TW201620938A

TW201620938A - 雙特異性抗cgrp受體/pac1受體抗原結合蛋白質及其用途

Info

Publication number: TW201620938A
Application number: TW104130488A
Authority: TW
Inventors: 古南斯卡瑞恩柯南; 玲劉; 艾德華Ｊ畢羅斯基; 岑徐
Original assignee: 安美基公司
Priority date: 2014-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2016-06-16
Also published as: US20210047422A1; WO2016044224A1; JP6956631B2; CA2960756C; AR101875A1; EP3194435A1; UY36302A; AU2015318008B2; JP2017533694A; AU2015318008A1; US20170306033A1; US10934362B2; CA2960756A1; MX2017003247A; JP2020074790A; US11919964B2

Abstract

本發明係關於能夠結合至人類CGRP受體及人類PAC1受體之雙特異性抗原結合蛋白質。亦揭示包含雙特異性抗原結合蛋白質之醫藥組成物以及用於產生該等醫藥組成物之方法。亦描述使用雙特異性抗原結合蛋白質來改善或治療與兩種受體相關聯的病狀(諸如慢性疼痛、偏頭痛及叢集性頭痛)之方法。

Description

雙特異性抗CGRP受體/PAC1受體抗原結合蛋白質及其用途

[相關申請案之交互參照]

本申請案主張2014年9月15日申請之美國臨時申請案第62/050,737號之權益，該申請案據此以全文引用方式併入。

[電子提交的正文檔案之說明]

本申請案含有已以ASCII格式電子提交且據此以全文引用方式併入的序列表。於2015年9月8日創建的該序列表之電腦可讀格式複本命名為A-1922-WO-PCT_ST25.txt，且大小為1,116,989位元組。

本發明係關於生物藥品領域。詳言之，本發明係關於能夠特異地結合至人類降血鈣素基因相關肽(CGRP)受體及人類垂體腺苷酸環化酶活化多肽I型(PAC1)受體之雙特異性抗原結合蛋白質、包含該等雙特異性抗原結合蛋白質之醫藥組成物、以及產生及使用此等雙特異性抗原結合蛋白質之方法。

偏頭痛為一種複雜、常見神經性病狀，其特徵為頭痛之嚴重、陣發性發病及相關聯特徵，該等特徵可包括噁心、嘔吐、對光、聲或移動之敏感性。在一些患者中，感覺預警徵象或症狀(亦即先兆)先於頭痛，或頭痛伴隨有該等徵象或症狀。頭痛疼痛可為嚴重的，且在某些患者中亦可為單側的。偏頭痛發作對日常生活具破壞性，且每年因錯過工作日及受影響的執行表現而造成數十億美金的損失(Modi及Lowder,Am.Fam.Physician，第73卷：72-78,2006)。

偏頭痛為全球高度流行的疾病，其中歐洲人口之大致15%及美國人口之12%皆遭受偏頭痛發作(Lipton等人，Neurology，第68卷：343-349,2007)。另外，已發現偏頭痛與許多精神及醫學共病相關聯，該等精神及醫療共病諸如抑鬱症及血管病症(Buse等人，Neurol.Neurosurg.Psychiatry，第81卷：428-432,2010；Bigal等人，Neurology，第72卷：1864-1871,2009)。

偏頭痛係通常主要利用止痛劑及稱為翠普登(triptans)之一類藥物進行急性治療(Humphrey等人，Ann NY Acad Sci.，第600卷：587-598,1990；Houston及Vanhoutte,Drugs，第31卷：149-1631986)。翠普登為選擇性血清素5-HT1B/1D促效劑，其為用於急性偏頭痛之有效藥物且通常良好耐受，但於心血管疾病存在下，翠普登歸因於其用於冠狀動脈收縮之潛力而遭禁忌。另外，許多偏頭痛患者並未對翠普登順利地反應。在53次試驗之後設分析中，患有偏頭痛的所有人中之三分之一以及所有偏頭痛發作之40%並不對翠普登反應(Ferrari等人，Laneet，第358卷：1668-1675,2001)。

偏頭痛預防為很大程度上未獲醫療需要滿足之領域。偏頭痛患者群體之大致40%將受益於防止性療法(Lipton等人，Neurology，第68卷：343-349,2007)。然而，僅大致12%之患者接收任何防止性療法，此係部分地歸因於使用可利用預防性療法的有限功效及顯著可耐受性及安全性問題。托必拉美(Topiramate)為一種阻斷電壓依賴性鈉通道及某些麩胺酸受體(AMPA-kainate)之抗驚厥劑，其為在美國最常用於偏頭痛預防之藥劑。托必拉美為經由隨機化安慰劑受控試驗而證明在陣發性偏頭痛及慢性偏頭痛患者中皆具有功效的唯一偏頭痛預防劑(Diener等人，Cephalalgia，第27卷：814-823,2007；Silberstein等人，Headache，第47卷：170-180,2007)。然而，大致50%之患者未能對托必拉美反應且托必拉美耐受不良。與托必拉美治療相關聯的常見不利事件包括感覺異常、厭食症及認知不利事件，包括心理動作性遲緩、嗜眠症、語言困難及記憶與精力集中困難(Brandes等人，JAMA，第291卷：965-973,2004；Adelman等人，Pain Med.，第9卷：175-1852008；Silberstein等人，Arch Neurol.，第61卷：490-495,2004)。在開放標籤、靈活劑量研究中，20%之患者由於不利效應而撤銷托必拉美(Nelles等人，Headache，第49卷：1454-1465,2009)。因此，偏頭痛受害者具有對更有效及/或可耐受治療選擇的迫切醫療需要。

降血鈣素基因相關肽(CGRP)屬於肽之降血鈣素家族，其亦包括降血鈣素、澱粉素及腎上腺髓素。CGRP為中央神經系統及周邊神經系統兩者中表現的37胺基酸肽，且已作為關鍵介體牽連於偏頭痛之疼痛的起始及進程中。除CGRP充當血管舒張劑的能力之外，CGRP亦充當三叉神經節及三叉神經尾核中之神經傳導物，從而有助於突觸傳導及疼痛反應(Durham等人，Curr Opin Investig Drugs，第5卷：731-735,2004；Zimmermann等人，Brain Res.，第724卷：238-245,1996；Wang等人，Proc Natl Acad Sci USA.，第92卷：11480-11484,1995；Poyner,Pharmacol.Ther.，第56卷：23-51,1992)。

CGRP受體為由G蛋白質偶合的類降血鈣素受體(CLR)及單一跨膜域蛋白質受體活性修飾蛋白質(RAMP1)構成的複合體。CGRP受體複合體位於與偏頭痛有關的位點處，該等位點包括腦血管結構、腦幹中之三叉神經與頸神經複合體以及三叉神經節(Zhang等人，J.Neurosci.，第27卷：2693-2703,2007；Storer等人，Br J Pharmacol.，第142：1171-1181,2004卷；Oliver等人，J Cereb Blood Flow Metab.，第22卷：620-629,2002)。若干證據系指示出CGRP為已與偏頭痛病理生理學相關聯的有效血管舒張劑及痛覺感受調變劑：(1)其表現於三叉系統中，從而牽連偏頭痛之病理生理學；(2)在發作期間，偏頭痛者中之CGRP量升高(Bellamy等人，Headache，第46卷：24-33,2006；Ashina等人，Pain，第86卷：133-138,2000；Gallai等人，Cephalalgia，第15卷：384-390,1995；Goadsby等人，Ann Neurol. ，第28卷：183-187,1990；Goadsby等人，Ann Neurol.，第23卷：193-196,1988)；(3)諸如翠普登之急性偏頭痛療法在治療後使CGRP量恢復至正常(Juhasz等人，Cephalalgia，第25卷：179-183,2005)；(4)CGRP輸注觸發偏頭痛受害者中偏頭痛的發病(Petersen等人，Br J Pharmacol.，第143卷：1074-1075,2004；Lassen等人，Cephalalgia，第22卷：54-61,2002)；且(5)CGRP拮抗劑在急性偏頭痛逆轉中具有經證明之功效(Connor等人，Neurology，第73卷：970-977,2009；Hewitt等人，Abstract for the 14^th Congress of the International Headache Society,2009；LBOR3；Ho等人，Lancet，第372卷：2115-2123,2008a；Ho等人，Neurology，第70卷：1304-1312,2008b)。另外，小分子CGRP受體拮抗劑及抗體CGRP配位體在陣發性偏頭痛防止中具有經證明之臨床功效(Dodick等人，Lancet Neurol.，第13卷：1100-1107,2014a；Dodick等人，Lancet Neurol.，第13卷：885-8922014b；Ho等人，Neurology，第83卷：958-966,2014)；總而言之，此等資料暗示CGRP神經肽及其受體在偏頭痛之發病機制中的作用。

垂體腺苷酸環化酶活化多肽(PACAP)屬於VIP/胰泌素/升糖素超家族。PACAP 27之序列相應於PACAP 38之27個N末端胺基酸，且與激脈腸多肽(VIP)享有68%一致性(Pantaloni等人，J.Biol.Chem.，第271卷：22146-22151,1996；Pisegna及Wank,Proc.Natl.Acad.Sci.USA ，第90卷：6345-49,1993；Campbell及Scanes,Growth Regul.，第2卷：175-191,1992)。人體中PACAP肽之主要形式為PACAP 38，且尚未證實PACAP 38及PACAP 27之藥理學彼此不同。已報告三種PACAP受體：一種受體以高親和力結合PACAP並且對VIP(PAC1受體)具有低得多的親和力，而其他兩種受體同樣良好地識別PACAP及VIP(VPAC1及VPAC2受體)(Vaudry等人，Pharmacol Rev.，第61卷：283-357,2009)。PACAP能夠以類似效力結合所有三種受體，並且因此不具特定選擇性。另一方面，與PAC1比較，VIP以顯著較高親和力結合至VPAC1及VPAC2。除內源性促效劑PACAP及VIP之外，maxadilan為最初自糠蚊分離的一種65胺基酸肽，其相較於VPAC1或VPAC2而言對PAC1有強烈選擇性。

使用PACAP作為誘導類偏頭痛的激發劑的人類實驗性偏頭痛模型支援PAC1受體拮抗作用作為用於偏頭痛預防之潛在治療方法的作用。PACAP 38之輸注在健康受試者中引起頭痛，且在偏頭痛患者中引起類偏頭痛(Schytz等人，Brain，第132卷：16-25,2009)。另外，在相同模型中，VIP不在偏頭痛患者中引起類偏頭痛(Rahmann等人，Cephalalgia，第28卷：226-236,2008)。缺少自VIP輸注的類偏頭痛誘導暗示：PAC1受體而非VPAC1或VPAC2受體涉及偏頭痛，因為VIP在後兩種受體處具有高得多的親和力。此等資料暗示：選擇性PAC1拮抗劑具有治療偏頭痛之潛力。

此項技術中需要開發偏頭痛特定預防療法，該等療法具有新穎作用機制，該等作用機制針對構成偏頭痛病理生理學基礎之標靶。詳言之，在拮抗CGRP/CGRP受體及PACAP/PAC1受體路徑兩者中具有雙重功能之治療分子將為尤其有益的。

本發明部分地基於能夠阻斷人類CGRP受體及人類PAC1受體之雙特異性抗原結合蛋白質之設計及產生。此等雙特異性抗原結合蛋白質包含特異地結合至人類CGRP受體之第一結合域及特異地結合至人類PAC1受體之第二結合域。在一些實施例中，結合域中之每一者包含來自免疫球蛋白輕鏈及重鏈之可變區。結合域可自抗CGRP受體抗體及抗PAC1受體抗體製備。

在某些實施例中，結合域之一為Fab片段，且另一結合域為單鏈可變片段(scFv)。在其他實施例中，兩個結合域為Fab片段。雙特異性抗原結合蛋白質亦可包含免疫球蛋白恆定區或Fc區，在一些實施例中，該免疫球蛋白恆定區或Fc區來源於人類免疫球蛋白IgG1或IgG2。在某些實施例中，恆定區包含一或多個胺基酸取代，該等胺基酸取代減少雙特異性抗原結合蛋白質之醣基化及/或效應物功能。

在一些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質對每一標靶為單價的。在此等實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質可為抗體，其中一個抗原結合域或臂結合至CGRP受體，而另一抗原結合域或臂結合至PAC1受體。在其他實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質對每一標靶為二價的。在此等實施例中，一個結合域定位於免疫球蛋白Fc區之胺基末端，而另一結合域定位於Fc區之羧基末端，以使得在二聚化時，抗原結合蛋白質包含結合至CGRP受體之兩個抗原結合域及結合至PAC1受體之兩個抗原結合域。

在一些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質為諸如異源二聚抗體之抗體。異源二聚抗體可包含來自特異地結合至人類CGRP受體之第一抗體的第一輕鏈及第一重鏈，以及來自特異地結合至人類PAC1受體之第二抗體的第二輕鏈及第二重鏈。在某些實施例中，第一重鏈及第二重鏈包含恆定區(例如CH3域)中之一或多個電荷對突變以促進異源二聚物形成。在相關實施例中，第一輕鏈及第一重鏈(或第二輕鏈及第二重鏈)包含一或多個電荷對突變，以促進正確的輕鏈-重鏈配對。在一些此等實施例中，第一重鏈包含引入帶電胺基酸(例如麩胺酸)之胺基酸取代，該帶電胺基酸具有與引入第一輕鏈中之胺基酸(例如離胺酸)相反的電荷，以便第一輕鏈及第一重鏈彼此吸引。引入第二輕鏈中之帶電胺基酸(例如麩胺酸)將較佳具有與引入第一重鏈中之胺基酸(例如麩胺酸)相同的電荷，但與引入第二重鏈中之胺基酸(例如離胺酸)相反的電荷，以便第二輕鏈將吸引至第二重鏈，但與第一重鏈排斥。

在本發明之某些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質包含針對第一標靶(例如CGRP受體或PAC1受體)之抗體及來源於針對第二標靶(例如PAC1受體或CGRP受體)之抗體的scFv。在此IgG-scFv型式中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質包含(i)來自第一抗體之輕鏈及重鏈，以及(ii)scFv包含來自第二抗體之輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)，其中scFv在其胺基末端處視情況經由肽連接子融合至重鏈之羧基末端以形成經修飾重鏈，且其中第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，且另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。在一些實施例中，scFv自N末端至C末端包含VH區、肽連接子及VL區。在其他實施例中，scFv自N末端至C末端包含VL區、肽連接子及VH區。

在本發明之其他實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質包含針對第一標靶(例如CGRP受體或PAC1受體)之抗體及來源於針對第二標靶(例如PAC1受體或CGRP受體)之抗體的Fab片段。在此IgG-Fab型式中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質包含(i)來自第一抗體之輕鏈；(ii)來自第一抗體之重鏈，其中重鏈在其羧基末端處視情況經由肽連接子融合至包含第二抗體之VL-CL域或VH-CH1域之第一多肽，以形成經修飾重鏈；以及(iii)包含第二抗體之VH-CH1域或VL-CL域之第二多肽，其中第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，且另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。在特定實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VL域及CL域(亦即，輕鏈)，且第二多肽包含來自第二抗體之VH域及CH1域(亦即，Fd片段)。在其他特定實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VH域及CH1域(亦即，Fd片段)，且第二多肽包含來自第二抗體之VL域及CL域(亦即，輕鏈)。CL及CH1域可在一些實施例中在第一多肽與第二多肽之間交換。因此，在一些實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VL域及CH1域，且第二多肽包含來自第二抗體之VH域及CL域。在其他實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VH域及CL域，且第二多肽包含來自第二抗體之VL域及CH1域。

本發明包括編碼本文所述的任何雙特異性抗原結合蛋白質或其組分的一或多種核酸，以及包含該等核酸之載體。本發明內亦涵蓋的是諸如CHO細胞之重組寄主細胞，該重組寄主細胞表現任何雙特異性抗原結合蛋白質。

本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質可用於製造用於治療與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之醫藥組成物或藥劑，該等病狀諸如頭痛、偏頭痛及慢性疼痛。因此，本發明亦提供醫藥組成物，其包含雙特異性抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。

在一些實施例中，本發明提供用於治療或防止有需要之患者的頭痛之方法，該方法包含向患者投與有效量之本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。在一些實施例中，頭痛為偏頭痛。偏頭痛可為陣發性偏頭痛或慢性偏頭痛。在其他實施例中，頭痛為叢集性頭痛。在特定實施例中，該方法提供用於此等病狀之預防性治療。

在另一實施例中，本發明提供用於治療有需要之患者的慢性疼痛之方法，該方法包含向患者投與有效量之本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。待根據本發明之方法治療的慢性疼痛症候群可包括關節炎性疼痛，諸如與骨關節炎或類風溼性關節炎相關聯的疼痛。

特定地涵蓋雙特異性抗原結合蛋白質在本文揭示的任何方法中或用於製備根據本文揭示的任何方法來投與的藥劑之用途。例如，本發明包括雙特異性抗原結合蛋白質，其適用於用於治療或防止有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之方法。該病狀可包括頭痛(例如偏頭痛或叢集性頭痛)及慢性疼痛。

本發明亦包括雙特異性抗原結合蛋白質在製備用於治療或防止有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之藥劑中之用途。該病狀可包括頭痛(例如偏頭痛或叢集性頭痛)及慢性疼痛。

圖1 展示用於產生抗CGRP受體/PAC1受體雙特異性抗體的三種雙特異性異源免疫球蛋白型式之示意表示。Kabat-EU編號方案用於表示每一鏈內電荷對突變之位置。此IgG類雙特異性抗體型式為異源四聚物，其包含兩個不同輕鏈及兩個不同重鏈。HC1及LC1分別係指一個Fab結合臂之重鏈及輕鏈，且HC2及LC2分別係指第二Fab結合臂之重鏈及輕鏈。例如，在示意圖中，HC1及LC1相應於抗CGRP受體結合臂，且HC2及LC2相應於抗PAC1結合臂。然而，兩個結合臂可交換以使得HC1及LC1相應於抗PAC1結合臂，且HC2及LC2相應於抗CGRP受體結合臂。

圖2 繪示用於產生抗CGRP受體/PAC1受體雙特異性抗原結合蛋白質之IgG-scFv型式之示意表示。在此型式中，包含來自第二抗體的藉由甘胺酸-絲胺酸連接子(SEQ ID NO：369)連接在一起的可變域之單鏈可變片段(scFv)係經由肽連接子融合至第一抗體之重鏈之羧基末端，以產生經修飾重鏈。儘管展示scFv內之可變域之VH-VL定向，但可變域亦可以VL-VH定向來組織。完整分子為同源四聚物，其包含兩個經修飾重鏈及來自第一抗體之兩個輕鏈。

圖3 繪示用於產生抗CGRP受體/PAC1受體雙特異性抗原結合蛋白質之IgG-Fab型式之示意表示。在此型式中，來自第二抗體之Fab片段之一個多肽鏈(例如，輕鏈(VL2-CL))經由肽連接子融合至第一抗體之重鏈之羧基末端，以產生經修飾重鏈。完整分子為同源六聚物，其包含兩個經修飾重鏈、來自第一抗體之兩個輕鏈以及含有來自第二抗體之Fab片段之另一半的兩個多肽鏈(例如，Fd鏈(VH2-CH1))。電荷對突變(由圓表示)可引入第一抗體(Fab 1)或第二抗體(Fab 2)之Fab區中，以促成正確的重鏈-輕鏈對。儘管第二抗體之輕鏈在示意圖中展示為用於第一抗體之重鏈的融合搭配物，但第二抗體之Fd區(VH-CH1)可用第二抗體之輕鏈融合至重鏈之羧基末端，從而在Fc區之羧基末端處完成Fab域。

本發明係關於特異地結合至人類CGRP受體及人類PAC1受體兩者之雙特異性抗原結合蛋白質。由於CGRP受體及PAC1受體傳訊皆牽連腦血管張力之控制，所以本發明之雙特異性結合蛋白質提供同時地調變兩種傳訊級聯以改善與顱血管結構之調節障礙相關聯的病狀(諸如叢集性頭痛及偏頭痛)之手段。因此，在一個實施例中，本發明提供雙特異性抗原結合蛋白質，其包含特異地結合至人類CGRP受體之第一結合域，及特異地結合至人類PAC1受體之第二結合域。

如本文所使用，術語「抗原結合蛋白」係指特異地結合至一或多種標靶抗原的蛋白質。抗原結合蛋白質可包括抗體及其功能片段。「功能抗體片段」為抗體之一部分，該部分缺少存在於全長重鏈及/或輕鏈中之至少一些胺基酸，但仍能夠特異地結合至抗原。功能抗體片段包括但不限於單鏈可變片段(scFv)、奈米抗體(例如，駱駝重鏈抗體之VH域；VHH片段，參見Cortez-Retamozo等人，Cancer Research，第64卷：2853-57,2004)、Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂ 片段、Fv片段、Fd片段及互補決定區(CDR)片段，且可來源於任何哺乳動物來源，諸如人類、小鼠、大鼠、兔子或駱駝。功能抗體片段可與完整抗體競爭對標靶抗原之結合，且可藉由完整抗體之修飾(例如酶促或化學裂解)來產生片段或使用重組DNA技術或肽合成來重新合成片段。

抗原結合蛋白質亦可包括包含併入單一多肽鏈中或併入多個多肽鏈中之一或多個功能抗體片段的蛋白質。例如，抗原結合蛋白質可包括但不限於雙功能抗體(參見，例如，EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：6444-6448,1993)；內抗體；域抗體(單一VL或VH域或藉由肽連接子接合的兩個或兩個以上VH域；參見Ward等人 ，Nature ，第341卷：544-546,1989)；大抗體(融合至Fc區之2 scFv，參見Fredericks等人，Protein Engineering,Design & Selection，第17卷：95-106,2004，且Powers等人，Journal of Immunological Methods，第251卷：123-135,2001)；三功能抗體；四功能抗體；微型抗體(融合至CH3域之scFv；參見Olafsen等人，Protein Eng Des Sel.第17卷：315-23,2004)；肽抗體(附接至Fc區之一或多個肽，參見WO 00/24782)；線性抗體(一對串連Fd段(VH-CH1-VH-CH1)，其連同互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區，參見Zapata等人，Protein Eng.，第8卷：1057-1062,1995)；小模組化免疫醫藥劑(參見美國專利公開案第20030133939號)；以及免疫球蛋白融合蛋白質(例如，IgG-scFv、IgG-Fab、2scFv-IgG、4scFv-IgG、VH-IgG、IgG-VH以及Fab-scFv-Fc)。

本發明之抗原結合蛋白質為「雙特異性的」，意指該等抗原結合蛋白質能夠特異地結合至兩種不同抗原，即人類CGRP受體及人類PAC1受體。如本文所使用，當在類似結合測定條件下，相較於抗原結合蛋白質對其他無關蛋白質之親和力而言，其具有對抗原顯著更高的結合親和力且因此能夠辨別彼抗原時，該抗原結合蛋白質「特異地結合」至標靶抗原。特異地結合抗原之抗原結合蛋白質可具有平衡解離常數(K_D )1×10^-6 M。當K_D 為1×10^-8 M時，抗原結合蛋白質以「高親和力」特異地結合抗原。在一個實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以5×10^-7 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在另一實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以1×10^-7 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在另一實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以5×10^-8 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在另一實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以1×10^-8 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在某些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以5×10^-9 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在其他實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以1×10^-9 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在一個特定實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以5×10^-10 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。在另一特定實施例中，本發明之抗原結合蛋白質以1×10^-10 M之K_D 結合至人類CGRP受體及/或人類PAC1受體。

使用各種技術測定親和力，該等技術之一實例為親和力ELISA測定。在各種實施例中，藉由表面電漿子共振測定(例如，基於BIAcore^® 之測定)來測定親和力。使用此方法，可量測締合速率常數(k_a ，單位M^-1 s^-1 )及解離速率常數(k_d ，單位s^-1 )。平衡解離常數(K_D ，單位M)可隨後由動力學速率常數之比率(k_d /k_a )來計算。在一些實施例中，藉由動力學方法來測定親和力，該動力學方法諸如Rathanaswami等人Analytical Biochemistry，第373卷：52-60,2008中所述的動力學排除測定(KinExA)。使用KinExA測定，可量測平衡解離常數(K_D ，單位M)及締合速率常數(k_a ，單位M^-1 s^-1 )。解離速率常數(k_d ，單位s^-1 )可由此等值來計算(K_D ×k_a )。在其他實施例中，藉由平衡/溶液方法測定親和力。在某些實施例中，藉由FACS結合測定來測定親和力。WO 2010/075238及WO 2014/144632(兩者據此以全文引用方式併入)描述用於測定結合蛋白質對人類CGRP受體及人類PAC1受體之親和力的適合親和力測定。在本發明之某些實施例中，抗原結合蛋白質以K_D 特異地結合至藉由哺乳動物細胞(例如，CHO、HEK 293、Jurkat)表現的人類CGRP受體及/或人類PAC1受體，該K_D 為20nM(2.0×10^-8 M)或更小之K_D 、10nM(1.0×10^-8 M)或更小之K_D 、1nM(1.0×10^-9 M)或更小之K_D 、500pM (5.0×10^-10 M)或更小之K_D 、200pM(2.0×10^-10 M)或更小之K_D 、150pM(1.50×10^-10 M)或更小之K_D 、125pM(1.25×10^-10 M)或更小之K_D 、105pM(1.05×10^-10 M)或更小之K_D 、50pM(5.0×10^-11 M)或更小之K_D 或20pM(2.0×10^-11 M)或更小之K_D ，其如藉由Rathanaswami等人，Analytical Biochemistry，第373卷：52-60,2008中描述的方法進行的動力學排除測定所測定。在一些實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質展現合乎需要的特性，諸如結合親合力，如藉由約10^-2 、10^-3 、10^-4 、10^-5 、10^-6 、10^-7 、10^-8 、10^-9 、10^-10 s^-1 或較低(較低值指示較高結合親合力)的對人類CGRP受體或人類PAC1受體之k_d (解離速率常數)所量測，及/或結合親和力，如藉由約10^-9 、10^-10 、10^-11 、10^-12 、10^-13 、10^-14 、10^-15 、10^-16 M或較低(較低值指示較高結合親和力)的對人類CGRP受體或人類PAC1之K_D (平衡解離常數)所量測。

在本發明之一些實施例中，抗原結合蛋白質為多價的。結合蛋白質之原子價表示結合蛋白質內的個別抗原結合域之數量。例如，對本發明之抗原結合蛋白質提及之術語「單價」、「二價」及「四價」係指分別具有一個、兩個及四個抗原結合域之結合蛋白質。因此，多價抗原結合蛋白質包含兩個或兩個以上抗原結合域。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為二價的。因此，此等雙特異性、二價抗原結合蛋白質含有兩個抗原結合域：結合至人類CGRP受體之一個抗原結合域，及結合至人類PAC1受體之一個抗原結合域。在其他實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質為多價的。例如，在某些實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質為四價的，包含四個抗原結合域：結合至人類CGRP受體之兩個抗原結合域，及結合至人類PAC1受體之兩個抗原結合域。

如本文所使用，可與「結合域」互換使用的術語「抗原結合域」係指抗原結合蛋白質之區域，該區域含有與抗原相互作用且於抗原結合蛋白質上賦予其對抗原之特異性及親和力的胺基酸殘基。在一些實施例中，結合域可來源於人類CGRP受體及人類PAC1受體之天然配位體。例如，特異地結合至人類CGRP受體之結合域可來源於人類α-CGRP，且包含肽拮抗劑，諸如Chiba等人，Am.J.Physiol.，第256卷：E331-E335,1989及Taylor等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，第319卷：749-757,2006中描述的CGRP8-37拮抗劑肽及其變異體。類似地，特異地結合至人類PAC1受體之結合域可來源於PACAP38或PACAP27，且可包含肽拮抗劑，諸如Bourgault等人，J.Med.Chem.，第52卷：3308-3316,2009及美國專利第6,017,533號中描述的彼等肽拮抗劑。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之某些實施例中，結合域可來源於抗體或其功能片段。例如，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之結合域可包含來自特異地結合至人類CGRP受體或人類PAC1受體之抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區的一或多個互補決定區(CDR)。如本文所使用，術語「CDR」係指抗體可變序列內之互補決定區(亦稱為「最小識別單元」或「高變區」)。存在三個重鏈可變區CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及三個輕鏈可變區CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。如本文所使用的術語「CDR區」係指出現在單一可變區中的三個CDR之群組(亦即，三個輕鏈CDR或三個重鏈CDR)。兩個鏈中之每一者中的CDR典型地藉由構架區來對準，以形成與標靶蛋白質(例如，人類CGRP受體或人類PAC1受體)上之特定抗原決定基或域特異性地結合的結構。自N末端至C末端，天然存在的輕鏈可變區及重鏈可變區兩者典型地符合此等元件之以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計編號系統來用於將編號指定至佔據此等域之每一者中之位置的胺基酸。此編號系統定義於Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987及1991,NIH,Bethesda,MD)或Chothia & Lesk,1987,J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883中。給定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)可使用此系統來鑑定。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含抗CGRP受體抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之所有六個CDR，且本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域包含抗PAC1受體抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之所有六個CDR。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之一些實施例中，結合域(抗CGRP受體結合域、抗PAC1受體結合域或兩者)包含Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv、單鏈可變片段(scFv)或奈米抗體。在一個實施例中，兩個結合域為Fab片段。在另一實施例中，一個結合域為Fab片段，且另一結合域為scFv。

抗體之木瓜酶消化產生：兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自具有單一抗原結合位點；以及殘餘「Fc」片段，其含有免疫球蛋白恆定區。Fab片段含有所有可變域，以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。因此，「Fab片段」包含一個免疫球蛋白輕鏈(輕鏈可變區(VL)及恆定區(CL))及一個免疫球蛋白重鏈之CH1區及可變區(VH)。Fab分子之重鏈無法與另一重鏈分子形成二硫鍵。Fc片段顯示碳水化合物且負責許多抗體效應物功能(諸如結合補體及細胞受體)，該等抗體效應物功能將一類抗體與另一類抗體相區別。「Fd片段」包含來自免疫球蛋白重鏈之VH域及CH1域。Fd片段表示Fab片段之重鏈組分。

「Fab'片段」為在CH1域之C末端處具有來自抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸殘基的Fab片段。

「F(ab')₂ 片段」為二價片段，其包括在鉸鏈區處藉由重鏈之間的雙硫鍵連接的兩個Fab'片段。

「Fv」片段為含有來自抗體之完整抗原識別及結合位點的最小片段。此片段由一個免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及一個免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)呈緊密、非共價締合之二聚物組成。在此組態中，每一可變區之三個CDR相互作用以界定VH-VL二聚物之表面上的抗原結合位點。單一輕鏈或重鏈可變區(或Fv片段中僅包含三個對抗原具特異性之CDR的半部)具有識別並結合抗原之能力，儘管親和力低於包含VH及VL兩者的整個結合位點。

「單鏈可變抗體片段」或「scFv片段」包含抗體之VH區及VL區，其中此等區存在於單一多肽鏈中，且視情況包含VH區與VL區之間的肽連接子，該肽連接子允許Fv形成用於抗原結合之所要結構(參見例如，Bird等人，Science，第242卷：423-426,1988；以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第85卷：5879-5883,1988)。

「奈米抗體」為重鏈抗體之重鏈可變區。此等可變域為此等重鏈抗體的具有僅15kDa之分子質量之最小完全功能抗原結合片段。參見Cortez-Retamozo等人，Cancer Research 64：2853-57,2004。缺少輕鏈之功能性重鏈抗體天然存在於某些動物物種中，諸如鉸口鯊、鬚鯊及駱駝科，諸如駱駝、單峰駱駝、羊駝及駱馬。在此等動物中，抗原結合位點減小至單域，即VHH域。此等抗體僅使用重鏈可變區來形成抗原結合區，亦即，此等功能抗體為僅具有結構H₂ L₂ 的重鏈之同源二聚物(稱為「重鏈抗體」或「HCAb」)。據報告，駱駝化VHH與IgG2及IgG3恆定區重組，該等恆定區含有鉸鏈、CH2及CH3域且缺少CH1域。已發現駱駝化VHH域以高親和力結合至抗原(Desmyter等人，J.Biol.Chem.，第276卷：26285-90,2001)且在溶液中擁有高穩定性(Ewert等人，Biochemistry，第41卷：3628-36,2002)。用於產生具有駱駝化重鏈之抗體的方法描述於例如美國專利公開案第2005/0136049號及第2005/0037421號中。替代骨架可由人類之類可變域製成，該等類可變域更緊密地匹配鯊魚V-NAR骨架；且該等替代骨架可提供用於長的穿透環結構之架構。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之特定實施例中，結合域包含特異地結合至所要抗原之抗體或抗體片段之免疫球蛋白重鏈可變區(VH)及免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)。例如，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含來自抗CGRP受體抗體之VH區及VL區，且抗PAC1受體結合域包含來自抗PAC1受體抗體之VH區及VL區。

可在本文中與「可變域」(輕鏈(VL)之可變區、重鏈(VH)之可變區)互換使用的「可變區」係指每一輕鏈免疫球蛋白鏈及重鏈免疫球蛋白鏈中直接地涉及將抗體結合至抗原之區域。如以上所論述，可變輕鏈及重鏈之區域具有相同通用結構，且每一區包含藉由三個CDR連接的四個架構(FR)區，該等區之序列受廣泛保存。構架區採用β褶板構形，且CDR可形成連接β褶板結構之環。每一鏈中之CDR藉由構架區保持於其三維結構中，且連同來自其他鏈之CDR形成抗原結合位點。

特異地結合至人類CGRP受體或人類PAC1受體之結合域可來源於a)此等抗原之已知抗體或b)新抗體或抗體片段，該等新抗體或抗體片段係藉由使用抗原蛋白質或其片段的重新免疫方法、藉由噬菌體顯示或其他例行方法來獲得。得到用於雙特異性抗原結合蛋白質之結合域的抗體可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體或人源化抗體。在某些實施例中，得到結合域之抗體為單株抗體。在此等及其他實施例中，抗體為人類抗體或人源化抗體，且可具有IgG1類型、IgG2類型、IgG3類型或IgG4類型。

如本文所使用的術語「單株抗體」(或「mAb」)係指自實質上同源抗體之群體獲得的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可以微量存在之可能天然存在的突變之外皆相同。單株抗體為高度特異性的，與典型地包括旨在針對不同抗原決定基之不同抗體的多株抗體製劑相對比，該等單株抗體旨在針對個別抗原位點或抗原決定基。單株抗體可使用此項技術中已知的任何技術產生，例如藉由在完成免疫時程之後將來自基因轉殖動物收穫的脾細胞永生化來產生。脾細胞可使用此項技術中已知的任何技術永生化，例如藉由將該等脾細胞與骨髓瘤細胞融合來產生融合瘤。適用於產生融合瘤之融合程序的骨髓瘤細胞較佳地為非產生抗體的，具有高融合效率及酶缺乏性，該等酶缺乏性使得該等骨髓瘤細胞不能在某些選擇性培養基中生長，該等選擇性培養基僅支援所要融合細胞(融合瘤)之生長。適用於小鼠融合之適合細胞系之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞系之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。適用於細胞融合之其他細胞系為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。

在一些情況下，融合瘤細胞系藉由以下方式產生：用CGRP受體或PAC1受體免疫原免疫動物(例如，具有人類免疫球蛋白序列之基因轉殖動物)；自免疫動物收穫脾細胞；將收穫脾細胞融合至骨髓瘤細胞系，進而產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞建立融合瘤細胞系，且鑑定產生結合CGRP受體或PAC1受體之抗體的融合瘤細胞系。

藉由融合瘤細胞系分泌的單株抗體可使用此項技術中已知的任何技術純化，該技術諸如蛋白質A-瓊脂糖、氫氧磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和力層析。融合瘤或mAb可例如使用cAMP測定(例如，如本文所述)進一步篩選以鑑定具有特定性質之mAb，該等特定性質諸如結合表現CGRP受體或PAC1受體之細胞的能力、阻斷或干擾CGRP配位體或PACAP配位體與其各別受體之結合的能力、或功能上阻斷任一受體的能力。

在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體及抗CGRP受體結合域可分別來源於針對PAC1受體及CGRP受體之人源化抗體。「人源化抗體」係指其中數個區域(例如構架區)已經修飾以包含來自人類免疫球蛋白之相應區域之抗體。通常，人源化抗體可由最初在非人類動物中產生的單株抗體來產生。此單株抗體中典型地來自抗體之非抗原識別部分的某些胺基酸殘基經修飾以與相應同型之人類抗體中之相應殘基同源。人源化可例如使用各種方法，藉由將齧齒動物可變區之至少一部分取代為人類抗體之相應區域來執行(參見，例如，美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，Nature，第321卷：522-525,1986；Riechmann等人，Nature，第332卷：323-27,1988；Verhoeyen等人，Science，第239卷：1534-1536,1988)。在另一物種中產生的抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之CDR可接枝至一致人類FR。為產生一致人類FR，來自若干人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR可經對準來鑑定一致胺基酸序列。

針對人類CGRP受體或人類PAC1受體產生的可得到用於本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之結合域的新抗體可為完全人類抗體。「完全人類抗體」為包含來源於或指示人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。提供用於實行完全人類抗體之產生的一種特定手段為小鼠體液性免疫系統之「人源化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入其中內源性Ig基因已經失活的小鼠中為在小鼠(可利用任何合乎需要抗原免疫的動物)中產生完全人類單株抗體(mAb)之一種手段。使用完全人類抗體可最小化免疫原性及過敏性反應，該等反應有時可由將小鼠或源於小鼠之mAb作為治療劑投與至人類引起。

完全人類抗體可藉由能夠在不存在內源性免疫球蛋白產生的情況下產生人類抗體之戲目的免疫基因轉殖動物(通常為小鼠)來產生。為達此目的之抗原典型地具有六個或六個以上鄰接胺基酸，且視情況共軛至載劑，諸如半抗原。參見，例如，Jakobovits等人，1993,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362：255-258；以及Bruggermann等人，1993,Year in Immunol.7：33。在此種方法之一個實例中，基因轉殖動物係藉由以下方式產生：使編碼小鼠之小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈的內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，且將人類基因組DNA中含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座的之大片段插入小鼠基因組中。具有不及人類免疫球蛋白基因座之完全補體的部分修飾動物隨後經交叉育種以獲得具有所有所要免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等基因轉殖動物產生對免疫原具免疫特異性但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。對此等方法之更多細節，參見，例如，WO 96/33735及WO 94/02602。關於用於製造人類抗體之基因轉殖小鼠的另外方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,939,598號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；PCT公開案WO 91/10741、WO 90/04036、WO 94/02602、WO 96/30498、WO 98/24893及EP 546073B1及EP 546073A1中。

本文中稱為「HuMab」小鼠的以上所述基因轉殖小鼠含有編碼未重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列之人類免疫球蛋白基因微小基因座，連同使內源性μ及κ鏈基因座失活的經靶向突變(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。因此，小鼠展現小鼠IgM或κ之減少表現，且回應於免疫，所引入人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別交換及體細胞突變以產生高親和力人類IgGκ單株抗體(Lonberg等人，同上；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546)。HuMab小鼠之製劑詳細地描述以下文獻中：Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology 5：647-656； Tuaillon等人，1994,J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14：845-851；前述參考文獻據此以全文引用方式併入以達所有目的。進一步參見，美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；以及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；國際公開案第WO 93/1227號；第WO 92/22646號；以及第WO 92/03918號，該等案件之揭示內容據此以全文引用方式併入以達所有目的。利用來在此等基因轉殖小鼠中產生人類抗體之技術亦揭示於WO 98/24893及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156中，該等文獻據此以引用方式併入。例如，HCo7及HCo12基因轉殖小鼠菌株可用於產生另外的完全人類抗CGRP受體及抗PAC1受體抗體。

源於人類的抗體亦可使用噬菌體顯示技術來產生。噬菌體顯示描述於例如Dower等人，WO 91/17271；McCafferty等人，WO 92/01047，以及Caton及Koprowski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：6450-6454(1990)，其中每一者以全文引用方式併入本文。藉由噬菌體技術產生的抗體通常在細菌中產生為抗原結合片段，例如Fv或Fab片段，且因此缺少效應物功能。效應物功能可藉由以下兩種策略之一來引入：片段可經工程改造成用於在哺乳動物細胞中表現的完整抗體，或工程改造成具有能夠在需要時觸發效應物功能之第二結合位點的雙特異性抗體片段。典型地，抗體之Fd片段(VH-CH1)及輕鏈(VL-CL)單獨地藉由PCR選殖，且隨機重組於組合噬菌體顯示文庫中，該等組合噬菌體顯示文庫可隨後經選擇用於結合至特定抗原。抗體片段表現於噬菌體表面上，且藉由抗原結合對Fv或Fab(及因此含有編碼抗體片段之DNA的噬菌體)之選擇經由若干輪的抗原結合及再擴增(稱為淘選之程序)來完成。富集並最終分離對抗原具特異性之抗體片段。噬菌體顯示技術亦可用於齧齒動物單株抗體之人源化所用之方法(稱為「引導選擇」)中(參見Jespers,L.S.,等人，Bio/Technology 12,899-903(1994))。為此，小鼠單株抗體之Fd片段可與人類輕鏈文庫組合顯示，且可隨後利用抗原來選擇所得雜交Fab文庫。小鼠Fd片段進而提供模板來引導選擇。隨後，所選人類輕鏈與人類Fd片段文庫組合。所得文庫之選擇完全地產生人類Fab。

本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含特異地結合至人類PAC1受體之結合域。人類PAC1受體(本文中亦稱為「人類PAC1」、「hPAC1」及「hPAC1受體」)為在UniProtKB/Swiss-Prot資料庫中命名為P41586(PACR_HUMAN)之468胺基酸蛋白質，且係藉由ADCYAP1R1 基因編碼。PACAP-27及PACAP-38為PAC1之主要內源性促效劑。人類PAC1受體之胺基酸序列在以下列明： (SEQ ID NO：339)

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域包含來自抗PAC1受體抗體或其功能片段之VH區及/或VL區或CDR區。較佳地，抗PAC1受體抗體或其功能片段特異地結合至人類PAC1受體，且防止或減少受體與PACAP-38及/或PACAP-27之結合。在一些實施例中，抗PAC1受體抗體或其功能片段特異地結合至人類PAC1受體之細胞外區。在一個特定實施例中，抗PAC1受體抗體或其功能片段特異地結合至PAC1受體之胺基端細胞外域(亦即，SEQ ID NO：339之胺基酸21-155)。

在一些實施例中，得到本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域的抗PAC1抗體或其功能片段相對於人類VPAC1及人類VPAC2受體而選擇性地抑制人類PAC1受體。當在特定受體之抑制測定中抗體之IC50低於在另一「參考」受體(例如，hVPAC1或hVPAC2受體)之抑制測定中的IC50至少50倍時，抗體或其功能片段相對於其他受體「選擇性地抑制」特定受體。「IC50」為達成生物學或生物化學功能之50%抑制所需的劑量/濃度。利用放射性配位體，IC50為競爭配位體替代放射配位體之特異性結合之50%的濃度。任何特定物質或拮抗劑之IC50可藉由以下方式來測定：構造劑量反應曲線，且在特定功能測定中檢查藥物或拮抗劑之不同濃度對反轉促效劑活性之效應。可藉由測定抑制促效劑之最大生物反應之一半所需的濃度計算給定拮抗劑或藥物之IC50值。因此，任何抗PAC1抗體或其功能片段之IC50值可藉由以下方式計算：在諸如實例中所述的cAMP測定的任何功能測定中，測定在活化人類PAC1受體中抑制PACAP配位體(PACAP-27或PACAP-38)之最大生物反應之一半所需的抗體或片段之濃度。選擇性地抑制特定受體之抗體或其功能片段應理解為相對於彼受體而言的中和抗體或中和片段。因此，在一些實施例中，得到本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域的抗PAC1受體抗體或其功能片段為人類PAC1受體之中和抗體或片段。

任何抗PAC1受體抗體或其功能片段之可變區或CDR區可用於構築本文所述的任何雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域。例如，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域可包含來自WO 2014/144632(其據此以全文引用方式併入)中所述的任何抗人類PAC1受體抗體之VH區及/或VL區或一或多個CDR。在某些實施例中，得到抗PAC1結合域之抗PAC1抗體與WO 2014/144632中所述的人類抗PAC1抗體中之一或多者或以下所述的抗PAC1抗體中之一或多者競爭對人類PAC1受體之結合。術語「競爭」係指抗體或其他抗原結合蛋白質干擾其他抗體或結合片段與標靶(例如，人類PAC1受體或人類CGRP受體)之結合的能力。抗體或結合片段能夠干擾另一抗體或結合片段與標靶(例如，人類PAC1受體或人類CGRP受體)之結合的程度及因此是否該干擾可稱作競爭皆可使用競爭結合測定來判定。可使用眾多類型之競爭性結合測定，包括例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見，例如，Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見，例如，Kirkland等人，1986,J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見，例如，Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標籤之固相直接標籤RIA(參見，例如，Morel等人，1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見，例如，Cheung,等人，1990,Virology 176：546-552)；以及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。典型地，競爭性結合測定涉及使用結合至固體表面或帶有抗原之細胞的純化抗原、未標記測試抗體或其他抗原結合蛋白質，以及經標記參考抗體或其他抗原結合蛋白質。競爭性抑制藉由測定在測試抗體或其他抗原結合蛋白質存在下結合至固體表面或細胞之標籤之量來量測。通常，測試抗體或其他抗原結合蛋白質過量存在。藉由競爭測定鑑定的抗體或其他抗原結合蛋白質(亦即，競爭抗體及抗原結合蛋白質)包括與參考抗體或抗原結合蛋白質結合至相同抗原決定基的抗體及抗原結合蛋白質。通常，當競爭抗體或其他抗原結合蛋白質過量存在時，其將參考抗體或其他抗原結合蛋白質與標靶抗原之特異性結合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，將參考抗體或其他抗原結合蛋白質之結合抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更大。在一些實施例中，競爭抗體或其結合片段將參考抗體之人類PAC1受體結合減少約40%與100%之間，諸如約60%與約100%，特別是約70%與100%之間，且更特別是約80%與100%之間。

用於偵測競爭性結合之尤其適合的定量測定使用Biacore機器，該Biacore機使用表面電漿子共振技術來量測相互作用之程度。示範性的基於Biacore之競爭性結合測定涉及使參考抗體固定至感測器晶片。標靶抗原隨後與感測器晶片接觸，其中標靶抗原藉由固定的參考抗體俘獲。測試抗體隨後注入在所俘獲標靶抗原上。若所注入測試抗體識別出與藉由固定抗體所識別者相異的抗原決定基，則觀察到第二結合事件，且將測試抗體視為不與參考抗體競爭結合至標靶抗原。另一適合的定量競爭結合測定使用基於FACS之方法來量測就結合至人類PAC1受體之抗體而言抗體之間的競爭。

可得到或構築出本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1結合域的示範性人類抗PAC1受體抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區及相關聯CDR可分別在以下表1A及1B中列明。

表1B. 示範性抗PAC1受體重鏈可變區胺基酸序列

雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域可包含存在於表1A(輕鏈CDR；亦即CDRL)及表1B(重鏈CDR，亦即，CDRH)中之CDR之一或多者。例如，在某些實施例中，抗PAC1受體結合域包含選自以下各項之一或多個輕鏈CDR：(i)選自SEQ ID NO：1至13之CDRL1；(ii)選自SEQ ID NO：14至19之CDRL2；以及(iii)選自SEQ ID NO：20至27之CDRL3；以及(iv)(i)、(ii)及(iii)中含有一或多個，例如一個、兩個、三個、四個或四個以上胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)、不超過五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸之缺失或插入的CDRL。在此等及其他實施例中抗PAC1受體結合域包含選自以下各項之一或多個重鏈CDR：(i)選自SEQ ID NO：55至65之CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO：66至73之CDRH2；以及(iii)選自SEQ ID NO：74至82之CDRH3；以及(iv)(i)、(ii)及(iii)中含有一或多個，例如一個、兩個、三個、四個或四個以上胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)、不超過五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸胺基酸之缺失或插入的CDRH。

在某些實施例中，抗PAC1受體結合域可包含表1A及1B中所列CDR之1、2、3、4、5或6種變異體形式，其各自具有與表1A及1B中所列CDR序列至少80%、85%、90%或95%序列一致性。在一些實施例中，抗PAC1受體結合域包括表1A及1B中所列CDR之1、2、3、4、5或6者，其各自與此等表中所列CDR相差不超過1、2、3、4或5個胺基酸。

在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：1、14及20之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：2、15及21之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：3、15及21之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：4、16及22之序列；(e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、15及21之序列；(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：6、17及23之序列；(g)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、18及24之序列；(h)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：8、17及25之序列；(i)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：9、16及22之序列；(j)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：10、19及26之序列；(k)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：11、16及27之序列；(l)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、16及22之序列；或(m)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：13、16及27之序列。

在其他特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：55、66及74之序列；(b)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO： 56、67及75之序列；(c)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及76之序列；(d)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：58、69及77之序列；(e)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：59、69及78之序列；(f)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：60、70及79之序列；(g)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：61、71及80之序列；(h)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：62、72及81之序列；(i)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：63、73及82之序列；(j)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：64、68及76之序列；或(k)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：65、68及76之序列。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3；以及重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：1、14及20之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：55、66及74之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：2、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：3、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：4、16及22之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及76之序列； (e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：5、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：58、69及77之序列；(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：2、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：59、69及78之序列；(g)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：6、17及23之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：60、70及79之序列；(h)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：7、18及24之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：61、71及80之序列；(i)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：8、17及25之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：62、72及81之序列；(j)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：9、16及22之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及76之序列；(k)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：10、19及26之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：63、73及82之序列；(l)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：11、16及27之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：64、68及76之序列；(m)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：12、16及22之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及 76之序列；或(n)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：13、16及27之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：65、68及76之序列。

在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3；以及重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：1、14及20之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：55、66及74之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：2、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：3、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；或(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：4、16及22之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及76之序列。

本發明之抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域可包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區選自由如表1A所示的LV-01、LV-02、LV-03、LV-04、LV-05、LV-06、LV-07、LV-08、LV-09、LV-10、LV-11、LV-12、LV-13、LV-14、LV-15、LV-16、LV-17、LV-18、LV-19、LV-20、LV-21、LV-22、LV-23、LV-24、LV-25、LV-26及LV-27組成之群；以及/或重鏈可變區，該重鏈可變區選自由如表1B所示的HV-01、HV-02、HV-03、HV-04、 HV-05、HV-06、HV-07、HV-08、HV-09、HV-10、HV-11、HV-12、HV-13、HV-14、HV-15、HV-16、HV-17、HV-18、HV-19、HV-20、HV-21、HV-22、HV-23、HV-24、HV-25及HV-26組成之群；以及此等輕鏈可變區及重鏈可變區之功能片段、衍生物、突變蛋白質及變異體。

表1A中所列的輕鏈可變區中之每一者可與表1B中所示的重鏈可變區中之任何者組合，以形成適用於併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質中之抗PAC1受體結合域。此等組合之實例包括但不限於：LV-01及HV-01；LV-02及HV-02；LV-03及HV-01；LV-04及HV-03；LV-05及HV-04；LV-06及HV-05；LV-07及HV-06；LV-08及HV-07；LV-09及HV-08；LV-10及HV-09；LV-11及HV-10；LV-12及HV-11；LV-13及HV-13；LV-13及HV-03；LV-13及HV-14；LV-14及HV-12；LV-15及HV-13；LV-15及HV-03；LV-15及HV-12；LV-16及HV-03；LV-16及HV-15；LV-16及HV-16；LV-16及HV-17；LV-17及HV-18；LV-18及HV-18；LV-19及HV-19；LV-20及HV-20；LV-21及HV-21；LV-22及HV-22；LV-23及HV-23；LV-24及HV-24；LV-25及HV-25；LV-26及HV-23；以及LV-27及HV-26。在某些實施例中，抗PAC1受體結合域包含：(a)LV-01(SEQ ID NO：28)及HV-01(SEQ ID NO：83)；(b)LV-03(SEQ ID NO：30)及HV-01(SEQ ID NO：83)；(c)LV-04(SEQ ID NO：31)及HV-03(SEQ ID NO：85)；(d)LV-06(SEQ ID NO：33)及HV-05(SEQ ID NO：87)；(e)LV-08(SEQ ID NO：35)及HV-07(SEQ ID NO：89)；或(f)LV-10(SEQ ID NO：37)及HV-09(SEQ ID NO：91)。

在一些實施例中，抗PAC1受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含鄰接胺基酸之序列，該序列僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處不同於表1A中之輕鏈可變區之序列，亦即選自LV-01、LV-02、LV-03、LV-04、LV-05、LV-06、LV-07、LV-08、LV-09、LV-10、LV-11、LV-12、LV-13、LV-14、LV-15、 LV-16、LV-17、LV-18、LV-19、LV-20、LV-21、LV-22、LV-23、LV-24、LV-25、LV-26及LV-27之VL，其中每一此種序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中缺失、插入及/或取代產生相對於先前可變域序列而言不超過15個胺基酸之改變。一些抗PAC1結合域中之輕鏈可變區包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：28-54之胺基酸序列(亦即，表1A中之輕鏈可變區)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

在此等及其他實施例中，抗PAC1受體結合域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含鄰接胺基酸之序列，該序列僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處不同於表1B中之重鏈可變區之序列，亦即選自HV-01、HV-02、HV-03、HV-04、HV-05、HV-06、HV-07、HV-08、HV-09、HV-10、HV-11、HV-12、HV-13、HV-14、HV-15、HV-16、HV-17、HV-18、HV-19、HV-20、HV-21、HV-22、HV-23、HV-24、HV-25及HV-26之VH，其中每一此種序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中缺失、插入及/或取代產生相對於先前可變域序列而言不超過15個胺基酸之改變。一些抗PAC1受體結合域中之重鏈可變區包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：83-108之胺基酸序列(亦即，表1B中之重鏈可變區)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

如本文所使用的術語「一致性」係指兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係，如藉由比對並比較序列所測定。如本文所使用的「一致性百分比」意指所比較分子中胺基酸或核苷酸之間的相同殘基之百分比，且係基於所比較分子中之最小者之大小來計算。對於此等計算而言，對準物中之空隙(若存在)必須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即，「演算法」)來定址。可用於計算所比對核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所述的彼等方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；以及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.48：1073。例如，序列一致性可藉由常用於比較兩個多肽之胺基酸位置之相似性的標準方法來測定。使用諸如BLAST或FASTA之電腦程式，針對兩個多肽或兩個多核苷酸序列之各別殘基(沿一或兩個序列之全長，或沿一或兩個序列之預先確定部分)之最佳匹配來比對該等多肽或多核苷酸序列。該等程式提供預設開放罰分及預設空隙罰分，且諸如PAM250(一種標準記分矩陣；參見Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure，第5卷，增刊3(1978))之記分矩陣可結合電腦程式使用。例如，可隨後將一致性百分比如下計算：將相同匹配總數乘以100，且隨後除以所匹配跨距內較長序列之長度與為比對兩個序列而引入較長序列中之空隙數量之總和。在計算一致性百分比中，所比較序列以給出序列之間的最大匹配之方式來比對。

GCG程式包裝為可用於測定一致性百分比之電腦程式，該包裝包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。電腦演算法GAP係用於比對兩個多肽或兩個多核苷酸，該等多肽或多核苷酸之序列一致性百分比為待測定的。針對序列之各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨距」，如藉由演算法來測定)來比對該等序列。空隙開放罰分(其係計算為3x平均對角線，其中「平均對角線」為所使用比較矩陣之對角線之平均值；「對角線」為藉由特定比較矩陣指定至每一完全胺基酸匹配之得分或數字)及空隙延伸罰分(通常為1/10乘以空隙開放罰分)以及諸如PAM 250或BLOSUM 62之比較矩陣結合演算法使用。在某些實施例中，標準比較矩陣(關於BLOSUM 62比較矩陣，參見，Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352 for the PAM 250 comparison matrix；Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919)亦藉由演算法使用。

使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數包括以下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，Henikoff等人，1992，同上；空隙罰分：12(但對末端空隙無罰分)

空隙長度罰分：4

相似性之閾值：0

用於比對兩個胺基酸序列之某些比對方案可產生兩個序列之僅短區之匹配，且此小比對區可具有極高序列一致性，儘管不存在兩個全長序列之間的明顯關係。因此，所選比對方法(GAP程式)可在需要時經調整以產生標靶多肽之跨距至少50個鄰接胺基酸之比對。

本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含特異地結合至人類CGRP受體之結合域。人類CGRP受體(本文中亦稱為「CGRPR」、「CGRP R」、「hCGRPR」及「huCGRPR」)為異源二聚物，該異源二聚物包含人類降血鈣素受體樣受體(CRLR)多肽(Genbank登錄號U17473.1)及人類受體活性修飾蛋白質1(RAMP1)多肽(Genbank登錄號AJ001014)。全長人類CRLR及RAMP1多肽之胺基酸序列以及來自兩種多肽之細胞外域在以下表2中列明。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含來自抗CGRP受體抗體或其功能片段之VH區及/或VL區或CDR區。較佳地，抗CGRP受體抗體或其功能片段特異地結合至人類CGRP受體，且防止或減少受體與CGRP之結合。在某些實施例中，抗CGRP受體抗體或其功能片段特異地結合至人類CRLR及人類RAMP1多肽兩者中之殘基或殘基之序列或區域。在一個實施例中，抗CGRP受體抗體或其功能片段特異地結合至由人類CRLR及人類RAMP1多肽兩者中之胺基酸形成的抗原決定基。如本文所使用，「抗原決定基」係指能夠藉由抗體或其功能片段特異地結合的任何決定子。抗原決定基可鄰接或非鄰接的(例如，(i)在單鏈多肽中，在多肽序列中彼此不鄰接但在分子之情形中藉由抗體或功能片段結合的胺基酸殘基，或(ii)在例如包含兩個或兩個以上個別組分之多聚蛋白質中，存在於個別組分之兩個或兩個以上者上但在多聚蛋白質之情形中藉由抗體或功能片段結合的胺基酸殘基)。在一些實施例中，由人類CRLR及人類RAMP1多肽兩者中之胺基酸形成的抗原決定基包含用於AspN蛋白酶之一或多個裂解位點，該AspN蛋白酶裂解胺基末端處天冬胺酸殘基及一些麩胺酸殘基之後的肽。

在某些實施例中，得到抗CGRP受體結合域之抗CGRP受體抗體或其功能片段特異地結合至人類CRLR多肽之細胞外域，其包含SEQ ID NO：342之胺基酸序列。替代地或另外，抗CGRP受體抗體或其功能片段特異地結合至人類RAMP1多肽之細胞外域，其包含SEQ ID NO：343之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CGRP受體抗體或結合片段特異地結合至人類CRLR多肽內之抗原決定基，其包含選自以下各項之至少一個序列：SEQ ID NO：344(DSIQLGVTRNKIMTAQY；相應於SEQ ID NO：342之胺基酸8-24)、SEQ ID NO：345(DVAAGTESMQLCP；相應於SEQ ID NO：342之胺基酸55-67)、SEQ ID NO：346(DGNWFRHPASNRTWTNYTQCNVNTH；相應於SEQ ID NO：342之胺基酸86-110)、SEQ ID NO：347(ECYQKIMQ；相應於SEQ ID NO：342之胺基酸25-32)或SEQ ID NO：348(DGWLCWN；相應於SEQ ID NO：342之胺基酸48-54)。例如，在一些實施例中，抗CGRP受體抗體或其功能片段結合SEQ ID NO：342之人類CRLR多肽之子區內的抗原決定基，其中抗原決定基包含SEQ ID NO：344-348，其視情況呈其原生三維構形。替代地或另外，抗CGRP受體抗體或功能片段特異地結合至人類RAMP1多肽內之至少一個抗原決定基，其選自SEQ ID NO：349(RELADCTWHMAE；相應於SEQ ID NO：343之胺基酸41-52)、SEQ ID NO：350(DWGRTIRSYRELA；相應於SEQ ID NO：343之胺基酸32-44)、SEQ ID NO：351(ELCLTQFQV；相應於SEQ ID NO：343之胺基酸12-20)或SEQ ID NO：352(DCTWHMA；相應於SEQ ID NO：343之胺基酸45-51)。在一些實施例中，抗CGRP受體抗體或其功能片段結合至SEQ ID NO：343之人類RAMP1多肽之子區內的抗原決定基，其中抗原決定基包含SEQ ID NO：349-352，其視情況呈其原生三維構形。

在一些實施例中，得到本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域的抗CGRP受體抗體或其功能片段相對於人類腎上腺髓素1(AM1)、人類腎上腺髓素2(AM2)或人類澱粉素受體(例如，人類AMY1受體)選擇性地抑制人類CGRP受體。人類AM1受體包含人類CRLR多肽及RAMP2多肽，且人類AM2受體包含人類CRLR多肽及RAMP3多肽。因此，將不預期僅結合CRLR(而非RAMP1)之抗體或其他結合蛋白質選擇性地抑制CGRP受體，因為CRLR多肽亦為AM1及AM2受體之組分。人類澱粉素(AMY)受體包含人類降血鈣素受體(CT)多肽及RAMP1、RAMP2或RAMP3次單元之一者。特別地，人類AMY1受體由CT多肽及RAMP1多肽構成，人類AMY2受體由CT多肽及RAMP2多肽構成，且人類AMY3受體由CT多肽及RAMP3多肽構成。因此，將不預期僅結合RAMP1(而非CRLR)之抗體或其他結合蛋白質選擇性地抑制CGRP受體，因為RAMP1多肽亦為人類AMY1受體之組分。如上所述，任何抗體或其功能片段相對於參考受體(例如，人類AM1、AM2或AMY1受體)選擇性地抑制特定受體(例如，人類CGRP受體)之能力可藉由在用於標靶及參考受體之抑制測定中測定抗體或功能片段之IC50值來評估。任何抗CGRP受體抗體或其功能片段之IC50值可藉由以下方式計算：在諸如實例中所述的cAMP測定的任何功能測定中，測定在活化人類CGRP受體中抑制CGRP配位體之最大生物反應之一半所需的抗體或片段之濃度。在一些實施例中，得到本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域的抗CGRP受體抗體或其功能片段為人類CGRP受體之中和抗體或片段。

任何抗CGRP受體抗體或其功能片段之可變區或CDR區可用於構築本文所述的任何雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域。例如，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域可包含來自WO 2010/075238(其據此以全文引用方式併入)中描述的任何抗人類CGRP受體抗體之VH區及/或VL區或一或多個CDR。在一些實施例中，得到抗CGRP受體結合域之抗CGRP受體抗體與WO 2010/075238中所述的人類抗CGRP受體抗體中之一或多者或以下所述的抗CGRP受體抗體中之一或多者競爭對人類CGRP受體之結合。在一些實施例中，競爭抗體或其結合片段將參考抗體之人類CGRP受體結合減少約40%與100%之間，諸如約60%與約100%，特別是約70%與100%之間，且更特別是約80%與100%之間。用於偵測競爭性結合之尤其適合的定量測定使用Biacore機器，該Biacore機使用表面電漿子共振技術來量測相互作用之程度。另一適合定量競爭結合測定使用基於FACS之方法，以就抗體結合至人類CGRP受體而言量測該等抗體之間的競爭。

得到或構築出本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域的示範性人類抗CGRP受體抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區及相關聯CDR可分別在以下表3A及3B中列明。

雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域可包含存在於表3A(輕鏈CDR；亦即CDRL)及表3B(重鏈CDR，亦即，CDRH)中CDR之一或多者。例如，在某些實施例中，抗CGRP受體結合域包含選自以下各項之一或多個輕鏈CDR：(i)選自SEQ ID NO：109至119之CDRL1；(ii)選自SEQ ID NO：14、17、18、120至126之CDRL2；以及(iii)選自SEQ ID NO：127至135之CDRL3；以及(iv)(i)、(ii)及(iii)中含有一或多個，例如一個、兩個、三個、四個或四個以上胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)、不超過五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸之缺失或插入的CDRL。在此等及其他實施例中，抗CGRP受體結合域包含選自以下各項之一或多個重鏈CDR：(i)選自SEQ ID NO：159至166之CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO：167至178之CDRH2；以及(iii)選自SEQ ID NO：179至189之CDRH3；以及(iv)(i)、(ii)及(iii)中含有一或多個，例如一個、兩個、三個、四個或四個以上胺基酸取代(例如，保守胺基酸取代)、不超過五個、四個、三個、兩個或一個胺基酸胺基酸之缺失或插入的CDRH。

在某些實施例中，抗CGRP受體結合域可包含表3A及3B中所列CDR之1、2、3、4、5或6種變異體形式，其各自具有與表3A及3B中所列CDR序列至少80%、85%、90%或95%序列一致性。在一些實施例中，抗CGRP受體結合域包括表3A及3B中所列CDR之1、2、3、4、5或6者，其各自與此等表中所列CDR相差不超過1、2、3、4或5個胺基酸。

在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、122及127之序列；(e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：112、14及130之序列；(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：113、123及131之序列；(g)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：114、124及132之序列；(h)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：115、18及133之序列；(i)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：116、124及132之序列；(j)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：117、125及134之序列；(k)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：118、124及132之序列；或(l)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：119、126 及135之序列。

在其他特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、167及179之序列；(b)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、168及179之序列；(c)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及180之序列；(d)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及181之序列；(e)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、170及182之序列；(f)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、171及182之序列；(g)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、172及179之序列；(h)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：162、173及183之序列；(i)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：163、174及184之序列；(j)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、175及185之序列；(k)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：164、176及186之序列；(l)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：165、177及187之序列；(m)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：166、178及188之序列；或(n)CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及189之序列。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3；以及重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、167及179之序列； (b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、168及179之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及180之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及181之序列；(e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、170及182之序列；(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、171及182之序列；(g)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、122及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、172及179之序列；(h)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：112、14及130之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：162、173及183之序列；(i)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：113、123及131之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：163、174及184之序列；(j)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：114、124及132之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、175 及185之序列；(k)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：115、18及133之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：164、176及186之序列；(l)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：116、124及132之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、175及185之序列；(m)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：117、125及134之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：165、177及187之序列；(n)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：118、124及132之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、175及185之序列；(o)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：119、126及135之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：166、178及188之序列；或(p)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及189之序列。

在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含CDRL1、CDRL2及CDRL3；以及重鏈可變區，該重鏈可變區包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、167及179之序列； (b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、168及179之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及180之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及181之序列；(e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、170及182之序列；或(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、171及182之序列。

本發明之抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域可包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區選自由如表3A所示的LV-101、LV-102、LV-103、LV-104、LV-105、LV-106、LV-107、LV-108、LV-109、LV-110、LV-111、LV-112、LV-113、LV-114、LV-115、LV-116、LV-117、LV-118、LV-119、LV-120、LV-121、LV-122及LV-123組成之群；以及/或重鏈可變區，該重鏈可變區選自由如表3B所示的HV-101、HV-102、HV-103、HV-104、HV-105、HV-106、HV-107、HV-108、HV-109、HV-110、HV-111、HV-112、HV-113、HV-114、HV-115、HV-116、HV-117、HV-118、HV-119、HV-120及HV-121組成之群；以及此等輕鏈可變區及重鏈可變區之功能片段、衍生物、突變蛋白質及變異體。

表3A中所列的輕鏈可變區中之每一者可與表3B中所示的重鏈可變區中之任何者組合，以形成適用於併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質中之抗CGRP受體結合域。此等組合之實例包括但不限於：LV-101及HV-101；LV-102及HV-102；LV-103及HV-103；LV-104及HV-104；LV-105及HV-105；LV-106及HV-106；LV-105及HV-107；LV-106及HV-108；LV-107及HV-105；LV-108及HV-106；LV-109及HV-105；LV-110及HV-106；LV-107及HV-107；LV-108及HV-108；LV-111及HV-109；LV-112及HV-110；LV-111及HV-111；LV-112及HV-112；LV-113及HV-105；LV-114及HV-113；LV-115及HV-114；LV-116及HV-115；LV-117及HV-116；LV-118及HV-117；LV-119及HV-116；LV-120及HV-105；LV-121及HV-118；LV-122及HV-116；LV-123及HV-119；LV-101及HV-120；以及LV-107及HV-121。在某些實施例中，抗CGRP受體結合域包含：(a)LV-101(SEQ ID NO：136)及HV-101(SEQ ID NO：190)；(b)LV-103(SEQ ID NO：138)及HV-103(SEQ ID NO：192)；(c)LV-105(SEQ ID NO：140)及HV-105(SEQ ID NO：194)；(d)LV-105(SEQ ID NO：140)及HV-107(SEQ ID NO：196)；(e)LV-107(SEQ ID NO：142)及HV-105(SEQ ID NO：194)；(f)LV-109(SEQ ID NO：144)及HV-105(SEQ ID NO：194)；(g)LV-107(SEQ ID NO：142)及HV-107(SEQ ID NO：196)；(h)LV-111(SEQ ID NO：146)及HV-109(SEQ ID NO：198)；或(i)LV-111(SEQ ID NO：146)及HV-111(SEQ ID NO：200)。

在一些實施例中，抗CGRP受體結合域包含：輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含鄰接胺基酸之序列，該序列僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處不同於表3A中之輕鏈可變區之序列，亦即選自LV-101、LV-102、LV-103、LV-104、LV-105、LV-106、LV-107、LV-108、LV-109、LV-110、LV-111、LV-112、LV-113、LV-114、LV-115、LV-116、LV-117、LV-118、LV-119、LV-120、LV-121、LV-122及LV-123之VL，其中每一此種序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中缺失、插入及/或取代產生相對於先前可變域序列而言不超過15個胺基酸之改變。一些抗CGRP結合域中之輕鏈可變區包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：136-158之胺基酸序列(亦即，表3A中之輕鏈可變區)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

在此等及其他實施例中，抗CGRP受體結合域包含：重鏈可變區，該重鏈可變區包含鄰接胺基酸之序列，該序列僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基處不同於表3B中之重鏈可變區之序列，亦即選自HV-101、HV-102、HV-103、HV-104、HV-105、HV-106、HV-107、HV-108、HV-109、HV-110、HV-111、HV-112、HV-113、HV-114、HV-115、HV-116、HV-117、HV-118、HV-119、HV-120及HV-121之VH，其中每一此種序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代，其中缺失、插入及/或取代產生相對於先前可變域序列而言不超過15個胺基酸之改變。一些抗CGRP受體結合域中之重鏈可變區包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：190-210之胺基酸序列(亦即，表3B中之重鏈可變區)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為抗體。如本文所使用，術語「抗體」係指四聚免疫球蛋白蛋白質包含兩個輕鏈多肽(各自為約25kDa)及兩個重鏈多肽(各自為約50-70kDa)。術語「輕鏈」或「免疫球蛋白輕鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白輕鏈可變區(VL)及單一免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)之多肽。免疫球蛋白輕鏈恆定域(CL)可為卡帕(κ)或拉目達(λ)。術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」係指自胺基末端至羧基末端包含單一免疫球蛋白重鏈可變區(VH)、免疫球蛋白重鏈恆定域1(CH1)、免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白重鏈恆定域2(CH2)、免疫球蛋白重鏈恆定域3(CH3)及視情況免疫球蛋白重鏈恆定域4(CH4)之多肽。重鏈係分類為牟(μ)、德爾塔(Δ)、伽馬(γ)、阿爾法(α)及埃普西隆(ε)，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG類及IgA類抗體進一步分別分成子類，即IgG1、IgG2、IgG3及IgG4、以及IgA1及IgA2。IgG、IgA及IgD中之重鏈具有三個域(CH1、CH2及CH3)，且IgM及IgE抗體中之重鏈具有四個域(CH1、CH2、CH3及CH4)。免疫球蛋白重鏈恆定域可來自任何免疫球蛋白同型，包括亞型。抗體鏈經由C1域與CH1域之間(亦即，輕鏈與重鏈之間)及抗體重鏈之鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起。

在特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為異源二聚抗體(在本文中可與「異源免疫球蛋白」或「異源Ig」互換使用)，其係指兩個不同輕鏈及兩個不同重鏈之抗體。例如，在一些實施例中，異源二聚抗體包含來自抗PAC1受體抗體之輕鏈及重鏈及來自抗CGRP受體抗體之輕鏈及重鏈。參見圖1。

異源二聚抗體可包含任何免疫球蛋白恆定區。如本文所使用的術語「恆定區」係指抗體中不同於可變區之所有域。恆定區不直接涉及抗原之結合，但展現各種效應物功能。如上所述，抗體取決於其重鏈之恆定區之胺基酸序列而分成特定同型(IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及亞型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2)。輕鏈恆定區可為例如κ或λ型輕鏈恆定區，例如人類κ或λ型輕鏈恆定區，其可在所有五種抗體同型中發現。人類免疫球蛋白輕鏈恆定區序列之實例在下表中展示。

異源二聚抗體之重鏈恆定區可為例如α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區，例如人類α、δ、ε、γ或μ型重鏈恆定區。在一些實施例中，異源二聚抗體包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白之重鏈恆定區。在一個實施例中，異源二聚抗體包含來自人類IgG1免疫球蛋白之重鏈恆定區。在另一實施例中，異源二聚抗體包含來自人類IgG2免疫球蛋白之重鏈恆定區。人類IgG1及IgG2重鏈恆定區序列之實例在以下表5中展示。

表1A、1B、3A及3B中揭示的可變區中之每一者可附接至以上輕鏈及重鏈恆定區，以分別形成完整抗體輕鏈及重鏈。另外，如此產生的重鏈多肽及輕鏈多肽中之每一者可經組合以形成完整雙特異性抗體結構，例如異源二聚抗體。應理解，本文中提供的重鏈可變區及輕鏈可變區亦可附接至其他恆定域，該等恆定域具有與以上所列示範性序列不同的序列。

為促進來自抗PAC1受體抗體之輕鏈及重鏈與來自抗CGRP受體抗體之輕鏈及重鏈裝配成雙特異性、異源二聚抗體，來自每一抗體之輕鏈及/或重鏈可經工程改造以減少錯誤配對分子之形成。例如，經由同源二聚物形成來促進異源二聚物形成之一種方法為所謂的「凸結入孔中」方法，該方法涉及將突變引入兩個不同抗體重鏈之CH3域的接觸介面處。確切而言，一個重鏈中之一或多個整體胺基酸用具有短側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸或蘇胺酸)置換以產生「孔」，且具有大側鏈之一或多個胺基酸(例如，酪胺酸或色胺酸)係引入其他重鏈中以產生「凸結」。當經修飾重鏈獲共同表現時，相較於同源二聚物(孔-孔或凸結-凸結)而言，形成較大百分比之異源二聚物(凸結-孔)。「凸結入孔中」方法詳細地描述於WO 96/027011；Ridgway等人，Protein Eng.，第9卷：617-621,1996；以及Merchant等人，Nat,Biotechnol.，第16卷：677-681,1998，其全部據此以全文引用方式併入。

用於促進異源二聚物形成以排除同源二聚物形成之另一種方法需要利用靜電轉向機構(參見Gunasekaran等人，J.Biol.Chem.，第285卷：19637-19646,2010，其據此以全文引用方式併入)。此方法涉及在每一重鏈中之CH3域中引入或引出帶電殘基，以便兩個不同重鏈經由引起靜電吸引之相反電荷締合。相同重鏈之同源二聚化為不利的，因為相同重鏈具有相同帶電並因此相排斥。此相同靜電轉向技術可用於藉由在正確輕鏈-重鏈對中結合介面處引入具有相反電荷之殘基而防止輕鏈與非同源重鏈之錯誤配對。用於促進異源二聚物及正確輕鏈/重鏈配對之靜電轉向技術及適合電荷對突變描述於WO2009089004及WO2014081955中，兩者據此以全文引用方式併入。

在其中本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為異源二聚抗體之實施例中，其中該等異源二聚抗體包含來自特異地結合至人類CGRP受體之第一抗體的第一輕鏈(LC1)及第一重鏈(HC1)以及來自特異地結合至人類PAC1受體之第二抗體的第二輕鏈(LC2)及第二重鏈(HC2)，HC1或HC2可包含一或多個胺基酸取代以用帶負電胺基酸置換帶正電胺基酸。例如，在一個實施例中，HC1之CH3域或HC2之CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶正電胺基酸(例如，離胺酸、組胺酸及精胺酸)用一或多個帶負電胺基酸(例如，天冬胺酸及麩胺酸)置換。在此等及其他實施例中，在選自370、392及409(EU編號系統)之一或多個位置處的胺基酸(例如離胺酸)用帶負電胺基酸(例如，天冬胺酸及麩胺酸)置換。除非另外指示，否則貫穿本說明書及申請專利範圍，免疫球蛋白重鏈或輕鏈中殘基之編號係根據Kabat-EU編號，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所述。胺基酸序列中之胺基酸取代在本文中典型地用針對胺基酸殘基之特定位置中的一個字母縮寫、繼之以相對於所關注原始序列之數值胺基酸位置、再繼之以針對胺基酸殘基取代的一個字母符號來指定。例如，「T30D」符號表示了在相對於所關注原始序列之胺基酸位置30處藉由天冬胺酸殘基取代蘇胺酸殘基。另舉一例，「S218G」符號表示了在相對於所關注胺基酸序列之胺基酸位置218處藉由甘胺酸殘基取代絲胺酸殘基。

在某些實施例中，異源二聚抗體之HC1或HC2可包含一或多個胺基酸取代，以用帶正電胺基酸置換帶負電胺基酸。例如，在一個實施例中，HC1之CH3域或HC2之CH3域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型人類IgG胺基酸序列中在CH3域中之相應位置處之一或多個帶負電胺基酸用一或多個帶正電胺基酸置換。在此等及其他實施例中，在選自CH3域之356、357及399(EU編號系統)之一或多個位置處的胺基酸(例如，天冬胺酸或麩胺酸)用帶正電胺基酸(例如，離胺酸、組胺酸及精胺酸)置換。

在特定實施例中，異源二聚抗體包含：第一重鏈，該第一重鏈在位置392及409處包含帶負電胺基酸(例如，K392D及K409D取代)；以及第二重鏈，該第二重鏈包含在位置356及399處之帶正電胺基酸(例如，E356K及D399K取代)。在其他特定實施例中，異源二聚抗體包含：第一重鏈，該第一重鏈在位置392、409及370處包含帶負電胺基酸(例如，K392D、K409D及K370D取代)；以及第二重鏈，該第二重鏈包含在位置356、399及357處之帶正電胺基酸(例如，E356K、D399K及E357K取代)。在相關實施例中，第一重鏈來自抗CGRP受體抗體，且第二重鏈來自抗PAC1受體抗體。在其他相關實施例中，第一重鏈來自抗PAC1受體抗體，且第二重鏈來自抗CGRP受體抗體。

為促進特定重鏈與其同源輕鏈之締合，重鏈與輕鏈兩者可含有互補胺基酸取代。如本文所使用，「互補胺基酸取代」係指一個鏈中對帶正電胺基酸之取代與另一鏈中之帶負電胺基酸取代配對。例如，在一些實施例中，重鏈包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，且相應輕鏈包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，其中引入重鏈中之帶電胺基酸具有與引入輕鏈中之胺基酸相反的電荷。在某些實施例中，一或多個帶正電殘基(例如，離胺酸、組胺酸或精胺酸)可引入第一輕鏈(LC1)中，且一或多個帶負電殘基(例如，天冬胺酸或麩胺酸)可引入伴隨重鏈(HC1)中，在LC1/HC1之結合介面處進入，而一或多個帶負電殘基(例如，天冬胺酸或麩胺酸)可引入第二輕鏈(LC2)中，且一或多個帶正電殘基(例如，離胺酸、組胺酸或精胺酸)可引入伴隨重鏈(HC2)中，在LC2/HC2之結合介面處引入。靜電相互作用將導引LC1與HC1配對，且導引LC2與HC2配對，因為介面處之相反帶電殘基(極性)相吸引。在介面(例如，LC1/HC2及LC2/HC1)處具有相同帶電殘基(極性)之重鏈/輕鏈對將相排斥，從而造成對非所需HC/LC配對之抑止。

在此等及其他實施例中，重鏈之CH1域或輕鏈之CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電胺基酸用一或多個帶負電胺基酸置換。替代地，重鏈之CH1域或輕鏈之CL域包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電胺基酸用一或多個帶正電胺基酸置換。在一些實施例中，異源二聚抗體中之第一重鏈及/或第二重鏈之CH1域中在選自F126、P127、L128、A141、L145、K147、D148、H168、F170、P171、V173、Q175、S176、S183、V185及K213之EU位置處的一或多個胺基酸用帶電胺基酸置換。在某些實施例中，供用帶負電或帶正電胺基酸進行取代之一較佳殘基為S183(EU編號系統)。在一些實施例中，S183用帶正電胺基酸取代。在替代實施例中，S183用帶負電胺基酸取代。例如，在一個實施例中，S183在第一重鏈中用帶負電胺基酸(例如，S183E)代替，且S183在第二重鏈中用帶正電胺基酸(例如，S183K)取代。

在其中輕鏈為κ輕鏈之實施例中，異源二聚抗體中之第一輕鏈及/或第二輕鏈之CL域中在選自F116、F118、S121、D122、E123、Q124、S131、V133、L135、N137、N138、Q160、S162、T164、S174及S176之位置(κ輕鏈中之EU及Kabat編號)處的一或多個胺基酸用帶電胺基酸置換。在其中輕鏈為λ輕鏈之實施例中，異源二聚抗體中之第一輕鏈及/或第二輕鏈之CL域中在選自T116、F118、S121、E123、E124、K129、 T131、V133、L135、S137、E160、T162、S165、Q167、A174、S176及Y178之位置(λ鏈中之Kabat編號)處的一或多個胺基酸用帶電胺基酸置換。在一些實施例中，供用帶負電或帶正電胺基酸進行取代之一較佳殘基為κ輕鏈或λ輕鏈之CL域之S176(EU及Kabat編號系統)。在某些實施例中，CL域之S176用帶正電胺基酸置換。在替代實施例中，CL域之S176用帶負電胺基酸置換。在一個實施例中，S176在第一輕鏈中用帶正電胺基酸(例如，S176K)取代，且S176在第二輕鏈中用帶負電胺基酸(例如，S176E)取代。

除CH1及CL域中之互補胺基酸取代之外或作為對該互補胺基酸取代之替代，異源二聚抗體中之輕鏈及重鏈之可變區可含有一或多個互補胺基酸取代以引入帶電胺基酸。例如，在一些實施例中，異源二聚抗體之重鏈之VH區或輕鏈之VL區包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶正電胺基酸用一或多個帶負電胺基酸置換。替代地，重鏈之VH區或輕鏈之VL區包含不同於野生型IgG胺基酸序列之胺基酸序列，以使得野生型IgG胺基酸序列中之一或多個帶負電胺基酸用一或多個帶正電胺基酸置換。

VH區內的V區介面殘基(亦即，介導VH區及VL區之裝配的胺基酸殘基)包括Kabat位置1、3、35、37、39、43、44、45、46、47、50、59、89、91及93。VH區中之此等介面殘基中之一或多者可用帶電(帶正電或帶負電)胺基酸取代。在某些實施例中，第一重鏈及/或第二重鏈之VH區中Kabat位置39處之胺基酸取代為帶正電胺基酸，例如離胺酸。在替代實施例中，第一重鏈及/或第二重鏈之VH區中Kabat位置39處之胺基酸取代為帶負電胺基酸，例如麩胺酸。在一些實施例中，第一重鏈之VH區中Kabat位置39處之胺基酸取代為帶負電胺基酸(例如，G39E)，且第二重鏈之VH區中Kabat位置39處之胺基酸取代為帶正電胺基酸(例如，G39K)。在一些實施例中，第一重鏈及/或第二重鏈之VH區中Kabat位置44處之胺基酸取代為帶正電胺基酸，例如離胺酸。在替代實施例中，第一重鏈及/或第二重鏈之VH區中Kabat位置44處之胺基酸取代為帶負電胺基酸，例如麩胺酸。在某些實施例中，第一重鏈之VH區中Kabat位置44處之胺基酸取代為帶負電胺基酸(例如，G44E)，且第二重鏈之VH區中Kabat位置44處之胺基酸取代為帶正電胺基酸(例如，G44K)。

VL區內的V區介面殘基(亦即，介導VH區及VL區之裝配的胺基酸殘基)包括Kabat位置32、34、35、36、38、41、42、43、44、45、46、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、85、87、89、90、91及100。VL區中之一或多個介面殘基可用帶電胺基酸取代，該胺基酸較佳為具有與引入同源重鏈之VH區中之彼等胺基酸相反電荷的胺基酸。在一些實施例中，第一輕鏈及/或第二輕鏈之VL區中Kabat位置100處之胺基酸取代為帶正電胺基酸，例如離胺酸。在替代實施例中，第一輕鏈及/或第二輕鏈之VL區中Kabat位置100處之胺基酸取代為帶負電胺基酸，例如麩胺酸。在某些實施例中，第一輕鏈之VL區中Kabat位置100處之胺基酸取代為帶正電胺基酸(例如，G100K)，且第二輕鏈之VL區中Kabat位置100處之胺基酸取代為帶負電胺基酸(例如，G100E)。

在某些實施例中，本發明之異源二聚抗體包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈，其中第一重鏈包含在位置44(Kabat)、183(EU)、392(EU)及409(EU)處之胺基酸取代，其中第二重鏈包含在位置44(Kabat)、183(EU)、356(EU)及399(EU)處之胺基酸取代，其中第一輕鏈及第二輕鏈包含在位置100(Kabat)及176(EU)處之胺基酸取代，且其中胺基酸取代在該等位置處引入帶電胺基酸。在相關實施例中，第一重鏈之位置44(Kabat)處之甘胺酸用麩胺酸置換，第二重鏈之位置44(Kabat)處之甘胺酸用離胺酸置換，第一輕鏈之位置100(Kabat)處之甘胺酸用離胺酸置換，第二輕鏈之位置100(Kabat)處之甘胺酸用麩胺酸置換，第一輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置392(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第一重鏈之位置409(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第二重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二重鏈之位置356(EU)處之麩胺酸用離胺酸置換，及/或第二重鏈之位置399(EU)處之天冬胺酸用離胺酸置換。

在其他實施例中，本發明之異源二聚抗體包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈，其中第一重鏈包含在位置位置183(EU)、392(EU)及409(EU)處之胺基酸取代，其中第二重鏈包含在位置183(EU)、356(EU)及399(EU)處之胺基酸取代，其中第一輕鏈及第二輕鏈包含在位置176(EU)處之胺基酸取代，且其中胺基酸取代在該等位置處引入帶電胺基酸。在相關實施例中，第一輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置392(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第一重鏈之位置409(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第二重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二重鏈之位置356(EU)處之麩胺酸用離胺酸置換，及/或第二重鏈之位置399(EU)處之天冬胺酸用離胺酸置換。

在其他實施例中，本發明之異源二聚抗體包含第一重鏈及第二重鏈以及第一輕鏈及第二輕鏈，其中第一重鏈包含在位置位置183(EU)、392(EU)、409(EU)及370(EU)處之胺基酸取代，其中第二重鏈包含在位置183(EU)、356(EU)、399(EU)及357(EU)處之胺基酸取代，其中第一輕鏈及第二輕鏈包含在位置176(EU)處之胺基酸取代，且其中胺基酸取代在該等位置處引入帶電胺基酸。在相關實施例中，第一輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二輕鏈之位置176(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用麩胺酸置換，第一重鏈之位置392(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第一重鏈之位置409(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第一重鏈之位置370(EU)處之離胺酸用天冬胺酸置換，第二重鏈之位置183(EU)處之絲胺酸用離胺酸置換，第二重鏈之位置356(EU)處之麩胺酸用離胺酸置換，第二重鏈之位置399(EU)處之天冬胺酸用離胺酸置換，及/或第二重鏈之位置357(EU)處之麩胺酸用離胺酸置換。

本文所述的任何恆定域、抗PAC1受體可變區及抗CGRP受體可變區可經修飾以含有以上所述的電荷對突變中之一或多者，以促進異源二聚抗體之正確裝配。來自含有適用於本發明之異源二聚抗體之一或多個電荷對突變的抗PAC1受體抗體之示範性全長輕鏈序列及全長重鏈序列分別在表6A及表6B中展示。

在一些實施例中，本發明之異源二聚抗體包含來自表6A之抗PAC1受體輕鏈及來自表6B之抗PAC1受體重鏈。可併入異源二聚抗體中之抗PAC1受體輕鏈及重鏈之示範性對包括但不限於：LC-01(SEQ ID NO：211)及HC-01(SEQ ID NO：233)；LC-02(SEQ ID NO：212)及HC-02(SEQ ID NO：234)；LC-01(SEQ ID NO：211)及HC-03(SEQ ID NO：235)；LC-01(SEQ ID NO：211)及HC-04(SEQ ID NO：236)；LC-03(SEQ ID NO：213)及HC-01(SEQ ID NO：233)；LC-03(SEQ ID NO：213)及HC-03(SEQ ID NO：235)；LC-04(SEQ ID NO：214)及HC-05(SEQ ID NO：237)；LC-05(SEQ ID NO：215)及HC-06(SEQ ID NO：238)；LC-04(SEQ ID NO：214)及HC-07(SEQ ID NO：239)；LC-04(SEQ ID NO：214)及HC-08(SEQ ID NO：240)；LC-06(SEQ ID NO：216)及HC-09(SEQ ID NO：241)；LC-07(SEQ ID NO：217)及HC-10(SEQ ID NO：242)；LC-06(SEQ ID NO：216)及HC-11(SEQ ID NO：243)；LC-06(SEQ ID NO：216)及HC-12(SEQ ID NO：244)；LC-08(SEQ ID NO：218)及HC-13(SEQ ID NO：245)；LC-09(SEQ ID NO：219)及HC-14(SEQ ID NO：246)；LC-08(SEQ ID NO：218)及HC-15(SEQ ID NO：247)；LC-08(SEQ ID NO：218)及HC-16(SEQ ID NO：248)；LC-10(SEQ ID NO：220)及HC-17(SEQ ID NO：249)；LC-11(SEQ ID NO：221)及HC-18(SEQ ID NO：250)；以及LC-10(SEQ ID NO：220)及HC-19(SEQ ID NO：251)。

併入本發明之異源二聚抗體中之抗PAC1受體輕鏈及/或重鏈可包含鄰接胺基酸之序列，該序列與表6A中之輕鏈或表6B中之重鏈之序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或15個以上胺基酸殘基，其中每一此序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代。在一些實施例中，併入異源二聚抗體中之抗PAC1受體輕鏈包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：211-221之胺基酸序列(亦即，表6A中之抗PAC1受體輕鏈)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。在某些實施例中，併入異源二聚抗體中之抗PAC1受體重鏈包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：233-251之胺基酸序列(亦即，表6B中之抗PAC1受體重鏈)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

來自含有適用於本發明之異源二聚抗體之一或多個電荷對突變的抗CGRP受體抗體之示範性全長輕鏈序列及全長重鏈序列分別在表7A及表7B中展示。

表7B. 示範性抗CGRP受體重鏈序列

在一些實施例中，本發明之異源二聚抗體包含來自表7A之抗CGRP受體輕鏈及來自表7B之抗CGRP受體重鏈。可併入異源二聚抗體中之抗CGRP受體輕鏈及重鏈之示範性對包括但不限於：LC-101(SEQ ID NO：271)及HC-101(SEQ ID NO：295)；LC-102(SEQ ID NO：272)及HC-102(SEQ ID NO：296)；LC-101(SEQ ID NO：271)及HC-103(SEQ ID NO：297)；LC-101(SEQ ID NO：271)及HC-104(SEQ ID NO：298)；LC-103(SEQ ID NO：273)及HC-105(SEQ ID NO：299)；LC-104(SEQ ID NO：274)及HC-106(SEQ ID NO：300)；LC-103(SEQ ID NO：273)及HC-107(SEQ ID NO：301)；LC-103(SEQ ID NO：273)及HC-108(SEQ ID NO：302)；LC-105(SEQ ID NO：275)及HC-109(SEQ ID NO：303)；LC-106(SEQ ID NO：276)及HC-110(SEQ ID NO：304)；LC-105(SEQ ID NO：275)及HC-111(SEQ ID NO：305)；LC-105(SEQ ID NO：275)及HC-112(SEQ ID NO：306)；LC-105(SEQ ID NO：275)及HC-113(SEQ ID NO：307)；LC-106(SEQ ID NO：276)及HC-114(SEQ ID NO：308)；LC-105(SEQ ID NO：275)及HC-115(SEQ ID NO：309)；LC-107(SEQ ID NO：277)及HC-109(SEQ ID NO：303)；LC-108(SEQ ID NO：278)及HC-110(SEQ ID NO：304)；LC-107(SEQ ID NO：277)及HC-111(SEQ ID NO：305)；LC-109(SEQ ID NO：279)及HC-109(SEQ ID NO：303)；LC-110(SEQ ID NO：280)及HC-110(SEQ ID NO：304)；LC-109(SEQ ID NO：279)及HC-111(SEQ ID NO：305)；LC-107(SEQ ID NO：277)及HC-113(SEQ ID NO：307)；LC-108(SEQ ID NO：278)及HC-114(SEQ ID NO：308)；LC-107(SEQ ID NO：277)及HC-115(SEQ ID NO：309)；LC-111(SEQ ID NO：281)及HC-116(SEQ ID NO：310)；LC-112(SEQ ID NO：282)及HC-117(SEQ ID NO：311)；LC-111(SEQ ID NO：281)及HC-118(SEQ ID NO：312)；LC-111(SEQ ID NO：281)及HC-119(SEQ ID NO：313)；LC-111(SEQ ID NO：281)及HC-120(SEQ ID NO：314)；LC-112(SEQ ID NO：282)及HC-121(SEQ ID NO：315)；以及LC-111(SEQ ID NO：281)及HC-122(SEQ ID NO：316)。

併入本發明之異源二聚抗體中之抗CGRP受體輕鏈及/或重鏈可包含鄰接胺基酸之序列，該序列與表7A中之輕鏈或表7B中之重鏈之序列相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或15個以上胺基酸殘基，其中每一此序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代。在一些實施例中，併入異源二聚抗體中之抗CGRP受體輕鏈包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：271-282之胺基酸序列(亦即，表7A中之抗CGRP受體輕鏈)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。在某些實施例中，併入異源二聚抗體中之抗CGRP受體重鏈包含胺基酸之序列，該序列具有與SEQ ID NO：295-316之胺基酸序列(亦即，表7B中之抗CGRP受體重鏈)至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%序列一致性。

表6A及6B中所列任何抗PAC1受體輕鏈及重鏈可與表7A及7B中所列任何抗CGRP受體輕鏈及重鏈組合，以形成本發明之雙特異性、異源二聚抗體。本發明之示範性雙特異性、異源二聚抗體的結構特微(例如，抗PAC1受體輕鏈及重鏈及抗CGRP受體輕鏈及重鏈之組分)在以下表8中列明。此等抗體含有如本文所述的一或多個電荷對突變以促進重鏈及輕鏈之正確配對，以及抗PAC1受體重鏈與抗CGRP受體重鏈之間的異源二聚化。具有「A」名稱之抗體包含圖1中所示的「v1」靜電轉向策略，且具有「B」名稱之抗體包含圖1中所示的「v3」靜電轉向策略。具有「C」或「D」名稱之抗體包含圖1中所示的「v4」靜電轉向策略，其中「C」抗體具有IgG1恆定域，且「D」抗體具有IgG2恆定域。表8中之可變輕鏈及重鏈名稱(例如，LV-01、LV-02、LV-101、LV-102、HV-01、HV-02、HV-101、HV-102等等)藉由表1A、1B、3A及3B中之胺基酸序列及表11及12中之核苷酸序列來定義。表8中之輕鏈及重鏈名稱(LC-01、LC-02、LC-101、LC-102、HC-01、HC-02、HC-101、HC-102 等等)藉由表6A、6B、7A及7B中之胺基酸及核苷酸序列來定義。因此，表8中之示範性異源二聚抗體之四個鏈中之每一者的完全序列資訊可藉由交互參照此等表來獲得。舉例說明，異源二聚抗體iPS：326417包含：抗PAC1受體輕鏈，該抗PAC1受體輕鏈包含SEQ ID NO：211(LC-01)之胺基酸序列；抗PAC1受體重鏈，該抗PAC1受體重鏈包含SEQ ID NO：233(HC-01)之胺基酸序列；抗CGRP受體輕鏈，該抗CGRP受體輕鏈包含SEQ ID NO：281(LC-111)之胺基酸序列；以及抗CGRP受體重鏈，該抗CGRP受體重鏈包含SEQ ID NO：310(HC-116)之胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為異源二聚抗體，其選自如表8中列明的命名為以下者之抗體：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、 iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、 iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050或iPS：328051。在一些實施例中，異源二聚抗體為選自如表8中列明的命名為以下者之抗體的抗體：iPS：327730、iPS：327680、iPS：328001、iPS：327741、iPS：326648、iPS：327689、iPS：327111、iPS：327742、iPS：327698、iPS：327272、iPS：327717、iPS：327702、iPS：327270、iPS：327026、iPS：327112、iPS：327283、iPS：327688或iPS：327714。在其他實施例中，異源二聚抗體為選自如表8中列明的命名為以下者之抗體的抗體：iPS：327730、iPS：327680、iPS：328001、iPS：327741、iPS：326648、iPS：327689、iPS：327111、iPS：327742、iPS：327698、iPS：327272、iPS：327717、iPS：327702或iPS：327270。在特定實施例中，異源二聚抗體為如表8中列明的命名為以下者之抗體：iPS：327689或iPS：327742。

本發明之異源二聚抗體亦涵蓋包含本文所述的重鏈及/或輕鏈之抗體，其中相對於表6A、6B、7A及7B中列明的重鏈及輕鏈中之任何一者而言，一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸殘基自N末端或C末端或兩者缺少，例如，此歸因於由表現抗體之寄主細胞類型所產生的轉譯後修飾。例如，中國倉鼠卵巢(CHO)常常裂解脫離來自抗體重鏈之C末端離胺酸。

在某些實施例中，本發明之抗原結合蛋白質包含：(i)特異地結合至人類CGRP受體之第一結合域，(ii)特異地結合至人類PAC1受體之第二結合域，以及(iii)人類免疫球蛋白Fc區，其中結合域之一定位於Fc區之胺基末端處，且另一結合域定位於Fc區之羧基末端處。在一些此等實施例中，第一結合域及第二結合域中之每一者包含免疫球蛋白可變區。例如，在某些實施例中，第一結合域包含來自抗CGRP受體抗體之第一輕鏈可變區(VL1)及第一重鏈可變區(VH1)，且第二結合域包含來自抗PAC1受體抗體之第二輕鏈可變區(VL2)及第二重鏈可變區(VH2)。

如本文所使用，術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈之C末端區，其可藉由完整抗體之木瓜酶消化來產生。免疫球蛋白之Fc區通常包含兩個恆定域、CH2域及CH3域，且視情況包含CH4域。在某些實施例中，Fc區為來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白之Fc區。在一些實施例中，Fc區包含來自人類IgG1或人類IgG2免疫球蛋白之CH2及CH3域。Fc區可保持效應物功能，諸如C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)及吞噬作用。在其他實施例中，Fc區可經修飾以減少或消除如在本文中更詳細描述的效應物功能。

在本發明之抗原結合蛋白質之一些實施例中，定位於Fc區之羧基末端處的結合域(亦即，羧基末端結合域)為scFv。在某些實施例中，scFv包含藉由肽連接子連接的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)。可變區可以VH-VL或VL-VH定向而定向於scFv內。例如，在一個實施例中，scFv自N末端至C末端包含VH區、肽連接子及VL區。在另一實施例中，scFv自N末端至C末端包含VL區、肽連接子及VH區。scFv之VH區及VL區可含有一或多個半胱胺酸取代，以允許在VH區與VL區之間的二硫鍵形成。此等半胱胺酸夾使抗原結合組態中之兩個可變域穩定。在一個實施例中，VH區中之位置44(Kabat編號)及VL區中之位置100(Kabat編號)各自用半胱胺酸殘基取代。

在某些實施例中，scFv經由肽連接子以其胺基末端融合或以其他方式連接在Fc區之羧基末端(例如，CH3域之羧基末端)。因此，在一個實施例中，scFv融合至Fc區，以使得所得融合蛋白質自N末端至C末端包含CH2域、CH3域、第一肽連接子、VH區、第二肽連接子及VL區。在另一實施例中，scFv融合至Fc區，以使得所得融合蛋白質自N末端至C末端包含CH2域、CH3域、第一肽連接子、VL區、第二肽連接子及VH區。「融合蛋白質」為包括來源於一個以上親本蛋白質或多肽之多肽組分的蛋白質。典型地，融合蛋白質自融合基因表現，其中編碼來自一種蛋白質之多肽序列的核苷酸序列與編碼來自不同蛋白質之多肽序列的核苷酸序列同框附連，且視情況藉由連接子來分離。融合基因可隨後藉由重組寄主細胞表現，以產生單一融合蛋白質。

「肽連接子」係指將一個多肽共價地接合至另一多肽的具有約2至約50個胺基酸之寡肽。肽連接子可用於連接scFv內之VH域及VL域。肽連接子亦可用於將scFv、Fab片段或其他功能抗體片段連接至Fc區之胺基末端或羧基末端，以產生本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。較佳地，肽連接子為長度至少5個胺基酸。在某些實施例中，肽連接子為長度約5個胺基酸至長度約40個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子為長度約8個胺基酸至長度約30個胺基酸。在其他實施例中，肽連接子為長度約10個胺基酸至長度約20個胺基酸。

較佳而非必需地，肽連接子包含二十種典型胺基酸中之胺基酸，尤其為半胱胺酸、甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸及/或絲胺酸。在某些實施例中，肽連接子包含大多數空間位阻胺基酸，諸如甘胺酸、絲胺酸及丙胺酸。因此，在一些實施例中較佳的連接子包括聚甘胺酸、聚絲胺酸及聚丙胺酸，或此等連接子中任何者之組合。一些示範性肽連接子包括但不限於聚(Gly)_2-8 (SEQ ID NO：642)，尤其為(Gly)₃ 、(Gly)₄ (SEQ ID NO：362)、(Gly)₅ (SEQ ID NO：363)及(Gly)₇ (SEQ ID NO：364)，以及聚(Gly)₄ Ser(SEQ ID NO：365)、聚(Gly-Ala)_2-4 (SEQ ID NO：643)及聚(Ala)_2-8 (SEQ ID NO：644)。在某些實施例中，肽連接子為(Gly_x Ser)_n ，其中x=3或4，且n=2、3、4、5或6(SEQ ID NO：645)。此等肽連接子包括「L5」(GGGGS；或「G₄ S」；SEQ ID NO：366)、「L9」(GGGSGGGGS；或「G₃ SG₄ S」；SEQ ID NO：367)、「L10」(GGGGSGGGGS；或「(G₄ S)₂ 」；SEQ ID NO：368)、「L15」(GGGGSGGGGSGGGGS；或「(G₄ S)₃ 」；SEQ ID NO：369)及「L25」(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；或「(G₄ S)₅ 」；SEQ ID NO：370)。在一些實施例中，接合scFv內之VH區及VL區之肽連接子為L15或(G₄ S)₃ 連接子(SEQ ID NO：369)。在此等及其他實施例中，將羧基末端結合域(例如，scFv或Fab)接合至Fc區之C末端之肽連接子為L9或G₃ SG₄ S連接子(SEQ ID NO：367)或L10(G₄ S)₂ 連接子(SEQ ID NO：368)。

可用於本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之肽連接子的其他特定實例包括(Gly)₅ Lys(SEQ ID NO：371)；(Gly)₅ LysArg(SEQ ID NO：372)；(Gly)₃ Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO：373)；(Gly)₃ AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO：374)；(Gly)₃ Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO：375)；GlyProAsnGlyGly(SEQ ID NO：376)；GGEGGG(SEQ ID NO：377)；GGEEEGGG(SEQ ID NO：378)；GEEEG(SEQ ID NO：379)；GEEE(SEQ ID NO：380)；GGDGGG(SEQ ID NO：381)；GGDDDGG(SEQ ID NO：382)；GDDDG(SEQ ID NO：383)；GDDD(SEQ ID NO：384)；GGGGSDDSDEGSDGEDGGGGS(SEQ ID NO：385)；WEWEW(SEQ ID NO：386)；FEFEF(SEQ ID NO：387)；EEEWWW(SEQ ID NO：388)；EEEFFF(SEQ ID NO：389)；WWEEEWW(SEQ ID NO：390)；以及FFEEEFF(SEQ ID NO：391)。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之某些實施例中，定位於Fc區之胺基末端處的結合域(亦即，胺基末端結合域)為經由本文所述的肽連接子或經由免疫球蛋白鉸鏈區融合至Fc區之胺基末端的Fab片段。「免疫球蛋白鉸鏈區」係指連接免疫球蛋白重鏈之CH1域及CH2域之胺基酸序列。人類IgG1之鉸鏈區總體上定義為約Glu216或約Cys226至約Pro230之胺基酸序列。其他IgG同型之鉸鏈區可藉由將形成重鏈間二硫鍵之第一半胱胺酸殘基及最後半胱胺酸殘基置放於同一位置中來與IgG1序列比對，且對熟習此項技術者而言為可測定的。在一些實施例中，胺基末端結合域經由人類IgG1鉸鏈區接合至Fc區之胺基末端。在其他實施例中，胺基末端結合域經由人類IgG2鉸鏈區接合至Fc區之胺基末端。較佳地，胺基末端結合域(例如，Fab片段)經由Fab之CH1區之羧基末端融合至Fc區。

在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含特異地結合至第一標靶(例如，人類CGRP受體或人類PAC1受體)之第一抗體，其中包含來自特異地結合至第二標靶(例如，人類CGRP受體或人類PAC1受體)之第二抗體的可變域之scFv融合至第一抗體之重鏈之羧基末端。此型式在本文中稱為「IgG-scFv」型式，且此種類型分子之一個實施例在圖2中示意地展示。因此，在某些實施例中，本發明包括雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其包含：(i)來自第一抗體之輕鏈及重鏈，以及(ii)包含來自第二抗體之VL區及VH區之scFv，其中scFv在其胺基末端處經由肽連接子融合至重鏈之羧基末端以形成經修飾重鏈，且其中第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，而另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。當二聚化時，雙特異性抗原結合蛋白質為包含兩個輕鏈及兩個經修飾重鏈之同源四聚物。

如本文所使用，術語「經修飾重鏈」係指包含免疫球蛋白重鏈、尤其為人類IgG1或人類IgG2重鏈及其功能抗體片段(例如，scFv、Fab)或部分(例如，免疫球蛋白輕鏈或Fd片段)之融合蛋白質，其中其片段或部分在其N末端處視情況經由肽連接子融合至重鏈之C末端。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG-scFv型式中，抗PAC1受體抗體可為第一抗體(亦即，「IgG」)或第二抗體(亦即，自其得到scFv)。類似地，抗CGRP受體抗體可為第一抗體(亦即，「IgG」)或第二抗體(亦即，自其得到scFv)。表1A及1B中列明的抗PAC1受體抗體可變區中之任何可變區可併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分或scFv組分中。表3A及3B中列明的抗CGRP受體抗體可變區中之任何可變區可併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分或scFv組分中。

呈IgG-scFv型式的本發明之示範性抗原結合蛋白質之輕鏈及經修飾重鏈的胺基酸序列概述於以下表9中。表之前一半中所列分子包含抗PAC1受體IgG組分及抗CGRP受體scFv，而表之後一半中所列分子包含抗CGRP受體IgG組分及抗PAC1受體scFv。

在某些實施例中，IgG-scFv雙特異性抗原結合蛋白質之第一抗體(亦即，IgG組分)為抗PAC1受體抗體，且第二抗體(亦即，自其得到scFv)為抗CGRP受體抗體。在此等實施例中，抗PAC1受體抗體包含來自表1A中所述任何彼等者之VL區，及來自表1B中所述任何彼等者之VH 區。例如，在一個實施例中，得到IgG組分之抗PAC1受體抗體包含LV-04(SEQ ID NO：31)VL區及HV-03(SEQ ID NO：85)VH區。

在其中scFv組分來源於抗CGRP受體抗體之實施例中，抗CGRP受體抗體可包含來自表3A中所述任何彼等者之VL區，及來自表3B中所述任何彼等者之VH區。在一個實施例中，抗CGRP受體scFv包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，抗CGRP受體scFv包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。在另一實施例中，抗CGRP受體scFv包含LV-107(SEQ ID NO：142)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，抗CGRP受體scFv包含LV-109(SEQ ID NO：144)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在又一實施例中，抗CGRP受體scFv包含LV-107(SEQ ID NO：142)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。

在其中雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分來源於抗PAC1受體抗體且scFv組分來源於抗CGRP受體抗體之實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：396至410之序列。在相關實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之輕鏈包含SEQ ID NO：392之序列。在某些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表9中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：386738、iPS：386764、iPS：386762、iPS：386760、iPS：386758、iPS：386756、iPS：386754、iPS：386752、iPS：386750、iPS：386748、iPS：386746、iPS：386744、iPS：386742、iPS：386740或iPS：386736。在其他實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表9中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：386738、iPS：386754、iPS：386750、iPS：386748、iPS：386746、iPS：386744、iPS：386740或iPS：386736。在其他實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表9中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：386744、iPS：386746或iPS：386748。

在本發明之其他實施例中，IgG-scFv雙特異性抗原結合蛋白質之第一抗體(亦即，IgG組分)為抗CGRP受體抗體，且第二抗體(亦即，自其得到scFv)為抗PAC1受體抗體。在此等實施例中，抗CGRP受體抗體包含來自表3A中所述任何彼等者之VL區，及來自表3B中所述任何彼等者之VH區。例如，在一個實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。在另一實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-107(SEQ ID NO：142)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-109(SEQ ID NO：144)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在又一實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-107(SEQ ID NO：142)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。

在其中scFv組分來源於抗PAC1受體抗體之實施例中，抗PAC1受體抗體可包含來自表1A中所述任何彼等者之VL區，及來自表1B中所述任何彼等者之VH區。在一個實施例中，抗PAC1受體scFv包含LV-04(SEQ ID NO：31)VL區及HV-03(SEQ ID NO：85)VH區。

在其中雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分來源於抗CGRP受體抗體且scFv組分來源於抗PAC1受體抗體之實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：411至425之序列。在相關實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之輕鏈包含選自SEQ ID NO：393至395之序列。在一個實施例中，經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：411至416之序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：393之序列。在另一實施例中，經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：417至421之序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：394之序列。在另一實施例中，經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：422至425之序列，且輕鏈包含SEQ ID NO：395之序列。

在某些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表9中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：386731、iPS：386725、iPS：386717、iPS：386715、iPS：386707、iPS：386705、iPS：386723、iPS：386719、iPS：386713、iPS：386709、iPS：386727、iPS：386721、iPS：386711、iPS：386733或iPS：386729。在一些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表9中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：386721、iPS：386723或iPS：386733。

在本發明之抗原結合蛋白質之一些實施例中，定位於Fc區之羧基末端處的結合域(亦即，羧基末端結合域)為Fab片段。在此等實施例中，Fab經由肽連接子、經由Fab片段之VL區或VH區之胺基末端融合或以其他方式連接至Fc區之羧基末端(例如，CH3域之羧基末端)。因此，在一個實施例中，Fab經由Fab之VL區之胺基末端融合至Fc區，以使得所得融合蛋白質自N末端至C末端包含CH2域、CH3域、肽連接子、VL區及CL區。在另一實施例中，Fab經由Fab之VH區之胺基末端融合至Fc區，以使得所得融合蛋白質自N末端至C末端包含CH2域、CH3域、肽連接子、VH區及CH1區。

將Fc區接合至羧基末端Fab之肽連接子可為本文所述的肽連接子中之任何者。在特定實施例中，將Fc區接合至羧基末端Fab片段之肽連接子為長度至少5個胺基酸。在其他實施例中，將Fc區接合至羧基末端Fab片段之肽連接子為長度至少8個胺基酸。用於將Fc區接合至羧基末端Fab片段之尤其適合肽連接子為甘胺酸-絲胺酸連接子，諸如(Gly_x Ser)_n ，其中x=3或4，且n=2、3、4、5或6(SEQ ID NO：645)。在一個實施例中，將Fc區連接至羧基末端Fab片段之肽連接子為L10 (G₄ S)₂ 連接子(SEQ ID NO：368)。在另一實施例中，將Fc區連接至羧基末端Fab片段之肽連接子為L9或G₃ SG₄ S連接子(SEQ ID NO：367)。

在其中羧基末端結合域為Fab片段的本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之一些實施例中，定位於Fc區之胺基末端處之結合域(亦即，胺基末端結合域)亦為Fab片段。胺基末端Fab片段可經由本文所述的肽連接子或免疫球蛋白鉸鏈區融合至Fc區之胺基末端。在一些實施例中，胺基末端Fab片段經由人類IgG1鉸鏈區接合至Fc區之胺基末端。在其他實施例中，胺基末端Fab片段經由人類IgG2鉸鏈區接合至Fc區之胺基末端。較佳地，胺基末端Fab片段經由Fab之CH1區之羧基末端融合至Fc區。

在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含特異地結合至第一標靶(例如，人類CGRP受體或人類PAC1受體)之第一抗體，其中來自特異地結合至第二標靶(例如，人類CGRP受體或人類PAC1受體)之第二抗體的Fab片段之一個多肽鏈(例如，輕鏈(VL-CL))融合至第一抗體之重鏈之羧基末端。此等實施例中之雙特異性抗原結合蛋白質亦包含多肽鏈，該多肽鏈含有來自第二抗體之Fab片段之另一半(例如，Fd鏈(VH-CH1))。此型式在本文中稱為「IgG-Fab」型式，且此種類型分子之一個實施例在圖3中示意地展示。因此，在某些實施例中，本發明包括雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其包含：(i)來自第一抗體之輕鏈；(ii)來自第一抗體之重鏈，其中重鏈在其羧基末端處經由肽連接子融合至包含第二抗體之VL-CL域或VH-CH1域之第一多肽，以形成經修飾重鏈；以及(iii)第二多肽，其包含第二抗體之VH-CH1域或VL-CL域，其中第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，且另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。當二聚化時，雙特異性抗原結合蛋白質為同源六聚物，其包含兩個經修飾重鏈、來自第一抗體之兩個輕鏈，以及含有來自第二抗體之Fab片段之另一半(或Fd片段或輕鏈)的兩個多肽鏈。在一個實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VL域及CL域，且第二多肽包含來自第二抗體之VH域及CH1域。在另一實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽包含來自第二抗體之VH域及CH1域，且第二多肽包含來自第二抗體之VL域及CL域。

如本文所述的電荷對突變或互補胺基酸取代可引入第一抗體(Fab 1)或第二抗體(Fab 2)之Fab區中，以促成正確的重鏈-輕鏈配對。例如，在一些實施例中，Fab 1中之VL域之Kabat位置38處的胺基酸用帶負電胺基酸(例如，麩胺酸)置換，且Fab 1中之VH域之Kabat位置39處的胺基酸用帶正電胺基酸(例如，離胺酸)置換。在其他實施例中，Fab 1中之VL域之Kabat位置38處的胺基酸用帶正電胺基酸(例如，離胺酸)置換，且Fab 1中之VH域之Kabat位置39處的胺基酸用帶負電胺基酸(例如，麩胺酸)置換。在某些實施例中，Fab 2中之VL域之Kabat位置38處的胺基酸用帶負電胺基酸(例如，麩胺酸)置換，且Fab 2中之VH域之Kabat位置39處的胺基酸用帶正電胺基酸(例如，離胺酸)置換。在其他實施例中，Fab 2中之VL域之Kabat位置38處的胺基酸用帶正電胺基酸(例如，離胺酸)置換，且Fab 2中之VH域之Kabat位置39處的胺基酸用帶負電胺基酸(例如，麩胺酸)置換。

在其中來自第二抗體之VH-CH1區(亦即，Fd片段)融合至第一抗體之重鏈之實施例中，來自第一抗體之重鏈包含S183E突變(EU編號)，來自第一抗體之輕鏈包含S176K突變(EU編號)，來自第二抗體之輕鏈包含S176E突變(EU編號)，且來自第二抗體之Fd區(其融合至來自第一抗體之重鏈之C末端)包含S183K突變(EU編號)。在其他實施例中，來自第一抗體之重鏈包含G44E突變(Kabat)及S183E突變(EU編號)，來自第一抗體之輕鏈包含G100K突變(Kabat)及S176K突變(EU編號)，來自第二抗體之輕鏈包含G100E突變(Kabat)及S176E突變(EU編號)，且來自第二抗體之Fd區(其融合至來自第一抗體之重鏈之C末端)包含G44K突變(Kabat)及S183K突變(EU編號)。先前實例中之電荷可電性反轉，只要相應輕鏈或重鏈上之電荷亦電性反轉以便正確的重鏈/輕鏈對具有相反的電荷。

另外或替代地，正確的重鏈-輕鏈配對可藉由調換羧基末端Fab結合域中之CH1域及CL域來促成。舉例而言，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽可包含來自第二抗體之VL域及CH1域，且第二多肽可包含來自第二抗體之VH域及CL域。在另一實施例中，融合至重鏈之羧基末端的第一多肽可包含來自第二抗體之VH域及CL域，且第二多肽可包含來自第二抗體之VL域及CH1域。

在本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG-Fab型式中，抗PAC1受體抗體可為第一抗體(亦即，「IgG」)或第二抗體(亦即，自其得到C末端Fab)。類似地，抗CGRP受體抗體可為第一抗體(亦即，「IgG」)或第二抗體(亦即，自其得到C末端Fab)。表1A及1B中列明的抗PAC1受體抗體可變區中之任何可變區可併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分或C末端Fab組分中。表3A及3B中列明的抗CGRP受體抗體可變區中之任何可變區可併入本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分或C末端Fab組分中。

呈IgG-Fab型式的本發明之示範性抗原結合蛋白質之輕鏈、經修飾重鏈及第二多肽的胺基酸序列概述於以下表10中。表之前一半中所列分子包含抗PAC1受體IgG組分及抗CGRP受體C末端Fab片段，而表之後一半中所列分子包含抗CGRP受體IgG組分及抗PAC1受體C末端Fab片段。

表10. 呈IgG-Fab型式的示範性雙特異性抗原結合蛋白質之胺基酸序列

在某些實施例中，IgG-Fab雙特異性抗原結合蛋白質之第一抗體(亦即，IgG組分)為抗PAC1受體抗體，且第二抗體(亦即，自其得到羧基末端Fab)為抗CGRP受體抗體。在此等實施例中，抗PAC1受體抗體包含來自表1A中所述任何彼等者之VL區，及來自表1B中所述任何彼等者之VH區。例如，在一個實施例中，得到IgG組分之抗PAC1受體抗體包含LV-04(SEQ ID NO：31)VL區及HV-03(SEQ ID NO：85)VH區。

在其中羧基末端Fab組分來源於抗CGRP受體抗體之實施例中，抗CGRP受體抗體可包含來自表3A中所述任何彼等者之VL區，及來自表 3B中所述任何彼等者之VH區。在一個實施例中，抗CGRP受體Fab包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，抗CGRP受體Fab包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。

在其中雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分來源於抗PAC1受體抗體且羧基末端Fab組分來源於抗CGRP受體抗體之實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：428至439之序列。在相關實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之輕鏈包含SEQ ID NO：214或SEQ ID NO：426之序列，且第二多肽(其含有羧基末端Fab片段之另一半)包含選自SEQ ID NO：452至459之序列。在一些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質包含輕鏈、經修飾重鏈及第二多肽，其中：(a)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：428之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：452之序列；(b)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：429之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：453之序列；(c)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：430之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：454之序列；(d)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：431之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：455之序列；(e)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：432之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：456之序列；(f)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：433之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：457之序列；(g)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：434之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：458之序列； (h)輕鏈包含SEQ ID NO：214之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：435之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：459之序列；(i)輕鏈包含SEQ ID NO：426之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：436之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：456之序列；(j)輕鏈包含SEQ ID NO：426之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：437之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：457之序列；(k)輕鏈包含SEQ ID NO：426之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：438之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：459之序列；或(l)輕鏈包含SEQ ID NO：426之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：439之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：458之序列。在某些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表10中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：392513、iPS：392514、iPS：392475、iPS：392519、iPS：392515、iPS：392516、iPS：392521、iPS：392520、iPS：392517、iPS：392518、iPS：392522或iPS：392523。

在本發明之其他實施例中，IgG-Fab雙特異性抗原結合蛋白質之第一抗體(亦即，IgG組分)為抗CGRP受體抗體，且第二抗體(亦即，自其得到羧基末端Fab)為抗PAC1受體抗體。在此等實施例中，抗CGRP受體抗體包含來自表3A中所述任何彼等者之VL區，及來自表3B中所述任何彼等者之VH區。例如，在一個實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-105(SEQ ID NO：194)VH區。在另一實施例中，得到IgG組分之抗CGRP受體抗體包含LV-105(SEQ ID NO：140)VL區及HV-107(SEQ ID NO：196)VH區。在其中羧基末端Fab組分來源於抗PAC1受體抗體之實施例中，抗PAC1受體抗體可包含來自表1A中所述任何彼等者之VL區，及來自表1B中所述任何彼等者之VH區。在一個實施例中，抗PAC1受體Fab包含LV-04(SEQ ID NO：31)VL區及HV-03(SEQ ID NO：85)VH區。

在其中雙特異性抗原結合蛋白質之IgG組分來源於抗CGRP受體抗體且羧基末端Fab組分來源於抗PAC1受體抗體之實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：440至451之序列。在相關實施例中，雙特異性抗原結合蛋白質之輕鏈包含SEQ ID NO：275或SEQ ID NO：427之序列，且第二多肽(其含有羧基末端Fab片段之另一半)包含選自SEQ ID NO：460至463之序列。在一些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質包含輕鏈、經修飾重鏈及第二多肽，其中：(a)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：440之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：460之序列；(b)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：441之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：461之序列；(c)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：442之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：460之序列；(d)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：443之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：461之序列；(e)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：444之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：462之序列；(f)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：445之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：463之序列；(g)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：446之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：462之序列；(h)輕鏈包含SEQ ID NO：275之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：447之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：463之序列；(i)輕鏈包含SEQ ID NO：427之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：448之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：462之序列； (j)輕鏈包含SEQ ID NO：427之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：449之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：463之序列；(k)輕鏈包含SEQ ID NO：427之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：450之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：462之序列；或(l)輕鏈包含SEQ ID NO：427之序列，經修飾重鏈包含SEQ ID NO：451之序列，且第二多肽包含SEQ ID NO：463之序列。在某些實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表10中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：392524、iPS：392525、iPS：392526、iPS：392527、iPS：392528、iPS：392529、iPS：392532、iPS：392533、iPS：392530、iPS：392531、iPS：392534或iPS：392535。在其他實施例中，雙特異性、多價抗原結合蛋白質為如表10中列明的命名為以下者之抗原結合蛋白質：iPS：392524、iPS：392525、iPS：392526、iPS：392527、iPS：392532、iPS：392533、iPS：392534或iPS：392535。

本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之重鏈恆定區或Fc區可包含影響抗原結合蛋白質之醣基化及/或效應物功能之一或多個胺基酸取代。免疫球蛋白之Fc區的功能之一在於當免疫球蛋白結合其標靶時與免疫系統通訊。此通常稱為「效應物功能」。通訊會產生抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。ADCC及ADCP係經由Fc區與免疫系統之細胞表面上的Fc受體之結合來介導。CDC係經由Fc與補體系統之蛋白質(例如，C1q)之結合來介導。在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含恆定區中之一或多個胺基酸取代以增強效應物功能，包括ADCC活性、CDC活性、ADCP活性及/或抗原結合蛋白質之清除率或半衰期。可增強效應物功能之示範性胺基酸取代(EU編號)包括但不限於：E233L、L234I、L234Y、L235S、G236A、S239D、F243L、F243V、P247I、D280H、K290S、K290E、K290N、K290Y、R292P、E294L、 Y296W、S298A、S298D、S298V、S298G、S298T、T299A、Y300L、V305I、Q311M、K326A、K326E、K326W、A330S、A330L、A330M、A330F、I332E、D333A、E333S、E333A、K334A、K334V、A339D、A339Q、P396L或前述任何者之組合。

在其他實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含恆定區中之一或多個胺基酸取代以減少效應物功能。可減少效應物功能之示範性胺基酸取代(EU編號)包括但不限於：C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S或前述任何者之組合。

醣基化可有助於抗體、尤其為IgG1抗體之效應物功能。因此，在一些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質可包含影響結合蛋白質之醣基化水平或類型之一或多個胺基酸取代。多肽之醣基化通常為N連接醣基化或O連接醣基化。N連接係指碳水化物部分連接至天冬醯胺酸殘基之側鏈。其中X為除脯胺酸之外之任何胺基酸的三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸為碳水化物部分酶促連接至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，多肽中存在此等三肽序列中之任一者皆會產生潛在醣基化位點。O連接醣基化係指糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。

在某些實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之醣基化藉由例如向結合蛋白質之Fc區添加一或多個醣基化位點來增加。向抗原結合蛋白添加醣基化位點可適宜地藉由改變胺基酸序列以使其含有上述三肽序列中之一或多者來完成(針對N連接醣基化位點)。改變亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或取代起始序列之一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基來進行(針對O連接醣基化位點)。為容易起見，經由在DNA層面上之變化、尤其藉由使編碼標靶多肽之DNA在預先選擇之鹼基處突變以使得產生將轉譯成所要胺基酸之密碼子來改變抗原結合蛋白胺基酸序列。

本發明亦涵蓋具有經改變碳水化合物從而產生經改變效應物活性之雙特異性抗原結合蛋白質分子之產生，該等雙特異性抗原結合蛋白質分子包括缺少或減少展現改良ADCC活性之海藻糖基化之抗原結合蛋白質。此項技術中已知各種方法來減少或消除海藻糖基化。例如，ADCC效應物活性藉由抗體分子與FcγRIII受體之結合來介導，該結合已證實為取決於CH2域之N297殘基處的N連接子醣基化之碳水化合物結構。非海藻糖基化抗體以增加的親和力結合此受體，且比原生海藻糖基化抗體更有效地觸發FcγRIII介導效應物功能。例如，其中α-1,6-海藻糖基轉移酶已獲敲除之CHO細胞中非海藻糖基化抗體之重組產生得到具有100倍增加ADCC活性之抗體(參見Yamane-Ohnuki等人，Biotechnol Bioeng.87(5)：614-22,2004)。類似效應可經由減小α-1,6-海藻糖基轉移酶或其他酶於海藻糖基化路徑中之活性，例如經由siRNA或反義RNA處理、工程改造細胞系以敲除酶或利用選擇性醣基化抑制劑培養來完成(參見Rothman等人，Mol Immunol.26(12)：1113-23,1989)。例如Lec13或大鼠融合瘤YB2/0細胞系之一些寄主細胞菌株天然地產生具有較低海藻糖基化水平之抗體(參見Shields等人，J Biol Chem.277(30)：26733-40,2002及Shinkawa等人，J Biol Chem.278(5)：3466-73,2003)。例如經由在過度表現GnTIII酶之細胞重組地產生抗體而達成的對分碳水化合物之水平的增加亦已判定為增加ADCC活性(參見Umana等人，Nat Biotechnol.17(2)：176-80,1999)。

在其他實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之醣基化藉由例如自結合蛋白質之Fc區移除一或多個醣基化位點來減少或消除。消除或改變N連接醣基化位點之胺基酸取代可減少或消除抗原結合蛋白質之N連接醣基化。在某些實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質包含在定位N297(EU編號)處之突變，諸如N297Q、N297A或N297G。在一個特定實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質包含具有N297G突變的來自人類IgG1抗體之Fc區。為改良包含N297突變之分子之穩定性，分子之Fc區可進一步工程改造。例如，在一些實施例中，Fc區中之一或多個胺基酸用半胱胺酸取代以促進在二聚狀態中的二硫鍵形成。相應於IgG1 Fc區之V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332(EU編號)之殘基可因此用半胱胺酸取代。較佳地，一對特定殘基用半胱胺酸取代，以使得該等殘基優先彼此形成二硫鍵，因此限制或防止二硫鍵攪亂(scrambling)。較佳配對包括但不限於A287C及L306C、V259C及L306C、R292C及V302C以及V323C及I332C。在特定實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質包含在R292C及V302C具有突變的來自人類IgG1抗體之Fc區。在此等實施例中，Fc區亦可包含N297G突變。

增加血清半衰期的對本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之修飾亦可為合乎需要的，該修飾例如藉由併入或添加救援受體結合抗原決定基(例如，藉由適當區域之突變或藉由將抗原決定基併入肽標籤中，隨後將肽標籤融合至抗原結合蛋白質之任一末端處或中間，例如藉由DNA或肽合成來融合；參見，例如WO 96/32478)或增加諸如PEG或其他水溶性聚合物(包括多醣聚合物)之分子而達成。救援受體結合抗原決定基較佳構成一區域，在該區域中，來自Fc區之一或兩個環的任何一或多個胺基酸殘基轉移至抗原結合蛋白質中之類似位置。甚至更佳地，來自Fc區之一或兩個環的三個或三個以上殘基得以轉移。仍更佳地，自Fc區(例如，IgG Fc區)之CH2域取得抗原決定基，且將該抗原決定基轉移至抗原結合蛋白質之CH1、CH3或VH區，或一個以上此種區域。替代地，自Fc區之CH2域取得抗原決定基，且將該抗原決定基轉移至抗原結合蛋白質之CL區或VL區或兩者。就Fc變異體及其與救援受體之相互作用的描述，參見國際申請案WO 97/34631及WO 96/32478。

本發明包括編碼本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質及其組分之一或多種經分離之核酸。本發明之核酸分子包括呈單鏈形式與雙鏈形式兩者之DNA及RNA以及相應互補序列。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、化學合成DNA、藉由PCR擴增之DNA及其組合。本發明之核酸分子包括全長基因或cDNA分子以及其片段之組合。本發明之核酸優先來源於人類來源，但本發明亦包括來源於非人類物種之彼等核酸。

來自所關注免疫球蛋白或其區域(例如，可變區、Fc區等等)或多肽之相關胺基酸序列可藉由直接蛋白質測序來測定，且適合的編碼核苷酸序列可根據通用密碼子表來設計。替代地，編碼可得到本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之結合域的單株抗體之基因組或cDNA可自產生此等抗體之細胞，使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性地結合至編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來分離並測序。

在自天然存在之來源分離核酸之情況下，在本文中可與「經分離之多核苷酸」互換使用的「經分離之核酸」為已與分離出核酸之生物體之基因組中存在的相鄰遺傳序列分離的核酸。在自模板酶促合成或化學合成核酸(諸如PCR產物、cDNA分子或例如寡核苷酸)之情況下，應理解，由此等方法產生之核酸為經分離之核酸。經分離之核酸分子係指呈單獨片段形式或呈較大核酸構築體之組分形式之核酸分子。在一個較佳實施例中，核酸實質上不含污染性內源物質。核酸分子已較佳來源於至少分離一次的呈實質上純形式且量或濃度使得能夠藉由標準生物化學方法(諸如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)中所概述之彼等方法)鑑定、操作及回收其組成核苷酸序列之DNA或RNA。較佳以不由通常存在於真核基因中之內部非轉譯序列或內含子中斷之開放閱讀框架形式提供及/或構築此等序列。非轉譯DNA之序列可存在於開放閱讀框架之5'或3'，在5'或3'處，該等序列不干擾編碼區之操作或表現。除非另外指定，否則本文中所論述的單鏈多核苷酸序列之左手末端為5’末端；雙鏈多核苷酸序列之左手方向稱為5’方向。初生RNA轉錄物之5'至3'產生之方向稱為轉錄方向；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同序列的為RNA轉錄物之5'末端之5'的序列區稱為「上游序列」；DNA鏈上具有與RNA轉錄物相同序列的為RNA轉錄物之3'末端之3'的序列區稱為「下游序列」。

本發明亦包括在適度嚴格條件且更佳高度嚴格條件下雜交於編碼如本文所述之多肽之核酸的核酸。影響雜交條件之選擇之基本參數及對設計適合條件之指導由Sambrook,Fritsch及Maniatis(1989,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，第9及11章；以及Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley & Sons公司，第2.10及6.3-6.4章節)所闡述，且可易於藉由一般技藝人士基於例如DNA之長度及/或鹼基組成加以測定。一種達成適度嚴格條件之方法涉及使用含有5×SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之預洗滌溶液；具有約50%甲醯胺、6×SSC之雜交緩衝液；以及雜交溫度約55℃(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液，其中雜交溫度為約42℃)，以及於0.5×SSC、0.1% SDS中的約60℃之洗滌條件。通常，高度嚴格條件定義為如上雜交條件，但在約68℃下、於0.2×SSC、0.1% SDS中洗滌。在雜交及洗滌緩衝液中，SSPE(1×SSPE為0.15M NaCl、10mM NaH₂ PO₄ 及1.25mM EDTA，pH 7.4)可被替換成SSC(1×SSC為0.15M NaCl及15mM檸檬酸鈉)；在雜交完成之後進行洗滌15分鐘。應理解，必要時可藉由應用如熟習此項技術者已知，且以下進一步所述之支配雜交反應及雙鏈體穩定性之基本原理來調整洗滌溫度及洗滌鹽濃度，以達成所要嚴格程度(參見，例如，Sambrook等人，1989)。當使核酸雜交於序列未知之標靶核酸時，雜交物長度假定為雜交核酸之長度。當序列已知之核酸獲雜交時，雜交物長度可藉由比對核酸之序列並鑑定具有最佳序列互補性之一或多個區域來確定。預期長度小於50個鹼基對之雜交物之雜交溫度應比雜交物之熔融溫度(Tm)小5至10℃，其中Tm係根據以下方程式測定。對於長度小於18個鹼基對之雜交物，Tm(℃)=2(A+T鹼基數)+4(G+C鹼基數)。對於長度大於18個鹼基對之雜交物，Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(G+C%)-(600/N)，其中N為雜交物中之鹼基數，且[Na+]為雜交緩衝液中之鈉離子濃度(1×SSC之[Na+]=0.165M)。較佳地，每一此種雜交核酸具有之長度為至少15個核苷酸(或更佳至少18個核苷酸、或至少20個核苷酸、或至少25個核苷酸、或至少30個核苷酸、或至少40個核苷酸、或最佳至少50個核苷酸)，或為與其雜交之本發明之核酸的長度之至少25%(更佳至少50%、或至少60%、或至少70%，且最佳至少80%)，且具有與同其雜交之本發明之核酸至少60%(更佳至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，且最佳至少99.5%)序列一致性，其中序列一致性係藉由在經對準以使重疊及一致性最大化，同時使如上更詳細描述的序列空隙最小化時比較雜交核酸之序列來測定。

本文所述的抗原結合蛋白質之變異體藉由以下方式來製備：使用卡匣或PCR突變誘發或此項技術中熟知之其他技術，使編碼多肽之DNA中之核苷酸經受位點特異性突變誘發，以產生編碼變異體之DNA，且此後在如本文概述之細胞培養物中表現重組DNA。然而，可藉由使用已確立技術進行活體外合成來製備包含變異體CDR的具有多達約100-150個殘基之抗原結合蛋白片段。變異體典型地展現與天然存在的模擬物相同的定性生物活性，例如結合至抗原之生物活性。此等變異體包括例如抗原結合蛋白質之胺基酸序列內的殘基之缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體擁有所要特徵。胺基酸改變亦可改變抗原結合蛋白質之轉譯後過程，諸如改變醣基化位點之數量或位置。在某些實施例中，製備抗原結合蛋白質變異體，意圖在於修飾直接涉及抗原決定基結合之彼等胺基酸殘基。在其他實施例中，對不直接涉及抗原決定基結合之殘基或不涉及以任何方式進行抗原決定基結合之殘基的修飾對本文中論述的目的而言為合乎需要的。涵蓋CDR區及/或架構區中任何者內之突變誘發。可由熟練技藝人士使用協方差分析技術來設計抗原結合蛋白質之胺基酸序列中的有用修飾。參見，例如，Choulier，等人，Proteins 41：475-484,2000；Demarest等人，J.Mol.Biol.335：41-48,2004；Hugo等人，Protein Engineering 16(5)：381-86,2003；Aurora等人，美國專利公開案第2008/0318207 A1號；Glaser等人，美國專利公開案第2009/0048122 A1號；Urech等人，WO 2008/110348 A1；Borras等人，WO 2009/000099 A2。藉由協方差分析測定的此等修飾可改良抗原結合蛋白質之效力、藥物動力學、藥力學及/或可製造性特性。

表11展示編碼抗PAC1受體抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區的示範性核酸序列，且表12展示編碼抗CGRP受體抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區的示範性核酸序列。編碼抗PAC1受體可變區及抗CGRP受體可變區之多核苷酸可用於分別構築本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域及抗CGRP受體結合域。

表11. 示範性抗PAC1受體可變區核酸序列

表12. 示範性抗CGRP受體可變區核酸序列

編碼本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗PAC1受體結合域的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表11中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在一些實施例中，編碼抗PAC1受體輕鏈可變區之經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：464至490之序列。在相關實施例中，編碼抗PAC1受體重鏈可變區之經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：491至516之序列。編碼本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之抗CGRP受體結合域的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表12中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在一些實施例中，編碼抗CGRP受體輕鏈可變區之經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：517至539之序列。在相關實施例中，編碼抗CGRP受體重鏈可變區之經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：540至560之序列。

在其中本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為異源二聚抗體之實施例中，編碼抗PAC1受體抗體輕鏈之經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表6A中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在某些實施例中，編碼本發明之異源二聚抗體之抗PAC1受體輕鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：222至232之序列。在此等及其他實施例中，編碼抗PAC1受體抗體重鏈之經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表6B中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在一些實施例中，編碼本發明之異源二聚抗體之抗PAC1受體重鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：252至270之序列。

在其中本發明之雙特異性抗原結合蛋白質為異源二聚抗體之其他實施例中，編碼抗CGRP受體抗體輕鏈之經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表7A中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在某些實施例中，編碼本發明之異源二聚抗體之抗CGRP受體輕鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：283至294之序列。在此等及其他實施例中，編碼抗CGRP受體抗體重鏈之經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表7B中所列的任何核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在一些實施例中，編碼本發明之異源二聚抗體之抗CGRP受體重鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：317至338之序列。

編碼呈IgG-scFv型式的本發明之示範性雙特異性抗原結合蛋白質之輕鏈及經修飾重鏈(例如，包含重鏈及scFv之融合蛋白質)的核酸序列在表13中列出。在此等實施例中，編碼IgG-scFv分子之輕鏈的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表13中所列的任何輕鏈核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。例如，在一些實施例中，編碼IgG-scFv分子之輕鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：561至564之序列。在相關實施例中，編碼IgG-scFv分子之經修飾重鏈的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表13中所列的任何經修飾重鏈核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在某些實施例中，編碼IgG-scFv分子之經修飾重鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：565至594之序列。

表13. 呈IgG-scFv型式的示範性雙特異性抗原結合蛋白質之核酸序列

編碼呈IgG-Fab型式的本發明之示範性雙特異性抗原結合蛋白質之三個組分(例如，輕鏈、經修飾重鏈及包含羧基末端Fab域之另一半的第二多肽)的核酸序列在表14中列出。在此等實施例中，編碼IgG-Fab分子之輕鏈的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表14 中所列的任何輕鏈核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。例如，在一些實施例中，編碼IgG-Fab分子之輕鏈之經分離之核酸包含SEQ ID NO：225、287、595及596之序列。在相關實施例中，編碼IgG-Fab分子之經修飾重鏈的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表14中所列的任何經修飾重鏈核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致。在某些實施例中，編碼IgG-Fab分子之經修飾重鏈的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：597至620之序列。在此等及其他實施例中，編碼IgG-Fab分子之第二多肽的經分離之核酸可包含核苷酸序列，該核苷酸序列與表14中所列的任何經修飾重鏈核苷酸序列至少80%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致，該第二多肽包含羧基末端Fab域之另一半(例如，Fd片段或第二輕鏈)。在一些實施例中，編碼IgG-Fab分子之第二多肽的經分離之核酸包含選自SEQ ID NO：621至632之序列。

表6A、6B、7A、7B及11-14中提供的核酸序列僅為示範性的。如此項技術者將瞭解，歸因於遺傳密碼之簡併性，可製成極大數目的全部編碼本發明之CDR(及本文所述的抗原結合蛋白質之重鏈及輕鏈或其他組分)的核酸。因此，在已鑑定特定胺基酸序列時，熟習此項技術者可藉由以不改變編碼蛋白質之胺基酸序列之方式，僅修飾一或多個密碼子之序列來製成任何數量之不同核酸。

本發明亦包括包含一或多種核酸的載體，該等核酸編碼本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之一或多個組分(例如，可變區、輕鏈、重鏈、經修飾重鏈及Fd片段)。術語「載體」係指用於將蛋白質編碼資訊轉移至寄主細胞中之任何或實體(例如，核酸、質體、噬菌體或病毒)。載體之實例包括但不限於質體、病毒載體、非游離基因哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。如本文所使用的術語「表現載體」或「表現構築體」係指重組DNA分子，該重組DNA分子含有在特定寄主細胞中表現可操作連接編碼序列所必需的所要編碼序列及適當核酸控制序列。表現載體可包括但不限於影響或控制轉錄、轉譯且在存在內含子的情況下影響與其可操作連接的編碼區之RNA剪接的序列。在原核生物中表現所必需的核酸序列包括啟動子、視情況操作子序列、核糖體結合位點及可能的其他序列。已知真核細胞利用啟動子、強化子及終止與多腺苷酸化信號。分泌信號肽序列亦可視情況藉由可操作連接至所關注編碼序列之表現載體來編碼，以便所表現多肽可藉由重組寄主細胞分泌，以在需要時達到所關注多肽與細胞之更簡易分離。例如，在一些實施例中，信號肽序列可附加/融合至表6A、6B、7A、7B、9及10中所列任何多肽序列之胺基末端。在某些實施例中，具有MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(SEQ ID NO：633)之胺基酸序列的信號肽融合至表6A、6B、7A、7B、9及10中的任何多肽序列之胺基末端。在其他實施例中，具有MAWALLLLTLLTQGTGSWA(SEQ ID NO：634)之胺基酸序列的信號肽融合至表6A、6B、7A、7B、9及10中的任何多肽序列之胺基末端。在其他實施例中，具有MTCSPLLLTLLIHCTGSWA(SEQ ID NO：635)之胺基酸序列的信號肽融合至表6A、6B、7A、7B、9及10中的任何多肽序列之胺基末端。可融合至本文所述的多肽序列之胺基末端的其他適合的信號肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：636)、MEWTWRVLFLVAAATGAHS(SEQ ID NO：637)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：638)、METPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO：639)、MKHLWFFLLLVAAPRWVLS(SEQ ID NO：640)及MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO：641)。其他信號肽為熟習此項技術者已知的，且可融合至表6A、6B、7A、7B、9及10中所列任何多肽鏈，以促進或最佳化在特定寄主細胞中之表現。

典型地，在寄主細胞中用於產生本發明之雙特異性抗原蛋白質之表現載體將含有用於質體維持並用於選殖及表現編碼雙特異性抗原結合蛋白質之組分的外源核苷酸序列的序列。在某些實施例中總稱為「側接序列」之此等序列將典型地包括以下核苷酸序列之一或多者：啟動子、一或多種增強子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及接受體拼接位點之完全內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、多腺苷酸化序列、用於插入編碼欲表現多肽之核酸的多連接子區域以及可選擇標記物元件。以下論述此等序列之每一者。

視情況，載體可含有「標籤」編碼序列，亦即位於多肽編碼序列之5'或3'末端之寡核苷酸分子；寡核苷酸標籤序列編碼多His(諸如六His(SEQ ID NO：646))、FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)、myc或市售抗體存在之另一「標籤」分子。此標籤典型地在多肽表現後融合至多肽，且可充當一種自寄主細胞親和力純化或偵測多肽之手段。親和力純化可例如藉由使用針對標籤之抗體作為親和力基質進行管柱層析來完成。視情況，可隨後藉由各種手段，諸如使用用於裂解之某些肽酶自純化多肽移除標籤。

側接序列可為同源的(亦即來自與寄主細胞相同之物種及/或菌株)、異源的(亦即來自不同於寄主細胞物種或菌株之物種)、雜交的(亦即，來自一種以上來源之側接序列之組合)、合成的或原生的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，其限制條件為側接序列在寄主細胞機構中具有功能性且可藉由寄主細胞機構活化。

適用於本發明之載體中之側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法中之任何方法來獲得。典型地，適用於本文中之側接序列已先前藉由定位分析及/或藉由限制核酸內切酶消化鑑定，且因此可使用適當限制核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些狀況下，側接序列之完全核苷酸序列可為已知的。此處，可使用用於核酸合成或選殖之常規方法合成側接序列。

無論是否已知側接序列之全部或僅一部分，其可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用適合探針，諸如來自相同或另一物種之寡核苷酸及/或側接序列片段來篩選基因組文庫而獲得。當側接序列未知時，含有側接序列之DNA片段可自一段較大DNA分離，該段DNA可含有例如編碼序列或甚至另外一或多種基因。分離可藉由以下方式完成：限制核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，繼之以使用瓊脂糖凝膠純化Qiagen®管柱層析(Chatsworth,CA)或熟練技藝人士已知之其他方法進行分離。對用以完成此目的之適合酶之選擇將對一般技藝人士顯而易知。

複製起點典型地為彼等商購原核表現載體之一部分，且起點有助於在寄主細胞中擴增載體。若所選載體不含有複製起點位點，則可基於已知序列化學合成複製起點位點，且接合至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適於大多數革蘭氏陰性細菌，且各種病毒起點(例如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或諸如HPV或BPV之乳頭狀瘤病毒)適用於哺乳動物細胞中之選殖載體。通常，複製起點組分不為哺乳動物表現載體所需(例如，僅因為SV40起點亦含有病毒早期啟動子而常獲使用)。

轉錄終止序列典型地位於多肽編碼區之末端之3'且用於終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為G-C富集片段，繼之以聚T序列。儘管序列易於自文庫選殖或甚至作為載體之一部分商購，但其亦可易於使用用於核酸合成之已知方法來合成。

可選擇標記基因編碼對在選擇性培養基中生長之寄主細胞之存活及生長所必需的蛋白質。典型選擇標記基因編碼達成以下各項之蛋白質：(a)賦予原核寄主細胞對抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin)之抗性；(b)彌補細胞之營養缺陷不足；或(c)供應不可自複合或限定培養基獲得之關鍵養分。特定可選擇標記物為康黴素抗性基因、胺苄青黴素抗性基因及四環素抗性基因。有利地，新黴素(neomycin)抗性基因亦可用於在原核寄主細胞與真核寄主細胞兩者中之選擇。

其他可選擇基因可用於擴增將要表現之基因。擴增為對生長或細胞存活關鍵之蛋白質產生所需之基因在連續多代重組細胞之染色體內串聯重複的過程。適於哺乳動物細胞之可選擇標記物之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中僅轉型體藉助於載體中存在之可選擇基因而唯一適應於存活。選擇壓力係藉由在以下條件下培養轉型細胞來施加：連續增加培養基中之選擇劑之濃度，進而導致擴增可選擇基因與編碼另一基因(諸如本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之一或多個組分)之DNA兩者。因此，自擴增DNA合成增加量之多肽。

核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯啟始所必需的，且特徵在於Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件典型地位於啟動子之3'及欲表現之多肽之編碼序列的5'。在某些實施例中，一或多個編碼區可予以可操作連接至內部核糖體結合位點(IRES)，從而允許自單一RNA轉錄物轉譯兩個開放閱讀框。

在一些狀況下，諸如當在真核寄主細胞表現系統中需要醣基化時，可操作各種前序列或原序列以改良醣基化或產率。例如，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加原序列，此亦可影響醣基化。最終蛋白質產物可在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)中具有與表現相伴的一或多個另外胺基酸，該等胺基酸可能尚未完全移除。例如，最終蛋白質產物可具有一或兩個見於肽酶裂解位點中的附接至胺基末端之胺基酸殘基。或者，若酶在成熟多肽內之此區域處切割，則使用一些酶裂解位點可產生所要多肽之略微截短形式。

本發明之表現及選殖載體將典型地含有由寄主生物體識別且可操作連接至編碼多肽之分子之啟動子。如本文所使用的術語「可操作連接」係指以產生核酸分子之方式進行兩個或兩個以上核酸序列之連接，該核酸分子能夠導引給定基因之轉錄及/或所要蛋白質分子之合成。例如，載體中「可操作連接」至蛋白質編碼序列之控制序列係與之接合，以便蛋白質編碼序列之表現在與控制序列之轉錄活性相容的條件下達成。更確切言之，若包括順式作用轉錄控制元件之任何組合的啟動子及/或增強劑序列刺激或調變編碼序列於適當寄主細胞或其他表現系統中之轉錄，則該啟動子及/或增強劑序列可操作連接至該編碼序列。

啟動子為位於結構基因(通常在約100至1000bp內)之起始密碼子上游(亦即5')之未轉錄序列，其控制結構基因之轉錄。啟動子習知地分組至以下兩個類別之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子可回應於培養條件之某一變化(諸如存在或不存在養分或溫度變化)來引發在其控制下自DNA轉錄之水平增加。另一方面，組成性啟動子均一轉錄其所可操作連接之基因，亦即少許控制或不控制基因表現。許多由多種潛在寄主細胞識別之啟動子為熟知的。藉由限制酶消化自來源DNA移除啟動子並將所要啟動子序列插入載體中來使適合啟動子可操作連接至編碼例如本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之重鏈、輕鏈、經修飾重鏈或其他組分的DNA。

與酵母寄主一起使用的適合啟動子亦在此項技術中為熟知的。酵母強化子有利地與酵母啟動子一起使用。適合與哺乳動物寄主細胞一起使用之啟動子為熟知的，且包括但不限於自病毒之基因組獲得之彼等啟動子，該等病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及最佳猿猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。

可為所關注的其他啟動子包括但不限於：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中含有之啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；金屬硫蛋白(metallothionine)基因之啟動子及調控序列(Prinster等人，1982,Nature 296：39-42)；以及原核啟動子，諸如β內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。所關注的亦為以下動物轉錄控制區，該等控制區展現組織特異性且已用於基因轉殖動物中：在胰腺腺泡細胞中為活性的彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；在胰腺β細胞中為活性的胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；在淋巴細胞中為活性的免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睪丸、乳房、淋巴及肥大細胞中為活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；在肝中為活性的白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes及Devel.1：268-276)；在肝中為活性的α-胎蛋白質基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253：53-58)；在肝中為活性的α1-抗胰蛋白基因控制區 (Kelsey等人，1987,Genes及Devel.1：161-171)；在骨髓細胞中為活性的的β球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；在腦中之寡樹突細胞中為活性的髓鞘鹼性蛋白質基因控制區(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；在骨胳肌肉中為活性的的副肌蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314：283-286)；及在下視丘中為活性的促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。

強化子序列可插入載體中以增加編碼雙特異性抗原結合蛋白質之組分(例如，輕鏈、重鏈、經修飾重鏈、Fd片段)的DNA藉由較高級真核生物之轉錄。增強子為DNA之順式作用元件，通常長度為約10-300bp，其作用於啟動子以增加轉錄。增強子具有相對定向及位置非依賴性，其已見於轉錄單元之5'位置與3'位置兩者處。可自哺乳動物基因獲得的若干增強子序列為已知的(例如，球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白質及胰島素)。然而，典型地使用來自病毒之增強子。此項技術中已知的SV40增強子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤增強子及腺病毒增強子為用於活化真核啟動子之示範性增強元件。儘管增強子可在載體中定位於編碼序列之5'或3'，但其典型地位於啟動子之5'位點處。編碼適當原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。對信號肽或前導物之選擇取決於欲產生抗體之寄主細胞之類型，且異源信號序列可替換原生信號序列。以上描述信號肽之實例。在哺乳動物寄主細胞中具有功能性之其他信號肽包括以下：美國專利第4,965,195號中所述的介白素(interleukin)-7(IL-7)之信號序列；Cosman等入，1984,Nature 312：768中所述的介白素-2受體之信號序列；EP專利第0367 566號中所述的介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述的I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中所述的II型介白素-1受體信號肽。

所提供的表現載體可自諸如市售載體之起始載體構築。此等載體可或可不含有全部所要側接序列。在本文所述的側接序列中之一或多者尚未存在於載體中的情況下，其可個別地加以獲得且接合至載體中。用於獲得側接序列中之每一者的方法為熟習此項技術者所熟知。表現載體可引入寄主細胞中以藉以產生藉由如本文所述的核酸編碼的蛋白質，包括融合蛋白質。

在某些實施例中，編碼本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之不同組分的核酸可插入同一表現載體中。例如，編碼抗PAC1受體輕鏈之核酸可與編碼抗PAC1受體重鏈之核酸選殖至同一載體中。在此等實施例中，兩個核酸可藉由內部核糖體進入位點(IRES)分離，且受單一啟動子控制，以使得輕鏈及重鏈自同一mRNA轉錄物表現。替代地，兩個核酸可受兩個單獨啟動子之控制，以使得輕鏈及重鏈自兩個單獨mRNA轉錄物表現。在一些實施例中，編碼抗PAC1受體輕鏈及重鏈之核酸選殖至一個表現載體中，且編碼抗CGRP受體輕鏈及重鏈之核酸選殖至第二表現載體中。

類似地，對IgG-scFv雙特異性抗原結合蛋白質而言，編碼輕鏈之核酸可與編碼經修飾重鏈(包含重鏈及scFv之融合蛋白質)之核酸選殖至同一表現載體中，其中兩個核酸受單一啟動子之控制且藉由IRES分離，或其中兩個核酸受兩個單獨啟動子之控制。對IgG-Fab雙特異性抗原結合蛋白質而言，編碼三個組分中之每一者的核酸可選殖至同一表現載體中。在一些實施例中，編碼IgG-Fab分子之輕鏈的核酸及編碼第二多肽(其包含C末端Fab域之另一半)之核酸選殖至一個表現載體中，且編碼經修飾重鏈(包含重鏈及Fab域之一半的融合蛋白質)之核酸選殖至第二表現載體中。在某些實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之所有組分自同一寄主細胞群體表現。例如，即使一或多個組分選殖至單獨表現載體中，寄主細胞亦用兩種表現載體共轉染，以使得一個細胞產生雙特異性抗原結合蛋白質之所有組分。

在載體已獲構築且編碼本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之組分的寄主細胞或多種核酸分子已插入該或該等載體之適當位點中之後，所完成載體可插入適合寄主細胞中以用於擴增及/或多肽表現。因此，本發明涵蓋分離寄主細胞，該分離寄主細胞包含編碼雙特異性抗原結合蛋白質之組分的一或多種表現載體。如本文所使用的術語「寄主細胞」係指已用核酸轉型或能夠用核酸轉型且表現所關注基因之細胞。術語包括親本細胞之後代，無論該後代在形態上或在遺傳構成上是否與原始親本細胞一致，只要所關注基因存在即可。包含較佳可操作連接至至少一種表現控制序列(例如，啟動子或強化子)之本發明之經分離之核酸的寄主細胞為「重組寄主細胞」。

抗原結合蛋白質之表現載體轉型至所選寄主細胞中可藉由熟知方法來完成，該等方法包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選方法將部分地隨欲使用之寄主細胞之類型而變。此等方法及其他適合方法為熟練技藝人士所熟知，且例如闡述於Sambrook等人，2001(同上)中。

當在適當條件下培養時，寄主細胞合成抗原結合蛋白質，其可隨後自培養基收集(若寄主細胞將其分泌至培養基中)，或直接自產生其之寄主細胞收集(若其不分泌)。對適當寄主細胞之選擇將取決於各種因素，諸如所要表現水平、合乎活性需要或為活性所必需之多肽修飾(諸如醣基化或磷酸化)及折疊成生物活性分子之容易性。

示範性寄主細胞包括原核生物、酵母或較高級真核生物細胞。原核寄主細胞包括真細菌，革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸內菌科(Enterobacteriaceae )，諸如大腸桿菌屬(Escherichia )(例如，大腸桿菌(E.coli ))、腸內桿菌屬(Enterobacter )、伊文氏桿菌屬(Erwinia )、克留氏菌屬(Klebsiella )、變形桿菌屬(Proteus )、沙氏桿菌屬(Salmonella )(例如，鼠傷寒沙氏桿菌(Salmonella typhimurium ))、沙雷菌屬(Serratia )(例如，黏質沙雷氏菌(Serratia marcescans ))及志賀桿菌屬(Shigella )，以及桿菌屬(Bacillus )(諸如枯草桿菌(B.subtilis )及地衣芽孢桿菌(B.licheniformis ))、假單胞菌屬(Pseudomonas )及鏈黴菌屬(Streptomyces )。諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為用於重組多肽之適合選殖或表現寄主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )或普通麵包酵母在較低級真核寄主微生物中最為常用。然而，許多其他的屬、種及菌株在本文中為可利用的及有用的，諸如畢赤酵母(Pichia )，例如巴斯德畢赤酵母(P.pastoris )；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )；刻魯維拉菌(Kluyveromyces )；耶氏酵母(Yarrowia )；念珠菌屬(Candida )；瑞氏木黴(Trichoderma reesia )；粉色麵包黴菌(Neurospora crassa )；許旺酵母屬(Schwanniomyces )，諸如西方許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis )；以及絲狀真菌，諸如，例如，紅黴菌屬(Neurospora )、青黴菌屬(Penicillium )、彎頸黴菌屬(Tolypocladium )及麴菌屬(Aspergillus )寄主，諸如小巢狀麴菌(A.nidulans )及黑色麴菌(A.niger )。

用於醣基化抗原結合蛋白質之表現的寄主細胞可來源於多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑定眾多桿狀病毒菌株及變異體以及來自諸如以下者之寄主的相應容許昆蟲寄主細胞：草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedes aegypti )(蚊子)、白線斑蚊(Aedes albopictus )(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )(果蠅)及家蠶(Bombyx mori )。用於轉染此等細胞之各種病毒菌株可公開獲得，例如，加州苜蓿夜蛾(Autographa californica )NPV之L-1變異體及家蠶NPV之Bm-5菌株。

脊椎動物寄主細胞亦為適合寄主，且自此等細胞重組產生抗原結合蛋白質已成為例行程序。可用作用於表現之寄主的哺乳動物細胞系此項技術中為熟知的，且包括但不限於：可自美國菌種保存中心(ATCC)獲得之永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括CHOK1細胞(ATCC CCL61)、DXB-11、DG-44及中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216,1980)；藉由SV40轉型的猴腎CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人類胚腎系(293或次選殖用於在懸浮液培養物中生長293細胞(Graham等人，J.Gen Virol.36：59,1977)；嬰兒倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠足細胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23：243-251,1980)；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠色猴腎細胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人類宮頸癌瘤細胞(HELA,ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK,ATCC CCL 34)；buffalo大鼠肝細胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138,ATCC CCL 75)；人類肝瘤細胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562,ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y Acad.Sci.383：44-68,1982)；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞；以及許多其他細胞系。在某些實施例中，可經由測定哪些細胞系具有高表現量且組成性產生具有CGRP受體及PAC1受體結合性質之雙特異性抗原結合蛋白質來選擇細胞系。在另一實施例中，可選擇來自B細胞譜系之細胞系，該細胞系不產生其自身抗體，但具有製成且分泌異源抗體之能力。在一些實施例中，對表現本發明之雙特異性抗原結合蛋白質而言，CHO細胞為較佳寄主細胞。

寄主細胞用用於產生雙特異性抗原結合蛋白質之上述核酸或載體來轉型或轉染，且在習知養分培養基中培養，該培養基適當時經修飾用於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所要序列之基因。另外，具有藉由選擇性標記分離的多個轉錄單元複本之新穎載體及轉染細胞系尤其適用於表現抗原結合蛋白質。因此，本發明亦提供用於製備本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質之方法，該方法包含：在培養基中，在允許表現藉由一或多種表現載體編碼的雙特異性抗原結合蛋白質之條件下，培養包含本文所述的一或多種表現載體之寄主細胞；以及自培養基回收雙特異性抗原結合蛋白質。

用於產生本發明之抗原結合蛋白質的寄主細胞可在各種培養基中培養。諸如Ham's F10(Sigma)、最低必需培養基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜貝卡氏改良依格氏培養基((DMEM),Sigma)之市售培養基適合於培養寄主細胞。另外，描述於Ham等人，Meth.Enz.58：44,1979；Barnes等人，Anal.Biochem.102：255,1980；美國專利第4,767,704號；第4,657,866號；第4,927,762號；第4,560,655號；或第5,122,469號；WO90103430；WO 87/00195；或美國再頒專利第30,985號中之任何培養基可用作用於寄主細胞之培養基。此等培養基中之任何培養基可按需要補充有激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)；鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽)；緩衝液(諸如HEPES)；核苷酸(諸如腺苷及胸苷)；抗生素(諸如健他黴素^TM 藥物)；痕量元素(定義為通常在最終濃度下以微莫耳範圍存在的無機化合物)；以及葡萄糖或等效能量來源。任何其他必要的補充物亦可以熟習此項技術者已知的適當濃度納入。諸如溫度、pH及類似條件之培養條件為先前與選用於表現之寄主細胞一起使用的彼等培養條件，且將對一般技藝人士而明顯的。

在培養寄主細胞時，雙特異性抗原結合蛋白質可在細胞內產生於周質空間中，或直接分泌至培養基中。若抗原結合蛋白質在細胞內產生，則作為第一步驟，例如藉由離心或超濾來移除微粒碎屑(寄主細胞或溶解片段)。雙特異性抗原結合蛋白質可使用例如羥磷灰石層析、陽離子或陰離子交換層析或較佳地親和力層析、使用所關注抗原或蛋白質A或蛋白質G作為親和力配位體來純化。蛋白質A可用於純化包括基於人類γ1、γ2或γ4重鏈的多肽之蛋白質(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62：1-13,1983)。蛋白質G經推薦用於所有小鼠同型及用於人類γ3(Guss等人，EMBO J.5：15671575,1986)。附接有親和力配位體之基質最常為瓊脂糖，但其他基質為可利用的。諸如孔隙受控玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯之機械穩定基質允許比可利用瓊脂糖所達成更快的流動速率及更短的處理時間。在蛋白質包含CH3域的情況下，Bakerbond ABX^TM 樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)適用於純化。取決於待回收的特定雙特異性抗原結合蛋白質，諸如乙醇沈澱、逆相HPLC、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱的用於蛋白質純化之其他技術亦為可能的。

在一些實施例中，本發明提供醫藥組成物，其包含本發明之一個或複數個雙特異性抗原結合蛋白質，連同醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、賦形劑、穩定劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。本發明之醫藥組成物包括但不限於液體、冷凍及凍乾組成物。「醫藥學上可接受之...」係指在所使用劑量及濃度下對人類接受者為無毒的，且在投與至人類時不產生過敏或不利反應的分子、化合物及組成物。在某些實施例中，醫藥組成物可含有用於調節、維持或保存例如組成物之pH值、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸收或滲透之調配材料。在此等實施例中，適合調配材料包括但不限於胺基酸(諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)；抗微生物劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸(ascorbic acid)、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)；增積劑(諸如甘露糖醇或甘胺酸)；螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼(caffeine)、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣；雙醣；以及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑、調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽相對離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸(sorbic acid)或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露糖醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普洛尼克(pluronic)、PEG、脫水山梨醇酯、聚山梨醇酯(諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、曲通(triton)、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷脂(lecithin)、膽固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；穩定性增強劑(諸如蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳氯化鈉或氯化鉀)、甘露糖醇山梨糖醇)；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑。調配用於治療用途之分子的方法及適合材料在醫藥技術中為已知的，並且例如描述於REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(A.R.Genrmo編)，1990,Mack Publishing Company中。

在一些實施例中，本發明之醫藥組成物包含標準醫藥載劑，諸如無菌磷酸鹽緩衝鹽水溶液、抑菌水及類似物。可使用各種水性載劑，例如水、緩衝水、0.4%鹽水、0.3%甘胺酸及類似物，且可包括用於增強穩定性之其他蛋白質，諸如經受輕微化學修飾或類似修飾的白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。

調配物中雙特異性抗原結合蛋白質之示範性濃度可在以下範圍變化：約0.1mg/ml至約180mg/ml，或約0.1mg/mL至約50mg/mL，或約0.5mg/mL至約25mg/mL，或替代地約2mg/mL至約10mg/mL。抗原結合蛋白質之水性調配物可在pH緩衝溶液中，例如在約4.5至約6.5或約4.8至約5.5範圍變化之pH下，或替代地為約5.0之pH下製備。適用於此範圍內之pH的緩衝液之實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(諸如琥珀酸鈉)、葡萄糖酸、組胺酸、檸檬酸及其他有機酸緩衝液。緩衝液濃度可為約1mM至約200mM，或約10mM至約60mM，此例如取決於緩衝液及調配物之所要等張性。

亦可穩定抗原結合蛋白質之張力劑可包括於調配物中。示範性張力劑包括多元醇，諸如甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。較佳地，水性調配物為等張的，儘管高張性或低張性溶液可為適合的。調配物中多元醇之示範性濃度可在約1%至約15% w/v範圍變化。

界面活性劑亦可添加至抗原結合蛋白質調配物以減少所調配抗原結合蛋白質之聚集及/或最小化調配物中微粒之形成及/或減少吸附。示範性界面活性劑包括非離子界面活性劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)或泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188)。界面活性劑之示範性濃度可在以下範圍(w/v)變化：約0.001%至約0.5%，或約0.005%至約0.2%，或替代地約0.004%至約0.01%。

在一個實施例中，調配物含有以上認明的藥劑(亦即抗原結合蛋白質、緩衝劑、多元醇及界面活性劑)，且基本上不含一或多種防腐劑，諸如苄醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇及氯化本索寧。在另一實施例中，防腐劑可以例如約0.1%至約2%或替代地約0.5%至約1%之濃度範圍包括於調配物中。一或多種其他醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(諸如描述於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中之彼等者)可包括於調配物中，其限制條件為該等藥劑不會不利地影響調配物之所要特性。

藉由以下方式來製備用於儲存的雙特異性抗原結合蛋白質之治療調配物：將具有所要純度之雙特異性抗原結合蛋白質與可選生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))以凍乾調配物或水溶液形式進行混合。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用劑量及濃度下對接受者為無毒的，且包括緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六烴季銨；氯化苄烷銨、氯化本索寧；苯酚、丁醇或苄醇；對羥苯甲酸烷酯(諸如對羥苯甲酸甲酯或丙酯)；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣，及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉離子；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；以及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN^TM 、普洛尼克^TM 或聚乙二醇(PEG)。

在一個實施例中，所請求發明之適合調配物含有與諸如多元醇、山梨糖醇、蔗糖或氯化鈉之張力劑(其等張及穩定作用)組合的等張緩衝劑，諸如磷酸鹽、乙酸鹽或TRIS緩衝劑。此種張力劑之一個實例為5%山梨糖醇或蔗糖。另外，調配物可視情況包括在0.01%至0.02%(wt/vol)下之界面活性劑，例如，以防止聚集或改良穩定性。調配物之pH可在4.5-6.5或4.5至5.5範圍變化。用於抗原結合蛋白質之醫藥調配物之其他示範性描述可見於US 2003/0113316及美國專利第6,171,586號中，其各自以全文引用方式併入本文。

本文中之調配物亦可含有所治療之特定適應症所必需的一種以上活性化合物，較佳為不會不利地彼此影響的具有互補活性之彼等活性化合物。例如，可能需要進一步提供免疫抑制劑。此等分子適合以對預期目的有效之量組合存在。

該等活性成分亦可圍堵於例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合作用製備之微膠囊(例如分別為羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠狀藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。

亦涵蓋抗原結合蛋白質之懸浮液及晶體形式。製成懸浮液及晶體形式之方法為熟習此項技術者所知。

欲用於活體內投藥之調配物必須為無菌的。本發明之組成物可藉由習知、熟知滅菌技術來滅菌。例如，滅菌容易藉由經無菌過濾膜過濾來完成。所得溶液可加以包裝以供使用，或在滅菌條件下過濾並凍乾，凍乾製劑係於投藥之前與無菌溶液組合。

常常使用冷凍乾燥之方法來使多肽穩定以供長期儲存，尤其當多肽在液體組成物中為相對不穩定的情況下如此。凍乾循環通常由三個步驟構成：冷凍、一級乾燥及二級乾燥(參見，Williams及Polli,Journal of Parenteral Science及Technology，第38卷，第2期，第48-59頁，1984)。在冷凍步驟中，將溶液冷卻直至其充分冷凍。呈溶液形式之整體水在此階段形成冰。冰在一級乾燥階段中昇華，該昇華係藉由使用真空減小腔室壓力至低於冰之蒸氣壓來進行。最終，在二級乾燥階段，於減小的腔室壓力及升高的存放溫度下移除吸附水或結合水。該方法產生稱為凍乾餅料之材料。此後，可在使用之前將餅料復水。

用於凍乾材料之標準復水實踐方法為再添加一定體積之純水(典型地等效於在凍乾期間移除的體積)，儘管有時在用於非經腸投藥之醫藥品之產生中使用抗菌劑之稀釋溶液(參見Chen,Drug Development及Industrial Pharmacy，第18卷：1311-1354,1992)。

在一些狀況下，已注意到賦形劑充當用於冷凍-乾燥產品之穩定劑(參見，Carpenter等人，第74卷：225-239,1991)。例如，已知賦形劑包括多元醇(包括甘露糖醇、山梨糖醇及甘油)；糖(包括葡萄糖及蔗糖)；以及胺基酸(包括丙胺酸、甘胺酸及麩胺酸)。

另外，多元醇及糖亦常常用於保護多肽免受冷凍及乾燥誘導的破壞，且增強在以乾燥狀態進行儲存期間的穩定性。一般而言，糖、尤其為雙醣在冷凍乾燥方法及儲存期間為有效的。包括單醣及雙醣及諸如PVP之聚合物的其他類別之分子亦已報告為凍乾產品之穩定劑。

對注射而言，醫藥調配物及/或藥劑可為適用於利用如上所述的適當溶液復水之粉末。此等粉末之實例包括但不限於冷凍乾燥、旋轉乾燥或噴霧乾燥粉末，非晶形粉末，顆粒，沈澱物或微粒。對注射而言，調配物可視情況含有穩定劑、pH調節劑、界面活性劑、生物可用性調節劑及此等藥劑之組合。

可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有雙特異性抗原結合蛋白質之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成形物件，例如薄膜或微膠囊形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥基乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與y-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、可降解乳酸-乙醇酸共聚物(諸如Lupron Depot^TM (由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球))，及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。諸如乙烯-乙酸乙烯酯及乳酸-乙醇酸共聚物之聚合物能夠釋放分子超過100天，而某些水凝膠釋放蛋白質釋放分子歷時較短時間段。當經囊封之多肽保留於體內長時間時，其可能會因暴露於37℃下之濕氣而變性或聚集，從而使生物活性喪失且可能使免疫原性發生變化。可取決於所涉及之機制而設計出合理策略以達成穩定。例如，若發現聚集機制係經由硫基-二硫化物交換而形成分子內S--S鍵，則可藉由修飾硫氫基殘基、自酸性溶液凍乾、控制濕氣含量、使用適當添加劑及開發特定聚合物基質組成物來達成穩定。

本發明之調配物可如本文所述設計成短效、快速釋放、長效或持續釋放的。因此，醫藥調配物亦可經調配用於受控釋放或用於緩慢釋放。

特定劑量可取決於以下來調整：疾病之病狀，受試者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食，劑量間隔，投藥路線，排泄率，及藥物之組合。含有有效量之以上劑型中之任何劑型完全在例行實驗之限定範圍內，且因此完全在本發明之範疇內。

雙特異性抗原結合蛋白質係藉由任何適合手段來投與，包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內，且若需要用於局部治療，則病灶內投藥。非經腸輸注包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或皮下投藥。另外，雙特異性抗原結合蛋白質適合藉由脈衝式輸注，尤其利用遞減劑量之抗原結合蛋白質來投與。較佳地，給藥係藉由注射來給予，最佳地藉由靜脈內或皮下注射來給予，此部分地取決於投藥是否為短暫的或長期的。涵蓋其他投藥方法，包括局部投藥，尤其為經皮、經黏膜、經直腸、經口，或例如經由置放成接近於所要位點之導管進行的局部投藥。最佳地，本發明之抗原結合蛋白質係以在0.01mg/kg至100mg/kg之間的範圍變化的劑量、以在每天至每週至每月的範圍變化的頻率(例如，每天、每隔一天、每三天或每週2、3、4、5或6次)，較佳地以在0.1mg/kg至45mg/kg、0.1mg/kg至15mg/kg或0.1mg/kg至10mg/kg的範圍變化的劑量、以在每週一次、每兩週一次或一月一次的範圍變化的頻率，以生理學溶液形式靜脈內投與。

本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質適用於治療或改善有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀。如本文所使用，術語「治療(treating)」或「治療(treatment)」為以防止病症之發展或改變病症之病理學為意圖來進行的介入。因此，「治療」係指治療性治療及預防性或防止性措施。需要治療之彼等人士包括已診斷為患有或罹患病症或病狀之彼等認識，以及欲防止其病症或病狀之彼等人士。「治療」包括在損傷、病理學或病狀之改善中的任何成功標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如症狀之減除、緩和、減少，或使得患者更可耐受損傷、病理學或病狀，減慢退化或衰退之速率，使得最終退化點較不虛弱，或改善患者之身體或精神表現。症狀之治療或改善可基於客觀或主觀參數，包括身體檢查之結果、患者之自我報告、神經精神狀況檢查及/或精神狀況評估。

因此，在一些實施例中，本發明提供用於治療或防止有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之方法，該方法包含向患者投與有效量之本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。術語「患者」包括人類患者。「有效量」通常為足以達成以下各項之量：減小症狀之嚴重性及/或頻率，消除症狀及/或根本病因，防止症狀及/或其根本病因之出現，及/或改善或緩和由特定病狀(例如，慢性疼痛、頭痛或偏頭痛)造成與該特定病狀相關聯的破壞。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。「治療有效量」為足以達成以下各項之量：補救疾病狀態(例如，頭疼、偏頭痛或慢性疼痛)或症狀，尤其為與該疾病狀態相關聯的狀態或症狀，或無論如何另外以任何方式(亦即，提供「治療功效」之方式)防止、阻礙、阻滯或逆轉疾病狀態或與該疾病相關聯的任何其他不合需要症狀之進程。「預防有效量」為醫藥組成物之量，當向受試者投與時，該醫藥組成物將具有所欲預防效應，例如防止或延遲病狀(例如，頭痛或偏頭痛)之發病(或復發)，或減小病狀(例如，頭痛、偏頭痛或頭痛症狀)之發病(或復發)之可能性。完全的治療或預防效應不一定藉由投與一次劑量而發生，並且可僅在投與一系列劑量之後發生。因此，治療或預防有效量可藉由一或多次投藥來投與。

在某些實施例中，本發明提供用於治療或改善有需要之患者的頭痛、尤其為偏頭痛之方法，該方法包含向患者投與有效量之本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。偏頭痛為持續約4小時至約72小時之復發性頭痛，其特徵為單側、脈衝式及/或中等至嚴重疼痛及/或因身體活性而加重的疼痛。偏頭痛常常伴隨噁心、嘔吐及/或對光(畏光症)、聲(懼音症)或氣味之敏感性。在一些患者中，偏頭痛發病前出現先兆。先兆典型地為視覺、感覺、語言或情緒之擾動，其傳達頭痛將很快發生之信號。本文所述的方法防止、治療或改善人類患者的具有及不具有先兆之偏頭痛的一或多種症狀。

CGRP受體及PAC1受體藉由其各別配位體之活化誘導血管擴張、尤其為硬膜血管結構之血管擴張。兩種受體傳訊級聯已牽連於偏頭痛之病理生理學，且咸信有助於經由不同但相關機構來誘導偏頭痛。由於三叉血管系統之活化而釋放的CGRP不僅誘導顱血管之血管擴張，而且有助於神經原性炎症之誘導，該神經原性炎症為繼發於感覺神經活化之炎症形式。參見，例如Bigal等人，Headache，第53卷(8)：1230-44,2013，其據此以引用方式併入。CGRP亦充當神經傳導物，以將疼痛信號自腦幹傳導至視丘。雖然CGRP經由感覺系統作用，但PAC1受體及其PACAP配位體係經由自主神經系統之副交感神經分系工作。石蟹獼猴中之免疫組織化學研究將PACAP及PAC1定位對映至穿過蝶齶神經結(SPG；亦稱翼齶神經節)之副交感神經路徑，該蝶齶神經結亦神經支配硬膜血管結構(未展示資料)。副交感神經路徑為獨立的且平行於感覺路徑，該感覺路徑亦控制硬膜血管結構張力。PAC1受體促效劑PACAP之輸注引起偏頭痛患者的類偏頭痛，從而暗示阻斷PAC1可適用於治療偏頭痛(Schytz等人，Brain 132：16-25,2009)。支援本發明所執行的另外實驗證實：選擇性PAC1抗體阻斷電刺激的三叉頸複合體(TCC)活化，此為已報告為與臨床偏頭痛功效關聯之電生理學模型(未展示資料)。在一些實施例中，相較於利用單獨的抗CGRP受體拮抗劑或抗PAC1受體拮抗劑所獲得的治療效應而言，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質在治療偏頭痛中具有相加效應或協同效應(例如，減小偏頭痛的頻率、持續時間或嚴重性)。在不受理論束縛的情況下，咸信利用本發明之雙特異性抗原結合蛋白質抑制CGRP受體及PAC1受體兩者將在治療偏頭痛中比拮抗任一單獨標靶提供更大功效。

在一些實施例中，根據本發明之方法治療的患者具有、罹患或診斷為患有陣發性偏頭痛。當有偏頭痛病史之患者(例如，生命中至少五次偏頭痛發作)每月有14個或14個以下偏頭痛天數，該患者即診斷為陣發性偏頭痛。「偏頭痛天數」包括任何日曆天數，此期間患者經歷持續大於30分鐘的具有或不具有先兆之發病、延續或復發。「偏頭痛」為與噁心或嘔吐或對光或聲之敏感性相關聯的頭疼，及/或特徵為以下疼痛特徵中之至少兩者的頭疼：單側疼痛、博動疼痛、中等至嚴重疼痛強度，或因身體活性而加重的疼痛。在某些實施例中，具有、罹患或診斷為患有陣發性偏頭痛之患者平均每月有四個，但少於15個偏頭痛天數。在相關實施例中，具有、罹患或診斷為患有陣發性偏頭痛之患者平均每月有少於15個頭痛天數。如本文所使用，「頭痛天數」為任何日曆天數，其中患者經歷如本文所定義的偏頭痛或持續大於30分鐘之任何頭痛或需要急性頭痛治療。

在某些實施例中，根據本發明之方法治療的患者具有、罹患或診斷為患有慢性偏頭痛。當偏頭痛患者(例如，生命中有至少五次偏頭痛發作的患者)每月有15個或15個以上頭痛天數，且頭痛天數之至少8天為偏頭痛天數，該患者即診斷為慢性偏頭痛。在一些實施例中，具有、罹患或診斷為患有慢性偏頭痛之患者平均每月有15個或15個以上偏頭痛天數。在本文所述的方法之某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白質之投藥防止、減少或延遲患者的陣發性偏頭痛進展至慢性偏頭痛。

在其他實施例中，本發明提供用於治療或改善有需要之患者的叢集性頭痛之方法，該方法包含向患者投與有效量之本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質。叢集性頭痛為其最突出特徵涉及頭的一側上、典型地在眼睛周圍的復發性、嚴重頭痛之病狀(參見Nesbitt等人，BMJ，第344卷：e2407,2012)。一些醫生及科學家已將由叢集性頭痛造成的疼痛描述為人類可經忍受的最強烈疼痛-比出生、燒傷或骨斷裂情況更遭。叢集性頭痛常常週期性地出現：自發緩和中斷疼痛之活動期。叢集性頭痛常常伴隨顱自主症狀，諸如流淚、鼻塞、下垂、面部潮紅、流汗及眼睛周圍腫脹，該等症狀常常限制於頭部中患有疼痛之一側。叢集性頭痛之平均發病年齡為約30-50年。該叢集性頭痛在男性中更為流行，其中男性與雌性比率為約2.5：1至約3.5：1。蝶齶神經結(SPG)刺激已用於叢集性頭痛之治療。遞送對SPG之低水平(但高頻率、生理阻斷)電刺激的神經刺激系統已在最新臨床試驗中證明在減輕叢集性頭痛之急性令人疲乏之疼痛中的功效(參見Schoenen J，等人，Cephalalgia，第33(10)卷：816-30,2013)。鑒於該證據並因為PACAP為SPG中之主要神經傳導物之一，利用本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質抑制PAC1受體傳訊預期在治療人類的叢集性頭痛中具有功效。

可根據本發明之方法治療的與CGRP受體及/或PAC1受體傳訊相關聯的其他病狀包括但不限於慢性疼痛症候群，諸如關節炎性疼痛(例如骨關節炎及類風溼性關節炎)、神經原性炎症、緊縮型頭痛、偏癱性偏頭痛、視網膜偏頭痛及血管舒張性症狀(例如潮熱、面部潮紅、流汗及夜間盜汗)，諸如與絕經期相關聯之彼等疼痛。在一個實施例中，病狀為慢性疼痛。CGRP可涉及不同於偏頭痛之慢性疼痛症候群。在齧齒動物中，鞘內遞送的CGRP誘導嚴重的疼痛，且CGRP量在許多疼痛模型中增強。另外，CGRP拮抗劑在齧齒動物中部分地阻斷急性胰腺炎中之感覺接受性(參見Wick等人Surgery，第139卷：197-201,2006)。在本文所述的方法之任何方法中，治療可包含預防性治療。預防性治療係指設計來在病狀之發病或發作之前(例如，在偏頭痛發作或叢集性頭痛發病期開始之前)採取的治療，以減少患者的症狀(例如，偏頭痛或叢集性頭痛)之頻率、嚴重性及/或時間長度。

本發明之雙特異性抗原結合蛋白質適用於偵測生物樣本中之CGRP受體及/或PAC1受體，且適用於對表現CGRP受體及/或PAC1受體之細胞或組織之鑑定。例如，雙特異性抗原結合蛋白質可用於診斷測定，例如結合測定，以便偵測及/或定量在組織或細胞表現的CGRP受體及/或PAC1受體。另外，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質可用於抑制CGRP受體與其配位體CGRP形成複合體，進而調變細胞或組織中CGRP受體之生物活性。同樣地，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質可用於抑制PAC1受體與其配位體PACAP形成複合體，進而調變細胞或組織中PAC1受體之生物活性。可調變的活性之實例包括但不限於抑制血管擴張及/或減少神經原性炎症。

本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質可用於診斷目的，以偵測、診斷或監測與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的疾病及/或病狀。亦提供用於使用熟習此項技術者已知的經典免疫組織學方法(例如，Tijssen,1993,Practice及Theory of Enzyme Immunoassays，第15卷(編者R.H.Burdon及P.H.van Knippenberg,Elsevier,Amsterdam)；Zola,1987,Monoclonal AntibodieS：A Manual of Techniques，第147-158頁(CRC Press,Inc.)；Jalkanen等人，1985,J.Cell.Biol.101：976-985；Jalkanen等人，1987,J.Cell Biol.105：3087-3096)偵測樣本中CGRP受體或PAC1受體之存在的方法。任一受體(CGRP受體或PAC1受體)之偵測可在活體內或活體外執行。

本文中提供的診斷應用包括使用抗原結合蛋白質來偵測CGRP受體及/或PAC1受體之表現，及配位體與任一受體之結合。適用於偵測受體之存在的方法之實例包括免疫測定法，諸如酶聯免疫吸附測定(ELISA)及放射免疫測定(RIA)。

對於診斷應用，抗原結合蛋白質典型地用可偵測標記基團標記。適合標記基團包括但不限於以下：放射性同位素或放射性核種(例如³ H、¹⁴ C、¹⁵ N、³⁵ S、⁹⁰ Y、⁹⁹ Tc、¹¹¹ In、¹²⁵ I、¹³¹ I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶(luciferase)、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鍊對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，經由具有各種長度之間隔子臂使標記基團偶合於抗原結合蛋白質以降低潛在空間位阻。用於標記蛋白質之各種方法在此項技術中為已知的且可加以使用。

在另一實施例中，本文所述的雙特異性抗原結合蛋白質可用於鑑定表現CGRP受體及/或PAC1受體之一或多種細胞。在特定實施例中，抗原結合蛋白質用標記基團標記且偵測經標記抗原結合蛋白質與CGRP受體及/或PAC1受體之結合。在另一特定實施例中，活體內偵測抗原結合蛋白質與CGRP受體及/或PAC1受體之結合。在另一特定實施例中，使用此項技術中已知的技術分離並量測雙特異性抗原結合蛋白質。參見，例如，Harlow及Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor(1991出版且定期補正)；John E.Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York：John Wiley & Sons。

另一態樣提供用於偵測與本文所述的抗原結合蛋白質競爭結合至CGRP受體及/或PAC1受體之測試分子的存在。一種此類分析之實例將涉及在存在或不存在測試分子下偵測含有一定量之CGRP受體及/或PAC1受體之溶液中游離抗原結合蛋白質的量。遊離抗原結合蛋白質(亦即未結合至CGRP受體及/或PAC1受體之抗原結合蛋白)之量的增加將指示測試分子能夠與雙特異性抗原結合蛋白質競爭CGRP受體及/或PAC1受體結合。在一個實施例中，抗原結合蛋白質用標記基團標記。或者，標記測試分子且在存在及不存在抗原結合蛋白質下監測遊離測試分子之量。

以下為用於示範性目的的本發明之另外的實施例，且不意欲以任何方式加以限制：

實施例1：一種雙特異性抗原結合蛋白質，其特異地結合至人類CGRP受體及人類PAC1。

實施例2：實施例1之雙特異性抗原結合蛋白質，其中抗原結合蛋白質為抗體或抗體片段。

實施例3：實施例1-2之雙特異性抗原結合蛋白質，其中抗原結合蛋白質為抗體或抗體片段，其包含見於選自如本文所闡述的命名為以下者之抗體的抗體中之所有四個可變域：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、 iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050及iPS：328051。

實施例4：實施例1-3之雙特異性抗原結合蛋白質，其中抗原結合蛋白質為抗體：(a)其選自如本文中所闡述的命名為以下者之抗體： iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、 iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050及iPS：328051；或(b)來自(a)之抗體，其包含免疫球蛋白輕鏈或免疫球蛋白重鏈，其中自該輕鏈或重鏈或兩者之N末端或C末端缺少一個、兩個、三個、四個或五個胺基酸殘基。

實施例5：實施例1-4之雙特異性抗原結合蛋白質，其中抗原結合蛋白質為抗體片段，其選自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、域抗體(dAb)互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、單鏈抗體片段、大抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、線性抗體、螯合物重組抗體、內抗體、奈米抗體、小模組化免疫醫藥劑(SMIP)、抗原結合域免疫球蛋白融合蛋白質及駱駝化抗體。

實施例6：實施例1-5之雙特異性抗原結合蛋白質，其包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白同型之恆定區。

實施例7：實施例1-6之雙特異性抗原結合蛋白質，其包含抗體之所有十二個互補決定區(CDR)，該抗體係選自如本文所闡述的命名為以下者之抗體：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、 iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、 iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050及iPS：328051。

實施例8：實施例1-6之雙特異性抗原結合蛋白質，其包含：(a)特異地結合抗體之CGRP受體的所有六個互補決定區(CDR)，該抗體係選自如本文中所闡述的命名為以下者之抗體：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、 iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050及iPS：328051；以及(b)特異地結合來自不同抗體之PAC1的所有六個CDR，該抗體係選自如本文所闡述的命名為以下者之抗體：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、 iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050及iPS：328051。

實施例9：實施例7-8之雙特異性抗原結合蛋白質，其中抗原結合蛋白質之CDR之一或多者含有保守胺基酸取代。

實施例10：實施例1-9之雙特異性抗原結合蛋白質，其包含：減少或消除效應物功能之修飾。

實施例11：一種醫藥組成物，其包含實施例1-10中任何實施例之抗原結合蛋白質，及醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。

實施例12：一種重組寄主細胞，其表現實施例1-10中任何實施例之雙特異性抗原結合蛋白質。

實施例13：實施例12之重組寄主細胞，其中細胞為CHO細胞。

實施例14：一種用於治療患者的與CGRP受體或PAC1或兩者相關聯的病狀之方法，該方法包含向患者投與有效量之實施例1-10中任何實施例之雙特異性抗原結合蛋白質。

實施例15：實施例14之方法，其中該病狀為頭痛。

實施例16：實施例15之方法，其中該病狀為叢集性頭痛。

實施例17：實施例15之方法，其中該病狀為偏頭痛。

實施例18：實施例17之方法，其中該偏頭痛為陣發性偏頭痛。

實施例19：實施例17之方法，其中該偏頭痛為慢性偏頭痛。

實施例20：實施例14之方法，其中該病狀為慢性疼痛。

實施例21：實施例14-20中任何實施例之方法，其中該方法包含預防性治療。

僅出於說明性目的提供以下實例(包括進行的實驗及達成的結果)且其不欲解釋為限制隨附申請專利範圍之範疇。

實例

實例1 工程改造CGRP受體及PAC1受體抗體以改良穩定性、生物物理性質及表現並消除化學熱點

起始抗體

抗CGRP受體抗體之產生及篩選。 單株抗人類CGRP受體抗體係如據此以全文引用方式併入的WO 2010/075238(人類CGRP受體結合蛋白質(Human CGRP Receptor Binding Proteins))之實例1-3中所述來產生並測序。簡言之，人類CRLR cDNA(GenBank登錄號U17473)及RAMP1 cDNA(GenBank登錄號AJ001014)係分別選殖至哺乳動物細胞表現載體pcDNA3.1-Zeo及pcDNA3.1-Hyg(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，以用於轉染HEK 293EBNA細胞(Invitrogen)。hCRLR cDNA及hRAMP1 cDNA亦選殖至pDSRα24載體(Kim,H.Y.等人J.Inv.Derm.Symp.Proc.(2007)12：48-49)中，以用於轉染AM-1 CHO細胞(美國專利第6,210,924號)。鑑定表現CGRPR之穩定轉染物。

分別使用10μg/小鼠及150μg/小鼠之劑量，利用純化可溶性CGRP受體蛋白質及自穩定表現CGRP受體之AM-1 CHO細胞製備的純化CGRP受體膜來免疫XENOMOUSE®動物。以10μg/小鼠之可溶性CGRP受體的劑量或75μg之純化CGRP受體膜的劑量來投與後續增強免疫。亦利用表現CGRP受體之細胞，使用每只小鼠3.4×10⁶ 個經CGRP受體轉染之細胞的劑量來免疫XENOMOUSE®動物，且以每只小鼠1.7×10⁶ 個經CGRP受體轉染之細胞的劑量進行後續增強免疫。所使用的注射位點為皮下、尾根與腹膜內之組合。免疫係根據美國專利第7,064,244號中所揭示的方法來執行，該專利之揭示內容據此以引用方式併入。根據製造商之說明書來製備佐劑TiterMax Gold(Sigma；目錄號#T2684)、Alum(E.M.Sergent Pulp and Chemical Co.,Clifton NJ，目錄號#1452-250)，且以佐劑乳液與抗原溶液之1：1比率混合。第一次注射之後4-6週收集血清，且藉由表現重組CGRP受體之293EBNA細胞之FACS染色來測定特定效價。在大致一個月至三個半月之時期內，以11-17次免疫之範圍，利用表現全長CGRP受體或可溶性CGRP受體細胞外域之細胞或來自細胞之膜來免疫小鼠。鑑定具有最高血清效價之小鼠，且製備用於融合瘤產生。在成組的多隻小鼠中執行免疫，典型地在膕肌腱(ten.Popliteal)及腹股溝淋巴結中執行免疫，且典型地自每一組中彙集脾組織以用於產生融合瘤。藉由螢光微體積測定技術(FMAT)(Applied Biosystems,Foster City,CA)來篩選融合瘤上清液之CGRP受體特異性單株抗體。針對用人類CGRP受體轉染的AM-1 CHO huCGRP受體細胞或重組HEK 293細胞來篩選上清液，且針對親本HEK293細胞反篩選上清液。使用標準RT-PCR方法來對抗CGRP受體抗體測序，如WO 2010/075238(人類CGRP受體結合蛋白質(Human CGRP Receptor Binding Proteins))之實例2-3中所述。

抗PAC1受體抗體之產生及篩選。 單株抗人類PAC1受體抗體係如據此以全文引用方式併入的WO 2014/144632(人類PAC1抗體(Human PAC1 Antibodies))中所述來產生並測序。簡言之，經由使用標準方法，例如使用美國專利公開案第2010/0172895號中詳述的彼等方法，利用PAC1細胞外域蛋白質(用T細胞抗原決定基標籤標記的DNA)、表現全長人類PAC1或其他人類PAC1抗原之L1.2細胞免疫XENOMOUSE®動物來產生抗體。在藉由利用PACAP(例如，PACAP-27或PACAP-38)或選擇性、外源肽配位體(Maxadilan)活化PAC1來偵測其阻斷cAMP之產生的能力之測定中，針對結合至PAC1受體以及針對功能拮抗劑活性來篩選融合瘤上清液，且針對相關受體VPAC1及VPAC2反篩選融合瘤上清液。對具有合乎需要功能及選擇性之彼等上清液測序並選殖、重組表現、純化，且使用標準方法再次測試其功能及選擇性。在活體外PAC1介導之cAMP測定中篩選所選擇人類PAC1受體抗體以測定固有效力。測定使用表現人類PAC1(SH-SY-5Y，內源性表現PAC1之人類神經胚細胞瘤細胞系)、石蟹獼猴PAC1、大鼠PAC1、人類VPAC1及人類VPAC2之細胞系。LANCE cAMP測定套組(PerkinElmer,Boston,MA)用於篩選。在總體積為60μL之白色96孔板中執行測定。簡言之，在測定當天，在37℃下將冷凍細胞解凍，用測定緩衝劑洗滌細胞一次，且將12μL之細胞懸浮液添加至96孔半區白色板中，該細胞懸浮液含有與Alexa 標記之抗cAMP抗體混合的10,000個細胞。在添加12μL PAC1抗體之後，在室溫下將混合物培養30min。隨後，添加12μL PAC1促效劑PACAP-38(1nM最終濃度)，且在室溫下進一步培養15min。在促效劑刺激之後，添加24μL之偵測混合物，且在室溫下培養60分鐘，並在EnVision儀器(PerkinElmer,Boston,MA)上、於665nM之發射波長下讀取該等板。藉由Prizm(GraphPad Software Inc.)或ActivityBase(IDBS)來處理並分析資料。

工程改造以改良生物物理性質

在如上所述產生並篩選的單株抗體中，針對雙特異性抗體產生及工程改造以改良生物物理性質來鑑定抗CGRP受體抗體及抗人類PAC1受體抗體之子集。

針對在PAC1抗體工程改造期間之最佳化來選擇兩種抗體。根據新穎CDR接枝實行技術產生此等抗體，以改良序列多樣性、穩定性及表現。然而，其他PAC1受體抗體及所有CGRP受體抗體不經歷最佳化工程改造方法。然而，分析此等抗體之潛在化學熱點及協方差違規(covariance violation)。已在眾多專案研究中證實：修正協方差違規改良抗體之熱穩定性、表現及生物物理性質。參見，例如WO 2012/125495。根據WO 2012/125495中所述的方法來進行所選擇抗CGRP受體及抗PAC1受體抗體之協方差分析。

實例2. CGRP受體/PAC1受體異源免疫球蛋白之產生

經由兩種不同抗體之共表現產生雙特異性抗體導致產生污染物。具有與正確配對輕鏈締合的兩種不同重鏈之較佳雙特異性、異源四聚物分子僅為所表現組合總量之少部分。污染物出現主要歸因於兩個不同原因。第一原因在於：共同來自抗體之Fc區處的重鏈可同源二聚，從而導致產生習知的單特異性抗體；或異源二聚，從而導致產生雙特異性抗體。第二原因在於：輕鏈為雜亂的，且可與重鏈中之任一者配對，從而導致產生錯誤配對的輕鏈-重鏈Fab裝配，進而不可保持活性及與所要標靶之結合。因此，雙特異性工程改造為兩步方法。第一目標為防止重鏈之同源二聚化且促成異源二聚化。此可經由使用例如凸結入孔中或電荷對突變策略工程改造抗體之Fc區而達成。第二目標為以一方式工程改造輕鏈-重鏈介面，該方式使得輕鏈僅與其同源重鏈特異地締合。

「異源Ig」平臺技術(參見，例如，WO 2009089004及WO 2014081955，兩者皆據此以全文引用方式併入)利用靜電轉向機制來克服以上提及的兩個問題。確切言之，引入或引出帶電殘基以驅動重鏈異源二聚化及輕鏈-重鏈締合。Fc區之CH3域中的電荷對突變(CPM)經由引起靜電吸引之相反電荷驅動兩個不同重鏈之異源二聚化(參見，例如，WO 2009089004及美國專利第8,592,562號)；兩個相同重鏈組合具有相同電荷且相排斥。正確的重鏈-輕鏈配對藉由CH1/CL結合介面處(參見圖1 ；「v1」及「v4」)或在VH/VL與CH1/CL結合介面之間(參見圖1 ；「v3」)之CPM來促進。正確重鏈-輕鏈組合將具有相反電荷且因此彼此吸引，而不正確的重鏈-輕鏈組合將具有相同電荷且相排斥。因此，正確裝配的異源Ig將具有三個(「v1」)或四個CPM(「v3」及「v4」)，其驅動包含兩個不同重鏈及兩個不同輕鏈之較佳異源四聚物之裝配，以便異源四聚物將為藉由表現系統產生的多數組分。

因為CGRP受體及PAC1受體標靶表現於細胞表面上，所以存在因拮抗任一標靶而造成活體內血小板耗盡之風險。因此，將無效應物功能之IgG1骨架(參見，例如，美國專利公開案第2014/0343252號，其據此以全文引用方式併入)選擇為用於產生雙特異性異源Ig分子之架構。無效應物功能之骨架包括具有敲除CH2域中之醣基化的N297G突變之IgG1變異體，及引入CH2域中以改良不存在醣基化時的穩定性之經工程改造二硫鍵。CH2域中由N297G突變產生的醣基化之缺少導致顯著地減小與Fcγ受體之結合，從而有助於解決血小板耗盡問題。參見，例如，WO 2014/144632之實例5。

利用六種抗PAC1受體抗體(如本文所述的抗體01至06)及九種抗CGRP受體工程改造之抗體(如本文所述的抗體50至58)，使用高產出量選殖、表現及純化於該等抗體之協方差違規正確的情況下產生169種相異雙特異性異源Ig分子。雙特異性異源Ig分子中之每一者具有圖1 中所示的使用無IgG1效應物功能之骨架或IgG2骨架的三種型式之一。169種雙特異性異源免疫球蛋白中之每一者之序列在表8 中列明。

實例3. 雙特異性異源免疫球蛋白分子之功能活性

使用如以下詳細描述的活體外cAMP測定，測試如實例2中所述產生的雙特異性異源Ig分子抑制人類CGRP受體及人類PAC1受體之配位體誘導活化之能力。

CGRP受體活性測定。 測定使用自ATCC(ATCC號HTB-10；「HTB-10細胞」)獲得的源於人類神經胚細胞瘤之細胞系(SK-N-MC；Spengler等人(1973)In Vitro 8：410)。HTB-10細胞表現人類CRLR及人類RAMP1，其形成人類CGRP受體(McLatchie等人，(1998)Nature,393：333-339)。

使用LANCE Ultra cAMP測定套組(PerkinElmer,Boston,MA)。在總體積為40μL之白色96孔板中執行測定。簡言之，在測定當天，在37℃下將冷凍HTB-10細胞解凍，且用測定緩衝劑洗滌一次。將含有1000個細胞之10μL之細胞懸浮液添加至96孔半區白色板中。在添加5μL之雙特異性異源IgG(單點或10點劑量反應曲線：最終濃度在1μm至0.5fM範圍變化)之後，在室溫下培養混合物30min。隨後，添加5μL CGRP受體促效劑人類α-CGRP(3nM最終濃度)，且在室溫下進一步培養15min。在人類α-CGRP刺激之後，添加20μL之偵測混合物，且在室溫下培養45分鐘，且在EnVision儀器(PerkinElmer,Boston,MA)上、於665nm 之發射波長下讀取該等板。藉由Prizm(GraphPad Software Inc.)來處理並分析資料。

PAC1受體活性測定。 測定使用自ATCC(ATCC號CRL-2266；「CRL-2266細胞」)獲得的源於人類神經胚細胞瘤之細胞系(SH-SH5Y；Biedler JL，等人，Cancer Res.38：3751-3757,1978)。CRL-2266細胞表現人類PAC1受體(Monaghan等人，J Neurochem.104(1)：74-88,2008)。

使用LANCE Ultra cAMP測定套組(PerkinElmer,Boston,MA)。在總體積為40μL之白色96孔板中執行測定。簡言之，在測定當天，在37℃下將冷凍CRL-2266細胞解凍，且用測定緩衝劑洗滌一次。將含有2000個細胞之10μL之細胞懸浮液添加至96孔半區白色板中。在添加5μL之雙特異性異源IgG(單點或10點劑量反應曲線：濃度在1μM至0.5fM範圍變化)之後，在室溫下培養混合物30min。隨後，添加5μL PAC1受體促效劑人類PACAP38(10pM最終濃度)，且在室溫下將混合物進一步培養15min。在人類PACAP38刺激之後，添加20μL之偵測混合物，且在室溫下培養45分鐘，且在EnVision儀器(PerkinElmer,Boston,MA)上、於665nm之發射波長下讀取該等板。藉由Prizm(GraphPad Software Inc.)來處理並分析資料。

169種雙特異性異源IgG中之每一者的CGRP受體及PAC1受體活性抑制百分比展示於以下表15 中。基於10點劑量反應曲線來計算雙特異性異源IgG之子集的IC50值。此等IC50值展示於以下表16 中。

表15. 藉由雙特異性異源IgG的人類CGRP受體及人類PAC1受體活性抑制百分比(n=1)

實例4. CGRP受體/PAC1受體IgG-scFv雙特異性抗原結合蛋白質之合成及活性

實例1中所述的抗CGRP受體及抗PAC1受體抗體之子集用於設計具有IgG-scFv型式之雙特異性抗原結合蛋白質。在此型式中，含有來自第一抗體之重鏈可變域及輕鏈可變域之單鏈可變片段(scFv)經由肽連接子融合至第二抗體之重鏈之羧基末端，以形成經修飾重鏈(參見圖2 )。來自第二抗體之輕鏈與經修飾重鏈一起表現。完全分子之裝配建立四價結合蛋白質，其具有針對第一標靶的位於二聚化免疫球蛋白Fc區之胺基末端側上的兩個抗原結合域，以及針對第二標靶的位於二聚化Fc區之羧基末端側上的兩個抗原結合域。

CGRPR/PAC1 IgG-scFv含有兩個抗原結合域，一個抗原結合域直接針對CGRP受體，且另一抗原結合域針對PAC1受體。編碼 CGRPR-PAC1 IgG-scFv分子之DNA分子含有編碼抗CGRPR(或抗PAC1受體)抗體重鏈(HC)及抗CGRP受體(或抗PAC1受體)抗體輕鏈(LC)之片段，在該抗體重鏈中，C末端利用或不利用半胱胺酸夾融合至抗PAC1受體(或抗CGRP受體)單鏈可變片段(scFv)。為引入可改良穩定性之半胱胺酸夾，使VH區中之位置44(Kabat編號)及VL區中之位置100(Kabat編號)突變成半胱胺酸。DNA分子藉由合成的gBlock來產生，且選殖至pTT5.1載體中。此等表現載體係用於在人類293-6E細胞中轉染並表現CGRPR/PAC1雙特異性分子。產生三十種不同IgG-scFv雙特異性分子。每一分子之完全序列在表9 中列明。

如實例3所述，使用活體外cAMP測定，測試IgG-scFv分子抑制人類CGRP受體及人類PAC1受體之配位體誘導活化之能力。用於每一標靶受體之每一分子之IC50值展示於以下表17 中。

受測試的所有雙特異性IgG-scFv分子展現針對人類CGRP受體及人類PAC1受體兩者之抑制活性。有趣地，為PAC1受體之較有效抑制劑之分子(例如，iPS：386736、iPS：386738、iPS：386740、iPS：386742、iPS：386744、iPS：386746、iPS：386748、iPS：386750、iPS：386752、iPS：386754、iPS：386756、iPS：386758、iPS：386760、iPS：386762及iPS：386764)為其中PAC1受體結合域位於Fc區之胺基末端處的彼等分子。一般而言，在此型式中，CGRP受體結合域可位於Fc區之任一側上，而實質上不影響抑制效力。

實例5. CGRP受體/PAC1受體IgG-Fab雙特異性抗原結合蛋白質之合成及活性

使用第三型式，利用實例1所述的抗CGRP受體及抗PAC1受體抗體之子集製備另外的雙特異性抗原結合蛋白質。在此IgG-Fab型式之一些實施例中，包含來自第一抗體之VL-CL域或VH-CH1域的多肽經由肽連接子融合至第二抗體之重鏈之羧基末端，以形成經修飾重鏈(參見圖3 )。包含來自第一抗體之Fab片段之保留域(亦即VH-CH1域或VL-CL域)的第二多肽與第二抗體之輕鏈及經修飾重鏈共表現，以產生完整分子。類似於IgG-scFv型式，完全分子之裝配建立四價結合蛋白質，其具有針對第一標靶的位於二聚化免疫球蛋白Fc區之胺基末端側上的兩個抗原結合域，以及針對第二標靶的位於二聚化Fc區之羧基末端側上的兩個抗原結合域。

CGRPR/PAC1 IgG-Fab由兩個抗原結合域組成，一個抗原結合域直接針對CGRP受體，且另一抗原結合域針對PAC1受體。編碼CGRPR-PAC1 IgG-Fab分子之DNA分子含有編碼抗CGRP受體(或抗PAC1受體)抗體輕鏈、抗CGRP受體(或抗PAC1受體)抗體重鏈及第三多肽之片段，在該抗體重鏈中，C末端融合至(i)抗PAC1受體(或抗CGRP受體)抗體輕鏈或(ii)抗PAC1受體(或抗CGRP受體)Fd(VH-CH1)，且該第三多肽包含Fab片段之另一半以完成羧基末端結合域(例如，(i)抗PAC1受體(或抗CGRP受體)Fd或(ii)抗PAC1受體(或抗CGRP受體)抗體輕鏈。IgG-Fab雙特異性分子含有引入每一Fab區(如圖3所例示之Fab 1及Fab 2)之CH1域及CL域中之電荷對突變。電荷對係設計來允許優先裝配抗CGRPR輕鏈/VHCH1(Fd)對及抗PAC1輕鏈/VHCH1(Fd)對。作為促進輕鏈/VHCH1(Fd)對之正確配對的另一方法，對所產生的IgG-Fab分子之子集而言，羧基末端Fab(亦即Fab 2)中之CL區及CH1區調換，以使得融合至第二抗體之重鏈之羧基末端區的多肽包含來自第一抗體之VL區及CH1區，且第二多肽包含來自第一抗體之VH區及CL區。參見表10中命名為iPS：392513、iPS：392514、iPS：392475、iPS：392519、iPS：392524、iPS：392525、iPS：392526及iPS：392527之分子。DNA分子藉由合成的gBlock來產生，且選殖至pTT5.1載體中。此等表現載體係用於在人類293 6E細胞中轉染並表現CGRPR/PAC1雙特異性分子。產生二十四種不同IgG-Fab雙特異性分子。每一分子之完全序列在表10 中列明。

如實例3所述，使用活體外cAMP測定，測試IgG-Fab分子抑制人類CGRP受體及人類PAC1受體之配位體誘導活化之能力。用於每一標靶受體之每一分子之IC50值展示於以下表18 中。

除雙特異性IgG-Fab分子中之四者外，所有受測試分子皆展現針對兩種受體之抑制活性。

本文論述並引用的所有出版物、專利及專利申請案皆據此以全文引用方式併入。應瞭解，所揭示的本發明不限於所描述特定方法、協定及材料，因為此等可有所變化。亦應理解，本文中所使用的術語僅係用於描述特定實施例之目的，且並非意欲限制所附申請專利範圍之範疇。

熟習此項技術者將僅使用常規實驗即會認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。此等等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。

<110> AMGEN INC.

<120> 雙特異性抗CGRP受體/PAC1受體抗原結合蛋白質及其用途

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<400> 614

<210> 615

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 615

<210> 616

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 616

<210> 617

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 617

<210> 618

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 618

<210> 619

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 619

<210> 620

<211> 2046

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 620

<210> 621

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 621

<210> 622

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 622

<210> 623

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 623

<210> 624

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 624

<210> 625

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 625

<210> 626

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 626

<210> 627

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 627

<210> 628

<211> 684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 628

<210> 629

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 629

<210> 630

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 630

<210> 631

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 631

<210> 632

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多核苷酸」

<400> 632

<210> 633

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 633

<210> 634

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 634

<210> 635

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 635

<210> 636

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 636

<210> 637

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 637

<210> 638

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 638

<210> 639

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 639

<210> 640

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 640

<210> 641

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<400> 641

<210> 642

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<220>

<221> 變異體

<222> (3)..(8)

<223> /置換=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<223> /注釋=「相對於針對變異體位置的注記中之彼等殘基而言序列中給出的不具有偏好的變異體殘基」

<400> 642

<210> 643

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<220>

<221> 變異體

<222> (3)..(8)

<223> /置換=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<223> /注釋=「此序列可涵蓋2-4個「Gly-Ala」重複單元，其中一些位置可不存在」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<400> 643

<210> 644

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成肽」

<220>

<221> 變異體

<222> (3)..(8)

<223> /置換=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(8)

<400> 644

<210> 645

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成多肽」

<220>

<221> 變異體

<222> (4)..(4)

<223> /置換=「」

<220>

<221> 變異體

<222> (9)..(9)

<223> /置換=「」

<220>

<221> 變異體

<222> (14)..(14)

<223> /置換=「」

<220>

<221> 變異體

<222> (19)..(19)

<223> /置換=「」

<220>

<221> 變異體

<222> (24)..(24)

<223> /置換=「」

<220>

<221> 變異體

<222> (29)..(29)

<223> /置換=「」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223> /注釋=「此序列可涵蓋2-6個「GlyxSer」重複單元，其中X為3-4且一些位置可不存在」

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<400> 645

<210> 646

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 來源

<223> /注釋=「人工序列之描述：合成6xHis標籤」

<400> 646

Claims

一種雙特異性抗原結合蛋白質，其包含特異地結合至人類CGRP受體之第一結合域，及特異地結合至人類PAC1受體之第二結合域。
如請求項1之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該第一結合域包含第一輕鏈免疫球蛋白可變區(VL1)及第一重鏈免疫球蛋白可變區(VH1)，且該第二結合域包含第二輕鏈免疫球蛋白可變區(VL2)及第二重鏈免疫球蛋白可變區(VH2)。
如請求項2之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該第一結合域及/或該第二結合域包含人源化或人類免疫球蛋白可變區。
如請求項2或3之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL1包含(i)選自SEQ ID NO：109至119之CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO：14、17、18及120至126之CDRL2；以及(iii)選自SEQ ID NO：127至135之CDRL3。
如請求項2至4中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VH1包含(i)選自SEQ ID NO：159至166之CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO：167至178之CDRH2；以及(iii)選自SEQ ID NO：179至189之CDRH3。
如請求項2至5中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL1包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，且VH1包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，且其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、167及179之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：109、120及 127之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：159、168及179之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及180之序列；(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：110、121及128之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：160、169及181之序列；(e)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、170及182之序列；或(f)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：111、17及129之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：161、171及182之序列。
如請求項2至5中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL1包含與選自SEQ ID NO：136至158之胺基酸序列至少90%一致的序列。
如請求項2至5中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VH1包含與選自SEQ ID NO：190至210之胺基酸序列至少90%一致的序列。
如請求項2至8中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中(a)VL1包含SEQ ID NO：136之序列，且VH1包含SEQ ID NO：190之序列；(b)VL1包含SEQ ID NO：138之序列，且VH1包含SEQ ID NO：192之序列；(c)VL1包含SEQ ID NO：140之序列，且VH1包含SEQ ID NO： 194之序列；(d)VL1包含SEQ ID NO：140之序列，且VH1包含SEQ ID NO：196之序列；(e)VL1包含SEQ ID NO：142之序列，且VH1包含SEQ ID NO：194之序列；(f)VL1包含SEQ ID NO：142之序列，且VH1包含SEQ ID NO：196之序列；(g)VL1包含SEQ ID NO：144之序列，且VH1包含SEQ ID NO：194之序列；(h)VL1包含SEQ ID NO：146之序列，且VH1包含SEQ ID NO：198之序列；或(i)VL1包含SEQ ID NO：146之序列，且VH1包含SEQ ID NO：200之序列。
如請求項2至9中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL2包含(i)選自SEQ ID NO：1至13之CDRL1；(ii)選自SEQ ID NO：14至19之CDRL2；以及(iii)選自SEQ ID NO：20至27之CDRL3。
如請求項2至10中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VH2包含(i)選自SEQ ID NO：55至65之CDRH1；(ii)選自SEQ ID NO：66至73之CDRH2；以及(iii)選自SEQ ID NO：74至82之CDRH3。
如請求項2至11中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL2包含CDRL1、CDRL2及CDRL3，且VH2包含CDRH1、CDRH2及CDRH3，且其中：(a)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：1、14及20之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：55、66及74之序列；(b)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：2、15及21 之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；(c)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：3、15及21之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：56、67及75之序列；或(d)CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有SEQ ID NO：4、16及22之序列，且CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有SEQ ID NO：57、68及76之序列。
如請求項2至11中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VL2包含與選自SEQ ID NO：28至54之胺基酸序列至少90%一致的序列。
如請求項2至11中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中VH2包含與選自SEQ ID NO：83至108之胺基酸序列至少90%一致的序列。
如請求項2至14中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中：(a)VL2包含SEQ ID NO：28之序列，且VH2包含SEQ ID NO：83之序列；(b)VL2包含SEQ ID NO：30之序列，且VH2包含SEQ ID NO：83之序列；(c)VL2包含SEQ ID NO：31之序列，且VH2包含SEQ ID NO：85之序列；(d)VL2包含SEQ ID NO：33之序列，且VH2包含SEQ ID NO：87之序列；(e)VL2包含SEQ ID NO：35之序列，且VH2包含SEQ ID NO：89之序列；或(f)VL2包含SEQ ID NO：37之序列，且VH2包含SEQ ID NO：91之序列。
如請求項1至15中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該第一結合域及/或該第二結合域包含Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv、單鏈可變片段(scFv)或奈米抗體。
如請求項1至16中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白之恆定區。
如請求項17之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該恆定區包含人類IgG1或IgG2免疫球蛋白CH2域及CH3域。
如請求項17或18之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該恆定區包含一或多個胺基酸取代以相較於不具有該一或多個取代之該結合蛋白質而言減少醣基化及/或效應物功能。
如請求項19之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該等取代之至少一者為N297G。
如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質為一抗體。
如請求項21之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該抗體包含來自特異地結合至人類CGRP受體之第一抗體之第一輕鏈(LC1)及第一重鏈(HC1)，以及來自特異地結合至人類PAC1受體之第二抗體之第二輕鏈(LC2)及第二重鏈(HC2)。
如請求項22之雙特異性抗原結合蛋白質，其中LC1包含與選自SEQ ID NO：271至282之序列至少90%一致的序列。
如請求項22或23之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1包含與選自SEQ ID NO：295至316之序列至少90%一致的序列。
如請求項22至24中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中：(a)LC1包含SEQ ID NO：271之序列，且HC1包含SEQ ID NO：295之序列；(b)LC1包含SEQ ID NO：272之序列，且HC1包含SEQ ID NO： 296之序列；(c)LC1包含SEQ ID NO：271之序列，且HC1包含SEQ ID NO：297之序列；(d)LC1包含SEQ ID NO：271之序列，且HC1包含SEQ ID NO：298之序列；(e)LC1包含SEQ ID NO：273之序列，且HC1包含SEQ ID NO：299之序列；(f)LC1包含SEQ ID NO：274之序列，且HC1包含SEQ ID NO：300之序列；(g)LC1包含SEQ ID NO：273之序列，且HC1包含SEQ ID NO：301之序列；(h)LC1包含SEQ ID NO：273之序列，且HC1包含SEQ ID NO：302之序列；(i)LC1包含SEQ ID NO：275之序列，且HC1包含SEQ ID NO：303之序列；(j)LC1包含SEQ ID NO：276之序列，且HC1包含SEQ ID NO：304之序列；(k)LC1包含SEQ ID NO：275之序列，且HC1包含SEQ ID NO：305之序列；(l)LC1包含SEQ ID NO：275之序列，且HC1包含SEQ ID NO：306之序列；(m)LC1包含SEQ ID NO：275之序列，且HC1包含SEQ ID NO：307之序列；(n)LC1包含SEQ ID NO：276之序列，且HC1包含SEQ ID NO：308之序列；(o)LC1包含SEQ ID NO：275之序列，且HC1包含SEQ ID NO： 309之序列；(p)LC1包含SEQ ID NO：277之序列，且HC1包含SEQ ID NO：303之序列；(q)LC1包含SEQ ID NO：278之序列，且HC1包含SEQ ID NO：304之序列；(r)LC1包含SEQ ID NO：277之序列，且HC1包含SEQ ID NO：305之序列；(s)LC1包含SEQ ID NO：279之序列，且HC1包含SEQ ID NO：303之序列；(t)LC1包含SEQ ID NO：280之序列，且HC1包含SEQ ID NO：304之序列；(u)LC1包含SEQ ID NO：279之序列，且HC1包含SEQ ID NO：305之序列；(v)LC1包含SEQ ID NO：277之序列，且HC1包含SEQ ID NO：307之序列；(w)LC1包含SEQ ID NO：278之序列，且HC1包含SEQ ID NO：308之序列；(x)LC1包含SEQ ID NO：277之序列，且HC1包含SEQ ID NO：309之序列；(y)LC1包含SEQ ID NO：281之序列，且HC1包含SEQ ID NO：310之序列；(z)LC1包含SEQ ID NO：282之序列，且HC1包含SEQ ID NO：311之序列；(aa)LC1包含SEQ ID NO：281之序列，且HC1包含SEQ ID NO：312之序列；(ab)LC1包含SEQ ID NO：281之序列，且HC1包含SEQ ID NO： 313之序列；(ac)LC1包含SEQ ID NO：281之序列，且HC1包含SEQ ID NO：314之序列；(ad)LC1包含SEQ ID NO：282之序列，且HC1包含SEQ ID NO：315之序列；或(ae)LC1包含SEQ ID NO：281之序列，且HC1包含SEQ ID NO：316之序列。
如請求項22至25中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中LC2包含與選自SEQ ID NO：211至221之序列至少90%一致的序列。
如請求項22至26中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC2包含與選自SEQ ID NO：233至251之序列至少90%一致的序列。
如請求項22至27中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中：(a)LC2包含SEQ ID NO：211之序列，且HC2包含SEQ ID NO：233之序列；(b)LC2包含SEQ ID NO：212之序列，且HC2包含SEQ ID NO：234之序列；(c)LC2包含SEQ ID NO：211之序列，且HC2包含SEQ ID NO：235之序列；(d)LC2包含SEQ ID NO：211之序列，且HC2包含SEQ ID NO：236之序列；(e)LC2包含SEQ ID NO：213之序列，且HC2包含SEQ ID NO：233之序列；(f)LC2包含SEQ ID NO：213之序列，且HC2包含SEQ ID NO：235之序列；(g)LC2包含SEQ ID NO：214之序列，且HC2包含SEQ ID NO：237之序列； (h)LC2包含SEQ ID NO：215之序列，且HC2包含SEQ ID NO：238之序列；(i)LC2包含SEQ ID NO：214之序列，且HC2包含SEQ ID NO：239之序列；(j)LC2包含SEQ ID NO：214之序列，且HC2包含SEQ ID NO：240之序列；(k)LC2包含SEQ ID NO：216之序列，且HC2包含SEQ ID NO：241之序列；(l)LC2包含SEQ ID NO：217之序列，且HC2包含SEQ ID NO：242之序列；(m)LC2包含SEQ ID NO：216之序列，且HC2包含SEQ ID NO：243之序列；(n)LC2包含SEQ ID NO：216之序列，且HC2包含SEQ ID NO：244之序列；(o)LC2包含SEQ ID NO：218之序列，且HC2包含SEQ ID NO：245之序列；(p)LC2包含SEQ ID NO：219之序列，且HC2包含SEQ ID NO：246之序列；(q)LC2包含SEQ ID NO：218之序列，且HC2包含SEQ ID NO：247之序列；(r)LC2包含SEQ ID NO：218之序列，且HC2包含SEQ ID NO：248之序列；(s)LC2包含SEQ ID NO：220之序列，且HC2包含SEQ ID NO：249之序列；(t)LC2包含SEQ ID NO：221之序列，且HC2包含SEQ ID NO：250之序列；或 (u)LC2包含SEQ ID NO：220之序列，且HC2包含SEQ ID NO：251之序列。
如請求項22至28中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1或HC2包含至少一個胺基酸取代以用帶負電胺基酸置換帶正電胺基酸。
如請求項29之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該取代用帶負電胺基酸置換在位置370、392及/或409處之離胺酸。
如請求項22至28中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1或HC2包含至少一個胺基酸取代以用帶正電胺基酸置換帶負電胺基酸。
如請求項31之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該取代用帶正電胺基酸置換在位置356及/或399處之天冬胺酸。
如請求項31之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該取代用帶正電胺基酸置換在位置356及/或357處之麩胺酸。
如請求項22至33中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，且LC1包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，其中引入HC1中之該帶電胺基酸具有與引入LC1中之該胺基酸相反的電荷。
如請求項34之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1中之該胺基酸取代在位置44及/或183處，且LC1中之該胺基酸取代在位置100及/或176處。
如請求項35之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC1中之該胺基酸取代為G44E及/或S183E，且LC1中之該胺基酸取代為G100K及/或S176K。
如請求項22至36中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC2包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，且LC2包含至少一個胺基酸取代以引入帶電胺基酸，其中引入HC2中之該帶電胺基酸具有與引入LC2中之該胺基酸相反的電荷。
如請求項37之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC2中之該胺基酸取代在位置44及/或183處，且LC2中之該胺基酸取代在位置100及/或176處。
如請求項38之雙特異性抗原結合蛋白質，其中HC2中之該胺基酸取代為G44K及/或S183K，且LC1中之該胺基酸取代為G100E及/或S176E。
如請求項21至39中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該抗體係選自如表8中列明的命名為以下者之該等抗體：iPS：326417、iPS：326626、iPS：326628、iPS：326631、iPS：326634、iPS：327870、iPS：327871、iPS：326645、iPS：326648、iPS：326651、iPS：326654、iPS：328000、iPS：328001、iPS：326661、iPS：326663、iPS：326666、iPS：326669、iPS：327017、iPS：327018、iPS：327019、iPS：327023、iPS：327024、iPS：327025、iPS：327026、iPS：327091、iPS：327092、iPS：327093、iPS：327094、iPS：326414、iPS：327102、iPS：327103、iPS：327104、iPS：327105、iPS：327106、iPS：327107、iPS：327108、iPS：327109、iPS：327110、iPS：327111、iPS：327112、iPS：327267、iPS：327268、iPS：327269、iPS：327270、iPS：327272、iPS：327273、iPS：327274、iPS：327275、iPS：327276、iPS：327277、iPS：327278、iPS：327279、iPS：327280、iPS：327281、iPS：327282、iPS：327283、iPS：327284、iPS：327285、iPS：327286、iPS：327287、iPS：327288、iPS：327289、iPS：327290、iPS：327291、iPS：327677、iPS：327678、iPS：327679、iPS：327680、iPS：327681、iPS：327682、iPS：327683、iPS：327684、iPS：327685、iPS：327686、iPS：327687、iPS：327688、iPS：327689、iPS：327690、iPS：327691、iPS：327693、iPS：327694、 iPS：327696、iPS：327697、iPS：327698、iPS：327699、iPS：327700、iPS：327701、iPS：327702、iPS：327703、iPS：327704、iPS：327705、iPS：327706、iPS：327707、iPS：327708、iPS：327709、iPS：327710、iPS：327711、iPS：327712、iPS：327713、iPS：327714、iPS：327717、iPS：327718、iPS：327719、iPS：327721、iPS：327722、iPS：327724、iPS：327725、iPS：327726、iPS：327727、iPS：327728、iPS：327729、iPS：327730、iPS：327731、iPS：327732、iPS：327733、iPS：327734、iPS：327735、iPS：327736、iPS：327737、iPS：327738、iPS：327739、iPS：327740、iPS：327741、iPS：327742、iPS：327872、iPS：327874、iPS：327875、iPS：327876、iPS：327877、iPS：327878、iPS：327879、iPS：327880、iPS：327881、iPS：327882、iPS：327883、iPS：327884、iPS：327885、iPS：327886、iPS：327887、iPS：327888、iPS：327889、iPS：327890、iPS：327891、iPS：327892、iPS：327893、iPS：327894、iPS：327895、iPS：327896、iPS：327897、iPS：328031、iPS：328033、iPS：328034、iPS：328035、iPS：328036、iPS：328037、iPS：328038、iPS：328039、iPS：328040、iPS：328041、iPS：328042、iPS：328043、iPS：328044、iPS：328045、iPS：328046、iPS：328047、iPS：328048、iPS：328049、iPS：328050或iPS：328051。
如請求項40之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該抗體係選自如表8中列明的命名為以下者之該等抗體：iPS：327730、iPS：327680、iPS：328001、iPS：327741、iPS：326648、iPS：327689、iPS：327111、iPS：327742、iPS：327698、iPS：327272、iPS：327717、iPS：327702或iPS：327270。
如請求項1至20中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質包含：(i)特異地結合至人類CGRP受體之第一結合域，其包含第一輕鏈免疫球蛋白可變區(VL1)及第一重鏈免疫球蛋白可變區(VH1)；(ii)特異地結合至人類PAC1受體之第二結合域，其包含第二輕鏈免疫球蛋白可變區(VL2)及第二重鏈免疫球蛋白可變區(VH2)；以及(iii)人類免疫球蛋白Fc區，其中該等結合域之一定位於該Fc區之該胺基末端處，而另一結合域定位於該Fc區之該羧基末端處。
如請求項42之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該羧基末端結合域為scFv，且在其胺基末端處經由肽連接子融合至該Fc區之該羧基末端。
如請求項43之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該等可變區以VH-VL或VL-VH定向定位於該scFv內。
如請求項43或44之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該肽連接子包含SEQ ID NO：368之序列。
如請求項42之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該羧基末端結合域為Fab，且經由肽連接子融合至該Fc區之該羧基末端。
如請求項46之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該Fab經由該Fab之該VL區之該胺基末端融合至該Fc區。
如請求項46之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該Fab經由該Fab之該VH區之該胺基末端融合至該Fc區。
如請求項46至48中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該肽連接子包含SEQ ID NO：368之序列。
如請求項42至49中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該胺基末端結合域為Fab，且經由免疫球蛋白鉸鏈區融合至該Fc區之該胺基末端。
如請求項50之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該胺基末端Fab經由該Fab之該CH1區之該羧基末端融合至該Fc區。
如請求項42至49中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該胺基末端結合域特異地結合至人類CGRP受體，且該羧基末端結合域特異地結合至人類PAC1受體。
如請求項42至49中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該胺基末端結合域特異地結合至人類PAC1受體，且該羧基末端結合域特異地結合至人類CGRP受體。
一種雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其包含：(i)來自第一抗體之輕鏈及重鏈；以及(ii)scFv，其包含來自第二抗體之輕鏈免疫球蛋白可變區(VL)及重鏈免疫球蛋白可變區(VH)，其中該scFv在其胺基末端處經由肽連接子融合至該重鏈之該羧基末端，以形成經修飾重鏈；且其中該第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，而另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。
如請求項54之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該等可變區以VH-VL或VL-VH定向定位於該scFv內。
如請求項54或55之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體特異地結合至人類CGRP受體，且該第二抗體特異地結合至人類PAC1受體。
如請求項56之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中：(a)該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：411至416之序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：393之序列；(b)該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：417至421之序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：394之序列；或(c)該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：422至425之序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：395之序列。
如請求項57之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質係選自如表9中列明的命名為以下者之該等結合蛋白質：iPS：386731、iPS：386725、iPS：386717、iPS：386715、iPS：386707、iPS：386705、iPS：386723、iPS：386719、iPS：386713、iPS：386709、iPS：386727、iPS：386721、iPS：386711、iPS：386733或iPS：386729。
如請求項54或55之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體特異地結合至人類PAC1受體，且該第二抗體特異地結合至人類CGRP受體。
如請求項59之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：396至410之序列，且該輕鏈包含SEQ ID NO：392之序列。
如請求項60之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質係選自如表9中列明的命名為以下者之該等結合蛋白質：iPS：386738、iPS：386764、iPS：386762、iPS：386760、iPS：386758、iPS：386756、iPS：386754、iPS：386752、iPS：386750、iPS：386748、iPS：386746、iPS：386744、iPS：386742、iPS：386740或iPS：386736。
一種雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其包含：(i)來自第一抗體之輕鏈；(ii)來自該第一抗體之重鏈，其中該重鏈在其羧基末端處經由肽連接子融合至包含第二抗體之VL-CL域或VH-CH1域之第一多肽，以形成經修飾重鏈；以及(iii)第二多肽，其包含該第二抗體之VH-CH1域或VL-CL域；且其中該第一抗體或第二抗體特異地結合至人類CGRP受體，而另一抗體特異地結合至人類PAC1受體。
如請求項62之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一多肽包含該第二抗體之VL-CL域，且該第二多肽包含該第二抗體之 VH-CH1域。
如請求項62之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一多肽包含該第二抗體之VH-CH1域，且該第二多肽包含該第二抗體之VL-CL域。
如請求項62至64中任一項之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體特異地結合至人類CGRP受體，且該第二抗體特異地結合至人類PAC1受體。
如請求項65之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：275或SEQ ID NO：427之序列，該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：440至451之序列，且該第二多肽包含選自SEQ ID NO：460至463之序列。
如請求項66之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質係選自如表10中列明的命名為以下者之該等結合蛋白質：iPS：392524、iPS：392525、iPS：392526、iPS：392527、iPS：392532、iPS：392533、iPS：392534或iPS：392535。
如請求項62至64中任一項之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體特異地結合至人類PAC1受體，且該第二抗體特異地結合至人類CGRP受體。
如請求項68之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：214或SEQ ID NO：426之序列，該經修飾重鏈包含選自SEQ ID NO：428至439之序列，且該第二多肽包含選自SEQ ID NO：452至459之序列。
如請求項69之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該結合蛋白質係選自如表10中列明的命名為以下者之該等結合蛋白質：iPS：392513、iPS：392514、iPS：392475、iPS：392519、iPS：392515、iPS：392516、iPS：392521、iPS：392520、iPS：392517、iPS：392518、 iPS：392522或iPS：392523。
如請求項54至70中任一項之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體及/或該第二抗體為人類IgG1或人類IgG2抗體。
如請求項71之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體為在該重鏈中具有N297G突變之人類IgG1抗體。
如請求項71或72之雙特異性、多價抗原結合蛋白質，其中該第一抗體為在該重鏈中具有突變R292C及V302C之人類IgG1抗體。
一或多種經分離之核酸，其編碼如請求項1至73中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質。
一種表現載體，其包含如請求項74之一或多種經分離之核酸。
一種寄主細胞，其包含如請求項75之載體。
一種用於製備雙特異性抗原結合蛋白質之方法，其包含：在允許該抗原結合蛋白質之表現的條件下培養如請求項76之寄主細胞；以及自該培養物回收該抗原結合蛋白質。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至73中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，及醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑或載劑。
一種用於治療有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之方法，該方法包含向該患者投與有效量之如請求項1至73中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質。
如請求項79之方法，其中該病狀為頭痛。
如請求項80之方法，其中該頭痛為叢集性頭痛。
如請求項80之方法，其中該頭痛為偏頭痛。
如請求項82之方法，其中該偏頭痛為陣發性偏頭痛。
如請求項82之方法，其中該偏頭痛為慢性偏頭痛。
如請求項79之方法，其中該病狀為慢性疼痛。
如請求項79至85中任一項之方法，其中該治療包含預防性治療。
一種如請求項1至73中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質在製備用於治療有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之藥劑中的用途。
如請求項87之用途，其中該病狀為頭痛。
如請求項88之用途，其中該頭痛為叢集性頭痛。
如請求項88之用途，其中該頭痛為偏頭痛。
如請求項90之用途，其中該偏頭痛為陣發性偏頭痛。
如請求項90之用途，其中該偏頭痛為慢性偏頭痛。
如請求項87之用途，其中該病狀為慢性疼痛。
如請求項87至93中任一項之用途，其中該治療包含預防性治療。
如請求項1至73中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其適於用於治療有需要之患者的與CGRP受體及/或PAC1受體相關聯的病狀之方法。
如請求項95之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該病狀為頭痛。
如請求項96之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該頭痛為叢集性頭痛。
如請求項96之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該頭痛為偏頭痛。
如請求項98之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該偏頭痛為陣發性偏頭痛。
如請求項98之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該偏頭痛為慢性偏頭痛。
如請求項95之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該病狀為慢性疼痛。
如請求項95至101中任一項之雙特異性抗原結合蛋白質，其中該治療包含預防性治療。