JPH03502801A - 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、免疫グロブリン（Ｉｇ）超群から誘導される単一ドメインリガンド、 そのようなリガンド少なくとも１つからなる受容体、このようなリガンドをコー ドするＤＮＡ配列のクローニング、増幅および発現方法、Ｉｇ−型分子および上 記リガンドまたは受容体の製造のにおける上記ＤＮＡ配列の使用方法、ならびに 治療、診断または接触への上記リガンドまたは受容体の使用に関する。 参考文献の一覧表を本明細書の末尾に付す。そこに挙げた文献は、角括弧内に番 号を示して記述中に引用する。 Ｉｇ超超群は、Ｉｇ自体のみでなく、１９２２球のようなリンパ系細胞上の受容 体のような分子も包含する。 免疫グロブリンは、互いに共有結合した少なくとも１個のＨ鎖と１個の軽鎖から なる。それぞれの鎖は多くのドメインに分割される。各鎖のＮ末端には可変性ド メインがある。Ｈ鎖およびＬ鏡上の可変性ドメインは互いに適合して、特定の標 的分子を受容するように設計された結合部位を形成する。Ｉｇの場合、標的分子 は抗原である。 Ｔ細胞受容体は同サイズの２個の鎖、α鎖およびβ鎖を有し、それぞれは２つの ドメインから構成されている。 各鎖のＮ末端には可変性ドメインがあり、α鎖およびβ鎖の可変性ドメインは互 いに適合して、標的分子、この場合は組織適合抗原によって与えられるペプチド に対する結合部位を形成すると考えられている。可変性ドメインは、そのアミノ 酸配列がとくにある分子から他の分子へと変化するので、そのように呼ばれる。 この配列の変化により、その分子はきわめて広範囲の標的分子を認識できるよう になる。 どのようにして可変性ドメインが作られるかを明らかにするため、１ｇ分子につ いて多くの研究が行われてきた。これまでに、各可変性ドメインは比較的保存性 の高い多くの領域と、３つの超可変性領域からなることが明らかにされている。 この３つの超可変性領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤ　Ｒ）として知られ ている。 結晶学的研究によれば、１ｇ分子の各可変性ドメインでは、ＣＲＤは、保存性配 列の領域によって形成された枠組に支持されていることが示されている。３つの ＣＤＲは枠組領域によって集められ、他の鎖のＣＤＲとともに、標的分子を受容 するポケットが形成される。 組換えＤＮＡ技術の出現以来、この技術を１ｇ分子および誘導体のクローン化お よび発現に利用することに多くの興味が示されてきた。この興味は、これを主題 とした特許出願および他の文献の数に反映している。 完全なＩｇのクローン化および発現に関して、特許文献に現れた最初の研究はＥ Ｐ−Ａ−０１２０６９４号（Ｂｏｓｓ）である。Ｂｏｓｓの出願は同時に、キメ ラ抗体のクローン化および発現に関するものである。キメラ抗体とは、あるＩｇ からの可変領域が他のＩｇからの不変ドメインと融合したＩｇ型分子である。通 常、可変ドメインはある種のＩｇ（多くの場合マウスＩｇ）から誘導され、不変 ドメインは別の種のＩｇ（多くの場合ヒトＩｇ）から誘導される。 その後のヨーロッパ特許出願、ＥＰ−Ａ−０１２５０２３号（Ｇｅｎｅｌｅｃｈ ）はＢｏｓｓの出願とほぼ同じ主題に関するものであるが、他の変種１ｇ型分子 の組換えＤＮＡ技術による製造も包含する。 ＥＰ−Ａ−０１９４２７６号（Ｎｅ＋＋ｂＣｔＩｅｒ）はｌ１ｏｓｓの出願に開 示された型のキメラ抗体のみでなく、不変ドメインの一部またはすべてが、非１ ｇ誘導蛋白質配列によって置換されたキメラ抗体をも開示している。たとえば、 Ｈ鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインが、酵素または蛋白トキシンから誘導される 蛋白質によって置換される。 ＥＰ−Ａ−０２３９４００号（Ｗｉ＋ｔｅｒ）は、１ｇ分子の製造へのまた別の アプローチを開示している。このアプローチでは、第一の型のＩｇからのＣＤＲ のみが、その正常ＣＤＲに代えて第二の型１ｇ上に移植される。 このようにして製造された１ｇ分子は、ＣＤＲがＩｇ全全体比較的小部分を形成 するにすぎないので、第二の型の部分が圧倒的な優位を占めている。しかしなが ら、ＣＤＲはそのＩｇの特異性を決定する部分であるから、このようにして製造 された１ｇ分子は第一のＩｇから誘導される特異性を有する。 以下、キメラ抗体、ＣＤＲ−移植１　ｇ、　ＧｃｎｅＮｅｃｂによって報告され た変換抗体、ならびにこのようなＩｇのフラグメントたとえばＦ　（ａ　ｂ’　 ）　！およびＦｖフラグメントを本明細書では、修飾抗体と呼ぶことにする。 組換えＤＮＡ技術を用いたＩｇ分野におけるすべての活動の主たる理由のひとつ は、治療へのＩｇの応用の願望である。Ｋｏｈｌｅｔ　＆　Ｍ＋１ｓｌｅｉｎに よって開発されたハイプリドーマ法を用いてほとんど任意の特異性をもつモノク ローナル抗体（ＭＡｂ）を製造できることはよく知られている。たとえば、癌抗 原に対するＭａｂが製造されている。これらのＭＡｂを毒素に共有結合させるか または融合させれば、癌治療用の「魔法の弾丸」が得られるであろうと想像され る。正常組織または細胞表面抗原に対するＭＡｂも製造されている。ｉｎ　　ｖ ｉｖｏでの造影に使用できるように、これらに標識を結合させることができる。 このようなＭＡｂを治療またはｉｎ　　ｖｉｖｏ診断に使用する際の大きな障害 は、製造される大部分のＭＡｂがげっ歯類とくにマウス起源のものということで ある。 ヒトＭＡｂを製造することはきわめて難しい。大部分のＭＡｂがヒト以外の種か ら誘導されるので、ヒトでは抗原性をを示す。すなわち、これらのＭＡｂをヒト に投与すると、ヒトに装備されている抗＝Ｉｇ反応が生じる。 このような反応により、たとえば抗体は速やかに破壊または除去されて治療また は診断は妨害され、あるいは患者に有害なアレルギー反応や免疫複合体性過敏症 反応を生じる。 修飾１ｇの製造は、患者に投与されるＩｇが可能な限り「人間性」でありながら 、なお適当な特異性を維持するように提案されてきたものである。したがって、 修飾Ｉｇには、特異性が誘導されたＭＡｂとして有効であると同時に、抗原性は あまり強くないことが期待されている。すなわち修飾１ｇは、治療または診断過 程に必要な回数、使用できるものでなければならない。 遺伝子レベルでは、Ｈ鎖可変ドメインは、３個の遺伝子セグメント、すなわち「 非再配列ＪＶＨ遺伝子（Ｎ末端の３個の枠組領域、最初の２個の完全ＣＤＲ，お よび第三のＣＤＲの最初の部分をコードする）、多様相（Ｄ　Ｈ）−セグメント （ＤＨ）（第三のＣＤＨの中央部分をコードする）、および接合セグメント（Ｊ Ｈ）（第三のＣＤＨの最後の部分と第四の枠組領域）をコードする）から構築さ れる「再配列」遺伝子によってコードされる。Ｂ細胞の成熟に際しては、各非再 配列ＶＨ遺伝子が１個のＤＨ遺伝子と１個のＪＨ遺伝子に連結するように、遺伝 子が再配列される。再配列遺伝子はＶＨ−ＤＨ−ＪＨに相当する。この再配列遺 伝子が、１ｇ鎖の不変部分をコードする遺伝子に連結する。 Ｌ鎖の場合も、多様性領域がないことを除けば事情は類似している。即ち、Ｈ鎖 の可変性ドメインは、「非再配列ＪＶＬ遺伝子とＪＬ遺伝子によってコードされ ている。Ｌ鎖には２種類、即ちカッパ（に）とラムダ（λ）があって、それぞれ 、非再配列Ｖに遺伝子とＪにセグメント、および非再配列Ｖλ遺伝子とＪλ上セ グメントら構成される。 これまでの研究から、有効な構造には２種の可変ドメイン相互の会合を必要とす ることが示されている。例えばＨ鎖およびＬ鎖の両ドメインの相互の会合により 、抗原結合部位を生じることが明らかにされた［１］。この仮説は、抗体／抗原 複合結晶のＸ線結晶回折研究によって支持されている［２〜６］。これらの研究 は、ＨおよびＬ鎖側抗体の可変ドメインが抗原と接触することを示している。Ｈ およびＬ鎖の可変性ドメインが抗原との効果的な結合に必要であるとの期待が、 細菌によりこれらのドメインを共分泌させたり［１］、一本鎖抗体の場合のよう にドメインを短いポリペプチドセクションで互いに連結する［８，９］研究の基 盤になっている。 単離されたＨ鎖とＬ鎖の結合も検出された。しかしながら、結果は、これがＨ鎖 またはＬ鎖のダイマーの性質であったことを強く示唆するものであった。主とし てポリクロナール抗体を用い、抗体Ｈ鎖とＬ鎖を変性条件下で分離した初期の研 究［１０］では、単離された抗体Ｈ鎖が蛋白抗原［１１］またはハプテン［１２ ］に結合できることが示唆された。蛋白抗原の結合の性質は明らかにされなかっ たが、Ｈ鎖フラグメントのハプテン結合親和性は２次の大きさで減少し［１２］ 、結合するハプテン分子の数は単離Ｈ鎖あたり０．１４、または０．３７［１３ ］もしくは０．２６　［１４］のように様々に評価された。さらに、ハプテンの 結合は、ダイマーＨ鎖またはダイマーＬ鎖の性質であることが明らかにされた［ １４］。実際、Ｌ鎖のダイマーは結晶化された。Ｌ鎖のダイマーでは、２個の鎖 が、ハプテンの単一分子を結合できる腔部を形成することが示されている［１５ ］。 これが、有効な結合を達成するには、ダイマーを形成させること、好ましくは、 Ｈ鎖／Ｌ鎖の、それぞれの可変性ドメインを含有するダイマーが必須であるとい う仮説を裏付けるものである。この仮説はまた、先に引用した参考特許の教示の 基盤となったものであり、それらの意図は常にダイマー、好ましくはＨ／Ｌ鎖ダ イマー分子を製造することである。 期待に反して、単離１ｇＨ鎖可変可変性ドメイン抗原と１＝１の比率で結合し、 しかもその場合の結合定数は完全抗原分子との結合の場合と同等の大きさを示す ことが発見されたのである。これまでに知られていた事実および本技術分野の熟 練者によって作られてきた仮説を考慮すると、これは全く驚くべきことである。 したがって、本発明の第一の態様は、Ｉｇ超超群らの分子のひとつの鎖の可変ド メインの少なくとも部分から構成される単一ドメインリガンドを提供するもので ある。 好ましくは、リガンドは、１ｇ　Ｌ鎖または、とくに好ましくはＨ鎖の可変ドメ インから構成される。 リガンドは任意の既知方法により、たとえば、■ｇ超群分子の制御された切断ま たはペプチド合成によって製造できる。しかしながら、これらのリガンドは組換 えＤＮＡ技術によって製造されるのが好ましい。たとえば、Ｈ鎖可変ドメインの 再配列遺伝子をコードする遺伝子は、たとえばクローン化または遺伝子合成によ って製造され、適当な発現ベクター中に配置される。ついでこの発現ベクターを 用いて適合性のある宿主細胞をトランスホームし、ついでこれを培養してリガン ドを発現させ、好ましくは分泌させる。 所望により、このリガンドの遺伝子は、発現したドメインの性質を改良するため 、たとえば、リガンドの発現収率もしくは溶解度を増大させるため、リガンドの より良好な結合を可能にするため、また他の分子との共有結合（たとえばシステ ィンやヒスチジンのような化学的に反応性の残基の導入）あるいは非共有結合の ための第二の部位を導入するために、突然変異を起こさせることもできる。とく に、血清中でのドメインの滞留時間を延長するために血清成分に結合する第二の 部位、またはエフェクター機能をもつ分子たとえば補体の成分、もしくは細胞表 面上の受容体に結合する第二の部位を導入するのが望ましい。 すなわち、通常Ｈ鎖可変ドメインとＬ鎖可変ドメインとの界面に存在する疎水性 残基はより親水性の残基に変異させて溶解性を改良すること、ＣＤＲループの残 基を変異させて抗原結合製を改良すること、他のループもしくはβ−シートの部 分の残基を変異させて新たな結合活性を導入することが可能である。突然変異に は、単点突然変異、多点突然変異またはより広範な変化が包含され、任意の様々 な組換えＤＮＡ法、たとえば遺伝子合成、特定部位の突然変異誘発、またはポリ メラーゼ連鎖反応によって導入できる。 本発明のリガンドは完全な１ｇ分子の場合と同等な結合親和性をもつので、この リガンドは１ｇ分子またはリガンドと同じく多くの方法で使用できる。たとえば 、１ｇ分子は、治療に（たとえば癌、細菌性およびウィルス性疾患）、診断に（ たとえば妊娠試験）、予防接種に（たとえば、抗原を模倣する抗−イディオタイ プ抗体の製造に）、ホルモンまたは成長刃の活性の調節に、検出に、バイオセン サーに、また触媒に使用されてきた。 本発明のサイズの小さいリガンドには完全な抗体に優るいくつかの利点がもたら される。たとえば、低分子量薬剤（たとえばジゴキシン）の活性を中和し、結合 した薬剤の腎からの濾過；組織および腫瘍への浸透；ウィルス表面の小さな保存 性領域たとえばウィルスの「峡谷１部への結合によるウィルスの中和［１６コ、 蛋白質の高分解エピトープマツピング；抗原を模倣するリガンドによる予防接種 への応用が企図される。 本発明はまた、本発明の第一の態様におけるリガンドが１種もしくは２種以上の エフェクター分子、標識、表面、または同種もしくは異種の特異性を有する１種 もしエフェクター分子に連結したリガンドからなる受容体は治療に使用できる。 エフェクター分子は、リシンもしくはシュードモナストキシン、プロドラッグを 活性化できる酵素、結合パートナ−または放射性同位元素とすることができる。 放射性同位元素は、リガンドに直接結合させてもよく、またリガンドに直接結合 するキレート構造によってそれに結合させることもできる。このような同位元素 が結合したリガンドはＦｖフラグメントに基づくリガンドよりもはるかに小さく 、より容易に組織に浸透し腫瘍に接近することが期待できる。 標識に連結したリガンドからなる受容体は診断に有用である。標識は重金属原子 または放射性同位元素とすることができて、この場合、受容体はＸ線または他の 走査装置を用いるｉｎ　　ｖｉｖｏ造影に利用できる。金属原子または放射性同 位元素は、リガンドに直接またはリガンドに直接結合したキレート構造を介して 結合させることができる。ｉｎ　　ＶｉｔｒＯでの診断試験用には、標識は、重 金属原子、放射性同位元素、酵素、蛍光もしくは着色分子、または抗体、抗体フ ラグメントもしくは他の蛋白質によって検知できる蛋白質もしくはペプチドタグ とすることができる。このような受容体はＥＬ　Ｉ　ＳＡまたは蛍光連結検定の ような任意の既知診断試験への利用が期待できる。 表面たとえばクロマトグラフィーにカラムに連結したリガンドからなる受容体は 、アフィニティークロマトグラフィーによる他の分子の精製に使用できる。リガ ンドの細胞への連結、例えば大腸菌の外膜蛋白質またはリガンドを細胞膜に局在 化する疎水性テールへの結合は、リガンドが結合する多重部位をもつ分子の存在 下に細菌または細胞を凝集させる簡単な診断試験を可能にするものである。 少なくとも２種のリガンドからなる受容体をたとえば診断試験に使用できる。第 一のリガンドは試験抗原に結合し、第二のリガンドはレポーター分子たとえば酵 素、蛍光染料、着色染料、放射性同位元素、または着色、蛍光もしくは放射性標 識蛋白質に結合する。 また、このような受容体は、抗原への結合を増大させるのに有用である。第一の リガンドは抗原の第一のエピトープに結合し、第二のリガンドは第二のエピトー プに結合する。このような受容体はまた、細胞の表面上の近似した別の抗原に対 する結合の親和性および特異性を増大させるためにも使用できる。第一のリガン ドは第一の抗原へ、第二のエピトープは第二の抗原に結合し、強力な結合は細胞 表面上のエピトープの共発現に依存する。 これは、いくつかの表面マーカーの発現が増大している腫瘍の治療に有用性が考 えられる。リガンドがさらに増えれば、さらに結合または特異性の改善が付加さ れる。 しかも、同一または多重特異性を有する一連のリガンドを用いると腎臓によって 循環から濾過され難い大分子が創製される。 抗原を模倣するリガンドの予防接種に一連のリガンドを使用すれば、免疫処置エ ピトープの反復により、単一のリガンドよりさらに有効なことがわかる。所望に より、このような多重リガンドをもつ受容体には、上述の治療または診断に使用 できるように、エフェクター分子または標識を包含させることができる。 リガンドは、任意の適当な手段たとえば共有または非共有的化学結合により、受 容体の他の部分に連結させることができる。しかしながら、受容体がリガンドお よび他の蛋白分子からなる場合には、それらは組換えＤＮＡ技術により融合生成 物として製造されるのが好ましい。 必要に応じて、可撓性を付与するために、リガンドと他の蛋白分子の間にリンカ −ペプチド配列を配置することもできる。 １ｇ分子を組換えＤＮＡ技術で操作する場合の基本的技術は上述の引用特許文献 に記載されている。これらは、本発明のリガンドおよび受容体の組換えＤＮＡ技 術による製造を可能にするために適用できる。 リガンドをヒトのｉｎ　　ｖｉｖｏ診断または治療に使用する場合には、ＥＰ− Ａ−０２３９４００号に記載されているように、たとえばＣＤＲ置換でヒト化す ることが好ましい。 リガンドをコードするＤＮＡ配列を得るためには、一般的にはまず、適当なＭＡ ｂを分泌するハイブリドーマを製造することが必要である。これは、きわめて時 間のかかる方法である。免疫処置動物が得られたならば、分離された牌臓細胞を 適当な骨髄細胞系と融合し、このようにして製造された細胞系を増殖し、適当な 系を選び、選ばれた系を再クローニングし、再選択することが必要である。これ には長時間を要する。この問題は修飾１ｇの製造の場合にも同様に存在する。 リガンドの製造、また本発明の受容体および修飾１ｇの製造の場合でも、組換え ＤＮＡ技術によるときは、さらに、特異性が誘導されるＭＡｂを産生ずるハイブ リドーマから可変ドメインをコードする配列をクローニングするという問題があ る。これは、適当なプローブの製造、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡからのクロー ンライブラリーの構築、クローンライブラリーの徹底的な精査、および単離され たクローンの適当な発現ベクターへのクローニングを可能にする操作を包含し、 かなり長時間を要する。１ｇ可変性ドメインをコードするＤＮＡ配列はその固有 の可変性により、このような時間のかかる方法では、従来クローン化が不可能で あった。したがって、本発明はさらに、Ｉｇ超群分子の可変ドメイン（リガンド ）をコードする任意の配列を、合理的な時間内にクローン化することを実質的に 可能にする方法の提供を目的とするものである。 すなわち、本発明の他の態様によれば、Ｉｇ超群分子の可変ドメインの少なくと も一部をコードする配列（標的配列）をクローン化するにあたり、 （１）標的配列を含有する二本鎖（ｄｓ）核酸のサンプルを準備し、 （ｂ）サンプルを変性させて２本の鎖を分離し、（Ｃ）サンプルにフォワードお よびパックオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、この場合フォワー ドプライマーは標的配列のセンス鎖の３′末端配列またはその隣接配列に特異的 であり、バックプライマーは標的配列のアンチセンス鎖３′末端配列またはその 隣接配列に特異的であって、アニーリングは標的配列の核酸またはその隣接核酸 にプライマーがハイブリダイズする条件に行い、 （ｄ）アニーリングされたサンプルを、デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下 、プライマー延長が起こる条件下のＤＮＡポリメラーゼ酵素で処理し、ついで（ ｅ）サンプルを、延長プライマーが標的配列から分離する条件下に変性させる方 法を提供する。 この本発明の方法にはさらに、変性混合物に対して工程（Ｃ）〜（ｅ）を複数回 反復する工程（ｆ）を包含させることが好ましい。 本発明の方法は、好ましくは１ｇ分子からの、とくに好ましくはＩｇＨ鎖からの 完全可変ドメインのクローン化に使用される。最も好ましい例では、この方法に より、本発明のリガンドをコードするＤＮＡ配列が製造される。 上述の工程（Ｃ）においては、フォワードプライマーは、標的配列のセンス鎖に 、その鎖の３′末端またはその隣接配列においてアニーリングされる。同様にパ ックプライマーは、標的配列のアンチセンス鎖に、その鎖の３′末端またはその 隣接配列においてアニーリングされる。 すなわちフォワードプライマーは、可変領域またはドメインのＣ末端をコードす るｄｓ核酸の領域またはその隣接領域にアニーリングする。同様に、バックプラ イマーは可変ドメインのＮ末端をコードするｄｓ核酸の領域またはその隣接領域 にアニーリングする。 工程（ｄ）においては、フォワードおよびノ（ツクプライマーの３′末端に、そ れらがアニーリングされた鎖の配列に応じて、ヌクレオチドが付加される。この 方法でプライマー延長は、変性工程（ｅ）の開始によって停止されるまで続けら れる。したがって、工程（ｄ）は、プライマ＝が延長し、延長鎖がすべて互いに 重複することが保証される十分な時間、確実に実施されなければならな一部。 工程（ｅ）においては、延長プライマーがｄｓ核酸から分離される。ついでｄｓ 核酸は、さらにプライマーがアニーリングできる基質として再び働くことができ る。しかも、延長されたプライマー自体は、プライマーのそれへのアニーリング を可能にするのに必要な相補性配列をもっている。 工程（１）を行う場合には、以後のサイクル時に延長プライマーの量は指数関数 的に増加し、サイクルの終わりには、標的配列のセンスおよびアンチセンス鎖に 相補性の配列を有する大量のｃＤＮＡが存在することになる。 すなわち、本発明の方法では、可変性ドメインの少なくとも一部をコードするｄ ｓ　　ｃＤＮＡを形成できる大量のｃＤＮＡの蓄積を生じる。 熟練者には明らかなように、上記方法の一部の工程は所望により同時に行うこと もまた順番に行うこともできる。 フォワードおよびバックプライマーは単離されたオリゴヌクレオチドとして提供 することができ、この場合は２種のオリゴヌクレオチドのみが用いられる。しか しながら、別法として、フォワードおよびバックプライマーはそれぞれ、近似し た関連オリゴヌクレオチドの混合物として供給される。たとえば、プライマーが アニーリングする配列中の特定の点に、ヌクレオチド変動の可能性があることが 見出される。この場合には、それぞれの可能性のあるヌクレオチド変動に対して プライマーを使用することができる。さらに、可変領域遺伝子の特異的クローニ ングを増大させる方法として、２種または３種以以上のセットの「組み重ね」プ ライマーを使用することができる。 上述の方法は５ｘｉｋｉ　らの報告した方法［１７コに類似している。また、類 似の方法がＥＰ−Ａ−０２００３６２号に記載の方法にも用いられている。いず れの場合も、記載の方法は特定のヌクレオチド配列に効率的にアニーリングする ことが知られているブライマーを用いて実施される。これらの開示のいずれにも 、この方法が、標的配列に固有の高い可変性領域を含む、可変ドメインをコード する配列のＩｇ部分のクローン化に使用できることは示唆されていなかった。 本発明の方法に用いられるｄｓ核酸配列はｍＲＮＡから誘導することができる。 たとえば、ＲＮＡはＩｇを産生ずることが知られている細胞または細胞系から既 知の方法で単離できる。ｍＲＮＡは他のＲＮＡからオリゴ−ｄＴクロマトグラフ ィーによって分離できる。ついでｃＤＮＡの相補鎖をｍＲＮＡ鋳型上に、逆転写 酵素および適当なブライマーを用いて合成し、ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａへテロ二重 鎖を生成する。ＤＮＡの第二の鎖は、数種の方法のひとつ、たとえばｍＲＮＡ鎖 のＲＮＡフラグメント（ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａへテロ二重鎖をＲＮアーゼＨとイ ンキュベートして作成）で、ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライミングにより、 または第一の鎖の３′末端にアニーリングする合成オリゴヌクレオチドブライマ ーで、ＤＮＡポリメラーゼを用いプライミングにより作成でき本発明の方法が、 この方法で製造したｄｓ　　ｃＤＮＡを用いて実施できることが明らかにされて いる。 このようなｄｓ　　ｃＤＮＡを作成する場合、ｃＨ１ドメイン（Ｈ鎖可変ドメイ ン）またはＣλもしくはＣにドメイン（Ｌ鎖可変性ドメイン）中の配列にアニー リングするフォワードブライマーを使用することができる。これらは、その配列 のクローン化が可能になるように十分、標的配列に接近して存在する。 バックブライマーは、ｖＨｌ、ｖにまたはＶλドメインのＮ末端における配列に アニーリングする配列とすることができる。バックブライマーは、既知のＶＨＩ 、ＶにまたはＶλ配列の様々なファミリーに相補性になるように設計された様々 な配列を有する複数個のブライマーから構成されてもよい。また、バックブライ マーは、可変領域遺伝子の全ファミリーから誘導される一致配列を有する単一ブ ライマーであってもよい。 驚くべきことに、本発明の方法はゲノムＤＮＡを用いて実施できることが見出さ れた。ゲノムＤＮＡを用いるならば、実際のコード配列、イントロンおよび遺伝 子間の非翻訳配列を含めて、きわめて大量のＤＮＡが存在する。すなわち、使用 される条件下では、非特異的アニーリングのかなりの余地がある。しかしながら 、驚くべきことに、非特異的アニーリングはほとんど起こらないことが明らかに された。すなわち、Ｉｇ−可変ドメインの遺伝子をゲノムＤＮＡからクローニン グできることは全く予期し得ないものであった。 ある環境下には、ゲノムＤＮＡの使用は、ｍＲＮＡの使用に比べて有利であるこ とが明らかにされている。 ｍＲＡＮは容易に分解し、とくにヒト組織の臨床サンプルからの製造は困難だか らである。 したがって、本発明の一態様によれば、工程（１）に用いられるｄｓ核酸はゲノ ムＤＮＡである。 ｄｓ核酸源としてゲノムＤＮＡを用いる場合は、フォワードブライマーとして不 変ドメインの配列と相補性の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することは 不可能である。これは、ゲノムＤＮＡでは不変ドメイン遺伝子が一般に可変ドメ イン遺伝子から、かなりの数の塩基対をはさんで離れているからである。すなわ ち、アニーリングの部位がクローン化すべき配列から離れすぎている。 本発明の方法は、ゲノムＤＮＡからの再配列および非再配列可変ドメイン配列、 両者のクローニングに使用できることに注目すべきである。生殖細胞系ゲノムＤ ＮＡでは、それぞれＶＨＳＤＨおよびＪＨをコードする３種の遺伝子はかなり多 数の塩基対によって互いに分離されている。免疫応答の成熟に際し、これらの遺 伝子は再配列され、ＶＨ，ＤＨ，およびＪＨ遺伝子は一緒に融合して、全可変ド メインをコードする遺伝子を与える（第１図参照）。ゲノム「非再配列ＪＶＨ遺 伝子のセンス鎖の３′末端におけるまたはそれに隣接する配列に特異的なフォワ ードブライマーを用いることにより、ＤＨおよびＪＨ遺伝子もクローニングする ことなく、「非再配列ＪＶＨ遺伝子単独をクローニングすることが可能である。 これは、ｖＨ遺伝子を予めクローン化されたまたは合成されたＤＨおよびＪＨ遺 伝子に融合させることを可能にする点で有用である。この方法により、可変ドメ イン遺伝子の再配列をｉｎ　　ｖｉｔｒｏで行ことができる。 工程（Ｃ）に用いるオリゴヌクレオチドブライマーは、特定の標的配列と使用す るために特異的に設計できる。 この場合、適当なオリゴヌクレオチドを合成できるように、標的配列の少なくと も５′および３′末端における配列を決定する必要がある。しかしながら、本発 明者らは、このような特異的に設計されたブライマーを使う必要がないことを発 見した。代わりに、標的配列の各末端のアニーリングには、種特異的一般プライ マーまたはこのようなブライマーの混合物を使用することが可能である。これは 標的配列の３′末端に関していえばとくに驚くべきことではない。可変ドメイン をコードする配列のこの末端は、比較的保存性であることが知られているＪＨを コードするセグメントにつながれていることはわかっている。しかしながら、驚 くべきことに、単一の種の中では、標的配列の５′末端における配列は、標的配 列の５′末端用に種特異性の一般的プライマーまたはその混合物を設計できるほ ど十分に保存性であることが発見されたのである。 したがって、本発明の好ましい態様によれば、工程（Ｃ）では、使用される２種 のプライマーは、単一ブライマーとして用いられても、またプライマー混合物と して用いられても、種特異的な一般的プライマーである。これは、標的配列に特 異的なプライマーを製造するために標的配列について何らかの配列決定を行う必 要を解消するものであり、未決定の標的配列のクローニングを著しく容易にする ものである。すなわち、本発明のこの態様の方法は、特定の種の可変領域または ドメインをコードする配列をクローニングするための一般的方法を提供するもの である。 上述の方法を用いて可変ドメインの遺伝子が、クローン化されたならば、その遺 伝子をたとえばベクター中に貼り込むためにＰＣＲ反応を用い、直接、発現ベク ター中に挿入することができる。 しかしながら、各プライマーは、制限酵素認識部位を含む配列を包含するのが有 利である。制限酵素によって認識される配列はｄｓ核酸にアニーリングするプラ イマーの部分内に存在する必要はなく、アニーリングしない延長として提供され てもよい。制限部位をもつプライマーの使用は、そのＤＮＡが少なくとも１種の 制限酵素で、３′または５′の張り出したヌクレオチドを残して切断できる利点 がある。このようなりＮＡは、上述の方法で直接得られたプラント末端フラグメ ントに比べて、ベクター上の相当する位置にはるかにクローニングしやすい。 すなわち、このサイクルの終わりに製造されたｄｓｃＤＮＡは、適当な制限酵素 の使用により、クローニングベクター中に容易に挿入ができる。制限部位の選択 は、ｄｓ　　ｃＤＮＡが、その遺伝子によってコードされるリガンドを発現させ る発現ベクター中に直接クローン化されるように行うのが好ましい。この場合、 制限部位はｄｓ核酸にアニーリングされる配列中に存在するのが好ましい。 たとえばヌクレオチドの変動のため、または制限酵素認識部位の挿入のために、 プライマーはアニーリングすべき標的配列と正確に相補性の配列をもたない場合 があり、プライマーがｄｓ核酸にアニーリングできるようにアニーリング混合物 中の条件を調整する必要が考えられる。これは本技術分野の熟練者の能力の範囲 内であって、これ以上の説明は要しない問題である。 工程（ｄ）では、任意のＤＮＡポリメラーゼが使用できる。このようなポリメラ ーゼは本技術分野では公知であり、市販品を入手できる。各ポリメラーゼが使用 される条件はよく知られていて、本明細書においてさらに説明する必要はない。 ポリペラーゼの反応は４種のヌクレオシド三リン酸の存在下に行う必要がある。 これらおよびポリメラーゼ酵素はすでにサンプル中に存在するかまたは各サイク ル毎に新たに与えられる。 変性工程（ｅ）は、たとえば、サンプルの加熱により、尿素もしくはグアニジン のようなカオトロピック試薬の使用により、またはイオン強度もしくはｐＨの変 化を用いて実施できる。変性は加熱によって行うのが好ましい。 これは容易な可逆性を示すからである。変性を行うために加熱を用いる場合は、 Ｔａｑポリメラーゼのような熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いるのが通常であ る。これは各サイクル毎の補充を必要としないからである。 この方法の制御に加熱を用いる場合には、適当な加熱サイクルは、約９５℃で約 １分間の変性、３０℃〜６５℃で約１分間のアニーリングおよび約７５℃で約２ 分間のプライマー延長である。延長と再生の完結を確実にするためには、最終サ イクル後の混合物を約６０℃に約５分間保持することが好ましい。 生成物ｄｓ　　ｃＤＮＡは、混合物からたとえば、アガロースゲルを用いるゲル 電気泳動によって分離することができる。しかしながら、所望により、ｄｓ　　 ｃＤＮＡは未精製の形で使用し、常法により適当なりローニングまたは発現ベク ターに直接挿入することもできる。これは、プライマーが制限酵素確認部位を含 む場合には、とくに容易に達成される。 本発明の方法は、可変ドメインをコードする配列中の多様性の作成に使用できる 。たとえば、これは、少なくとも１種のプライマーとして関連オリゴヌクレオチ ドプライマーの混合物を使用することにより達成できる。好ましくは、そのプラ イマーはとくにプライマーの中央部で可変性であり、５′および３′末端では比 較的保存性である。好ましくは、そのプライマーの末端は可変ドメインの枠組領 域と相補性であり、プライマーの中央部における可変領域はＣＤＨの全部または 一部を覆うものである。好ましくは、前方ブライマーは第三のＣＤＲを形成する 領域に使用される。この方法をオリゴヌクレオチドのこのような混合物を用いて 行うと、生成物は可変ドメインをコードする配列の混合物となる。しかも、配列 中の変動は、工程（ｄ）において、突然変異誘発ヌクレオチド三リン酸を一部添 加して点突然変異が標的領域全体に散在するようにして導入することができる。 別法として、このような点突然変異は、多数回の増幅サイクルを繰り返すことに より、ＤＮＡポリメラーゼの自然の誤りの発生率による誤りが、とくに高濃度の ヌクレオシド三リン酸を用いた場合に増幅されるので、導入される。 本発明のこの態様の方法は、可変ドメインをコードする配列のｍ　ＲＮ　Ａまた はゲノムＤＮＡからの直接のクローニングを著しく容易にする利点がある。これ は一方、上述の従来技術法のいずれかにより修飾Ｉｇ型分子の製造を容易にする 。さらに、標的遺伝子は、抗体産生細胞を含む組織サンプルからクローン化でき て、この遺伝子の配列を決定できる。これを行うことにより、患者の免疫レパー トリ−を直接のぞくことが可能になる。患者の免疫レパートリ−のこの「指紋」 は、たとえば自己免疫疾患の診断に有用と考えられる。 可変ドメインをコードする遺伝子の量を増幅する方法においては、単一のセット のプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応を介する数サイクルのコピーに使用され る。 好ましさはやや劣る別法として、上述（１）〜（ｄ）の工程からなり、さらに以 下の工程を包含する第二の方法が提供される。すなわち、 （ｇｏｄｓ　　ｃＤＮＡのサンプルをＤＮＡポリメラーゼの存在下に痕跡量のＤ Ｎアーゼで処理してＤＮＡのニックトランスレーションを可能にし、 （ｈ）ｄｓ　　ｃＤＮＡをベクター中にクローニングする。 所望により、第二の方法にはさらに、 （ｉ）・組換えプラスミドのＤＮＡを消化して可変ドメインをコードする遺伝子 を含有するＤＮＡフラグメントを放出させ、ついで （ｉ）　このフラグメントをさらに工程（Ｃ）〜（ｈ）のセットで処理する工程 を包含させることができる。 好ましくは、フラグメントは、ベクターおよびサイズの正しくない他のフラグメ ントからゲル電気泳動によって分離される。 工程（１）〜（ｄ）ついで（ｇ）〜（ｂ）を１回行うことができるが、好ましく は全サイクル（Ｃ）〜（ｄ）および（Ｓ）〜（ｉ）を少なくとも１回反復する。 この方法では、遺伝子を特異的にコピーするプライミング工程に続いて、遺伝子 量を増大させるクローニング工程を行う。 工程（１）ではｃＤＮＡがｍＲＮＡから誘導される。 １ｇ誘導可変ドメインの場合には、ｍＲＮＡは好ましくは、ｍＲＮＡの産生を増 大させるために予め刺激したリンパ球から単離される。 各工程（Ｃ）では、プライマーのセットは、コピーの特異性が増大するように、 前工程（ｅ）とは異なることが好ましい。すなわち、プライマーのセットは組み 重ねセットを形成する。たとえば、ＩｇＨ鎖可変ドメインのクローニングに際し ては、第一のセットのプライマーはＬｓｒｒｉｃｋら［１８］によって記載され たように単一配列および不変領域内に位置され、第二のセットブライマーは０ｔ ｌｉｎｄｉ　ら［１９］によって記載されたように完全に可変領域内に位置され る。工程（Ｃ）のプライマーは、以後のクローニングを容易にするために制限部 位を包含することが好ましい。最後のサイクルで工程（Ｃ）に用いられるプライ マーのセットは、好ましくは、発現ベクターへの導入のための制限部位を包含す るものである。工程（ｇ）では、プライマーと鋳型鎖の間に存在する可能性があ るミスマツチは、ニックトランスレーションによって矯正される。工程（ｈ）で はｄｅ　　ｃＤＮＡが、クローニングを容易にするためにブライマー内に導入さ れた部位で制限酵素により、好ましくは、切断される。 本発明の他の態様によれば、生成物ｄｅ　　ｃＤＮＡは直接、発現ベクター内に クローニングされる。宿主は原核生物でも真核生物でもよいが細菌が好ましい。 好ましくは、プライマーおよびベクター内における制限部位、ならびにベクター の他の特徴の選択で、完全なリガンドの発現が可能になる。一方、扱かわれたリ ガンドに典型的なアミノ酸配列のすべての特徴が保存される。たとえば、再配列 可変遺伝子の発現には、少なくとも３種のＣＤＲ配列すべてを包含する標的配列 のクローニングが可能なようにプライマーを選択する。クローニングベクターは 、シグナル配列（リガンドの分泌のための）、ならびに最初の枠組領域、クロー ニングのための制限部位、ついで最後の（第四の）枠組領域のＣ−末端をコード する配列をコードすることになる。 完全リガンドの部位として非配列ＶＨ遺伝子の発現には、少なくとも最初の２種 のＣＤＲを包含する標的配列のクローニングを可能にようにプライマーが選択さ せる。 クローニングベクターは、シグナル配列、第一の枠組領域のＮ−末端、クローニ ングのための制限部位、ついで第三の枠組領域のＣ−末端、第三のＣＤＲおよび 第四のプライマーおよびクローニングベクターは、同様に、完全リガンドの部分 として、単一のＣＤＲとくに第三のＣＤＲの発現のために作成することができる 。単一のＣＤＲのクローニング能力の利点は、所望の性質たとえば溶解性を導入 して、「普遍的」な枠組領域のセットの設計を可能にするからである。 単一リガントは単独でまたは相補性の可変ドメインと組合せて発現させることが できる。たとえば、Ｈ鎖可変ドメインは、単独のドメインとして、またはそれが 相補性り鎖可変ドメインとともに発現された場合には抗原結合部位として発現さ れる。好ましくは２種のパートナ−は同一の細胞内で発現されるかまたは同一の 細胞から分泌され、蛋白質は非共有結合的に会合してＦｖフラグメントを形成す る。すなわち、相補性のパートナ−をコードする２種の遺伝子は縦列に置かれて 単一のベクターから発現され、ベクターは２セツトの制限部位を包含する。 好ましくは、遺伝子は順次導入される。たとえば、Ｈ鎖可変ドメインを最初にク ローン化し、ついでＬ鎖可変ドメインをクローン化できる。別法として、２種の 遺伝子を、たとえば、Ｙｏｎ　＆　Ｆｒｅｄ　［２９］　（７）記載ニＩＨｒ従 イ、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて各遺伝子を一緒に必要な介在配列とともに貼 り込むことにより、ベクター内へ単一工程で導入する。２種のパートナ−はまた 、上述のベクターと類似のベクターを用い、単一の連鎖Ｆｖフラグメントを生成 させた連結蛋白質として発現させることもできる。さらに別法として、２種の遺 伝子を、たとえば一方のベクターがファージベクターであり、他方がプラスミド ベクターである２種の異なるベクターに置くこともできる。 さらに、クローン化されたｄｅ　　ｃＤＮＡは、１種または２種以上の不変ドメ インをコードする配列をすでに含有する発現ベクター中に挿入し、そのベクター に１ｇ型の鎖を発現させることもできる。たとえばＦａｂフラグメントの発現は 、可変ドメインに加えて不変ドメインを介するＨ鎖とＬ鎖の会合に役立つので、 Ｆｖフラグメント以上に有利である。最終の発現生成物は上述の任意の修飾Ｉｇ 型分子であってよい。 クローン化配列は、それが融合蛋白質として発現できるように発現ベクター中に 挿入することもできる。可変ドメインをコードする配列は、直接またはリンカ− 配列を介して、任意の蛋白質エフェクター分子たとえばトキシン、酵素、標識ま たは他のリガンドをコードするＤＮＡ配列に連結される。可変ドメイン配列はま た、細菌またはファージの外側の蛋白質に連結することもできる。すなわち、本 発明のこの態様は本発明の受容体の製造に使用できる。 本発明の他の態様によれば、発現のためのｄｓｃＤＮＡの直接クローニングが、 結合活性をスクリーニングできる発現ライブラリーの迅速な構築を可能にする。 ＩｇＨおよびＬ鎖可変ドメインの場合は、ｄｓｃＤＮＡは、動物からの完全再配 列遺伝子として単離された可変遺伝子、または数種の異なる起源から作り上げら れた可変遺伝子、たとえばＤＨおよびＪＨ遺伝子の合成レパートリ−と結合され た非再配列ＶＨ遺伝子のレパートリ−であってもよい。ＩｇＨ鎖可変ドメインを コードする遺伝子レパートリ−は、抗原で免疫した動物のリンパ球から調製する のが好ましい。 スクリーニング法は、本技術分野でよく知られている一連のフォーマットを取る ことができる。たとえば、細菌から分泌されたＩｇＨ鎖可変ドメインは固相上の 抗原へ結合させ、捕捉されたドメインを抗体で検出することによってスクリーニ ングできる。すなわち、ドメインは、細菌を液体培地中で増殖させ、ＥＬＩＳＡ プレートの表面上に被覆された抗原に結合させてスクリーニングできる。しかし ながら、好ましくは、リガンド（または修飾リガンドもしくは蛋白質とのリガン ド融合物）を分泌する細菌コロニー（またはファージプラーク）を膜上で抗原の 結合についてスクリーニングする。リガンドは膜に直接、結合するか（そしてた とえば標識抗原で検出する）または抗原被覆膜に捕捉する（そしてリガンドに特 異的な試薬で検出する）。膜の使用は多くのクローンのスクリーニングに著しい 便宜を提供し、このような方法は本技術分野ではよく知られている。 スクリーニング方法も、リガンドとの蛋白融合体を作成することにより、たとえ ば抗体によって認識されるペプチドタグをリガンドのＮ−末端もしくはＣ−末端 に導入することにより、または無色の基質の有色物質への変換を触媒する酵素に リガンドを連結することにより、著しく容易になる。後者の場合、抗原の結合は 単に基質の添加によって検出できる。また、真核細胞の内部で発現され正しく折 畳まれたリガンドについては、そのリガンドと酵母のＧＡＬ４蛋白質のような転 写アクティベーターのドメインの連結、および抗体とＧＡＬ４蛋白質の他のドメ インの連結が、Ｆｉｅｌｄｓ　＆　Ｓｏｎｇ　　［２１］の記載のように、結合 活性のスクリーニングの基盤となる。 リガンドの多重コピーをもつ蛋白質の製造、または細胞の製造でも、固定化抗原 に対するリガンドの結合能、したがってスクリーニング法の感度を改善できる。 たとえば、リガンドは、マルチマー蛋白質の蛋白サブユニット、ファージコート 蛋白質、または大腸菌の外膜蛋白質たとえばｏｍｐＡもしくはｌ　ａｍＢに連結 させることができる。ファージまたは細菌蛋白質へのこのような融合はまた、抗 原結合活性をもつリガンドが表示された細菌の選択の可能性を提供する。たとえ ば、このような細菌は、固体支持体に結合した抗原とともに沈殿させることがで きるし、またアフィニティークロマトグラフィーに付すことができるし、また抗 原で被覆されたより大きな細胞もしくは粒子に結合させ、蛍光活性化細胞ソータ ー（ＦＡＣ８）を用いて選択できる。リガンドに融合した蛋白質またはペプチド は好ましくは、ｄｓ　　ｃＤＮＡレパートリ−のクローニングが融合生成物を創 製するようなベクターによってコードされる。 単一リガントの結合活性のスクリーニングに加えて、会合したリガンド、たとえ ば会合したＩｇＨおよびＬ鎖可変ドメインの結合活性または触媒活性についても スクリーニングする必要がある。たとえば、ＨおよびＬ鎖可変遺伝子のレパート リ−は、２種のドメインが一緒に発現するようにクローン化される。ドメインの 対の一部のみが会合し、これらの会合した対の一部のみが抗原に結合する。Ｈお よびＬ鎖可変ドメインのレパートリ−は、各ドメインが無作為に対をなすように クローン化することができる。このアプローチは、両パートナ−の存在がクレッ トの形成に必要な会合ドメインの単離にとくに適している。また、Ｌ鎖配列のレ パートリ−はＨ鎖の場合よりも多様性が低いので、Ｌ鎖可変ドメインの小さなレ バトリー、たとえばドメインの各ファミリーの代表的メンバーを含むレパートリ −を、Ｈ鎖可変ドメインのより大きなレパートリ−と結合させることができる。 しかしながら好ましくは、Ｈ鎖可変ドメインのレパートリ−をまず、Ｌ鎖パート ナ−の不存在下に抗原結合についてスクリーニングし、対で抗原に結合したＨ鎖 可変ドメインのみをＬ鎖可変ドメインのレパートリ−と結合させる。会合したＨ およびＬ鎖可変ドメインの結合は、たとえば各ドメインを様々なモノクローナル 抗体によって特異的に認識される、異なるＣ−末端ペプチドタグに融合させるこ とによって容易に、単一ドメインの結合と識別できる。 最初に結合活性をもつＨ鎖可変ドメインをクローニングし、ついで合致するＬ鎖 可変ドメインをクローニングする段階的アプローチは、Ｈ鎖がまず基質結合性に ついてスクリーニングされるので、触媒的抗体の構築にと（に適している。次に 、Ｈ鎖と会合できるＬ鎖可変ドメインを同定し、システィンまたはヒスチジンの ような「触媒性」残基（または補欠分子団）を、Ｂｅ１ｄｖｉｎ　＆５ｃｈｏｌ Ｎ　　［２２］によって記載されているように、遷移状態を安定化しまた基質を 攻撃するため、ＣＤＨに導入する。 非共有結合的に会合したＨおよびＬ鎖可変ドメイン（Ｆｖフラグメント）の結合 活性はスクリーニングできるが、適当な融合蛋白質は可変ドメインパートナ−の 会合を推進できる。すなわち、ＦａｂフラグメントはＦｖフラグメントよりも会 合しやすいようである。Ｈ鎖可変ドメインを単−Ｈ鎖不変ドメインに結合させ、 Ｌ鎖可変ドメインを単一り鎖可変ドメインに結合させ、２つの不変ドメインを一 緒に会合させることができる。 また、ＨおよびＬ鎖可変ドメインをペプチドと、単一鎖抗体のように共有結合さ せるか、または好ましくはＣ−末端に結合したペプチド配列と連結させると、シ スティン結合の形成もしくは非共有結合作用を介してたとえば「ロイシンジッパ −」要素の導入により、会合する。 しかしながら、強固に会合した可変ドメインの対を単離するためには、Ｆｖフラ グメントの使用が好ましい。 可変領域遺伝子のレパートリ−から単離されるＦｖフラグメントの構築は、完成 抗体を作り上げる方法、ノ１イブリドーマ技術の別法を提供する。たとえば可変 ドメインを適宜、Ｌ鎖または適当なＨ鎖不変ドメインに付着させ、集合遺伝子を 哺乳動物細胞中で発現させると、完全抗体が作成され、これは天然のエフェクタ ー機能たとえば補体溶菌を有することになる。この径路は、ノ１イブリドーマ技 術は困難なことが明らかにされていて、たとえばヒト末梢血リンパ球はエプスタ イン・バーウィルスで不死化されるが、このようなハイプルドーマは低親和性の ＩｇＭ抗体を分泌しやすいので、ヒトモノクロナール抗体の構築にはとくに魅力 的である。 しかも、リンパ球は一般には宿主蛋白質に対する抗体は分泌しないことを保証す る免疫機構が知られている。 しかしながら、ヒト蛋白質に対するヒト抗体、たとえば癌の治療のためにヒト細 胞表面マーカーに対する抗体または自己免疫疾患の治療のために組織適合性抗原 に対する抗体の作成が望まれる。ＨおよびＬ鎖可変ドメインの組合せのレパート リ−から作られるヒト抗体の構築では、正常時には除去された特異性をもったヒ ト抗体の作成が可能なので、この問題は克服される。 この方法はまた二相特異性抗体を作成する新しい方法を提供する。二相性の特異 性を有する抗体は、異なる特異性を有する２種のハイブリドーマを融合させるこ とにより、第一の特異性のＦａｂ腕部をもつハイブリッド抗体と第二の特異性の 他のＦａｂ腕部とから、作成できる。 しかしながら、ＨおよびＬ鎖は誤ったパートナ−も選ぶので、二相特異性抗体の 収率は低い。強固に会合したＦｖフラグメントの構築はＨ鎖とＬ鎖の正しい対の 会合によって進められるのが好ましい（これは２個のＨ鎖相互の正しい組合せを 支援するものではない）。二相特異性抗体の改良された製造法は、よく知られて いるように、診断および治療に様々な応用の可能性をもっている。 すなわち、本発明は、ある動物種からの可変ドメインをコードする配列をクロー ニングするのに有用な種特異性のある一般的なオリゴヌクレオチドブライマーま たはそのようなプライマーの混合物を提供する。この方法は、ある種から任意所 望の抗体特異性をクローン化するために、種特異性の一般的なブライマーの単一 対または混合物の対の使用を可能にする。これは、クローン化すべき標的配列の 配列決定の必要性および回収すべき各特異性について特異的なブライマーを設計 する必要性を排除するものである。 さらに、本発明は、可変遺伝子のレパートリ−の構築、可変遺伝子の直接クロー ニングによる発現、それでコードされたドメインの結合活性のスクリーニング、 およびそのドメインとそのレパートリ−から誘導される他の可すなわち、本発明 の方法の使用により、結合活性を有するＨ鎖可変ドメインおよびこれらのドメイ ンの変異体の製造が可能になる。本発明の方法の使用により、モノクローナル抗 体および二相特異性抗体の製造が可能になり、ハイブリドーマ技術に代わる方法 が提供される。たとえば、マウス肺臓ｄｓ　　ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡは過 免疫マウスから得ることができる。これは本発明の方法を用いてクローン化する ことができ、ついでクローン化されたｄｓ　　ＤＮＡは適当な発現ベクターに挿 入される。発現ベクターは、宿主細胞たとえば細菌細胞のトランスホームに使用 され、ＦｖフラグメントまたはＦａｂフラグメントの産生が可能になる。Ｆｖま たはＦａｂフラグメントはついで不変ドメインに結合され、哺乳動物細胞中で発 現されて、モノクローナル抗体中に組込まれる。 本発明を以下、添付の図面を参照しながら、単に例示の目的でさらに詳細に説明 する。添付の図面中、第１図は、非再配列および再配列ＨおよびＬ鎖可変遺伝子 およびプライマーの位置を模式的に表した図であり、第２図は、Ｍｌ　３−ＶＩ ＰＣＲＩベクターノ模式図と、増幅されたＨ鎖可変ドメインのクローニングの概 略を示す図であり、 第３図は、Ｍｌ　３−ＶＨＰＣＲＩ中の■ｇ可変領域誘導配列を示す図であり、 第４図は、Ｍｌ　３−ＶＫＰＣＲ１ベクターの模式図、！−１Ｌ鎖可変ドメイン のクローニングの概略を示す図であり、第５図は、Ｍｌ　３−ＶＫＰＣＲＩ中（ ７）Ｉｇ可変領域誘導配列を示す図であり、 第６図は、ＭＡｂ　　ＭＢｒｌのＨおよびＬ鎖可変ドメインをコードする配列の ヌクレオチド配列を示す図であり、 第７図は、Ｈｉｎｄｌ［［−ＢａｍＨＩフラグメントとしてクローン化され、新 しい可変領域の導入に際して切り取られる可変領域を含有するｐＳＶ−ｇｐｔベ クター（α−Ｌｙｓ３０としても知られている）の模式図である。ヒトＩ　ｇＧ ｌの遺伝子もＢａｍＨＩ部位が除去されるように操作されていて、ベクター中の ＢａｍＨＩ部位は唯一のものとなっている。 第８図は、ｐＳＶ−ｈｙｇｒｏベクターの模式図である（α−Ｌｙｓ１７として も知られている）。これはＳＶｇｐｔベクターから誘導され、マイコフェノール 酸をコードする遺伝子がハイグロマイシン抵抗性をコードする遺伝子で置換され ている。この構築体は、Ｈｉ　ｎ　ｄｍ−Ｂ　ａｍＨＩフラグメントとしてクロ ーン化され、新しい可変領域の導入に際して切り取られる可変遺伝子を含んでい る。ヒトＣにの遺伝子も操作されてＢａｍＨＩ部位が除去されていて、ベクター 中のＢａｍＨＩ部位は唯一のものとなっている。 第９図は、マウス：ヒトＭＢｒｌキメラ抗体の集合体を示す。 第１０図は４８マウス再配列ＶＨ遺伝子のコードされたアミノ酸配列を示す。 第１１図は、ヒト再配列ＶＨ遺伝子のコードされたアミノ酸配列を示す。 第１２図は、非再配列ヒトＶＨ遺伝子のコードされたアミノ酸配列を示す。 第１３図は、プラスミドｐｓｗｉの一部の配列であり、主として、ｐＳＷｌ中の ＶＨＬＹＳに連結されｐＵｃ１９中に５ｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントととし てクローン化されたペクチン酸リアーゼリーグ−の配列と、ペクチン酸すアゼリ ーダーーＶＨＬＹＳポリペプチドをコードする読み取り枠での翻訳が示されてい る。 第１４図は、プラスミドｐＳＷ２の一部の配列であり、主としてＶＨＬＹＳおよ びＶＫＬＹＳに連結されｐＵｃ１９中に５ｐｈｌ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラ グメントとしてクローン化されたペクチン酸リアーゼリーグーの配列と、ペクチ ン酸リアーゼリーグー−ＶＨＬＹＳおよびペクチン酸すアーゼリーダーＶＫＬＹ Ｓポリペプチドをコードする読み取り枠での翻訳が示されている。　　　′ 第１５図は、ｐＳＷｌに基づき、ポリリンカー配列がＶＨＬＹＳの可変ドメイン で置換されていて、増幅ＶＨ遺伝子のクローニング部位として働き、ペプチドタ グがＣ−末端に導入されているプラスミド ｐｓＷＩＨＰＯＬＹＭＹｃの一部の配列を示す。 第１６図は、マウス肺臓から誘導され、リゾチーム結合活性を有する２つのＶＨ ドメインのコードされたアミノ酸配列を示し、Ｄｌ、３抗体のＶＨドメインと比 較した。矢印は、２種のＶＨドメインの間の異なる点を示している。 第１７図は、ヒト末梢血リンパ球から誘導され、リゾチーム結合活性を有するＶ Ｈドメインのコードされたアミノ酸配列を示す。 第１８図は、ＶＨＬＹＳ遺伝子の変異体の発生およびクローニングの概略を示す 図であり、ＶＨ遺伝子の天然のレパートリ−のクローニングの場合と比較した。 第１９図は、ベクターｐｓＷ２８ＰＯＬＹの一部の配列を示す図である。 第２０図は、２つの連結されたＶＨＬＹＳドメインをコードするベクターｐＳＷ ３の一部の配列を示す図である。 第２１図は、ＷＨＬＹＳドメインとｐｅｌＢリーダー配列がアルカリホスファタ ーゼ遺伝子に連結した配列を示す。 第２２図は、■にＬ鎖可変ドメインのレパートリ−をＶＨＬＹＳドメインと会合 して発現させるベクターｐｓＷＩＶＨＬＹｓ−ＶＫＰＯＬＹＭＹＣ１７）配列を 示す。 第２３図は、大腸菌から高レベルで分泌されるＶＨドメインの配列を示す。ＶＨ ＬＹＳドメインとの差に印を以下に記載する例においては、以下のオリゴヌクレ オチドプライマーまたは混合プライマーを使用した。それらの位置は第１図に示 したが、その配列は次のとおりである。 ｖ）！１ＦＯＲ５１ＴＧＡＧＧＡＧＡＣ（１；ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴ ｒＧＧＣＣＣＣＡＧ　　３’ｉ■ＩＦＯＲ−２５’　　　ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧ ＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴにＧＣＣＣＣ３豐ＩＨｕｌＶ）ＩＦＯＲ５’ 　　　ＣＴＴＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ３’；Ｈｕ ２ＶＨＦＯＲ５’　　　　ＣＴＴ（、ＣＴににＡＧＣＣＴＧＡＣにＡＧＡＣにＧ ＴＧＡＣＣ３’　；Ｍｕコ■ＦＯＲ５言　　　　ＣＴＴＧＧＴＧＧ＾ＴＧＣＴＧ ＡにＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣコ・；）（ｕ４ＶＨＦＯＲ５’　　　（’ＴＴＧ ＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣ３’；ＭＯｊＨ：ＩＦＯＲ 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上述の５種のハイブリドーマそれぞれをローラー瓶中で生育させ、各ハイブリド ーマ約５Ｘ１０８細胞をＲＮＡの単離に使用した。単離したＲＮＡからオリゴｄ Ｔセルロースを用いてｍＲＮＡを分離した［２９］。 第一の鎖ｃＤＮＡは、以下に記述するようにＭｓ＋１ｌｊｉｓら［３０］の記載 した操作に従って合成した。 Ｈ鎖可変ドメインをコードする配列をクローニングするためには、１０．ｕｇの ｍＲＮＡｑ　２０＋１１１１０１のＶＨＩＦＯＲプライマー、ｄＡＴＰＳｄＴＴ Ｐ。 ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰそれぞれ２５０μＭ１ジチオスレイトール（ＤＴ　Ｔ） 　　１０ｍＭ、　　１００ｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ・ＨＣｌ−１０ｍＭ　　Ｍｇ Ｃ１２および１４０ｍＭＫＣｌを含有し、ｐ）Ｉを８．３に調整した反応溶液５ ０μＩを調製した。反応溶液を７０℃に１０分間加熱し、放冷してプライマーを 、ｍＲＮＡ中可変ドメインをコードする配列の３′末端にアニーリングさせる。 ついで反応溶液に４６単位の逆転写酵素（Ａｖｌｌｉ＊ｎ　Ｂｉｏｌｅｃ）を加 え、この溶液を４２℃で１時間インキュベートして第一の鎖ｃＤＮＡの合成を行 わせた。 Ｌ鎖可変ドメインをコードする配列をクローニングするためには、ＶＨＩＦＯＲ ブライマーの代わりにＶＫＩＦＯＲブライマーを用いたほかは上に述べたと同じ 操作を使用した。 ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッドからの増幅ＲＮ　Ａ／Ｄ　Ｎ　Ａハイブリッ ドが生成されたならば、可変ドメインをコードする配列は以下のように増幅され る。 Ｈ鎖可変ドメインをコードする配列の増幅には、ｄｓ　　ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ リッド含有溶液５ｕｌ。 ＶＨＩＦＯＲおよびＶＨＩＢＡＣＫブライマー各２５ｐｍｏｌｅ　、　２５０　 ＩＢＭのｄＡＴＰＳｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、６７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ φＨＣ１，１７ｍＭ硫酸アンモニウム、１０ｍＭ　　ＭｇＣ１，２００μｇ７　 ｍ＋のゼラチンおよび２単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔ＋＋ｓ　）を含有す る反応溶液５０μｌを調製した。反応溶液をパラフィン油で覆い、Ｔｅｃｈｍｅ 　　ＰＨＣ−１プログラム化加熱ブロツクを用い２５回の温度サイクリングに付 した。各サイクルは、１分間９５℃（核酸の変性）、１分間３０℃（プライマー の核酸へのアニーリング）および２分間７５℃（プライマーからの延長の形成） からなる。２５サイクル後、反応溶液および油を２回エーテル、１回フェノール および１回フェノール／クロロホルムで抽出した。ついでｄｓ　　ｃＤＮＡをエ タノールで沈殿させた。次に、沈殿したｄｅ　　ｃＤＮＡを５０μｌの水に取り 、凍結した。 Ｌ鎖増幅の操作は、ＶＨＩＦＯＲおよびＶＨＩＢＡＣＫプライマーそれぞれの代 わりにＶＫＩＦＯＲおよびＶＫＩＢＡＣＫブライマーを用いたほかは、全く上述 の場合と同じである。 増幅ｃＤＮＡの各サンプル５μｌを２％アガロースゲル上電気泳動で分画し、エ チジウムプロミドで染色した。 これは、増幅されたｄｓ　　ｃＤＮＡは期待されたサイズの主バンド（約３３０ ｂｐ）を与えることを示した（しかしながら、ＭＢｒｌのＶＫＤＮＡのバンドは きわめて弱かった。したがって、これはゲルから切り取り、第二ラウンドで再増 幅した）。すなわち、この単純な操作で、５種のＭＡｂのしおよびＨ鎖可変ドメ インをコードする合理的な量のｄｓ　　ＤＮＡが生成された。 Ｈ鎖ベクター構築 ＢｓｔＥＩ［認識部位を、ベクターＭ１３−ＨｕＶＨＮＰ　［３１］へ、特定部 位の突然変異誘発［３２，３３］によって導入し、ベクターＭ１３−ＶＨＰＣＲ Ｉを製造した（第２図および第３図）。 Ｈ鎖可変ドメインをコードする各増幅配列を制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩ Ｉで消化した。フラグメントをフェノールで抽出し、２％低融点アガロースゲル 上で精製し、ついでＰｓｔＩおよびＢｓｔＥｎで予め消化して０．８％アガロー スゲル上で精製したベクターＭ１３−ＶＨＰＣＲＩ中に強制クローン化した。可 変ドメイン挿入体を含むクローンを直接、Ｍ２Ｓ−ＶＨＰＣＲＩベクター中３′ 非暗号可変遺伝子に基づくプライマーを用いる配列決定により同定した［３４］ 。 ＢＷ４３１／２６のＨ鎖可変ドメインをコードする配列中に内部ＰｓｔＩ部位が 存在する。この可変ドメインをコードする配列はしたがって、２工程で集合され た。 ３’　Ｐｓ　ｔ　ｌ−Ｂｓ　ｔＥＩＩフラグメントをまずＭ２Ｓ−ＶＨＰＣＲＩ 中にクローン化し、ついで第２工程で５′ＰＳｔＩフラグメントをクローン化し た。 Ｌ鎖ベクター構築 ベクターＭｌ　３ｍｐ　１８　［３５］をＰｖｕＩＩで切断し、ベクターバック ボーンを合成Ｈｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩポリリンカーにプラント連結した。ベクタ ーＭ１３−ＨｕＶＫＬＹＳ　［３６］をＨｉｎｄｍとＢａｍＨＩで消化してＨｕ ＶＫＬＹＳ遺伝子を単離した。ついでこのＨｉ　ｎ　ｄｍ−Ｂ　ａｍＨＩフラグ メントをＨｉｎｄｌｆｆ−ＢａｍＨＩポリリンカ一部位に挿入し、ベクターバッ クボーンにＰｖｕｌＩ部位を欠くベクターＭ１３−ＶＫＰＣＲＩを形成させた（ 第４図および第５図）。このベクターは大腸菌ＪＭＩ　１０中で製造し［２２］ 、ＢｃｌＩ部位におけるｄａｍメチル化を回避した。 Ｌ鎖可変ドメインをコードする各増幅配列をＰｖｕＩ［とＢｇｌｍで消化した。 フラグメントをフェノール抽出し、２％低融点アガロースゲル上で精製し、予め Ｐｖｕ■とＢｃｌｌで消化し、０．８％アガロースゲル上で精製し、ウシ腸ホス ファターゼで処理したベクターＭ１３−ＶＫＰＣＲＩ中に強制クローン化した。 Ｌ鎖可変領域挿入体を含むクローンは、直接、Ｍ２Ｓ−ＶＫＰＣＲＩベクター中 可変ドメインの３′非暗号領域に基づくプライマーを用いる配列決定により同定 した［３４］。 ＭＢｒｌＨおよびＬ鎖可変ドメインのヌクレオチド配列は、Ｍ２Ｓ−ＶＨＰＣＲ ＩおよびＭ２Ｓ−ＶＫＰＣＲＩベクターの隣接領域の部分とともに第６図Ｍ１３ −ＶＨ−ＰＣＲＩ中にＭＢｒｌＨ鎖可変ドメイン暗号配列をもつＨｉｎｄｍ−Ｂ ａｍＨＩフラグメントを、ヒトγ１不変領域［３７］とともに、ｐＳＶ−ｇｐｔ ベクター中に再クローニングした（第７図）。Ｍ２Ｓ−ＶＫＰＣＲＩ中のＭＢｒ ｌ　　Ｌ鎖可変ドメイン暗号配列は、Ｈｉｎｄｍ−ＢａｍＨＩフラグメントとし て、ノ１イグロマイシン抵抗性マーカーおよびヒトカツノ々不変ドメイントドも ＋、＝　ｐ　ｓ　ｖベクター、ＰＳＶ−ｈ７ｇ−ＨｕＣＫ中に再クローニングし た（第８図）。遺伝子の集合体を第９図にまとめる。 このようにして製造されたベクターをＰｖｕ　Ｉで線状化しくｐＳＶ−ｈｙｇｒ ｏベクターの場合には、Ｐｖｕ　Ｉ消化は部分的にすぎない）、非分泌マウス骨 髄腫細胞系ＮＳＯ［３８］に、エレクトロポレーションによってコトランスフエ クトした。コトランフエクション１日後に細胞を０．３μｇ　／　ｍｌマイコフ ェノール酸（ＭＰＡ）中で、７日後にはｌμｇ／ｍｌ　　ＭＰＡ中で選択した。 １４日後に、それぞれ１個または２個の主コロニーを含む４個のウェルについて １４Ｃ−リジンの導入によりスクリーニングし［４０］、分泌抗体はプロティン −ＡＭ Ｓｅｐｈｘ＋ｏｓ！（Ｐｈ＊ｒｍａｃｉ＊）で沈殿させたのち、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ上で検出した［４１］。ゲルを染色し、固定し、蛍光試薬Ａｍｐｌｉ！７”（ Ａｍｅｒｓｈａｍ）に浸漬し、乾燥し、−７０℃で２時間、プレフラッシュした フィルムに上でオートラジオグラフィーを行った。 上澄液についても、はぼＭｅｎａｒｄら［２３コの記載に従い、細胞懸濁液間接 免疫蛍光検定［蛍光標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて］ま たは単層固定細胞上固相ＲＩＡ［１２５１−プロティンＡ　（Ａｍｅｒ山ｍ）を 用いて］によって、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および結腸癌細胞系ＨＴ−２９への結 合を試験した。 ４個のウェルからの上澄液のひとつは分泌抗体を含むことが見出された。母体マ ウスＭＢｒｌ抗体のように、上澄液中のキメラ抗体はＭＣＦ−７細胞には結合す るがＨＴ−２９細胞には結合しないことが見出され、すなわち、特異性が適当に クローン化され、発現されたことをマウス肺臓からのＤＮＡは１つまたは２つの 方法で調製した（他の方法も使用できる）。 方法１：マウス肺臓を２片に切断し、各月をＰＢＳ２００μｍを含む標準Ｅｐｐ ｅｎｄｏｒｌ管に入れた。１　ｍｌのガラスピペットの先端をブンゼンバーナー の青焔中で閉じて丸くした。このピペットを用いて容管の肺臓片を押しつぶした 。このようにして生成した細胞を新しいＥｐｐｅｎｄｏｔｆ管に移し、この方法 を、膵臓の結合織が白く見えるようになるまで、３回反復した。細胞とともに移 された結合織を、引き延ばしたパスツールピペットを用いて除去した。ついで細 胞をＰＢＳ中で洗浄し、４個の管に分配した。 マウス膵臓細胞は次に旧ｃｒｏｃｅｎｔ■ｒ遠心分離機により低速にセットして ２分間回転させて沈降させた。上澄液はすべて引き延ばしたパスツールピペット で吸引した。 所望により、この時点で細胞サンプルを凍結し、−２０℃で保存することができ る。 細胞サンプル（凍結した場合は解凍して）に、水５゜Ｏμｌおよび非イオン界面 活性剤ＮＰ−４０の１０％溶液５μｌを加えた。この管に蓋をし、蓋に孔をあけ た。 管を沸騰水浴中５分装置いて細胞を破壊し、ついで氷上で５分間冷却した。管を ２分間高速で遠心分離し、細胞層を除去した。 上澄液を新しい管に移し、これに５Ｍ　　ＮａＣ１１２５μｌおよびｐｉを７． ０に調整したＬＭ　　ＭＯＰＳ３０ｕ　１を加えた。上澄液中のＤＮＡをＱｇｉ ｔｇｅａ　５チツプ上に吸着させ、ラムダＤＮＡについての製造業者の指示に従 って精製した。 方法２：この方法はＭｓｎｉｘｌｉｓら［３０］の記載した技術に基づくもので ある。マウスの膵臓を微細片に切断し、２　ｍｌのガラスホモジナイザーに入れ た。ピストンでゆっくり上下に数回振盪して、細胞を組織から分離させた。 細胞懸濁液を５００μｌのリン酸緩衝食塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）中に作成し、Ｅｐ ｐｅｎｄｏｔｆ管に移した。ついで細胞を旧ｃｔｃ＋ｃｅｌｘ＋＋ｒ遠心分離機 により低速で２分間回転させた。 これにより、白血球と赤血球が肉眼的に分離される。白血球の方がゆっくりと沈 降し、赤血球の上部に層を形成する。上澄液を注意深く除去し、遠心分離してす べての白血球の沈降を確実にした。白血球相を５００μｌのＰＢＳ　　２部に再 懸濁し、他の管に移した。 旧ｃｔｏｃｅｌｘｉｒ遠心分離機により低速で１分間回転させＰＢＳで２回洗浄 し、最後に２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。白血球を２５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、 １０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７，４の２．５ｍｌに加え、穏やかに撹拌した。 撹拌中に２０％ＳＤ３　２５μｌを加えた。 細胞を直ちに溶解すると、溶液は粘稠、澄明となった。 ２０■／ｍｌのプロティンキナーゼ−Ｋ　１００μｌを加え、５０℃で１〜３時 間インキュベートした。 サンプルを等容のフェノールおよび同容のクロロホルムで抽出し、撹拌した。遠 心分離後、水相を除去し、１／１０容の３Ｍ酢酸アンモニウムを加えた。これを ３容の冷エタノールで覆い、ＤＮＡ鎖が肉眼で見えるようになるまで、管を注意 深く振盪した。ＤＮＡをパスツールピペットで巻き取り、エタノールを傾湾し、 ＤＮＡをＥｐｐｃｉｄｏｒｌ管中１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　ｓ　ｌＩＣＩ、　ｐＨ ７，４，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　１ｍｌに移した。 ゲノムＤＮＡからの増幅 ＤＮＡ溶液を水で１／１０に希釈し、５分間煮沸したのち、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）に使用した。各ＰＣＲ反応毎に通常、５０〜２００ｎＨのＤＮＡを 使用した。 ヒトＰＢＬまたはマウス膵臓細胞から単離されたゲノムＤＮＡ中のＨおよびＬ鎖 可変ドメイン暗号配列をついで、各サイクルのアニーリングの部では温度６５℃ に維持し、３０サイクル実施したほかは、例１のｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド からの増幅」と題した項の最初の２つのバラグラフに記載した一般的プロトコー ルを使用して増幅し、クローン化した。さらに、２種のブライマーの３′末端で アニーリングを最小限にするため、サンプルを最初９５℃に加熱し、ついで６５ ℃でアニーリングを行ったのちはじめて、Ｔａｑポリメラーゼを加えた。 ３０サイクル終了後、反応混合物を６０℃に５分間保持して、増幅フラグメント の完全な延長と再生を確実にした。 マウス膵臓ゲノムＤＮＡの増幅に使用したブライマーけ、Ｈ鎖可変ドメインにつ いてはＶＨＩＦＯＲおよびＶＨＩＢＡＣＫ、Ｌ鎖可変ドメインについてはｖＫ２ ＦＯＲおよびＶＫＩＢＡＣＫであツタ（ＶＫ２ＦＯＲは、５′末端に余分のＣ残 基をもつ点でＶＫＩＦＯＲと異なるのみである）。 様々のファミリーのマウスＶＨおよびＶに遺伝子とのアニーリングを至適化する ために設計された他のセットのブライマーを案出し、上述のブライマーとの混合 物として使用した。たとえば、Ｖに遺伝子の増幅のためフォワードブライマーと してＶＫＩＦＯＲ。 ＭＯＪＫＩＦＯＲＳＭＯＪＫ３ＦＯＲおよびＭＯＪＫ４ＦＯＲの混合物を、パッ クブライマーとしてＶＫＩＢＡＣＫ、ＭＯＶＫＩ［ＡＢＡＣＫおよびＭＯＶＫＩ ＩＢＢＡＣＫの混合物を使用した。同様に、ＶＨ遺伝子の増幅にはフォワードブ ライマーとしてＶＨＩＦＯＲ，ＭＯＪＨＩＦＯＲ，ＭＯＪＨ２ＦＯＲ。 ＭＯＪＨ３ＦＯＲおよびＭＯＪＨ４ＦＯＲの混合物を、パックブライマーとして はＶＨＩＢＡＣＫ。 ＭＯＶＨＩ　ＢＡＣＫ、ＭＯＶＨＩＩＡＢＡＣＫ。 ＭＯＶＨＩＩＢＢＡＣＫおよびＭＯＶＨｍＢＡＣＫ（７）混合物を使用した。 上に挙げたこれらのＨＩＩＦＯＲプライマーはすべてＢｓｔＥ１１部位を含有し 、上述のＢＡＣＫプライマーはナベてＰｓｔ１部位を含有する。上述のＨ鎖ＦＯ ＲおよびＢＡＣＫブライマーはすべて、それぞれＢｇｌｌｌおよびＰｖｕ１１部 位を含有する。別の制限部位、５ａｃＩおよびＸｈｏｌを使用したＬ鎖ブライｖ −（ＶＫ３ＦＯＲおよびＶＫ２ＢＡＣＫ）も創製した。 通常、これらのブライマーはすべて、ゲル電気泳動で、他のバンドも存在するも のの、正しいサイズの増幅ＤＮＡを生成した。しかしながら、ＶＨ遺伝子に対す る前方および後方プライマーの５′および３′末端が部分的に相補性であった場 合には問題がみられた。この場合は、２種のオリゴヌクレオチドが互いにプライ ムした「プライマー二量体」が主パンとなることがある。この理由から、２個の ３′ヌクレオチドがＶＨＩＦＯＲから除去された改良フォワードプライマー、Ｖ ＨＩＦＯＲ−２を創製した。 すなわち、マウスＶＨ遺伝子の好ましい増幅条件は次のとおりである。サンプル は５０〜１１００ｎ　　ＤＮＡ。 ＶＨＩＦＯＲ−２およびＶＨＩＢＡＣＫプライｖ−（２５ｐｍｏｌｅ　）　、各 デオキシヌクレオチド三すン酸各２５０μＭ、１０ｍＭ　　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ ｌ、ｐＨ８，８，５０ｍＭ　　ＫＣＩ、１．５ｍＭ　　ＭｇＣ１２およびｉｏ。 μｇ　／　ｍｌゼラチンを含み、容量を５０〜１００μｌとした。サンプルをパ ラフィン油で覆い、９５℃に２分間、６５℃に２分間、ついで７２℃に加熱して 、サンプルが延長温度に達したならばｔａｑポリメラーゼを加え、反応を７２℃ で２分間続けた。サンプルはＴｅｃｈｎｅ　　Ｐ　ＨＣ−１プログラム化加熱ブ ロツクを用いてさらに２９回の温度サイクルに付した。 ゲノムＤＮＡからのマウス■に遺伝子に好ましい増幅条件は次のとおりである。 すなわちサンプルは、■にプライマーたとえばＶＫ３ＦＯＲおよびＶＫ２ＢＡＣ Ｋにより、９４℃に１分間、６０℃に１分間および７２℃に１分間のサイクルを 用いて処理したほかは上述の通りとした。 ゲノムＤＮＡのために案出した条件は、マウス肺臓またはマウスハイブリドーマ からのｍＲＮＡより誘導されるｃＤＮＡの増幅にも適している。 可変領域遺伝子のクローニングおよび解析反応混合物を次に４０μｌの水飽和ジ エチルエーテルで２回抽出した。続いて例１と同様に標準フェノール抽出および エタノール沈殿を行った。ついでＤＮＡペレットを１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　・Ｃ １，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。 １００μｌに溶解した。゛ Ｌ鎖可変ドメイン暗号配列を含む各反応液を５ａＣＩおよびＸｈｏＩ（またはＰ ｖｕｎおよびＢｇｌｌＩ）で消化して、適当な発現ベクター中にリゲートできる ようにした。Ｈ鎖可変ドメイン暗号配列を含む各反応液は、同じ目的で、Ｐｓｔ ＩおよびＢｓｔＥＩｒによって消化した。 リゾチームで超免疫したマウスから上述のようにして単離したＨ鎖可変遺伝子は 、Ｍ１３−ＶＨＰＣＲＩベクター中にクローン化して、配列を決定した。４８の ＶＨ遺伝子クローンの完全配列を決定した（第１０図）。マウスＶＨ遺伝子ファ ミリーの２個の除くすべてについての頻度分布は、ＶＡ　（１）　、ｍｃ　（１ ）　、Ｉ［［Ｂ　（８）、ｍＡ　（３）　、■Ｂ　（１７）　、Ｉ［Ａ　（２） 　、ＩＢ　（１２）、ＩＡ（４）であった。３０個のクローン中、Ｄセグメント は、ファミリーＳＰ２　（１４）　、ＦＬ１６　（１１）およびＱ５２（５）に 帰属され、３８個のクローン中Ｊ　Ｈミニ遺伝子はＪＨＩ　（３）　、ＪＨ２（ ７）　、ＪＨ３（１４）およびＪＨ４（１４）に帰属された。ＣＤＲ３の異なる 配列が４８個のクローンのそれぞれから独特なものとして区画された。９個の偽 似遺伝子および１６個の不毛の再配列が同定された。配列が決定されたクローン 中、２７個が読み取り枠をもっている。 すなわち、この方法で、マウス肺臓ＤＮＡからＨ鎖可変遺伝子の多様なレパート リ−を発生させることができる。 例３ ヒト末梢血リンパ球のｍＲＮＡからの再配列可変遺伝ヒト末梢血リンパ球を精製 し、ｍＲＮＡを直接調製するか（方法１）、またはエプスタイン・バーウィルス を添加後にｍＲＮＡを調製した（方法２）。 方法１：健常志願者からのヘパリン化ヒト血液２０ｍ１を等容量のリン酸緩衝液 食塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で希釈し、５０ｍ１のＦａｌｃｏｎ管に等量ずつ分配し た。ついで血液の下に１５ｍ１のＦｉｃｏｌｌ　Ｈｙｐｘｑｕｅ　（Ｐｈｘｒ＋ ＊ｃｉｓ　１０−Ａ　−００ｌ−０７）を敷いた。赤血球からリンパ球を分離す るために、管を、Ｉ　Ｅ　ＣＣｅｎｔｓ　３　Ｅテーブル遠心機を用い、室温、 １８００　ｒｕで１０分間回転させた。末梢血リンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）はついで 中間相からパスツールピペットで吸引して集めた。細胞を等容量のＰＢＳで希釈 し、再び１５００　ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上澄液を吸引し、細胞ペレ ットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、細胞を２個のＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に分配し た。 方法２：前ＡＩＤＳ状態のＨＩＶ患者からのヒト血液４０ｍ１をＦｉｃｏｌｌ上 で層別し、白血球を分離した（上述の方法１参照）。ついで白血球を組織培養培 地中で４〜５日間インキュベートした。３日目に、エプスタイン・パーウィルス を感染させた。細胞をペレット化しく約２×１０７個）、ＰＢＳ中で洗浄した。 細胞を再びペレット化し、５Ｍグアニジンイソチオシアネート、５０ｍＭ　　Ｔ 　ｒ　ｉ　ｓ、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ。 ０．１ｍＭ　　’）チオスレイトール、７ｍｌで溶解した。細胞を激しく撹拌し 、４Ｍ　　ＬｉＣ１７容を加えた。混合物を４℃で１５〜２０時間インキュベー トした。懸濁液を遠心分離し、上澄液を３ＭＬｉＣ１中に再懸濁し、再び遠心分 離した。ペレットを、ｏ、１％ＳＤＳ、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩおよび １ｍＭ　　ＥＤＴＡ、２０＋１に溶解した。懸濁液を一２０℃で凍結し、４５分 間１０分置きに２０秒間撹拌して解凍した。大きな白色のペレットを捨てて、澄 明な上澄液をフェノール−クロロホルム、ついでクロロホルムで抽出した。１／ １ｏ容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２容のエタノールを加え、−夜−２０℃に放 置してＲＮＡを沈殿させた。ペレットを０．２ｍｌの水に懸濁し、エタノールで 再沈殿させた。微細な懸濁液を生成させるために撹拌してエタノール沈殿させ、 ｃＤＮＡ合成用サンプルとした。 懸濁液１００μｌを沈殿させ、ｌＱｐｍｏｌｅのＨＵＦＯＲブライマー（下記参 照）を用いてｃＤＮＡ合成用に水２０μｌに溶解し［３０］、最終容量５０μｌ とした。ｃＤＮＡ５μｌのサンプルを、ヒトＶＨ遺伝子ファミリー（下記参照） 用のプライマーを使用し、９０℃、６０℃および７２℃のサイクルを用いたほか は例２と同様にして増幅させた。 ヒトＤＮＡ増幅用パックプライマーは、用いられるヒトＨおよびＬ鎖配列に合致 するように設計された。この場合、ファミリーが異なると５′末端にわずかなが らヌクレオチド配列に差がある。すなわち、ヒトＶＨ遺伝子については、プライ マーは、パックプライマーとしてＨｕ　２ＶＨＩ　ＢＡＣＫ、ＨｕＶＨＩ［ＢＡ ＣＫ。 Ｍｕ２ＶＨｍＢＡＣＫおよびＨｕＶＨＩＶＢＡＣＫが設計され、すべて可変遺伝 子に基づくフォワードプライマーとしてはＨＵＪＨＩＦＯＲＳＨＵＪＨ２ＦＯＲ およびＨＵＪＨ４ＦＯＲが設計された。）オワ−ドブライマーの他のセットとし ては、ＨｕｌＶＨＦＯＲ，Ｈｕ２ＶＨＦＯＲ，Ｈｕ３ＶＨＦＯＲおよびＨｕ４Ｖ ＨＦＯＲも用いられた。これはヒトゴー領域および異種のヒト同位体の不変領域 の５′末端に一致するように設計された。 これらのプライマーのセットを用いると、増幅されたｄｓ　　ｃＤＮＡのバンド をゲル電気泳動で認めることができた。 このような実験のひとつを詳細に解析して、ＨＩｖ感染患者には多様なレパート リ−があったか否かを確立した。ＡＩＤＳの経過時に、Ｔ細胞および抗体も血液 に著しく低下することが知られている。多分、リンパ球のレパートリ−も減少し ているものと思われる。この実験では、フォワードプライミングのために、プラ イマーＨｕｌＶＨＦＯＲＳＨｕ２ＶＨＦＯＲ。 Ｈｕ３ｖＨＦＯＲ，およびＨｕ４ＶＨＦＯＲの等モル混合物（ＰＣＲ中、プライ マー５′末端２５　ｐａｒｏｌｅ　）を使用した。パックプライミングのために は、プライマーＨｕ２ＶＨＩ　ＢＡＣＫ％ＨｕＶＨＩＩＢＡＣＫ。 Ｈｕ　２ＶＨｍＢＡＣＫおよびＨｕＶＨＩＶＢＡＣＫを、４つの別のプライミン グに別個に使用した。別個のプライミングからの増幅ＤＮＡをついでプールし、 上述のように制限酵素ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩ［で消化し、ついで配列決定の ためにベクターＭ１３ＶＨＰＣＲ１中にクローン化した。配列は、疾患のこの段 階で、多様なレパートリ−を示すことが明らかにされた（第１１図）。 ヒト■に遺伝子については、フォワードプライマーとしてブライ？−ＨｕＪＫＩ ＦＯＲＳＨＵＪＫ３ＦＯＲ。 ＨＵＪＫ４ＦＯＲおよびＨＵＪＫ５ＦＯＲを、パックプライマーとしてＶＫＩＢ ＡＣＫを用いた。これらのプライマーを用いると、ゲル電気泳動により、正しい サイズの増幅ｄｓ　　ＣＤＮのバンドを認めることができた。 例４ ヒト末梢血リンパ球からの非再配列可変遺伝子ゲノムＤＮＡのクローニング 非ホジキン病リンパ腫患者のヒト末梢血リンパ球を例３（方法１）と同様にして 調製した。ゲノムＤＮＡはＰＢＬから、例２（方法２）に記載した方法を用いて 調製した。単離されたゲノムＤＮＡ中のＶＨ領領域ついで、各サイクルのアニー リングの部では温度を５５℃に維持し、３０サイクルを実施したほかは、上記例 １のｒＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドからの増幅」と題したセクションの最初の２ つのパラグツに述べられた一般的プロトコールを用いて、増幅し、クローン化し た。３０サイクルの終了後、反応混合物を６０℃に５分間保持して、増幅フラグ メントの完全な延長と再生を確実にした。 用いたフォワードプライマーはＨｕＨｅｐｌＦＯＲであった。これは５ａｃＩ部 位を含有する。このプライマーは、非再配列ヒトＶＨ領域遺伝子の３′末端にア ニーリングするように設計され、とくにＶＨ領域遺伝子における最後の３つのコ ドンおよびこれらの３つのコドンの下流の９個のヌクレオチドと相補性の配列を 包含する。 パックプライマーとしては、ＨｕＯｃｔａｌＢＡＣＫ。 ＨｕＯｃｔａ２ＢＡＣＫおよびＨｕＯｃｔａ３ＢＡＣＫの等モル混合物を使用し た。これらのプライマーはゲノムＤＮＡ　　ＶＨ遺伝子のプロモーター領域にお ける配列にアニーリングする（第１図参照）。増幅ＤＮＡ５μｌをＴＢＥ緩衝液 中２％アガロースゲル上でチェックし、エチジウムプロミドで染色した。約６２ ０ヌクレオチドの二重バンドが認められ、これは非再配列ＶＨ遺伝子について期 待されるサイズに相当する。ｄｓ　　ｃＤＮＡを５ａｃＩで消化し、配列決定の ためにＭ１３ベクター中にクローン化した。同一の配列も一部存在するが、一連 の異なる非配列ヒトｖＨ遺伝子が同定された（第１２Ｄ１．３（抗リゾチーム） 抗体のＨ鎖可変ドメイン（ＶＨＬＹＳ）を以前に報告されたベクター［４２］と 類似のベクターにクローン化したが、１ａｃＺプロモーターの制御下にあり、ｖ ＨしＹＳドメインは周辺質への放出のためにｐｅｌＢリーダー配列に結合してい る。このベクターは、ｐｅｌＢリーダー配列［４３］の合成、重複オリゴヌクレ オチドの使用およびｐＵｃ１９ベクター［３５］へのクローニングによって構築 された。Ｄｌ。 ３抗体のＶＨＬＹＳドメインは、ｃＤＮＡりｏ−ン［４４］および配列が決定さ れた（第１３図）構築体（ｐＳＷＩ）から誘導された。 ＨおよびＬ鎖側可変ドメインを一緒に発現されるためには、Ｄｌ、３抗体のＬ鎖 可変領域（ＶＫＬＹＳ）　をｐｅｌＢシグナル配列とともにｐＳＷＩベクター中 に導入し、構築体ｐＳＷ２（第１４図）を得た。 次に、大腸菌株（ＢＭＨ７１−１８）［４５コをプラスミドｐ　Ｓ　Ｗ　１また はｐＳＷ２でトランスホームし［４６，４７コ、アンピシリン（１００μｇ／ｍ ｌ）に抵抗性のコロニーを、異化物質抑制によって可変ドメインの発現を抑制す るために１％グルコースを加えた高栄養（２ＸＴＹ＝水１１あたり、バクトート リプトン１６ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣ１５ｇ）プレート上で選択した。 コロニーを２ＸＴＹ　（１％グルコースおよび１００μｇ　／　ｍｌアンピシリ ン含有）５０ｍｌに接種し、フラスコ中３７℃で振盪しながら１２〜１６時間生 育させた。細胞を遠心分離し、ペレットを５０ｍＭ食塩で２回洗浄し、１００μ ｇ　／　ｍｌアンピシリンとインデューサーＩ　ＰＴＧ（１ｍＭ）を含有する２ ＸＴＹ培地中に再懸濁し、さらに３７℃で３０時間生育させた。細胞を遠心分離 し、上澄液をＮａ１ｇｅｎｅフィルター（０，４５μｍ）に通し、ついで１〜５ 　ｍｌのりゾチームー５ｅｐｂｕｏｓｅアフィニティーカラム（カラムは、リゾ チームを１０■／　ｍｌでＣＮＢｒ活性化５ｅｐｈｘ＋ｏ＋ｅにカップリングさ せて誘導）に滴下した。カラムを、最初リン酸緩衝食塩溶液（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗 浄し、ついで５０ｍＭジエチルアミンにより、ＶＨＬＹＳドメイン（ｐｓＷｌか ら）またはＶＫＬＹＳ　（ｐＳＷ２から）と会合したＶＨＬＹＳを溶出させた。 ＶＨＬＹＳおよびＶＫＬＹＳドメインはＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によ り、正しいサイズとして同定された。さらに、ポリアクリルアミドゲルから単離 されたＶＨＬＹＳおよびＶＫＬＹＳのＮ末端配列決定により、シグナルペプチド は正しく生成されたことが明らかにされた。すなわち、Ｆｖフラグメントおよび ＶＨＬＹＳドメインの両者ともりゾチームアフィニティーカラムに結合すること が可能で、両者が元の抗体の親和性の少なくとも一部を維持していることが示唆 された。 ＶＨＬＹＳドメインのサイズは、ＦＰＬＣによれば、５ｖｐｅ＋ｏｓｅ　１２上 のＦｖフラグメントに匹敵するものであった。これはＶＨＬＹＳドメインがモノ マーであることを示している。ＶＨＬＹＳおよびＦｖフラグメントのリゾチーム への結合はＥＬＩＳＡによってチェックされ、平衡および高速反応の研究が蛍光 消光を利用して行われた。 リゾチーム結合についてのＥＬＩＳＡは以下のように行われた。 （１）プレート（Ｄ７ｎａｔｅｃｈ　１ｍｍｕｌｏｎ）　　に５０ｍＭＮ　ａ　 ＨＣ０３，ｐＨ９、６中３００　ｔｔ　ｇ　／　ｍｌリゾチームを各ウェルあた り２００μｌ加えて、室温で一部コーティングした。 （２）ウェルをＰＢＳ洗液で３回すすぎ、ＰＢＳ中１％５ｘｉｎｓｂｕｒマ高速 乾燥スキムミルク末を各ウェルあたり３００μｌを加え、３７℃で２時間ブロッ クした。 （３）　’ｙエルをＰＢＳ洗液で３回すすぎ、ＶＨＬＹＳまたはＦｖフラグメン ト（ＶＫＬＹＳと会合したＶＨＬＹＳ）２００μｌを加えて室温で２時間インキ ュベートした。 （４）ウェルをＰＢＳ中０．０５％Ｔｖｅｅｎ　　２０で３回洗浄し、ついでＰ ＢＳで３回洗浄して界面活性剤を除去した。 （５）Ｆｖフラグメントに対するウサギポリクローナル抗血清のＰＢＳ中２％ス キムミルク末液中適当な希釈液（１：　１０００）２００μｌを各ウェルに加え 、室温で２時間インキュベートした。 （６）　　（４）　　と同様に洗浄をくり返した。 （７）西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗−ウサギ抗体（Ｉ 　ＣＮ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｂｅｍｉｃｘ！ｓ　）のＰＢＳ中２％スキムミルク末 液中適当な希釈液（１：１０００）２００μｍを各ウェルに加え、室温で１時間 インキュベートした。 （８）　　（４）　　と同様に洗浄をくり返した。 （９）２．２’−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）　　 ［Ｓｉｇｍａ］　　（０，５５■／ｍ１゜１μｌ　　２０％過酸化水素：水／１ ０ｍ１）２００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分間まで、発色させた。 反応は、５０ｍＭクエン酸ｐＨ４，３中０．０５％ナトリウムアジドを加えて停 止させた。ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレートをＴｉ１ｅ＋ｌｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃｇｎプ レートリーダーで読み取った。 ｐｓＷｌ　（ＶＨＬＹＳドメイン）またはｐＳＷ２（Ｆｖフラグメント）、いず れの誘導細菌培養液からの上澄液もＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいてリゾチームに結合す ることが明らかにされた。 精製ＶＨＬＹＳおよびＦｖフラグメントを蛍光消化を用いて（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅ Ｉｍｅ＋　　Ｌ　Ｓ　５　Ｂ　　Ｌｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅＳｐＣｃｔ＋ｏｍｅ ｊｅ＋）リゾチームで滴定し、リゾチームとの結合の化学量論および親和性定数 を測定した［４８．４９コ。３ＱｎＭ濃度でのＦｖフラグメントの滴定では。 解離定数は５ｃｘｔｃｈｘｒｄ解析を用い、２．８μＭであるこ　。 とを示した。 蛍光消光および５ｃａｔｃｈｕｄプロツトを用いた類似の解析を、ＶＨＬＹＳに ついても、濃度１１００ｎで実施した。抗原結合の化学量論はＶＨＬＹＳ　　１ モルあたりリゾチーム約１モルである（プロットから計算。ＶＨドメインの濃度 は、完全免疫グロブリンについての通常の吸光係数を用い２８０μＭでの光学密 度から計算した）。 低光学密度の測定における誤差の可能性と吸光係数についての仮定により化学量 論はまた、さらに注意深く測定した。ＶＨＬＹＳは上述のように蛍光消光を用い てリゾチームで滴定した。ＷＨＬ　Ｙ　Ｓの濃度を測定するためには、保存液液 のサンプルを取り、既知量のノルロイシンを加え、サンプルを定量的アミノ酸分 析に付した。これから、ＶＨＬＹＳドメイン１ｍｏｌｅあたり、リゾチーム１　 、　２１１１ｏｌｅの化学量論を示した。解離定数は約１２ｎＭと計算された。 ＶＨＬＹＳおよびＦｖフラグメントのリゾチームとのオン−レートは、リゾチー ムより１０倍高濃度のフラグメントを用いる擬−次条件下に、ストップフロー法 （旧Ｔｅｃｈ　５ｔｏｐ　Ｆｌｏｗ　ＳＨＯ装置）によって測定した［５０］。 リゾチーム結合部位の濃度は、上述の蛍光消光を用いてリゾチームによる滴定で 、最初に測定した。オン−レートは結合部位（ＶＨＬＹＳ蛋白質の量ではなくて ）１モルあたりで計算した。Ｆｖフラグメントについてのオン−レートは、２５ ℃で２．２Ｘ１０’Ｍ”　　ｓ−’であった。ＶＨＬＹＳフラグメントについて は２０℃で、オンーレ−１１；！３．８Ｘ１０’　Ｍ−’　　ｓ−’、オフーレ ー）ハ０．０７５ｓ−１であった。親和性定数の計算値は１９ｎＭである。すな わち、ＶＨＬＹＳはリゾチームと解離定数的１９ｎＭで結合し、一方Ｆｖの値は ３ｎＭである。 マウスをニワトリの卵白リゾチームで免疫しく完全フロインドアジュバント中１ ００μｇを日１に腹腔的投与）、１４日後にリゾチーム１００μｇを不完全フロ インドアジュバントとともに再び腹腔内に免疫し、日３５に５０μｇのりゾチー ムを食塩水中静注した。日３９に膵臓を収穫した。第２のマウスは、同様にして 、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）で免疫した。 ＤＮＡは膵臓から、例２（方法２）に従って調製した。 ＶＨ遺伝子は、例２の好ましい方法によって増幅した。 ＨＩＶ感染患者からのヒト末梢血リンパ球を例３（方法２）と同様にして調製し 、ｍＲＮＡを調製した。ＶＨ遺伝子は、例３に記載の方法に従い、ヒトＶＨ遺伝 子ファミリー用に設計したプライマーを用いて増幅した。 ＰＣＲ後、反応混合物および油をエーテルで２回、フェノールで１回、フェノー ル／クロロホルムで１回抽出した。ついで二重鎖ＤＮＡを水５０μｌに取り、凍 結した。５μｌをＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ（増幅プライマー内にコードされ る）で消化し、アガーロースゲルに負荷して電気泳動を行った。約３５０ｂｌ） における増幅ＤＮＡのバンドを抽出した。 抗−リゾチーム活性の発現 増幅Ｈ鎖可変ドメイン（リゾチームで免疫したマウスおよびヒトＰＢＬから）の レパートリ−をついで直接、発現ベクターｐｓＷＩＨＰＯ−ＬＹＭＹＣにクロー ン化した。このベクターはＶＨＬＹＳ遺伝子が除去され、ポリリンカー制限部位 で置換されたほかは、ｐｓＷｌから誘導される。ペプチドタグをコードする配列 を挿入した（第１５図）。コロニーを１　ｍｌの培養液中にようじで移した。イ ンキュベーション後（詳細は例５参照）。１４個の１ｍｌ培養液からの上澄液１ ０μｌを５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷し、蛋白質を電気泳動的にニトロセルロ ースに移した。プロットはペプチドタグに対する抗体９Ｅ１０で検査した。 検査は次のように実施した。ニトロセルロース濾紙を、ＴＢＳ緩衝液（ＩＯＸＴ ＢＳは１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，４，９％ｖ／　ｗ　Ｎ　ａ　 Ｃｌである）中３％ウシ血清アルブミンに取り、２０分間インキュベートした。 この濾紙を、３％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｔ　Ｂ　Ｓ中適当に希釈した抗体９Ｅ１０　（約 １１５００）と１〜４時間インキユベートシた。濾紙をＴＢＳ中で３回洗浄した のち（１回あたり１００ｍ１を用い、各洗浄は１０分間行う）、濾紙を３％Ｂ　 Ｓ　Ａ／Ｔ　Ｂ　Ｓ中１：５００に希釈した抗−マウス抗体［ペルオキシダーゼ 接合抗−マウスＩｇ（Ｄａｋｏｐ＊ｊｓ）　］　と１〜２時間インキュベートし た。 ＴＢＳおよび０．１％Ｔ「目ｏｎＸ−１００中で３回洗浄したのち（各回あたり 約１００ｍ１を用い、各洗浄は１０分間行う）、メタノール中クロロナフトール （３■／ｍｌ）１０ｍｌ、４０ｍ１ＴＢＳおよび５０μｌ過酸化水素溶液を含む 液をプロット上に加え、１０分まで反応させた。基質を過剰のエーテルで洗い流 した。プロットは、ウェスタンプロットでのＶＨＬＹＳＭＹＣに移動度が類似し たバンドを現し、他のＶＨドメインも発現できたとを示した。 次にコロニーを個々にＥＬＩＳＡプレートのウェル（２００μｌ）にようじで移 し、生育、誘導させた。これらについて、９Ｅ１０抗体とのリゾチームの結合を 検定した。リゾチーム結合活性をもつウェルを確認した。 増幅マウス膵臓ＤＮＡから２個（２００個中）の陽性ウェルが、またヒトｃＤＮ Ａから１個のウェルが確認された。Ｈ鎖可変ドメインをリゾチーム−８ｅｐｈａ ｒｏｓｅのカラム上で精製した。クローンのりゾチームに対する親和性を蛍光消 光滴定で調べたところ＞５０ｎＭであった。マウス遺伝子から誘導された２つの クローン（ＶＨ３およびＶＦ（８）の親和性もストップフロー法で求めたところ （ｋ　ｏｎ／　ｋ　ｏｆｆの比）、それぞれ１２ｎＭおよび２７ｎＭであった。 すなわち、これらの両クローンはＶＨＬＹＳドメインに匹敵する親和性を有する 。ＶＨ３およびＶＨ８のコードされるアミノ酸配列は第１６図に、ヒト可変ドメ インのそれは第１７図に示す。 リゾチームで免疫したマウスからのＶＨドメインのライブラリーを、リゾチーム およびキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）の両者の結合活性につ いてスクリーニングした。２０００個のコロニーを５個ずつの群としてＥＬ　Ｉ 　ＳＡプレートのウェルにようじで移し、上澄液についてリゾチーム被覆プレー トおよび別個に、Ｋ　Ｌ　Ｈ被覆プレートへの結合を試験した。２１個の上澄液 がリゾチーム結合活性を２個がＫＬＨ結合活性をもつことが明らかにされた。Ｋ ＬＨで免疫したマウスから調製した第２の発現ライブラリーも上述のようにして スクリーニングした。１４個の上澄液がＫＬＨ結合活性を、１個の上澄液がリゾ チーム結合活性を示した。 これは、抗原結合活性が単−ＶＨドメインから調製できること、および免疫処置 がこれらのドメインの単離を容易にすることを示している。 単一の再配列ＶＨ遺伝子を取れば、それぞれのＣＤＨの広範囲な変異誘発により 、全く新しい抗原結合活性を誘導することが可能である。突然変異は全く無作為 であってもよく、また予め存在するＣＤＲのレパートリ−から誘導してもよい。 すなわち、ＣＤＲ３のレパートリ−は、隣接配列に基づく「普遍的」プライマー を用いて前例と同様にして、また同様に他のＣＤＲのレパートリ−も（単一にま たは組合せで）調製できる。ＣＤＲレパートリ−は、様々な組換えＤＮＡ技術に より、隣接枠組み領域内の位置にとじ込むことができた。 ＣＤＲ３はＣＤＲＩおよび２に比べてサイズ、配列ともに変化しやすいので、Ｃ ＤＲ３は突然変異の最も期待できる領域である。この領域は抗原への結合に大き な寄与が考えられる。抗−リゾチーム抗体Ｄ１．３のＨ鎖可変領域（ＶＨＬＹＳ ）はＣＤＲ３領域といくつかの重要な接触があることが知られている。 多重突然変異はＣＤＲ３に行われた。突然変異の作成にはポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）および高度の縮退プライマーを使用し、この方法によりＣＤＲ３の基 の配列は破壊された（混合オリゴヌクレオチド二重型をＣＤＨに隣接する制限部 位にクローニングすることにより、または他の特定部位の突然変異誘発方法によ り、ＣＤＲａ中に突然変異を構築することも可能であった）。 リゾチームに対する親和性をもつＨ鎖可変ドメイン発現変異体をスクリーニング し、親和性の改良または新しい特異性を確認した。 Ｈ鎖可変ドメインのソースはＶＨＬＹＳ遺伝子を含有するＭ１３ベクターとした 。可変領域をコードする配列の本体を、ＣＤＲ３に基づく突然変異プライマーＶ ＨＭＵＴ１およびＭ１３ベクターバックボーンに基づくＭ１３プライマーとのポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。突然変異プライマーは、ＣＤ Ｒ３の中央の４個の残基（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）に高度な突然変異 を誘発する。ＰＣＲは、１１００ｎの一本鎮Ｍ１３ｍｐ１９ＳＷＯ鋳型と、２５ 　ｐｍｏｌのＶＨＭＵＴｌおよびＭ１３プライマー、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、 ６７ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，８，１０ｍＭ　　ＭｇＣ１，１７ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２００μｇ　／　ｍｌゼラチンおよび２．５単位Ｔａｑポ リメラーゼを用い、最終容量５０μｌで、ＴｅｃｈｎＣＰ　ＨＣ−１プログラム 化熱ブロツクにより２５サイクル実施した。 温度の基準は、９５℃に１．５分、２５℃に１．５分、７２℃に３分とした（し かしながら、ある範囲のＰＣＲ条件が使用できた）。反応生成物はフェノール／ クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、ｌＱｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌおよ び０．１ｍＭ　　ＥＤＴＡ。 ｐ）Ｉｓ、　　０に再懸濁した。 ＰＣＲからの生成物はＰｓｔｌおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、１．５％ＬＧＴア ガロースゲル上、Ｔｒｉｓ酢酸塩緩衝液により、Ｇｅｎｅｃｌｅｇｎ　　（Ｂ　 ｉ　ｏ　　１０１゜ＬａＪφ１ｌａ）を用いて精製した。ゲル精製バンドをｐｓ Ｗ２ＨＰＯＬＹ中にリゲートした（第１９図、このベクターは、ＶＨＬＹＳ遺伝 子の本体がポリリンカーで置換されているほかはｐ　ＳＷ２に類似している）。 ベクターを最初はＢｓｔＥＩＩおよびＰｓｔＩで消化し、ウシ腸ホスファクター ゼで処理した。反応混合物の一部を用いて、アンピシリン抵抗性大腸菌ＢＭＨ７ １−８１をトランスホームした。コロニーはグルコース０．８％Ｗ／マを含むア ンピシリン（１００μｇ　／　ｍｌ　）高栄養プレート上で選択した。 トランスフェクションで生じたコロニーを５個ずつ集めて、２００μｌ　　２ｘ ＴＹ培地および１００μｌＴＹ培地、１００μｇ　／　ｍｌアンピシリンならび に１％グルコースを含有する２×９６ウエルのＣＣｏ１ｎ１ｎマイクロタイター プレートに移した。コロニーを３７℃で２４時間生育させたのち、細胞を５０ｍ Ｍ　　ＮａＣ１２００μｌで２回洗浄し、マイクロタイタープレートに蓋をかふ ぜてＩ　Ｅ　ＣＣｅｎ！＋ｉ　−３ベンチトップ遠心分離機で細胞をペレット化 した。プレートは室温、２．５ＱＱ＋ｐｌｎで１０分間回転させた。細胞を２０ ０μｍ　　２ＸＴＹ。 １００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１ｍＭ　　ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ　）に再 懸濁して発現を誘導し、さらに２４時間生育させた。 細胞を遠心して沈降させ、上澄液をリゾチーム被覆プレートと抗−イディオタイ プ血清（Ｄｌ、３抗体のＦｖフラグメントに対してウサギで励起）とのＥＬＩＳ Ａに使用した。結合した抗−イディオタイプ血清は、抗−ウサギ血清に結合した 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＩＣＮＩｍｍａｎｏｃｈ！Ｉｏｉｃｘｌｓ　）を 用いて検出した。７個のウェルがＥＬＩＳＡで陽性の結果を与えた。これらのプ ールを単一コロニーについて画線培養し、マイクロタイタープレートに取り、生 育させ、誘導し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡで上述のように再スクリーニングした。陽性コ ロニーを５０ｍ１のスケールで生育させ、発現を誘導した。培養上澄液を例５と 同様にしてリゾチーム−５ｅｐｂ１ｒｏｓｅのカラム上で精製し、溶出液を５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ上で分析し、Ｐａｇｅ　Ｂｌｕｅ９０　（ＢＤＨ）で染色した。カ ラムのジエチルアミン溶出でＷＨＬＹＳ変異体ドメインに相当するバンドが確認 されたが、ＶＫＬＹＳのドメインは認められなかった。 これは、変異体ドメインがリゾチームに結合できるものの、それらはも早ＶＫＬ ＹＳドメインとは会合できないことを示唆した。 ＥＬＩＳＡで陽性を与えた７つのクローンについて、プラスミドを調製し、ＶＫ ＬＹＳ遺伝子をＥｃｏＲＩ切断によって切り出して、再すゲートした。すなわち 、このプラスミドは、ＶＨＬＹＳ変異体の発現のみを指示する。１．５ｍｌの培 養体を生育させ、上述のように発現を誘導した。細胞を遠心分離して沈降させる と、上澄液は上述のようにリゾチームへの結合を示した（また、増幅変異体ＶＫ ＬＹＳ遺伝子ハｐ　Ｓ　Ｗ　Ｉ　ＨＰ　ＯＬ　Ｙベクターに直接クローン化して 、ＶＫＬＹＳの不存在下に変異体活性を発現させることができた）。 ＥＬ　Ｉ　ＳＡは、細菌上澄液のリゾチーム（またはＫＬＨ）結合活性を比較で きるように案出した。最初に、ベクターは、ｖＨドメインをそのＣ−末端領域で 、モノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識されるｃ−ｍｙｃ蛋白質からのペプ チドとつなぐために創製された。 ベクターはｐ　Ｓ　Ｗ　１からＢｓｔＥＩＩおよびＳｍａ　Ｉによる二重消化、 および ５’ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ ＧＡＡ　　ＣＡＡ　　ＡＡＡ　　ＣＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡ　　ＧＡＧ　　ＧＡ Ｔ　　ＣＴＧ　　ＡＡＴ　　ＴＡＡＴＡＡ　　３’　および ５’ＴＴＡ　　ＴＴＡ　　ＡＴＴ　　ＣＡＧ　　ＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡ　　 ＧＡＴ　　ＧＡＧ　　ＴＴＴＴＴＧ　　ＴＴＣＴ−ＧＡ　　ＧＧＡ　　ＧＡＣＧ ３’から作られたオリゴヌクレオチド二重体のリゲーションによって誘導された 。 誘導後に発現されたＶＨＬＹＳＭＹＣ蛋白質ドメインはリゾチームおよび９Ｅ１ ０抗体と結合することが、以下のＥＬＩＳＡによって示された。 （１）　ＦｓＩｃｏｎ　（３９１２）の平底ウェルを、５０ｍＭＮ　ａ　ＨＣＯ ａ　、ｐＨ９，６中各ウエルあたり１８０μｌのリゾチーム（３ａｕｘ／ｍｌ） またはＫＬＨ（５０μｇ／ｍｌ）で被覆し、室温に一夜放置した。 （２）ウェルをＰＢＳで洗浄し、各ウェルあたり２００μｍ（７）ＰＢＳ中２％ Ｓ＊１ｎｔｂｎＢ高速乾燥スキムミルク末溶液により３７℃で２時間ブロックし た。 （３）ブロッキング溶液を捨て、ウェルをＰＢＳで洗浄しく３回）、各ウェルに 試験溶液１５０μｍ　（上澄液または精製した標識ドメイン）をピペットで加え た。サンプルを３７℃で２時間インキュベートした。 （４）試験溶液を捨て、ウェルをＰＢＳで洗浄した（３回）。ＰＢＳ中２％Ｓ＊ １ｎｓｂｏｒ７高速乾燥スキムミルク末溶液中に精製９Ｅ１０抗体４μｇ　／　 ｍｌを取り、この液１００μｌを加えて３７℃で２時間インキュベートした。 （５）９Ｅ１０抗体を捨て、ウェルをＰＢＳで洗浄した（３回）。抗−マウス抗 体［ベルオキシターゼ接合抗−マウスＩ　ｇ　（Ｄｓｋｏｐａｔｓ）　］の１１ ５００希釈液１００μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートした。 （６）第２の抗体を捨て、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。 （７１２，２’−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸）　　 （ＳｉｇｍＭ）　　（０，５５■／ｍｌ、１μｍ　　２０％過酸化水素：水／１ ０ｍ１）１００μｌを各ウェルに加え、室温で１０分まで発色させた。 ５０ｍＭクエン酸、ｐＨ４，３中０．０５％ナトリウムアジドを加えて反応を停 止させた。ＴＨｅｒｊｅｋ　ＭｕＨｉｓｃｘｎプレートリーダー用いてＥＬ　Ｉ 　ＳＡプレートを読み取った。 変異体上澄液の活性を、リゾチームへの結合に対するＶＨＬＹＳＭＹＣドメイン との競合ニヨリ、ＶＨＬＹＳ上澄液と比較した。結果は、ＶＨＬＹＳＭＹＣとの 競合において、クローンＶＨＬＹＳＭＵＴ５９からの上澄液は野生型ＶＨＬＹＳ 上澄液に比べてより有効であった。 さらに、ＶＨＬＹＳおよびＶＨＬＹＳＭＵＴ５９からの上澄液の５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅサンプルのウェスタンブロッティングでは（抗−Ｆｖ抗血清を使用）、両サン プル量はほぼ等しいことを示した。すなわち、ｖＨＬＹＳとＶＨＬＹＳＭＵＴ５ ９の量が等しいと考えると、変異体の親和性はＶＨＬＹＳドメインの場合より大 きいものと思われる。 ＶＨＬＹＳＭＵＴ５９ドメインの親和性を直接チェックするためには、クローン を１！のスケールで生育させ、例５と同様に、２００〜３００μｇをリゾチーム −５ｅｐｈｓｒｏｓｅ上で精製した。ＶＨＬＹＳおよびＶＨＬＹＳＭＵＴ５９の サンプルの蛍光消光滴定により、リゾチームに対する結合部位の数を測定した。 ついで、ｖＨＬＹＳおよびＶＨＬＹＳＭＵＴ５９のサンプルをＶＨＬＹＳＭＹＣ と２オーダーの大きさにわたり、競合ＥＬ　Ｉ　ＳＡで比較した。競合検定では 、各マイクロタイターウエルニハ一定量＋７）ＶＨＬＹＳＭＹＣ（約０．６μｇ のＶＨＬＹｓＭＹｃ）を含有させた。ＶＨＬＹＳまｌｔＶＨＬＹｓＭＵＴ５９　 （リゾチーム結合部位３゜８μＭ）の量は様々に変えて添加した（０．１６６〜 ２５μｍ）。最終容量および緩衝液濃度は全ウェルで一定にした。９Ｅ１０　（ 抗−ｍｙｃ）は各アッセイウェルにおける結合ＶＨＬＹＳＭＹＣの定量に使用し た。 ＶＨＬＹＳＭＭＣの結合の％阻害率は、ＶＨＬＹＳまたはＶＨＬＹＳＭＵＴ５９ の各添加毎に、バックグランド結合を差し引いて計算した。検定は二重に実施し た。結果は、ＶＨＬＹＳＭＵＴ５９がリゾチームニ対してＶＨＬＹＳより高い親 和性をもつことを示している。 ＶＨＬＹＳＭＵＴ５９の配列決定を行ったところ（Ｍ２Ｓに再クローニング後） 、ＣＤＲ３の中央残基（Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）を除いてＶＨＬＹＳ 遺伝子と同一であることを示した。これらはＴｈｒ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　 （ＡＣＡＣＡＡ−ＡＧＧＣＣＡによってコードされる）によって置換されていた 。 ２０００個の変異体ＶＨクローンのライブラリーをリゾチームおよびＫＬＨの結 合についてスクリーニングした（例６に記載したように各ウェルあたり５個のコ ロニーを取る）。１９の上澄液にリゾチーム結合活性が、４の上澄液にＫＬＨ結 合活性が確認された。これは、ＣＤＲ３のランダムレパートリ−を作成すること により、新たな特異性および親和性の改良を誘導できることを示単−ドメインが 優れた結合活性を有するという所見がら、連結したドメイン（コンヵテマー）の 構築が考慮された。すなわち、同一分子に多重特異性を作り上げることができ、 ドメイン頭部間の距離により空間的に離れた異なるエピトープへの結合が可能に なった。可撓性のリンカ−領域によりドメインを離して構築することができた。 原理的には、このような分子は、優れた特異性と親和性をもつように案出できる 。 Ｄｌ、３抗体のクローン化Ｈ鎖可変遺伝子の２つのコピーを可撓性リンカ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１ｙ をコードするヌクレオチド配列によって連結して（数工程の切断、貼り込みおよ び特定部位の突然変異誘発）、プラスミドｐＳＷ３（第２０図）を生成させた。 発現は１ａｃｚプロモーターによって駆動し、蛋白質はｐｅｌＢリーダー配列に より周囲質に分泌させた（例５にｐＳＷｌおよびｐ　ＳＷ２の発現について記載 したのと同じ）。蛋白質はリゾチーム親和性カラム上で均一に精製した。５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で、これは正しいサイズ（分子量約２６．０００） を与えた。この蛋白質も、この蛋白質を検知するためにＤｌ、３抗体のＦｖフラ グメントに対する抗−イディオタイプ抗血清を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡによって検 出されるように（例５参照）リゾチームに強力に結合した。すなわち、このよう な構築体は容易に作成され、分泌され、そのドメインの少なくともひとつはりゾ チームに結合する。 ベクターｐ　ｓｗ２中のＶＨＬＹＳドメインのＣ−末端にシスティン残基を導入 した。システィンは、ベクターの制限酵素ＢｓｔｌおよびＳｍａＩ（これはＪセ グメントのＣ−末端部分を切断する）による切断、および短いオリゴヌクレオチ ドニ重体 ５’ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ ＴＧＴ　　ＴＡＡ　　ＴＡＡ３’および５’　ＴＴＡ　　ＴＴＡ　　ＡＣＡ　　 ＴＧＡ　　ＧＧＡＧＡＣＧ３’　のリゲーションで導入した。 リゾチーム−５ｅｐｈａｒｏｓｅの親和性カラム上での精製により、ＶＨＬＹＳ −Ｃｙ　ｓドメインはＶＫＬＹＳ可変ドメインと会合して発現するが、総収率は 野生型のＦｖフラグメントよりもはるかに低いことが明らかにされた。 精製Ｆｖ−Ｃｙｓ蛋白質の非還元および還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの比 較から、２つのＶＨ−Ｃｙｓドメインが導入されたシスティン残基を介して連結 されたことが明らかにされた。 ＶＨドメインへの酵素活性の連結は、■ＨドメインのＮ−末端またはＣ−末端側 への酵素のクローニングによって可能なはずである。両パートナ−が活性でなけ ればならないから、２つのドメインの間に適当なリンカ−（例８参照）を設計す る必要があると考えられる。ＶＨ−酵素融合体の分泌のためには、通常分泌され る酵素を利用することが好ましい。第２１図には、Ｖ）（ドメインとアルカリホ スファターゼの融合体の配列を示す。アルカリホスファターゼ遺伝子は、プラス ミドｐＥＫ４８［５１］中に大腸菌アルカリホスファターゼ遺伝子をもつプラス ミドからポリメラーゼ連鎖反応を用いてクローン化した。遺伝子をプライマー ５’ＣＡＣＣＡＣＧＧＴ　　ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ　　ＧＡＣＡＣＣ ＡＧＡＡＡＴ　　ＧＣＣＴＧＴ　　ＴＣＴ　　Ｇ３’および５’ＧＣＧ　　ＡＡ Ａ　　ＡＴＴ　　ＣＡＣＴＣＣＣＧＣＧＣＧ　　ＣＧＧ　　ＴＴＴ　　ＴＡＴ　 　ＴＴＣ３’で増幅した。この遺伝子は、ベクターｐ　Ｓ　Ｗ　１にＢｓｔＥｎ およびＳｍａ　Ｉで切断して導入した。この構築体（第２１図）は大腸菌株ＢＭ Ｈ７１−１８中で例５のように発現させ、１０ｍＭジェタノールアミンおよび０ ．５ｍＭ　　ＭｇＣ１％ｐＨ９，５中基質として１■／ｍｌのｐ−ニトロフェニ ルリン酸を用いてホスファターゼ活性をスクリーニングし、またウェスタンブロ ッティングを行ったＳＤＳポリアクリルアミド上でスクリーニングした（抗−イ ディオタイプ抗血清で検出）。連結ＶＨＬＹＳ−アルカリホスファターゼの分泌 はウェスタンプロットでは検出されず（例５参照）、またホスファターゼ活性の 分泌も証明されなかった。 しかしながら、構築体を、プロテアーゼを欠く細菌株ＢＬ２１ＤＥ　［５２］中 にトランスフェクションした場合には、正しいサイズのバンド（ならびに分解生 成物カリウェスタンプロットで検出された。しかも、ホスファターゼ活性が細菌 上澄液に検出された。このような活性はこの構築体でトランスフェクションされ なかった株の上澄液には存在しない。 様々なリンカ−配列を、２つのドメインの間の距離を改良するために、ＢｓｔＥ １１部位に導入することができるものである。 Ｖに遺伝子のレパートリ−は、例２に記載したプライマーを用いるＰＣＲによっ てマウス肺臓より調製したＤＮＡから、またプライマーＶＫ３ＦＯＲおよびＶＫ ２ＢＡＣＫを用い９４℃に１分間、６０℃に１分間、７２℃に２分間のサイクル でマウス肺臓ｍＲＮＡから誘導された。ＰＣＲ増幅ＤＮＡをアガロースゲル上で 分画し、バンドを切り取り、ＶＨＬＹＳドメイン（Ｄｌ、３抗体から）と、ｍｙ ｃテールをもつＬ鎖可変ドメインのクローニングのためのクローニング部位（Ｓ ａｃＩおよびＸｈｏＩ）をもつベクトル（ｐ　Ｓ　Ｗ　Ｉ　Ｖ　ＨＬ　Ｙ　Ｓ　 −ＶＫＰＯＬＹＭＩＣ，第２２図）ｌ：りｏ−ン化した。 クローンは例５および７に記載したように、Ｌ鎖可変ドメイン上のｍｙｃタグを 介して、リゾチーム結合活性をスクリーニングした。これは以下の種類のＶにド メインの同定を可能にする。 （１）ＶＨＬＹＳドメインの不存在下にリゾチームに結合するもの （２）Ｈ鎖と会合してリゾチームの結合には寄与しないもの、および （３）Ｈ鎖と会合し、またリゾチームの結合に寄与するもの（支援または遮閉） これはＶＨＬＹＳドメインと会合し、そのリゾチームへの結合を完全に破壊する Ｖにドメインは確認しない。 別の実験で、ＶＨＬＹＳドメインを、そのレパートリ−から単離したＨ鎖可変ド メインＶＨ３によって置換しく例６参照）、ついでＶにドメインをベクターにク ローン化した（ＶＨ３ドメインは内部５ａｃＩ部位を有し、これを最初に除去し てＶにレパートリ−を５ａｃＩ−Ｘｈｏｌフラグメントとしてクローニングする ことを可能にした）。 例６に記載したＥＬ　Ｉ　ＳＡを用いて上澄液をスクリーニングして、リゾチー ムに結合する細菌上澄液を同定でリゾチームで免疫したマウスより誘導されたＶ Ｈライブラリーの数種のクローンを、ペプチドタグに対する９Ｅ１０抗体を用い るウェスタンプロットでスクリーニングして、ドメインをきわめて高レベルに発 現する１つのクローンを認めた（２５〜５０■／Ｊ）。このクローンの配列決定 を行い、配列の性質を調べた。この配列は、数個のアミノ酸変化を除いてＶＨＬ ＹＳドメインの配列ときわめて類似していた（第２３図）。この結果は予期し得 ないものであり、限られた数のアミノ酸の変化、多分単一のアミノ酸の置換でも 、発現のレベルが著しく上昇することがあることを示している。 高発現ドメインのこれらの領域に突然変異を作ることにより、ＶＨＬＹＳドメイ ン（Ａｓｎ３５〜Ｈｉｓ）の単一のアミノ酸変化で、ドメインの高レベル発現を 生じるのに十分なことが明らかにされた。 結論 以上、本発明は、Ｈ鎖およびＬ鎖可能ドメインをコードする配列のクローニング 、増幅および発現を、従来可能であったよりもはるかに簡単な方法で可能にする ものである。単離された可変ドメインまたはエフェクター分子に連結したこのよ うなドメインは、予想外の有用性をもつことも明らかにされた。 本発明を以上、例を挙げて説明してきたがこれは単に例示のためのものであって 、多くの改変および修飾が、熟練者によれば、本発明の範囲から逸脱することな く可能なことを理解すべきである。 丈を飲−ｌ菱 （１３Ｉｎｂａｒ　　’）、’　　　　　　ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、　　ｊｊ、、　 　２６５９−２６６２．　１９フ２゜

【２】　　　　入ｗｉｔ　　５　　’　　 　　　　５ｃｉｅｎｃ＠、　　２ココ、　フ４７．　１９！１６゜［３］　　　 　Ｓａｔｏｗ　　う　：　　　　　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、、　　！ ９０．　５９コ、　　１９ＪＩ６゜［４］　　　　Ｃｏｌｍａｎ　　５　　’　 　　　　　Ｎａｔｕｒ＠、　　コ２６．　３５８．　１９８フ。 ［５］　　　　Ｓｈ＠ｒｉｆｆ　　ラ　：　　　　　ＰＮＡＳ−υＳＡ、　　旦 ｌ、　　１１０７５−１１０７９．　１９８７゜（６）　　　　Ｐａｄｌａｎ　 　’ｐ　　’　　　　　　ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、　　１立、　５９コ８−５９４２ ．　１９８９゜［７］　　　　　５ｋａｒｒａ　　Ｖ　　　Ｐｉ（ｌｃｋｔｈｕ ｎ二　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２ｉＱ、　　１０コト１０４１．　１９１１Ｌ（ａ ）　　　　Ｂｉｒｄ　　５シ　−ＳＣ”ｎＣ”ｒ　　２１１ｒ　　４２３−４２ ６．　１９８８゜［９１Ｈｕｔｔｏｎ　　う　−ＰＮＡＳ−Ｌ）ＳＡ、　　旦３ ．　５１１７９−５Ｑコ’３．　１９８Ｂ。 ［１０］　　　ｒｌａｉｓｃｈｍａｎ：　　Ａｒｃｈ、　　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　５ｕｐｐ１．、　　λ、　１フ４゜［１Ｌ］　　　Ｐｏ ｒｔｅｒ　　ν　　Ｗａｉｒ】　３．Ｃｅ１１．　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　　５ｕ ｐｐ１．、　　上、　５１゜１９６フ。 ［１２］　　Ｊａｔｏｎ　’）　二Ｂｉｏｃｈ＠ｒＩｉｓｔｒｙ、　ｌ、　４１ ８５．１９６８゜τ１コ）　　　Ｒｏｃｋ＠ｙ；　　コ、　　Ｅｘｐ、　　Ｍａ ｄ、、　　出、　　２４９．　１９６７゜（１４］　　　５ｔｓｖ＠ｎ１ｏｎ； 　　Ｂｉｏｃｈ倫ｍ、　　Ｊ、、　　！２２，８２７−８３６．１９フコ。 （１５）　　　Ｅｄｍｕｎｄｓｏｎ　　　う　、　　　　　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ、　　ＩＬ　　３９５コ、　１９フＳ。 ［１１１］　　Ｌａｒｒｉｃｋ　　５　：　　　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、　Ｒ＠Ｓ、　Ｃｏｍａ、、　、１ｊＪｌ。 １２５０．１９１１９＋ ［１９］　　　０ｒｌａｎｄｉ　　５　　：　　　　　ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、　　 旦ｊ１　コ８ココ、　　１９＠９゜［２０］　　Ｙｏｎ　ｋ　　Ｆｒ１ｅｄ：　 Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ＠ｓ、、　ｕ、　４１１９５．　１９８９［２１３Ｆ ｉ＠ｌｄｓ　　ｋ　　５ｏｎｑ：　％ａｔｕｒ＠、　２ｉＱ、　２４５−２４６ ．’１９８９゜［２２］　　　Ｂａｌｄｗｉｎ　　Ｊ／　　　５ｃｈｕｌｔｚ　 ：　ｓｃ　１ａｎｃａ、　　Ｊ≧［、１１０４−４１０７，１９８９゜

【２コ］ 　　　Ｍａｎａｒｄ　　　Ｓ　　−Ｃａｎｃｅｒ　　　Ｒ＊ｓ、、　　Ａユ、　 　１２９５−１コ００．　１９８３゜［２４］　　Ｂｏｓｓｌ＠ｔ　　５　：　 　　　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｎｕｃ、　Ｍａｄ、、　Ｍ、　５２３−５２８．１９８ １１゜−［２５］　　　Ｂｅ５ｓｌａｔ　　＞　　−Ｃ’ａｎｅｅｒ　　ＩＩｌ ｌｍｕｎＯｌ、　　Ｉｒｎｍｕｎｏｔｈａｒ、、　　λユ。 １８５−１９１．１９＠６゜ ［２６）　　　１ｌｏｓｓｌ＠ｔ　　５　　：　　　　　ｒｎｔ、　　Ｊ、　　 Ｃａｎｃｅｒ、　　ユ五、　フ５Ｊ４．　１９８５゜【２７１ ［２８３Ｂｒａｍａｒ　　５　−　　　　コ、Ｂｉｏ１．Ｃｈｉｎ、、　　ｍ、 　　１４７フコー１４フフフ、１９ａ４゜［２９］　　　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　 　＆　　Ｍｉｌｉｔａｉｎ；　　ＨｙｂｒｉｄｏＩ？Ｉａ　　Ｔ＠ｃｈｎｏｌｏ ｇｙ　　ｉｎ　　ｔｈ■ Ｂｉｏｓｃｉ＊ｎｃ＠ｓ　　ＩＩ／　　Ｍｅｄｉａｉｎｓ、　　１０コー１１５ ．　１９１１５゜【コＯ）　　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　　２　　’、　　　　　 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　　ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ ａｎｕａｌ、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｕｒ　　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　　１９１１２゜【コ１３　　　Ｊｏｎｅｓ　　　ｉ　　：　　　 　　Ｎａｔｕｒｓｔ、　　ユ２ユ、、　　５２２−５２５．　１９１１６゜【コ ２］　　　Ｚｏｌｌａｒ　　＆　　５ｒｎｉｔｈ　：　Ｎｕｃ、　　八ａｉｄｓ 　　Ｒ＠ｓ、、　　！、　　６４５７−６５００．　１X！１２゜ 【コ４）　　　５ａｎｇａｒ　　ら　：　　　　　ＰＮＡＳ−ｔＪｓ＾、　ヱ４ ．　５４６コー５４６７、　１９フフ。 【コ５］　　　Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐ＊ｒｒｏｎ　　　ｉ　　：　　　　　　Ｇ ｅｎｅ、　　コｌ、　　１０３−１１９．　１９８５゜【コロ】 ［）７］　　　Ｒｉ＠ｅｈｍａｎｎ　　う　：　　　　　　Ｎａｔｕｒ＠！、　 　ユニλ、　コ２コーコ２フｌ　　１９８１１゜【コ８］　　　　）Ｃ・ａｒｎ ｅｙ　　　”ｒ　　て　　　　　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　Ｊ、　　１ ５４８−１５５０．　　！９V９゜ ［３９］　　　Ｐｏｔｔ＠ｒ　　　ラ　：　　　　　ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、　　旦 ユ、　フ１６１−フ１６コ、　　１９８４゜［４０３Ｇａ１ｆｒａ　　＆　　Ｍ ｉｌｓｔ＊ｉｎ　：　Ｍａｔｈ、　　Ｅｎｚｙｍ、、　　ｌ≦コｌ、　　１−４ ４．　１９１１１゜（４１）　　　ＩＪ＊ｍｍ１ｉ　：　　Ｎａｔｕｒｅ、　　 λ２ヱ、　　６８０−６８５．　１９フ０゜［４２］　　Ｂ１１１ｔｔｌｌｒ　 　７　’、　　　　Ｓ（：ｉ＠ｎＣｊ　２ｉＱ、　１０４１．１９Ｂ８゜［４３ ）　　　Ｌ＠ｉ　　：）：　　　　　　Ｊ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　１ 五２．４コア９．　１９８７゜［４４］　　　Ｖａｒｈｏｅｙｅｎ　　　ｐ）　 ’　　　　　　５ｃｉｅｎｃｅ、３ｊｊ、１５コ４．　１９１１Ｂ。 （４５）　　　ｃｒｏｎ＠ｎｂｏｒｎ、’　　Ｍｏ１．　　ａ＠ｎ、　　（ａｎ ＠ｔ、　　ＬＬ！Ｌ、　　２４コ、　　１９７６゜（４６）　　　Ｄａｇ＠ｒｔ 　　　５　　：　　　　　Ｇ＠ｎｇ、　　Ｌ　　２コ、　　１９７４゜【４フ］ 　　　Ｈａｎａｈａｎ：　　、７．　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、、　　１丘五、 　　５５７．　１９８コ。 ［４ｇ］　　Ｊｏｎ’ｓ　　Ｓ　―Ｎａｔｕｒｅ、　□、　　５２２．　１９８ ｇ。 ［４９］　　　５ｅｑａｌ　：　　ＥｎｚｙＦｅ　　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ、　　ヱ ユ、　　Ｗｉｌｔｙ、　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ、　　１９フT゜ （５０）　、　Ｇｕｔｆｒ＠ｕｎｄ：　Ｅｎｚｙｍ＠ｓ、　Ｐｈｙｓｉｃａｌ　 Ｐｒ１ｎｃｉｐｌ＠ｓ、　５Ｊｉｌ＊ｙＩｎｔａｒ＋５ｅｉａｎｅａ、Ｌｏｎｄ ｏｎ、１９７２゜［Ｓｉｌ　　　Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｏｕ：　　Ｂｉｏｃｈｅ ＝、、、　　Ｚヱ、　８ココＢ、　　Ｌ９８Ｂ。 τ５２）　　Ｇｒｏｄｂｅｒｇ　　ν　Ｄｕｎｎ　：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ、、　ｆ曵、　１２４５−１２５３゜１９８Ｂ。 再＾己９’ｌｌｌ！を可（〔１しイムさ−（ＤＮＡ）＋ｕＣｉ（工ＡａＡＣＫｌ 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋ｕ＋Ｅ：ｌＦｃ只Ｍｌ刊）１ １１リ−＊、ａ云Ｘｒ　（ｒｎＲＮＡ）再１冴ＩＪＬ砂り１．１伍↓（ｏＮＡ） ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　２ Ｍ１３−ＶＫＩｇ ＦＩＧ、　４ 区−二五よ口Ｕ− ｃＡＡＡＯ−μυＮスＴＧＡＧＡγ　　ｚｚｃ−ｚっ（＝＝コニ＝：：烏：＝コ コχユαＧ７−λτに７９ｃｓ：：　　　、、０ＦＩＧ、　３区−二α二＝は ルｔｒｂ　　Ｉ：ｒ Ｍ８ヒｌ　　ＶＨう　＾己グリ ＦＩＧ、６ ＦＩＧ、　７ α−Ｌｙｓ　１７ ＦＩＧ、　８ ＬＬＬ　　　　　　　　　ＣｎＪＬＩ　　　　　　　ＥＪＬ２　　　　　　　　 ＷＺ：、；ｉ−、′Ｕ７ｙｓ’、’ｘ’、ｌ：ＩＬｓ：？τ−−、ニー、ｋ”ｙ 、’Ｊ／＜：Ｓｉｋ＜Ｓ：ｊＷ：Ｓ−一＝Ｓ−ｉＹνＳ：λＳ■i”７’Ｃ ・；′ア＝−、テコ、’Ｓ’−−Ｚ　：　ｘ：　ｓ＋＝−、Ｔ　−、：　ｒＡ’ ｉ　　　　　Ｗ−＜Ｑ　ｓ・＾弓＝＝’、　Ｓ　　　Ｖ’、■m！：ＡＳｐぐＣ Ｃ Ｚ：！：：’°：＋Ｓ：）’、’７．Ｌ！：ＡＡＳＳｒ−、Ｆ！二＾ｄ−＝ｉ、 １；！７ミノー二＝ｉ、＾＝：λ５Ｗｙ５：’ｒ’Ａ−、？xＡ二１−−ｌコ ニ；、入こ一、＋／ｌみ１１１：二；つ＾Ｅ；ｒ７−０二Ｙ−４−ｌヤニ；；； シ；−：＾°；＾「！Ｆ；コ；ＳコＩｒ：ＣにＦＩＧ、　１０ａ ｕ：　　　　　　　　　　　　Ｃユ＆−ｙ）７．ｒ、□、Ｈ５７ｚ２ｙｚ−人Ｂ −７！ｚ＝５５′、７２：ＡＳｌ：ｒ、：静ｔｘ峰１Ｌべ＾；）−＝、＝／５ｓ ｘ＝、；＝＝−入λ−：＝＝＝ｓＡ’、”、”こ＊２ニー；、０１Ａａλｉτ： ｓｚ：ｉｙ、ｉｘ−、：；ンｈｘ；；入ｔニア；：τ丁””４Ｆｍ＊Ｌェ一　　 　　　　料力吋しエ　　　　―、ＫＡｍＡ、Ｔ　　　ヒ、ト　　Ｖ！ｌｌ庚Ａ丁 　しヒ　Ｖｌ！２ 肱Ｂ＾τヒトＶ！＋３ 皮し張口フ７ミシ１− ＦＩＧ、　　１１ ＦＩＧ、　１２ ｐｓＷｌ ４：ＩＣ４４Ｃ４５０４６０４７０４８０ＦＩＧ、　１３ ５Ｗ２ ＦＩＧ、　１４　ｂ ｐｓＷｉＨＰｃ二りαＣ Ｈ訃ｄ：：：音ｆイ九　入ＡＧＣＴτ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、　１６ ＦＩＧ、１７ ｄ口東へ−）混奪巧５ｔ ＦＩＧ、　１８ ｐｓＷ２Ｈｐ＋）Ｌｙ ＦＩＧ、　２２ ＯＶＯＬＯΣ　５ＧＰＧＬＶＯｉ’５Ｏ５ＬＳＩＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡ ＧＧＡＧＴＣＡＧＱ’１ＣＣＴＧＧＣＣＴＡＧＴＧＣＡＧＣＣ（ＩＴｃＡｃＡＧ ＡＧｃＣＴＧＴＣＣＡＴＣｌｏ　　　　　２０　　　　３０　　　　４０　　　 　５０　　　　　Ｇ。 ７０　　　　　ｇｏ　　　　　９０　　　１００　　　１１０　　　１２０ＦＩ Ｇ、　２３ 手続補正書（自発） 平成　２年　８　月３０日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）免疫グロブリン（Ｉｇ）超群からの分子のひとつの鎖の可変ドメインの少 なくとも一部から構成される単一ドメインリガンド （２）ＩｇＨ鎖の可変ドメインから構成される請求項（１）記載のリガンド （３）天然配列から１個もしくは２個以上の点突然変異を有するＩｇ鎖の可変ド メインから構成される請求項（１）記載のリガンド （４）請求項（１）〜（３）記載のリガンドが１種または２覆以上のエフェクタ ー分子、補欠分子団、標識、固体支持体または、同一もしくは異種の特異性を有 する１種もしくは２種以上の他のリガンドに連結してなる受容体（５）少なくと も２種のリガンドからなる請求項（４）記載の受容体 （６）第１のリガンドは抗原の第１のエピトープに結合し、第２のリガンドは第 ２のエピトープに結合する請求項（５）記載の受容体 （７）エフェクター分子または標識を包含する請求項（６）記載の受容体 （８）リガンドおよび組換えＤＮＡ技術によって融合生成物として製造された他 の蛋白質分子からなる請求項（５）〜（７）に記載の受容体。 （９）リガンドと他の蛋白質分子の間にはリンカーペプチド配列が置かれる請求 項（８）記載の受容体（１０）Ｉｇ超群分子の可変ドメインの少なくとも一部を コードする配列（標的配列）をクローニングする方法において、 （ａ）標的配列を含有する二重鎖（ｄｓ）核酸のサンプルを準備し、 （ｂ）サンプルを変性させて２本の鎖を分離し、（ｃ）サンプルにフォワードお よびバックオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、この場合、フォワ ードプライマーは標的配列のセンス鎖の３′末端配列またはその隣接配列に特異 的であり、バックプライマーは標的配列のアンチセンス鎖３′末端配列またはそ の隣接配列に特異的であって、アニーリングは標的配列の核酸またはその隣接核 酸にプライマーがハイブリダイズ可能な条件下に行い、 （ｄ）アニーリングされたサンプルを、デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下 、プライマー延長が起こる条件下にＤＮＡポリメラーゼで処理し、ついで（ｅ） サンプルを、延長プライマーが標的配列から分離する条件下に変性させる、各工 程からなる方法（１１）変性混合物に対して工程（ｃ）〜（ｅ）を複数回反復す る工程（ｆ）をさらに包含する請求項（１０）記載の方法 （１２）ＩｇＨ領からの完全可変ドメインのクローン化に使用される請求項（１ ０）または（１１）記載の方法（１３）請求項（１）〜（３）のいずれかに記載 のリガンドをコードするＤＮＡ配列の製造に使用される請求項（１０）または（ １１）記載の方法 （１４）フォワードおよびバックプライマーは単一のオリゴヌクレオチドとして 与えられる請求項（１０）〜（１３）に記載の方法 （１５）フォワードおよびバックプライマーは、それぞれ、密接に関連したオリ ゴヌクレオチドの混合物として供給される請求項（１０）〜（１３）に記載の方 法（１６）使用されるプライマーは、種特異性の一般的プライマーである請求項 （１４）または（１５）に記載の方法（１７）ｄｓ核酸配列はゲノムＤＮＡであ る請求項（１０）〜（１６）に記載の方法 （１８）ｄｓ核酸はヒトから誘導される請求項（１０）〜（１７）に記載の方法 （１９）ｄｓ核酸は末梢血リンパ球から誘導される請求項（１０）〜（１８）に 記載の方法 （２０）各プライマーは制限酵素認識部位をコードする配列を包含する請求項（ １０）〜（１８）に記載の方法（２１）制限酵素認識部位は、ｄｓ核酸にアニー リングする配列中に存在する請求項（２０）記載の方法（２２）生成物ｄｓｃＤ ＮＡを発現ベクター中に挿入し、単独で発現させる請求項（１０）〜（２１）に 記載の方法（２３）生成物ｄｓｃＤＮＡは相補性の可変ドメインと組合せて発現 させる請求項（１０）〜（２２）に記載の方法（２４）クローン化ｄｓｃＤＮＡ を、すでに１種または２種以上の不変ドメインをコードする配列を含有する発現 ベクター中に挿入し、ベクターがＩｇ−型鎖を発現できるようにする請求項（１ ０）〜（２３）に記載の方法（２５）クローン化ｄｓｃＤＮＡを、融合蛋白質と して発現されるように発現ベクター中に挿入する請求項（１０）〜（２４）に記 載の方法 （２６）プライマーの一方または両者が超可変配列のオリゴヌクレオチド混合物 からなり、可変ドメインをコードする配列の混合物が生成される請求項（１０） 記載の方法（２７）Ｉｇ超群分子の可変ドメインの少なくとも一部をコードする 配列（標的配列）をクローニングする方法において、 （ａ）標的配列を含有する二重鎖（ｄｓ）核酸のサンプルを準備し、 （ｂ）サンプルを変性させて２本の鎖に分離し、（ｃ）サンプルにフォワードお よびバックヌクレオチドプライマーをアニーリングし、この場合、フォワードプ ライマーは標的配列のセンス鎖の３′末端配列またはその隣接配列に特異的であ り、バックプライマーは標的配列のアンチセンス鎖３′末端配列またはその隣接 配列に特異的であって、アニーリングは標的配列の核酸またはその隣接核酸にプ ライマーがハイブリダイズ可能な条件下に行い、 （ｄ）アニーリングされたサンプルを、デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下 、プライマー延長が起こる条件下にＤＮＡポリメラーゼで処理し、 （ｇ）ｄｓｃＤＮＡのサンプルをＤＮＡポリメラーゼＩの存在下に痕跡のＤＮア ーゼで処理してＤＮＡのニックトランスレーションを可能にし、ついで（ｈ）ｄ ｓｃＤＮＡをベクター中にクローニングする、各工程からなる方法 （２８）さらに、 （ｉ）組換えプラスミドのＤＮＡを消化して、可変ドメインをコードする遺伝子 を含むＤＮＡフラグメントを放出させ、 （ｊ）このフラグメントをさらに工程（ｃ）〜工程（ｈ）のセットで処理する、 各工程を包含する請求項（２７）の方法（２９）フラグメントをベクターおよび 正しくないサイズの他のフラグメントからゲル電気泳動によって分離する請求項 （２７）または（２８）に記載の方法（３０）生成物ｄｓｃＤＮＡは直接、発現 ベクター中にクローニングする請求項（２７）〜（２９）記載の方法（３１）あ る種の動物からの可変ドメインをコードする配列の少なくとも一部をクローニン グするために有用なその種に特異的な一般的オリゴヌクレオチドプライマーまた はそのようなプライマーの混合物 （３２）各プライマーは可変ドメインをコードする配列のコード部分にアニーリ ングする配列内に制限酵素認識部位を包含する請求項（２７）記載のプライマー またはプライマー混合物