CN119552248A - B7-h4抗体及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了特异性结合至人类B7‑H4(并且任选地结合至食蟹猕猴、小鼠和/或大鼠B7‑H4)的抗体和其抗原结合片段，以及包含此类抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个特定方面，所述特异性结合至人类B7‑H4的抗体或其抗原结合片段增加T细胞增殖，增加干扰素‑γ产生和/或通过ADCC活性耗尽表达B7‑H4的细胞。本公开还提供通过施用特异性结合至人类B7‑H4的抗体或其抗原结合片段来治疗病症如癌症的方法。
Description
本申请为分案，其母案申请的申请号为201880059953.1，申请日为2018年8月23日，发明名称为“B7-H4抗体及其使用方法”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年8月25日提交的美国临时申请第62/550,173号、2017年10月31日提交的美国临时申请第62/579,774号、2017年12月19日提交的美国临时申请第62/607,810号以及2018年4月12日提交的美国临时申请第62/656,789号的权益，各案以全文引用的方式并入本文中。
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发明背景
技术领域
本公开涉及特异性结合至人类B7-H4的抗体、包含此类抗体的组合物以及产生和使用特异性结合至B7-H4的抗体的方法。
相关技术的描述
B7-H4(又称为B7x、B7-S1和VTCN1)是与包括PD-L1在内的其它B7家族成员共有同源性的一种免疫调节分子。它是包含IgV和IgC胞外结构域的I型跨膜蛋白。尽管在蛋白质水平上，B7-H4在健康组织中的表达相对有限，但B7-H4在若干实体肿瘤，如乳癌、卵巢癌和子宫内膜癌之类妇科癌瘤中有表达。B7-H4在肿瘤中的表达量往往与不良预后相关。B7-H4的受体仍未知，但相信它是在T细胞上表达。相信B7-H4直接抑制T细胞活性。
已知B7-H4的表达和功能，本文中提供特异性结合至B7-H4的抗体以及这些抗体调节B7-H4活性，包括在癌症治疗中的用途。
发明内容
本文中提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列：对应地，SEQ ID NO:5-10；对应地，SEQ ID NO:15-20；对应地，SEQ ID NO:25-30；对应地，SEQ ID NO:35-40；对应地，SEQ ID NO:458-463；对应地，SEQ ID NO:45-50；对应地，SEQ ID NO:55-60；对应地，SEQ ID NO:65-70；对应地，SEQ ID NO:75-80；对应地，SEQ ID NO:85-90；对应地，SEQ IDNO:95-100；对应地，SEQ ID NO:105-110；对应地，SEQ ID NO:115-120；对应地，SEQ ID NO:125-130；对应地，SEQ ID NO:135-140；对应地，SEQ ID NO:145-150；对应地，SEQ ID NO:155-160；对应地，SEQ ID NO:165-170；对应地，SEQ ID NO:175-180；对应地，SEQ ID NO:185-190；以及对应地，SEQ ID NO:195-200。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列的VH。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列的VL。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列。
本文也提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列。
本文也提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括分别含以下氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区：SEQ ID NO:11和12；SEQ ID NO:21和22；SEQ ID NO:31和32；SEQ ID NO:41和42；SEQ IDNO:464和42；SEQ ID NO:51和52；SEQ ID NO:61和62；SEQ ID NO:71和72；SEQ ID NO:81和82；SEQ ID NO:91和92；SEQ ID NO:101和102；SEQ ID NO:111和112；SEQ ID NO:121和122；SEQ ID NO:131和132；SEQ ID NO:141和142；SEQ ID NO:151和152；SEQ ID NO:161和162；SEQ ID NO:171和172；SEQ ID NO:181和182；SEQ ID NO:191和192；或SEQ ID NO:201和202。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段另外包含重链恒定区。在一个实施例中，所述重链恒定区选自由人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2重链恒定区组成的组。
在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段另外包含轻链恒定区。在一个实施例中，所述轻链恒定区选自由人类免疫球蛋白IgGκ和IgGλ轻链恒定区组成的组。
在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段另外包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区是人类IgG1重链恒定区，并且其中所述轻链恒定区是人类IgGκ轻链恒定区。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:13、23、33、43、469、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193或203的氨基酸序列的重链。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194或204的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括分别含以下氨基酸序列的重链和轻链：SEQ ID NO:13和14；SEQ ID NO:23和24；SEQ ID NO:33和34；SEQ ID NO:43和44；SEQ ID NO:469和44；SEQ ID NO:53和54；SEQ ID NO:63和64；SEQ ID NO:73和74；SEQ IDNO:83和84；SEQ ID NO:93和94；SEQ ID NO:103和104；SEQ ID NO:113和114；SEQ ID NO:123和124；SEQ ID NO:133和134；SEQ ID NO:143和144；SEQ ID NO:153和154；SEQ ID NO:163和164；SEQ ID NO:173和174；SEQ ID NO:183和184；SEQ ID NO:193和194；或SEQ IDNO:203和204。
本文还提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的抗体的VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2以及VL CDR3：15461、20500、20501、20502、20502.1、22208、15462、22213、15465、20506、15483、20513、22216、15489、20516、15472、15503、15495、15478、15441和20496。在一个实施例中，所述CDR是Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
本文还提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ IDNO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区和含SEQID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区和含SEQID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区和含SEQID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)其中所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种结合至人类B7-H4中与权利要求1至20中任一项的抗体或其抗原结合片段所结合相同的表位的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，如由SPR所测定，所述抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4的同一表位。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是人类抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是鼠类、人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段诱导T细胞增殖。在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段使T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少21％。在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段使T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约35％。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段诱导CD4+T细胞增殖。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段使CD4+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少9％。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段使CD4+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约15％。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段诱导CD8+T细胞增殖。在一个实施例中，所述抗体或抗原结合片段使CD8+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少11％。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段使CD8+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约15％。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段诱导干扰素γ(IFNγ)产生。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段能够使IFNγ产生增加至少2倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、约2倍至约10倍，或约3倍至约10倍。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段能够在B7-H4表达细胞中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段诱导至少20％、至少30％、至少40％、约20％至约50％，或约30％至约50％的表达B7-H4的细胞的特异性水解。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段在鼠类CT26结肠直肠癌模型、鼠类乳癌4T1模型或黑素瘤细胞系B16-moB7-H4/H3模型中抑制肿瘤生长。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段使肿瘤生长相较于用对照抗体处理减少至少25％、至少30％、至少40％、至少45％或至少50％。
在一个实施例中，T细胞增殖的诱导、CD4+T细胞增殖的诱导、CD8+T细胞增殖的诱导、IFNγ产生的诱导、ADCC活性和/或肿瘤生长的抑制是剂量依赖性的。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至食蟹猕猴B7-H4。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至大鼠B7-H4。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至小鼠B7-H4。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4、食蟹猕猴B7-H4、大鼠B7-H4和小鼠B7-H4。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4的IgV结构域。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是全长抗体。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。在一个实施例中，所述抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段还包含可检测标记。
本文还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子。在一个实施例中，所述核酸分子编码SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的VH，或SEQ ID NO:13、23、33、43、469、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193或203的重链。在一个实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:213、223、233、243、470、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、383、393或403的序列。在一个实施例中，所述核酸分子包含(i)SEQ ID NO:213、223、233、243、470、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、383、393或403的序列；和(ii)SEQ ID NO:408的序列。
本文还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本文所提供的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子。在一个实施例中，所述核酸分子编码SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的VL，或SEQ ID NO:14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194或204的轻链。在一个实施例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394或404的序列。在一个实施例中，所述核酸分子包含(i)SEQ ID NO:214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394或404的序列；和(ii)SEQ ID NO:406的序列。
本文还提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码本文所提供的抗体或抗原结合片段的重链可变区或重链以及所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子。
本文还提供一种分离的载体，所述载体包含本文所提供的多核苷酸。
本文还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、包含一个本文所提供的多核苷酸(例如包含可变重链或重链编码核酸的多核苷酸)的第一载体以及包含另一种本文所提供的多核苷酸(例如包含可变轻链或轻链编码核酸的多核苷酸)的第二载体。在一个实施例中，所述宿主细胞是选自由以下组成的组的细胞：大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)、杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptomyces)、酵母、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10细胞、组织培养物中的植物细胞、昆虫细胞以及人类细胞。在一个实施例中，宿主细胞是CHO细胞。在一个实施例中，宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞，如CHO细胞)缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)。
本文还提供一种产生结合至人类B7-H4的抗体或其抗原结合片段的方法(例如体外方法)，该方法包括培养本文所提供的宿主细胞，由此表达核酸分子并产生抗体或其抗原结合片段。
本文还提供一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人类B7-H4且由本文所提供的多核苷酸编码。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体或本文所提供的宿主细胞；以及药学上可接受的赋形剂。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本文所提供的抗体或抗原结合片段和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本文所提供的抗体或抗原结合片段和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区和含SEQID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ IDNO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ IDNO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)其中所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)其中所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
在一个实施例中，在所述组合物中没有检测到岩藻糖基化。
本文还提供一种用于诱导T细胞增殖的方法，所述方法包括使T细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。在一个实施例中，T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％(例如相较于用对照抗体处理)。
本文还提供一种用于诱导CD4+T细胞增殖的方法，所述方法包括使CD4+T细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。在一个实施例中，CD4+T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％(例如相较于用对照抗体处理)。
本文还提供一种用于诱导CD8+T细胞增殖的方法，所述方法包括使CD8+T细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。在一个实施例中，CD8+T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％(例如相较于用对照抗体处理)。
本文还提供一种用于诱导干扰素γ产生的方法，所述方法包括使T细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。在一个实施例中，干扰素γ产生增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％(例如相较于用对照抗体处理)。
本文还提供一种用于杀灭表达B7-H4的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。
本文还提供一种用于耗尽细胞群中表达B7-H4的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞群与本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物接触。
在一个实施例中，所述杀灭或耗尽是通过ADCC发生。
在一个实施例中，所述接触是在体外进行。在一个实施例中，所述接触是在受试者体内进行。
本文还提供一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物。在一个实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：乳癌，如三阴性乳癌或侵袭性导管癌；子宫内膜癌；卵巢癌；非小细胞肺癌；胰腺癌；甲状腺癌；肾癌；以及膀胱癌。在一个实施例中，所述乳癌是三阴性乳癌或其中所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。在一个实施例中，所述非小细胞肺癌是腺癌。在一个实施例中，所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、小细胞肺癌、胃癌和黑素瘤。在一个实施例中，卵巢癌是浆液性腺癌。在一个实施例中，乳癌是导管腺癌。
在一个实施例中，所述癌症是PD-1抑制剂反应不足和/或PD-L1抑制剂反应不足性癌症。在一个实施例中，所述癌症低水平表达PD-L1。
在一个实施例中，受试者是人类。
本文还提供一种用于检测样品中的B7-H4的方法，所述方法包括使所述样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触。在一个实施例中，所述样品是自人类受试者的癌症获得。
本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所提供的抗体或其抗原结合片段、本文所提供的多核苷酸、本文所提供的载体、本文所提供的宿主细胞或本文所提供的药物组合物；以及a)检测试剂、b)B7-H4抗原、c)反映批准使用或销售用于人类施用的通知，或d)其组合。
本文还提供一种分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制B7-H4的T细胞检查点阻断活性。在一个实施例中，所述T细胞检查点阻断活性是由IL-2产生相对于对照细胞增加来测量。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)抗体或抗原结合片段，和(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述抗体或抗原结合片段抑制B7-H4的T细胞检查点阻断活性。在一个实施例中，所述T细胞检查点阻断活性是由IL-2产生相对于对照细胞增加来测量。
附图说明
图1A显示在多种肿瘤组织中B7-H4的表达。(参看实例1。)
图1B显示通过IHC测定的各种肿瘤类型中B7-H4的流行率(prevalence)。(参看实例1。)
图2A显示B7-H4抗体与表达人类、食蟹猕猴或小鼠B7-H4的HEK293T细胞的结合。(参看实例6。)
图2B显示B7-H4抗体与SK-BR-3细胞以及与表达小鼠、食蟹猕猴或大鼠B7-H4的HEK293T细胞的结合。(参看实例6。)
图3A显示B7-H4抗体对CD4+T细胞、CD8+T细胞或总T细胞增殖的影响。(参看实例7。)
图3B显示B7-H4抗体对干扰素-γ(IFNγ)产生的影响。(参看实例7。)
图3C显示B7-H4抗体对CD4+T细胞、CD8+T细胞或总T细胞增殖以及对干扰素-γ(IFNγ)产生的影响。(参看实例7。)
图3D显示各种浓度的B7-H4抗体对干扰素-γ(IFNγ)产生的影响。(参看实例7。)
图4A-4D显示岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗体与SK-BR-3细胞(图4A)以及与表达小鼠(图4B)、食蟹猕猴(图4C)或大鼠B7-H4(图4D)的HEK293T细胞上B7-H4的结合。(参看实例9。)
图5A和5B显示无岩藻糖基化和岩藻糖基化B7-H4抗体(分别地)与人类Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)V158等位基因的结合。(参看实例10。)
图6A显示岩藻糖基化和无岩藻糖基化B7-H4抗体的T细胞检查点阻断活性。(参看实例11。)
图6B显示通过IL-2产量所测量的无岩藻糖基化B7-H4抗体的T细胞检查点配体活性与同型对照处理的细胞的比较。(参看实例11。)
图7显示岩藻糖基化和无岩藻糖基化B7-H4抗体针对B7-H4表达细胞系的ADCC活性。(参看实例12。)
图8显示岩藻糖基化和无岩藻糖基化B7-H4抗体针对具有各种B7-H4表达量的细胞的ADCC活性。(参看实例13。)
图9A显示B7-H4抗体20502的体内抗肿瘤功效。(参看实例14。)
图9B显示B7-H4抗体22213的体内抗肿瘤功效。(参看实例14。)
图10显示B7-H4抗体20502的鼠类形式在植入4T1(乳癌)和B16(黑素瘤)细胞的小鼠中的体内抗肿瘤功效。(参看实例14。)
图11显示无岩藻糖基化20502在MX-1人类乳癌异种移植模型中的体内抗肿瘤功效。图像显示在MX-1异种移植肿瘤中的人类B7-H4表达(左图)以及在4T1肿瘤中的鼠类B7-H4表达(右图)。(参看实例14。)
图12A-12C显示在与抗PD-1抗体同一天施用20502-msIgG2a-F的体内抗肿瘤功效。(参看实例15。)*指示p<0.05；且****指示p<0.0001。
图13显示相较于用对照抗体处理(上图)，用无岩藻糖基化20502处理(下图)引起NK细胞浸润(左图)、T细胞浸润(中图)及PD-L1上调(右图)。(参看实例16。)
图14A显示，20502-msIgG2a-F抗体在4T1乳癌细胞中以剂量依赖性方式明显减少肿瘤生长。(参看实例17。)
图14B显示，如在第30天通过单因素方差分析(OneWay ANOVA)所评估，20502-msIgG2a-F抗体在30mg/kg(p＝0.0003)、20mg/kg(p＝0.0103)、10mg/kg(p＝0.0419)、3mg/kg(p＝0.0277)及1mg/kg(p＝0.0333)下明显抑制肿瘤生长。(参看实例17。)
图15A显示，20502-msIgG2a-F抗体明显减少表达B7-H4/H3的B16生长。(参看实例17。)
图15B显示，如在第23天通过单因素方差分析所评估，20502-msIgG2a-F抗体在30mg/kg(p＝0.0085)、20mg/kg(p＝0.0041)、10mg/kg(p＝0.0017)及3mg/kg(p＝0.0420)下明显抑制肿瘤生长。(参看实例17。)
具体实施方式
本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体(例如单克隆抗体)及其抗原结合片段。这些B7-H4抗体和其抗原结合片段可以例如引起T细胞检查点阻断活性(例如通过干扰素γ(IFNγ)、CD4T细胞增殖、CD8 T细胞增殖和/或总T细胞增殖增加来测量)和/或具有抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC活性)。
本文还提供了编码此类抗体和其抗原结合片段的分离的核酸(多核苷酸)，如互补DNA(cDNA)。还提供了包含编码此类抗体和其抗原结合片段的核酸(多核苷酸)的载体(例如表达载体)和细胞(例如宿主细胞)。还提供了制备此类抗体和其抗原结合片段的方法。在其它方面，本文提供了用于治疗某些病况如癌症的方法。还提供了相关组合物(例如药物组合物)、试剂盒和检测方法。
1.1术语
如本文所使用，术语“B7-H4”是指哺乳动物B7-H4多肽，包括但不限于天然B7-H4多肽和B7-H4多肽的同功异型物。“B7-H4”涵盖全长、未加工的B7-H4多肽以及由细胞内加工产生的B7-H4多肽形式。如本文所使用，术语“人类B7-H4”是指包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的多肽。“B7-H4多肽”、“B7-H4核苷酸”或“B7-H4核酸”是指编码B7-H4的多核苷酸。
如本文所使用，术语“PD-1”是指哺乳动物PD-1多肽，包括但不限于天然PD-1多肽和PD-1多肽的同功异型物。PD-1又称为计划性死亡蛋白1或计划性细胞死亡蛋白1。“PD-1”涵盖全长、未加工的PD-1多肽以及由在细胞内加工得到的PD-1多肽形式。如本文所使用，术语“人类PD-1”是指包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的多肽：
PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTSESFVLNWYRM SPSNQTDKLAAFPEDRSQPG QDCRFRVTQLPNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGSLVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTSSPARRGSADG PRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO:439)(不含信号肽的成熟人类PD-1)。“PD-1多核苷酸”、“PD-1核苷酸”或“PD-1核酸”是指编码PD-1的多核苷酸。
术语“抗体”意思指一种免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子通过其可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合至靶，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述各物的组合。如本文所使用，术语“抗体”涵盖完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的融合蛋白，及任何其它修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体展现所希望的生物活性即可。抗体可以属于五个主要类别的免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，或其亚类(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)，基于其重链恒定结构域的属性，分别称为α、δ、ε、γ及μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚单元结构和三维构造。抗体可以是裸抗体，或与其它分子，如毒素、放射性同位素等缀合。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分。“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”是指完整抗体中结合至抗原的一部分。抗原结合片段可以含有完整抗体的抗原决定区(例如互补决定区(CDR))。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体以及单链抗体。抗体的抗原结合片段可以来源于任何动物物种，如啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)和人类，或可以是人工制造的。
术语“抗B7-H4抗体”、“B7-H4抗体”和“结合至B7-H4的抗体”是指这样一种抗体，该抗体能够以足够亲和力结合B7-H4以使得该抗体可用作靶向B7-H4的诊断剂和/或治疗剂。如例如由放射免疫分析(RIA)所测量，抗B7-H4抗体与不相关的非B7-H4蛋白质的结合程度可以比该抗体与B7-H4的结合低约10％。
术语“抗PD-1抗体”、“PD-1抗体”和“结合至PD-1的抗体”是指这样一种抗体，该抗体能够以足够亲和力结合PD-1以使得该抗体可用作靶向PD-1的诊断剂和/或治疗剂。如例如由放射免疫分析(RIA)所测量，抗PD-1抗体与不相关的非PD-1蛋白质的结合程度可以比该抗体与PD-1的结合低约10％。
“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指参与单一抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质性抗体或抗原结合片段群。它与多克隆抗体形成对比，多克隆抗体典型地包括针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆”抗体或其抗原结合片段涵盖完整和全长单克隆抗体以及抗体片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆”抗体或其抗原结合片段是指以多种方式，包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物制备的此类抗体和其抗原结合片段。
如本文所使用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用且是本领域中常用的。可变区典型地是指抗体的一部分，一般是轻链或重链的一部分，典型地是成熟重链中的大致氨基末端110至120个氨基酸或110至125个氨基酸以及成熟轻链中约90至115个氨基酸，其序列随抗体而明显不同且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列变异集中在称为互补决定区(CDR)的区域，而可变结构域中高度保守的区域称为构架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论束缚，相信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在某些实施例中，可变区是人类可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR以及人类构架区(FR)。在特定实施例中，可变区是灵长类动物(例如非人类灵长类动物)可变区。在某些实施例中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR以及灵长类动物(例如非人类灵长类动物)构架区(FR)。
术语“VL”与“VL结构域”可互换使用，指抗体的轻链可变区。
术语“VH”与“VH结构域”可互换使用，指抗体的重链可变区。
术语“Kabat编号”和类似术语是本领域中公认的，并且是指对抗体或其抗原结合片段的重链和轻链可变区中的氨基酸残基编号的系统。在某些方面，CDR可以根据Kabat编号系统测定(参见例如Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci 190:382-391；以及KabatEA等人,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号系统，在抗体重链分子内的CDR典型地存在于氨基酸位置31至35，所述CDR任选地可以在35位后包括一个或两个额外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A及35B)(CDR1)；氨基酸位置50至65(CDR2)；以及氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号系统，在抗体轻链分子内的CDR典型地存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)以及氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个特定实施例中，本文所描述的抗体的CDR是根据Kabat编号方案确定。
而Chothia是指结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环长度而在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处有插入；如果不存在35A和35B，则该环在32处结束；如果仅存在35A，则该环在33处结束；如果同时存在35A和35B，则该环在34处结束)。AbM高变区表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中，并且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。
如本文所使用，术语“恒定区”或“恒定结构域”可互换使用且具有它们在本领域中常用的含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但能展现各种效应功能，如与Fc受体相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区一般具有较为保守的氨基酸序列。在某些方面，抗体或抗原结合片段包含足以实现抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的恒定区或其部分。
如本文所使用，在提到抗体时使用的术语“重链”可以基于恒定结构域的氨基酸序列而指任何截然不同的类型，例如α、δ、ε、γ及μ，由此分别得到IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体类别，包括IgG的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列是本领域中熟知的。在具体实施例中，重链是人类重链。
如本文所使用，在提到抗体时使用的术语“轻链”可以基于恒定结构域的氨基酸序列而指任何截然不同的类型，例如κ或λ。轻链氨基酸序列是本领域中众所周知的。在具体实施例中，轻链是人类轻链。
术语“嵌合”抗体或其抗原结合片段是指氨基酸序列来源于两个或两个以上物种的抗体或其抗原结合片段。典型地，轻链和重链的可变区对应于来源于具有所希望的特异性、亲和力和能力的一个哺乳动物物种(例如小鼠、大鼠、兔等)的抗体或其抗原结合片段的可变区，而恒定区与来源于另一个物种(通常是人类)的抗体或其抗原结合片段中的序列同源以避免在该物种中引起免疫反应。
术语“人源化”抗体或其抗原结合片段是指非人类(例如鼠类)抗体的形式或抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是特定免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其含有最小非人类(例如鼠类)序列的片段。典型地，人源化抗体或其抗原结合片段是来自互补决定区(CDR)的残基被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR的残基置换(“CDR移植”)的人类免疫球蛋白(Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science 239:1534-1536(1988))。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基是被来自具有所希望的特异性、亲和力和能力的非人类物种的抗体或片段中的相应残基置换。人源化抗体或其抗原结合片段可进一步通过取代Fv构架区中和/或被置换的非人类残基内的额外残基进行修饰以精制并优化抗体或其抗原结合片段的特异性、亲和力和/或能力。一般而言，人源化抗体或其抗原结合片段将包含至少一个，且典型地两个或三个可变结构域的大体上全部，所述结构域含有所有或大体上所有的与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，而所有或大体上所有的FR区是人类免疫球蛋白共同序列的FR区。人源化抗体或其抗原结合片段也可包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，典型地是人类免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利5,225,539；Roguska等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)；及Roguska等人,Protein Eng.9(10):895-904(1996)中。在一些实施例中，“人源化抗体”是表面重塑的抗体。
术语“人类”抗体或其抗原结合片段意谓具有来源于人类免疫球蛋白基因座的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段，其中此类抗体或抗原结合片段是使用本领域中已知的任何技术制备。这一有关人类抗体或其抗原结合片段的定义包括完整或全长抗体及其片段。
“无岩藻糖基化”抗体或其抗原结合片段或者“缺乏岩藻糖”的抗体或其抗原结合片段是指在恒定区糖基化中缺乏岩藻糖的IgG1或IgG3同型抗体或其抗原结合片段。当核心岩藻糖基化双触角复合物寡糖糖基化以至多2个Gal残基封端时，人类IgG1或IgG3的糖基化是在Asn297处发生。在一些实施例中，无岩藻糖基化抗体在Asn297处没有岩藻糖。取决于末端Gal残基的量，这些结构称为G0、G1(a 1,6或a 1,3)或G2聚糖残基。参见例如Raju,T.S.,BioProcess Int.1:44-53(2003)。抗体Fc的CHO型糖基化描述于例如Routier,F.FL,Glycoconjugate J.14:201-207(1997)中。
测量岩藻糖的方法包括本领域中已知的任何方法。出于本文的目的，岩藻糖是通过WO2015/017600的实例1中所描述的方法检测，该案以全文引用的方式并入本文中。简单点说，通过自抗体释放聚糖(例如通过酶法释放)，用邻氨基苯甲酸(2-AA)标记聚糖，接着纯化被标记的聚糖来进行聚糖分析。使用带荧光检测的正相HPLC分离各聚糖，并测量抗体中各聚糖的相对量。聚糖可以通过质谱法确定地鉴别为缺乏或包括岩藻糖。在一些实施例中，在包含多种无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段的组合物中无法检测到岩藻糖。在一些实施例中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段具有增强的ADCC活性，该活性可以通过本文实例12中所提供的分析测量。在一些实施例中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA具有增强的亲和力。在一些实施例中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA(V158)具有增强的亲和力。在一些实施例中，无岩藻糖基化抗体或其抗原结合片段对FcγRIIIA(F158)具有增强的亲和力。针对FcγRIIIA或其等位基因的亲和力可以通过本文实例10中所提供的分析测量。
“结合亲和力”一般是指一个分子(例如抗体或其抗原结合片段)的单一结合位点与其结合搭配物(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另作指示，否则如本文所使用，“结合亲和力”是指反映结合对成员(例如抗体或其抗原结合片段与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其搭配物Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域中已知的多种方式测量和/或表示，包括但不限于，平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA)。KD是由koff/kon的商计算，而KA是由kon/koff的商计算。kon是指例如抗体或其抗原结合片段与抗原的缔合速率常数，且koff是指例如抗体或其抗原结合片段自抗原解离。kon和koff可以由本领域普通技术人员已知的技术，如或KinExA测定。
如本文所使用，“表位”是本领域中的一个术语，并且是指抗体或其抗原结合片段能特异性结合的抗原的局部区域。表位可以例如是多肽的相邻氨基酸(线性或相邻表位)，或表位可以例如是来自一个或多个多肽的两个或更多个不相邻区域(构象、非线性、不连续或不相邻表位)。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段的表位可以通过例如NMR波谱法、X射线衍射结晶学研究、ELISA分析、氢/氘交换结合质谱法(例如液相色谱-电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描分析和/或诱变定位(例如定点诱变定位)测定。对于X射线结晶法，结晶可以使用本领域中已知的任何方法实现(例如GiegéR等人(1994)Acta Crystallogr DBiol Crystallogr 50(第4部分):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体/其抗原结合片段:抗原晶体可以使用众所周知的X射线衍射技术研究并且可以使用计算机软件精修，如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.发布；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114及115卷,Wyckoff HW等人编；U.S.2004/0014194)，以及BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(第1部分):37-60；Bricogne G(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW编；Roversi P等人(2000)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(第10部分):1316-1323)。诱变定位研究可以使用本领域技术人员已知的任何方法实现。有关诱变技术，包括丙氨酸扫描诱变技术的描述，参见例如Champe M等人(1995)J Biol Chem 270:1388-1394，以及Cunningham BC和Wells JA(1989)Science 244:1081-1085。
与参考B7-H4抗体“结合至相同表位”的B7-H4抗体是指与参考B7-H4抗体结合至相同B7-H4氨基酸残基的抗体。B7-H4抗体与参考B7-H4抗体结合至相同表位的能力是通过氢/氘交换分析测定(参见Coales等人,Rapid Commun.Mass Spectrom.2009；23:639–647)。
如本文所使用，术语“免疫特异性结合”、“免疫特异性识别”、“特异性结合”和“特异性识别”在抗体或其抗原结合片段的情形中是类似的术语。这些术语指示，抗体或其抗原结合片段通过其抗原结合结构域结合至表位且该结合需要该抗原结合结构域与表位之间存在一定互补性。因此，“特异性结合”至人类B7-H4(SEQ ID NO:1)的抗体也可结合至来自其它物种的B7-H4(例如食蟹猕猴、小鼠和/或大鼠B7-H4)和/或由其它人类等位基因产生的B7-H4蛋白质，但如例如通过放射免疫分析(RIA)所测量，该抗体结合至不相关的非B7-H4蛋白质(例如其它B7蛋白质家族成员，如PD-L1)的程度比它与B7-H4的结合低约10％。
在一个特定实施例中，本文提供了一种结合至人类、食蟹猕猴、小鼠和大鼠B7-H4的抗体或其抗原结合片段。
如果一种抗体优先结合至给定表位或重叠表位，使得它在某种程度上阻断参考抗体与该表位的结合，则认为该抗体“竞争性抑制”该参考抗体与该表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域中已知的任何方法，例如竞争ELISA分析测定。据信，抗体可以将参考抗体与给定表位的结合竞争性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈自然界中未发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括纯化达到使其不再呈其在自然界所见的形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施例中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是大体上纯的。如本文所使用，“大体上纯”是指物质是至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是线性或分支的，它可包含修饰的氨基酸，并且它可间杂非氨基酸。这些术语也涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域中已知的其它修饰的多肽。应了解，由于本发明的多肽是基于抗体的，故在某些实施例中，这些多肽可以呈单链或结合链形式存在。
“一致性百分比”是指两个序列(例如氨基酸序列或核酸序列)之间的一致性程度。一致性百分比可以通过对准两个序列，引入空位以使这些序列之间的一致性最大来测定。对准可以使用本领域中已知的程序产生。出于本文的目的，核苷酸序列的对准可以用blastn程序，以设置的默认参数执行，并且氨基酸序列的对准可以用blastp程序，以设置的默认参数执行(参见国家生物技术资讯中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的万维网，ncbi.nlm.nih.gov)。
如本文所使用，术语“宿主细胞”可以是任何类型的细胞，例如原代细胞、培养的细胞，或来自细胞系的细胞。在特定实施例中，术语“宿主细胞”是指被核酸分子转染的细胞以及此类细胞的子代或可能的子代。此类细胞的子代可能例如因在以后数代中发生的突变或环境影响或该核酸分子整合至宿主细胞基因组中而与被核酸分子转染的亲本细胞不相同。
术语“药物配制物”是指呈使活性成分的生物活性有效的形式且不含对将施用配制物的受试者产生不可接受的毒性的其它组分的制剂。所述配制物可以是无菌的。
如本文所使用，术语“施用(administer/administering/administratio n)”和类似表述是指可以用于实现药物，例如抗B7-H4抗体或其抗原结合片段向希望的生物作用部位递送的方法(例如静脉内施用)。可以用于本文所述的试剂和方法的施用技术见于例如Goodman及Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,现行版,Pergamon；及Remington's,Pharmaceutical Sciences,现行版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa。
与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(并行)或以任何次序连续施用。
组合疗法可以提供“协同作用”，即，当活性剂一起使用时实现的作用超过单独使用各活性剂引起的作用的总和。当存在以下情况时可以获得协同作用：(1)共配制各活性成分并以组合的单位剂量配制物形式同时施用或递送；(2)以独立配制物形式连续、交替地或平行递送各活性成分；或(3)通过某种其它方案施用各活性成分。当以交替疗法递送时，如果通过例如用独立注射器进行不同注射依序施用或递送各活性剂，则可以获得协同作用。“协同组合”产生的作用高于该组合中个别活性剂的作用的总和。
组合疗法可以提供“加和”作用，即，当活性剂一起使用时实现的作用等于单独使用各活性剂引起的作用的总和。
如本文所使用，术语“受试者”与“患者”可互换使用。受试者可以是动物。在一些实施例中，受试者是哺乳动物，如非人类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠、猴或其它灵长类动物等)。在一些实施例中，受试者是食蟹猕猴。在一些实施例中，受试者是人类。
术语“治疗有效量”是指有效治疗受试者的疾病或病症的药物，例如抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的量。就癌症而言，药物的治疗有效量可以减少癌细胞数量；减小肿瘤尺寸或负荷；抑制(即，在一定程度上减慢且在某一实施例中停止)周围器官中的癌细胞浸润；抑制(即，在一定程度上减慢且在某一实施例中停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；在一定程度上缓解一种或多种癌症相关症状；和/或引起有利反应，如增加无进展存活期(PFS)、无疾病存活期(DFS)或总体存活率(OS)、完全反应(CR)、部分反应(PR)，或在一些情况下稳定疾病(SD)、减轻进行性疾病(PD)、缩短进展时间(TTP)或其任何组合。就药物可以预防癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞而言，所述药物可以是细胞抑制性和/或细胞毒性药物。
术语如治疗(“treating/treatment/to treat)”或“减轻(alleviating/toalleviate)是指治愈所诊断的病理病况或病症、减慢其进展、减轻其症状和/或停止其进展的治疗措施。因此，需要治疗者包括已诊断患有或怀疑患有该病症者。在某些实施例中，如果患者显示以下一种或多种情形，则根据本发明的方法成功地“治疗”受试者的癌症：癌细胞数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减小；周围器官中癌细胞的浸润，例如软组织和骨骼中癌症的扩散受到抑制或不存在；肿瘤转移受到抑制或不存在；肿瘤生长受到抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状缓解；发病率和死亡率降低；生活质量改善；肿瘤的肿瘤发生、肿瘤发生频率或肿瘤发生能力减小；肿瘤中癌症干细胞的数量或频率减小；肿瘤发生细胞向非肿瘤发生状态分化；无进展存活期(PFS)、无疾病存活期(DFS)或总体存活期(OS)增加、完全反应(CR)、部分反应(PR)、稳定疾病(SD)、进行性疾病(PD)减轻、进展时间(TTP)缩短或其任何组合。
术语“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物体内的细胞群以不受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于妇科癌症(例如乳癌(包括三阴性乳癌、导管癌)、卵巢癌和子宫内膜癌)、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)以及膀胱癌(例如膀胱上皮细胞癌)。非小细胞非癌可以是例如腺癌。癌症的其它实例包括例如头颈癌、小细胞肺癌、胃癌、黑素瘤、胆管上皮癌、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM)，及默克细胞癌(merkel cell carcinoma)。在一个实施例中，卵巢癌是浆液性腺癌。在一个实施例中，乳癌是导管腺癌。癌症可以是“表达B7-H4的癌症”或“B7-H4表达性癌症”。这些术语是指包含表达B7-H4的细胞的癌症。癌症可以是原发性肿瘤或可以是晚期或转移性癌。
“难治性”癌症是即使向癌症患者施用如化学疗法之类抗肿瘤治疗仍进展的癌症。
“复发性”癌症是在对初始疗法起反应后，在初始部位或远端部位处再生长的癌症。
“再发性”患者是在缓解后具有癌症病征或症状的患者。任选地，该患者在辅助或新辅助疗法之后再发。
“T细胞检查点阻断活性”是指阻断或抑制T细胞检查点活性或反应。T细胞检查点阻断活性可以在人工抗原呈递细胞(aAPC)分析中基于IFNγ产量的变化测量。可以使用T细胞富集试剂盒(如EasySepTM人T细胞富集试剂盒或类似试剂盒)，自PBMC富集原代人类T细胞。将富集的T细胞与珠粒(例如抗CD3/抗CD28珠粒)一起培育。在一段时间后，以磁力方式取出珠粒，并洗涤T细胞，并且培育。接下来，洗涤T细胞并将其与人工抗原呈递细胞(aAPC)一起在B7-H4抗体剂量调定存在下培育。aAPC可以用丝裂霉素C处理，接着充分洗涤，随后添加至T细胞共培养物中。共培养T细胞、aAPC和B7-H4抗体之后，可以对培养盘离心，并且可以收集上清液，并通过ELISA评估IFNγ产量。IFNγ产量可以相对于抗体浓度作图，并且可以使用非线性回归曲线拟合计算EC50效力。结果可以用EC50+/-STD量度，单位nM。B7-H4抗体的T细胞检查点阻断活性可以由IFNγ产量增加展示。“T细胞检查点阻断活性”也可在使用内源性表达B7-H4的细胞的分析中测量。可以使用T细胞分离试剂盒(例如人类全T细胞分离试剂盒(Human Pan T Cell Isolation Kit))自HLA-A2+供体PBMC富集原代人类T细胞。MART-I TCR表达性T细胞可以通过先用珠粒(例如抗CD3/抗CD28 Dynabead)、IL-2和IL-7活化富集的全T细胞48小时产生。接着，活化的T细胞可以在IL-2、IL-7和聚凝胺存在下用MART-I TCR慢病毒粒子转导。转导后，可以在IL-2和IL-7存在下，使MART-I TCR+全T细胞扩增一段时间。为了产生表达HLA-A2的靶细胞系，可以用HLA-A2慢病毒粒子转导内源B7-H4表达性癌细胞一段时间(例如48小时)。此外，可将B7-H4自HLA-A2+细胞系敲除。接着，MART-ITCR+全T细胞可以在1:1E:T比率的各种靶细胞系、MART-I肽和B7-H4抗体或人类同型对照存在下共培养。共培育后，可以对培养盘离心，并且可以收集上清液，并评估IL-2产量。IL-2产量可以通过标准免疫分析试剂盒(如AlphaLISA分析或类似分析)测量。
除非上下文另作清楚地规定，否则如本发明和权利要求书中所使用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数形式。
应理解，当在本文中用语言“包含”描述各实施例时，也提供以“由...组成”和/或“基本上由...组成”的术语描述的相似实施例。在本发明中，“包含(comprises/comprising)”、“含有”和“具有”以及类似表述可以具有它们在美国专利法中的含义，并且可以意谓“包括(includes/including)”和类似表述；“基本上由……组成(consistingessentially of/consists essentially)”同样具有它们在美国专利法中的含义且该术语是开放式的，允许存在超出所陈述的内容，只要所陈述的内容的基本或新颖特征不因超过所陈述的内容的存在而变化即可，但不包括现有技术实施例。
除非上下文具体陈述或显而易见，否则如本文所使用，术语“或”应理解为包容性的。本文中在如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”和“B”。同样，在如“A、B和/或C”的短语中所使用的术语“和/或”意图涵盖以下实施例中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
如本文所使用，术语“约”和“近似地”当用于修饰数字值或数字范围时，指示在该值或范围以上5％至10％和以下5％至10％的偏差在所述值或范围的预定含义内。
本文所提供的任何组合物或方法都可与本文所提供的任何其它组合物和方法中的一种或多种组合。
1.2抗体
在一个特定方面，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体(例如单克隆抗体，如嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体)及其抗原结合片段。人类、食蟹猕猴、鼠类和大鼠B7-H4的氨基酸序列是本领域中已知的，并且在本文中也有提供，如对应地SEQ IDNO:1-4所示。
人类B7-H4：
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK(SEQ ID NO:1)
食蟹猕猴B7-H4：
MASLGQILFWSIISIIFILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVIGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFLAISWALLPLAPYLMLK(SEQ ID NO:2)
鼠类B7-H4
MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLQLLNSGPSPCVFSSAFVAGWALLSLSCCLMLR(SEQ ID NO:3)
大鼠B7-H4
MASLGQIIFWSIINVIIILAGAIVLIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIHTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLELLNSGPSPCVSSVSAAGWALLSLSCCLMLR(SEQ ID NO:4)
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至人类和食蟹猕猴B7-H4。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至人类、鼠类和大鼠B7-H4。在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段结合至人类、食蟹猕猴、鼠类和大鼠B7-H4。
B7-H4含有IgC胞外结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸153-241)和IgV结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸35-146)。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4的IgV结构域。因此，本文提供结合至由SEQ ID NO:1的氨基酸35-146组成的多肽的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)。
表1.VH CDR氨基酸序列1
1表1中的VH CDR是根据Kabat确定。
表2.VL CDR氨基酸序列2
2表2中的VL CDR是根据Kabat确定。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表3中所列抗体的VH。
表3：可变重链(VH)氨基酸序列
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表4中所列抗体的VL。
表4：可变轻链(VL)氨基酸序列
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表3和4中所列抗体的VH和VL(即，表3中所列抗体的VH和表4中所列相同抗体的VL)。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表5中所列抗体的VH构架区。
表5.VH FR氨基酸序列4
4表5中所描述的VH构架区是基于Kabat编号系统有关CDR的边界确定。换句话说，VH CDR是由Kabat确定且构架区是呈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4形式的可变区中在CDR周围的氨基酸残基。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表6中所列抗体的VL构架区。
表6.VL FR氨基酸序列3
3表6中所描述的VL构架区是基于Kabat编号系统有关CDR的边界确定。换句话说，VL CDR是由Kabat确定且构架区是呈FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4形式的可变区中在CDR周围的氨基酸残基。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表5和6中所列抗体的四个VH构架区和四个VL构架区(即，表5中所列抗体的四个VH构架区和表6中所列相同抗体的四个VL构架区)。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表7中所列抗体的重链序列。
表7：全长重链氨基酸序列
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表8中所列抗体的轻链序列。
表8：全长轻链氨基酸序列
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4且包含表7和8中所列抗体的重链序列和轻链序列(即，表7中所列抗体的重链序列和表8中所列相同抗体的轻链序列)。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少80％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少80％同一的序列的VL。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少85％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少85％一致的序列的VL。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少90％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少90％一致的序列的VL。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少95％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少95％一致的序列的VL。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少96％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少96％一致的序列的VL。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少97％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少97％一致的序列的VL。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少98％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少98％一致的序列的VL。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)且包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少99％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少99％一致的序列的VL。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少80％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少80％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VLCDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少85％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少85％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少90％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少90％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VLCDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少95％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少95％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少96％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少96％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VLCDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少97％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少97％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少98％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少98％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少99％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少99％一致的序列的VL，并且结合至人类、食蟹猕猴、大鼠和/或小鼠B7-H4。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少80％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少80％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少85％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少85％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少90％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少90％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量和/或介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少95％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少95％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少96％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少96％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少97％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少97％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少98％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少98％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4，包含表1和2中所列抗体的六个CDR(即，表1中所列抗体的三个VH CDR和表2中所列相同抗体的三个VL CDR)，包括含与表3中相同的抗体的VH序列至少99％一致的序列的VH和含与表4中相同的抗体的VL序列至少99％一致的序列的VL，增加T细胞增殖，增加IFNγ产量并介导针对表达B7-H4的细胞的ADCC活性。
在某些方面中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段可以仅通过其VL结构域或仅通过其VH结构域，或仅通过其3个VL CDR或仅通过其3个VH CDR描述。参见例如Rader C等人(1998)PNAS 95:8910-8915，该文献以全文引用的方式并入本文中，描述了通过鉴别分别来自人类轻链或重链文库的互补轻链或重链，产生亲和力与原始抗体亲和力同样高或高于原始抗体亲和力的人源化抗体变体来使小鼠抗αvβ3抗体人源化。另参见Clackson T等人(1991)Nature 352:624-628，该文献以全文引用的方式并入本文中，描述了通过使用特定VL结构域(或VH结构域)并针对互补结构域筛选文库来产生结合特定抗原的抗体的方法。该筛选产生特定VH结构域的14个新搭配物和特定VL结构域的13个新搭配物，如通过ELISA测定，这些搭配物是强结合物。另参见Kim SJ和Hong HJ,(2007)J Microbiol 45:572-577，该文献以全文引用的方式并入本文中，描述了通过使用特定VH结构域并针对互补VL结构域筛选文库(例如人类VL文库)来产生结合特定抗原的抗体的方法；所选VL结构域又可用于引导选择额外互补(例如人类)VH结构域。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段的CDR可以根据Chothia编号方案确定，该方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol196:901-917；Al-Lazikani B等人(1997)J Mol Biol 273:927-948；Chothia C等人(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利第7,709,226号)。典型地，当使用Kabat编号规则时，Chothia CDR-H1环出现在重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环出现在重链氨基酸52至56处，并且ChothiaCDR-H3环出现在重链氨基酸95至102处，而Chothia CDR-L1环出现在轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环出现在轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环出现在轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环长度而在H32与H34之间变化(这是因为Kabat编号方案在H35A和H35B处有插入；如果不存在35A和35B，则该环在32处结束；如果仅存在35A，则该环在33处结束；如果同时存在35A及35B，则该环在34处结束)。
在某些方面，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)且包含表3和4中所列抗体的Chothia VH和VL CDR的抗体和其抗原结合片段。在某些实施例中，特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含一个或多个CDR，其中Chothia与Kabat CDR具有相同氨基酸序列。在某些实施例中，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)且包含Kabat CDR与Chothia CDR的组合的抗体和其抗原结合片段。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可以根据如Lefranc M-P,(1999)TheImmunologist 7:132-136和Lefranc M-P等人(1999)Nucleic Acids Res 27:209-212中所描述的IMGT编号系统确定。根据IMGT编号方案，VH-CDR1是在26至35位处，VH-CDR2是在51至57位处，VH-CDR3是在93至102位处，VL-CDR1是在27至32位处，VL-CDR2是在50至52位处，且VL-CDR3是在89至97位处。在一个特定实施例中，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)且包含如上文Lefranc M-P(1999)和上文Lefranc M-P等人(1999)所描述的表3和4中所列抗体的IMGT VH和VL CDR的抗体和其抗原结合片段。
在某些方面，抗体或其抗原结合片段的CDR可根据MacCallum RM等人,(1996)JMol Biol 262:732-745确定。另参见例如Martin A.“Protein Sequence and StructureAnalysis of Antibody Variable Domains”,Antibody Engineering,Kontermann和Dübel编,第31章,第422-439页,Springer-Verlag,Berlin(2001)。在一个特定实施例中，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)且包含如MacCallum RM等人中的方法所确定的表3和4中所列抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，抗体或其抗原结合片段的CDR可以根据AbM编号方案确定，该方案是针对AbM高变区，代表着Kabat CDR与Chothia结构环之间的折中，并且用于OxfordMolecular的AbM抗体建模软件(Oxford Molecular Group,Inc.)。在一个特定实施例中，本文提供了特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)且包含如由AbM编号方案所确定的表3和4中所列抗体的VH和VL CDR的抗体或其抗原结合片段。
在特定方面，本文提供了包含重链和轻链的抗体。就重链而言，在一个特定实施例中，本文所述抗体的重链可以是α、δ、ε、γ或μ重链。在另一个特定实施例中，所述抗体的重链可以包含人类α、δ、ε、γ或μ重链。在一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中所陈述的氨基酸序列，且其中重链的恒定区包含人类γ重链恒定区的氨基酸序列。在一个特定实施例中，本文所述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包含重链，其中VH结构域的氨基酸序列包含表3中所陈述的序列，且其中重链的恒定区包含本文所描述或本领域中已知的人类重链的氨基酸。人类恒定区序列的非限制性实例在本领域中有描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat EA等人(1991),同上文。
就轻链而言，在一个特定实施例中，本文所述抗体的轻链是κ轻链。人类κ轻链的恒定区可以包含以下氨基酸序列：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:405)。
人类κ轻链的恒定区可以由以下核苷酸序列编码：
CGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT(SEQ ID NO:406)。
在另一个特定实施例中，本文所述抗体的轻链是λ轻链。在又另一特定实施例中，本文所述抗体的轻链是人类κ轻链或人类λ轻链。在一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4多肽(例如人类B7-H4)的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所陈述的序列，且其中轻链的恒定区包含人类κ轻链恒定区的氨基酸序列。在另一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所陈述的序列，且其中轻链的恒定区包含人类λ轻链恒定区的氨基酸序列。在一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包含轻链，其中VL结构域的氨基酸序列包含表4中所陈述的序列，且其中轻链的恒定区包含人类κ或λ轻链恒定区的氨基酸序列。人类恒定区序列的非限制性实例在本领域中有描述，例如参见美国专利第5,693,780号和Kabat EA等人(1991),同上文。
在一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包括含本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子，或人类IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列。在另一个特定实施例中，本文所述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体包括含本文所述的任何氨基酸序列的VH结构域和VL结构域，且其中恒定区包含IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或任何亚类(例如IgG2a及IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。在一个特定实施例中，这些恒定区包含人类IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的任何类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或任何亚类(例如IgG2a和IgG2b)的恒定区的氨基酸序列。
人类IgG1重链的恒定区可以包含以下氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:407)。
人类IgG1重链的恒定区可以由以下核苷酸序列编码：
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO:408)。
人类恒定区的非限制性实例在本领域中有描述，参见例如Kabat EA等人(1991),同上文。
在某些实施例中，将一个、两个或两个以上突变(例如氨基酸取代)引入本文所述抗体或其抗原结合片段的Fc区(例如根据Kabat编号系统(例如Kabat中的EU索引)编号，CH2结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人类IgG1的残基341-447)和/或铰链区)中，以改变该抗体或其抗原结合片段的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。
在某些实施例中，如例如美国专利号5,677,425中所述，将一个、两个或两个以上突变(例如氨基酸取代)引入Fc区(CH1结构域)的铰链区中，由此使铰链区中半胱胺酸残基的编号改变(例如增加或减小)。CH1结构域的铰链区中半胱胺酸残基的数量可以被改变以例如有利于轻链和重链的组装，或改变(例如增加或降低)抗体或其抗原结合片段的稳定性。
在一些实施例中，将一个、两个或两个以上突变(例如氨基酸取代)引入本文所述抗体或其抗原结合片段的Fc区(例如根据Kabat编号系统(例如Kabat中的EU索引)编号，CH2结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或CH3结构域(人类IgG1的残基341-447)和/或铰链区)中，以增加或减小该抗体或其抗原结合片段对效应细胞表面上Fc受体(例如活化的Fc受体)的亲和力。Fc区中减小或增加针对Fc受体的亲和力的突变以及用于将此类突变引入Fc受体或其片段中的技术是本领域技术人员已知的。Fc受体中可以改变抗体或其抗原结合片段对Fc受体的亲和力的突变的实例描述于例如Smith P等人(2012)PNAS109:6181-6186；美国专利第6,737,056号，以及国际公开案第WO 02/060919号、第WO 98/23289号及第WO 97/34631号中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一个特定实施例中，将一个、两个或两个以上氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以改变(例如减小或增加)抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。有关改变(例如减小或增加)抗体或其抗原结合片段的体内半衰期的实例，参见例如国际公开第WO 02/060919号、第WO 98/23289号及第WO 97/34631号；以及美国专利第5,869,046号、第6,121,022号、第6,277,375号和第6,165,745号。在一些实施例中，将一个、两个或两个以上氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以减小抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。在其它实施例中，将一个、两个或两个以上氨基酸突变(即，取代、插入或缺失)引入IgG恒定结构域或其FcRn结合片段(优选是Fc或铰链区-Fc结构域片段)中以增加抗体或其抗原结合片段的体内半衰期。在一个特定实施例中，根据Kabat(Kabat EA等人(1991),同上文)中的EU索引编号，所述抗体或其抗原结合片段可以在第二恒定(CH2)结构域(人类IgG1的残基231-340)和/或第三恒定(CH3)结构域(人类IgG1的残基341-447)中具有一个或多个氨基酸突变(例如取代)。在一个特定实施例中，根据Kabat中的EU索引编号，IgG1的恒定区包含252位中甲硫氨酸(M)变为酪氨酸(Y)的取代、254位中丝氨酸(S)变为苏氨酸(T)的取代；以及256位中苏氨酸(T)变为谷氨酸(E)的取代。参见美国专利第7,658,921号，该案以引用的方式并入本文中。经显示，此类突变IgG，称为“YTE突变体”的半衰期相较于同种抗体的野生型形式增加四倍(参见Dall’Acqua WF等人(2006)JBiol Chem 281:23514-24)。在某些实施例中，根据Kabat中的EU索引编号，抗体或其抗原结合片段包含在位置251-257、285-290、308-314、385-389及428-436处含一个、两个、三个或更多个氨基酸残基的氨基酸取代的IgG恒定结构域。
在另一实施例中，将一个、两个或两个以上氨基酸取代引入IgG恒定结构域Fc区中以改变抗体或其抗原结合片段的效应功能。例如，根据Kabat的EU索引编号的选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换以使所述抗体或其抗原结合片段对效应配体的亲和力改变，但保持亲本抗体的抗原结合能力。引起相关亲和力改变的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组份。这一方法进一步详细描述于美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中。在一些实施例中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它手段引起)可以降低循环抗体或其抗原结合片段的Fc受体结合，由此增进肿瘤定位。有关使恒定结构域缺失或失活并由此增进肿瘤定位的突变的描述，参见例如美国专利第5,585,097号和第8,591,886号。在某些实施例中，可以将一个或多个氨基酸取代引入Fc区中以移除Fc区上的潜在糖基化位点，由此可减少Fc受体结合(参见例如Shields RL等人(2001)J Biol Chem 276:6591-604)。
在某些实施例中，根据Kabat的EU索引编号的恒定区中选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换，由此使所述抗体或其抗原结合片段具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这一方法进一步详细描述于美国专利第6,194,551号(Idusogie等人)中。在一些实施例中，在CH2结构域N末端区中氨基酸位置231至238内的一个或多个氨基酸残基被改变以改变抗体固定补体的能力。这一方法进一步详细描述于国际公开第WO 94/29351号中。在某些实施例中，Fc区通过在根据Kabat的EU索引编号的以下位置处一个或多个氨基酸突变(例如引入氨基酸取代)进行修饰以增加抗体或其抗原结合片段介导抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的能力和/或增加抗体或其抗原结合片段对Fcγ受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、328、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这一方法进一步详细描述于国际公开第WO 00/42072号中。
在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含根据Kabat的EU索引编号，在位置267、328或其组合处具有突变(例如取代)的IgG1恒定结构域。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含在选自由S267E、L328F及其组合组成的组的突变(例如取代)的IgG1恒定结构域。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含具有S267E/L328F突变(例如取代)的IgG1恒定结构域。在某些实施例中，本文所描述的包含具有S267E/L328F突变(例如取代)的IgG1恒定结构域的抗体或其抗原结合片段对FcγRIIA、FcγRIIB或FcγRIIA和FcγRIIB具有增加的结合亲和力。
据报导，岩藻糖含量较低的抗体对Fc受体，如对FcγRIIIA具有增加的亲和力。因此，在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段具有较低岩藻糖含量或不含岩藻糖(即，是“无岩藻糖基化的”)。这些抗体或其抗原结合片段可使用本领域技术人员已知的技术产生。例如，这些抗体或其抗原结合片段可在缺陷性或缺乏岩藻糖基化能力的细胞中表达。在一个具体实例中，可使用敲除两个α1,6-岩藻糖基转移酶等位基因的细胞系产生具有较低岩藻糖含量的抗体或其抗原结合片段。系统(Lonza)是可用于产生具有较低岩藻糖含量的抗体和其抗原结合片段的此类系统的一个实例。或者，可以通过例如以下方式产生具有较低岩藻糖含量或不含岩藻糖的抗体或其抗原结合片段：(i)在防止或减少岩藻糖基化的条件下培养细胞；(ii)翻译后移除岩藻糖(例如利用岩藻糖苷酶)；(iii)翻译后添加所希望的碳水化合物，例如在重组表达非糖基化糖蛋白之后添加；或(iv)纯化糖蛋白以选择未岩藻糖基化的抗体或其抗原结合片段。有关用于产生不含岩藻糖或具有较低岩藻糖含量的抗体的方法，参见例如Longmore GD和Schachter H(1982)CarbohydrRes 100:365-92；以及Imai-Nishiya H等人,(2007)BMC Biotechnol.7:84。另参见本文中的实例8，该实例描述无岩藻糖基化B7-H4抗体的产生。
在一些实施例中，相较于具有相同氨基酸序列的岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段，所述B7-H4抗体或其抗原结合片段具有增强的体外ADCC活性。在一些实施例中，无岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段引起的比溶解率比岩藻糖基化B7-H4抗体引起的比溶解率高至少10％、至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％或至少75％。
在一些实施例中，相较于具有相同氨基酸序列的岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段，所述B7-H4抗体或其抗原结合片段具有增强针对FcγRIIIA的亲和力。在一些实施例中，无岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段以比岩藻糖基化B7-H4抗体或其抗原结合片段高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少7倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、至少17倍或至少20倍的亲和力结合至FcγRIIIA。在一些实施例中，对FcγRIIIA的亲和力是使用表面等离子体共振测定。在一些实施例中，FcγRIIIA是选自FcγRIIIA(V158)和FcγRIIIA(F158)。在一些实施例中，FcγRIIIA是FcγRIIIA(V158)。
在一些实施例中，岩藻糖的存在可以通过包含高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳或MALDI-TOF质谱法的方法测定。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段(i)包含20502的CDR序列(例如SEQ IDNO:458-463的氨基酸序列)、20502的VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:464和42的氨基酸序列)或20502的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:469和44的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的。
在特定实施例中，组合物包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段(i)包含20502的CDR序列(例如SEQ ID NO:458-463的氨基酸序列)、20502的VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:464和42的氨基酸序列)或20502的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:469及44的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的，例如其中该组合物中至少95％的抗体是无岩藻糖基化的或其中在该组合物中无法检测到岩藻糖基化。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段(i)包含20502.1的CDR序列(例如SEQ IDNO:35-40的氨基酸序列)、20502.1的VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:41和42的氨基酸序列)或20502.1的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:43和44的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的。
在特定实施例中，组合物包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段(i)包含20502.1的CDR序列(例如SEQ ID NO:35-40的氨基酸序列)、20502.1的VH和VL序列(分别为SEQ IDNO:41和42的氨基酸序列)或20502.1的重链和轻链序列(分别为SEQ IDNO:43和44的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的，例如其中该组合物中至少95％的抗体是无岩藻糖基化的或其中在该组合物中无法检测到岩藻糖基化。
在特定实施例中，抗体或其抗原结合片段(i)包含22213的CDR序列(例如SEQ IDNO:65-70的氨基酸序列)、22213的VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:71和72的氨基酸序列)或22213的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:73和74的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的。
在特定实施例中，组合物包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段(i)包含22213的CDR序列(例如SEQ ID NO:65-70的氨基酸序列)、22213的VH和VL序列(分别为SEQ ID NO:71和72的氨基酸序列)或22213的重链和轻链序列(分别为SEQ ID NO:73和74的氨基酸序列)，以及(ii)是无岩藻糖基化的，例如其中该组合物中至少95％的抗体是无岩藻糖基化的或其中在该组合物中无法检测到岩藻糖基化。
工程改造的糖型可以用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应功能。用于产生本文所描述的抗体或其抗原结合片段中工程改造的糖型的方法包括但不限于例如 P等人(1999)Nat Biotechnol 17:176-180；Davies J等人(2001)BiotechnolBioeng 74:288-294；Shields RL等人(2002)J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa T等人(2003)J Biol Chem 278:3466-3473；Niwa R等人(2004)Clin Cancer Res 1:6248-6255；Presta LG等人(2002)Biochem Soc Trans 30:487-490；Kanda Y等人(2007)Glycobiology 17:104-118；美国专利第6,602,684号、第6,946,292号和第7,214,775号；美国专利公开第US 2007/0248600号、第2007/0178551号、第2008/0060092号和第2006/0253928号；国际公开第WO 00/61739号、第WO 01/292246号、第WO 02/311140号和第WO 02/30954号中所公开的方法；PotillegentTM技术(Biowa,Inc.Princeton,N.J.)；以及糖基化工程改造技术(Glycart biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。另参见例如Ferrara C等人(2006)Biotechnol Bioeng 93:851-861；国际公开第WO 07/039818号、第WO 12/130831号、第WO 99/054342号、第WO 03/011878号和第WO 04/065540号。
在某些实施例中，可以将本文所述的恒定区突变或修饰中的任一种引入具有两个重链恒定区的本文所述抗体或其抗原结合片段的一个或两个重链恒定区中。
在另一个特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中(i)重链包括含表1中所列抗体的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:458-460、35-37或65-67)的VH结构域；(ii)轻链包括含表2中所列相同抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3氨基酸序列(例如SEQ IDNO:461-463、38-40或68-70)的VL结构域；以及(iii)重链进一步包括含人类IgG1重链的恒定结构域氨基酸序列的恒定重链结构域；(iv)轻链进一步包括含人类κ轻链恒定结构域的氨基酸序列的恒定轻链结构域。
在另一个特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含重链和轻链，其中(i)重链包括含表3中所列抗体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464、41或71)的VH结构域；(ii)轻链包括含表4中所列相同抗体的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或73)的VL结构域；以及(iii)重链进一步包括含人类IgG1重链的恒定结构域氨基酸序列的恒定重链结构域；(iv)轻链进一步包括含人类κ轻链恒定结构域的氨基酸序列的恒定轻链结构域。
在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段展现T细胞检查点阻断活性。测量T细胞检查点阻断活性的例示性方法提供于本文实例7和11中。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加T细胞中干扰素γ(IFNγ)的产生。测量IFNγ产生的例示性方法提供于本文实例7和11中。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加T细胞增殖。测量T细胞增殖的例示性方法提供于本文实例7中。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加CD4+T细胞增殖。测量CD4+T细胞增殖的例示性方法提供于本文实例7中。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段增加CD8+T细胞增殖。测量CD8+T细胞增殖的例示性方法提供于本文实例7中。
在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段对带有至少300,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如SK-BR-3细胞)展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段对带有至少100,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如HCC1569细胞)展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段对带有至少50,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如ZR-75-1细胞)展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段对带有至少30,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如MDA-MB-468细胞)展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段对带有至少15,000个细胞表面B7-H4分子的细胞系(例如HCC1964细胞)展现抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性。测量ADCC活性的例示性方法提供于本文实例13中。
在特定实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含构架区(例如VH结构域和/或VL结构域的构架区)，所述构架区是人类构架区或来源于人类构架区。人类构架区的非限制性实例在本领域中有描述，参见例如Kabat EA等人(1991),同上文。在某些实施例中，本文所描述的抗体或其抗原结合片段包含构架区(例如VH结构域和/或VL结构域的构架区)，所述构架区是灵长类动物(例如非人类灵长类动物)构架区或来源于灵长类动物(例如非人类灵长类动物)构架区。
在某些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含具有本文关于以上表5中所述抗体所描述的氨基酸序列(例如SEQ IDNO:465、466、467和/或469；SEQ ID NO:235、236、237和/或238；或SEQ ID NO:265、266、267和/或268)的一个、两个或两个以上VH构架区(FR)。在某些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含具有本文关于以上表6中所述抗体所描述的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:239、240、241和/或242；或SEQ ID NO:269、270、271和/或272)的一个、两个或两个以上VL构架区(FR)。在某些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含具有本文关于以上表5中所述抗体所描述的氨基酸序列的一个、两个或两个以上VH构架区，以及具有本文关于以上表6中所述抗体所描述的氨基酸序列的一个、两个或两个以上VL构架区(例如(i)SEQ ID NO:465、466、467和/或469，以及SEQ ID NO:239、240、241和/或242；(ii)SEQ ID NO:235、236、237和/或238，以及SEQ ID NO:239、240、241和/或242；或(iii)SEQ ID NO:265、266、267和/或268，以及SEQ ID NO:269、270、271和/或272)。
在某些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与本文在以上表5中所述的VH构架区具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH构架区(FR)。在某些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与本文在以上表6中所述的VL构架区具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL构架区(FR)。在一些实施例中，本文所描述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与本文在以上表5中所述的VH构架区具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH构架区(FR)，以及与本文在以上表6中所述的VL构架区具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL构架区(FR)。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与20502或22213的VH结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464或71)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH结构域，其中所述抗体包含与20502或22213的VH CDR(例如SEQ ID NO:458-460或65-67)一致的VH CDR。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与20502或22213的VL结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或72)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL结构域，其中所述抗体包含与20502或22213的VL CDR(例如SEQ ID NO:461-463或68-70)一致的VL CDR。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含：(i)与20502或22213的VH结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464或71)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH结构域；以及(ii)与20502或22213的VL结构域的氨基酸序列(例如SEQ IDNO:42或72)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL结构域；其中所述抗体包含与20502或22213的VH CDR和VL CDR(例如SEQID NO:458-463或SEQ ID NO:65-70)一致的VH CDR和VL CDR。
在另一方面，本文提供与本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如20502或22213)结合至B7-H4的相同表位(例如人类B7-H4的表位)的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与20502.1或22213的VH结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:41或71)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH结构域，其中所述抗体包含与20502.1或22213的VH CDR(例如SEQ ID NO:35-37或65-67)一致的VH CDR。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含与20502.1或22213的VL结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或72)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL结构域，其中所述抗体包含与20502.1或22213的VL CDR(例如SEQ ID NO:38-40或68-70)一致的VL CDR。
在某些实施例中，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段包含：(i)与20502.1或22213的VH结构域的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:41或71)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VH结构域；以及(ii)与20502.1或22213的VL结构域的氨基酸序列(例如SEQ IDNO:42或72)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％序列一致性的VL结构域；其中所述抗体包含与20502.1或22213的VH CDR和VL CDR(例如SEQID NO:35-40或SEQ ID NO:65-70)一致的VH CDR和VL CDR。
在另一方面中，本文提供与本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如20502.1或22213)结合至B7-H4的相同表位(例如人类B7-H4的表位)的抗体或其抗原结合片段。
可以使用竞争结合分析确定两种抗体是否结合至重叠表位。竞争性结合可以使用一种分析测定，在该分析中，待测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原如B7-H4的特异性结合。已知多种类型的竞争性结合分析，例如：直接或间接固相放射免疫分析(RIA)、直接或间接固相酶免疫分析(EIA)、夹心竞争分析(参见Stahli C等人(1983)Methods Enzymol9:242-253)；直接固相生物素-抗生物蛋白EIA(参见Kirkland TN等人(1986)J Immunol137:3614-9)；直接固相标记的分析、直接固相标记的夹心分析(参见Harlow E和Lane D,(1988)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的直接固相标记的RIA(参见Morel GA等人(1988)Mol Immunol25(1):7-15)；直接固相生物素-抗生物素蛋白EIA(参见Cheung RC等人,(1990)Virology 176:546-52)；以及直接标记的RIA(Moldenhauer G等人(1990)Scand J Immunol 32:77-82)。典型地，此类分析涉及使用结合至固体表面或带有未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白中的任一种的细胞的纯化抗原(例如B7-H4，如人类B7-H4)。竞争性抑制可以通过测定在测试免疫球蛋白存在下结合至固体表面或细胞的标记的量来测量。通常，测试免疫球蛋白是过量存在。通常，当竞争抗体过量存在时，所述竞争抗体将使参考抗体与共同抗原的特异性结合抑制至少50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％或更高。竞争结合分析可以使用标记的抗原或标记的抗体，配置成众多不同的形式。在这一分析的一种常见形式中，抗原被固定于96孔盘上。接着，使用放射性标记或酶标记测量未标记抗体阻断被标记抗体结合至抗原的能力。关于进一步详情，参见例如Wagener C等人(1983)JImmunol 130:2308-2315；Wagener C等人(1984)J Immunol Methods 68:269-274；Kuroki M等人(1990)Cancer Res 50:4872-4879；Kuroki M等人(1992)Immunol Invest 21:523-538；Kuroki M等人(1992)Hybridoma11:391-407；以及Antibodies:A Laboratory Manual,Harlow E和Lane D编辑,见上文,第386-389页。
在一个实施例中，竞争分析是使用表面等离子体共振例如通过‘串联方法’，如Abdiche YN等人(2009)Analytical Biochem 386:172-180所描述的方法执行，由此将B7-H4抗原固定于芯片表面，例如CM5传感器芯片上，接着使抗B7-H4抗体流过该芯片。为了确定抗体或其抗原结合片段是否与本文所述的抗B7-H4抗体竞争，先使所述抗B7-H4抗体流过芯片表面以达到饱和，接着添加可能的竞争抗体。接着，可以相对于非竞争对照测定并定量竞争抗体或其抗原结合片段的结合。
在一个实施例中，使用Fortebio Octet竞争结合(例如，如以下实例2中所述)确定B7-H4抗体或其抗原结合片段竞争性抑制另一种B7-H4抗体或其抗原结合片段与B7-H4的结合。
在另一方面，本文提供如使用本领域技术人员已知或本文所描述的分析(例如ELISA竞争性分析或悬浮阵列或表面等离子体共振分析)所测定，竞争性抑制(例如以剂量依赖性方式)本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如20502、20502.1或22213)与B7-H4(例如人类B7-H4)的结合的抗体。
在特定方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(例如以剂量依赖性方式)包含具有SEQ ID NO:464中所述的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:42中所述的氨基酸序列的VL结构域的抗体与B7-H4(例如人类B7-H4)的结合。
在特定方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(例如以剂量依赖性方式)包含具有SEQ ID NO:41中所述的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:42中所述的氨基酸序列的VL结构域的抗体与B7-H4(例如人类B7-H4)的结合。
在特定方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(例如以剂量依赖性方式)包含具有SEQ ID NO:71中所述的氨基酸序列的VH结构域和具有SEQ ID NO:72中所述的氨基酸序列的VL结构域的抗体与B7-H4(例如人类B7-H4)的结合。
在特定方面，本文提供了一种抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段竞争性抑制(例如以剂量依赖性方式)以下抗体与B7-H4(例如人类B7-H4)的结合，所述抗体包括(i)含具有表1中所列VH CDR的氨基酸序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH结构域；以及(ii)含具有表2中所列CDR的氨基酸序列的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL结构域。
在特定方面，本文提供了一种与20502、20502.1或22213免疫特异性结合至相同B7-H4(例如人类B7-H4)表位的抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，抗体或其抗原结合片段与以下抗体免疫特异性结合至相同B7-H4(例如人类B7-H4)表位，所述抗体包括(i)含具有表1中所列CDR的氨基酸序列的VH CDR1、VHCDR2和VH CDR3的VH结构域；以及(ii)含具有表2中所列CDR的氨基酸序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL结构域。
在一个特定方面，本文所描述的免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗原结合片段选自由Fab、Fab'、F(ab')2和scFv组成的组，其中所述Fab、Fab'、F(ab')2或scFv包含如本文所描述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的重链可变区序列和轻链可变区序列。Fab、Fab'、F(ab')2或scFv可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生，包括但不限于以下第5.3部分中所论述的技术。在某些实施例中，Fab、Fab'、F(ab')2或scFv进一步包含延长抗体的体内半衰期的部分。所述部分又称为“半衰期延长部分”。本领域技术人员已知用于延长Fab、Fab'、F(ab')2或scFv的体内半衰期的任何部分都可以使用。例如，半衰期延长部分可以包括Fc区、聚合物、白蛋白或白蛋白结合蛋白或化合物。所述聚合物可以包括天然或合成、任选地被取代的直链或分支链聚亚烷基、聚亚烯基、聚氧亚烷基、聚糖、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、甲氧基聚乙二醇、乳糖、直链淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。取代基可以包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。在某些实施例中，Fab、Fab'、F(ab')2或scFv可以通过添加一个或多个C末端氨基酸以连接半衰期延长部分来进行修饰。在某些实施例中，半衰期延长部分是聚乙二醇或人血清白蛋白。在某些实施例中，Fab、Fab'、F(ab')2或scFv与Fc区融合。
抗B7-H4抗体或其抗原结合片段可以与可检测标记或物质融合或缀合(例如共价或非共价连接)。可检测标记或物质的实例包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，如鲁米诺(luminol)；以及荧光标记，如荧光素和罗丹明(rhodamine)，以及生物素。这些被标记的抗体或其抗原结合片段可以用于检测B7-H4(例如人类B7-H4)蛋白。参见例如以下第5.5.2部分。
抗体产生
免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体和其抗原结合片段可通过本领域中已知用于合成抗体和其抗原结合片段的任何方法，例如通过化学合成或通过重组表达技术产生。除非另外指示，否则本文所述的方法采用了分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交中的常规技术以及在本领域技能范围内的相关技术。这些技术例如描述于本文所引用的参考文献中并于文献中完整地阐明。参见例如，Sambrook J等人(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Ausubel FM等人Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)；Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(1987和年度更新)Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,IRL Press；Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,IRL Press；Birren B等人(编)(1999)Genome Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
在某一方面，本文提供了一种制备免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或抗原结合片段的方法，该方法包括培养本文所述的细胞或宿主细胞。在某一方面，本文提供了一种制备免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括使用本文所述的细胞或宿主细胞(例如包含编码本文所述的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的细胞或宿主细胞)表达(例如重组表达)所述抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施例中，细胞是分离的细胞。在一个特定实施例中，已将外源多核苷酸引入细胞中。在一个特定实施例中，所述方法还包括纯化自所述细胞或宿主细胞获得的抗体或抗原结合片段的步骤。
用于产生多克隆抗体的方法是本领域中已知的(参见例如Short Protocols inMolecular Biology,(2002)第5版,Ausubel FM等人编,John Wiley and Sons,New York,第11章)。
单克隆抗体或其抗原结合片段可以使用本领域中已知的多种技术制备，包括使用杂交瘤、重组技术和噬菌体展示技术、基于酵母的展示技术或其组合。例如，单克隆抗体或其抗原结合片段可以使用杂交瘤技术产生，包括本领域中已知以及例如Harlow E和LaneD,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)；Hammerling GJ等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681(Elsevier,N.Y.,1981)中所教示，或如Kohler G及Milstein C(1975)Nature 256:495中所述的方法。可以用于选择和产生本文所述抗体的基于酵母的展示方法的实例包括例如WO2009/036379A2、WO2010/105256和WO2012/009568中所教示的方法，各案以全文引用的方式并入本文中。
在特定实施例中，单克隆抗体或抗原结合片段是由克隆细胞(例如产生重组抗体或抗原结合片段的杂交瘤或宿主细胞)产生的抗体或抗原结合片段，其中如例如通过ELISA或本领域中已知的其它抗原结合分析，或本文所提供的实例中所测定，所述抗体或抗原结合片段免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)。在特定实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段可以是嵌合或人源化抗体或其抗原结合片段。在某些实施例中，单克隆抗体或其抗原结合片段可以是Fab片段或F(ab’)2片段。本文所描述的单克隆抗体或其抗原结合片段可例如通过如Kohler G和Milstein C(1975)Nature 256:495中所描述的杂交瘤方法制备，或者可以例如使用如例如本文所描述的技术，自噬菌体文库分离。用于制备克隆细胞系以及由所述细胞系表达的单克隆抗体和其抗原结合片段的其它方法是本领域中众所周知的(参见例如，Short Protocols in Molecular Biology,(2002)第5版,第11章,Ausubel FM等人,同上文)。
本文所述抗体的抗原结合片段可以通过本领域技术人员已知的任何技术产生。例如，可通过使用酶，如木瓜蛋白酶(用以产生Fab片段)或胃蛋白酶(用以产生F(ab')2片段)蛋白水解裂解免疫球蛋白分子来产生本文所述的Fab和F(ab')2片段。Fab对应于四聚体抗体分子的两个相同臂之一，并且含有与重链VH和CH1结构域配对的完整轻链。F(ab')2片段含有通过铰链区中的二硫键连接的四聚体抗体分子的两个抗原结合臂。
此外，本文所述的抗体或其抗原结合片段也可使用本领域中已知的各种噬菌体展示和/或基于酵母的展示方法产生。在噬菌体展示法中，将蛋白质展示于带有编码所述蛋白质的多核苷酸的噬菌体粒子的表面上。确切地说，由动物cDNA文库(例如受影响组织的人类或鼠类cDNA文库)扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR将编码VH和VL结构域的DNA用scFv连接子重组在一起并克隆至噬菌粒载体中。将所述载体通过电穿孔放入大肠杆菌中，并用辅助噬菌体感染大肠杆菌。用于这些方法中的噬菌体典型地是丝状噬菌体，包括fd和M13，并且VH和VL结构域通常与噬菌体基因III或基因VIII重组融合。可用抗原，例如使用被标记的抗原或者结合至或捕捉于固体表面或珠粒的抗原选择或鉴别表达结合至特定抗原的抗体或其抗原结合片段的噬菌体。可用于制备本文所述的抗体或片段的噬菌体展示法的实例包括以下中所公开的方法：Brinkman U等人(1995)JImmunol Methods 182:41-50；Ames RS等人(1995)J Immunol Methods184:177-186；Kettleborough CA等人(1994)Eur JImmunol 24:952-958；Persic L等人(1997)Gene 187:9-18；Burton DR和Barbas CF(1994)Advan Immunol 57:191-280；PCT申请第PCT/GB91/001134号；国际公开第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/11236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号及第WO 97/13844号；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号。
人源化抗体或其抗原结合片段可选自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
1.2.1多核苷酸
在某些方面，本文提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如可变轻链区和/或可变重链区)的核苷酸序列；以及载体，例如包含这些多核苷酸以在宿主细胞(例如大肠杆菌和哺乳动物细胞)中重组表达的载体。
在特定方面，本文提供了多核苷酸，所述多核苷酸包含编码免疫特异性结合至B7-H4多肽(例如人类B7-H4)且包含如本文所述的氨基酸序列的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，以及与这些抗体或抗原结合片段竞争结合至B7-H4多肽(例如以剂量依赖性方式)或与这些抗体或抗原结合片段结合至相同表位的抗体或抗原结合片段。
本文还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码含选自由以下组成的组的序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201和202。在一些实施例中，包含所述多肽的抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合至B7-H4。
本文还提供一种多核苷酸，该多核苷酸包含编码含选自由以下组成的组的序列的多肽的核苷酸序列：SEQ ID NO:13、14、23、24、33、34、43、469、44、53、54、63、64、73、74、83、84、93、94、103、104、113、114、123、124、133、134、143、144、153、154、163、164、173、174、183、184、193、194、203及204。在一些实施例中，包含所述多肽的抗体或其抗原结合片段免疫特异性结合至B7-H4。
本文还提供包含多核苷酸，所述多核苷酸包含表9中所示编码可变重链的核苷酸序列，例如其中包含编码的可变重链的抗体或其抗原结合片段结合至B7-H4。
表9：编码可变重链的多核苷酸序列
本文亦提供包含表10中所示可变轻链编码核苷酸序列的多核苷酸，例如其中包含该编码的可变轻链的抗体或其抗原结合片段结合至B7-H4。
表10：编码可变轻链的多核苷酸序列
本文也提供包含以下核苷酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404。本文也提供多核苷酸，所述多核苷酸包含(i)以下核苷酸序列：SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404；以及(ii)SEQ ID NO:408或406的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约80％、85％或90％一致的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约95％一致的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约96％一致的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约97％一致的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约98％一致的核苷酸序列。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码SEQ ID NO:11、12、21、22、31、32、41、464、42、51、52、61、62、71、72、81、82、91、92、101、102、111、112、121、122、131、132、141、142、151、152、161、162、171、172、181、182、191、192、201或202，并且分别与SEQ ID NO:213、214、223、224、233、234、243、470、244、253、254、263、264、273、274、283、284、293、294、303、304、313、314、323、324、333、334、343、344、353、354、363、364、373、374、383、384、393、394、403或404至少约99％一致的核苷酸序列。
在某些方面，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所述抗体或抗原结合片段的轻链或重链的核苷酸序列。所述多核苷酸可以包含编码含本文所述抗体的VH FR和CDR(参见例如表1和5)的重链的核苷酸序列。该等多核苷酸可以包含编码含本文所述抗体的VL FR及CDR(参见例如表2及6)的轻链的核苷酸序列。
在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:464中所陈述的氨基酸序列。在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:42中所陈述的氨基酸序列。
在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:41中所陈述的氨基酸序列。在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:42中所陈述的氨基酸序列。
在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VH结构域，所述VH结构域包含SEQ IDNO:71中所陈述的氨基酸序列。在特定实施例中，本文所述的多核苷酸编码VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:72中所陈述的氨基酸序列。
在特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗B7-H4抗体的核苷酸序列，所述抗B7-H4抗体包含三个VH CDR，例如含有本文所述任一抗体的VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3(例如参见表1)。在特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含三个VL链CDR，例如含有本文所述任一抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如参见表2)。在特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗B7-H4抗体的核苷酸序列，所述抗B7-H4抗体包含三个VH CDR，例如含有本文所述任一抗体的VH CDR1、VH CDR2和VHCDR3(例如参见表1)以及三个VL链CDR，例如含有本文所述任一抗体的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3(例如参见表2)。
在特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其片段的核苷酸序列，所述抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其片段包含VH结构域，例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包含本文所述的氨基酸序列(例如参见表1和5，例如这些表中以名称标识的特定抗体的VH CDR和VH FR)。在特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其片段的核苷酸序列，所述抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其片段包含VL结构域，例如含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，包含本文所述的氨基酸序列(例如参见表2和6，例如这些表中以名称标识的特定抗体的VL CDR和VL FR)。
在某些实施例中，本文所述的多核苷酸包含编码重链可变区的核苷酸序列，所述重链可变区包含本文所述的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464、41或71)，其中含所述重链可变区的抗体免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)。在某一实施例中，本文所述的多核苷酸包含本文所提供的重链可变区编码序列(例如SEQ ID NO:470、243或273的可变区编码部分)，其中含所述重链可变区的抗体免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)。
在某些实施例中，本文所述的多核苷酸包含编码轻链可变区的核苷酸序列，所述轻链可变区包含本文所述的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或72)，其中含所述轻链可变区的抗体免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)。在某一实施例中，本文所述的多核苷酸包含本文所提供的轻链可变区编码序列(例如SEQ ID NO:244或274的可变区编码部分)，其中含所述轻链可变区的抗体免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)。
在一个特定实施例中，本文所提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或核苷酸序列组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链，其中该重链包括含表3中所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464、41或71)的重链可变结构域以及含人类γ重链恒定区的氨基酸序列的恒定区。
在一个特定实施例中，本文所提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或核苷酸序列组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含轻链，其中该轻链包括含表4中所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或72)的轻链可变结构域以及含人类λ轻链恒定区的氨基酸序列的恒定区。
在一个特定实施例中，本文所提供的多核苷酸或多核苷酸组合包含编码免疫特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列或核苷酸序列组合，其中所述抗体或其抗原结合片段包含(i)重链，其中该重链包括含表3中所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:464、41或71)的重链可变结构域以及含人类γ重链恒定区的氨基酸序列的恒定区；和(ii)轻链，其中该轻链包括含表4中所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO:42或72)的轻链可变结构域以及含人类λ轻链恒定区的氨基酸序列的恒定区。
在一个实施例中，本文所提供的多核苷酸组合包括含SEQ ID NO:470的核苷酸序列的多核苷酸以及含SEQ ID NO:244的核苷酸序列的多核苷酸。
在一个实施例中，本文所提供的多核苷酸组合包括含SEQ ID NO:243的核苷酸序列的多核苷酸以及含SEQ ID NO:244的核苷酸序列的多核苷酸。
在一个实施例中，本文所提供的多核苷酸组合包括含SEQ ID NO:273的核苷酸序列的多核苷酸以及含SEQ ID NO:274的核苷酸序列的多核苷酸。
在一个特定实施例中，本文提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文所命名的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其结构域的核苷酸序列，参见例如表1-8。
本文还提供了编码本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸，所述多核苷酸例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换以及消除mRNA不稳定元件进行优化。通过引入密码子变化(例如由于遗传密码的简并性而编码同一氨基酸的密码子变化)和/或去除mRNA中的抑制区来产生编码抗B7-H4抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如重链、轻链、VH结构域或VL结构域)的优化的核酸进行重组表达的方法可以通过采用例如美国专利第5,965,726号、第6,174,666号、第6,291,664号、第6,414,132号及第6,794,498号中所述的优化方法进行。
编码本文所述抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸可以由来自适合来源(例如杂交瘤)的核酸，使用本领域中众所周知的方法(例如PCR及其它分子克隆方法)产生。例如，可以使用自产生所关注抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA，使用可与已知序列的3’和5’末端杂交的合成引物进行PCR扩增。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法可以用于获得包含编码抗体或其抗原结合片段的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆至载体中以在宿主细胞中表达并用于进一步克隆以例如产生嵌合和人源化抗体或其抗原结合片段。
本文所提供的多核苷酸可例如呈RNA形式或呈DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，并且DNA可以是双链或单链的。如果是单链，则DNA可以是编码链或非编码(反义)链。在某些实施例中，多核苷酸是cDNA或缺少一个或多个内源性内含子的DNA。在某些实施例中，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸是重组产生的。在某些实施例中，多核苷酸是分离的。在某些实施例中，多核苷酸是大体上纯的。在某些实施例中，多核苷酸是自天然组分纯化得到。
1.2.2细胞和载体
在某些方面，本文提供了用于在宿主细胞中，优选在哺乳动物细胞中重组表达的包含多核苷酸的载体(例如表达载体)，所述多核苷酸包含编码抗B7-H4抗体和其抗原结合片段或其结构域的核苷酸序列。本文也提供包含此类用于重组表达本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如人类或人源化抗体或其抗原结合片段)的载体的细胞，例如宿主细胞。在一个特定方面，本文提供了用于产生本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达此类抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，本文所述的特异性结合至B7-H4(例如人类B7-H4)的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如本文所述的重链或轻链)的重组表达涉及构建表达载体，所述表达载体含有编码所述抗体或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸。在获得编码本文所述的抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如重链或轻链可变结构域)的多核苷酸后，就可通过重组DNA技术，使用本领域中众所周知的技术制造用于产生所述抗体或其抗原结合片段的载体。因此，本文描述了通过表达多核苷酸来制备蛋白质的方法，该多核苷酸含有编码抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如轻链或重链)的核苷酸序列。可以使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有抗体或其抗原结合片段或其结构域(例如轻链或重链)编码序列以及适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。还提供了可复制载体，所述值载体包含可操作地连接至启动子的编码本文所述的抗体或其抗原结合片段、重链或轻链、重链或轻链可变结构域，或重链或轻链CDR的核苷酸序列。所述载体可例如包括编码抗体或其抗原结合片段的恒定区的核苷酸序列(参见例如国际公开第WO 86/05807号和第WO 89/01036号；以及美国专利第5,122,464号)，并且所述抗体或其抗原结合片段的可变结构域可克隆至此类载体中以表达完整重链、完整轻链或完整重链和轻链两者。
可以通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如宿主细胞)中，接着可以通过常规技术培养所得细胞，以产生本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的六个CDR、VH、VL、VH和VL、重链、轻链或重链和轻链的抗体或其抗原结合片段)或其结构域(例如20502、20502.1或22213的VH、VL、VH和VL、重链或轻链)。因此，本文提供了含有编码本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的六个CDR、VH、VL、VH和VL、重链、轻链或重链和轻链的抗体或其抗原结合片段)或其结构域(例如20502、20502.1或22213的VH、VL、VH和VL、重链或轻链)的多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸可操作地连接至使此类序列在宿主细胞中表达的启动子。在某些实施例中，对于表达双链抗体或其抗原结合片段，如以下详述，可在宿主细胞中共表达独立地编码重链和轻链的载体以表达完整免疫球蛋白分子。在某些实施例中，宿主细胞含有载体，该载体包含编码本文所述抗体的重链和轻链(例如20502、20502.1或22213的重链和轻链)或其结构域(例如20502、20502.1或22213的VH和VL)的多核苷酸。在特定实施例中，宿主细胞含有两个不同载体，第一个载体包含编码本文所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸，并且第二个载体包含编码本文所述抗体(例如包含20502、20502.1或22213的六个CDR的抗体)的轻链或轻链可变区，或其结构域的多核苷酸。在其它实施例中，第一宿主细胞包含第一载体，该第一载体包含编码本文所述抗体或其抗原结合片段的重链或重链可变区的多核苷酸；并且第二宿主细胞包含第二载体，该第二载体包含编码本文所述抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的六个CDR的抗体或其抗原结合片段)的轻链或轻链可变区的多核苷酸。在特定实施例中，由第一细胞表达的重链/轻链可变区与第二细胞的轻链/重链可变区缔合形成本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的六个CDR的抗体或其抗原结合片段)。在某些实施例中，本文提供包含所述第一宿主细胞以及所述第二宿主细胞的宿主细胞群。
在一个特定实施例中，本文提供了一组载体，所述载体包含：第一载体，该第一载体包含编码本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的轻链/轻链可变区的多核苷酸；和第二载体，该第二载体包含编码本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的CDR的抗体或其抗原结合片段)的重链/重链可变区的多核苷酸。或者，可使用单一载体，该载体编码且能够表达重链和轻链多肽两者。
可以利用多种宿主表达载体系统表达本文所述的抗体或其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的CDR的抗体或其抗原结合片段)(参见例如美国专利第5,807,715号)。所述宿主表达系统表示运载工具，利用这些运载工具，可以产生所关注编码序列，随后进行纯化，而且也表示细胞，这些细胞当用适当核苷酸编码序列转化或转染时可以原位表达本文所述的抗体或其抗原结合片段。这些表达系统包括但不限于，被含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物，如细菌(例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；被含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如毕赤酵母(Saccharomyces Pichia))；被含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；被重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或被含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统(例如绿藻，如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii))；或带有含来源于哺乳动物细胞基因组(例如金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20以及BMT10细胞)。在一个特定实施例中，用于表达本文所述抗体和其抗原结合片段(例如包含20502、20502.1或22213的CDR的抗体或其抗原结合片段)的细胞是CHO细胞，例如来自CHO GS SystemTM(Lonza)的CHO细胞。在一个特定实施例中，用于表达本文所述抗体的细胞是人类细胞，例如人类细胞系。在一个特定实施例中，哺乳动物表达载体是pOptiVECTM或pcDNA3.3。在一个特定实施例中，使用细菌细胞，如大肠杆菌；或真核细胞(例如哺乳动物细胞)表达重组抗体分子，尤其用于表达完全重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞结合载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件是有效的抗体表达系统(Foecking MK和Hofstetter H(1986)Gene 45:101-105；以及Cockett MI等人(1990)Biotechnology 8:662-667)。在某些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是由CHO细胞或NS0细胞产生。
此外，可选择调节插入序列的表达，或以所希望的特定方式改变和加工基因产物的宿主细胞系。针对蛋白质产物的所述修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)可以促成蛋白质功能。为此，可使用具有用于适当加工初级转录物、糖基化和基因产物磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及T47D、NS0(不能内源性产生任何免疫球蛋白链的鼠类骨髓瘤细胞系)、CRL7O3O、COS(例如COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10以及HsS78Bst细胞。在某些实施例中，本文所述的抗B7-H4抗体(例如包含20502、20502.1或22213的CDR的抗体或其抗原结合片段)是在哺乳动物细胞，如CHO细胞中产生。
在某些实施例中，本文所述的抗B7-H4抗体(例如包含20502、20502.1或22213的CDR的抗体或其抗原结合片段)是在CHOK1SV细胞中产生。
在一些实施例中，提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含编码本文所述抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的核酸，其中所述宿主细胞缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)。在一些实施例中，宿主细胞是CHO细胞。
一旦通过重组表达产生本文所述抗体或其抗原结合片段，就可以通过本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法，例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是在蛋白质A后针对特定抗原的亲和色谱法，以及尺寸排阻色谱法)、离心、差异性溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术对所述抗体或其抗原结合片段进行纯化。另外，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以与本文所述或本领域中另外已知的有助于纯化的异源多肽序列融合。
在特定实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段被分离或纯化。一般而言，分离的抗体或其抗原结合片段是大体上不含抗原特异性不同于所述分离的抗体或其抗原结合片段的其它抗体或其抗原结合片段者。例如，在一个特定实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段制剂大体上不含细胞材料和/或化学前驱物。
1.3药物组合物
本文提供了组合物，所述组合物包含于生理学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.,Easton,PA)中的具有所希望纯度的本文所述抗体或其抗原结合片段。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。
在各种实施例中，包含抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的组合物是以与药学上可接受的载剂的配制物形式提供(参见例如Gennaro,Remington:The Science and Practiceof Pharmacy with Facts and Comparisons:Drugfacts Plus,第20版(2003)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,LippencottWilliams and Wilkins(2004)；Kibbe等人,Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000))。
本文所述的药物组合物可用于阻断B7-H4针对T细胞的抑制活性和/或可用于ADCC依赖性耗尽表达B7-H4的细胞。本文所述的药物组合物可用于治疗病况，如癌症。可根据本文所述方法治疗的癌症的实例包括但不限于乳癌(例如三阴性乳癌、导管癌)、子宫内膜癌、卵巢癌和非小细胞肺癌(例如鳞状细胞癌)、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)以及膀胱癌(例如膀胱上皮细胞癌)。非小细胞非癌可以是例如腺癌。可根据本文所述方法治疗的癌症的其它实例包括但不限于头颈癌、小细胞肺癌、胃癌、黑素瘤以及胆管上皮癌。在一个实施例中，卵巢癌是浆液性腺癌。在一个实施例中，乳癌是导管腺癌。
在一个实施例中，本文所述的药物组合物用作药物。在一个实施例中，本文所述的药物组合物用作诊断剂，例如用以检测自患者(例如人类患者)获得的样品中B7-H4的存在。
打算用于体内施用的组合物可以是无菌的。这易于通过滤过例如无菌滤膜来实现。
在一些实施例中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。在一些实施例中，提供了药物组合物，其中所述药物组合物包含本文所述的无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载剂。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少80％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少85％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少90％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少95％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少96％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少97％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少98％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，例如其中所述组合物中至少99％的抗体是无岩藻糖基化的。在特定实施例中，所述药物组合物包含无岩藻糖基化的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，其中在所述组合物中没有检测到岩藻糖
在一些实施例中，药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括(a)分别为SEQ ID NO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列；(b)含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(c)含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；以及(ii)药学上可接受的赋形剂。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含分别为SEQ ID NO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中在所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括(a)分别为SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列；(b)含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区和含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(c)含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链和含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链；以及(ii)药学上可接受的赋形剂。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含分别为SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中在所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
在一些实施例中，药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括(a)分别为SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列，(b)含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区，或(c)含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链；以及(ii)药学上可接受的赋形剂。
本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含分别为SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中在所述组合物中至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。在一个实施例中，(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
1.4用途和方法
1.4.1治疗用途和方法
在一个方面，本文提供了用于调节受试者的一种或多种免疫功能的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或如上文和本文所述的其药物组合物。
在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给患者(例如人类患者)以增加患者体内T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给患者(例如人类患者)以增加患者体内干扰素γ(IFNγ)的产生。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给患者(例如人类患者)以阻断患者体内B7-H4针对T细胞的抑制性活性。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给患者(例如人类患者)以耗尽患者体内表达B7-H4的癌细胞。在另一个实施例中，施用抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物以实现以上作用中的两种或两种以上作用。
在某一实施例中，本文提供了治疗癌症，例如表达B7-H4的癌症的方法。所述治疗癌症的方法可以包括向有需要的患者(例如人类患者)施用本文所提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或包含本文所提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在某一实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，所述癌症选自由以下组成的组：乳癌(例如三阴性乳癌、导管癌)、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌(例如鳞状细胞癌)、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)以及膀胱癌(例如膀胱上皮细胞癌)。在某一实施例中，本文提供了治疗非小细胞肺癌的方法，该非小细胞肺癌是腺癌。在某一实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、小细胞肺癌、胃癌、黑素瘤以及胆管上皮癌。在一个实施例中，卵巢癌是浆液性腺癌。在一个实施例中，乳癌是导管腺癌。在一些实施例中，所述方法包括向有需要的患者(例如人类患者)施用本文所提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或包含本文所提供的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施例中，癌症是表达B7-H4的癌症。
在某一实施例中，本文提供了一种治疗PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症的方法。PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症可能先前对PD-1/PD-L1抑制剂起反应，但可能变得对PD-1/PD-L1抑制剂反应性降低，或该癌症可能从未对PD-1/PD-L1抑制剂起反应。对PD-1/PD-L1抑制剂反应不足意谓，预期在标准剂量的PD-1/PD-L1抑制剂之后将改善的癌症各方面都未改善，和/或仅在施用超过标准剂量时才发生改善。在一些实施例中，患有PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症的受试者在接收标准剂量至少两周、至少三周、至少四周、至少六周或至少十二周之后已经历，或正在经历对PD-1/PD-L1抑制剂的不足反应。“标准”剂量是由医学专业人员确定，并且可以取决于受试者的年龄、健康史、疾病的严重程度、给药频率等。在一些实施例中，患有PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症的受试者已经历，或正在经历对抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体的不足反应。在一些实施例中，患有PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症的受试者已经历，或正在经历对AMP-224的不足反应。在一些实施例中，患有PD-1/PD-L1抑制剂反应不足性癌症的受试者已经历，或正在经历对选自纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)的PD-1/PD-L1抑制剂的不足反应。
在某一实施例中，本文提供了一种治疗表达较低量PD-L1的癌症的方法。在一些实施例中，表达“较低量PD-L1”的癌症或“低水平表达PD-L1”的癌症表示，PD-L1的含量低于适于用PD-1或PD-L1拮抗剂治疗的癌症的表达量，其中基于PD-L1表达量选择进行治疗的患者。在一些实施例中，“较低量PD-L1”是肿瘤中不到1％的细胞具有膜染色者。在一些实施例中，关于PD-L1的“较低量”是肿瘤细胞中有不到1％，例如0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或0％的细胞被染色。在一些实施例中，PD-L1表达量可以通过显色IHC或免疫荧光IHC(Aqua评分)进行测量。在某些实施例中，5％或更低(包括肿瘤和/或免疫细胞)的PD-L1染色可以指示样品表达“较低量PD-L1”。在某些实施例中，10％或更低(包括肿瘤和/或免疫细胞)的PD-L1染色可以指示样品表达“较低量PD-L1”。除非本文另作指示，否则在本文中使用5％阈值(即，5％或更低指示“较低量的PD-L1”)。
在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给被诊断患有癌症的患者(例如人类患者)以增加患者体内T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给被诊断患有癌症的患者(例如人类患者)以增加患者体内干扰素γ(IFNγ)的产生。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给被诊断患有癌症的患者(例如人类患者)以阻断患者体内B7-H4针对T细胞的抑制性活性。在另一个实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物施用给被诊断患有癌症的患者(例如人类患者)以耗尽患者体内表达B7-H4的癌细胞。
在其它实施例中，将抗B7-H4抗体或其抗原结合片段，或药物组合物，且另外与额外治疗剂，例如化学治疗剂或免疫调节剂，如T细胞检查点抑制剂组合施用给以上提供的患者。
在一个例示性实施例中，所述额外治疗剂是PD-1拮抗剂，如拮抗性PD-1抗体。适合PD-1抗体包括例如OPDIVO(纳武单抗)、KEYTRUDA(派姆单抗)或MEDI-0680(AMP-514；WO2012/145493)。适合PD-1抗体还包括例如卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR-1210)、替雷利珠单抗(tislelizumab)(BGB-A317)或斯帕利珠单抗(spartalizumab)(NPVPDR001、NVS240118、PDR001)。所述额外治疗剂还可包括匹迪立珠单抗(pidilizumab)(CT-011)。由PD-L2(B7-DC)的细胞外结构域与IgG1的Fc部分融合构成的重组蛋白，称为AMP-224，也可用于拮抗PD-1受体。
在另一个例示性实施例中，所述额外治疗剂是PD-L1拮抗剂，如拮抗性PD-L1抗体。适合PD-L1抗体包括例如TECENTRIQ(阿特珠单抗)、度伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)、BMS-936559(WO2007/005874)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。
在又另一个例示性实施例中，所述额外治疗剂是GITR激动剂，如激动性GITR抗体。适合GITR抗体包括例如TRX-518(WO06/105021、WO09/009116)、MK-4166(WO11/028683)或WO2015/031667中所公开的GITR抗体。在另一个实施例中，所述额外治疗剂是WO2017/015623中所公开的GITR抗体。在一个特定实施例中，GITR抗体选自：a)包含GITR结合结构域(GITR-BD)的抗体，该GITR结合结构域包括含SEQ ID NO:411的序列的CDR1、含SEQ ID NO:412的序列的CDR2和含SEQ ID NO:413的序列的CDR3；b)包括含SEQ ID NO:414的序列的GITR-BD的抗体；c)包含两个多肽拷贝的四价分子，所述多肽具有结构(GITR-BD)-连接子-(GITR-BD)-连接子-铰链-Fc，其中(i)GITR-BD包括含SEQ ID NO:411的序列的CDR1、含SEQID NO:412的序列的CDR2和含SEQ ID NO:413的序列的CDR3；(ii)连接子是多肽；(iii)铰链是来源于免疫球蛋白铰链区的多肽；以及(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；d)包含两个多肽拷贝的四价分子，所述多肽具有结构(GITR-BD)-连接子-(GITR-BD)-连接子-铰链-Fc，其中(i)GITR-BD包括含SEQ ID NO:414的氨基酸序列；(ii)连接子是多肽；(iii)铰链是来源于免疫球蛋白铰链区的多肽；以及(iv)Fc是免疫球蛋白Fc多肽；及e)包括含SEQ ID NO:415的序列的多肽的两个拷贝的四价分子。在以上四价分子的实施例中的任一个中，铰链区可以包含SEQ ID NO:416、417或418的序列。在以上四价分子的实施例中的任一个中，连接子可以包含选自GG、GGG以及SEQ ID NO:419-425的氨基酸序列。在某些实施例中，铰链包含SEQID NO:417且连接子包含SEQ ID NO:419-423中的任一个。
在又另一个例示性实施例中，所述额外治疗剂是CD80细胞外结构域(CD80 ECD)，例如SEQ ID NO:426；或如WO2017/079117中所公开的包含CD80 ECD和融合搭配物的CD80ECD融合分子。在某些实施例中，CD80 ECD融合分子是CD80 ECD-Fc融合蛋白。在一个特定实施例中，CD80 ECD-Fc融合蛋白包含SEQ ID NO:427或428的序列。
在又另一个例示性实施例中，所述额外治疗剂是US8,182,813、US8,206,715、US8,263,079、US8,513,199或US9,221,910中所公开的抗CSF1R抗体。在一个特定实施例中，抗CSF1R抗体选自：a)包括含SEQ ID NO:429的序列的重链和含SEQ ID NO:430的序列的轻链的抗体；b)包含重链和轻链的抗体，所述重链包括含SEQ ID NO:431的序列的重链(HC)互补决定区1(CDR1)、含SEQ ID NO:432的序列的HC CDR2和含SEQ ID NO:433的序列的HC CDR3，并且轻链包括含SEQ ID NO:434的序列的轻链(LC)CDR1、含SEQ ID NO:435的序列的LCCDR2和含SEQ ID NO:436的序列的LC CDR3；以及c)包括含SEQ ID NO:437的序列的重链和含SEQ ID NO:438的序列的轻链的抗体。
通常，患者是人类，但也可治疗非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物。
在一些实施例中，本发明涉及用作药物的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在一些方面，本发明涉及用于治疗癌症的方法中的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。在一些方面，本发明涉及用于治疗受试者的癌症的方法中的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物。
1.4.1.1施用途径和剂量
本文所述的抗体或其抗原结合片段或组合物可以通过多种途径，如通过肠胃外、皮下、静脉内、皮内、经皮、鼻内、肿瘤内以及施用给肿瘤引流淋巴结来递送至受试者。在一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段或组合物是通过静脉内途径施用。
有效治疗病况的抗体或其抗原结合片段或组合物的量将取决于疾病的性质。组合物中采用的精确剂量也将取决于施用途径和疾病的严重程度。
1.4.2检测和诊断用途
可以使用本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段(参见第5.2部分)，使用本领域技术人员已知的经典方法，包括免疫分析，如酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫沉淀或Western印迹法分析生物样品中的B7-H4蛋白质含量。适合抗体分析标记是本领域中已知的，并且包括酶标记，如葡萄糖氧化酶；放射性同位素，如碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)和锝(99Tc)；发光标记，如鲁米诺；以及荧光标记，如荧光素和罗丹明；以及生物素。此类标记可用于标记本文所述的抗体或其抗原结合片段。或者，识别本文所述的抗B7-H4抗体或其抗原结合片段的另一抗体或其抗原结合片段可被标记，并且与抗B7-H4抗体或其抗原结合片段组合使用以检测B7-H4蛋白质含量。
预期B7-H4蛋白质表达量的分析包括直接地(例如通过测定或估计绝对蛋白质含量)或相对地(例如通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白质含量相比较)定性或定量地测量或估计第一生物样品中B7-H4蛋白质的含量。可测量或估计第一生物样品中的B7-H4多肽表达量并与标准B7-H4蛋白质含量相比较，该标准是自未患病症的个体获得的第二生物样品取得或通过对未患病症的个体群的含量求平均值测定。如本领域中所了解，一旦已知“标准”B7-H4多肽含量，就可反复使用该含量作为比较标准。
如本文所使用，术语“生物样品”是指从可能表达B7-H4的受试者、细胞系、组织或其它细胞来源获得的任何生物样品。用于自动物(例如人类)获得组织活检样品和体液的方法是本领域中众所周知的。生物样品包括外周单核血液细胞。生物样品也可以是血液样品，其中循环肿瘤细胞(或“CTC”)可以表达B7-H4并且被检测。
本文所述的抗B7-H4抗体可用于预测、诊断、监测和筛选应用，包括本领域技术人员众所周知且基于本发明的标准体外及体内应用。用于体外评估和评价免疫系统状态和/或免疫反应的预测、诊断、监测和筛选分析和试剂盒可以用于预测、诊断和监测以评价包括已知具有或怀疑具有免疫系统功能异常或癌症的患者样品。此类预测和诊断监测和评估已用于利用针对乳癌中的HER2蛋白质的抗体(HercepTestTM,Dako)的实践中，其中所述分析也被用于评价使用的抗体疗法的患者。体内应用包括定向细胞疗法以及免疫系统调节和免疫反应放射成像。
本文所述的抗B7-H4抗体和其抗原结合片段可以带有可检测或功能性标记。当使用荧光标记时，可以利用本领域中已知的当前可用的显微镜检查和荧光活化细胞分选仪分析(FACS)或两种方法程序的组合来鉴别和定量特定结合成员。本文所述的抗B7-H4抗体和其抗原结合片段可以带有荧光标记。例示性荧光标记包括例如反应性和缀合探针，例如氨基香豆素、荧光素和得克萨斯红、Alexa Fluor染料、Cy染料以及DyLight染料。抗B7-H4抗体可以带有放射性标记，如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、67Cu、90Y、99Tc、111In、117Lu、121I、124I、125I、131I、198Au、211At、213Bi、225Ac和186Re。当使用放射性标记时，可以本领域中已知的当前可用的计数程序鉴别和定量抗B7-H4抗体或抗原结合片段与B7-H4(例如人类B7-H4)的特异性结合。在标记是酶的实例中，检测可以通过本领域中已知的目前所用的比色法、分光光度法、荧光分光光度法、安培法或气体定量分析技术实现。这可以通过使样品或对照样品与抗B7-H4抗体或其抗原结合片段在允许该抗体或其抗原结合片段与B7-H4之间形成复合物的条件下接触实现。检测样品和对照物中所述抗体或其抗原结合片段与B7-H4之间形成的任何复合物并加以比较。就本文所述的抗体或其抗原结合片段与B7-H4特异性结合而言，可以使用所述抗体或其抗原结合片段特异性检测细胞表面上B7-H4的表达。也可使用本文所述的抗体或其抗原结合片段，通过免疫亲和纯化法来纯化B7-H4。
本文还包括一种分析系统，该分析系统可以制备成测试试剂盒的形式以用于定量分析例如B7-H4的存在范围。该系统或测试试剂盒可以包含被标记的组分，例如被标记的抗体或抗原结合片段，以及一种或多种额外免疫化学试剂。有关试剂盒的更多详情，参见例如以下第5.6部分。
在一些方面，本文提供了用于体外检测样品中的B7-H4的方法，所述方法包括使该样品与抗体或其抗原结合片段接触。在一些方面，本文提供了本文所提供的抗体或其抗原结合片段用于体外检测样品中的B7-H4的用途。在一个方面，本文提供了本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其用于检测受试者或自受试者获得的样品中的B7-H4。在一个方面，本文提供了本文所提供的抗体或其抗原结合片段或药物组合物，其用作诊断剂。在一个优选实施例中，所述抗体包含可检测标记。在一个优选实施例中，B7-H4是人类B7-H4。在一个优选实施例中，受试者是人类。
1.5试剂盒
本文提供了试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种本文所述的抗体或其抗原结合片段或其缀合物。在一个特定实施例中，本文提供了一种药物包装或试剂盒，该药物包装或试剂盒包含一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的药物组合物的一种或多种成分，如一种或多种本文所提供的抗体或其抗原结合片段。任选地与此类容器相联的可以是政府机构规定形式的规定药物或生物产品制造、使用或销售的说明书，该说明书反映该机构批准制造、使用或销售用于人类施用。
本文还提供了可用于诊断方法中的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒在一个或多个容器中包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，优选为纯化的抗体或其抗原结合片段。在一个特定实施例中，本文所述的试剂盒含有大体上分离的B7-H4抗原(例如人类B7-H4)，该抗原可用作对照物。在另一个特定实施例中，本文所述的试剂盒进一步包含不与B7-H4抗原反应的对照抗体或其抗原结合片段。在另一个特定实施例中，本文所述的试剂盒含有一种或多种用于检测抗体或其抗原结合片段与B7-H4抗原的结合的成分(例如，该抗体或其抗原结合片段可与可检测基质，如荧光化合物、酶底物、放射性化合物或发光化合物缀合，或者识别第一抗体或其抗原结合片段的第二抗体可与可检测基质缀合)。在特定实施例中，本文所提供的试剂盒可以包括重组产生或化学合成的B7-H4抗原。试剂盒中提供的B7-H4抗原也可附接至固体支撑物。在一个更具体的实施例中，上述试剂盒的检测构件包括附接有B7-H4抗原的固体支撑物。此类试剂盒还可包括未附接的报告子标记的抗人类抗体或其抗原结合片段、或抗小鼠/大鼠抗体或其抗原结合片段。在这一实施例中，该抗体或其抗原结合片段与B7-H4抗原的结合可以通过所述报告子标记的抗体或其抗原结合片段的结合检测。
以下实例是出于说明目的而非限制性目的提供。
实例
本部分(即第6部分)中的实例是出于说明目的而非限制性目的提供。
实例1：对多种适应症中B7-H4表达的流行率的评估
使用B7-H4小鼠单克隆抗体A57.1(ATCC目录号PTA-5180)检测档案样品、全切片的混合物以及肿瘤微阵列上B7-H4的存在。用一次抗体处理样品，并使用附接至DAB(VentanaMedical Systems)的聚合物检测系统检测。
在从多名癌症患者，包括侵袭性导管癌、三阴性乳癌、卵巢癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌患者收集的肿瘤组织中的细胞膜和细胞溶质中容易检测到B7-H4。(图1)。此外，在表11中所列适应症中，表达的频率也较高。
表11：肿瘤中B7-H4的检测
B7-H4在其它癌症，如肾癌(例如肾细胞癌)、膀胱癌(例如膀胱上皮细胞癌)、胰腺癌和甲状腺癌中表达。参见例如Zhu,J.等人,Asian Pacific J.Cancer Prev.14:3011-3015(2011)；Krambeck A等人,PNAS 103:10391-10396(2006)；Fan,M.等人,Int.J.Clin.Exp.Pathol.7:6768-6775(2014)；Xu,H.等人,Oncology Letters 11:1841-1846(2016)；以及Liu,W.等人,Oncology Letters 8:2527-2534(2014)。
在随后的实验中，通过免疫组织化学法(IHC)评估各种肿瘤类型中B7-H4的流行率(图1B)。测试以下肿瘤类型和疾病分期：子宫内膜癌、乳房侵袭性导管癌(IDC)、三阴性乳癌(TN)、三阴性乳癌(晚期)、卵巢癌、膀胱癌(早期)、非小细胞肺癌(鳞状细胞(sq)，早期)、非小细胞肺癌(sq，晚期)、头颈癌、膀胱癌(晚期)、小细胞肺癌、胆管上皮癌、非小细胞肺癌(腺癌(ad))、甲状腺癌、胰腺癌、胃癌、黑素瘤、胶质母细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤(GBM)，以及默克细胞癌。针对从可获得的各种肿瘤类型和疾病分期(早期(I/II)、晚期(III/IV))得到的肿瘤样品评价肿瘤细胞上B7-H4表面蛋白质的表达。根据0至3级分类对抗体A57.1的IHC强度评分，并通过在每个全切片的所有肿瘤细胞的最少10％中观察到最高强度，对样品赋予单一IHC分数。每一肿瘤类型评价总计50至100个样品。
实例2：针对人类B7-H4的新颖抗体的产生
使用体外酵母展示系统，从全长人类IgG1天然抗体文库分离出B7-H4特异性抗体。这些文库被设计用于模拟免疫系统；这些免疫系统不含预先限定的重链和轻链对。使用B7-H4蛋白质对文库执行多轮阳性和阴性选择策略，以富集与人类、食蟹猕猴和鼠类B7-H4靶交叉反应的IgG。在四轮选择之后，对所得到的IgG测序，并产生独特的抗体，并且针对与重组B7-H4胞外结构域的期望和单体结合亲和力、针对表位分组以及针对靶特异性细胞结合加以评价。
以下论述有关用于产生和表征B7-H4抗体的选择、亲和力成熟和分析方法的更详细说明。
材料和方法
使用来自Pierce的EZ-Link磺基-NHS-生物素化试剂盒使抗原生物素化。山羊F(ab’)2抗人类κ-FITC(LC-FITC)、ExtrAvidin-PE(EA-PE)和抗生蛋白链菌素-AF633(SA-633)分别是从Southern Biotech、Sigma和Molecular Probes获得。抗生蛋白链菌素微珠和MACS LC分离柱是从Miltenyi Biotec购得。山羊抗人类IgG-PE(Human-PE)是从SouthernBiotech获得。
天然发现
如先前所述(参见Y.Xu等人,Addressing polyspecificity of antibodiesselected from an in vitro yeast presentation system:aFACS-based,high-throughput selection and analytical tool.PEDS26.10,663-70(2013)；WO2009036379；WO2010105256；以及WO2012009568)，使分别具有约109多样性的八个天然人类合成酵母文库繁殖。对于前两轮选择，如先前所述(参见Siegel等人,High efficiency recovery andepitope-specific sorting of an scFv yeast display library."J Immunol Methods286(1-2),141-153(2004))，利用Miltenyi MACS系统执行磁珠分选技术。简单点说，在30℃下，将酵母细胞(约1010个细胞/文库)与10ml的10nM生物素化Fc融合抗原一起在洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)/0.1％牛血清白蛋白(BSA))中培育30分钟。在用40ml冰冷的洗涤缓冲液洗涤一次之后，使细胞团再悬浮于20mL洗涤缓冲液中，并将抗生蛋白链菌素微珠(500μl)添加至酵母中，并在4℃下培育15分钟。接下来，使酵母聚结成团，再悬浮于20mL洗涤缓冲液中，并装载至Miltenyi LS柱上。在20mL都装载后，用3ml洗涤缓冲液洗涤柱3次。接着，将柱从磁场移开，并用5mL生长培养基洗脱酵母，接着使其生长过夜。随后的数轮选择是使用流式细胞术执行的。使约2×107个酵母聚结成团，用洗涤缓冲液洗涤三次，并在30℃下，与递减浓度的生物素化Fc融合抗原(10至1nM)在平衡条件下一起培育、与10nM不同物种的生物素化Fc融合抗原(以便获得物种交叉反应性)或与多特异性耗尽试剂(poly-specificity depletion reagent，PSR)(用以自选择中移除非特异性抗体)一起培育。对于PSR耗尽，如先前所述(参见Y.Xu等人,addressing polyspecificity of antibodiesselected from an in vitro yeast presentation system:a FACS-based,high-throughput selection and analytical tool.PEDS26.10,663-70(2013))，将文库与1:10稀释的生物素化PSR试剂一起培育。接着，用洗涤缓冲液洗涤酵母两次并在4℃下，用LC-FITC(1:100稀释)以及SA-633(1:500稀释)或EAPE(1:50稀释)二次试剂染色15分钟。用洗涤缓冲液洗涤两次之后，使细胞团再悬浮于0.3mL洗涤缓冲液中并转移至过滤器封盖的分选管中。使用FACS ARIA分选仪(BD Biosciences)执行分选，并确定分选选通以选出具有所希望特征的抗体。重复选择循环，直至获得具有所有所希望特征的群体。最后一轮分选之后，涂铺酵母并拣选个别集落进行表征。
抗体优化
如下所述，通过轻链分批改组法，接着通过将多样性引入重链和轻链可变区中来执行抗体的优化。针对每种抗体使用这些方法中的一些的组合。
轻链分批改组：通过强行夺取(smash and grab)从酵母提取出来自天然选择输出的重链质粒，使其在大肠杆菌中扩增，随后自大肠杆菌纯化，并将其转化至具有5×106多样性的轻链文库中。采用与天然发现相同的条件，利用一轮MACS和四轮FACS执行选择。
CDRH1和CDRH2选择：使单一抗体的CDRH3重组于多样性为1×108且具有CDRH1和CDRH2变体的预先制备的文库中，并如天然发现中所述，利用一轮MACS和四轮FACS执行选择。对于每轮FACS，检查文库的PSR结合、物种交叉反应性和亲和力压力，并执行分选以便获得具有所希望特征的群体。对于这些选择，通过在30℃下，在平衡条件下使用递减浓度的生物素化HIS-B7-H4抗原(100至1nM)施加亲和力压力。
VH Mut选择：通过易错PCR对重链可变区(VH)进行诱变。接着，通过将该诱变的VH和重链表达载体转化至已含有亲本的轻链质粒的酵母中来产生文库。使用FACS分选，以与先前循环类似的方式执行两轮选择。对于每轮FACS，检查文库的PSR结合和亲和力压力，并执行分选以便获得具有所希望特征的群体。这些选择的亲和力压力是如以上在CDRH1和CDRH2选择中所述执行。
CDRL1和CDRL2选择：将单一抗体的CDRL3重组于多样性为约5×105且具有CDRL1和CDRL2变体的预先制备的文库中，并使用FACS分选，以与先前循环类似的方式执行三轮选择。对于每轮FACS，检查文库的PSR结合和亲和力压力，并执行分选以便获得具有所希望特征的群体。这些选择的亲和力压力是如以上在CDRH1和CDRH2选择中所述执行。
抗体产生和纯化
使酵母克隆生长至饱和，接着在振荡下，在30℃下诱导48小时。诱导之后，使酵母细胞聚结成团，并收集上清液进行纯化。使用蛋白质A柱纯化IgG并用乙酸(pH 2.0)洗脱。通过木瓜蛋白酶消化产生Fab片段，并通过KappaSelect(GE Healthcare LifeSciences)纯化。
ForteBio KD测量
ForteBio亲和力测量是大体上如先前所述(参见Estep等人,High throughputsolution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitopebinning.Mabs 5(2),270-278(2013))，在Octet RED384上执行。简单点说，ForteBio亲和力测量是通过将IgG在线装载至AHQ传感器上来执行。传感器在分析缓冲液中离线平衡30分钟，接着在线监测60秒以建立基线。使载有IgG的传感器暴露于100nM抗原3分钟，接着转移至分析缓冲液中，保持3分钟，以测量解离速率。对于单价亲和力评估，使用Fab代替IgG。对于这一评估，将未生物素化的Fc融合抗原在线装载至AHQ传感器上。传感器在分析缓冲液中离线平衡30分钟，接着在线监测60秒以建立基线。使载有抗原的传感器暴露于100nM Fab 3分钟，接着将其转移至分析缓冲液中，保持3分钟，以测量解离速率。所有动力学均使用1:1结合模型分析。
ForteBio表位分组/配体阻断
使用标准夹心型交叉阻断分析执行表位分组/配体阻断。将对照抗靶IgG装载至AHQ传感器上并用不相关人类IgG1抗体阻断该传感器上未被占据的Fc结合位点。接着，使传感器依序暴露于100nM靶抗原和另一抗靶抗体或配体。在抗原缔合后，所述另一抗体或配体的额外结合指示有未被占据的表位(非竞争剂)，而不结合指示表位阻断(竞争剂或配体阻断)。
使用四种非竞争抗体(“分组抗体”1、2、3和4)，通过SPR鉴别B7-H4胞外结构域的四个不同部分。接着，针对与这四种分组抗体竞争结合至B7-H4胞外结构域来评估在此实验期间产生的所有抗体。如果B7-H4抗体与这四种分组抗体之一(例如分组抗体1)竞争，则确定该B7-H4抗体是在该组(例如组1)中。如果B7-H4抗体与这四种分组抗体中的两种(例如分组抗体2和3)竞争，则确定该B7-H4抗体是在该两个组中(例如组2/3)。
IgG抗体属于至少四个结合组，其中>90％的抗体以在>0.1nm与<100nM之间范围内的亲和力反应结合至人类/食蟹猕猴或小鼠B7-H4。在重组蛋白结合物中，也有约75％结合至细胞上的B7-H4。
细胞结合分析
用洗涤缓冲液洗涤过度表达抗原的100,000个细胞并在室温下与100μl的100nMIgG一起培育5分钟。接着，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并在冰上与100μl的1:100抗人类IgGPE一起培育15分钟。接着，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次，并在FACS Canto II分析仪(BDBiosciences)上进行分析。
PSR结合分析
如先前所述(参见Xu Y等人(2013)Addressing polyspecificity of antibodiesselected from an in vitro yeast presentation system:AFACS-based,high-throughput selection and analytical tool.Protein Eng Des Sel26(10):663–670)进行PSR分析。简单点说，由CHO细胞制备可溶性膜蛋白。使用NHS-LCBiotin(Pierce,ThermoFisher)使富集的膜部分生物素化。将这一多特异性试剂与IgG展示酵母一起培育，随后洗涤。接着，将二次标记混合物(Extravidin-R-PE、抗人类LC-FITC和碘丙锭)添加至混合物中。使用HTS样品注射器，在FACSCanto II分析仪(BD Biosciences)上分析样品。分析流式细胞术数据在R-PE信道中的平均荧光强度(MFI)以评估非特异性结合。基于展现低、中和高PSR MFI值的三种参考抗体，在0至1内使MFI值归一化。
动态扫描荧光测定法
将10μL 20x Sypro Orange添加至20μL的0.2-1mg/mL mAb或Fab溶液中。使用RT-PCR仪器(BioRad CFX96 RT PCR)使样品板温度以0.5℃增量自40℃匀变至95℃，其中在每种温度平衡2分钟。使用原始数据的一阶负导数提取Tm。
AC-SINS
AC-SINS是如先前所述(参见Liu Y等人(2014)High-throughput screening fordevelopability during early-stage antibody discovery using self-interactionnanoparticle spectroscopy.MAbs6(2):483–492)执行。简单点说，用80％捕捉抗人类山羊IgG Fc(Jackson ImmunoResearch)和20％多克隆山羊非特异性抗体(JacksonImmunoResearch)涂布金纳米粒子(Ted Pella Inc.)。接着，将所关注抗体与所述粒子一起培育2小时，并使用Molecular Devices SpectraMax M2，用SoftMax Pro6软件测量波长位移。自相互作用克隆显示距PBS样品较远的波长位移。
实例3：针对B7-H4的人类单克隆抗体的结构表征
B7-H4抗体是人类IgG1/κ同型。可变重链(VH)区包含来自生殖系基因VH1、VH3和VH4的等位基因，并且可变轻链(VL)区包含来自含Vk1和Vk3的生殖系基因的等位基因。一些抗体亚群在VH和VL的对应CDR区内共有高一致性，该一致性可以在72-100％范围内。共有相同生殖系等位基因的抗体在其VH和VL构架(FR)区内具有高一致性，该一致性在88-100％范围内。B7-H4抗体的序列提供于表1-10中。
实例4：单克隆抗体与B7-H4蛋白质的结合的表征
通过生物膜层干涉法(BLI)测定抗B7-H4抗体与B7-H4细胞外结构域(ECD)的结合亲和力。以上实例2中已较为详细地描述ForteBio亲和分析。简单点说，将重组人类B7-H4-huIgG1(SEQ ID NO:409)蛋白质固定于蛋白质A尖端，随后添加同型对照hIgG1以便使捕捉尖端上任何残留的结合位点饱和。接着，评价抗B7-H4抗体的结合。此外，也使用相同方案，评估抗体与食蟹猕猴B7-H4(SEQ ID NO:2)和小鼠B7-H4(SEQ ID NO:3)的结合。结果概述于表12中。
B7-H4-huIgG1：
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:409)
表12：通过生物膜层干涉法测定的B7-H4抗体与细胞外结构域的结合
此外，通过表面等离子体共振(SPR)测定所选抗B7-H4抗体与人类B7-H4 N末端结构域(B7-H4 IgV-huIgG1；SEQ ID NO:410)的结合亲和力。简单点说，将抗人类Fab抗体固定于羧基衍生化的SPR芯片表面上，并将抗B7-H4抗体以5μg/ml捕捉于所得表面上，保持30秒。接着，使各种浓度(0nM、3.7nM、11.1nM、33.3nM、100nM和300nM)的B7-H4 IgV-huIgG1流过所述表面并使其在缔合期间结合至抗B7-H4抗体，随后在解离期间用缓冲液洗涤。使用1:1结合模型拟合数据，且结果概述于表13中。
B7-H4 IgV-huIgG1：
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:410)
表13：通过表面等离子体共振测定的B7-H4抗体与N末端结构域的结合
因此，多项分析证实，所述抗体结合至B7-H4。
实例5：表位定位
通过生物膜层干涉法(BLI)测定抗B7-H4抗体结合组。以上实例2中已较为详细地描述表位定位分析。简单点说，将第一抗B7-H4抗体捕捉于蛋白质A尖端，随后添加对照huIgG1抗体使尖端上的额外结合位点饱和。接下来，使传感器尖端暴露于抗原(B7-H4-huIgG1)(SEQ ID NO:409)，随后添加第二抗B7-H4抗体，接着评价其结合。通过与使用非B7-H4抗体作为第一抗体之后的结合相比较来确定表位组。结果概述于表12中。
实例6：单克隆抗体与细胞表面上表达的B7-H4的结合的表征
转染HEK293T细胞系以使其表达全长人类、食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4。此外，使用表达内源性人类B7-H4的SK-BR-3乳癌细胞评估所述抗体结合细胞表面上表达的B7-H4的能力。将1×105个亲本HEK293T细胞系或被转染的HEK293T细胞系与100nM B7-H4抗体一起培育。培育后，使细胞聚结成团，洗涤，并与二次标记抗体一起培育，并将样品采集于流式细胞仪上。计算相对于亲本细胞系的倍数结合(FOP)如下：MFI被转染的HKE293T细胞/MFI亲本HEK293T细胞。FOP值大于10被视为展示特异性结合。
为了评估B7-H4抗体的细胞结合效力，将1×105个SK-BR-3细胞或被转染以表达食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4的293细胞与滴定剂量的B7-H4抗体一起培育。培育后，使细胞聚结成团，洗涤，并与二次标记抗体一起培育，并将样品采集于流式细胞仪上。使用FlowJo软件分析数据并将MFI相对于抗体浓度作图。使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50细胞结合效力。
所有B7-H4抗体均展示结合至表达人类B7-H4、食蟹猕猴B7-H4或小鼠B7-H4的HEK293T细胞。抗体还展示与在细胞表面上内源性表达人类B7-H4的SK-BR-3细胞或被转染以在细胞表面上表达食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4的HEK293T细胞的有效剂量依赖性结合。这些数据展示，大部分B7-H4抗体与食蟹猕猴、小鼠和大鼠B7-H4完全交叉反应(图2A和2B，表14)。
表14：B7-H4抗体与细胞表面B7-H4的结合
实例7：单克隆抗体T细胞检查点阻断活性的表征
为了表征B7-H4抗体的T细胞检查点阻断活性，使用EasySepTM人T细胞富集试剂盒，根据制造商的说明书，从外周血单核细胞(PBMC)富集原代人类T细胞。在37℃下，将富集的T细胞以2×105个细胞/毫升与抗CD3/抗CD28 Dynabeads以每个细胞一个珠粒的比率一起培育。六天后，用磁力移除珠粒，并洗涤T细胞，并且在37℃下，将其以1×106个细胞/毫升与10U/mL IL-2一起培育。四天后，洗涤T细胞并在37℃下，将其以1×106个细胞/毫升与2×106个细胞/毫升的人工抗原呈递细胞(aAPC)一起在10μg/mL抗体或滴定剂量的抗体存在下培育。aAPC是被转染以在细胞表面上共表达抗人类CD3克隆OKT3的scFv形式和全长人类B7-H4的HEK293T细胞系。aAPC在37℃下用丝裂霉素C处理一小时且接着充分洗涤，随后添加至T细胞共培养物中。共培养T细胞、aAPC和B7-H4抗体之后72小时，对培养盘离心，收集上清液并通过ELISA评估IFNγ产量，并收集细胞，并且染色以通过FACS评估增殖情况(确切地说，各孔中的细胞与针对CD4和CD8的抗体一起培育)。接着，洗涤细胞，固定，透性化，并根据制造商的说明书，将其与Edu-Click试剂一起培育。洗涤细胞，并使用流式细胞术测量增殖的CD4+T细胞、CD8+T细胞或总T细胞的数量。使用FlowJo软件分析数据。对于仅用单一浓度抗体处理的样品，数据以相对于对照-huIgG处理的样品的倍数增加计算并报导。对于用剂量滴定的抗体处理的样品，将IFNγ产量相对于抗体浓度作图，并使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50效力。
如由IFNγ产量和/或CD4+T细胞、CD8+T细胞或总T细胞增殖增加所测量，所有组2/3及组3抗体可再现地引起T细胞检查点阻断活性。图3A显示，抗体15441使T细胞增殖增加至少3％并使CD4+及CD8+T细胞增殖增加至少2％。图3A还显示，抗体15461使T细胞增殖增加至少21％，使CD4+T细胞增殖增加至少9％，并使CD8+T细胞增殖增加至少11％。图3B-3D显示其它剂量依赖性T细胞检查点阻断活性。
表15：B7-H4抗体-T细胞检查点阻断活性
表16：B7-H4抗体与细胞表面B7-H4的结合
实例8：无岩藻糖基化和岩藻糖基化单克隆抗体的产生
相较于完全岩藻糖基化的抗体，含在聚糖部分中岩藻糖含量较低的Fc区的抗体可以展现较高的ADCC活性(Niwa R等人,Clinical Cancer Research11(6):2327-36(2005))。在产生正常岩藻糖基化的抗体的CHO-x细胞(Yamane-Ohnuki N等人,Biotechnology andBioengineering87(5):614-22(2004))中以及在工程改造成产生无岩藻糖基化抗体的CHO细胞系(CHO-y细胞)(同上)中产生B7-H4抗体。
实例9：无岩藻糖基化和岩藻糖基化单克隆抗体的结合的表征
遵循实例4中所描述的方案，通过SPR表征岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗B7-H4抗体。这些抗体显示类似的与人类B7-H4蛋白质的结合，并因此，糖基化对结合无影响(表17)。
表17：无岩藻糖基化和岩藻糖基化抗体的结合
也通过流式细胞术表征岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗B7-H4抗体。在这些实验中，转染HEK293T细胞系以使其表达全长人类、食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4。此外，使用表达内源性人类B7-H4的SK-BR-3乳癌细胞系评估B7-H4抗体的细胞结合效力。将1×105个SK-BR-3细胞或被转染以表达全长人类、食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4的293细胞与滴定剂量的B7-H4抗体一起培育。培育后，使细胞聚结成团，洗涤，与二次标记抗体一起培育，并在流式细胞仪上操作。使用FlowJo软件分析数据。将MFI相对于抗体浓度作图，并使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50细胞结合效力。
B7-H4抗体展示与在细胞表面上内源性表达B7-H4的SK-BR-3细胞或被转染以在细胞表面上表达食蟹猕猴、小鼠或大鼠B7-H4的293细胞系的有效剂量依赖性结合。无论抗体是岩藻糖基化的还是无岩藻糖基化的，都不会影响结合效力和物种交叉反应性(图4A-4D和表17)。
实例10：无岩藻糖基化和岩藻糖基化单克隆抗体与人类Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)V158等位基因的结合
产生呈岩藻糖基化形式(Ab-F)和无岩藻糖基化形式(Ab-A)的抗体20502并通过表面等离子体共振(SPR)测试Fc区与FcgRIIIa(V158)的结合亲和力。简单点说，使用胺偶合试剂盒，用含100mM乙二胺的100mM硼酸钠缓冲液pH 8.0作为阻断试剂，将蛋白质A共价附接至葡聚糖芯片。将Ab-A或Ab-F以2种密度捕捉于独立流槽上，并将蛋白质A衍生化的流槽用作参考对照。在HBS-P+操作缓冲液中稀释FcγRIIIA(V158)，并一式两份，以6种浓度(0nM、1.37nM、12.3nM、37nM、111nM、333nM和1000nM)注射。使用Biacore T200评价软件1:1结合模型计算有关Ab-A结合的缔合常数、解离常数和亲和力。使用Biacore T200评价软件稳态亲和力模型测定有关Ab-A和Ab-F结合的亲和力常数。无岩藻糖基化B7-H4抗体(Ab-A)对Fcγ受体IIIA(V158)的亲和力比带有岩藻糖基化Fc的相同抗体(Ab-F)高140倍(图5A和5B，表18)。
表18：Fcγ受体IIIa(FcγRIIIa)V158等位基因结合
| ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(nM) | |
| Ab-A | 6.46E+05 | 9.54E-10 | 15 |
| Ab-F | N/A | N/A | 210 |
实例11：无岩藻糖基化和岩藻糖基化单克隆抗体的T细胞检查点阻断活性
使用EasySepTM人类T细胞富集试剂盒，根据制造商的说明书，从PBMC富集原代人类T细胞。在37℃下，将富集的T细胞以2×105个细胞/毫升与抗CD3/抗CD28 Dynabeads以每个细胞一个珠粒的比率一起培育。六天后，用磁力移除珠粒，并洗涤T细胞，并在37℃下，将其以1×106个细胞/毫升与10U/mL IL-2一起培育。四天后，洗涤T细胞并在37℃下，将其以1×106个细胞/毫升与2×106个细胞/毫升浓度的人工抗原呈递细胞(aAPC)一起在滴定剂量的B7-H4抗体存在下培育。aAPC在37℃下用丝裂霉素C处理一小时，接着充分洗涤，随后添加至T细胞共培养物中。共培养T细胞、aAPC和B7-H4抗体之后72小时，对培养盘离心并收集上清液，并且通过ELISA评估IFNγ产量。将IFNγ产量相对于抗体浓度作图，并使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50效力。
如通过IFNγ产量增加所测量，B7-H4抗体展示有效的T细胞检查点阻断活性。此外，无岩藻糖基化抗体与岩藻糖基化抗体之间的效力无明显差异(图6A和表19)。
表19：T细胞检查点阻断效力
接下来，使用人类全T细胞分离试剂盒(Human Pan T Cell Isolation Kit)，遵循制造商的说明书，自HLA-A2+供体PBMC富集原代人类T细胞。通过先用1.5×107个抗CD3/抗CD28 Dynabead、100ng/mL IL-2和15ng/mL IL-7活化5×106个富集的全T细胞48小时，产生表达MART-I TCR的T细胞。接着，在200ng/mL IL-2、30ng/mL IL-7和10μg/mL聚凝胺存在下，用MART-I TCR慢病毒粒子转导5×106个活化的T细胞。转导后24小时，在33.3ng/mL IL-2和5ng/mL IL-7存在下，使MART-I TCR+全T细胞扩增15天时间。为了产生表达HLA-A2的靶细胞系，用HLA-A2慢病毒粒子转导表达内源性B7-H4的人类乳癌细胞系MDA-MB-468和SK-BR-3，保持48小时。此外，将B7-H4从HLA-A2+SK-BR-3细胞系敲除。MART-I TCR+全T细胞在1:1E:T比率的各种靶细胞、500μg/mL MART-I肽和67nM B7-H4抗体20502(无岩藻糖基化)或人类同型对照存在下共培养。共培育后24小时，对培养盘离心并收集上清液，并且通过AlphaLisa，根据制造商的说明书，评估IL-2产生。
如图6B中所示，当以生理量内源性表达时，由于相对于SK-BR-3KO细胞，IL-2产量在含有SK-BR-3B7-H4+细胞的孔中较少，故B7-H4在本分析中展示T细胞检查点配体活性。此外，如通过IL-2产量相对于同型对照处理的细胞有所增加所测量，B7-H4抗体也展示T细胞检查点阻断活性(图6B)。因此，这一数据证实B7-H4抗体20502(无岩藻糖基化)的T细胞检查点阻断活性，并显示B7-H4抗体20502在内源性表达B7-H4的细胞中提供T细胞检查点阻断活性。
实例12：无岩藻糖基化和岩藻糖基化单克隆抗体ADCC活性
评估B7-H4抗体针对表达B7-H4的靶细胞系的ADCC活性。确切地说，在37℃下，用200IU/mL IL-2对1×106个细胞/毫升的原代人类PBMC细胞进行细胞因子活化。次日，洗涤细胞并以40:1的效应细胞:靶比率与标记Calcein-AM的SK-BR-3靶细胞一起培育。培育之后4小时，使用荧光计定量靶细胞溶解。Triton/X处理的样品用作最大溶解对照样品，而仅培养基处理的样品用作背景溶解对照样品。比溶解率的百分比(％)计算如下：[1-((样品–培养基对照)/(最大溶解–培养基对照))]×100。将比溶解率的百分比(％)相对于抗体浓度作图，并使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50效力。
B7-H4抗体针对表达内源性B7-H4的乳房细胞系SK-BR-3展示有效的剂量依赖性ADCC活性。此外，相较于岩藻糖基化抗体，无岩藻糖基化抗体展示明显更有效的ADCC活性(图7和表20)。
表20：ADCC活性
实例13：ADCC活性与受体密度的相关性
根据制造商的说明，通过FACS定量在SK-BR-3、HCC1569、ZR-75-1、MDA-MB-48和HCC1964细胞的表面上的B7-H4密度。确切地说，在冰上将1×105个细胞与15μg/mL B7-H4抗体一起培育25分钟。并行地，还将一滴QuantumTM Simply Cellular(QSC)微球(预先涂布递增浓度的抗小鼠IgG捕捉抗体)与15μg/mL B7-H4抗体一起在冰上培育25分钟。培育之后，使细胞和QSC微球聚结成团并洗涤，并将样品采集于流式细胞仪上。使用FlowJo软件分析数据。计算平均荧光强度(MFI)并输入试算表中。自动地计算将各珠粒的荧光通道值与其预先指定的抗体结合能力(ABC)值相关联的回归。还在将被标记细胞的MFI值也添加至模板中后，指定ABC值。
评估B7-H4抗体针对具有不同B7-H4细胞表面密度值的表达B7-H4的靶细胞系的ADCC活性。确切地说，在4℃下，将1×104个SK-BR-3、HCC1569、ZR-75-1、MDA-MB-468或HCC1964靶细胞与剂量滴定的B7-H4抗体共培育。25分钟后，将来自Promega的含Jurkat-huCD16报告细胞的一次性小瓶解冻，并将7.5×104个细胞添加至靶细胞/B7-H4抗体混合物中，并在37℃下培育。24小时后，使样品达到室温(RT)并与Bio-Glo缓冲液一起培育。在EnVision多标记读取器上定量底物和发光度。数据是以发光度相对于抗体浓度作图，并使用非线性回归曲线拟合(GraphPad Prism)计算EC50效力。
B7-H4抗体ADCC活性取决于B7-H4细胞表面密度：当细胞表面分子的数量减少时，最大ADCC活性的量也减小。此外，无岩藻糖基化抗体相较于岩藻糖基化抗体展示出改良的ADCC活性，尤其是针对B7-H4细胞表面密度较低的靶细胞(图8)。
实例14：体内抗肿瘤功效
自Charles River Laboratories(Hollister,CA)购得七周龄的雌性BALB/c小鼠并在开始研究之前，使其适应环境长达三周。将鼠类结肠直肠癌细胞系CT26工程改造成表达由鼠类B7-H4细胞外结构域与鼠类B7H3跨膜结构域组成的嵌合蛋白。将这些肿瘤细胞以每只小鼠1.0×106个细胞/200μl经皮下植入小鼠的右侧腹。接种之前，将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养不超过三代。在37℃下，使细胞在含5％ CO2的潮湿氛围中生长。达到80-85％汇合后，收集细胞并使其以5×106个细胞/毫升再悬浮于无血清RPMI 1640与基质胶的1:1混合物中。
在细胞植入后，每周两次监测小鼠的肿瘤生长情况。对于肿瘤测量，使用测径器测量各肿瘤的长度和宽度，并根据下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝(宽度(mm)×长度(mm2))/2。治疗开始当天，测量所有肿瘤，排除不符合要求的肿瘤，并将小鼠随机分入各治疗组。对于抗B7-H4治疗，所用抗体包括20502(图9A)和22213(图9B)。作为对照，向小鼠施用多克隆人类IgG(Bio X Cell,BE0092)或小鼠IgG2a(Bio X Cell,BE0085)。自接种后第4天或第5天开始，每周两次经由静脉内(i.v.)注射施用抗体四次。
继续每周至少两次测量肿瘤，直至肿瘤体积超过动物体重的10％，或达到约2000mm3。通过将个别肿瘤相对于动物接种CT26细胞的天数作图，显示肿瘤尺寸的变化。使用不成对、双尾t检验分析，计算在研究每一天所计算的肿瘤体积的P值。当以10-20mg/kg之间的剂量施用时，相较于人类IgG对照，用20502或22213治疗使肿瘤生长明显减慢(p<0.05)(图9A和9B)。
使用植入4T1细胞(鼠类乳癌细胞系)或B16(鼠类黑素瘤细胞系)的小鼠执行类似实验。这些小鼠用20mg/kg称为20502-msIgG2a-F的20502的小鼠代用品治疗，该代用品含有20502可变区与岩藻糖基化小鼠IgG2a的融合物；或用鼠类IgG对照抗体治疗。在4T1乳癌和B16黑素瘤模型中，20502-msIgG2a-F治疗使肿瘤生长相较于鼠类IgG对照明显减慢(图10)。
另外，在MX-1人类乳癌异种移植模型中，使用无岩藻糖基化20502执行额外实验。自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)购得雌性NSG(NOD-scid,IL2Rγnull)小鼠并在研究开始之前，使其适应环境一周。先前已显示，人类乳癌细胞系MX-1内源性表达细胞表面B7H4蛋白。将含5×106个细胞/毫升这些肿瘤细胞的无血清RPMI 1640与基质胶的1:1混合物以每只小鼠1.0×106个细胞/100μl皮下植入小鼠的右侧腹中。
在细胞植入后，每周两次监测小鼠的肿瘤生长情况。对于肿瘤测量，使用测径器测量各肿瘤的长度和宽度，并根据下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝(宽度(mm)×长度(mm)2)/2。接种后第7天，测量所有肿瘤，排除不符合要求的肿瘤，并将小鼠随机分入各治疗组。所有动物均施用DNA构建体，用以诱导在循环中组成性表达人类IL-15以进行后续研究。第9天，一半小鼠接受静脉内(i.v.)注射20×106个自StemCell Technologies(Tukwila,WA)获得的人类外周血单核细胞(PBMC)。自第11天开始，向小鼠施用无岩藻糖基化20502(20mg/kg)或作为阴性对照的生理盐水。一周两次通过静脉内(i.v.)注射施用治疗剂四次。
继续每周至少两次测量肿瘤，直至肿瘤体积超过动物体重的10％或直至动物展示15％或更高百分比的初始体重减轻。在第28天，使用单因素方差分析计算P值，以比较所有治疗组的平均肿瘤体积。如图11中所示，当对预先注射人类PBMC的小鼠施用时，无岩藻糖基化20502治疗使肿瘤生长相较于生理盐水对照明显减慢(p<0.05)。
实例15：与抗PD-1抗体组合的体外抗肿瘤功效
方法
自Charles River Laboratories(Hollister,CA)购得八周龄的雌性BALB/c小鼠并在开始研究之前，使其适应环境长达两周。将鼠类乳癌细胞系4T1工程改造成表达含有鼠类B7-H4细胞外结构域与鼠类B7H3跨膜结构域的嵌合蛋白。将肿瘤细胞以每只小鼠0.5×105个细胞/50μl原位植入小鼠乳腺脂肪垫中。接种之前，将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中培养不超过三代。在37℃下，使细胞在含5％ CO2的潮湿氛围中生长。达到80-85％汇合后，收集细胞并使其再悬浮于无血清RPMI 1640中，且经各小鼠的侧腹部植入乳腺脂肪垫中。
在细胞植入后，每周两次监测小鼠的肿瘤生长情况。使用测径器测量各肿瘤的长度和宽度，并根据下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝(宽度(mm)×长度(mm)2)/2。治疗开始当天，测量所有肿瘤，排除不符合要求的肿瘤，并将小鼠随机分入各治疗组。对于抗B7-H4治疗，利用20502的小鼠代用品，称为20502-msIgG2a-F，该代用品含有20502可变区与岩藻糖基化小鼠IgG2a的融合物。作为对照，向小鼠施用msIgG2a(抗HEL)。自接种后第11天开始，每周两次通过静脉内(i.v.)注射施用20502-msIgG2a-F或msIgG2a四次。自接种后第11天开始，每周两次通过腹膜内(i.p.)注射施用抗PD-1(含有Fc沉默msIgG2a结构域的改良型RMP1-14(Bio X Cell))三次。继续每周至少两次测量肿瘤，直至肿瘤体积超过动物体重的10％，或达到约2000mm3。
结果
肿瘤尺寸的变化、平均肿瘤体积的变化和存活率百分比分别显示于图12A、12B和12C中。用20502-msIgG2a-F或抗PD-1治疗使肿瘤生长相较于msIgG2a对照明显减慢(p<0.05)。相较于任一单药疗法，共施用20502-msIgG2a-F和抗PD-1显著增强肿瘤生长抑制作用(p<0.05)。此外，组合疗法在12只小鼠中的5只中引起完全肿瘤消退。使用单因素方差分析，计算在研究每一天计算的肿瘤体积的P值和各组之间的多重比较。
实例16：抗B7-H4抗体增加NK细胞和T细胞浸润并上调PD-L1自Charles RiverLaboratories(Hollister,CA)购得八周龄的雌性BALB/c小鼠并将4T1+moB7-H4/H3细胞以每只小鼠0.5×105个细胞/50μl原位植入小鼠的乳腺脂肪垫中。治疗开始当天，测量所有肿瘤，排除不符合要求的肿瘤，并将小鼠随机分入各治疗组。通过静脉内(i.v.)注射向小鼠施用20mg/kg huIgG1(抗HEL)或无岩藻糖基化20502两次(接种后第11天和第14天)。
施用第二剂后24小时，对小鼠实施安乐死并灌注磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。接着，提取肿瘤，在10％福尔马林中固定五小时，在PBS中冲洗并放入30％蔗糖溶液中，保持至少24小时。将肿瘤包埋于Tissue-O.C.T.Compound中并在-15℃腔室(低温恒温器)中切成20μm切片。在含0.3％ Triton的PBS中冲洗载有组织的载片，用5％正常山羊血清阻断，并用一次抗体(抗NKp46、抗CD3或抗PD-L1；1:500)染色过夜。对来自每个肿瘤的两个连续切片染色。
培育过夜后，在0.3％ Triton中冲洗切片，接着在黑暗潮湿腔室中与二次抗体(1:400)一起培育三小时，并冲洗。接着，将组织固定于1％三聚甲醛中并在PBS中冲洗。使用和DAPI对盖片封片，用CytosealTM密封，并使其在黑暗腔室中干燥。用荧光显微镜和照相机手动获取图像。如图13中所示，无岩藻糖基化20502治疗使自然杀手(NK)细胞增加(如通过抗NKp46抗体测量)并使肿瘤边缘处CD3+T细胞增加，且肿瘤核心中CD3+T细胞有适度增加。也观察到PD-L1表达增加。
实例17：抗B7-H4抗体在4T1-和B16-moB7-H4/H3模型中以剂量依赖性方式显著减少体内肿瘤生长
自Charles River Laboratories(Hollister,CA)购得六至八周龄的雌性BALB/c或C57Bl/6小鼠并在开始研究之前，使其适应环境长达三周。将鼠类乳癌细胞系4T1和黑素瘤细胞系B16-F10工程改造成使鼠类表达由鼠类B7-H4细胞外结构域与鼠类B7-H3跨膜结构域组成的嵌合蛋白。对于4T1+moB7-H4/H3，这些肿瘤细胞是以每只小鼠0.05×106个细胞/50μl原位植入乳腺脂肪垫中，或对于B16+moB7-H4/H3，以每只小鼠0.5×106个细胞/100μl皮下植入小鼠的右侧腹中。接种之前，将细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640或DMEM培养基中培养不超过三代。在37℃下，使细胞在含5％ CO2的潮湿氛围中生长。
在细胞植入后，每周两次监测小鼠的肿瘤生长情况。对于肿瘤测量，使用测径器测量各肿瘤的长度和宽度并根据下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝(宽度(mm)×长度(mm)2)/2。治疗开始当天，测量所有肿瘤，排除不符合要求的肿瘤，并将小鼠随机分入各治疗组。自接种后第11天(4T1+moB7-H4/H3)或第6天(B16+moB7-H4/H3)开始，每周两次通过静脉内(i.v.)注射对小鼠施用20502-msIgG2a-F抗体(抗B7-H4，msIgG2a，岩藻糖基化(又称为“cmFPA150-F”)或小鼠IgG2a对照抗体四次，但20mg/kg组除外，该组每周两次连续施用直至研究结束。
继续每周至少两次测量肿瘤，直至肿瘤体积超过动物体重的10％，或达到约2000mm3。通过将平均肿瘤体积相对于动物接种的天数作图，显示肿瘤尺寸的变化。在4T1+moB7-H4/H3模型中以1mg/kg或更高剂量施用时(参看图14A和14B)以及在B16+moB7-H4/H3模型中以3mg/kg或更高剂量施用时(图15A和15B)，20502-msIgG2a-F治疗使肿瘤生长相较于小鼠IgG2a对照明显减慢(p<0.05)。使用单因素方差分析比较所有治疗组与msIgG2a，计算统计显著性。
图14A和14B显示，20502-msIgG2a-F抗体明显减慢表达B7-H4/H3的4T1生长。对BALB/c小鼠原位接种工程改造成表达鼠类B7-H4 ECD与B7-H3 TM的融合物的4T1乳癌细胞。自接种后第11天开始，每周两次向小鼠施用20502-msIgG2a-F抗体(抗B7-H4，msIgG2a，岩藻糖基化)。如在第30天通过单因素方差分析所评估，20502-msIgG2a-F抗体在30mg/kg(p＝0.0003)、20mg/kg(p＝0.0103)、10mg/kg(p＝0.0419)、3mg/kg(p＝0.0277)和1mg/kg(p＝0.0333)下展示肿瘤生长的剂量依赖性减慢，以及显著肿瘤生长抑制作用。
图15A和15B显示，20502-msIgG2a-F抗体明显减慢表达B7-H4/H3的B16生长。对C57Bl/6小鼠皮下接种工程改造成表达鼠类B7-H4 ECD与B7-H3 TM的融合物的B16-F10黑素瘤细胞。自接种后第6天开始，每周两次向小鼠施用20502-msIgG2a-F抗体(抗B7-H4，msIgG2a，岩藻糖基化)。如在第23天通过单因素方差分析所评估，20502-msIgG2a-F抗体在30mg/kg(p＝0.0085)、20mg/kg(p＝0.0041)、10mg/kg(p＝0.0017)和3mg/kg(p＝0.0420)下展示肿瘤生长的剂量依赖性减慢(图15A)，以及显著肿瘤生长抑制作用(图15B)。
因此，在两个不同的癌症模型中，20502-msIgG2a-F抗体均以剂量依赖性方式明显减小肿瘤尺寸。在乳癌和黑素瘤细胞系中的这一数据指示，20502-msIgG2a-F抗体可以用于治疗癌症患者。
序列表
GITR抗体序列
CD80序列
CSFR1序列
PD-1(纳武单抗)抗体序列
***
本发明的范围不受本文所述具体实施例限制。事实上，本领域技术人员自前述说明将对除所描述的修改外的本发明的各种修改显而易见。这些修改意图在所附权利要求书的范围内。
本文引用的所有参考文献(例如出版物或者专利或专利申请)均以全文引用的方式并入本文中并用于所有目的，其引用程度就如同具体地且个别地指示每一个别参考文献(例如出版物或者专利或专利申请)以全文引用的方式并入本文中用于所有目的一般。
其它实施例在权利要求书的范围内。
本发明还包括以下示例性实施方案：
1.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VHCDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2及CDR3序列：
(a)对应地，SEQ ID NO:458-463；
(b)对应地，SEQ ID NO:5-10；
(c)对应地，SEQ ID NO:15-20；
(d)对应地，SEQ ID NO:25-30；
(e)对应地，SEQ ID NO:35-40；
(f)对应地，SEQ ID NO:45-50；
(g)对应地，SEQ ID NO:55-60；
(h)对应地，SEQ ID NO:65-70；
(i)对应地，SEQ ID NO:75-80；
(j)对应地，SEQ ID NO:85-90；
(k)对应地，SEQ ID NO:95-100；
(l)对应地，SEQ ID NO:105-110；
(m)对应地，SEQ ID NO:115-120；
(n)对应地，SEQ ID NO:125-130；
(o)对应地，SEQ ID NO:135-140；
(p)对应地，SEQ ID NO:145-150；
(q)对应地，SEQ ID NO:155-160；
(r)对应地，SEQ ID NO:165-170；
(s)对应地，SEQ ID NO:175-180；
(t)对应地，SEQ ID NO:185-190；以及
(u)对应地，SEQ ID NO:195-200。
2.根据实施方案1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列的VH。
3.根据实施方案1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列的VL。
4.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列。
5.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列。
6.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括含以下氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区：
(a)对应地，SEQ ID NO:464和42；
(b)对应地，SEQ ID NO:11和12；
(c)对应地，SEQ ID NO:21和22；
(d)对应地，SEQ ID NO:31和32；
(e)对应地，SEQ ID NO:41和42；
(f)对应地，SEQ ID NO:51和52；
(g)对应地，SEQ ID NO:61和62；
(h)对应地，SEQ ID NO:71和72；
(i)对应地，SEQ ID NO:81和82；
(j)对应地，SEQ ID NO:91和92；
(k)对应地，SEQ ID NO:101和102；
(l)对应地，SEQ ID NO:111和112；
(m)对应地，SEQ ID NO:121和122；
(n)对应地，SEQ ID NO:131和132；
(o)对应地，SEQ ID NO:141和142；
(p)对应地，SEQ ID NO:151和152；
(q)对应地，SEQ ID NO:161和162；
(r)对应地，SEQ ID NO:171和172；
(s)对应地，SEQ ID NO:181和182；
(t)对应地，SEQ ID NO:191和192；或
(u)对应地，SEQ ID NO:201和202。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区。
8.根据实施方案7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区选自由人类免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2重链恒定区组成的组。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含轻链恒定区。
10.根据实施方案9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区选自由人类免疫球蛋白IgGκ和IgGλ轻链恒定区组成的组。
11.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区和轻链恒定区，其中所述重链恒定区是人类IgG1重链恒定区，并且其中所述轻链恒定区是人类IgGκ轻链恒定区。
12.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:13、23、33、43、469、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193或203的氨基酸序列的重链。
13.根据实施方案1至6或12中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194或204的氨基酸序列的轻链。
14.根据实施方案1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含以下氨基酸序列的重链和轻链：
(a)对应地，SEQ ID NO:469和44；
(b)对应地，SEQ ID NO:13和14；
(c)对应地，SEQ ID NO:23和24；
(d)对应地，SEQ ID NO:33和34；
(e)对应地，SEQ ID NO:43和44；
(f)对应地，SEQ ID NO:53和54；
(g)对应地，SEQ ID NO:63和64；
(h)对应地，SEQ ID NO:73和74；
(i)对应地，SEQ ID NO:83和84；
(j)对应地，SEQ ID NO:93和94；
(k)对应地，SEQ ID NO:103和104；
(l)对应地，SEQ ID NO:113和114；
(m)对应地，SEQ ID NO:123和124；
(n)对应地，SEQ ID NO:133和134；
(o)对应地，SEQ ID NO:143和144；
(p)对应地，SEQ ID NO:153和154；
(q)对应地，SEQ ID NO:163和164；
(r)对应地，SEQ ID NO:173和174；
(s)对应地，SEQ ID NO:183和184；
(t)对应地，SEQ ID NO:193和194；或
(u)对应地，SEQ ID NO:203和204。
15.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2以及VL CDR3：15461、20500、20501、20502、20502.1、22208、15462、22213、15465、20506、15483、20513、22216、15489、20516、15472、15503、15495、15478、15441和20496。
16.根据实施方案15所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR是Kabat定义的CDR、Chothia定义的CDR或AbM定义的CDR。
17.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含20502.1的Chothia定义或AbM定义的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2以及VL CDR3。
18.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ ID NO:458-463的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。
19.根据实施方案18所述的抗体或其抗原结合片段，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链以及含SEQID NO:44的氨基酸序列的轻链。
20.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。
21.根据实施方案20所述的抗体或其抗原结合片段，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链以及含SEQ IDNO:44的氨基酸序列的轻链。
22.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含对应地SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列。
23.根据实施方案22所述的抗体或其抗原结合片段，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)其中所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
24.一种与根据实施方案1至23中任一项所述的抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4的相同表位的分离的抗体或其抗原结合片段。
25.根据实施方案1至24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是人类抗体或其抗原结合片段。
26.根据实施方案1、15至20、22或24中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是鼠类、人源化或嵌合抗体或其抗原结合片段。
27.根据实施方案1至26中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导T细胞增殖。
28.根据实施方案27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段使T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少21％。
29.根据实施方案27所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段使T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约35％。
30.根据实施方案1至29中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导CD4+T细胞增殖。
31.根据实施方案30所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段使CD4+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少9％。
32.根据实施方案30所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段使CD4+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约15％。
33.根据实施方案1至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导CD8+T细胞增殖。
34.根据实施方案33所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段使CD8+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加至少11％。
35.根据实施方案34所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段使CD8+T细胞增殖相较于用对照抗体处理增加约5％至约15％。
36.根据实施方案1至35中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导干扰素-γ(IFNγ)产生。
37.根据实施方案36所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够使IFNγ产量增加至少2倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、约2倍至约10倍，或约3倍至约10倍。
38.根据实施方案1至37中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段能够在表达B7-H4的细胞中诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
39.根据实施方案38所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段诱导至少20％、至少30％、至少40％、约20％至约50％，或约30％至约50％的表达B7-H4的细胞特异性溶解。
40.根据实施方案1至39中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段在鼠类CT26结肠直肠癌模型、鼠类乳癌4T1模型或黑素瘤细胞系B16-moB7-H4/H3模型中抑制肿瘤生长。
41.根据实施方案40所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段使肿瘤生长相较于用对照抗体处理减少至少25％、至少30％、至少40％、至少45％或至少50％。
42.根据实施方案27至41中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞增殖的诱导、所述CD4+T细胞增殖的诱导、所述CD8+T细胞增殖的诱导、所述IFNγ产生的诱导、所述ADCC活性和/或所述肿瘤生长的抑制是剂量依赖性的。
43.根据实施方案1至42中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至食蟹猕猴B7-H4。
44.根据实施方案1至43中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至大鼠B7-H4。
45.根据实施方案1至44中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至小鼠B7-H4。
46.根据实施方案1至45中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段结合至人类B7-H4的IgV结构域。
47.根据实施方案1至46中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
48.根据实施方案1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是全长抗体。
49.根据实施方案1至47中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是抗原结合片段。
50.根据实施方案49所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、内抗体、IgGΔCH2、微型抗体、F(ab')3、四功能抗体、三功能抗体、双功能抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
51.根据实施方案1至50中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段还包含可检测标记。
52.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码根据实施方案1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链的核酸分子。
53.根据实施方案52所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子编码SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的VH，或SEQ ID NO:13、23、33、43、469、53、63、73、83、93、103、113、123、133、143、153、163、173、183、193或203的重链。
54.根据实施方案52所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:213、223、233、243、470、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、383、393或403的序列。
55.根据实施方案52所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子包含(i)SEQ IDNO:213、223、233、243、470、253、263、273、283、293、303、313、323、333、343、353、363、373、383、393或403的序列；以及(ii)SEQ ID NO:408的序列。
56.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码根据实施方案1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子。
57.根据实施方案56所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子编码SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的VL，或SEQ ID NO:14、24、34、44、54、64、74、84、94、104、114、124、134、144、154、164、174、184、194或204的轻链。
58.根据实施方案56所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394或404的序列。
59.根据实施方案56所述的分离的多核苷酸，其中所述核酸分子包含(i)SEQ IDNO:214、224、234、244、254、264、274、284、294、304、314、324、334、344、354、364、374、384、394或404的序列；以及(ii)SEQ ID NO:406的序列。
60.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含编码根据实施方案1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的重链可变区或重链以及根据实施方案1至51中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的轻链可变区或轻链的核酸分子。
61.一种分离的载体，所述分离的载体包含根据实施方案52至60中任一项所述的多核苷酸。
62.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案52至60中任一项所述的多核苷酸、根据实施方案61所述的载体，或包含根据实施方案52至55中任一项所述的多核苷酸的第一载体以及包含根据实施方案56至59中任一项所述的多核苷酸的第二载体。
63.根据实施方案62所述的宿主细胞，所述宿主细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、假单胞菌、杆菌、链球菌、酵母、CHO、YB/20、NS0、PER-C6、HEK-293T、NIH-3T3、HeLa、BHK、Hep G2、SP2/0、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS 7、BSC1、BSC40、BMT10细胞、组织培养物中的植物细胞、昆虫细胞以及人类细胞。
64.根据实施方案62或63所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞缺乏功能性α-1,6-岩藻糖基转移酶基因(FUT8)。
65.一种产生结合至人类B7-H4的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括培养根据实施方案62至64中任一项所述的宿主细胞，由此表达核酸并产生所述抗体或其抗原结合片段。
66.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段特异性结合至人类B7-H4并且由根据实施方案52至60中任一项所述的多核苷酸编码。
67.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的赋形剂。
68.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
69.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:458-460的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
70.根据实施方案69所述的药物组合物，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:464的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
71.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:35-40的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
72.根据实施方案71所述的药物组合物，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)所述抗体包括含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链。
73.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)特异性结合至人类B7-H4且包含对应地SEQ ID NO:65-70的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或其抗原结合片段；以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物中至少95％的所述抗体或其抗原结合片段是无岩藻糖基化的。
74.根据实施方案73所述的药物组合物，其中(i)所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的可变重链区以及含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的可变轻链区；或(ii)其中所述抗体包括含SEQ ID NO:73的氨基酸序列的重链以及含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的轻链。
75.根据实施方案67至74中任一项所述的药物组合物，其中在所述组合物中不能检测到岩藻糖基化。
76.根据实施方案67至75中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
77.根据实施方案76所述的药物组合物，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗或派姆单抗。
78.根据实施方案76所述的药物组合物，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段是AMP-514、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗和斯帕利珠单抗。
79.根据实施方案67至75中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物还包含抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。
80.一种用于诱导T细胞增殖的方法，所述方法包括使T细胞与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
81.根据实施方案80所述的方法，其中T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
82.一种用于诱导CD4+T细胞增殖的方法，所述方法包括使CD4+T细胞与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
83.根据实施方案82所述的方法，其中CD4+T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
84.一种用于诱导CD8+T细胞增殖的方法，所述方法包括使CD8+T细胞与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
85.根据实施方案84所述的方法，其中CD8+T细胞增殖减少至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
86.一种用于诱导干扰素γ产生的方法，所述方法包括使T细胞与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
87.根据实施方案86所述的方法，其中干扰素γ产量增加至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
88.一种用于杀灭表达B7-H4的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
89.一种用于耗尽细胞群中表达B7-H4的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞群与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物接触。
90.根据实施方案88或89所述的方法，其中所述杀灭或所述耗尽是通过ADCC发生。
91.根据实施方案80至90中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述T细胞、所述CD4+T细胞、所述CD8+T细胞、所述细胞或所述细胞群与抗PD-1抗体或其抗原结合片段接触。
92.根据实施方案91所述的方法，其中所述与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至78中任一项所述的药物组合物接触以及所述与抗PD-1抗体或其抗原结合片段接触是同时发生的。
93.根据实施方案91所述的方法，其中所述与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至78中任一项所述的药物组合物接触以及所述与抗PD-1抗体或其抗原结合片段接触是依序发生的。
94.根据实施方案80至90中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述T细胞、所述CD4+T细胞、所述CD8+T细胞、所述细胞或所述细胞群与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段接触。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至75中任一项所述的药物组合物接触以及所述与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段接触是同时发生的。
96.根据实施方案94所述的方法，其中所述与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至75中任一项所述的药物组合物接触以及所述与抗PD-L1抗体或其抗原结合片段接触是依序发生的。
97.根据实施方案80至96中任一项所述的方法，其中所述接触是在体外进行的。
98.根据实施方案80至96中任一项所述的方法，其中所述接触是在受试者体内进行的。
99.一种治疗受试者的表达B7-H4的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物。
100.根据实施方案99所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳癌、导管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌以及膀胱癌。
101.根据实施方案100所述的方法，其中所述乳癌是三阴性乳癌或其中所述非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。
102.根据实施方案100所述的方法，其中所述非小细胞肺癌是腺癌。
103.根据实施方案99所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：头颈癌、小细胞肺癌、胃癌和黑素瘤。
104.根据实施方案100所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌，所述卵巢癌是浆液性腺癌。
105.根据实施方案101所述的方法，其中所述癌症是乳癌，所述乳癌是导管腺癌。
106.根据实施方案99至105中任一项所述的方法，其中所述癌症是PD-1抑制剂反应不足性癌症。
107.根据实施方案99至106中任一项所述的方法，其中所述癌症是PD-L1抑制剂反应不足性癌症。
108.根据实施方案99至107中任一项所述的方法，其中所述癌症表达较低量的PD-L1。
109.根据实施方案99至108中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类。
110.根据实施方案99至109中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
111.根据实施方案110所述的方法，其中根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至78中任一项所述的药物组合物的施用与所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的施用是同时发生的。
112.根据实施方案110所述的方法，其中根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至78中任一项所述的药物组合物的施用与所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的施用是依序发生的。
113.根据实施方案112所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的施用是在根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至78中任一项所述的药物组合物的施用之后发生。
114.根据实施方案91至93、97、98以及110至113中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段是纳武单抗或派姆单抗。
115.根据实施方案91至93、97、98以及110至113中任一项所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段是AMP-514、卡瑞利珠单抗、替雷利珠单抗或斯帕利珠单抗。
116.一种用于检测样品中的B7-H4的方法，所述方法包括使所述样品与根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。
117.根据实施方案116所述的方法，其中所述样品是自人类受试者的癌症获得。
118.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据实施方案67至79中任一项所述的药物组合物；以及a)检测试剂、b)B7-H4抗原、c)反映批准使用或销售用于人类施用的通知，或d)其组合。
119.根据实施方案1至51或66中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段抑制B7-H4的T细胞检查点阻断活性。
120.根据实施方案119所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述T细胞检查点阻断活性是由IL-2产量相对于对照细胞增加进行测量。
121.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)根据实施方案1至51或66中任一项所述的抗体或抗原结合片段，以及(ii)药学上可接受的赋形剂，其中所述抗体或抗原结合片段抑制B7-H4的T细胞检查点阻断活性。
122.根据实施方案121所述的药物组合物，其中所述T细胞检查点阻断活性是由IL-2产量相对于对照细胞增加进行测量。
Claims (10)
1.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组的重链可变区(VH)互补决定区(CDR)1、VH CDR2、VH CDR3以及轻链可变区(VL)CDR1、CDR2及CDR3序列：
(a)对应地，SEQ ID NO:458-463；
(b)对应地，SEQ ID NO:5-10；
(c)对应地，SEQ ID NO:15-20；
(d)对应地，SEQ ID NO:25-30；
(e)对应地，SEQ ID NO:35-40；
(f)对应地，SEQ ID NO:45-50；
(g)对应地，SEQ ID NO:55-60；
(h)对应地，SEQ ID NO:65-70；
(i)对应地，SEQ ID NO:75-80；
(j)对应地，SEQ ID NO:85-90；
(k)对应地，SEQ ID NO:95-100；
(l)对应地，SEQ ID NO:105-110；
(m)对应地，SEQ ID NO:115-120；
(n)对应地，SEQ ID NO:125-130；
(o)对应地，SEQ ID NO:135-140；
(p)对应地，SEQ ID NO:145-150；
(q)对应地，SEQ ID NO:155-160；
(r)对应地，SEQ ID NO:165-170；
(s)对应地，SEQ ID NO:175-180；
(t)对应地，SEQ ID NO:185-190；以及
(u)对应地，SEQ ID NO:195-200。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列的VH。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包括含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列的VL。
4.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含SEQ ID NO:11、21、31、41、464、51、61、71、81、91、101、111、121、131、141、151、161、171、181、191或201的氨基酸序列。
5.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:12、22、32、42、52、62、72、82、92、102、112、122、132、142、152、162、172、182、192或202的氨基酸序列。
6.一种特异性结合至人类B7-H4的分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段包括含以下氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区：
(a)对应地，SEQ ID NO:464和42；
(b)对应地，SEQ ID NO:11和12；
(c)对应地，SEQ ID NO:21和22；
(d)对应地，SEQ ID NO:31和32；
(e)对应地，SEQ ID NO:41和42；
(f)对应地，SEQ ID NO:51和52；
(g)对应地，SEQ ID NO:61和62；
(h)对应地，SEQ ID NO:71和72；
(i)对应地，SEQ ID NO:81和82；
(j)对应地，SEQ ID NO:91和92；
(k)对应地，SEQ ID NO:101和102；
(l)对应地，SEQ ID NO:111和112；
(m)对应地，SEQ ID NO:121和122；
(n)对应地，SEQ ID NO:131和132；
(o)对应地，SEQ ID NO:141和142；
(p)对应地，SEQ ID NO:151和152；
(q)对应地，SEQ ID NO:161和162；
(r)对应地，SEQ ID NO:171和172；
(s)对应地，SEQ ID NO:181和182；
(t)对应地，SEQ ID NO:191和192；或
(u)对应地，SEQ ID NO:201和202。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含重链恒定区。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链恒定区选自由人类免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2重链恒定区组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段还包含轻链恒定区。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链恒定区选自由人类免疫球蛋白IgGκ和IgGλ轻链恒定区组成的组。
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