EA012799B1 - Терапевтические применения ингибиторов rtp801 - Google Patents

Abstract

Данное изобретение обеспечивает новые молекулы, композиции, способы и применения для лечения микрососудистых нарушений, глазных болезней и респираторных состояний на основе ингибирования гена и/или белка RTP801.

Description

По данной заявке испрашивается приоритет ЕР заявки на патент 04019405.2, поданной 16 августа 2004 года; Предварительных заявок США № 60/601983, поданной 17 августа 2004 года; № 60/604668, поданной 25 августа 2004 года; № 60/609786, поданной 14 сентября 2004 года; № 60/638659, поданной 22 декабря 2004 года; № 60/664236, поданной 22 марта 2005 года, и № 60/688943, поданной 8 июня 2005 года, все из которых включены в качестве ссылки в их полном объеме.

Область изобретения

Данное изобретение относится к новым молекулам δίΡΝΛ. которые ингибируют ген КТР801, и к применению таких молекул для лечения респираторных нарушений всех типов (в том числе легочных нарушений), глазных болезней и состояний, микрососудистых нарушений, состояний, связанных с ангиогенезом и апоптозом.

Уровень техники

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)

Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) поражает более чем 16 миллионов американцев и является четвертой наиболее распространенной причиной смерти в Соединенных Штатах. Большинство случаев этого изнуряющего заболевания вызывает курение сигарет, но и другие факторы окружающей среды не могут быть исключены (Рейу ТЬ. 2003. Όβίίηίίίοη, ер1беш1о1оду, соигае, аиб. ρτο^ηοδίδ οί СОРЭ. Сби. ^тетк^ие, 5-10).

Эмфизема легких является основным проявлением ХОБЛ. Перманентная деструкция периферических воздушных пространств, дистальных относительно терминальных бронхиол, является отличительным признаком ХОБЛ (Тибет К.М., е! а1.: Ох1бабуе к!гекк аиб αρορίοδίδ ш!етас! аиб сайке етрНукета бие ΐο уакси1ат еибοίйе1^а1 дго\\Л1 ГасЮг Ьксабе. Ат 1 Кекрб Се11 Μοί Βίοί, 29:88-97; 2003). Эмфизема характеризуется также накоплением воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, в бронхиолах и альвеолярных структурах (Ре!!у, 2003).

Патогенез эмфиземы является сложным и многофакторным. Было показано, что у людей недостаточность ингибиторов протеаз, продуцируемых воспалительными клетками, таких как альфа1антитрипсин, способствует нарушению баланса протеаз/антипротеаз, способствуя тем самым деструкции альвеолярного внеклеточного матрикса в индуцируемой сигаретным дымом (С8) эмфиземе (Έπΐ^κοπ, 8. 1964. РЫп-югину ЕтрЫкета аиб А1рба1-Аиббуркш Оейаеису. Ас!а Меб 8саиб 175: 197-205. Ιοκκ, Ь., Раге, Ρ.Ό., аиб 8аηбίο^б, АД 2002. Сеиебс пкк ГасЮгк οί сбготс οЬк!^исбνе ρи1тοиа^у б1кеаке. 8\\зкк Меб ^к1у 132; 27-37). Металлопротеиназы матрикса (ММР) играют центральную роль в экспериментальной эмфиземе, как документировано резистентностью мышей с нокаутом металлоэластазы макрофагов против эмфиземы, вызываемой хронической ингаляцией С8 (Наи1атак1, е! а1.: Вес.|шгтеЩ ίοτ тасгорбаде е1ак!аке ίοτ адатебе ктοке-^ибисеб етрЫкета ш писе. 8с1еисе 277:2002-2004). Кроме того, легочная сверхэкспрессия интерлейкина-13 в трансгенных мышах приводит к ММР- и катепсинзависимой эмфиземе ^беид, Т., е! а1.: 2000. 1ибис1Ь1е !атдебид οί Ш-13 Ιο !Не аби1! 1иид саикек табтх теίа11ορ^ο!е^иаке- аиб саШеркш-береибеи! етрНукета. 1 С1ш 1иуек1 106:1081-1093). Недавние исследования описывают участие апоптоза септальных клеток в деструкции легочной ткани, приводящей к эмфиземе (Каидакат! Т., е! а1.: Сеиебс аЬ1а!юи οί №Г2 еиНаисек киксербЬббу !ο адатебе ктοке-^πбисеб етрНукета ш тке. 8иЬт1!!еб !ο кигшб οί С1б1ка1 Iиνекбдабοи; Тибет К.М. е! а1.: Ох1бабуе кбекк аиб аρορ!οк^к ш!етас! аиб сайке етрНукета бие !ο уакси1аг еибο!Ье1^а1 дго\\Л1 ГэсЮг Ьксабе. Ат 1 Кекрб се11 Μο1 Βίο1, 29:88-97; 2003; ΥοΚοΙιοπ Ν., АοкЫЬа Κ., Νηβηί А., 1исгеакеб 1еуе1к οί се11 беа!Н аиб ρ^ο1^ίе^абοи ш а1νеο1а^ \та11 се11к ш рабеи!к хуИН ρи1тοиа^у етрНукета. СНек!. 2004 ЕеЬ:125(2):626-32; АοкЫЬа Κ., ΥοΚοΙιοπ Ν., №1да1 А., А1νеο1а^ теа11 аρορ!οк^к саикек 1иид бекбис!юи, аиб етрбукетакик сНаидек. Ат 1 Кекрб Се11 Μο1 Βίο1. 2003 Мау; 28 (5):555-62).

Среди механизмов, которые лежат в основе обоих путей деструкции легких при эмфиземе, прежде всего должно быть упомянуто избыточное образование молекулярных частиц активного (реакционноспособного) кислорода (КО8). Хорошо установлено, что в крови и ткани легких курильщиков существует баланс прооксиданта/антиоксиданта (Ни1еа 8.А., е! а1.: Шдатебе 8ιιιο1<6ι§ саикек Ьюсбетка1 сНаидек ш Μοο6 1ба! аге киддекбуе οί οx^бабуе к!гекк: а саке-сοи!^ο1 к!ибу. 1 ΕπνίΓοπ РаίЬο1 Шх!^ Оиток 1995; 14 (34): 173-80; КаНтаи I., Мас№е Ьиид д1и!а!Нюие аиб οx^бабνе кбекк: ^тρ1кабοик ш адаге!!е ктοкешбисеб а1г\тау б1кеаке. Ат 1 Рбукю1. 1999 Эес; 277 (6 Р! 1):Ь1067-88; Мас№е Оx^баη!к/аибοx^баη!к аиб СОРЭ. СНек!. 2000 Мау; 117(5 8ирр1 1):3038-178; Маг\\кк 1.А., Кбкбат Р., Ώ^ου^- Р.8., ^οиа1бкοи Κ., Мас№е ^., КаНтаи I. Шдагебе ктοке-^ибисеб οx^бабνе к!гекк аиб ТСЕ-Ье1а1 шсгеаке р21\таП/ар1 ехргеккюи ш а1νеο1а^ ербЬеба1 се11к. Аии Ν Υ Асаб 8а. 2002 Νον; 973:278-83.; АοкЫЬа К., ^шита М., ΥοΚοΙιοπ Ν., №да1 А. IттииοЫк!οсЬет^са1 еνа1иабοи οί οx^бабνе к!гекк ш тшгие, 1иидк айет адатебе ктοке еxροкиге. 1иба1 ^χ^οΕ 2003 8ер; 15 (10); 1029-38; Оекбиу/еи РК Ащкх|баШ ргорегбек οί №асе!у1сук!еш: !Не1г гекм-шсе ш гек-Июи !ο сΗ^οπ^са1 ο^οια^Ό ρи1тοиа^у б1кеаке. Еиг Кекрб. 1. 2004. Арг; 23(4):629-36; Тибет К.М., Ζΐκΐ'ΐ Ь., С1ю СУ., Та^акеν^с^еηе-8ιе\νа^ι Ь., 1<акаНага Υ., 8акетби Ό., Абе1ке1 Ν.Ε., аиб Екгек 8.С. Ох1ба!Ке к!гекк аиб аρορ!οк^к ш!етас! аиб сайке етрНукета бие !ο νакси1а^ еибοίЬе1^а1 дго\\Л1 ГэсЮг Ьксабе. Ат 1 Кекрб Се11 Μο1 Βίο1, 29:88-97; 2003). После одного часа подвергания мышей действию С8 наблюдается значительное увеличение 8-гидрокси-2'-дезоксигуанозина (8-ОНбС) в альвеолярных эпителиальных клетках, в частности, типа II (см. 1иНа1 Ήχί^Ι 2003 8ер; 15(10):1029-38, выше).

- 1 012799

Сверхпродуцируемые молекулярные частицы активного (реакционноспособного) кислорода известны вследствие их цитотоксической активности, которая происходит из прямого разрушающего действия на ДНК и из активации путей трансдукции апоптотического сигнала (Такайакй1 А., Макиба А., 8ип М., СеШопхе У.Е., Негтап В. Ох1бабуе к!гекк-шбисеб арор!ок1к 1к аккос1а!еб ίη тйосйопбпа1 сакраке асбуйу апб Вс1-2-берепбеп1 а1!егабопк ίη тйосйопбпа1 рН (рНт). Вгат Век Ви11. 2004 ЕеЬ 15; 62(6):497-504; Татуата Υ., Спепбшд К.К. Веасбуе охудеп крешек ш !йе уакси1а1иге: то1еси1аг апб се11и1аг тесйашктк. Нурейепкюп. 2003 Эес; 42(6):1075-81. ЕриЬ 2003 Ос! 27; ШдисЫ Υ. Сйготокота1 ΌΝΑ Ггадтеп!а!юп ш арор!ок1к апб песгоык шбисеб Ьу ох1бабуе к!гекк. Вюсйет Рйагтасо1. 2003 Ос! 15; 66(8):1527-35; Рип) V., СйакгайаПу А.М., Вебох рго!ешк ш таттайап се11 беа!й: ап еуо1ибопагу сопкегуеб Гцпс!юп ш тйосйопбпа апб ргокагуо!ек. Се11 МюгоЬю1. 2003 Арг; 5(4): 225-31; Иеба 8., Маки!ат Н., №1катига Н., Тапака Т., Иепо М., Υобо^ 1. Вебох соп!го1 оГ се11 беа!й. Ап!юх1б Вебох 81дпа1, 2002 1ип:4(3):405-14).

Молекулярные частицы активного (реакционноспособного) кислорода (ΚΌ8) не только являются цитотоксичными рег ке, но также являются провоспалительными стимулами, являясь сильными активаторами редокс-чувствительных факторов транскрипции ΝΡκΡ и АР-1 (обсуждаемых в Вайтап I. Ох1бабуе к!гекк апб депе !тапкспр!юп ш ак!йта апб сйгошс оЬк!гис!1уе ри1топагу б1кеаке: ап!юх1бап! !йегареи!1с !агде!к. Сшт Эгид Тагде!к 1пГ1атт А11егду. 2002 8ер; 1(3):291-315). В свою очередь, оба фактора транскрипции, как предполагается, участвуют в стимуляции транскрипции провоспалительных цитокинов (обсуждаемых в Вепагб Р., Ваек М. Тйе ртошГ1атта!огу !гапкспр!юп Гас!ог ЖкарраВ: а ро!епба1 !агде! Гог поуе1 !йегареи!1са1 к!га!ед1ек. Се11 Вю1 Тохюо1. 1999; 15 (6):341-4; Ьеп!ксй А.В., \Уагб Р.А. Тйе №карраВЬДкарраВ кук!ет ш аси!е шГ1атта!юп. Агсй 1ттипо1 Тйег Ехр (\Уагкх). 2000; 48 (2):59-63) и деградирующих матрикс протеиназ (Апбе1а У.В., Согбоп А.Н., 2о!а11к С., Вок1ег Β.Ν., Соа!ег 1.1, Бетак Ο.Ό., 8сй\гагх Е.М., Рихак 1.Е., О'КееГе В.1. ОТкарраВ: а р1уо!а1 !тапкспр!юп Гас!ог ш ргок!а!е сапсег те!ак!ак1к !о Ьопе. Сйп Ог!йор. 2003 Ос!; (415 8ирр1.):875-85; Е1еепог ЭЬ, Рапд 1.Н., С1агк А.Е. 1пуо1уетеп! оГ АР-1 ш ш!ег1еикт-1а1рйа-к!1ти1а!еб ММР-3 ехргеккюп ш йитап !гаЬеси1аг текй\гогк 5 се11к. 1пуек! Орй!йа1то1 У1к 8с1. 2003 Аид; 44(8):3494-501; Вийи1 Атш А.В., 8епда Т., Оо М.Ь., Тйап! А.А., НагаадисЫ М. 8есге!юп оГ та!пх те!а11орго!ешаке-9 Ьу !йе ргошГ1атта!огу су!окше, 1Ь-1Ье!а: а го1е Гог !йе биа1 к1дпа11тд ра!й^аук, Ак! апб Егк. Сепек Се11к. 2003 1ип; 8(6):515-23. Провоспалительные цитокины, в свою очередь, служат аттрактантами воспалительных клеток, которые также секретируют деградирующие матрикс ферменты, цитокины и молекулярные частицы активного кислорода. Таким образом, по-видимому, патогенный фактор, такой как, например, С8, запускает патологическую сеть, в которой молекулярные частицы активного кислорода действуют в качестве главных медиаторов деструкции легких.

Молекулярные частицы активного кислорода (ВО8) как из вдыхаемого сигаретного дыма, так и образуемые эндогенно воспалительными клетками, способствуют увеличенной нагрузке внутрилегочного оксиданта.

Одним дополнительным патогенным фактором, относящимся к патогенезу ХОБЛ, является наблюдаемая уменьшенная экспрессия УЕСЕ и УЕСЕВП в легких пациентов с эмфиземой ^акипоп Какайага, ВиЬш М. Тибег, Саг1упе Ό. Соо1, Эау|б А. Ьупсй, 8оша С. Е1огек, апб №гйег1 Е. Уое1ке1. Епбо!йейа1 Се11 Эеа1й апб Эесгеакеб Ехргеккюп оГ Уакси1аг Епбо!йейа1 Сго\\1й Еас!ог апб Уакси1аг Епбо!йейа1 Сго\\1й Еас!ог Весер!ог 2 ш Етрйукета. Ат 1 Векрп Сп! Саге Меб. Уо1. 163, рр. 737-744, 2001). Кроме того, ингибирование передачи сигнала УЕСЕ с использованием химического ингибитора УЕСЕВ приводит к апоптозу альвеолярных септальных эндотелиальных и затем эпителиальных клеток, возможно, вследствие разрушения тесной структурной/функциональной связи обоих типов клеток в альвеолах ^акипоп Какайага, ВиЬш М. Тибег, Ьа1ти!е Тагакеу1с1епе-8!е^аг!, Т1то!йу Ό. Ье Сгак, 8!еуеп АЬтап, Ре!ег К. Н1г!й, 1ойаппек ^а1!епЬегдег, апб №гйег1 Е. Уое1ке1. 1пй1Ьйюп оГ УЕСЕ гесер!огк саикек 1ипд се11 арор!ок1к апб етрйукета. 1. Сйп. 1пуек!. 106:1311-1319 (2000). Уое1ке1 Ν.Ε., Соо1 С.О. Ри1топагу уакси1аг шуоКетеп! ш сйгошс оЬк!гис!1уе ри1топагу б1кеаке. Еиг Векр1г 1 8ирр1. 2003 Ш; 46:28к-32к).

Дегенерация желтого пятна сетчатки

Наиболее обычной причиной пониженного лучше всего корректируемого видения у индивидуумов старше 65 лет в Соединенных Штатах является нарушение сетчатки, известное как связанная со старением дегенерация желтого пятна (сетчатки) (АМЭ). По мере прогрессирования АМЭ это заболевание характеризуется потерей острого, центрального зрения. Зоной глаза, поражаемой АМЭ, является желтое пятно - небольшая зона в центре сетчатки, состоящая в основном из фоторецепторных клеток. Так называемая «сухая» АМЭ, наблюдающаяся у приблизительно 85-90% пациентов с АМЭ, включает изменения в распределении пигмента глаза, потерю фоторецепторов и пониженную ретинальную функцию вследствие общей атрофии клеток. Так называемая «влажная» АМЭ включает пролиферацию аномальных хороидальных сосудов, приводящую к сгусткам крови или рубцам в субретинальном пространстве. Таким образом, возникновение влажной АМЭ происходит вследствие образования аномальной хороидальной неоваскулярной сети (хороидальной неоваскуляризации, СNV) под нейроретиной. Заново образованные сосуды являются избыточно негерметичными. Это приводит к накоплению субретинальной жидкости и крови, приводящему к потере остроты зрения. Со временем происходит полная потеря функциональной сетчатки в области, вовлеченной в дегенерацию, так как образуется большой дискообразный рубец, охватывающий сосудистую оболочку глаза и сетчатку. В то время как пациенты с сухой АМЭ могут сохра

- 2 012799 нять зрение пониженного качества, влажная ΑΜΌ часто ведет к слепоте (Натб1 & Кеппеу, Аде-ге1а1еб Маси1аг бедепегайоп - а пе\у \зе\\рот1. РгопЕегк ίη Вюкшепсе, е305-314, Мау 2003). ΟΝΥ имеет место не только во влажной ΑΜΌ, но также в других глазных патологиях, таких как синдром глазного гистоплазмоза, ангиоидные полосы сетчатки, разрывы в базальной пластинке (оболочке Бруха), миопическая дегенерация, глазные опухоли и некоторые дегенеративные заболевания сетчатки.

Различные проведенные исследования определили несколько факторов риска для ΆΜΌ, таких как курение, старение, семейный анамнез (МШоп, Ат 1 ОрЫйа1то1 88, 269 (1979); М11сЬе11 е1 а1.: Ор11111а1то1оду 102, 1450-1460 (1995); 8тйй е1 а1.: ОрЫЪа1то1оду 108, 697-704 (2001)), пол (в 7 раз более высокий риск у женщин: К1еш е1 а1.: ОрЫЪа1то1оду 99, 933-943 (1992)) и раса (представители белой расы являются наиболее восприимчивыми). Дополнительные факторы риска могут включать характеристики глаз, такие как дальнозоркость (гиперметропия) и светлые глаза, также как сердечно-сосудистое заболевание и гипертензия. Было также документировано доказательство генетического участия в возникновении прогрессирования заболевания (см. Натб1 & Кеппеу выше).

Две компании, Асийу Рйагтасеийса1 и 81гпа Тйегареийск недавно зарегистрировали ΙΝΌ (1пби51па1 Ргорейу) относительно молекул δίΚΝΑ, ингибирующих УЕСР и УЕСР-Р1 (Р11-1) соответственно, для лечения ΑΜΌ. Эти молекулы обозначены Сапб5-ингибитором и 027-ингибитором соответственно.

Микрососудистые нарушения

Микрососудистые нарушения состоят из широкой группы состояний, которые прежде всего поражают микроскопические капилляры и лимфатические сосуды и, следовательно, находятся вне сферы прямого хирургического вмешательства. Микрососудистое заболевание может быть в широком смысле подразделено на вазоспастическое, васкулитное и лимфатическое окклюзивное заболевание. Кроме того, многие из известных сосудистых состояний имеют микрососудистый элемент.

Вазоспастическое заболевание. Вазоспастические заболевания являются группой обычных состояний, в которых по неизвестным причинам периферические вазоконстрикторные рефлексы являются гиперчувствительными. Это приводит к неуместной вазоконстрикции и ишемии тканей вплоть до потери ткани. Вазоспастические симптомы обычно связаны с температурой или с использованием вибрирующих аппаратов, но могут быть вторичными относительно других состояний.

Васкулитное заболевание. Васкулитные заболевания являются заболеваниями, которые участвуют в первичном воспалительном процессе в микроциркуляции. Васкулит является обычно компонентом аутоиммунного или связанного с соединительной тканью нарушения и обычно не поддается хирургическому лечению, а требует иммуносупрессивного лечения в случае наличия тяжелых симптомов.

Лимфатическое окклюзивное заболевание. Хроническое опухание нижней или верхней конечности (лимфатический отек) является результатом периферической лимфатической окклюзии. Это относительно редкое состояние, которое имеет большое количество причин, некоторые из них являются наследственными, некоторые являются приобретенными. Основными способами лечения являются правильно подобранные сжимающие предметы одежды и применение устройств с прерывистым сдавливанием.

Микрососудистые патологии, связанные с диабетом

Диабет является основной причиной слепоты, причиной номер один ампутаций и импотенции и одним из наиболее часто встречающихся хронических детских заболеваний. Диабет является также основной причиной почечного заболевания терминальной стадии в Соединенных Штатах с частотой распространенности 31% в сравнении с другими почечными заболеваниями. Диабет является также наиболее частым показанием для трансплантации почки, составляющим 22% всех операций по трансплантации.

Обычно диабетические осложнения могут в широком смысле классифицироваться как микрососудистые или макрососудистые заболевания. Микрососудистые осложнения включают невропатию (повреждения нервов), нефропатию (заболевание почек) и нарушения зрения (например, ретинопатию, глаукому, катаракту и корнеальное заболевание (заболевание роговицы)). В сетчатке, почетном клубочке и уака пегуогит подобные патофизиологические признаки характеризуют диабет-специфическое микрососудистое заболевание.

Микрососудистые патологии, ассоциированные с диабетом, определяют как заболевание самых малых кровеносных сосудов (капилляров), которое может иметь место, например, у людей, которые имели диабет в течение продолжительного времени. Стенки этих сосудов становятся ненормально толстыми, но слабыми. Таким образом, они кровоточат, теряют белок и замедляют кровоток по телу.

Клинические данные и данные на моделях животных показывают, что хроническая гипергликемия является центральным инициирующим фактором для всех типов диабетического микрососудистого заболевания. Продолжительность и величина гипергликемии в значительной степени коррелируют со степенью и скоростью прогрессирования диабетического микрососудистого заболевания. Хотя все диабетические клетки подвергаются действию повышенных уровней глюкозы в плазме, гипергликемическое повреждение ограничивается только теми типами клеток (например, эндотелиальными клетками), которые развивают внутриклеточную гипергликемию. Эндотелиальные клетки развивают внутриклеточную гипергликемию, так как в отличие от многих других клеток они не могут подавлять транспорт глюкозы при подвергании действию внеклеточной гипергликемии. То, что внутриклеточная гипергликемия является необходимой и достаточной для развития диабетической патологии, дополнительно демонстрируется

- 3 012799 фактом, что сверхэкспрессия транспортера глюкозы СЬИТ1 в мезангиальных клетках, культивируемых в среде с нормальной глюкозой, имитирует диабетический фенотип, индуцируя такие же увеличения в экспрессии генов коллагена типа IV, коллагена типа I и фибронектина, что и диабетическая гипергликемия.

Атипичная функция эндотелиальных клеток

На ранних стадиях сахарного диабета, до того как становятся очевидными структурные изменения, гипергликемия вызывает аномалии в кровообращении и сосудистой проницаемости в сетчатке, почечных клубочках и периферическом нерве уака иетуошт. Считают, что увеличение давления в кровотоке и внутрикапиллярного давления отражает индуцированное гипергликемией уменьшенное продуцирование оксида азота (N0) на эфферентной стороне капиллярного ложа и, возможно, увеличенную чувствительность к ангиотензину II. Как следствие увеличенного внутрикапиллярного давления и дисфункции эндотелиальных клеток капилляры сетчатки проявляют увеличенную утечку флуоресцеина, а гломерулярные капилляры имеют повышенную скорость экскреции альбумина (ЛЕВ). Сравнимые изменения имеют место в уака уакотит периферического нерва. На ранней стадии диабета увеличенная проницаемость является обратимой; однако по мере прогрессирования во времени она становится необратимой.

Увеличенное накопление белка в стенке сосудов

Общим патофизиологическим признаком диабетического микрососудистого заболевания является прогрессирующие сужение и постепенная окклюзия просветов сосудов, которое приводит к неадекватной перфузии и функции пораженных тканей. Ранняя индуцированная гипергликемией микрососудистая гипертензия и увеличенная сосудистая проницаемость способствуют необратимой окклюзии микрососудов посредством трех процессов:

первым процессом является аномальная утечка периодная кислота-Шифф (РА8)-положительных, углеводсодержащих белков плазмы, которые депонируются в стенке капилляров и которые могут стимулировать периваскулярные клетки, такие как перициты и мезангиальные клетки, для высвобождения факторов роста и внеклеточного матрикса;

вторым процессом является экстравазация факторов роста, таких как трансформирующий фактор роста β1 (ТОЕ-βΙ), который непосредственно стимулирует сверхпродукцию компонентов внеклеточного матрикса и может индуцировать апоптоз в некоторых связанных с осложнением типах клеток;

третьим процессом является индуцированная гипертензией стимуляция экспрессии патологического гена эндотелиальными клетками и поддерживающими клетками, которые кодируют транспортеры глюкозы д1и1-1, факторы роста, рецепторы факторов роста, компоненты внеклеточного матрикса и молекулы адгезии, которые активируют циркулирующие лейкоциты. С этой концепцией согласуется наблюдение, что одностороннее уменьшение тяжести диабетического микрососудистого заболевания имеет место на стороне со стенозом глазной или почечной артерии.

Потеря микрососудистых клеток и окклюзия сосудов

Прогрессирующие сужение и окклюзия просветов диабетических микрососудов сопровождаются также потерей микрососудистых клеток. В сетчатке сахарный диабет индуцирует запрограммированную гибель клеток Мюллера и клеток ганглиев, перицитов и эндотелиальных клеток. В почечном клубочке снижение функции почек ассоциируется с широко распространившейся окклюзией капилляров и потерей подоцитов, но механизмы, лежащие в основе потери гломерулярных клеток, еще не известны. В уака пегуотит имеет место дегенерация эндотелиальных клеток и перицитов, и эти микрососудистые изменения, по-видимому, предшествуют развитию диабетической периферической невропатии. Многоочаговое распределение, дегенерации аксонов при диабете подтверждает причинную роль микрососудистой окклюзии, но индуцированные гипергликемией уменьшения нейротрофинов могут способствовать предотвращению нормальной репарации и регенерации аксонов.

Другой обычный признак диабетического микрососудистого заболевания был назван гипергликемической памятью или персистенцией или прогрессированием индуцированных гипергликемией микрососудистых изменений во время последующих периодов нормального гомеостаза глюкозы. Наиболее ярким примером этого феномена является развитие тяжелой ретинопатии в гистологически нормальных глазах диабетических собак, которое встречается полностью во время периода 2,5 лет нормализованной глюкозы крови, за которым следует период 2,5 лет гипергликемии. Индуцированные гипергликемией увеличения транскрипции выбранных генов матрикса также сохраняются в течение недель после восстановления нормогликемии ίη νίνο, и менее выраженное, но количественно сходное пролонгирование индуцированного гипергликемией увеличения транскрипции выбранных генов матрикса происходит в культивируемых эндотелиальных клетках.

В отношении дополнительной информации см. 8йатеб ра11юр11укю1ощс ГеаШгек οί т^с^ονакси1а^ сотрйсайопк оГ ШаЬеЮк (Ьагкеп: ХУПКатк ТехФоок оГ Епбостшо1о§у, 10^4Ь еб., СоругщЫ ©2003 Е1ке\зег).

Микрососудистые осложнения встречаются не только в явном диабете, но также вследствие нарушенной толерантности к глюкозе (ЮТ). Микрососудистые осложнения ЮТ: невропатия, ретинопатия и почечная микропротеинурия.

- 4 012799

Диабетическая невропатия

Диабетические невропатии являются невропатическими нарушениями (повреждением периферических нервов), которые ассоциированы с сахарным диабетом. Эти состояния обычно происходят из диабетического микрососудистого повреждения, включающего малые кровеносные сосуды, которые обеспечивают кровоснабжение нервов (газа петуотит). Относительно обычные состояния, которые могут быть ассоциированы в диабетической невропатией, включают паралич третьего нерва; мононевропатию; множественную мононевропатию; диабетическую амиотрофию; болезненную полиневропатию; автономную невропатию и торако-абдоминальную невропатию и наиболее обычную форму, периферическую невропатию, которая поражает в основном стопы и ноги. В развитии диабетической невропатии участвуют четыре фактора: микрососудистое заболевание, продвинутые гликозилированные конечные продукты, протеинкиназа С и путь полиолов.

Микрососудистое заболевание в диабетической невропатии

Сосудистые и невральные заболевания являются тесно связанными и переплетенными друг с другом. Кровеносные сосуды зависят от нормальной функции нервов, а нервы зависят от достаточного кровоснабжения. Первым патологическим изменением в микрососудистой сети является вазоконстрикция (сужение кровеносных сосудов). По мере прогрессирования заболевания дисфункция нервных клеток тесно коррелирует с развитием сосудистых патологий, таких как утолщение базальной мембраны капилляров и гиперплазия эндотелия, которые способствуют уменьшению кислородного потенциала и гипоксии. Нейронная ишемия является хорошо установленной характеристикой диабетической невропатии. Сосудорасширяющие агенты (вазодилататоры) (например, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, альфа 1-антагонисты) могут приводить к существенным улучшениям в кровоснабжении нервных клеток, с соответствующими улучшениями скорости проводимости нервов. Таким образом, микрососудистая дисфункция происходит в ранней стадии диабета, следует параллельно с прогрессированием нейронной дисфункции и может быть достаточной для поддержания тяжести структурных, функциональных и клинических изменений, наблюдаемых в диабетической невропатии. Периферическая невропатия (ноги), сенсорно-двигательная невропатия является существенным компонентом в патогенезе язв ног в диабете.

Невропатия является обычным осложнением диабета, встречающимся со временем у более половины пациентов с диабетом типа 2. Исследования проводимости нервов демонстрируют, что невропатия уже присутствует у 10-18% пациентов на момент диагностики диабета, что предполагает, что повреждение периферического нерва происходит на ранних стадиях заболевания и с более слабым нарушением гликемической регуляции. Концепция, что невропатия является ранним клиническим признаком диабета, была предложена >40 лет назад, и большинство исследований сообщают связь между ЮТ и невропатией. Большинство пациентов с ЮТ и ассоциированной невропатией имеют симметричную дистальную сенсорную полиневропатию с сильно выраженной невропатической болью. ЮТ-невропатия (М1сгоуазси1аг сотрНеаНоиз о£ ппрайеб д1исозе 1о1етаисе - Ретзресйуез ίη Э|аЬе1ез. 1. КоЫпзоп 8шд1е1оп, ίη Э1аЬе1ез ЭесетЬет 1, 2003) является фенотипически сходной с ранней диабетической невропатией, которая также вызывает сенсорные симптомы, в том числе боль, и автономную дисфункцию. В исследовании 669 пациентов с ранней диабетической невропатией сенсорные симптомы присутствовали у >60%, импотенция почти у 40% и другое автономное участие у 33%, но доказательство двигательного участия наблюдали только у 12%. Эти клинические результаты предполагают раннее участие малых немиелинированных нервных волокон, которые приносят боль, температуру, и автономные сигналы. Прямое количественное определение немиелинированных интраэпидермальных нервных волокон из кожных биопсий показывает сходную потерю волокон и измененную морфологию у пациентов с невропатией, ассоциированной с ЮТ и ранним диабетом.

Автономная дисфункция, в частности эректильная дисфункция, и измененная сердечная вагусная реакция являются ранними признаками невропатического повреждения при диабете. Исследование с пациентами с ЮТ также предполагает преобладающую вагусную вегетативную дистонию: отдельные исследования обнаружили восстановление атипичной частоты сердечных сокращений после физической нагрузки, вариабельность отношения затупленного К-К интервала к глубокому дыханию и уменьшенное отношение выдоха к вдоху (все критерии вагусной вегетативной дистонии) в большей части пациентов с ЮТ, чем в нормогликемических контрольных субъектах того же самого возраста.

Повреждение нервов при диабете поражает двигательные, сенсорные и автономные волокна. Двигательная невропатия вызывает мьшечную слабость, атрофию и парез. Сенсорная невропатия приводит к потере защитных ощущений боли, давления и нагревания. Отсутствие боли приводит ко многим проблемам в нечувствительности стоп, в том числе образованию язв, неощутимой травмы и нейрогенной артропатии (сустава Шарко). Пациент может не стремиться к лечению до тех пор, пока рана не станет запущенной. Комбинация сенсорной и двигательной дисфункции может заставить пациента подвергать стопу атипичному стрессу, приводящему к травме, которая может приводить к инфекции. Автономная симпатическая невропатия вызывает вазодилатацию и уменьшенное потоотделение, которое приводит к теплым, чрезмерно сухим стопам, которые особенно склонны к кожным разрывам, а также функциональным изменением в микрососудистом кровоснабжении. Автономная дисфункция (и дегенерация кожных

- 5 012799 структур) также приводит к потере целостности кожи, которая обеспечивает идеальное место для микробной инвазии. Невропатическая стопа не изъязвляется спонтанно; скорее она является комбинацией некоторой формы травмы, сопровождающейся невропатией.

Микрососудистая дисфункция встречается на ранней стадии диабета, следует параллельно с прогрессированием нервной дисфункции и может быть достаточной для поддержания тяжести структурных, функциональных и клинических изменений, наблюдаемых при диабетической невропатии.

Продвинутые гликозилированные конечные продукты - повышенные внутриклеточные уровни глюкозы вызывают неферментативное ковалентное связывание связей с белками, которое изменяет их структуру, и разрушает их функцию. Предполагается, что некоторые из этих гликозилированных белков участвуют в патологии диабетической невропатии и других долгосрочных осложнениях диабета.

Протеинкиназа С (РКС) - РКС участвует в патологии диабетической невропатии. Увеличенные уровни глюкозы вызывают увеличение внутриклеточного диацилглицерина, который активирует РКС. Ингибиторы РКС в моделях животных будут увеличивать скорость проводимости нервов увеличением нейронного кровоснабжения.

Сенсорно-двигательная полиневропатия

Более длинные нервные волокна поражаются в большей степени, чем более короткие, так как скорость проводимости нервов замедляется пропорционально длине нерва. В этом синдроме пониженное ощущение и потеря рефлексов происходит сначала в кончиках пальцев билатерально, затем простирается вверх. Это обычно описывается как перчаточно-чулочное распределение онемение, потеря чувствительности, дизестезия и ночная боль. Эта боль может ощущаться как жжение, чувство покалывания, тупая боль или ноющая боль. Чувство покалывания и иголок является обычным. Потеря проприоцепции, т.е. ощущения, где находится в пространстве конечность, проявляется в ранней стадии. Эти пациенты не могут чувствовать, когда они наступают на чужеродное тело, например на щепку, или когда возникает мозоль от плохо подходящих туфель. Вследствие этого они находятся при риске развития язв и инфекций на стопах и ногах, которые могут приводить к ампутации. Подобным образом эти пациенты могут получить многочисленные переломы колена, лодыжки или стопы и развить сустав Шарко. Потеря двигательной функции приводит к изогнутой назад контрактуре пальцев стопы, так называемым молоткообразным пальцам стопы. Эти контрактуры встречаются не только в стопе, но также и в кисти руки.

Автономная невропатия

Автономная нервная система состоит из нервов, обслуживающих сердце, желудочно-кишечный тракт (01) и мочевую систему. Автономная невропатия может поражать любую из систем этих органов. Наиболее часто диагностируемой автономной дисфункцией при диабете является ортостатическая гипотензия или неприятное ощущение головокружения при вставании у пациента. В случае диабетической автономной невропатии это является следствием неспособности сердца и артерий должным образом корректировать частоту сердечных сокращений и сосудистый тонус для сохранения непрерывного и полного протекания крови к головному мозгу. Этот симптом обычно сопровождается потерей синусного респираторного изменения, т.е. обычного изменения частоты сердечных сокращений, наблюдаемого при нормальном дыхании. Когда присутствуют эти два явления, присутствует сердечная автономная невропатия.

Проявления желудочно-кишечного тракта включают задержанное опорожнение желудка, гастропарез, тошноту, метеоризм и диарею. Поскольку многие диабетики принимают пероральное лекарственное средство от диабета, на абсорбцию этих лекарственных средств в сильной степени влияет опорожнение желудка. Это может приводить к гипогликемии, когда пероральный диабетический агент принимается перед едой и не всасывается до нескольких часов или иногда нескольких дней, когда уже имеется нормальный или низкий сахар в крови. Вялое движение тонкой кишки может вызывать избыточный бактериальный рост, ухудшаемый присутствием гипергликемии. Это приводит к метеоризму, газам и диарее.

Симптомы мочеиспускания включают частоту мочеиспускания, острые позывы к мочеиспусканию, недержание и задержку мочи. В этом случае также вследствие задержки сладкой мочи частыми являются инфекции мочевых путей. Задержка мочи может приводить к дивертикулам мочевого пузыря, камням, рефлюкс-нефропатии.

Краниальная невропатия

При поражении краниальных (черепных) нервов наиболее частыми являются глазодвигательные невропатии (3-его нерва). Глазодвигательный нерв контролирует все мышцы, которые участвуют в движениях глаза, за исключением латеральной прямой и верхней косой мышц. Он служит также для сужения зрачка и поднятия верхнего века. Возникновение диабетического паралича третьего нерва является обычно внезапным, начинающимся с лобной или расположенной вокруг глазницы боли с последующей диплопией. Могут быть поражены все глазодвигательные мышцы, иннервируемые третьим нервом, за исключением тех, которые контролируют размер зрачка. Шестой нерв, отводящий нерв, который иннервирует латеральную прямую мышцу глаза (перемещает глаз латерально), также часто поражается, но участие четвертого нерва, блокового нерва, (который иннервирует переднюю косую мышцу, которая перемещает глаз вниз) является нечастым. Мононевропатии грудных или поясничных нервов могут встречаться и приводить к болезненным синдромам, которые имитируют инфаркт миокарда, холецистит

- 6 012799 или аппендицит. Диабетики имеют более высокую встречаемость туннельных невропатий, например запястного синдрома.

Диабетическая ишемия конечностей и диабетические язвы стоп

Диабет и сдавливание могут нарушать микрососудистую циркуляцию и приводить к изменениям в коже на нижних конечностях, которые в свою очередь могут приводить к образованию язв и последующей инфекции. Микрососудистые изменения приводят к микроангиопатии мышц конечностей, а также к предрасположенности к развитию периферической ишемии и уменьшенной компенсаторной реакции ангиогенеза на ишемические события. Микрососудистая патология обостряет заболевание периферических сосудов (РУО) (или заболевание периферических артерий (ΡΑΌ) или артериальное заболевание нижних конечностей (ЬЕАО) - МАКРОсосудистое осложнение - сужение артерий в ногах вследствие атеросклероза. РУО встречается на более ранней стадии диабета, является более тяжелым и широкораспространенным и часто включает интеркуррентные микроциркуляторные проблемы, поражающие ноги, глаза и почки.

Язвы и гангрена ног являются частыми сопутствующими состояниями ΡΑΌ. Одновременная периферическая невропатия с нарушенной чувствительностью делает стопы восприимчивыми к травме, образованию язв и инфекции. Прогрессирование ΡΑΌ при диабете смешивается с таким сопутствующим патологическим процессом, как периферическая невропатия и нечувствительность стоп и нижних конечностей к боли и травме. С ухудшенной циркуляцией и ухудшенной чувствительностью происходит образование язв и инфекция. Прогрессирование до остеомиелита и гангрены может привести к необходимости ампутации.

Лица с диабетом имеют в 25 раз большую вероятность, чем лица без диабета, быть подвергнутыми ампутации нижней конечности, что усиливает необходимость предотвращения язв стоп и последующей потери конечностей.

Диабетические язвы стоп могут встречаться не только вместе с ΡΑΌ, но могут быть также связаны с невропатией, венозной недостаточностью (варикозными венами), травмой и инфекцией. ΡΑΌ способствует этим другим состояниям в продуцировании или ускорении язв стоп. Язвы стоп необязательно представляют прогрессирование ΡΑΌ, так как они могут иметь место в присутствии адекватной клинической периферической артериальной перфузии. Исследования на пациентах показывают увеличенный риск образования язв стоп у пациентов с диабетом, которые имели периферическую невропатию и сильное сдавливание подошвы стопы. Частота случаев язв или поражений на стопе или лодыжках была равна 15% от всех пациентов с диабетом в исследовании на основе популяции в южном Висконсине. Эта частота случаев была более высокой для индивидуумов с диабетом, диагностированных в возрасте менее 30 лет, была слегка более высокой у мужчин (16%), чем у женщин (13%), и была более высокой у получавших инсулин пациентах с диабетом (17%), чем у пациентов, не принимавших инсулин (10%). Частота случаев увеличивалась с возрастом, особенно у пациентов с диабетом, диагностированных в возрасте менее 30 лет. В исследованиях пациентов из Европы частота случаев язв стоп у пациентов с диабетом была 3% в возрасте пациентов <50 лет, 7% в возрасте <60 лет и 14% в возрасте <80 лет. Частота случаев была большей у мужчин, чем у женщин, в возрасте 70 лет.

У пациентов с диабетом ишемия и инфекция стоп являются более серьезными и даже угрожающими жизни явлениями; однако, для лечения наиболее трудным состоянием является невропатия. Медицинская и хирургическая литература, относящаяся ко всем аспектам клинических и патологических проявлений диабетической стопы, имеется в несметном количестве. Невропатия, ангиопатия, ретинопатия и нефропатия, по отдельности или в комбинации и в различных степенях тяжести могут влиять на лечение диабетических стоп.

Каждый год выполняются 82000 ампутаций конечностей у пациентов с сахарным диабетом. Большинство этих ампутаций выполняются в популяции пожилых людей. Ампутации, являющиеся следствием диабета, могут возникать из множественных этиологии, включающих язвы стоп, ишемию, венозные язвы ног (т.е. язвы, вторичные относительно венозного рефлюкса) и язвы пяток (т.е. язвы, происходящие из неизлеченных пролежней в пятке). Большинство этих ампутаций происходят из образования язв. Распространенность язв стоп среди пациентов с диабетом составляет 12%. Кроме того, 20-летняя кумулятивная распространенность язв нижних конечностей у пациентов с диабетом типа 1 составляет 9,9%. Индуцированные диабетом ампутации конечностей приводят к 5-летнему коэффициенту смертности 3968% и связаны с увеличенным риском дополнительных ампутаций. Продолжительность нахождения в больнице является приблизительно на 60% более длительной среди пациентов с диабетическими язвами стоп в сравнении с пациентами без язв.

Диабетическая невропатия нарушает рефлекс аксонов нейронов, который зависит от функции здорового ноцицептора (болевого рецептора) С-волокон, и вызывает локальную вазодилатацию в ответ на болевой стимул. Это состояние дополнительно ухудшает вазодилататорную реакцию, присутствующую в состояниях стресса, таких как повреждение или воспаление, в диабетической невропатической стопе. Это ухудшение может частично объяснять, почему некоторые язвы в диабетической невропатической стопе либо заживают медленно, либо не заживают вообще, несмотря на успешную реваскуляризацию нижних конечностей.

- 7 012799

Таким образом, наиболее обычный причинный путь для образования диабетических язв стоп может быть идентифицирован как комбинация невропатии (потери чувствительности), деформации (например, сильно выступающих метатарзальных (плюсневых) выступов) и травмы (например, из-за неподходящей обуви).

Большинство хирургов предпочитают выполнять подколенное или тибиальное артериальное шунтирование вследствие худших коэффициентов выживаемости и проходимости сосудов в сравнении с более проксимальными процедурами. Сообщалось, что, если подколенное или тибиальное артериальное шунтирование неспособно восстановить пальпируемый пульс стопы, ножное (относящееся к стопе) шунтирование обеспечивает более надежную и эффективную процедуру спасения конечности для пациентов с диабетом и ишемическими ранами стоп. Даже экстенсивное многосегментное заболевание у пациентов с диабетом не является препятствием для спасения стопы. В то время как серьезные раневые осложнения могут иметь гибельные результаты, они являются нечастыми после трансплантации обходного сосудистого ножного шунта (шунтирования стопы). Было показано, что подходящий контроль предсуществующей инфекции стопы и осторожной туннелизации трансплантата является эффективным в избежании дополнительных осложнений. Ангиопластика в нижней конечности становится более прогрессивно используемой. Однако следует обратить внимание на то, что для того, чтобы ангиопластика была эффективной, должен быть доступным дистальный сосуд или питающий сосуд, если должна быть получена более проксимальная ангиопластика.

Хотя диабетические язвы/патологии конечностей могут быть излечены у некоторых пациентов (посредством санации раны, обработки антибиотиками, использованием препаратов для стимуляции грануляционной ткани (нового коллагена и ангиогенеза) и уменьшения бактериальной нагрузки в ране), было бы предпочтительно иметь фармацевтическую композицию, которая могла бы лучше лечить эти состояния и/или уменьшать эти симптомы.

В отношении дополнительной информации, см. Ашепсаи 1оитпа1 о£ Зигдегу, Уо1ите 187, ЫитЬет 5 8ирр1 1, Мау 1, 2004, СорупДи © 2004 Е1кеу1ет.

Коронарная микрососудистая дисфункция в диабете

Корреляция между гистопатологией и микроциркуляторной дисфункцией при диабете хорошо известна из старых экспериментальных исследований и из аутопсии, где часто обнаруживают утолщение базальной мембраны, периваскулярный фиброз, разрежение сосудов и капиллярное кровоизлияние. Подтверждение этих данных ίη у1уо остается затруднительным, хотя недавняя статья продемонстрировала корреляцию между патологией и глазной микрососудистой дисфункцией (Ат 1 Рйукю1. 2003; 285). Однако большое количество клинических исследований показывают, что не только явный диабет, но также нарушенный метаболический контроль может влиять на коронарную микроциркуляцию. (Нурей Век 2002; 25: 893). Вернер ссылался на важную статью ЗатЬисей е1 а1 (С1тси1а1юп 2001; 104:1129), показывающую персистенцию микрососудистой дисфункции у пациентов после успешного повторного открывания связанной с инфарктом артерии, которая может объяснить увеличенную сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность этих пациентов. Имеется накапливающееся доказательство из больших исследований острой реперфузии, что заболеваемость и смертность не связаны с самим повторным открыванием связанной с инфарктом артерии, но гораздо больше зависят от ΤΙΜΙ-потока (лизиса тромбов при инфаркте миокарда) +/- миокардиального прилива (81опе 2002; Ре1бтапп С1тси1а1юп 2003). Неггтапп показал, среди прочих, что целостность коронарной микроциркуляции является, возможно, наиболее важным и прогностическим фактором в этом контексте (СйсиИйоп 2001). Нейтральное действие защитных устройств (нет релевантного изменения для ΤΙΜΙ-потока, для разрешения ЗТ или для МАСЕ) может указывать на то, что функциональное нарушение микроциркуляции является главной детерминантой прогноза. Имеется также увеличивающееся доказательство того, что коронарная микрососудистая дисфункция играет главную роль в необструктивной С АО. Коронарная эндотелиальная дисфункция остается сильным прогностическим показателем в этих пациентах.

Диабетическая нефропатия (почечная дисфункция у пациентов с диабетом)

Диабетическая нефропатия включает микроальбуминурию (эффект микрососудистого заболевания), протеинурию и Е8ВО. Диабет является наиболее частой причиной почечной недостаточности, являясь ответственным за более чем 40% новых случаев. Даже когда лекарственные средства и диета могут контролировать диабет, это заболевание может приводить к нефропатии и почечной недостаточности. Большинство людей с диабетом не развивают нефропатию, которая является достаточно серьезной, чтобы вызывать почечную недостаточность.

Приблизительно 16 миллионов людей в Соединенных Штатах имеют диабет и приблизительно 10000 людей имеют почечную недостаточность как следствие диабета.

Диабетическая ретинопатия

В диабетическом состоянии гипергликемия приводит к пониженному кровотоку сетчатки, гиперпроницаемости сетчатки, задержкам проводимости нерва фоторецептора и гибели нервных клеток сетчатки. В диабете с короткой продолжительностью была идентифицирована гибель нервных клеток во внутреннем ядерном слое сетчатки. Конкретно, апоптоз был локализован в глиальных клетках, таких как клетки Мюллера и астроциты, и было показано, что он происходит в пределах 1 месяца диабета в модели

- 8 012799 δΤΖ-индуцированных диабетических крыс. Причина этих событий является многофакторный, включающий активацию пути диацилглицерин/РКС, окислительный стресс и неферментативное гликозилирование. Комбинация этих событий делает сетчатку гипоксической и, в конечном счете, приводит к развитию диабетической ретинопатии. Одной из возможных связей между ретинальной ишемией и ранними изменениями в диабетической сетчатке является индуцированное гипоксией продуцирование факторов роста, таких как УЕСР. В качестве главного регулятора этой гипоксической реакции был идентифицирован индуцируемый гипоксией фактор-1 (Н1Р-1), контролирующий гены, которые регулируют клеточную пролиферацию и ангиогенез. Предыдущие исследования продемонстрировали, что ингибирование убиквитинирования Н1Р-1 приводит к связыванию с отвечающими на гипоксию элементами (НЕЕ) и продуцированию мРНК УЕСР.

Диабетическая ретинопатия определяется как прогрессирующая дисфункция сосудистой сети сетчатки, вызываемая хронической гипергликемией. Ключевые признаки диабетической ретинопатии включают микроаневризмы, кровоизлияния сетчатки, липидные экссудаты сетчатки, пятна типа «ватных комочков», отсутствие капиллярного кровоснабжения, отек желтого пятна и неоваскуляризацию. Ассоциированные признаки включают кровоизлияние стекловидного тела, отслоение сетчатки, неоваскулярную глаукому, преждевременную катаракту и параличи черепных нервов.

В Соединенных Штатах имеются 16 миллионов людей с диабетом типа 1 и типа 2. В пределах 15 лет у 80% пациентов с диабетом Типа 1 развилась диабетическая ретинопатия, тогда как у 84% пациентов с диабетом типа 2 развилась ретинопатия в пределах 19 лет. Эти цифры создают значительный рынок для терапевтических агентов, нацеленных на глазные заболевания с неоваскуляризацией. Развитие диабетической ретинопатии зависит от времени. Несмотря на оптимальный контроль сахара крови можно ожидать, что у пациентов с продолжительным заболеванием со временем разовьется некоторая форма ретинопатии. Ναΐίοηαΐ 8ос1е(у 1о РгсусШ В11и61е88 приближенно определило, что 4-6 миллионов диабетиков в США имеют диабетическую ретинопатию. Определенная приближенно ежегодная встречаемость новых случаев пролиферативной диабетической ретинопатии и диабетического отека желтого пятна равна 65000 и 75000, соответственно, с частотой случаев 700000 и 500000, соответственно. Диабетическая ретинопатия вызывает 12000-24000 новых случаев слепоты в США ежегодно. Ретинопатию лечат хирургическими способами, эффективными в снижении тяжелой потери зрения, но обработанные лазерами части сетчатки являются необратимо разрушенными. Лечение лекарственными средствами является недоступным.

Микрососудистое заболевание, которое первично поражает капилляры, сахарный диабет поражает глаз разрушением сосудистой сети в конъюнктиве, сетчатке и центральной нервной системе. Пациенты могут иметь в анамнезе давнишнюю инъецированную бульбарную конъюнктиву вместе с системными жалобами на потерю массы, несмотря на более чем нормальный аппетит (полиплазию), атипичную жажду (полидипсию) и патологически частое мочеиспускание (полиурию).

Колебания остроты зрения, вторичные относительно нестабильного сахара крови, являются обычным глазным симптомом. Опухание в хрусталике приводит к большим неожиданным сдвигам в дифракции, а также преждевременному образованию катаркты. Изменения остроты зрения будет зависеть от тяжести и стадии этого заболевания.

В сетчатке ослабление артериол и капилляров может приводить к характерному появлению интраретинальных кровоизлияний в виде точек и пятен, экссудатов, интраретинальных микрососудистых аномалий (ΙΚΜΑ), микроаневризм, отека и повреждений типа «ватных комочков». Пролиферативная диабетическая ретинопатия является результатом тяжелого сосудистого нарушения и видна в виде неоваскуляризации диска (ИУЭ) зрительного нерва, неоваскуляризации в другом месте (ΝΥΕ) и неоваскуляризации радужки (Ννΐ или диабетического покраснения радужки). Неврологические осложнения включают параличи третьего, четвертого и шестого черепных нервов, а также диабетический папиллит (воспаление диска зрительного нерва) и паралич лицевого нерва.

Сахарный диабет является генетически обусловленной группой заболеваний, которые имеют общую непереносимость глюкозы. Он характеризуется как нарушение метаболической регуляции в результате недостаточности или нарушения функции инсулина или недостаточности или нарушения функции клеточных рецепторов инсулина.

Биохимия, включающая образование сорбита, играет роль в деструкции перицитов, которые представляют собой клетки, которые поддерживают эндотелий сосудов. Когда эти поддерживающие перициты погибают, эндотелий капилляров становится ухудшенным, что приводит к утечке крови, белка и липидов из сосудов. Это в комбинации со сгущенной, загруженной глюкозой кровью, создает сосудистую недостаточность, отсутствие перфузии капилляров, ретинальную гипоксию, измененную структуру и пониженную функцию. Образование и высвобождение вазопролиферативных факторов, которые играют роль в генезе ретинальной неоваскуляризации, является слабо понимаемым.

Большинство не угрожающих зрению осложнений диабета разрешаются спонтанно на протяжении нескольких недель - месяцев после лекарственного лечения. В случаях, когда имеются большие относящиеся к рефракции изменения, пациенты могут нуждаться во временном прописывании очков до тех пор, пока рефракция не стабилизируется. Когда ретинопатия угрожает желтому пятну или когда проли

- 9 012799 ферируют новые кровеносные сосуды, пациент может быть направлен на лазерную фотокоагуляцию. Исследование диабетической ретинопатии (ΌΚ8) убедительно доказало, что панретинальная фотокоагуляция была успешной в уменьшении риска тяжелой потери зрения в пациентах с высоким риском. Оно определило характеристики высокого риска следующим образом: (1) неоваскуляризация (образование новых сосудов) оптического диска (ΝνΌ) в размере одной четверти - одной трети диаметра оптического диска и (2) неоваскуляризация в другом месте (ΝΥΕ) с любым кровоизлиянием стекловидного тела.

Диабетический отек желтого пятна (ΌΜΕ)

ΌΜΕ является осложнением диабетической ретинопатии, заболеванием, поражающим кровеносные сосуды сетчатки. Диабетическая ретинопатия приводит к множественным патологиям в сетчатке, в том числе утолщению и отеку сетчатки, кровоизлияниям, затрудненному кровотоку, избыточному подтеканию жидкости из кровеносных сосудов и, в конечных стадиях, к атипичному росту кровеносных сосудов. Этот рост кровеносных сосудов может приводить к большим кровоизлияниям и тяжелому повреждению сетчатки. Когда подтекание кровеносных сосудов диабетической ретинопатии вызывает отек в желтом пятне, его называют ΌΜΕ. Основным симптомом ΌΜΕ является потеря центрального зрения. Факторы риска, ассоциированные с ΌΜΕ, включают слабо контролируемые уровни глюкозы крови, высокое кровяное давление, атипичную функцию почек, вызывающую задержку жидкости, высокие уровни холестерина и другие обычные системные факторы.

Согласно Всемирной Организации Здравоохранения диабетическая ретинопатия является главной причиной слепоты у взрослых людей работающего возраста и главной причиной потери зрения у диабетиков. Атепсап Э|аЬс1с5 ΛδδοοίαΙίοη сообщает, что имеется приблизительно 18 миллионов диабетиков в Соединенных Штатах и приблизительно 1,3 миллиона вновь диагностируемых случаев диабета в Соединенных Штатах каждый год. РгеуегИ Вйпбпекк Лтепса и 111е Ναΐίοηαΐ Εуе 1п81йи1е оценивают приближенно, что в Соединенных Штатах имеются более 5,3 миллионов людей в возрасте 18 лет или более с диабетической ретинопатией, в том числе приблизительно 50000 с ΌΜΕ. СЭС оценивает, что ежегодно имеются приблизительно 75000 новых случаев ΌΜΕ в Соединенных Штатах.

Дополнительные невропатии

Кроме диабета обычными причинами невропатии являются инфекция опоясывающего герпеса, хроническая или острая травма (в том числе после хирургии) и различные нейротоксины. Невропатическая боль является обычной в случае рака как прямое действие рака на периферические нервы (например, сдавливание опухолью) и в качестве побочного действия многих химиотерапевтических лекарственных средств.

Микрососудистое заболевание - сосудистые и невральные заболевания являются тесно связанными и переплетенными. Кровеносные сосуды зависят от нормальной функции нервов, а нервы зависят от достаточного кровоснабжения. Первым патологическим изменением в микрососудистой сети является вазоконстрикция. По мере прогрессирования заболевания дисфункция нервных клеток тесно коррелирует с развитием сосудистых патологий, таких как утолщение базальной мембраны капилляров и гиперплазия эндотелия, которые способствуют уменьшению кислородного потенциала и гипоксии.

Сосудорасширяющие агенты (вазодилататоры) (например, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, альфа1-антагонисты) могут приводить к существенным улучшениям в кровоснабжении нервных клеток с соответствующими улучшениями скорости проводимости нервов.

Клинические проявления

Невропатия поражает все периферические нервы: болевые волокна, двигательные нейроны, автономные нервы. Таким образом, она может необязательно поражать все органы и системы, так как все они иннервированы. Имеются несколько отдельных синдромов, основанных на пораженных системах органов и членах, но они ни в коем случае не являются исключительными. Пациент может иметь сенсорнодвигательную и автономную невропатию или любую другую комбинацию.

Несмотря на успехи в понимании метаболических причин невропатии, лечения, нацеленные на прерывание этих патологических процессов, ограничивались побочными эффектами и отсутствием эффективности. Таким образом, способы лечения являются симптоматическими и не направлены на лежащие в основе невропатии проблемы. Агенты для боли, вызываемой сенсорно-двигательной невропатией, включают трициклические антидепрессанты (ТСА), ингибиторы обратного захвата серотонина (88К1) и антиэпилептические лекарственные средства (ΑΕΌ). Ни один из этих агентов не обращает патологические процессы, приводящие к диабетической невропатии, и ни один из них не изменяет непреклонно ход этого заболевания. Таким образом, было бы полезно иметь фармацевтическую композицию, которая могла бы лучшим образом лечить эти состояния и/или уменьшать эти симптомы.

Дополнительные ретинопатии

Ретинальная микроваскулопатия (ретинопатия СПИДа)

Ретинальная микроваскулопатия наблюдается в 100% пациентов со СПИДом. Она характеризуется интраретинальными кровоизлияниями, микроаневризмами, пятнами Рота, пятнами типа «ватных комочков» (микроповреждений слоя нервных волокон) и образованием периваскулярной оболочки. Этиология этой ретинопатии неизвестна, хотя предполагали, что она обусловлена циркулирующими иммунными комплексами, локальным высвобождением цитотоксических веществ, аномальной гемореологией и

- 10 012799

ВИЧ-инфекцией эндотелиальных клеток. Ретинопатия СПИДа является в настоящее время настолько обычной, что пятна типа «ватных комочков» у пациента без диабета или гипертензии, но при риске в отношении ВИЧ должны побудить врача провести вирусное тестирование. Специфического лечения ретинопатии СПИДа не существует, но ее продолжающееся присутствие может побудить врача к повторному испытанию эффективности ВИЧ-терапии и получению согласия на это пациента.

Ретинопатия трансплантации костного мозга (ВМТ)

О ретинопатии трансплантации костного мозга впервые сообщалось в 1983 году. Она обычно возникает в пределах шести месяцев, но может иметь место так поздно, как при 62 месяцах после ВМТ. Факторы риска, такие как диабет и гипертензия, могут облегчать развитие ретинопатии ВМТ повышением ишемической микроваскулопатии. Не существует возрастной, половой или расовой предрасположенности в отношении развития ретинопатии ВМТ. Пациенты обнаруживают уменьшенную остроту зрения и/или недостаточность поля зрения. Показатели задних сегментов являются обычно билатеральными и симметричными. Клинические проявления включают множественные пятна типа «ватных комочков», телеангиэктазию, микроаневризмы, отек желтого пятна, твердые экссудаты и кровоизлияния сетчатки. Ангиография с флуоресцеином демонстрирует отсутствие перфузии и подтекание капилляров, интраретинальные микрососудистые отклонения от нормы, микроаневризмы и отек желтого пятна. Хотя точная этиология ретинопатии ВМТ не была выяснена, на нее, по-видимому, действуют несколько факторов: токсичность циклоспорина, облучение всего тела (ΤΒΙ) и химиотерапевтические агенты. Циклоспорин является сильным иммуномодулирующим агентом, который подавляет иммунную реакцию трансплантат против хозяина. Это может приводить к повреждению эндотелиальных клеток и неврологическим побочным действиям, и вследствие этого было сделано предположение, что это может быть причиной ретинопатии ВМТ. Однако ретинопатия ВМТ может развиваться в отсутствие применения циклоспорина, и не было показано, что циклоспорин вызывает ретинопатию ВМТ в аутологичных или сингенных реципиентах костного мозга. Таким образом, циклоспорин, по-видимому, не является единственной причиной ретинопатии ВМТ. Предполагалось также, что облучение всего тела (ΤΒΙ) является причиной ретинопатии ВМТ. Облучение повреждает микроваскулатуру (микроциркуляторную часть сосудистого русла) и приводит к ишемической васкулопатии. Такие переменные, как общая доза облучения и временной интервал между облучением и иссечением костного мозга, являются, по-видимому, важными. Однако ретинопатия ВМТ может встречаться у пациентов, которые не получали ΤΒΙ, и ретинопатию ВМТ не наблюдают у реципиентов трансплантатов солидных органов, которые получали сходные дозы облучения. Таким образом, ΤΒΙ не является единственной причиной, но является другим фактором, способствующим развитию ретинопатии ВМТ. Предполагалось, что химиотерапевтические агенты являются потенциальным фактором, способствующим развитию ретинопатии ВМТ. Лекарственные средства, такие как цисплатин, кармустин и циклофосфамид, могут вызывать глазные побочные действия, в том числе отек диска зрительного нерва, ретробульбарный неврит, недостаточность поля зрения и корковую слепоту. Было сделано предположение, что эти химиотерапевтические лекарственные средства могут предрасполагать пациентов к индуцированным облучением ретинальным повреждениям и усиливать вредное действие облучения. Обычно, пациенты с ретинопатией ВМТ имеют хороший прогноз. Эта ретинопатия обычно устраняется в пределах двух-четырех месяцев после прекращения приема или понижения дозы циклоспорина. В одном сообщении 69% пациентов испытывали полное устранение ретинальных показателей и 46% пациентов полностью восстанавливали их фоновую остроту зрения. Вследствие благоприятного прогноза и относительно не прогрессирующего характера ретинопатии ВМТ агрессивное вмешательство обычно не является необходимым.

Ишемические состояния

Ишемия может быть подразделена на 2 категории: первая включает ускоренный атеросклероз, который встречается обычно у пациентов с диабетом, т.е. в бедренной, подколенной и задней большеберцовой артериях. Эти сосуды часто только 1 или 2 см в диаметре могут развивать атеросклеротическую бляшку, которая серьезно уменьшает кровоток. После того как большие сосуды становятся полностью закупоренными, могут происходить инсульт, инфаркт миокарда, ишемия и неизлечимые диабетические язвы стоп. Эта форма ишемии является, по существу, заболеванием больших сосудов.

Деменция после инсульта

25% людей имеют деменцию после инсульта, причем у многих других развивается деменция на протяжении 5-10 лет. Кроме того, многие индивидуумы испытывают более трудно уловимые нарушения их более высоких функций головного мозга (таких как навыки планирования и скорость переработки информации) и подвержены очень высокому риску развития после этого деменции. Очень небольшие инсульты в глубоких частях головного мозга в этом процессе (называемом микрососудистым заболеванием) являются, по-видимому, существенными в процессе, приводящем к идентифицированному распределению атрофии головного мозга, специфическому для деменции после инсульта.

Глазной ишемический синдром

Пациенты, страдающие глазным ишемическим синдромом (ΘΙ8), являются обычно пожилыми, в пределах возраста 50-80 лет. Мужчины поражаются в два раза более часто, чем женщины. Такой пациент лишь в редких случаях является бессимптомным. Пониженное зрение обнаруживается в 90% случаев, и

- 11 012799

40% пациентов имеют сопутствующую глазную боль. Может быть также сопутствующая или предшествующая история временных ишемических приступов или преходящей слепоты. Пациенты также имеют существенное известное или неизвестное системное заболевание в момент описания случая. Наиболее часто встречающимися системными заболеваниями являются гипертензия, диабет, ишемическая болезнь сердца, инсульт и периферическое сосудистое заболевание. В меньшей степени пациенты проявляют ΘΙ8 как следствие гигантоклеточного артериита (ССА).

Односторонние показатели присутствуют в 80% случаев. Обычные показатели могут включать запущенную одностороннюю катаракту, воспаление передней камеры глаза, бессимптомную реакцию передней камеры глаза, отек желтого пятна, расширенные, но не скрученные вены сетчатки, среднепериферические кровоизлияния в виде точек и пятен, пятна типа ватных комочков, экссудаты и неоваскуляризацию диска зрительного нерва и сетчатки. Может наблюдаться также спонтанная артериальная пульсация, повышенное внутриглазное давление и неоваскуляризация радужки и угол с неоваскулярной глаукомой (ЯУС). Хотя этот пациент может обнаруживать неоваскуляризацию передней камеры глаза, может иметь место гипотония глаза вследствие низкой артериальной перфузии к ресничному телу. Иногда имеется видимая ретинальная эмболия (бляшки Холенхорста).

Показатели в ΟΙ8 обусловлены атероматозным изъязвлением сонной артерии и стенозом в бифуркации общей сонной артерии. У пяти процентов пациентов со стенозом внутренней артерии развивается ΟΙ8. Однако ΟΙ8 встречается только в том случае, если степень стеноза превышает 90%. Стеноз сонной артерии уменьшает перфузионное давление на глаз, приводя к вышеупомянутым ишемическим явлениям. Как только стеноз достигает 90%, перфузионное давление в центральной ретинальной артерий (СКА) падает только до 50%. Часто уменьшенное артериальное давление проявляется в виде спонтанной пульсации СКА. Эти показатели являются вариабельными и могут включать все из приведенных выше показателей.

Пациенты с ΟΙ8 имеют существенное системное заболевание, которое должно быть обследовано. Сердечная смерть является первичной причиной смертности в случае пациентов с ΟΙ8 - пятилетний коэффициент смертности равен 40%. По этой причине пациенты с ΟΙ8 должны быть отосланы к кардиологу для полной серологии, ЭКГ, эхокардиограммы и оценки сонных артерий.

Микрососудистые заболевания почки

Почка участвует в ряде отдельных клиникопатологических состояний, которые влияют на системную и почечную микроциркуляторную часть сосудистого русла (микроваскулатуру).

Некоторые из этих состояний характеризуются первичным повреждением эндотелиальных клеток, таким как гемолитико-уремический синдром (НИ8) и тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР). НИ8 и ТТР являются близкородственными заболеваниями, отличающимися микроангиопатической гемолитической анемией и вариабельными нарушениями органов. Традиционно диагноз ТТР делается, когда почечная недостаточность является преобладающим признаком этого синдрома, как это является обычным у детей. У взрослых часто преобладает неврологическое нарушение и тогда этот синдром называют ТТР. Тромботическая микроангиопатия является лежащим в основе патологическим повреждением в обоих синдромах, и клинические и лабораторные показатели в пациентах с НИ8 или ТТР в значительной степени перекрываются. Это побудило некоторых исследователей рассматривать эти два синдрома как непрерывное единое заболевание. Патогенез: экспериментальные данные в сильной степени предполагают, что повреждение эндотелиальных клеток является первичным событием в патогенезе НИ8/ТТР. Эндотелиальное повреждение запускает каскад событий, который включает локальную внутрисосудистую коагуляцию, отложение фибрина и активацию и агрегацию тромбоцитов. Конечным результатом является гистопатологический показатель тромботической микроангиопатии, общий для различных форм синдрома НИ8/ТРР. При отсутствии лечения НИ8/ТТР коэффициент смертности приближается к 90%. Поддерживающая терапия - в том числе диализ, антигипертензивные лекарственные средства, переливания крови и лечение неврологических осложнений - способствует улучшенному выживанию пациентов с НИ8/ТТР. Адекватный баланс жидкости и отдых пищеварительного тракта являются важными в лечении типичного НИ8 с диареей;

лучевой (радиационный) нефрит - долгосрочные осложнения облучения почек более чем 2500 рад могут быть подразделены на пять клинических синдромов:

(ΐ) острый радиационный нефрит имеет место в приблизительно 40% пациентов после латентного периода 6-13 месяцев. Он характеризуется клинически резким возникновением гипертензии, протеинурией, отеком и прогрессирующей почечной недостаточностью, в большинстве случаев приводящим к почкам терминальной стадии;

(ΐΐ) хронический радиационный нефрит, напротив, имеет латентный период, который варьируется между 18 месяцами и 14 годами после начального повреждения. Он является постепенно протекающим в начале и характеризуется гипертензией, протеинурией и постепенной потерей почечной функции;

(ίίί) третий синдром проявляется спустя 5-19 лет после действия облучения в виде доброкачественной протеинурии с нормальной почечной функцией;

(ίν) четвертая группа пациентов обнаруживает только доброкачественную гипертензию спустя 2

- 12 012799 года - 5 лет и может иметь вариабельную протеинурию. Поздняя злокачественная гипертензия возникает спустя 18 месяцев - 11 лет после облучения у пациентов либо с хроническим радиационным нефритом, либо доброкачественной гипертензией. Удаление пораженной почки устраняет гипертензию. Сообщалось также индуцированное облучением повреждение почечных артерий с последующей гипертензией почечных сосудов;

(ν) синдром почечной недостаточности, аналогичный острому радиационному нефриту, _:наблюдали у пациентов с трансплантацией костного мозга (ВМТ), которых лечили облучением всего тела (ΤΒΙ).

Сообщалось, что облучение вызывает эндотелиальную дисфункцию, но сохраняет клетки гладких мышц сосудов в ранней стадии после облучения. Облучение могло бы непосредственно повреждать ДНК, приводя к пониженной регенерации этих клеток и оголению (денудации) базальной мембраны в клубочковых капиллярах и канальцах. Каким образом это начальное повреждение со временем приводит к гломерулосклерозу, атрофии канальцев и интерстициальному фиброзу, является неясным. Постулируется, что дегенерация слоя эндотелиальных клеток может приводить к внутрисосудистому тромбозу в капиллярах и более мелких артериолах. Эта внутрипочечная ангиопатия может тогда объяснять прогрессирующий почечный фиброз и гипертензию, которые характеризуют радиационный нефрит. Недавнее исследование почек облученной мыши показало зависимое от дозы увеличение лейкоцитов в корковом веществе почки, что предполагает роль воспалительных процессов в индуцированном облучением нефрите.

В других заболеваниях почек микроциркуляторная часть сосудистой сети почки участвует в аутоиммунных нарушениях, таких как системный склероз (склеродермия). Участие почек в системном склерозе проявляется в виде медленно прогрессирующего хронического почечного заболевания или в виде почечного кризиса склеродермии (8К.С), который характеризуется злокачественной гипертензией и острой азотемией. Постулируется, что 8К.С обусловлена Рейно-подобным феноменом в почке. Тяжелый вазоспазм приводит к ишемии коркового вещества почки и усиленному продуцированию ренина и ангиотензина II, которые, в свою очередь, сохраняют навсегда почечную вазоконстрикцию. Гормональные изменения (беременность), физический и эмоциональный стресс или низкая температура могут запускать Рейно-подобный артериальный вазоспазм. Роль системы ренин-ангиотензин в сохранении почечной ишемии подтверждается значительной пользой ингибиторов АСЕ в лечении 8К.С. Для пациентов с 8РС. у которых прогрессирует тяжелая почечная недостаточность, несмотря на антигипертензивное лечение, становится необходимым диализ. Использовали как перитонеальный диализ, так и гемодиализ. Сообщение ΝοΙ\\όγ1< ТНс Епб-81аде Кепа1 Икеаке (Е8КИ) о 311 пациенте с системным индуцированным склерозом Е8КЭ, подвергнутом диализу между 1983 и 1985 годами, выявило коэффициент выживаемости 33% при 3 годах.

На почечную микроциркуляцию может влиять также серповидно-клеточная болезнь, к которой почка особенно чувствительна вследствие низкого кислородного потенциала, достигаемого в глубоких сосудах мозгового вещества почки в результате противоточного переноса кислорода вдоль таха тее1а. Более мелкие почечные артерии и артериолы могут быть также местом тромбоэмболического повреждения от холестеринсодержащего материала, смещенного со стенок крупных сосудов.

Взятые в виде группы заболевания, которые вызывают преходящую или перманентную окклюзию почечной микродиркуляторной части сосудистого русла, приводят к нарушению клубочковой перфузии и, следовательно, скорости клубочкового фильтрования, создавая тем самым серьезную угрозу в отношении системного гомеостаза.

Острая почечная недостаточность

АКЕ может быть вызвана микрососудистым или макрососудистым заболеванием (окклюзией главной почечной артерии или тяжелым заболеванием абдоминальной аорты). Классические микрососудистые заболевания часто обнаруживают микроангиопатический гемолиз и острую почечную недостаточность, имеющую место вследствие тромбоза или окклюзии клубочковых капилляров, часто сопровождающуюся тромбоцитопенией. Типичные примеры этих заболеваний включают:

a) тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру - классическая пентада в тромботической тромбоцитопенической пурпуре включает лихорадку, неврологические изменения, почечную недостаточность, микроангиопатическую гемолитическую анемию и тромбоцитопению;

b) гемолитический уремический синдром - гемолитический уремический синдром подобен тромботической тромбоцитопенической пурпуре, но не обнаруживает неврологических изменений;

c) синдром НЕБЕР (гемолиза, повышенных ферментов печени и низких тромбоцитов) - синдром НЕББР является типом гемолитического уремического синдрома, который встречается у беременных женщин, с добавлением повышений трансаминазы.

Острая почечная недостаточность может присутствовать во всех медицинских условиях, но преимущественно приобретается в больницах. Это состояние развивается у 5% госпитализированных пациентов и приблизительно 0,5% госпитализированных пациентов нуждаются в диализе. На протяжении последних 40 лет коэффициент выживаемости для острой почечной недостаточности не улучшился, прежде всего вследствие того, что пораженные пациенты являются в настоящее время более старыми и имеют больше сопутствующих патологических состояний. Инфекция ответственна за 75% смертей в слу

- 13 012799 чае пациентов с острой почечной недостаточностью, и сердечно-респираторные осложнения являются второй наиболее частой причиной смерти. В зависимости от тяжести почечной недостаточности, коэффициент смертности может находиться в диапазоне от 7 до 80%. Острая почечная недостаточность может быть подразделена на три категории: предпочечная, внутренняя и послепочечная АКК Внутренняя АКР подразделена на четыре категории: канальцевое заболевание, клубочковое заболевание, сосудистое заболевание (в том числе микрососудистое) и интерстициальное заболевание.

Прогрессирующее почечное заболевание

Имеется доказательство, что прогрессирующее почечное заболевание характеризуется прогрессирующей потерей микроциркуляторной части сосудистого русла. Потеря микроциркуляторной части сосудистого русла коррелирует непосредственно с развитием образования клубочковых и канальцевоинтерстициальных рубцов. Этот механизм частично опосредован уменьшением эндотелиальной пролиферативной реакции, и это нарушение репарации капилляров опосредовано изменением локальной эксцрессии как ангиогенных (сосудистый эндотелиальный фактор роста), так и антиангиогенных (тромбоспондин 1) факторов в почке. Изменение в балансе ангиогенных факторов роста опосредуется как связанными с макрофагами цитокинами (интерлейкин-ΐβ), так и вазоактивными медиаторами. Наконец, существует интригующее доказательство того, что стимуляция ангиогенеза и/или репарации капилляров может стабилизировать почечную функцию и замедлять прогрессирование и что этот положительный эффект имеет место независимо от действий на ВР или протеинурию.

В отношении дополнительной информации см. Вгеппег & КссЮг'5 Т11С К1бпеу, 7'¹' еб., СоругщЫ © 2004 Е15СУ1ег: Сйар1ег 33 - М1сгоуа8си1аг бщеакек, οί кИпеу и также ТРгагу апб У1кгап1 1оигпа1 οί 1пб1ап Асабету οί С11шса1 Мебкте, Уо1. 5, Νο. 1 Ке\зе\\· Агйс1е-8ер5щ апб 1Не К1бпеу.

В заключение, можно сказать, что существующие способы терапии для профилактики и/или лечения ХОБЛ, дегенерации желтого пятна и микрососудистых заболеваний являются неудовлетворительными, и существует потребность в развитии новых соединений для этой цели. Все заболевания и показания, описанные здесь выше, а также другие заболевания и состояния, описанные здесь, такие как М1, могут также лечиться новыми соединениями этого изобретения.

КТР801

О гене КТР801 было впервые сообщено правопреемником данной заявки.

Патенты США с номерами 6455674, 6555667 и 6740738, все переуступленные правопреемнику данной заявки, описывают рег §е полинуклеотид и полипептид КТР801 и антитела, направленные против этого полипептида. КТР801 представляет уникальную генную мишень для индуцируемого гипоксией фактора-1 (Н1Р-1), который может регулировать индуцируемый гипоксией патогенез независимо от факторов роста, таких как УБОР.

Автор данного изобретения сделал открытия, ведущие к новой концепции ингибирования гена КТР801 с целью улучшения лечения различных респираторных нарушений.

Следующие заявки на патенты и публикации представляют аспекты информации уровня техники \УО 2001070979 относится к маркерам нуклеиновых кислот, которые сверхэкспрессируются в клетках рака яичника.

ϋδ 6673549 описывает комбинацию, содержащую кДНК, которые дифференциально экспрессируются в ответ на лечение стероидами.

Заявка США 2003165864 относится к кДНК, которые дифференциально экспрессируются в клетках, обработанных деметилирующим ДНК агентом.

Заявка США 2003108871 относится к композиции, содержащей несколько кДНК, которые дифференциально экспрессируются в культурах клеток печени С3А человека и якобы применимы для лечения нарушений печени.

Заявка США 2002119463 описывает новую композицию, применимую для лечения и диагностики рака предстательной железы, причем указанная композиция содержит кДНК человека, которые дифференциально экспрессируются в раке предстательной железы.

\УО 2004018999 описывает способ оценки, характеристики, мониторинга, профилактики и лечения рака шейки матки.

ЕР 1394274 относится к способу тестирования на бронхиальную астму или хроническую обструктивную болезнь легких посредством сравнения уровня экспрессии маркерного гена в биологической пробе из субъекта с уровнем экспрессии этого гена в пробе из здорового субъекта.

XVО 2002101075 относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, применимой для детектирования, характеристики, профилактики и лечения рака шейки матки человека.

νθ 2003010205 относится к ингибированию ангиогенеза для лечения заживления ран, ретинопатии, ишемии, воспаления, микроваскулопатии, заживления костей и воспаления кожи.

νθ 2002046465 относится к идентификации гена, участвующего в заболевании, для лечения регулируемых гипоксией состояний.

νθ 2002031111 относится к якобы новым полипептидам и их кодируемым белкам и, следователь

- 14 012799 но, обеспечены многие их применения.

АО 2001012659 относится к нуклеиновым кислотам, применимым в методологиях рекомбинантных ДНК.

АО 2001077289 описывает шестьсот двадцать три полинуклеотида, полученных из различных источников тканей человека.

АО 2003101283 относится к комбинации, которая содержит многие кДНК и белки, якобы дифференциально экспрессируемые в респираторных заболеваниях.

ДР 2003259877 относится ко многим маркерам заболевания фиброза печени.

Τζίροπι 81ιοδ1ι;·ιηΓ с1 а1.: Иепбйсайоп οΓ а Νονοί Нурох1а-1пбис1Ые ЕасЮг 1-Ке8рои81уе Сспс. КТР801, Ιηνοίνβά ίη Άρορΐοδίδ. МОЬЕСиЬЛК ΆΝΏ СЕЕЕиЬЛК ВЮЬОСУ, Арг. 2002, р. 2283-2293; эта статья, где соавтором является автор данного изобретения, подробно описывает ген КТР801 (тогда новый ΗΙΕ-1зависимый ген).

Аиа1 ВгаГтап, е1 а1.: ΙηΗίΗίΙίοη οΓ Охудеп-1пбисеб геигюраШу ίη ИТР801-ОеПс1еи1 М1се, ΙηνΌδΙ Ор11Ιΐκιίιηοί νίδ δα. 2004 Ос1; 45 (10): 3796-805; также в соавторстве с автором данного изобретения; эта статья демонстрирует, что в мышах с нокаутом КТР801 гипоксия не вызывает дегенерации капиллярной сети сетчатки.

ЬегГ А. Е1Шеп, е1 а1.: ΚΕΌΌ1, а ^еνе1ορтеηίа11у Кеди1а1еб Тгащспр1юпа1 Тгде1 οΓ р63 апб р53, Ып1<5 р63 ίο Κ£§υ1Ηίίοη οΓ Кеасйуе Охудеп 8рес1е5. ΜοΚ^^ Се11, νο1. 10, 995-1005, ШтетЬег 2002; эта статья демонстрирует, что сверхэкспрессия КТР801 (называемого в этой статье ΚΕΌΌ1) приводит к увеличенному продуцированию молекулярных частиц активного кислорода.

Ртсйагб Ό.Κ., Вегга Е., апб Ρο^δ^^ω· 1. Nοη-йуροx^с раШгау теШа1е5 Не тбис1юп οΓ йуροx^ашбиаЫе ГасЮг 1 а1р1а ίη тахсЫаг δΐηοοίΐι ти8с1е се1к. 1. Βίο1. Сйет. 2000, 8ер1; 275(35): 26765-71; эта статья демонстрирует, что ΗΙΕ-1-зависимая транскрипция может быть индуцирована избыточным продуцированием молекулярных частиц активного кислорода.

Иапдахапй Т., е1 а1.: Сепебс ηΗ^ίοη οΓ ΝγΓ2 епйапсек хихсериЫШу ίο адагейе δтοке-^ηбисеб етрйухета ίη ппсе. Подана в ^οи^паί οΓ СНшса1 Iηνеδΐ^даί^οη. Эта работа касается мышей с нарушенной защитой против антиоксидантов (вследствие инактивации КТР801 в зародышевой линии, здесь называемого ΝγΓ2).

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает новые способы и композиции для лечения микрососудистых нарушений, дегенерации желтого пятна, респираторных нарушений и повреждения или заболевания спинного мозга.

В одном варианте осуществления обеспечены новые молекулы, которые ингибируют КТР801 и могут быть использованы для лечения различных заболеваний и показаний.

В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, дегенерацией желтого пятна или респираторным нарушением, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КТР801.

Другой вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего ХОБЛ, предусматривающему введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора КТР801. В одном варианте осуществления этим ингибитором является молекула δίΚΝΑ, антисмысловая молекула, антитело (например, нейтрализующее антитело), доминантно негативный пептид или рибозим.

Другой вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего дегенерацией желтого пятна, предусматривающему введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора КТР801. В одном варианте осуществления этим ингибитором является молекула δίΚΝΑ, антисмысловая молекула, антитело (например, нейтрализующее антитело), доминантно негативный пептид или рибозим.

Другой вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, предусматривающему введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора КТР801. В одном варианте осуществления этим ингибитором является молекула δίΚΝΑ, антисмысловая молекула, антитело (например, нейтрализующее антитело), доминантно негативный пептид или рибозим.

Дополнительный вариант осуществления данного изобретения обеспечивает применение терапевтически эффективного количества ингибитора КТР801 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего респираторным нарушением. В одном варианте осуществления этим респираторным нарушением является ХОБЛ, а ингибитором является предпочтительно δίΚΝΑ.

Дополнительный вариант осуществления данного изобретения обеспечивает применение терапевтически эффективной дозы ингибитора КТР801 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего дегенерацией желтого пятна. В одном варианте осуществления дегенерацией желтого пятна является АМЭ, а ингибитором является предпочтительно δίΚΝΑ.

- 15 012799

Дополнительный вариант осуществления данного изобретения обеспечивает применение терапевтически эффективной дозы ингибитора ΚΓΡ801 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего микрососудистым нарушением. В одном варианте осуществления этим микрососудистым нарушением является диабетическая ретинопатия, а ингибитором является предпочтительно δίΚΝΆ.

Подробное описание изобретения

Данное изобретение в некоторых его вариантах осуществления относится к ингибированию гена или полипептида ВТР801 для лечения глазных болезней, респираторных нарушений и микрососудистых нарушений, т1сг айа. Как будет описано здесь, предпочтительными ингибиторами для применения с данным изобретением являются биологические молекулы.

Не связывая себя теорией, авторы данного изобретения обнаружили, что КТР801 участвует в различных патологических состояниях, в том числе микрососудистых нарушениях, глазных болезнях, респираторных нарушениях и повреждении и заболевании костного мозга, и мог бы быть полезным для ингибирования ΚΓΡ801 для лечения любого из указанных заболеваний или нарушений. Способы, молекулы и композиции, которые ингибируют ΚΓΡ801, обсуждаются здесь подробно, и любые из указанных молекул и/или композиций могут быть с пользой использованы в лечении пациента, страдающего любым из указанных состояний.

Данное изобретение обеспечивает способы и композиции для ингибирования экспрессии гена ΚΓΡ801 ίη νίνο. Обычно, этот способ включает введение олигорибонуклеотидов, таких как малые интерферирующие РНК (т.е. δίΚΝΆ), которые нацелены на конкретную мРНК и гибридизуются с ней, или материала нуклеиновых кислот, который может продуцировать δίΚΝΆ в клетке в количестве, достаточном для подавления экспрессии гена-мишени посредством механизма интерференции РНК. В частности, рассматриваемый способ может быть использован для ингибирования гена ΚΓΡ801 для лечения респираторных нарушений, микрососудистых нарушений или глазных нарушений.

Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, глазной болезнью или респираторным нарушением, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КТР801, в терапевтически эффективном количестве, с тем, чтобы таким образом лечить пациента. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, глазной болезнью или респираторным нарушением, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КТР801, в дозе и на протяжении периода времени, достаточных для стимуляции выздоровления. Глазной болезнью может быть дегенерация желтого пятна, например связанная с возрастом дегенерация желтого пятна (ΆΜΌ), ίηίοΓ айа. Микрососудистым нарушением может быть диабетическая ретинопатия или острая почечная недостаточность, ίηίοΓ айа. Респираторным нарушением может быть хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), эмфизема, хронический бронхит, астма и рак легкого, ίηίοΓ айа. Ингибитор КТР801 может быть выбран из большого разнобразия молекул, в том числе, но не только, таких соединений, как полинуклеотиды, Λδ-фрагменты (антисмысловые фрагменты), молекулы РНК, которые нацелены на мРНК гена ΚΓΡ801, такие как рибозимы или δίΚΝΆ (такие как δίΚΝΆ таблиц А-С и, в частности, δίΚΝΆ с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 таблицы А), или содержащие их экспрессирующие векторы; полипептиды, такие как доминантно негативные полипептиды, антитела (такие как антитело, которое специфически связывается с эпитопом, присутствующим в полипептиде, который содержит последовательные аминокислоты, последовательность которых представлена на фиг. 2 (8Е0 ΙΌ ΝΟ:2)), или, в некоторых случаях, ферменты. Кроме того, ингибитором ΚΓΡ801 может быть химический ингибитор, такой как малая молекула, например химические молекулы с низкой молекулярной массой, например с молекулярной массой, меньшей чем 2000 Да. Конкретные ингибиторы ЕТР801 представлены ниже.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего дегенерацией желтого пятна, ХОБЛ или диабетической ретинопатией, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу ингибитора ΚΓΡ801, содержащего полинуклеотид, который специфически гибридизуется с мРНК, транскрибируемой из гена ΚΓΡ801, и/или подавляет экспрессию гена ЕТР801 с тем, чтобы таким образом лечить пациента. Этим полинуклеотидом может быть δίΚΝΆ, содержащая последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность, идентичную любой из последовательностей, представленных в табл. А-С (8Е0 ΙΌ ΝΟ:3-344), и, в частности, δίΚΝΆ с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 табл. А.

Кроме того, дополнительный вариант осуществления данного изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, респираторным нарушением или глазной болезнью, предусматривающему введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу ингибитора ΚΓΡ801, содержащего молекулу δίΚΝΆ. необязательно молекулу δίΚΝΆ, представленную в любой из табл. А-С, в дозе и на протяжении периода времени с тем, чтобы таким образом лечить пациента.

Обеспечен дополнительный способ лечения пациента, страдающего микрососудистым нарушением, респираторным нарушением или глазной болезнью, предусматривающий введение этому пациенту фар

- 16 012799 мацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу молекулы РНК, которая нацелена на мРНК гена ΚΤΡ801, в дозе и на протяжении периода времени с тем, чтобы таким образом лечить пациента. Этой молекулой РНК может быть молекула δίΚΝΑ, такая как молекула δίΚΝΑ, представленная в табл. А-С, и, в частности, δίΚΝΑ с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 табл. А, или рибозим. Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего респираторным нарушением, микрососудистым нарушением или глазной болезнью или любым из описанных здесь состояний, предусматривающий введение пациенту фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу молекулы δίΚΝΑ, которая нацелена на мРНК гена ΚΤΡ801, необязательно молекулы δίΚΝΑ, представленной в табл. А-С, в дозе и на протяжении периода времени с тем, чтобы таким образом лечить пациента. Кроме того, глазной болезнью может быть дегенерация желтого пятна (ΑΜΌ); микрососудистым нарушением может быть диабетическая ретинопатия или острая почечная недостаточность; респираторным нарушением может быть ХОБЛ, и проявлениями ХОБЛ, подлежащими лечению, могут быть, но не только, эмфизема, хронический бронхит или и то, и другое.

«Лечение заболевания» обозначает введение терапевтического вещества, эффективного для уменьшения симптомов, связанных с заболеванием, для ослабления тяжести или лечения этого заболевания или для предупреждения возникновения этого заболевания.

«Терапевтически эффективной дозой» называют количество фармацевтического соединения или фармацевтической композиции, которое является эффективным для достижения улучшения у пациента или его физиологических системах, включающего, но не ограничивающегося ими, улучшенный коэффициент выживаемости, более быстрое выздоровление или улучшение или устранение симптомов и другие показатели, выбранные в качестве подходящих определяющих критериев специалистами с квалификацией в данной области.

Способы лечения заболеваний, описанные здесь и включенные в данное изобретение, могут предусматривать введение ингибитора ΚΤΡ801 вместе с дополнительным ингибитором ΚΤΡ801, веществом, которое улучшает фармакологические свойства этого активного ингредиента, как подробно описано ниже, или дополнительным соединением, о котором известно, что оно является эффективным в лечении подлежащего лечению заболевания, такого как дегенерация желтого пятна, ХОБЛ, ΑΚΡ, ΌΚ, т!ег айа. Под выражением «вместе с» имеется в виду: до, одновременно или после. Дополнительная детализация примерных объединенных терапий приведена ниже.

В другом варианте осуществления данное изобретение обеспечивает применение терапевтически эффективной дозы ингибитора ΚΤΡ801 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего дегенерацией желтого пятна, ХОБЛ, ΑΚΡ, ΌΚ или любой другой глазной болезнью, микрососудистым или респираторным состоянием, подробно описанным выше, и применение терапевтически эффективной дозы ингибитора ΚΤΡ801 для приготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний и состояний. В этом варианте осуществления ингибитор ΚΤΡ801 может содержать полинуклеотид, который содержит последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность, которая содержит антисмысловую последовательность относительно последовательности, представленной на фиг. 1 (8ЕО ΙΌ N0:1). Дополнительно, ингибитором ΚΤΡ801 может быть экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, имеющий последовательность, которая является антисмысловой последовательностью относительно последовательности, представленной на фиг. 1 (8Е0 ΙΌ N0:1). Ингибитором ΚΤΡ801 в соответствии с указанными применениями может также быть антитело, такое как нейтрализующее антитело, которое специфически связывается с эпитопом, присутствующим в полипептиде, который содержит последовательные аминокислоты, последовательность которых представлена на фиг. 2 (8Е0 ΙΌ N0:2). Кроме того, ингибитором ΚΤΡ801 может быть молекула РНК, которая нацелена на мРНК гена ΚΤΡ801, необязательно δίΚΝΑ, необязательно δίΚΝΑ, содержащая последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность, идентичную любой из последовательностей, представленных в табл. А-С (8Е0 ΙΌ Ν0:3-344) и, в частности, δίΚΝΑ с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 3 9, 41, 42 и 50 табл. А, или рибозим.

Таким образом, в соответствии с описанной здесь информацией ингибитор ΚΤΡ801, который должен быть использован с любым из описанных здесь способов, в любом из описанных здесь применений, в любой из описанных здесь фармацевтических композиций, может быть выбран из группы, состоящей из молекулы δίΚΝΑ, вектора, содержащего молекулу δίΚΝΑ, вектора, который может экспрессировать молекулу δίΚΝΑ, и любой молекулы, которая эндогенно процессируется в молекулу δίΚΝΑ. Как подробно описано здесь, указанной молекулой δίΚΝΑ является предпочтительно δίΚΝΑ, содержащая последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность, идентичную любой из последовательностей, представленных в табл. А-С (8Е0 ΙΌ Ν0:3-344), и, в частности, δίΚΝΑ с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42 и 50 табл. А.

«Респираторным нарушением» называют состояния, заболевания или синдромы дыхательной (респираторной) системы, включающие, но не ограничивающиеся ими, легочные нарушения всех типов, в том числе хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), эмфизему, хронический бронхит, астму и рак легкого, ш!ег айа. Эмфизема и хронический бронхит могут встречаться в виде части ХОБЛ или независимо.

- 17 012799 «Микрососудистым нарушением» называют любое состояние, которое влияет на микроскопические капилляры и лимфатические сосуды, в частности вазоспастические заболевания, васкулитные заболевания и лимфатические окклюзивные заболевания. Примеры микрососудистых нарушений включают 1п(ег айа: глазные нарушения, такие как слепота преходящая (эмболическая или вторичная относительно системной красной волчанки (8ЬЕ)), ар1а-синдром, недостаточность Рго! С8 и АТ111, микрососудистые патологии, обусловленные 1У-применением лекарственных средств, диспротеинемию, височный артериит, переднюю ишемическую глазную невропатию, ретробульбарный неврит (первичный или вторичный относительно аутоиммунных заболеваний), глаукому, синдром фон Гиппеля-Линдау, корнеальное заболевание, отторжение корнеального трансплантата, катаракты, болезнь Илза (ретинальный васкулит), Ггоз1е6 Ьгапсй апдййз, операция стягивания склеры (при отслойке сетчатки), увеит, в том числе рагз р1ап111з, хороидальная меланому, аплазия зрительного нерва; ретинальные состояния, такие как окклюзия ретинальной аретрии, окклюзия ретинальной вены, ретролетальная фиброплазия (синдром Терри), ВИЧретинопатия, ретинопатия Пурчера, ретинопатия системного васкулита и аутоиммунных заболеваний, диабетическая ретинопатия, гипертоническая ретинопатия, радиационная ретинопатия, окклюзия ветвей ретинальной артерии или вены, идиопатический ретинальный васкулит, аневризмы, нейроретинит, ретинальная эмболизация, острый ретинальный некроз, ретинохороидопатия Бердшота, давняя отслойка сетчатки; системные состояния, такие как сахарный диабет, диабетическая ретинопатия (ΌΚ), связанные с диабетом микрососудистые патологии (подробно описанные здесь), синдромы повышенной вязкости, синдромы дуги аорты и глазные ишемические синдромы, каротидно-кавернозный свищ, рассеянный склероз, системная красная волчанка, артериолит с аутоантителом 88-А, острый многоочаговый геморрагический васкулит, васкулит, происходящий из инфекции, васкулит, происходящий из болезни Бехчета, саркоидоз, коагулопатии, невропатии, нефропатии, микрососудистые заболевания почки и ишемические микрососудистые состояния, 1п(ег айа.

Микрососудистые нарушения могут содержать неоваскулярный элемент (элемент образования новых сосудов). Термин «неоваскулярное нарушение» обозначает состояния, в которых образование кровеносных сосудов (неоваскуляризация) является вредной для пациента. Примеры глазной неоваскуляризации включают ретинальные заболевания (диабетическую ретинопатию, диабетический отек желтого пятна, хроническую глаукому, отслойку сетчатки и серповидноклеточную ретинопатию); покраснение радужки; пролиферативную витреоретинопатию; воспалительные заболевания; хронический увеит; неоплазмы (ретинобластому, псевдоглиому и меланому); гетерохромный иридоциклит Фухса; неоваскулярную глаукому; корнеальную неоваскуляризацию (воспалительную, трансплантационную и связанную с развитием гипоплазию радужки); неоваскуляризацию после объединенной эктомии стекловидного тела и эктомии хрусталика; сосудистые заболевания (ретинальную ишемию, хороидальную сосудистую недостаточность, хороидальный тромбоз и ишемию сонной артерии); неоваскуляризацию зрительного нерва и неоваскуляризацию вследствие проникновения в глаз или повреждение глаза в результате ушиба (контузии). Все эти неоваскулярные состояния могут лечиться с использованием соединений и фармацевтических композиций данного изобретения.

«Глазной болезнью» называют состояния, заболевания или синдромы глаза, включающие, но не ограничивающиеся ими, любые состояния, включающие хороидальную неоваскуляризацию (СЫУ), влажную и сухую АМЭ, синдром гистоплазмоза глаза, ангиоидные полосы сетчатки, разрывы в оболочке Бруха (базальной пластинке), миопическую дегенерацию, глазные опухоли, ретинальные дегенеративные заболевания и окклюзию ретинальной вены (КУО). Некоторые описанные здесь состояния, такие как ΌΚ, которые могут лечиться в соответствии со способами данного изобретения, рассматривались либо как микрососудистое нарушение, либо как глазная болезнь, либо и то, и другое в представленных здесь определениях.

«Геном КТР801» называют открытую рамку считывания кодирующей КТР801 последовательности, показанную на фиг. 1 (8Е0 Ш N0:1), или ее любую гомологичную последовательность, предпочтительно имеющую по меньшей мере 70%-ную идентичность, более предпочтительно 80%-ную идентичность, даже более предпочтительно 90- или 95%-ную идентичность. Это включает любые последовательности, произведенные из 8Е0 Ш N0:1, которые были подвергнуты мутациям, изменениям или модификациям, описанным здесь. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления КТР801 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, соответствующей 8Е0 Ш N0:1. В данное изобретение входят также нуклеиновые кислоты, которые являются только комплементарными и идентичными, соответственно, части нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, предпочтительно в виде первой цепи, и первая цепь является обычно более короткой, чем нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением. Должно быть также понятно, что на основе аминокислотной последовательности КТР801 любая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая такую аминокислотную последовательность, может быть представлена специалистом с квалификацией в данной области на основе генетического кода. Однако вследствие предположительного механизма действия нуклеиновых кислот по данному изобретению наиболее предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота, кодирующая КТР801, предпочтительно его мРНК, была нуклеиновой кислотой, присутствующей в организме, ткани и/или клетке, соответственно, в которой должна быть уменьшена экспрессия КТР801.

- 18 012799 «Полипептидом ΚΤΡ801» называют полипептид гена ΚΤΡ801, и, как это понятно, этот термин включает для целей данного изобретения термины «ΚΤΡ779», «ΚΕΌΌ1», «Ό6ίΐ4», «ЕЫ20500», «Όί§2» и «ΡΚΡ1», полученные из любого организма, необязательно человека, их сплайсинговые варианты и фрагменты, сохраняющие биологическую активность, и их гомологи, предпочтительно имеющие по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, даже более предпочтительно по меньшей мере 90- или 95%-ную гомологию с ним. Кроме того, предполагается, что этот термин включает полипептиды, происходящие из минорных изменений в кодирующей последовательности ΚΤΡ801, таких как 1п1сг аЛа, точковые мутации, замены, делеции и инсерции, которые могут вызывать различие в немногих аминокислотах между полученным полипептидом и природно встречающимся ΚΤΡ801. Полипептиды, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот, которые связываются с кодирующей последовательностью или геномной последовательностью ΚΤΡ801 в условиях гибридизации высокой строгости, которые хорошо известны в данной области (например, см. Ли8иЬе1 с1 а1.: СиггеШ ΡΐΌΐοοοΙδ ίη Мо1еси1аг Βίοίοβν. 1оЬт XVПсу апЛ δοηκ, ВаЫтоге. Магу1апЛ (1988), дополненные в 1995 и 1998 годах), также охвачены этим термином. В этот термин включены также химически модифицированный ΚΤΡ801 или химически модифицированные фрагменты ΚΤΡ801, пока сохраняется биологическая активность. ΚΤΡ801 предпочтительно имеет или содержит аминокислотную последовательность, соответствующую 8Еф ΙΌ N0:2. Понятно, что могут быть различия в этой аминокислотной последовательности среди различных тканей организма или среди различных организмов одного вида или среди различных видов, к которым нуклеиновая кислота по данному изобретению может быть применена в различных вариантах осуществления данного изобретения. Однако на основе обеспеченных здесь технических описаний соответствующая последовательность может быть учтена соответствующим образом при конструировании любой из нуклеиновых кислот по данному изобретению. Конкретные фрагменты ΚΤΡ801 включают аминокислоты 1-50, 51-100, 101-150, 151-200 и 201-232 последовательности, показанной на фиг. 2. Дополнительные конкретные фрагменты ΚΤΡ801 включают аминокислоты 25-74, 75-124, 125-174, 175-224 и 225232 последовательности, показанной на фиг. 2.

ΚΤΡ801 обозначает в данном контексте белок, описанный, среди других, в №0 99/09046. ΚΤΡ801, который также называют ΚΤΡ801, был описан в качестве транскрипционной мишени ΗΙΕ-1α, δΐιοδίιηηί Τ. е1 а1.: (δΐιοδίιηηί е1 а1.: 2002, Μο1 Се11, 22, 2283-93). Кроме того, исследование ЕПЬеп е1 а1.: (ЕПЬеп е1 а1.: Μο1 Се11, 10, 995-1005) идентифицировали ΚΤΡ801 в качестве р53-зависимого гена реакции повреждения ДНК и в качестве р63-зависимого гена, участвующего в дифференцировке эпителия. ΚΤΡ801 также отражает тканеспецифический характер члена р63 семейства р53, является эффективным подобно ТР 63 или в дополнение к ТР 63, является ингибитором дифференцировки ίη νίίτο и участвует в регуляции молекулярных частиц активного кислорода. Кроме того, ΚΤΡ801 является чувствительным к чувствительному к гипоксии фактору транскрипции, индуцируемому гипоксией фактору 1 (ΗΙΕ-1) и является обычно положительно регулируемым во время гипоксии как ίη νίίτο, так и ίη νίνο в модели ишемического инсульта животного. ΚΤΡ801 функционирует, по-видимому, в регуляции молекулярных частиц активного кислорода (ΡΌ8), и уровни ΚΌ8 и уменьшенная чувствительность к окислительному стрессу увеличиваются после эктопической экспрессии ΚΤΡ801 (ЕНЬем еί а1.: 8ирта; δΐιοδίιηηί еί а1. 2002, кирга). Предпочтительно, ΚΤΡ801 является биологически активным белком ΚΤΡ801, который предпочтительно обнаруживает по меньшей мере одну из этих характеристик, предпочтительно две или более и наиболее предпочтительно каждую и любую из этих характеристик.

Родственным ΚΤΡ801 геном является ΚΤΡ801Ε, также называемый ΚΕΌΌ2, и он был обнаружен авторами данного изобретения. ΚΤΡ801Ε является гомологичным ΚΤΡ801 и реагирует сходным образом на окислительный стресс; таким образом, ΚΤΡ801Ε, возможно, обладает некоторыми сходными функциями с ΚΤΡ801.

Не связывая себя теорией, авторы считают, что ΚΤΡ801, будучи индуцируемым стрессом белком (отвечающим на гипоксию, окислительный стресс, термический стресс, ЕК-стресс), является фактором, действующим в тонкой настройке реакции клеток на нарушение баланса энергии. Как таковой, он является мишенью, пригодной для лечения любого заболевания, в котором клетки должны быть спасены от апоптоза вследствие стрессовых условий (например, заболеваний, сопровождающихся гибелью нормальных клеток), или в котором клетки, которые адаптированы к стрессовым условиям вследствие изменений в экспрессии ΚΤΡ801, должны быть убиты. В последнем случае ΚΤΡ801 может рассматриваться как фактор выживаемости для раковых клеток, и его ингибиторы могут лечить рак в виде монотерапии или в виде сенсибилизирующих лекарственных средств в комбинации с химиотерапией или лучевой терапией.

Термин «полинуклеотид» обозначает любую молекулу, состоящую из ДНК-нуклеотидов, РНКнуклеотидов или комбинации обоих типов, т. е. которая содержит два или более из оснований гуанидина, цитозина, тимидина, аденина, урацила или инозина, йИег а11а. Полинуклеотид может включать природные нуклеотиды, химически модифицированные нуклеотиды и синтетические нуклеотиды или их химические аналоги. Этот термин включает «олигонуклеотиды» и включает «нуклеиновые кислоты».

Термин «аминокислота» относится к молекуле, которая состоит из любой из 20 природно встречающихся аминокислот, аминокислот, которые были химически модифицированы (см. ниже) или синте

- 19 012799 тических аминокислот.

Термин «полипептид» относится к молекуле, состоящей из двух или нескольких аминокислотных остатков. Этот термин включает пептиды, полипептиды, белки и пептидомиметики.

«Пептидомиметик» является соединением, содержащим непептидные структурные элементы, который способен имитировать биологическое действие (действия) природного исходного пептида. Некоторые из классических пептидных характеристик, таких как ферментативно разрезаемые пептидные связи, обычно не присутствуют в пептидомиметике.

Под термином «доминантно негативный пептид» имеют в виду полипептид, кодируемый кДНКфрагментом, который кодирует часть белка (см. Негкко\уЦх I.: РипсЬопа1 шасйуайоп οί депек Ьу ботшапГ педабуе тиГаГюпк. №Ц.1ге. 1987 8ер 17-23; 329 (6136):219-22. Кеу1еу; Кошпкоп Ι.Β. еГ а1.: Сепебс кирргекког е1етепГк: пе\у 1оо1з Гог то1еси1аг опсо1оду - 11нг(ееп(11 Соте1шк Р. КЬоабк Метопа1 А\уагб ЬесГиге. Сапсег Кек. 1995 8ер 15; 55 (18) : 4023). Этот пептид может иметь отличающуюся функцию в сравнении с белком, из которого он произведен. Он может взаимодействовать с полным белком и ингибировать его активность или он может взаимодействовать с другими белками и ингибировать их активность в ответ на полноразмерный (исходный) белок. Доминантно негативный означает, что этот пептид способен преодолеть природный исходный белок и ингибировать его активность, придавая этой клетке отличающееся свойство, такое как резистентность или сенсибилизацию в отношении смерти или любого представляющего интерес клеточного фенотипа. Для терапевтического вмешательства этот пептид сам может доставляться в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции или эта кДНК может быть доставлена в клетку с использованием известных способов.

Получение пептидов и полипептидов

Полипептиды могут быть получены с использованием нескольких способов, например:

1) синтетически.

Синтетические полипептиды могут быть получены с использованием коммерчески доступного прибора с использованием известной последовательности КТР801 или ее части;

2) рекомбинантные способы.

Предпочтительный способ получения полипептидов КТР801 или их фрагментов заключается в клонировании полинуклеотида, содержащего кДНК гена КТР801, в экспрессирующий вектор и культивировании клетки, несущей этот вектор, таким образом, чтобы экспрессировать кодируемый полипептид, и затем очистке полученного полипептида, причем все выполняется с использованием способов, известных в данной области, как описано, например, в МагкЬак еГ а1.: 8ГгаГед1ек Гог РгоГеш РипДсаГюп апб СЬагас1епха1юп. Α 1аЬогаГогу соигке тапиа1.: С8НЬ Ргекк (1996). (Кроме того, см. В1Ь1 НаетаГо1. 1965; 23:116574 Арр1 МюгоЬю1. 1967 1и1; 15(4):851-6; Сап. ί. ВюсЬет. 1968 Мау; 46 (5):441-4; ВюсЬет1кШу. 1968 1и1; 7 (7) :2574-80; АгсЬ ВюсЬет ВюрЬук. 1968 8ер 10; 126 (3.) : 746-72; ВюсЬет ВюрЬук Кек Соттип. 1970 РеЬ 20; 38 (4): 825-30).

Этот экспрессирующий вектор может включать промотор для регуляции транскрипции гетерологичного материала, и этот промотор может быть конститутивным или индуцибельным промотором, чтобы сделать возможной селективную транскрипцию. Необязательно могут быть включены энхансеры, которые могут требоваться для получения необходимых уровней транскрипции. Этот экспрессирующий вектор может также включать ген для отбора.

Векторы могут быть введены в клетки или ткани любым из разнообразных способов, известных в данной области. Такие способы могут быть найдены обычно в 8атЬгоок еГ а1.: Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаГогу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаГогу, №\у Уогк (1989, 1992), в АикиЬе1 еГ а1.: СиггепГ РгоГосо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1оЬт \УПеу апб 8опк, ВаШтоге, Магу1апб (1989), Уеда еГ а1.: Сепе ТагдеЬпд, СКС Ргекк, Апп АгЬог, ΜΙ (1995.), УесГогк: А 8шуеу оГ Мо1еси1аг С1ошпд. УесГогк апб ТЬеи Икек, ВиГГегуогГЬк, ВокГоп МА (1988) и СбЬоа еГ а1.: (1986);

3) очистка из природных источников.

Полипептид. КТР801 или его природно встречающиеся фрагменты могут быть очищены из природных источников (таких как ткани) с использованием многих способов, известных специалисту с обычной квалификацией в данной области, таких как, например иммунопреципитация анти-КТР801-антителом или аффинная хроматография с матриксом, связанным с любой молекулой, о которой известно, что она связывает КТР801.

Очистку белка выполняют, как известно в данной области и как описано, например, в МагксЬак еГ а1.: 8ГгаГед1ек Гог РгоГеш РипДсаГюп апб СЬагасГеп/аГюп. А 1аЬогаГогу соигке тапиа1. С8НЬ Ргекк (1996).

Под «биологическим эффектом КТР801» или «биологической активностью КТР801» имеют в виду действие КТР801 в респираторных нарушениях, которое может быть прямым или непрямым и включает, без связывания теорией, действие КТР8013 на апоптоз альвеолярных клеток, индуцированный гипоксическими или гипероксическими условиями. Непрямое действие включает, но не ограничивается ими, связывание КТР801 с одной из нескольких молекул или действие на одну из нескольких молекул, которые участвуют в каскаде трансдукции сигнала, приводящего к апоптозу.

«Апоптозом» называют физиологический тип смерти клеток, который возникает из активации некоторых клеточных механизмов, т. е. смерти, которая регулируется аппаратом клетки. Апоптоз может,

- 20 012799 например, быть результатом активации аппарата клетки внешним пусковым механизмом, например цитокином или анти-ЕА8-антителом, который приводит к смерти клеток, или внутренним сигналом. Термин «запрограммированная смерть клеток» может быть также использован взаимозаменяемо с «апоптозом».

«Связанное с апоптозом заболевание» обозначает заболевание, этиология которого связана либо полностью, либо частично с процессом апоптоза. Это заболевание может быть вызвано либо нарушением функции апоптотического процесса (например, в случае рака или аутоиммунного заболевания), либо повышенной активностью апоптотического процесса (например, в случае некоторых нейродегенеративных заболеваний). Многие заболевания, в которых участвует ВТР801, являются связанными с апоптозом заболеваниями. Например, апоптоз является важным механизмом в сухой АМЭ, посредством которого имеет место медленная атрофия фоторецепторных и содержащих пигементы эпителиальных клеток, прежде всего в центральном (макулярном) районе сетчатки. Нейроретинальный апоптоз является также важным механизмом в диабетической ретинопатии.

«Ингибитор» является соединением, которое способно ингибировать активность гена или продукта такого гена до степени, достаточной для достижения биологического или физиологического эффекта. «Ингибитор ВТР801» является соединением, которое способно ингибировать активность гена ВТР801 или продукта гена ВТР801, в частности гена или продукта гена ВТР801 человека. Такие ингибиторы включают вещества, которые влияют на транскрипцию или трансляцию этого гена, а также вещества, которые влияют на активность продукта этого гена. Ингибитор ВТР801 может быть также ингибитором промотора ВТР801. Примеры таких ингибиторов могут включать, 1п(ег айа: полинуклеотиды, такие как А8-фрагменты (антисмысловые фрагменты), малая интерферирующая РНК (кг№А) или содержащие их векторы; полипептиды, такие как доминантно негативные пептиды, антитела и ферменты; каталитические РНК, такие как рибозимы; и химические молекулы с низкой молекулярной массой, например молекулярной массой ниже 2000 Да. Конкретные ингибиторы ВТР801 приведены ниже.

«Экспрессирующий вектор» является вектором, который имеет способность включения в чужеродную клетку и экспрессии гетерологичных фрагментов ДНК в чужеродной клетке. Многие прокариотические и эукариотические экспрессирующие векторы находятся в рамках квалификации специалистов в данной области.

Термин «антитело» относится к антителу ЦС, ЦМ, !дО, ЦА и ЦЕ, 1п(ег айа. Это определение включает поликлональные антитела или моноклональные антитела. Этот термин относится к целым антителам или фрагментам антител, содержащим антигенсвязывающий домен, например антителам без Есчасти, одноцепочечным антителам, мини-антителам, фрагментам, состоящим, по существу, только из вариабельного антигенсвязывающего домена антитела, и т. д. Термин «антитело» может также относиться к антителам против полинуклеотидных последовательностей, полученных вакцинацией кДНК. Этот термин включает также фрагменты антител, которые сохраняют способность селективного связывания с их антигеном или рецептором, и примерами их являются, т!ег айа:

(1) ЕаЬ, фрагмент, который содержит одновалентный антигенсвязывающий фрагмент молекулы антитела, который может быть получен расщеплением целого антитела ферментом папаином с получением легкой цепи и части тяжелой цепи;

(2) Е(аЬ')₂, фрагмент антитела, который может быть получен обработкой целого антитела ферментом пепсином без последующего восстановления; Е(аЬ')₂ является димером двух ЕаЬ-фрагментов, удерживаемых вместе двумя дисульфидными связями;

(3) Εν, определяемый как генетически сконструированный фрагмент, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, экспрессированную в виде двух цепей; и (4) одноцепочечное антитело (8СА), определяемое как генетически сконструированная молекула, содержащая вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, связанные подходящим полипептидным линкером в виде слитой одноцепочечной молекулы.

Под термином «эпитоп» в контексте данного изобретения имеют в виду антигенную детерминанту на антигене, с которой связывается антитело. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или сахарные боковые цепи, и обычно имеют специфические структурные характеристики, а также специфические характеристики зарядов.

Получение анти-КТР801-антител

Антитела, которые связываются с ВТР801 или произведенным из него фрагментом, могут быть получены с использованием интактного полипептида или фрагментов, содержащих меньшие полипептиды в качестве иммунизирующего антигена. Например, может быть желательным получение антител, которые специфически связываются с Ν-концевым или С-концевым или любыми другими подходящими доменами ВТР801. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть произведен из транслированной кДНК или получен химическим синтезом и может быть необязательно конъюгирован с белком-носителем. Такие обычно используемые носители, которые химически связаны с полипептидом, включают гемоцианин фиссуреллы (КЬН), тироглобулин, бычий сывороточный альбумин (БСА) и столбнячный токсоид. Затем этот связанный полипептид используют для иммунизации животного.

- 21 012799

Если желательно, поликлональные или моноклональные антитела могут быть дополнительно очищены, например, связыванием с матриксом и элюцией из матрикса, с которым связан полипептид или пептид, к которому были индуцированы антитела. Специалистам с квалификацией в данной области известны различные способы, обычные в иммунологии, для очистки и/или концентрирования поликлональных, а также моноклональных антител (Со11дап е! а1.: ИпБ 9, Сиггеп! Рго!осо1к ίη Ιιηιηιιηοίομν. УПеу ΙηΙοίΈοίοηοο. 1994).

Способы получения антител всех типов, в том числе фрагментов, известны в данной области (см., например, Наг1оте апб Ьапе, АпйЬоФек: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, №\ν Уогк (1988)). Способы иммунизации, в том числе все необходимые стадии приготовления иммуногена в подходящем адъюванте, определения связывания антител, выделения антител, способы получения моноклональных антител и гуманизации моноклональных антител являются известными квалифицированному специалисту в данной области.

Антитела могут быть гуманизированными антителами или антителами человека. Антитела могут быть гуманизированы различными способами, известными в данной области, в том числе СПКтрансплантацией (ЕР239400; Публикация РСТ \νΟ 91/09967; И8 патенты с номерами 5225539; 5530101 и 5585089), облицовкой или изменением поверхности (ЕР 592106; ЕР 519596; Раб1ап, Мо1еси1аг Iттиηο1оду 28 (4/5) : 489-498 (1991); 8!ибшска е! а1.: Рго!ет Шдтеегтд. 7(6):805-814 (1994); Кодикка е! а1.: РЫА8 91:969-973 (1994)) и перетасовкой цепи (патент США № 5565332). Моноклональные антитела по определению включают антитела, полученные из одного вида (такие как мышиные, кроличьи, козьи, крысиные антитела и антитела человека и т.д.), а также антитела, полученные из двух или большего количества видов, такие как химерные и гуманизированные антитела.

Полностью человеческие антитела особенно желательны для терапевтического лечения пациентовлюдей. Антитела человека могут быть получены различными способами, известными в данной области, включающими способы фагового дисплея с использованием библиотек антител, полученных из последовательностей иммуноглобулинов человека. См. также патенты США № 4444887 и 4716111 и публикации РСТ УС) 98/46645, УС) 98/50433, УС) 98/24893, УС) 98/16654, УС) 96/34096, УС) 96/33735 и УС) 91/10741, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме.

Дополнительная информация в отношении всех типов антител, в том числе гуманизированных антител, антител человека и фрагментов антител может быть найдена в УС 01/05998, которая включена здесь в качестве ссылки в ее полном объеме.

Нейтрализующие антитела могут быть получены обсуждаемыми выше способами, возможно с дополнительной стадией скрининга на нейтрализующую активность, например, с использованием анализа выживаемости.

Термины «химическое соединение», «малая молекула», «химическая молекула», «малая химическая молекула» и «малое химическое соединение» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к химическим частям молекул любого конкретного типа, которые могут быть синтетически получены или получены из природных источников и обычно имеют молекулярную массу менее чем 2000 Да, менее чем 1000 Да или даже менее чем 600 Да.

Данное изобретение относится также к функциональным нуклеиновым кислотам, содержащим двухцепочечную структуру, их применению для приготовления лекарственного средства, фармацевтической композиции, содержащей такие функциональные нуклеиновые кислоты, и способу лечения пациента.

Гипоксию считают ключевым элементом в патологическом механизме целого ряда заболеваний, таких как инсульт, эмфизема и инфаркт, которые ассоциированы с субоптимальной доступностью кислорода и реакциями повреждения тканей в ответ на условия гипоксии. В быстро растущих тканях, в том числе в опухоли, субоптимальная доступность кислорода компенсируется нежелательным образованием новых кровеносных сосудов (неоангиогенезом). Таким образом, по меньшей мере в случае раковых заболеваний рост сосудистой сети является нежелательным.

Ввиду этого ингибирование ангиогенеза и роста сосудов, соответственно, является предметом интенсивных исследований. Уже сегодня является доступными несколько соединений, которые ингибируют нежелательный ангиогенез и рост сосудов. Некоторые из более важных соединений являются соединениями, которые ингибируют УЕСЕ и рецептор УЕСЕ. В обоих случаях действие УЕСЕ устраняется либо блокированием УЕСЕ как такового, например, с использованием антител, направленных против УЕСЕ, таких как изучаемое Сепеп!есБ антитело АУА8ТГЫ (моноклональное АВ, специфическое в отношении УЕСЕ) (Ееггага Ν., Епбосг Ке\^г. 2004 Аид; 25(4):581-611), либо блокированием соответствующего рецептора, т.е. рецептора УЕСЕ (Тгах1ег Р.; Сапсег Кек. 2004 Л.11 15: 64(14):4931-41; или 81а61ег У.М. е! а1.: С11п Сапсег Кек. 2004 Мау 15; 10 (10): 3365-70).

Однако, поскольку ангиогенез и рост сосудистой сети является очень существенными и жизненно важным процессом в любом животном и человеке, действие этого типа соединений должно быть сфокусировано в конкретном участке, где ангиогенез и рост сосудов является фактически нежелательным, что делает подходящее нацеливание и подходящую доставку решающими в связи с этим типом терапевтического подхода.

- 22 012799

Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение дополнительных средств для лечения заболеваний, в которых принимает участие рост сосудистой сети и ангиогенез, соответственно.

Под «малой интерферирующей РНК» (кЖПА) имеют в виду молекулу РНК, которая уменьшает или осуществляет сайленсинг (предотвращает экспрессию) гена/мРНК ее эндогенной клеточной копии. Предполагается, что этот термин включает «интерференцию РНК» (ΚΝΛί). Интерференцией РНК (ΚΝΛί) называют процесс последовательность-специфического посттранскрипционного сайленсинга генов в млекопитающих, опосредуемого малыми интерферирующими РНК (к1ВПА). (Иге е! а1.: 1998, Па!иге 391, 806). Соответствующий процесс в растениях обычно называют специфическим посттранскрипционным сайленсингом генов или сайленсингом РНК, а также называют набуханием в грибах. Реакция интерференции РНК может представлять эндонуклеазный комплекс, содержащий к1ВПА, обычно называемый комплексом РНК-индуцируемого сайленсинга (В18С), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей последовательность, комплементарную антисмысловой цепи этого кЖПА-дуплекса. Расщепление РНК-мишени может иметь место в середине района, комплементарного антисмысловой цепи к1ВПА-дуплекса (Е1ЬакЫт е! а1. 2001, Сепек Эеу.. 15, 188). В отношении недавней информации по этим терминам и предполагаемым механизмам см. Ветпк!еш Е.Ь.., Эепй А.М.., Наппоп С.к: ТЬе гек1 1к кбепсе. КПА. 2001 Ш; 7(11).:1509-21; и Νίκΐιίίαιη К.: А к1юй рптет оп ВПА1: ВПА-бнес!еб ВПА ро1утегаке ас!к ак а кеу са!а1ук!. Се11. 2001 Ыоу 16; 107 (4) 415-8. Примеры молекул к1ВПА, которые могут быть использованы, приведены в табл. А-С.

В последние годы интерференция РНК (ВПА1) появилась в качестве одного из наиболее эффективных способов инактивации генов (Па!иге Веу1е^к, 2002, ν. ,3, р. 737-47; Па!иге, 2002, ν. 418, р. 244-51). В качестве одного способа он основан на способности молекул двухцепочечной РНК (бкВПА) входить в специфический белковый комплекс, где она затем действует на комплементарную клеточную РНКмишень и специфически разрушает ее. Более подробно, бкВПА расщепляется на короткие (17-29 п.н.) ингибиторные РНК (к!ВПА) РНК-азами типа III (Э1СЕВ, Этокба, и т.д.) (Па!иге, 2001, ν. 409, р. 363-6; Па!иге, 2003, 425, р. 415-9). Эти фрагменты и комплементарные мРНК узнаются специфическим белковым комплексом В18С. Весь процесс кульминируется эндонуклеазным расщеплением мРНК-мишени (Па!иге Веν^е\νк. 2002, ν. 3, р. 737-47; Сшт Орш Мо1 ТЬег. 2003 Лт; 5(3):217-24).

В отношении описания как конструировать и получать кЖПА к известным генам см., например, СЬа1к А.М., ^ак1ек1еб1 С., 8оппЬаттег Е.Ь.. 1тргохеб апб аи1ота1еб ргебюбоп оГ еГГесбуе к1ВПА ВюсЬет. ВюрЬук. Век. Соттип. 2004 Лт 18; 319 (1) : 264-74; 8юиб М, Ьенба1 М., Ро1еп11а1 бекщп ги1ек апб епхутабс куп!Ьек1к оГ кГВПАк, Мебюбк Мо1 Вю1.2004; 252:457-69; беуепкоуа П., Си О, Вих кк: Сепе кресШс к1В^А ке1ес!ог ВютГогтабск. 2004 РеЬ 12; 20(3):430-2. апб и1-Те1 К., Пабо Υ., ТакаЬакЫ Р., НагадисЬ1 Т., О111б-Натахак| Н, Лий А., Иеба В., 8ащо К., СшбеЛпек Гог 1ке ке1есбоп оГ ЫдЬ1у еГГесбуе кГВПА кесщепсек Гог таттабап апб сЫск ВПА биегГегепсе Пис1ею Ас1бк Век. 2004 РеЬ 9; 32 (3):936-48. См. также Ьш Υ., ВгааксЬ Э.А., Пи1Г С.Л, Согеу Э.В. ЕГЛшеп! апб 1коГотт-ке1есбуе 1пЬ1Ь1боп оГ се11и1аг депе ехртеккюп Ьу рерббе пис1ею ас1бк ВюсЬеттбу, 2004 РеЬ 24;43(7):1921-7. См. также РСТ риЬбсабопк XV О 2004/015107 (А!идеп) апб νθ 02/44321 (ТиксЬ1 е! а1.), апб а1ко СЫи Υ.6., Вапа Т.М. кГВПА Гипсбоп ш ВПА1: а с11епйса1 тобШсабоп апа1ук1к, ВПА 2003 8ер; 9 (9): 1034-48 апб И8 Ра!еп! Пок.5898031 апб 6107094 (Сгооке) в отношении получения модифицированных/более стабильных кГВПА.

Были также разработаны векторы на основе ДНК, способные генерировать. кГВПА в клетках. Этот способ обычно включает транскрипцию коротких шпилечных РНК, которые эффективно процессируются с образованием кГВПА в клетках. Рабб1коп е! а1. РПА8 2002, 8:5515-5520; и Вгитте1катр е! а1. 8с1епсе 2002, 296:550-553. Эти сообщения описывают способы генерирования кГВПА, способных специфически нацеливаться на многочисленные эндогенно и экзогенно экспрессируемые гены.

В отношении доставки к1ВПА см., например, 8Ьеп е! а1. (РЕВ8 1ебетк 539: 111-114 (2003)), Х1а е! а1.: Па!иге Вю!есбпо1оду 20: 1006-1010 (2002), Вею11 е! а1.: Мо1еси1аг У1кюп 9: 210-216 (2003), 8огепкеп е! а1. (I. Мо1. Вю1. 327: 761-766 (2003), Леток е! а1., Па!иге Сепебск 32: 107-108 (2002) апб 81теош е! а1.: Пис1е1с Ас1бк ВекеагсЬ 31,11: 2717-2724 (2003)). кГВПА недавно была успешно использована для ингибирования в приматах; в отношении дополнительных подробностей см. То1епбпо е! а1.: Вебпа 24(1) РеЬгиагу 2004 рр. 132-138.

κΐΚΝΑ данного изобретения

Общие описания кГВПА данного изобретения

Обычно кГВПА, используемые в данном изобретении, содержат рибонуклеиновую кислоту, содержащую двухцепочечную структуру, причем эта двухцепочечная структура содержит первую цепь и вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов и указанный первый сегмент является, по меньшей мере, частично комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов и указанный второй сегмент является, по меньшей мере, частично идентичным нуклеиновой кислоте-мишени, причем указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в положении 2', причем в каждой группе этой цепи модифицированные нуклеотиды фланкированы на одной или на обеих сторонах фланкирующей группой нуклеотидов, причем фланкирующие нуклеотиды, образующие фланкирующую группу нуклеотидов, являются либо немодифицированными нуклеотидами,

- 23 012799 либо нуклеотидами, имеющими модификацию, отличающуюся от модификации вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов. Кроме того, указанная первая цепь и/или указанная вторая цепь может содержать указанное множество модифицированных нуклеотидов и может содержать указанное множество групп модифицированных нуклеотидов.

Группа модифицированных нуклеотидов и/или группа фланкирующих нуклеотидов может содержать некоторое количество нуклеотидов, причем это количество нуклеотидов выбрано из группы, состоящей из 1-10 нуклеотидов. В связи с любыми диапазонами, указанными здесь, должно быть понятно, что каждый диапазон включает любое отдельное целое число между соответствующими числами, используемыми для определения диапазона, в том числе указанные два числа, ограничивающие указанный диапазон. Таким образом, в данном случае эта группа содержит один нуклеотид, два нуклеотида, три нуклеотида, четыре нуклеотида, пять нуклеотидов, шесть нуклеотидов, семь нуклеотидов, восемь нуклеотидов, девять нуклеотидов и десять нуклеотидов.

Распределение модифицированных нуклеотидов указанной первой цепи может быть таким же, что и распределение модифицированных нуклеотидов указанной второй цепи, и может быть сопоставлено с распределением указанной второй цепи. Кроме того, распределение указанной первой цепи может быть смещено на один или несколько нуклеотидов относительно распределения второй цепи.

Обсуждаемые выше модификации могут быть выбраны из группы, состоящей из амино, фтора, метокси, алкокси и алкила.

Двухцепочечная структура δίΚΝΑ может быть затуплена на одной стороне или на обеих сторонах. Более конкретно, эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 5'-концом первой цепи и 3'-концом второй цепи, или эта двухцепочечная структура может быть затуплена на стороне двухцепочечной структуры, которая ограничена 3'-концом первой цепи и 5'-концом второй цепи.

Кроме того, по меньшей мере одна из этих двух цепей может иметь выступ по меньшей мере одного нуклеотида на 5'-конце; этот выступ может состоять из по меньшей мере одного дезоксирибонуклеотида. По меньшей мере одна из этих цепей может также необязательно иметь выступ из по меньшей мере одного нуклеотида на 3'-конце.

Длина двухцепочечной структуры этой δίΚΝΑ обычно равна приблизительно 17-21 и более предпочтительно 18-19 оснований. Кроме того, длина указанной первой цепи и/или длина указанной второй цепи может независимо друг от друга быть выбрана из группы, содержащей приблизительно 15 оснований - приблизительно 23 основания, 17 оснований - 21 основание и 18 или 19 оснований.

Кроме того, комплементарность между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью может быть абсолютной, или дуплекс, образованный между первой цепью и нуклеиновой кислотоймишенью, может содержать по меньшей мере 15 нуклеотидов, где имеется одно ошибочное спаривание или два ошибочных спаривания между указанной первой цепью и нуклеиновой кислотой-мишенью, образующими указанную двухцепочечную структуру.

В некоторых случаях как первая цепь, так и вторая цепь, каждая содержат по меньшей мере одну группу модифицированных нуклеотидов и по меньшей мере одну фланкирующую группу нуклеотидов, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид и каждая фланкирующая группа нуклеотидов содержит по меньшей мере один нуклеотид, причем каждая группа модифицированных нуклеотидов первой цепи сопоставляется с фланкирующей группой нуклеотидов на второй цепи, причем наиболее концевой 5'-нуклеотид первой цели является нуклеотидом группы модифицированных нуклеотидов, а наиболее 3'-концевой нуклеотид второй цепи является нуклеотидом фланкирующей группы нуклеотидов. Каждая группа модифицированных нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида и/или каждая фланкирующая группа нуклеотидов может состоять из единственного нуклеотида.

Кроме того, может быть так, что на первой цепи нуклеотид, образующий фланкирующую группу нуклеотидов, является немодифицированным нуклеотидом, который расположен в 3'-направлении относительно нуклеотида, образующего группу модифицированных нуклеотидов, а на второй цепи нуклеотид, образующий группу модифицированных нуклеотидов, является модифицированным нуклеотидом, который расположен в 5'-направлении относительно нуклеотида, образующего фланкирующую группу нуклеотидов.

Кроме того, первая цепь δίΚΝΑ может содержать восемь-двенадцать, предпочтительно девятьодиннадцать групп модифицированных нуклеотидов, а вторая цепь может содержать семь-одиннадцать, предпочтительно восемь-десять групп модифицированных нуклеотидов.

Первая цепь и вторая цепь могут быть связаны структурой петли, которая может состоять из полимера, не являющегося нуклеиновой кислотой, такого как, ш!ег а11а, полиэтиленгликоль. Альтернативно, эта структура петли может состоять из нуклеиновой кислоты.

Кроме того, 5'-конец первой цепи δίΚΝΑ может быть связан с 3'-концом второй цепи или 3'-конец первой цепи может быть связан с 5'-концом второй цепи, причем указанная связь осуществляется через представляющий собой нуклеиновую кислоту линкер, обычно имеющий длину 10-2000 нуклеооснований.

- 24 012799

Конкретные описания δίΚΝΑ данного изобретения

Данное изобретение обеспечивает соединение, имеющее структуру (структуру А):

5' (Ν)_χ - Ζ 3' (антисмысловая цепь),

3'Ζ' - (Ν')_γ 5' (смысловая цепь), где каждый N и Ν' обозначает рибонуклеотид, который может быть модифицированным или немодифицированным в его сахарном остатке, а (Ν)_χ и (Ν')_γ обозначает олигомер, в котором каждый последовательный N или Ν' соединен с последующим N или Ν' ковалентной связью;

где каждый из х и у обозначает целое число 19-40;

где каждый из Ζ и Ζ' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, обозначает 6Т6Т и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует; и где последовательность (Ν)_χ содержит антисмысловую последовательность относительно кДНК гена ΚΤΡ801.

В частности, данное изобретение обеспечивает вышеуказанное соединение, в котором последовательность (Ν)_χ содержит одну или несколько антисмысловых последовательностей, присутствующих в табл. А, В и С.

В частности, данное изобретение обеспечивает вышеуказанное соединение, где ковалентной связью является фосфодиэфирная связь, где х=у, предпочтительно х=у=19, где Ζ и Ζ' оба отсутствуют, где по меньшей мере один рибонуклеотид является модифицированным в его сахарном остатке в положении 2', где группой в положении 2' является метокси (2'-О-метил), где чередующиеся рибонуклеотиды являются модифицированными как в антисмысловой, так и в смысловой цепях и где рибонуклеотиды на 5'- и 3'концах антисмысловой цепи являются модифицированными в их сахарных остатках, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными в их сахарных остатках.

В частности, δίΚΝΑ, используемая в данном изобретении, является олигорибонуклеотидом, где одна цепь содержит последовательные нуклеотиды, имеющие от 5' к 3' последовательность, представленную в 8Е0 ΙΌ N0:3-52 или в 8Е0 ΙΌ N0:103-174 или в 8Е0 ΙΌ N0:247-295 (которые являются смысловыми цепями), где множество оснований могут быть модифицированными, предпочтительно 2-О-метилмодификацией, или ее гомолог, где изменено основание в сегменте до 2 нуклеотидов в каждом концевом районе.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ лечения пациента, страдающего респираторным нарушением, глазной болезнью, микрососудистым нарушением или повреждением или заболеванием спинного мозга, предусматривающий введение этому пациенту фармацевтической композиции, содержащей соединение вышеуказанной структуры (А) (имеющей любые вышеупомянутые специфические признаки), в терапевтически эффективном количестве с тем, чтобы таким образом лечить пациента. Кроме того, данное изобретение обеспечивает применение терапевтически эффективного количества вышеуказанной структуры (А) (имеющей любые вышеупомянутые специфические признаки) для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего респираторным нарушением, глазной болезнью, микрососудистым нарушением или повреждением или заболеванием спинного мозга.

Дополнительный аспект данного изобретения обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую соединение вышеуказанной структуры (А) для лечения любого из упомянутых здесь заболеваний и состояний.

Кроме того, этот аспект обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую два или более соединений вышеуказанной структуры (А) для лечения любого из упомянутых здесь заболеваний и состояний, причем указанные два соединения могут быть физически смешаны вместе в фармацевтической композиции в количествах, которые генерируют одинаковую или полезную в другом отношении активность, или могут быть ковалентно или нековалентно связаны или соединены вместе линкером нуклеиновой кислоты с длиной в диапазоне 2-100, предпочтительно 2-50 или 2-30 нуклеотидов. Таким образом, такие молекулы δίΚΝΑ состоят из двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты, описанной здесь, причем две последовательности δίΚΝΑ, выбранные из табл. А-С и предпочтительно из табл. А, 8Е0 ΙΌ N0:14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50, являются ковалентно или нековалентно связанными или соединенными вместе линкером с образованием тандемной молекулы δίΚΝΑ. Такие тандемные молекулы δίΚΝΑ, содержащие две последовательности δίΚΝΑ, будут обычно иметь длину из 38-150 нуклеотидов, более предпочтительно 38 или 40-60 нуклеотидов и большую длину, если в эту тандемную молекулу включены более чем две последовательности δίΚΝΑ. Считается, что такие тандемные молекулы также являются частью данного изобретения, и дополнительная информация, касающаяся их, приведена ниже.

Указанные, объединенные или тандемные структуры имеют то преимущество, что токсичность и/или не относящиеся к нацеливанию действия каждой δίΚΝΑ являются минимизированными, тогда как эффективность является увеличенной.

В частности, δίΚΝΑ, используемые в примерах, были модифицированы таким образом, что 2'-О-Мегруппа присутствовала на первом, третьем, пятом, седьмом, девятом, одиннадцатом, тринадцатом, пятнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом нуклеотиде антисмысловой цепи, причем та же самая модификация, т.е. 2'-О-Му-группа, присутствовала на втором, четвертом, шестом, восьмом, десятом, двенадца

- 25 012799 том, четырнадцатом, шестнадцатом и восемнадцатом нуклеотиде смысловой цепи. Кроме того, следует отметить, что в случае конкретных нуклеиновых кислот по данному изобретению первый сегмент является идентичным первой цепи, а второй сегмент является идентичным второй цепи, и эти нуклеиновые кислоты являются также затупленными. δίΚ,ΝΑ была фосфорилированной, но ожидается, что нефосфорилированная версия может быть более простой для получения в крупном масштабе, и было обнаружено, что указанная нефосфорилированная ΚΕΌΌ14, названная ΚΕΌΌ14ΝΡ, является точно такой же биологически активной, что и ΚΕΌΌ14, в модели СКУ (см. пример 6). Последовательностью этой δίΚ,ΝΑ. используемой в экспериментах в примерах 6-8, является последовательность ΚΕΌΌ14, т.е. последовательность, имеющая внутреннюю ссылку № 14 (см. табл. А).

Концевым районом этого олигонуклеотида называют основания 1-4 и/или 16-19 в 19-мерных последовательностях (табл. А и В ниже) и основания 1-4 и/или 18-21, в 21-мерных последовательностях (табл. С ниже).

Дополнительно, δίΚΝΑ, используемые в данном изобретении, являются олигорибонуклеотидами, причем одна цепь содержит последовательные нуклеотиды, имеющие от 5'-конца к З'-концу последовательность, представленную 8Ε0 ГО N0:53-102, или 8Ε0 ГО N0:175-246, или 8Ε0 ГО N0:296-344 (антисмысловые цепи), или ее гомолог, в котором изменено основание в сегменте до 2 нуклеотидов в каждом концевом районе. Таким образом, в конкретных аспектах этот олигонуклеотид содержит двухцепочечную структуру, причем такая двухцепочечная структура содержит первую цепь и вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов, причем этот первый сегмент является либо комплементарным, либо идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ген ΚΤΡ801, причем второй сегмент является либо идентичным, либо комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801. Указанный первый сегмент содержит по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов и даже более предпочтительно 19 нуклеотидов или даже по меньшей мере 21 нуклеотид. В одном варианте осуществления этот первый сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида. В одном варианте осуществления этот второй сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида или даже приблизительно 19 нуклеотидов - 21 нуклеотид. В одном варианте осуществления первый нуклеотид первого сегмента соответствует нуклеотиду последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801, вследствие чего последний нуклеотид этого первого сегмента соответствует нуклеотиду последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801. В одном варианте осуществления первый сегмент содержит последовательность по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов олигонуклеотида, причем такой олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из 8Ε0 ГО N0:3-344, предпочтительно из группы, содержащей олигонуклеотиды, имеющие последовательность любого из последовательных номеров 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 в табл. А. Дополнительные описания молекул δίΚ^Α, используемых в данном изобретении, могут обеспечивать олигорибонуклеотид, в котором динуклеотид άΤάΤ ковалентно присоединен к 3'-концу и/или по меньшей мере в одном нуклеотиде сахарный остаток является модифицированным, возможно, модификацией, содержащей 2'-О-метил-модификацию. Кроме того, 2'-ОНгруппа может быть заменена группой или частью молекулы, выбранной из группы, состоящей из -НОСН₃, -ОСН₂СН₃, -0СН₂СН₂СН₃, -Е1Н₂ и Р. Кроме того, предпочтительные соединения данного изобретения, как описано выше, могут быть фосфорилированными или нефосфорилированными.

Кроме того, δ^ΚNΑ, используемые в данном изобретении, могут быть олигорибонуклеотидом, в котором в чередующихся нуклеотидах модифицированные сахара расположены в обеих цепях. Конкретно, этот олигорибонуклеотид может содержать одну из смысловых цепей, в которой сахар является немодифицированным в 5'- и 3'-нуклеотидах, или одну из антисмысловых цепей, в которой сахар модифицирован в концевых 5'- и 3'-нуклеотидах.

Кроме того, дополнительные нуклеиновые кислоты, которые могут быть использованы в данном изобретении, содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов любой из 8Ε0 ГО N0:3-344 и более предпочтительно 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, как описано выше. Специалисту с квалификацией в данной области должно быть понятно, что при наличии потенциальной длины нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением и, в частности, отдельных сегментов, образующих такую нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением, возможны некоторые смещения относительно кодирующей последовательности гена ΚΤΡ801, как показано в 8Ε0 ГО N0:1, в каждую сторону, причем такие смещения могут быть на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 нуклеотидов в обоих направлениях, причем генерированные таким образом двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот будут также находиться в рамках данного изобретения.

Дополнительный аспект данного изобретения относится к функциональной нуклеиновой кислоте, содержащей двухцепочечную структуру, где такая двухцепочечная структура содержит первую цепь и

- 26 012799 вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов, причем этот первый сегмент является либо комплементарным, либо идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, а второй сегмент является либо идентичным, либо комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801.

В одном варианте осуществления эта нуклеиновая кислота отрицательно регулируется КТР801, причем эта отрицательная регуляция КТР801 выбрана из группы, состоящей из отрицательной регуляции функции КТР801, отрицательной регуляции белка КТР801 и отрицательной регуляции экспрессии мРНК КТР801.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов и даже более предпочтительно 19 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида.

В одном варианте осуществления второй сегмент содержит приблизительно 14-40 нуклеотидов, предпочтительно приблизительно 18-30 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно 19-27 нуклеотидов и наиболее предпочтительно приблизительно 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида.

В одном варианте осуществления первый нуклеотид первого сегмента соответствует нуклеотиду последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, причем последний нуклеотид первого сегмента соответствует нуклеотиду последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801.

В одном варианте осуществления один сегмент содержит последовательность из по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, причем такая последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательностей, описанных в табл. А-С, предпочтительно из группы, содержащей 8ΕΟ ΙΌ N0:53, 66, 67, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 91, 92, 93, 94, 96, 101 и 102, более предпочтительно выбранных из группы, содержащей 8Ε0 ΙΌ N0:66, 75, 79, 91, 94, 101 и 102, и наиболее предпочтительно выбранных из группы, содержащей 8Ε0 ΙΌ N0:66, 74, 75 и 79.

В одном варианте осуществления другой сегмент содержит последовательность из по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, причем такая последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из последовательностей, описанных в табл. А-С, предпочтительно из группы, содержащей 8Ε0 ΙΌ N0:3, 16, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 51 и 52, более предпочтительно выбрана из группы, содержащей 8Ε0 ΙΌ N0:16, 24, 25, 29, 41, 44, 51 и 52, и наиболее предпочтительно выбрана из группы, содержащей 8Ε0 ΙΌ N0:16, 24, 25 и 29.

В одном варианте осуществления первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:53, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:3;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:66, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:16;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:67, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:17;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:72, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:22;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:73, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:23;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:74, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0: 24;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:75, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:25;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:76, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:26;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:77, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:27;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:79, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:29;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:91, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:41;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:92, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:42;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:93, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:43;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:94, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:44;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Ε0 ΙΌ N0:95, а второй сегмент имеет

- 27 012799 последовательность в соответствии с 8ЕО ΙΌ ΝΟ:45;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:96, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:46;

первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:101, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:51; и первый сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:102, а второй сегмент имеет последовательность в соответствии с 8Е0 ΙΌ ΝΟ:52.

В одном варианте осуществления первый сегмент имеет последовательность нуклеиновой кислоты, которая выбрана из группы, содержащей 8Е0 ΙΌ ΝΟ:53, 66, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 101 и 102.

Должно быть понятно, что, хотя термины «первый» и «второй» сегмент используются вместе с нуклеиновыми кислотами данного изобретения, они используются только для удобства, и любая молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения, которая описана как имеющая первый сегмент с последовательностью X и второй сегмент с последовательностью Υ, могла бы быть также описана как имеющая первый сегмент с последовательностью Υ и второй сегмент с последовательностью X, пока является ясным, что один сегмент содержится в антисмысловой цепи, которая должна быть антисмысловой относительно части кодирующей последовательности гена НТР801, а другой сегмент содержится в смысловой цепи, которая должна быть комплиментарной (хотя и не на 100% комплементарной) антисмысловой цепи, в соответствии с определениями и описаниями, представленными здесь.

В одном варианте осуществления первая и/или вторая цепь содержит, по меньшей мере, выступ из одного нуклеотида на 3'-конце, который является комплементарным или идентичным соответствующему нуклеотиду последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей НТР801.

В одном варианте осуществления первая и/или вторая цепь содержит выступ из 1-15 нуклеотидов на 3'-конце, предпочтительно первая и/или вторая цепь содержит выступ из 1-10 нуклеотидов на 3'конце, более предпочтительно первая и/или вторая цепь содержит выступ из 1-5 нуклеотидов на 3'-конце и наиболее предпочтительно первая и/или вторая цепь содержит выступ из 1-2 нуклеотидов на 3'-конце.

В одном варианте осуществления первая и/или вторая цепь содержит, по меньшей мере, выступ из одного нуклеотида, который является отличающимся от соответствующего нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей НТР801.

В одном варианте осуществления первая цепь содержит выступ из двух нуклеотидов, которые является отличающимися от соответствующего нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей НТР801.

В одном варианте осуществления первая цепь состоит только из первого сегмента.

В одном варианте осуществления вторая цепь состоит только из второго сегмента.

В одном варианте осуществления первый сегмент и/или первая цепь содержит рибонуклеотиды.

В одном варианте осуществления второй сегмент и/или вторая цепь содержит рибонуклеотиды.

В одном варианте осуществления первый сегмент и/или вторая цепь состоят из рибонуклеотидов.

В одном варианте осуществления некоторые или все эти нуклеотиды являются модифицированными.

В предпочтительном варианте осуществления такая модификация относится к нуклеооснованию нуклеотида, сахарной части нуклеотида и/или фосфатной части нуклеотида.

В более предпочтительном варианте осуществления этой модификацией является модификация сахарной части, и эта модификация находится в положении 2', причем 2'-ОН-группа заменена группой или частью молекулы, выбранной из группы, содержащей -Η-ΟΟΗ₃, -ΟΟΗ₂ΟΗ₃, -ΟΟΗ₂ΟΗ₂ΟΗ₃, -ΝΗ₂ и -Ρ.

В одном варианте осуществления этой модификацией является модификация нуклеооснования, или модифицированное нуклеооснование выбрано из группы, содержащей инозин, ксантин, гипоксантин, 2аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 5галогеназацитозин, 6-азацитозин, 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8галогенгуанины, 8-аминогуанины, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанин, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5трифторцитозин.

В одном варианте осуществления этой модификацией является модификация фосфатной части молекулы, причем модифицированная фосфатная часть выбрана из группы, содержащей фосфотиоат.

В одном варианте осуществления первый сегмент и/или второй сегмент содержит множество групп модифицированных нуклеотидов, имеющих модификацию в положении 2', причем в этом сегменте каждая группа модифицированных нуклеотидов фланкирована на одной или на обеих сторонах фланкирующей группой нуклеотидов, причем эти фланкирующие нуклеотиды, образующие фланкирующую группу нуклеотидов, являются либо немодифицированными нуклеотидами, либо нуклеотидами, имеющими модификацию, отличающуюся от модификации модифицированных нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления первый сегмент и/или второй сегмент состоит из рибонуклеотидов.

- 28 012799

В более предпочтительном варианте осуществления первый сегмент и второй сегмент содержат множество групп модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит указанное множество групп модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления второй сегмент содержит указанное множество групп модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления каждая группа модифицированных нуклеотидов и/или каждая группа фланкирующих нуклеотидов содержит некоторое количество нуклеотидов, причем это количество нукдеотидов выбрано из группы, содержащей 1 нуклеотид - 10 нуклеотидов.

В одном варианте осуществления первый сегмент содержит первое распределение модифицированных нуклеотидов, а второй сегмент содержит второе распределение модифицированных нуклеотидов.

В одном варианте осуществления первое распределение является тем же самым распределением, что и второе распределение.

В другом варианте осуществления первое распределение сопоставляется со вторым распределением.

В предпочтительном варианте осуществления первое распределение смещено на один или несколько нуклеотидов относительно второго распределения.

В одном варианте осуществления каждая из групп модифицированных нуклеотидов состоит из одного модифицированного нуклеотида и каждая из групп фланкирующих нуклеотидов состоит из одного немодифицированного нуклеотида, имеющего модификацию, которая является отличающейся от модификации модифицированных нуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления модифицированный нуклеотид имеет группу -ОМе в положении 2'.

В предпочтительном варианте осуществления фланкирующим нуклеотидом является рибонуклеотид, который имеет 2'-ОН-группу.

В одном варианте осуществления первый сегмент начинается с модифицированного нуклеотида на 5'-конце и каждый другой нуклеотид этого сегмента является также модифицированным нуклеотидом, тогда как второй нуклеотид от 5'-конца и каждый другой нуклеотид является немодифицированным нуклеотидом или нуклеотидом, имеющим модификацию, которая является отличающейся от модификации. этого модифицированного нуклеотида (модифицированных нуклеотидов).

В одном варианте осуществления первый сегмент находится в антисмысловой ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801.

Дополнительный аспект данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту в соответствии с первым аспектом данного изобретения и/или вектор в соответствии со вторым аспектом данного изобретения и предпочтительно фармацевтически приемлемый носитель; причем указанная композиция предназначена необязательно для системного или местного применения.

В одном варианте осуществления эта композиция предназначена для лечения заболевания, причем это заболевание выбрано из группы, содержащей опухолевые заболевания.

В дополнительном аспекте проблема, лежащая в основе данного изобретения, решается с использованием способа профилактики и/или лечения пациента, нуждающегося в таком предупреждении и/или лечении, предусматривающего введение нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением, и/или вектора в соответствии с данным изобретением, и/или композиции в соответствии с данным изобретением.

В дополнительном варианте осуществления нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением и/или вектор в соответствии с данным изобретением используют для приготовления лекарственного средства. Это лекарственное средство может быть предназначено для профилактики и/или лечения заболевания, причем такое заболевание выбрано из группы, содержащей опухолевые заболевания. Это опухолевое заболевание может быть выбрано из группы, содержащей солидные опухоли, метастатические опухоли, в том числе ΡΤΕΝ-отрицательные опухоли, опухоли, которые являются устойчивыми к лекарственным средствам, и опухоли, в которых ингибирование ΚΤΡ801 может быть использовано для сенсибилизации. Кроме того, этим опухолевым заболеванием может быть опухолевое заболевание последней стадии или это опухолевое заболевание может включать клетки, которые являются нечувствительными к опухолевому супрессору; указанным опухолевым супрессором может быть ΡΤΕΝ.

Дополнительный аспект данного изобретения решается способом конструирования нуклеиновой кислоты или скрининга на нуклеиновую кислоту, которая пригодна для отрицательной регуляции ΚΤΡ801, предусматривающим следующие стадии:

a) конструирование или скрининг нуклеиновой кислоты, которая пригодна для отрицательной регуляции ΚΤΡ801;

b) оценку дефекта нуклеиновой кислоты в соответствии с любым из вышеуказанных аспектов данного изобретения;

c) сравнение действия нуклеиновой кислоты стадии а) с действием нуклеиновой кислоты стадии Ь).

- 29 012799

В одном варианте осуществления этим действием является отрицательная регуляция КТР801.

Дополнительным аспектом данного изобретения является применение нуклеиновой кислоты по данному изобретению в качестве сенсибилизатора, в частности, в качестве сенсибилизатора в лечении заболевания, причем такое заболевание выбрано из группы, содержащей опухоль и, более конкретно, опухолей, которые являются резистентными к лечению с использованием химиотерапевтических и/или радиотерапевтических средств. Дополнительные заболевания, для которых нуклеиновая кислота данного изобретения может служить в качестве сенсибилизатора, описаны здесь.

Данная заявка описывает, что нуклеиновая кислота, содержащая двухцепочечную структуру, которая является специфической в отношении КТР801, является подходящим средством ингибирования ангиогенеза/роста сосудистой сети и подтекания сосудов (как из существующей кровеносной сети, так и из растущей сосудистой сети). Кроме того, эта заявка описывает (без связывания теорией), что КТР801, являясь индуцируемым стрессом белком (индуцируемым гипоксией, окислительным стрессом, тепловым стрессом, ЕК-стрессом), является фактором, действующим в тонкой настройке реакции клетки на нарушение баланса энергии. Таким образом, ингибирование КТР801 такой двухцепочечной нуклеиновой кислотой является пригодным для лечения любого заболевания, в котором клетки должны быть спасены от апоптоза вследствие стрессовых условий (например, заболеваний, сопровождающихся гибелью нормальных клеток) или в котором клетки, адаптированные к стрессовым состояниям вследствие изменений в экспрессии КТР801, должны убиваться (например, опухолевые клетки). В последнем случае после ингибирования КТР801 такой двухцепочечной нуклеиновой кислотой фактор выживания с антиапоптотической функцией в гипоксических клетках, более конкретно в гипоксических раковых клетках, становится неэффективным, позволяя, следовательно, клеткам, лишенным КТР801-опосредованной защиты, переходить в апоптоз. Это может встречаться также, когда присутствуют другие стимулирующие апоптоз факторы. Такие другие стимулирующие апоптоз факторы включают, среди прочих, химиотерапию и лучевую терапию. Другими словами, двухцепочечная нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может быть эффективной в лечении рака (в качестве монотерапии), а также в качестве дополнительной терапии.

Такая двухцепочечная структура содержит первую цепь и вторую цепь, причем первая цепь содержит первый сегмент смежных нуклеотидов, а вторая цепь содержит второй сегмент смежных нуклеотидов, причем этот первый сегмент является либо комплементарным, либо идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ген КТР801, причем второй сегмент является либо идентичным, либо комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801. Таким образом, с использованием, в частности, КТР801 в качестве мишени для такого типа двухцепочечной нуклеиновой кислоты можно также непосредственно действовать на мишень в каскаде, участвующем в росте и развитии сосудистой сети и ангиогенезе соответственно, и, следовательно, отличающимся путем в сравнении с путем, используемым ингибиторами УЕСР, такими как антитела к УЕСР. Не желая связывать себя теорией, авторы данного изобретения предполагают, что нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может проявлять свою функцию в клетках, которые обеспечивают фон, который участвует или наблюдается в связи с любым заболеванием, при котором имеет место нежелательный, в частности, индуцированный гипоксией ангиогенез и/или рост или развитие сосудистой сети. Это понимание подтверждается обнаружением того, что мыши с нокаутом КТР801 не проявляют никакого фенотипа, отличающегося от фенотипа мышей дикого типа, при негипоксических состояниях. Только после индукции гипоксии, как наблюдалось в патологическом состоянии, таком как, например, опухолевый рост, нокаут КТР801 приводит к патологии, сходной с патологией, наблюдаемой у людей, страдающих от этого типа заболевания.

Должно быть понятно, что нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением является предпочтительно функциональной нуклеиновой кислотой. В данном контексте термин функциональная нуклеиновая кислота предпочтительно обозначает нуклеиновую кислоту, функция которой отличается от функции быть активной в клетке в качестве матрицы для транскрипции любой гетерогенной ядерной РНК (гяРНК), мРНК или другого продукта транскрипции, причем либо указанная гяРНК, мРНК или любой другой продукт транскрипции соответственно, либо нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением подвергается процессу трансляции, предпочтительно клеточному процессу трансляции, приводящему к биологически активному белку КТР801. Должно быть понятно, что функциональная кислота, как предпочтительно используемая здесь, способна уменьшать экспрессию нуклеиновой кислотымишени. Более конкретно, такое уменьшение основано на посттранскрипционном процессе сайленсинга гена нуклеиновой кислоты-мишени. Еще более предпочтительно, такое уменьшение основано на интерференции РНК. Наиболее предпочтительной формой функциональной нуклеиновой кислоты является молекула δίΚΝΑ или любая другая молекула, имеющая то же самое действие, что и молекула δίΚΝΑ. Такая дополнительная молекула выбрана из группы, содержащей δίΚΝΑ, синтетические δίΚΝΑ, δΙιΚ,ΝΑ и синтетические δΙιΚ,ΝΑ. В данном контексте, δίΚΝΑ могут дополнительно содержать полученные из экспрессирующего вектора δίΚΝΑ, причем этим экспрессирующим вектором является в предпочтительном варианте осуществления вирус, такой как аденовирус, аденоассоциированные вирусы, герпесвирус и лентивирусы. В данном контексте, δΙιΚ,ΝΑ предпочтительно обозначают «шпилечные» РНК (образующие

- 30 012799 петлю РНК). Такие з11КХА могут быть получены синтетически или генерированы с использованием кодируемых вектором систем экспрессии, предпочтительно с использованием промоторов РНКполимеразы III. В связи с этим должно быть понятно, что функциональная нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением направлена на белок КТР801, который также предпочтительно называют здесь мишенью, а нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную мишень, называют нуклеиновой кислотой-мишенью.

В предпочтительном использовании здесь двухцепочечная структура нуклеиновой кислоты по данному изобретению содержит любую двухцепочечную структуру, причем такая двухцепочечная структура предпочтительно генерирована первым сегментом и вторым сегментом, обеспечиваемыми нуклеиновой кислотой, имеющей эту базовую конструкцию. Эта двухцепочечная структура может содержать одно или несколько ошибочных спариваний. Такая двухцепочечная структура образована спариванием оснований по правилам спаривания Уотсона-Крика и/или спариванием оснований по Хугстину и/или с использованием сходных механизмов спаривания оснований. На основе базовой конструкции нуклеиновой кислоты данного изобретения предпочтительным является то, что один сегмент находится в антисмысловой ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть, тогда как другой сегмент находится в смысловой ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть. Вследствие этого один сегмент является комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть, а другой сегмент является идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть. В связи с этим должно быть понятно, что термин идентичный, конечно, обозначает «частично идентичный», причем эта идентичность, выраженная в виде гомологии, равна по меньшей мере 80%, предпочтительно 90%, более предпочтительно 95, 96, 97, 98, 99 или 100%. Подобно определению идентичности комплементарность может быть определена в виде гомологии, причем такая гомология находится в том же самом диапазоне, что и идентичность, если комплементарная цепь могла бы транслироваться в идентичную цепь в соответствии с правилами спаривания оснований Уотсона-Крика. В альтернативном варианте осуществления один сегмент является идентичным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть, а другой сегмент является комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 или его часть.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением отрицательно регулирует функцию КТР801. Отрицательная регуляция функции КТР801 предпочтительно осуществляется уменьшением уровня экспрессии на уровне белка и/или уровне мРНК, причем такой уменьшенный уровень экспрессии, предпочтительно на уровне белка, может быть таким малым, как 5%, и быть таким высоким, как 100%, относительно экспрессии в условиях, в которых нуклеиновая кислота данного изобретения не вводится или не является функционально активной. Такие условия являются предпочтительно условиями системы экспрессии или условиями, присутствующими в системе экспрессии, предпочтительно системы экспрессии КТР801. Такая система экспрессии является предпочтительно системой трансляции, которая может быть системой трансляции ш νίΐΐΌ, более предпочтительно системой трансляции клетки, органа и/или организма. Более предпочтительно, этот организм является многоклеточным организмом, более предпочтительно млекопитающим, причем такое млекопитающее предпочтительно выбрано из группы, содержащей человека, обезьяну, мышь, крысу, морскую свинку, кролика, кошку, собаку, овцу, корову, лошадь, крупный рогатый скот и свинью. В связи с отрицательной регуляцией должно быть понятно, что указанная отрицательная регуляция может быть функцией времени, т.е. действие отрицательной регуляции не обязательно наблюдается сразу же после введения или функциональной активации нуклеиновых кислот данного изобретения, но может быть отсрочено во времени, а также разнесено в пространстве, т. е. может наблюдаться в различных клетках, тканях и/или органах. Такая отсрочка может быть в диапазоне 5-100%, предпочтительно 10-50%. Специалистам с квалификацией в данной области должно быть понятно, что уменьшение 5% в течение более продолжительного периода времени может быть таким же эффективным, что и уменьшение 100% на протяжении более короткого периода времени. Специалистам с квалификацией в данной области должно быть также понятно, что такая отсрочка в сильной степени зависит от конкретной функциональной нуклеиновой кислоты, фактически используемой, а также от популяции клеток-мишеней и, следовательно, в конечном счете от заболевания, которое должно лечиться и/или предотвращаться в соответствии с технической идеей данной заявки. Таким образом, уменьшение 5% на протяжении более продолжительного периода времени может быть таким же эффективным, что и уменьшение 100% на протяжении более короткого периода времени. Специалистам с квалификацией в данной области должно быть также понятно, что эта отсрочка может иметь место на любом описанном выше уровне, т.е. отсрочка в функции, причем такой функцией является любая функция, проявляемая КТР801, отсрочка экспрессии белка или отсрочка уровня экспрессии мРНК.

В предпочтительном варианте осуществления первый сегмент содержит по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно 14 смежных нуклеотидов. Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что первый сегмент должен иметь длину, которая пригодна для создания возможности направления специфически на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801 и, более

- 31 012799 конкретно, специфически на нуклеиновую кислоту, кодирующую ВТР801, присутствующую в системе трансляции, в которой должна быть уменьшена экспрессия ВТР801. Опять, не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы считают, что имеется взаимодействие между нуклеиновой кислотой по данному изобретению и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801, предпочтительно на уровне транскрипта, т. е. после генерирования мРНК из соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801. Вследствие вероятности того, что любая последовательность нуклеиновой кислоты по данному изобретению является идентичной с последовательностью или комплементарной последовательностью, содержащейся в геноме или транскриптоме системы трансляции, длина первого сегмента должна быть, следовательно, такой длинной, чтобы гарантировать то, что при допущении, что действительно имеет место некоторый тип спаривания оснований между нуклеиновой кислотой, кодирующей ВТР801, и одной из цепей нуклеиновой кислоты по данному изобретению, только последовательность, кодирующая ВТР801, но не другая кодирующая последовательность, предпочтительно не другая существенная кодирующая последовательность, генома или транскриптома, направляется для такого спаривания оснований или таким спариванием оснований. Посредством этой длины может уменьшаться и предпочтительно элиминироваться возникновение эффектов, не имеющих отношения к мишени. Для увеличения строгости этого типа специфического направления на ВТР801 и на кодирующую его нуклеиновую кислоту первый сегмент предпочтительно имеет длину по меньшей мере 18 или 19 нуклеотидов. Верхний предел для длины первого сегмента равен предпочтительно менее чем 50 нуклеотидам, однако эта длина может быть значительно большей и может содержать 100, 200 или даже 500 нуклеотидов или быть любой длины между ними. Кроме этого, специалист с квалификацией в данной области предпочтет иметь скорее короткий первый сегмент, особенно в случае, когда нуклеиновая кислота по данному изобретению химически синтезирована, так как чем короче эта последовательность, тем меньше времени и материала будет требовать ее синтез и тем меньше будет степень встраивания неправильных нуклеотидов в соответствующую последовательность. Другим фактором, который должен учитываться в связи с фиксированием длины первого сегмента, является тот факт, что, обычно при длине выше 50 или более нуклеотидов, может наблюдаться неспецифическая интерфероновая реакция. Переносится ли этот тип неспецифической интерфероновой реакции пациентом или не переносится, зависит от конкретного состояния, подлежащего лечению. Например, интерфероновая реакция могла бы переноситься, если бы эта интерфероновая реакция и/или экспрессия генов интерферонов могла быть ограничена патогенными клетками.

Ввиду этого, более предпочтительными длинами первого сегмента являются длины приблизительно 14-40 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 19-27 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов и 19 нуклеотидов - 23 нуклеотида.

Те же самые рассмотрения, что и описанные выше для первого сегмента, применимы ко второму сегменту, который может, следовательно, иметь любую длину, как описано здесь в связи с первым сегментом. Кроме того, согласно данному изобретению, длина первого сегмента отличается от длины второго сегмента, однако предпочтительно оба сегмента имеют одну и ту же длину.

Согласно базовой конструкции этой нуклеиновой кислоты первый сегмент и второй сегмент являются частями первой цепи и второй цепи соответственно нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Будет понятно, что на любом конце, т.е. на 5'-конце, а также на 3'-конце первый и/или второй сегмент может содержать один или несколько нуклеотидов, предпочтительно дополнительных нуклеотидов, в любой комбинации.

В связи с этим должно быть понятным, что нуклеотиды отдельной цепи, следующие за концом (за концами) сегмента, соответствующего соответствующей цепи, могут быть использованы для дополнительного содействия комплементарности и идентичности соответственно этого сегмента и, следовательно, специфическому направлению на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801.

Будет понятно, что, по существу, на основе обеспеченной здесь технической идеи, нуклеиновая кислота по данному изобретению может быть направлена на любую часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801, предпочтительно кодирующей ВТР801 в системе трансляции, в которой должна быть уменьшена экспрессия ВТР801. Таким образом, данное изобретение содержит любую нуклеиновую кислоту, имеющую характеристики, определенные здесь, причем комплементарные и идентичные цепи и сегменты нуклеиновой кислоты по данному изобретению могут, по существу, начинаться с любого нуклеотида последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801. Таким образом, при условии, что первый сегмент нуклеиновой кислоты по данному изобретению является комплементарным последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801, т.е. является ее антисмысловой цепью или находится в антисмысловой ориентации к ней, первый нуклеотид указанного сегмента, т.е. наиболее 5'-концевой нуклеотид, соответствует т.е. сопоставляется с последним нуклеотидом последовательности, кодирующей ВТР801, на 3'-конце. В следующем варианте осуществления такой наиболее 5'-концевой нуклеотид соответствует предпоследнему нуклеотиду нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801 и т.д., пока не достигается последнее положение, которое при условии этой длины антисмыслового сегмента все еще позволяет этой антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты по данному изобретению быть комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей ВТР801.

- 32 012799

Таким образом, в рамках данного изобретения находится любая нуклеиновая кислота по данному изобретению, которая могла бы быть генерирована сканированием последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801, начиная от наиболее 5'-концевого нуклеотида, и наложением на базовую конструкцию нуклеиновой кислоты по данному изобретению и выявлением характеристик для такой нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Те же самые рассмотрения применимы к описанным здесь вариантам осуществления, где комплементарность и идентичность нуклеиновой кислоты по данному изобретению обеспечивается не только первым сегментом и вторым сегментом, соответственно, но такая комплементарность и идентичность включает также один или несколько нуклеотидов за пределами первого сегмента и второго сегмента, соответственно, являющихся частью первой цепи и второй цепи, соответственно.

Из различных нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, описанных здесь, особенно предпочтительными являются нуклеиновые кислоты с внутренними ссылочными номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 (см. табл. А). В связи с этим следует отметить, что нуклеиновые кислоты по данному изобретению, которые могут быть использованы как в человеке, так и в модели животного, такого как крыса и/или мышь, являются особенно предпочтительными. Неожиданное преимущество этих конкретных нуклеиновых кислот по данному изобретению основано на том факте, что они являются эффективными как в человеке, так и в модели животного, что означает, что тест-результаты, полученные в модели животного, могут быть непосредственно перенесены из модели животного на человека и, более конкретно, без необходимости производить какие-либо изменения в отношении последовательности человека, которые в противном случае становятся необходимыми в случае, когда нуклеиновую кислоту данного изобретения конструировали таким образом, чтобы она содержала (а) последовательность (последовательности), которая отличается (которые отличаются) между видами, более конкретно, видами, используемыми для тестирования модели животного и человека в качестве конечных предпочтительных организмов или пациента. Кроме того, предпочтительно, чтобы эти нуклеиновые кислоты имели распределение модификаций, описанное также в примерах.

Однако в рамках данного изобретения находится также любая из последовательностей, соответствующих 8ЕО ΙΌ N0:3, 16-17, 22-27, 29, 41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79, 91-96 и 101-102, и соответствующие комбинации, приводящие к молекулам нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, имеющим внутренние ссылочные номера 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50, только частично содержатся в дополнительной нуклеиновой кислоте в соответствии с данным изобретением. Предпочтительно дополнительные нуклеиновые кислоты по данному изобретению содержат по меньшей мере 14 смежных нуклеотидов 8ЕО ΙΌ N0:3, 16-17, 22-27, 29, 41-46, 51-53, 66-67, 72-77, 79, 91-96 и 101-102 и более предпочтительно 14 смежных пар нуклеотидных оснований на любом конце двухцепочечной структуры, состоящей из первого сегмента и второго сегмента, описанных в предыдущей таблице. Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что при условии потенциальной длины нуклеиновой кислоты по данному изобретению и, в частности, отдельных сегментов, образующих такую нуклеиновую кислоту, по данному изобретению, возможны некоторые смещения относительно кодирующей последовательности ΚΤΡ801 в каждую сторону, причем такие смещения могут быть смещениями на 1, 2, 3, 4, 5 и 6 нуклеотидов в обоих направлениях, причем генерированные таким образом двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот будут также находиться в рамках данного изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения первый сегмент и первая цепь имеют одну и ту же длину. Подобным образом предпочтительно вторая цепь имеет ту же самую длину, что и второй сегмент, причем даже более предпочтительно первый сегмент и второй сегмент имеют одинаковую длину. В еще более предпочтительном варианте осуществления первая цепь содержит только первый сегмент и вторая цепь содержит только второй сегмент. В даже более предпочтительном варианте осуществления ни первый сегмент и, следовательно, первая цепь, ни второй сегмент и, следовательно, вторая цепь, не содержат выступа. Другими словами, в рамках данного изобретения находится также то, что двухцепочечные нуклеиновые кислоты по данному изобретению являются затупленными на концах, предпочтительно на каждом конце двухцепочечной структуры нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением. Такая затупленная на концах структура может быть осуществлена в связи с любыми другими вариантами нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением, в частности вариантами, в которых нуклеиновые кислоты по данному изобретению имеют распределение модификаций, более предпочтительно распределение модификаций, описанное здесь.

В следующем аспекте нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением имеет, следовательно, базовую конструкцию, которая обеспечивает тупые концы на обеих сторонах двухцепочечной структуры нуклеиновой кислоты данного изобретения. Однако в рамках данного изобретения является также то, что имеется выступ, т. е. сегмент из одного или нескольких нуклеотидов, выступающий из этой двухцепочечной структуры. Этот выступ может находиться, в принципе, на 5'-конце антисмысловой цепи, на 3'-конце антисмысловой цепи, на 5'-конце смысловой цепи и/или на 3'-конце смысловой цепи. Следует отметить, что осуществление любой из указанных возможностей, а также любой их комбинации находится в рамках данного изобретения. Более предпочтительной является комбинация, причем этот выступ расположен на 3'-конце антисмысловой цепи и на 3'-конце смысловой цепи. В рамках данного

- 33 012799 изобретения находится также то, что этот выступ находится на 5'-конце антисмысловой цепи и на 5'конце смысловой цепи. Кроме того, в рамках данного изобретения находится также то, что этот выступ расположен только на антисмысловой цепи двухцепочечной структуры, более предпочтительно на 3'конце антисмысловой цепи двухцепочечной структуры.

В связи с этими выступами следует отметить, что выступ плюс сегмент предпочтительно образуют цепь, и длины, обеспеченные для этих сегментов здесь, применимы также к этим вариантам осуществления. Однако отдельный выступ может содержать так много, как 10 нуклеотидов, и предпочтительно имеет длину два нуклеотида. В рамках данного изобретения находится также то, что соответствующий нуклеотид (соответствующие нуклеотиды), образующий выступ (образующие выступы), является (являются) также комплементарным (комплементарными) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, в случае, когда первая цепь является комплементарной указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, и этот выступ находится на 3'- или 5'-конце антисмысловой цепи, или то, что выступ (выступы) является (являются) идентичным (идентичными) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801, в случае, когда первая цепь является идентичной указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801. Это относится к любому выступу, расположенному на втором сегменте базовой конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением, причем должно быть понятно, что конструкция выступа на втором сегменте может быть независимой от конструкции выступа первого сегмента.

В рамках данного изобретения находится также то, что образующие выступ нуклеотиды не являются ни комплементарными, ни идентичными соответствующим нуклеотидам последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей КТР801. В данном контексте и предпочтительно в этом варианте осуществления «соответствующие» обозначает соответствующие нуклеотиды, которые следуют на 5'-конце и/или 3'-конце сегмента, имеющего нуклеотидную копию на нуклеиновой кислоте, кодирующей КТР801.

Предпочтительно первая цепь содержит на ее 3'-конце два нуклеотида, предпочтительно дезоксинуклеотида, и более предпочтительно два ТТ и/или этот тип нуклеотидов также на 3'-конце второй цепи, причем более предпочтительно длина первого сегмента и второго сегмента равна 19 нуклеотидам. Таким образом, эти цепи состоят из сегмента и выступа. В этом варианте осуществления двухцепочечная структура состоит из 19 пар оснований и выступа из двух нуклеотидов на каждом 3'-конце отдельного сегмента.

В предпочтительном варианте осуществления первый сегмент и/или первая цепь содержат рибонуклеотиды, причем особенно предпочтительно первый сегмент состоит весь из рибонуклеотидов. То же самое применимо ко второму сегменту и ко второй цепи, соответственно. Однако в связи с этим каждый и любой из нуклеотидов первого сегмента и второго сегмента соответственно является модифицированным в предпочтительном варианте осуществления. То же самое применимо к первой цепи и второй цепи, соответственно. В частности, концевые нуклеотиды, независимо от того, являются ли они рибонуклеотидами или дезоксирибонуклеотидами, могут иметь ОН-группу, которая сама может быть модифицирована. Такая ОН-группа может происходить либо из сахарной части нуклеотида, более предпочтительно из 5'-положения в случае 5'-СН-группы и/или 3'-положения в случае 3'-СН-группы, или из фосфатной группы, присоединенной к этой сахарной части соответствующего концевого нуклеотида. Фосфатная группа может быть, в принципе, присоединена к СН-группе сахарной части этого нуклеотида. Предпочтительно, фосфатная группа присоединена к 5'-ОН-группе сахарной части в случае свободной 5'-ОН-группы и/или к 3'-ОН-группе сахарной части в случае свободной 3'-ОН-группы, все еще с обеспечением того, что называется здесь свободной 5'- или 3'-группой.

В контексте любой стратегии для конструирования κίΡΝΆ или любого варианта к£КЫА, описанного здесь, термин концевая модификация обозначает химическую частицу, добавленную к наиболее 5'- или 3'-концевому нуклеотиду первой и/или второй цепи. Примеры таких концевых модификаций включают, но не ограничиваются ими, 3'- или 5'-фосфат, инвертированные (дезокси), не содержащие нуклеооснований нуклеотиды, амино, фтор, хлор, бром, ΟΝ, СЕ, метокси, имидазол, карбоксилат, тиоат, низший С₁ -С₆ алкил, замещенный низший алкил, алкарил или аралкил, ССЕ₃, ΟΟΝ, Ο-, 8- или Ν-алкил; Ο-, 8- или Νалкенил; 8Ο₃ί.Ή₃; 8Ο₃ί'.Ή₃; ΟΝΟ₂; ΝΟ₂, Ν₃; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино или замещенный силил, описанные среди других в Европейских патентах ЕР 0586520 В1 или ЕР 0618925 В1.

В данном контексте алкил или любой термин, содержащий «алкил», предпочтительно обозначает любую цепь атомов углерода, содержащую 1-12, предпочтительно 1-6 или более предпочтительно 1-2 атома углерода.

Дополнительной концевой модификацией является группа биотина. Такая группа биотина может быть предпочтительно присоединена либо к наиболее 5' (левому), либо к или наиболее 3' (правому) нуклеотиду первой и/или второй цепи или к обоим концам. В более предпочтительном варианте осуществления группа биотина связана с полипептидом или белком. В объеме данного изобретения находится то, что этот полипептид или белок присоединен через любую из других вышеуказанных концевых модификаций. Этот полипептид или белок может придавать дополнительные характеристики молекулам нуклеиновых кислот данного изобретения. Среди других свойств этот полипептид или белок может действо

- 34 012799 вать в качестве лиганда для другой молекулы. Если указанной другой молекулой является рецептор, функция и активность рецептора могут быть активированы посредством связывания лиганда. Этот рецептор может обнаруживать активность интернализации, которая делает возможной трансфекцию лигандсвязанных молекул нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением. Примером лиганда для связывания с молекулой нуклеиновой кислоты данного изобретения является УЕСЕ, а соответствующим рецептором является рецептор УБСЕ.

Различные возможные варианты δ^ΚNΑ данного изобретения, имеющие различные типы концевой модификации (концевых модификаций), представлены в следующей табл. 1.

Таблица 1. Различные варианты интерферирующей рибонуклеиновой кислоты

в соответствии с данным изобретением
	1-ая цель/1-ый сегмент	2-ая цепь/2-ой сегмент
1)	5'-конец	свободный ОН	свободный ОН
	3'-конец	свободный ОН	свободный ОН
2)	5'-конец	свободный ОН	свободный ОН
	3'-конец	концевая модификация	концевая модификация
3)	5'-конец	свободный ОН	свободный ОН
	3'-конец	свободный ОН	концевая модификация
4)	5'-конец	свободный ОН	свободный ОН
	3'-конец	концевая модификация	свободный ОН
5)	5'-конец	свободный ОН	концевая модификация
	3'-конец	свободный ОН	свободный ОН
6)	5'-конец	свободный ОН	концевая модификация
	3'-конец	концевая модификация	свободный он
7)	5'-конец	свободный ОН	концевая модификация
	3'-конец	свободный ОН	концевая модификация
8)	5'-конец	свободный конец	концевая модификация
	3' -конец	концевая модификация	концевая модификация

Различные концевые модификации, описанные здесь, предпочтительно расположены на рибозной части нуклеотида нуклеиновой кислоты данного изобретения. Более конкретно, концевая модификация может быть присоединена в ОН-группам или может заменять ОН-группы рибозной части молекулы, в том числе, но не только, в положении 2'ОН, 3'ОН и 5'ОН, при условии, что модифицированный таким образом нуклеотид является концевым нуклеотидом. Инвертированные не содержащие нуклеооснований нуклеотиды являются дезоксирибонуклеотидами или рибонуклеотидами, которые не содержат части, являющейся нуклеооснованием. Этот тип соединения, среди других, описан в 81егпЬегд, Μ., 8сЬт1ейекпесЫ, Α., Кге1зсйпег, Α., беЬБагЩ, Р., Ееепбега, Р., Схаибета, Р., Уоп Саг1о^11х, I., Бпд1е, Μ., С^еδе. К., Ве1де1тап, Ь. & К11рре1, Α. (2002). ЛпЩеще ШсШс Ααά Эгид Эсу, 12, 131-43.

Любые из вышеуказанных концевых модификаций могут быть использованы в связи с различными вариантами δίΚ^Α, изображенными в табл. 1. Следует отметить, что 5'-концевые модификации, указанные выше, присутствуют обычно только в смысловой цепи молекулы δ^ΚNΑ.

Дополнительные модификации могут быть связаны с частью-нуклеооснованием, сахарной частью или фосфатной частью отдельного нуклеотида.

Такая модификация части-нуклеооснования может выполняться таким образом, что производные аденина, гуанина, цитозина, тимидина и урацила являются модифицированными. Особенно предпочтительные модифицированные нуклеооснования выбраны из группы, содержащей инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил, 5-галогенцитозин, 5-галогеназацитозин, 6-азацитозин, 6-азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8аминоаденин, 8-тиоладенин, 8-тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8галогенгуанины, 8-аминогуанин, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанин, 8-гидроксилгуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5трифторцитозин.

В другом предпочтительном варианте осуществления сахарная часть нуклеотида является модифицированной, причем такая модификация находится предпочтительно в положении 2' рибозной или дезоксирибозной части молекулы, соответственно. Более предпочтительно, 2'ОН-группа заменена группой или частью молекулы, выбранной из группы, содержащей амино, фтор, алкокси и алкил. Предпочтительно, алкокси является метокси или бутокси. Также предпочтительно алкил обозначает метил, этил, пропил, изобутил, бутил и изопропил. Даже более предпочтительно независимо от типа модификации этим нуклеотидом является предпочтительно рибонуклеотид.

Модификация фосфатной части молекулы предпочтительно выбрана из группы, содержащей фосфотиоаты.

- 35 012799

Специалисту с квалификацией в данной области будет понятно, что нуклеиновая кислота данного изобретения, которая состоит из множества нуклеотидов, может быть, следовательно, образована нуклеотидами, которые связаны через фосфодиэфирную связь или через фосфотиоатную связь, или комбинацией обеих вдоль длины нуклеотидной последовательности отдельной цепи и сегмента, соответственно.

Дополнительной используемой формой нуклеотидов может быть фактически δίΚΝΑ, которая, среди других, описана в Международной заявке на патент А0 03/070918.

Нуклеотиды, образующие первый сегмент и первую цепь соответственно нуклеиновой кислоты данного изобретения, могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, причем отдельный модифицированный нуклеотид имеет модификацию, которая предпочтительно является модификацией, описанной здесь. Кроме этой конкретной модификации, эта модификация может быть меткой или может содержать метку определенного сорта, причем эта метка выбрана из группы хемилюминесцентных меток, флуоресцентных меток и радиоактивных меток. Эти типы меток известны специалисту с квалификацией в данной области и, например, описаны в Л1Ы1Ье1 е1 а1.: Сиггеп! ΡΐΌΐο^1δ ίη Мо1еси1аг Βίο1ο§γ, ίοΐιιη АПеу апб 8οηδ, ВаШтоге, Магу1апб, 1998. Меченая таким образом нуклеиновая кислота данного изобретения может быть использована также для диагностических целей или для мониторинга места действия, а также для демонстрации любого лечения, предпочтительно связанного с любым из описанных здесь заболеваний.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновую кислоту в соответствии с данным изобретением модифицируют таким образом, что пиримидиновые нуклеотиды в смысловом сегменте или смысловой цепи являются 2'0-метилпиримидиновыми нуклеотидами и, либо дополнительно, либо альтернативно, пуриновые нуклеотиды в смысловом сегменте или смысловой цепи являются 2'дезоксипуриновыми нуклеотидами. В дополнительном варианте осуществления пиримидиновые нуклеотиды, присутствующие в смысловом сегменте или смысловой цепи, являются 2-дезокси-2'фторпиримидиновыми нуклеотидами.

В альтернативном варианте осуществления модификация не основана на химии нуклеотида, т.е. модификация зависит от того, является ли подлежащий модификации нуклеотид пуриновым или пиримидиновым нуклеотидом, но преимущественно основана на пространственном размещении отдельного нуклеотида в общей двухцепочечной структуре базовой конструкции нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением.

Более конкретно, либо первая цепь и первый сегмент, либо вторая цепь и второй сегмент обнаруживают пространственное распределение модификации нуклеотидов, образующих указанные сегменты и цепи, соответственно.

Фокусируя сначала внимание на первом сегменте, следует отметить, что имеется распределение групп модифицированных нуклеотидов и групп немодифицированных нуклеотидов. Эти группы немодифицированных нуклеотидов называют здесь также фланкирующими группами нуклеотидов. Более предпочтительно, это распределение состоит из групп модифицированных и немодифицированных нуклеотидов. Даже более предпочтительно это распределение является регулярным распределением и даже более предпочтительно чередующимся распределением вдоль длины первого сегмента нуклеиновой кислоты данного изобретения. Группа модифицированных нуклеотидов может состоять либо из одного, либо из нескольких нуклеотидов, которые являются модифицированными и которые являются предпочтительно нуклеотидами, которые модифицированы в положении 2', т. е. имеют модификацию в сахарной части молекулы. Более предпочтительно, этой модификацией является 2'-О-Ме-модификация.

Группа не-модифицированных нуклеотидов может состоять из одного или нескольких нуклеотидов, которые либо являются немодифицированными, причем немодифицированные нуклеотиды являются предпочтительно рибонуклеотидами, либо эти немодифицированные нуклеотиды являются нуклеотидами, имеющими модификацию, причем такая модификация является отличающейся от модификации, обнаруживаемой нуклеотидами, образующими группу модифицированных нуклеотидов. Даже более предпочтительно, немодифицированные нуклеотиды являются рибонуклеотидами. Следует отметить, что термин немодифицированные и не-модифицированные используется взаимозаменяемо, если нет другого указания. Первый сегмент нуклеиновой кислоты по данному изобретению может начинаться либо с группы модифицированных нуклеотидов, либо с группы не-модифицированных нуклеотидов, определенных здесь. Однако предпочтительно первый сегмент начинается с группы модифицированных нуклеотидов. Наиболее предпочтительно, группа модифицированных нуклеотидов состоит из единственного нуклеотида. В связи с этим вариантом осуществления первый сегмент находится предпочтительно в антисмысловой ориентации относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей ΚΤΡ801. В рамках данного изобретения находится также то, что модификация, проявляемая нуклеотидами, образующими группу модифицированных нуклеотидов, является одинаковой для всех групп модифицированных нуклеотидов, присутствующих на первом сегменте. Однако в рамках данного изобретения находится также то, что некоторая группа модифицированных нуклеотидов имеет другую модификацию, чем модификация одной или нескольких групп модифицированных нуклеотидов, присутствующих на первом сегменте.

На втором сегменте нуклеиновой кислоты по данному изобретению может также находиться рас

- 36 012799 пределение, описанное для первого сегмента. Такие же характеристики, какие описаны в связи с первым сегментом, могут быть также представлены в варианте на втором сегменте, причем, предпочтительно, при условии, что второй сегмент находится в смысловой ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей НТР801, вторая цепь нуклеиновой кислоты по данному изобретению начинается с группы не-модифицированных нуклеотидов.

Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением, содержащая двухцепочечную структуру, может содержать первый сегмент, имеющий описанное здесь распределение модификаций. Альтернативно, двухцепочечная нуклеиновая кислота по данному изобретению может содержать второй сегмент, имеющий распределение модификаций, описанное выше. Однако, наиболее предпочтительно, двухцепочечная нуклеиновая кислота по данному изобретению состоит из первого сегмента и второго сегмента, причем как первый сегмент, так и второй сегмент имеют пространственное распределение модификаций, как описано здесь.

В рамках данного изобретения находится то, что характеристики пространственного распределения модификаций являются одинаковыми на обоих сегментах по размеру групп модифицированных нуклеотидов и групп не-модифицированных нуклеотидов и типу фактически используемых модификаций. Предпочтительно пространственное распределение модификаций на первом сегменте смещено таким образом, что группа модифицированных нуклеотидов на первом сегменте находится напротив группы не-модифицированных нуклеотидов на втором сегменте и νίοο νοΓδη. Однако в рамках данного изобретения находится также то, что эти распределения точно сопоставляются, т. е. что группа модифицированных нуклеотидов на первом сегменте находится напротив группы не-модифицированных нуклеотидов на втором сегменте, а группа не-модифицированных нуклеотидов на первом сегменте находится напротив группы не-модифицированных нуклеотидов на втором сегменте. В рамках данного изобретения находится также то, что пространственное распределение модификаций на первом сегменте и втором сегменте смещено относительно друг друга таким образом, что первая часть группы модифицированных нуклеотидов на одном сегменте находится напротив части группы не-модифицированных нуклеотидов на другом сегменте, тогда как вторая часть группы модифицированных нуклеотидов находится напротив другой группы модифицированных нуклеотидов. В рамках данного изобретения находится также то, что приведенное здесь описание пространственного распределения модификаций сегмента (сегментов) нуклеиновой кислоты по данному изобретению применимо также к цепи (цепям) нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Однако, предпочтительно, сегменты этой нуклеиновой кислоты имеют пространственное распределение модификаций, и эти цепи содержат такие сегменты и один или несколько выступов, описанных здесь. Особенно предпочтительным является то, что этот выступ является фосфатной группой на 3'-конце антисмысловой или смысловой цепи или обеих цепях, причем более предпочтительно, эта фосфатная группа находится на 3'-конце как антисмысловой цепи, так и смысловой цепи. В еще более предпочтительном варианте осуществления фосфатная группа является описанной здесь фосфатной группой.

В рамках данного изобретения находится также то, что нуклеиновая кислота по данному изобретению может иметь линкер, соединяющий первую и вторую цепь. Таким линкером является предпочтительно полимер. Этот полимер может быть любым синтетическим или природным полимером. Возможными синтетическими линкерами являются, среди прочих, ПЭГ или полинуклеотид. Такой линкер предпочтительно конструируют таким образом, чтобы сделать возможным частичный или полный обратный фолдинг первого сегмента на второй сегмент и νίοο νοΓδη.

Наконец, в рамках данного изобретения находится то, что нуклеиновая кислота по данному изобретению является синтетической нуклеиновой кислотой, выделенной нуклеиновой кислотой или нуклеиновой кислотой, полученной из любого из природных источников, таких как, например, источники, полученные способами рекомбинантной технологии. В связи с получением любой нуклеиновой кислоты по данному изобретению любая модификация, описанная здесь, может быть введена до, во время или после получения соответствующей нуклеиновой кислоты по данному изобретению, как известно специалистам с квалификацией в данной области.

Вектор в соответствии с данным изобретением содержит нуклеиновую кислоту по данному изобретению. Кроме того, этот вектор может включать элементы для регуляции нацеливания, экспрессии и транскрипции указанной нуклеиновой кислоты клеткоспецифическим образом, как известно в данной области. Плазмида может включать промотор для регуляции транскрипции гетерологичного материала, т.е. нуклеиновой кислоты по данному изобретению и. промотор может быть либо конститутивным, либо индуцибельным промотором для создания возможности селективной транскрипции. Могут быть также необязательно включены энхансеры, которые могут требоваться для получения необходимых уровней экспрессии. Энхансерами являются обычно любые нетранслируемые ДНК-последовательности, которые работают смежно с кодирующей последовательностью, следовательно, ίη οίδ, для изменения базового уровня транскрипции, диктуемого промотором. Экспрессия таких конструкций известна специалисту с квалификацией в данной области и может быть выполнена, например, обеспечением соответствующей тандемной конструкции или введением различных промоторов транскрипции для первой и второй цепи и первого и второго сегмента, соответственно, нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением.

- 37 012799

При приготовлении или экспрессии нуклеиновой кислоты по данному изобретению предпочтительно экспрессии ш νίνΌ, более предпочтительно в пациенте, который нуждается в нуклеиновой кислоте данного изобретения, такое приготовление или такая экспрессия предпочтительно используют экспрессирующий вектор, предпочтительно экспрессирующий вектор млекопитающего.

Экспрессирующие векторы известны в данной области и предпочтительно включают плазмиды, космиды, вирусные системы экспрессии. Предпочтительные вирусные системы экспрессии включают, но не ограничиваются ими, аденовирус, ретеровирус и лентивирус.

В данной области известны способы введения этих векторов в клетки или ткани. Такие способы могут быть найдены обычно в 8атЬгоок е1 а1.: Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогакгу Мапиа1, Со16 8рппд НагЬог ЬаЬогакгу, №\ν Уогк (1989, 1992), в АизиЬе1 е1 а1.: Сиггеп! Рго1осо1з т Мо1еси1аг Вю1оду, Чойпт \УПеу апб 8опз, ВаШтоге, Магу1апб (1989).

Подходящие способы включают, среди прочих, трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфекцию рекомбинантными вирусными векторами. В связи с данным изобретением дополнительным признаком этого вектора является в одном варианте осуществления ограничивающий экспрессию признак, такой как промотор и регуляторный элемент соответственно, которые являются специфическими для желаемого типа клеток, следовательно позволяющими экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением только после обеспечения фона, который делает возможной желаемую экспрессию.

В следующем аспекте данное изобретение относится к фармацевтической композиции по данному изобретению и/или вектору по данному изобретению и необязательно к фармацевтически приемлемому носителю, разбавителю или адъювантам или другому наполнителю (другим наполнителям). Предпочтительно, такой носитель, растворители, адъюванты и наполнители являются инертными и нетоксичными. Фармацевтическая композиция в ее различных вариантах адаптирована для введения различными способами. Такое введение включает системное и местное введение, а также пероральное, подкожное, парентеральное, внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное и интратекальное (подоболочечное) введение.

Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что количество фармацевтической композиции и соответствующих нуклеиновой кислоты и вектора, соответственно, зависит от клинического состояния пациента, места и способа введения, схемы введения, возраста, пола, массы тела пациента и других факторов, известных врачам-практикам. Таким образом, фармацевтически эффективное количество для целей профилактики и/или лечения определяется с учетом таких факторов, которые известны в этих областях медицины. Предпочтительно это количество является эффективным для достижения улучшения, в том числе, но не только, для улучшения патологического состояния или для обеспечения более быстрого выздоровления, улучшения или устранения симптомов и других показателей, выбранных в качестве подходящих критериев специалистами с квалификацией в области медицины.

В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может содержать другие фармацевтически активные соединения. Предпочтительно такие другие фармацевтически акивные соединения выбраны из группы, содержащей соединения, которые делают возможной доставку для внутриклеточного поглощения, соединения, которые делают возможным эндосомное высвобождение, соединения, которые делают возможным более продолжительное время циркуляции, и соединения, которые делают возможным нацеливание на эндотелиальные клетки или патогенные клетки. Предпочтительными соединениями для эндосомного высвобождения являются хлорохин и ингибиторы ДТФ-зависимых Н⁺-насосов.

Фармацевтическую композицию предпочтительно готовят таким образом, чтобы обеспечивать однократное введение или многократное введение.

Будет понятно, что фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть использована для любого заболевания, которое включает нежелательное развитие или нежелательный рост сосудистой сети, в том числе ангиогенез, а также любое из заболеваний и состояний, описанных здесь. Предпочтительно, этим типом заболеваний являются опухолевые заболевания. Среди опухолевых заболеваний следующие опухоли являются наиболее предпочтительными для лечения: рак эндометрия, колоректальные карциномы, глиомы, эндометриальные карциномы, аденокарциномы, эндометриальные гиперплазии, синдром Коудена, наследственная неполипозная колоректальная карцинома, синдром Ли-Фромени, рак молочной железы, рак предстательной железы (А11, 1.И., 1оигпа1 оГ Ше №1юпа1 Сапсег 1пзШи1е, Уо1. 92, по. 11, Чипе 07, 2000, раде 861-863), синдром Баннаяна-Зонана, ΕΌΌ (синдром Лермитте-Дуклоса) (Мас1ео6, К., зирга), болезни гамартомы-макроцефалии, в том числе болезнь Коу (СО) и синдром Баннаяна-Рувалькаба-Рили (ВКК), кожнослизистые повреждения (например, трихилеммомы), макроцефалия, задержка умственного развития, желудочно-кишечные гамартомы, липомы, аденомы щитовидной железы, фиброзно-кистозное заболевание молочной железы, мозжечковая диспластическая ганглиоцитома и злокачественности молочной железы и щитовидной железы (Уа/сщех, Р., 8е11егз, ^.К., зирга).

Должно быть понятно, что любое из опухолевых заболеваний, которое должно лечиться фармацевтической композицией в соответствии с данным изобретением, является предпочтительно опухолевым заболеванием поздней стадии. В другом варианте осуществления это опухолевое заболевание включает

- 38 012799 клетки, которые являются нечувствительными к опухолевому супрессору, причем более предпочтительно этим опухолевым супрессором является РТБ^ (гомолог фосфатазы и тензина).

Фармацевтическая композиция по данному изобретению может быть также использована в способе профилактики и/или лечения описанного здесь заболевания, причем этот способ предусматривает введение нуклеиновой кислоты по данному изобретению, вектора по данному изобретению или фармацевтической композиции или лекарственного средства по данному изобретению для любого из описанных здесь заболеваний.

В следующем аспекте данное изобретение относится к способу конструирования или скрининга нуклеиновой кислоты, которая пригодна для отрицательной регуляции КТР801, более предпочтительно для отрицательной регуляции функции КТР801. Этот способ предусматривает применение последовательности нуклеиновой кислоты, описанной здесь, и оценку такой нуклеиновой кислоты в подходящем анализе. Такой анализ известен в данной области и, например, описан в части примеров этой заявки. В следующей стадии конструируют двухцепочечную струтуру предпочтительно в соответствии с принципами конструирования, представленными здесь, которая пригодна для отрицательной регуляции КТР801, предпочтительно в связи с механизмом посттранскрипциооного сайленсинга генов, такого как интерференция РНК. Полученную таким образом, т. е. сконструированную или полученную скринингом, нуклеиновую кислоту оценивают также в соответствующем анализе, и этот результат, т.е. действие как нуклеиновой кислоты по данному изобретению, так и заново сконструированной или полученной скринингом нуклеиновой кислоты, сравнивают в таком анализе. Предпочтительно эта сконструированная или полученная скринингом нуклеиновая кислота является более пригодной, если она является либо более стабильной, либо более эффективной, предпочтительно имеет оба эти свойства. Будет понятно, что этот способ будет особенно эффективным, если любую из нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением используют в качестве исходной точки. Таким образом, в рамках данного изобретения находится то, что новые молекулы нуклеиновых кислот будут конструироваться на основе описанных здесь признаков, причем последовательность-мишень на мРНК КТР801 будет слегка смещена относительно последовательности-мишени на мРНК КТР801 для соответствующей нуклеиновой кислоты в соответствии с данным изобретением. Предпочтительно эта новая нуклеиновая кислота будет смещена на по меньшей мере один или несколько нуклеотидов относительно сегмента на мРНК-мишени либо в 5'направлении, либо в 3'-направлении мРНК, кодирующей КТР801. Однако в соответствии с данным изобретением это смещение имеет место в обоих направлениях одновременно, что означает, что эта новая нуклеиновая кислота включает нуклеиновую кислоту по данному изобретению, используемую в качестве исходной точки. В соответствии с данным изобретением элонгация нуклеиновой кислоты по данному изобретению, используемой в качестве начальной точки, также смещена либо к 3'-, либо 5'-концу. В случае такого смещения либо 3'-конец, либо 5'-конец новой нуклеиновой кислоты является более длинным, т.е. более удлиненным, чем другой конец. При генерировании этой новой молекулы нуклеиновой кислоты удлинением 3'-конца или 5'-конца антисмысловой цепи и/или смысловой цепи применяют обычно следующую последовательность стадий. Если смещение выполняется к 5'-концу мРНК КТР801, 3'-конец антисмысловой цепи должен быть удлинен количеством нуклеотидов, на которое был смещен 5-конец мРНК КТР801. Таким образом, нуклеотид или нуклеотиды, которые должны быть добавлены к 3'-концу антисмысловой цепи новой нуклеиновой кислоты, являются комплементарными нуклеотидам, находящимся на 5'-конце последовательности-мишени на мРНК КТР801, используемой для молекулы нуклеиновой кислоты по данному изобретению в качестве исходной точки. То же самое должно быть выполнено для смысловой цепи. Однако нуклеотиды, которые должны быть добавлены к смысловой цепи, должны соответствовать, т.е. быть комплементарными нуклеотидам, заново добавляемым к 3'-концу антисмысловой цепи, что означает, что они должны быть добавлены к 5'-концу смысловой цепи. Однако эта последняя стадия на смысловой цепи должна выполняться только до той степени, до которой будет смещена также смысловая цепь, кроме антисмысловой цепи, что имеет место в предпочтительном варианте осуществления данного изобретения. Хотя это смещение может быть выполнено до степени, определяемой специалистами с квалификацией в данной области, более предпочтительно это смещение будет выполняться таким образом, что также и новая нуклеиновая кислота все еще содержит сегмент из по меньшей мере 14 нуклеотидов, предпочтительно 14 смежных нуклеотидов, как показано любой из описанных здесь молекул нуклеиновых кислот.

Синтез любой из описанных здесь нуклеиновых кислот находится в рамках квалификации специалиста в данной области. Такой синтез описан, среди других, в Веаисаде 8.Ь. апб [уег К.Р., Те1га11ебгоп 1992; 48: 2223-2311, Веаисаде 8.Ь. апб кег К.Р., Те1гаЬебгоп 1993; 49: 6123-6194 и СагиНегк М.Н. е! а1.: МеФобк Бп7уто1. 1987; 154: 287-313, синтез тиоатов, среди других, описан в Вск81е1п Р., Аппи. Кеу. ВюсЬеш. 1985; 54: 367-402, синртез молекул РНК описан в 8ргоа1 В., ίπ Нитапа Ргекк 2005 Ε6ιΚ6 Ьу Негбе\\'|)п Р.; Кар. 2: 17-31 и соответствующие процессы далее по ходу описаны, среди других, в Ртдоиб А. е! а1., т ΙΚΤ Ргекк 1989 Ε6ιΚ6 Ьу 011уег О.А.; Кар. 7: 183-208 и 8ргоа1 В., т Нитапа Ргекк 2005 Ε6ιΚ6 Ьу Негбе\\рп Р.; Кар. 2: 17-31 (кирга).

8^КNА для КТР801 может быть получена с использованием способов, известных в данной области, описанных выше, на основе известной последовательности КТР801 (8ΕΟ ΙΌ N0:1) и может быть сделана

- 39 012799 стабильной различными описанными выше модификациями. В отношении дополнительной информации см. пример 9.

Кроме того, что касается способов данного изобретения, описанных здесь, дополнительные молекулы РНК могут быть использованы с указанными способами, например ингибирующие молекулы РНК данного изобретения включают одноцепочечные олигорибонуклеотиды, предпочтительно содержащие сегменты из по меньшей мере 7-10 последовательных нуклеотидов, присутствующих в последовательностях, подробно описанных в табл. А-С, причем указанные олигорибонуклеотиды способны образовывать [и/или содержат] двухцепочечные районы в конкретных конформациях, которые узнаются внутриклеточными комплексами, что приводит к деградации указанных олигорибонуклеотидов на меньшие молекулы РНК, которые способны проявлять ингибирование их соответствующего эндогенного гена и ДНКмолекул, кодирующих такие молекулы РНК. Соответствующим эндогенным геном является предпочтительно ген 801 и может быть ген УЕСР и/или ген УЕСР-К1. Данное изобретение обеспечивает также композицию, содержащую вышеуказанный одноцепочечный олигорибонуклеотид в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе.

Кроме того, данное изобретение обеспечивает комбинированную терапию для всех описанных здесь состояний и, в частности состояний, включающих хороидальную неоваскуляризацию. В указанной комбинированной терапии как ген КТР801, так и ген УЕСР ингибируются для ослабления симптомов подлежащего лечению заболевания. Эти гены могут быть ингибированы комбинацией к^КNΑ или антител (в том числе аптамерных антител) или обоими. Таким образом, данное изобретение обеспечивает также новую фармацевтическую композицию, содержащую ингибитор КТР801 и ингибитор УЕСР или УЕСРК-1, причем ингибитором КТР801 является предпочтительно к^КNΑ, более предпочтительно к1^А. подробно, описанная в табл. А-С, и, в частности к!^А с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 табл. А, а ингибитором УЕСР/УЕСРК-1 необязательно является антитело или аптамер. Комбинированное применение указанных соединений (т.е. к^КNΑ КТР801 и антитела УЕСР или любого другого комбинированного примера, описанного здесь) в приготовлении лекарственного средства является также частью данного изобретения.

Таким образом, к1^А КТР801, такие как молекула к!^А, подробно описанная в табл. А-С и, в частности, к1^А с номерами 14, 22, 23, 25, 27, 39, 41, 49 и 50 табл. А, могут вводиться вместе с агентами, которые нацелены на УЕСР и рецептор 1 УЕСР (УЕСРК1). Такие агенты имеются в настоящее время на рынке или находятся в различных стадиях утверждения и исследования посредством различных механизмов. Антитела и фрагменты антител, такие как ранибицумаб (Ъисепйк, СепепГесЬ) присоединяют к высвобожденному УЕСР для ингибирования связывания УЕСР с активными рецепторами. Аптампер, который может действовать подобно комплексу лиганд/антитело (Масидеп, ЕуеГесЬ/РД/ег, одобренный недавно Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (РОА), для влажной АМЭ), также может быть использован. Макуген связывается с внеклеточным УЕСР с блокированием его активности. Эти лекарственные средства вводят локально инъекцией в стекловидное тело. Анти-УЕСР-соединения на основе к!^А (такие как ингибитор УЕСР Асийу'к Сапб5 или ингибитор УЕСРК-1 δΙΚΝΑδ 027) также являются доступными. Кроме того, сообщалось, что низкомолекулярный аминостерин Скваламин (Сепаега), который вводят системно, является интерферирующим фактором во многих аспектах ангиогенного процесса, в том числе ингибирует УЕСР и передачу сигналов других факторов роста в эндотелиальных клетках.

Одновременное введение ингибитора КТР801, предпочтительно к^КNΑ, и любого из вышеуказанных ингибирующих агентов УЕСР/УЕСРК-1 может иметь синергическое действие, причем указанное комбинированное лечение является более эффективным, чем лечение любым из этих отдельных композиций, независимо от дозы в случае монотерапии. Это синергическое действие подтверждается также предварительными результатами, полученными этим правопреемником, как описано подробно в примере 6.

Ингибитор КТР801 (КТР8011) имеет другой механизм действия и является потенциально синергическим с ингибиторами УЕСР-УЕСРК. Исследование на мышах с нокаутом КТР801 показывает, что защитный фенотип в мышах с нокаутом сохраняется, несмотря на тот факт, что экспрессия мРНК УЕСР в глазу является такой же высокой, как и в мышах дикого типа. Дополнительные предварительные результаты авторов данного изобретения показывают, что ингибирование КТР801 может быть синергическим с ингибированием регуляторной системы УЕСР-УЕСРК в лечении патологии сетчатки. Авторы данного изобретения обнаружили в соответствующих экспериментах, что введение к^КNΑ против КТР801 в модели АМЭ (см. пример 6 ниже) приводит не только к отрицательной регуляции самого КТР801, но так же, как следствие, к повышающей регуляции антиангиогенного и нейропротективного фактора РЕЭР, а также отрицательной регуляции экспрессии МСР, хемоаттрактантного белка макрофагов. Таким образом, ингибирование КТР801 одновременно индуцирует антиангиогенное, нейропротективное и противовоспалительное действия.

Должно быть понятно, что в контексте данного изобретения любая из молекул к^КNΑ, описанных здесь, или любая из двухцепочечных молекул РНК (обычно с длиной 25-500 нуклеотидов), которые процессируются эндогенными клеточными комплексами (такими как Э1СЕК - см. выше) с образованием описанных здесь молекул к^КNΑ или молекул, которые содержат описанные здесь молекулы к^КNΑ, мо

- 40 012799 гут быть использованы в лечении описанных здесь заболеваний или нарушений.

Дополнительные нарушения, которые могут лечиться молекулами и композициями данного изобретения, включают все типы хороидальной неоваскуляризации ^ΝΥ), которая имеет место не только во влажной ΑΜΌ, но также в других глазных патологиях, таких как синдром глазного гистоплазмоза, ангиоидные полосы сетчатки, разрывы в оболочке Бруха, миопическая дегенерация, глазные опухоли и некоторые дегенеративные заболевания сетчатки.

Дополнительный аспект данного изобретения обеспечивает способы лечения связанного с апоптозом заболевания. Обеспечены способы терапии заболеваний или нарушений, ассоциированных с неконтролируемым патологическим ростом клеток, например рака, псориаза, аутоиммунных заболеваний, 1п1ег айа, и способы терапии заболеваний, ассоциированных с ишемией и отсутствием правильного кровотока, например инфаркта миокарда (ΜΙ) или инсульта. «Раком» или «опухолью» называют неконтролируемую растущую массу отклоняющихся от нормы клеток. Эти термины включают как первичные опухоли, которые могут быть доброкачественными или злокачественными, так и вторичные опухоли или метастазы, которые распространились в другие места тела. Примеры заболеваний ракового типа включают, Й11ег айа: карциному (например, молочной железы, ободочной кишки и легкого), лейкоз, такой как Вклеточный лейкоз, лимфому, такую как В-клеточная лимфома, бластому, такую как нейробластома и меланома.

Данное изобретение обеспечивает также композицию, содержащую одно или несколько соединений данного изобретения в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе. Эта композиция может содержать смесь двух или большего количества δίΚΝΑ для различных генов или различные δίΚΝΑ для одного и того же гена. Рассматривается вопрос о композиции, содержащей δίΚΝΑ для гена ИТР801 и δίΚΝΑ для гена УЕСР и /или гена УЕСР-ΚΕ

Другое соединение данного изобретения включает вышеуказанное соединение данного изобретения (структуру А), ковалентно или нековалентно связанное с одним или несколькими соединениями данного изобретения (структурой А). Это соединение может доставляться в носителе и может процессироваться внутриклеточно эндогенными клеточными комплексами с образованием одной или нескольких δίΚΝΑ данного изобретения. Другое соединение данного изобретения содержит вышеуказанное соединение данного изобретения (структуру А), ковалентно или нековалентно связанное с δίΚΝΑ для другого гена, в частности, гена УЕСР или гена УЕСР-ΚΕ

Данное изобретение включает также новую химическую частицу, которая является ингибитором ΚТР801, предпочтительно δίΚΝΑ, химически связанным, ковалентно или нековалентно, с любым из ингибирующих агентов VЕСР/VЕСРΚ-1. Конкретной рассматриваемой химической частицей является ингибитор ΚТР801 δίΚΝΑ, ковалентно связанный с антителом УЕСР или рецептором-1 УЕСР. Способы получения таких новых химических частиц известны специалистам с квалификацией в данной области.

Данное изобретение включает также тандемную двухцепочечную структуру, которая содержит две или большее количество последовательностей δίΚΝΑ, которая процессируется внутриклеточно с образованием двух или большего количества δίΚΝΑ, одна из которых ингибирует 801, а вторая ингибирует УЕСР/УЕСРΚ-1. В родственном аспекте это изобретение включает также тандемную двухцепочечную структуру, которая содержит две или большее количество последовательностей δίΚΝΑ, которая деградируется внутриклеточно с образованием двух или большего количества δίΚΝΑ, обе из которых ингибируют 801.

В частности, рассматривается, что длинный олигонуклеотид (обычно с длиной приблизительно 80500 нуклеотидов), содержащий одну или несколько структур стебля и петли, где районы стебля содержат последовательности олигонуклеотидов этого изобретения, может доставляться в носителе, предпочтительно фармацевтически приемлемом носителе, и может процессироваться внутриклеточно эндогенными клеточными комплексами (например, ^ΚО8НΑ и О1СЕК описанными выше) с образованием одного или нескольких меньших двухцепочечных олигонуклеотидов (δίΚΝΑ), которые являются олигонуклеотидами данного изобретения. Этот олигонуклеотид может быть назван тандемной конструкцией δΙιΚ,ΝΑ. Предполагается, что этот длинный олигонуклеотид является одноцепочечным олигонуклеотидом, содержащим одну или несколько структур стебля и петли, где каждый район стебля содержит смысловую и соответствующую антисмысловую последовательность δίΚΝΑ гена 801. В частности, предполагается, что этот олигонуклеотид содержит смысловую и антисмысловую последовательности δίΚΝΑ, изображенные в любой из табл. А-С. Альтернативно, эта тандемная конструкция δΙιΚ,ΝΑ может содержать смысловую и соответствующую антисмысловую последовательность δίΚΝΑ гена 801 и дополнительно смысловую и соответствующую антисмысловую последовательность δίΚΝΑ другого гена, такого как УЕСР или УЕСРΚ1.

Как упоминалось выше, δίΚΝΑ против ΚТР801 может быть основным активным компонентом в фармацевтической композиции или может быть одним активным компонентом фармацевтической композиции, содержащей две или несколько δίΚΝΑ (или молекул, которые кодируют или эндогенно продуцируют две или более δίΚΝΑ, будь это смесью молекул или одной или несколькими тандемными молекулами, каждая из которых кодирует две или более δίΚΝΑ), причем указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит одну или несколько дополнительных молекул δίΚΝΑ, каждая из которых

- 41 012799 нацелена на один или несколько дополнительных генов. Одновременное ингибирование КТР801 и указанного дополнительного гена или генов будет возможно иметь аддитивное или синергическое действие в лечении описанных здесь заболеваний в соответствии со следующим.

Острая почечная недостаточность (ΑΚΕ) и другие микрососудистые нарушения: фармацевтическая композиция для лечения ΑΚΕ может состоять из следующих комбинаций соединений: 1) димеры δίΚΝΑ КТР801 и δίΚΝΑ р53; 2) димеры δίΚΝΑ ΚΊΚ801 и Εαδ; 3) димеры δίΚΝΑ ΚΊΚ801 и Вах; 4) димеры δίΚΝΑ р53 и Εαδ; 5) димеры δίΚΝΑ ЭТР801 и Вах; 6) димеры δίΚΝΑ ЭТР801 и Νοχη; 7) димеры δίΚΝΑ ЭТР801 и Рита; 8) димеры δίΚΝΑ ΚΙΚ801 (ИЕОО1) и ИТР801Е (ИЕОО2); 9) δίΚΝΑ ΚΙΡ801, δίΚΝΑ Εαδ и любая из δίΚΝΑ ΚΤΡ801^, δίΚΝΑ р53, δίΚΝΑ Вах, δίΚΝΑ Νοχη или δίΚΝΑ Рита для образования тримеров или полимеров (т.е. тандемных молекул, которые кодируют три δίΚΝΑ).

Дегенерация желтого пятна (МО), диабетическая ретинопатия (ΌΚ), повреждение спинного мозга: фармацевтические композиции для лечения МО, ΌΚ и повреждения спинного мозга могут состоять из следующих комбинаций соединений: 1) δίΚΝΑ, комбинированная с δίΚΝΑ νΈ^Ε, δίΚΝΑ VΕСΕ-Κ1, δίΚΝΑ VΕСΕ-Κ2, δίΚΝΑ РКСбета, δίΚΝΑ МСР1, δίΚΝΑ еЫОЗ, δίΚΝΑ КЬР2, δίΚΝΑ НТР801Е (физически смешанные или в тандемной молекуле); 2) δίΚΝΑ ΚΙΡ801 в комбинации с двумя или более δίΚΝΑ приведенного выше перечня (физически смешанные или в тандемной молекуле, кодирующей три δίΚΝΑ, или их комбинацию).

ХОБЛ и респираторные нарушения: фармацевтическая композиция для лечения респираторных нарушений может состоять из следующих комбинаций соединений: δίΚΝΑ ΚΙΡ801, объединенная с δίΚΝΑ одного или нескольких из следующих генов: эластаз, металлопротеаз внеклеточного матрикса, фосфолипаз, каспаз, сфингомиелиназы и церамидсинтазы.

Кроме того, δίΚΝΑ ΚΙΡ801 или любая молекула нуклеиновой кислоты, содержащая или кодирующая δίΚΝΑ ΚΤΡ801, может быть связана (ковалентно или нековалентно) с антителами для достижения усиленного нацеливания для лечения описанных здесь заболеваний в соответствии со следующим:

ΑΚΕ: анти-Εаδ-антитело (предпочтительно, нейтрализующие антитела);

дегенерация желтого пятна, диабетическая ретинопатия, повреждение спинного мозга: анти-Гагантитела, анти-МСР1-антитело, анти-VΕСΕ-Κ1- и анти-VΕСΕ-Κ2-антитело. Эти антитела должны быть, предпочтительно, нейтрализующими антителами.

Любые молекулы, такие как, например, антисмысловые молекулы ДНК, которые содержат последовательности δίΚΝΑ, описанные здесь (с подходящими модификациями нуклеиновых кислот), являются особенно желательными и могут быть использованы с той же самой эффективностью, что и их соответствующие δίΚΝΑ, для всех описанных здесь применений и способов.

Данное изобретение включает также способ лечения пациента, страдающего от нарушения, такого как описанные здесь нарушения, предусматривающий введение пациенту вышеуказанных композиции или соединения в терапевтически эффективной дозе таким образом, чтобы лечить этого пациента.

Под термином «антисмысловой» (Α3) или «антисмысловой фрагмент» имеется в виду полинуклеотидный фрагмент (содержащий дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды или их смесь), имеющий ингибирующую антисмысловую активность, причем указанная активность вызывает уменьшение экспрессии эндогенной геномной копии соответствующего гена (в данном случае ΚΤΡ801). Αδ-полинуклеотид является полинуклеотидом, который содержит последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность достаточной длины и гомологии относительно последовательности, присутствующей в последовательности гена ΚΤΡ801, представленной в ЗЕЦ ΙΌ NО:1, для создания возможности гибридизации этого Α3 с этим геном. Последовательность Α3 сконструирована таким образом, чтобы быть комплементом представляющей интерес мРНК-мишени и образовывать дуплекс РНКАЗ. Это образование дуплекса может предотвращать процессинг, сплайсинг, транспорт или трансляцию релевантной мРНК. Кроме того, некоторые Αδ-нуклеотидные последовательности могут индуцировать активность клеточной РНКазы Н при гибридизации с их мРНК-мишенью, приводя к деградации мРНК (Са1аЬгейа е( а1., 1996: ΑπΕχο^ο δί^аίед^еδ ίη Не 1геа1теп1 οΓ 1еикет^аδ. Зетт ОпотЕ 23(1): 78-87). В этом случае РНКаза Н будет расщеплять РНК-компонент этого дуплекса и может потенциально высвобождать Α3 для дополнительной гибридизации с дополнительными молекулами РНК-мишени. Дополнительный механизм действия происходит из взаимодействия Α3 с геномной ДНК с образованием тройной спирали, которая может быть транскрипционно неактивной. Конкретными ΑЗ-фрагментами являются Α3 ДНК, кодирующей конкретные фрагменты описанного здесь Κ1Ρ801.

Многие обзоры охватывают основные аспекты антисмысловой (Α3) технологии и ее терапевтический потенциал (АпдЫ & ΑηΗζοάο, 1995. Απ^ο^ο Мο1еси1еδ апб ТНей Ροίеηί^а1 Εοτ ТНе Тгеа1теп1 ОГ Сапсег апб ΑΙΌ3. Сапсег ί. 8:185-189). Имеются обзоры по химическим аспектам этой технологии. (ΟόοΗο, 1995. Ρ^οд^еδδ ίη апШеще ίЬе^аρеиί^сδ, НешаЮЕ Ра( ΐιοί. 2:59; ИЫтапп апб Реутап, 1990. ΑηЩспхс О1^дοηис1еοί^беδ: Α №\ν ТНегареибс Ргтар1е. СНет Иет 90(4): 543-584), се11и1аг (Аадпег, 1994. Сепе ίηΗίΜΐίοη ттд аплете ο1^дοбеοxуηис1еοί^беδ. №11иге 372:333) апб Шегареибс (Напаша, е( а1., 1995. Κесеηΐ абνаηсеδ ίη (Не арр11са1юп οΓ депе (Негару ίο Нитап йххсихс. Αт. ί. Меб. 99:537; ЗсапШп е( а1., 1995. О1^дοηис1еοί^беδ-теб^аΐеб тοби1аί^οη οΓ таттаЕап депе схргсххюп. ΕΑЗΕΒ ί. 9:1288; Се\\'1гМ 1993. О11дοбеοxуηис1еοί^бе-Ьаδеб ίЬе^аρеиί^сδ Γογ Нитап 1еикет^аδ, З(ет Сс11х Эау1. 11:96).

- 42 012799

Антисмысловое вмешательство в экспрессию конкретных генов может быть достигнуто с использованием синтетических последовательностей А8-олигонуклеотидов (см. М. ΕΌίοΥ'ΐΌ-άΉ1ΕικοιΐΓΐ еί а1., 1995. IттиηοтοЛи1аί^οη Ьу суЮкте агНЕеще ο1^дοηис1еοί^Леκ. Еиг. СуЮкте №ΐ\ν. 6:7; Адга^а1, 1996. Αηйбспбс ο1^дοηис1еοί^Леκ: Ю\\'агЛк сНп1сп1 1г1а1з, ΤΙΕΤΕΟΉ 14:376; Есу-ЕеНтаг еί а1., 1997. АпПкспкс 011дοте^κ ίη νίίτο агЛ ίη νίνο. Ιη АпПкспкс Τйе^аρеиί^сκ, А. СоНсп агЛ 8. 8тюек, еЛк (Ρ1еηит Ρκδδ, №\у ΥοιΈ)). А8-олигонуклеотидные последовательности сконструированы таким образом, чтобы быть комплементом представляющей интерес мРНК-мишени и образовывать дуплекс РНК:А8. Это образование дуплекса может предотвращать процессинг, сплайсинг, транспорт или трансляцию релевантной мРНК. Кроме того, некоторые А8-нуклеотидные последовательности могут индуцировать активность клеточной РНКазы Н при гибридизации с их мРНК-мишенью, приводя к деградации мРНК (Са1аЬге11а еί а1., 1996: АпЦкспкс 81га1ец1е8 ίη Ше ПеаПпегИ οί 1еикет1ак. 8етт 0μο1. 23(1): 78-87). В этом случае РНКаза Н будет расщеплять РНК-компонент этого дуплекса и может потенциально высвобождать А8 для дополнительной гибридизации с дополнительными молекулами РНК-мишени. Дополнительный механизм действия происходит из взаимодействия А8 с геномной ДНК с образованием тройной спирали, которая может быть транскрипционно неактивной.

Последовательность сегмента-мишени для антисмыслового олигонуклеотида выбрана таким образом, что эта последовательность проявляет подходящие связанные с энергией характеристики, важные для образования олигонуклеотидного дуплекса с их комплементарными матрицами и обнаруживает низкий потенциал в отношении самодимеризации или самокомплементации ^^/ούο еί а1., 1996). Например, компьютерная программа 0ЫС0 (Тптег А11а1ук1к 8οίίνа^е, Уегкюг 3.4) может быть использована для определения точки плавления антисмысловой последовательности, свойств свободной энергии и приближенного определения свойств потенциального образования самодимеров и самокомплементарности. Эта программа позволяет делать количественную оценку этих двух параметров (потенциального образования самодимеров и самокомплементарности) и обеспечивает показатели «нет потенциала» или «некоторый потенциал» или «по существу, полный потенциал». С использованием этой программы обычно отбирают сегменты-мишени, которые имеют оценки «нет потенциала» в этих параметрах. Однако могут быть использованы сегменты, которые имеют «некоторый потенциал», в одной из этих категорий. Баланс этих параметров используют в этом отборе, как это известно в данной области. Кроме того, эти олигонуклеотиды отбирают по мере необходимости таким образом, что аналогичная замена, по существу, не влияет на функцию.

Фосфоротиоатные антисмысловые олигонуклеотиды обычно не обнаруживают значимой токсичности в концентрациях, которые являются эффективными, и проявляют достаточные фармакодинамические полупериоды существования в животных (Адта^а1, 1996. АпПкспкс ο1^дοηис1еοί^Леκ: Ю\уагЛк с1^η^са1 Птак, ΤΙΒΤΕΟΗ, 14:376) и являются резистентными к нуклеазам. Антисмысловые индуцированные фенотипы с потерей функции, связанной с клеточным развитием, были показаны для глиального фибриллярного кислого белка (СЕАЛ), для установления образования тектальной пластинки у цыплят (Са1^1еο еί а1., 1991. ί. Се11. Βίο1., 112:1285) и для белка Ν-тус, ответственного за сохранение клеточной гетерогенности в нейроэктодермальных культурах (эпителиальных клеток в сравнении с нейробластными клетками, которые отличаются по их колониеобразующей активности, онкогенности и прикреплению) (Κο^Κη еί а1.: Сагсег Кек. 50:6316; №Н11еке11 еί а1., 1991. Ερ^κοте-деηе^аίеЛ Ν-тус ηηΐί^η^ ^А гек1пс1к Ше Л^ίίе^еηί^аί^οη ροίеηί^а1 οί рптЮуе ηеи^οесίοЛе^та1 се11 1шек. Μο1. Се11. Βίο1. 11:1360). Ингибирование антисмысловым олигонуклеотидом основного фактора роста фибробластов (ЬЕСЕ), имеющего митогенные и ангиогенные свойства, подавляло 80% роста в клетках глиомы (Μοιτίκοη, 1991. 8ιιρρΐΌΚκίοη οί Ьак1с ПЬгоЬ1ак1 дгомЗН ίасίο^ схргсккюп Ьу а^ке^е ο1^дοηис1еοί^Леκ тЫЬНк Ше дгомЗН οί НагкРэгтеЛ Питан ак1госу1ек. ί. Βίο1. СНет. 266:728) насыщающим и специфическим образом. Будучи гидрофобными, антисмысловые олигонуклеотиды хорошо взаимодействуют с фосфолипидными мембранами (АкНег еί а1., 1991. Iηίе^асί^οηκ οί анЕкеике ^NΑ ο1ίβοηικΚοΙ^ ат^дк \уНН ρНοκρНο1^ρ^Л тетЬитек (1^ροκοтеκ) №с. Кек. 19:5551-5559). После их взаимодействия с клеточными плазматическими мембранами они активно (или пассивно) транспортируются в живые клетки (Пке еί а1., 1989. Οιηπ^Ι^ηζηίίοη οί ο1ί§οηικΚοΙ^ ιгаηκρο^ι ίηίο 1ίνίη§ се11к. ΡNΑ8 И8А 86:3474) в насыщаемом механизме, который, как предсказано, включает специфические рецепторы (ΥакиЬον еί а1., 1989. ΡNΑ8 И8А 86:6454).

«Рибозим» является молекулой РНК, которая имеет РНК-каталитическую способность (см. СесН в отношении обзора) и расщепляет специфический сайт в РНК-мишени.

Согласно данному изобретению рибозимы, которые расщепляют мРНК ΚΤΡ801, могут быть использованы в качестве ингибиторов ΚΤΡ801. Это может быть необходимым в случаях, когда антисмысловая терапия ограничена стехиометрическими соображениями (8атует еί а1., 1990, Сеге Редик-ию!! агЛ А1Лк, рр. 305-325). Затем могут быть использованы рибозимы, которые нацелены на последовательность ΚΤΡ801. Количество молекул РНК, которые расщепляются рибозимом, больше, чем количество, предсказанное стехиохимией (Натре1 агЛ Ττίίζ, 1989; иЫегЬеск, 1987).

Рибозимы катализируют расщепление фосфодиэфирной связи РНК. Были идентифицированы несколько структурных семейств рибозимов, включающих интроны Группы Ι, РНКазу Р, рибозим вируса гепатита дельта, молотоголовые рибозимы и шпилечный рибозим, первоначально полученный из нега

- 43 012799 тивной цепи сателлитной РНК вируса кольцевой пятнистости табака (δΤΚδν) (8иШтап, 1994; υ.δ. Ра1. Νο. 5225347, столбцы 4-5). Два последних семейства получены из вироидов и вирусоидов, в которых, как считается, рибозим отделяет мономеры от олигомеров, создаваемых во время репликации по типу «катящегося кольца» (δγιηοηδ, 1989 и 1992). Мотивы молотоголовых и шпилечных рибозимов являются наиболее часто адаптируемыми для транс-расщепления мРНК для генотерапии (8иШтап, 1994). Тип рибозима, используемый в данном изобретении, выбирают, как известно в данной области. Шпилечные рибозимы находятся в настоящее время в клиническом исследовании и являются рибозимами предпочтигельного типа. Обычно этот рибозим имеет длину 30-100 нуклеотидов. Доставка рибозимов сходна с доставкой Αδ-фрагментов и/или молекул δίΚΝΑ.

Следует отметить, что все полинуклеотиды, которые должны использоваться в данном изобретении, могут подвергаться модификациям для улучшения терапевтических свойств. Модификации или аналоги нуклеотидов могут быть введены для улучшения терапевтических свойств полинуклеотидов. Улучшенные свойства включают увеличенную устойчивость к нуклеазам и/или увеличенную способность проникать через клеточные мембраны. Устойчивость к нуклеазам, когда она необходима, обеспечивается любым известным в данной области способом, который не мешает биологической активности Αδ-полинуклеотида, δίΚΝΑ, кДНК и/или рибозимов, необходимых для данного способа применения и доставки Цуег е1 а1., 1990; ЕскЦет, 1985; 8рйхег апб ЕскЦет, 1988; δίκην е1 а1., 1991). Модификации, которые могут быть произведены в олигонуклеотидах для увеличения устойчивости к нуклеазам, включают модификацию гетероатома фосфора или кислорода в фосфатном скелете. Они включают приготовление метилфосфонатов, фосфоротиоатов, фосфородитиоатов и олигомеров морфолино. В одном варианте осуществления это обеспечивается использованием фосфоротиоатных связей для связывания четырехшести нуклеотидных оснований 3'-конца. Альтернативно, фосфоротиоатные связи связывают все нуклеотидные основания. Могут быть использованы другие модификации, известные в данной области, при которых сохраняется биологическая активность, но стабильность к нуклеазам является существенно увеличенной.

Все аналоги или модификации полинуклеотида могут быть использованы с данным изобретением, при условии, что указанные аналог или модификация, по существу, не влияют на функцию этого полинуклеотида. Эти нуклеотиды могут быть выбраны из природно встречающихся или синтетически модифицированных оснований. Природно встречающиеся основания включают аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил. Модифицированные основания включают инозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил-, 2-пропил- и другие алкиладенины, 5-галогенурацил-5-галогенцитозин, 6-азацитозин и 6азатимин, псевдоурацил, 4-тиоурацил, 8-галогенаденин, 8-аминоаденин, 8-тиоладенин, 8тиоалкиладенины, 8-гидроксиладенин и другие 8-замещенные аденины, 8-галогенгуанины, 8аминогуанины, 8-тиолгуанин, 8-тиоалкилгуанин, 8-гидроксигуанин и другие замещенные гуанины, другие аза- и деазааденины, другие аза- и деазагуанины, 5-трифторметилурацил и 5-трифторцитозин.

Кроме того, могут быть получены аналоги полинуклеотидов, в которых структура нуклеотида фундаментально изменена и которые более подходят в качестве терапевтических или экспериментальных реагентов. Примером аналога нуклеотида является пептиднуклеиновая кислота (ПНК), в которой дезоксирибоза- (или рибоза)-фосфатный скелет в ДНК (или РНК) заменен полиамидным скелетом, который сходен со скелетом, обнаруживаемым в пептидах. Было показано, что ПНК-аналоги устойчивы к деградации ферментами и имеют пролонгированные периоды существования ίη νίνο и ίη νίίτο. Кроме того, было показано, что ПНК сильнее связываются с комплементарной последовательностью ДНК, чем молекула ДНК. Это наблюдение связывают с отсутствием отталкивания зарядов между цепью ПНК и цепью ДНК. Другие модификации, которые могут быть произведены в отношении олигонуклеотидов, включают полимерные скелеты, циклические скелеты или ациклические скелеты молекул.

Полипептиды, используемые в данном изобретении, могут быть также модифицированы, необязательно химически модифицированы, для улучшения их терапевтической активности. «Химически модифицированный», при ссылке на полипептиды, обозначает полипептид, в котором по меньшей мере один из аминокислотных остатков модифицирован либо природными процессами, такими как процессинг или другие посттрансляционные модификации, либо химическими способами модификации, которые хорошо известны в данной области. Среди многочисленных известных модификаций типичные, но не исключительные, примеры включают: ацетилирование, ацилирование, амидирование, АДФ-рибозилирование, гликозилирование, образование ΟΡΙ-якоря (гликозилфосфатидилинозит-якоря), ковалентное присоединение липида или производного липида, метилирование, миристилирование, ПЕГилирование, пренилирование, фосфорилирование, убиквитинирование или любой подобный процесс.

Дополнительные возможные полипептидные модификации (такие как происходящие из изменения нуклеиновых кислот) включают следующие модификации.

«Консервативная замена» обозначает замену аминокислоты в одном классе аминокислот аминокислотой того же самого класса, где класс определяется обычными физико-химическими свойствами боковых цепей аминокислот и высокими встречаемостями замен в гомологичных полипептидах, обнаруживаемых в природе, определяемыми, например, с использованием стандартной матрицы аминокислотных замен Дайхоффа или матрицы ВЬ08ИМ. Были выделены шесть основных классов боковых цепей ами

- 44 012799 нокислот, которые включают: Класс Ι (Сук); Класс ΙΙ (8ег, Тбг, Рго, А1а, С1у); Класс ΙΙΙ (Акп, Акр, С1п, С1и); Класс ГУ (Н1к, Агд, Ьук); Класс У (Не, Ьеи, Уа1, Ме!); и Класс У (РЬе, Туг, Тгр). Например, замена остатком Акр другого остатка класса ΙΙΙ, такого как Акп, С1п или С1и, является консервативной заменой.

«Неконсервативная замена» обозначает замену аминокислоты в одном классе аминокислотой из другого класса, например замену А1а, остатка класса ΙΙ, остатком класса ΙΙΙ, таким как Акр, Акп, С1и или С1п.

«Делеция» обозначает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, в которых отсутствуют один или несколько нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно.

«Инсерция» или «добавление» обозначает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности, которое привело к добавлению одного или нескольких нуклеотидов или аминокислотных остатков, соответственно, в сравнении с природно встречающейся последовательностью.

«Замена» - замена одного или нескольких нуклеотидов или аминокислотных остатков другими нуклеотидами или аминокислотами, соответственно. Что касается аминокислотных последовательностей, эта замена может быть консервативной или неконсервативной.

В дополнительном варианте осуществления данного изобретения полипептид или полинуклеотид КТР801 может быть использован для диагностики или детектирования дегенерации желтого пятна в субъекте. Способ детектирования может обычно включать анализ мРНК КТР801 или полипептида КТР801 в пробе, полученной из субъекта.

«Детектирование (детекция)» обозначает способ детектирования заболевания. Этот термин может относиться к детектированию предрасположения к заболеванию или к детектированию тяжести заболевания.

Под «гомологом/гомологией» в данном контексте подразумевают по меньшей мере приблизительно 70%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% гомологию, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% гомологию, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% гомологию, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% гомологию, например по меньшей мере приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или даже приблизительно 100% гомологию. Данное изобретение рассматривает также то, что эти полинуклеотиды и полипептиды могут быть использованы таким же образом, что и описанные здесь и вышеупомянутые полинуклеотиды и полипептиды.

Альтернативно или дополнительно, «гомология» в отношении последовательностей может относиться к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотными остатками, деленному на количество нуклеотидов или аминокислотных остатков в более короткой из этих двух последовательностей, причем сопоставление этих двух последовательностей может быть выполнено в соответствии с алгоритмом Вильбура и Липмана ((1983) Ргос. №!1. Асаб. 8сГ И8А 80:726); например, с использованием размера окна 20 нуклеотидов, длины слова 4 нуклеотида и штрафа за гэп 4, и анализ и интерпретация данных последовательностей, в том числе сопоставление с использованием компьютера, могут быть удобным образом выполнены с применением коммерчески доступных программ (например, И'ИеШдепебск™ 8ш!е, ЮеШдепебск Шс., СА). Когда говорится, что последовательности являются сходными или имеют некоторую степень идентичности или гомологии с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в этой последовательности ДНК рассматривается как равный урацилу (И) в последовательности РНК. РНК-последовательности в рамках данного изобретения могут быть получены из ДНКпоследовательностей или их комплементов заменой тимидина (Т) в ДНК-последовательности урацилом (и).

Дополнительно или альтернативно, сходство или гомология аминокислотных последовательностей могут быть определены с использованием программы В1акГР (А1!ксБи1 е! а1., №с1. Ас1бк Кек. 25:33893402), доступной в NСВI. Следующие ссылки обеспечивают алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологии аминокислотных остатков двух полипептидов, и дополнительно или альтернативно, что касается предыдущих описаний, описания в этих ссылках могут быть использованы для определения процентной гомологии 8ш1!б е! а1., (1981) Абν. Арр1. Ма!б. 2:482-489; 8тЪЬ е! а1., (1983) №с1. Ас1бк Кек. 11:2205-2220; Ое\'егеих е! а1., (1984) №с1. Ас1бк Кек. 12:387-395; Еепд е! а1., (1987) I. Мо1ес. Еνο1. 25:351-360; Н1ддтк е! а1., (1989) САВЮ8 5:151-153; апб ТЬотркоп е! а1., (1994) №с1. Ас1бк Кек. 22:4673-4680.

«Имеющие по меньшей мере Х% гомологию» в отношении двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей обозначает процент остатков, которые являются идентичными в этих двух последовательностях при оптимальном сопоставлении этих последовательностей. Таким образом, идентичность 90% аминокислотных последовательностей означает, что 90% аминокислот в двух или более оптимально сопоставленных полипептидных последовательностях являются идентичными.

Дополнительный вариант осуществления данного изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей ингибитор КТР801 в терапевтически эффективном количестве в качестве активного ингредиента и фармацевтически приемлемый носитель. Этим ингибитором может быть биологический ингибитор, органическая молекула, химическая молекула и т.д., указанная фармацевтическая композиция может содержать ингибитор КТР801, который является полинуклеотидом, который содержит

- 45 012799 последовательные нуклеотиды, имеющие последовательность, которая является антисмысловой последовательностью относительно последовательности, представленной на фиг. 1 (8ЕЦ ГО N0:1). Кроме того, ингибитором ВТР801 может быть вектор, содержащий эти полинуклеотиды. Кроме того, ингибитором ВТР801 может быть моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, содержащим 4-25 аминокислот, представленным на фиг. 2 (8ЕЦ ГО N0:2), или молекула РНК, которая нацелена на мРНК гена ВТР8013, такая как молекула кгΚNΑ. (необязательно изображенная в табл. А-С и, в частности, м^А с номерами 22, 23, 25, 27, 39, 41, 42, 49 и 50 табл. А) или рибозим.

Активные ингредиенты фармацевтической композиции могут включать олигонуклеотиды, которые являются устойчивыми к нуклеазам, необходимые для применения на практике данного изобретения, или их фрагмент, который, как показано, имеет то же самое действие, нацеленный против соответствующей последовательности (соответствующих последовательностей), или рибозим. Могут быть использованы комбинации активных ингредиентов, описанных в данном изобретении, в том числе комбинации антисмысловых последовательностей.

Дополнительный вариант осуществления данного изобретения обеспечивает применение терапевтически эффективной дозы ингибитора ВТР801 для приготовления лекарственного средства для стимуляции выздоровления пациента, страдающего от заболевания или повреждения спинного мозга. В одном варианте осуществления этим ингибитором является предпочтительно к^ΚNΑ. В другом варианте осуществления этим ингибитором является предпочтительно Структура А, изображенная здесь.

Данное изобретение было описано иллюстративным образом, и должно быть понятно, что терминология, которая была использована, предназначена для описания, а не для ограничения.

Очевидно, что многие модификации и вариации данного изобретения возможны в свете приведенных выше описаний. Таким образом, должно быть понятно, что в пределах объема прилагаемой формулы изобретения данное изобретение может быть использовано на практике иным образом, чем оно конкретно описано.

Во всей этой заявке различные публикации, в том числе патенты США, используются с приведением автора и года, а патенты с приведением номера. Описания этих публикаций, и патентов, и заявок на патент в их полном виде, включены тем самым в качестве ссылки в эту заявку для более полного описания состояния области, к которой относится это изобретение.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 описывает подробно кодирующую последовательность гена ВТР801 (8ЕЦ ГО N0:1);

фиг. 2 описывает подробно аминокислотную последовательность полипептида ВТР801 (8ЕЦ ГО N0:2);

фиг. 3 является диаграммой, изображающей экзоны, СЭ8, 8№ человека и положение различных молекул нуклеиновых кислот, которые являются специфическими для человека или специфическими для человека, мыши и крысы параллельно;

фиг. 4А-Н изображает панель Вестерн-блот-анализа, полученную после применения различных двухцепочечных нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением к первой линии клеток человека, причем этот эксперимент проводили дважды с обозначением этих экспериментов как эксперимент 1 и эксперимент 2, причем уровень экспрессии р110а и р85 представлен в качестве контролей нанесения, и интенсивность (плотность) полосы ВТР801 является мерой ингибирующей активности конкретной примененной двухцепочечной нуклеиновой кислоты;

фиг. 5А-Е изображает панель Вестерн-блот-анализа, полученную после применения различных двухцепочечных нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением ко второй линии клеток человека, причем этот эксперимент проводили дважды с обозначением этих экспериментов как эксперимент 1 и эксперимент 2, причем уровень экспрессии р110а и р85 представлен в качестве контролей нанесения, и интенсивность (плотность) полосы ВТР801 является мерой ингибирующей активности конкретной примененной двухцепочечной нуклеиновой кислоты;

фиг. 6А-С изображает панель Вестерн-блот-анализа, полученную после применения различных двухцепочечных нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением к первой линии клеток человека при различных концентрациях, а именно 10 нМ (5А), 5 нМ (5В) и 1 нМ (5С), причем этот эксперимент проводили дважды с обозначением этих экспериментов как эксперимент 1 и эксперимент 2, причем уровень экспрессии р110а и р85 представлен в виде контролей нанесения, и интенсивность (плотность) полосы ВТР801 является мерой ингибирующей активности конкретной примененной двухцепочечной нуклеиновой кислоты;

фиг. 7 изображает панель Вестерн-блот-анализа, полученную с применением различных двухцепочечных нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением к мышиной клеточной линии, причем этот эксперимент проводили дважды с обозначением этих экспериментов как эксперимент 1 и эксперимент 2, причем уровень экспрессии р110а и р85 представлен в виде контролей нанесения, и интенсивность (плотность) полосы ВТР801 является мерой ингибирующей активности конкретной примененной двухцепочечной нуклеиновой кислоты;

фиг. 8 показывает результаты эксперимента в мышиной модельной системе АМЭ;

фиг. 9 показывает результаты дополнительных экспериментов в мышиной модельной системе

- 46 012799

АМО;

фиг. 10 показывает результаты экспериментов в модельной системе АМЭ примата не человека;

фиг. 11А-В показывает результаты дополнительных экспериментов в модельной системе АМЭ примата не человека;

фиг. 12 А-В показывает результаты дополнительных экспериментов в модельной системе АМЭ примата не человека;

фиг. 13 А-В представляет анализ экспериментальных результатов, полученных в модели АМЭ примата не человека;

фиг. 14 представляет дополнительный анализ экспериментальных результатов, полученных в модели АМЭ примата не человека;

фиг. 15А-С показывает результаты эксперимента с использованием инстилляции КТР801экспрессирующей плазмиды в мышей;

фиг. 16А-С показывает результаты модели краткосрочного (7 дней) воздействия сигаретным дымом в мышах с нокаутом ВТР801 (КО) и мышах дикого типа (^Т);

фиг. 17А-С показывает результаты модели воздействия сигаретным дымом в мышах дикого типа (^Т), которым вводили инстилляцией активную анти-ВТР801 (ВЕЭЭ14) и контрольную (ВЕЭЭ8) к1ВКА;

фиг. 18 показывает результаты экспериментов с мышами КО с нокаутом ВТР801 в долгосрочной модели С8;

фиг. 19 показывает результаты экспериментов в мышиной модели АВЕ;

фиг. 20 показывает результаты экспериментов в мышиной модельной системе диабетической ретинопатии;

фиг. 21 показывает результаты дополнительных экспериментов в мышиной модельной системе диабетической ретинопатии;

фиг. 22 показывает результаты дополнительных экспериментов в мышиной модельной системе диабетической ретинопатии;

фиг. 23 показывает результаты экспериментов комбинированного ингибирования ВТР801/УЕСЕ в мышиной модели СNV;

фиг. 24 показывает результаты дополнительных экспериментов комбинированного ингибирования ВТР801/УЕСЕ в мышиной модели СКУ;

фиг. 25 показывает результаты экспериментов, исследующих действие к1ВКА ВТР801 на экспрессию гена в ВРЕ и нейроретине;

фиг. 26А-В показывает дополнительные результаты экспериментов, исследующих действие к1ВКА ВТР801 на экспрессию гена в ВРЕ и нейроретине;

фиг. 27 показывает результаты экспериментов, демонстрирующих, что ВТР80ЮТ является таким же активным, что и ВТР801.

Примеры

Авторы считают, что без дополнительного разъяснения специалист с квалификацией в данной области может с учетом предыдущего описания использовать данное изобретение в его самой полной степени. Таким образом, следующие предпочтительные конкретные варианты осуществления должны рассматриваться только как иллюстративные, а не ограничивающие каким-либо образом заявленное изобретение.

Стандартные протоколы молекулярной биологии, известные в данной области, не описанные конкретно здесь, обычно выполняются, по существу, как описано в 8атЬгоок е! а1.: Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, №\ν Υо^к (1989, 1992) и АикиЬе1 е! а1.: Сиггеп! Рго!осо1к т Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойт \УПеу апб 8опк, ВаШтоге, Магу1апб (1989).

Стандартные протоколы органического синтеза, известные в данной области, не описанные конкретно здесь, обычно выполняются, по существу, как описано в Огдашс купШекек: Уо1. 1-79, ебйогк уагу,

1. ^11еу, №\ν Υо^к (1941-2003); Сетей е! а1.: Огдашс куп!йек1к тегкЬоок, ХУПеу-УСН, ХУетйепп (2000); 8тйй & Магсй, Абуапсеб Огдашс Сйет1к!гу, ^11еу-1п!егкс1епсе; 5^4Ь ебйюп (2001).

Стандартные способы медицинской химии, известные в данной области, не описанные конкретно здесь, обычно выполняются, по существу, как описано в серии Сотргейепшуе Мебюта1 Сйет1к!гу различными авторами и издателями, публикуемой Регдатоп Ргекк.

Признаки данного изобретения, описанные в этом описании, формула изобретения и/или рисунки могут быть как по отдельности, так и в любой комбинации материалом для реализации этого изобретения в его различных формах.

Пример 1.

Общие материалы и способы.

Если нет других указаний, следующие материалы и способы использовали в примерах 1-5.

Культура клеток

Первую линию клеток человека, а именно клетки НеЬа (Американская Коллекция Типовых Культур) культивировали следующим образом: клетки НеЬа (Американская Коллекция Типовых Культур) культивировали, как описано в Схаибегпа Е. е! а1. (С/аибегпа, Е., Еесй!пег, М., Аудип, Н., Агпо1б, XV.8.,

- 47 012799

Кйрре1, Α., С^еδе, К. &. КаиТтапп, 1. (2003). №.1с1ею Ααάδ Κ£δ, 31, 670-82).

Второй линией клеток человека была клеточная линия кератиноцитов человека, которую культивировали следующим образом: кератиноциты человека культивировали при 37°С в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), содержащей 10% ФТС.

Мышиной клеточной линией была линия В16У (Американская Коллекция Типовых Культур), культивируемая при 37°С в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ΌΜΕΜ), содержащей 10% ФТС. Условия культивирования были такими, как описанные в Μеίйοάδ Ршб Ехр Сйп Ρйа^тасο1. 1997 Мау; 19(4):231-9.

В каждом случае эти клетки подвергали описанным здесь экспериментам при плотности приблизительно 50000 клеток на лунку и двухцепочечную нуклеиновую кислоту по данному изобретению добавляли при 20 нМ, причем эту двухцепочечную нуклеиновую кислоту объединяли в комплекс с использованием 1 мкг/мл подходящего липида.

Индукция подобного гипоксии состояния

Клетки обрабатывали ί,'οί,'Ρ для индукции подобного гипоксии состояния следующим образом: трансфекции δίΚΝΑ проводили в планшетах 10 см (30-50% конфлюэнтность), как описано Схаийегпа е1 а1., 2003; КгеЬсйпег е1 а1., 2003). Вкратце, δίΚΝΑ трансфицировали добавлением предварительно приготовленного 10х концентрированного комплекса СВ и липида в бессывороточной среде к клеткам в полной среде. Общий объем трансфекции был 10 мл. Конечная концентрация липида была 1,0 мкг/мл; конечная концентрация δίΚΝΑ была 20 нМ, если нет другого указания. Индукцию гипоксических реакций проводили добавлением СЬСЕ (100 мкМ) непосредственно к среде для культуры ткани за 24 ч перед лизисом.

Приготовление клеточных экстрактов и иммуноблоттинг

Приготовление клеточных экстрактов и иммуноблот-анализ проводили, по существу, как описано К11рре1 е1 а1. (Кйрре1, Α., еδсοЬеάο, Μ.Α., ΧνηΟιολνΕχ, М.8., Αре11, С., Вюлит Τ.Α., С1е41ш, Μ.Α. Каьапаидй, А.М., Αре11, С., Εδοο^άο, Μ.Α. & АШапъ, Ό.Τ. (1996). Μο1 Се11 Βίο1, 16, 4117-27). Поликлональные антитела против полноразмерного ΚΤΡ801 генерировали иммунизацией кроликов продуцирующими рекомбинантный белок ΚΤΡ801 бактериями из экспрессирующего вектора рЕТ19-Ь (Мегск В^аепсе СтЬН, 8сй\та1Ьас1т Сегтапу). Мышиные моноклональные анти-р110а-антитела и анти-р85-антитела были описаны К11рре1 е1 а1. ^ирга).

Пример 2. Уменьшение экспрессии ΚΤΡ801 в первой клеточной линии человека.

Получали различные двухцепочечные нуклеиновые кислоты. Их локализация относительно мРНК и СИ8, а также 8ΝΡ человека в нуклеиновой кислоте, кодирующей ΚΤΡ801 человека (номер доступа банка, данных ΝΜ_019058), изображена на фиг. 3. Эту первую клеточную линию человека контактировали с указанными двухцепочечными нуклеиновыми кислотами, как описано в примере 1. После индукции подобного гипоксии состояния и обработки указанными двухцепочечными нуклеиновыми кислотами эти клетки лизировали и клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу. Ρ110а, который является каталитической единицей ΡΙ-киназы, и р85 использовали в качестве контролей нанесения. Интенсивность полосы ΚΤΡ801, визуализированная с использованием поликлональных антител к ΚΤΡ801, является мерой активности отдельных двухцепочечных нуклеиновых кислот на примере уменьшения уровня экспрессии ΚΤΡ801.

Каждую и любую из двухцепочечных нуклеиновых кислот модифицировали таким образом, что группа 2'-О-Ме присутствовала на первом, третьем, пятом, седьмом, девятом, одиннадцатом, тринадцатом, пятнадцатом, семнадцатом и девятнадцатом нуклеотиде антисмысловой цепи, причем та же самая модификация, т.е. группа 2'-О-Ме, присутствовала при втором, четвертом, шестом, восьмом, десятом, двенадцатом, четырнадцатом, шестнадцатом и восемнадцатом нуклеотиде смысловой цепи. Кроме того, следует отметить, что в случае этих конкретных нуклеиновых кислот по данному изобретению первый сегмент является идентичным первой цепи, а второй сегмент является идентичным, второй цепи и эти нуклеиновые кислоты имеют также затупленные концы.

Эти эксперименты выполняли дважды, и отдельные результаты показаны на фиг. 4А-Н, где эти эксперименты обозначены как эксперимент 1 и эксперимент 2, соответственно.

Обозначения 1т йг и йтг на фиг. 4А-Н указывают на то, что соответствующая двухцепочечная нуклеиновая кислота была сконструирована таким образом, чтобы быть нацеленной на участок мРНК ΚΤΡ801, который является специфическим для мРНК ΚΤΡ801 человека (й), чтобы быть нацеленной на участок мРНК ΚΤΡ801, который является специфическим для мРНК ΚΤΡ801 человека и крысы (йг), и чтобы быть нацеленной на участок мРНК ΚΤΡ801, который является специфическим для мРНК ΚΤΡ801 человека, мыши и крысы (йтг). Двухцепочечную нуклеиновую кислоту, называемую № 40.1, использовали в качестве положительного контроля, а необработанные клетки (υΤ+) использовали в качестве отрицательного контроля.

В соответствии с этими результатами оказалось, что следующие двухцепочечные нуклеиновые кислоты являются особенно применимыми в отрицательной регуляции экспрессии ΚΤΡ801: № 14, № 15, № 20, № 21, № 22, № 23, №24, № 25, № 27, № 39, № 40, № 41, № 42, № 43, № 44, № 49 и № 50 (см. табл. А).

- 48 012799

Пример 3. Уменьшение экспрессии НТР801 во второй клеточной линии человека.

Эксперименты, описанные в связи с примером 2, повторяли с использованием второй клеточной линии человека, как описано в примере 1, и эти результаты изображены на фиг. 5А-Р.

Как можно заключить из этих фигур, результаты, полученные в связи с экспериментами, описанными в примере 2, были подтверждены с использованием этой второй клеточной линии человека.

Пример 4. Эффект дозы НТР801-специфических двухцепочечных нуклеиновых кислот.

В этом эксперименте исследовали эффект дозы НТР801-специфических двухцепочечных нуклеиновых кислот.

Для этой цели клетки Иска обрабатывали, как в связи с примерами 2 и 3, причем концентрация двухцепочечной нуклеиновой кислоты в культуральном бульоне была 10 нМ, 5 нМ и 1нМ. В качестве положительного контроля использовали двухцепочечную нуклеиновую кислоту № 40.1, в качестве отрицательного контроля - необработанные клетки (ИТ+). Считывание было таким же, как описанное в связи с примерами 2 и 3. Конкретными двухцепочечными нуклеиновыми кислотами были нуклеиновые кислоты с внутренними ссылочными номерами 14, 22, 23 и 27, которые направлены на сегменты мРНК НТР801, которые являются общими для человека, мышей и крыс, и двухцепочечные нуклеиновые кислоты с внутренними ссылочными номерами 39 и 42, которые направлены на сегменты мРНК НТР801, специфические для НТР801 человека.

Эти результаты показаны на фиг. 6А-С. Из указанных фигур можно видеть, что имеется явная концентрационная зависимость эффекта двухцепочечных нуклеиновых кислот, специфических в отношении НТР801, причем молекулы нуклеиновых кислот, имеющие внутренние ссылочные номера 1, 15, 20, 21, 24, 40, 41, 43, 44, 22, 23, 27, 39, 42, 40.1, 44.1 и 14, предпочтительно 22, 23, 27, 39, 42, 40.1 и 44.1 и более предпочтительно 14, 23 и 27, и предпочтительно каждая из указанных молекул нуклеиновых кислот, имеющих конкретные распределения модификаций, описанные для них в части примера здесь, являются особенно эффективными.

Пример 5. Видовая специфичность НТР801-специфической двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

Были сконструированы двухцепочечные нуклеиновые кислоты по данному изобретению против сегментов мРНК НТР801, которые являются одинаковыми или различными в разных видах. Для испытания, имеется ли видовая специфичность ΚТР801-специфической двухцепочечной нуклеиновой кислоты, двухцепочечные нуклеиновые кислоты с внутренними ссылочными номерами 14, 22, 23 и 27, которые направлены на сегмент мРНК НТР801, который является консервативным среди мРНК НТР801 человека, мыши и крысы, и двухцепочечные нуклеиновые кислоты с внутренними ссылочными номерами 39 и 42, которые направлены на сегмент мРНК НТР801, который является специфическим для мРНК НТР801 человека, т.е. которые направлены на сегмент, который, как таковой, не присутствует в мыши или крысе, сравнивали в отношении отрицательной регуляции НТР801 с использованием того же самого подхода и считывания, какие описаны в примерах 1 и 2.

Хотя все использованные двухцепочечные нуклеиновые кислоты являются в принципе активными против мРНК человека и, как показано в предыдущих примерах, являются также пригодными для отрицательной регуляции экспрессии НТР801, после использования мышиной клеточной линии только те двухцепочечные нуклеиновые кислоты, которые являются также специфическими в отношении мРНК НТР801 мыши, эффективно уменьшали экспрессию НТР801, а именно двухцепочечные нуклеиновые кислоты с номерами 14, 22, 23 и 27.

Из этого результата можно сделать вывод, что можно конструировать направленные на НТР801 двухцепочечные нуклеиновые кислоты, которые являются специфическими только в отношении одного или нескольких видов. Это делает возможным применение одной и той же молекулы в моделях животных, а также в людях.

Пример 6. Экспериментальные модели, способы и результаты, относящиеся в дегенерации желтого пятна.

Соединения данного изобретения испытывали в следующей модели хороидальной неоваскуляризации животного (ΟΝν). Этот отличительный признак влажной ΆΜΌ индуцируется в моделях животных лазерной обработкой.

А) Мышиная модель

Индукция хороидальной неоваскуляризации (СКУ)

Хороидальная неоваскуляризация (СКУ), отличительный признак влажной ΆΜΌ, индуцируется лазерной фотокоагуляцией (532 нм, 200 мВ, 100 мс, 75 мкм) (ΟοιιΕίβΙιΙ ОЬ, Ιηάβχ, ΜοιιηΙηίη νίβ^, СА), выполняемой на обоих глазах каждой мыши в день 0 одним индивидуумом, которому неизвестно распределение групп лекарственных средств. Лазерные «пятна» наносили стандартизованным образом вокруг зрительного нерва с использованием системы доставки в виде щелевой лампы и покровного стекла в виде контактной линзы.

Группы обработки

СNV индуцировали в следующих группах мышей (самцов в возрасте 6-8 недель):

(1) 12 мышей \УТ;

(2) 12 мышей с нокаутом НТР801;

- 49 012799 (3) 12 мышей ^Т, инъецированных 0,25 мкг синтетической стабилизированной активной антиКТР801-к^КNА (ΒΕΌΌ14) в одном глазу и неактивной анти-КТР801-к|КХА (ΚΕΌΌ8 - отрицательный контроль) в парном глазу в дни 0 и 7;

(4) 12 мышей ^Т, инъецированных 0,1 мкг синтетической стабилизированной активной антиКТР801-к|КХА (ΒΕΌΌ14) в одном глазу и ЗФР (отрицательный контроль) в парном глазу в дни 0 и 7;

(5) 12 мышей ^Т, инъецированных 0,05 мкг синтетической стабилизированной активной антиКТР801-к|КХА (ΒΕΌΌ14) в одном глазу и ЗФР (отрицательный контроль) в парном глазу в дни 0 и 7.

Оба глаза каждой мыши обрабатывали лазером. Инъецированный объем был 2 мкл.

Оценка

1. Этот эксперимент заканчивали в день 14. Для оценки глаза полностью удаляли (энуклеировали) из глазного яблока и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 30 мин при 4°С. Нейросенсорную сетчатку отделяли и отрезали от зрительного нерва. Оставшийся комплекс КРЕ-хороид-склера плоско монтировали в Iтти-Μοии! (Уес(акН|е1б Μοииί^ид Мебшт, УесЮг) и покрывали покровным стеклом. Плоские препараты исследовали сканирующего лазерного конфокального микроскопа (ТС8 8Р, Ьека, Сегтаиу). Сосуды визуализировали возбуждением синим аргоновым лазером. Горизонтальные оптические срезы (с шагом 1 мкм) получали из поверхности комплекса КРЕ-хороид-склера. Самую глубокую фокальную плоскость, в которой могла быть идентифицирована окружающая хороидальная сосудистая сеть, соединяющаяся с повреждением, оценивали как дно этого повреждения. Любой сосуд в обработанной лазером зоне и внешний относительно этой ссылочной плоскости оценивали как СНУ. Изображения каждого среза хранили в цифровом виде. Площадь связанной с СNУ флуоресценцией измеряли компьютеризованным анализом изображения с использованием программы Ьека ТС8 8Р. Суммирование всей флуоресцентной площади в каждом горизонтальном срезе использовали в качестве показателя для объема СNУ.

2. Отдельных мышей дикого типа (^Т) (5 глаз на группу) использовали для оценки экспрессии мРНК КТР801 в СNУ (а также экспрессии других генов, относящихся к АМИ) (обработанных и не обработанных к^КNА) с использованием ПЦР реального времени на РНК, экстрагированной из КРЕ/хороидов или из нейроретины.

Результаты

1. Мыши с нокаутом КТР801 обнаруживали на 30% меньшее подтекание кровеносных сосудов в сравнении с мышами дикого типа (^Т) после индукции СNУ; см. фиг. 8.

2. Синтетическая стабилизированная к^КNА против КТР801, КЕИИМ, индуцировала зависимое от дозы уменьшение объема СNУ. Максимальное ~70% ингибирование в сравнении с ЗФРинъецированными глазами достигалось при дозе 0,25 мкг на глаз КЕОЭ14 (8ЕЦ ГО NО:14 в табл. 1, 8ЕЦ ГО NО:16 (смысловая) и 66 (антисмысловая)). При той же самой дозе как кШХА отрицательного контроля, КЕОП8, так и анти-СЕР-к|КХА обнаруживали только 27 и 33% уменьшение объема СNУ, соответственно, что подтверждает превосходящую эффективность КЕОИМ, а также специфичность ее действия.

В) Модель примата не человека

Индукция СNУ

Восемь самцов собакоголовых обезьян (Масаса ίакс^си1а^^к) в возрасте 2-6 лет использовали для этого исследования. Хороидальную неоваскуляризацию (ΟΝν) индуцировали околомакулярной лазерной обработкой обоих глаз перед введением дозы. В желтом пятне помещали девять повреждений лазером [ОсиЫдН! СЬ (532 гаи) Ьакет РЬο!ο-сοади1а!ο^ \\'ЦН аи №8 Меб1са1® Рο^ιаЬ1е 811! Ьатр АбарЮг| и лазерные «пятна» в правом глазу были зеркальным отражением размещения пятен в левом глазу. Приблизительные параметры лазера были следующими: размер пятна: диаметр 50-100 мкм; мощность лазера: 300700 мВт; время экспонирования: 0,1 с.

Обработка

Сразу же после лазерной обработки оба глаза всех животных подвергали единственной инъекции в стекловидное тело. В левый глаз вводили дозу 350 мкг синтетической стабилизированной ктКЫА против КТР801 (той же самой к^КNА, которую использовали в исследовании с мышами) в конечном объеме 50 мкл, тогда как в контралатеральный глаз вводили 50 мкл ЗФР (носителя).

Оценка

1. Всех животных подвергали ежедневному обследованию в отношении потребления пищи и измерениям массы тела.

2. Двух обезьян эвтанизировали в день 6 после индукции СNУ. Их глаза удаляли из глазных яблок и задний полюс хрусталика уплощали. Затем вырезали участок центральной ямки сетчатки и разделяли на хороиды и нейроретину, которые по отдельности замораживали (для каждого животного) в жидком азоте для последующего использования для экстракции РНК и оценки с использованием ПЦР реального времени экспрессии КТР801.

3. Флуоресцентные ангиограммы выполняли перед исследованием и в конце недель 1, 2 и 3 после индукции СNУ. Получали фотографии с использованием камеры Гии6ик (ТКС-50ЕХ Кебиа Сатега). Изображения собирали с использованием системы ТОРСОN ^АСЕие!™. Флуоресцеиновый краситель (10% флуоресцеин-натрий, приблизительно 0,1 мл/кг) инъецировали через отверстия сосудистого доступа.

- 50 012799

Фотографии получали при нескольких интервалах времени после инъекции красителя для включения артериальной фазы, ранней артериовенозной фазы и нескольких поздних артериовенозных фаз для оценки неоваскуляризации и для мониторинга подтекания флуоресцеина, связанного с повреждениями СКУ. Интерпретацию и анализ флуоресцеиновых ангиограмм проводили независимо два офтальмолога.

Неоваскуляризацию (№У) оценивали в ранних ангиограммах и каждое пятно оценивали в соответствии со следующей схемой:

- нет признаков №У

0,5 - подозрительное пятно

- «горячее» пятно

- №У в лазерном ожоге

- явная №У.

Подтекание оценивали в соответствии со следующей схемой:

- нет подтекания

0,5 - подозрительное пятно

- явное небольшое подтекание пятна

- подтекание, увеличивающееся со временем

- подтекание, большее чем предыдущие границы (явно).

Кроме того, размер каждого пятна сравнивали между ранней и поздней ангиограммами с использованием морфометрических измерений и рассчитывали увеличение размера пятна, происходящего из подтекания.

4. Электроретинограммы (ΕΚ6) регистрировали с использованием электроретинографа Ερκ 2000 в соответствии с 81егга^ 80Ρ и специфическими для данного исследования 80Ρ, включающими использование аппарата Ганцфилда, при предварительном исследовании и в конце недели 3. Приведенные в таблице данные ΕΚΟ оценивались ветеринаром-офтальмологом.

Это исследование заканчивали в день 21 после индукции С№У. Макроскопическую аутопсию и гистологическое исследование выполняли на органах и тканях, в том числе глазах.

Результаты

1. δίΚ^Α против ΚΤΡ801 уменьшала экспрессию ΚΤΡ801 в ΚΡΕ-хороидах обработанных лазером животных, как измерено в день 6 после индукции с использованием ПЦР реального времени (см. фиг. 10).

2. Сравнение оценки пятен в отношении подтекания и неоваскуляризации между парными глазами в каждой отдельной обезьяне выявило, что обе из этих патологических характеристик уменьшались в глазах, инъецированных δίΚ^Α ΚΤΡ801, в сравнении с контролем (в отношении результатов подтекания см. фиг. 11; в отношении результатов неоваскуляризации см. фиг. 12).

3. Расчет общего количества пятен с более высокими клинически-релевантными оценками (2 и 3) подтекания или неоваскуляризации во всех инъецированных δίΚ^Α глазах опять выявил, что инъецированные δ^ΚNΑ. глаза были менее пораженными (см. фиг. 13, а+Ь).

4. Все данные оценки в отношении подтекания пятен и неоваскуляризации подвергали статистической обработке. Существование различий между обработкой δ^ΚNΑ. и контрольными обработками анализировали расчетом дельта между средними рангами пятен контрольного правого (Κ) глаза и инъецированного δίΚ^Α левого (Ь) глаза (дельта=к-Ь). Значимость этого различия рассчитывали с использованием непараметрического статистического метода, критерия знаковых рангов Уилкоксона - одностороннего критерия. Различные фазы ангиограмм (раннюю артериальную, артериовенозную и позднюю венозную) анализировали отдельно в течение каждой недели (1, 2 и 3).

Табл. 1 показывает значимость (односторонний критерий) рангового различия подтекания от 0 для каждой группы (р-величины <0,05 подчеркнуты). Значимое ранговое уменьшение подтекания было обнаружено в левых глазах (обработанных δ^ΚNΑ.) относительно правых (обработанных плацебо) в неделе 2 и 3 в поздних ангиограммах.

Таблица 1

Подтекание	Величина Р
Ангиограммы	Неделя	Критерий знаковых рангов Уилкоксона
	1	0,2500
Ранняя	2	0,5000
	3	0,5000
Артерио- .	1	0,3438
венозная	2	0,1250
	3	0,2344
	1	0,1250
Поздняя	2	0,0313
	3	0,0156

- 51 012799

Обратите внимание, что для оценки параметров подтекания обычно используются поздние ангиограммы.

Табл. 2 показывает значимость (односторонний критерий) рангового различия неоваскуляризации (Νν) от 0 для каждой группы (р-величины <0,05 подчеркнуты).

Таблица 2

Νν	Величина Р
Ангиограммы	Неделя	Критерий знаковых рангов Уилкоксона
	1	0, 0781
Ранняя	2	0,0313
	3	0,0313
Артерио“ венозная	1 2 ' 3	0,0625 0,0313 0,1563
	1	0,2500
Поздняя '	2 -	0,'3'4 38 '
	3	0,2500

Значимое ранговое уменьшение Νν было обнаружено в левых глазах относительно правых в неделе 2 и 3 в раннем периоде и в артериовенозном периоде в неделе 2.

Обратите внимание, что для оценки параметров неоваскуляризации обычно используются ранние ангиограммы.

5. Количественная морфометрическая оценка увеличения площади пятен, имеющего место между ранней (артериальная фаза) и поздней (венозная фаза) ангиограммами вследствие подтекания, выявила, что этот параметр значимо уменьшался в лазерных пятнах в инъецированных з1ККА глазах (левые глаза, 08) в сравнении с контролем (правые глаза, 0Ό). На фиг. 14 показаны два примера. Эти диаграммы демонстрируют относительное увеличение (в %) площади каждого пятна в левом и правом глазу животных №3315 и 3300.

Кроме того, во всех вышеописанных исследованиях отмечалось, что анти-КТР801-з1ККА не оказывала вредных действий на электроретинограммы (ЕКС), гистологию глаз или на структуру и функцию других органов и систем.

Суммирование приведенных выше экспериментов и результатов

1. Как генетическое (КТР801-/-), так и терапевтическое з1ККА-ингибирование экспрессии КТР801 в модели, индуцированной лазером СNУ, влажной связанной с возрастом дегенерации желтого пятна (влажной АМЭ) приводит к значимому уменьшению объема СNУ.

2. Положительные результаты были получены в мышиной модели и модели примата не человека.

3. Патологическое и ЕКС-исследование на обезьянах не обнаруживало никакой зЖКАопосредованной токсичности ни в глазах, ни в каких-либо других органах или системах.

С) Эффективность комбинированной терапии з|ККА КТР801 (КЕЭЭ14) и анти-УЕСЕ-антитела.

Эффективность комбинированной терапии з|ККА КТР801 (КЕЭЭ14) и анти-УЕСЕ-антитела в лечении заболеваний, в которых имеет место СNУ, исследовали в описанной выше мышиной модели СNУ.

A) Исследования объема СNУ

Объем хороидальной неоваскуляризации (СИУ) спустя 3 недели после лазерного повреждения рассчитывали с использованием конрфокальной флуоресцентной микроскопии, как описано ранее (8акига1 е! а1., 10У8 2003; 44:3578-85 и 8акига1 е! а1. 10У8 2003; 44: 2743-2749). В предшествующих исследованиях авторы обнаружили, что анти-УЕСЕ-А-антитело (АЬ) уменьшало объем СNУ зависимым от дозы образом. Доза 1 нг УЕСЕ-А-АЬ была выбрана для комбинированных исследований КЕ0014+УЕСЕ-А-АЬ, так как эта доза имела промежуточное ингибирующее действие: антитело УЕСЕ-А (АЬ) (1 нг) уменьшало размер СNУ на 26±6%.

Главными результатами исследования КЕЭЭ14+ антитело УЕСЕ-А (АЬ) являются:

добавление КЕЭЭ14 при более низкой дозе 0,05 мкг уменьшало размер СКУ на 27±4% в сравнении с одним АЬ УЕСЕ-А;

добавление КЕЭЭ14 при более высокой дозе 0,25 мкг уменьшало размер СКУ на 55±3% в сравнении с одним АЬ УЕСЕ-А.

B) Исследования подтекания СКУ

Эксперимент 1

Этот эксперимент планировали для идентификации потенциального аддитивного или синергического терапевтического действия ингибирования УЕСЕ и КТР801 в модели индуцируемой лазером хороидальной неоваскуляризации в мышах.

- 52 012799

Материалы

ИЕ0014 (δίΚΝΑ ΚΊ^η

ИЕ0Э8 (отрицательный контроль)

Анти-УЕСР-антитела

Неспецифический 1дС (отрицательный контроль)

СΝV индуцировали в день 0, как описано выше; тест-материал инъецировали субъектам в день 0 и день 7.

Результаты оценивали флуоресцеиновой ангиографией в недели 1, 3, 3 и посредством измерения объемов СΝV при неделе 3. Каждая тест-группа состояла из 10 глаз.

Экспериментальные группы:

УЕСЕ-ΑΕ 0,5 нг/глаз

УЕСЕ-ΑΕ 1 нг/глаз

VЕСР-ΑЬ 2 нг/глаз

VЕСР-ΑЬ 4 нг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,05 мкг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,01 мкг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,25 мкг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,05 мкг/глаз + VЕСР-ΑЬ 1 нг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,1 мкг/глаз + VЕСР-ΑЬ 1 нг/глаз

ΚΒΌΌ14 0,25 мкг/глаз + VЕСР-ΑЬ 1 нг/глаз

Контрольные группы

ЗФР

Неспецифический 1дС 2 нг/глаз

ΚΒΌΌ8 0,1 мкг/глаз

ΚΒΌΌ8 0,1 мкг/глаз + VЕСР-ΑЬ 1 нг/глаз

Результаты

Результаты приведенного выше эксперимента представлены на фиг. 23-24. Эти результаты показывают, что одновременное интравитреальное введение VЕСР-ΑЬ и ΚΒΌΌ14 приводит к увеличенному и зависимому от дозы ингибированию хороидальной неоваскуляризации и подтекания хороидальных кровеносных сосудов, выраженному в уменьшенной встречаемости пятен категории 4 и уменьшенной встречаемости пятен категории 1.

Ангиограммы распределяли на категории с использованием модификации ранее опубликованной схемы полуколичественного распределения по категориям (1-4) (8акига1 е1 а1., 1ОУ8 2003; 44: 2743-2749). Повреждения категории 1 рассматривали как никогда не образующиеся, т. е. как эквивалент полного предотвращения. Повреждения категории 4 рассматривали как патологически значимые, т.е. как эквивалент повреждений, которые могли бы лечиться в пациентах. Антитело (ΑΒ) УЕСР-Α (1 нг) уменьшало встречаемость повреждений категории 4 на один глаз на 38±8% и увеличивало встречаемость повреждений категории 1 на один глаз на 66±43%.

Главными результатами исследования подтекания с использованием комбинации ΚΒΌΌ14+ΑΒ УЕСР-Α являются:

добавление ИЕОЭ14 при более низкой дозе 0,05 мкг уменьшало встречаемость повреждений категории 4 на 66±12% в сравнении с одним ΑΕ УЕСР-Α;

добавление ИЕОЭ14 при более высокой дозе 0,25 мкг уменьшало встречаемость повреждений категории 4 на 60±12% в сравнении с одним ΑΕ УЕСР-Α;

добавление ИЕОЭ14 при более высокой дозе 0,25 мкг удваивало встречаемость повреждений категории 1 в сравнении с одним ΑΕ УЕСР-Α.

Эксперимент 2

Этот эксперимент планировали для исследования действия ИЕОЭ14 на экспрессию гена в ИРЕ и нейроретине.

План эксперимента

Группы:

ЗФР

РЕПП14 0,25 мг

Размер группы был 5 глаз. СΝУ индуцировали лазерной обработкой, как описано выше, в день 0; тест-материал также инъецировали в день 0 и действие оценивали количественным ПЦР-анализом экспрессии, гена в ЯРЕ и нейроретине в дни 0 и 5.

Результаты

Результаты описанного выше эксперимента представлены на фиг. 25. Эти результаты показывают, что введение РЕПП14 вызывает:

~40% отрицательную регуляцию экспрессии ΚТР801 ниже фона как в РРЕ, так и в нейроретине (см. также фиг. 26);

- 53 012799 ~70% положительную регуляцию экспрессии РЕЭЕ над фоном в нейроретине (обратите внимание: в ЗФР-инъецированных глазах экспрессия РЕЭЕ отрицательно регулируется на 40% ниже фона);

~40% отрицательную регуляцию экспрессии УЕСЕ 164 ниже фона в В РЕ (обратите внимание: в ЗФР-инъецированных глазах экспрессия УЕСЕ164 отрицательно регулируется на 20%);

~50% уменьшение экспрессии МСР1 в ВРЕ/хороидах (фиг. 26).

Общие выводы из обоих экспериментов одновременное ингибирование ВТР801 и УЕСЕ усиливало ингибирующее действие на хороидальную неоваскуляризацию и неоваскулярное подтекание;

ингибирование экспрессии ВТР801 ВЕЭЭ14 не только предотвращает отрицательную регуляцию РЕЭЕ в модели СПУ, но и усиливает его экспрессию в сравнении с фоном;

ингибирование экспрессии ВТР801 приводит к одновременной отрицательной регуляции МСР1, которая должна иметь противовоспалительное действие;

без связывания себя теорией авторы считают, что увеличение экспрессии РЕЭЕ ВЕЭЭ14 может лежать в основе наблюдаемого объединенного действия одновременного ингибирования УЕСЕ и ВТР801.

(Примечание: РЕЭР является хорошо известным антиангиогенным и нейропротективным фактором).

Без связывания себя теорией, авторы считают, что уменьшение экспрессии МСР1 ВЕЭЭ14 может также лежать в основе наблюдаемого объединенного действия одновременного ингибирования УЕСЕ и ВТР801.

(Примечание: МСР1 является хорошо известным провоспалительным хемокином, участвующим в патогенезе АМО)

Дополнительные модели АМЭ, которые могут быть использованы для испытания способов данного изобретения:

Сс1-2- или Ссг-2-недостаточные животные - недостаточность любого из этих белков вызывает развитие некоторых из основных признаков АМЭ. Животные, недостаточные по этим белкам, могут быть использованы для испытания способов данного изобретения.

В отношении дополнительной информации о моделях АМО животных см. СЬабег, У1кюп гекеагсЬ 42 (2002) 393-399; АтЬаб е! а1., Па!иге Мебюте 9 (11) (2003) 1390-1397; То1епбпо е! а1., Вебпа 24 (2004) 132-138.

Ό) Сравнение активности анти-ВТР801-к1ВПА ВЕЭО14, имеющей 3'-фосфатную группу на каждой цепи с активностью той же самой молекулы, не имеющей 3'-фосфата (ВЕЭЭ14ПР) в модели индуцированной лазером СПУ.

Этот эксперимент обычно выполняли и оценивали, как описано выше. Один глаз каждой мыши (12 на группу) инъецировали 0,25 мкг кГВПА ВЕОО14, тогда как другой глаз инъецировали кГВПА ВЕОП14П1Р.

Результаты

Обе кГВПА равным образом эффективно уменьшали объем СПУ (фиг. 27).

Пример 7. Модели и результаты, связанные с ХОБЛ и эмфиземой.

Соединения данного изобретения испытывали на следующих моделях животных:

Модель индуцированной сигаретным дымом эмфиземы: хроническое воздействие сигаретным дымом вызывает эмфизему у нескольких животных, таких как, т!ег аба, мышь, морская свинка.

Индуцируемая активностью легочных протеаз эмфизема.

Модель эмфиземы с ингибированием УЕСЕВ.

Бронхиальная инстилляция с использованием нейтрофилов/панкреатической эластазы в грызунах.

Индуцируемая ММР (металлопротеазой матрикса) эмфизема.

Индуцируемая воспалением эмфизема.

Кроме того, модели эмфиземы могут быть получены с использованием генетических способов (например, мыши, несущие мутацию Т8К), и эмфизематозные животные могут быть получены с использованием известных модификаторов восприимчивости к эмфиземе, таких как, т!ег аба, легочное повреждение, альвеолярная гиперплазия, гипероксия, обработка глюкокортикоидами и питание.

А. Оценка влияния отсутствия ВТР801 на развитие заболевания в мышиных моделях эмфиземы (с использованием мышей с нокаутом ВТР801).

(1) Индуцированные сигаретным дымом (С8) воспаление и апоптоз инициируют в 5 самцах мышей с нокаутом (КО) ВТР801 и 5 контрольных мышах дикого типа в возрасте 4 месяцев. Этих мышей подвергают интенсивному С8 (как описано в Вапдакату е! а1., см. выше) в течение 7 дней. Необработанные мыши КО и VΤ из эксперимента с ингибированием УЕСЕВ, описанного выше, могут служить в качестве необработанных контрольных групп для этого эксперимента. Эти легкие затем раздувают агарозой, фиксируют и заливают в парафин, и развивающийся окислительный стресс в мышах КО оценивают посредством:

a) иммуногистохимической локализации и количественного определения 8-оксо-бС в срезах легкого;

b) иммуногистохимической локализации и количественного определения активной каспазы 3 в сре

- 54 012799 зах легкого с использованием специфических антител или количественной оценки количества ТЦКЕЬположительных клеток;

с) измерения концентрации церамидов в легочных экстрактах;

б) измерения каспазной активности в легочных экстрактах.

(2) Долгосрочная обработка сигаретным дымом в мышах КО.

самок мышей КО и 6 самок мышей \УТ того же возраста подвергали интенсивной обработке сигаретным дымом (5 ч в день) во время периода 6 месяцев. Затем этих мышей умерщвляли и средний интерсептальный диаметр (параметр развития эмфиземы) оценивали с использованием морфометрического подхода.

В. Оценка влияния отсутствия КТР801 на прогрессирование заболевания в мышиных моделях эмфиземы посредством ингибирования эндогенного КТР801 с использованием внутрилегочной доставки КТР801-инактивирующей к!^А.

С8-индуцируемое воспаление индуцировали 7-дневной обработкой дымом в 2 группах мышей С57ВЬ6, 10 мышей на группу. Группа 1: С8 + доставка контрольной к!^А (КЕЭЭ8); группа 2: С8 + к1^А КТР801 (КЕОЭ14). Контрольные группы мышей инсталлировали любым типом к!^А, но держали в условиях комнатного воздуха. Этих животных оценивали как в описанном выше эксперименте с мышами КО.

Способы

Воздействие сигаретным дымом (С8)

Воздействие проводили (7 ч/день, 7 дней в неделю) сжиганием эталонных сигарет 2К4Р (2,45 мг никотина на одну сигарету), купленных в ТоЬассо КекеагсЬ 1пкйГиГе, Ишуегкйу оГ КепГиску, ЬехтдГоп, ΚΥ, И8А, с использованием образующего сигаретный дым аппарата (Мобе1 ТЕ-10, Теаде ЕпГегрпкек, Пау1к, СА, И8А). Каждая тлеющая сигарета пускала клубы дыма в течение 2 с один раз каждую минуту с получением всего восьми выпусков дыма, при скорости тока 1,05 л/мин с получением стандартного выпуска дыма 35 см³. Эта машина для образования сигаретного дыма приспособлена для образования смеси дыма бокового потока (89%) и дыма основного потока (11%) сжиганием пяти сигарет одновременно. Атмосферу камеры подвергают мониторингу на общие взвешенные частички и монооксид углерода с концентрациями 90 мг/м³ и 350 м.д., соответственно.

Морфологический и морфометрический анализы

После подвергания мышей действию С8 или инстилляции экспрессирующей КТР801 плазмиды мышей анестезируют галотаном и легкие раздувают 0,5% низкокипящей агарозой при постоянном давлении 25 см, как описано ранее. Раздутые легкие фиксируют в 10% забуференном формалине и заливают в парафин. Срезы (5 мкм) окрашивают гематоксилином и эозином. Средний альвеолярный диаметр, альвеолярную длину и средние линейные перегородки определяют морфометрией при помощи компьютера с использованием программы 1таде Рго Р1ик (Меб1а СуЬетейск, 8Пусг 8рппд, ΜΌ, И8А). Срезы легких в каждой группе шифруют и репрезентативные изображения (15 на один срез легкого) получает исследователь, которому неизвестна идентичность предметных стекол, с использованием микроскопа №коп Е800, объектива 20Х.

Бронхоальвеолярный лаваж (ВАЬ) и фенотипирование

После подвергания действию С8 или инстилляции экспрессирующей КТР801 плазмиды мышей анестезируют натрий-пентобарбиталом. Жидкость ВАЬ, собранную из легких этих мышей, центрифугируют (500 д при 4°С) и осадок клеток ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе. Общее количество клеток в жидкости лаважа определяют и 2х10⁴ клеток цитоцентрифугируют (8Ьапбоп 8ои111егп РгобисГк, Р1йкЬигдЬ, РА, И8А) на стеклянных предметных стеклах и окрашивают красителем Райта-Гимзы. Дифференциальный счет клеток выполняют на 300 клетках в соответствии со стандартными цитологическими способами.

Идентификация популяций альвеолярных апоптотических клеток в легких

Для идентификации различных типов альвеолярных клеток, подвергающихся апоптозу в легких, иммуногистохимическое окрашивание активной каспазы 3 выполняют в срезах легких из комнатного воздуха (КА), а также подвергнутых С8 мышах. Для идентификации эпителиальных апоптотических клеток типа II в легких после мечения активной каспаза 3 срезы легких инкубируют сначала с антителом против мышиного сурфактантного белка С (8рС) и затем с антикроличьим антителом с Техасским красным в качестве маркера. Апоптотические эндотелиальные клетки идентифицируют инкубированием срезов сначала с антителом против мышиного СО 31 и затем с биотинилированным кроличьим антимышиным вторичным антителом. Срезы легких промывают в ЗФР и затем инкубируют с конъюгированным комплексом стрептавидина-Техасского красного. Апоптотические макрофаги в легких идентифицируют инкубированием срезов сначала с крысиным антителом против мышиного Мас-3 и затем с антикрысиным конъюгированным с Техасским красным антителом. Наконец, на все срезы легких наносят краситель ЭАР1 (4,6-диамидино-2-фенилиндол), инкубируют в течение 5 мин, промывают и монтируют с использованием среды для заключения гистологических препаратов УесГакЫе1б Нагб8еГ. ЭАР1 и флуоресцеин визуализируют при 330-380 нм и 465-495 нм, соответственно. Изображения срезов легких получают с использованием микроскопа №коп Е800, объектива 40Х.

- 55 012799

Иммуногистохимическая локализация активной каспазы-3

Иммуногистохимическое окрашивание в анализе активной каспазы-3 выполняют с использованием антитела против активной каспазы-3 и положительные в отношении активной каспазы-3 клетки считают с Масго с использованием программы Ийаде Рго Р1ик. Количества нормализуют посредством суммы альвеолярных профилей, называемых здесь альвеолярной длиной, и выражают в мкм. Альвеолярные длины обратно коррелируют со средним линейным промежутком между септами (перегородками), т.е. когда альвеолярные септы (перегородки) разрушаются, средние линейные промежутки между септами увеличиваются в виде общей альвеолярной длины, т.е. общая альвеолярная септальная длина уменьшается.

Анализ активности каспазы-3

Активность каспазы 3/7 измеряют в экстрактах ткани легких с использованием флуорометрического анализа в соответствии с инструкциями изготовителя. Быстро замороженную ткань легкого (п=3 на группу) гомогенизировали с буфером для анализа с последующими обработкой ультразвуком и центрифугированием при 800хд. После удаления ядер и клеточных остатков супернатант (300 мкг белка) инкубировали с профлуоресцентным субстратом при комнатной температуре в течение 1 ч и интенсивность флуоресценции измеряли с использованием прибора ТурНооп рНокрНотадег (АтегкНат Вюкшепсек, Шс., Р1кса1а^ау, N1, И8А). Результаты выражают в виде скорости расщепления специфического субстрата каспазы-3, выраженной в единицах ферментативной активности каспазы-3, нормализованных с использованием общей концентрации белка. Активную рекомбинантную каспазу-3 использовали в качестве стандарта анализа (0-4 Е). Лизаты ткани без субстрата, один буфер для анализа и лизаты с ингибитором каспазы-3 использовали в качестве отрицательнрых контролей.

Иммуногистохимическая локализация 8-оксо-бО

Для иммуногистохимической локализации и количественного определения 8-оксо-бО срезы легкого из мышей, подвергнутых действию С8 или инсталлированных экспрессирующей КТР801 плазмидой, инкубировали с анти-8-оксо-бО-антителом и окрашивали с использованием набора ИиюСепех ТМ НоГНС ЭЛВ с использованием мышиных антител. 8-оксо-бО-положигельные клетки считали с Масго (с использованием Инаде Рго Р1ик) и количества клеток нормализовали с использованием альвеолярной длины, как описано.

Инстилляция плазмидной ДНК в легкие мыши

Экспрессирующие плазмидную ДНК КТР801 и контрольные векторы готовили с использованием набора для выделения не содержащей эндотоксинов ДНК. Для интратрахеальной инстилляции 50 мкг плазмидной ДНК доставляют в 80 мкл стерильного перфторуглерода. Свойства переноса кислорода перфторуглеродом делают его хорошо переносимым при этих объемах, в то время как его физикохимические свойства делают возможной чрезвычайно эффективную дистальную легочную доставку при интратрахеальной инстилляции. Мышей анестезируют коротким ингаляционным воздействием галотана, язык осторожно вытягивают вперед пинцетом и трахею инстиллируют раствором перфторуглерода, наносимым при основании языка через тупой ангиокатетер.

Инстилляция к^КNА в легкие мыши

Мышей анестезируют внутрибрюшинной инъекцией Кетамина/Ксилазина (115/22 мг/кг). 50 мкг к^КNА инсталлируют интраназально в объеме 50 мкл 0,9% №1С1 доставкой пяти последовательных порций по 10 мкл. В конце интраназальной инстилляции голову мыши удерживают в прямом положении в течение 1 мин для гарантии того, что весь инстилированный раствор стекает внутрь.

В отношении дополнительной информации, см. Капдакату Т., СНо С.У., ТЫтти1арра, К.К., Ζΐκιι Ь., 8г1кнта 8.8., Кепк1ег Έν., УататоЮ М., Ре1гасНе Ι., Тибег К.М., В1к^а1 δ. СепеИс аЫаИоп οί №£2 епНапсек кнксерИЬПИу Ю адагеие ктоке-1бисеб етрНукета ш тюе. 8нЬтЦ1еб !о 1оита1 οί С11шпса1 ИкекИдаПоп; Уакипоп КакаНага, КиЬт М. Тибег, Саг1упе Ό. Соо1, Эау|б А. ЬупсН, 8оша С Р1огек, апб №гЬеИ Р. Уое1ке1. ВπбοΐНе1^а1 Се11 Оеа1Н апб Оесгеакеб Вxр^екк^οπ οί Уакси1аг ВπбοΐНе1^а1 ОгоМН РасЮг апб Уакси1аг ВπбοΐНе1^а1 Сго\\1Н РасЮг КесерЮг 2 т ВтрНукета. Ат 1 КекрД СгН Саге Меб Уо1 163. рр 737-744, 2001; Уакипоп КакаЬага, КиЬт М. Тибег, Иатш1е Тагакеую1епе-81е^аг1, ТнпоШу Ό. Ье Сгак, 81еуеп АЬтап, Ре1ег К. Н1г1Ь, 1оНаппек VаИеπЬе^де^, апб ШгЬеИ Р. Уое1ке1. [пЫЬИюп οί УГОР гесерЮгк саикек 1ипд се11 арорЮкк апб етрНукета. 1. С1ш. ИкекИ 106:1311-1319 (2000); апб а ге\зе\\· оп Не Юрю: КоЬт М. Тибег, 8Ьагоп МсОгаИ апб Ειπ6 №р1ипе, ТЬе ра1Но1одюа1 тесЬашктк οί етрНукета тобе1к: \\Ьа1 бо Неу Науе ш соттоп? Ри1топагу РНагтасо1оду & ТНеграенИск 2002.

Результаты

1. Инстилляция экспрессирующей КТР801 плазмиды приводит к эмфиземаподобному фенотипу в легких мыши, что доказывается (1) увеличением количеств клеток в бронхоальвеолярном лаваже (фиг. 15а); апоптозом легочных септальных клеток (фиг. 15Ь) и увеличением альвеолярного диаметра (фиг. 15с).

2. Инстилляция к|№А КТР801 (№0014) приводит к уменьшению экспрессии КТР801 в легких (фиг. 17Ь).

3. Мыши с нокаутом КТР801 (КО) защищены от развития эмфиземы после 6 месяцев воздействия сигаретным дымом, что доказывается отсутствием увеличения альвеолярного диаметра (фиг. 18).

4. Мыши с нокаутом КТР801 (КО) защищены от индуцируемого воздействием сигаретного дыма

- 56 012799 воспаления, что доказывается уменьшенным количеством воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже после 1 недели воздействия сигаретным дымом (фиг. 16, а-Ь).

5. Мыши с нокаутом КТР801 (КО) защищены от индуцированного воздействием сигаретного дыма апоптоза септальных клеток, что доказывается окрашиванием легочных срезов на активированную каспазу (фиг. 16с).

6. Инсталлированные КЕОЭ14 мыши частично защищены от индуцируемого воздействием сигаретного дыма воспаления, что доказывается уменьшенным количеством воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже после 1 недели воздействия сигаретным дымом (фиг. 17а).

Пример 8. Модели и результаты, относящиеся к микрососудистым нарушениям

Соединения данного изобретения испытывали на моделях животных диапазона микрососудистых нарушений, описанного ниже.

1. Диабетическая ретинопатия

КТР801 стимулирует апоптоз нервных клеток и генерирование молекулярных частиц активного кислорода 1п νίΙΐΌ. Автор данного изобретения также нашел, что в мышах с нокаутом КТР801 (ΚΟ), подвергнутых модели ретролетальной фиброплазии (КСР), патологическая неоваскуляризация NУ уменьшалась при гипоклических условиях, несмотря на повышения УЕСЕ, в то время как этот ген не влиял на физиологическую неонатальную ретинальную ΝΥ. Кроме того, в этой модели отсутствие КТР801 было также протективным против гипоксического апоптоза нейронов и гипероксической облитерации сосудов.

Эксперимент 1

Диабет индуцировали в 8-недельных однопометных мышах с нокаутом КТР801 (КО) и мышах дикого типа (УТ) С57/129к\' внутрибрюшинной инъекцией 8Т2. Спустя 4 недели получали ЕКС (единственная белая вспышка, 1,4х10⁴ фут-свечей, 5 мс) из левого глаза после 1 ч темновой адаптации. КУР оценивали из обоих глаз с использованием способа проникновения Еνаηк-Ь1ие-альбумина.

Результаты

Глюкоза крови не отличалась ни между диабетическими мышами (ОМ) УТ и ОМ КО (495±109 против 513±76 мг/дл), ни между недиабетическими мышами (ЫЭМ) УТ и КО (130±10 против 135±31 мг/дл, соответственно). КУР в группе ОМ УТ увеличивался на 138% (51,2±37,9 мкл/г/ч, п=8) в сравнении с МЭМ УТ (21,5±18,8 мкл/г/ч, п=6, р=0,055). В отличие от этого, КУР уменьшался на 80% в ОМ КО (9,5±8,5 мкл/г/ч, п=6, р=0,023) в сравнении с мышами ОМ УТ, что приводило к 140% уменьшению индуцируемого диабетом КУР. В мышах ОМ УТ наблюдали пролонгирование (р<0,05) неявных периодов колебательного потенциала для ОР2 (11%), ОР3 (12%) и ОР4 (14%) и для В-волны (23%) в сравнении с ПБМ УТ. А-волна не была значимо изменена. Эти изменения нормализовали ~100% в ОМ КО для ОР3 и ОР4 и 65% для В-волны в сравнении с ПБМ КО.

Вывод: нокаут КТР801 уменьшает индуцируемые диабетом КУР- и ЕКС-отклонения от нормы в мышах, что позволяет предположить, что этот индуцируемый гипоксией ген может играть важную роль в патогенезе раннего диабетического заболевания сетчатки.

Эксперимент 2

Диабет индуцировали в мышах с нокаутом КТР801 и в контрольных мышах дикого типа с соответствующим генетическим фоном. Кроме того, его индуцировали в мышах С57В16, которых затем использовали для внутривенной инъекции стрептозотоцином (8Т2 90 мг/кг в течение 2 дней после ночного голодания). Физиологию животных подвергали мониторингу на протяжении этого исследования на глюкозу крови, массу тела и гематокрит. Инъецированные носителем мыши служили в качестве контролей.

Соответствующих животных обрабатывали интравитреальными инъекциями 1 мкг анти-КТР801к|КНА КЕОО14 или 1 мкг контрольной анти-СЕР-кЖЫА. кГКЫА инъецировали дважды в ходе этого исследования - в день 0, когда выполняли первую инъекцию 8Т2, и в день 14 после инъекции 8Т2.

Ретинальное сосудистое подтекание измеряли с использованием способа с красителем Еνаηк-Ь1ие (ЕВ) на животных после 4-недельного срока диабета. Мыши имели катетер, имплантированный в правую яремную вену за 24 ч перед измерениями Еνаηк Ь1ие (ЕВ). Измерения проницаемости сетчатки в обоих глазах каждого животного выполняли согласно стандартному протоколу с использованием красителя Еνаηк Ь1ие.

Результаты

1. Подтекание кровеносных сосудов сетчатки уменьшалось на 70% в диабетических мышах с нокаутом КТР801 (КО) в сравнении с диабетическими мышами дикого типа (см. фиг. 20).

2. Нокаут КТР801 нормализует ЕКС-отклонения от нормы в мышах: в мышах ОМ УТ имелось пролонгирование (р<0,05) неявных периодов колебательного потенциала для ОР2 (11%), ОР3 (12%) и ОР4 (14%) и для В-волны (23%) в сравнении с ПБМ УТ. А-волна не была значимо изменена. Эти изменения нормализовали ~100% в мышах ОМ с КО КТР801 для ОР3 и ОР4 и 65% для В-волны в сравнении с мышами НЭМ КО КТР801 (см. фиг. 21).

3. Подобно результатам в мышах КО подтекание кровеносных сосудов сетчатки уменьшалось на 50% в диабетических мышах, инъецированных интравитреально кЖЫА против КТР801 КЕОО14 в срав

- 57 012799 нении с диабетическими мышами, инъецированными интравитреально контрольной к^ВNΑ против СЕР (см. фиг. 22).

2. Ретролетальная фиброплазия

Ретролетальную фиброплазию индуцировали подвергающем тест-животных гипоксическим и гипероксическим условиям и затем тестированием действий на сетчатку. Результаты показали, что мыши КО ВТР801 были защищены от ретролетальной фиброплазии, что валидизировало защитное действие ингибирования ВТР801.

3. Инфаркт миокарда

Инфаркт миокарда индуцировали лигированием левой передней нисходящей артерии в мышах, как краткосрочно, так и долгосрочно. Результаты: уменьшение уровней фракции ТпТ и СРК-МВ при 24 ч после инфаркта в крови и улучшенная эхокардиограмма (объем фракции выброса) при 28 днях после инфаркта в мышах с нокаутом ВТР801 (КО).

4. Микрососудистые ишемические состояния

Модели животных для оценки ишемических состояний включают:

1) закрытое повреждение головы (СШ) - экспериментальная ТЫ индуцирует ряд событий, способствующих нейрологическим и нейрометаболическим каскадам, которые связаны со степенью и продолжительностью бихевиористических (поведенческих) нарушений. СЫ индуцируют под анестезией, когда гире дают падать свободно с предварительно фиксированной высоты (Сйеп е! а1., 1. №иго!гаита 13, 557, 1996) на открытый череп, охватывающий левое полушарие в средневенечной плоскости;

2) временную окклюзию средней мозговой артерии (МСАО) - 90-120-минутную временную очаговую ишемию выполняют во взрослых самцах крыс 8ргадие-Эате1еу, 300-370 г. Примененный способ представляет собой МКАО с использованием интралюминального шовного материала (Ьопда е! а1., 8!гоке, 30, 84, 1989 и Эодап е! а1., 1. №игосйет. 72, 765, 1999). Вкратце, под анестезией галотаном 3-0найлоновый шовный материал, покрытый поли-Ь-лизином, вставляют в правую внутреннюю сонную аретрию ОСА) через отверстие в наружной сонной артерии. Найлоновую нить проталкивают в Κ.Ά до начала правой МСА (20-23 мм). Спустя 90-120 мин эту нить вытягивают, животное зашивают и дают ему придти в нормальное состояние;

3) перманентную окклюзию средней мозговой артерии (МСАО) - окклюзия является перманентной, односторонне индуцированной электрокоагуляцией МСА. Оба способа приводят к очаговой ишемии головного мозга ипсилатеральной стороны коры головного мозга с оставлением интактной контралатеральной стороны (контроля). Левую МСА обнажают посредством височной резекционной трепанации черепа, как описано для крыс (Татига А. е! а1.: 1 СегеЬ В1ооб Иоте Ме!аЬ. 1981; 1:53-60). МСА и ее лентикуло-стриатальное ответвление (ответвление к хрусталику и полосатому телу) закупоривают проксимально относительно медиальной границы обонятельного тракта микробиполярной коагуляцией. Рану зашивают и животных возвращают в их клетку в помещении, нагреваемом при 26-28°С. Температуру животных поддерживают все время при помощи автоматического термостата.

5. Острая почечная недостаточность (АВЕ)

Испытание активной к^ВNΑ для лечения АВЕ может быть выполнено с использованием индуцированной сепсисом АВЕ или индуцированной ишемией-реперфузией АВЕ.

1. Индуцированная сепсисом АВЕ

Две прогностические модели животных индуцированной сепсисом АВЕ описаны М1уа_р Т., Ни X., Уиеп Р.8., Мигата!ки Υ., Вег 8., Нетей! 8.М., 8!аг В.А., 2003, Е!йу1 ругиуа!е бесгеакек керкщ-шбисеб аси!е гепа1 Габиге апб ти1!1р1е огдап батаде т адеб тюе, К1бпеу Ш!. Ш; 64 (5): 1620-31. Эти две модели получают введением липополисахарида и слепокишечной лигирующей пункцией в мышах, предпочтительно в старых мышах.

2. Индуцированная ишемией-реперфузией АВЕ

Эта прогностическая модель животного описана Ке11у Кб., Р1о!кш Ζ., ^1дато!! 8.Ь., Оадкег Р.С., 2003 1апиагу, Р53 теб1а!ек !йе арор!о!1с гекропке !о СТР бер1е!юп айег гепа1 1ксйет1а-герегГикюп: рго!ес!1уе го1е оГ р53 шЫЬйог, 1 Ат №рйго1.; 14(1):128-38.

Ишемическое-реперфузионное повреждение индуцировали в крысах после 45 мин билатерального пережимания артерий почек и последующего прекращения пережимания для создания возможности 24часовой реперфузии. 250 мкг б^А ΒΕΩΩ14 или СЕР (отрицательный контроль) инъецировали в яремную вену за 2 ч до и 30 мин после этого пережимания. Дополнительные 250 мкг вводили через хвостовую вену при 4 и 8 ч после пережимания. к^ВNΑ против СЕР служила в качестве отрицательного контроля. Прогрессирование АВЕ подвергали мониторингу посредством измерения сывороточных уровней креатинина до и спустя 24 ч после хирургии. В конце этого эксперимента крыс реперфузировали через постоянную бедренную линию теплым ЗФР и затем 4% параформальдегидом. Левые почки удаляли и хранили в 4% параформальдегиде для последующего гистологического анализа. Острая почечная недостаточность часто определяется как резкое увеличение уровня креатинина в сыворотке относительно фона. Увеличение по меньшей мере 0,5 мг на 1 дл или 44,2 мкмоль на 1 л сывороточного креатинина считается указанием на острую почечную недостаточность. Сывороточный креатинин измеряют при времени 0 до хирургии и при 24 ч после хирургии АВЕ.

- 58 012799

Для исследования распределения δίΚΝΑ в почке крысы Су3-меченые 19-мерные затупленные молекулы δίΚΝΑ (2 мг/кг), имеющие чередующуюся О-метил-модификацию в сахарных остатках, вводили ίν в течение 3-5 мин, после чего проводили визуализацию ίη νίνο с использованием двухфотонной конфокальной микроскопии. Анализ с использованием конфокальной микроскопии обнаружил, что основная часть δίΚΝΑ в почках сконцентрирована в эндосомном компартменте проксимальных канальцевых клеток. Как эндосомная, так и цитоплазматическая флуоресценция δίΚΝΑ является относительно стабильной во время первых 2 ч после доставки и исчезает при 24 ч.

Как видно из фиг. 19, было десятикратное увеличение уровня сывороточного креатинина после 45минутной обработки билатерального зажимания артерий (обработки ЗФР). Четыре инъекции δίΚΝΑ ΚΤΡ801 (660014, 8Е0 ΙΌ N0: 16 и 66) (за 2 ч до и при 30 мин, 4 и 8 ч после зажимания) значимо уменьшали уровень креатинина в сыворотке на 30% (Р<0,02). Эти результаты предполагают, что δίΚΝΑ ΚΤΡ801 может защищать почечную ткань от действий ишемического-реперфузионного повреждения и, следовательно, уменьшать серьезность ΑΚΕ.

Пример 9. Получение δίΚΝΑ.

С использованием патентованных алгоритмов и известной последовательности гена ΚΤΡ801 (8Е0 ΙΌ N0:1) генерировали последовательности многих потенциальных δίΚΝΑ. Молекулы δίΚΝΑ в соответствии с приведенными выше описаниями, получали, по существу, как описано здесь.

δίΚΝΑ данного изобретения могут быть синтезированы любым из способов, которые хорошо известны в области синтеза рибонуклеиновых (или дезоксирибонуклеиновых) олигонуклеотидов. Например, может быть использован коммерчески доступный прибор (доступный, 1п!ег аба, из Αρρ^ά Βίοδλ'δ1сщх); олигонуклеотиды получают в соответствии с описанными здесь последовательностями. Перекрывающиеся пары химически синтезированных фрагментов могут быть лигированы с использованием способов, хорошо известных в данной области (например, см. патент США № 6121426). Цепи синтезируют по отдельности и затем отжигают друг с другом в пробирке. Затем эти двухцепочечные δίΚΝΑ отделяют от одноцепочечных олигонуклеотидов, которые не отожглись (например, вследствие избытка одного из них), при помощи ВЖХ. Что касается δίΚΝΑ или фрагментов δίΚΝΑ данного изобретения, две или более таких последовательностей могут быть синтезированы и связаны вместе для применения в данном изобретении.

Молекулы δίΚΝΑ этого изобретения могут быть синтезированы с использованием процедур, известных в данной области, например процедур, описанных в Штап е! а1., 1987., ί. Αт. СНет. δοα, 109, 7854; 8саппде е! а1., 1990, М1с1е1с Ααάδ. Есх., 18, 5433; ΧνάκοΙΙ е! а1., 1995, М1с1е1с Ααάδ 6сх. 23, 26772684; и ΧνίικοΙΙ е! а1., 1997, Мс6ю6х Μο1. Βίο., 74, 59, и могут использовать обычные защитные и связывающие группы нуклеиновых кислот, такие как диметокситритил на 5'-конце и фосфорамидиты на 3'конце. Необязательно включены модифицированные (например, 2'-О-метилированные) нуклеотиды и немодифицированные нуклеотиды.

Альтернативно, молекулы нуклеиновых кислот данного изобретения могут быть синтезированы по отдельности и соединены вместе после синтеза, например, лигированием (ΜοοίΌ е! а1., 1992, 8с1епсе 256, 9923; Огарег е! а1., Iη!етабοηа1 ΡΟΓ риЬ11са1юп Νο. ХУ093/23569; 8НаЬагоуа е! а1., 1991, МЮсю Ααάδ ЕехсзгсН 19, 4247; Ве1кп е! а1., 1997, Nис1еοδ^άеδ & Nис1еοбάеδ, 16, 951; Ве1кп е! а1., 1997, Βίοοοπ)π0; СНет. 8, 204) или гибридизацией после синтеза и/или удалением защитных групп.

Молекулы δίΚΝΑ этого изобретения могут быть также синтезированы с использованием методологии тандемного синтеза, описанного в публикации заявки на патент США № И82004/0019001 (Мс8\\щдеп), где обе цепи синтезируют в виде единого смежного олигонуклеотидного фрагмента или единой цепи, разделяемой расщепляемым линкером, который затем расщепляют с получением отдельных фрагментов δίΚΝΑ или цепей, которые гибридизуются и делают возможной очистку этого δίΚΝΑ-дуплекса. Этим линкером может быть полинуклеотидный линкер или ненуклеотидный линкер. В отношении дополнительной информации см. публикацию РСТ \У0 2004/015107 (ΑΤυСΕN).

Как описано выше, δίΚΝΑ табл. А (ниже) конструировали таким образом, что чередующиеся сахара имеют 2'-0-метил-модификацию, т.е. чередующиеся нуклеотиды были таким образом модифицированы. В этих предпочтительных вариантах осуществления в одной цепи этой δίΚΝΑ модифицированными нуклеотидами были номера 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19, а в противолежащей цепи модифицированными нуклеотидами были номера 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 и 18. Таким образом, эти δίΚΝΑ являются затупленными на концах 19-мерными молекулами РНК с чередующимися 2'-0-метил-модификациями, описанными выше. δίΚΝΑ табл. 2 и 3 (ниже) конструируют также подобным образом; δίΚΝΑ табл. В являются затупленными на концах 19-мерными молекулами РНК с чередующимися 2'-О-метил-модификациями; δίΚΝΑ таблицы С являются затупленными на концах 21-мерными молекулами РНК с чередующимися 2'О-метил-модификациями.

Табл. А подробно описывает новые молекулы δίΚΝΑ, которые были генерированы и затем синтезированы для гена ΚΤΡ801. Два последних столбца показывают результаты двух экспериментов, выполненных для испытания активности этих новых молекул. Вкратце, клетки Неба или Наса! трансфицировали конкретной новой δίΚΝΑ, которая подлежала испытанию. Затем экспрессию полипептида ΚΤΡ801 определяли Вестерн-блоттингом с использованием антитела против полипептида ΚΤΡ801. В двух правых

- 59 012799 столбцах таблицы А «-» обозначает неактивную или имеющую низкую активность молекулу (которая по существу не ингибирует экспрессию гена ΚΓΡ801); «+» обозначает молекулу δίΚΝΑ с некоторой ингибирующей активностью (экспрессии гена ΚΓΡ801), «++» обозначает молекулу с более высокой ингибирующей активностью и т.д. Любая из молекул δίΚΝΑ, описанных здесь, и, в частности, активные молекулы, подробно описанные в табл. А, являются новыми и также рассматриваются как часть данного изобретения.

Таблица А

1-кхте,	.'Иои<Г1«|*а*К1Я- кА ноиео Ю м им	1доде	ЙКПлшмЖНме	Пэ»	АгпиЕшспован (Αϋ) 1епь<э * “>3 * )	Дойлем» [Ъ№1 1£пь(д'->3')	Ηιίΐύ,ΐΰΜΜ	НиСа4, 20 >4
1	ЙЕ001	Ь	5'ОТА '	12Θ	ОАЗДАбССОСАССиАСССС	осссиАСсиоссссоисиА	+ ’	4
2	ЙЕЛ02		сад	337	□СССАССиСОССАСССОСС	ссдсссиссАСАйсис^А	-
3	КЕООЗ	Ьгаг	соз '	360	шкиосивоссАйбСАсис	САСдССССбСАСАССАССА	- ’	. -
4	ЙЕ004	Ьн1Г	соз	47В	А(ЗСАОСибСДиСАС<51П1бО	сСААСсисАиссязсиссо	-
5	КЕПО5	Ь	сиз	72В	издсоссАсссссдесАсо	ССОССОСССССОССАСОСА	- '
€	Нейдб	Ηπιε	5*итв	119	сАСсилсссссзисАССБА	исссиЗАСсссссидссис
7	ВздКП	Шве	з.'ита	122	ССССАССиАССССССОСАС	СООАССОСССОАССООССб	-	-
8	неаае	ЬйГ	5'итй	125	АЛССсссАссидасссссо	Ассссссилссисссссии	-	-
9	ВесЮ9	Ьгаг	СОЙ	339	лсисссАссисисслс^зси	АеССиОСАбАЗСОСбОАСО	-	- . .
Ю	Кеде! 10	Ьтпг	СОЯ ..	341	еСАОТсссдосисоссАос	ССиБСАСАОСОСОСАСООС		-
11	КеййЦ	Ншг	СОЗ	зёз	ОСОисСОССОССССАСОСА	ОСССиССАСАССАССААСА	-
12	.	Ьлг ..	СОЗ ..	369	ассс Асосииссиссосис	САСАССАССААСАСТСССО		-
11		Ешг	СО5	370	аасссасисоиососспси	АСАссдссААСАсисссии	-	-
. 1-1 ....	Ηεάΰ·14	ктг ··	СОЕ	475	АСсиесмсАССпиабСАС	СОбСС А АССО ОАО ССАСС 0	.**+ -	4++ ..
15	КейсПЗ	Нин*	СОЗ	¢91	ОССАССАССиОСАОСАССО	АССОСАиССАОСООСиОСА	4	4
Згб	ВеДИб	Нтг	СОЗ	486	исиссшзсдссАестесАо	АивСАБСОеСивСАЭОАОА	. -	— . ·
ГГ	ϋβάά17	Ншг	СОЗ	610	ССССССАС5ССССАС6СС0	Абссбигсбсссиссббос	-	-
18	ΗβύεΙΙΒ	Итог	СОЗ	750	ссисоАосиососссАСАС	СиСОСССССААСАИССВДБ	-	-
19	вески 9	Итог	СЦ5	В09	САССЙОСЛСССАСиССССЮ	САбссАсисссибАсвсис	-	-
2ϋ	Йес1с120	Ъшг	Э’ОТВ	1097	Аи&сиАСАСиАСОСАСССС	ССССТСАСОАСРСиАССАО	+ ’	’ +
21	кеаа21	Инг	З'ОТН	1419	оисисиААСАОАбсисссо	АСССАССОАисииАСАСАС	+	4-
22	Ке<И22	Ьтг	З’ОТК	1617	иизид<злиесгл<ЗАСссА5	еисссисиоссАосиАСАА	++	++
гг	йнигз	Ьтг	З'ОТВ	1670	иисААСАисААвиецАиис	СААПАСАСиисАисицсдА	++	+4
г<	Кес!й24.	Ьтг	а* отв	1693	АААОАЩГССАиА&СУСиОА	иААодссцАовсААиАиои	+	+
25 ..	Веска! 5	Ш	З’-отв	1695	АААААиАОиССАОАССИСи .	АЕТАссиАоесААилиипои	4+ ..	+4
26	вееаге	Атт	СОЗ	349	АбсемсасбсАсосседбс	ссисссАсисссАсиссси		- -
27 .		1ЙПГ	ЗЧГРЙ	1673	иАсиоедАСАОСААсосиА	вдслсиисАоетисААвой	44 ....	4+
2В	Вёбй28		з*отв	1717	АААСАисиииАиаАСАДАА	ооооспААОАААСАисиаи	V
29	кеаагэ .....	Ъ	уотк	99	АйСассийАСАСААбОССб	СССЙСШЮОСиОАССАСОО	_ -	-
30	КебдЗО	η	СОЕ	213	АСОАСОАСОАСААССССис	сдссссоисоссцссис&о		-
31	Р.ейсШ	И	СОЗ	393	ААСсссисисшссисссс	ССССАССААСАСАССССиО '	·	_ ·
32	ДесИ32	н	СОЗ	453	АСосоисАассисАсосис	САСССиСАССАОСААСАСО	-
33 '	Р.есМЗЭ	ь	СОЗ	521	АСОСССОССАСАССССАСС	всисассостсеАсессси	‘ - '	- '
34	ЕесИ34	Нг	СОЗ	535	А0СА6СА&СС6СССАСССС	ССССДСССССССЦССиСАО	-	-
35		И	СОЗ	571	АЗоисооизсссАссиеес	СССАССОССССАААСААСО	-
36	веааз^ ...	К	СОЗ	597	АССССОСССОСиАСОССАб .	собес соасАсгссАсссси	-
37	йесшз?	и	ссз	625	АСбОССАССАССбСССССС	сссбсссссиссиссАссо	-
ЗВ .	.....	н	СОЯ ·	829	АиоАсисссААСссАСисс...	с^схюссииссслсисли ..	* ..	- ..

39	весМЗЭ	Н	з.’итв	104 6	АлсисААисАСсииссосс	с сассаассисаоосдсии		++
40 .	К60Б40	И	З'ОТЯ	1539	СиСААСиССБСАЕЦАСАСС	ссоеиАСийсАСАСоисАс	+ .	+ .
41	ВесЙ41	К	З'ОТЙ	1317	АОАОАСАСАААССАССОСС	ссАСсиссооисосидосо	+	+
42	Вебй42	И	гчгтя	1350	АСААСАААСАСАсиисеие	СлссААсисисииисии&у	·++ .1	44
43	Ке<М43	Ьяс	СОЗ	473	стбСАисйссиисссАСАС	сисисссАдссиздиссАс	+	4
44	ЙЕ0044	П	3' (ТТН	955	иссисссосиАсисиссАс·	СиОСАСАСиАСАСССАССА	'+ ·	-4 ·;
45	Ке<к!45	Итг	соя	476	САССООСЛиСАССЕИЮССА	поссААСсисАиссАссис		-
46	ВесЗс14б	ЙШГ	соя	479	САССА ССОССАОСАССиЦС	СААСсисАиссАСсиссис	- ··	- -
47 .	Вебс147	Нпг	соя	483	ССиССЛССАССОССАОСАС	сисАиссАссобсобСАОс		-
49	ВесН48	М»г '	СОЕ	4В5	сиссобСАЯСАОСОССАис	САОССАбСОССОССАбСАС	-	. ·
49	ВЕРО40Л	А	З’итй	1536	ААСОсиесьеоАСАссАоб	слоссисиАсиссАСАОУо	++	4+
50	ВЕО044Л	Ь	З’отй	954	ссосссисиАеосиссАСС	ССТССАОАСиАСАОССАСС	++	44

Обратите внимание, что в приведенной выше табл. А. смысловые цепи δίΚΝΑ 1-50 имеют 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:352, соответственно, а антисмысловые цепи δίΚΝΑ 1-50 имеют 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:53-102, соответственно. Молекула, обозначенная ΚΒΌΌ14, имеет 8Е0 ΙΌ ΝΟ:16 (смысловая цепь) и 8Е0 ΙΌ ΝΟ:66 (антисмысловая цепь).

- 60 012799

Таблица В

Номер	Источник	Длина олиго	Смысловая είΡΝΑ	Антисмысловая δίΚΝΑ	д1950€68бге£ ΝΜ-019058.1 (Ното зарЛепз)	д121312867ге £ΝΜ_029083.1 (Мышь)	д118376Й38ге £НМ_080906.1 (Крыса)	Перекрывание с ре(1 (антисмысловая)
51	Человек	19	СТАСССАООиОсиААСССА	иоосоиАссАДсиоосшиз	[556*574]
52	Человек	19	исвадкхмувоттеюллА	□оиссААССАсиаадАисА	19В4-1002)	-
53	Человек	19	ССАбУббиУббААААСОбА	УСАОТУУОССААССАСТЗб	[389-1007)	-
54	Человек	19	бСШССОАОиСАУСААбАА	УиСУУСАОбАСиСООДАОС	[835-651]	(763-781)
55	Человек	19	ссАМЭсосАииомэтогис	САСААСУСААУЗАССииСС	[1049-1067]
5«	Человек, ообакотшювая обезьяна	19	ссАисУббсисууссдиси	АбАУббААЗАСССАбАУЗб	(1613-16311	[1569-1583]	[1610-1624]	+
5*7	Человек, собахоголовая обезьяна	19	аолиаивиеоаоАссдоси	АСАУОСУАСАСАСАСАУСС	(1152-11701	-
58	Человек, собаюголовая обезьяна	19	АСАСАУАССССУСАОбАСУ	АбСАСУбАббооидабУси	(1090-1108]		[1081-1098]
59	Человек, собакоголовая обезьяна	19	АСАУАССССУСАбУАСУбУ	АСАбОАСУЗАЗбббаАОЗи	[1092-1110]		(1082-1100)
60	Человек, собакоголовая обезьяна	19	САсиаоисАУаддудсдси	АбтеОАГОСАЗСААСАЗОб	11660-1678]	(1612-1626)	(1652-1666)
61	Человек, собаюголовая обезьяна	19	ссмзсооаАиоооиоигиА	□АСАСАСАСАУССАССХЮС	(3146-1164)	[1099-1114]	(1139-1154]
62	Человек, собакоголовая обезьяна	19	сжмсаосуосусмлаза	исААУЗАОслзсизииссб	1868-886]	[601-814]	(854-867)
63	Человек, собакоголовая обезьяна	19	аллосослиоадаишуаи	АСАСААСУСААУСАОСиаС	(1050-1068]	-
64	Человек, собаюголовая обезьяна	19	ОбАСАСАУАССССУСАЭУА	□АСУбАХйезАиаиеусс	1088-11061
65	Человек, собаюголовая обезьяна	19	ебАиСЛЛТУСАСАСУУОААА	хлллзаеазисаиииэАтхх	1483-1501]	(1424-1442)
66	Человек, собакоголовая обезьяна	19	будб^иаудСсиулиУАи	апаауадзссасаизсуас	1162-11881	(1112-1128)
67	Человек, собаюголовая обезьяна	19	ислаиАсозшксслсгзАА	УОСС«»СаАСАбаАСУОА	1101-1119]		(1093-1106)
68	Человек, собакоголовая обезьяна	19	увисудбслоаУАСсииАУ	АиААЗбСАСАУЗСУАСДСА	1159-1177]	[1111-1127]	[1151-1167]
69	Человек, собакоголовая обезьяна	19	сиссАдеисэтсиздАссм;	АИССОАСАСАСАСАУССАб	1150-1168]	-
70	Человек, собакоголовая обезьяна, МЫШЬ	19	АслстобАоаиисААэсар	АПАСУУбААСАУСААбУЗС	1674-1693]	(1632-1640)		*
71	Человек, собакоголовая обезьяна, мышь	19	ССАОТААПаПААОАОЦАОС	ССОАСУСиУАСАУиСАОбС	1438-1456)	[1379-1397]
72	Человек, собаюголовая обезьяна. мышь	19 ь	АОСДОСАдСАаиоосгосс	СадАОССАСООШбСОССУ	1372-390]	[300-318]
73	Человек, собакоголовая обезьяна, МЫШь	1»	АОСАлпааАдаАага.ааАА	иусстасусозАСАУбСАи	(1440-1458)	[1381-1399]
74	Человек, едёакосслдвгю обезьяна, мышь	19	ДОСАОСААСАСТЭССТГОС	здогссАстеуизсуосие	(371-389)	(299-317)
75	Человек, собакоголовая обезьяна, мышь	19	САУйААУСУААСАбУАббА	иССУАСУСУУАСАПУСАУС	[1439-1457]	[13ВО-1398]
76	Человек, собаюголовая обезьяна, мышь	19	бАУбиУСААбУАУУАЛбАС	бУСУУААгасииалАСАУс	[1680-1698]	[1636*1646]
77	Человек, собясоголов» овеаышв, еаш, ч»о·	19	ибдиосдэ<дзасуосАн<ЗА	усхиасдасА-зсузсАисА	[484-502]	[412-430]	(465-483)	-
78	Человек, Шякоолфпя «еьяки, шиь. да·»	19	СААДАСАСШОАПСииСАА	иислАСАУСААОиотАиис	(1670-1688)	[1618-1636]		+
79	Человек, соКаюлтвая овеете, мышь, фыса	19	уадАад^суу&АШУУСА	УбААСАУСААСибУАОТТСЛ	[1669-1687]	[1617*1635]	[1657-1675]	+
88	Челом·, ссвамголоеая евеаьякв. кет, ммса	19	АДОСАсииздштосддеи	АСУббААСАУСААбУбиАУ	(1672-1690]	[1620-1638]	[1660-1678]	+
81		19	сдуоддиАСАСиуалуаци	ААСАУСААСУОТАУУСДиб	[1667-1685]	[1615-1633]	[1655-1673]	+
82	Человек, мбекпмвал обедала, мышь, фыса	19	стзооасаослйсалсайос	САСУОШИсобсибаеСАсз	[366-384]	(294-312)	(347-365)	-
83	Человек, ссбакоголеваясбеэьяп, мете, крыса	19	сиисАиалАПАСАсиисдп	АУСААСУбОАУУСАУбААС	[1664-1682]	[1612-1630]	[1652-1670]
84	человек, оебаытемвм овеете. мышь. «нее	19	УСАУбААУАСАСУУСАТОи	АСАиСААбОЗУАУУСАУОЛ	[1666-1684]	[1614-1632]	[1654-1672]	+
85	Человек, еовшвгалоеая обедакм, ишь. крыса	19	УООАСАОСАССААСАСУОб	ССАСШУУЗСУбСУОУССА	(367-385)	[295-313]	(348-366)
86		19	уаосуасалсххюАУЭСА	УбСАУСАОЗУиббСАСАСА	(472-490)	[400-418]	(453-471)
87	Человек ибмонломе овеете, ишь. «ыи	19	иисАоалАПАСАсаиаАОб	саосалсусомгосатсаа	[1665-1683]	[1613-1631]	[1653-1671]	♦
88		19	ААССУСАХХЗСАЗСУОСУбС	бСАбСАОСУбСАУСАббУи	[480-498]	[408-426]	[461-479]
89	Челееек, ееСшплвеал еведаяна. мышь, фыеа	19	лаистахзоАСАбСАОСЗЛ	иисстосшоссАоссАСУ	(361-379)	[289-307]	(342-360)
90	Человек, собжоголоеав обезьяна, ашк, крысе	19	ссстгсАсилсосоАБСАис	САУссЦАСАзиАсиздсзс	[1098-11161	[1048-1066]	[1088-1106]
»1	Человек, собакелиавея обеетм, мшы, «река	19	ССиССАСАССАССААСАСП	АСУаииссубСУбУссАса	[365-383]	[293-311]	(346-3641
92	Челож мбекрствая «Вадаяка, — — фыса	19	гюссссАмсиамюсдес	ССУССАУСАЗОТОСбСАСА	[474-4921	(402-420)	[455-473]
93		19	ААЦАСАсиисАОзиисдАЗ	СиУбААСАУСААбУЗиАУУ	[1671-16891	[1619-1637]	(1659-1677)	*
94	Человек, евбемпловая ебвеьлна, мышь, фыьа	19	АисдАОАСАСпосдисиис	аДАСАУСААЗиЗОАУиСАУ	(1668-1686)	[1616-1634]	(1656-1674)
95	Человек, собакоголоеая обезьяна, (фыса	19	услуссАссуестосАазА	□ссиасАасласуссАУСА	(484-502)		(465-483)	+
96	Человек, совашгалоеа* овевьм, фыса	19	АвААСУЗДУШСМЗДАСА	□сиисдисилААсдсиУСУ	[1632-1650]		(1625-1643)	+
97	ЧеловекмВивчлоияевадаяне, фыеа	19	АУСТАбААСУбУОУДСАУб	САУЗУАААСАбУОСШМЭАУ	[1628-1646]		[1621-1639]	+
98	Человек, еобопголаввяобвеыыа. крыса	19	ссАизссоАзсстииоесА	ГГСССАААОбСОАОаСАУОб	(196-214)		(186-204)	-
99	Чалове*, «ева’о'оломяобныме. яия	19	силаАдсоботиАСАОСАА	оиСАазУАААСдуиосалБ	[1630-1648]		[1623-1641]	+
100		19	оААсасииоАСАосдАсди	АОСУиСАУСПАААСАСт:	[1633-1651]		(1626-1644)	+
101	Человек, собаиогшввая обеаыма, ерыса	19	ааосууссАосиАСАдсуа	САЗУиСУАЗАУЗбААОАСС	(1620-1638)		[1613-1631]	к-
102	Человек. ообакоОДОВвй обезыма, армса	19	ссаусуа6аасузуууаса	УбУддАгуизуисуАбАУбе	[1626-1644		[1619-1637	*
103	Человек, пбакоголовая обедаем, факса	19	стиссАУсидсААсиаши	ДМСАЗУУСУАаДУЗбААО	(1623-1641		[1616-1634	+
104	Человек, пбиягалови обедам, ФЫМ	19	ЦАСААСУСЩГСАСАУаАЛС	СииСАУСУАЙАСАСПУСУА	[1631-1649		[1624-1642	+
105	Человек, совакоголовая овеоыма. фыов	19	истиссАосиАСААсиоти	ААСАбиусиАбАиабААбА	(1622-1640		[1615-1633	*
10«	Челомк. ообакоголоввя Обвемев, фыса	19	САОсиАЗААсиетгоудсди	АУбОАДАСАбУасиАбАУб	[1627-1645		(1620-1638	*
107	Человек, сабепгопоыяоВедаям. ерша	19	бзедсиисслосадзААео	АбУОСУАбАУббААОАССС	[1619-1637		(1612-1630	+
108	Человек, еобмдаоломя обедаяна. крыса	19	усслосидсААсаеиииду	аУАААСАСУиСПАОАУббА	(1625-1643		[1618-1636	+
109	Человег, собакоголоеая обвеем, факса	19	псилодАсисицидсАГСА	иСДОЗиАААСАЗУУСУАСА	(1629-1647		(1622-1640	+
110	чемвее.ообаиголвем обедам, крыса	19	уисслисшсААстлзоотА	УАААСАбУУСУАСАУббАА	[1634-1642		[1617-1635
111	Человек, ооба (столовая обедам, крыса	19	додгосздисидслАсиоп	АСАбииСОАСАУббААОАС	11621-1639		[1634-1632	+
112	человек, чьи*.	19	СААоилисдАСАссиАоас	схлилсотсуиААпдсиио	[1686-1704	1634-1652]		+
113	Челнок, адаыь	19	баАУиААСАССУАУССААО	АУУССАСХЭаОСУУААУДС	(1689-1707	1637-1655)		'*
114	Человек, меш	19	АбУАУУДАбДССОАУбСАА	УУбСЛУЛетУСУУААОАСУ	[168.8-1706	1636-1654)		+
115	Человек фш	19	АОбГОСААОУАУиААбАТС	ОбУСОУАДУАСУУСЛАСАЦ	[1681-1699	1629-1647)		+
116	Чалм ίο. ишь	19	САсиоодосиисААсодпо	ААУЛсиаедАСдусААота	(1675-1693	1623-1641]		+
117	Человек, км»	19	ссддадуссл&эаастсуо	АЛСАСССССТХИАПСУТОС	[757-775]	[685-703]		-
118	Человек, меш	19	вотгсмвоАоимздссид	УЛЭЗУСТгаААУАСУУБААС	(1683-3701]	(1631-1649]		*
119	человек, мышь	19	исААЗОдиУАлзАсаиАш	слуаооусууаауасууза	(1685-1703]	(1633-1651
120	Человек ыш	19	АДеПАУШкАЗАССОАХГОСА	□ОСАУАбОУСООДАОАСОТ	[1687-1705]	(1635-1653		*
121	Человек, мыте '	19	усзотсаайцаууллоассо	АбсисиуддудсиУбААСА	[1682-1700]	(1630-1648		+
122	Человек, ишь,фыса	19	иаососииссАиссАадАС	ЗиУСТАбДУЭбААОАСССА	[1618-1636]	(1570-1588)	(1611-1629)	*

Обратите внимание, что в приведенной выше табл. В смысловые цепи к1ВКА 51-122 имеют 8Еф ΙΌ КО:103-122, соответственно, а антисмысловые цепи к1ВКА 51-122 имеют 8Еф ΙΌ КО:175-246, соответственно.

Таблица С

Номер	Источник	Длина олиго	Смысловая βί^ΝΑ	Антисмысловая 5ίΡΝΑ	д19506686геС НМ_О19О58.1 (Ното зар!епз).	9121312867« ίΝΜ_029083.1 (Муз тиесиАи?)	?11837б838хе £ΝΜ_ΟΒ0906.1 (Ивсеие ηοκνβ <|1сиз)	Перекрывание сре(1 (антисмысловая)
123	Человек	21	ссдасацуэсисАпиоАс<лхэт	АСААСОСАА[МЗА5СОТ1С«ЭТе<3	[1046-1066}			-
124	Человек	21	ссмтсигввисииссдосшыэ	сиАбА^ббААадсссАОЛГюа	[1613-1633]	[1569-15851	[1610-1626]
125	Человек	21	«эдслхлгеаотА&САисадс	ОТАСДиЗСТАСАСАСАСАИСС	(1152-1172]	[1102-Ц22]	[1142-1161]
126	Человек	21	СААбосиситозиисиоизии	ААСАААСААСАААСАСАСиОС	(1353-1373]
127	Человек	21	ССОСМЗгаСООПМЗСАОбОАА	отгсаияаподэтАсвэдзв	(1099-11191	(1049-1066]	[1089-1106]
128	Человек	21	ОАССААбииииииибиисиии	АААСААСДААСАСАСОиОаиС	(1350-13701
129	Человек	21	ССШГОЭАбиСАОСААОДАбА	ПСГОСОКШХУиЛХХЮААОС	[835-8551	[763-783]
130	Человек	21	ОСАбОТбООббЛАЦАббВ^	ААдсдсиАоисссссАссрсс	[1024ΊΟ44]	[976-985]
131	Человек	21	аАОТАСОбОАбСАГОбАМСАА	иаэ'лксАВДЗДсдегастб	(1102-11221	[1052-1072]
133	Человек, собакоголовая обезьяна	21	бААОАСАСииСАЦСГОСААСТ	АСОТСААСАЦСАЛТООТАТОС	[1670-1690]	[1618-16389	[1658-1678]	*
133	Человек, собакоголовая обезьяна	21	СААоиАиидАОАСсиАаэсАА	оиссмтдк^сшААиАСООй	[1686-1706]	[1634-1654]	[1674-1694]	4-
134	Человек, собакоголоеея обезьяна	21	СААСШТОиБОСбОССАеАСОА	ОАОКШССЛССССААААЙиОС	[944-9641
135	Человек, собакоголовая обезьяна	21	(ХЛСЛСАЦАССССиСАОТАСи	АОТАсиаАооаоалааиоисс	[10ΘΒ-11ΟΒ]	[1047-105В]	[1081-1098]
135	Человек, собакоголовая обезьяна	21	оолооиооипиоисшакАША	НААСАиДСАСАДАССАССиСС	11317-1337]	(1256-1268)
137	Человек, собакоголовая обезьяна	21	СбАиСШОСАСАСТЛХЗААААА	ООПОТСЛЛаОСТСАДАОХОСС	[1483-1503]	[1424-1442]		• -
138	Человек. Собакоголовая Обезьяна	21	СОТСиОССАОСТАОААСОСШ	ААСАвГОСОВДАОООААОАСС	(1520Ί6401	(1572-1588)	[1513-1633]	*
13»	Человек, собакоголовая обезьяна	21	исзосзпзизсыютАссипАпок	иддстимэетлсАаасшьСАСА	[1159-1179]	[1111-1128]	[1151-1169]
140	Человек, собакоголовая обезьяна	21	СААСАМбСбТССдеСРОЗМТ	АОССМЭТбЗДЮССВОЭШЮ	(1135-11551
141	Человек, собакоголовая обезьяна	21	САСотоааАиситоЗАСАСои	А№ЖПСАЛАЗАиСССАА1ГОа	(1477-1497]
142	Человек, собакоголовая обезьяна	21	(^САСшсооАсси&тооиА	швддслевисмзшиэтоАВб	(1399-14191	[1341-1356]	(1383-13981
143	Человек, собакоголовая обезьяна	21	оаоиоооиАССАиасАссииА	ПААОоид<зигасиАслсАслс	(1156-11761	[1106-1126]	[1146-1166]
144	Человек. Собакоголовая обезьяна, мышь	21	σΟΑϋΟΑΑΟαΟΑΑΟΑΟυΑΟΟΑΑ	писсоАсисииАСАшсдисс	(1438-1458)	[1379-1399]
145	Человек, собакоголоеея обезьяна, мышь	21	ОАСАОСАОСААСАОТС6СШС	ошикздадэтлюаюсовис	(369-3891	[297-317]
145		21	иОАПОСАаСОССибСАббАбА	осасстгасдасАасиасАПСА	(4В4-504)	[412-432]	[465-485]
147	Челом», собйигчлоеея обоым. мышь, феса	21	ЦбААбАСАСТОЗАЦбШСААб	СиГХЗААСДиСААОТОТАГОСА	[1669-1689]	(1617-1637)	[1657-1677]	+
144	Чвломк, еоб91лгыкпяоКмым·, кшь. «рмее	21	САХЮААоАСАСиосдиагосА	саАдсдисАлоуэнАиисАио	[1667-1687]	(1615-1635)	[1655-1675]	+
14»	Чеммк, мВодпямая «бЫЬАЙ, ЫЫШЬ.	21	сбАслссагклАСдешзсои	АМбсдетсотюсдосжисс	(368-3881	[296-316]	[349-369]	-
150	Чьлоее», оова»яхике«я ебеаым, «рыса	21	сипсАШААОАСлсииоАози	ДСАПСААбЦООАииаАОЗААС	(1664-16841	[1612-16321	(1652-16721	+
151	Чеповак, сеСакаголовая обазыма. мыиь. цма	21	ислаоААаАСАсииОАткзшс	адАсдосААОТСПАписАиад	(1666-1686]	(1614-16341	[1654-1674]	*
152		21	иСССООШСМЭЗДЭСААСАОО	лстгаитосггествисслзавл	[363-383]	[291-311]	(344-3641	-
153	чело»», явакоголвмя ебезыеч, ими»,	21	А£С1СССХИ6АСА<ЗСАОСААСА	тоотгасдостоиссюэздси	[361-381]	[289-309]	[342-3621	-
154	Человек, собакоголовая обезьяна. кпмся	21	сддиАСАсиисАтсиисААОТ	ЛСаОСАЛаАОСААОТЗОАОТС	(1570-16901		[1558-1678]	+
155	Человек, собакоголовая обезьяна. «лыса	21	СТГАОАДСООТОТАСАРВААОА	осчослазиАААСдсиосилс	[1630-1650]		[1623-1643]	+
155	Человек, собекоголовая обезьяна. коыса	21	ссАОсиАсзААсисииоАСАиа	(^«лжАдсуузиисиАаАОбО	[1636-1646]		[1519-1639]	*
187	Человек, собакоголовая обезьяна. коыса	21	стиссдисиАбААСоотшАс	аОАМСДОТЦСиДбАГЮбАДС	[1633-1643]		1616-1636]	+
158	Человек, собакоголовая обезьяна. квысе	21	истоесАосиАСААСЭзаииА	иАААСАЙОТСТАСАООаААОА	[1633-1642]		1615-1635]	*
159	Человек, собакоголовая обезьяна. кьыса	21	САОСиДСААСООШиАСАабА	ПСАиОТАААСАОТиСОАОАПС	[1627-16471		1620-1640]	+
150	Человек, собакоголовая Обезьяна. кпмся	21	ссотсаоссАосоАОААстаа	АСАСШСиАСАТКЗаДАОАССС	[1619-1639]		1612-1632]	+
161	Человек, собакоголовая обезьяна. коыса	21	исс*остАаААсисиииАСАи	АиаидААСАотисиАОАиосА	(1625-16451		1618-1638]	+
163	Человек, собакоголовая обезьяна. коыса	21	исиАбААснооиидсАибААб	СииСАГОТТАААСДбШСХТАСА	[1639-16491		1622-1642]	*
163	Человек.собакоголоваяобезьяна, коыса	21	ииССАбСЦАСААСТМОТОАСА	ГЖЩААДСАЗШСТааАиОЭДА	[1624-1644]		1517-1637]	*

164	Человек, собакоголовая обезьяна. коыса	21	апстлххадспдшлсисплга	АААСАбиосолблааадАОАС	(1621-1641)		[1614-1634]	+
165	Человек, мышь	21	ОбАОбООСААОТАЦиААСАСС	СОТСОТАДиАСииСААСАССА	(1679-1699)	[1627-1647]		+
166	Человек, мышь	21	йцислАаидисААбАСсиАай	САОТЛбОСиидлаАСггоОААС	(1583-1703)	(1631-16511		+
167	Человек, мышь	21	исААбаАГОАДСАссидиасА	гсаюдооосотААПАсиисА	(1585-1705]	(1633-1653)		+
168	Человек, мышь	21	ОАЛбиисААОТдаимадссо	дсесгсииААиАСТОбААСАПс	[1680-1700]	[1626-1648]
169	Человек, мышь	21	щгсмвшишААОАССшикзс	ссАОАбаисциААЦАсиссАА	[1684-1704]	[1632-1652]		♦
170	Человек, мышь	21	СиСССбСиОССАОСОАСААСТ	АОШСТАбАШЗЛАЗЛСССАЗ	[1617-1637]		[1610-1630]	*
171	Человек, мышь	21	оссаисииссАислибДАсте	САО1ЛМ7СА6АПС6АА6АС€СА	(1618-16381		(1511-1631)	+

Обратите внимание, что в приведенной выше табл. С смысловые цепи δ^ΚNΑ 123-171 имеют 8Εφ ΙΌ N0:2470295 соответственно, а антисмысловые цепи δί^Α 123-171 имеют 8Εφ ΙΌ N0:296-344 соот ветственно.

Пример 10. Фармакология и доставка лекарственных средств.

Нуклеотидные последовательности данного изобретения могут доставляться либо непосредственно, либо вирусными или невирусными векторами. При непосредственной доставке эти последовательности обычно делают устойчивыми к нуклеазам. Альтернатиано, эти последовательности могут быть включены в экспрессионные кассеты или конструкции, так что эта последовательность экспрессируется в клетке, как обсуждается здесь ниже. Обычно эта конструкция содержит подходящую регуляторную последовательность или промотор для создания возможности экспрессии этой последовательности в клеткемишени.

Соединения или фармацевтические композиции данного изобретения вводят и используют в дозах в соответствии с хорошей медицинской практикой, с учетом клинического состояния индивидуального пациента, подлежащего лечению заболевания, места и способа введения, схемы введения, возраста, пола, массы тела пациента и других факторов, известных врачу-практику.

Таким образом, фармацевтически «эффективное количество» для приведенных здесь целей определяется соображениями, известными в данной области. Это количество должно быть эффективным для получения улучшения, в том числе, но не только, улучшенного коэффициента выживаемости или более быстрого выздоровления или улучшения или устранения симптомов и других показателей, которые выбраны в качестве подходящих критериев специалистами с квалификацией в данной области.

Лечение обычно имеет продолжительность, пропорциональную продолжительности процесса заболевания и эффективности лекарственных средств и виду пациента, подвергаемого лечению. Отмечается, что людей обычно лечат в течение более продолжительного периода времени, чем мышей или других экспериментальных животных, приведенных здесь в качестве примеров.

Соединения данного изобретения могут вводиться любым из общепринятых способов введения. Следует отметить, что это соединение может вводиться в виде соединения или в виде фармацевтически приемлемой соли и может вводиться отдельно или в виде активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами или наполнителями. Эти соединения могут вводиться перорально, подкожно или парентерально, в том числе внутривенным, внутриартериальным, внутримышечным, внутрибрюшинным и интраназальным введением, а также интратекальным (подоболочечным) и инфузионным способами. Применимы также имплантаты. Жидкие формы могут быть приготовлены для инъекции, причем этот термин включает подкожный, трансдермальный, внутривенный, внутримышечный, интратекальный (подоболочечный) и другие парентеральные способы введения. Жидкие композиции включают водные растворы с органически

- 62 012799 ми сорастворителями или без органических сорастворителей, водные или масляные суспензии, эмульсии с годными в пищу маслами, а также сходными фармацевтически наполнителями. Кроме того, при определенных обстоятельствах композиции для применения в новых способах лечения данного изобретения могут быть приготовлены в виде аэрозолей для интраназального и подобного введения. Подлежащий лечению пациент является теплокровным животным и, в частности, млекопитающим, в том числе человеком. Фармацевтически приемлемыми носителями, растворителями, разбавителями, эксципиентами, адъювантами и наполнителями, а также носителями-имплантатами являются обычно инертные, нетоксичные твердые или жидкие наполнители, разбавители или инкапсулирующий материал, не реагирующие с активными ингредиентами данного изобретения.

При парентеральном введении соединения по данному изобретению его обычно готовят в унифицированной (стандартной) дозированной инъекционной форме (в форме раствора, суспензии, эмульсии). Эти фармацевтические готовые формы, подходящие для инъекции, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для воссоздания в стерильные инъекционные растворы или дисперсии. Носителем может быть растворитель или диспергирующая среда, содержащая, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси и растительные масла.

Необходимая текучесть может поддерживаться, например, применением покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностноактивных веществ. В качестве систем растворителей для композиций соединений могут быть также использованы неводные носители, такие как хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, соевое масло, кукурузное масло, подсолнечное масло или арахисовое масло и эфиры, такие как изопропилмиристат. Кроме того, могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность, улучшают стерильность и изотоничность этих композиций, в том числе антимикробные консерванты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов может гарантироваться различными антибактериальными и противогрибковыми агентами. Например, парабенами, фенолом, сорбиновой кислотой и т. п. Во многих случаях желательно включать изотонические агенты, например сахара, хлорид натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция инъецируемой фармацевтической формы может быть получена применением агентов, задерживающих абсорбцию (всасывание), например моностеарата алюминия и желатина. Однако согласно данному изобретению любой используемый носитель разбавитель или любая используемая добавка должны быть совместимыми с рассматриваемыми соединениями.

Стерильные инъецируемые растворы могут быть приготовлены включением соединений, используемых в применении на практике данного изобретения, в требуемое количество подходящего растворителя, необязательно с различными другими ингредиентами.

Фармакологическая композиция данного изобретения может вводиться пациенту в инъекционном препарате, содержащем любой совместимый носитель, такой как различные наполнители, адъюванты, добавки и разбавители; или соединения, используемые в данном изобретении, могут вводиться парентерально пациенту в форме подкожных имплантатов медленного высвобождения или систем нацеленной доставки, таких как моноклональные антитела, векторная доставка, ион(т)офоретическая доставка, полимерные матриксы, липосомы и микросферы. Примеры систем доставки, применимых в данном изобретении, включают патенты США № 5225182; 5169383; 5167616; 4959217; 4925678; 4487603; 4486194; 4447233; 4447224; 4439196 и 4475196. Многие другие такие имплантаты, системы доставки и модули хорошо известны специалистам с квалификацией в данной области.

Фармакологическая композиция соединения, используемого в данном изобретении, может быть введена пациенту перорально. Применимы общепринятые способы, такие как введение соединения в таблетках, суспензиях, эмульсиях, капсулах, порошках, сиропах и т. п. Предпочтительными являются известные способы, которые доставляют соединение перорально или внутривенно и сохраняют его биологическую активность. В одном варианте осуществления соединение данного изобретения может вводиться сначала внутривенной инъекцией, чтобы довести уровни в крови до подходящего уровня. Затем эти уровни пациента поддерживают с использованием пероральной дозированной формы, хотя могут быть также использованы другие формы введения, зависимые от состояния пациента и указанные здесь выше.

Обычно, активная доза соединения для людей находится в диапазоне 1 нг/кг - приблизительно 20100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно приблизительно 0,01 мг - приблизительно 2-10 мг/кг массы тела в день, в схеме одна доза в день или два раза или три раза или более в день в течение периода 1-2 недель или в течение более длительного времени, предпочтительно в течение 24-48 ч или непрерывной инфузией на протяжении периода 1-2 недель или более.

Введение соединений данного изобретения в глаз

Соединения данного изобретения могут вводиться в глаз местно или в форме инъекции, такой как интравитреальная инъекция, субретинальная инъекция или билатеральная инъекция. Дополнительная информация о введении соединений данного изобретения может быть найдена в ΤοΚ^^ο е! а1., Пейпа 24 (2004) 132-138; Неюй е! а1., ΜοΚ^τ у18юп 9 (2003) 210-216.

- 63 012799

Легочное введение соединений данного изобретения

Терапевтические композиции данного изобретения предпочтительно вводят в легкое ингаляцией аэрозоля, содержащего эти композиции/соединения, или интраназальной или интратрахеальной инстилляцией указанных композиций.

Приготовление этих композиций в липосомах может быть полезным для абсорбции. Кроме того, эти композиции могут включать РЕС-жидкость, такую как перфлуброн, и эти композиции могут быть приготовлены в виде комплекса соединений этого изобретения с полиэтиленимином (РЕ1).

В отношении дополнительной информации относительно легочной доставки фармацевтических композиций см. \Уе1зз е! а1.: Нитап депе Шегару 10:2287-2293 (1999); Эепзтоге е! а1.: Мо1еси1аг Шегару 1:180-188 (1999); Саи!ат е! а1.: Мо1еси1аг Шегару 3:551-556 (2001) и 81ι;·ι1ιί\ν;·ι1;·ι & МЧзга, ААР8 РНагт8с|Тес11 5 (2004). Кроме того, респираторные формы для з1ККА описаны в Заявке на патент США № 2004/0063654 Оа\зз е! а1.

Дополнительные готовые формы для улучшенной доставки соединений данного изобретения могут включать не приготовленные в виде композиции соединения, соединения, ковалентно связанные с холестерином, и соединения, связанные с нацеливающими антителами (8опд е! а1., АпЕЬобу те661а!е6 т νί\Ό бек'егу оГ зта11 т!егГеппд ККАз νίη се11-зшГасе гесер!огз, ΝηΙ Вю!есйпо1. 2005 Чип; 23(6): 709-17).

Claims (22)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение, имеющее структуру

   5'(Ν)_χ-Ζ3' (антисмысловая цепь),

   3'Ζ'-(Ν')_Υ5' (смысловая цепь), где каждый Ν и Ν' обозначает рибонуклеотид, который может быть модифицированным или немодифицированным в сахарном остатке и каждый из (Ν)_χ и (Ν')_γ обозначает олигомер, в котором каждый последовательный Ν или Ν' соединен с последующим Ν или Ν' ковалентной связью;

   каждый из х и у обозначает целое число от 19 до 40 включительно;

   каждый из Ζ и Ζ' может присутствовать или отсутствовать, но, если присутствует, обозначает 6Т6Т и является ковалентно присоединенным на 3'-конце цепи, в которой он присутствует;

   и последовательность (Ν) содержит последовательность, по существу, комплементарную последовательности, представленной в последовательности мРНК, кодируемой 8ЕО ΙΌ Ν0:1.
2. 2. Соединение по п.1, в котором последовательность (Ν)χ содержит последовательность любой из 8ЕО ΙΌ Ν0:66, 67, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 79, 91, 92, 93, 95, 96 и 102.
3. 3. Соединение по п.1, в котором последовательность (Ν)χ содержит последовательность любой из 8ЕО ΙΌ Ν0:66, 74, 75, 77, 79, 91, 93 и 102.
4. 4. Соединение по любому из пп.1-3, в котором сахарный остаток по меньшей мере в одном рибонуклеотиде является модифицированным.
5. 5. Соединение по п.4, в котором сахарный остаток является модифицированным путем замены 2'ОН-группы на -Н, -ОСН₃, -ОСН₂СН₃, -ОСН₂СН₂СН₃, -ΝΗ₂ или -Е.
6. 6. Соединение по п.5, в котором -ОН является замещенным -ОСН₃.
7. 7. Соединение по п.6, в котором ковалентная связь является фосфодиэфирной связью; х=у, предпочтительно х=у=19; Ζ и Ζ' отсутвуют совместно, чередующиеся рибонуклеотиды в каждой антисмысловой и смысловой цепях содержат 2'-ОСН3 модификацию в их сахарных остатках; и рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи модифицированы таким же образом, а рибонуклеотиды на 5'- и 3'концах смысловой цепи не модифицированы.
8. 8. Соединение по любому из пп.1-7, которое является фосфорилированным или нефосфорилированным.
9. 9. Соединение по любому из пп.1-8, в котором динуклеотид 6Т6Т ковалентно присоединен к 3'концу антисмысловой цепи или смысловой цепи.
10. 10. Соединение по любому из пп.1-9, в котором последовательность (Ν)_χ содержит последовательность, представленную в 8ЕО ΙΌ Ν0:66.
11. 11. Соединение по любому из пп.1-7 или 10, имеющее структуру

    5* АССиССАОСАОеииСССАС 3' антисмысловая цепь (ЗЕф Ю N0:66)

    11IIIIII1111 IIII111

    3' иССАССОАСОССААССбие 5' смысловая цепь (5Е0 Ю N0:16) где чередующиеся рибонуклеотиды в антисмысловой и смысловой цепях содержат 2'-О-метилмодификацию в сахарном остатке рибонуклеотидов; где рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах антисмысловой цепи содержат 2'-О-метил-модификацию; где рибонуклеотиды на 5'- и 3'-концах смысловой цепи являются немодифицированными и где каждый рибонуклеотид на 5'- и 3'-концах каждой антисмысловой и смысловой цепи является независимо фосфорилированным или нефосфорилированным и каждая вертикальная линия представляет водородную связь между рибонуклеотидами на каждом их конце.
12. 12. Соединение по п.11, в котором обе антисмысловая и смысловая цепи являются нефосфорилированными на 3'-конце.

    - 64 012799
13. 13. Соединение по п.11, в котором обе антисмысловая и смысловая цепи являются нефосфорилированными на 3'- и 5'-концах.
14. 14. Соединение по п.11, в котором обе антисмысловая и смысловая цепи являются фосфорилированными на 3'- и 5'-концах.
15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-14 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
16. 16. Применение соединения по любому из пп.1-14 для стимуляции выздоровления пациента, страдающего респираторным нарушением, глазной болезнью или микрососудистым нарушением или повреждением или заболеванием спинного мозга.
17. 17. Применение по п.16, в котором состояние является глазной болезнью.
18. 18. Применение по п.17, в котором глазной болезнью является глаукома.
19. 19. Применение по п.17, в котором глазной болезнью является дегенерация желтого пятна.
20. 20. Применение по п.17, в котором глазной болезнью является ΑΜΌ.
21. 21. Применение по п.17, в котором глазная болезнь является обусловленной диабетом.
22. 22. Применение по п.17 или 21, в котором глазной болезнью является диабетическая ретинопатия.