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MX2014011582A - Metodos y composiciones de diagnostico para el tratamiento de cancer. - Google Patents

Metodos y composiciones de diagnostico para el tratamiento de cancer.

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MX2014011582A
MX2014011582A MX2014011582A MX2014011582A MX2014011582A MX 2014011582 A MX2014011582 A MX 2014011582A MX 2014011582 A MX2014011582 A MX 2014011582A MX 2014011582 A MX2014011582 A MX 2014011582A MX 2014011582 A MX2014011582 A MX 2014011582A
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MX
Mexico
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patient
expression
level
vegf antagonist
gene
Prior art date
Application number
MX2014011582A
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English (en)
Inventor
Maike Schmidt
Priti Hegde
Ru-Fang Yeh
Original Assignee
Genentech Inc
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Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
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Abstract

La invención proporciona métodos y composiciones para detectar la expresión de uno o más biomarcadores para identificar y tratar pacientes quienes probablemente respondan a la terapia con un agonista de VEGF. La invención también proporciona equipos y artículos de manufactura para su uso en los métodos.

Description

- - MÉTODOS Y COMPOSICIONES DE DIAGNÓSTICO PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a métodos para identificar pacientes que se beneficiarán del tratamiento con un antagonista de VEGF, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La medición de los niveles de expresión de biomarcadores (por ejemplo, proteínas secretadas en plasma) puede ser un medio efectivo para identificar pacientes y poblaciones de pacientes que responderán a terapias específicas incluyendo, por ejemplo, tratamiento con antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF.
Existe una necesidad de medios efectivos para determinar que pacientes responderán a que tratamiento y para incorporar tales determinaciones en regímenes de tratamiento efectivos para pacientes con terapias antagonistas de VEGF, ya sea usados como agentes únicos o combinados con otros agentes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para identificar pacientes que se beneficiarán del tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Estos pacientes se identifican en base a los niveles de - - expresión de los siguientes genes: DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2), N0S2 , Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7 , EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) .
La invención proporciona métodos para determinar si es probable que un paciente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, incluyendo los métodos: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF), EGFL7, EFNA3, PGF, A GPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF; y, opcionalmente, (c) informar a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, los métodos opcionalmente, pueden incluir, en su lugar (c) informar a los pacientes que no tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF si, por - - ejemplo, no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia .
La invención también proporciona métodos para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer para un paciente, incluyendo los métodos: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3, PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF; y, opcionalmente, (c) proporcionar una recomendación al paciente que la terapia anti-cáncer incluye un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, los métodos opcionalmente, pueden incluir, en su lugar (c) proporcionar una recomendación al paciente que la terapia anti-cáncer no es un antagonista de VEGF si, por ejemplo, no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, - - relativo al nivel de referencia.
En estos métodos, el paciente puede estar en una población de pacientes que se prueba para su respuesta a un antagonista de VEGF y el nivel de referencia puede ser el nivel de expresión medio del al menos un gen en la población de pacientes.
También se incluyen en la invención métodos para monitorear si un paciente quien ha recibido al menos una dosis de un antagonista de VEGF responderá al tratamiento con un antagonista de VEGF, incluyendo los métodos: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4 , angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7 , EFNA3, PGF, A GPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente después de la administración de la al menos una dosis de un antagonista de VEGF; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de referencia, que puede ser el nivel de expresión del al menos un gen en una muestra biológica obtenida del paciente antes de la administración del antagonista de VEGF al paciente, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que responderá al tratamiento con un antagonista de - - VEGF; y, opcionalmente, (c) informar a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir en su lugar (c) informar a los pacientes que pueden noresponder al tratamiento con un antagonista de VEGF si, por ejemplo, no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF relativo al nivel de referencia.
En los métodos descritos arriba, el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente puede ser un incremento o una disminución, relativo al nivel de referencia.
La expresión del al menos un gen en la muestra biológica obtenida del paciente puede detectarse al medir, por ejemplo, ARNm y/o niveles de proteína en plasma.
La muestra biológica puede ser, por ejemplo, tejido tumoral, tal como una biopsia de tumor, o una muestra de plasma en la sangre.
Los métodos de la invención pueden incluir además detectar la expresión de al menos un segundo, tercero, cuarto o adicional de los genes en una muestra biológica del paciente .
El antagonista de VEGF puede ser un anticuerpo anti-VEGF, tal como bevacizumab.
- - El paciente puede tener un trastorno angiogénico. Por ejemplo, el paciente puede tener un cáncer seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, glioblastoma, y combinaciones de los mismos .
Los métodos descritos arriba pueden incluir además una etapa de administrar un antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, tal como, por ejemplo, bevacizumab) al paciente.
La invención también incluye métodos para seleccionar una terapia para un paciente particular en una población de pacientes que se consideran para la terapia, incluyendo los métodos: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, A GPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, y (c) seleccionar una - - terapia incluyendo un antagonista de VEGF si se identifica que el paciente probablemente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y, opcionalmente, recomendar al paciente la terapia seleccionada incluyendo un antagonista de VEGF; o (d) seleccionar una terapia que no incluye un antagonista de VEGF si se identifica que el paciente probablemente no responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y, opcionalmente, recomendar al paciente la terapia seleccionada que no incluye un antagonista de VEGF.
En estos métodos, el paciente puede estar en una población de pacientes que se prueba para su respuesta a un antagonista de VEGF y el nivel de referencia puede ser el nivel de expresión medio del al menos un gen en la población de pacientes.
También se incluyen en la invención métodos para seleccionar una terapia para un paciente quien ha recibido al menos una dosis de un antagonista de VEGF, incluyendo los métodos: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1 , SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente después de la administración del antagonista de VEGF; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de referencia, que es el - - nivel de expresión del al menos un gen en una muestra biológica obtenida del paciente antes de la administración del antagonista de VEGF al paciente; en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, y (c) seleccionar una terapia incluyendo un antagonista de VEGF si se detecta un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF y, opcionalmente, recomendar al paciente la terapia seleccionada incluyendo un antagonista de VEGF; o (d) seleccionar una terapia que no incluye un antagonista de VEGF si no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF y, opcionalmente, recomendar al paciente la terapia seleccionada que no incluye un antagonista de VEGF.
En los dos métodos descritos arriba, el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente puede ser un incremento o una disminución, relativo al nivel de referencia.
Los métodos pueden incluir además detectar la expresión de al menos un segundo, tercero, cuarto o adicional de los genes en la muestra biológica del paciente.
- - Además, la terapia de (d) puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico, y combinaciones de los mismos.
Los métodos pueden incluir además: (e) administrar una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF al paciente si se identifica que el paciente probablemente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF. El antagonista de VEGF puede ser un anticuerpo anti-VEGF, tal como bevacizumab.
Además, los métodos pueden incluir además administrar una cantidad efectiva de al menos un segundo agente. Por ejemplo, el segundo agente puede seleccionarse del grupo que consiste de: un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico, y combinaciones de los mismos.
También se incluyen en la invención métodos para diagnosticar un trastorno angiogénico en un paciente, incluyendo los métodos las etapas de: (a) detectar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7 , EFNA3, PGF, A GPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al - - paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen o biomarcador con un nivel de referencia del al menos un gen; en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que tiene un trastorno angiogénico; y, opcionalmente, (c) informar a los pacientes que tienen un trastorno angiogénico. En algunas modalidades, los métodos pueden incluir en su lugar (c) informar a los pacientes que pueden no tener un trastorno angiogénico si, por ejemplo, no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia.
Estos métodos de diagnóstico también pueden incluir una etapa de administrar un antagonista de VEGF al paciente si se identifica que tiene un trastorno angiogénico. El antagonista de VEGF puede ser, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, tal como, por ejemplo, bevacizumab.
La invención también incluye equipos para determinar si un paciente puede beneficiarse del tratamiento con un antagonista de VEGF, el equipo incluyendo (a) compuestos (por ejemplo, polipéptidos o polinucleótidos (por ejemplo, cebadores PCR o sondas) ) capaces de determinar el nivel de expresión de al menos uno de loe siguientes genes : DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2 , Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SSLP, Cox2 , Fibronectina - - (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) y, opcionalmente, (b) instrucciones para uso de los polipéptidos o polinucleótidos para determinar el nivel de expresión de al menos uno de DLL4 , angiopoyetina 2 (Angpt2), N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen relativo a un nivel de referencia indica que el paciente puede beneficiarse del tratamiento con un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, los polipéptidos son anticuerpos .
Estas y otras modalidades se describen además por la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un esquema que muestra el diseño de estudio total. El diseño de estudio permite la valoración de los cambios moleculares y clínicos de pacientes con cáncer de mama avanzado después del tratamiento neoadyuvante a base de bevacizumab (bev) seguido por quimioterapia, con o sin bev.
La Figura 2 es un diagrama de pruebas controladas aleatorias que muestra la colocación aleatoria de 90 pacientes en grupos de control con placebo o tratados con bev y el número de pacientes que completaron el estudio en su totalidad.
La Figura 3 es una gráfica que muestra que la expresión de CD144 (VE-Cadherin) es la misma después del tratamiento con bev (tratamiento bajo en bev o alto en bev) .
La Figura 4 es una gráfica que muestra que la expresión de DLL4 normalizada con CD144 (ligando 4 similar a delta) se subregula luego de tratamiento con bev (tratamiento bajo en bev o alto en bev) .
La Figura 5 es una gráfica que muestra que la expresión de angiopoyetina 2 (ANGPT2) se subregula luego de tratamiento con bev.
La Figura 6 es una gráfica que muestra que la expresión de Factor V se aumenta luego de tratamiento con bev.
La Figura 7 es una gráfica que muestra que la expresión de Factor VIII (AHF) se aumenta luego de tratamiento con bev.
La Figura 8 es una gráfica que muestra que la expresión de sintasa de óxido nítrico (NOS2, o NOS inducible (NOSi)) se subregula luego de tratamiento con bev.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I . Introducción La presente invención proporciona métodos y composiciones para monitorear y/o identificar pacientes sensibles o receptivos al tratamiento con antagonistas de VEGF, por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF. La invención se basa en el descubrimiento que la determinación de niveles de expresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes listados abajo en la Tabla 1 antes y/o después de tratamiento con un antagonista de VEGF (tal como un anticuerpo anti-VEGF) es útil para identificar pacientes sensibles o receptivos a tratamiento con un antagonista de VEGF, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF.
Tabla 1 Los términos "biomarcador" y "marcador" se usan de manera intercambiable en la presente para referirse a un ADN, AR , proteína, carbohidrato, o marcador molecular a base de glicolípido, la expresión o presencia del cual en una muestra del paciente o del sujeto puede detectarse por métodos estándar (o métodos descritos en la presente) y es útil para monitorear la sensibilidad o respuesta de un sujeto mamífero a un antagonista de VEGF. Tales biomarcadores incluyen, pero no se limitan a, los genes listados en la Tabla 1. La expresión de tal un biomarcador puede determinarse para ser más alta o inferior en una muestra obtenida de un paciente sensible o receptivo a un antagonista de VEGF que un nivel de referencia (incluyendo, por ejemplo, el nivel de expresión medio del biomarcador en una muestra de un grupo/población de pacientes que se prueba para su respuesta a un antagonista de VEGF; el nivel en una muestra previamente obtenida del individuo en una ocasión anterior; o el nivel en una muestra de un paciente que recibió tratamiento anterior con un antagonista de VEGF (tal como un anticuerpo anti-VEGF) en un establecimiento de tumor primario, y quien ahora puede estar experimentando metástasis) . Los individuos que tienen un nivel de expresión que es mayor a o menor al nivel de expresión de referencia de al menos un gen, tales como aquellos observados arriba, pueden identificarse como sujetos/pacientes que responden probablemente a tratamiento con un antagonista de VEGF. Por ejemplo, tales sujetos/pacientes que muestran niveles de expresión genética en lo más extremo 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% relativos a (es decir, más altos o inferiores al) nivel de referencia (tal como el nivel medio, observado arriba) , pueden identificarse como sujetos/pacientes que responden probablemente a tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF.
Los términos "muestra" y "muestra biológica" se usan de manera intercambiable para referirse a cualquier muestra biológica obtenida de un individuo incluyendo fluidos corporales, tejido corporal (por ejemplo, tejido tumoral) , células, u otras fuentes. Los fluidos corporales son, por ejemplo, linfa, suero, sangre fresca completa, células mononucleares de sangre periférica, sangre completa congelada, plasma (incluyendo fresco o congelado) , orina, saliva, semen, fluido sinovial y fluido espinal. Las muestras también incluyen tejido de mama, tejido renal, tejido colónico, tejido cerebral, tejido muscular, tejido sinovial, piel, folículo piloso, médula ósea, y tejido tumoral. Los métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mamíferos se conocen bien en la materia.
Una "respuesta efectiva" de un paciente o una "sensibilidad" o "respuesta" del paciente a tratamiento con un antagonista de VEGF se refiere a el beneficio terapéutico o clínico impartido a un paciente en riesgo de o que sufre de un trastorno angiogénico de o como un resultado del tratamiento con el antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Tal beneficio incluye respuestas biológicas o celulares, una respuesta completa, una respuesta parcial, una respuesta estable (sin evolución o recaída) , o una respuesta con una recaída posterior del paciente de o como un resultado del tratamiento con el antagonista. Por ejemplo, una respuesta efectiva puede ser tamaño de tumor reducido o supervivencia libre de evolución en un paciente diagnosticado como expresando uno o más de los biomarcadores observados arriba, en una manera descrita en la presente, contra un paciente que no expresa uno o más de los biomarcadores en tal manera. La expresión de biomarcador (es) genético (s) predice de manera efectiva, o predice con alta sensibilidad, tal respuesta efectiva.
"Antagonistas" como se usa en la presente se refiere a compuestos o agentes que inhiben o reducen la actividad biológica de la molécula a la cual se unen. Antagonistas incluyen anticuerpos, péptidos de secuencia nativa o sintética, inmunoadhesinas , y antagonistas de molécula pequeña que se unen a VEGF, opcionalmente conjugados con o fusionados a otra molécula. Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno que une.
Un "anticuerpo agonista," como se usa en la presente, es un anticuerpo que imita parcial o completamente al menos una de las actividades funcionales de un polipéptido de interés .
El término "anticuerpo" en la presente se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpo mientras muestren la actividad biológica deseada.
Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de investigación, diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica (1) a más del 95% en peso de anticuerpo como se determina mediante, por ejemplo, el método Lowry, y en algunas modalidades, a más del 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por uso de, por ejemplo, un secuenciador de copa giratorio, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras usando, por ejemplo, colorante color plata o azul de Coomassie. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos no estará presente un componente del ambiente natural del anticuerpo. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación.
"Anticuerpos nativos" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas idénticas ligeras (L) y dos cadenas idénticas pesadas (H) . Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras el número de enlaces de disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena ligera y pesada también tiene puentes de disulfuro de intracadena regularmente separados . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácido particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede referirse como "VH." El dominio variable de la cadena ligera puede referirse como WVL." Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.
El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas pociones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente por todo los dominios variables de anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVRs) tanto en los dominio variables de cadena ligera como cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se llaman las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas nativas pesadas y ligeras comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando grandemente una configuración de hoja beta, conectadas por tres HVRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de hoja beta. Las HVRs en cada cadena se mantienen juntas en proximidad por las regiones FR y, con las HVRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences ¦ of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no se incluyen directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones de ejecución, tal como participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa ( ) y lambda (?) , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2/ IgG3, IgG4, IgAi, e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien y describen generalmente en, por ejemplo, Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos.
Los términos "anticuerpo de longitud completa" , "anticuerpo intacto," y "anticuerpo entero" se usan en la presente de manera intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no fragmentos de anticuerpo como se define abajo. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fe .
Un "anticuerpo puro" para los propósitos en la presente es un anticuerpo que no se conjuga con una porción citotóxica o radiomarca.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, comprendiendo preferentemente la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2/ Y" Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo.
La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión a antígeno único, y un fragmento "Fe" residual, cuyo nombre refleja su habilidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab' )2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y aún es capaz de degradar el antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de unión a antígeno completo. En una modalidad, una especie Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena ligera y uno de pesada en asociación no covalente, hermética. En una especie Fv de cadena única (scFv) , un dominio variable de cadena ligera y uno de pesada puede enlazarse covalentemente por un enlazador de péptido flexible de manera que las cadenas pesadas y ligeras pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie Fv de dos cadenas . Es en esta configuración que las tres HVRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis HVRs confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o mitad de un Fv que comprende solamente tres HVRs específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unir antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.
El fragmento Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región de unión de anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en el cual el (los) residuo(s) de cisterna de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo originalmente se producen como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteína de unión entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
"Fv de cadena única" o fragmentos de anticuerpo "scFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptido única. Generalmente, el polipéptido scFv además comprende un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Mono-clonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg and Moore eds . (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315.
El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígenos, tales fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL) . Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan para acoplarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitio de unión a antigenos. Los diacuerpos pueden ser bivalentes o biespecíficos . Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Los trxacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto para posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que ocurren de manera natural, que pueden estar presentes en cantidades menores . De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como no siendo una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas modalidades, tal un anticuerpo monoclonal típicamente incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se une a un objetivo, en donde la secuencia de polipéptidos de unión a objetivo se obtuvo por un proceso que incluye la selección de una secuencia de polipéptidos de unión a antígeno única de una pluralidad de secuencias de polipéptidos . Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones hibridoma, clones fago, o clones de ADN recombinante . Debe entenderse que una secuencia de unión a objetivo seleccionada puede además alterarse, por ejemplo, para mejorar la afinidad para el objetivo, para humanizar la secuencia de unión a objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a antígeno alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste a preparaciones del anticuerpo policlonal, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un determinante único en un antígeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en que típicamente no se contaminan por otras inmunoglobulinas .
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obteniéndose de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no se construye como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a usarse de acuerdo con la presente invención pueden hacerse por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma {por ejemplo, Kohler and ilstein. , Nature 256:495-497 (1975); Hongo et al., Hybridoma 14 (3):253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 4,816,567), tecnologías de despliegue de fago (ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS _ USA 101 (34) :12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284 (1-2) : 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos de humano o similares a los de humano en animales que tienen partes o todos los lugares de inmunoglobulina humana o genes que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Inmunol . 7:33 (1993); Patentes de EE.UU. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/'Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14:845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Inmunol. 13:65-93 (1995).
Los anticuerpos raonoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica ú homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la(s) cadena (s) es idéntica ú homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras muestren la actividad biológica deseada (por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 4,816,567 y Morrison et al., PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región de unión a antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido al, por ejemplo, inmunizar macacos con el antígeno de interés.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) , en el cual los residuos de una HVR del receptor se reemplazan por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo, o primate no humano teniendo la especificidad, afinidad, y/o capacidad deseada. En algunos casos, residuos de FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones pueden hacerse para perfeccionar además el desempeño del anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana, y todas, o sustancialmente todas, las FRs son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también, por ejemplo, Vaswani and Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Inmunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr.
Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y Patentes de EE.UU. Nos. 6,982,321 y 7,087,409.
Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha hecho usando cualquiera de las técnicas para hacer anticuerpos humanos como se describe en la presente . Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humano. Los anticuerpos humanos pueden producirse usando varias técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de despliegue de fago. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991). También están disponibles para la preparación de anticuerpos humanos monoclonales , métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. In unol. 147(1) :86-95 (1991). Ver también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-374 (2001). Los anticuerpos humanos pueden prepararse al administrar el antigeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir tales anticuerpos en respuesta a reto antigénico, pero cuyos lugares endógenos se han incapacitado, por ejemplo, xenoratones inmunizados (ver, por ejemplo, Patentes de EE.UU. Nos. 6,075,181 y 6,150,584 que consideran la tecnología XENOMOUSE ) . Ver también, por ejemplo, Li et al., PNAS USA 103:3557-3562 (2006) que consideran anticuerpos humanos generados a través de una tecnología de hibridoma de célula B de humano.
El término "región hipervariable, " "HVR," o "HV," cuando se usa en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o formar bucles estructuralmente definidos. Generalmente, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2 , L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 despliegan la mayor diversidad de las seis HVRs, y H3 en particular se cree que juega un papel único para conferir la especificidad perfeccionada a anticuerpos. Ver, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Ciertamente, los anticuerpos de camélidos que ocurren de manera natural de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en la ausencia de cadena ligera. Ver, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol . 3:733-736 (1996).
Un número de descripciones de HVR están en uso y se comprenden en la presente. Las HVRs que son regiones que determinan la capacidad de complementación (CDRs) Kabat, se basan en la variabilidad de secuencia y son las más comúnmente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Inmunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Chothia se refiere en su lugar a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ) . Las HVRs de Abm representan un compromiso entre las CDRs Kabat y bucles estructurales Chothia, y se usan por el software de modelado de anticuerpo de Oxford Molecular. Las HVRs "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristal complejas, disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se observan abajo.
Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24 -L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50 -L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89 -L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26 -H35B H26-H32 H30-H35B (Kabat Numbering) Hl H31-H35 H26 -H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración Chothia) H2 H50-H65 H50 -H58 H53-H55 H47-H58 H3 H95-H102 H95 -H102 H96-H101 H93-H101 HVRs pueden comprender "HVRs extendidas" como sigue: 24-36 o 24-34 (Ll) , 46-56 o 50-56 (L2) , y 89-97 o 89-96 (L3) en VL, y 26-35 (Hl) , 50-65 o 49-65 (H2), y 93-102, 94-102, o 95-102 (H3) en VH. Los residuos de dominio variable se enumeran de acuerdo a Kabat et al., supra, para - - cada una de estas definiciones de HVR extendida.
Residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de HVR como se define en la presente.
La expresión "numeración de residuo de dominio variable como en Kabat" o "numeración de posición de aminoácido como en Kabat," y variaciones de la misma, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal actual puede contener pocos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una inserción de aminoácido única (residuo 52a de acuerdo a Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etc. de acuerdo a Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada Kabat "estándar" .
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HRVs del mismo que resulta en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno, en comparación con un anticuerpo de origen que no posee aquella (a) alteración (es) . En una modalidad, un anticuerpo moderado por afinidad tiene afinidades nanomolares o incluso picomolares para el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen por procedimientos conocidos en la materia. Por ejemplo, Marks et al., Bio/'Technology 10:779-783 (1992) describe maduración por afinidad mediante la mezcla del dominio VH y VL. La mutagénesis aleatria de HVR y/o residuos de estructura se describe mediante, por ejemplo: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Inmunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Inmunol. 154 (7) : 3310-3319 (1995); y Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
Los anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que previenen o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se une el anticuerpo.
Anticuerpos que "inducen apoptosis" son aquellos que inducen la muerte celular programada, como se determina por ensayos de apoptosis estándar, tales como unión de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento celular, eliminación de retículo endoplásmico, fragmentación celular, y/o formación de vesícula de membrana (llamados cuerpos apoptóticos) .
"Funciones ejecutoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones ejecutoras del anticuerpo incluyen: unión de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; unión de receptor de Fe; citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; subregulación de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B.
El término "región Fe" en la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes . Aunque pueden variar los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina, la región Fe de cadena pesada de IgG humana usualmente se define para estirarse de un residuo aminoácido en la posición Cys226, o de Pro230, al término carboxilo del mismo. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo al sistema de numeración de EE.UU.) de la región Fe puede removerse, por ejemplo, durante producción o purificación del anticuerpo, o por diseño recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpo con todos los residuos K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 removidos, y poblaciones de anticuerpo teniendo una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
Al menos que se indique de otra manera en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es aquella del índice de EE.UU. como en Kabat et al., supra. El "índice de EE.UU. como en Kabat" se refiere a la numeración de residuo del anticuerpo de EE.UU. de IgGl de humano.
Una "región Fe funcional" posee una "función ejecutora" de una región Fe de secuencia nativa. Las "funciones ejecutoras" ejemplificativas incluyen unión de Clq; CDC; unión de receptor de Fe; ADCC; fagocitosis; subregulación de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. Tales funciones ejecutoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden valorarse usando varios ensayos como se describe, por ejemplo, en definiciones en la presente.
Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe encontrada en la naturaleza. Las regiones Fe de humano de secuencia nativa incluyen una región Fe de IgGl de humano de secuencia nativa (alotipos A y no A) ; región Fe de IgG2 de humano de secuencia nativa; región Fe de IgG3 de humano de secuencia nativa; y región Fe de IgG4 de humano de secuencia nativa, así como variantes que ocurren de manera natural de las mismas .
Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región Fe de secuencia nativa en virtud de al menos una modificación de aminoácido, preferentemente una o más sustitución (es) de aminoácido. Preferentemente, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácido comparada con una región Fe de secuencia nativa o con la región Fe de un polipéptido de origen, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácido, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido de origen. La región Fe variante en la presente preferentemente poseerá al menos aproximadamente 80% de homología con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido de origen, y más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología con la misma, más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología con la misma.
El término "anticuerpo que comprende región Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe . La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo al sistema de numeración de EE.UU.) de la región Fe puede removerse, por ejemplo, durante purificación del anticuerpo o por diseño recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, una composición que comprende un anticuerpo teniendo una región Fe de acuerdo a esta invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todos los K447 removidos, o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447.
"Receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, un FcR es un FcR de humano nativo. En algunas modalidades, un FcR es uno que une un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo variante alélicas y alternativamente formas divididas de aquellos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor de inhibición"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene un motivo de activación a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor de inhibición FcyRIIB contiene un motivo de inhibición a base de tirosina inmunoreceptora (ITI ) en su dominio citoplásmico. (ver, por ejemplo, Daéron, Annu. Rev. Inmunol. 15:203-234 (1997)). FcRs se revisan, por ejemplo, en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Inmunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-341 (1995). Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se comprenden por el término BFcR" en la presente.
El término "receptor de Fe" o wFcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Inmunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Inmunol. 24:249 (1994)) y la regulación de homeostasis de inmunoglobulinas . Se conocen los métodos para medir la unión a FcRn (ver, por ejemplo, Ghetie and ard, Inmunology Today 18 (12) : 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7) : 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8) : 6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).
Puede analizarse la unión a FcRn de humano in vivo y vida media en suero de polipéptidos de unión de alta afinidad de FcRn de humano, por ejemplo, en ratones transgénicos o estirpes de humano transíectadas que expresan FcRn de humano, o en primates a los cuales se administran los polipéptidos con una región Fe variante. WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcRs. Ver, también, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9 (2 ): 6591-6604 (2001).
"Células ejecutoras de humano" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones ejecutoras. En ciertas modalidades, las células expresan al menos FcyRIII y realizan función (es) ejecutora (s) de ADCC. Ejemplos de leucocitos de humano que median la ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas, y neutrófilos. Las células ejecutoras pueden aislarse de una fuente nativa, por ejemplo, de sangre.
"Citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad, en la cual Ig secretada unida sobre el receptor de Fes (FcRs) presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos, y macrófagos) permite que estas células ejecutoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo que lleva antígeno y subsiguientemente matan la célula objetivo con citotoxinas. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras los monocitos expresan FcyRI, FcyRII, y FcyRIII. La expresión de Fcr en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Inmunol. 9:457-492 (1991). Para valorar la actividad de ADCC de una molécula de interés puede realizarse un ensayo de ADCC in vi tro, tal como aquel descrito en Patente de EE.UU. No. 5,500,362 o 5,821,337 o Patente de EE.UU. No. 6,737,056 (Presta) . Las células ejecutoras útiles para tales ensayos incluyen células PBMC y NK. Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de la ADCC de la molécula de interés puede valorarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al., PNAS (USA) 95 :652-656 (1998) .
"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en la presencia de complemento. La activación de la trayectoria de complemento clásica se inicia por la unión del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) , que se unen a su antígeno similar. Para valorar la activación del complemento puede realizarse un ensayo de la CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Inmunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptido con secuencias de aminoácidos de región Fe alterada (polipéptidos con una región Fe variante) y capacidad de unión de Clq incrementada o disminuida se describen, por ejemplo, en Patente de EE.UU. No. 6,194,551131 y WO 1999/51642. Ver, también, por ejemplo, Idusogie et al., J. Inmunol. 164:4178-4184 (2000).
La "afinidad de unión" generalmente se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno) . Al menos que se indique de otra manera, como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X para su pareja Y generalmente puede representarse por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la materia, incluyendo aquellos descritos en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen a antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen a antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Una variedad de métodos para medir la afinidad de unión se conocen en la materia, cualquiera de los cuales puede usarse para propósitos de la presente invención. Las modalidades ejemplificativas e ilustrativas específicas para medir afinidad de unión se describen más adelante.
En una modalidad, "Kd" o "valor Kd" de acuerdo a esta invención se mide por un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. La afinidad de unión a solución de Fabs para antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en la presencia de una serie de concentración de antígeno no marcado, capturando entonces antígeno unido con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas de microconcentración (DY EX Technologies, Inc.) se revisten durante la noche con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fn de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9.6), y se bloquean subsiguientemente con 2% (p/v) de albúmina de suero de bovino en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , 100 p o 26 pM antígeno [125I] se mezclan con diluciones seriales de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la valoración del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un periodo más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Después, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . La solución se remueve entonces y la placa se enjuaga ocho veces con 0.1% de agente tensoactivo TWEEN-20™ en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 µ?/cavidad de agente de centelleo ( ICROSCINT-20™; Packard) , y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) por diez minutos . Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de unión máxima se eligen para usarse en ensayos de unión competitivos .
De acuerdo a otra modalidad, Kd o valor Kd se mide al usar ensayos de resonancia de plasmón en superficie usando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE^-SOOO (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips de biosensor de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con 10 mM acetato de sodio, pH 4.8, a 5 ug/ml (-0.2 µ?) antes de inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para alcanzar aproximadamente diez unidades de respuesta (RU) de la proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1 M de etanolamina para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones de cinéticas, las diluciones seriales dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con 0.05% de agente tensoactivo TWEEN 20™ (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kactiVa) y disociación (kinactiva) se calculan usando un modelo de unión simple uno a uno Langmuir (Software de evaluación BrAcore® versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la proporción kinactiva/kactiva · Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la velocidad activa excede 106 "1s"1 por el ensayo de resonancia de plasmon en superficie anterior, entonces la velocidad activa puede determinarse al usar una técnica de enfriamiento fluorescente que mide el incremento o disminución en intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm,- emisión = 340 nm, 16 nm paso banda) a 25°C de un anticuerpo de anti-antígeno a 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con flujo de detención (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.
Una "velocidad activa," "velocidad de asociación," "tasa asociación," o "kactiva" de acuerdo a esta invención también puede determinarse como se describe arriba usando un sistema BIACORES-2000 BIACORE^-SOOO (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) .
El término "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo," como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/comparación) , de manera que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores es de poco o ningún significado biológico y/o estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, y/o menos de aproximadamente 10% como una función del valor de referencia/comparación.
La frase "sustancialmente reducida," o "sustancialmente diferente," como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparación) de manera que un experto en la materia consideraría que la diferencia entre los dos valores es de significado estadístico dentro del contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor a aproximadamente 10%, mayor a aproximadamente 20%, mayor a aproximadamente 30%, mayor a aproximadamente 40%, y/o mayor a aproximadamente 50% como una función del valor para la molécula de referencia/comparación.
En ciertas modalidades, el anticuerpo humanizado útil en la presente además comprende alteraciones de aminoácido en Fe de IgG y muestra afinidad de unión incrementada para FcRn de humano sobre un anticuerpo que tiene Fe de IgG tipo silvestre, por al menos 60 veces, al menos 70 veces, al menos 80 veces, más preferentemente al menos 100 veces, preferentemente al menos 125 veces, aún más preferentemente al menos 150 veces a aproximadamente 170 veces .
Un "trastorno" o "enfermedad" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con una sustancia/molécula o método de la invención. Este incluye enfermedades o trastornos crónicos y agudos que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos de trastornos no limitantes a tratarse en la presente incluyen tumores malignos y benignos; no leucemias y enfermedades linfoides; trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocoélicos; y trastornos inflamatorios, inmunológicos y otros angiogénicos .
Los términos "trastorno proliferativo celular" y "trastorno proliferativo" se refieren a trastornos que se asocian con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, el trastorno proliferativo celular es cáncer. En una modalidad, el trastorno proliferativo celular es angiogénesis .
"Tumor," como se usa en la presente, se refiere a toda proliferación y crecimiento celular neoplásico, ya sea maligno o benigno, y todos los tejidos y células pre-cancerosas y cancerosas. Los términos "cáncer," "canceroso," "trastorno proliferativo celular," "trastorno proliferativo, " y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se refiere en la presente .
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por proliferación celular no regulada. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal (incluyendo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer ovárico, cáncer del hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer coloreetal, carcinoma uterino o endometrial, carcinoma de glándula salivar, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de célula B (incluyendo linfoma no Hodgkin (NHL) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL) ; NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no segmentada pequeña de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linforna de célula del manto; linfoma relacionado con SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia linfoblástica aguda (ALL) ; leucemia de célula pilosa; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como aquel asociado con tumores cerebrales) , y síndrome de Meigs .
El término "composición anti-neoplástica" o "composición anti-cáncer" o "agente anti-cáncer" se refiere a una composición útil para tratar cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente anti-cáncer." Ejemplos de agentes terapéuticos (agentes anti-cáncer) incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis , agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista de receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de la tirosina quinasa) , inhibidor HERI/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) , inhibidores del factor de crecimiento derivado de plaqueta (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib Mesilato) ) , un inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones , citoquinas. Antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a uno o más de los siguientes receptor (es) objetivo ErbB2, ErbB3, ErbB4 , PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA VEGF, o VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes químicos bioactivos y orgánicos, etc. Las combinaciones de los mismos también se incluyen en la invención.
Un "agente o factor angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promueven angiogénesis, crecimiento celular endotelial, estabilidad de vasos sanguíneos, y/o vasculogénesis, etc. Por ejemplo, factores angiogénicos, incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia de VEGF, P1GF, familia de PDGF, familia del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFs) , ligandos TIE (Angiopoyetinas) , Efrinas, Del-1, factores de crecimiento de fibroblasto: ácido (aFGF) y básico (bFGF) , Folistatina, factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF) , factor de crecimiento de Hepatocito (HGF) /factor difusor (SF) , Interleucina-8 (IL-8) , Leptina, Midkina, Factor de crecimiento placental, factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaqueta (PD-ECGF) , Factor de crecimiento derivado de plaqueta, especialmente PDGF-BB o PDGFR-beta, Pleiotrofina (PTN) , Progranulia, Proliferina, Factor de crecimiento de transformación alfa (TGF-alfa) , Factor de crecimiento de transformación beta (TGF-beta) , Factor de necrosis de tumor alfa (TNF-alfa) , Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) /factor de permeabilidad vascular (VPF) , etc . También incluiría factores que aceleran la sanación de heridas, tales como hormona de crecimiento, factor I de crecimiento similar a insulina (IGF-I) , VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , CTGF y miembros de su familia, y TGF-alfa y TGF-beta. Ver, por ejemplo, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene 22:3172-3179 (2003); Ferrara and Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 1 lista factores angiogénicos conocidos) ; y Sato, Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (2003).
El término "VEGF" como se usa en la presente se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular de humano de 165 aminoácidos y factores de crecimiento celulares endoteliales vasculares de humano de 121, 189 y 206 aminoácidos, como se describe por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), y Houck et al., Mol. Endocrin. 5:1806 (1991) , junto con las formas procesadas y alélicas que ocurren de manera natural de los mismos. El término "VEGF" también se refiere a VEGFs de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. Algunas veces el VEGF de una especie específica se indica por los términos tales como hVEGF para VEGF de humano, mVEGF para VEGF de murino, etc. El término "VEGF" también se usa para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprende 8 a 109 o l a 109 aminoácidos del factor de crecimiento celular endotelial vascular de humano de 165 aminoáacidos . La referencia a cualquiera de tales formas de VEGF también puede identificarse en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8-109)," "VEGF (1-109)," o "VEGF165." Las posiciones de aminoácido para un VEGF nativo "truncado" se enumeran como se indica en la secuencia VEGF nativa. Por ejemplo, la posición 17 de aminoácido (metionina) en VEGF nativo truncado también es la posición 17 (metionina) en VEGF nativo. VEGF nativo truncado tiene afinidad de unión para los receptores KDR y Flt-1 comparables con VEGF nativo. De acuerdo a una modalidad preferida, el VEGF es un VEGF de humano.
Un "antagonista de VEGF" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abolir, reducir o interferir con actividades de VEGF incluyendo su unión a VEGF o uno o más receptores de VEGF o el ácido nucleico que los codifica. Preferentemente, el antagonista de VEGF une VEGF o un receptor de VEGF. Antagonistas de VEGF incluyen anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, polipéptidos que unen VEGF y receptores de VEGF y bloquean la interacción de ligando-receptor (por ejemplo, inmunoadhesinas, peptocuerpos) , anticuerpos del receptor anti-VEGF y antagonistas del receptor de VEGF tales como inhibidores de molécula pequeña de las tirosinas quinasas de VEGFR, aptámeros que unen VEGF y ácido nucleicos que se hibridan bajo condiciones severas con secuencias de ácido nucleico que codifican VEGF o receptor de VEGF (por ejemplo, ARNi) . De acuerdo a una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se une a VEGF e inhibe la proliferación celular endotelial inducida por VEGF in vitro. De acuerdo a una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se une a VEGF o un receptor de VEGF con mayor afinidad que un no VEGF o no receptor de VEGF. De acuerdo a una modalidad preferida, el antagonista de VEG se une a VEGF o un receptor de VEGF con un Kd de entre luM y lpM. De acuerdo a otra modalidad preferida, el antagonista de VEGF se une a VEGF o un receptor de VEGF entre 500nM y lpM.
De acuerdo a una modalidad preferida, el antagonista de VEGF se selecciona de un polipéptido tal como un anticuerpo, un pepticuerpo, una inmunoadhesina, una molécula pequeña o un aptámero. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-VEGF tal como el anticuerpo AVASTI 5 O un anticuerpo receptor anti-VEGF tal como un anti-VEGFR2 o un anticuerpo anti-VEGFR3. Otros ejemplos de antagonistas de VEGF incluyen: VEGF-Trap, Mucagen, PTK787, SU11248, AG-013736, Bay 439006 (sorafenib) , ZD-6474, CP632, CP-547632, AZD-2171, CDP-171, SU-14813, CHIR-258, AEE-788, SB786034, BAY579352, CDP-791, EG-3306, GW-786034, RWJ-417975/CT6758 y KR -633.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se une a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. Preferentemente, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede usarse como un agente terapéutico en la determinación de objetivos e interferir con enfermedades o condiciones en donde se incluye la actividad VEGF. Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se unirá a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. Un anticuerpo anti-VEGF preferido es un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por HB 10709 ATCC de hibridoma. Más preferentemente el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo anti-VEGF monoclonal humanizado recombinante, generado de acuerdo a Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997), incluyendo pero no limitándose al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; Avastin®) . De acuerdo a otra modalidad, anticuerpos anti-VEGF que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a los anticuerpos descritos en WO 2005/012359. De acuerdo a una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF comprende la región ligera variable y pesada variable de cualquiera de los anticuerpos descritos en las Figuras 24, 25, 26, 27 y 29 de WO 2005/012359 (por ejemplo, G6, G6-23, G6-31, G6-23.1, G6-23.2, B20, B20-4 y B20.4.1). En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-VEGF conocido como ranibizumab es el antagonista de VEGF administrado para enfermedad ocular tal como neuropatía diabética y AMD.
El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV) " , también conocido como "rhuMAb VEGF" o "Avastin®" , es un anticuerpo anti-VEGF monoclonal humanizado recombinante generado de acuerdo a Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997). Comprende regiones de estructura de IgG de humano mutada y regiones que determinan la capacidad de complementación de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF A.4.6.1 de murino que bloquea la unión de VEGF de humano a sus receptores. Aproximadamente 93% de la secuencia de aminoácidos de Bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones de estructura, se deriva de IgGl de humano, y aproximadamente 7% de la secuencia se deriva del anticuerpo A4.6.1 de murino. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149,000 daltones y se glicosila. Otros anticuerpos anti-VEGF incluyen los anticuerpos descritos en la Patente de EE.UU. No. 6,884,879 y WO 2005/044853.
El anticuerpo anti-VEGF Ranibizumab o el anticuerpo - - LUCENTIS® o rhuFab V2 es un fragmento Fab de VEGF anti-humano madurado por afinidad, humanizado. Ranibizumab se produce por métodos de tecnología recombinante estándar en vector de expresión de Escherichia coli y fermentación bacterial. Ranibizumab no se glicosila y tiene una masa molecular de -48,000 daltones. Ver W098/45331 y US 2003/0190317.
La disregulación de angiogénesis puede conducir a angiogénesis anormal, es decir., cuando se encuentra crecimiento excesivo, insuficiente, o de otra manera inapropiado de nuevos vasos sanguíneos (por ejemplo, la ubicación, temporización o inicio de la angiogénesis siendo indeseada desde un punto de vista médico) en un estado de enfermedad o causa un estado de enfermedad, es decir, un trastorno angiogénico. La angiogénesis excesiva, inapropiada o no controlada ocurre cuando hay nuevo crecimiento de vaso sanguíneo que contribuye al empeoramiento del estado de enfermedad o causa un estado de enfermedad. Los nuevos vasos sanguíneos pueden alimentar los tejidos de enfermedad, destruir tejidos normales, y en el caso de cáncer, los nuevos vasos sanguíneos pueden permitir que las células de tumor escapen hacia la circulación y se alojen en otros órganos (metástasis de tumor) . Los estados de enfermedad incluyendo angiogénesis anormal (es decir, trastornos angiogénicos) incluyen tanto condiciones neoplásticas como no neoplásticas incluyendo, por ejemplo, cáncer, especialmente tumores - 5 - sólidos vascularizados y tumores metastáticos (incluyendo cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de célula pequeña) , cáncer cerebral (especialmente glioblastoma) o cáncer de próstata) , hipertrofia indeseada o aberrante, artritis, artritis reumatoide (RA) , enfermedad intestinal inflamatoria o IBD (enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroescleróticas , retinopatías diabéticas y otras proliferativas incluyendo retinopat a del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización del injerto de córnea, rechazo del injerto de córnea, neovascularización retinal/coroidal , neovascularización de la superficie anterior del iris (rubeosis) , enfermedad neovascular ocular, restenosis vascular, malformaciones arteriovenosas (AVM) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave) , inflamación crónica, inflamación del pulmón, lesión aguda del pulmón/ARDS, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado con ataque agudo/lesión cerrada en la cabeza/trauma) , inflamación sinovial, miositis osificante, formación ósea hipertrópica, osteoartritis (OA) , ascitis refractaria, enfermedad ovárica poliquística, endometriosis , enfermedades del tercer espacio de fluido (pancreatitis, síndrome de compartimento, quemaduras, enfermedad intestinal) , fibroides uterina, parto prematuro, inflamación crónica tal como IBD, rechazo de aloinjerto renal, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome nefrótico, crecimiento de masa de tej ido indeseado o aberrante (no cáncer) , articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición de crecimiento de pelo, síndrome Osler-Weber, fibroplasias retrolentales de granuloma piogénico, fibroplasias, escleroderma, tracoma, adhesión vasculares, sinovitis, dermatitis, preeclampsia, ascitis, efusión pericardial (tal como aquella asociada con pericarditis) , y efusión pleural.
Como se usa en la presente, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o la célula que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen prevenir la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, disminución de la velocidad de evolución de la enfermedad, mejora o alivio del estado de enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención se usan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o trastorno.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico o terapéutico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, agonista o antagonista puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la habilidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o dañino de la sustancia/molécula, agonista o antagonista se sopesa por los efectos terapéuticamente benéficos. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido o antagonista de esta invención efectiva para "tratar" una enfermedad o trastorno en un mamífero (también conocido como paciente) . En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir el número de células cancerígenas; reducir el tamaño del tumor o peso; inhibir (es decir, disminuye a algún grado y preferentemente detiene) la infiltración de células cancerígenas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, disminuye a algún grado y preferentemente detiene) metástasis de tumor; inhibir, a algún grado, el crecimiento de tumor; y/o aliviar a algún grado uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. Al grado que el fármaco puede prevenir el crecimiento y/o matar las células cancerígenas existentes, puede ser citoestático y/o citotóxico. En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad inhibidora de crecimiento. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que extiende la supervivencia de un paciente. En otra modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad que mejora la supervivencia libre de progreso de un paciente.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no necesariamente, ya que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva es menos de la cantidad terapéuticamente efectiva.
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células . El término se propone incluir isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re18S, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas , antibióticos, y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacterial, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o de las mismas, y los varios agentes antitumor o anticáncer descritos abajo. Otros agentes citotóxicos se describen abajo. Un agente tumoricida causa la destrucción de las células de tumor.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfámida CYTOXAN®; sulfonatos de alquilo tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; una camptotecina (incluyendo el topotecan análogo sintético (HYCAMTIN®) , CPT- 11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilinica; tenipósido; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, caliqueamiciña, especialmente caliqueamicina gammall y caliqueamicina omegall (ver, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl . 33:183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como cromóforo de neocarzinostatina y cromoforos antibióticos de enedina de cromoproteína relacionada) , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptoporina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; pirógenos tales como calusterona, propionato de drornostañolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; rellenador de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina complejo de polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina,-sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico,- triacicuona; 2 , 21 , 2" -triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), libre de Cremofor ABRAXANE™, formulación de nanopartícula diseñada por albúmina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , y doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) ; cloranbucil; gemcitabina (GEMZAR®) ; 6-tioguanina; mercaptoporina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina (VELBAN®) ; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®) ; oxaliplatina; leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®) ; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tal como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®) ; sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores ,-así como combinaciones de dos o más de los anteriores tal como CHOP, una abreviación para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona, y FOLFOX, una abreviación para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovovin. Los agentes quimioterapéuticos adicionales incluyen los agentes citotóxicos útiles como conjugados de fármaco de anticuerpo, tales como maitansinoides (DM1, por ejemplo) y las auristatinas MMAE y MMAF, por ejemplo.
"Agentes quimioterapéuticos" también incluyen "agentes anti-hormonales" que actúan para regular, reducir, bloquear, o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer, y con frecuencia están en la forma de tratamiento sistémico, o de todo el cuerpo. Ellos mismos pueden ser hormonas. Los ejemplos incluyen anti-estrógenos y moduladores del receptor de estrógeno selectivos (SERMs) , incluyendo, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4 -hidroxitamoxifen, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; subreguladores del receptor de estrógeno (ERDs) ; agentes que funcionan para suprimir o detener los ovarios, por ejemplo, agonistas de la hormona de liberación de hormona leutinizante (LHRH) tales como LUPRON® y acetato de leuprólido ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina y tripterelina; otros anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; e inhibidores de aromatasa que inhiben la aromatasa de enzima, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, (5) -imidazoles , aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestaño, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®. Además, tal definición de agentes quimioterapéuticos incluye bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato A EDIA®, tiludronato SKELID®, o risedronato ACTONEL®; asi como troxacitabina (un análogo de citosina de 1, 3-dioxolano nucleósido) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en trayectorias de señalización implicadas en proliferación celular aberrante, tal como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) vacunas tales como vacuna THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEÜVECTIN®, y vacuna VAXID® ; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (un inhibidor de molécula pequeña de tirosina quinasa dual EGFR y ErbB-2 también conocido como GW572016) ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento y/o proliferación de una célula (por ejemplo, una célula que expresa Robo4) ya sea in vitro o in vivo. De esta manera, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan Robo4 en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean la evolución del ciclo celar (en un lugar diferente a fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y detención de fase M. Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen los vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como la doxorubicina antibiótica de antraciclina ( (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3 , 6-trideoxi-a-L-lixo-hexapiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6 , 8 , ll-trihidroxi-8- (hidroxiacetil) -l-metoxi-5, 12-naftacenediona) , epirubicina, daunorubicina, etopósido, y bleomicina. Esos agentes que detienen Gl también se desbordan de la detención de fase S, por ejemplo, agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracil , y ara-C. Puede encontrarse información adicional en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds., Capítulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, y antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer, derivados ambos del árbol de tejo negro. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo Europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de microtúbulos de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al prevenir la depolimerización, que resulta en la inhibición de mitosis en células.
Como se usa en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier animal único, más preferentemente un mamífero (incluyendo tales animales no humanos como, por ejemplo, perros, gatos, caballos, conejos, animales del zoológico, vacas, puercos, ovejas, y primates no humanos) para los cuales se desea tratamiento. Más preferentemente, el paciente en la presente es un humano.
Un "sujeto" en la presente es cualquier sujeto humano único, incluyendo un paciente, elegible para tratamiento quien está experimentando o ha experimentado una o más señales, síntomas, u otros indicadores de un trastorno angiogénico. Se propone incluir como un sujeto cualquier sujeto incluido en las pruebas de investigación clínica que no muestra ninguna señal clínica de enfermedad, o sujetos incluidos en estudios epidemiológicos, o sujetos alguna vez usados como controles. El sujeto pudo haberse tratado previamente con un antagonista de VEGF, o no tratado así. El sujeto puede ser inexperto en cuanto un segundo medicamento que se usa cuando se inicia el tratamiento en la presente, es decir, el sujeto pudo no haberse tratado previamente con, por ejemplo, un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico en "línea base" (es decir, un punto fijo en el tiempo antes de la administración de una primer dosis de antagonista en el método de tratamiento en la presente, tal como el día de selección del sujeto antes de que comience el tratamiento) . Tales sujetos "inexpertos" generalmente se consideran candidatos para tratamiento con un segundo medicamento .
La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un medicamento que es efectiva para tratar trastornos de angiogénesis .
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación estéril que está en tal forma para permitir que la actividad biológica del medicamento sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se administraría la formulación.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivos y sus esporas .
Una "inserción de paquete" se usa para referirse a instrucciones incluidas normalmente en paquetes comerciales de medicamentos o productos terapéuticos, que contiene la información acerca de las indicaciones, uso, dosificación, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a combinarse con el producto empacado, y/o advertencias concernientes al uso de tales medicamentos o productos terapéuticos, etc.
Un "kit" es cualquier fabricación (por ejemplo, un paquete o recipiente) que comprende al menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para tratamiento de un trastorno angiogénico, o una sonda para detectar específicamente un gen biomarcador o proteína de la invención. La fabricación se promueve, distribuye o vende preferentemente como una unidad para realizar los métodos de la presente invención.
Para propósitos de no respuesta a medicamento (s) , un sujeto quien experimenta "un alto nivel clínicamente inaceptable de toxicidad" del tratamiento previo o actual con uno o más medicamentos, experimenta uno o más efectos secundarios negativos o eventos adversos asociados con el mismo, que se consideran significativos por un médico experimentado, tales como, por ejemplo, infecciones serias, falla cardiaca congestiva, demielinación (que conduce a esclerosis múltiple) , hipersensibilidad significativa, eventos neuropatológicos , altos grados de autoinmunidad, o cáncer tal como cáncer endometrial, linfoma no Hodgkin, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer ovárico, o melanoma, tuberculosis (TB) , etc.
Por "reducir el riesgo de un efecto secundario negativo" significa reducir el riesgo de un efecto secundario que resulta del tratamiento con el antagonista en la presente a un grado inferior al riesgo observado que resulta del tratamiento del mismo paciente u otro paciente con un medicamento previamente administrado. Tales efectos secundarios incluyen aquellos establecidos arriba considerando toxicidad, y son preferentemente infección, cáncer, falla cardiaca, o demielinación.
Por "correlacionar" o "correlacionando" se entiende comparar, en cualquier manera, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, uno puede usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo un segundo protocolo y/o uno puede usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si debe realizarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto a varias modalidades en la presente, uno puede usar los resultados de un ensayo analítico para determinar si debe realizarse un régimen terapéutico específico usando un antagonista de VEGF, tal como anticuerpo anti-VEGF.
La palabra "marca" cuando se usa en la presente se refiere a un compuesto o composición que se conjuga o fusiona directa o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo con el cual se conjuga o fusiona. La marca por si misma puede ser detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopo o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de una composición o compuesto de sustrato que es detectable . Se propone que el término comprenda marcado directo de una sonda o anticuerpo al acoplar (es decir, unir físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como marcado indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que se marca directamente. Ejemplos de marcado indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario fluorescentemente marcado y marcado final de una sonda de ADN con biotina de manera que puede detectarse con estreptavidina fluorescentemente marcada.
Los términos "nivel de expresión" o "nivel expresión" se usan de manera intercambiable y generalmente se refiere a la cantidad de un polinucleótido o un producto aminoácido o proteína en una muestra biológica. "Expresión" generalmente se refiere al proceso por el cual la información codificada por gen se convierte en las estructuras presentes y que operan en la célula. Por lo tanto, de acuerdo a la invención "expresión" de un gen puede referirse a transcripción en un polinucleótido, traducción en una proteína, o incluso modificación post-traducción de la proteína. Fragmentos del polinucleótido transcrito, la proteína traducida, o la proteína modificada post-traducción también deben considerarse como expresados si se originan de una transcripción generada por división alternativa o una transcripción degradada, o de un procesamiento posttraducción de la proteína, por ejemplo, por proteólisis. Los "genes expresados" incluyen aquellos que se transcriben en un polinucleótido como AR m y después se traducen en una proteína, y también aquellos que se transcriben en AR pero no se traducen en una proteína (por ejemplo, AR s de transferencia y ribosomal) .
Como se usa en la presente, el término "covariable" se refiere a ciertas variables o información relacionada con un paciente. Los puntos finales clínicos se consideran frecuentemente en modelos de regresión, donde los puntos finales representan la variable dependiente y los biomarcadores representan las variables principales o independientes objetivo (regresores) . Si se consideran las variables adicionales del grupo de datos clínicos, se denotan como covariables (clínicas) El término "covariable clínica" se usa en la presente para describir toda la información clínica acerca del paciente, que está, en general, disponible en la línea base. Estas covariables clínicas comprenden información demográfica como sexo, edad, etc., otra información amnésica, enfermedades concomitantes, terapias concomitantes, resultados de examinaciones físicas, parámetros comunes de laboratorio obtenidos, propiedades conocidas de los trastornos angiogénicos, desarrollo de la enfermedad clínica, temporización y resultado de pretratamientos, historial de la enfermedad, así como toda la información similar que puede asociarse con la respuesta clínica a tratamiento.
Como se usa en la presente, el término "análisis neto" o "análisis sin ajustar" se refiere a análisis de regresión, en donde además de los biomarcadores considerados, no se usan covariables clínicas adicionales en el modelo de regresión, ni como factores independientes ni como covariable de estratificación.
Como se usa en la presente, el término "ajustado por covariables" se refiere a análisis de regresión, en donde además de los biomarcadores considerados, se usan covariables clínicas adicionales en el modelo de regresión, ya sea como factores independientes o como variables de estratificación.
Como se usa en la presente, el término "univariable" se refiere a modelos de regresión o planteamientos gráficos en donde, como una variable independiente, solamente uno de los biomarcadores objetivo es parte del modelo. Estos modelos univariables pueden considerarse con y sin covariables clínicas adicionales.
Como se usa en la presente, el término "multivariable" se refiere a modelos de regresión o planteamientos gráficos en donde, como variables independientes, más de uno de los biomarcadores objetivo es parte del modelo. Estos modelos multivariable pueden considerarse con y sin covariables clínicas adicionales.
III. Métodos para Identificar Pacientes Receptivos a Antagonistas de VEGF La presente invención proporciona métodos para identificar y/o monitorear pacientes que probablemente son receptivos a terapia antagonista de VEGF (por ejemplo, anticuerpo anti-VEGF) . Los métodos son útiles, Ínter alia, para incrementar la probabilidad de que la administración de un antagonista de VEGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF) a un paciente será eficaz. Los métodos comprenden detectar la expresión de uno o más biomarcadores genéticos en una muestra biológica de un paciente, en donde la expresión de uno o más de tales biomarcadores es indicativa de si el paciente es sensible a o receptivo a antagonistas de VEGF, tales como anticuerpos anti-VEGF.
Más particularmente, determinar el nivel de expresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes listados en la Tabla 1 (es decir, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , N0S2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7 , EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) ) en una muestra de un paciente es útil para monitorear si el paciente es receptivo o sensible a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Para cualquiera de los métodos descritos en la presente, uno podría, por ejemplo, determinar los niveles de expresión de cualquier combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o 13 genes seleccionados del grupo que consiste de DLL4, ANGPT2 , NOS2, Factor V, AHF, EGFL7 , EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, FN_EIIIB, ESM1, y SDF1. Alternativamente, para cualquiera de los métodos descritos en la presente, puede determinarse el nivel de expresión de todos los 14 genes (es decir, DLL4, A GPT2 , N0S2, Factor V, AHF, EGFL7, EFNA3, PGF, A GPTL1, SELP, Cox2 , FN_EIIIB, ESM1, y SDF1) .
Los métodos y ensayos descritos proporcionan medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en costo para obtener datos e información útil para valorar terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, un paciente puede proporcionar una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia de tumor o una muestra de sangre) antes y/o después de tratamiento con un antagonista de VEGF y la muestra puede examinarse por medio de varios ensayos in vitro para determinar si las células del paciente son sensibles a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF.
La invención también proporciona métodos para monitorear la sensibilidad o respuesta de un paciente a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Los métodos pueden conducirse en una variedad de formatos de ensayo, incluyendo ensayos que detectan expresión de proteína o genética (tales como inmunoensayos de enzima y PCR) y ensayos bioquímicos que detectan la actividad apropiada. La determinación de expresión o la presencia de tales biomarcadores en muestras de paciente es predictiva de si un paciente es sensible a los efectos biológicos de un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. La invención de los solicitantes en la presente es que un cambio (es decir, un incremento o disminución) en la expresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes listados en la Tabla 1 en una muestra de un paciente se correlaciona con tratamiento de tal un paciente con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. El Ejemplo 1 muestra que tratamiento con anticuerpo anti-VEGF resulta en niveles disminuidos de DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2), N0S2 , EGFL7, EFNA3 , PGF, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , y ESM1, así como niveles incrementados de Factor V, Factor VIII (AHF) , ANGPTL1, P-selectina (SELP) , y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , y de esta manera en varias modalidades, la detección de tales niveles en los métodos descritos en la presente se incluye en la invención.
Típicamente, un cambio (es decir, una disminución o incremento) de al menos aproximadamente 1.5 veces, 1.6 veces, 1.8 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, o 10 veces en expresión en al menos uno de los genes, relativa a la expresión en una muestra de control (por ejemplo, una muestra obtenida del mismo paciente antes de un tratamiento con un antagonista de VEGF, una muestra o muestra agrupada obtenida de uno o más individuo (s) relacionado (s) quien (es) no se ha(n) tratado con un antagonista de VEGF) o un cambio (es decir, una disminución o incremento) de una proporción log promedio de al menos aproximadamente -2, -3, -4, -5, o -6 desviaciones estándar de los niveles de expresión promedio de los genes medidos indica que un paciente responderá a o es sensible a tratamiento con un antagonista de VEGF.
De acuerdo a los métodos de la invención, la probabilidad de que un individuo particular (por ejemplo, un paciente) responda probablemente a tratamiento con un antagonista de VEGF puede determinarse al detectar el nivel de expresión de al menos uno de los genes listados en la Tabla 1 y comparar el nivel de expresión del gen con un nivel de expresión de referencia. Por ejemplo, como se observa arriba, el nivel de expresión de referencia puede ser el nivel de expresión medio del al menos un gen en un grupo/población de pacientes que se prueba para su respuesta a un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, el nivel de expresión de referencia es el nivel de expresión del al menos un gen en una muestra previamente obtenida del individuo en una ocasión anterior. En otras modalidades, los individuos son pacientes que recibieron tratamiento anterior con un antagonista de VEGF en un establecimiento de tumor primario. En algunas modalidades, los individuos son pacientes que están experimentando metástasis. Los individuos que tienen un nivel de expresión que es mayor a o menor al nivel de expresión de referencia de al menos un gen biomarcador como se describe en la presente se identifican como sujetos/pacientes que responden probablemente a tratamiento con un antagonista de VEGF. Sujetos/pacientes que muestran niveles de expresión genética a, por ejemplo, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% relativo a (es decir, más altos que o inferiores a) la media se identifican como pacientes que responden probablemente a tratamiento con un antagonista de VEGF. A los sujetos/pacientes puede informarse que tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF y/o proporcionarles una recomendación de que la terapia anti-cáncer incluye un antagonista de VEGF. El nivel de expresión genética puede determinarse usando al menos uno de los genes biomarcadores como se describe en la presente, o cualquier combinación lineal de los genes biomarcadores como se describe en la presente (por ejemplo, promedio, promedio ponderal, o media) usando métodos conocidos en la materia y descritos en, por ejemplo, Sokal R.R. and Rholf, F.J. (1995) "Biometry: the principies and practice of statistics in biological research, " W.H. Freeman and Co. New York, NY.
En un aspecto, esta invención proporciona un método para monitorear si un paciente con un trastorno angiogénico responderá al tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, que comprende valorar, como un biomarcador, expresión de al menos uno de los genes listados en la Tabla 1 en una muestra del paciente obtenida ya sea (i) antes de que se haya administrado cualquier antagonista de VEGF al paciente, o (ii) antes y después de tal tratamiento. Un cambio (es decir, incremento o disminución) en la expresión de al menos uno de los genes relativo a un nivel de referencia (ver arriba) indica que el paciente responderá al tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Puede informarse a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder a tratamiento con un antagonista de VEGF y/o proporcionarles una recomendación de que la terapia anti-cáncer incluye un antagonista de VEGF.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para monitorear la sensibilidad o respuesta de un paciente a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Este método comprende valorar la expresión genética de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes listados en la Tabla 1 de una muestra del paciente y predecir la sensibilidad o respuesta del paciente al antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, en donde un cambio (es decir, incremento o disminución) en la expresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes se correlaciona con respuesta o sensibilidad del paciente a tratamiento efectivo con el antagonista de VEGF. De acuerdo a una modalidad de este método, se obtiene una muestra biológica del paciente antes de la administración de cualquier antagonista de VEGF y se somete a un ensayo para evaluar el nivel de los productos de expresión de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes en la muestra. Si se cambia la expresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, o 14 de los genes (es decir, incrementa o disminuye) relativa a un nivel de referencia (por ejemplo, ver arriba) , se determina que el paciente es sensible o receptivo a tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF. Puede informarse a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de ser sensibles o receptivos a tratamiento con un antagonista de VEGF y/o que se les proporcione una recomendación de que la terapia anti-cáncer incluye un antagonista de VEGF. En otra modalidad de este método, se obtiene una muestra biológica del paciente antes y después de la administración de un antagonista de VEGF, como se describe en la presente.
Aquellos de experiencia en la materia médica, particularmente perteneciendo a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento con terapéuticos, reconocerán que los sistemas biológicos de alguna manera son variables y no siempre completamente predecibles, y de esta manera muchas pruebas buenas de diagnóstico o terapéuticos son ocasionalmente inefectivas. De esta manera, es en última instancia el juicio del médico, determinar el curso más apropiado de tratamiento para un paciente individual, en base a los resultados de prueba, condición del paciente e historia, y su propia experiencia. Puede haber incluso ocasiones, por ejemplo, cuando un médico elegirá tratar a un paciente con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, aun cuando no se predice que un paciente es particularmente sensible a antagonistas de VEGF, en base a los datos de pruebas de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todas o la mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias han fallado, o si algo de sinergia se anticipa cuando se le da otro tratamiento.
En modalidades expresadas adicionales, la presente invención proporciona un método para predecir la sensibilidad de un paciente a tratamiento con un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, o predecir si un paciente responderá efectivamente a tratamiento con un antagonista de VEGF, que comprende valorar el nivel de uno o más de los biomarcadores genéticos identificados en la presente expresados en la muestra; y predecir la sensibilidad del paciente a inhibición por un antagonista de VEGF, en donde los niveles de expresión de uno o más de estos biomarcadores genéticos se correlacionan con alta sensibilidad del paciente a respuesta efectiva a tratamiento con un antagonista de VEGF.
La presente invención además proporciona un método para identificar un biomarcador cuyo nivel de expresión es predictivo de la sensibilidad o respuesta de un paciente particular a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, que comprende: (a) medir el nivel de expresión de un biomarcador candidato en un panel de células que despliega un rango de sensibilidades a un antagonista de VEGF, y (b) identificar una correlación entre el nivel de expresión de, seropositividad para, o presencia de dicho biomarcador candidato en las células y la sensibilidad o respuesta del paciente al antagonista de VEGF, en donde la correlación indica que el nivel de expresión, seropositividad, o presencia de dicho biomarcador es predictivo de la sensibilidad del paciente a tratamiento por un antagonista de VEGF. En una modalidad de este método el panel de células es un panel de muestras preparadas de muestras derivadas de pacientes o modelos animales experimentales . En una modalidad adicional el panel de células es un panel de estirpes en xenoinjertos de ratón, en donde la sensibilidad, por ejemplo, puede determinarse al monitorear un marcador molecular de sensibilidad, por ejemplo, al menos uno de los genes listados en la Tabla 1.
La presente invención también proporciona un método para identificar un biomarcador que es útil para monitorear respuesta o sensibilidad a un antagonista de VEGF, tal como un anticuerpo anti-VEGF, comprendiendo el método: (a) medir el nivel de un biomarcador candidato en muestras de pacientes con trastornos angiogénicos obtenidas antes de que se administre cualquier dosis de un antagonista de VEGF a los pacientes, en donde un cambio (es decir, un incremento o disminución) en la expresión del biomarcador candidato relativo a un control indica que el biomarcador es diagnóstico para tratamiento más efectivo del trastorno angiogénico con un antagonista de VEGF. En algunas modalidades, el biomarcador es genético y se analiza su expresión.
La muestra puede tomarse de un paciente que se sospecha que tiene, o se diagnostica como teniendo un trastorno angiogénico, y por lo tanto probablemente está en necesidad de tratamiento, o de un individuo normal que es sospechoso de tener cualquier trastorno. Para valoración de expresión del marcador, las muestras del paciente, tales como aquellas conteniendo células, o proteínas o ácido nucleicos producidos por estas células, pueden usarse en los métodos de la presente invención. En los métodos de esta invención, el nivel de un biomarcador puede determinarse al valorar la cantidad (por ejemplo, la concentración o cantidad absoluta) de los marcadores en una muestra, preferentemente una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tejido tumoral, tal como una biopsia) . Además, el nivel de un biomarcador puede valorarse en fluidos corporales o excreciones conteniendo niveles detectables de biomarcadores . Fluidos corporales o secreciones útiles como muestras en la presente invención incluyen, por ejemplo, sangre, orina, saliva, heces, fluido pleural, fluido linfático, esputo, ascitis, fluido prostático, fluido cerebroespinal (CSF) , o cualquier otra secreción corporal o derivado de los mismos. La palabra sangre significa que incluye sangre entera, plasma, suero, o cualquier derivado de sangre. La valoración de un biomarcador en tales fluidos corporales o excreciones algunas veces puede preferirse en circunstancias donde un método de muestreo invasivo es inapropiado o inconveniente . Sin embargo, en el caso de muestras que son fluidos corporales, la muestra a tratarse en la presente es preferentemente sangre, tejido sinovial, o fluido sinovial, más preferentemente sangre .
La muestra puede congelarse, ser fresca, fijarse [por ejemplo, fijarse en formalina) , centrifugarse, y/o incrustarse (por ejemplo, incrustarse en parafina) , etc. La muestra de célula, por supuesto, puede someterse a una variedad de técnicas de almacenamiento y preparativas después de la recolección bien conocidas (por ejemplo, ácido nucleico y/o extracción de proteína, fijación, almacenamiento, congelamiento, ultrafiltración, concentración, evaporación, centrifugación, etc.) antes de valorar la cantidad del marcador en la muestra. Del mismo modo, las biopsias también pueden someterse a técnicas de almacenamiento y preparativas después de la recolección, por ejemplo, fijación.
En cualquiera de los métodos descritos en la presente, al individuo (por ejemplo, paciente/sujeto) puede informarse de una probabilidad incrementada o disminuida de ser sensible o receptivo a tratamiento con un antagonista de VEGF; proporcionarle una recomendación de una terapia anti-cáncer (por ejemplo, una terapia anti-cáncer que incluye o no incluye un antagonista de VEGF) ; y/o seleccionar una terapia adecuada (por ejemplo, un antagonista de VEGF y/u otro agente anti-angiogénico) .
A. Detección de Expresión Genética Los biomarcadores genéticos descritos en la presente pueden detectarse usando cualquier método conocido en la materia. Por ejemplo, muestras de célula o tejido de mamíferos pueden analizarse convenientemente para, por ejemplo, ARNsm o ADNs de un biomarcador genético de interés usando análisis Northern, dot-blot, o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , hibridización de conjunto, ensayo de protección RNase, o usando microconjuntos de chip SNP de ADN, que están comercialícente disponibles, instantáneas de microconjunto de ADN. Por ejemplo, ensayos de PCR en tiempo real (RT-PCR) tales como ensayos PCR cuantitativos se conocen bien en la materia. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar ARNm de un biomarcador genético de interés en una muestra biológica comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa usando al menos un cebador; amplificar el ADNc así producido; y detectar la presencia del ADNc amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten que uno determine los niveles de ARNm en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de ARNm de control comparativa de un gen "constitutivo" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, puede determinarse la secuencia del ADNc amplificado . 1. Detección de Ácidos Nucleicos En una modalidad específica, la expresión de los genes biomarcadores como se describe en la presente puede realizarse por Tecnología RT-PCR. Las sondas usadas para PCR pueden marcarse con un marcador detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, quelante metálico, o enzima. Tales sondas y cebadores pueden usarse para detectar la presencia de genes expresados establecidos en la Tabla 1 en una muestra. Como se entenderá por el experto, puede prepararse un gran número de cebadores y sondas diferentes y usarse de manera efectiva para amplificar, clonar y/o determinar la presencia y/o niveles expresados de uno o más de los genes listados en la Tabla 1.
Otros métodos incluyen protocolos que examinan o detectan AR ms de al menos uno de los genes listados en la Tabla 1 en una muestra de célula o tejido por tecnologías de microconjunto. El uso de microconjuntos de ácido nucleico, muestras de AR m de control y prueba de las muestras de tejido de control y prueba se transcriben inversas y marcan para generar las sondas de ADNc . Las sondas se hibridan entonces a un conjunto de ácido nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. El conjunto se configura de manera que se conoce la secuencia y posición de cada miembro del conjunto. Por ejemplo, una selección de genes que tienen potencial de expresarse en ciertos estados de enfermedad puede formarse en conjunto en un soporte sólido. La hibridización de una sonda marcada con un miembro de conjunto particular indica que la muestra de la cual se deriva la sonda expresa ese gen. El análisis de expresión genética diferencia de tejido de enfermedad puede proporcionar información valuable . La tecnología de microconjunto utiliza técnicas de hibridización de ácido nucleico y tecnología de computación para evaluar el perfil de expresión de ARNm de miles de genes dentro de un experimento único (ver, por ejemplo, WO 2001/75166) . Ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,700,637, Patente de EE.UU. No. 5,445,934, y Patente de EE.UU. No. 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology 14:1675-1680 (1996); y Cheung et al., Nature Genetics 21 (Suppl) : 15-19 (1999) para una discusión de fabricación de conjunto.
Además, puede emplearse el método de detección y descripción de ADN que utiliza microconjuntos descritos en EP 1753878. Este método se identifica y distingue rápidamente entre diferentes secuencias de ADN utilizando análisis de repetición aleatorio corto (STR) y microconjuntos de ADN. En una modalidad, una secuencia objetivo STR marcada se híbrida a un microconjunto de AND que lleva sondas complementarias. Estas sondas varían en longitud para cubrir el rango de STRs posibles. Las regiones de un solo filamento marcadas de los híbridos de ADN se remueven selectivamente de la superficie de microconj nto utilizando una digestión enzimática después de hibridización. El número de repeticiones en el objetivo desconocido se deduce en base del patrón de ADN objetivo que permanece híbrido al microconjunto .
Un ejemplo de un procesador de microconjunto es el sistema GENECHIP® de Affymetrix, que está comercraímente disponible y comprende conjuntos fabricados por síntesis directa de oligonucleótidos en una superficie de vidrio. Pueden usarse otros sistemas como se sabe por un experto en la materia.
Otros métodos para determinar el nivel del biomarcador además de RT-PCR u otro método a base de PCR incluyen técnicas proteómicas, así como perfiles genéticos individualizados que son necesarios para tratar trastornos angiogénicos en base a la respuesta del paciente a un nivel molecular. Los microconjuntos especializados en la presente, por ejemplo, microconjuntos de oliginucleótidos o microconjuntos de ADNc, pueden comprender uno o más biomarcadores que tienen perfiles de expresión que se correlacionan con ya sea sensibilidad o resistencia a uno o más anticuerpos anti-VEGF. Otros métodos que pueden usarse para detectar ácido nucleicos, para usarse en la invención, incluyen análisis de expresión de secuencia de ARN de alto rendimiento, incluyendo análisis genómico a base de ARN, tal como, por ejemplo, RNASeq.
Están disponibles muchas referencias para proporcionar guía para aplicar las técnicas anteriores (Kohler et al., Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980) ; Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985) ; Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, Amsterdam, 1984) ; Hurrell, Monoclonal Hybridoma Antibodies : Techniques and Applications (CRC Press, Boca Ratón, FL, 1982) ; y Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pp. 147-1 58 (CRC Press, Inc., 1987)). El análisis Northern blot es una técnica convencional bien conocida en la materia y se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, a Laboratory Manual, segunda edición, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500. Los protocolos típicos para evaluar el estado de los genes y productos genéticos se encuentra, por ejemplo, en Ausubel et al., eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Unidades 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Inmunoblotting) y 18 (Análisis PCR) . 2

Claims (38)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar si es probable que un paciente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, comprendiendo el método: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ES 1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF; e (c) informar a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF.
2. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de una terapia anti-cáncer para un paciente, comprendiendo el método: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, A GPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF; y (c) proporcionar una recomendación al paciente que la terapia anti-cáncer comprende un antagonista de VEGF.
3. Un método para monitorear si un paciente quien ha recibido al menos una dosis de un antagonista de VEGF responderá al tratamiento con un antagonista de VEGF, comprendiendo el método: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF), EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente después de la administración de la al menos una dosis de un antagonista de VEGF; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de referencia, que es el nivel de expresión del al menos un gen en una muestra biológica obtenida del paciente antes de la administración del antagonista de VEGF al paciente, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que responderá al tratamiento con un antagonista de VEGF; y (c) informar a los pacientes que tienen una probabilidad aumentada de responder al tratamiento con un antagonista de VEGF.
4. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el paciente está en una población de pacientes que se prueba para su respuesta a un antagonista de VEGF y el nivel de referencia es el nivel de expresión medio del al menos un gen en la población de pacientes.
5. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente es un incremento relativo en el nivel de referencia.
6. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente es una disminución relativa en el nivel de referencia.
7. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde la expresión del al menos un gen en la muestra biológica obtenida del paciente se detecta al medir ARNm.
8. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde la expresión del al menos un gen en la muestra biológica obtenida del paciente se detecta al medir niveles de proteína en plasma.
9. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde la muestra biológica es tej ido tumoral .
10. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, que comprende además detectar la expresión de al menos un segundo de dichos genes en la muestra biológica del paciente .
11. El método de la reivindicación 10, que comprende además detectar la expresión de al menos un tercero de dichos genes en la muestra biológica del paciente.
12. El método de la reivindicación 11, que comprende además detectar la expresión de al menos un cuarto de dichos genes en la muestra biológica del paciente.
13. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
14. El método de la reivindicación 13, en donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.
15. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, en donde el paciente tiene un trastorno angiogénico.
16. El método de la reivindicación 15, en donde el paciente tiene cáncer seleccionado del grupo que consiste de: cáncer colorectal, cáncer de mama, cáncer de pulmón, glioblastoma, y combinaciones de los mismos.
17. El método de la reivindicación 1, 2, o 3, que comprende además administrar un antagonista de VEGF al paciente.
18. El método de la reivindicación 17, en donde el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
19. El método de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.
20. Un método para seleccionar una terapia para un paciente particular en una población de pacientes que se consideran para la terapia, comprendiendo el método: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de expresión de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF; y (c) seleccionar una terapia que comprende un antagonista de VEGF si se identifica que el paciente probablemente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y recomendar al paciente la terapia seleccionada que comprende un antagonista de VEGF; o (d) seleccionar una terapia que no comprende un antagonista de VEGF si se identifica que el paciente probablemente no responda al tratamiento con un antagonista de VEGF y recomendar al paciente la terapia seleccionada que no comprende un antagonista de VEGF.
21. Un método para seleccionar una terapia para un paciente quien ha recibido al menos una dosis de un antagonista de VEGF, comprendiendo el método: (a) detectar la expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4 , angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, A GPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra biológica obtenida del paciente después de la administración del antagonista de VEGF; (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen con un nivel de referencia, que es el nivel de expresión del al menos un gen en una muestra biológica obtenida del paciente antes de la administración del antagonista de VEGF al paciente, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que es probable que responda al tratamiento con un antagonista de VEGF, y (c) seleccionar una terapia que comprende un antagonista de VEGF si se detecta un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF y recomendar al paciente la terapia seleccionada que comprende un antagonista de VEGF; o (d) seleccionar una terapia que no comprende un antagonista de VEGF si no se detecta cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra obtenida después de la administración del antagonista de VEGF y recomendar al paciente la terapia seleccionada que no comprende un antagonista de VEGF.
22. El método de la reivindicación 20, en donde el paciente está en una población de pacientes que se consideran para la terapia y el nivel de referencia es el nivel de expresión medio del al menos un gen en la población de pacientes.
23. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente es un incremento relativo en el nivel de referencia.
24. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde el cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente es una disminución relativa en el nivel de referencia.
25. El método de la reivindicación 20 o 21, que comprende además detectar la expresión de al menos un segundo de dichos genes en la muestra biológica del paciente.
26. El método de la reivindicación 25, que comprende además detectar la expresión de al menos un tercero de dichos genes en la muestra biológica del paciente .
27. El método de la reivindicación 26, que comprende además detectar la expresión de al menos un cuarto de dichos genes en la muestra biológica del paciente.
28. El método de la reivindicación 20 o 21, en donde la terapia de (d) es un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico, y combinaciones de los mismos.
29. El método de la reivindicación 20 o 21, que comprende además: (e) administrar una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF al paciente si se identifica que el paciente probablemente responda al tratamiento con un antagonista de VEGF.
30. El método de la reivindicación 29, en donde el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
31. El método de la reivindicación 30, en donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab .
32. El método de la reivindicación 31, que comprende además administrar una cantidad efectiva de al menos un segundo agente.
33. El método de la reivindicación 32, en donde el segundo agente se selecciona del grupo que consiste de: un agente anti-neoplásico, un agente quimioterapéutico, un agente inhibidor de crecimiento, un agente citotóxico, y combinaciones de los mismos.
34. Un método para diagnosticar un trastorno angiogénico en un paciente, comprendiendo el método las etapas de : (a) detectar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes genes, DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7, EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en una muestra obtenida del paciente antes de cualquier administración de un antagonista de VEGF al paciente; y (b) comparar el nivel de expresión del al menos un gen o biomarcador con un nivel de referencia del al menos un gen, en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen en la muestra del paciente, relativo al nivel de referencia, identifica un paciente que tiene un trastorno angiogénico; y (c) informar a los pacientes que tienen un trastorno angiogénico.
35. El método de la reivindicación 34, que comprende además administrar un antagonista de VEGF al paciente si se identifica que tiene un trastorno angiogénico.
36. El método de la reivindicación 35, en donde el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
37. El método de la reivindicación 36, en donde el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.
38. Un equipo para determinar si un paciente puede beneficiarse del tratamiento con un antagonista de VEGF, comprendiendo el equipo: (a) polipéptidos o polinucleótidos capaces de determinar el nivel de expresión de al menos uno de los siguientes genes: DLL4 , angiopoyetina 2 (Angpt2) , NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF) , EGFL7 , EFNA3 , PGF, ANGPTL1, SELP, Cox2, Fibronectina (FN_EIIIB) , ES 1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) ; e instrucciones para uso de los polipéptidos o polinucleótidos para determinar el nivel de expresión de al menos uno de DLL4, angiopoyetina 2 (Angpt2), NOS2, Factor V, Factor VIII (AHF), EGFL7, EFNA3, PGF, A GPTL1, SELP, Cox2 , Fibronectina (FN_EIIIB) , ESM1, y factor de crecimiento derivado del estroma (SDF1) , en donde un cambio en el nivel de expresión del al menos un gen relativo a un nivel de referencia indica que el paciente puede beneficiarse del tratamiento con un antagonista VEGF.
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