与该类似物衍生自的原初抗体免疫特异性结合不同的表位。具有相似氨基酸序列的试剂是指满足至少一项以下条件的第二试剂：(a) 试剂的氨基酸序列与第二试剂的氨基酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同；(b) 编码试剂的核苷酸序列在严格条件下与编码第二试剂的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60 个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基或至少150个连续氨基酸残基的核苷酸序列杂交；和(c) 编码试剂的核苷酸序列与编码第二试剂的核苷酸序列至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同。与第二试剂具有相似结构的试剂是指与第二试剂具有类似的二级、三级或四级结构的试剂。试剂的结构可通过本领域技术人员已知的方法测定，包括但不限于肽测序、X射线晶体学、核磁共振、圆二色性和晶体电子显微镜。
为了测定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，为了达到最佳比较目的而比对序列(例如在第一种氨基酸序列或核酸序列中引入空位以与第二氨基酸或核酸序列达到最佳比对)。然后在相应的氨基酸位置或核苷酸位置比较氨基酸残基或核苷酸。当第一种序列的位置被与第二种序列相应位置相同的氨基酸或核苷酸占据时，所述分子在该位置是相同的。两种序列之间的同一性百分比是两种序列共有相同位置的数量的函数(即%同一性=相同重叠位置的数量/位置总数量×100%)。在一个实施方案中，两种序列具有相同长度。
两种序列之间同一性百分比的测定也可使用数学算法完成。用于比较两种序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin和Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 87:2264 2268的算法，在Karlin和Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 90:5873 5877中进行修改。此类算法被并入Altschul 等人, 1990, J. Mol.Biol. 215:403的NBLAST和BLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST核苷酸程序进行，参数设定在例如分值=100，字长=12，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可用XBLAST程序进行，参数设定在例如分值=50，字长=3，以获得与本发明蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可使用Altschul等人，1997,Nucleic Acids Res. 25:3389 3402中所述的Gapped BLAST。或者，可使用PSI BLAST进行检测分子间远缘关系(Id.)的叠代搜索。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI Blast程序时，可使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)默认的参数(参见例如NCBI网站)。用于序列比较的数学算法的另一个优选非限制性实例是Myers和Miller, 1988, CABIOS 4:11 17的算法。该算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，其为GCG序列比对软件包的部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残基表、缺口长度罚分12和空位罚分4。
两种序列之间的同一性百分比可使用与上述技术相似的技术测定，允许或不允许缺口。在计算同一性百分比时，通常只计算完全匹配。
如本文所用，术语“衍生物”(例如蛋白、多肽、肽和抗体)是指包含通过引入氨基酸残基取代、缺失和/或插入而改变的氨基酸序列的试剂。如本文所用，术语“衍生物”也是指进行修饰的试剂，即通过将任何类型的分子共价连接至试剂。例如但不以任何方式限制，抗体可进行修饰，例如通过糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解裂解、连接细胞配体或其它蛋白等。试剂的衍生物可通过使用本领域技术人员已知技术化学修饰而产生，所述技术包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，试剂的衍生物可包含一种或多种非典型氨基酸。试剂的衍生物具有与其来源的物质相似或相同的功能。
如本文所用，术语“约”或“大约”当与数字连用时是指相关数字的1%、5%或10%之内的任何数字。
如本文所用，术语“有效量”在向对象施用治疗的背景下是指具有一种或多种预防性和/或治疗性效果的治疗的量。在某些实施方案中，在向对象施用治疗的背景下有效量是指能够足以实现下述效果中的一种、两种、三种、四种或更多种的治疗的量：(i)降低或改善FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的严重度；(ii)降低FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的持续时间；(iii)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的发展；(iv) FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的退化；(v)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的发展或发作；(vi)预防FmoPV感染、FmoPV疾病或与之相关症状的复发；(vii)降低或预防FmoPV从一个细胞传播到另一个细胞，一个组织传播到另一个组织，或一个器官传播到另一个器官；(viii)预防或降低FmoPV从一个对象传播/传递到另一个对象；(ix)降低与FmoPV感染或FmoPV疾病相关的器官衰竭；(x)减少对象住院治疗；(xi)缩短住院治疗的时间；(xii)增加具有FmoPV感染或与之相关疾病的患者的存活率；(xiii)消除FmoPV感染或与之相关疾病；(xiv)抑制或降低FmoPV复制；(xv) 抑制或降低FmoPV与宿主细胞的结合或融合；(xvi)抑制或降低FmoPV进入宿主细胞；(xvii) 抑制或降低FmoPV基因组的复制；(xviii) 抑制或降低FmoPV蛋白的合成；(xix) 抑制或降低FmoPV颗粒的装配；(xx) 抑制或降低FmoPV颗粒从宿主细胞的释放；(xxi) 降低FmoPV滴度；(xxii) 降低与FmoPVB感染或FmoPV疾病相关的症状数；(xxiii) 增强、改善、补充、互补或增加另一种疗法的一种或多种预防或治疗效果；(xxiv) 预防与FmoPV感染相关的二次感染的发作或进展；和/或 (xxv) 预防继发于FmoPV感染发生的疾病严重度的发生或减小。本文下面提供了有效量的示例性剂量。
在某些实施方案中， 治疗的有效量并不导致完全保护免于FmoPV疾病，但是导致相比于未治疗对象FmoPV滴度降低或FmoPV数量减少。在某些实施方案中，治疗的有效量导致FmoPV滴度相对于未治疗对象0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、或1000倍或更大的降低。在某些实施方案中，治疗的有效量使得FmoPV滴度相对于未治疗的对象降低0.5对数、1对数、2对数、3对数、4对数、5对数、6对数、7对数或10对数或更多。降低FmoPV的滴度、数量或总载量的益处包括，但不限于，感染症状的严重度更低、感染症状更少、与感染相关的疾病的病程的缩短、和预防继发于FmoPV感染的感染的发生或减少其疾病严重度。
如本文所用，术语“片段”在核酸序列的背景下是指包含来自亲本序列的至少2个或至少3个连续核苷酸的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，该术语是指来自亲本序列的2至30、5至30、10至60、25至100、150至300或更多个连续核苷酸的核苷酸序列。在另一个实施方案中，该术语是指亲本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450或475个连续核苷酸的核苷酸序列。
如本文所用，术语“片段”在氨基酸序列的背景下是指包含来自亲本序列的至少2个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，该术语是指来自亲本序列的2至30、5至30、10至60、25至100、150至300或更多个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该术语是指亲本序列的至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250、275、300、325、350、375、400、425、450或475个连续氨基酸残基的氨基酸序列。
如本文所用，术语“异源的”是指没有发现与另一个单元天然相关的单元。例如，如果两个核苷酸序列在自然界中没有被发现彼此相关联，则第一核苷酸序列被称为对于第二核苷酸序列是异源的。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何类型的细胞，例如，原代细胞或来自细胞系的细胞。在具体实施方案中，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的细胞和此类细胞的子代或潜在后代。此类细胞的后代可以不与用核酸分子转染的亲代细胞相同，这是由于在随后的传代或核酸分子整合进入宿主细胞基因组时可能发生的突变或环境影响。
如本文所用，术语“组合”在向对象施用一种或多种治疗的背景下是指使用多于一种治疗。术语“组合”的使用不限制向对象施用治疗的顺序。第一治疗可以在向对象施用第二治疗之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之前)、同时、或者之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周之后)施用。
如本文所用，术语“感染”意指病毒在细胞或对象中侵入、增殖和/或存在。在一个实施方案中，感染是“活跃”感染，即，其中病毒在细胞或对象中复制。此类感染的特征在于病毒从病毒初始感染的细胞、组织和/或器官向其它细胞、组织和/或器官传播。感染也可以是潜伏感染，即，其中病毒不复制的感染。在某些实施方案中，感染是指由细胞或对象中病毒的存在，或通过病毒侵入细胞或对象而导致的病理学状态。
如本文所用，术语“FmoPV疾病”和涉及与FmoPV感染有关的疾病的短语是指由FmoPV在细胞或对象中存在或FmoPV侵入细胞或对象导致的病理学状态。在某些实施方案中，该术语是指由FmoPV引起的肾病。
如本文所用，术语“分离的”在核酸的背景下是与核酸分子的天然来源中存在的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术生产时可基本不含其它细胞材料或培养基，当通过化学法合成时可基本不含化学前体或其它化学物质；然而，“分离的”排除克隆文库诸如cDNA文库的成员。在一个具体实施方案中，本文所述核酸是分离的。在另一个具体实施方案中，本文所述的抗体是分离的。用语“基本上不含其它细胞材料”包括制备核酸分子，其中将所述核酸分子与其从中分离或重组产生的细胞的细胞组分分离。因此，基本上不含细胞材料的核酸分子包括具有小于约30％、20％、10％或5％(以干重计)的异源核酸分子或其它细胞组分的制剂。当核酸分子是重组产生的时，其还优选基本上不含培养基，即培养基代表小于约20％、10％、或5％的核酸分子制剂的体积。当核酸分子通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其它化学物，即将其与参与核酸分子的合成的化学前体或其它化学物分离开。因此，此类核酸分子的制剂除了目标核酸分子以外具有小于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。
如本文所用，短语“感染复数”或“MOI”是每个受感染细胞的病毒的平均数。MOI通过添加的病毒数(添加的ml x 噬斑形成单位(pfu))除以添加的细胞数(添加的ml x 细胞/ml)来确定。
如本文所用，术语“核酸”和“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核酸，核糖核苷酸，和核糖核酸及其聚合形式，并且包括单链或双链形式。在某些实施方案中，此类术语包括天然核苷酸的已知类似物，例如，肽核酸(“PNA”)，其与参考核酸具有相似的结合特性。在一些实施方案中，此类术语是指脱氧核糖核酸(例如，cDNA或DNA)。在其它实施方案中，此类术语是指核糖核酸(例如，mDNA或RNA)。
如本文所用，术语“预防”在向对象施用(一种或多种)治疗的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的预防效果。在一个具体实施方案中，术语“预防”在向对象施用(一种或多种)治疗以预防疾病的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的以下效果中的一种或多种：(i) 抑制或降低疾病或其症状的发展或发作；(ii) 抑制或降低疾病或其相关症状的复发；和(iii) 抑制或降低病原体感染和/或复制。在其它具体实施方案中，术语“预防”在向对象施用(一种或多种)治疗以预防FmoPV疾病的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的以下效果中的一种或多种：(i) 抑制或降低FmoPV疾病或其症状的发展或发作；(ii) 抑制或降低FmoPV疾病或其相关症状的复发；和(iii) 抑制或降低FmoPV感染和/或复制。
在另一个具体实施方案中，术语“预防”在向对象施用(一种或多种)治疗以预防FmoPV感染的背景下是指由施用治疗或治疗组合导致的以下效果中的一种或多种： (i) 降低或抑制FmoPV 从一个细胞传播到另一个细胞；(ii) 降低或抑制FmoPV 从一个器官或组织传播到另一个器官或组织；和/或 (iii) 降低或抑制FmoPV 从一个器官或组织的区域传播到另一个器官或组织的区域(例如，降低FmoPV从上呼吸道传播到下呼吸道)。
如本文所用，术语“对象”或“患者”可互换地用于指动物(例如，猫，狗，鸟，爬行动物和哺乳动物)。在一个具体实施方案中，对象是猫。在另一个实施方案中，对象是包括非灵长类的哺乳动物(例如，骆驼、驴、斑马、奶牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠)和灵长类(例如，猴、黑猩猩和人类)。在另一个实施方案中，对象是非人类的哺乳动物。在另一个实施方案中，对象是人类。
如本文所用，术语“治疗”可以是指可用于防止或处理病毒感染或与之相关的疾病或症状的任何一种或多种方案、方法、化合物、组合物、制剂和/或试剂。在某些实施方案中，术语“治疗”是指生物治疗、支持治疗和/或其它治疗，其用于处理或预防本领域技术人员已知的病毒感染或与之相关的疾病或症状。在一些实施方案中，术语“治疗”是指免疫原性组合物(例如，FmoPV疫苗)。
如本文所用，术语“治疗”在向对象施用治疗的背景下是指从施用治疗或治疗组合引起的有益的或治疗性的效果。在具体实施方案中，该术语是指由施用治疗或治疗组合引起的下列效果中的1、2、3、4、5种或更多种：(i)降低或改善疾病或与之相关症状的严重度；(ii)降低疾病或与之相关症状的持续时间；(iii)预防疾病或与之相关症状的发展；(iv)疾病或与之相关症状的退化；(v)预防疾病或与之相关症状的发展或发作；(vi)预防疾病或与之相关症状的复发；(vii)降低或预防病原体从一个细胞传播到另一个细胞，一个组织传播到另一个组织，或一个器官传播到另一个器官；(viii)预防或降低病原体从一个对象传播/传递到另一个对象；(ix)降低与疾病相关的器官衰竭；(x)减少对象住院治疗；(xi)缩短住院治疗的时间；(xii) 增加具有之相关疾病的患者的存活率；(xiii)消除疾病；(xiv)抑制或降低病原体复制；(xv) 降低病原体数目；和(xvi) 增强、改善、补充、互补或增加另一种疗法的预防或治疗效果。
如本文所用，在一些实施方案中，术语“野生型”在病毒的背景下是指流行的、循环的和天然产生典型疾病爆发的病毒类型。
4. 附图简述
图1显示了FmoPV和其它麻疹病毒的基因组组织。基因被显示为按比例绘制的框。对于P基因，在标记“P”的框上且在线末端具有字母V的第一线代表V CDS的区域，在线末端具有字母C的第二线代表C CDS。
图2是FmoPV 761U Cats/Hong Kong/2009的16050 bp核苷酸序列。
图3是FmoPV 776U Cats/Hong Kong/2009的16050 bp核苷酸序列。
图4是FmoPV M252A Cats/Hong Kong/2009的16050 bp核苷酸序列。
图5显示了FmoPV和其它麻疹病毒的N蛋白的多重比对。麻疹病毒中的保守MA(S,T)L基序和副粘病毒中的三个保守基序在空心框中用实线边界标记，报道的共有序列在比对上方表示(其中x代表任何氨基酸残基，代表芳族氨基酸残基)。对于每种蛋白的氨基酸残基编号显示在每个序列的右边。点表示相同的残基，虚线表示空位。NES在具有点划线边界的空心框中，NLS在具有虚线边界的空心框中。
图6A-D. 小图A显示FmoPV对CRFK细胞的细胞病变效应。空心正方形显示巨细胞的形成。小图B和C显示使用来自FmoPV的重组N蛋白免疫的豚鼠的血清在未感染和感染的CRFK细胞中的间接免疫荧光抗原检测，显示在FmoPV感染的CRFK细胞中的特定苹果绿细胞质荧光。小图D是感染的CRFK细胞培养上清液的电子显微镜检查，显示具有爆发包膜和副粘病毒中螺旋形N的典型的“鲱鱼骨(herring bone)”外观的有包膜病毒。
图7是FmoPV 的N、P、M、F、A和L氨基酸序列的系统发生分析。用从1000个树计算并在中点生根的的引导程序值通过最大似然法构建树。刻度条表明对应于0.5个取代/位点的枝长。来自FmoPV的三株分别命名为761U、776U、M252A。其它病毒的名称和登录号列于下表3中。
图8 本研究中从猫鉴定的副粘病毒的L基因的72-bp片段的氨基酸序列的系统发生分析。该树通过邻接法构建。刻度条表明对应于2个氨基酸差异/序列的枝长。基因组序列测定的编号为761U、776U和M252A的来自流浪猫的三个毒株以粗体显示。RSV, 呼吸道合胞病毒(U39661); DmoPV, 海豚麻疹病毒(NC_005283); PprPV, Peste-des-petits反刍动物病毒(NC_006383); MeaPV, 麻疹病毒(NC_001498); CdiPV, 犬瘟热病毒(NC_001921);MosPV, 莫斯曼病毒(NC_005339); NarPV, Nariva病毒(FJ362497); ThkPV3, Tuhoko病毒3 (GU128082); ThkPV2, Tuhoko病毒2 (GU128081); ThkPV, Tuhoko病毒1 (GU128080);JPV, J-病毒(NC_007454); BeiPV, 贝隆病毒(NC_007803); NipPV, 尼帕病毒(NC_002728); HenPV, 亨德拉病毒(NC_001906); FdlPV, Fer-de-lance病毒(NC_005084);SenPV, 仙台病毒(NC_001552); HpiPV-1, 人副流感病毒1 (NC_003461)。
图9显示了用针对纯化(His)6-标记的重组FmoPV N蛋白抗原的流浪猫血清的Western印迹分析。也显示了FmoPV的对应尿液样品的RT-PCR结果。
图10A-F. 小图A和B显示来自尿中检测到FmoPV的流浪猫和正常猫的H & E染色的肾脏的组织切片，显示受感染的猫中小间隙中炎性细胞的聚集和肾小管变性。小图C和D显示使用抗FmoPV N蛋白抗体阳性的豚鼠血清和免疫前豚鼠血清对尿中检测到FmoPV的流浪猫的肾切片的免疫组织化学染色，显示出阳性的肾小管细胞。小图E和F显示使用抗FmoPV N蛋白抗体阳性的豚鼠血清和免疫前豚鼠血清对FmoPV阳性的流浪猫的淋巴结切片的免疫组织化学染色，显示出阳性的单核细胞。
图11A-B表示在小图A和B分别没有和有TIN的组织学证据的猫中cauxin免疫组织化学染色石蜡包埋的肾切片的代表性图像。
图12A-C显示对于以下的FmoPV感染的流浪猫的淋巴结的双重染色：(A)小鼠抗人髓细胞/组织细胞抗原，然后用得克萨斯红缀合的山羊抗小鼠IgG标记；(B)针对FmoPV的N蛋白的豚鼠抗血清，随后为FITC缀合的兔抗豚鼠IgG; (C)合并照片显示，两种抗原共定位于细胞的细胞质中。
5. 发明详述
5.1 核酸
在一个方面，本发明提供了包含野生型或修饰的猫麻疹病毒(“FmoPV”)或由其组成的核酸序列。还提供了修饰的FmoPV基因区段(基因组RNA)或其互补序列(反基因组RNA)。
在一个方面，本文描述了FmoPV的完整核苷酸序列。在某些实施方案中，核苷酸序列是Genbank登录号：JQ411014、JQ411015和JQ411016。JQ411014核苷酸序列显示于图2，标记为FmoPV 761U Cats/Hong Kong/2009。JQ411015核苷酸序列显示于图3，标记为FmoPV776U Cats/Hong Kong/2009。JQ411016核苷酸序列显示于图4，标记为FmoPV M252A Cats/Hong Kong/2009。
在其它方面，本文描述了FmoPV核苷酸序列的互补序列、类似物、衍生物、或其片段或部分。在某些实施方案中，在严格条件下，本文描述了与FmoPV的基因组的任何部分杂交的核酸分子。在具体实施方案中，本文描述了适合用作引物的核酸分子，其由FmoPV的核酸序列组成或包含FmoPV的核酸序列。在另一个实施方案中，本文描述了适合用作检测FmoPV的杂交探针的核酸分子。引物和探针包含在用于检测来自FmoPV的野生型、天然或人工变体、类似物或衍生物的核酸分子或蛋白的试剂盒中。
本文描述了由于一个或多个自然发生的突变(包括但不限于可能导致或可能不会导致表型改变的对基因组序列的点突变、重排、插入、缺失等)具有不同于Genbank登录号JQ411014、JQ411015和JQ411016的基因组序列的序列的FmoPV的自然变体。优选地，变体包括基因组中1-5、6-10、11-10、20-40、40-60、60-100、100-500、500-1000、1000-2000个核酸变化。在某些实施方案中，FmoPV的基因组序列的突变导致相对于FmoPV的野生型基因组序列的重排、插入和/或缺失。
在某些实施方案中，本文所述的核酸序列是载体的部分或并入载体。在一个具体实施方案中，本文所述的核酸序列是是载体的部分或并入载体，其促进修饰的FmoPV基因区段或其互补序列的产生。在一个实施方案中，本文所述的核酸序列是pDZ载体的部分或并入pDZ载体 (对于涉及pDZ载体的信息，参见例如，Quinlivan等人, 2005, J. of Virology79：8431–8439)。在另一个实施方案中，本文所述的核酸序列是pHW2000载体的部分或并入pHW2000载体 (对于涉及pHW2000载体的信息，参见例如，Hoffmann等人, 2000, Proc NatlAcad Sci U S A. 97(11):6108-13)。在另一个实施方案中，本文所述的核酸序列是pAD3000载体的部分或并入pAD3000载体 (对于涉及pAD3000载体的信息，参见例如，Hoffmann等人, 2000, Proc Natl Acad Sci U S A. 97(11):6108-13)。在另一个实施方案中，本文所述的核酸序列是pAD4000载体的部分或并入pAD4000载体 (对于涉及pAD4000载体的信息，参见例如，Wang等人, 2007, J. of Virology 4：102)。在一个实施方案中，本文所述的核酸序列是以下章节6中载体的部分或并入以下章节6中载体。
用于产生或使用核酸的技术将采用，除非另有说明，分子生物学和重组DNA操作和生产的通常常规技术。技术人员已知的任何克隆技术可用于装配本文所述的核酸和必要时突变核苷酸。此类技术是众所周知的，并对于技术人员可获得自实验室手册，诸如Sambrookand Russell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)。具体地，聚合酶链式反应，限制性酶，连接酶，诱变引物和载体中核酸片段的扩增可用来产生本文所述的核酸的个别元件，然后装配它们。
在一些实施方案中，将本文所述的核酸序列引入(例如转染至)基质，诸如宿主细胞或含胚蛋。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的核酸序列的基质(例如，宿主细胞或蛋)。在其它实施方案中，将本文所述的作为载体的部分或并入载体的核酸序列引入(例如转染至)基质，诸如宿主细胞或含胚蛋。因此，在一些实施方案中，本文提供了包含本文所述的作为载体的部分或并入载体的核酸序列的基质(例如，宿主细胞或蛋)。在某些实施方案中，本文提供了用含有FmoPV核酸序列的载体转化的细胞系。在某些实施方案中，本文提供了含有包含FmoPV核酸序列的载体的的转基因动物。
在某些实施方案中，FmoPV核酸用于针对FmoPV感染的诊断测定中。具体地，诊断测定是用于检测FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的定量测定。在某些实施方案中，定量测定是PCR或RT-PCR。在某些实施方案中，FmoPV核酸是在诊断试剂盒中分开的容器中。
5.2 蛋白
FmoPV基因区段的开放阅读框可以使用标准分子生物学和病毒学技术来确定。本文提供了由包含FmoPV核酸序列的FmoPV核酸分子表达的FmoPV多肽。在某些实施方案中，FmoPV蛋白是。在某些实施方案中，FmoPV抗原是片段或全长的N、P/V/C(P)、P/V/C/(V)、P/VC(C)、M、F、H和L蛋白。本文还描述了由衍生自FmoPV或其天然变体的基因组的病毒载体编码的重组或嵌合病毒。
在另一个具体实施方案中，本文描述了嵌合FmoPV病毒，其进一步包含异源核苷酸序列。在某些实施方案中，嵌合病毒可由核苷酸序列编码，其中已向基因组添加了异源核苷酸序列，或者其中内源或天然核苷酸序列已被异源核苷酸序列取代。
在某些实施方案中，嵌合病毒由进一步包含异源核苷酸序列的载体编码。根据本发明，嵌合病毒由可包含或不包含对病毒基因组非天然的核酸的病毒载体编码。根据本发明，嵌合病毒由病毒载体编码，其中已添加、插入异源核苷酸序列或已用天然或非天然序列取代。根据本发明，嵌合病毒可由来源于FmoPV的不同毒株或变体的核苷酸序列编码。具体地，嵌合病毒由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码来源于FmoPV的不同毒株或变体的抗原性多肽。
嵌合病毒对于生产针对两种或多种病毒保护的重组疫苗特别有用(Tao等人, J. Virol. 72:2955-2961; Durbin等人, 2000, J. Virol. 74:6821-6831; Skiadopoulos等人, 1998, J. Virol. 72:1762-1768; Teng等人, 2000, J. Virol. 74:9317-9321)。例如，可以设想，表达FmoPV和FmoPV变体的一种或多种蛋白的载体将保护接种了此类载体的对象免受FmoPV和FmoPV变体两者的感染。减毒和复制缺陷型病毒可以与活疫苗一样用于接种目的。
根据本发明，待引入编码本发明重组或嵌合病毒的病毒载体中的异源序列包括从FmoPV的不同毒株或变体获得或衍生的序列。
在某些实施方案中，本发明的嵌合或重组病毒由来源于病毒基因组(其中一个或多个序列、基因间区、末端序列或ORF的部分或整体已被异源或非天然序列取代)的病毒载体编码。在本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合病毒由来源于病毒基因组(其中一种或多种异源序列已被插入或添加到载体中)的病毒载体编码。
对于FmoPV异源的任何核苷酸序列可以包括在本文所述的修饰FmoPV基因区段中。在某些实施方案中，异源核苷酸序列是8至100个核苷酸长，15至100个核苷酸长，25至100个核苷酸长，50至200个核苷酸长，50至400个核苷酸长，200至500个核苷酸长，或400至600个核苷酸长，500至800个核苷酸长。在其它实施方案中，异源核苷酸序列是750至900个核苷酸长，800至100个核苷酸长，850至1000个核苷酸长，900至1200个核苷酸长，1000至1200个核苷酸的长度，1000至1500个核苷酸长或10至1500个核苷酸长。在一些实施方案中，异源核苷酸编码肽或多肽，所述肽或多肽是5至10个氨基酸长，10至25个氨基酸长，25至50个氨基酸长，50至100个氨基酸长，100至150氨基酸长，150至200个氨基酸长，200至250个氨基酸长，250至300个氨基酸长，300至400个氨基酸长，或500个或更多个氨基酸长。在一些实施方案中，异源核苷酸编码长度不超过500个氨基酸的多肽。在具体实施方案中，异源核苷酸序列不含终止密码子。在某些实施方案中，异源核苷酸序列是密码子优化的。用于密码子优化技术是本领域已知的，并且可以应用以便密码子优化异源核苷酸序列。
在一个实施方案中，异源核苷酸序列编码任何感染性病原体的抗原，或与能够引发免疫应答的任何疾病相关的抗原。在一个具体实施方案中，抗原是糖蛋白。在某些实施方案中，异源核苷酸序列编码病毒抗原。在其它实施方案中，病毒抗原是来自除了FmoPV以外的病毒的抗原。
在具体实施方案中，本文所述的FmoPV是减毒的。在一个具体实施方案中，FmoPV是减毒的，使得病毒至少部分保留感染性并可在体内复制，但是仅产生低滴度，其导致非致病性的感染的亚临床水平。此类减毒病毒尤其适合于本文所述实施方案，其中病毒或其免疫原组合物施用于对象以诱导免疫应答。
在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在修饰FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变。在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在互补FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变。在某些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在两个、三个或更多个互补FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变。在一些实施方案中，本文所述的FmoPV包含在修饰FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变和在互补FmoPV基因区段中的一个或多个减毒突变。
病毒载体的选择可取决于待治疗或保护免受病毒感染的对象的物种。如果对象是猫科动物，则减毒FmoPV可用来提供抗原序列。
根据本发明，可对病毒载体进行工程改造，以提供针对FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物的感染赋予保护作用的抗原序列。可对病毒载体进行工程改造，以提供一种、两种、三种或更多种抗原序列。根据本发明，抗原序列可来源于相同病毒、相同种类病毒的不同毒株或变体、或不同病毒。
根据本发明获得的表达产物和/或重组或嵌合病毒颗粒可有利地应用在疫苗制剂中。可对表达产物和嵌合病毒颗粒进行工程改造，以产生针对范围广泛的病原体的疫苗，所述病原体包括病毒和细菌抗原、肿瘤抗原、变应原抗原和参与自身免疫病的自身抗原。具体地，可对本发明的嵌合病毒颗粒进行工程改造，以产生用于保护对象免受FmoPV、其天然或人工变体、类似物或衍生物感染的疫苗。
在另一个方面，FmoPV的基因组序列的突变导致FmoPV蛋白的改变。在某些实施方案中，FmoPV的基因组序列的突变导致FmoPV蛋白中少于25、20、15、10、5、4、3、或2个氨基酸取代。
保守或非保守氨基酸取代可在一个或多个氨基酸残基进行。在优选实施方案中，变体具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即对于病毒生物活性例如感染性、复制性、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性效应的表达不是关键的氨基酸残基)上进行的保守氨基酸取代。在其它实施方案中，变体具有在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即对于病毒生物活性例如感染性、复制能力、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性效应的表达不是关键的氨基酸残基)上进行的非保守氨基酸取代。在其它实施方案中，在必需的氨基酸残基(即对于病毒生物活性例如感染性、复制能力、蛋白合成能力、装配能力和细胞毒性效应的表达关键的氨基酸残基)上进行氨基酸取代。
“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被侧链电荷相似的氨基酸残基替代的取代。“非保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被侧链电荷相反的氨基酸残基替代的取代。侧链电荷相似的氨基酸残基的家族在本领域是已定义的。遗传编码的氨基酸可被分为四个家族：(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。以相似的方式，全部氨基酸可被分类为(1)酸性= 天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3) 脂族=甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸，且丝氨酸和苏氨酸任选被单独分类为脂族-羟基；(4)芳族=苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；(5)酰胺=天冬酰胺、谷氨酰胺；(6)含硫=半胱氨酸和甲硫氨酸。(参见例如Biochemistry, 4th ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman andCo.：1995)。
本发明进一步涉及突变FmoPV肽。在一个实施方案中，突变可沿FmoPV或其变体的所有或部分编码序列随机引入，诸如通过饱和诱变，可筛选所得突变体的生物活性以鉴定保留活性的突变体。也可使用本领域已知的诱变技术，包括但不限于定点诱变、化学诱变、体外定点诱变，使用例如QuikChange定点诱变试剂盒(Stratagene)等。此类修饰的非限制性实例包括氨基酸取代为半胱氨酸而形成二硫键；氨基酸取代为酪氨酸并随后化学处理多肽以形成二酪氨酸键，如本文中详细公开的；一个或多个氨基酸取代和/或生物或化学修饰以产生小分子(底物或抑制剂)结合口袋；和/或引入侧链特异性标记(例如以表征分子相互作用或捕获蛋白-蛋白相互作用伴侣)。在一个具体实施方案中，生物修饰包括烷基化、磷酸化、硫酸化、氧化或还原、ADP-核糖基化、羟基化、糖基化、葡糖磷脂酰肌醇加成、泛素化。在另一个具体实施方案中，化学修饰包括改变重组病毒的电荷。在又一个实施方案中，正电荷或负电荷被化学加入到氨基酸残基中，其中带电荷的氨基酸残基被修饰成不带电荷的残基。
5.3 重组FMOPV的构建
本领域技术人员已知的技术可用于产生本文所述的含有修饰的FmoPV基因区段的重组FmoPV。例如，反向遗传学技术可以用于产生此类FmoPV。简而言之，反向遗传学技术通常涉及制备含有负链病毒RNA的非编码区域的合成重组病毒RNA，所述非编码区域对病毒聚合酶识别和产生成熟病毒体需要的包装信号是必要的。重组RNA从重组DNA模板合成并在体外用纯化的病毒聚合酶复合物重构以形成重组核糖核蛋白(RNP)，其可以用于转染细胞。如果在合成RNA在体外或体内转录过程中存在病毒聚合酶蛋白，则实现更有效的转染。合成重组RNP可以被拯救进入感染性病毒颗粒。
或者，无辅助质粒技术(helper-free plasmid technology)可用于产生含有修饰的FmoPV基因区段的重组FmoPV。简而言之，病毒区段的全长cDNA用PCR以包括独特限制性位点的引物来扩增，所述限制性位点允许PCR产物插入质粒载体中。质粒载体设计为使得精确的负链(vRNA方向)转录得到表达。例如，质粒载体可以设计为将PCR产物置于截短的人RNA聚合酶I启动子和丁型肝炎病毒核糖体序列之间，从而使得从聚合酶I启动子来产生精确的负链(vRNA方向)转录物。包含每个病毒区段的分离的质粒载体和包含必需病毒蛋白的表达载体可以转染进细胞从而导致产生重组病毒颗粒。在另一个实施方案中，可以使用表达病毒基因组RNA和编码必需病毒蛋白的mRNA两者的质粒载体。
5.4. FMOPV的增殖
本文所述的FmoPV可以在任何基质中增殖，其允许病毒生长至允许使用本文所述的病毒的滴度。在一个实施方案中，该基质允许本文所述的FmoPV生长至与对应的野生型病毒测定的滴度相当的滴度。
本文所述的FmoPV可以生长在易受病毒感染的宿主细胞(例如，猫、禽类细胞、鸡细胞等)、含胚蛋或动物(例如，鸟)中。宿主细胞的具体实例包括Vero细胞、MDCK细胞、MBCK细胞、COS细胞、293细胞、293T细胞、A549细胞、MDBK细胞等。此类方法是本领域技术人员众所周知的。在一个具体实施方案中，本文所述的FmoPV可以在细胞系中增殖。在另一个实施方案中，本文所述的FmoPV在鸡细胞或含胚蛋中增殖。代表性的鸡细胞包括，但不限于，鸡胚胎成纤维细胞和鸡胚肾细胞。
对于病毒分离，本文所述的FmoPV可以从细胞培养液中去除并从细胞组分中分离，典型地通过众所周知的净化过程，例如，梯度离心和柱色谱，并可以根据需要使用本领域技术人员众所周知的程序来进一步纯化，例如噬菌斑分析。
5.5 组合物和施用途径
可以将本文所述的FmoPV并入组合物中。在一个具体实施方案中，组合物是药物组合物，诸如免疫原性组合物(例如，疫苗制剂)。本文提供的药物组合物可以是允许将组合物施用至对象的任何形式。在一个具体实施方案中，药物组合物适合用于兽医和/或人施用。组合物可以用于预防和/或治疗FmoPV感染的方法中。组合物也可以用于预防和/或治疗FmoPV疾病的方法中。组合物也可以用于引发针对一种或多种特定抗原的免疫应答的方法中或将特定蛋白递送至对象的方法中。
在一个实施方案中，药物组合物包含FmoPV与药学可接受的载体的混合物。在一些实施方案中，除了FmoPV之外，药物组合物还可以包含一种或多种其它疗法。在具体实施方案中，掺入药物组合物(例如，免疫原性组合物，诸如疫苗)的本文所述的FmoPV是活病毒。用于施用于对象的包含活FmoPV的免疫原性组合物可以是优选的，因为病毒在对象中的增殖可以导致与自然感染发生的种类和量级相似的种类和量级的延长刺激，并且因此赋予显著持久的免疫力。
在一些实施方案中，掺入药物组合物(例如，免疫原性组合物，诸如疫苗)的本文所述的FmoPV是灭活的。本领域技术人员已知的技术可以用于灭活本文所述的FmoPV。
在具体实施方案中，本文所述的免疫原性组合物是单价制剂。在其它实施方案中，本文所述的免疫原性组合物是多价制剂。
如本文所用，术语“药学可接受的”是指得到联邦政府或州政府的管理机构批准，或被列入美国药典或其它通常公认的药典中，用于在动物中、更具体在人类中使用。术语“载体”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液和葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、石灰石、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例在E. W. Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述。
在某些实施方案中，可生物降解的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙二醇(PEG化)、聚甲基丙烯酸酯聚合物、聚交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸，可以用作载体。脂质体或胶束也可以用作药学可接受的载体。根据本领域技人员已知的方法，例如，如美国专利号4,522,811所述制备这些。
在一个具体实施方案中，将药物组合物配制成适于施用于对象的预期途径。例如，可以将药物组合物可以配制成适于胃肠外、口服、皮内、鼻内、经皮、肺、结肠直肠、腹膜内和直肠施用。在一个具体实施方案中，可以将药物组合物配制用于静脉内、口服、腹膜内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、经皮或经肺施用。
在某些实施方案中，本文所述的组合物包含佐剂，或与佐剂组合施用。可以在施用组合物之前、同时或、之后施用与本文所述的组合物组合施用的佐剂。在具体实施方案中，本文所述的灭活病毒免疫原性组合物包含一种或多种佐剂。在一些实施方案中，术语“佐剂”是指当与本文所述组合物结合或作为其部分施用时，增加、增强和/或加强针对FmoPV病毒的免疫应答，但当单独施用化合物时，不产生针对病毒的免疫应答的化合物。在一些实施方案中，佐剂生成针对FmoPV的免疫应答，且不会产生过敏或其它不良反应。佐剂可以通过几种机制，包括，例如，淋巴细胞募集，B和/或T细胞的刺激，和巨噬细胞的刺激来增强免疫应答。
佐剂的具体实例包括，但不限于，铝盐(alum)(诸如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3脱-O-酰化单磷酰脂质A(MPL)(参见GB 2220211)和QS21 (参见Kensil等人, in VaccineDesign:The Subunit and Adjuvant Approach (eds.Powell & Newman, Plenum Press,NY, 1995); 美国专利号5,057,540)。在一些实施方案中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。其它佐剂是水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油)，任选地与免疫刺激剂，诸如单磷酰脂质A组合(参见Stoute等人, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today, Nov. 15, 1998)。此类佐剂可与或不与其它特异性免疫刺激剂诸如MPL或3-DMP、QS21、聚合的或单体氨基酸诸如聚谷氨酸或聚赖氨酸一起使用。
本文所述的药物组合物可以连同施用说明书包括在容器、包装或分配器中。
在一个具体实施方案中，本发明的重组N蛋白具有抗原性，使它们适合于在免疫原性组合物中使用。实施例7中证明了这些重组N蛋白的抗原性。在来自FmoPV RT-PCR阳性的56只猫和FmoPV RT-PCR阴性的40只猫的测试血清中，通过Western印迹分析，分别49(76.7%)和78 (19.4%)对于针对FmoPV的N蛋白的IgG是阳性的（p<0.0001）。参见图9，并参见下表6。在来自FmoPV RT-PCR阳性的56只猫的测试血清中，只有5个 (8.9%)对于针对FmoPV的N蛋白的IgM是阳性的。
在图9(用针对纯化的(His)6-标签的重组FmoPV N蛋白抗原的流浪猫血清的Western印迹分析)中，在显示的六份猫血清样品中的三份中检测道约69 kDa的突出免疫反应蛋白条带，与重组蛋白的68.7 kDa的预期大小一致，表明重组FmoPV N蛋白和血清抗体之间的抗原-抗体相互作用。也显示了对应尿液样品针对FmoPV的RT-PCR结果。表6显示了本研究中的RT-PCR阳性流浪猫的FmoPV病毒载量和抗体水平。
表 6
使用来自用FmoPV的重组N蛋白免疫的豚鼠的血清或受感染猫的对应血清也观察到特异性苹果绿细颗粒状弥漫性胞浆荧光(图6)。
5.6 包含活病毒的免疫原性组合物
在一个实施方案中，本文提供了包含一种或多种本文所述的活FmoPV的免疫原性组合物(例如，疫苗)。在一些实施方案中，活病毒是减毒的。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含两种、三种、四种或更多种活病毒。
在某些实施方案中，本文提供了包含约105至约1010荧光病灶单位(FFU)的本文所述的减毒活FmoPV、约0.1至约0.5 mg谷氨酸单钠、约1.0至约5.0 mg水解猪明胶蛋白、约1.0至约5.0 mg精氨酸、约10至约15 mg蔗糖、约1.0至约5.0 mg磷酸氢二钾、约0.5至约2.0 mg磷酸二氢钾和约0.001至约0.05 µg/ml硫酸庆大霉素/剂量的免疫原性组合物(例如疫苗)。在一些实施方案中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为含有单一0.2 ml剂量的预充式喷雾器。
在一个具体实施方案中，本文提供了包含106.5至107.5 FFU的本文所述的减毒活FmoPV、0.188 mg谷氨酸单钠、2.0 mg水解猪明胶蛋白、2.42 mg精氨酸、13.68 mg蔗糖、2.26mg磷酸氢二钾、0.96 mg磷酸二氢钾和< 0.015 µg/ml硫酸庆大霉素/剂量的免疫原性组合物(例如疫苗)。在一些实施方案中，免疫原性组合物(例如，疫苗)被包装为含有单一0.2 ml剂量的预充式喷雾器。
在一个具体实施方案中，活病毒在其用于本文所述的免疫原性组合物之前在含胚鸡蛋中增殖。在另一个具体实施方案中，活病毒在其用于本文所述的免疫原性组合物之前不在含胚鸡蛋中增殖。在另一个具体实施方案中，活病毒在其用于本文所述的免疫原性组合物之前在哺乳动物细胞中增殖。
用于施用于对象的包含活病毒的免疫原性组合物可以是优选的，因为病毒在对象中的增殖可以导致与自然感染发生的种类和量级相似的种类和量级的延长刺激，并且因此赋予显著持久的免疫力。
5.7 抗体的生成
本文所述的FmoPV可用于引发针对FmoPV或异源核苷酸序列的抗体。在一个具体实施方案中，可以将本文所述的FmoPV或其组合物施用于非人对象(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猫等)来诱导免疫应答，其包括产生可以使用本领域技术人员已知的技术(例如，免疫亲和层析、离心、沉淀等)分离的抗体。
或者，本文所述的病毒可用于从抗体文库中筛选抗体。例如，可以将FmoPV固定至固体支持物(例如，硅胶、树脂、衍生化的塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、氧化铝凝胶、或多糖、磁珠)，并筛选结合至抗体。作为替代，可以将抗体固定至固体支持物，并筛选结合至本文所述的FmoPV。任何筛选测定法，诸如淘选测定法、ELISA、表面等离子体共振或本领域中已知的其它抗体筛选测定法可用于筛选结合至FmoPV的抗体。筛选的抗体文库可以是市售的抗体文库，体外生成的文库，或者通过从FmoPV感染的对象鉴定和克隆或分离抗体而获得的文库。在具体实施方案中，抗体文库是从FmoPV爆发的幸存者生成的。抗体文库可以根据本领域中已知的方法来生成。在一个具体实施方案中，抗体文库是通过克隆抗体并在噬菌体展示文库或噬菌粒展示文库中使用它们来生成。
可以使用本领域中已知或本文所述的生物测定法测试根据本文所述的方法引发或鉴定的抗体对FmoPV抗原的特异性和中和FmoPV的能力。在一个实施方案中，从非人动物抗体鉴定或分离的抗体特异性结合FmoPV抗原。
可以使用本领域中已知或本文所述的生物测定法测试根据本文所述的方法引发或鉴定的抗体对本文所述的异源核苷酸序列编码的肽或多肽抗原的特异性和中和本文所述的异源核苷酸序列编码的肽或多肽抗原的能力。在一个实施方案中，从非人动物抗体鉴定或分离的抗体特异性结合本文所述的异源核苷酸序列编码的肽或多肽抗原。在一个实施方案中，中和抗体中和病毒、细菌、真菌或其它病原体、或表达本文所述的异源核苷酸序列编码的肽或多肽抗原的肿瘤。
使用本文所述的FmoPV引发或鉴定的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合血细胞凝集素多肽的抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA 和IgY)、类(例如、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和IgA2)或亚类。抗体包括但不限于，单克隆抗体，多特异性抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，单链Fv(scFv)，单链抗体，Fab片段，F(ab')片段，二硫键连接的Fvs (sdFv)和抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对使用本文所述的方法引发或鉴定的抗体的抗-Id抗体)，和任何上述的表位结合片段。
使用本文所述的FmoPV引发或鉴定的抗体可以用于诊断免疫测定法、被动免疫治疗和抗独特型抗体的生成中。在被动免疫治疗中使用前，抗体可以进行修饰，例如，该抗体可以进行嵌合或人源化。生成对于嵌合和人源化抗体的综述，参见，例如，美国专利号4,444,887和4,716,111；和国际公开号WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741，其各自完整地通过引用并入本文。此外，抗体中和FmoPV的能力和抗体对于FmoPV抗原的特异性可以在被动免疫治疗中使用该抗体之前进行测试。使用针对FmoPV抗原的抗体来检测对象中FmoPV的存在。在具体实施方案中，FmoPV抗体用于诊断猫科动物中的FmoPV感染。在具体实施方案中，FmoPV抗体用于诊断猫科动物中的TIN。
可以将使用本文所述的FmoPV引发或鉴定的抗体并入组合物中。在一个具体实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物可以包含除了抗体的一种或多种其它疗法。本文提供的药物组合物可以是允许将组合物施用至对象的任何形式。在一个具体实施方案中，药物组合物适合用于兽医和/或人施用。在另一个具体实施方案中，将抗体组合物配制用于预期使用途径(例如，肠胃外，鼻内或经肺施用)。抗体组合物可以用于预防和/或治疗FmoPV感染的方法中。抗体组合物也可以用于预防和/或治疗FmoPV疾病的方法中。
使用本文所述的FmoPV引发或鉴定的抗体可以用于监测治疗和/或疾病进展的疗效。本领域中已知的任何免疫测定系统可以用于该目的，包括但不限于，使用竞争性和非竞争性测定系统的技术诸如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体固定测定法、免疫放射测定法、荧光免疫测定法、蛋白A免疫测定法和免疫电泳测定法，仅举几例。
5.8 预防和治疗用途
在一个方面，本文提供了利用本文所述的FmoPV或其免疫原性组合物诱导对象中的免疫应答的方法。在一个具体实施方案中，诱导对象中针对FmoPV的免疫应答的方法包括向有需要的对象施用有效量的FmoPV或其免疫原性组合物。在某些实施方案中，FmoPV或其免疫原性组合物表达来自FmoPV的两种或更多种类型、亚型或毒株的FmoPV蛋白，并且因此，可以用来诱导针对FmoPV的两种或更多种类型、亚型或毒株的免疫应答。在一个具体实施方案中，诱导对象中针对FmoPV的免疫应答的方法包括向有需要的对象施用作为活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。在具体实施方案中，活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方案中，诱导对象中针对FmoPV的免疫应答的方法包括向有需要的对象施用作为灭活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。
在另一个方面，本文提供了利用本文所述的FmoPV或其药物组合物预防和/或治疗对象中的FmoPV感染的方法。在一个实施方案中，预防和/或治疗对象中的FmoPV感染的方法包括向有需要的对象施用有效量的FmoPV或其组合物。在另一个实施方案中，预防和/或治疗对象中的FmoPV感染的方法包括向有需要的对象施用有效量的FmoPV或其药物组合物和一种或多种其它疗法。在另一个实施方案中，预防或治疗对象中FmoPV感染的方法包括向有需要的对象施用作为活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。在具体实施方案中，活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方案中，预防或治疗对象中FmoPV感染的方法包括向有需要的对象施用作为灭活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。
在另一个方面，本文提供了利用本文所述的FmoPV或其药物组合物预防和/或治疗对象中的FmoPV的方法。在一个具体实施方案中，预防或治疗对象中的FmoPV疾病的方法包括向有需要的对象施用有效量的FmoPV或其药物组合物。在另一个实施方案中，预防或治疗对象中的FmoPV的方法包括向有需要的对象施用有效量的FmoPV或其药物组合物和一种或多种其它疗法。在另一个实施方案中，预防或治疗对象中FmoPV疾病的方法包括向有需要的对象施用作为活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。在具体实施方案中，活病毒疫苗包含减毒病毒。在另一个实施方案中，预防或治疗对象中FmoPV疾病的方法包括向有需要的对象施用作为灭活病毒疫苗的本文所述的FmoPV。
5.9 施用的剂量和频率
可以通过各种途径将本文所述的FmoPV、抗体或组合物递送给对象。这些包括，但不限于，鼻内，气管内，口服，皮内，肌内，局部腹膜内，经皮，静脉内，经肺，结膜和皮下途径。在一些实施方案中，将组合物配制用于局部施用，例如，用于施用至皮肤。在具体实施方案中，将组合物配制用于经鼻施用，例如作为鼻喷雾的部分。在某些实施方案中，将组合物配制用于肌内施用。在一些实施方案中，将组合物配制用于皮下施用。在用于活病毒疫苗的具体实施方案中，将疫苗配制用于通过除了注射之外的途径施用。在一些实施方案中，可以期望通过任何合适的途径来将药物组合物引入肺。也可例如通过使用吸入器或喷雾器，与气雾化剂一起配制用作喷雾剂来实施肺部施用。
在一些实施方案中，当将FmoPV或其组合物施用于非人对象(例如，猫)时，可以将病毒或组合物在对象的食物中口服施用于对象。在其它实施方案中，当将FmoPV或其组合物施用于对象(例如，猫)时，可以将病毒或组合物在对象的水中口服施用于对象。在其它实施方案中，当将FmoPV或其组合物施用于非人对象时，通过用病毒或组合物喷雾对象而施用病毒或组合物。
本文所述的FmoPV、抗体或组合物将有效治疗和/或预防FmoPV感染或FmoPV疾病的量将取决于疾病的性质，可通过标准技术来确定。在制剂中待采用的精确剂量也将取决于施用途径和感染或由其引起的疾病的严重度，且应根据执业医生的判断和各个对象的情况来决定。例如，有效剂量也可以根据施用方式、目标部位、对象的生理状态(包括年龄、体重、健康)而变化，无论对象是人或动物，无论是否施用其它药物，且无论治疗是预防或治疗性。类似地，将有效作为递送载体的FmoPV或其组合物的量将变化，并且可以通过标准技术来确定。将治疗剂量最佳滴定，以优化安全性和有效性。
在某些实施方案中，采用体外测定法来帮助鉴定最佳剂量范围。有效剂量可从衍生自体外或动物模型测试系统的剂量应答曲线推知。
对于活FmoPV的示例性剂量可以从10至100或更多病毒颗粒/剂量变化。在一些实施方案中，活FmoPV病毒的合适剂量为102、5 x 102、103、5 x 103、104、5 x 104、105、5 x 105、106、5 x 106、107、5 x 107、108、5 x 108、1 x 109、5 x 109、1 x 1010、5 x 1010、1 x 1011、5 x1011或1012 pfu，并且可以如需要经常地间隔一次、两次、三次或更多次施用于对象。在另一个实施方案中，配制活FmoPV，从而使得0.2-mL剂量含有106.5–107.5荧光焦点单元的活FmoPV。在另一个实施方案中，配制灭活疫苗，从而使得其含有约15 μg至约100 μg、约15 μg至约75 μg、约15 μg至约50 μg或约15 μg至约30 μg的FmoPV蛋白。
在某些实施方案中，将本文所述的FmoPV或其组合物作为单一剂量和随后3至6周后的第二剂量施用至对象。根据这些实施方案，可以在第二次接种后以6至12个月的间隔将加强接种施用于对象。在某些实施方案中，加强接种可以利用不同的FmoPV毒株或其组合物。在一些实施方案中，可以重复施用相同FmoPV毒株或其组合物，并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
对于用抗体被动免疫，剂量范围为约0.0001至100 mg/kg，更通常0.01至50 mg/kg或0.1至15 mg/kg对象体重。例如，对于70 kg患者，剂量可以分别为1 mg/kg体重或10 mg/kg体重或在1-10 mg/kg范围内，或者换言之，70 mg或700 mg或在70-700 mg的范围内。示例性治疗方案需要持续一年或几年期间或者几年间隔以每两周一次或每个月一次或每3至6个月一次施用。在一些方法中，将两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体同时施用，在这种情况下，每种施用抗体的剂量落入所示范围内。抗体通常在多个场合施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者中针对FmoPV的抗体的血液水平所指示。
5.10 筛选测定
在一个方面，本文所述的FmoPV可用于研究FmoPV的生命周期。例如，将表达可检测的异源序列(例如，可检测的物质，诸如上面所述的)的本文所述的FmoPV引入宿主细胞，并且通过评估可检测的异源序列的表达监测病毒的生命周期。也可以将本文所述的表达可检测的异源序列的FmoPV施用于非人动物，并且通过评估可检测的异源序列的表达监测感染。
在另一个方面，本文中提供了用于鉴定或验证调节反义单链RNA病毒、特别是FmoPV的复制的化合物的高通量筛选测定法。在一个具体实施方案中，用于鉴定调节反义单链RNA病毒(特别是FmoPV)的复制的化合物的高通量筛选测定法包括：(a) 将化合物或化合物文库的成员与用本文所述的表达可检测的异源核苷酸序列的FmoPV感染的宿主细胞接触；和(b) 测量由可检测的异源核苷酸序列编码的产物的表达或活性。在另一个具体实施方案中，用于鉴定调节反义单链RNA病毒(特别是FmoPV)的复制的化合物的高通量筛选测定法包括：(a) 在化合物或化合物文库的成员存在的情况下用本文所述的表达可检测的异源核苷酸序列的FmoPV感染宿主细胞；和(b) 测量由可检测的异源核苷酸序列编码的产物的表达或活性。在另一个具体实施方案中，用于鉴定调节反义单链RNA病毒(特别是FmoPV)的复制的化合物的高通量筛选测定法包括：(a) 将宿主细胞与化合物或化合物文库的成员接触；(b) 用本文所述的表达可检测的异源核苷酸序列的FmoPV感染宿主细胞；和(c) 测量由可检测的异源核苷酸序列编码的产物的表达或活性。
本领域技术人员已知的任何方法可用于测量由可检测的异源核苷酸序列编码的产物的表达或活性。在一个实施方案中，由可检测的异源核苷酸序列编码的产物是RNA，并且本领域技术人员已知的技术，诸如RT-PCR或Northern印迹分析用于测量RNA产物的表达。在另一个实施方案中，由可检测的异源核苷酸序列编码的产物是蛋白，并且本领域技术人员已知的技术，诸如western印迹分析或ELISA用于测量蛋白产物的表达。在另一个实施方案中，由可检测的异源核苷酸序列编码的产物是蛋白，并且蛋白活性使用本领域技术人员已知的技术测量。
本文所述的任何筛选测定法可以单独进行，例如，只是用测试化合物或用适当对照进行。例如，可以进行没有测试化合物的平行测定，或没有其它反应组分(例如，病毒)的其它平行测定。在一个实施方案中，进行如上面所述的平行筛选测定，除了使用阴性对照和/或阳性对照以代替测试化合物。在另一个实施方案中，为了消除作为假阳性出现的细胞毒性化合物，进行反向筛选，其中用包含可检测的异源核苷酸序列的核酸构建体(例如，质粒)转染未感染的细胞，并且测量由可检测的异源核苷酸序列编码的产物的表达或活性。或者，也可以将测定结果与参考，例如，参考值，例如，从文献、事先测定等等获得的参考值进行比较。适当的关联和本领域已知的统计方法可用于评价测定结果。
在另一个方面，可以使用本文所述的FmoPV在非人动物中评估化合物对FmoPV的抗病毒效果。在一个实施方案中，可以使用包括以下的方法评估化合物对FmoPV的抗病毒效果：(a) 在施用化合物同时、随后或之前将有效量的本文所述的FmoPV施用(例如，肠胃外，皮下，鼻内，或腹膜内)于非人对象；b) 在施用FmoPV之后等待时间间隔；和d)检测对象或来自对象的生物样本中的FmoPV。
5.11 试剂盒
在一个方面，本文提供了试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中包含一种或多种本文所述的核酸序列。在一个具体实施方案中，试剂盒在一个容器中包含FmoPV基因区段或其互补序列。在另一个实施方案中，试剂盒在一个、两个或更多个容器中包含编码FmoPV基因区段或其互补序列的核酸序列。试剂盒可以进一步包含以下中的一种或多种：适于拯救病毒的宿主细胞，适于将质粒DNA转染进宿主细胞中的试剂，辅助病毒，编码一种或多种类型的FmoPV基因区段的质粒，一种或多种编码病毒蛋白的表达质粒，和/或一种或多种对于FmoPV基因区段或其互补序列或编码其的核酸序列特异性的引物。
在另一个方面，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个填充一种或多种本文所述的FmoPV基因区段或其互补序列中的一种或多种的容器。在一个具体实施方案中，本文提供了药物包装或试剂盒，所述药物包装或试剂盒在一个或多个容器中包含含有一种或多种本文所述的FmoPV的组合物。在另一个方面，本文提供了试剂盒，所述试剂盒在一个或多个容器中包含对于FmoPV基因区段特异性的引物。
在另一个方面，本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个填充一种或多种使用本文所述的FmoPV生成或鉴定的抗体的容器。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的抗体，优选分离的抗体。在一个具体实施方案中，本文中涵盖的试剂盒含有作为对照的本文涵盖的抗体与之反应的分离的FmoPV抗原。在一个具体实施方案中，本文提供的试剂盒进一步包含本文涵盖的抗体与之反应的FmoPV抗原不与之反应的对照抗体。在另一个具体实施方案中，本文提供的试剂盒含有用于检测抗体与本文涵盖的抗体与之反应的FmoPV抗原的结合的装置(例如，抗体可以缀合至可检测的底物，诸如荧光化合物，酶促底物，放射性化合物或发光化合物，或者识别第一抗体的第二抗体可以缀合至可检测的底物)。在具体实施方案中，试剂盒可以包括重组产生或化学合成的FmoPV抗原。试剂盒中提供的FmoPV抗原也可以结合至固体支持物。在一个更具体的实施方案中，上述试剂盒的检测装置包括连接FmoPV抗原的固体支持物。此类试剂盒还可以包括未连接的报道分子标记的抗人抗体。在该实施方案中，抗体与FmoPV抗原的结合可以通过所述报道分子标记的抗体的结合来检测。
任选伴随此类试剂盒的是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构的规定形式通知书，该通知书反映了政府机构对生产、使用或销售用于人施用的批准。
实施例2表明通过RT-PCR进行的诊断测试。实施例3中所示的另一种诊断测试是使用从测序获得的上述基因组信息使用实时定量RT-PCR的病毒载量测试。
5.12 全基因组测序和分析
使用我们以前的出版物(13,14)中描述的策略使用直接从样本提取的RNA作为模板扩增并测序来自从两份尿(761U，776U)和一份直肠拭子(M252A)样品的FmoPV的三种全基因组。如我们以前的出版物(13,14,23,24,25)中所述进行基因组分析。使用PhyML 3.0(26)通过最大似然法构建系统发生树。
测定命名为761U、776U和M252A的三株FmoPV的全基因组序列。FmoPV毒株761U的基因组序列保藏在GenBank并给予登录号JQ411014。FmoPV 761U核苷酸序列显示于图2。FmoPV毒株776U的基因组序列保藏在GenBank并给予登录号JQ411015。FmoPV 776U核苷酸序列显示于图3。FmoPV毒株M252A的基因组序列保藏在GenBank并给予登录号JQ411016。FmoPVM252A核苷酸序列显示于图4。
这些FmoPV核苷酸序列的基因组大小为16050个碱基且G+C含量为35.1%至35.3%，其中FmoPV在基因组序列可得的所有麻疹病毒中具有最大的基因组(参见图1)。FmoPV的基因组符合如其它副粘病毒基因组中的六个规则。它含有12-nt的互补的3’前导序列和5’尾随序列。3’'前导序列为55 nt。与仅具有40或41 nt的5’尾随序列的其它麻疹病毒相反，FmoPV的基因组具有400 nt的尾随序列，负责其更大的基因组大小。此类>400 nt的长尾随序列只在禽类副粘病毒3 (681-707 nt)和5 (552 nt)以及树鼩副粘病毒(590 nt)中被观察到。
类似于其它麻疹病毒，FmoPV的基因组含有6个基因(3’-N-P/V/C-M-F-H-L-5’)(参见图1)。FmoPV和其它副粘病毒间预测的基因产物的成对比对显示与麻疹病毒属的成员的最高的氨基酸同一性，其中FmoPV的N、P/V/C(P)、P/V/C(V)、P/V/C(C)、M、F、H和L与其它麻疹病毒的那些具有54.3-56.8%、25.6-31.7%、20.7-25.7%、18.3-25.4%、57.6-60.0%、35.8-45.1%、20.4-24.1%和55.2-57.3%氨基酸同一性(参见表1)。主要结构基因和基因间区域(IGRs)的长度和特征总结在表2中。
表 2
FmoPV和其它麻疹病毒的分子特征和预测基因产物
麻疹病毒中的保守N末端基序MA(T/S)L在FmoPV 的N蛋白中是不存在的，所述FmoPV 的N蛋白由于在第二个氨基酸的A→S (在第一个密码子位置的G→U)取代而含有序列MSSL(图5)。类似于CdiPV、MeaPV和RinPV中N蛋白的核定位信号(NLS)但不同于经典NLS序列(PMID:16716375)，在FmoPV 的N蛋白中鉴定了在氨基酸位置70-77的富含亮氨酸/异亮氨酸的基序(参见SI图7)。类似于CdiPV和RinPV中N蛋白的核输出信号(NES)，在FmoPV 的N蛋白中也鉴定了在氨基酸位置4-11的富含亮氨酸的基序(参见图5)。
如在其它麻疹病毒中，FmoPV的P/V/C基因含有两个起始密码子，第一个用于P和V的翻译，第二个用于C的翻译。类似于副粘病毒亚科的大多数成员，FmoPV的P/V/C基因含有富含UC的编辑位点，其允许在P/V/C基因转录过程中将非模板G残基添加至mRNA产物中，导致产生具有共同N-末端区域的不同蛋白。在所有三株FmoPV中，这种共同N-末端区域由226个氨基酸组成。
为了确定P基因编辑位点的确切位置和G残基插入的数目和频率，使用从FmoPV感染的CRFK细胞提取的mRNA扩增、克隆和测序包括富含UC区的小cDNA片段。在测序的23个独立克隆中，13个含有序列TTAAAAGGGG(无G插入，编码P蛋白)，且10个含有序列TTAAAAGGGGG(插入一个G，编码V蛋白)。序列TTAnGn如在其它副粘病毒编辑位点中一样是保守的，除了风疹病毒的那些。与其中该序列是TTA5G3 (33)的其它麻疹病毒相比，FmoPV中的TTAnGn序列是TTA4G4。
不同于所有其它已知麻疹病毒，FmoPV的F蛋白具有单一碱性蛋白裂解位点，而其它麻疹病毒中的裂解位点是多碱性的(34)。在细胞融合发生之前，细胞胰蛋白酶样蛋白酶将F蛋白裂解为F1和F2，这有利于在细胞系中分离这些病毒。在FmoPV的F1中还鉴定了类似于其它副粘病毒的蛋白F中的序列的两个七肽重复序列。FmoPV的F蛋白还含有在其它麻疹病毒中高度保守的10个Cys残基是和5个潜在的N-糖基化位点，其大部分位于F2肽中。
使用FmoPV和副粘病毒科的其它成员的N、P、M、F、H和L基因的预测氨基酸序列构建的系统发生树显示在图7中。在所有六个树中，三种病毒与麻疹病毒成簇，具有高引导程序支持(bootstrap support)，形成了独特的亚组(参见图7)。用从1000个树计算并在中点生根的引导程序值通过最大似然法构建树。图2中的刻度条表明对应于0.5个取代/位点的枝长。来自FmoPV的三株分别命名为761U、776U、M252A。图2中其它病毒的名称和登录号列于下表3中。
表 3
病毒和GenBank登录号
5.13 猫科动物中FMOPV感染的检测
FmoPV对猫科动物的感染可以通过如实施例9中展示的使用免疫荧光抗体或通过如实施例10中展示的检测中和抗体在血清中检测。在实施例9中测试的27份猫血清样品中，从7只猫检测到免疫荧光抗体，滴度为1:40至1:640。下表4显示了TIN和FmoPV感染证据之间的关联。
表 4
TIN和FmoPV感染证据之间的关联
在实施例10中测试实施例9中使用的相同27份猫血清样品中中和抗体的存在。
从6只猫检测到中和抗体，滴度为1:20至1:40，显示在下表5中，其中全部都对于免疫荧光抗体呈阳性(表4)。
表 5
从猫血清检测到的中和抗体
6. 实施例
本文描述了来自香港流浪猫的新型猫科动物副粘病毒FmoPV，这代表家猫(Felis catus)中发现的副粘病毒的首次记录。Woo等人 (2012) “Feline morbillivirus, anovel paramyxovirus associated with tubulointerstitial nephritis in domesticcats.” PNAS (排版中)，其完整地通过引用并入本文。
分子流行病学研究在香港流浪猫中和来自中国大陆的患病猫(如以下实施例中显示，由其分离并表征新型猫副粘病毒FmoPV)上进行。
总之，在457只流浪猫中的53只的尿样品中和这些猫中的四只和一只的直肠拭子和血液样品中分别检测到FmoPV。Western印迹分析揭示在测试的猫中对于针对重组N蛋白的IgG中27.8%的血清阳性率，且抗体的存在与病毒的存在高度相关。先前在第5.12节中描述的三株FmoPV的完整基因组的分析显示，它们在使用N、P、M、F、H和L基因构建的所有六个系统发生树中在麻疹病毒间形成独特簇(图7)。免疫组织化学分析还显示，与其它麻疹病毒类诸如麻疹病毒类似，FmoPV感染单核细胞和薄壁细胞两者(图10)。三株FmoPV表现出高序列相似性和相同的基因组组织，表明FmoPV的单一种和FmoPV中的高物种特异性程度。虽然在本FmoPV株中没有鉴定到重组(数据未显示)，但是其它来自猫的病毒，诸如猫冠状病毒和猫乳头瘤病毒，已被显示与它们在狗中的犬对应病毒密切相关或与之重组，表明猫病毒可以具有在类似生活栖息地的动物中跨越物种屏障的潜力(17,35)。
一些新近的研究表明，猫TIN由自身免疫机制介导，因为用CRFK细胞裂解物接种的猫产生针对CRFK和肾细胞裂解物两者的抗体(36-38)。对CRFK裂解物敏化的这些猫中的一半在多种情况下在敏化后2周发生小管间质性肾炎。通过Western印迹证实来自CRFK接种猫的血清识别膜联蛋白A2和α-烯醇化酶。在人中，α-烯醇化酶抗体是致肾炎的，且α-烯醇化酶和膜联蛋白A2抗体已经与自身免疫性疾病相关。因此，猫嗜神经病毒诸如FmoPV可能在此急性损伤后触发自我维持的免疫病理过程。值得注意的是，一些麻疹病毒，诸如小反刍兽疫病毒、牛瘟病毒和犬瘟热病毒，也已经在肾脏和/或尿中发现(39-41)。进一步的研究将描绘这些病毒是否也与这些动物中的肾脏病理相关。
尽管家猫已经与人类相关几乎10,000年，但它们通常对人类造成很小的身体危害。然而，由于猫咬伤或经由其它途径，猫可以传播在人中引起疾病的多种细菌(例如汉氏巴尔通体(Bartonella henselae))、原虫(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))和罕见病毒(例如狂犬病毒)。除了本新型副粘病毒，至少15个科的病毒也已经在猫中被发现，包括在猫中新近发现第一种小核糖核酸病毒(23)。此外，也已经显示家猫容易受到高致病性禽流感病毒H5N1和H7N7和SARS冠状病毒感染，表明它们可能容易受到严重感染相关病毒感染(42-44)。在香港的先前调查(http://www.aud.gov.hk/pdf_e/e54ch04.pdf)显示，在每8个家庭中就有一个家庭饲养宠物，其中22.3％养猫。香港出售猫和狗的本地批准的宠物店的数量已经从2000年的77增加到2009年的155。在许多家庭，宠物主人与他们的宠物共享他们的床，并且宠物主人经常亲吻他们的宠物或正在被他们的宠物舔。这种行为可能使得显著暴露于宠物携带的动物传染病原体或寄生节肢动物(45)。这些动物中病毒的持续监控对于理解它们在其它哺乳动物(包括人)中引起新发传染病的的潜力是重要的。
6.1 实施例1
样品收集
香港渔农自然护理署(Agriculture Fisheries and Conservation Department)提供了作为监控计划的一部分在2年时间(2009年3月至2011年2月)从香港各地捕获的457只流浪猫收集的样品。使用先前描述的程序收集气管和直肠拭子、尿液和血液(23)。此外，还收集了来自中国大陆的16只患病猫的口腔和直肠拭子。研究由香港大学活动物在教学和研究中的用途的委员会(the Committee on the Use of Live Animals in Teaching andResearch, The University of Hong Kong)批准。作为用于处置本地捕获的流浪猫的常规政策，在安乐死之后立即收集样品。
FmoPV感染的流浪猫的尸体剖检
为了鉴定与FmoPV相关的可能疾病，在RT-PCR检测FmoPV阳性的两只安乐死的流浪猫上进行尸体剖检。从肺；脑；心脏；前肩胛(prescaspular)，咽后，颌下和胸淋巴结；脾；肝；肾；膀胱；胆囊；胸腺；唾液腺；眼球；鼻甲；肠；胰腺；脚垫；睾丸或卵巢；扁桃体和肾上腺收集组织样品。将每个组织样品的一半固定在10％中性缓冲福尔马林中用于组织学处理，而将另一半浸没在病毒运输介质中用于RNA提取和病毒分离。
由于这两只流浪猫的肾脏显示与TIN相容的组织病理学特征，从总共27只流浪猫(包括进行尸体剖检的两只猫)获得肾脏、尿液和血浆，并进行RT-PCR，病理组织学和通过western印迹的抗体检测和免疫荧光以检查FmoPV感染(RT-PCR和/或抗体阳性)和TIN之间的可能关联。
6.2 实施例2
麻疹病毒的L基因的RT-PCR检测和DNA测序。
使用EZ1 Virus Mini试剂盒(QIAgen)从气管和直肠拭子、尿和血液中和使用QIAamp Viral RNA Mini 试剂盒(QIAgen)从组织样品中提取病毒RNA。使用通过麻疹病毒的可获得的L基因序列的多重比对设计的保守引物(LPW12490 5’-CAGAGACTTAATGAAATTTATGG -3’和LPW12491 5’- CCACCCATCGGGTACTT -3’)通过扩增麻疹病毒的L基因的155-bp片段进行麻疹病毒检测。根据我们以前的出版物(13,14)进行反转录、PCR和测序。
6.3 实施例3
实时定量RT-PCR
使用LightCyler FastStart DNA Master SYBR Green I Mix试剂盒(Roche)用引物LPW12490和LPW12491在56份阳性样品上进行实时定量RT-PCR以检测FmoPV的L基因。通过LightCycler 2.0 (Roche)用20-µl反应混合物在95℃持续10 min、随后95℃持续10 s、60℃持续5 s和72℃持续8 s的50个循环扩增互补DNA(cDNA)，所述反应混合物含有FastStartDNA Master SYBR Green I Mix试剂盒(Roche)，2 µl cDNA，4 mmol/L MgCl2和0.5 mmol/l引物。含有目标序列的质粒用于生成标准曲线。
麻疹病毒的L基因中的155-bp 片段的RT-PCR在56只(12.3%)来自香港的猫的样品中是阳性，包括53份尿液，4份直肠拭子和1份血液样本。对于16只来自中国大陆的患病猫，一只(6.25％)猫在其口腔和直肠拭子中都是RT-PCR阳性。实时定量RT-PCR结果显示，中位病毒载量为3.9×103 (范围0.037至1.4×106) 拷贝/ml。测序结果表明了麻疹病毒属的新型副粘病毒的存在，与已知副粘病毒具有<80% nt同一性(图8)。这种新型副粘病毒被命名为FmoPV。
6.4 实施例4
P mRNA编辑的分析
为了检查在P mRNA编辑位点的G插入的数目，使用Oligotex mRNA Mini试剂盒(QIAgen)提取来自原始样本的mRNA。使用Superscript III试剂盒(Invitrogen)用随机六聚体引物进行第一链cDNA合成。使用引物(5’-TTCATCTCTTAGTTCCCAGGAA-3’和5’-TTTCAGACTCACCCTCGATATCT -3’)来扩增覆盖假定的编辑位点的FmoPV的442-bp产物。如我们以前的出版物(13)中所述进行PCR、克隆和测序。
6.5 实施例5
从大肠杆菌克隆(His)6-标签的重组核蛋白(N)并纯化
通过RT-PCR使用引物(5’- ACGCGGATCCGATGTCTAGTCTA-3’和5’-CGGAATTCGGTTTTAGAAGGTCAGTA-3’)来扩增FmoPV毒株761U的N基因(519个氨基酸)。如(1)Lau SK,等人 (2010) Virology 404:106-116; (2) Woo PC,等人 (2005) J Virol 79:884-895; and (3) Woo PC,等人 (2004) Lancet 363:841-845中所述进行(His)6-标签的重组N蛋白的克隆、表达和纯化。
6.6 实施例6
豚鼠血清
通过将100 μg纯化的FmoPV的N蛋白与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)皮下注射至三只豚鼠而产生针对FmoPV的N蛋白的豚鼠抗血清。不完全弗氏佐剂(Sigma)用于随后免疫中。每豚鼠以每两周一次施用三次接种。最后免疫后两周，经由豚鼠的侧向隐静脉获取1 ml血液以获得血清。
这种超免疫豚鼠抗体可以以下方式用于诊断目的或用作疫苗：
1. 重组核蛋白，N蛋白，可用作目标抗原用于检测来自猫血清的针对该病毒的特异性抗体。
2. 超免疫抗体可用于组织或感染细胞培养物中病毒蛋白的免疫组织化学检测，以证实该病毒的特异性存在。
3. 重组核蛋白可用作疫苗以诱导抗体产生。
6.7 实施例7
Western印迹分析
通过Western印迹在FmoPV RT-PCR 阳性的56只猫和FmoPV RT-PCR阴性的401只猫的血浆样品中检测针对FmoPV的N蛋白的抗体。如我们以前的出版物(24,25,27)中所述，使用1000 ng纯化的(His)6-标签的的重组N蛋白、猫血浆样品的1:1000稀释物、辣根过氧化物酶缀合的山羊抗猫IgG 抗体的1:400稀释物和山羊抗猫IgM抗体(Bethyl laboratories)的1:10000稀释物进行Western印迹分析。
在来自FmoPV RT-PCR阳性的56只猫和FmoPV RT-PCR阴性的401只猫的测试血清中，通过western印迹分析，分别49 (76.7%)和78 (19.4%)对于针对FmoPV的N蛋白的IgG是阳性的(P <0.0001)(图9，表6)。在来自FmoPV RT-PCR阳性的56只猫的测试血清中，只有5份(8.9％)对于针对FmoPV的N蛋白的IgM是阳性的。
在图9中显示的6只猫血清样品中的3只中检测到约69 kDa的突出免疫反应蛋白条带，与重组蛋白的68.7 kDa的预计大小一致，表明该重组FmoPV N蛋白和血清抗体之间的抗原-抗体相互作用。也显示了FmoPV的对应尿液样品的RT-PCR结果。
6.8 实施例8
病毒培养
根据我们以前的出版物(28, 29)进行病毒培养和电子显微镜。将两百微升用于全基因组测序的三份样品进行病毒培养。离心后，用病毒运输介质将它们稀释5倍并过滤。将200 μl过滤液接种至200 μl含有聚凝胺的MEM中。通过吸附接种将400 μl混合物添加至具有CRFK(猫肾)、B95(狨猴B-细胞)、CEF(鸡胚成纤维细胞)、NIH/3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)或Vero E6(非洲绿猴肾)细胞的24孔组织培养板中。吸附1小时后，弃去过量接种物，将孔用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并替代为1 ml补充0.1 μg/ml L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶(Sigma)的无血清MEM。将培养物在37℃ 5% CO2下孵育并通过倒置显微镜每天检查细胞病变效应(CPE)。两至三周孵育后，进行亚培养至新鲜细胞系，即使没有CPE，并收集培养裂解物用于针对FmoPV的RT-PCR。在FmoPV RT-PCR阳性的样品上进行免疫组织化学和电子显微镜分析。
FmoPV RT-PCR阳性的CRFK和Vero E6细胞在-20℃在冷丙酮中冷却10分钟。将固定的细胞与针对FmoPV的N蛋白的豚鼠抗血清的1:200稀释物孵育，随后与1:50稀释的FITC-兔抗豚鼠IgG (Invitrogen)孵育。然后通过荧光显微镜检查细胞。未接种的细胞用作阴性对照。
在第八代，用FmoPV阳性的尿样品(761U)接种的CRFK细胞在第14天显示CPE，呈细胞变圆、随后从单层细胞脱离和细胞裂解的形式。在第16代，CPE在第10天很明显，具有合胞体形成(图6)。使用培养物上清液和细胞裂解物针对FmoPV的RT-PCR显示在尿样品761U接种的CRFK细胞中和FmoPV 阳性的CRFK细胞的上清液接种的VeroE6细胞中的阳性结果。使用来自FmoPV的重组N蛋白免疫的豚鼠的血清或受感染猫的对应血清也观察到特异性苹果绿细颗粒状弥漫性胞浆荧光(图6)。电子显微镜显示具有副粘病毒中螺旋形N的典型的“鲱鱼骨(herring bone)”外观的有包膜病毒(图6)。病毒粒子大小高度可变，直径范围为约130至380 nm。通过RT-PCR在用样品接种的3T3、B95和CEF细胞中没有检测到CPE和病毒。
6.9 实施例9
免疫荧光抗体测试
将FmoPV感染的CRFK细胞在-20℃在冷冻丙酮中固定10分钟。将固定的细胞与来自27只尸检猫的1:10至1:10240的血浆的4倍稀释液孵育，随后与1:20稀释的FITC-山羊抗猫IgG(Sigma)孵育。然后在荧光显微镜下检查细胞。未感染的细胞用作阴性对照。在27只猫中，从7只猫检测到免疫荧光抗体，滴度为1:40至1:640(参见表4，同上)。
6.10 实施例10
中和抗体检测
将100 TCID50 FmoPV与来自27只尸检猫的1:10至1:2560的血浆的2倍稀释液在37℃孵育1 h。将混合物接种至汇合CRFK细胞的96孔板中。吸附1小时后，弃去接种物，将板用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，并替代为补充0.1 µg/ml L-1-甲苯磺酰胺-2-苯基乙基氯甲基酮处理的胰蛋白酶(Sigma)的无血清MEM。将板在37℃、5% CO2孵育7天。除去上清液，将细胞单层用磷酸盐缓冲的盐水洗涤一次，并在-20℃在冰冷甲醇中固定10 min。将固定的细胞与针对FmoPV的N蛋白的豚鼠抗血清的1:200稀释物孵育，随后与1:50稀释的FITC-兔抗豚鼠IgG (Invitrogen)孵育。然后通过荧光显微镜检查细胞。用中和的FMoPV感染的细胞显示没有荧光。FmoPV感染的细胞用作阴性对照。在27只猫中，从6只猫检测到中和抗体，滴度为1:40至1:640(参见表5，同上)，其中全部对于免疫荧光抗体呈阳性(参见表4，同上)。
6.11 实施例11
组织中FmoPV N蛋白和肾脏中cauxin蛋白的组织病理学检查和免疫组织化学染色
为了确定FmoPV是否与肾脏病状诸如TIN相关，如下所述在其尿液样品中FmoPVRT-PCR 阳性的2只流浪猫的尸检肾组织上进行组织病理学和免疫组织化学，显示出与TIN相容的组织病理学特征以及通过免疫组织化学在肾小管中检测到FmoPV的N蛋白。
将两只流浪猫的固定尸检组织石蜡包埋。将5 µm的组织切片用苏木精和伊红(H＆E)染色。使用Nikon 80i显微镜和成像系统观察组织病理学变化。通过免疫组织化学染色检查FmoPV N蛋白的表达。将组织切片脱石蜡和再水化，随后用3% H2O2封闭内源性过氧化物酶20 min，然后用10％正常兔血清/PBS在室温封闭1 h以尽可能降低非特异性染色。将切片在4℃与豚鼠抗N蛋白抗血清的1:250稀释液孵育过夜，随后在室温用生物素缀合的兔抗豚鼠IgG, H & L链(Abcam) (30)的1:500稀释液孵育30 min。然后添加链霉亲和素/过氧化物酶复合物试剂(Vector Laboratories)，并在室温孵育30 min。使用3,3'-二氨基联苯胺进行显色，并且用Nikon 80i成像系统和Spot-advance计算机软件捕获图像。使用小鼠抗人髓性/组织细胞抗原抗血清MAC387 (DakoCyomation)进行淋巴结的双重染色，并用Texas-red缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch) (31)标记。根据公开的方案(32)检测Cauxin蛋白表达。
在尿中检测到FmoPV的两只流浪猫的各种器官的组织学检查在它们的肾脏中的间质炎症浸润和肾小管变性或坏死(图10)。此外，与在内皮层和外髓质之间没有观察到cauxin阳性近端肾直细管的TIN的组织学证据的猫(图11B)相比，在变性肾小管上皮细胞中的cauxin表达也存在明显下降，这与具有TIN的组织学证据的猫中的肾小管间质性肾炎相容(图11A)。使用抗FmoPV N蛋白抗体阳性的豚鼠血清对它们器官的免疫组织化学染色揭示肾脏切片中的阳性肾小管细胞和淋巴结切片中的阳性单核细胞(图10)。使用鼠抗人髓性/组织细胞抗原血清MAC387，显示淋巴结切片中FmoPV的目标是巨噬细胞(图12)。
6.12 实施例12
病例对照研究
在27只流浪猫中，在具有FmoPV感染证据的12只猫中的7只观察到TIN，但仅在没有FmoPV感染证据的15只猫中的2只观察到TIN (P<0.05，通过Fisher精确检验)(表4)。这些结果支持在猫中FmoPV感染(RT-PCR和/或抗体阳性)和TIN之间的正相关关系。
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。事实上，除了描述的那些之外，本发明的各种改变对于本领域技术人员而言根据前面描述和附图是显而易见的。此类改变意在落在所附权利要求的范围内。
本文中引用的所有参考文献都完整地通过引用并入本文，出于所有目的其程度等同于每个单独的出版为或专利或专利申请都被具体和单独地指示为出于所有目的完整地通过引用并入。
序列表
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the People's republic of China
Versitech limited
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<151> 2012-01-20
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<400> 1
accagacaaa gatgtttgtg acctattcta acgacaagac tattattaaa tatttaggaa 60
taacgattcc attagtgagg tgagggggag gaatcaggta ttccacaatg tctagtctat 120
tgaggtcact tgctgcattt aagagacata gggagcaacc aacagcaccg tcaggttcgg 180
gtggtgcaat taaaggattg aaaaatacaa ttattgttcc agttccaggg gatacagtaa 240
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tgatgatgaa aaccattatt cagagattaa tggccggtct tccgctatcg aaggactgga 2160
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tgtgcatctg tcaatgggca taaatttact tgaccaatcc aaggacccta gattaagaaa 4020
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actacaggct tatttaggat tcaaaaggac tttatgttac cctttgatgt atgttaatga 4260
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tatcttgaat caccaaatgt aagagcatca acaggtaata agttttggat tgctagattg 4620
acacttaatt ctcagaacta gaatacccag attgtcaaac ctataacctt gttagattca 4680
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ttaatggtta taaagatggt tcctaatata tcatcaatca ttaattgcac taaactcgaa 5160
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tcaagtatat tgtgccaaca aaattcaatt tacccaatgt caacagagat gcaaagatgt 6000
attaagggcg agataagatt ctgtccaaga tccaaggcaa ttgggacatt agttaatcgg 6060
tttatattga ccaaaggtaa tttaatggct aattgtttag ggattatatg cagatgttat 6120
acttcaggac aagttataac acaagaccca agtaaattga ttacgataat atcgcaagag 6180
gagtgcaagg aagttggtgt tgatggtatt cgtattatgg taggacctag aaaattacca 6240
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gtcgggactg atttagcgat tgcttcagct aaacttaata attctaaggc attgttagag 6360
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ggattaatct tagcaattat gataatcttt ataatcatta ttactattat ctggatcata 6480
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gattgtataa tatactcctt taaactagat agtgataaag ggttatagat gatttcagtt 6720
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tgtgtcatca attaatagct taataatatc gtttaatgta cttatattga tggatagatg 6840
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tcatggagtc caacaatatt aagtattaca aagattctag ccggtacttt ggtaaaatat 7020
tagatgaaca caaaacaatt aatagtcaat tgtacagttt gagtatcaag gtaattacca 7080
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atgttcaata tcgagtgttt gagatcggat atatttctga tcagtttggt gtattcccct 7740
ccttaatagt atcgagagtg ttgccgatac gtatgctatt aggaatggaa tcctgtacct 7800
tgacaagtga tagactaggc gggtattttt tatgtatgaa tacactgaca cgatctatat 7860
atgattatgt tagcataagg gatttgaaat cactttatat aacaatccct cattatggta 7920
aagttaatta tacttacttt aattttggta agatcaggag cccacatgag attgataaaa 7980
tttggttaac atctgataga ggccaaatta tctctggtta ttttgcagca tttgttacca 8040
ttacaattcg gaactataat aattatccct acaaatgctt aaataaccca tgttttgaca 8100
actctgagaa ttactgtaga ggatggtata aaaacataac aggaactgat gatgttccga 8160
tattagcata cttattggtt gaaatgtatg atgaggaggg acctttaatt acacttgtgg 8220
caataccacc ttacaattat acagctccat ctcataattc tctttactat gatgacaaaa 8280
ttaataaatt aataatgact acatctcaca taggttatat tcaaatcaac gaggtgcatg 8340
aggtaattgt tggcgataat ttgaaggcta tcctcttaaa cagattgtct gatgaacatc 8400
ctaacctgac tgcctgtaga ctcaatcagg gtattaagga gcaatacaag tctgacggaa 8460
caataatttc aaattctgca cttattgata tacaagaacg aatgtacatt acagttaaag 8520
ctattccacc agcaggtaac tataacttta cagttgagtt gcattctaga tcaaacacat 8580
cctatgtatc gttaccaaaa cagtttaatg ctaagtatga caaattacat cttgagtgct 8640
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acttcgttgc aatggagcag tcagactacc aagatattct atacccggaa gtacatctta 8940
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atctcaagat tcgatcagat atcataaaat gttttgatag attgaaaatg aaaatgaata 9300
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attcagttat tgcattatta gagcctcttt ctcttgctta tttgcaattg atagatgcag 9780
atccacagat tcggggaaca ttcttgcatc actgcttttc cgagttagaa gaaattatat 9840
ttgacaaaac cccttttgat ccttttgtgt atgaaaattt aattaatggg cttgattaca 9900
tttatttgac aggtgatatt catctaactg cagaagtttt ttcttttttt agaagttttg 9960
gtcatccttt tttagaggca caaaatgctg ctaataatgt aaggaagtat atgaataagc 10020
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atacaggggt tagaatctca tcattggttc aaggcgataa ccaggcaatt gcagtaacca 11280
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ttcaaggatc aagatattat acatggtttt ttgtaccttc aaattgtcaa ctcgatcaaa 12540
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ttcacttaca tgcagatgtt aattgttgta tagtacagat gactgatcag ccttatacac 13080
caagcttaac aaaaaagcta cctgatatta ggcccattaa taataaactg atatatgatc 13140
cggctcctat aatcgatacc gatgcagcta ggctatattc ccaaaaatac ctgtcacatt 13200
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cggtatccat tgtagaatta attacaaaag ctagtaaaga ccatctcaat gagataatag 13320
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attccactag atgtcccaat ataaaagggg cagatacaat tatgagaaac tcaattctta 13860
gatctttcat tgataatgag aggagaacaa atccactcgg tttgacatgg aaccttgacc 13920
cgttactcgt ggatcatttt agctgttcta ttacgtatct gaggagaggt attattaaac 13980
agatgaggtt aagatttgat ccaagtgtat cgttggaact atctaggatg attaagcctg 14040
atgcggttta tcaagcacct aaaattccgt cttcatgggc tcttatagat atcaaccctg 14100
aagtaaatga ccttaatgta atttttggag agctgaatag caaatggaaa gacattccta 14160
ttggacagat taggatacag aattatgaaa tacatgcata taggaggatc ggagttaatt 14220
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catcaggtgc attgttttta ggtgaaggag caggatcaat gctggtcaca taccgtgctt 14340
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gaaatttaca accaactcca gttacatttt tgtcctatat ttttgaaact aagtatagaa 14940
ataatatggt tacaaattat ggactgtgct tgtcagacgg acacaaaagt gattacctgt 15000
catcaattac aaaaatagag aacgttcttc tgtcatgtgg gttagaattg aatggaccta 15060
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ttgcattgaa atatgttgta tatctactct tttattcaag ctctacatta tctagtaaac 15300
aaataatgag taatcttaga aagggaatat tgatgtatga tttgagagat gaatttttca 15360
tatcaagatt gtcagcaaat tacaagaaaa aggtgatgtc acaagaagtc aaaactacct 15420
ggatctttaa tcttgatact ccgacacgaa aagcattata taagttagta ggttattcat 15480
taataattaa tcatgtatga tgatagagta tgattatcca tctttaaaag agtaagataa 15540
tatcagatgt atgataacca attaagtatt acttttgaat tgaaaggttg ctcaattaca 15600
cgctttttta gtaatcgggt ttttattcca attagggcaa ttagaaaaaa cttcaacggt 15660
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ttagaattat aacagtaata ctaatttatg aatggaagac aattgatatc tagtgtgaat 15780
tttatgttta tgtgtcttaa accttatact cactataatt gttctttatt tgagaattta 15840
attataggtg tttatgtgtt atgtgatggg aaccatcagt gctgacatta ttaataacca 15900
taggtattgt atgggatagt gtttatttac taccaatgta caatctcata tgtcggaccc 15960
ctcaacctcc tccttatagt tgagttttct ggaaaaacac aaaagatgat cttgagtaat 16020
tgtacggacc tatagctttc tttgtctggt 16050
<210> 2
<211> 16050
<212> DNA
<213> 猫麻疹病毒毒株776U
<400> 2
accagacaaa gatgtctgtg acctattcta acgacaagat tattactaaa tatttaggaa 60
taacgattcc attagtgagg tgaggaggag gaatcaggta ttccacaatg tctagtctat 120
tgaggtcact tgctgcattt aagagacata gggagcaacc aacagcaccg tcaggttcag 180
gtggtacaat taaaggattg aaaaatacaa ttattgttcc ggttccaggg gatacagtaa 240
ttactacaag gtctaatttg ttatttagat tagtttatat aataggcaat ccggatacac 300
ctttaagcac ctcgacggga gcaataatat cattgttgac cctatttgtc gaatctccag 360
gtcaattaat tcaaagaatt gctgatgacc ctgatgcagt ttttaaattg gtagaggtca 420
ttcctgaagc tggtaatcct ggagaattaa cttttgcatc tcgagggatt aatttagaca 480
agcaagctca acaatacttt aaattggctg agaaaaatga tcaggggtat tatgttagct 540
taggatttga gaaccctcca aatgatgacg atataacatc tagtcctgag atattcaatt 600
atatcctggc atctgtactt gcacaagttt ggattcttct ggcaaaagct gtgactgctc 660
cagatacggc tgctgaagcc gaaaatcgta gatggattaa attaatgcaa caacgtaggg 720
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cagatattac aataaggcga ttcatggtag cattagttct tgacatcaaa cgttctcctg 840
ggacaagacc caggatagct gaaatgattt gtgatattga taattatatt gtagaagcag 900
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cactacatga gttttctgga gaactagcca ctattgaggg gcttatgaaa ttgtaccaat 1020
ctatggggga aatggcacca tacatggtaa ttctggaaaa ctcaatccaa accaggttta 1080
gtgcagggtc ttatcctctg ctatggagtt atgcaatggg tgtcggggtg gagcttgaaa 1140
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cttcaggtgt caccaaccat tataatgata ctgaccttct aaaataatat gagcataccc 1680
taattgatta tgatacaact caaattaaga aaaacttagg acctcaaggt tcacaactgt 1740
tggcatatca ccaaaacaca gtcagctctt cacccacccc atgtcctctc accaaatcca 1800
acaagtcaaa catggcctcg aatctttaca agagatcaaa agcaaccctc cgccttccca 1860
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gcaaggagga gccattgcgg gaaataatat tacgtcaggg ggtaacaatg actcaatgta 1980
tagccaagga ccaagtcctc ctatttcaag tattaacaag aatatcgaag gacctactgg 2040
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gtctaagact gattcatctc ctagttccca ggaaactaca ctatctgttg ggggatctga 2280
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aagatttggt cagtttcata tatatggtta ttgatttgtg ataattataa aaaacttagg 3360
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agtgcctaaa gttcgagtta tcgatccggg tctaggagat cgcaagagtg gggggtatat 3540
gtatctactt cttcatggtg tcatagaaga tagtgagact ataattagtc cgaaaggaag 3600
agcatttggt gcattcccat taggagtggg tcaatcaact gaaaacccgg aagacttgtt 3660
taaggaaata ttaactctca acatcgtgac tcgtaggact gctggattta atgagaaatt 3720
ggtttattat aataccacac ctctacattt actgaccccc tggaagaaag tgttggcata 3780
tggaggcatt tttaatgcta atcaggtctg cagtgataca agttccatac caatagacat 3840
tccacaaaaa tttaggccag tatatttgac tgttacaaaa ttatctgatg atggctatta 3900
tcagatccca aagatgattc aagatttcaa atcgtcaaat tctgttgcat ttaacatcct 3960
tgtgcatctg tcaatgggca caaatttact tgaccaatcc aaggacccta gattaagaag 4020
tgctgcagaa actgtgatca catttatgat tcatattgga aactttaaac ggaagagtaa 4080
taagtcttac tcacctgaat attgcaagag gaaaataatg aggcttggtt taatattctc 4140
attaggtgca attggtggca caagcttgca tattagatgt acaggtaaga tgagcaaacg 4200
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tggtctcttc aagattaaat agactataac aataataaac cgccaccaaa tggtaccatg 4440
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attggagtta taagtactaa gcaatacgac tataaaataa ctactctgaa cactgaccag 5100
ttaatggtta taaagatggt tcctaatata tcatcaatca ttaattgcac taaactcgaa 5160
ttaacaaaat acagagagtt agtctcaggg atcattagac caataaatga gtcattagaa 5220
ttaatgaatt catacattaa catgagagca ggttcagaga gattcatagg ggctgtaata 5280
gctggtgtag ccttaggagt ggcaactgca gcacaaataa catcagggat tgccctacat 5340
aattcaatta tgaacaaaaa acagatacaa gaattgagga aggctcttag tactactaac 5400
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<210> 3
<211> 16050
<212> DNA
<213> 猫麻疹病毒毒株M252A
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tgggttaaat ctgaataact attaggaatt gagattttaa attgattctc tcttaactct 4920
aaagttttag taatatagca tcaattcagc accatgaaca gaattaaagt tataataatt 4980
agttctttgt tattatcaga tattacgatt gcacaaatag gctgggataa tttaacttcg 5040
attggggtta taagtactaa gcagtacaac tataaaataa ctactctaaa tactaatcag 5100
ttgatggtta taaagatggt tcccaatata tcgtcaatca ttaattgcac taaacttgaa 5160
ttgataaaat atagagagtt agtctcaggg atcattagac caataaatga gtcattagaa 5220
ttaatgaact catacattaa tatgagagta ggttcagaga gatttatagg ggctgtaata 5280
gctggagtag cattaggagt ggcaactgca gcacaaataa catcagggat tgccctacat 5340
aattcaatta tgaacaaaaa acagatacaa gagttgagga aggctcttag tactaccaac 5400
aaagcaattg atgaaataag gattgcaggt gaacgaacat taatggcagt acaaggtgta 5460
caggattata tcaataatat aattgtccct atgcaggaca aactccaatg tgatatttta 5520
tcatcacagc tttctgttgc attactcaga tattatacaa atatattaac agtctttgga 5580
ccaagtatac gagatcctat cactagcacg atttcggtac aagcacttag tcaagcattc 5640
aatggtaatc ttcaggcact acttgacgga ctaggatata ctgggagaga cttacatgac 5700
cttctagaga gtaaatctat cactggtcag ataattcatg cagatatgac tgatttgttc 5760
cttgttctga gaattaatta cccttccata actgagatgc agggagtaac aatatatgaa 5820
ctgaattcaa ttacatatca tattgggcct gaagagtggt atactattat gcctgatttt 5880
atagctgttc agggtttttt aatatctaat tttgatgaaa gaaagtgttc aataactaaa 5940
tcgagtgtaa tatgccaaca aaattcaatt tacccgatgt cagcagagat gcaaagatgt 6000
attaagggcg aaataagatt ctgtccaaga tctaaggcaa ttgggacgtt agttaatcgg 6060
ttcatattga ccaaaggtaa tttaatggct aattgtctgg gaattatatg cagatgttat 6120
acctcaggcc aagttataac acaggacccc agtaagttaa ttacaataat atcacaagag 6180
gagtgcaaag aagtcggtgt tgatggtatc cgtattatgg taggacctag aaaattacca 6240
gatattacct ttaatgctag gttagaaatt ggtgtaccga tatcattaag caaattagat 6300
gtcggaaatg atttagcaat tgcttcagct aagcttaata attccaaagc attgttagag 6360
caatcagata agattctggg ttctatgtct aagttggatt ctattaattc aagaattata 6420
ggattaatct tagcaatcat gataatcttt ataattattg ttaccattat ctggatcata 6480
tataaaaatt gtagaaataa agatactaaa ttcagtactt caattgaacc gctctacata 6540
cccccttctt ataactcacc tcatagtgtg gtcaagtcta tttgagtact gaccatatga 6600
tttactgtaa taagtccagt ggaagtatca attgacaata ctggtagtat aatgaatatt 6660
gaatatataa tatactctct taaattggat agtgataaag agttatagat gattgcaatc 6720
attttaatat aattatatat tgatttgatt acctggtata attcttatgc aattgaatta 6780
tgtgtcatca attaatagct taatagcact gttttataca cttatgttga tagatagatg 6840
tgttatattg taatcaagga tttagtatct agaagaggaa agagttcaat tggttgttaa 6900
ttggttattg tgtattcaat tagaaaaaac ttaggaatcc atgttaataa aaactcatta 6960
tcatggagtc caataatgtt aaatattaca aggattctaa ccgatacttt ggtaaaatat 7020
tagatgaaca caaaacaatt aatagtcaat tgtacagctt aagtattaaa gtaattacca 7080
ttattgccat aattgtaagc ctaattgcaa caataatgac tattattaat gccacaagtg 7140
ggaggactgc cctaaacagt aatacagaca tactgcttag ccaaagagat gagattcata 7200
atatccaaga aatgatattt gatcgtattt atcctttgat aaatgctatg agtacagagt 7260
taggacttca tattcctacc ttattggatg aacttactaa agcgattgac caaaagatta 7320
aaataatgaa tccccctatt gacactgtga cgtctgatct taattggtgc atcaaacccc 7380
ctaacggaat tattatagac ccgaagggtt attgtgagag tatggaattg tccaaaactt 7440
ataaattact acttgaccaa ttagatgtct taagaaagaa atcactcatt ataaatagaa 7500
agaatattaa ccagtgtcaa ttagttgatg attcaaagat catttttgct actgtcaaca 7560
tacaatctac accgaggttt ttgaattttg gtcacacagt cagcaatcaa cgtataacat 7620
ttggtcaagg aacatatagt agtacttatg ttataactat ccaagaagat gggataactg 7680
atgttcaata tcgagttttt gaaatcgggt atatctctga tcagtttggt gttttcccct 7740
ccttaatagt atccagagtg ttgcctatac gcatgctatt aggaatggaa tcctgtacct 7800
tgacaagtga cagactaggt gggtatttct tgtgtatgaa tacactgaca cgatctatat 7860
atgattatgt tagcataagg gatttgaaat cattatatat aacactccct cattatggta 7920
aggttaatta tacttacttt gattttggta agatcagaag cccacatgaa atagataaaa 7980
tttggttaac atctgagagg ggccaaatta tttctggtta ttttgcagca tttgttacca 8040
ttacaattcg gaattataat aattatccct acaaatgttt aaataatcca tgctttgaca 8100
actctgagaa ttactgtaga gggtggtata aaaacataac aggtactgac gatgttccga 8160
tattagcata cctattagtt gaaatgtatg atgaagaagg acctttaatt acacttgtag 8220
caatcccgcc ttacaattat acagctccat ctcataattc tctttactat gatgataaaa 8280
tcaataaatt gataatgact acatctcaca taggtcatat tcaagttaat gaggtgcatg 8340
aggtgattgt tggcgataat ttaaaggcta tcctcctaaa cagattatct gatgaacatc 8400
ctaatcttac tgcctgtaga ctcaatcagg gcattaagga gcagtacagg tctgacggaa 8460
caataatttc aaattctgca cttattgata tacaagaacg gatgtatatt acaattaaag 8520
ctgttccacc agtgggtaac tataacttta cagttgaatt gcattctaga tcaaacacat 8580
cttatctatt gttaccaaaa cagtttaatg ctaaatacga caaattacat cttgagtgct 8640
ttagctggga caaatcttgg tggtgcgcct tgatacctca gttttcatta agttggaatg 8700
aatccctttc tgttgatact gctattttta atttaataag ttgtaaatga atatgtcaac 8760
tgatagttga tagttgtcaa aacatcagct aattgagatt aaagaaataa aaaaatgaaa 8820
ttatcaagat ttgactagat gtatactcaa gctaaattac aaaaaactta ggagtcagag 8880
acttcgttgc aatggagcag tcagactacc aagatattct atatcctgag gtacatctta 8940
acagtcctat agtaatctct aaattagtag gtattttaga atatgcccga attgctcaca 9000
atcaacaact atcagaccat acaattatca agaatattca atttagatta agaaatggct 9060
ttaatagtcc aaggatacag acactatcaa ctatgggtga aatcatcaac aaaattaaaa 9120
gcaaacaccc caattattta cacatacctt accccgaatg taaccaaaag ctatttcgaa 9180
tagtagatcc agaactgaca tcaaaattgg aatctcttct gaacaaaggt gatacactgt 9240
atctcaaaat tcggtcagat atcataaaat gctttgatag attgaaaatg aagatgaaca 9300
taaggaatga tcttcttaat gacaatagtc aattaattct ggatcttcct ttaattctca 9360
aaggatctca gtggttcttc ccgtttttat tttggttttc gattaaaact gagactagaa 9420
gctgtatccg acaaaatcaa aaagctcgtg ttagatcaca atatcggcct cacttatcag 9480
agactaagag aattacattg gttgttacat ctgatctaat tacgatattt gatcatatta 9540
ataaatgtat attttatctg acttttgaga tgttgttaat gtattgcgat gtggtagaag 9600
gtagattaat gactgaaaca gctatgagct tggattgtcg atttatcaat ctattgccaa 9660
gagtgcaata tatgtgggat ttgctagatg gaatgtttga aagtttaggt aatcaattat 9720
attcagttat tgcattgtta gagcctcttt ctcttgctta tttgcaatta atagatgcag 9780
atccacagat tcggggaaca ttcttgcatc actgtttttc agagttagaa gaaattatat 9840
ttgacaagtc tccttttgat ccttttgtgt atgaaaattt aattaatgga ctagattata 9900
tttatttgac agatgatatt catctaactg cagaagtttt ttcttttttt aggagctttg 9960
gtcatccttt tttagaagca caaaatgctg ctaataatgt gaggaagtat atgaataagc 10020
ctaaagtgat ctcataccag actctaatgc aaggacatgc gattttctgt ggtattataa 10080
taaatggatt tagagatcgc catgggggaa catggcctcc tgtagagtta ccaaatcatg 10140
catctgctgt aattagaaat gcccagctat ctggagaagg gttaacatct gaacaatgtg 10200
ctcaacactg gagatccttt tgtggattta aatttaaatg ttttatgcca ctgagtctag 10260
atagtgacct tacaatgtac cttcgggaca aggcgttgtc acctgtcaaa agtgagtggg 10320
attctgttta tgcgaaagag tatttaagat acaatccagg attacctaca agctctagaa 10380
gactagtgaa tgtattctta gaagatgata agtttgatcc atatgaaatg atcatgtacg 10440
tgataaatgg tgattactta agagacaaag agtttaatct ttcatacagt cttaaagaga 10500
aagagatcaa agaggtaggt cgattgttcg ccaaaatgac ttataaaatg agggcttgcc 10560
aagtaatagc tgaaaacctg attgccaatg gagtagggaa gttcttcaaa gataatggaa 10620
tggcaaaaga tgaacataaa ctaactaaaa cgttacacaa attagccatt tcaggtgtac 10680
ctaaagataa ttctcaactt tatttagatg aatgctggga gcaagtagtt cgacaatgct 10740
caagtagtac acagatagga gaacagacta tgaattcaca atcgaagagg gcaattgaat 10800
caaagtcttc tagatcacat cgaaataata gggatatctt aaggggcagg agagatttga 10860
ataaacagat aaagtaccct tccaacaccg agtattatga gactattagt agtttcataa 10920
ctactgacct taaaaagtac tgtcttaatt ggcgatatga atcaagtagt gtgtttgcag 10980
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agaaatctgt tttatacgtt agcgatccgt ctagtccacc tgattttgat cgacatatcg 11100
atatagaatc agttccgaat gaccatatct ttattaagta cccgatgggt ggaatagagg 11160
ggttctgtca aaaattatgg actattagta cgattccatt cctatattta gcagcttttg 11220
atacaggagt tagaatctca tcattggttc agggcgataa tcaggcaatt gcagtgacca 11280
aaagagttcc atcatcttgg agttactcaa agaaaaagga agaatcaact aaaataacaa 11340
cacaatattt ccttaattta agacaacgct tacacgacat aggtcatgaa ttaaaagcaa 11400
atgagactat tatatcctct catttctttg tttactctaa aggtatttat tacgatggaa 11460
tacttctctc tcaagcactt aaaagtattg caagatgtgt tttttggtct gaaacaattg 11520
ttgatgaaac tagatcagct tgcagtaata tatctacgac acttgcaaag gcaattgaaa 11580
ggggttatga taaatttgtg gcatatgcta ttaatattta taaaacaata catcaagttt 11640
tgattgcatt atcttttacg attaatccta ctatgacacc agacattaca gaacctttct 11700
acaaaagttt ggatctactt aaaaatctag ttctaatccc tgcaccattg ggaggcatga 11760
attatatgaa catgagcagg ttatttgtta ggaacatagg tgaccccatt actgcttcat 11820
ttgctgatat aaagcgcatg atcgaatgtg ggttattagg atgtagcatt ctgtcacaga 11880
taatgtacca aaaatgtggt tcctctaaat acttagactg ggctagtgat ccttactcaa 11940
taaaccttcc ttatagccaa agtatgacca aggtcttaaa aaatgtaaca gcaagatatg 12000
tacttatgca tagccccaat cctatgctca aagatttgtt ccatgaaaag tcacaagaag 12060
aagatgaaat ccttgctgaa tttctgttag accgacactt aataatccct agagcagcac 12120
acgaaatttt atcaaattca gtgacaggtg ctagggaatc tatagcaggt atgcttgaca 12180
ctactaaggg tttaatccgt gctagtatgt caagaggtgg gctgacatca tcactagttt 12240
taaaattatc aacatatgac taccaacagt ttagaacgtg tcttgaatgg ctttatgctc 12300
ctatcacggg aattgctgta agcgttgatt cttgttctgt attcttagct aagaccatcc 12360
gaaagagaat gtgggttcat ctaactaagg gaagggagat ttacgggttg gaggtacctg 12420
acattttgga atgcatgcaa aacaatataa ttattgatca tgaagattgt tactcatgta 12480
ttcaaggatc aaaatattat acatggtttt ttgtaccttc aaattgtcaa ctcgatcaga 12540
taaataagtc aacaaattct ctccgagtac cttatgttgg atcaacaact gaagaaagga 12600
gtgatatgaa gttgtcatat gtgaggtcac caagtagacc acttaaagca gcagtccgaa 12660
ttgcagcagt atatacatgg gcttatggtg atgatgattt atcctggcat gaggcttggt 12720
atttggcaag gactagggca aatattacat ttgatgaact caaattaata acacctatag 12780
ctacatctac taatttggca cataggttga gagatagaag tactcaagtt aaatattcag 12840
ggacttcctt agtaagagtg gcacgctata caacaatatc taatgataac atgtcgttca 12900
ctattaacaa caggaaagtc gatactaatt ttgtctacca gcaagggatg ttattaggct 12960
tgagtatact cgaatacata ttcagatact gtacaagtac tggacaatca aacactgtaa 13020
ttcacttaca tgcagatgtt aattgttgta tagtacagat gactgatcag ccttatacgc 13080
caagcttaac taagaagcta cctgatatca aacccatcaa taataaattg atatatgatc 13140
cggctcctat aattgatact gatgcagcta ggttgtattc tcaaaaatat ctgtcacatc 13200
taatagattt tccaagttgg tcaactactc agcttaacac agtgttggca aaagtggtag 13260
cagtatctat agtagaattg atcacaaaag cgagtaaaga ccatctcaat gagataatag 13320
cggttgttgg tgatgatgat atcaatagct ttattacaga atttctactt gttgatccac 13380
gtttgtttac actatactta ggccaataca tgtctttaca atgggcatat gaaatccatt 13440
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ctagtagagg catatttagc atattgacca atgcctttag ccatccccgg gtctataaaa 13560
gattctggga atgtggttta ttggagccta tttatgggcc ttatatagga agtcaaaatc 13620
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caaatagaat tgacaattac caaagtagac acctagctgt actcatagac ttgtactgcg 13800
attccactag atgccccaat ataaaagggt cagatacaat tatgagaaat tcaatcctta 13860
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atgtgattta tcaagcacct aaagttccgt cctcatgggc tcttatagat atcaaccctg 14100
aagtaaatga ccttaataca atttttggag agcttaatag caagtggaaa gacatcccta 14160
taggacaaat cagaatccaa aattatgaaa tacatgcata taggaggatt ggagttaatt 14220
caactgcatg ttataaggct ttagagctat tatctgttct aaatcggttc atgtctaacc 14280
catcaggtgc attgttttta ggtgaagggg caggatcgat gctggtcaca tatcgtgcct 14340
ttattccatt caagacaatt tattataata gtggtatttc agttcaaaat gttcagggtc 14400
agagagaatt aagtctatat ccatctgaag tggcactagt tgataacaaa aatcgcttgg 14460
ctaatgaccc taatatcaaa gtcttgttta atggtaagcc agagtctaca tgggttggaa 14520
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taccaagggt cagtgattat acgtattcat tttgcaaata tgcatcagag ttctatcaac 14760
aaaactttct tgttctgcct agatttagta acatgtcatc atctgaggtt tactacatag 14820
gaattcacct taatacaaat cgattgattg accctgatag aatagtacaa tacataatta 14880
gaaatttaca acctactcca gttacatttt tatcctacat ttttgaaact aagtatcgaa 14940
ataatatggt tacaaattat ggactatgct tgtcagacgg acacaaaagt gattacttgt 15000
catcaattac aaaaatagag agtgttcttc tgtcatgtgg gttagaattg aacggaccta 15060
agattataca gcaattatca ggacatgact atgccagtgg agagactagt ctggaatcaa 15120
gtataatgat attagttaga gaatatctta atgcaactat acaaggccgg gaaacattag 15180
gcttgttttc accttacccg gtccttcatg agagtcagtt aagagaaatc aataagtgta 15240
ttgtattgaa gtatattgta tatctgctct tttattcaaa ctctacatta tctagtaaac 15300
aaataatgag taatcttaga aaaggaatat tgatgtatga tttgagagat gagtttttca 15360
tatcaagatt gtcagcaaat tacaagaaaa aagtaatgtc acaggaagtt aagactacct 15420
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taataattaa tcacatatga aggttgggca tggttattca ttttttaagg agtaagataa 15540
gacttgatat atgataactg attaaacatt acctctgaat tgaaggattg ctcaattaca 15600
tggtttttga gtaattgaga ttttattcca attagtacaa ttagaaaaaa cttcaacagt 15660
tgattgagcc ttaatttact ccatactagc tatatttata agctcggata aaactttggt 15720
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ttcatattta tatgttttta atcttatacc cactctaatt agttcctatt taagaattaa 15840
attatagatg ttaacatgtt atataatggg aaccatcaat gctgctattg ttggtaacta 15900
taggcattgt attagataat gtttatttct tagaaatgtg caatctcata cgtcggaccc 15960
ctcagcctcc cccttatagt tgcgtgattt gaaaaaacac aaaaaataat catgaatggg 16020
tgtacgtacc tatagctttc tttgtctggt 16050
<210> 4
<211> 172
<212> DNA
<213> 猫麻疹病毒毒株776U
<400> 4
agagacttaa tgagatttat ggactgcctg gatttttcca gtggcttcac aagattttgg 60
agaaatctgt tctatacgtt agtgatccat atagtccacc tgactttgat caacatatcg 120
atatagaatc agtcccaaac gaccatatct ttatcaagta cccgatgggt gg 172
<210> 5
<211> 172
<212> DNA
<213> 猫麻疹病毒毒株M252A
<400> 5
agagacttaa tgaaatttat ggattgcctg ggttttttca gtggcttcac aaaatattgg 60
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atatagaatc agttccgaat gaccatatct ttattaagta cccgatgggt gg 172
<210> 6
<211> 172
<212> DNA
<213> 猫麻疹病毒毒株761U
<400> 6
agagacttaa tgaaatttat ggactgcctg gatttttcca gtggcttcac aagattttgg 60
agaaatctgt tctatacgtt agtgatccat ctagtccacc tgactttgat caacatgtcg 120
atatagaatc agtcccaaat gaccatatct ttatcaagta cccgatgggt gg 172
<210> 7
<211> 519
<212> PRT
<213> 猫麻疹病毒
<400> 7
Met Ser Ser Leu Leu Arg Ser Leu Ala Ala Phe Lys Arg His Arg Glu
1 5 10 15
Gln Pro Thr Ala Pro Ser Gly Ser Gly Gly Thr Ile Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Asn Thr Ile Ile Val Pro Val Pro Gly Asp Thr Val Ile Thr Thr Arg
35 40 45
Ser Asn Leu Leu Phe Arg Leu Val Tyr Ile Ile Gly Asn Pro Asp Thr
50 55 60
Pro Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ala Ile Ile Ser Leu Leu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Ala Asp Asp Pro Asp
85 90 95
Ala Val Phe Lys Leu Val Glu Val Ile Pro Glu Ala Gly Asn Pro Gly
100 105 110
Glu Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ile Asn Leu Asp Lys Gln Ala Gln
115 120 125
Gln Tyr Phe Lys Leu Ala Glu Lys Asn Asp Gln Gly Tyr Tyr Val Ser
130 135 140
Leu Gly Phe Glu Asn Pro Pro Asn Asp Asp Asp Ile Thr Ser Ser Pro
145 150 155 160
Glu Ile Phe Asn Tyr Ile Leu Ala Ser Val Leu Ala Gln Val Trp Ile
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Glu Ala Glu
180 185 190
Asn Arg Arg Trp Ile Lys Leu Met Gln Gln Arg Arg Val Asp Gly Glu
195 200 205
Leu Arg Leu Ser Lys Gly Trp Leu Asp Leu Val Arg Asn Lys Ile Ala
210 215 220
Ser Asp Ile Thr Ile Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Val Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Arg Ser Pro Gly Thr Arg Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp
245 250 255
Ile Asp Asn Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Leu Leu Thr
260 265 270
Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Arg Tyr Pro Ala Leu Ala Leu His Glu
275 280 285
Phe Ser Gly Glu Leu Ala Thr Ile Glu Gly Leu Met Lys Leu Tyr Gln
290 295 300
Ser Met Gly Glu Met Ala Pro Tyr Met Val Ile Leu Glu Asn Ser Ile
305 310 315 320
Gln Thr Arg Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala
325 330 335
Met Gly Val Gly Val Glu Leu Glu Arg Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe
340 345 350
Thr Arg Ser Phe Phe Asp Pro Thr Tyr Phe Arg Leu Gly Gln Glu Met
355 360 365
Val Arg Arg Ser Ser Gly Met Val Asn Ser Ser Phe Ala Arg Glu Leu
370 375 380
Gly Leu Ser Glu His Glu Thr Gln Leu Val Ser Gln Ile Val Asn Ser
385 390 395 400
Gly Gly Glu Ser Gly Ile Pro Lys Phe Asp Gly Phe Arg Ala Asn Pro
405 410 415
Thr Thr Phe Leu Gly Thr Lys Asp Asn Ile Asp Asp Arg Gly Glu Asp
420 425 430
Gln Ser Asn Ser Ile Ser Gly Leu Pro Gly Pro Leu Leu Pro Ser Arg
435 440 445
Asp Leu Asp Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Gly Ile Asn Ser Gly Val Lys
450 455 460
Asn Val Ser Asp Lys Leu Asn Glu Gly Val Gly Pro Asp His Asp Val
465 470 475 480
Ser Ser Ser Ala Met Glu Glu Leu Arg Arg Leu Val Glu Ser Thr Asn
485 490 495
Arg Ile Asp Thr Lys Gln Pro Glu Ala Ser Gly Val Thr Asn His Tyr
500 505 510
Asn Asp Thr Asp Leu Leu Lys
515
<210> 8
<211> 519
<212> PRT
<213> 猫麻疹病毒
<400> 8
Met Ser Ser Leu Leu Lys Ser Leu Ala Ala Phe Lys Arg His Arg Glu
1 5 10 15
Gln Pro Thr Thr Pro Ser Gly Ser Gly Gly Thr Ile Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Asn Thr Ile Ile Val Pro Val Pro Gly Asp Thr Val Ile Thr Thr Arg
35 40 45
Ser Asn Leu Leu Phe Arg Leu Val Tyr Ile Ile Gly Asn Pro Asp Thr
50 55 60
Pro Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ala Ile Ile Ser Leu Leu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Ala Asp Asp Pro Asp
85 90 95
Ala Val Phe Lys Leu Val Glu Val Ile Pro Glu Ala Gly Asn Pro Gly
100 105 110
Glu Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ile Asn Leu Asp Lys Gln Ala Gln
115 120 125
Gln Tyr Phe Lys Leu Ala Glu Arg Asn Asp Gln Gly Tyr Tyr Val Ser
130 135 140
Leu Gly Phe Glu Asn Pro Pro Asn Asp Asp Asp Ile Thr Ser Ser Pro
145 150 155 160
Glu Ile Phe Asn Tyr Ile Leu Ala Ser Val Leu Ala Gln Val Trp Ile
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Glu Ala Glu
180 185 190
Asn Arg Arg Trp Ile Lys Leu Met Gln Gln Arg Arg Val Asp Gly Glu
195 200 205
Leu Arg Leu Ser Lys Gly Trp Leu Asp Leu Val Arg Asn Lys Ile Ala
210 215 220
Ser Asp Ile Thr Ile Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Val Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Arg Ser Pro Gly Thr Arg Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp
245 250 255
Ile Asp Asn Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Leu Leu Thr
260 265 270
Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Arg Tyr Pro Ala Leu Ala Leu His Glu
275 280 285
Phe Ser Gly Glu Leu Ala Thr Ile Glu Gly Leu Met Lys Leu Tyr Gln
290 295 300
Ser Met Gly Glu Met Ala Pro Tyr Met Val Ile Leu Glu Asn Ser Ile
305 310 315 320
Gln Thr Arg Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala
325 330 335
Met Gly Val Gly Val Glu Leu Glu Arg Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe
340 345 350
Thr Arg Ser Phe Phe Asp Pro Thr Tyr Phe Arg Leu Gly Gln Glu Met
355 360 365
Val Arg Arg Ser Ser Gly Met Val Asn Ser Ser Phe Ala Arg Glu Leu
370 375 380
Gly Leu Ser Glu His Glu Thr Gln Leu Val Ser Gln Ile Val Asn Ser
385 390 395 400
Gly Gly Glu Ser Gly Ile Pro Lys Phe Asp Gly Phe Arg Ala Asn Pro
405 410 415
Thr Thr Phe Leu Gly Thr Lys Asp Asn Ile Asn Asp Lys Gly Glu Asp
420 425 430
Gln Ser Ser Ser Val Ser Gly Leu Pro Gly Pro Leu Leu Pro Ser Arg
435 440 445
Asp Leu Thr His Pro Gly Asp Ser Tyr Gly Ala Asp Asp Gly Val Lys
450 455 460
Asn Val Ser Asn Lys Leu Ser Glu Gly Ile Ser Pro Asp His Asp Val
465 470 475 480
Ser Ser Ser Ala Met Glu Glu Leu Arg Arg Leu Val Glu Ser Thr Asn
485 490 495
Arg Ile Asp Thr Lys Lys Pro Glu Ala Pro Gly Val Thr Asn His Tyr
500 505 510
Asn Asp Thr Asp Leu Leu Arg
515
<210> 9
<211> 519
<212> PRT
<213> 猫麻疹病毒
<400> 9
Met Ser Ser Leu Leu Arg Ser Leu Ala Ala Phe Lys Arg His Arg Glu
1 5 10 15
Gln Pro Thr Ala Pro Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Lys Gly Leu Lys
20 25 30
Asn Thr Ile Ile Val Pro Val Pro Gly Asp Thr Val Ile Thr Thr Arg
35 40 45
Ser Asn Leu Leu Phe Arg Leu Val Tyr Ile Ile Gly Asn Pro Asp Thr
50 55 60
Pro Leu Ser Thr Ser Thr Gly Ala Ile Ile Ser Leu Leu Thr Leu Phe
65 70 75 80
Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Ala Asp Asp Pro Asp
85 90 95
Ala Val Phe Lys Leu Val Glu Val Ile Pro Glu Ala Gly Asn Pro Gly
100 105 110
Glu Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Ile Asn Leu Asp Lys Gln Ala Gln
115 120 125
Gln Tyr Phe Lys Leu Ala Glu Lys Asn Asp Gln Gly Tyr Tyr Val Ser
130 135 140
Leu Gly Phe Glu Asn Pro Pro Asn Asp Asp Asp Ile Thr Ser Ser Pro
145 150 155 160
Glu Ile Phe Asn Tyr Ile Leu Ala Ser Val Leu Ala Gln Val Trp Ile
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Glu Ala Glu
180 185 190
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195 200 205
Leu Arg Leu Ser Lys Gly Trp Leu Asp Leu Val Arg Asn Lys Ile Ala
210 215 220
Ser Asp Ile Thr Ile Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Val Leu Asp Ile
225 230 235 240
Lys Arg Ser Pro Gly Thr Arg Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp
245 250 255
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260 265 270
Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Arg Tyr Pro Ala Leu Ala Leu His Glu
275 280 285
Phe Ser Gly Glu Leu Ala Thr Ile Glu Gly Leu Met Lys Leu Tyr Gln
290 295 300
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325 330 335
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355 360 365
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385 390 395 400
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405 410 415
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Asp Leu Asn Leu Ser Gly Asp Ser Tyr Gly Ile Asn Ser Gly Val Lys
450 455 460
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465 470 475 480
Ser Ser Ser Ala Met Glu Glu Leu Arg Arg Leu Val Glu Ser Thr Asn
485 490 495
Arg Ile Asp Thr Lys Gln Pro Glu Ala Ser Gly Val Thr Asn His Tyr
500 505 510
Asn Asp Thr Asp Leu Leu Lys
515

Claims (13)

1.麻疹病毒属的猫副粘病毒（FmoPV），其中所述副粘病毒的基因组序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3任一的核苷酸序列。
2.分离的多核苷酸，其核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3任一的核苷酸序列。
3.分离的多肽，其由SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9任一的氨基酸序列组成。
4.抗体或其片段，特异性针对权利要求1所述的猫副粘病毒或权利要求3所述的多肽。
5.载体，其包含权利要求2的多核苷酸；任选地进一步包含与所述多核苷酸可操作地连接的启动子。
6.宿主细胞，其包含权利要求5的载体。
7.产生权利要求1的猫副粘病毒的方法，其包括培养产生所述病毒的权利要求6的宿主细胞和回收所述病毒。
8.免疫原性组合物，其包含权利要求1的猫副粘病毒或权利要求3所述的多肽，以及药学可接受的载体；任选地其中所述载体是佐剂。
9.权利要求1的病毒或权利要求3的多肽或权利要求4的抗体在制备用于检测样品中权利要求1的猫副粘病毒或诊断猫科动物中的肾小管间质性肾炎的试剂盒中的用途，其中所述肾小管间质性肾炎是由权利要求1中所述猫副粘病毒感染导致的。
10.用于扩增SEQ ID NO:1-3中任一的引物，其具有核苷酸序列CAGAGACTTAATGAAATTTATGG，
CCACCCATCGGGTACTT，ACGCGGATCCGATGTCTAGTCTA，或CGGAATTCGGTTTTAGAAGGTCAGTA。
11.在检测猫副粘病毒中使用的试剂盒，其包含权利要求2的多核苷酸或权利要求10的两种或多种引物。
12.权利要求2的多核苷酸或权利要求10的引物在制备用于检测样品中权利要求1的猫副粘病毒或诊断猫科动物中的猫肾小管间质性肾炎的试剂盒中的用途，其中所述肾小管间质性肾炎是由权利要求1中所述猫副粘病毒感染导致的，其包括从猫科动物获得样品，将所述样品与权利要求2的多核苷酸适于杂交的长度的片段或权利要求10的引物一起孵育，并确定样品中包含权利要求2的多核苷酸序列或其互补序列的核酸序列的存在；任选地其中所述存在通过扩增方法，或通过使用探针或通过测序确定。
13.权利要求12的用途，其中所述扩增方法是RT-PCR。
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