MX2008005405A

MX2008005405A - Anticuerpos quimericos equinos: humanos.

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Publication number: MX2008005405A
Application number: MX2008005405A
Authority: MX
Inventors: Jorge Paniagua Solis; Juan C Almagro; Alejandro Alagon-Cano; Sylvia L Smith; Alvaro Velandia
Original assignee: Florida Internat University Bo
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2008-09-11
Also published as: WO2007053524A2; WO2007053524A3; US20090155850A1

Abstract

La presente invención proporciona una pluralidad de anticuerpos de región variable de una sola cadena quiméricos (scFv). Los anticuerpos scFv quiméricos individuales contienen regiones variables tanto equinos como no equinos. También se proveen métodos para producir y usar la pluralidad de anticuerpos.

Description

ANTICUERPOS QUIMÉRICOS EQUINOS : HUMANOS Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud se basa en la solicitud norteamericana no. de serie 60/731,185 presentada el 28 de octubre de 2005, cuya descripción se incorpora en su totalidad. Antecedentes de la Invención Los anticuerpos son proteínas globulares presentes en el suero sanguíneo. Esas proteínas también conocidas como inmunoglobulinas (Igs), tienen un papel crucial en la inmunidad adaptativa. Reconocen antígenos no propios y los neutralizan y/o facilitan su eliminación. Esos, receptores inmunes así involucrados para reconocer ninguna otra molécula con especificidad exquisita y alta afinidad, que ha probado tener un gran potencial en biología molecular, investigación para el diagnóstico clínico, proteómicos y aplicaciones terapéuticas. D los tipos conocidos de Ig, en particular IgG, IgM, IgD, IgA y IgE, IgG es el más abundante en la circulación sanguínea. Los IgG son el producto de una maduración de la respuesta inmune y por lo tanto son altamente específicos y sus anticuerpos generales de alta afinididad. Como resultado, la vasta mayoría de anticuerpos que se producen comercialmente pertenecen al tipo IgG. Todos los IgG tienen la misma estructura general. Están compuestos de dos cadenas pesadas (H) de polipéptidos idénticos y dos cadenas ligeras (L) de polipéptidos idénticos. Cada cadena H tiene un dominio variable ((VH) y tres dominios constantes, CHI, CH2, y CH3, contados desde el dominio VH en el extremo terminal amino. La cadena L tiene un dominio variable (VL) en el extremo terminal amino y solo un dominio constante CL. Los dominios VH y CH1 de una cadena H asociada con los dominios VL y CL de una cadena L para formar un fragmento ligante de antígeno (Fab). Los dominios CH2 y CH3 de una cadena H asociada con los dominios de una cadena H asociada con los dominios CH2 y CH3 de otra cadena H para formar el fragmento de cristalización (Fe). Este fragmento conecta dos Fabs por medio de los segmentos articulados entre CH1 y CH2, dando a la molécula IgG su típica forma de Y. Cada dominio V está compuesto por cuatro regiones de trama de marco conservada (FW-1 a FW-3) que alternan con tres ciclos que varían en longitud y composición de aminoácidos. Esos circuitos hipervariables, o regiones determinantes complementarias (CDR), denotadas como CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 para VH, y CDR-LI, CDR-L2 y CDR-L3 para VL, se juntan por medio de una asociación no covalente de los dominios VH y VL en un Fv, y formar un sitio de enlace de antígeno en el término del fragmento Fab. Cuando un IgG está digerido enzimáticamente, diferentes fragmentos se obtienen dependiendo de la enzima usada. Que es si se usa papaína, tres fragmentos se obtienen: un fragmento Fe y un fragmento F(ab')2. Lo anterior se debe al hecho de que la papaína corta las cadenas H en la región de articulación antes de un puente de disulfuro, mientras que la pepsina las corta en la región articulada después del puente de disulfuro. Por lo tanto la digestión con la papaína libera dos fragmentos Fab, mientras que la pepsina deja dos fragmentos Fab ligados por medio del puente de disulfuro. Los fragmentos Fab y F(ab')2 conservan su capacidad de ligarse específicamente al antígeno contra el cual se produjeron, ya que contienen el fragmento Fv. Cuando una especie se administran anticuerpos enteros producidos en otras especies, el primero genera una respuesta inmune contra los determinantes antigénicos del último. Esto da como resultado puede dar lugar a diversas respuestas secundarias adversas que pueden incluir choque anafiláctico. Esos problemas se reducen significativamente cuando los anticuerpos previamente se digieren con papaína o pepsina y solo se administran los fragmentos purificados resultantes Fab o F(ab')2. El uso de fragmentos F(ab')2 tiene una ventaja particular durante el uso de fragmentos Fab en que se retienen más tiempo en el organismos. Además debido a que los fragmentos F(ab')2 tienen dos Fabs, son capaces de formar una red que precipita el antígeno en condiciones fisiológicas. Ya que los fragmentos F(ab')2 conservan sus características principales de los anticuerpos intactos, las aplicaciones de los anticuerpos se extienden a fragmentos F(ab')2 con la ventaja adicional de que ya que carecen del fragmento Fe, es menos probable el que un paciente a quien se le administre lo reconozca como materia extraña. Este resultado proporciona una mayor tolerancia a la aplicación de los fragmentos F(ab')2 y reducen la posibilidad de reacciones secundarias. En algunas aplicaciones, el uso de fragmentos Fv tiene las ventajas sobre los fragmentos Fab y F(ab')2. En el caso particular de envenenamientos o intoxicaciones aguas, se desean tiempos de eliminación más rápidos. El fragmento Fv tiene la mitad del peso molecular del fragmento Fab, y se elimina más rápido del organismo, junto con la toxina o fármaco. Los fragmentos Fv se producen fácilmente y se purifican por medio de tecnologías recombinantes como scFv (fragmentos Fv de cadena simple). Los genes de anticuerpos o sus fragmentos, una vez aislados pueden modificarse por medio de técnicas de biología molecular. Esta posibilidad ofrece ventajas adicionales, tales como la modificación de propiedades químico-físicas de los anticuerpos para obtener terapias más estables o injertar el sitio ligante a antígenos de un anticuerpo no humano en un marco humano para producir moléculas menos inmunogénicas, o maduración in vitro la afinidad del anticuerpo para el antígeno determinante para que alcance afinidades que no pueden obtenerse in vivo. En regiones en donde debido a las condiciones climáticas, abundan los animales venenosos, los anticuerpos han recibido usado un uso especial para combatir la toxicidad de los venenos. En general un gran número de dosis se administran cuando se tratan pacientes con mordeduras o piquetes de alacrán, araña o víbora. Por ejemplo la terapia de elección en los casos de envenenamiento por alacrán en los humanos en la administración intravenosa de fragmentos F(ab')2 altamente purificados obtenidos por medio de la digestión con pepsina de la fracción IgG producida por caballos (Equus caballus) después de la inmunización con extracto de las glándulas de veneno de las especies de alacranes del género Centruroides. Aunque el producto resultante es altamente efectivo, el hecho de que el terapéutico aun se compone de dominios V y C heterólogos a los humanos, puede producir una respuesta inmune anti-caballo humano. Además la preparación y el control de calidad de este producto requiere grandes números de animales, incluyendo caballos, ratones y alacranes, lo que es costoso y éticamente cuestionable. Así continua existiendo una necesidad en la técnica de nuevas terapias útiles en los regímenes de tratamiento que reducen la posibilidad de evocar una respuesta inmune en el receptor del tratamiento. Nuevas terapias que pueden producirse por medio de tecnología recombinante también tendría un valor económico elevado y evitaría la necesidad de usar animales vivos como fuentes de producción. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv que comprenden cuando menos dos o más anticuerpos quiméricos scFv que son inmunoespecíficos para diferentes epítopes diferentes/distintos, esos anticuerpos quiméricos scFv individualmente comprenden un primer dominio V derivado de un caballo y un segundo dominio V derivado de las especies que no son caballos ("no equinos"). En una modalidad, el segundo dominio V se deriva de un humano. En un aspecto, la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv se dirige hacia el reconocimiento inmunoespecífico de epítopes de toxina. En otro aspecto la toxina es una neurotoxina.

En una modalidad se proveen una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv en el cual cada uno de los dominios V es un fragmento VH y cada uno de los dominios B que no son equinos en un fragmento VL. En un aspecto cada dominio V que no es de caballo en la pluralidad es idéntico. En otro aspecto los dominios V que no son de caballo son dominios V humanos, y en todavía otro aspecto cada uno de los dominios humanos V en la pluralidad es el fragmento A27/jk1 (SEQ ID NO: 2). En otra modalidad, cada uno de los dominios V equino es un fragmento VL y cada uno de los dominios V que no son de caballo es un fragmento VH. En un aspecto el dominio V no equino en la pluralidad es idéntico como se describe antes. El "fragmento VH" como se usa aquí se refiere a una región variable de cadena pesada de un anticuerpo que comprende cuando menos un CDR de un dominio variable de cadena pesada. La cadena VH puede contener uno, dos o tres CDR de una cadena de anticuerpo VH, designados como fragmentos H1, H2 y H3. El "fragmento VL" como se usa aquí se refiere a una región variable de cadena ligera de un anticuerpo que comprende cuando menos un CDR de un dominio variable de cadena ligera. La cadena VL puede contener uno, dos o tres CDR de un anticuerpo de cadena ligera, que puede ser la cadena ligera kappa o lambda dependiendo del anticuerpo. Los CDR en la región variable de cadena ligera son designados como fragmentos L1, L2 y L3. La invención además proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención incluyen un fragmento VH que contiene uno o más fragmentos seleccionados del grupo consistente de un fragmento H1, un fragmento H2 y un fragmento H3. En otro aspecto, la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención incluye un fragmento VH que comprende un fragmento H1 y un fragmento H2, el fragmento VH comprende un fragmento H1 y un fragmento H3, el fragmento VH comprende un fragmento H2 y un fragmento H3 o el fragmento VH comprende un fragmento H1, un fragmento H2 y un fragmento H3. En otra modalidad la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención incluyen un fragmento VL que comprende uno o más fragmentos seleccionados del grupo consistente de un fragmento L1, un fragmento L2 y un fragmento L3. En varios aspectos la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención incluyen un fragmento VL que es un fragmento L1, un fragmento L2, un fragmento L2, un fragmento L1 y un fragmento L2, un fragmento L2 y un fragmento L3, o un fragmento L1, un fragmento L2 y un fragmento L3. La invención además proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv que comprenden uno o más miembros de la pluralidad que tiene una o más modificaciones naturales o no naturales que no erradican la afinidad de los anticuerpos quiméricos scFv a un epítope. En un aspecto la una o más modificaciones naturales o no naturales se seleccionan del grupo consistente de deleción, inserción, sustitución y modificación covalente para incluir una proteína o una porción no proteica. La invención además proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv en los cuales uno o más de los anticuerpos quiméricos scFv están conjugados a un segundo polipéptido. En un aspecto el segundo polipéptido es un fragmento de un segundo anticuerpo. En otro aspecto la invención proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv en donde los anticuerpos quiméricos scFv están conjugados a un polímero soluble en agua, y en un aspecto el polímero soluble en agua es polietilenogicol. En otro aspecto la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv están etiquetados, y en varias modalidades, la etiqueta se selecciona del grupo consistente de enzimas, radioisótopos y compuestos fluorescentes. La invención también proporciona métodos de mutagénesis de una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención que consiste en: a) genes mutagenizantes que codifican a los anticuerpos quiméricos scFv individuales; y b) expresar los genes para producir anticuerpos quiméricos scFv mutagenizados. En otro aspecto, los métodos de la invención además comprenden la etapa de analizar los anticuerpos quiméricos scFv mutagenizados en un método de la invención se obtiene por medio de mutagénesis dirigido al sitio. Breve Descripción de los Dibujos La figura 1 es una representación esquemática de un vector fagemido pHEN-A27. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona una pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv y materiales y métodos para producir y usar los mismos. Una pluralidad de anticuerpos de scFv de este tipo es particularmente útil para el tratamiento de condiciones que surgen en muchas especies pero para las cuales no son posibles debido a cuando menos en parte a la falta de una vacuna aprobada y/o efectiva. Ciertas condiciones de este tipo afectan a los caballos durante el curso normal de contacto ambiental y en esos casos dichos caballos han desarrollado la inmunidad específica, en parte en forma de una producción específica de anticuerpos, haciendo que esos caballos sean resistentes a las complicaciones asociadas con las condiciones que de otra manera en especies que han sido sometidas a retos ambientales. Al producir una pluralidad de anticuerpos quiméricos que consisten de un fragmento de región variable de cabalo y un fragmento de región variable que no es de caballo, uno o más miembros de la pluralidad pueden identificarse y utilizarse para inmunización pasiva de las especies que no sean caballos en el tratamiento de una condición para la cual la región variable de caballo será terapéuticamente benéfico. Al tener el componente de región variable que no sea de caballo de scFv derivada de las especies que reciben el tratamiento terapéutico, el régimen de tratamiento es menos probable que produzca una respuesta de anticuerpo anti-caballo como sería un problema potencial si ambas regiones variables en el scFv se derivaran de caballo. En un aspecto, la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv comprenden cuando menos dos o más anticuerpos quiméricos scFv que son inmunoespecíficos para las epítopes diferentes/distintas. Debido a que los anticuerpos quiméricos scFv en la pluralidad comprende un dominio V equino y un dominio V no equino en la mayoría de los casos pero no siempre se ligaran a diferentes epítopes. Sin embargo, la "inmunoespecificidad para diferentes/distintos epítopes" como se usa aquí significa que un componente V equino individual en los anticuerpos scFV de la pluralidad específicamente se lija a diferentes epítopes en comparación entre sí y no en comparación con el ligado de los dominios V que no sean de caballo. "Liga específicamente" o "inmunoespecificidad" como se usan aquí significan que un dominio V (ya sea de caballo o no equino) de un anticuerpo scFV en la pluralidad preferentemente se liga a un epítope único y específico cuando menos 10 vece, cuando menos 100 veces y cuando menos 100 veces mayor que otros epítopes cuando ambos epítopes están disponibles en cantidades iguales. Así un dominio V de un anticuerpo en la pluralidad puede reaccionar cruzadamente (o ligarse) con múltiples epítopes, pero a un grado y con una afinidad que es insignificante en comparación con un único epítope contra el cual se genero el dominio V. La frase "dirigido hacia el reconocimiento inmunoespecífico" como se usa aquí significa que un número mayor o un porcentaje mayor de anticuerpos quiméricos scFv en la pluralidad es inmunoespecífico para uno o varios antígenos específicos en comparación con una pluralidad generada aleatoriamente de anticuerpos quiméricos scFv. Un número mayor de un porcentaje mayor de anticuerpos quiméricos scFv en la pluralidad de inmunoespecíficos para un antígeno específico demuestra, en varios aspectos significantemente un ligante inmunoespecíficamente mayor para los antígenos específicos comparados a una pluralidad generada aleatoriamente de los anticuerpos quiméricos scFv. El número mayor o el mayor porcentaje en varios aspectos es aproximadamente la mitad (aproximadamente 50%), una mayoría (>50%), esencialmente todo (>85%) o todos (100%) de los anticuerpos quiméricos scFv en la pluralidad que son inmunoespecífico para un antígeno específico en comparación con la pluralidad generada aleatoriamente de anticuerpos quiméricos scFv. En un aspecto, el antígeno es una toxina. En varios aspectos los diferentes dominios V equino en la pluralidad de anticuerpos scFV se ligara específicamente a cuando menos dos diferentes/distintos epítopes, cuando menos cinco diferentes/distintos epítopes, cuando menos 10 epítopes diferentes/distintos, cuando menos 102 diferentes/distintos epitopes, cuando menos 103 diferentes/distintos epitopes, cuando menos 104 diferentes/distintos epitopes, cuando menos 105 diferentes/distintos epitopes, cuando menos 106 diferentes/distintos epitopes, cuando menos 107 diferentes/distintos epitopes, o más. En un aspecto dos o más dominios de caballo V en la pluralidad pueden ligar específicamente el mismo epítope y aun así los anticuerpos individuales scFv pueden diferir en la secuencia aminoácida primaria, esto es dominios de caballo V estructuralmente diferentes pueden competir para ligarse a un único epítope. En una modalidad, el dominio V no equino en cada anticuerpo quimérico de la pluralidad es idéntico. En este aspecto, las diferencias entre los anticuerpos quiméricos individuales en la pluralidad surjan solo de las diferencias entre secuencias aminoácidas primarias y/o propiedades de enlace primarias especificas de los dominios de caballo V en los anticuerpos. En un aspecto alternativo, los anticuerpos individuales en la pluralidad pueden diferir entre sí al tener dominios V no equino únicos. Esto no quiere decir que cuando menos de acuerdo con este aspecto de la invención, un anticuerpo individual en la pluralidad tiene más de un dominio B no equino pero en vez del anticuerpo individual en la pluralidad tiene más de un dominio V no equino, pero en vez de eso el dominio V no equino en cada anticuerpo no necesita ser idéntico a todos los demás dominios no equino V en la pluralidad.

Así, en varios aspectos una pluralidad puede incluir anticuerpos individuales quiméricos que tengan cuando menos dos, cuando menos 10, cuando menos 102, cuando menos 103, cuando menos 104, cuando menos 105, cuando menos 106, cuando menos 107, o más diferentes dominios V no equino en los anticuerpos individuales en la pluralidad. La frase "no erradica la afinidad" con respecto a la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv no se eleva o diminuye significantemente en comparación con la pluralidad no modificada (tipo nativo) de anticuerpos quiméricos scFv. La frase "modificación natural o no natural" con respecto a la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv significa una alteración en las secuencias aminoácidos de la pluralidad no modificada (tipo nativo) de anticuerpos quiméricos scFv. En un aspecto, la modificación es una deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos de las secuencias aminoácidos de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv con uno o más aminoácidos naturales o no naturales. Las modificaciones naturales incluyen cambios aminoácidos en la secuencia tipo nativo con uno o más aminoácidos que existen en la naturaleza incluyendo alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico (o aspartato), cisteina, glutamina, ácido glutámico (o glutamato), glicina, histidina, isoluecina, leucina, lisina, meitonina, fenilalanina, prolina, serina, triptofano, treonina, tirosina y valina. Las modificaciones no naturales incluyen cambios aminoácidos en la secuencia tipo nativa con uno o más aminoácidos que no existen en la naturaleza incluyendo ß-alanina (ß- ácido aminopropiónico), norleucina, norvalina, ornithina, N-metilvalina, N-metilisoleucina, N-metilglisina (carcosina), allo-isoleucina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, 3-hidroxiprolina, allo-hidroxilisina, hidroxilisina, N- etilasparagina, N-etilglicima, ácido 2,3-diaminopropionico, ácido 2,2'-diamopimelico, desmosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 6-aminocaproico, ácido 4-aminobutirico (ácido piperidinico), ácido 2-am inobutírico, ácido 3-aminoadípico y ácido 2-aminoadípico. En otro aspecto, la modificación no natural incluye el enlace de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv a péptidos, agentes químicos y otros agentes en comparación con la pluralidad no modificada (tipo nativo) de anticuerpos quiméricos scFv. Los dominios de no cabalo ejemplares pueden derivarse de una variedad de animales incluyendo pero sin limitarse a humanos; animales de la granja tales como vacas, borregos, cerdos, llamas y cabras; animales de compañía tales como perros y gatos; animales exóticos y/o de zoológico; animales de laboratorio incluyendo ratones, ratas, conejos, conejillos de indias y hámsteres; y aves de corral tales como pollos, pavos, patos y gansos. En varios aspectos de la invención los anticuerpos individuales scFv en la pluralidad pueden comprender un dominio V equino intacto y completo, incluyendo uno o más CDR encontrados en el dominio V. De acuerdo con esto en un caso en el cual los anticuerpos quiméricos scFv individuales de la pluralidad comprenden un fragmento equino VH, los miembros individuales de la pluralidad pueden comprender CDR-HI, CDR-H2, y CDR-H3. De igual manera cuando los anticuerpos quiméricos scFv individuales comprende un fragmento equino VL, los miembros individuales de la pluralidad pueden comprender CDR-LI, CDR-L2, y CDR-L3. Las secuencias aminoácidas individuales que conectan los CDR individuales esto es las secuencias de marco, pueden ser secuencias de marco de dominio V equino que se presentan naturalmente o pueden derivarse de otras fuentes (incluyendo preparaciones sintéticas), como se describe aquí, siempre y cuándo el anticuerpo resultante scFv mantiene el epítope específico que se enlaza a dominio V pariente en el cual se introducen las modificaciones. Sin embargo se entiende que un anticuerpo modificado en la región de marco V puede tener una afinidad de enlace mayor o menor para el epítope especifico que reconoce. En un aspecto alternativo, el anticuerpo quimérico scFv de la pluralidad puede comprender dos CDR de dominio V. Por ejemplo cuando el anticuerpo quimérico scFv incluye un fragmento VH, las especies individuales pueden contener una combinación de de H1 y H2 de CDR, H1 y H3 de CDR o H2 y H3 de CDR. Lo mismo se aplica en las modalidades en las cuales los scFv quiméricos individuales comprende un fragmento VL, las especies que comprenden una combinación de L1 y L2 de CDR, L1 y L3 de CDR o L2 y L3 de CDR. Otra vez los anticuerpos quiméricos scFv modificados para incluir solo esos CDR del dominio pariente V retendrán la especificidad para el epítope que se reconoce por medio del dominio V del cual se obtuvieron los CDR individuales, sin embargo la afinidad de enlace para el epítope puede modificarse. En todavía otro aspecto, los anticuerpos quiméricos scFv individuales en la pluralidad pueden contener un único CDR de un dominio V equino. Si el anticuerpo quimérico scFv comprende un fragmento equino VL, esa porción del anticuerpo quimérico scFv puede comprender un único CDR-H1, CDR-H2, o CDR-H3. Si el anticuerpo quimérico scFv comprende un fragmento equino VL, esa porción del anticuerpo quimérico scFv puede comprender un único CDR-LI, CDR-L2 o CDR-L3. Como se describen antes los anticuerpos quiméricos scFv retienen la especificidad de enlace al epítope del dominio pariente V del cual se obtuvieron los CDR individuales aunque la afinidad de enlace del epítope puede modificarse. Esos aspectos modificados de los anticuerpos individuales en la pluralidad también pueden aplicarse al dominio V no equino de los anticuerpos quiméricos scFv. Por ejemplo el dominio V no equino puede contener CDR-H1, CDR-H2, y CDR-H3; CDR-LI, CDR-L2, y CDR-L3; CDRs H1 y H2; CDRs H1 y H3; CDRs H2 y H3; CDRs Ll y L2; CDRs Ll y L3; CDRs L2 y L3; CDR-H1; CDR-H2; CDR-H3; CDR-Ll; CDR-L2; o CDR-L3 en tanto como el anticuerpo modificado por medio de alguna de esas maneras mantienen el epitome que enlaza la especificidad de los dominios V no equino del cual se obtuvieron los CDR. Otra vez se entiende que el anticuerpo scFv resultante puede ligarse a un epítope específico con afinidad de enlace modificada. Otras modificaciones a los anticuerpos individuales scFv o grupos de anticuerpos de los mismos, se describan detalladamente a continuación. I. Producción de anticuerpos quiméricos scFv Los anticuerpos scFv pueden generarse por medio de un número de metodologías q;ue existen en la técnica. Por ejemplo los anticuerpos scFV pueden generarse a partir de hibridomas que expresan un anticuerpo monoclonal que tenga la especificidad y afinidad de enlace de antígenos deseadas. Los oligonucléotidos que codifican a los dominios variables de cadena pesada y ligera de anticuerpos pueden amplificarse de los hibridomas de ARN células, en donde el polinucléotido que codifica uno de los dominios V se amplifica desde un tipo celular y un polinucléotido que codifica al otro dominio V se deriva del segundo tipo de célula. Los oligonucléotidos que codifican a los dominios V de cadena pesada y ligera pueden entonces ser amplificados desde el cADn al utilizar pares de cebadores que hibridizan 5' y 3' a cada una de las regiones de codificación de región variable de cadena pesada y ligera. Ver por ejemplo las patentes norteamericanas 4,683,195, 4,683,202, y 4,800,159, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad. Las secuencias de cebadores adecuados para la amplificación PCR de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo scFv se describen en la patente norteamericana no. 6,248,516 y la publicación de patente PCT no. WO90/05144. Los oligonucléotidos que codifican las dominios V de cadena ligera y pesada individuales aislados de esta manera pueden combinarse la utilizar metodología de AD recombinante convencional tal como el polinucleotido que comprende la región codificante VH en un marco fundido con el poliunucleótido que comprende la región de codificación VL. Dependiendo del scFv preciso que va a expresarse puede ser deseable ligar la región codificadora VH a la región codificadora puede ligarse 3' a la región codificadora Vu. Sin importar la orientación el ligado en el marco de las regiones codificadoras VH y VL permite la traducción en una única proteína scFv que retiene la actividad biológica de los componentes polipéptidos VH y VL. Para una guía general de como diseñar anticuerpos ScGv ver la patente norteamericana no. 4,946,778, cuya descripción se incorpora como referencia. Otros métodos para producir anticuerpos scFv son descritos por Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97 (1991); Bird et al., Science 242:423 (1988); y Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993), todos los cuales se incorporan como referencia. Cada una de las metodologías antes descritas pueden modificarse por aquellos en la técnica para incorporar fragmentos VH equino y fragmentos VL no equino para producir anticuerpos quiméricos scFv. Los anticuerpos quiméricos scFV también pueden generarse al primero inmunizar un animal con un antígeno o una mezcla de antígeno que ha sido preparada para la inyección con o sin adyuvantes. Los antígenos usados para inmunizar un animal puede ser cualquier sustancia que sea capaz de inducir una respuesta inmune y de reaccionar con los productos de esa respuesta esto es con anticuerpos específicos o linfocitos T específicamente sensibilizado, o ambos. Los antígenos pueden ser sustancias solubles tales como toxinas y proteínas ajenas ("no propias"), o partículas tales como bacterias o células de tejidos. En otros aspectos la inmunización puede ser no intencional surgiendo de factores ambientales. Aunque no es una verdadera inmunización en el sentido aceptado en la técnica, la introducción en un animal de antígenos ambientales que evoquen una respuesta inmune proporciona un resultado similar a un inmunización intencional, esto es pueden producirse anticuerpos. Los factores ambientales que inducen esa respuesta de anticuerpos incluyen factores de la dieta, partículas atmosféricas, rasguños y mordeduras de animales, y similares. Los ácidos nucleicos que codifican a un antígeno de proteína también pueden usarse para inmunizar un animal. Ahora se ha mostrad que un número de sistemas que la inyección directa de un ácido nucleico puede inmunizar de forma efectiva contra el producto codificado (ver patentes norteamericanas nos. 589,466 y 5,593,972; Hedley et al., Nature Med. 4:365-368,1998; Ho et al., Arch. Virol. 143:115-125,1998; Cardoso et al., J. Virol. 72:2516-2518.1998; Bagarazzi et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 226:107-143, 1998; Lozes et al., Vaccina 15:830-833, 1997; Shiver et al, Vaccina 15:884- 887,1997, todos los cuales se incorporan como referencia). En otro aspecto de la invención, dirigido en la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv hacia el reconocimiento inmunoespecífico de epítopes de un tipo particular puede inducirse. Por ejemplo el direccionamiento puede crearse al inmunizar un animal con un antígeno específico o una mezcla de antígenos para provocar una respuesta inmune que incluye un número importante de anticuerpos individuales que se enlace específicamente a uno o más epítopes en ese antígeno o esos antígenos en particular. Otros métodos para general el direccionamiento de anticuerpos hacia antígenos/epítopes específicos son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo la publicación de solicitud de patente no. 20030092125 el cual se incorpora como referencia). En varios momentos después de la inmunización se obtienen muestras de sangre del animal para medir los anticuerpos del suero. La concentración de los anticuerpos del suero se determina por varias técnicas conocidas en la técnica tal como por medio de un ensayo inmunoasorbente ligado por enzimas (ELISA) y citometría de flujo. Se entenderá que el protocolo de inmunización antes descrito con un antígeno o mezcla de antígenos no se limita a una única inyección, pero puede incluir esquemas de inmunización que incluyen tanto inmunizaciones primarias como subsecuentes de refuerzo, con y sin adyuvantes como se conoce muy bien en la técnica inmunológica. Una vez que la concentración de anticuerpos circulantes alcancen el nivel deseado, los dominios V de los anticuerpos pueden clonarse desde las células hematopoyéticas del animal inmunizado, se forman en secuencia y se clona por medio de técnicas recombinantes como se describe aquí y como se conoce normalmente en la en la técnica. Un ejemplo una biblioteca de cADN puede construirse por medio de transcripción inversa de mARN celular y la biblioteca se examina usando sondas específicas para las secuencias de genes de polipéptido de inmunoglobulina. En otra modalidad, la reacción .de cadena de polimerasa (PCR) se usa para amplificar los polinucleótidos que codifican a la inmunoglobulina o sus fragmentos. Las secuencias amplificadas pueden clonarse fácilmente en cualquier vector apropiado, por ejemplo los vectores de expresión, vectores minígenos, o vectores de presentación de fagos. En un aspecto, el vector también codifica a un fragmento de región variable de un anticuerpo de diferentes especies mamíferas. La pluralidad de anticuerpos scFv se obtiene después de expresar y aislar las proteínas codificadas en una célula anfitriona apropiada. Aquellos expertos en la técnica entienden que los métodos descritos aquí pueden usarse para clonar un dominio V individual o una pluralidad de dominio V tal como se contempla en la presente invención. Tal modificación se describe en los ejemplos anexos. Aun si el método de preparación se diseña para producir solo un dominio específico V, el método puede repetirse para producir uno o más dominios V alternativos para completar la pluralidad deseada. II. Producción de variantes de anticuerpos quiméricos scFv Una vez que se ha preparado el anticuerpo quimérico scFv o aun la pluralidad de anticuerpos scFv, sus propiedades físicas, químicas y/o biológicas (inmunológicas) pueden opcionalmente modificarse al alterar uno o más de los residuos aminoácidos en su secuencia aminoácida y examinar los cambios en una o más de las propiedades. Las variantes de secuencias aminoácidas incluyen las variantes sustitución, deleción o inserción. En ciertos casos, las variantes se preparan con el intensot de modificar aquellos residuos aminoácidos que están directamente involucrados en el ligado del epítope. En otros aspectos, la modificación de los residuos que no están involucrados directamente en el ligado del epítope o los residuos no involucrados de forma alguna en el enlace del epítope es deseable para los propósitos descritos aquí.

Con el fin de determinar que residuos aminoácidos son importantes para el reconocimiento y en enlace de los epítope la mutagenesis de exploración de análisis puede realizarse para producir variantes de sustitución. Ver por ejemplo Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989), el cual se incorpora como referencia. En este método, los residuos aminoácidos individuales se reemplazad uno por uno con un residuo de alanina y el anticuerpo scFV resultante se examina en su capacidad de ligar su epítope específico en relación al anticuerpo no modificado. Aquellos anticuerpos modificados con capacidad de enlace reducido se ponen en secuencia para determinar que residuo no cambio^ indicando su importancia en el ligado. Alternativamente o en adición, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo quimérico scFv y el antígeno. Esos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que se generan esas variantes, el panel de variantes se somete al examen que se describe aquí y los anticuerpos quiméricos scFv parientes con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el desarrollo posterior. Los residuos así identificados proporcionan objetivos para diferentes tipos de variantes contemplados por la invención. Las variantes de sustitución son aquellas en las cuales cuando menos un residuo en la secuencia aminoácida de la molécula de anticuerpo se retira y en su lugar se inserta un residuo diferente. Se contempla la mutagénesis por sustitución dentro de cualquiera de las regiones CDR y/o regiones de marco. Las modificaciones en las propiedades biológicas del anticuerpo quimérico scFv pariente se logran al seleccionar sustituciones que difieren significantemente en su efecto de mantener (a) la estructura de polipéptidos en el área de la sustitución, por ejemplo como una conformación laminas o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. En ciertos aspectos de la invención, se designan las variantes de sustitución, esto es uno o más residuos aminoácidos específicos (contrariamente a los aleatorios) se sustituyen con un residuo aminoácido específico. Los cambios típicos de estos tipos incluyen sustituciones conservadoras y/o sustitución de un residuo de para otro en base a las propiedades similares de los residuos nativos y sustituyentes. Las sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1. La sustitución más conservadora se encuentra bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si esas sustituciones no dan como resultado el cambio en la actividad biológica, entonces pueden introducirse cambios más sustanciales y examinarse los productos. Tabla 1 Original Ejemplares Substituciones de residuos preferidos Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys ; gin; asn lys Asn (N) gln; his; asp, lys; gin arg Asp (D) glu; asn glu Cys (C) ser; ala ser Gln (Q) asn; glu asn Glu (E) asp; gln asp Gly (G) ala His (H) asn; gin; lys; arg lie (I) leu; val; met; ala; leu phe; norleucina Leu (L) norleucina; ile; val; ile met; ala; phe Lys (K) arg; gin; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Pro (P) ala Ser (S) thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) tip; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; leu ala; norleucina Los residuos aminoácidos que comparten propiedades de cadena lateral común frecuentemente se agrupan de la siguiente manera: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gin, his, lys, arg; (5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Como una alternativa a las variantes de substitución específicamente diseñadas, pueden prepararse otras variantes de sustitución por medio de maduración de afinidad en donde los cambios aleatorios en aminoácidos se introducen el a secuencia de anticuerpo parenteral. Ver por ejemplo Ouwehand et al., Vox Sang 74 (Suppl 2):223-232, 1998; Rader et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:8910-8915, 1998; Dall'Acqua et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 8:443-450, 1998, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad. La maduración por afinidad involucra el preparar y examinar los anticuerpos quiméricos scFv, o sus variantes y seleccionar de las variantes resultantes aquellos que tengan propiedades biológicas modificadas, tales como afinidad de enlace en relación al anticuerpo quimérico scFv. Una manera conveniente para generar variantes sustitucionales es la maduración por afinidad usando presentación de fagos. Brevemente, los múltiples sitios de la región hipervariable se mutan para generar todas las sustituciones de amino posible en cada sitio. Las variantes así generadas se expresan de una manera monovalente sobre la superficie de partículas de fagos filamentosos como funciones al producto de gen II del M13 empacado dentro de cada partícula.

Las variantes mostradas entonces se examinan en su actividad biológica (por ejemplo afinidad de ligado). Las técnicas que utilizan el arrastre de genes y la evolución dirigida también pueden usarse para preparar y examinar anticuerpos quiméricos scFv, o sus variantes para la actividad deseada. Por ejemplo Jermatus et al., Proc Nati Acad Sci U S A., 98(l):75-80 (2001) mostró que las estrategias de selección preparadas in vito en base a la presentación de ribosomas se combinaron con la diversificación in vitro por medio de arrastre de ADN para producir ya sea la proporción o estabilidad termodinámica de scFv; Fermer et al., Tumour Biol. 2004 Jan-Apr;25(l-2):7-13 reportó que el uso de presentación de fagos en combinación con arrastre de ADN aumenta la afinidad en casi tres ordenes de magnitud. Dougherty et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 2000 Feb. 29; 97(5):2029-2034. reportaron que (i) los clones funcionales ocurren con una frecuencia inesperadamente alta en bibliotecas hipermutadas, (ii) mutantes de ganancia de la función están bien representadas en esas bibliotecas, y (iii) la mayoría de las mutaciones scFv que conducen a una mayor afinidad corresponden a residuos distantes del sitio de enlace. Las variantes de deleción son polipéptidos en el cual cuando menos un residuo aminoácido de una secuencia aminoácida del anticuerpo quimérico scFv. Las deleciones pueden afectarse en uno o mas terminales de la proteína o con el retiro de uno o más residuos dentro (esto es en el interior de) una secuencia secuencia aminoácida del anticuerpo quimérico scFv. Los métodos de preparación de variantes de deleción son rutinarios en la técnica. Ver por ejemplo Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, cuya descripción se incorpora aquí como referencia. Las inserciones a la secuencia aminoácida incluyen fusiones de terminales amino y/o carboxilo en el rango en longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones de secuencias internas de uno o más residuos aminoácidos. Como en el caso de los diferentes tipos de variantes descritos aquí, las variantes de inserción se designan de tal forma que el anticuerpo resultante posee algunas propiedades físicas, químicas y/o biológicas no asociadas con el anticuerpo pariente del cual se derivan. Los métodos de preparación de las variantes de inserción también son rutinarias y bien conocidas en la técnica (Sambrook et al. arriba). Las proteínas de fusión que comprenden uno o más anticuerpos quiméricos y otras proteínas heterologas son un tipo específico de variante de inserción contemplada por la invención. Ejemplos de proteínas heterologas que pueden fusionarse a un anticuerpo quimérico scFv incluyen proteínas con una vida media circulante larga, tal como pero sin limitantes a las regiones constantes de inmunoglobulina ; proteínas marcadoras; proteínas o polipéptidos que facilitan la purificación del polipéptido de anticuerpo quimérico scFv deseado. Los métodos para producir las proteínas de fusión de anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo la patente norteamericana no. 6,306,393 cuya descripción se incorpora como referencia. En ciertos aspectos de la invención, se producen las proteínas de fusión las cuales pueden incluir un ligante flexible, que conecte al anticuerpo quimérico scFv a la porción de proteína heteróloga. Las secuencias ligantes apropiadas son aquellas que no afectan la capacidad de que la proteína de fusión resultante sea reconocida y se ligue al epítope ligado específicamente por el dominio V de la proteína (ver por ejemplo WO 98/25965, cuya descripción se incorpora como referencia). Adicionalmente, los anticuerpos quiméricos scFv de la presente invención también pueden construirse para desdoblarse en formas V multivalentes que pueden mejorar la afinidad de enlace, especificidad y/o la vida media elevada en la sangre. Las formas multivalentes de los anticuerpos scFv pueden prepararse por medio de técnicas bien conocidas en la técnica. Un método ha sido el de ligar dos anticuerpos scFv tales como dos anticuerpos quiméricos scFv, con ligantes o enlaces de disulfuro (Mallender y Voss, J. Biol. Chem. 269:199-2061994, WO 94/13806, y patente norteamericana No. 5,989,830, cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad). Otro método para producir dimeros de los anticuerpos de scFv es el de agregar secuencias que son conocidas para formar una cremallera de leucina (Kostelny et al, J Immunol. 148(5): 1547-53 (1992); De Kruif et al., J. Biol.

Chem. 271(13): 7630-34 (1996), cuyas descripciones se incorporan como referencia en su totalidad). Otro método se diseña para producir tetrámeros al agregar un a secuencia codificadora a estreptavidina en la terminal C del scFv. La estreptavidina se compone de cuatro subunidades, así que cuando la estraptavidina se pliega, cuatro subunidades se asocian para formar un tetrámero (Kipriyanov et al., Hum Antibodies Hybridomas 6(3): 93-101 (1995), cuya descripción se incorpora aquí por referencia). En todavía otro método, los dímeros, trímeros y tetrámeros se producen después de que una cisteina libre se introduce en la proteína parenteral. Un reticulador a base de péptido con números variables (dos a cuatro) de grupos de maleimida se usaron para reticular la proteína de interés a las cisteinas libres (Cochran et al., Immunity 12(3): 241-50 (2000), cuya descripción se incorpora aquí por referencia). III. Humanización Los anticuerpos humanizados también se contemplan como un aspecto de la invención. Los anticuerpos humanizados pueden obtener por medio de una variedad de métodos incluyendo, por ejemplo: (1) injerto de los CDR no humanos en una marco humano y región constante (un- proceso referido en la técnica como humanización a través del "injerto CDR"), o alternativamente (2) transplantar todos los dominios variable son-humanos, al "introducirlos" con una superficie tipo humana por medio de reemplazo de los residuos superficiales (un proceso referido en la técnica como "aplicación de carillas"). Esos métodos se describen por ejemplo por Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. ScL, U.S. A., 81:6851 6855 (1984); Morrison y Oi, Adv. Immunol., 44:65 92 (1988); Verhoeyer et al., Science 239:1534 1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489 498 (1991); Padlan, Molec. Immunol. 31(3):169 217 (1994); y Kettleborough, CA. et al., Protein Eng. 4(7):773 83 (1991) cuya descripción se incorpora aquí por referencia. La humanización de los anticuerpos monoclonales de ratón por medio del diseño racional ha sido reportado por ejemplo en la publicaciones de la solicitud de patente norteamericana no. 20020091240 publicada el 11 de julio de 2002, WO 92/11018 y patente norteamericana no., 5,693,762, patente norteamericana no.5, 766, 866, cuya descripción se incorpora aquí por referencia ) y alguien con experiencia normal puede fácilmente utilizar esas técnicas empezando con un dominio V equino o un fragmento del mismo o un anticuerpo quimérico scFv completo, como se describe aquí. IV. Otras modificaciones La invención además completa modificaciones adicionales a uno o más anticuerpos quiméricos scFv en la pluralidad. En un aspecto, las modificaciones son de naturaleza covalente, e incluyen por ejemplo un agente de enlace químico con una o más porciones orgánicas y/o inorgánicas. Por ejemplo los anticuerpos quiméricos scFv se modifican covalentemente para incluir uno o más polímeros solubles en agua, incluyendo polímeros polisacáridos. Los polímeros solubles en agua ejemplares incluyen por ejemplo polietileno glicol, polipropileno glicol, polioles polioxietilados, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, glicerol polioxietilado, polioxialquilenos, o polímeros de polisacaridos. Esos métodos son conocidos en la técnica ver por ejemplo patentes norteamericanas nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192, 4,179,337, 4,766,106, 4,179,337, 4,495,285, 4,609,546 o EP 315 456, cuya descripción se incorpora aquí por referencia . En un aspecto ejemplar y no limitante, el polímero soluble en agua es polietileno glicol (PEG). Como se usa aquí polietileno glicol se pretende que incluya cualquiera de las formas de PEG que pueden usarse para derivar otras proteínas, tales como mono-(C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietileno glicol. PEG es no tóxico, no-inmunogénico, y aprobado por la administración de alimentos y fármacos. Las proteínas y las enzimas cuando se conjugan a PEG han demostrado bioactividad, propiedades no antigénicas, y menores tasas de eliminación cuando se administran a animales. Los métodos para preparar anticuerpos quiméricos scFv PEGilados generalmente comprende las etapas de (a) hacer reaccionar el polipéptido con polietileno glicol (tal como éster reactivo o derivado de aldehido de PEG) bajo condiciones en las cuales el polipéptido se une a uno o más grupos PEG, y (b) obtener los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas. Para las reacciones de acilación se determinarán en base a parámetros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo entre mayor sea la proporción PG:proteína, mayor será el porcentaje de producto poli-pegilado. En algunas modalidades, el polipéptido tendrá una única porción PEG en la terminal N. Ver patente norteamericana no.5, 234, 784, incorporada como referencia. Los anticuerpos quiméricos scFv de la invención también pueden conjugarse directamente para formar compuestos generadores de señal, por ejemplo por medio de conjugación con una enzima (ver por ejemplo, Ngo et al., Mol. Cell. Biochem., 44:3-12, 1982; Maeda, M., J. Pharm. Biomed. Anal., 30:1725-1734, 2003, cuyas descripciones se incorporan cómo referencia), fluroforo, y/o compuestos quimioluminiscentes. Los fluoroferos y compuestos quimioluminiscentes ejemplares pueden encontrarse en el catálogo de sondas moleculares (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), y las referencias allí citadas, todas las cuales se incorporan como referencia en su totalidad. Los procedimientos para esos objetivos tales como etiquetado son bien conocidos en la técnica; por ejemplo ver Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. 18:315 (1970); Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. 62:308 (1979); Engval, E. et al., Immunol. 109:129 (1972); Goding, J.W. J. Immunol. Meth. 13:215 (1976); y patente norteamericana no.4, 391 ,904, todos los cuales se incorporan como referencia en su totalidad. V. Purificación de anticuerpos quiméricos scFv En ciertos casos sería deseable purificar uno o más anticuerpos quiméricos scFv de la invención o sus variantes. Las técnicas de purificación de proteínas son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica (ver en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982), incorporada como referencia). Generalmente, el término "purificada" se referirá a una composición que contenga anticuerpos quiméricos scFv que han sido sometidos a fraccionamiento para retirar varios componentes diferentes, y composición que substancialmente retiene su actividad biológica expresada. No existe un requisito general de que los anticuerpos quiméricos scFv de la invención siempre se proporcionarán en su estado más purificado. De hecho se contempla que anticuerpos quiméricos scFv sustancialmente menos purificados tendrán utilidad en ciertas modalidades. La purificación parcial puede lograrse al usar menos etapas de purificación en combinación o al utilizar diferentes formas del mismo esquema de purificación general. VI. Ensayos de enlace Los anticuerpos quiméricos scFv de la invención pueden examinarse por su afinidad de enlace a un antígeno por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Los ensayos de enlace inmunológico típicamente utilizan un agente de captura para ligarse específicamente y frecuentemente inmovilizar el antígeno dirigido al analito. El agente de captura es una porción que se liga específicamente al analito. Los ensayos de de enlace inmunológico son bien conocidos en la técnica [Ver por ejemplo, patentes norteamericanas nos. 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288; y 4,837,168, Harlow y Lañe, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), las cuales se incorporan como referencia en su totalidad]. A. Ensayos de ligado no competitivo Inmunoensayos no competitivos pueden usarse para la detección por diagnóstico de un antígeno en una muestra. Por ejemplo puede utilizarse un inmunoensayo de inserción de fase sólida de dos sitios (Harlow y Lañe, supra). En este tipo de ensayo, un agente ligante, por ejemplo un anticuerpo quimérico scFv, para un antígeno se une a un soporte sólido. Se etiqueta un segundo agente ligante, que también puede ser un anticuerpo y que une el antígeno en un diferente sitio. Después de que haya ocurrido el antígeno en ambos lados, el agente de enlace etiquetado no enlazado se retira y se mide la cantidad de agente ligante etiquetado se enlazan a la fase sólida. La cantidad de agente ligante etiquetado enlazado es directamente proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra. B. Ensayos de ligado competitivos Los ensayos de ligado competitivo puede usarse para determinaciones de reactivad cruzada que se reconoce por medio de un anticuerpo quimérico scFv de la invención es la proteína deseada y no una molécula de reacción cruzada o (2) para determinar si el anticuerpo es específico para el antígeno y no se liga a antígenos no relacionados. Numerosos tipos de ensayos de enlace competitivos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo patentes norteamericanas nos. 3,376,110, 4,016,043; Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, N. Y. (1988), todas las cuales se incorporan como referencia completamente. C. Otros ensayos de ligado Los métodos western blot son también valiosos para detectar o cuantificar la presencia de anfígenos) en una muestra (Hamada et al., J. Clin. Endocrinol. etab. 61 :120-128, 1985; Den is-Sykes et al., J. Biol. Stand., 13:309-314, 1985, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad). La técnica generalmente comprende separar proteínas de la muestra por medio de electroforesis de gel en base al peso molecular y transferir las proteínas a un soporte sólido adecuado tal como un filtro de nitrocelulosa, un filtro de nylon, un filtro de nylon derivatizado. La muestra se incuba con anticuerpos quiméricos o sus variantes que específicamente ligan los antígenos y el complejo resultante se detecta. Esos anticuerpos pueden etiquetarse directamente usando anticuerpos etiquetados que se ligan específicamente al anticuerpo. VII. Usos terapéuticos La presente invención proporciona tanto métodos terapéuticos como profilácticos y terapéuticos para tratar individuos (por ejemplo humanos u otros animales). En un aspecto la invención provee el prevenir o tratar una enfermedad o desorden en un individuo por medio de métodos profilácticos y terapéuticos.

La administración de un agente terapéutico en un método profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de síntomas de una enfermedad o trastornos, de tal forma que la enfermedad o trastorno se previene o alternativamente se retrasa su avance, por ejemplo, se contempla la protección a corto plazo a un individuo por medio de inmunización pasiva por medio de la administración de uno o más anticuerpos quiméricos scFv de la invención, con o sin adyuvantes. Esa inmunización pasiva puede usar para la protección inmediata de individuos no inmunizados expuestos a moléculas antígenas que pueden dar como resultado una enfermedad o un trastorno indeseables. Como se usa aquí los términos "tratar" o "tratamiento" incluye la aplicación o administración de un agente terapéutico a un sujeto que sufre de una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad o un trastorno indeseables, con el objetivo de curar, sanar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, superior o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o trastorno o la predisposición hacia la enfermedad o desorden. En otro aspecto la invención contempla la administración de un anticuerpo quimérico scFv, así como combinaciones o "cócteles" de diferentes anticuerpos. Esos cócteles de pueden presentar ciertas ventajas en tanto que contienen anticuerpos que explotan diferentes mecanismos efectores. Esos anticuerpos en combinación pueden presentar efectos terapéuticos sinérgicos. Por ejemplo dos o más anticuerpos quiméricos scFv de la pluralidad pueden combinarse de tal forma que la combinación de los anticuerpos juntos proporcionan mayor eficacia contra un desorden que va ase tratado. Las composiciones que contienen uno o más anticuerpos quiméricos scFv pueden administrarse a un individuo o que ya sufre de un trastorno, o a un individuo que puede estar en contacto con las moléculas de antígenos asociadas con un trastorno que va a tratarse. Un anticuerpo quimérico scFv de la invención puede administrarse a un individuo que lo necesite, o a el mismo o en una composición farmacéutica en donde se mezcla con portadores o excipientes adecuados en dosis adecuadas para tratar o mejorar una enfermedad o desorden indeseado tal composición también puede contener (además de un anticuerpo quimérico scFv y un portador) diluyentes, rellenos, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizadores, y otro material bien conocido en la técnica (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980). El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica de los ingredientes activos. La composición farmacéutica puede contener además otros agentes que promuevan la actividad del anticuerpo quimérico scFv o complementen su actividad o uso en el tratamiento. Esos agentes adicionales pueden incluir en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con un anticuerpo quimérico scFV o minimizar los efectos laterales Las técnicas para formulación y la administración de las composiciones farmacéuticas pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980), cuya descripción se incorpora como referencia. Los anticuerpos quiméricos scFv pueden administrarse para tratamientos terapéuticos y/o profilácticos. Como se usa aquí, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" significa la cantidad total de un componente activo de la composición farmacéutico o método que es suficiente para mostrar un beneficio significativo, esto es tratamiento, curación, prevención o mejora de la condición médica relevante, o un aumento en la velocidad de tratamiento, curación, prevención o mejora de la condición. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual, administrado solo, el término se refiere al ingrediente únicamente. Cuando se aplica a una combinación, el término se refiere a cantidades combinadas de ingredientes activos que dan como resultado el efecto terapéutico, ya sea administrado en combinación, serialmente o simultáneamente. Las cantidades terapéuticamente efectivas de una composición variarán y depender de la severidad de la enfermedad y el peso y el estado general del sujeto que se está tratando, pero generalmente se encontrará en el rango de aproximadamente 1.0 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal, o aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por aplicación. La administración puede ser diaria, o en días alternos, semanalmente, dos veces al mes, mensualmente o más o menos frecuente según sea necesario dependiendo de la respuesta de trastorno o la condición y de la tolerancia del individuo a la terapia. Las dosis de mantenimiento durante un periodo de tiempo mayor tal como 4, 5, 6, 7, 8, 10 o 12 semanas o más pueden necesitarse hasta que ocurra la supresión de los síntomas del trastorno, y las dosis pueden ajustarse como sea necesario. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente por medio de técnicas y ensayos convencionales. En aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos quiméricos scFv se administran a un sujeto que aun no se encuentra en un estado patológico para mejorar la respuesta inmune del sujeto a un antígeno. Tal cantidad se define como una "dosis profilácticamente efectiva". Otra vez cantidades efectivas de un anticuerpo quimérico scFv variará y dependerá de la severidad de la severidad de la enfermedad y el peso y el estado general del sujeto que se está tratando, pero se encontrará generalmente en el rango de 1.0 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal, o aproximadamente 10 pg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, o from aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg por aplicación. Típicamente debido a que se usa una dosis profiláctica en un sujeto antes o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. La dosis exacta se determinará en la luz de los factores relacionados al sujeto que requiera el tratamiento. La dosis y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficiente del anticuerpo quimérico scFV para mantener el efecto deseado. La dosis específicas pueden ajustarse dependiendo de las condiciones de la enfermedad, la edad, el peso corporal, las condiciones generales de salud, el sexo, y la dieta del sujeto, los intervalos de dosificaciones, las rutas de administración, la tasa de excreción, las combinaciones de fármacos, y la respuesta a la terapia. Cualquiera de las anteriores formas de dosificación que contienen cantidades efectivas se encuentran dentro de los límites de la experimentación rutinaria y por lo tanto dentro del alcance de la presente invención. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse solas o como una terapia ajustan en conjunto con otros productos terapéuticos para el tratamiento de una enfermedad o trastorno. La cantidad efectiva de esos agentes terapéuticos dependen de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de enfermedad, trastorno, condición o tratamiento y otros factores descritos antes. Además, también se contempla que los métodos de la presente invención pueden combinarse con otros métodos generalmente empleados en el tratamiento de la enfermedad que presenta el sujeto. Por ejemplo en el tratamiento de enfermedades o trastornos para los cuales la reducción de los niveles de anticuerpos quiméricos scFV mejora pero no erradica el desorden puede ser ventajoso usar compuestos adicionales que erradiquen el trastorno. En otros casos, puede ser útil administrar fármacos además del anticuerpo quimérico scFV con el fin de obtener efectos aditivos o sinérgicos. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la composición farmacéutica. Típicamente, una composición se administra hasta que se alcanza una dosificación que alcanza el efecto deseado. La composición por lo tanto puede administrarse en una única dosis o como múltiples dosis (con concentraciones/dosificaciones iguales o diferentes) durante el periodo de tiempo o como una infusión continua. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada pueden administrarse cada tercer día, cada semana o cada dos semanas o cada mes o más dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación particular. Otra refinación de la dosis apropiada se realiza rutinariamente. Las dosis apropiadas pueden determinarse por medio del uso de datos de respuesta a la dosis. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrar por medio de cualquier medio adecuado incluyendo parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para el tratamiento local, la administración intralesión. Las infusiones parenterales pueden incluir intravenosas, intraarteriales, intraperitoneales, intramusculares, intradermicas o subcutáneas. Además el anticuerpo quimérico scFV se administra de forma adecuada por medio de infusión de pulso, particularmente con dosis cada vez menores de anticuerpo quimérico scFV. En un aspecto, la dosis se da por medio de inyección ya sea intravenosa o subcutánea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Otros métodos de administración se contemplan incluyendo sistemas de liberación tópicos, particularmente transdérmicos, transmucosas, rectal, oral o por medio de sistemas de liberación sostenida o por medio de dispositivos de implante. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse por medio de inyección en bolo o continuamente por infusión, o por medio de un dispositivo de implante. En otro aspecto, los anticuerpos quiméricos scFv de la invención pueden administrarse a un individuo que ha sido afectado con factores ambientales que provocan una respuesta inmune. Esos factores ambientales incluyen partículas atmosféricas, rasguños de animales, mordeduras y piquetes, y similares. En otro aspecto, los anticuerpos quiméricos scFv de la invención son inmunoespecíficos para un factor ambiental específicos. En otro aspecto, la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención están dirigidos hacia el reconocimiento inmunoespecífico de extractos venenosos de uno o más animales venenosos. Así las composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los anticuerpos quiméricos scFv administrados a humanos o animales que sufren de un envenenamiento se contemplan específicamente. Además, los agentes terapéuticos secundarios pueden administrarse conjuntamente con los anticuerpos quiméricos scFv de la invención para aliviar varios otros síntomas de envenenamiento. . Por ejemplo el veneno de alacrán contiene varios polipéptidos que interfieren con el balance iónico neuronal y la actividad del canal y generalmente se manifiestan en el sistema nervioso periférico dando como resultado síntomas tales como dolor intenso en el lugar de la picadura que duran de minutos a veinticuatro horas; hinchamiento; prurito, y un cambio en el color de la piel; nausea u vomito; ansiedad, mareos y desmayos; salivación elevada, lagrimeo y sudoracióN, adormecimiento de la lengua; problemas de visión; diarrea o inabilidad para ocntorlar los intestinos; flanulas inflamadas; actividad, cardiaca alterada; y parestesia. Así es un aspecto de la presente invención el incorporar los agentes secundarios en una pluralidad de composiciones farmacéuticas para mejorar esos síntomas. Agentes terapéuticos ejemplares incluyen pero- no se limitan a anestésicos locales para controlar la parestesia y el dolor en el sitio de picadura; antihistamínicos, esteroides, hidrocortisona para reducir reacciones alérgicas; el hinchazón y la picazón los agentes bloqueadores andrenérgicos y los vasodilatadores para contrarrestar el efecto cardiovascular andrenérgico inducido por el alacrán; las benzosdiazepinas para contrarrestar la actividad motora y la excitación del sistema nervioso inducida por los alacranes; los barbituratos para contrarrestar la hiperactividad inducida por el alacrán; anticolinérgicos para contrarrestar los síntomas colinérgicos inducidos por el alacrán; y vasopresores/inotrópicos para combatir la hipotensión refractaria a la terapia de fluido IV. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán después de considerar los siguientes ejemplos ilustrativos, que no se pretenda sean limitantes en manera alguna. EJEMPLOS Ejemplo 1 - Producción de Anticuerpos equinos El presente ejemplo describe la producción de anticuerpos producidos en un caballo que ha sido atacado por cuatro diferentes especies de alacranes, a saber Centruroides noxius, C. limpidus limpidus, C. limpidus tecomanus y C. suffusus suffusus. Los esquemas de inmunización, como aquellos recomendados en la literatura, seguidos con dosis de venenos que van del rango de 3 a 150 DI_5o por caballo por medio de cinco inmunizaciones durante tres semanas para los esquemas de refuerzo, de acuerdo con el tipo de veneno aplicado. Se usaron adyuvantes completo e incompleto de Freund así como solución salina isotónica usando un total de 5, 10 o 20 mol en las diferentes inoculaciones. Ejemplo 2 - Amplificación de Regiones Variables de Cadena Pesada de Caballo Muestras de sangre de caballos inmunizados como se describe en el ejemplo 1 fueron obtenidos del Instituto Bioclon S.A. de C.V. Los linfocitos se aislaron por medio de centrifugación a través de un Lymphoprep (Gibco-BEL, Rockville, M) y se usa para extraer el ARN total como se describe previamente (Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162:156-159, 1987). Para amplificar los fragmentos de inmunoglobulina VH el ARN total aislado del caballo inmunizado se uso para la transcripción inversa(RT) usando el cebador IGHG2-6REV: 5' -GTC CAC CTT GGT GCT GCTG- 3" (SEQ ID NO: 95), que corresponde a una región conservada de genes IGHC2-6 de caballo (Wagner et al., Immunogenetics, 54:353-364, 2002, cuya descripción se incorpora como referencia). La reacción se realizada con el equipo Protoscript® First Strand DNA Synthesis Kit (New England Biolabs). El ADN aislado (dsADN) fue obtenido por medio de PCR usando los cebadores: HorVHForwl : 5' - CAG GTG CAR CTG MAG GAG TCR G - 3' (SEQ ID NO: 96) y HorJH5rev: 5' -GCC TCC ACC ACT CGA GAC GGT GAC CAG GAT ACC CTG - 3' (SEQ íD NO: 97). La secuencia subrayada en el último cebador corresponde a un sitio de reacción Xho I. La reacción PCR se realizó en un volumen total de 20 pL, conteniendo dNTP en una concentración de 2.5 mM, 4 pl de cADN, 20 pmol de cada cebador, amortiguador de reacción ThermoPol y 2 unidades de polimerasa de ADN VentR® (New England Biolabs). La mezcla de reacción se incubo a 94°C durante 3', seguido por 30 ciclos de 1' a 94°C, 1' a 62°C, y 1' a 72°C, y una extensión final de 10' a 72°C. El producto obtenido en esta reacción se reamplificó usando cebadores HorJH5rev (descrito antes) y HorVHForISfi 5' - TTA CTC GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAR CTG MAG GAG TCR G - 31 (SEQ ID NO: 98) para agregar a un sitio Sfi I (subrayado), de acuerdo con el procedimiento para obtener el dsADN descrito antes. Ejemplo 3 — Preparación del Vector de Presentación de Fagos Con el fin de mostrar los anticuerpos quiméricos scFv de la invención, se produjo un vector que ya codifica al fragmento humano de región variable de cadena ligera (A27/Jkl) (figura 1). Las secuencias nucleótidas (SEQ ID NO:1) y aminoácidas (SEQ. ID. NO: 2) de A27/Jk1 se describen a continuación: gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtcaccaggggaaagagccaccctctcc E I V L T Q S P G T L S L S P G E R A T L S tgcaggtccagccagagtgttttatacagctccaacaataagaactacttagcctggtaccagcag C R S S Q S V L Y S S N N K N Y L A W Y Q Q aaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagac K P G Q A P R L L I Y G A S S R A T G I P D aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagat R F S G S G S G T D F T L T I S R L E P E D tttgcagtgtattactgtcagcagtatggtagctcaccttggacgttcggccaagggaccaaggtg F A V Y Y C Q Q Y G S S P W T F G Q G T K V gaaatcaaacgt E I K R A27/Jk1 se sintetizó por medio de PCR en una reacción de etapa sencilla (Stemmer et al., Gene, 164:49-53, 1995, cuya descripción se incorpora por referencia en su totalidad) usando un grupo de oligonucleótidos traslapados (Rojas et al. J. Biotechnol. 94(3):287-98, 2002). La reacción de PCR contenía dNTPs (New England Biolabs) a una concentración de 2.5 ni , 1 pmol de cada cebador, 40 pmol de los cebadores, amortiguador de reacción ThermoPol y 2 unidades de polimerasa. de ADN VentR® (New England Biolabs) en un volumen final de 20 µ?_. La mezcla PCR se incubó inicialmente a 94°C para 3', seguido por 30 ciclos de 1' a 94°C, 1' a 65°C, y V a 72°C, y una extensión final de 10' a 72°C. El amplicon obtenido en esta reacción fue un gel purificado en borato tris con 2.5% de gel de agarosa con el equipo de extracción de gel (QIAquick de QIAGEN). El producto se digirió doblemente con Xho I y Not I (New England Biolabs) a una proporción de 20 unidades enzimáticas/pg de ADN, y se clono en un derivado de vector de pHEN-1 (Hoogenboom et al., Nucleic Acids, Res., 19:4133-4137, 1991) para dar un vector de pHEN-A27.

Ejemplo 4 - Clonación y presentación en fagos de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv Los fragmentos de VH se purificaron con gel con el equipo de extracción de gel (QIAquick de QIAGEN) y se digirieron secuencialmente con Xho I y Sfi I (New England Biolabs) a una proporción de 20 unidades enzi máticas/pg de ADN. Los fragmentos digeridos se ligaron en 1 pg del vector pHEN-A27 (figura 1) a una proporción molar de 1:6 (vectorinserto) con el equipo Quick Ligation Kit (New England Biolabs). La mezcla de ligado se purifico y se concentró usando QIAquick y luego se sometió a electroporación en células electrocompetentes TG1 (Stratagene) para producir una pluralidad de 2.3 x 108 unidades transformadas (tu). Las células transformadas se cultivaron durante la noche placas de agar 2x TY conteniendo 100 pg/mL de caebenicilina y 1% de glucosa. Las placas se rasparon con 10 mL de 2X TY, 50 pL de suspensión de células se usaron para inocular 50 mL de 2X TY que contienen 100 pg/mL de carbenicilina 1% de glucosa, cultivados hasta el OD a 600 nm alcanzaron 0.4 unidades y se infectaron con KM13 de fago auxiliar a (Goletz et al. J Mol Biol. 315(5): 1087-97, 2002; cuya descripción se incorpora aquí como referencia). El cultivo infectado se cultivo durante la noche en 2X TY que contiene 100 pg/mL carbenicilina, 50 pg/mL canamicina y 1% de glucosa, centrifugada y los fagos se purificaron con PEG. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv se titulo y se almacenó en 15% de glicerol y -80°C hasta que se uso. Ejemplo 5 - Secuenciación de Fragmentos VH de caballo Cuarenta y siete clones se seleccionaron aleatoriamente desde la pluralidad antes de la selección de antígenos, se cultivaron durante 8 horas en 5 ml_ de 2XTY que contiene 100 µg/mL de carbenicilina y 1% de glucosa. Los cultivos entonces se centrifugaron y el ADN de plasmido se purifico usando el Miniprep Kit Spin QIAprep® de QIAGEN. La secuenciación se realizó usando el equipo using the ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v3.1. la reacción de secuencia se realizó en un volumen total de 10 pL que contiene 2 pL de mezcla Biig Dye, 1X de amortiguador de secuenciación, 3.56 pmoles de cebador de secuencia y 40 mg de plasmido purificado. Las reacciones se realizaron usando las especificaciones de protocolo ABI Prism. Cuarenta y seis clones (SEQ ID NO. 49-94) se encontró que eran únicos en el nivel aminoácido y se alinean adelante en la tabla 2. t O TABLA 2. Alineación de Secuencias VH de caballos f.-M i .· ..., i.. --. G.3 ?..G.?- -· -i-SASÍ , A.. ,????,. ,,V, ,,,··?· .ß!.!. «....S3f i37P»i— - - - ÍÍK-í 'iüí í-i i s tn_ee--oi.c¡ 7. ..2.» -t?.a8Pi!...ow...ii..8i(.,r. ?.?, .$. s.ss . wacsrrr.K..»... 1 : .....-··· c o.». - - .-ga. sais, .......?...(( ??»· 5, ,g, .a5K¾ao -????ß??G , . •¦'í'n.c y.s».e."-- -.-9!"·.·; ..3 2- 1 E t...-.?.? V.SW.W- — GqftJXSt « ¦ . K.T-...V «..3 CÍÍtCrfK »--·..-.. £???·} 2-S ...!,¾!.··. C.R. , .R. .?, S '(¦· sí~íTS. ,S.. ?. ?? .?.?, . ?"„ ...Ü..S ?,??G???G I.® ¡1(«:. ?- " ¦ i,fíí- -iJsStS— M ?.?...R.T..S.T IT VAT . HSffig.... . ?'? i .' ... , -¡K>--'í : ¡ liSS. S 3..SKH7 Mf.lK.5 V 5.-3 íTYGTS.S STKS !&(''.- .... . M f V.....T.J.W--R ..C. , SSV.t- - - ¦¦ .3..S*.« ft. -V ? -i...'. . ,H - 4V , ... -':í¡- » --,?,?-· --t.,s. «í — - — na, sa..s...fs..<i... .. , .v. y, .«..8.,·.·,..· .pniaws avvsrrsi.. . t > -ji ! , — , , o as..sa * . x v.. srassív venta, wv.. .... ^ 2- 15 : ... j.. jt: . . : .¾ . , .5 , - s , ,<???- ' V,. , .. , ¦ , '¦>·'¦ i i .... K .?. a . 5..5.., OS». SIS riSjatr.TlGIH .5 . .. ? ., .? r..» . · BB.¾.BC i · .; .ft.. , ,e , . ,u , ..f.í. ¦ , ira.Yia affcw,- : A T....I &wrvsss» .:,..,·.-«..as IB 3-5 : .- ·. , · . ft... .r....V S91¡¡2-<- — ··¦ - B....... 5-t i . - . ,Q. , . R.Jffi U . í ,T..ÜET ES ..S .¾«!¡a« SÍJíMPI'lHR «.5 .1 .. í! V ^SXtB ¦ <? ¦ ¦ : · ¦. ¦: ·3 .o.Av.t; — ^.-wr.3½H r . i' ;..¾-.. ü.f .<¾3iitw ?G·?;?.3:<), ...f. . .??jr7 3- 1S : V . A- .. V -S .8.. .... OTÍWWííb-- C7BRURTT -13 .- & (-.,,p...í. ¾f;vF3 ? — 3Y*ry. B2 ii:. 3~i5 n ...t». . ;¡ ,z . ??-??-p-- ¦¦=-·=. c.yaat, 4 1 : ....0 S- ,??G?G ¦> ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Si---f, *.,s ..·¦-··· - - v «·¾ : i'. s..s i..oapsa¾- - ·<·« ! t r.izr — 3 0-? .S.3 B...v.. t s ?ß???.? . — - -aai íit ¦*·» i ji.jj.T—.T.G v.. - .£secs¾g .r.a..vx a..s c<aua.p»--«vs«i»j_sw¾vi........ i.vtD-.??.? eaa-. ...a.<¡3s; v ¡s..::: ..5 »ii -)-? ¦ 3i>ifii--r OVA---- — -sp.en ....ai..?.t.. sv u..namit!. 4- 6 : 1. J,.. - .0 ..W.V—*~ ¦-- ¦¦'!<-<. ¦'?'? 8..* ...?.F....¾ ti.. !; ???,?!!!·;::; - W Hií.ííIll... •i-i ¦ ....8 i..".A.S Y.DS.G' •••--•-•-SSSSK.r A...B.T,. ,SV.... S..« .?¾?3??. ¾.??????.??? · ..... ?·.!^ : i . · V .:. ,. ·.$..? A ,¾.SW ..A.. K.T. ,v ., .s..*. ... ..'!WaiaL - Y ¦ q t.. -- .lJ.'f. 05*5R>..«I..S.... ,?.? V ..7QN.S. .. ..ßß ???? «SetHüWS- *-Yi ·..--?..5 ...31 SS ??-f. . ,? ?G.? .. ? 3 SFS3 ? S1.D.AIHF ÜS8, ...0.. , ?,?.?.t.. S..ß wt ss.- «1-15 : 0 d I G. ;?.???5?¾? 1..? ?.? ? . ?..-??...SF...T..3. -?.?:1)3:3 ? .5??" .5. . . Cfff Ti . S ·. » - ...TO.StfJEB La secuencia nucleotida del clon 2-1 se encontró dos veces y su producto de translación se incluye por lo tanto solo una vez en la alineación. Todas las secuencias aminoácidas tienen un patrón compatible con el de los dominios funcionales VH (Chothia et al, J. Mol. Biol., 196:901-907, 1987; Almagro et al., Mol. Immunol, 34:1199-12 4, 1997, las descripciones se incorporan como resferencia). Las secuencias nucleótidas resultantes de cuarenta y seis clones únicos están disponibles en el banco genético GenBank (número de acceso: DQ125413- DQ125458) y se muestran a continuación en la tabla 3. Tabla 3. Secuencias nucleótidas de caballo VH Ejemplo 6 - Caracterización de secuencias H de caballo A. Matriz de identidad en pared de la pluralidad de secuencias VH Se ha establecido que las secuencias VH dentro de las familias comparten la identidad nucleótida estimada de cuando menos 80%, mientras que la identidad de la secuencia entre ellas que pertenecen a diferentes familias es cuando menos 75% (Brodeur et al., Eur. J. Immunol., 14:922-930, 1984 cuya descripción se incorpora como referencia).

De un total de 1081 comparaciones nucleótidas en pares de secuencias equinas VH, 54 resultaron de valores de identidad por encima de 90%, 620 comparaciones generaron estimados en el rango de 89-89%, 359 de 70-79% y 48 comparaciones resultaron en valores por debajo del 70%. Los estimados de identidad por encima del 90% se generaron por medio de comparación con seis secuencias VH equinas: 1- 5, 2-3, 2-14, 3-5, 4-9, y 4-10. Otras veintisiete secuencias dieron estimados en el rango de 80-89%. Trece secuencias (clones 1-7, 2-1, 2-7, 2-9, 2-15, 3-6, 3-8, 3-9, 3-13, 3- 15, 4-2, 4-7, y Ul 5150) dieron estimados de identidad de 70-79&, aunque dos de las comparaciones con secuencias 2-15 dieron como resultado en estimados por debajo del 70%. Todas las comparaciones realizadas con el clón 4-15 dieron resultados por debajo de 68%. Considerando que las secuencias equinas VH estudiadas en este trabajo son genes IGHV aislados de un caballo hiperinmunizado con veneno de alacrán, es posible que las seis secuencias con valores de identidad por encima del 90% originados del mismos gen de línea germinal y divergidos como resultado de la mutación osmática. Las cuarenta secuencias con valor de identidad entre 89% y 70% pueden representar versiones más altamente mutadas de un número pequeño de genes de línea germinal, aunque dada la considerable divergencia entre ellos es más probable que ellos se hayan originado del mismo número considerable de genes de línea germinal IGHV.

En el caso del clon 2-15 la inserción larga en el circuito H2 de este clon contribuyo a valores de identidad por debajo del 70% con respecto a otras dos secuencias. Los clones 4-15 por otro lado presentaron valores de identidad por debajo del 70% en todas los cuarenta y seis pares de comparaciones, así indicando el hecho de que esta secuencia originada de un gen de línea germinal que pertenece a otra familia de gen IGHV. B. Análisis de secuencia y repertorio estructural deestructuras canónicas equinas Las secuencias equinas VH se analizaron con una combinación de programas disponibles en el Internet tales como ExPASy (http://www.expasy.org/tools/dna.html), · Ident y Sim (http://www.123genomics.com/files/analysis.html). Las estructuras canónicas de los circuitos hipervariables han sido definidos en otros lados por ejemplo (Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989; Chothia et al., J. Mol. Biol., 227: 799-817, 1992; Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215: 175-182, 1990; Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol., 273: 927-948, 1997; y Almagro et al., Mol Immunol. 34(16-17): 1199-214, 1997, cuyas descripciones de incorporan como referencia). En términos estructurales H1 ha sido definido como el circuito hipervariable empezando en la posición 26 y terminado en la posición 32. Tres diferentes tamaños han sido identificados para este circuito: estructuras canónicas 1 (7 residuos), tipo 2 (8 residuos), y tipo 3 (9 residuos). El patrón de residuos compatibles con esos tipos de estructuras canónicas para H1 han sido descritos en otro lado (Chothia et al., 1987, supra; Chothia et al., 1989, supra; Chothia et al., 1992, supra; Tramontano et al., 1990, supra; Al-Lazikani et al., 1997, supra; y Almagro et al., 1997, supra). H2 se define como el circuito hipervariable localizado de la posición 52 a la posición 56. En tanto se han encontrado cinco diferentes tamaños. Los trabajos anteriores asignaron el tipo estructural canónico 1 al circuito más corto (5 residuos), la siguiente longitud (6 residuos) a los tipos 2 y 3 (esos tipos comparten la misma longitud y por lo tanto se hará referencia a esos tipos como 2/3), y el tipo 4, identificado con el circuito más largo (8 residuos). Más tarde dos otros tamaños para H2 se distinguieron en los segmentos de genes VH de humanos: uno con 7 residuos (entre el tamaño de tipos 2/3 y el tipo 4) llamado tipo 5 y uno más corto que el tipo 1 (4 residuos) llamado tipo 6. Los patrones de residuos que determinan las estructuras canónicas para H2 han sido descritos detalladamente en trabajos previos (Chothia et al., 1987, supra; Chothia et al., 1989, supra; Chothia et al., 1992, supra; Tramontano et al., 1990, supra; Al-Lazikani et al., 1997, supra; y Almagro et al., 1997, supra). Se determinó la estructura canónica del repertorio VH de caballo. En H1 dos de tres estructuras canónicas conocidas actualmente se codifican por la familia genética de caballo más numerosa IGVH1. El clon 4-15, que define la familia de genes IGVH2 equinos, tiene la tercera estructura canónica para H1. Ya que se sugirió que el repertorio estructural es específico a la familia (Almagro et al., 1997, supra), la diferencia de las estructuras canónicas en Hl en el clon 4-51 con respecto a las secuencias equinas remanentes proporcionaron un elemento adicional para validar esta secuencia como miembro de una nueva familia de genes VH equinos. En H2, 38 de 47 /80%) de secuencias equinas tienen el tipo 1. Dos clanes tienen un residuo más corto que el tipo 1 (tipo 6) y un clon presenta un aminoácido adicional en H2 generando ya sea los tipos 2 o 3. Un total de seis clones tienen longitudinales que no corresponden con ninguna de las estructuras canónicas descritas hasta ahora. Los clones 1-7, 2-4, 4-2 y 4-14 tienen circuitos más cortos que el tipo 6, con longitudes en el rango de 2 a 3 aminoácidos. El clon 2-7 es aun más corto, con la deleción completa de H2. Los clones 2-15 por otro lado tienen un circuito H2 inusualmente largo. Por definición, esas longitudes deberán generar nuevas estructuras canónicas en H2. El repertorio estructural codificado en los genes de línea germinal IGHB es dominado por el tipo 2 y 3 en H2 (56%) El tipo H2 1 que es la estructura canónica más abundante en caballos está presente en el 35% de las secuencias humanas. Además no se encontró ningún circuito más corto al tipo 6 o más largo que el tipo 4 se encuentra en humanos, mientras que en los caballos esas longitudes de circuito se encuentran en 13% de las secuencias. El repertorio estructura de los caballos así parece ser más corto que el repertorio del gen de línea germinal humana y con variaciones de longitud no visto en los genes de la línea germinal humana. Los insertos inusualmente largo en H2 en el clon 2-15 consiste de patrones repetitivos IGNSGST/IGNSGKT, una característica que se cree es una firma de la intermitencia de polimerasa de ADN durante la hipermutación (Wilson et al., J. Exp. Med., 187:59-70, 1998, cuya descripción se incorpora como referencia). Los análisis comparativos de genes de línea germinal VH humana y las secuencias rearregladas indican que las deleciones somáticas y las inserciones ocurren en H2 en miembros de familias de genes VH2 y VH4 (Wilson et al. 1998, supra; de Wildt et al., J. Mol. Biol, 294:701-710, 1999, cuya descripción se incorpora como referencia). Esos eventos de mutación generaran circuitos H2 más cortos que el tipo 6 o más cortos que el tipo 4. Asumiendo que esas longitudes se generan somáticamente también en el caballo, sin embargo es notable que en humanos esos eventos se presentan con una frecuencia del 2%, mientras que en los caballos la frecuencia de esos eventos es del 13% (6 de 47). Este aumento séxtuple en caballos puede ser una consecuencia del hecho de que las secuencias equinas obtenidas se derivan de un animal hiperinmunizado, en donde la diversificación del repertorio estructural codificado en los genes de línea germinal ha estado bajo la selección positiva. C. Distribución de longitud H3 y composición aminoácida Una vez que se ha caracterizado la región genética de los variables se analizo el repertorio de los circuitos H3. La distribución de longitud H3 en secuencias equina se encontró que seguían un modelo bimodal, estando la mayoría de las secuencias en el rango de 10 a 21 aminoácidos. El último «grupo de longitudes normalmente se distribuye con un promedio de 16.9 + 4 residuos aminoácidos. Previamente, Schrenzel et al. (Immunogenetics, 45:386-393, 1997, cuya descripción se incorpora como referencia), reporto que las longitudes H3 para las secuencias equinas se encontraron en el rango de 12 a 17 aminoácidos, teniendo la mitad de ellos 14 residuos. Los circuitos de caballo H3 solo tienen dos residuos de . cisterna de 727 aminoácidos (0.3%) analizados. Los únicos dos residuos de cisteina en los circuitos de caballo H3 se encuentran en el mismo clon, de hecho 3-2 y están separados seis residuos entre sí. Esto sugiere que forman un enlace de disulfuro interior a la cadena que restringe la estructura del circuito. En las cuarenta y seis secuencias restantes, la ausencia de los residuos de cisteina puede dar como resultado en circuitos menos restringidos. Los circuitos H3 menos restringidos puede ser capaces de buscar más exhaustivamente el espacio de las conformaciones, que crea más soluciones estructurales para reconocer los antígenos diversos. Los circuitos de cabello H3 también tienen un alto contenido de glicina y tirosina. El alto contenido de glicina en los caballos podría mejorar la flexibilidad del circuito y permitir aminoácido voluminosos en su inmediata vecindad, como tirosina y fenilalanina. La tirosina es un residuo muy versátil en términos de interacciones moleculares. Podría contribuir al complejo antígeno-anticuerpo con interacciones en la apilación, los enlaces de hidrógeno, así como p e interacciones hidrofóbicas. De esta manera el sobre-uso de tirosina en los circuitos equinos H3, junto con la flexibilidad potencial conferida por la ausencia de cisteina y el alto contenido de glicina también podría ser un factor importante en la expansión del repertorio de sitios ligantes de antígenos proporcionados por la diversidad observada de estructuras canónicas en H1 y H2. Ejemplo 7 - ELISA policlonal después, del paneo de la pluralidad con una toxina de alacrán Con el fin de determinar que la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv son inmunoespecíficas para una toxina de alacrán, se conducen dos rondas de selección contra c111, una de las dos toxinas responsables de la letalidad del veneno de C. limpidus limpidus. Se realizaron las seleccioens holgadamente como se describe previamente (Marks et al, J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991). Brevemente, se recubrieron inmunotubos (Nunc Maxisorb; Cat. # 12-565-135; Fisher-Scientific) con 4 mL de II I (10 pg/mL) en amortiguador de carbonato (bicarbonato 50 mM NaHC0350 mM, pH: 9.6). La solución de recubrimiento se incubó durante una hora a 37°C, se desecho, los inmunotubos se bloquearon con MPBS (PBS + 2% de leche descremada en polvo; Publix Brand) durante una hora adicional a 37°C. Para la primera ronda de selección la pluralidad (1013 fagos) se diluyeron en 4 mi de mPBNS y se agregaron a inmunotubos recubiertos con c111, se incuba durante una hora a la temperatura ambiente con rotación y luego se dejo reposar durante una hora adicional a la temperatura ambiente. Los fagos no ligados se eliminaron con 10 lavados con TPBS (PBS + 0.1% en Tween 20) y 10 lavados adicionales con PBS. Los fagos ligados se eluyeron por tripsinización (Goletz et al., J Mol Biol. 3 5(5):1087-97, 2002) y se usaron para infectar células TGI con crecimiento exponencial (OD6oo = 0.4). Las células infectadas se cultivaron durante la noche a 37°C en placas de agar 2x TY que contienen 100 pg/mL carbenicilina y 1% de glucosa. La células infectadas con los fagos seleccionados se rasparon de la placa y las partículas de fagos se rescataron con el fago auxiliar KM13 como se describe antes en el ejemplo 4. la segunda ronda de selección se condujo siguiendo el mismo procedimiento que la primera ronda de selección pero usando los fagos (1013 fagos) eluidos de la primera ronda. El enriquecimiento de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv inmunoespecíficos para c1 1 se determinó por medio de ELISA. Las placas para ELISA Nunx Maxisorp se recubrieron con 50 µ? de c111 5 pg/mL en amortiguador de carbonato durante una hora a 37°C y se bloquearon con MPBS durante una hora adicional a 37°C. 50 pL de fagos purificados con PEG policlonal después de las rondas primera y segunda de selección se incubaron en las placas recubiertas con c111 durante una hora a la temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron con 0.1 % TPBS (PBS que contenía 0.1 % Tween 20). Anti-M13: peroxidasa de rábano (HRP) conjugada (Amersham-Biotech) en una dilución 1:5000 en BSA-PBS se agrego a los pozos y se incubo durante una hora, las placas se lavaron y se agregaron 50 pl por pozo de la solución TMB (Promega). La reacción se detuvo después de diez minutos con HCI 1N y la absorbencia se lee en 450 nm en un lector de microplaca. Los resultados de la primera ronda de selección detecto ligado no específico de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv a c111 (línea base). Los resultados de la segunda ronda de selección indicó un aumento en el ligado c111 con un EC50 (titulación a 50% de la señal ELISA) de 1 x 10" cfu/mL. Este resultado .indica un aumento considerable en la población de anticuerpos quiméricos scFv que reconocen c111. Con el fin de confirmar que la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv fueron inmunoespecíficos para d 11 , otra ELISA se realizo de acuerdo con el procedimiento descrito antes pero usando HEL (lisozimas de clara de huevo de gallina) en vez de c111 para cubrir las placas para ELISA. El EC50 para HEL fue de 1 x 1012 cfu/mL,, que indica que solo el 10% de los fagos reconoce a HEL, o que el fago scFv reconoce HEL con una afinidad de una orden de magnitud por debajo de la usada para reconocer c111, o una combinación de los mismos. Estos resultados indican que la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv aislados de la segunda ronda de paneo con c11 fue inmunoespecífica para C111.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una pluralidad de anticuerpos quiméricos de cadena sencilla Fv (scFv) que comprenden cuando menos dos o más anticuerpos quiméricos scFv que son inmunoespecíficos para diferentes epítopes diferentes/distintos, esos anticuerpos quiméricos scFv individualmente comprenden un dominio equino Fv y un dominio Fv no equino.
2. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 1, en la cual la pluralidad se dirige hacia el reconocimiento inmunoespecífico de epítopes de toxina.
3. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 2, en la cual la toxina es una neurotoxina.
4. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 1, en la cual cada uno de los dominios V es un fragmento VH y cada uno de los dominios B que no son equinos en un fragmento VL.
5. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 4, en la cual cada dominio Fv humano es idéntico.
6. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 4 en la cual cada dominio de Fv humano en la pluralidad es el fragmento VL A27/jk1 (SEQ ID NO: 2).
7. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 1, en la cual cada uno de los dominios FV equino es un fragmento VL y cada uno de los dominios Fv que no son equinos es un fragmento VH.
8. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 7, en la cual cada dominio Fv humano en la pluralidad es idéntico.
9. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 4, en la cual el fragmento VH se selecciona de una biblioteca de fagos.
10. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 4 o 7, en la cual el fragmento VH comprende uno o más fragmentos seleccionados del grupo consistente de un fragmento H1, un fragmento H2 y un fragmento H3.
11. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH es un fragmento H1.
12. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH es un fragmento H2.
13. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH es un fragmento H2.
14. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH comprende un fragmento H1 y un fragmento H2,
15. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH comprende un fragmento H1 y un fragmento H3.
16. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 10, en la cual el fragmento VH comprende un fragmento H2 y un fragmento H3.
17. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 8, en la cual el fragmento VH 10 comprende un fragmento H1, un fragmento H2 y un fragmento H3.
18. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 4 o 7, en la cual el fragmento VL comprende uno o más fragmentos seleccionados del grupo consistente de un fragmento L1, un fragmento L2 y un fragmento L3.
19. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL es un fragmento L1.
20. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL es un fragmento L2.
21. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL es un fragmento L2.
22. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL comprende un fragmento L1 y un fragmento L2,
23. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL comprende un fragmento L1 y un fragmento L3.
24. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL comprende un fragmento L2 y un fragmento L3.
25. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 18, en la cual el fragmento VL comprende un fragmento L1, un fragmento L2 y un fragmento L3.
26. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 1, en la cual anticuerpos quiméricos scFv tienen una o más modificaciones naturales o no naturales que no erradican la afinidad de los anticuerpos quiméricos scFv a un epítope.
27. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 1, en la cual los anticuerpos quiméricos scFv tienen una o más modificaciones naturales o no naturales que no alteran la afinidad de los anticuerpos quiméricos scFv a un epítope.
28. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 26 o 27, en la cual las modificaciones naturales se seleccionan del grupo consistente de deleción, inserción y sustitución.
29. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 1 , 26 o 27, en la cual los anticuerpos quiméricos scFv están conjugados a un polipéptido.
30. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 29 en la cual el polipéptido es un fragmento de un segundo anticuerpo.
31. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 1 , 26 o 27, en la cual los anticuerpos quiméricos scFv están conjugados a un polímero soluble en agua.
32. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 31 en la cual el polímero soluble en agua es polietilenogicol.
33. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de las reivindicaciones 1 , 26 o 27, en la cual los anticuerpos quiméricos scFv están etiquetados.
34. La pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la reivindicación 33 en la cual la etiqueta se selecciona del grupo consistente de enzimas, radioisótopos y compuestos fluorescentes.
35. Un método de mutagénesis de la pluralidad de anticuerpos quiméricos scFv de la invención que consiste en: a) genes mutagenizantes que codifican a los anticuerpos quiméricos scFv individuales; y b) expresar los genes para producir anticuerpos quiméricos scFv mutagenizados.
36. El método de la reivindicación 35 que además comprende la etapa de analizar los anticuerpos quiméricos scFv mutagenizados.
37. El método de la reivindicación 35, en el cual la mutagénesis se realiza por medio de mutagénesis dirigido al sitio.