ES2808152T3

ES2808152T3 - Anticuerpos anti-PD-L1 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2808152T3
Application number: ES12790432T
Authority: ES
Inventors: Horacio G Nastri; Christel Iffland; Olivier Leger; Qi An; Mark Cartwright; Sean D Mckenna; Vanita D Sood; Gang Hao
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2021-02-25
Anticipated expiration: 2032-11-21
Also published as: EP2785375B1; BR112014012819B1; KR101764096B1; MX349096B; SG11201402603WA; CY2020045I2; CA2856895A1; JP2017158553A; PT2785375T; LTPA2021001I1; AR089010A1; JP6138813B2; CA2856895C; HUE051954T2; HK1200736A1; US20140341917A1; IL276573A; HUS2000056I1; HRP20201595T1; US20170253654A1

Abstract

Un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o su fragmento de union a antigeno que comprende una secuencia de region variable de cadena pesada y de cadena ligera, en donde: (a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde tambien: (i) la secuencia de HVR-H1 es SYIMM (SEQ ID NO: 15); (ii) la secuencia de HVR-H2 es SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 16); (iii) la secuencia de HVR-H3 es IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 17) y (b) la cadena ligera comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde tambien: (iv) la secuencia de HVR-L1 es TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 18); (v) la secuencia de HVR-L2 es DVSNRPS (SEQ ID NO: 19); (vi) la secuencia de HVR-L3 es SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 20); donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende ademas: (a) secuencias de entramado de cadena pesada de region variable HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 y HC-FR4, yuxtapuestas entre las HVR, formando asi la secuencia de la formula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)- (HVR-H3)- (HC-FR4), y (b) secuencias de entramado de cadena ligera de region variable LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 y LC-FR4, yuxtapuestas entre las HVR, formando asi la secuencia de la formula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)- (HVR- L3)-(LC-FR4).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-PD-LI y usos de los mismos

Campo de la Invención

La presente solicitud se refiere a anticuerpos anti-PD-LI o sus fragmentos de unión a antígeno, ácido nucleico que los codifica, sus composiciones terapéuticas y su uso para mejorar la función de las células T para regular hacia arriba las respuestas inmunes mediadas por células y para el tratamiento de trastornos disfuncionales de células T, tal como inmunidad tumoral, para el tratamiento de cáncer.

Antecedentes de la Invención

Desarrollo y activación de linfocitos

Los dos tipos principales de linfocitos en humanos son T (derivados del timo) y B (derivados de médula ósea). Estas células se derivan de células madre hematopoyéticas en la médula ósea y en el hígado fetal que se han comprometido a la vía de desarrollo linfoide. La progenie de estas células madre sigue vías divergentes para madurar hasta convertirse en linfocitos B o T. El desarrollo de los linfocitos B humanos se lleva a cabo completamente dentro de la médula ósea. Por otra parte, las células T, se desarrollan a partir de precursores inmaduros que salen de la médula y viajan a través del torrente sanguíneo al timo, donde proliferan y se diferencian en linfocitos T maduros.

Los linfocitos maduros que emergen de la médula ósea o del timo se hallan en un estado tranquilo, o en estado de “reposo”, es decir, son mitóticamente inactivos. Cuando se dispersan en el torrente sanguíneo, estos linfocitos “sin tratar” o “vírgenes” viajan a diversos órganos secundarios o linfoides periféricos, tales como el bazo, los ganglios linfáticos o las amígdalas. La mayoría de los linfocitos vírgenes tienen una vida útil inherentemente corta y mueren al cabo de unos pocos días después de salir de la médula ósea o del timo. Sin embargo, si una célula tal recibe señales que indican la presencia de un antígeno, pueden activarse y experimentar rondas sucesivas de división celular. Algunas de las células de la progenie resultantes luego vuelven al estado de reposo para convertirse en células B y T de linfocitos de memoria que están esencialmente preparado o cableados para su siguiente encuentro con el alergeno estimulante. La otra progenie de linfocitos activados vírgenes son células efectoras, que sobreviven sólo unos pocos días, pero que llevan a cabo actividades específicas de defensa.

La activación de los linfocitos se refiere a una serie ordenada de eventos a través de los cuales pasa un linfocito en reposo como se lo estimula para que se divida y produzca progenie, algunas de las cuales se convierten en células efectoras. Una respuesta completa incluye tanto la inducción de la proliferación celular (mitogénesis) como la expresión de funciones inmunológicas. Los linfocitos se activan cuando ligandos específicos se unen a receptores en sus superficies. Los ligandos son diferentes para células T y células B, pero los mecanismos fisiológicos resultantes intracelulares son similares.

Algunos antígenos extraños de por si pueden inducir la activación de los linfocitos, especialmente antígenos poliméricos grandes que reticulan las inmunoglobulinas de superficie sobre las células B, u otras glicoproteínas sobre las células T. Sin embargo, la mayoría de los antígenos no son poliméricos e incluso la unión directa a las células B en un gran número no resulta en la activación. Estos antígenos más comunes activan las células B, cuando se los coestimula con linfocitos T cooperadores cercanos. Tal estimulación puede producirse a partir de las linfoquinas secretadas por la célula T, pero se transmite más eficientemente por contacto directo de la célula B con proteínas de superficie de células T que interactúan con determinados receptores de superficie de células B de manera de generar una señal secundaria.

Células T

Los linfocitos T no expresan inmunoglobulinas, pero, en lugar de ello detectan la presencia de sustancias extrañas por medio de proteínas de superficie llamadas receptores de células T (TCR, por sus siglas en inglés). Estos receptores reconocen antígenos sea por contacto directo sea por el hecho de medio de influir en la actividad de otras células inmunitarias. Junto con los macrófagos, las células T son el principal tipo celular implicado en la inmunidad mediada por células.

A diferencia de las células B, las células T pueden detectar sustancias extrañas sólo en contextos específicos. En particular, los linfocitos T reconocerán una proteína extraña sólo si se escinde primero en péptidos pequeños, que luego son presentados sobre la superficie de una segunda célula huésped, llamada célula presentadora de antígeno (APC, por sus siglas en inglés). Muchos tipos de células hospederas pueden presentar antígenos bajo ciertas condiciones, pero determinados tipos están más específicamente adaptados para este propósito y son especialmente importantes en el control de la actividad de las células T, inclusive de los macrófagos y otras células B. La presentación del antígeno depende en parte de proteínas específicas, llamadas proteínas de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés), sobre la superficie de las células presentadoras. Por lo tanto, para estimular la inmunidad mediada por células, es necesario presentar péptidos extraños a las células T en combinación con péptidos del MHC, y esta combinación debe ser reconocida por un receptor de células T.

Existen dos importantes subconjuntos de células T: los linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) (o células Tc)) y linfocitos T cooperadores (Th), que aproximadamente pueden ser identificados sobre la base de la expresión de la superficie celular del marcador CD8 y CD4. Las células Tc son importantes en la defensa viral y pueden matar los virus directamente por el hecho de reconocer determinados péptidos virales expresados en la superficie de la célula. Las células Th promueven la proliferación, maduración y función inmunológica de otros tipos de células, por ejemplo, la secreción de linfoquinas para controlar las actividades de las células B, macrófagos y células T citotóxicas. Tanto los linfocitos T como los dato memoria normalmente permanecen en el estado de reposo, y en este estado no presentan una actividad cooperadora ni citotóxica significativas. Cuando se activan, estas células experimentan varias rondas de división mitótica para producir células hijas. Algunas de estas células hijas vuelven al estado de reposo como células de memoria, pero otras se convierten en células efectoras que expresan de forma activa una actividad cooperadora o citotóxica. Estas células hijas se parecen a sus genitores. Las células CD4+ pueden sólo producir progenie c D4+, mientras que las células CD8+ producen sólo progenie CD8+. Las células T efectoras expresan marcadores de superficie celular que no se expresan en células T en reposo, tales como CD25, CD28, CD29, CD40L, receptores de transferrina y proteínas de clase II del MHC. Cuando se retira la actividad estimulante, la actividad citotóxica o cooperadora disminuye gradualmente durante un período de varios días a medida que las células efectoras, o bien mueren o vuelven al estado de reposo. De manera similar a la activación de las células B, las respuestas de los linfocitos T a la mayoría de los antígenos también requieren dos tipos de estímulos simultáneos. El primero es el antígeno que, si está debidamente presentado por las proteínas del MHC sobre una célula presentadora de antígeno, puede ser reconocido y unido por receptores de células T. Aunque este complejo antígeno-MHC de hecho envía una señal al interior de la célula, por lo general es insuficiente para producir una activación de las células T. La activación completa, tal como ocurre con las células T cooperadoras, requiere la coestimulación con otros ligandos específicos llamados coestimuladores que se expresan en la superficie de la célula presentadora de antígeno. La activación de una célula T citotóxica, por otra parte, requiere generalmente IL -2, una citocina secretada por la activación de células T cooperadoras.

Ruta de PD-1

Una importante señal negativa coestimuladora que regula la activación de células T es provista el receptor 1 de muerte programada (PD-1) (CD279), y sus socios de unión a ligando PD-L1 (B7-H1, CD274) y PD L2-(B7-DC, CD273). El papel regulador negativo de PD-1 fue revelado por PD-1 knock outs (Pdcdl -/-), que son propensos a la autoinmunidad. Nishimura et al, JJ Immunity: 141-51 (1999); Nishimura et al, Science 291. 319-22 (2001). El PD-1 está relacionado con CD28 y CTLA-4, pero carece de la cisteína proximal de membrana que permite la homodimerización. El dominio citoplásmico de PD-1 contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado en tiorina (ITIM, V/IxYxxL/V). El PD-1 sólo se une a PD-L1 y L2-DP. Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1-9 (2000); Dong et al, Nature Med. 5: 1365-1369 (1999); Latchman et al, Nature Immunol 2: 261-268 (2001); Tseng et al, J. Exp. Med. 193: 839-846 (2001).

El PD-1 puede ser expresado en células T, células B, células T asesinas naturales, monocitos activados y células dendríticas (DCs, dendritic cells). El PD-1 se expresa por células T activadas, pero no por no estimuladas CD4+ y CD8+, células B y las células mieloides. Esto está en contraste con la expresión más restringido de CD28 y CTLA-4. Nishimura et al, Int. Immunol. 8: 773-80 (1996); Boettler et al, J. Virol. 80: 3532-40 (2006). Hay al menos 4 variantes de PD-1 que han sido clonados a partir de células T activadas humanas, incluidas las transcripciones que carecen de (i) el exón 2, (ii) el exón 3, (iii) los exones 2 y 3 o (iv) los exones 2 a 4. Nielsen et al, Cell. Immunol. 235: 109-16 (2005). Con la excepción de PD-IAex3, todas las variantes se expresan en niveles similares a los de PD-1 de longitud completa en células mononucleares de sangre periférica en reposo (PBMCs, por sus siglas en inglés). La expresión de todas las variantes se induce significativamente al activarse las células T humanas con anti-CD3 y anti-CD28. Las variantes de PD-1Aex3 carecen de un dominio transmembrana, y se asemeja a CTLA-4 soluble, que juega un papel importante en la autoinmunidad. Ueda et al, Nature 423: 506-11 (2003). Esta variante está enriquecida en el líquido sinovial y en los sueros de pacientes con artritis reumatoide. Wan et al, J. Immunol. 177: 8844-50 (2006). Los dos ligandos PD-1 difieren en sus patrones de expresión. El PD-L1 se expresa constitutivamente en células de ratón T y B, CD, macrófagos, células madre mesenquimales de la médula ósea y células derivadas de mastocitos. Yamazaki et al, J. Immunol. 169: 5538-45 (2002). El PD-L1 se expresa en una amplia gama de células no hematopoyéticas (por ejemplo, córnea, pulmón, epitelio vascular, células hepáticas no parenquimales, células madre mesenquimales, islotes pancreáticos, sinctiotrofoblastos de placenta, queratinocitos, etc.) [Keir et al, Annu. Rev. Immunol. 26: 677-704 (2008)], y se regula ascendentemente en una serie de tipos de células después de la activación. Ambos tipos de interferón (IFN) I y II regulan ascendentemente el PD-L1. Eppihimer et al, Microcirculation 9: 133-45 (2002); Schreiner et al, J. Neuroimmunol 155: 172-82 (2004). La expresión de PD-L1 en líneas celulares disminuye cuando se inhiben MyD88, TRAF6 y MEK. Liu et al, Blood Ho : 296-304 (2007). El JAK2 también se ha implicado en la inducción de PD-L1. Lee et al, FE^bS Lett. 580: 755-62 (2006), Liu et al, Blood HO: 296-304 (2007). La pérdida o inhibición de fosfatasa y de homólogo de tensina (PTEN), una fosfatasa celular que modificó la señalización de fosfaidilinosital 3-cinasa (PI3K) y de Akt, aumentó la expresión de PD-L1 postranscripcional en los cánceres. Parsa et al, Nat. Med. 13: 84-88 (2007). La expresión de PD-L2 expresión es más restringida que la del PD-L1. El PD-L2 se expresa de manera inducible en DCs, macrófagos y mastocitos derivados de médula ósea. El PD-L2 también se expresa en alrededor la mitad a dos tercios de las células BI peritoneales en reposo, pero no en las células B convencionales B2. Zhong et al, Eur. J. Immunol. 37: 2405-10 (2007). Las células PD-L2+ BB1 ligan la fosfatidilcolina y pueden ser importante para la inmunorrespuestas innatas contra los antígenos bacterianos. La inducción de la PD-L2 If N -y depende parcialmente de NF-KB. Liang et al, Eur. J. Immunol. 33_: 2706-16 (2003). El PD-L2 también puede ser inducido en monocitos y macrófagos mediante GM-CF, IL-4 e y IFN-y. Yamazaki et al., J. Immunol. 169: 5538-45 (2002); Loke et al, PNAS 100:5336-41 (2003).

Típicamente, la señalización de PD-1 tiene un mayor efecto sobre la producción de citocinas que sobre la proliferación celular, con efectos significativos en IFN-y, TNF-a y la producción de IL-2. La señalización inhibidora medida por PD-1 también depende de la intensidad de la señalización de TCR, con una mayor inhibición presentada en niveles bajos de estimulación por TCR. Esta reducción puede ser superada mediante la coestimulación por CD28 [Freeman et al, J. Exp. Med. 192: 1027-34 (2000)] o la presencia de IL-2 [Carter et al, Eur. J. Immunol. 32: 634-43 (2002)]. Aumenta la evidencia de que la señalización a través de PD-L1 y L2-DP puede ser bidireccional. Es decir, además de modificar la señalización de TCR o BCR, la señalización también puede ser entregada de regreso a las células que expresan PD-L1 y PD-L2. Mientras que el tratamiento de las células dendríticas con un anticuerpo anti-PD-L2 naturalmente humano aislado de un paciente con macroglobulinemia de Waldenstrom no demostró regular ascendentemente las moléculas coestimuladoras MHC II o B7, las células produjeron una mayor cantidad de citocinas proinflamatorias, en particular TNF-a y IL - 6, y la proliferación de células T estimuladas. Nguyen et al, J. Exp. Med. 196: 1393-98 (2002). El tratamiento de ratones con este anticuerpo también reforzó: (1) una resistencia a melanoma bl6 transplantado y al CTL específico para tumores, rápidamente inducido. Radhakrishnan et al, J. Immunol. 170: 1830-38 (2003); Radhakrishnan et al, Cancer Res. 64: 4965 72 (2004); Heckman et al, Eur. J. Immunol. 37: 1827-35 (2007); (2) bloqueó el desarrollo de la enfermedad de las vías respiratorias inflamatorias en un modelo murino de asma alérgica. Radhakrishnan et al, J. Immunol. 173: 1360-65 (2004); Radhakrishnan et al, J. Allergy Clin. Immunol. UJy. 668-74 (2005).

Otra prueba de la señalización inversa en células dendríticas (“DCs”, dendritic cells) resulta de los estudios de DCs derivadas de médula ósea cultivadas con PD-1 soluble (dominio PD-1 CE fusionado a la región constante de Ig - “s -PD-1”). Kuipers et al, Eur. J. Immunol. 36: 2472-82 (2006). Este SPD-1 inhibe la activación de DC y aumentó la producción de IL-10, de una manera reversible a través de la administración de anti-PD-1. Además, varios estudios muestran un receptor para PD-L1 o PD-L2 que es independiente de PD-1. El B7.1 ya ha sido identificado como un socio de unión para PD-L1. Butte et al, Inmunidad 27: 111-22 (2007). Los estudios químicos de reticulación sugieren que el PD-L1 y el B7.1 pueden interactuar a través de sus dominios similares a IgV. Las interacciones B7.1 :PD-L1 pueden inducir una señal inhibitoria en las células T.

La ligación de PD-L1 en células T CD4+ por B7.1 o ligación sobre B7.1 sobre células T CD4+ de PD-L1 entrega una señal inhibitoria. Las células T que carecen de CD28 y CTLA-4 muestran disminución de la proliferación y producción de citocinas cuando se las estimuló mediante perlas recubiertas de anti-CD3 más B7.1. En las células T que carecen de todos los receptores para B7.1 (es decir, CD28, CTLA-4 y PD L1-), la proliferación de células T y la producción de citocinas ya no fueron más inhibidas por perlas recubiertas de anti-CD3 más B7.1. Esto indica que el B7.1 actúa específicamente a través de PD-L1 sobre la célula T en ausencia de CD28 y CTLA-4. De manera similar, las células T que carecen de PD-1 mostraron una disminución de la proliferación y producción de citocinas cuando se las estimuló en presencia de perlas recubiertas de anti-CD3 más PD-L1, lo que demuestra el efecto inhibidor de PD-L1 sobre la ligación de B7.1 en las células T. Cuando las células T que carecen de todos los receptores conocidos para PD-L1 (es decir, sin PD 1 -n i B7.1), la proliferación de células T ya no estaba afectada por las perlas recubiertas de anti-CD3 más PD-L1. Por lo tanto, el PD-L1 puede ejercer un efecto inhibidor sobre las células T a través de B7.1 o 1-PD.

La interacción directa entre B7.1 y PD-L1 sugiere que la comprensión actual de la coestimulación es incompleta, y pone de relieve la importancia de la expresión de estas moléculas sobre las células T. Los estudios de células T PD-L1 - / -indican que el PD-L1 en las células T pueden regular a la baja la producción de citocinas de células T. Latchman et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10691-96 (2004). Debido a que tanto PD-L1 como B7.1 se expresan en células T, las células B, las DCs y los macrófagos, existe el potencial de interacciones direccionales entre B7.1 y PD-L1 sobre estos tipos de células. Además, el PD-L1 en células no hematopoyéticas puede interactuar con B7.1 así como también con PD-1 en las células T, lo que plantea la cuestión de si el PD-L1 está implicado en su regulación. Una posible explicación para el efecto inhibidor de la interacción B7.1: PD-L1 es que las células T PD-L1 pueden atrapar o segregar de manera de removerlo, el APC B7.1 de la interacción con CD28.

Como resultado de ello, el antagonismo de la señalización a través de PD-L1, incluyendo el bloqueo de PD-L1, de la interacción con cualquiera de PD-1, B7.1 o ambos, evitándose de este modo que el PD-L1 envíe una señal coestimuladora negativa de las células T y otras células presentadoras de antígenos, es probable que refuercen la inmunidad en respuesta a la infección (por ejemplo, aguda y crónica) y la inmunidad tumoral. Además, los anticuerpos anti-PD-L1 de la presente invención, se pueden combinar con antagonistas de otros componentes de PD-1: PD-L1 de señalización, por ejemplo, el antagonista anti-PD-1 y los anticuerpos anti-PD-L2.

En particular, la inhibición de la señalización de PD-L1 ha sido propuesta como un medio para reforzar la inmunidad de células T para el tratamiento de cáncer (por ejemplo, inmunidad tumoral) y la infección, lo que incluye tanto la infección aguda como la crónica (por ejemplo, persistente).

Los inhibidores que bloquean la interacción PD-L1: La interacción de PD-1 se conocen a partir de, entre otros, los documentos WO2001014557, WO2002086083, EP1537878A1 (WO2004004771), WO2007005874, WO2010036959, WO2010077634 y WO2011066389. Nomi Takeo et al., Clin. Cáncer Res. 13(7) (2007), 2151-57, describe el tratamiento de cáncer pancreático con una combinación de un anticuerpo anti-PD-L1 y gemcitabina. Sin embargo, como aún no se ha comercializado una terapéutica óptima dirigida a un objetivo en esta ruta, existe una importante necesidad médica no satisfecha.

Descripción de la invención

Es un objeto de la presente invención para proporcionar anticuerpos anti-PD-L1, incluyendo ácidos nucleicos que codifican y composiciones que contienen estos anticuerpos y su uso para mejorar la función de células T para regular hacia arriba respuestas inmunes mediadas por células y para el tratamiento de trastornos disfuncionales de células T, como inmunidad tumoral. De modo sorprendente, se halló que los anticuerpos anti-PD-L1 de acuerdo con la presente invención, que tienen una actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés), actúan directamente sobre PD-L1 que llevan células tumorales induciendo su lisis sin mostrar ninguna toxicidad significativa. Más aún, los anticuerpos no sólo bloquean la interacción entre PD-L1 humano y PD-1 humano, sino también las interacciones entre las respectivas proteínas de ratón y mono cynomolgus.

En una realización la invención proporciona un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde también: (i) la secuencia de HVR-H1 es SYIMM (SEQ ID NO: 15); (ii) la secuencia de HVR-H2 es SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 16); (iii) la secuencia de HVR-H3 es IKLGTVTTVDY, y (SEQ ID NO: 17);

(b) la cadena ligera comprende una HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, en donde también: (iv) la secuencia de HVR-L1 es TGTSSDVGGYNYVS (SEQ ID NO: 18); (v) la secuencia de HVR-L2 es DVSNRPS (SEQ ID NO: 19); (vi) la secuencia de HVR-L3 es SSYTSSSTRV (SEQ ID NO: 20);

La región variable de cadena pesada comprende una o varias secuencias de entramado yuxtapuestas entre las HVR como: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4) y las regiones variables de cadena ligera comprende una o varias secuencias de entramado yuxtapuestas entre las HVR como: (LC-FR1 )-(HVR-L1 )-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR- L3)-(LC-FR4).

En un aspecto adicional, las secuencias de entramado se derivan de secuencias de entramado consenso humanas o secuencias germinales humanas.

En un aspecto todavía adicional, una o varias de las secuencias de entramado de cadena pesada son las siguientes: HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO:4);

HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO:5);

HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:6);

HC-FR4 es WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:7).

En un aspecto todavía adicional, las secuencias de entramado de cadena ligera son secuencias de cadena ligera lambda. En un aspecto todavía adicional, una o varias de las secuencias de entramado de cadena ligera son las siguientes: LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO:11);

LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO:12);

LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC; (SEQ ID NO:13);

LC-FR4 es FGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 14).

En un aspecto todavía adicional, el polipéptido de región variable de cadena pesada, anticuerpo o fragmento de anticuerpo también comprende al menos un dominio Ch1.

En un aspecto más específico, el polipéptido de región variable de cadena pesada, anticuerpo o fragmento de anticuerpo también comprende un dominio Ch1, Ch2 y Ch3.

En un aspecto todavía adicional, la cadena ligera de región variable, anticuerpo o fragmento de anticuerpo también comprende un dominio Cl.

En un aspecto todavía adicional, el anticuerpo también comprende un dominio Ch1, Ch2, Ch3 y Cl.

En un aspecto específico todavía adicional, el anticuerpo también comprende una región constante humana o murina. En un aspecto todavía adicional, la región constante humana está seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4.

En otro aspecto más específico, la región constante humana o murina es IgG1.

El anticuerpo se une con PD-L1 humano, murino o de mono cynomolgus. En un aspecto específico, el anticuerpo es capaz de bloquear la interacción entre PD-L1 humano, murino o de mono cynomolgus y los respectivos receptores de PD-1 humano, murino o de mono cynomolgus.

En otra realización, más, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti— PD-L1 antes descritos en combinación con al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

En otra realización más, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido o cadena ligera una secuencia de región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-PD-L1 o su fragmento de unión a antígeno, tal como se describe en la presente.

En otro aspecto el ácido nucleico es SEQ ID NO:30 para la cadena pesada y SEQ ID NO:31 para la cadena ligera En otro aspecto, el ácido nucleico también comprende un vector apropiado para la expresión del ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 previamente descritos.

En otro aspecto más específico, el vector también comprende una célula huésped apropiada para la expresión del ácido nucleico.

En otro aspecto más específico, la célula huésped es una célula eucariota o una célula procariota.

En otro aspecto más específico, la célula eucariota es una célula de mamífero como de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés).

En otra realización más, la invención proporciona un proceso de preparación de un anticuerpo anti-PD-L1 o su fragmento de unión a antígeno, que comprende cultivar una célula huésped que contiene ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-PD-L1 antes descritos o fragmento de unión a antígeno en una forma apropiada para expresión, en condiciones apropiadas para producir este anticuerpo o fragmento y recuperación del anticuerpo o fragmento.

En otra realización más, la invención proporciona un kit de partes que comprende un recipiente que incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita en la presente y un inserto de envase que indica el uso para el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T.

En otra realización más, la invención proporciona un kit de partes que comprende cualquiera de las composiciones de anti-PD-L1 antes descritas en combinación con al menos otro agente terapéutico, como un agente quimioterapéutico. En un aspecto, el al menos un agente quimioterapeutico es gemcitabina, ciclofosfamida, fluorouracilo u oxaliplatino. Aún en otra realización, la invención proporciona una cantidad eficaz de los anticuerpos anti-PD-LI descritos anteriormente o composiciones para su uso en la mejora de la función de células T.

En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-L1 o composición vuelve no disfuncionales a las células T disfuncionales.

Según la descripción, el anticuerpo o composición trata o previene un síntoma de infección persistente, como infección viral, por ejemplo, por virus de inmunodeficiencia humana (VIH), herpes virus, virus Eppstein-Barr o virus de papiloma humano.

Aún en otra realización, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anti-PD-LI descritos anteriormente o composiciones para su uso en el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T.

En un aspecto específico, el trastorno disfuncional de células T es inmunidad tumoral.

En un aspecto todavía adicional, el anticuerpo PD-L1 o composición se combina con un régimen de tratamiento que comprende además una terapia tradicional seleccionada del grupo que consiste en: cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia dirigida, inmunoterapia, terapia hormonal, inhibición de angiogénesis y cuidados paliativos.

En otro aspecto más específico, la inmunidad tumoral resulta de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de mama, de pulmón, de colon, de ovario, melanoma, de vejiga, de riñón, de hígado, de saliva, de estómago, gliomas, de tiroides, tímico, epitelial, cánceres de cabeza y de cuello, cáncer gástrico y de páncreas.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo anti-PD-L1 revelado en la presente o composición en el tratamiento del cáncer. Por tanto, la invención se refiere a una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-PD-LI que induce citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) para su uso en el tratamiento del cáncer.

En una realización preferida, la región constante del anticuerpo anti-PD-L1 es IgG1.

En otra realización preferida, el cáncer está seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de mama, de pulmón, de colon, de ovario, melanoma, de vejiga, de riñón, de hígado, de saliva, de estómago, gliomas, de tiroides, tímico, epitelial, cánceres de cabeza y de cuello, cáncer gástrico y de páncreas.

De forma equivalente a los usos antes mencionados para la mejora de la función de las células T, tratamiento de un trastorno disfuncional de células T o tratamiento del cáncer, la invención se refiere asimismo al uso de un anticuerpo anti— PD-L1 o composición tal como se describe antes y después para la fabricación de un medicamento para la mejora de la función de células T, tratamiento de un trastorno disfuncional de células T o tratamiento del cáncer; o a un anticuerpo anti-PD-L1 o composición para usar en la mejora de la función de células T o el tratamiento de un trastorno disfuncional de células T o cáncer.

Definiciones

“Disfunción” en el contexto de disfunción inmune, se refiere a un estado de capacidad de respuesta inmunorreducida a la estimulación antigénica. El término incluye los elementos comunes de agotamiento y/o anergia en donde puede producirse el reconocimiento de antígeno, pero la consiguiente respuesta inmune es ineficaz para controlar infección o crecimiento tumoral.

“Mejora de la función de células T” significa que induce, causa o estimula que una célula T tenga una función biológica sostenida o amplificada o renueva o reactiva las células T agotadas o inactivas. Los ejemplos para mejorar la función de las células T incluyen: mayor secreción de Y-interferón de células T CD8+, mayor proliferación, mayor capacidad de respuesta a antígeno (por ejemplo, depuración viral o patogénica) respecto de tales niveles antes de la intervención. En una realización, el nivel de mejora es de al menos el 50%, de modo alternativo 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 150%, 200%. La manera de medir esta mejora es conocida por un experto en la técnica.

Un “trastorno disfuncional de células T” es un trastorno o condición de células T caracterizado por una menor capacidad de respuesta a la estimulación antigénica. En una realización particular, un trastorno disfuncional de células T es un trastorno que se asocia específicamente con una mayor señalización inapropiada a través de PD-1. En otra realización, el trastorno disfuncional de células T es uno en el que las células T son anérgicas o tienen menor capacidad de segregar citocinas, proliferar o ejecutar una actividad citolítica. En un aspecto específico, la menor capacidad de respuesta da como resultado un control ineficaz de un patógeno o tumor que expresa un inmunógeno. Los ejemplos de trastornos disfuncionales de células T caracterizados por disfunción de células T incluyen infección aguda no resuelta, infección crónica e inmunidad tumoral.

“Inmunidad tumoral” se refiere al proceso en donde los tumores evaden el reconocimiento inmune y la remisión. De este modo, como un concepto terapéutico, la inmunidad tumoral se “trata” cuando se atenúa la evasión y los tumores son reconocidos y atacados por el sistema inmune. Los ejemplos del reconocimiento tumoral incluyen unión a tumores, reducción tumoral y remisión tumoral.

El término “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud total que tienen una región de inmunoglobulina Fc), composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos {por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena simple, así como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv). El término “inmunoglobulina” (Ig) se usa indistintamente con “anticuerpo” en la presente. La unidad de anticuerpo básica de 4 cadenas es una glicoproteína heterotetramérica de dos cadenas livianas idénticas (L) y dos cadenas pesadas idénticas (H). Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetraméricas básicas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J y contiene 10 sitios de unión a antígeno, mientras que los anticuerpos de IgA comprenden 2-5 de las unidades básicas de 4 cadenas que pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de IgG, la unidad de 4 cadenas es, en general, de aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena L está ligada a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H se unen entre sí por uno o varios enlaces disulfuro en función del isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados de forma regular. Cada cadena H tiene en el extremo terminal N un dominio variable (Vh) seguido de tres dominios constantes (Ch) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios Ch para los isotipos |j y e. Cada cadena L tiene en el extremo terminal N un dominio variable (Vl) seguido de un dominio constante en su otro extremo. El Vl está alineado con Vh y el Cl está alineado con el primero dominio constante de la cadena pesada (Ch1). Se cree que los residuos particulares de aminoácidos forman una interface entre los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Los pares de Vh y Vl forman juntos un sitio individual de unión a antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr y Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y Capítulo 6. La cadena L de cualquier especie vertebrada se puede asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, 5, e, y y j , respectivamente. Las clases y y a se dividen también en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores en la secuencia de CH y función, por ejemplo, humanos que expresan las siguientes subclases: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 y IgK1.

Un anticuerpo “aislado” es uno que fue identificado, separado y/o recuperado de un componente de su ambiente de producción (por ejemplo, natural o recombinante). Con preferencia, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los demás componentes de su ambiente de producción. Los componentes contaminantes de su ambiente de producción, de modo que resulten de células transfectadas recombinantes, son materiales que típicamente interferirían con la búsqueda, los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones preferidas, el polipéptido se purificará: (1) a más del 95% en peso del anticuerpo tal como se determina, por ejemplo, por el método de Lowry y en algunas realizaciones, a más del 99% en peso; (1) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por uso de un secuenciador “spinning cup” o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras usando azul Coomassie o, con preferencia, tinción de planta. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes dado que al menos un componente del ambiente natural de anticuerpo no estará presente. Sin embargo, de forma ordinaria, un polipéptido o anticuerpo aislado se preparará por medo de al menos una etapa de purificación.

La “región variable” o “dominio variable” de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera el anticuerpo. Los dominios variables de la cadena pesada y ligera se pueden mencionar como “VH” y “VL”, respectivamente. Estos dominios son en general las partes más variables del anticuerpo (respecto de otros anticuerpos de la misma clase) y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término “variable” se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensivamente en la secuencia entre anticuerpos. El dominio V media la unión con antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye de forma pareja a través de toda la extensión de los dominios variables. En lugar de ello, se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVRs) tanto en los dominios variables de cadena ligera como pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan regiones de entramado (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y livianas nativas que comprenden cada una cuatro regiones FR, adoptando ampliamente una configuración beta-laminar, conectados por tres HVRs, que forman bucles que se conectan y que en algunos casos forman parte de la estructura beta-laminar. Las HVRs en cada cadena se mantienen juntas en cercana proximidad por las regiones FR y, con las HVRs de la otra cadena, contribuyen con la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no participan directamente en la unión del anticuerpo con un antígeno, pero exhibe diversas funciones efectoras, como la participación de la toxicidad celular dependiente de anticuerpos.

La expresión “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto respecto de posibles mutaciones y/o modificaciones postraducción (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que ocurren naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto a que pueden ser sintetizados por el cultivo de hibridoma sin contaminaciones de otras inmunoglobulinas. El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos y no se ha de construir como producción requerida del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para usar de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por medio de una variedad de técnicas que incluyen, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)), métodos de ADN recombinantes (ver, por ejemplo, patente U. S. N.° 4.816.567), tecnologías de desarrollo de fagos (ver, por ejemplo, Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al, J. Mol Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. ScL USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o de tipo humanos en animales que tienen partes o todos los loci o genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, los documentos WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes estadounidenses n.os. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnol 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

Un “fragmento de anticuerpo” comprende una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia la región de unión a antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y los fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver la patente de los Estados Unidos N.° 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8HO): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de los anticuerpos produjo dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, y un fragmento residual “Fc”, una designación que refleja la capacidad para cristalizar fácilmente. El fragmento Fab consiste en toda una cadena L además del dominio de la región variable de la cadena H (Vh), y el primer dominio constante de una cadena pesada (Ch1). Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la unión a antígeno, es decir, posee un único sitio de unión a antígeno.

El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento grande F(ab')2 que grosso modo se corresponde con dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro que tienen actividad de unión a antígeno divalente e incluso es capaz de formar enlaces cruzados con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el extremo terminal carboxi del dominio Ch1 incluso una o varias cisteínas provenientes de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab', en donde el(os) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo originalmente se producían como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos de fragmentos de anticuerpo.

El fragmento Fc comprende las porciones carboxiterminales de ambas cadenas H que se mantienen unidas mediante disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias de la región Fc, en donde la región también es la parte reconocida por los receptores Fc (FcR) que se encuentra en ciertos tipos de células.

“Fv” es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de unión a antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y un dominio de región variable de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis giros hipervariables (3 giros de cada una de las cadenas H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos en la fijación del antígeno y confieren especificidad de unión a antígeno con el anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable aislado (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicos para un antígeno) tiene capacidad para reconocer y unir el antígeno, aunque con menor afinidad que la totalidad del sitio de unión. “Fv monocatenario” también abreviado “sFv” o “scFv” son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpo conectados en una única cadena de polipéptidos. Con preferencia, el polipéptido sFv también comprende un ligador de polipéptido entre los dominios Vh y Vl, lo cual permite al sFv formar la estructura deseada para la unión a antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994). “Fragmentos funcionales” de los anticuerpos de la invención comprenden una porción de un anticuerpo intacto, en general, incluyendo la región de unión a antígeno o región variable del anticuerpo intacto o la

región Fc de un anticuerpo que retiene o tiene una capacidad de unión a FcR modificada. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpo lineal, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo.

El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo preparados al construir fragmentos sFv (ver el párrafo precedente) con ligadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios Vh y Vl de manera tal que se logra el apareamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, lo cual da por resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv “de cruzamiento” en los cuales los dominios Vh y Vl de los dos anticuerpos se encuentren en diferentes cadenas de polipéptidos. Los diacuerpos se describen con mayor detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 90: 6444-6448 (1993).

El término “nanocuerpos” se refiere a anticuerpos de dominio simple que son fragmentos de anticuerpo que consisten en un dominio de anticuerpo variable monomérico simple. Como un anticuerpo completo, son capaces se unirse selectivamente con un antígeno específico. Con un peso molecular de sólo 12-15 kDa, los anticuerpos de dominio simple son mucho más pequeños que los anticuerpos comunes (150-160 kDa). Los primeros anticuerpos de dominio simple se manipularon por ingeniería de anticuerpos de cadena pesada hallados en los camélidos. Gibbs, W. Wait (August 2005). “Nanobodies”. Scientific American Magazine.

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena es idéntico u homólogo a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente U. S. N.° 4.816.567; Morrison et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA, 81:6851-6855 (1984)). Tal como se usa en la presente, “anticuerpo humanizado” se usa un subgrupo de “anticuerpos quiméricos”.

Las formas “humanizadas” de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen mínimas secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual los residuos provenientes de una HVR (definida en la presente más abajo) del receptor están reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donante) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En ciertas instancias, los residuos de entramado (“FR”) de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Por otra parte, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se hallan en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar más el rendimiento del anticuerpo, como afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables se corresponden con aquellos de una secuencia de inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las regiones de FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana, a pesar de que las regiones de FR pueden incluir una o varias sustituciones de residuos de FR individuales que mejoran el rendimiento del anticuerpo, tales como afinidad de unión, isomerización, inmunogenicidad, etc. La cantidad de estas sustituciones de aminoácidos en FR son típicamente no más de 6 en la cadena H y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver, por ejemplo, Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también, por ejemplo, Vaswany y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 : 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y patentes U. S. . n° 6.982.321 y 7.087.409.

Un “anticuerpo humano” es un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se preparó usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos tal como se reveló en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de desarrollo de fagos. Hoogenboom y Winther, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descritos en Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.

77 (1985); Boerner et al, J. Immunol, 147(l):86-95 (1991). Ver también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos se pueden preparar administrando el antígeno a un animal transgénico que fue modificado para producir estos anticuerpos en respuesta a la estimulación antigénica, pero cuyos loci endógenos se han desactivado, por ejemplo, xenorratones inmunizados (ver, por ejemplo, las patentes U. S. Nros. 6.075.181 y 6.150.584 respecto de la tecnología XENOMOUSE™). Ver también, por ejemplo, Li et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557--3562 (2006) respecto de los anticuerpos humanos generados por una tecnología de hibridoma de células B humanas.

Las expresiones “región hipervariable” “HVR” o “HV” cuando se usan en la presente se refieren a las regiones de un dominio de anticuerpo variable que son hipervariables en secuencia y/o forman lazos estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos comprenden seis regiones hipervariables; tres en VH (H1, H2, H3), y tres en VL (L1, L2, L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 desempeñan la máxima diversidad de las seis HVR y se cree que H3 en particular desempeña un papel único para conferir una especificidad fina a los anticuerpos. Ver, por ejemplo, Xu et al, Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De hecho, los anticuerpos de camélido naturales que consisten en una cadena pesada sólo son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera Ver, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al, Nature Struct. Biol.

3:733-736 (1996).

Una cantidad de delineaciones de HVR están en uso y están comprendidas en la presente. Las regiones determinantes de complementariedad Kabat (CDR) se basan en la variabilidad de secuencias y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chotia se refiere, por el contrario, a la ubicación de los bucles estructurales (Chotia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las HVR de a AbM representan un compromiso entre los bucles estructurales de HVR de Kabat y Chotia y son usadas por el software de modelaje de anticuerpos Oxford Molecular's AbM.

Las HVRs de “contacto” se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVR se enumeran más abajo.

Bucle Kabat AbM Chotia Contacto

L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36

L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55

L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96

H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B

(numeración de Kabat)

H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35

(numeración de Chotia)

H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58

H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

Las HVR pueden comprender “HVR extendidas” de la siguiente manera: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 ó 50-56 (L2) y 89 97 u 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (H1), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH. Los residuos del dominio variable se numeran de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones.

La expresión “numeración de residuo de dominio variable como en Kabat” o “numeración de la posición de aminoácido como en Kabat” y sus variaciones, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menor cantidad o aminoácidos adicionales correspondientes a un acortamiento o inserción en una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un inserto individual de aminoácido (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo FR de cadena pesada 82. La numeración de Kabat de residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia de numeración de Kabat “estándar”.

Residuos “de entramado” o “FR” son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de HVR tal como se define en la presente. Un “entramado consenso humano” o “entramado humano aceptador” es un entramado que representa los residuos de aminoácidos que ocurren más comúnmente en una selección de secuencias de entramado de v L o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias de VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Los ejemplos incluyen para la VL el subgrupo kappa I, kappa II, kappa III o kappa IV como en Kabat et al, supra. Además, para la VH, el subgrupo puede ser subgrupo I, subgrupo II o subgrupo III como en Kabat et al., supra. De modo alternativo, un entramado consenso humano se puede derivar de lo anterior donde los residuos particulares, como cuando un residuo entramado humano está seleccionado en base a su homología con el entramado donante al alinear la secuencia de entramado donante con una colección de diversas secuencias de entramado humanas. Un entramado humano aceptador “derivado de” un entramado de inmunoglobulina humana o un entramado consenso humano puede comprender su misma secuencia de aminoácidos o puede contener cambios de secuencia de aminoácidos preexistentes. En algunas realizaciones, la cantidad de cambios de aminoácidos preexistentes es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos o 2 o menos.

Una “modificación de aminoácido” a una posición especificada, por ejemplo, de la región Fc, se refiere a la sustitución o supresión del residuo especificado o la inserción de al menos un residuo de aminoácido adyacente al residuo especificado. La inserción “adyacente” en un residuo especificado implica la inserción dentro de uno de sus dos residuos. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal en el residuo especificado. La modificación de aminoácido preferido en la presente es una sustitución.

Un anticuerpo “madurado por afinidad” es uno con una o varias alteraciones en una o varias de sus HVR que resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo principal que no posee esas alteraciones. En una realización, un anticuerpo maduro por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno blanco. Los anticuerpos maduros por afinidad se producen por medio de procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe maduración por afinidad por intercambio de dominio VH y Vl . La mutagénesis aleatoria de HVR y/o residuos de entramado se describe, por ejemplo, por: Barbas et al. Proc Nat. Acad. ScL USA 91 :3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); YáXon et al. J. Immunol.

155:1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154(7):3310- 9 (1995); y Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Tal como se usa en la presente, la expresión “se une específicamente con” o “es específico de” se refiere a interacciones mensurables y reproducibles tales como unión entre un blanco y un anticuerpo, que es determinante de la presencia del objeto en presencia de una población heterogénea de moléculas que incluyen moléculas biológicas. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente con un blanco (que puede ser un epítopo) es un anticuerpo que une este objeto con mayor afinidad, avidez, con mayor facilidad y/o con mayor duración que cuando se une con otros blancos. En una realización la extensión de unión de un anticuerpo a un blanco no relacionado es inferior a aproximadamente el 10% de la unión del anticuerpo con el blanco tal como se mide, por ejemplo, por un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas realizaciones un anticuerpo que se une específicamente con un blanco que tiene una constante de disociación (Kd) de < 1x10-6M, < 1x10-7M, < 1x10-8M, < 1x10-9M o < 1x10-10M. En ciertas realizaciones, un anticuerpo se une específicamente con un epítopo en una proteína que se conserva entre las proteínas de diferentes especies. En otra realización, la unión específica puede incluir, pero no requiere de una unión exclusiva.

“Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos” o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada ligada a receptores Fc (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente con una célula blanco portadora de antígeno y posteriormente maten la célula blanco con citotoxinas. Los anticuerpos “abrazan” las células citotóxicas y se requieren para matar la célula blanco por este mecanismo. Las células primarias para mediar ADCC, células Nk , expresan FcyRIII sólo, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de Fc en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede llevar a cabo un ensayo ADCC in vitro, tal como se describe en la patente U.S. N° 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras de utilidad para estos ensayos incluyen células mononucleares de la sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y células asesinas naturales (NK). De modo alternativo o adicional, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el revelado en Clynes et al, PNAS USA 95:652-656 (1998). A menos que se indique otra cosa en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice EU como en Kabat et al, supra. El “índice EU como en Kabat” se refiere a la numeración de los residuos del anticuerpo EU de IgG1 humana. En muchos cánceres, las células tumorales expresan altos niveles de PD-L1 sobre su superficie. Después de la unión con PD-L1 en células tumorales y la unión con su parte cristalina del fragmento (Fc) con los receptores Fc-gamma (FCGR, por sus siglas en inglés) en leucocitos, los anticuerpos anti-PD-L1 con ADCC potencial pueden disparar ADCC que puede llevar a la muerte de estas células tumorales.

La expresión “región Fc” en la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo las regiones Fc de secuencia nativa y regiones Fc variantes. A pesar de que los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana se define usualmente para extenderse de un residuo de aminoácido en la posición Cys226 o de Pro230, a su extremo terminal carboxilo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fc se puede eliminar, por ejemplo, durante la producción o la purificación del anticuerpo o por manipulación por ingeniería recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 eliminados y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Las regiones Fc de secuencia nativa apropiadas para usar en los anticuerpos de la invención incluyen IgG1, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 e IgG4 humana. El “receptor Fc” o “FcR” describe un receptor que se une con la región Fc de un anticuerpo. Además, una FcR preferida es aquella que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo las variantes alélicas y las formas de corte y empalme alternativamente de estos receptores, los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un" receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de las mismas. El receptor activante FcyRIIA contiene un motivo de activación a base de inmunorreceptor tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor de inhibición FcyRIIA contiene un motivo de inhibición a base de inmunorreceptor tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico, (véase M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997). FcRs se reseñan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al, Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al, J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos por identificar en el futuro, están comprendidos por el término “FcR” en la presente.

La expresión “receptor Fc” o “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto. Guyer et al, J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). Se conocen métodos de medición de la unión con FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al, Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al, J. Biol. Chem. TJI (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al). La unión con FcRn in vivo y la vida media sérica de polipéptidos de unión de gran afinidad FcRn humana se puede ensayar, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano o en primates a los que se administran los polipéptidos que tienen una región Fc variante. El documento WO 2004/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo que mejoraron o disminuyeron la unión con FcRs. Véase también, por ejemplo, Shields et al, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

“Células efectoras” son leucocitos que expresan uno o varios FcRs y realizan funciones efectoras. En un aspecto, las células efectoras expresan al menos FcyRIII y realizan la función efectora de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células asesinas naturales (NK), monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, sangre. Las células efectoras son en general linfocitos asociados con la fase efectora y funcionan para producir citocinas (células T cooperadoras), células asesinas infectadas con patógenos (células T citotóxicas) o anticuerpos segregantes (células B diferenciadas).

La “afinidad de unión” se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión simple de una molécula (por ejemplo, de un anticuerpo) y su par de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, tal como se usa en la presente, “afinidad de unión”, “unirse con”, “se une con” o “unión con” se refiere a una afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 : 1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, fragmento de anticuerpo Fab y antígeno). La afinidad de una molécula X por su par Y puede estar representada en general por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por medio de métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo los descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad se unen en general con antígeno lentamente y tienden a disociarse con facilidad, mientras que los anticuerpos de alta afinidad se unen en general con antígeno más rápido y tienden a quedarse unidos durante más tiempo. En la técnica, se conoce una variedad de métodos de medición de afinidad de unión, cualquiera de los cuales se puede usar a los fines de la presente invención. Las realizaciones ilustrativas y de ejemplo específicas para medir la afinidad de unión, es decir, la fuerza de unión, se describen a continuación.

El “Kd” o “valor Kd” de acuerdo con esta invención se mide en una realización por medio de un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab del anticuerpo y la molécula de antígeno tal como se describe en el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión de la solución de Fabs por el antígeno al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno (125I)-rotulado en presencia de una serie de titulaciones de antígeno no rotulado, capturando luego el antígeno ligado con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al, (1999) J. MoI Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de microtitulación (Dyinex) durante la noche con 5 ug/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6) y posteriormente se bloquean con 2% (p/v) de albúmina de suero bovino en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), 100 pM o 26 pM de [125I]-antígeno se mezclan con diluciones seriales de un Fab de interés (consistente con evaluación de un anticuerpo anti-vEGF, Fab-12, en Presta et al, (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés se incuba luego durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ejemplo, 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Después de ello, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente durante una hora. La solución luego se elimina y la placa se lava ocho veces con 0.1% de Tween-20 en PBS. Cuando las placas se secaron, se añaden 150 ul/pocillo de centelleador (Micro Scint-20; Packard) y las placas se cuentan en un contador Topcount gamma (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan igual o menos del 20% de máxima unión se seleccionan para usar en ensayos de unión competitiva. De acuerdo con otra realización, el Kd se mide usando ensayos de resonancia plasmónica superficial usando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N -etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8, a 5 |jg/ml (-0.2 |jM) antes de la inyección a una tasa de flujo de 5 jL/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU, por sus siglas en inglés) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con 0.05% de tensioactivo TWEEN 20™ (PBST) a 25°C a una tasa de flujo de aproximadamente 25 jL/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión simple uno a uno Langmuir (software de evaluación BIAcore® versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y de disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación kofi/kon. Véase, por ejemplo, Chen et al, J. Mol. Biol.

293:865-881 (1999). Si la velocidad excede 10⁶M ^-1s^-1por medio del ensayo de resonancia plasmónica superficial anterior, entonces la velocidad se puede determinar usando una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o la reducción en la intensidad de la emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de pasabanda) a 25°C de 20 nM de anticuerpo antiantigénico (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de aumentar las concentraciones de antígeno cuando se midió en un espectrómetro, como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o espectrofotómetro SLM-AMINCO™ de serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Una “velocidad”, “velocidad de asociación”, “tasa de asociación” o “kon” de acuerdo con esta invención también se puede determinar tal como se describió con anterioridad usando un sistema BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, los chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (ECD) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM de acetato de sodio, pH 4.8, en 5 mg/ml (~ 0.2 mM) antes de la inyección a una tasa de flujo de 5 ml/min para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se añade IM etanolamina para bloquear grupos sin reaccionar. Para las mediciones de cinética, se inyectan diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) en PBS con 0.05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a una tasa de flujo de aproximadamente 25 ul/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (koff) se calculan usando un modelo de unión simple uno a uno Langmuir (software de evaluación BIAcore versión 3.2) por ajuste simultáneo del sensograma de asociación y de disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la relación kofi/kon. Ver, por ejemplo, Chen, Y., et al, (1999) J. MoI Biol 293:865-881. Sin embargo, si la velocidad excede 10⁶M^-1s^-1por medio del ensayo de resonancia plasmónica superficial, entonces la velocidad se determina, con preferencia, usando una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o la reducción de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de pasabanda) a 25°C de 20 nM de anticuerpo antiantigénico (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de mayores concentraciones de antígeno cuando se medía en un espectrómetro, como un espectrofotómetro equipado con detención de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (Thermo Spectronic) con una cubeta agitada.

La expresión “epítopo funcional” tal como se usa en la presente se refiere a residuos de aminoácidos de un antígeno que contribuyen energéticamente con la unión de un anticuerpo, es decir, formación de un “epítopo energético”. La mutación de cualquiera de los residuos de contribución energética del antígeno a la alanina interrumpirá la unión del anticuerpo de modo que la relación relativa Kd (Kd de PD-L1 mutante / KD de PD-L1 de tipo natural) del anticuerpo será mayor que 4 (ver el Ejemplo 3.x(b)).

La expresión “epítopo conformacional” tal como se usa en la presente se refiere a residuos de aminoácidos de antígeno de PD-L1 que van juntos sobre la superficie cuando la cadena de polipéptidos se pliega para formar la proteína nativa y muestran una velocidad significativamente reducida de intercambio de HD debido a la unión de Fab, tal como se describe en la sección experimental. El epítopo conformacional contiene, pero sin limitación, el epítopo funcional.

La frase “sustancialmente reducido” o “sustancialmente diferente” tal como se usa en la presente denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia / comparadora) de modo que un experto en el arte considerará la diferencia entre los dos valores para ser de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre los dos valores es, por ejemplo, mayor que aproximadamente el 10%, mayor que aproximadamente el 20%, mayor que aproximadamente el 30%, mayor que aproximadamente el 40%, y/o mayor que aproximadamente el 50% en función del valor para la molécula de referencia / comparadora.

La expresión “sustancialmente similar” o “sustancialmente iguales”, tal como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia / comparadora), de modo que un experto en el arte considerará la diferencia entre los dos valores sean bajos o no tengan un significado biológico y/o estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre los dos valores, por ejemplo, es inferior a aproximadamente el 50%, inferior a aproximadamente el 40%, inferior a aproximadamente el 30%, inferior a aproximadamente el 20%, y/o inferior a aproximadamente el 10% en función del valor de referencia / comparadora.

“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” y “homología” con respecto a una secuencia de péptidos, polipéptidos o anticuerpos se definen como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia específica de péptidos o polipéptidos, después de alinear las secuencias y las brechas de introducción, de ser necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación a los fines de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos se puede lograr de distintos modos que están dentro de la pericia del arte, por ejemplo, usando software de computadora disponible al público como software BLAST, BLAST-2 o ALIGN. Los expertos en el arte pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima respecto de toda la longitud de las secuencias comparadas.

Un anticuerpo de “bloqueo” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe o reduce una actividad biológica del antígeno al que se une. En algunas realizaciones, los anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno. Los anticuerpos anti-PD-LI de la invención bloquean la interacción entre PD-L1 y su receptor PD-1 y, así, la señalización a través de PD-1 de modo de restaurar una respuesta funcional por células T de un estado disfuncional a la estimulación antigénica. Un “agonista” o anticuerpo activante es uno que mejora o inicia la señalización por el antígeno al que se une. En algunas realizaciones, los anticuerpos agonistas causan o activan la señalización sin la presencia del ligando natural.

Las expresiones “compiten de forma cruzada”, “competición de forma cruzada”, “bloqueo cruzado”, “bloqueado de forma cruzada” y “bloqueo de forma cruzada” se usan de forma indistinta en la presente para implicar la capacidad de un anticuerpo o su fragmento para interferir con la unión directa o indirecta a través de la modulación alostérica de los anticuerpos anti-PD-LI de la invención con el PD-L1 humano blanco. La extensión en la que un anticuerpo o su fragmento es capaz de interferir con la unión de otro con el blanco y, por ello, si se puede decir que bloquean de forma cruzada o compiten de forma cruzada de acuerdo con la invención, se puede determinar usando ensayos de unión por competición. Un ensayo de competición cruzada cuantitativo particularmente apropiado utiliza un enfoque a base de FACS o AlfaScreen para medir la competición entre un anticuerpo rotulado (por ejemplo, con rótulo His, biotinilado o radiactivo) o su fragmento y el otro anticuerpo o su fragmento en términos de su unión con el blanco. En la sección experimental, se describe un ensayo apropiado para determinar si una molécula de unión compite de forma cruzada o es capaz de competir de manera cruzada con un anticuerpo o su fragmento. En general, un anticuerpo que compite de forma cruzada o su fragmento es por ejemplo uno que se unirá con el blanco en el ensayo de competición cruzada de modo que, durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo o su fragmento, el desplazamiento registrado del dominio variable simple de inmunoglobulina o polipéptido de acuerdo con la invención es de hasta el 100% (por ejemplo, en ensayo de competición a base de FACS) del desplazamiento teórico máximo (por ejemplo, desplazamiento por anticuerpo frío (por ejemplo, no rotulado) o su fragmento que necesita ser bloqueado de forma cruzada) para ensayar el anticuerpo de bloqueo potencialmente cruzado o su fragmento que está presente en una cantidad dada. Preferiblemente, los anticuerpos de competición cruzada o sus fragmentos tienen un desplazamiento registrado que está entre el 10% y el 100%, con mayor preferencia, entre el 50% y el 100%.

Una molécula de ácido nucleico “aislado” que codifica los anticuerpos en la presente es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la que se asocia comúnmente en el ambiente en el que se produjo. Preferiblemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes asociados con el ambiente de producción. Las moléculas de ácido nucleico aislado que codifican los polipéptidos y anticuerpos en la presente están en una forma distinta que en la forma o ajuste en que se hallan en la naturaleza. Por ello, las moléculas de ácido nucleico aislado se distinguen de ácido nucleico que codifican los polipéptidos y anticuerpos de la presente existentes naturalmente en las células.

La expresión “secuencias de control” se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operativamente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son apropiadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión a ribosomas. Las células eucariotas se conocen por utilizar promotores, señales de poliadenilación y potenciadores. El ácido nucleico está “operativamente ligado” cuando se ubica en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor está operativamente ligado con ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente ligado con una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosomas está operativamente ligado a una secuencia codificante si está posicionada para facilitar la traducción. En general, “operativamente ligado” significa que las secuencias de ADN ligadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen que ser contiguos. La ligación se realiza por ligación en sitios de restricción conveniente. Si tales sitios no existen, los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos se usan de acuerdo con la formulación "estable" A convencional es una en la que la proteína que contiene esencialmente conserva su estabilidad e integridad física y química tras el almacenamiento. Diversas técnicas analíticas para medir la estabilidad proteica están disponibles en el arte y se reseñan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, Nueva York, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev.

10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un período seleccionado. Para un rápido control, la formulación se puede mantener a 40°C durante 2 semanas a 1 mes, durante lo cual se mide la estabilidad. Cuando la formulación debe ser almacenada a 2-8°C, en general, la formulación debe ser estable a 30°C o 40°C durante al menos 1 mes y/o estable a 2-8°C durante al menos 2 años. Cuando la formulación se debe almacenar a 30°C, en general, la formulación debe ser estable durante al menos 2 años a 30°C y/o estable a 40°C durante al menos 6 meses. Por ejemplo, el grado de agregación durante el almacenamiento se puede usar como un indicador de la estabilidad proteica. Así, una formulación “estable” puede ser una en la que menos de aproximadamente el 10% y con preferencia, menos de aproximadamente el 5% de la proteína está presente como un agregado en la fórmula. En otras realizaciones, se puede determinar cualquier aumento en la formación de agregados durante el almacenamiento de la formulación.

Una formulación “reconstituida” es una que fue preparada disolviendo una formulación de proteína o anticuerpo liofilizada en un diluyente de modo que la proteína se dispersa a través de ella. La formulación reconstituida es apropiada para administración (por ejemplo, administración subcutánea) a un paciente por tratar con la proteína de interés y, en determinadas realizaciones de la invención, puede ser una apropiada para administración parenteral o intravenosa.

Una formulación “isotónica” es una que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término “hipotónico” describe una formulación con una presión osmótica inferior a la sangre humana. De modo correspondiente, el término “hipertónico” se usa para describir una formulación con una presión osmótica superior a la de la sangre humana. La isotonicidad se puede medir usando una presión del vapor o un congelamiento de tipo osmómetro, por ejemplo. Las formulaciones de la presente invención son hipertónicas como resultado de la adición de sal y/o tampón. “Portadores” tal como se usan en la presente incluyen portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto a las dosis y concentraciones empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH tamponado. Los ejemplos de portadores fisiológicamente aceptables incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.

Un “ácido farmacéuticamente aceptable” incluye ácidos inorgánicos y orgánicos que no son tóxicos a la concentración y de la manera en que se formulan. Por ejemplo, los ácidos inorgánicos adecuados incluyen clorhídrico, perclórico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfúrico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen alquilo de cadena lineal y ramificada, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, saturados, insaturados, mono, di y tricarboxílicos, incluyendo por ejemplo, fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, t-butilacético, antranílico, propanoico, 2-hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propandioico, ciclopentanopropiónico, ciclopentanopropiónico, 3-fenilpropiónico, butanoico, butanodioico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, 2-acetoxi-benzoico, ascórbico, cinámico, lauril sulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succínico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malónico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glicónico, glucónico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, ftálico, palmítico, palmítico, tiocianico, metanosulfónico, etanosulfónico, 1, 2-etanodisulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenosulfónico, 4-clorobencenosulfónico, naftalen-2-sulónico, p-toluenosulfónico, canforsulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-en-1-carboxílico, glucoheptónico, 4,4'-metilenobis-3-(ácido hidroxi-2-en-1-carboxílico), hidroxinaftoico. “Bases farmacéuticamente aceptables” incluyen bases inorgánicas y orgánicas que son no tóxicas en la concentración y en la manera en la que se formulan. Por ejemplo, las bases apropiadas incluyen aquellas formadas de una base inorgánica que forma metales tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio, N -metilglucamina, morfolina, piperidina y bases no tóxicas orgánicas que incluyen aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas [por ejemplo, N(R')⁴+ (donde R' es, de modo independiente, H o alquilo C1-4, por ejemplo, amonio, Tris)], por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliaminas, y similares. Las bases no tóxicas orgánicas de particular preferencia son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina y cafeína. Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables adicionales de utilidad con la presente invención incluyen aquellos derivados de los aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y asparagina.

Los amortiguadores y sales “farmacéuticamente aceptables” incluyen aquellos derivados de sales por adición de bases y de ácidos de los ácidos y bases antes indicados. Los amortiguadores y/o sales específicos incluyen histidina, succinato y acetato.

Un “azúcar farmacéuticamente aceptable” es una molécula que, es una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés, evita o reduce de modo significativo la inestabilidad química y/o física de la proteína después de almacenamiento. Cuando la formulación pretende ser liofilizada y luego reconstituida, los azúcares “farmacéuticamente aceptables” también se pueden conocer como “lioprotectores”. Los azúcares de ejemplo y sus correspondientes alcoholes de azúcar incluyen: un aminoácido tales como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tales como alcoholes de azúcar trihídricos o de mayor peso molecular, por ejemplo, glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; PLURONICS®; y combinaciones de ellos. Los lioprotectores de ejemplo adicionales incluyen glicerina y gelatina y los azúcares melibiosa, melecitosa, rafmosa, manotriosa y estaquiosa. Los ejemplos de azúcares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Los ejemplos de azúcares no reductores incluyen glucósidos no reductores de compuestos de polihidroxi seleccionados de alcoholes de azúcar y otros polialcoholes de cadena lineal. Los alcoholes de azúcar preferidos son monoglucósidos, en especial aquellos compuestos obtenidos por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glucosídico puede ser glucosídico o galactosídico. Los ejemplos adicionales de alcoholes de azúcar son glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables preferidos son los azúcares no reductores trehalosa o sacarosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables se añaden a la formulación en una “cantidad de protección” (por ejemplo, preliofilización) que significa que la proteína retiene esencialmente su estabilidad física y química y su integridad durante el almacenamiento (por ejemplo, después de reconstitución y almacenamiento).

El “diluyente” de interés en la presente es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración en un humano) y es de utilidad para la preparación de una formulación líquida como una formulación reconstituida después de liofilizar. Los diluyentes de ejemplo incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución de pH tamponado (por ejemplo, solución fisiológico tamponado con fosfato), solución fisiológica estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. En una realización alternativa, los diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o amortiguadores.

Un “conservante” es un compuesto que se puede añadir a las formulaciones en la presente para reducir la actividad bacteriana. La adición de un conservante puede facilitar, por ejemplo, la producción de una formulación multiuso (de múltiples dosis). Los ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y w-cresol. El conservante de máxima preferencia en la presente es alcohol bencílico.

“Tratamiento” se refiere a una intervención clínica diseñada para alterar el curso natural del individuo o célula en tratamiento y se puede llevar a cabo ya sea por prevención o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, prevención de metástasis, reducción de la tasa de progresión de la enfermedad, mejora o paliación del estado patológico y remisión o mejor prognosis. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se usan para demorar el desarrollo de una enfermedad o trastorno. Un sujeto se “trata” exitosamente, por ejemplo, usando los anticuerpos anti-PD-LI apoptóticos de la invención si se mitiga uno o varios síntomas asociados con un trastorno disfuncional de células T.

Una “cantidad eficaz” se refiere a al menos una cantidad eficaz, en dosis y para períodos de tiempo necesarios para lograr el efecto deseado o indicado, incluyendo un resultado terapéutico o preventivo. Por ejemplo, una cantidad eficaz de los anticuerpos anti-PD-LI de la presente invención es al menos la concentración mínima que resulta en la inhibición de señalización de PD-L1, ya sea a través de PD-1 en células T o B7.1 en otros APCs o ambos.

Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es al menos la mínima concentración requerida para efectuar una mejora mensurable o prevención de un trastorno particular. Una cantidad terapéuticamente eficaz en la presente puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, edad, sexo y peso del paciente y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo son superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos anti-PD-LI de la presente invención es al menos la concentración mínima que resulta en la inhibición de al menos un síntoma de un trastorno disfuncional de células T.

Una “cantidad preventivamente efectiva” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante períodos de tiempo necesarios para lograr un resultado preventivo deseado. Por ejemplo, una cantidad preventivamente efectiva de los anticuerpos anti-PD-LI de la presente invención es al menos la concentración mínima que previene o atenúa el desarrollo de al menos un síntoma de un trastorno disfuncional de células T.

“Mamífero” a los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y animales de granja y de zoológico, animales para deportes o mascotas tales como perros, caballos, conejos, vacas, cerdos, hámsteres, jerbos, ratones, hurones, ratas, gatos, etc. Con preferencia, el mamífero es un ser humano.

La expresión “formulación farmacéutica” se refiere a una preparación que está en tal forma que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva y no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación. Estas formulaciones son estériles.

Una formulación “estéril” es aséptica o libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas.

El término “aproximadamente” tal como se usa en la presente se refiere al intervalo de error usual para el respectivo valor fácilmente conocido por el experto en el arte en este campo técnico.

Un “trastorno autoinmune” es una enfermedad o trastorno que surge y que está dirigido contra tejidos u órganos propios del individuo o una consegregación o manifestación de él o condición resultante. Las enfermedades autoinmunes pueden ser una enfermedad específica de órganos (es decir, la respuesta inmune está dirigida específicamente contra un sistema orgánico como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, la tiroides, los oídos, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar sistemas orgánicos múltiples (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), polimiositis, etc.). Tales enfermedades preferidas incluyen trastornos reumatológicos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, RA, síndrome de Sjogren, esclerodermia, lupus tales como SLE y nefritis lúpica, polimiositis-dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome de anticuerpos anti-fosfolípidos, y artritis psoriásica), trastornos gastrointestinales y hepáticos autoinmunitarios (tales como, por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino {por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmune y anemia perniciosa, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, y enfermedad celíaca), vasculitis (tales como, por ejemplo, Vasculitis ANCA-negativa y vasculitis ANCA-asociada, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener, y poliangeítis microscópica), trastornos neurológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome opsoclonus myoclonus, miastenia gravis, neuromielitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y polineuropatías autoinmunes), enfermedades renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, ronchas, Pemphigus vulgaris, penfigoide ampolloso, y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hematológicos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocitopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusional, y anemia hemolítica autoinmune), aterosclerosis, uveítis, enfermedades de la audición autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedad del oído interno y pérdida auditiva), enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, trasplante de órgano, y trastornos endocrinos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes relacionadas con la diabetes tales como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), enfermedad de Addison, y enfermedad tiroidea autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)). Estas enfermedades más preferidas incluyen, por ejemplo, RA, colitis ulcerativa, vasculitis asociada con ANCA, lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren, enfermedad de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroiditis y glomerulonefritis.

La expresión “agente citotóxico” tal como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función celular y/o cause la destrucción de las células. El término incluye isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radiactivos de Lu) y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o sus fragmentos.

Un “agente quimioterapéutico” es un compuesto químico en el tratamiento del cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida; sulfonatos de alquilo tales como busulfán, improsulfán, y piposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (CPT-11 (irinotecán), acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina); briostatina; pemetrexed; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin y bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, ^kW-2189 y CB1 -TM1 ); eleuterobina; pancratistatina; ^tL^k-286; CDP323, un inhibidor de la integrina alfa-4 oral; una sarcodictyin; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; antibioticos tales como los antibióticos enediyne (por ejemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamma y caliqueamicina omegle (véase, por ejemplo, Nicolaou et ah, Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos de antibióticos de cromoproteína enediyne relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposomas de doxorrubicina HCl y desoxidoxorubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina, tegafur, capecitabina, una epotilona, y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, e imatinib (un derivado de 2-fenilaminopirimidina), así como otros inhibidores de c-Kit; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reforzador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK® complejo de polisacáridos (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 ,2 ',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, paclitaxel, formulación de nanopartículas modificadas por ingeniería con albúmina de paclitaxel, y doxetaxel; cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; oxaliplatino; leucovovina; vinorelbina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometlilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatino combinado con 5-FU y leucovovina.

Otros agentes terapéuticos que pueden usarse en combinación con los anticuerpos anti-PD-L1 de la invención son bisfosfonatos tales como clodronato, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato, alendronato, pamidronato, tiludronato, o risedronato; así como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos anti-sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, tal como, por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R); vacunas tales como vacuna Stimuvax, vacuna Theratope y vacunas de terapia génica, por ejemplo, vacuna de alovectina, vacuna de leuvectina, y vacua Vaxid; inhibidor de la topoisomerasa 1; un anti-estrógeno tal como fulvestrant; un inhibidor del kit tal como imatinib o EXEL-0862 (un inhibidor de la tirosina cinasa); inhibidor del EGFR tal como erlotinib o cetuximab; un inhibidor anti-VEGF tal como bevacizumab; arinotecán; rmRH; lapatinib y ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina cinasa dual de ErbB-2 y EGFR también conocido como GW572016); 17AAG (derivado de geldanamicina que es un veneno de la proteína de choque térmico (Hsp) 90), y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Breve Descripción de las Figuras

La figura 1 muestra que el A09-246-2 bloquea de manera eficiente la unión de 125I-PD-L1 a PD-1-Fc inmovilizado. Mutante inactivo: Mutant VL-A31G, D52E, R99Y de A09-188-1. A09-246-2 (1): Expresado en células HEK 293. A09-246-2 (2): Expresado en células CHO-S, lote N.° 1. A09-246-2 (3): Expresado en células CHO-S, lote N.° 2.

La figura 2 muestra la secuencia del dominio extracelular (fusionado a un rótulo 6 aminoácido His, SEQ ID NO: 29) de PD-L1. Los péptidos que pudieron ser identificados por MS se indican mediante barras de color gris. Aquellos que mostraron una protección contra el intercambio de HD en la presencia de Fab están representados por barras negras. Los péptidos que no pudieron ser analizados se resaltan mediante subrayado y cursiva en la secuencia.

La figura 3 muestra el epítopo de A09-246-2 en PD-L1. La cadena principal de PD-L1 se muestra en una representación en cinta. Los aminoácidos que, cuando están mutado a alanina, desestabilizan la unión de A09-246-2 - PD-L1 en más de 0.7 kcal / mol se muestran como bastoncillos.

La figura 4 muestra que el A09-246-2 refuerza de manera eficiente las actividades de células T representados por la producción de IL-2 como se muestra mediante ensayos de PBMC con SEA humano.

Las figuras 5-16 muestran que el A09-246-2 incrementa el ADCC en diferencias líneas de tumor (estimulado y sin estimular) y los alotipos.

Sección experimental

Los ejemplos de trabajo presentados a continuación tienen por objeto ilustrar realizaciones particulares de la invención, y de ninguna manera tienen la finalidad de delimitar los alcances de la memoria descriptiva ni los de las reivindicaciones.

1. Selección y mejora de los anticuerpos

Se seleccionaron anticuerpos de bibliotecas de presentación de fagos de Fab. La selección incluyó dos brazos diferentes, uno utilizando PD-L1 biotinilado humano en las diferentes rondas de selección

y el otro PD-L1 alterno humano y de ratón como diana en diferentes rondas. Se seleccionaron sistemáticamente 3.840 clones mediante ELISA de manera de identificar 170 ligadores PD-L1 individuales. Sobre la base de la inhibición de la unión de ligando PD-1, se seleccionaron 48 aciertos y se los expresó en escala de medio para su caracterización adicional.

Los aciertos seleccionados fueron reformateados y se expresaron como IgGs. Se seleccionaron candidatos de optimización de los aciertos en base a la potencia para bloquear la unión de PD-1 a PD-L1 y la capacidad de ligarse tanto a las versiones humana y murina de PD-L1. La unión a PD-L1 se determinó originalmente mediante ELISA y posteriormente se cuantificó mediante Biacore y unión a células que expresan PD-L1, por FACS. Cuatro candidatos respondieron al perfil inclusive el A09-188-1, que contenía una cadena lambda ligera.

Se eligió A09-188-1 para la maduración de la afinidad y la optimización de la secuencia. Los objetivos de la maduración de la afinidad eran: mayor afinidad para con el objetivo humano, reactividad cruzada con el objetivo murino, y la mejora de la aptitud de la producción. Se introdujeron mutaciones de cadena pesada en las HVR mediante aleatorización basada en codón. Esta diversidad de cadena pesada se combinó con la diversidad de la cadena ligera introducida mediante intercambio de cadena ligera a efectos de generar la biblioteca de maduración de afinidad. Además, se mutaron residuos de cadena pesada y ligera FR y HVR se mutaron para aumentar la estabilidad del anticuerpo e introducir aminoácidos hallados en la línea germinal, tales como la mutación I93V de la cadena pesada FR.

Esto permitió obtener las secuencias HVR indicadas a continuación. Puede demostrarse que por lo menos los residuos

X i —X17 son variables en términos de unión de objetivo y tienen los significados revelados en la presente.

La secuencia HVR-H1 es X1YX2MX3 (SEQ ID NO:1);

La secuencia HVR-H2 es SIYPSGGX4TFYADX5VKG (SEQ ID NO:2);

La secuencia HVR-H3 es IKLGTVTTVXaY (SEQ ID NO:3);

en donde: X1 es K, R, T, Q, G, A, W, M, I o S; X2 es V, R, K, L, M o I; X3 es H, T, N, Q, A, V, Y, W, F o M; X4 es F o I; X5 es S o T; X⁶es E o D

La secuencia HVR-L1 es TGTX7X8DVGX9YNYVS (SEQ ID NO:8);

La secuencia HVR-L2 es X10VX11X12RPS (SEQ ID NO:9);

La secuencia HVR-L3 es SSX13TX14X15X16X17RV (SEQ ID NO:10);

en donde: X7 3 es F o Y; X1 o S; X15 es R,

2. Fabricación, purificación y formulación

2.1 Bioproducción y clarificación

El anticuerpo A09-246-2 correspondiente a la SEQ ID NO: 32 (cadena pesada) y a la SEQ ID NO: 33 (cadena ligera fue expresado a partir de células CHO-S transfectadas con la secuencia de ADN de isotipo PIS y la versión ERU de secuencia optimizada, respectivamente. Los cultivos celulares se realizaron en el modo de lotes en un biorreactor SUB (single use reactor, reactor de un solo uso) de 250 L (Tabla 2-2). Las células se cultivaron en un medio de cultivo ProCHO5 suplementado con L-glutamina 4 mM /- 25 |jg/mg de puromicina a 37°C. Los cultivos fueron alimentados con Eficient Breed B y ácido valproico 1.0 mM 3 días después de la inoculación.

Los medios brutos condicionados de las pasadas del biorreactor fueron aclarados mediante 1.1 m2 de Millistak Pod

D0HC (Millipore MD0HC10FS1) y filtros de 0.11 m2 Millistak Pod A1HC (Millipore MA1HC01FS1), seguido por filtración terminal con un filtro Sartopore 2 (Sartorius 5445307H8-SS).

2.2 Purificación

El proceso de purificación consistió en dos etapas de cromatografía; (a) Proteína A de MabSelect para capturar el anticuerpo de la recolección clarificada, y (b) etapa de pulido con hidroxiapatita de tipo II para retirar el producto agregado restante; las proteínas de la célula huésped y el ADN, y las impurezas relacionadas con el producto. Se insertó una etapa intermedia de filtración Q entre las 2 etapas de cromatografía para reducir aún más el ADN. Se utilizó SDS-PAGE y cromatografía por exclusión de tamaño (SE-HPLC, size exclusion chromatography) para analizar las muestras en proceso durante la purificación. El contenido de proteína de las muestras en proceso de Mabselect en proceso fue utilizado mediante el método de HPLC de Proteína A, mientras que se utilizó la espectroscopia de UV / Vis se utiliza para todos las otras etapas del proceso.

Los eluatos post Mabselect fueron sujetos durante 30 min a desactivación viral de bajo pH (pH 3.7) y posteriormente se neutralizó a pH 7.0 antes de la siguiente etapa de purificación.

La etapa de pulido final fue la cromatografía de hidroxiapatita de tipo II. La conductividad del filtrado Sartobind Q se ajustó a <3 mS / cm con agua, y se redujo el pH a 6.5 con ácido acético antes de la carga de la muestra.

El producto anti-PD-L1 ligado se eluyó con un gradiente escalonado de NaCl. Las impurezas agregadas relacionadas con el producto fueron eluidos con el tampón de la tira (Strip Buffer).

2.3 Formulación, ultrafiltración y diafiltración

Se llevó a cabo el anti-PDL1 purificado de la etapa de pulido con hidroxiapatita, se concentró y se diafiltró a continuación en sus respectivos amortiguadores de acuerdo con la siguiente Tabla. Los productos a granel fueron seguidamente filtrados estérilmente a través de unidades de filtro de 0.2 jm , y se diluyó adicionalmente con tampón de formulación hasta

sus concentraciones finales. Las sustancias formuladas a granel fueron seguidamente ensayadas para establecer la endotoxina, y se las verificó mediante SE-HPLC.

2.4 Formulación para humanos

Se estableció la siguiente administración objetivo y perfil de formulación:

Vía de administración: infusión iv

Intervalo de dosis para humanos: 1-15 mg/kg

Concentración: 10 mg/ml

Condiciones de almacenamiento: líquido o congelado

Vida de espera en los estantes: más de 12 m

Se seleccionó la siguiente formulación líquida:

10.0 mg/mL de A09-246-2

Acetato 10 mM

5.1% (peso(volumen) manitol

Metionina 1.4 mM

0.05% (peso/volumen) de Tween 20

Ajustado a pH 5.5

La formulación contiene excipientes antioxidantes y demostró ser suficientemente estable bajo las siguientes condiciones de estrés:

- Estrés liviano

- Estrés de corte

- Ciclos de congelación-descongelación

- Estrés de oxidación

Se evaluó la estabilidad a 2-8°C y 25°C durante hasta 26 y 13 semanas, respectivamente. Se encontró que la formulación es suficientemente estable a 2-8°C hasta el último momento de tiempo de 26 semanas. Además, se preparó una formulación liofilizada con una excelente estabilidad a 25°C hasta 26 semanas.

3. Caracterización bioquímica y biológica

3.1 Afinidad y especificidad de unión con Biacore

La afinidad de unión y la selectividad se determinaron mediante ensayos de Biacore. La afinidad del anticuerpo candidato principal con respecto a ortólogos humanos y no humanos se ha resumido en la siguiente tabla. La afinidad de unión de anticuerpo anti-PD-L1 A09-246-2 de acuerdo con esta invención para las proteínas humanas, de ratón y de mono cynomolgus fue estadísticamente similar pero muy reducida para las proteínas de perro, rata y conejo que mostraron un perfil de disociación muy rápido.

Los perfiles cinéticos para A09-188-1 y otros mutantes del mismo se muestran en la siguiente tabla:

3.2 Selectividad

La selectividad se determinó mediante la evaluación de la unión a miembros de la familia B7 inclusive hu-PD-L1-huFc, hu-PDL-2-huFc, hu-B7.1 huFc-, hu-B7.2 huFc-, huB7-H2-huFc y huB7-H3-huFc por Biacore.

Todos los MAb anti-huPD-L1 probados inclusive A09-246-2 reaccionaron específicamente con la proteína huPD-L1 solamente y no con ninguna otra proteína de la familia B7.

3.3 PD-L1: Bloqueo de interacción de PD-1

La capacidad de A09-246-2 y de un anticuerpo de control para competir con la unión de PD-L1 radioetiquetado con PD-1 inmovilizados se determinó mediante ensayo de desplazamiento radioactivo competitivo. La figura 1 muestra las curvas representativas de competencia para los anticuerpos de prueba. Los resultados demostraron que el A09-246-2 bloquea de manera eficiente la interacción de PD-1 y PD-L1 con una IC50 de 0.071 ± 0.008 nM (0.01 ± 0.001 |jm/ml).

Se utilizó el siguiente protocolo de ensayo:

1. Añadir 60 ml/pocillo de PBS, que contiene 1 mg/ml de PD-1Fc humano (R&D Systems, 1086-PD; PD-1 liofilizado disuelto con PBS a 200 mg/ml) a placas Costar blancas (Corning 3922). Incubar durante la noche a 4°C.

2. Enjugar pocillos 1 vez con PBS.

3. Bloquear pocillos con 120 ml de 0.5% BSA (Sigma A-3059) disuelto en tampón de unión, durante 1 h a temperatura ambiente (RT).

4. Enjugar pocillos 1 x con tampón de unión.

5. Añadir 50 ml de muestra de ensayo a los pocillos (anticuerpo, material sobrenadante). Diluir anticuerpos 20 nM en tampón de ensayos y diluir en serie 9x con una dilución 1:4. Las muestras se diluyen hasta una concentración final 2 x, antes de añadir a los pocillos (usualmente se empieza con una concentración 10 nM - 1x).

6. Unión no específica: añadir 50 ml de PD-L1/Fc (R&D Systems, 156-B7) con una concentración final de 250 nM en lugar de la muestra de ensayo con un exceso de 500 veces con respecto al PD-L1 etiquetado. Los pocillos reciben en total el mismo volumen de tampón de ensayo.

7. Añadir 50 ml de 0.5 nM 125I-PD-L1 (etiquetado a medida en Perkin Elmer, lote número CIS32211, 250 nM, 2400 Ci/mmol) en cada pocillo. Diluir a 2 x la concentración final en el tampón de ensayo- concentración final = 0.25 nM. 8. Sacudir la placa durante 2 - 2.5 horas a 37 °C.

9. Lavar los pocillos 5 veces con tampón de unión frío.

10. Añadir 100 ml de Microscint 20 (Packard 6013641) en cada pocillo. Incubar durante por lo menos 1 hora a temperatura ambiente.

11. Contar luminescencia en Topcount (protocolo 125I -Microscint).

Tampón de unión: Hepes 50 mM, pH 7.5, NaCl130 mM, KCl 5.1 mM, MgSÜ4 1.3 mM. Amortiguador de ensayo: tampón de unión BSA al 0.5%

3.4 PD-L1: B7.1 Bloqueo de interacción

La capacidad de A09-246-2 para bloquear la unión de B7.1 soluble sobre la superficie de las células fue medida mediante FACS. Los resultados demostraron que el A09-246-2 bloquea de manera eficiente la interacción de B7.1 y de PD-L1 con un IC50 de 0.2 ± 0.004 nM (0.03 ± 0.0006 jm/ml).

3.5 Mapeo de epítopos

a) Intercambio de hidrógeno-deuterio

El dominio extracelular del antígeno PD-L1 (SEQ ID NÜ: 29) se incubó en una solución de agua pesada (D2O) para permitir que los protones amida en el esqueleto de la proteína sean intercambiados con deuterones del solvente, ya sea en la presencia o ausencia de un exceso de anti-PD-L1 Fab o de un Fab no específico. Las muestras fueron digeridas con proteasa y se las analizó por LCMS (liquid chromatography-mass spectroscopy, espectroscopia de masa -cromatografía de líquidos) a efectos de determinar el nivel de deuteración en cada péptido.

En lugar de la IgG completa se utilizó el Fab correspondiente a A09-246-2 con el fin de simplificar el análisis de espectrometría de masa mediante la disminución de la cantidad de péptidos generados por digestión con proteasas. A pesar de ello, subsistieron algunas regiones permanecieron que no pudieron ser identificadas y analizadas (porciones de secuencia subrayadas, en cursiva en la Figura 2), sin embargo, estas regiones representan una pequeña fracción de la secuencia, y en su mayoría residen en el segundo dominio de inmunoglobulina, distante de la región que contiene epítopo. Los residuos 32-39 en el dominio I del dominio extracelular también eran resistentes a su identificación por espectrometría de masas y abarcan el sitio de una glicosilación ligada a N; como es sabido que el A09-246-2 se liga a una versión aglicosilado de PD-L1 producida en E. coli, la incapacidad para analizar este péptido en cuanto a coeficientes de intercambio de HD no era un tema de preocupación.

Se observó que varios péptidos de antígeno tenían un coeficiente significativamente reducido de intercambio de protones para deuterones en la presencia de Fab en comparación con su ausencia, lo que sugiere que al menos algunos residuos de estos péptidos están en contacto directo con el Fab y constituyen un epítopo conformacional (Figura 2). Aunque los dos péptidos que muestran la protección con respecto al solvente están muy separados en la secuencia primaria (subrayado, negrita en la Figura 2, son proximales en la estructura tridimensional de PD-L1 y constituyen, cada uno de ellos, un parche de unión único sobre la superficie del antígeno (ver Figura 3).

En resumen, el intercambio de HD identificó dos péptidos;

(i) residuos 36-48 en la figura 2 (dominio extracelular más etiqueta His, SEQ ID NO:29), correspondiente a los residuos 54-66 de la secuencia de longitud completa (SEQ ID NO:28)

(ii) residuos 94-104 en la Figura 2 (SEQ ID NO:29), correspondiente a los residuos 112-122 SEQ ID NO:28

que forman un epítopo conformacional en PD-L1 y que contiene el epítopo funcional de A09-246-2.

b) Mutagénesis

Para obtener un mapeo a nivel de residuo, más fino del epítopo y para complementar los datos de intercambio de HD, modelado molecular e inspección manual de la estructura cristalina de PD-L1 (Lin, DY-W. et al. PNAS 105, 3011-6 (2008; registro PDB 3BIK) se usó para seleccionar residuos expuestos a disolventes dentro de y alrededor del epítopo identificado por intercambio de HD. Los residuos seleccionados se mutaron tanto a alanina (grande a pequeño) o a otro aminoácido, potencialmente más disruptiva (de pequeñas a grandes).

En total, se diseñaron 48 mutantes de punto, se los expresó y purificó a partir de células HEK, y se ensayaron para su unión a A09-246-2, para lo cual se utilizó resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés). Los puntos calientes de unión, o residuos que más contribuyen a la energía de unión (Wells. JA, PNAS 93, 1-6, 1996), fueron identificados como aquellos que no cumplieron con una señal de unión de umbral a antígeno de 100 nM. Por otra parte, la afinidad del anticuerpo para el tipo natural y para cada mutante se determinó y se utilizó para calcular la contribución de cada residuo de epítopo a la energía de unión

Los resultados se resumen en la siguiente tabla, donde 48 mutantes puntuales de PD-L1 se compararon con el antígeno PD-L1 de tipo natural en cuanto a la unión de los anticuerpos. Se utilizó el SPR (Biacore) para realizar un estudio cinético que permite la determinación de las constantes cinéticas (ka y kd). En pocas palabras, el anticuerpo Fc antihumano policlonal de cabra se acopló químicamente a un chip CM5. Se inyectó A11-128 y se lo capturó mediante el policlonal. Se utilizó tampón para lavar el anticuerpo no ligado hasta que el RU de línea de base se estabilizó. Se inyectó antígeno (de tipo natural o PD-L1 mutante) con una concentración fija durante 3 minutos, y se registró la asociación. Se inyectó tampón durante otros 3 minutos y se observó una disociación. Los antígenos se inyectaron con concentraciones de 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM y 6.25 nM (a excepción de los mutantes Y56 y D61, que se inyectaron con 1 uM, 500 nM, 250 nM, 125 nM y 62.5 nM). Entre cada ciclo, el chip se regeneró con tampón de bajo pH y se capturó A09-246-2 fresco antes de inyectar la siguiente concentración de constantes de antígeno. Los coeficientes se determinaron mediante ajuste iterativo de los datos a un modelo 1:1 de unión mediante un algoritmo que minimiza la Chi cuadrado. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calculó como la relación entre las constantes cinéticas y el cambio en la energía libre de Gibbs de unión del mutante en relación con el PD-L1 de tipo natural (AAGmut) se deriva de la relación entre los Kds de tipo natural y mutante. Los cambios de energía libre se destacan de acuerdo con la desestabilización de la unión antígenoanticuerpo; "**": > desestabilización de 3 kcal/mol (hotspots de unión); "*": “*”:> 0.7 kcal/mol. Los mutantes en Y56 tenían una afinidad tan baja que el Kd pudo ser medido con precisión y en cambio se indica en Kd mínimo. Para D61A no pudo hallarse ninguna unión. Según este análisis, los aminoácidos marcados con “**” o “*” son parte del epítopo funcional. El punto medio de temperatura de la desnaturalización térmica supervisada por fluorescencia está dado para las proteínas de tipo natural y las proteínas mutantes. ND: No se determinó; BP: bifásica. El aspecto cualitativo de las proteínas de tipo natural y las proteínas mutantes en la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) también está indicado. M: monodisperso y el mismo volumen de elución que para el tipo natural, M/T: pico en el mismo volumen de elución que el tipo natural, pero con una cola adicional. Para Kd y T1/2, la desviación media y estándar está dada cuando n > 1.

Era importante confirmar que la falta de unión a A09-246-2 de los mutantes de punto Y56A, Y56K y D61A fue en efecto debida a la pérdida de residuos de puntos calientes y no para el despliegue global del antígeno. La integridad estructural de las proteínas mutadas se confirmó mediante un ensayo de desplegado térmico supervisado por fluoroscopia en el que la proteína es incubada con un colorante que se apaga en solución acuosa, pero que presenta una fluorescencia cuando se une a los residuos hidrófobos expuestos. Medida que la temperatura aumenta, la desnaturalización térmica de la proteína expone los residuos del núcleo hidrófobo y este puede ser controlado por un aumento en la fluorescencia del colorante. Los mutantes de Y56 o D61 despliegan, todos ellos, una transición de dos estados similares a la de tipo natural PD-L1, lo que indica una estructura plegada a temperatura ambiente. Los datos se ajustaron a la ecuación 1 (adaptado de Bullock, A. N. et al. Estabilidad termodinámica del dominio central de p53 mutante y de tipo natural. PNAS 94, 14338— 14342 (1997)) para determinar la temperatura en el punto de inflexión de la curva (T1/2).

Ecuación 1:

Los mutantes de Y56 y D61 presentaron una desestabilización mínima del antígeno indicado por una pequeña disminución en el T1/2 del desplegado supervisado por fluorescencia (tabla anterior). Esto confirma que Y56 y D61 son verdaderos puntos de unión para A09-246-2. La integridad estructural de la mayoría de las otras proteínas mutantes se confirmó también mediante este método (tabla anterior). La observación de que las proteínas más mutantes se comportaron de manera similar al tipo natural en la cromatografía de exclusión por tamaños analítico (última columna de la tabla anterior) provee más apoyo a la estructura nativa de las proteínas antigénicas mutantes.

3.6 Unión a células tumorales y células primarias

La unión de A09-246-2 a PD-L1 en la superficie de las células tumorales así como también en células primarias humanas y células de animales experimentales se confirmó mediante un ensayo de FACS. El A09-246-2 demostró una reactividad al PD-L1 humano en la totalidad de las siete líneas de células tumorales humanas ensayadas humanas; (A431, línea celular de carcinoma epitelial, A549, células epiteliales de adenocarcinoma de pulmón; BxPC3, células de cáncer de páncreas, HCT116, carcinoma colorrectal, M24, líneas celulares de melanoma; PC3mm2, línea de células de cáncer de próstata; U-87 MG, glioblastoma-astrocitoma) de los cuales PD-L1 fue regulado ascendentemente mediante tratamiento con interferón a efectos de permitir la detección. Dado que el PBMC primaria tiene bajos niveles de expresión de PD-L1 que es difícil de ser detectado, el PBMC humano o el PBMC de perro, conejo y rata se sometieron, todos ellos, a estimulación con PHA durante 2 días. El A09-246-2 demostró una reactividad a PD-L1 en células primarias humanas y animales.

3.7 EC50 Medido mediante ensayo de unión FACS directo

Mediante FACS se confirmó la capacidad de unión de A09-246-2 al objetivo de la superficie celular. El A09-246-2 se une de manera eficiente al PD-L1 humano expresado sobre la superficie celular HEK con una CE50 de 0.3 ± 0.02 nM (0.04 ± 0.003 |jm/ml); a mono cynomolgus expresado sobre la superficie celular HEK con una CE50 de 0.94 ± 0.015 nM (0.14 ± 0.002 jg / l); a PD-L1 de ratón expresado sobre la superficie celular HEK293 con una CE50 de 0.34 ± 0.08 nM (0.05 ± 0.012 jg /ml) y PD-L1 de ratón expresado sobre la superficie celular EL4 con una CE50 de 0.91 ± 0.21 nM (0.13 ± 0.03 jg/ml). Los ensayos describieron cualitativamente las características de unión función de la dosis, del anti-PD-L1.

3.8 Actividad en ensayos celulares

En la actualidad no hay ninguna evidencia científica de que el acoplamiento de PD-L1 con sus ligandos transduce una señalización estimulante a través de PD-L1 en las células que expresan PD-L1, por lo tanto, los ensayos desarrollados emplean la activación de las células T en los procedimientos. La capacidad de los anticuerpos anti-PD-L1 para reforzar las inmunorrespuestas de células T fue medida en ensayos celulares in vitro en las que se utilizaron células T murinas o PBMC humanas.

a) Ensayo OT-1

Unas células CD8 T específicas de antígeno fueron generadas mediante la estimulación de esplenocitos de ratones transgénicos OT-1 con SIINFEKL péptido OVA y criopreservado. Unas células mPD-L1 que sobreexpresan células EL4 fueron utilizadas como células presentadoras de antígeno. Unas diluciones seriadas de los compuestos ensayados se incubaron con células O T-1-T descongeladas y cargadas APC cargado con SIINFEKL durante 48 horas. El IFN-y en el sobrenadante se midió usando mlFN-y ELISA. El anti-PD-L1 (A09-246-2) reforzó eficientemente las actividades de las células T representados por la producción de IFN-y con una CE50 de 0.28 ± 0.1 nM (0.04 ± 0.015 jg/ml)

b) Ensayo SEA

Durante el desarrollo del ensayo PBMC humano, se pudo demostrar que sólo el tratamiento anti-PD-L1 no provocó la producción de IL-2 o IFN-gamma en la ausencia de activación de células T y que tampoco reforzó la producción de IL-2 en presencia de una óptima activación. Se evaluó la capacidad de los anti-PD-L1 para reforzar la producción de IL-2 por las células T que responden a la activación del súper antígeno. Los súper antígenos tales como la enterotoxina de estafilococo (SEA, por sus siglas en inglés) es capaz de reticular el receptor de células T (TCR) y la clase II de MHC para activar las células T CD4. Se evaluó la actividad dependiente de la dosis, de A09-246-2 para mejorar las funciones de las células T al tener lugar la activación. Diluciones seriadas de A09-246-2 se incubaron con PBMC humanas en presencia de SEA durante 96 horas. El IL-2 humano en el material sobrenadante se midió usando IL-2 humana ELISA. Los resultados indicaron que el anti-PD-L1 reforzó de manera eficiente las actividades de la células T representadas por la producción de IL-2 con una CE50 de 0.08 ± 0.03 nM (0.012 ± 0.005 jg/m l)

3.9 Citotoxicidad mediada por células función de anticuerpo (ADCC)

Se midió la ADCC se midió mediante dos diferentes líneas tumorales humanas A431 y A549 como células objetivo y PBMC humanas como células efectoras. En algunos casos, las pruebas se realizaron con células objetivo después de la estimulación con interferón-gamma para aumentar la expresión de PD-L1. El anticuerpo anti-EGFR, cetuximab, se utilizó como un control positivo al ADCC. Dado el hecho de que el receptor Fc gamma IIIa 158V alotipo muestra una mayor afinidad por IgG1 humana y aumenta la ADCC, los resultados observados se correlacionaron con alotipo del donante.

La actividad ADCC de A09-246-2 era comparable a la mediada con el cetuximab anticuerpo anti-EGFR, induciéndose aproximadamente 50% de la lisis máxima en ambas líneas celulares. El tratamiento con INF-gamma no alteró la respuesta de las células A431 para todos los alotipos diferentes ensayados (V/V, V/F y F/F). Se observó una diferencia significativa (casi el doble) entre las células estimuladas y no estimuladas cuando se emplearon células A549 para la PBMC de donantes V/V y V/F. No se observó ADCC cuando se analizaron PBMC de donantes F/F con células A549.

4. Actividad in vivo

En los estudios presentados aquí, se investigó la eficacia del bloqueo de anticuerpo (Ab) anticuerpo PD-L1 contra diversos modelos tumorales murinos. La inhibición de la interacción PD-1/PD-L1 ha sido propuesta para ejercer un efecto terapéutico mediante la restauración de respuestas antitumoral CD8+ células T, y por lo tanto todos los estudios preclínicos de eficacia se llevaron a cabo en modelos tumorales murinos singénicos en la que el sistema inmune del huésped está completamente intacta. Para evitar la necesidad de un anticuerpo sustituto, el anticuerpo utilizado en los estudios fue seleccionado específicamente en base a la reactividad cruzada con PD-L1 murino. Sin embargo, debido a que el anticuerpo es completamente humano, la neutralización del carácter inmunogénico se suscita en los ratones, lo que limita la ventana de dosificación eficaz a un periodo de siete días. A pesar de esta limitación significativa de dosificación, el anticuerpo seleccionado ha mostrado una actividad significativa como monoterapia y en diversos entornos de tratamiento de combinación. La actividad antitumoral del anticuerpo anti-PD-L1, mostró una tendencia, función de la dosis, cuando se administra como monoterapia contra tumores MC38.

El análisis inmunohistoquímico de la expresión de PD-L1 en modelos de tumores que responden y que no responden, reveló una fuerte relación entre el nivel de expresión de PD-L1 y el nivel de eficacia antitumoral. Para confirmar el mecanismo de acción propuesto (MOA, por sus siglas en inglés), se llevó a cabo un estudio en ratones portadores de tumores MC38 en los que se agotaron sistémicamente las células T CD8+. En los animales en los que se habían agotado las células T CD8+, la eficacia de la terapia anti-PD-L1 se abrogó completamente, lo que confirma que la función efectora citotóxica efectora de los linfocitos T (CTL, por sus siglas en inglés) es la causante de la inhibición del crecimiento del tumor. Para evaluar la potencial combinación de la terapia anti-PD-L1, se seleccionaron socios de combinación de los que se sabe que producen respuestas antitumorales de células T o que de alguna otra manera mejoran los efectos de la inmunoterapia. En combinación con la radioterapia fraccionada contra los tumores MC38, el anticuerpo anti-PD-L1 mostró una fuerte actividad sinérgica, con un potencial curativo. La combinación con una sola dosis baja de ciclofosfamida resultó en efectos antitumorales reforzados en el modelo MC-38 que se asociaron con una mayor frecuencia de células T CD8+ específicas de antígeno de tumor. La terapia anti-PD-L1 prolongó de manera significativa el tiempo de supervivencia cuando se combinó con gemcitabina en el modelo de tumor PANC02 ortotópico de cáncer de páncreas. Cuando el anti-PD-L1 fue combinado con pretratamiento con ciclofosfamida seguido de la vacunación con Stimuvax, se logró un aumento significativo en la inhibición del crecimiento del tumor tanto en el modelo tumor MC38/MUC1 como PANC02/MUC1. También se observó una eficacia significativamente mejorada cuando el anticuerpo anti-PD-L1 fue combinado con los componentes básicos del régimen de quimioterapia FOLFOX. Por lo tanto, varios enfoques prometedores de combinación para la terapia anti-PD-L1 terapia se identificaron con éxito, inclusive tres regímenes de tratamiento “estándar de atención” (terapia de radiación, FOLFOX; gemcitabina).

Los datos mecánicos derivados de estos estudios demostraron que la terapia anti-PD-L1 está constantemente asociada con porcentajes incrementados de células T CD8+, células T CD8+ efectoras de memoria, y células T PD-1+ CD8+ en los bazos y los tumores de los ratones tratados.

4.1 Respuesta de dosis en modelo de tumor MC38 y combinación con CPA

En este estudio, a unos ratones se les inoculó por vía subcutánea en el flanco derecho 1 x 106 células de carcinoma de colon MC38. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de ~ 50 mm3, los ratones se dividieron en grupos de tratamiento (N = 14) (definido como el día de estudio 0). A los grupos se les administró A09-246-2 por vía intravenosa con dosis de 100, 200, 400 u 800 mg en los días 0, 3 y 6. Un grupo de control fue tratado con 200 mg de un anticuerpo isotipo inactivo. Los tumores se midieron dos veces por semana durante la duración del estudio. Todos los grupos de tratamiento demostraron una eficacia significativa (P <0.050) en comparación con el grupo de control isotipo. Aunque el grupo de 800 mg de dosis no mostró una eficacia mejorada con respecto al grupo de 400 g, se observó una tendencia significativa hacia un efecto dependiente de la dosis. En un segundo estudio de dosis-respuesta que siguió el mismo diseño, nuevamente se observó una tendencia general hacia la actividad función de la dosis. Sin embargo, el grupo con la dosis de 800 mg de este estudio en particular mostró una actividad antitumoral significativamente menor que el grupo con la dosis de 400 mg. La falta de aumento de la eficacia a dosis superiores a 400 mg puede indicar una meseta de eficacia como resultado de la saturación del objetivo, o puede presentarse un fuerte efecto inmunogénico a dosis más altas, lo que resulta en una menor exposición al fármaco. Además, en estos estudios se exploró la eficacia de los anti-PD-L1 en combinación con el pretratamiento con una dosis baja inmunomoduladora de ciclofosfamida (CPA). Se observó que la combinación de CPA mejoró significativamente la eficacia de dosis bajas de anti-PD-LI (100 |jg), y este efecto se asoció con el aumento de las frecuencias de las células T CD8+ específicas para antígeno de tumor p15E, como se determina mediante ELISPOT. Los datos de inmunofenotipificación de estos estudios revelaron que la terapia anti-PD-L1 está asociada con porcentajes significativamente mayores de varios subconjuntos de células T CD8+ en los bazos: células T CD8+ totales, células T CD8+ específicas del antígeno tumoral p15E, células T PD-1+CD8+, y células de memoria efectora T CD8+ (T^em) y de memoria central T CD8+ (T^cm). También se observó un aumento de la acumulación intratumoral de células T CD8+ y células T^emCD8+. Estas observaciones respaldan que la terapia anti-PD-L1 como una estrategia efectiva para impulsar respuestas de células T CD8+ antitumorales.

4.2 Eficacia en el modelo de leucemia diseminada C1498/GFPl

Para crear el modelo de leucemia diseminada, unas células leucémicas C4198-GFP (2x10⁴) fueron inyectadas iv en ratones C57BL/6 en el día 0. Los ratones fueron asignados al azar a grupos de tratamiento (N = 5) que recibieron sea una dosis de 400 |jg de anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) sea una dosis equivalente de un anticuerpo isotipo inactivo en los días 1, 4, y 7 por inyección i.p.

El punto final primario del estudio fue la supervivencia basada en la aparición de los signos clínicos, lo que indica diseminación metastásica, lo que obligada a la eutanasia. Al final del estudio (día 76), el 20% de los ratones (1/5) estaban todavía vivos en el grupo tratado con anticuerpo isotipo, y el 80% (4/5) de los sobrevivientes permanecieron en el grupo tratado con A09-246-2.

4.3. Combinación con gemcitabina en el modelo ortotópico PANC02

Se llevaron a cabo tres estudios separados para investigar la combinación del anti-PD-L1 (A09-246-2) y gemcitabina (GEM). Los estudios fueron diseñados para explorar la posición de la terapia anti-PD-L1 dentro del período “vacaciones o feriado” de quimioterapia de un ciclo de 21 días o de 28 días de GEM. Los modelos ortotópico implican la inoculación de células tumorales en el órgano de origen, lo que resulta en una recapitulación estrecha de la progresión de la enfermedad tal como se produce en el entorno humano. Para crear un modelo de adenocarcinoma de páncreas, unas células PANC02 (1x10⁶) fueron inyectadas en el páncreas de ratones hembra C57BL/6 hembra. Cinco días más tarde, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento. El GEM se dosificó a razón de 150 mg/kg en todos los estudios y el A09-246-2 se dosificó a razón de 400 jg por ratón. En dos estudios, se modeló un ciclo de 28 días de GEM (administración en los días 5, 19, 26), con un período de vacaciones 14 días durante el cual el A09-246-2 se administró los días 8, 11, 14. En un tercer estudio, se modeló un ciclo de 21 días de GEM (administración en los días 5, 12, 26, 33), con un período de vacaciones de 14 días durante el cual el A09-246-2 se administró los días 13, 16, 19. La monoterapia con GEM o anti-PD-L1 no logró extender el tiempo de supervivencia en este modelo. Sin embargo, en los tres estudios, la combinación de GEM y A09-246-2 amplió considerablemente el tiempo medio de supervivencia (P < 0.02). La inmunofenotipificación reveló varios efectos en los grupos que recibieron A09-246-2, tanto en monoterapia como en combinación con GEM, que eran coherentes con la propuesta de MOA de anti-PD-L1 inclusive porcentajes crecientes de CD8+ T^emen los bazos, una proporción creciente de células de bazo CD8+ T^emcon respecto a las células Treg, y porcentajes crecientes de células esplénicas PD-1+ T CD8+. Además, el inmunofenotipo de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) mostró porcentajes significativamente mayores de CD8+ TIL en el grupo de combinación.

4.4 Combinación con ciclofosfamida (CPA) de baja dosis

Es sabido que las dosis bajas de CPA refuerzan las inmuno respuestas anti-tumor a través de la inhibición de las células T reguladoras inmunosupresoras. El potencial de un tratamiento preliminar con CPA a bajas dosis fue investigado para reforzar la eficacia del Ab anti-PD-L1 (A09-246-2) en el modelo de tumor subcutáneo MC38. Unos ratones fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco derecho con 1x10⁶células de carcinoma de colon MC38. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de -50 mm³, los ratones fueron divididos en grupos de tratamiento (N = 14) en el día 0. El grupo de tratamiento combinado recibió 100 jg de A09-246-2 por inyección i.v. en los días 0, 3, y 6, con o sin pretratamiento con una dosis de 100 jg/kg de CPA entregado i.v. en el día -1. Un grupo de tratamiento de control recibió 100 ug de un anticuerpo isotipo inactivo en combinación con un pretratamiento con CPA. El grupo de tratamiento de combinación mostró una mejora estadísticamente significativa (p < 0.050) de la actividad antitumoral en comparación con los grupos de control con isotipo y los grupos de monoterapia. Mediante un ensayo ELISPOT, se midieron los efectos del tratamiento sobre la magnitud de las respuestas de células T CD8+ dirigidas contra el antígeno de tumor p15E bien caracterizado. Tanto el CPA como el A09-246 2-mostraron niveles sustancialmente mayores de células T CD8+ p15R-reactivos (~ 100 puntos en ambos grupos) en comparación con el control de isotipo (~ 25 puntos), en donde el grupo de combinación mostró una mejora adicional (~ 250 puntos). Por lo tanto, la eficacia antitumoral de la combinación de CPA más A09-246-2 estaba asociada con mayores frecuencias de CTL reactivos de antígeno de tumor.

4.5 Combinación con ciclofosfamida /Stimuvax

La capacidad del bloqueo de PD-L1 para restaurar las respuestas antitumorales de células T provee una base sólida para la combinación con vacunas contra el cáncer. Stimuvax es una vacuna contra el antígeno MUC1 humana, que es comúnmente sobreexpresado por tumores sólidos. Los ratones transgénicos para la proteína MUC1 humana (ratones MUC1.tg ratones) son inmunológicamente tolerantes del antígeno, y, cuando se los inocula con tumores murinos que también expresan MUC1 humana, proveen un modelo correspondiente de la configuración de vacunación clínica. En la práctica clínica, se utiliza el tratamiento preliminar con ciclofosfamida (CPA) en combinación con Stimuvax como una estrategia para agotar transitoriamente las células Treg inmunosupresoras que pueden inhibir la respuesta a la vacuna.

En este estudio, unos ratones MUC1-tg fueron inoculados por vía subcutánea en el flanco trasero derecho con 1x10⁶células de células carcinoma de colon MC38/MUC1. Cinco días después de la inoculación de células tumorales, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en grupos de tratamiento (N = 10) en el día -3. El día -3, se administró una dosis de 100 mg/kg de CPA mediante administración i.v. La vacunación se inició en el día 0 y se repitió semanalmente. Se dosificó anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) mediante inyección intraperitoneal en los días 0, 3, y 6. Los tumores se midieron dos veces por semana. La combinación de CPA/Stimuvax y A09-246-2 demostró una inhibición significativamente mayor (p <0.050) del crecimiento del tumor en comparación con el tratamiento con CPA/Stimuvax.

En un segundo estudio, 1x10⁶células PANC02/MUC1 se inocularon en el páncreas de ratones MUCI.tg. Cuatro días más tarde, los ratones fueron asignados al azar en grupos (N = 8) y se inició el tratamiento. El mismo programa de tratamiento se aplicó como para el primer estudio. La combinación de CPA/Stimuvax y anti-PD-L1 (A09-246-2) aumentó significativamente el tiempo medio de supervivencia (MST, mean survival time) cuando se compara con el tratamiento con CPA/Stimuvax (MST de 43.5 días frente a 70 días, p = 0.0001). La inmunofenotipificación por FACS mostró una tendencia significativa hacia el aumento de los porcentajes de CD8+ T^emy CD8+ T^cmen el grupo de combinación.

4.6 Combinación con radioterapia fraccionada

Se ha demostrado que la radioterapia (RT) mejora el carácter inmunógeno de las células tumorales a través del aumento de la expresión de MHC de clase I y la diversificación de la combinación de péptidos intracelulares. Para probar el tratamiento anti-PD-L1 con anticuerpos en combinación con radioterapia, unas células de carcinoma de colon MC38 (1x10⁵) se inocularon por vía intramuscular en el cuadriceps derecho de ratones C57BL/6 hembra. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 150 mm³, los ratones se dividieron en grupos de tratamiento (n = 8) en el día 0. Las patas portadoras de tumor se aislaron y se trató con 360 cGy de irradiación gamma de una fuente de cesio-137 en los días 0, 1, 2, 3, y 4 (dosis total de 1800 cGy). Una cantidad de anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) se administró por vía intravenosa a 400 |jl en los días 3, 6 y 9. La combinación A09-246-2 y radioterapia resultó en una alta tasa de regresiones tumorales, llegándose finalmente a 6/10 respuestas completas (CR, complete responses). Unos ratones con CR fueron nuevamente expuestos mediante inoculación de las células tumorales MC38, y 3/6 ratones permanecieron libres de tumor setenta y cuatro días después de la nueva exposición, lo que indica que una memoria inmunitaria eficaz fue generada gracias a la terapia de combinación. A la inversa, un grupo de control tratado con un anticuerpo isotipo de control en combinación con la radiación mostró una inhibición significativa del crecimiento tumoral, pero no indujo regresiones.

Se llevó a cabo una repetición del estudio de combinación de RT y anti-PD L1-(A09-246-2), con la inclusión de un segundo grupo de terapia de combinación en el que a unos ratones se les agotó sistemáticamente sus células T CD8+. Las lecturas inmunológicas adicionales medidos en este estudio incluyeron inmunofenotipificación de esplenocitos basada en FACS, un análisis de proliferación in vivo, y un ensayo ELISPOT. Una vez más, la combinación demostró una eficacia sinérgica que indujo una fase inicial de regresión o estasis en todos los tumores. Sin embargo, una regresión completa se observó sólo en 1/8 ratones, hubo un ratón que experimentó un período prolongado de estasis del tumor. El agotamiento de células T CD8+ abrogó por completo la sinergia de la combinación, lo que confirma que el mecanismo consiste en la estimulación de respuestas anti-tumorales de células T CD8+. Esta observación fue apoyada además por el aumento de las frecuencias de células T CD8+ reactivas al antígeno de tumor p15E. La inmunofenotipificación por FACS reveló porcentajes crecientes de proliferación de las células T CD8+ en los bazos, y mayores porcentajes de CD8+ T^emy CD8 Tcm.

4.7 Combinación con componentes núcleo del régimen FOLFOX

FOLFOX es un régimen de quimioterapia de combinación, que consiste en ácido folínico, 5-fluoruracilo (5-FU) y oxaliplatino (OX), utilizado en el tratamiento de la etapa III del cáncer colorrectal. Se estudió el potencial para combinar anti-PD-L1 con los componentes básicos de FOLFOX (5-fluoruracilo y oxaliplatino) en el modelo de carcinoma de colon MC38 subcutáneo. Unos ratones fueron inoculados en el flanco derecho por vía subcutánea con 1x10⁶células de carcinoma de colon MC38. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de ~ 50 mm³, los ratones fueron divididos en grupos de tratamiento (N = 10) en el día 0. 5-FU (60 mg/kg iv) y OX (5 mg/kg ip) se administraron en los días 0 y 14. Una cantidad de anti-PD-L1 Ab (A09-246-2) (400 jg i.v.) fue administrada en los días 3, 6 y 9. Se observó que el tratamiento de combinación tenía una eficacia significativamente mayor (p < 0.050) en comparación con A09-246-2 administrada sola, o 5-FU y OX administrados en combinación con un anticuerpo de isotipo. Se llevó a cabo una repetición del estudio de combinación de Ab anti-PD-L1 y FOLFOX y, nuevamente, la combinación demostró una actividad antitumoral significativamente mayor (p < 0.050) que cualquiera de los regímenes de monoterapia.

La inmunofenotipificación basada en FACS llevada a cabo en estudios reveló aumentos en varios marcadores inmunológicos compatibles con una MOA impulsada por células T CD8+, inclusive el aumento de los niveles esplénicas de células T CD8+ específicas de antígeno de tumor p15E, un incremento en la relación esplénica de T^emcon respecto a células T reguladoras (Treg), y el aumento de los porcentajes de células CD8+ esplénicas. Además, se observó que el porcentaje de células asesinas naturales (NK) que infiltran el tumor y las células T CD8+ aumentó de manera significativa en el grupo de combinación.

4.8 Estudio de toxicidad piloto de dosis repetida de 4 semanas en mono cynomolgus

Cuatro grupos de 2 machos y 2 monos cynomolgus hembras fueron tratados con PD-L1 antihumano (A09-246-2) a niveles de dosis de 0 (vehículo), 20, 60 y 140 mg/kg de infusión intravenosa semanal durante un total de 5 administraciones.

La evaluación TK indica que todos los animales fueron expuestos a la sustancia de ensayo durante todo el estudio. Los niveles de exposición se incrementaron más o menos proporcionalmente con respecto a la dosis tanto a la dosis primera como a la cuarta, sin ninguna acumulación pertinente o función de género, a cualquier dosis. Se detectó anticuerpo antifármaco en 2/4 y 1/4 de los monos en los niveles 20 y 140 mg/kg, respectivamente. No hubo ninguna muerte prematura

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-PD-L1 aislado o su fragmento de unión a antígeno que comprende una secuencia de región variable de cadena pesada y de cadena ligera, en donde:

(a) la cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde también: (i) la secuencia de HVR-H1 es SYIMM (SEQ ID NO: 15); (ii) la secuencia de HVR-H2 es SIYPSGGITFYADTVKG (SEQ ID NO: 16); (iii) la secuencia de HVR-H3 es IKLGTVTTVDY (SEQ ID NO: 17) y

donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende además:

(a) secuencias de entramado de cadena pesada de región variable HC-FR1, HC-FR2, HC-FR3 y HC-FR4, yuxtapuestas entre las HVR, formando así la secuencia de la fórmula: (HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4), y

(b) secuencias de entramado de cadena ligera de región variable LC-FR1, LC-FR2, LC-FR3 y LC-FR4, yuxtapuestas entre las HVR, formando así la secuencia de la fórmula: (LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4).

2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(a) las secuencias de entramado de cadena pesada variable son las siguientes:

(i) HC-FR1 es EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS (SEQ ID NO:4);

(ii) HC-FR2 es WVRQAPGKGLEWVS (SEQ ID NO: 5);

(iii) HC-FR3 es RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:6);

(iv) HC-FR4 es WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7); y

(b) las secuencias de entramado de cadena ligera variable son las variables:

(i) LC-FR1 es QSALTQPASVSGSPGQSITISC (SEQ ID NO:11);

(ii) LC-FR2 es WYQQHPGKAPKLMIY (SEQ ID NO: 12);

(iii) LC-FR3 es GVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC (SEQ ID NO: 13);

(iv) LC-FR4 es FGTGTKVTVL (SEQ ID NO: 14).

3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 que comprende además un dominio C^l, a C^h1, a C^h2 y C^h3.

4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además una región constante humana o murina, en el que la región constante es IgG1.

5. Una composición que comprende el anticuerpo anti-PD-L1 o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable.

6. Un anticuerpo anti-PD-L1 de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que induce citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC), para su uso en el tratamiento del cáncer que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de tal anticuerpo anti-PD-L1.

7. El anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en: cáncer de mama, de pulmón, de colon, de ovario, melanoma, de vejiga, de riñón, de hígado, de saliva, de estómago, gliomas, de tiroides, tímico, epitelial, cánceres de cabeza y de cuello, cáncer gástrico y de páncreas.

8. Un anticuerpo anti-PD-L1 de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una composición de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de inmunidad tumoral que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de tal anticuerpo anti-PD-L1 o composición a un paciente que padece inmunidad tumoral.

9. El anticuerpo anti-PD-L1 para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la inmunidad tumoral resulta de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en: cáncer de mama, de pulmón, de colon, de ovario, melanoma, de vejiga, de riñón, de hígado, de saliva, de estómago, gliomas, de tiroides, tímico, epitelial, cánceres de cabeza y de cuello, cáncer gástrico y de páncreas.

10. El anticuerpo anti-PD-LI o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-9, que comprende además la administración de al menos un agente terapéutico adicional, seleccionado de un grupo que consiste en gemcitabina, ciclofosfamida, o una combinación de 5-fluorouracilo y oxaliplatino.