MX2013013054A - Metodo de monitoreo de lc-ms/ms de reaccion multiple para detectar anticuerpos terapeuticos en muestras de animales utilizando peptidos de firma de estructura. - Google Patents

Abstract

Se revelan métodos para detectar, caracterizar, medir y cuantificar anticuerpos humanos y humanizados y sus conjugados presentes en muestras biológicas de animales preclínicas, incluyendo muestras de plasma/suero y tejido.

Description

MÉTODO DE MONITOREO DE LC-MS/MS DE REACCIÓN MÚLTIPLE PARA DETECTAR ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS EN MUESTRAS DE ANIMALES UTILIZANDO PÉPTIDOS DE FIRMA DE ESTRUCTURA REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS La presente es una solicitud no provisional preseritada en virtud de 37 CFR §1.53(b), reivindica el benefició;, en virtud de 35 USC §119 (e) de la solicitud de patente estadounidense provisional número de serie 61/4:85, 249 presentada el 12 de mayo del 2011, que es incorporada1 por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención es concerniente con métodos ¡para detectar y determinar la cantidad de un anticuerpo humajno o humanizado de interés de una muestra animal tal como tejido, plasma o sueros. Los métodos incluyen enriquecimiento de afinidad y digestión de proteasa de la muestra para producir uno o más péptidos únicos y conservados a la región de estructura de un anticuerpo humano o humanizado detectado y cuantificado mediante espectrometría de masas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION · I El análisis de muestras de plasma/suero generada;s de estudios in vivo de proteínas terapéuticas es de interés en la industria biofarmacéutica . El procedimiento de1" ELISA convencional ha sido usado por más de 25 años y tiene varias limitaciones. El procedimiento de ELISA requiere reactivos sobre pedido de alta calidad que pueden tomar varios m ses para generar y la optimización del análisis puede tomar un numero adicional de meses. Asi, el procedimiento de ELISA tiene un tiempo de desarrollo de análisis largo que es [ una limitación tanto en etapa de descubrimiento prematuro comb la etapa de desarrollo de medicinas o medicamentos a basé de proteina (Murray et al (2001) J. Imm. Methods 255:4 i - 56; Kirchner et al (2004) Clin. Pharmacokinetics 43 (2) : 83-¡95) . i Reactivos y condiciones de análisis de ELISA apropiados no pueden ser posibles en algunos casos debido a los ajltos requerimientos de enlace sobre pedido na terapéutica. Otra limitación de ELISA es se pueden enlazar no específicamente de plasma/suero; la interferencia de matriz es un fenómeno común. La cuantificación de proteína mediante espectrometría de masas por otra parte es altamente específica y J por consiguiente la interferencia de matriz es rara! en comparación con ELISA. El desarrollo de análisis de1' ELISA puede ser de labor intensa y requerir reactivos específicos complejos. ELISA es también sensible a interferencias de matriz y reactividad cruzada de anticuerpos. El procedimiento de ELISA mide la concentración de analito indirectamente utilizando propiedades de enlace. Estas muchas variables i hacen a los métodos de ELISA de cuantificación de prot ína desafiantes para desarrollar y transferir a otros laboratorios con desempeño robusto. En base a estas j diferencias, la espectrometría de masas es un método ortogonal a ELISA. Los métodos de espectrometría de masas de cuantificación de proteína, LC-MS/MS en particular} no requieren reactivos sobre pedido y en general producen desarrollos de análisis más rápidos. Además, ¡ la espectrometría de masas es menos sometida a interferencias de matriz y provee condiciones de análisis genéricas qüej son altamente específicas y pueden ser multiplexadas y automatizadas. La alta especificidad de la espectrometría de masas mide la concentración de analito utilizando propiedades i fisicoquímicas intrínsecas del analito, esto es, májsa y patrón de fragmentación. El formato robusto permite1 una :¦ i transferencia de laboratorio a laboratorio rápida,1 una ventaja significativa para terapias de anticuerpo aprobadas. Una metodología general para cuantificar proteínas mediante espectrometría de masas es digestión por tripsina; ié la proteína intacta. Los péptidos resultantes son analizados mediante espectrometría de masas al introducir estándares internos marcados con isótopo estables correspondientes! a una concentración fija. ¡ Los avances recientes en el análisis de péptido y proteína mediante espectrometría de masas (MS) son debidos al * !i desarrollo en las técnicas de ionización e introducción de . í fase gaseosa de extremo frontal tales como ionización! de electroatomización (ESI) e ionización de desorción por láser auxiliada por matriz, (MALDI, US 2003 /0027216 ) , también omo ! mejoras en sensibilidad, resolución, exactitud de masaj del instrumento, bioinformática y algoritmos de desconvolución de datos por elementos de desprogramación ( "Electrospray Ionization Mass Spectrometry : Fundamentáis, Instrumentación, i and Applications", Colé, R.B., Ed. ( 1997 ) Wiley, New York; i "Modern Protein Chemistry: Practical Aspects", Howard,, ,'G.C. and Brown, W.E., Eds . ( 2002 ) CRC Press, Boca Ratón, Fli, p. 71-102; Martin et al (1997) Cáncer Chemother. Pharmácol. 40 : 18 9-201 ; WO 03 / 04 657 1 ; WO 03 / 04 6572 ) . ¡ La cromatografía líquida - espectrometría de masas en tándem es una herramienta poderosa para el análisis y cuantificación de proteína en matrices muy complejas' como ¦ i muestras de plasma/suero. Puesto que los péptidos resultantes de la digestión de la proteína de interés y otras proteínas de plasma/suero pueden tener la misma masa o masa ' nominal similar, la segunda MS frecuentemente provee de interés. La combinación del péptido padre especifico y el ion de fragmento único es usado para monitorear selectiváftiente la i molécula a ser cuantificada . Tal procedimiento es denominado 1 "Monitoreo de reacción Múltiple" (MRM) , también , .referido como Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM) , que ésj un i modo usado comúnmente para la cuantificación de proteína.. ¡ i La ionización de electroatomización (ESI) provee la ionización a presión atmosférica (API) de una muestra líquida. El proceso de electroatomización crea gotas altamente cargadas que, en la evaporación, crean i nes representativos de la especie contenida en la soluciónl Un orificio de toma de muestras de iones de un espectrómetro de masas puede ser usado para tomar muestras de estos iohés de fase gaseosas para el análisis de masa. La respuesta para un analito medido por el detector de espectrómetro de masas es dependiente la concentración del analito en el fluidio e I independiente de la velocidad del flujo del fluido. j ¡ ' ¦ I BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION ! La invención provee un método para detectar antipuerpos I humanos o humanizados que comprende las etapas de: ,' (a) tratar una muestra biológica con una . enzima digestiva para formar una muestra de anticuerpo digerida, en donde la muestra biológica es suero, plasma, tejido o · -células de un animal que ha sido tratada con un anticuerpo huiríano o humanizado y I (b) analizar la muestra de anticuerpo digerida mediante espectrometría de masas para detectar uno o más de estructura humana.

En una modalidad ejemplar, los péptidos de estructura t humana comprenden una o más secuencias seleccionadas de ¡ SEQ ID NOS. 1-8. J ! En una modalidad ejemplar la enzima es tripsina. i i En una modalidad ejemplar, la muestra biológicaj es puesta con un contacto con medios de captura de afinidad o absorbente de cromatografía. Una muestra biológica enriquecida es eluida y luego tratada con la enzima digestiva. j En una modalidad ejemplar, se mide la concentración de la muestra de anticuerpo digerida. j Un aspecto de la invención son métodos de digestió|n de proteasa de la muestra o captura de inmunoafinidad seguida por digestión de proteasa para producir uno o más péptidos únicos a la región de estructura de un anticuerpo humano o humanizado, no presente en muestra biológicas de animales, detectadas y cuantificadas mediante espectrometría' de masas (LC- S/MS) . j Una modalidad de la invención consiste de anticuerpos humanos o humanizados conjugados a porciones de fármaco, en donde los conjugados de anticuerpo-fármaco son medidos mediante los métodos déla invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la alineación de secuencias de I aminoácidos de cadena pesada de un anticuerpo humano ocrelizumab 2H7 (SEQ ID NO: 11) que empieza en el residuo 101, y cinco anticuerpos anti-CD20 de mono cynomolgus: Cynó 'HGi la t D3 1 (SEQ ID NO: 12), CynoHC Ib E5 1 (SEQ ID NO: 13), Cynó HC 2a (SEQ ID NO: 14), CynoHC 2b E6 1 (SEQ ID NO: 15), CynoHC 3 (SEQ ID NO: 16) . Los péptidos de firma de estructura I son identificados (FSP 1-8) como subrayados que son únicos a Mab2H7 humano (hu2H7) y no están presentes en la cadena pesada de IgG de mono cynomolgus, cada uno lleva por lo míenos una diferencia de aminoácido en la secuencias. j ¦' I La figura 2 muestra la cadena pesada de (SEQ ID NO:Í7) y cadena aligera, ( SEQ I D NO : 18 ) de trastuzumab (Hercepttin®, Genentech Inc.; rhuMAbHER2 , Anti pl85HER2), un anticierpo i monoglonal humanizado recombinante, número de registró! CAS 180288-69-1. ¡ j La figura 3 muestra la cadena pesa, (SEQ ID NO: 11) y cadena ligera (SEQ ID NO:19) de ocrelizumab, rhuMAb : 2H7, PRO70769, un anticuerpo anti-CD20 humanizado, número de registro CAS 637334-45-3.

La figura 4 muestra la cadena pesada, (SEQ ID ÑÓ:20) y cadena ligera (SEQ ID NO: 21) de pertuzumab, rhuMÁbj 2C4, número de registro CAS 380610-27-5. FSP2, FSP3, FS 8 son identificados como subrayados en la cadena pesada (SpQ ID NO: 20) . ; La figura 5 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: 22 y la I i [ cadena ligera (SEQ ID NO: 23) de anti-PDLl, un miembro de, la familia CD28/CTLA-4 extendida de reguladores de célula! T.

? FSP2, FSP4, FSP8 son identificados como subrayados én¡ la i cadena pesada (SEQ ID NO:22). ¡ I La figura 6 muestra la cadena pesada, (SEQ ID NO: 24) y la cadena ligera (SEQ ID NO:25) de anti-neuropilina-1, anti- NRP1, MNRP1685A. FSP2 , FSP4, FSP8 son identificados i'corno i subrayados en la cadena pesada (SEQ ID NO:24). ' La figura 7 muestra la cadena pesada, (SEQ ID y cadena ligera (SEQ ID NO: 27) de anti-MÜC16, í MMUC3333A/D UC4064A. FSP2, FSP4, FSP8 son identificados jcomo subrayados en la cadena pesada (SEQ ID NO: 26) . : ! i 1 i i La figura 8 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: 28) y cadena ligera (SEQ ID NO: 29) de rituximab, C2B8, MabThera, ? (Rituxan®, Genentech Inc., Biogen/Idec) , número de registro I CAS. 174722-31-7. FSP2, FSP4, FSP8 son identificados como i subrayados en la cadena pesada (SEQ ID NO:28). j : ' i La figura 9 muestra las etapas genéricas para el método LC-MS/ S para cuantificar un anticuerpo terapéutico en plasma/suero de animal utilizando uno o más péptidos de ¡firma de estructura (FSP) . i i La figura 10 muestra el monitoreo de reacción múltiple de trastuzumab mediante tripsina. Los péptidos de firma de estructura de FSP3 (12.5 minutos), FSP8 (15 minutos)' y FSP5 (17 minutos) son separados y cuantificados por referencia.

La figura 11 muestra el espectro de MS/MS de FSP5 (del i conjugado del anticuerpo anti-MUC16 - fármacos afiniáad-capturado y luego digerido que ha sido proyectado al plasma.

La figura 12 muestra una curva de calibración dé FSP8 proyectado a varias concentraciones de l-l'lOOO microgramos/mililitro en plasma de mono cynomolgus litio -heparinizado preparado mediante el procedimiento de digestión ! de plasma entero/ SPE. ! La figura 13 muestra cromatogramas de LC-MS/Msj que demuestran la detección de FSP8 proyectado al plasma de ¡mono cynomolgus litio-Heparinizado LLOQ = 1 microgramo/mili¡litro después de la preparación de la digestión de Jlasma entero/muestra de SPE. I i La figura 14 muestra un diagrama de flujo de etapas para ¡ el método LC-MS/MS con captura por afinidad de la próteina terapéutica y digestión enzimática para generar péptidos de I firma de estructura (FSP) de mAb de plasma/suero de animal.

La figura 15 muestra una caricatura de la captura mAb de plasma/suero de animal recubierto con estreptavidina enlazado a una sonda de captura biotinilada o perla magnética recubierta con proteina A, G seguida por aislamiento mediante separación magnética, digestión del anticuerpo capturado y análisis de LC-MS/MS . ;· I La figura 16 muestra modalidades de perla magnética recubierta con proteina A, G (parte superior) para la captura genérica de anticuerpo y perlas magnéticas recubiertas ¡con estreptavidina enlazadas a una sonda de captura biotiniliada (fondo) para captura especifica de anticuerpo. j La figura 17a muestra la detección y separación pórj LC-MS/MS de FSP8 a 1 g/mL de anticuerpo trastuzumab en plasma de rata. ¡ La figura 17b muestra la detección y separación mediante LC-MS/MS de estándar interno FSP8 marcado con isótopo estable (SIL) . " ? La figura 18 muestra la linealidad de detección, graficando la proporción de FSP8 a estándar interno de ¡ FSP8 marcado con isótopo estable versus la de trastuzumab (HERCEPTIN®) de 1-250 ug/mL en La figura 19a muestra una caricatura del anticuerpo monoclonal (mAb terapéutico) capturado mediante enlace; a un dominio extracelular inmovilizado (ECD) o anticuerpo I policlonal IgG anti-humano y detectado con un anticuerpo policlonal IgG anti-humano marcado con peroxidasa de: rábano (HRP) en un análisis de ELISA con detección electroluminiscente o colorimétrica . : ; ; La figura 19b muestra elementos del análisis de LCr-MS/MS que comienza con la captura de perla de proteina A dé un mAb terapéutico de una muestra biológica, digestión de tripsina del mAb terapéutico capturado para formar uno o más peptidos de firma de estructura (FSP), por ejemplo FSP8 y detección mediante LC/ S/MS de monitoreo de reacción múltiple (MíRM) para detectar la transición de 938.0 (M, 2+) a 836.7 (yl5, 2+) . i La figura 20 muestra la concordancia entre el análisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ELISA de la figura 19a en base a farmacocinética individual (PK) de muestras de plasma/suero de ratas dosificadas | con trastuzumab, un mAb anti-HER2. ¡ I La figura 21 muestra la concordancia entre el análisis LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ELISA de I la figura 19a en base a la fármacocinética individual' (PK) de muestras de plasma/suero de rata dosificadas de , un mAb anti-MUC 16.

La figura 22 muestra la concordancia entre el an lisis I I LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ¡ ELISA í de la figura 19a en base a la fármacocinética individual I (PK) de muestras de plasma/suero de ratas dosificadas con un mAb anti-mesotelina (Msln) . ¦ ¡ La figura 23 muestra la concordancia entre el :arálisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análi'sis de ELISA de la figura 19a en base a la fármacocjinética individual (PK) de muestras de plasma/suero de; monos cynomolgus dosificados con 3A5 (MMUC1206A) , un mAb anti-MUC 16 mediante medición del anticuerpo en el plasma durante 28 días La figura 24 muestra la concordancia entre el análisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ! ELISA de la figura 19a en base a la fármacocinética media (PK) de muestras de plasma/suero de monos cynomolgus dosificados con un mAb anti-mesotelina (Msln) mediante medición del anticuerpo en el plasma durante 40 dias.

La Figura 25 muestra la concordancia entre el análisis i de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ELISA de la figura 19a en base a la fármacociiijética A no ser que sean definidos de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el[i mismo significado como se entiende comúnmente por aquel de habilidad ordinaria en el arte con el cual esta invención es concerniente y son consistentes con: Singleton et al, i (1994) "Dictionary of Microbiology and Molecular Biology", 2a edición., J. iley & Sons, New York, NY; and Janeway,! et al (2001) "Immunobiology", 5th Ed., Garland New York. Cuando se usan nombres de marcas en , la formulación del producto de nombre de marca, el' ¡fármaco genérico y el (los) ingrediente (s) activo (s) del producto de nombre de marca son también incluidos DEFINICIONES El término "muestra biológica" es cualquier compórtente derivado o separado de un animal, e incluye sangre, plasma, suero, células, fluido cerebroespinal (CSF) , leche, livado I bronquial, médula ósea, fluido amniotico, saliva, bilis, vitreo, lagrimas o tejido. ! El término "enzima digestiva" es una enzima apta de escindir o hidrolizar péptidos o proteínas en fragmentos, ya i sea de manera especifica o genética, aleatoria. Una enzima digestiva puede formar una muestra de anticuerpo digerida de un anticuerpo, en donde el anticuerpo es un componente de una muestra biológica. Enzimas digestivas incluyen protíeasas tales como tripsina, papaina, endoproteinasa · 'LysC, endoproteinasa ArgC, staph aureus V8, quimiotripsina,' Ásp-N, i Asn-C, pepsina y endoproteinasa GluC. ¦ ; ¦'¦ El término "anticuerpo" es usado en la presente !en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitado a anticuerpos monoclónales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos bisespecificos) y fragmentas de anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad de enlace de antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula i diferente de un anticuerpo intacto que comprende una pprpión de un anticuerpo intacto que se enlaza al antigeno al cuáh. el anticuerpo intacto se enlaza. Ejemplos de fragmentos^ de i anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fab, Ejab', Fab'-SH, F(ab' )2? diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, scFv) y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos I En ciertas modalidades, un anticuerpo provisto1 en la presente es un fragmento de anticuerpo. Fragmentoé de anticuerpo incluyen pero no están limitados a fragmentos de Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab' )2, Fv, y scFv y otros fragm ntos descritos posteriormente en la presente. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, véase Hudson et al . Nat. Med. 9:129-134 ( de scFv, véase, por of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore !eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/Í6185; US 5571894; US 5587458. Para una discusión de fragmentos de Fab y F(ab' )2 que comprenden residuos de epitope de enlace de receptor de salvamento y que tienen vida media : in vivo incrementada, véase US 5869046. * j Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antigeno que pueden ser divalentes o bisespecificos (EP 404097; WO 1993/01161; Hudson,, et al. t (2003) Wat. Med. 9:129-134; Hollinger et al. (1993) Ptroc.

Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448) . Triacuerpos y tetracuerpos son también descritos en Hudson et al. (2003) Nat. Med. 9:129-134. j i Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentojs de anticuerpos que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades ¡ un anticuerpo de un solo1 dominio es un anticuerpo de Un solo dominio humano (US 6248516) . j Los fragmentos de anticuerpos pueden ser elaborados mediante varias técnicas, incluyendo pero no limitadas a digestión proteolitica de un anticuerpo intacto, también como I producción mediante células huésped recombinantes (e.¡g. E. coli o phage) , como se describe en la presente. J El termino anticuerpo "quimérico" se refiere í a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada o ligera es derivada de una fuente o especie particular, en tanto que el resto de la cadena pesada y/o ligera es derivada I de una fuente o especie diferente. ! El término" región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye regiones de ! Fe de secuencia natural y regiones de país Fe variantes En una modalidad, una región de Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226 o de Pro230 al término carboxilp de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región de Fe puede o puede no estar presente. A ño ser que se especifique de otra manera en la presente,: la numeración de residuos aminoácidos en la región de Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración de EU, también llamado el índice de EU, como se describe en Kabat en al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. ! "Estructura" o "FR" se constante diferentes de hipervariable (HVR) . La FR en general de cuatro dominios de FR: FR1, FR2, FR3, yj FR . Así, las secuencias de HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll ) -FR2-H2 (L2 ) ;-FR3-H3(L3)-FR4. ' ¡ Los términos "anticuerpo de plena longitud", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" son usados en la présente intercambiablemente para referirse a un anticuerpo que • ¡ itiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de i anticuerpo natural o que tiene cadenas pesadas que contienen una región de Fe como se define en la presente. ! Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado dia un fuente no humana que utiliza repertorios de anticüé'rpos humanos y otras secuencias de codificación de anticuerpo humanas. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende! los residuos de enlace antígeno no humanos. i Una "estructura de consenso humana" es una región de estructura de un anticuerpo que representa los residuos de I aminoácidos que se presentan más comúnmente en una selección de secuencias de estructura de VL o VH de inmunoglófcjjlina humana. En general, la selección de secuencias de VL o ¡VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias ¡es un I subgrupo como en Kabat et al. Sequences of Prot ins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una modalidad,' para la VL, el subgrupo es subgrupo es subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una modalidad, para la , VH, el .' , i subgrupo es subgrupo III como en Kabat et al., supra.;: Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácido de · HVR no humanas y residuos de aminoácido de FR humanas. En, diertas modalidades un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos dominios variables en los cuales todas o sustanciaímente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano y todas o sustanciaímente todás¡ las FR corresponden a aquellas de un anticuerpo humano .j Un anticuerpo humanizado puede comprender opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de Í un anticuerpo, un anticuerpo no humano, se refiere k un I anticuerpo que ha sufrido humanización. ,' i Un anticuerpo "quimérico" comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano tal como un ¦ mono) y una región constante humana (patente estadoúni'dense i 4816567; Morrison et al. (1984) Proc. Nati. Acad. | Sci. Estados Unidos de América, 81:6851 adicional, un anticuerpo quimérico es cambiada" en el cual la clase o subclase ha sido cambiada de aquella del anticuerpo padre. Los anticuerpos quiméricos incluyen fragmento enlace antigeno de los mismos. '' j i En ciertas modalidades un anticuerpo quimérico jes un anticuerpo humanizado. Comúnmente un anticuerpo no humano es humanizado para reducir la inmunogenicidad a húmanos, mientras que requiere la especificidad y afinidajd del anticuerpo no humano parental. En general, un a-ntijcuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en los cuales las HVR, por ejemplo, CDR (o porciones de las mismas) j son derivadas de un anticuerpo no humano y las FR¡ (o porciones de las mismas) son derivadas de secuencias de anticuerpo humanas. Un anticuerpo humanizado también I comprenderá opcionalmente por lo menos una porción dei una I región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos de FR en un anticuerpo humano son sustituidos con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano ! (por ejemplo, el anticuerpo del cual los residuos de HDR' son derivados) por ejemplo, para restaurar o mejorar la I especificad o afinidad del anticuerpo. j Anticuerpos humanizados y métodos para fabricarlos son revisados, por ejemplo en Almagro y Fransson, Front. Bájosci. 13:1619-1633 (2008) y son descritos adicionalmente,! por ejemplo en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 5821337; US 7527791; US 6982321; US 7087409; Kashmiri, ét al. (2005) Methods 36:25-34 (que describe injertación dei;SDR (a-CDR)); Padlan, (1991) Mol. Immunol . 28:489-498 (que describe "retratamiento superficial"); Dall'Acqua et al.,: ¡(2005) Methods 36:43-60 (que describe "entremezcla FR") y Osbo'urn et al, (2005) Methods 36:61-68; Klimka et al. (2000,):,.' Br. J.

Cáncer 83:252-260 (que describe el procedimiento de , i "selección guiada" a entremezcla de FR) . ;: ; Regiones de estructura humanas que pueden ser ; usadas para humanización incluyen pero no están limitadasj a: regiones de estructura seleccionadas utilizando el "mejor ajuste" (véase, por ejemplo, Sims et al. J. 151:2296 (1993) ) ; regiones de estructura derivadas de la secuencia de consenso de anticuerpos humanos de un subjgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o c'adena pesada (Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sel.) USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol . , 151:2623) ; regiones de estructura maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones de estructura de línea germinal humana (Almagro y Fransson, (2008) Front . Biosci. 13 : 1619-1633) y regiones de estructura derivadas de selección de bibliotecas de FR (véase, por ejemplo, Baca et al. (1997) J.

Biol. Chem. 272: 10678-10684 y Rosok et al. (1996) J.{ Biol . Chem. 271:22611-22618) . í i Anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando I varias técnicas conocidas en el arte. Anticuerpos humanos son descritos en general en van Dijk y van de Winkel, (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74; Lonberg, CurrJ Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) . ; : Anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar un inmunogeno a un animal transgénico que ha sido modificado ? para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al ataque antigénico. Tales animales comúnmente contienen todos o una porción de los sitios de inmunoglobulina humaná, que reemplazan los sitios de inmunoglobulina endógenos o j que están presentes extra-cromosomalmente o integrados aleatoriamente a los cromosomas del animal. En tales ratones transgénicos , los sitios de inmunoglobulina endógenósj han sido en general desactivados. Para una revisión de méiodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, véase, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) . Véase también, por ejemplo patentes estadounidenses 6,075,1;81 y 6,150, 584 que describen la tecnología de XENOMOUSE™; pajtente estadounidense 5770429 que describe la tecnología de HUMAB®; US 7041870 que describe la tecnología de K-M MOUSE® y US 2007/0061900, que describe la tecnología de VELOCIMOUSE®) .

Regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por tales animales pueden ser modificadas adicionalmentéj, por ejemplo mediante combinación con una región constante Humana diferente. , |; Los anticuerpos humanos pueden también ser elaborados mediante métodos a base de hibridoma. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humana para la producción de anticuerpos monoclonales humanos han! sido descritas. (Véase, por ejemplo, Kozbor J. Immunol . , 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Prpdjuction Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, ! Inc., New York, 1987) y Boerner et al., (1991) J. Immunol./ 147: I 86 ) . Los anticuerpos humanos generados a través dé! la tecnología de hibridomas de células B humanas también se describen en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 103 : 3'557 - 3562 ( 2006 ) . Métodos adicionales incluyen aquellos descritos por ejemplo en la patente estadounidense 7 , 18 9 , 826 j (que describe la producción de anticuerpos de IgM monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) ; Ni, ( 2006 ) Xiándai Mianyixue, 26 ( 4 ) : 265-2 68 (que describe hibridomas humjanos-humanos) . La tecnología de hibridoma (tecnología de trioma) es también descrita en Vollmers y Brandlein, ( 2005 ) Hist'ology and Histopathology, 20 ( 3 ) : 927 - 937 y Vollmers and Brandlein, (2005) Methods and Findings in Experimental Pharmacology, 27 ( 3 ) : 185 - 91 .

Anticuerpos humanos pueden también ser aislar secuencias de dominio variable de seleccionadas de bibliotecas de despliegue de derivadas. Tales secuencias de dominio variable pueden: luego ser combinadas con un dominio constante humano 'deseado.

Técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpo son descritas posteriormente en la presente.

Los anticuerpos de la invención pueden ser .aislados mediante selección de bibliotecas combinatoriales por anticuerpos con la actividad o actividades deseadájs. Por ejemplo, una variedad de métodos son conocidos en: el arte para generar bibliotecas de despliegue de fago y seleccionar t tales bibliotecas en cuanto a anticuerpos que poseen ! las características de enlace deseadas. Tales métodos 1 son revisados por ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y son descritos además, por ejemplo en ? McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et jal., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al. (1992) J. Mol. Biol. 222: 581-597; Marks y Bradbury, en Methods in Molecular I Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al. (2004) J. Mol. Biol. 338(2): 299-310; Lee éj al. (2004) J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093; Fellouse, ('2004) Proc. Nati. Acad . Sci . USA 101(34): 12467-12472 y Lee e't al. (2004) J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132. ,' . . | i En ciertos métodos de despliegue de fago, repertorios de genes de VH y VL son clonados separadamente mediante reacción r j en cadena de polimerasa (PCR) y recombinados aleatoriamente en bibliotecas de fago, que pueden luego ser seleccio 'n' 'adias en i cuanto a fago de enlace antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). El;' fago comúnmente despliega fragmentos de anticuerpo, ya sea como fragmentos de Fv de una sola cadena (scFv) o como fragmentos de fab. Las bibliotecas de fuentes inmunizadas ;; roveen I anticuerpos de alta afinidad al inmune sin el requerimiento de construir hibridomas. Alternativamente, el rep rtorio naive puede ser clonado (por ejemplo, de humano) para;1 proveer una sola fuente de anticuerpos a un amplio intervalo de antigenos no self y también self sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) . Finalmente, bibliotecas naive pueden también! ser elaboradas sintéticamente al clonar segmentos de gen V sin arreglar de células madre y usando cebadores de PCR que contienen secuencia aleatoria para codificar las regiones de CDR3 altamente variables y para llevar a cabo el re-árreglo in vitro, como se describe por Winter, J. Mol. Biol . , ! 227: 381-388 (1992) . Bibliotecas de fago de anticuerpo humanó son descritas en US 5750373; US 2005/0079574; US 2005/011945^; US 2005/0266000; US 2007/0117126; US 2007/0237764; US 2007/0292936; US 2009/00 fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humanos son considerados anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo humano en la presente. ¡ í En ciertas modalidades, un anticuerpo es un anticuerpo multiespecifico, un anticuerpo bisespecifico . Los ant multiespecificos son anticuerpos monoclonales que:' tienen especificidades de enlace por al menos dos sitios diférentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades dé enlace es por un antigeno y la otra es para un segundo antigeno. En ciertas modalidades, los anticuerpos bisespecificos se pueden enlazar a dos epitopes diferentes del mismo añtigeno. Anticuerpos bisespecificos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno. Anticuerpos bisespecificos puede ser preparados como anticuerpos de plena longitud o fragmentos I de anticuerpo. ; Técnicas para fabricar anticuerpos multiespecificas incluyen pero no están limitadas a co-expresión recombihante de dos pares de cadena pesada-cadena ligera j de inmunoglobulina que tienen especificidades diferentes (véase Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) y diseño de "perilla en agujero" (US 5731168). Anticuerpos multiespecificos pueden también ser elaborados medrante diseño de efectos de direccionamiento electrostáticos ! para fabricar moléculas heterodiméricas de anticuerpo Fe (WO 2009/089004A1) ; reticulación de dos o más anticuerpos o fragmentos (véase, por ejemplo patente estadounidense 4,676,980 y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras de leucina para producir anticuerpos bi-especificos (véase, por ejemplo Kostelny et al./ J. , , í Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992)); utilizar tecnología de "diacuerpo" para fabricar fragmentos de anticuerpo bisespecificos (véase, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)) y usar díméros de Fv de una sola cadena (sFv) (Gruber et al., J. Immünol., 152:5368 (1994)) y preparación de anticuerpos; tris- específicos (Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147: 60) .

Anticuerpos diseñados con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo" ' son también incluidos en la presente (véase, por ejemplo^ US 2006/0025576A1) . j El anticuerpo o fragmento en la presente también íncjluye un "FAb de acción doble" o "DAF" gue comprende un sitio de enlace de antígeno que se enlaza a un antígeno, también como otro antígeno diferente, (véase, US 2008/0069820/ ¡ por ejemplo) .

Variantes de a ticuerpo En ciertas modalidades, variantes de secuencia de aminoácido de los anticuerpos provistos en la presente | son contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológica!s del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácido de: un anticuerpo pueden ser preparadas al introducir modificaciones apropiadas a la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo o mediante síntesis de péptido. ' íales modificaciones incluyen, por ejemplo cancelaciones de y/o inserciones a y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede : h'acer cualquier combinación de cancelación, inserción y sustitución para llegar a la construcción o constructo final, a condición de que la construcción (constructo) final pos,ea¡ las características deseadas, por ejemplo enlace de antígeno.

Los anticuerpos incluyen proteínas de fusión' que comprenden un anticuerpo y una proteína, porción de fármaco, marcador o algún otro grupo. Las proteínas de fusión pueden ser elaboradas mediante técnicas recombinantes, conjugación o í síntesis de péptido para optimizar propiedades tales como i farmacocinética . El anticuerpo humano o humanizado de la invención puede también ser una proteína de fusión que comprende una secuencia de péptido de enlace de albúmina (ABP) (Dennis et al. (2002) "Albumin Binding As A General Strategy For Improving The Pharmacokinetics Of Protejins" J Biol Chem. 277:35035-35043; WO 01/45746). Los anticuerpos de la invención incluyen proteínas de fusión con secuencias de ABP enseñadas por: (i) Dennis et al (2002) J Bíóll Chem. ¦ t 277:35035-35043 en tablas III y IV, página 35038; (lii) US I 2004/0001827 en

[0076] y (iii) WO 01/45746 en páginas 12-13 y todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia . : : ¡ ¡ Variantes de sustitución, inserción y cancelación En ciertas modalidades, se proveen variantes de anticuerpo que tienen una o más sustituciones de aminoácido. Sitios de interés para muta génesis sustitucional " incluyen las HVR y FR. Las sustituciones conservadoras son mostradas en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras". Cambios más sustanciales son provistos ¡en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe además posteriormente en la presente con referencia a clases de cadena lateral de aminoácido. Se pueden introducir sustituciones de aminoácido a un anticuerpo de interés y los productos pueden ser seleccionados . ¡pór una actividad deseada, por ejemplo enlace de antigeno retenida/mejorada, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC.

Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con la ' i propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu,:: lie; (2) hidrofilicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; ! (3) ácidos: Asp, Glu : (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena Glur, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras abarcaran intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un antipuerpo padre (por ejemplo, un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la (s) variante (s) resultante (s) seleccionada para estudio adicional tendrá modificaciones (por éjemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad incrementada, inmunogenicidad reducida) en relación con el anticuerpo padre biológicas sustancialmente Una variante sustitucional por afinidad, que puede ser generado convenientemente, por ejemplo utilizando técnicas de maduración por afinidad a base de despliegue de fago tales como aquellas descritas en la presente. Brevemente, uno o más residuos de HVR son imitados y los anticuerpos variantes son desplegados sobre [ fago y seleccionados en cuanto a una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de enlace) .

Se pueden hacer alteraciones (por ;éjemplo, sustituciones) en HVR, por ejemplo para mejorar la a de anticuerpo. Tales alteraciones se pueden hacer e calientes" de HVR, esto es, residuos codificados por endones que sufren mutación a alta frecuencia durante el proceso de maduración somático (véase, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y/o SDR (a-CDR) , con la| VH o VL variante resultante siendo probada en cuanto a de enlace. La maduración por afinidad al construir y re-seleccionar bibliotecas secundarias se ha descrito! por i ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowá!, NJ, (2001) .) En algunas modalidades de maduración por afinidad, se introduce diversidad a los genes variables escogidos para maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR propensa a error, entremezcla de caclena o muta génesis oligonucleótido-dirigida ) . Luego se crea una biblioteca secundaria. La biblioteca es luego seleccionada i para identificar cualesquier variantes de anticuerpo Con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra procedimientos HVR-dirigidos en los cuales varios residuos de HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) son aleatorizados . Los residuos de HVR involucrados en el enlace de antigeno pueden ser identificados especificamerité, por ejemplo, utilizando muta génesis de barrido de alanina o j modelado. CDR-H3 Y CDR-L3 en particular son frecuentemente apuntados . ' '!· '! En ciertas modalidades, se pueden presentar sustituciones, inserciones o cancelaciones dentro 'de,! una o más HVR en tanto que tales alteraciones no reduzcan sustancialmente la habilidad del anticuerpo para enlazarse al antigeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras ; (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se estipula ¡en la presente) que no reducen sustancialmente la afinidad de enlace se pueden hacer en HVR. Tales alteraciones1 pueden estar fuera de "puntos calientes" de HVR o SDR. En ciertas modalidades de las secuencias de VH y VL variantes provistas anteriormente, cada HVR ya sea esta sin alterar o no contiene no más de uno, dos o tres sustituciones de aminoácido; Un método útil para identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que pueden ser apuntados para muta génesis es llamado "muta génesis de barrido de alanína" como se describe por Cunningham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupos de ¿esiduos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arq, asp, his, lys y glu) son identificados y reemplazados pjor un aminoácido neutro o cargado negativamente (por éjémplo, alanina o polialanina) para determinar si se afécjta la interacción del anticuerpo con el antigeno. Se pueden introducir sustituciones adicionales en los sitiios de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional' a las sustituciones iniciales. Alternativa o adicionalmente , la ' :¦!, i estructura cristalina de un complejo de ant igeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antigeno. Tales residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser . apuntados o eliminados como candidatos j para sustitución. Las variantes pueden ser seleccionadas para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían de longitud desde un residuo a polipéptidos que contienen j 100 o más re uno solo de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo N-terminal. Otras variantes insercionales '¦ de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al término iNf o C-del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEÉT)! o un polipéptido que incrementa la vida media en el suero del anticuerpo. ! Variantes de glicosilación En ciertas modalidades, el anticuerpo provisto 1 en la presente es alterado para incrementar o disminuir la extensión a la cual el anticuerpo es glicosilado. La¡ adición o cancelación de sitios de glicosilación a un anticüejrpo se puede efectuar convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que se crean o remueven 'uñó1 o más sitios de glicosilación. ¡ En donde el anticuerpo comprende una región dé Fe, el carbohidrato anexada a la misma puede ser alterado.

Anticuerpos naturales producidos por células mámíferas comúnmente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que es en general anexado por un enlace N a Asn297 del dominio de CH2 de la región de Fe (Wright et al.' l997) TIBTECH 15:26-32). El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa y ácido siálico, también como una1 fucosa anexada a un GlcNAc en la "derivación" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas modalidades, se pueden hacer modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo j de la invención con el fin de crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En una modalidad, se proveen variantes de anticuerpo que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa anexada (directa o indirectamente) a una región de Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en tal anticuerpo puede ser de I 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40¾. La cantidad de fucosa es determinada al calcular la tíantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en, án297, en relación con la suma de todas las glicoestructuras anexadas a Asn297 (por ejemplo, estructura compleja, híbridas y de alto contenido de mañosa, tal como se mide mediante espectrometría de masa de ALDI-TOF, como se describe jen WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina localizado alrededor de la posición 297 en la región de Fe (numeración de EU de residuos de región de Fe) . Sin embargo, Asn297 puede también estar ubicado alrededor de ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente debajo de la posición 297, esto es, entre posiciones 294 y 300, det?ido a variaciones de secuencia menores en anticuerpos. ¡Tales variantes de fucosilación pueden tener función de i ADCC mejorada (US 2003/0157108; US 2004/0093621) . Ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpo "desfucosiladas" o "fucosa-deficiente" incluyen:! US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO i 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; ; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. . 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. .

Bioeng. 87:614. Ejemplos de lineas celulares aptas de producir anticuerpos desfocusilados incluyen células CHO Lecl3 deficientes en fucosilación de proteina (Ripkai ejt al. Aren. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108, Presta, L y WO 2004/056312, Adams et al., especialmente 'en el ejemplo 11) y lineas celulares knock-out, tales como : e,l gen de alfa-1 , 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO kí'pck-out (Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotech. Bioeng. 87 : 614:;: ¡ Kanda, Y. et al. (2006) Biotechnol. Bioeng., 9 ( 4 ) : 680-688 ; WO2003/085107) . ; Variantes de anticuerpo son provistas adicionalmente con oligosacáridos bisectados, por ejemplo en los cuáles un oligosacáridos biantenario anexado a la región de Fp del anticuerpo es bisectado por GlcNAc. Tales de anticuerpo pueden tener fucosilación reducida de ADCC mejorada. Ejemplos de tales variantes de son descritos por ejemplo en WO 2003/011878 (Jean-Mairet etial.); patente estadounidense 6,602,684 (Umana et al.) iy US 2005/0123546 (Umana et al.). También se proveen variantes de anticuerpo con por lo menos un residuo de galactosa 'en el oligosacárido anexado a la región de Fe. Tales variantes de anticuerpo pueden tener función de CDC mejorada. ! Tales variantes de anticuerpo son descritas (WO 1997/30087; WO I 1998/58964; WO 1999/22764).

' Variantes de región de Fe ¡ En ciertas modalidades, una o más modificaciones de aminoácido pueden ser introducidas a la región de Fe ide un anticuerpo provisto en la presente, generando mediante esto una variante de región de Fe. La variante de región ;de Fe puede comprender una secuencia de región de Fe humana (por ejemplo una región de IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 Fe humana) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo!, una sustitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todajs las funciones efectoras, que lo hacen un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante y todavía ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarijas o perjudiciales. Análisis de citotoxicidad in vitro y/o in vivo se pueden llevar a cabo para confirmar! la reducción/agotamiento de actividades de CDC y/o ejemplo, análisis de enlace de receptor de Fe (FcR) llevar a cabo para asegurar que el anticuerpo carece de y FcDRIII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas es resumida en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Ejemplos no limitantes de análisis in vitro para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés son descritos | en US 5500362; Hellstrom, I. et al. (1986) Proc. Nat'l Acad. Sci.

USA 83:7059-7063); Hellstrom, I et al. (1985) Prpc., Nat'l i Acad. Sci. USA 82:1499-1502; US 5821337; Bruggemanri,: |. M . et al. (1987) J. Exp. Med. 166:1351-1361). Alternativámente, métodos de análisis no radioactivos pueden ser empleados (véase, por ejemplo, análisis de citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Moúntain View, CA y análisis de citotoxicidad no radioactivos^ tipo i CytoTox 96® (Promega, Madison, WI) . Células efectoras útiles para tales análisis incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . ' Alternativa o adicionalmente, la actividad de ADCC¡de la molécula de interés puede ser determinada in vivo] por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656. También se puede llevar a cabo análisis de enlace de Clq para i confirmar que el anticuerpo es no apto para enlazarse a ¡Clq y de aquí carece de actividad de CDC. Véase, por ejemplo, ELISA de enlace de Clq y C3c en WO 2006/029879 y O 2005/100402.

Para determinar la activación de complemento, se ¡puede efectuar un análisis de CDC (Gazzano-Santoro et al. (1996), J. Immunol. ethods 202:163; Cragg, M.S. et al. (2003) ¡Blood 101:1045-1052; Cragg, M.S. y M.J. Glennie, (2004)? |Blood 103:2738-2743) . Determinaciones de enlace de FcRn< !y de despeje/vida media in vivo pueden también ser efectuadas utilizando métodos conocidos en el arte (Petkova, S.Bi; <_lt al. i (2006) Int'l. Immunol. 18 ( 12 ) : 1759-1769 ) .

Los anticuerpos con funciones efectoras reducidas incluyen aquellos con sustitución de uno o más residubs de región de Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (US 6737056) . Tales mutantes de Fe incluyen mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el llamado mutante de Fe "DANA" con sustitución de residuos 265 y 297 a alaniria (US 7332581) .

Ciertas variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR son descritos. (US 6737056; WO 2004/056312; Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 9(2) : 6591-6604) ., j En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprende una región de Fe con una o más sustituciones de aminoácido que mejoran ADCC, por ejemplo, en posiciones 298, 333 y/o 334 de la región de de residuos de EU) .

En algunas modalidades se hacen al la región de Fe que dan como resultado ya sea enlace de' Glq y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) alteradaj (esto es, ya sea mejorada o disminuida) , por ejemplo, cómo se describe en la patente estadounidense 6, 194, 551, WO' '99/51642 e Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164: 4178-4184. : ¡ Anticuerpos con vidas medias incrementadas y enlace mejorado al receptor de Fe neonatal (FcRn), que es responsable por la transferencia de IgG (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) Immunol. 24:249 (1994)), son descritos en US20O5/O0lj4934Al (Hinton et al.) . Aquellos anticuerpos comprenden un región de Fe con una o más sustituciones en la misma que mejoran el para crear un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) , ;¦ también referido como inmunoconj ugado, como se describe además' ! en la presente. En ciertas modalidades, cualquiera de uno q ¡más de los siguientes residuos pueden ser sustituidos con cisteína: V205 (numeración de Kabat) de la cadena ligera; , A118 (numeración de EU) de la cadena pesada y S400 (numeración de EU) de la región de Fe de cadena pesada. Anticuerpos cisteina-diseñados pueden ser generados como se desc ibe por ejemplo en la patente estadounidense 7521541. 1 Derivados de anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo provisto jen la presente porciones arte y están disponibles fácilmente. Las porciones apropiadas para derivación del anticuerpo incluyen pero nb ¡ están limitadas a polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen fpéro no están limitados a polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dfextrana, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero¦ ' de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya ! sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrana o poli (n-vinil pirrolidona) polietilenglicol, homopolímérps de propilenglicol , co-polímeros óxido de propileno/ó ido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glióerol) , alcohol polivinílico y mezclas de los misirtos. El I polietilenglicol propionaldehido puede tener ventajas ¡en la manufactura debido a su estabilidad en agua. El número de polímeros anexados al anticuerpo puede variar y si más de un polímero es anexado, pueden ser las mismas o moléculas diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para derivación puede ser determinado en base a i consideraciones en las que se incluye per no están limitadas a las funciones o propiedades particulares del anticuerpo a ser mejorada, si el derivado de anticuerpo será usado eln una terapia bajo condiciones definidas, etc. ! En otra modalidad, se proveen conjugados de un anticuerpo y una porción no proteinácea que puedan ser calentados selectivamente mediante exposición a radiación. En una modalidad, la porción no proteinácea es un nanotübo de carbono (Kam et al. (2005) Proc. Nati. Acad. Scij. USA 102:11600-11605). La radiación puede ser de cúáljquiera longitud de onda e incluye pero no está limitada a lóhglitudes de onda que no dañan las células ordinarias, perjo que calientan la porción no proteinácea a una temperatura a la cual las células próximas a la porción de anticüérpo-no proteinácea son asesinadas.

El término "región hipervariable" o "HVR", domo se usa en la presente, se refiere a cada una de las regiones ' de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles definidos estructuralmente ("bucles hipervariables") . En general, los anticuerpos de 4 cadenas naturales comprenden seis HVR: tres en la VH (HÍ, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . Las HVR comprenden en general residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones que determinan la complementarjiedad" (CDR) , las últimas son de variabilidad de secuencia más alta y/o están involucradas en reconocimiento del antigeno, ¡Bucles hipervariables ejemplares se presentan en los residuos de aminoácidos 26-32 (Ll), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) (Chothia y Lesk, (1987) ¦ Biol. 196:901-917) . CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, i CDR-Hl, CDR-H2 y CDR-H3) se presentan en los residuos de aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de Hl, 50-65 de H2 y 95-102 de H3 (Kabat et al., Sequences de Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (jl 991) .

Con la excepción de CR1 en VH, la CDR comprenden en general i los residuos de aminoácido que forman los : , bucles hipervariables. Las CDR también comprenden "residuos que determinan la especificidad" o "SDR" que son los residuos que se ponen en contacto con el antigeno. Los SDR ; están contenidos dentro de regiones de las CDR llamadas abréviadas-CDR o a-CDR. a-CDR ejemplares (a-CDR-Ll, a-CDR-L2, a;-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2 y a-CDR-H3) se presentan en los residuos de 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de ??,? 50-58 de H2 y 95-102 de H3 (Almagro y Fransson, (2008)' Front. Biosci. 13:1619-1633). A no ser que se indique dej otra manera, los residuos de HVR y otros residuos en el -dominio variable (por ejemplo, residuos de FR) son numerados |en la presente de acuerdo con Kabat et al., supra.

Una anticuerpo "aislado" es uno que ha sido separado de un componente de su medio ambiente natural. En algunas modalidades, un anticuerpo es purificado a mayor de 95% jo 99% de pureza, tal como se determina por ejemplo mediante métodos electroforáticos (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográficos | (por ejemplo, HPLC de intercambio iónico o HPLC de fase inversa) . Para una revisión de métodos para determinación de la ureza de anticuerpo, véase, por ejemplo Flatman et al. (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población, son idénticos y/o se enlazan al mismo epitrope, exceptó por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones que se presentan naturalmente o que surgen : durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpo policlonal que comúnmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopes) ,| cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal es dirigido contra un solo determinante antígeno. Asi, el modificador "monoclonal" indica el del anticuerpo por ser obtenido de una pobjación I sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretara que requiere la producción del anticuerpo por algún: rhétodo particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonaleá |a ser usados de acuerdo con la presente invención puédeij ser elaborados mediante una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitado al método de hibridoma, métodos de ADN recombinantes, métodos de despliegue de fago y método que utilizan animales transgénicos que contienen todos o parte de los sitios de inmunoglobulina humanos, tales métodos y jotros métodos ejemplares para fabricar anticuerpos monoclonales son descritos en la presente.

Un "anticuerpo descubierto" se refiere a un anticuerpo que no es conjugado a una porción heteróloga (por egémplo, una porción citotóxica) o radio marcador. El anticuerpo descubierto puede estar presente en una formulación ; : i farmacéutica. i "Anticuerpos naturales" se refieren a moléculas de inmunoglobulina que se presentan naturalmente con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos de IgG naturales son glicoproteinas heterotetraméricas de alrededor de 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas jy dos cadenas pesadas idénticas que están disulfuro-enlazadas . De termino N a término C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguida por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) . Similarmente, de terminó N a término C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también llamada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede ser asignada a uno de dos tipos llamados kappa ( ) y lambdá (?) , en base a la secuencia de aminoácidos de su domino consijante.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipépt dos de referencia es definido como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácidos en la secuencia de polipéptidos de referencia, después de alinear las secuencias e introducir separaciones o espacio, si es necesario, para obtener:, él por ciento máximo de identidad de secuencia y no considerando ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación por propósitos de determinar el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede ser obtenida de varias maneras que están dentro de la habilidad I de aquellos experimentados en el arte, por ejemplo utilizando elementos de programación de computadora disponibles públicamente tales como elementos de programación BLAST, I BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos experimentados en el arte pueden determinar parámetros apropiadosj para alineación de secuencias, incluyendo cualesquier algoritmos necesarios para obtener la alineación máxima sobre la ¡plena longitud de las secuencias que son comparadas. Por propósitos de la presente, sin embargo, los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos son generados utilizando el programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2. El autor del programa de computadora de comparación de secuencias ALIGN-2 es Genentech, Inc <.¦ I \y el código fuente ha sido presentado con documentación ¡ del usuario en la oficina de derechos reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde ¡está registrado bajo el número de registro de derechos reservados de los Estados Unidos de América TXU510087. El programa ALIGN-2 esta disponible públicamente de Genentech, ??a?,! Sur de San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para uso" en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia son establecidos por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 ¦ i i comparaciones de secuencia de aminoácidos, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuehc'ia de aminoácidos dada A a, con o contra una secuencia de I aminoácido B dada (que puede ser denominada alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de secuenc'ia de aminoácidos con o contra una secuencia de aminoácidos da'da B) es calculado como sigue: 100 veces la fracción X/Y, en 'donde X es el número de residuos de aminoácidos puntuados ¡ como coincidencias idénticas por el programa de alineación de ii secuencias ALIGN-2 en que la alineación del programa dé A y B, y en donde Y es el número total de residuo Is de aminoácidos en B. Se apreciara que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A no ser que se -afirme especifica de otra manera, todos los valores de por cienio de identidad de secuencia de aminoácidos usados en la presente son obtenidos como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2 ¿i El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera' de anticuerpo que esta involucrada en el enlace del anticuerpo al antigeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo natural en general tienen estructuras similares, cada dominio comprende cuatro regiones de estructura conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR) . Véase, por ejemplo, | Kindt i et al. Kuby Immunology, 6a. ed. , W.H. Freeman y Co . página 91 (2007) . Un solo dominio de VH o VL para conferir especificidad de enlace los anticuerpos gue se enlazan a un pueden ser aislados utilizando un dominio de VH o VL 'de un anticuerpo gue se enlaza al antigeno para seleccionar una biblioteca de dominios de VL o VH complementarios, respectivamente (Portolano et al. (1993) J. Immunol. 150:880- 887; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628). I \ "Antigenos tumor-asociados" (TAA) son conocidos en el i arte y pueden ser preparados para uso en la generación de anticuerpos humanos o humanizados utilizando métodos e información que son bien conocidos en el arte. En intentos 1 por descubrir objetivos celulares efectivos para diagnósticos y terapia de cáncer, los investigadores han buscado identificar polipéptidos de transmembrana o de otra manera polipéptidos tumor-asociados gue son exprésados específicamente sobre la superficie de uno o más' ¡tipos particulares de células de cáncer, en comparación con ,|ma o más células no cancerosas normales. Frecuentemente, tales polipéptidos tumor-asociados son expresados, ! más i abundantemente sobre la superficie de las células de cáncer, .1 en comparación con sobre la superficie de las células no cancerosas. La identificación de tales polipéptidós de antigeno de superficie celular asociados al surgimiento a la habilidad para apuntar células de cáncer para destrucción vía terapias a baLe de anticuerpo. j Ejemplos de TAA incluyen pero no están limitados 'a TAA (l)-(36) enlistados a continuación. Por conveniencia , la i información concerniente con estos antígenos, todos1 los cuales son conocidos en el arte, es enlistada a ón e incluye nombres, nombres alternativos, números de GenBank y referencia (s) primaria (s), enseguida dé las convenciones de identificación de secuencia de ácido nüóleico y proteína del centro nacional para información de biotecnología (NCBI). Secuencias de ácido nucleico y proteínas correspondientes a TAA (l)-(36) están disponibles en base de datos publicas tales como GenBank. Los antígenos tumor-asociados apuntados por anticuerpos incluyen todaá las variantes de secuencias de aminoácidos e isoformas que ppseen por lo menos alrededor de 70%, 80%, 85%, 90% o ;9$!% de identidad de secuencia en relación con las secuencias identificadas en la referencias citadas o que xhiben sustancialmente las mismas propiedades biológicas o características como un TAA que tiene una secuéncia encontrada en las referencias citadas. Por ejemplo, un TAA que tiene una secuencia variante en general es apto de enlazarse específicamente a un anticuerpo que se énlaza específicamente al TAA con la secuencia enlistada. Las secuencias y revelación en la referencia citada específicamente en la presente son incorporadas expresamente por referencia.

Antígenos tumor-asociados (l)-(36): (1) BMPR1B (receptor tipo IB de proteína morfo genética de hueso, número de acceso Genbank NM_001203) ten Dijke,P., et al Science 264 ( 5155) : 101-104 (1994), Oncogerle 14 (11) : 1377-1382 (1997)); WO2004/063362 (reivindicación 2); WO2003/042661 (reivindicación 12); US2003/134790-Al (.páginas 38-39); WO2002/102235 (reivindicación 13; página 296) ; WO2003/055443 (páginas 91-92); WO2002/99122 (ejempl¡o 2; páginas 528-530); O2003/029421 (reivindicación ' 6) ; WO2003/024392 (reivindicación 2; figura 112); WO200;2)98358 (reivindicación 1; página 183); WO2002/54940 (páginas; 100-101); WO2002/59377 (páginas 349-350); WO2002^30268 (reivindicación 27; página 376); O2001/48204 (ejemplo; figura 4); NP_001194 receptor de proteína morfo genético de hueso tipo IB/pid=NP_001194.1. Referencias cruzadas: MIM: 603248; NP_001194.1; AY065994 \ (2) E16 (LATI, SLC7A5, número de acceso Genbank i 1 r ¡ NM_003486) Biochem. Biophys . Res. 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U.S. A. 96 (25) : 14523-14528 ) ; WO200 /065577 (reivindicación 6); WO2004/027049 (figura 1L) ; EEJ1394274 (ejemplo 11); WO2004/016225 (reivindicación 2); WO2003/C42661 (reivindicación 12); US2003/157089 (ejemplo 5); US2003/Í85830 (ejemplo 5); US2003/064397 (figura 2); O2002/89747 ('ejemplo 5; páginas 618-619); WO2003/022995 (ejemplo 9; figüráj 13A, ejemplo 53; página 173, ejemplo 2; figura 2A) ; NP 036581 seis transmerabrana antigeno epitelial de la próstata; referencias cruzadas: MIM: 604415; NP_036581.1; NM_012449_1 j (4) 0772P (CA125, MUC16, número de acceso Genbank AF361486); J. Biol. Chem. 276 (29) : 27371-27375 (2^01) ) ; I WO2004/ 04 5553 (reivindicación 14); WO2002Í/92836 (reivindicación 6; figura 12); WO2002/83866 (reivindicación 15; páginas 116-121); US2003/124140 (ejemplo 16); reférencias cruzadas: GI:34501467; AAK74120. 3 ; AF361486_1 i (5) PF ( PF, MSLN, SMR, factor de potenciación de cariocito, mesotelina, número de acceso Genbank NM_j_005823) Yamaguchi, N . , et al Biol. Chem. 269 (2), 805-808 , (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 96 ( 20 ) : 11531-11536 (1999), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 93 (1) :136-140 (1996), J . ¡Biol. 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Genet. 49 (3) : 555-565 (1991)); US2003/224411 (reivindicación 1); WO2003/0830 1 (ejemplo 1); WO2003/034984 (reivindicación 12); WO2002/88170 (reivindicación 2; páginas 52-53); WO2003 024392 (reivindicación 2; figura 58); WO2002/16413 (reivindicación ; ; i í I 1; páginas 94-95, 105); WO2002/22808 (reivindicación 2; i figura 1); US5854399 (ejemplo 2; Col 17-18); US5|792616 (figura 2); referencias cruzadas: IM: 187395; NP_003¡203.1 ; NM_003212_1 í (14) CD21 (CR2 (receptor 2 de complemento) cJ C3DR I (receptor de virus de C3d/virus de Epstein Barr) o Hsi.73792 número de acceso Genbank M26004); Fujisaku et al (1989) J. Biol. Chem. 264 ( ) : 2118-2125) ; Weis J.J., et al J. Eip' Med. 167, 1047-1066, 1988; Moore M. , et al Proc. Nati. Acádi Sci. U.S. A. 84, 9194-9198, 1987; Barel . , et al Mol. Immuríoí. 35, 1025-1031, 1998; Weis J.J., et al Proc. Nati. Acád.l Sci.

U.S. A. 83, 5639-5643, 1986; Sinha S.K., et al (19 ) J.

Immunol. 150, 5311-5320; O200 /0 5520 (ejemplo 4); US2004/005538 (ejemplo 1); O2003/062401 (reivindicación 9) ; WO2004/045520 (ejemplo 4) ; WO91/02536 (figura 9.1†9.9); WO2004/020595 (reivindicación 1); acceso: P20023; QÍ3866; Q14212; E BL; M26004; AAA35786.1. :: (15) CD79b (CD79B, ??79ß, IGb ( inmunoglobulina-asóciado beta), B29, número de acceso Genbank NM_000626 o 11038674); Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. (2003) 100 (7 ) : 4126-4131, 'Blood (2002) 100 (9) : 3068-3076, Muller et al (1992) Éuij. J.

Immunol. 22 (6) : 1621-1625) ; O2004/016225 (reivindicación 2, figura 140); O2003/087768 , US2004/101874 (reivindicación 1, página 102); WO2003/062401 (reivindicación 9); WO20Ó2/78524 (ejemplo 2); US2002/150573 (reivindicación 5, página, 15); US5644033; WO2003/048202 (reivindicación 1, página 306 y 309); WO 99/58658, US6534482 (reivindicación 13, 'figura 17A/B); WO2000/55351 (reivindicación 11, páginas Í145- 146) ; referencias cruzadas: MIM: 147245; NP_000617.1; NM_000626_1 (16) FcRH2 ( IFGP4 , IRTA4, SPAP1A (proteina la de afianzador de fosfato que contiene dominio SH2), SPAP1B, SPAP1C, número de acceso Genbank NM_030764, AY358130) ; Genome Res. 13 (10) :2265-2270 (2003), Immunogenetics 54 (f):87-95 (2002), Blood 99 ( 8 ): 2662-2669 (2002), Proc. Nati. Acád. Sci. U.S. A. 98 (17) : 9772-9777 (2001), Xu, M.J., et al (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 280 (3):768-775; WO200 /016225 i (reivindicación 2); WO2003/077836; WO2001/38490 (reivindicación 5; figura 18D-1-18D-2 ) ; WO20037097803 (reivindicación 12); WO2003/089624 (reivindicación ' 25); referencias cruzadas: MIM : 606509; NP_110391.2; M_03076 J_1 (17) HER2 (ErbB2, número de acceso Genbank M1Í730) ; Coussens L. , et al Science (1985) 230 (4730) : 1132-1139) ; Yamamoto T., et al Nature 319, 230-234, 1986; Semba K:;, et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82, 6497-6501, 1985; .¡Swiercz J.M., et al J. Cell Biol. 165, 869-880, 2004; Kuhns J\J., et al J. Biol. 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EMBL; M11761; AAA35808.1 ! j (18) NCA (CEACAM6, número de acceso Genbank MÍ8728); Barnett T., et al Genomics 3, 59-66, 1988; Tawaragi Y.1, ét al Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 89-96, 1 R.L., et al Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 2002; WO2004/063709; EP1439393 (reivindicación ; 7); WO2004/044178 (ejemplo 4); WO2004/031238 ; O2003/042661 (reivindicación 12); WO2002/78524 (ejemplo 2); O2002/8,6443 (reivindicación 27; página 427); WO2002/60317 (reivindicación 2); acceso: P40199; Q14920; EMBL; M29541; AAA59915.1. ; : EMBL; M18728 .! (19) MDP (DPEP1, número de acceso Genbank BC017023) ; ¦ ¦ i Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 99 (26) : 16899-16903 (2,002)); WO2003/016475 (reivindicación 1); WO2002/64798 j (reivindicación 33; páginas 85-87); JP05003790 (figura] 6-8); I W099/46284 (figura 9); referencias cruzadas: MIM 179780; AAH17023.1; BC017023_1 ! ! (20) IL20Ra (IL20Ra, ZCYTOR7 , número de acceso Genbank AF184971); Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Mungall A.J., et al Nature 425, 805-811, 2003; Blumbejrg H., et al Cell 104, 9-19, 2001; Duraoutier L., et al J. ímmunol. 167, 3545-3549, 2001; Parrish-Novak J. , et al J. Biol. Chem. 277, 47517-47523, 2002; Pletnev S., et al (2003) Biochemistry 42:12617-12624; Sheikh F. , et al (2004) J. Immunól . 172, 2006-2010; EP1394274 (ejemplo 11); US2004/005320 (ejemplo 5); WO2003/029262 (páginas 74-75); O2003/002717 (reivindicación i 2; página 63); WO2002/22153 (páginas 45-47); US2002/Ó42366 (páginas 20-21); O2001/46261 (páginas 57-59); 6232 (páginas 63-65); 098/37193 (reivindicación 1; 55- 59); acceso: Q9UHF4; Q6UWA9; Q96SH8; EMBL 971; AAF01320.1. (21) Brevican (BCAN, BEHAB, número de acceso ' Genbank AF229053); Gary S.C., et al Gene 256, 139-147, 2000¿ Clark H.F., et al Genome Res. 13, 2265-2270, 2003; Strausberg R . L . , et al Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A. 99, 16899-16903* ¡2002; US2003/186372 (reivindicación 11); US2003 1S86373 (reivindicación 11 ) ; US2003/119131 (reivindicación 1 ; figura 52); US2003/119122 (reivindicación 1; figura,, j 52); US2003/119126 (reivindicación 1); US2003/119121 (reivindicación 1; figura 52) ; US2003/119129 (reivindicación 1); US2003/119130 (reivindicación 1); US2003/119128 (reivindicación 1; figura 52) ; US2003/119125 (reivindicación 1); O2003/016475 (reivindicación 1); WO2002/02634 (reivindicación 1) (22) EphB2R (DRT, ERK, Hek5, EPHT3, Tyro5, númJro de acceso Genbank NM_004442) ; Chan,J. y Watt, V.M., Oncogene 6 (6), 1057-1061 (1991) Oncogene 10 (5) :897-905 (1995)e, ' Annu. Rev. Neurosci. 21:309-345 (1998), Int. Rev. 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Exp. Med. 173¡: 137-146; O2003/072036 (reivindicación 1; figura 1); referencias cruzadas: MI :107266; NP_001762.1; NM_001771_1 ¦ I (28) CD79a (CD79A, CD79 , inmunoglobulina-asociadá alfa, ¦ i una proteina especifica de célula B que int ractúa covalentemente con Ig beta (CD79B) y forma un complejq sobre la superficie con moléculas de Ig M, transduce una; señal involucrada en diferenciación de célula B) , pl : 4.84,| MW: 25028 TM: 2 [P] gen de cromosoma: 19ql3.2, número de 'acceso Genbank NP_001774.10 ) ; WO2003/088808 , US2003/0228319; WO2003/062401 (reivindicación 9); ÜS2002/150573 (reivindicación 4, páginas 13-14); W099/58658 (reivindicación 13, figura 16); WO92/07574 (figura 1); US5644033; Ha ¡ et al (1992) J. Immunol. 148 (5) : 1526-1531; Müller et al (1992!) Eur. i J. Immunol. 22:1621-1625; Hashimoto et al ¡(1994) Immunogenetics 40 ( 4 ) : 287-295 ; Preud'homme et al (1992) j Clin. Exp. Immunol. 90 (1) : 141-146; Yu et al (1992) J. 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(30) HLA-DOB (subunidad beta de molécula de clase II de MHC (antigeno de Ig) que se enlaza a péptidos y los presenta I a linfocitos T CD4+) ; 273 aa, pl: 6.56, MW: 30820.TM: ¡ 1 [P] gen de cromosoma: 6p21.3, número de acceso 1 Génbank i NP_002111.1) ; Tonnelle et al (1985) EMBO J. 4 ( 11) : 28391-2847 ; Jonsson et al (1989) Immunogenetics 29 ( 6) : 411-413; Beckj et al I (1992) J. Mol. Biol. 228:433-441; Strausberg et al !(2002) Proc. Nati. Acad. Sci USA 99:16899-16903; Servenius et al (1987) J. Biol. Chem. 262:8759-8766; Beck et al (199,6) J.

Mol. Biol. 255:1-13; Naruse et al (2002) Tissue Antigens I 59:512-519; W099/58658 (reivindicación 13, figura i 15); US6153408 (Col 35-38); US5976551 (col 168-170); US6011146 (col 145-146); Kasahara et al (1989) Immunogenetics 30 (1]) : 66-68; Larhammar et al (1985) J. Biol. Chem. 260 ( 26 ) : 14111-14119 (31) P2X5 (canal 5 de ion ligando-recortado de P2X de receptor purinergico, un canal de ion recortado por ATP extracelular , puede estar involucrado en transmisión sináptica y neurogenésis, la deficiencia puede contribuir a la patofisiología de inestabilidad detrusror idiopático) '; 422 aa) , pl: 7.63, MW: 47206 TM: 1 [P] gen de cromosoma: 17pl3.3, número de acceso Genbank NP_002552.2 ) ; Le::et al (1997) FEBS Lett . 18 ( 1-2 ) : 195-199; WO2004/047749; WO2003/072035 (reivindicación 10); Touchman et al (2000) Genome Res. 10:165-173; WO2002/22660 (reivindicación 20); WO2003/093444 (reivindicación 1); WO2003 087768 (reivindicación 1); O2003/029277 (página 82) ' ; i (32) CD72 (antígeno de diferenciación de célula É, GD72, ' ¦ i Lyb-2); 359 aa, pl : 8.66, W: 40225, TM: 1 [P] gen de cromosoma: 9pl3.3, número de acceso Genbank NP_0017|73.1 ) ; WO2004042346 (reivindicación 65); WO2003/026 93 (páginas 51-52, 57-58); O2000/75655 (páginas 105-106); Von Hoegenjet al (1990) J. Immunol. 144 (12 ): 4870-4877; Strausberg et al ¡(2002 ) Proc. Nati. Acad. Sci USA 99:16899-16903. ' (33) LY64 (antigeno 64 de linfocito (RP105) , proteina de membrana tipo I de la familia de repetición rica en, léucina (LRR) , regula la activación de célula B y apoptosis dé célula B, la prueba de función esta asociada con actividad de enfermedad incrementada en pacientes con lupus eritematoso sistémico) ; 661 aa, pl : 6.20, MW : 74147 TM: 1 [P] gen de ! ' i cromosoma: 5ql2, número de acceso Genbank NP_005573.1 ) ; US2002/193567; WO97/07198 (reivindicación 11, páginas, 39-42 ) ; iura et al (1996) Genomics 38 ( 3 ) : 299-304 ; Miura et al (1998) Blood 92:2815-2822; O2003/083047 ; W097/44452 ( reivindicación 8, páginas 57-61); WO2000/12130 (páginas 24-26) "; ' '!' j (34) FcRHl (proteina 1 semejante a receptor de Fe, un receptor supuesto para el dominio de Fe de inmnoglobüi;irja que contiene dominios semejantes a Ig tipo C2 e ITAM, puede ¡tener un papel en la diferenciación de B-linfocito) ; 429 áai, pl : 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P] gen de cromosoma: Iq21-lq22, número de acceso Genbank NP_443170.1) ; WO2003/077836; WO2001/38490 (reivindicación 6, figura 18E-1-18-E-2 ),; Davis et al (2001) Proc. Nati. Acad. Sci USA 98 ( 17 ): 977.2^9777 ; O2003/089624 (reivindicación 8); EP1347046 (reivindicación 1); O2003/089624 (reivindicación 7) 1 i (35) IRTA2 (FcRH5, translocación de superfamilia de inmnoglobulina asociada 2, un inmunoreceptor supuestjo con papeles posibles en desarrollo de célula B y linfoma génesis, desregulación del gen mediante translocación ocurre en algunas malignidades de célula B) ; 977 aa, pl: 6 . 88 ', MW: 1064 68 , TM: 1 [P] gen de cromosoma: lq21, número de acceso Genbank Human :AF3 3662, AF343663, AF343664, AF343665, AF369794, AF397453, AK090423, AK090475, AL834187, AY358085; Mouse:AK089756, AY158090, AY506558; NP_112 .1 ; WO2003/024392 (reivindicación 2, figura 97); Nakayama al (2000) Biochem. Biophys. Res. 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Oct 15; Los anticuerpos pueden ser producidos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo como se desjcribe en US 4816567. En una modalidad, se provee un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo descrito en la presiente. Tal ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende la VL y/o una secuencik de I aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo) . En1 una modalidad adicional, uno o más vectores (por ejemplo, i vectores de expresión) que comprenden tal ácido nucleico son provistos. En una modalidad adicional, se provee una :célula huésped que comprende tal ácido nucleico. En una dé1', tales modalidades, una célula huésped comprende (por ejemplo,, ha sido transformada con) : (1) un vector que comprende un» ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende la VH del anticuerpo. En una modalidad, · la célula huésped es eucariontica , por ejemplo una célula de ovario de hámster chino (CHO) ó 'célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20) . Én una modalidad, se provee un método para fabricar un anticuerpo, i en donde el método comprende cultivar una célula huéáped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo como se provee anteriormente, bajo condiciones apropiadas "para la expresión del anticuerpo y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo dé célula huésped) . ¡ Para producción recombinante de un anticuerpo, él \ ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ejemplo, como se describe anteriormente, es aislado e insertado a urtó 'o más vectores para clonación y/o expresión adicional en una célula i huésped. Tal ácido nucleico puede ser aislado y secuenciado fácilmente utilizando procedimientos convencionales ! (por ejemplo, al usar sondas de oligonucleótidos que son á'ptlos de enlazarse específicamente a genes que codifican las ; ;c denas pesadas y ligeras del anticuerpo) . ! Células huésped apropiadas para clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpo incluyen células procariontxcas o eucanonticas descritas en la presente. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos en bacterias, en particular cuando la glicosilación y función efectota I de Fe no son necesarias. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase, por ejemplo patentes estadounidenses 5648237; 5789199; 5840523; Charlton, Methods I in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, (2003), pp. 245-254, que describen la expresión 1 de fragmentos de anticuerpo en E. coli) . Después ele la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta de célula bacteriana en una fracción soluble y puede, ser purificada adicionalmente . | Además de procariontes, microbios eucarion icos ¡tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes de i clonación o expresión apropiados para vectores que codifican anticuerpo, incluyendo hongos y cepas de levadura eri donde las rutas de glicosilación han sido "humanizadas", dando! como resultado la producción de un anticuerpo con un pat|rón de glicosilación parcial o plenamente humano (Gerngross , ' (2004 ) Nat. Biotech. 22 : 1409-1414; Li et al. (2006) Nat . Biotech. 24:210-215). [ Células huésped apropiadas para la expresión! de anticuerpo glicosilado son también derivadas de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas y células de insectos. Numerosas cepas baculovirales ha,ñ isido identificadas que pueden ser usadas en conjunción con células de insectos, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda.

También se pueden utilizar cultivos de de plantas como huéspedes (US 5959177; US 6040498; 8; US 7125978; US 6417429, que describen la tecnología de PLANTIBODIES para producir anticuerpos en plantas transgénicas ) . ! . ¡ También se pueden usar células de vertebrados . como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares mamíferas aptas para crecer en suspensión pueden ser útiles ejemplos de líneas celulares huéspedes mamíferas útiles son línea de CV1 de mono transformada por SV40 (COS-7); l ;íneia de i riñon embriónico humano (células 293 o 293 como se describe, . i por ejemplo en Graham et al. (1977, J. Gen Virol. 36:59); 1 células de riñon de hámster bebe ( BHK) ; células de sertoli de ratón (células TM4 como se describe, por ejemplo en Mather, (1980) Biol . Reprod. 23:243-251); células de riñon dé Jmono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERCH76) ; células de carcinoma cervical humano (HELA) ; células de; riñon canino (MDCK; células de hígado de rata de búfalo ( BRL,'3A); células (Hep G2) como se N.Y. Acad. Sci . 383:44-68; células MRC 5 y células FS4.

I Otras líneas celulares huésped mamíferas útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células i DHFR-CHO (Urlaub et al. (1980) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 77:4216) y líneas de célula de mieloma tales como YO, j SO y I Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas de células huésped mamíferas apropiadas para producción de anticuerpo/ yéase, por ejemplo, Yazaki y u, Methods in Molecular BiologyJ Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp., 255-268 (2003). I ' Análisis ~:' anticuerpos pueden ser identificados, seleccionados o caracterizados en cuanto a sus propiedades físicas y/o actividades biológicas mediante varios análisis en el arte. En un aspecto, un anticuerpo de la invención es probado en cuanto a su actividad de enlace de antígéfto, por ejemplo mediante métodos conocidos tales como ELISA, ; estern I blot, etc. En otro aspecto, se pueden usar análisis de competencia para identificar un anticuerpo que compite con otro anticuerpo conocido por el enlace al antígénó!. En ciertas modalidades, tal anticuerpo competente se enlaza al mismo epítope (por ejemplo, un epítope lineal o conformacional ) que esta enlazado por el anticuerpo conocido.

Métodos ejemplares detallados para el mapeo de un epítope al cual un anticuerpo se enlaza son provistos en Morris';¦ (1996) " ,¡ "Epitope Mapping Protocols," in ethods in Molecular Biólogy, Vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ) . 1 En un análisis de competencia ejemplar, el antigeno inmovilizado es incubado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se enlaza al antigenol (por ejemplo, HER2 o CD20) y un segundo anticuerpo sin marcar que es probado en cuanto a su habilidad para competir ' cpn el primer anticuerpo por el enlace al antigeno. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como testigo, el antigeno inmovilizado es incubado primer anticuerpo al antigeno, el anticuerpo sin enlazar en exceso es removido y la cantidad de marcador asociada cón el antigeno inmovilizado es medida. Si la cantidad de marcador asociado con el antigeno inmovilizado es sustancia;lmente reducida en la muestra de prueba en relación con la muestra testigo, entonces esto indica que el segundo anticuerpo ¡está compitiendo con el primer anticuerpo por el enlace! al antigeno. Véase, Harlow y Lañe (1988) Antibodie.s :· A ; ' i Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory1,. pold i Spring Harbor, NY) . ! En un aspecto, se proveen análisis para identificar anticuerpos de los mismos que tienen actividad biológica J La actividad biológica puede incluir, por ejemplo inhibición de tumor. j En ciertas modalidades, los anticuerpos de los métodos ¦ ¦ I de la invención son útiles para detectar la presencia jde un antigeno en una muestra biológica. El término "detectar'' como se usa en la presente, abarca detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas modalidades, una muestra biológica comprende sangre, plasma, suero, células, orina, vitreo, lágrimas o tejido. En ciertas modalidades, el ; " método comprende poner en contacto la muestra biológica con anticuerpo como se describe en la presente bajo cond'icjiones permisivas para el enlace del anticuerpo al antigeno y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo ¡y el i antigeno. Tal método puede ser un método in vitro o un método i in vivo. En una modalidad, se usa un anticuerpo 'para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo, por ejemplo en donde la proteina de antigeno expresada1 es un i biomarcador para selección de pacientes. Alteraciones ejemplares que pueden ser diagnosticadas utilizando un anticuerpo de la invención incluyen cáncer y alteraciones inmunes . : " i Los anticuerpos marcados y conjugados son utilizados en ciertas modalidades de los métodos de la invención. Marcadores incluyen pero no están limitados a marcadores o porciones que son detectados directamente (tales ; como i marcadores fluorescentes, cromofóricos , densos de eléct'rones, quimioluminiscentes y radioactivos), también como porciones tales como enzimas o ligandos que son deté'ctados indirectamente, por ejemplo por medio de una reacción enzimática o interacción molecular. Marcadores ejemplares incluyen pero no están limitados a radioisótopos ?P> 14C, 125I, 3H y 131I, fluoroforos tales como quelatos de - tierras raras o fluoresceina y sus derivados, rodamina > y sus derivados, dansilo, umbeliferona, lucerifasa, por 'ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente I estadounidense 4737456), ' luciferina, 1 I 2,3-dihidroftalazinedionas , peroxidasa de rábano (HRP) , fósfatasa i alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxid sa de sacárido, por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxidása y 1 í glucosa-6-fosfato deshidrogenase, oxidasas heterociclicas i tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxi asa o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de 1' jspin, marcadores de bacteriófago, radicales libres estables, y los semej antes . '¦ ' Porciones de fármaco que efectúan exterminio celular pueden ser anexadas covalentemente a anticuerpos por m dio de una unidad de enlazar para formar conjugados de anticuerpo-fármaco para el extermino celular apuntado de ' efectos terapéuticos. Una modalidad ejemplar de un compuesto de conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) comprende un anticuerpo (Ab) que apunta a una célula de tumor y una porción de fármaco citotóxica o citostático (D) y una porción de enlazador (L) que anexa Ab a D. El anticuerpo es anexado por medio del uno o más residuos de aminoácido, tales corró lisina y cisteina, por la porción de enlazador (L) a , D; la composición que tiene la formula I: , . : Ab-(L-D)p I :' i en donde p es 1 a alrededor de 20 o de alrededor alrededor de 5. El número de porciones de fármaco que ser conjugadas via una porción de enlazador reactiva a una 1 molécula de anticuerpo puede ser limitado por el número de I residuos de cisteina libres, que son introducidos por los métodos que son descritos en la presente. j La porción de fármaco (D) de un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) incluye cualquier compuesto, porción o grupo que tiene un efecto citotóxica o citostático. Porciones de fármaco pueden impartir sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen pero nó están limitados a enlace de tubulina, enlace o intercalación ;de AND e inhibición de ARN polimerasa, síntesis de proteína y topoisomerasa . Algunos fármacos citotóxicos tienden :: a,, ser inactivos o menos activos cuando son conjugados a anticuerpos grandes o ligandos de receptor de proteína. Porciones de fármaco ejemplares incluyen pero no están limitadas1 a un í maitansinoide, dolastatina, auristatina, calicheamicina, pirrolobenzodiacepina (PBD), PNU-159682, antraciclina, i duocarmicina, alcaloide de la vinca, taxanos, tric tecenos, CC1065, duocarmicina, camptotecina, elinafide1 y estereoisómeros , isósteres, análogos o derivados de los mismos, e incluyendo los derivados de estos fármacos que tener actividad citotóxica. ! Los conjugados de anticuerpo-fármaco (ADO) ! son terapéuticos anti-cáncer apuntados diseñados para reducir ; I toxicidades no especificas e incrementar la eficacia en relación con la terapia de molécula pequeña convencional y quimioterapia de cáncer de anticuerpo. Emplean la habijlidad de apuntamiento poderosa de anticuerpos monoclonaleis i para administrar específicamente terapéuticos de moléculas pequeña o conjugados altamente potentes a una célula de cánceí.1 Para evaluar las propiedades tales como farmacocinética y toxicidad de estos conjugados de anticuerpo-fármaco, es , útil ser aptos de caracterizarlos y cuantificarios de muestras de plasma, orina y otras muestras biológicas. Métodos; ¡para detectar y seleccionar conjugados de anticuerpo-fármaco ¡ mediante captura de membrana de inmunoafinidad (I'AM) y espectrometría de masa han sido revelados (piatiente estadounidense 2005/0232929), incluyendo métodos de captura de afinidad a base de perla (patente estadounidense 2009/0286258) . j MÉTODOS PARA MEDIR ANTICUERPOS HUMANOS Y HUMANIZADOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS j I Un aspecto de la invención es un método a base de LC- MS/ S reproducible, eficiente y económico genérico para la cuantificación de varios terapéuticos de anticuerpo monoclonal humanos y humanizados (MAb) con una estructura de andamio de anticuerpo común en muestras de plasma y tejido de mono cynomolgus y rata y potencialmente otras especies no humanas, de estudios pre-clinicos . La de anticuerpos da péptidos de la región de estructura conservada que son únicos a los anticuerpos terapéuticos humanos o humanizados administrados y no encontrados en protéirías de mono y rata endógenas. 1 La figura 9 muestra el método de LC-MS/MS genérico para cuantificar un anticuerpo terapéutico en plasma/suero: animal utilizando uno o más péptidos de firma de estructura (FSP).

Los métodos de la invención incluyen un procedimiento genérico para cuantificar anticuerpos humanos o humanizados : :; · i que comprende las etapas de: '¦'· ' ? (a) tratar una muestra biológica con una- encima digestiva para formar una muestra de anticuerpo digerida, en donde la muestra de suero o plasma es de un animal ' que ha sido tratado con un anticuerpo humano o humanizado y (b) analizar la muestra de anticuerpo digerida mediante espectrometría de masas para detectar y medi]r la concentración de uno o más péptidos de estructura comunes, en donde los péptidos de estructura comprenden uno o más secuencias seleccionadas de SEQ 1-8. ;.

En una modalidad ejemplar, la enzima digestiva es tripsina. Proteasas alternativas pueden generar péptidos de estructura adicionales además de aquellos que tieneri SEQ ID NO: 1-8. Cualquier enzima específica podría ser usada1, tal como endoproteinasa LysC, endoproteinasa ArgC, V8 y endoproteinasa GluC. Se pueden usar específicas tales como papaína. Los péptidos generados para cuantificación pueden tener diferentes secuencias <¾üé con tripsina, pero el concepto de usar un péptido de estructura genérica presente en humano y no presente en anticuerpos de animal es el mismo. ¡ j En otra modalidad, el método comprende además poner en contacto la muestra de anticuerpo digerida con un rriédio de captura de afinidad o limpieza de muestra de extracdipn de fase solida (SPE) y eluir una muestra de anticuerpo digerida enriquecida. ! En otra modalidad, el método incluye capturaj por afinidad del anticuerpo que comprende uno o más péptidos de estructura humanos que tienen secuencias seleccionadas de SEQ ID NO: 1-8, seguido por digestión. El método de captura por i afinidad puede ser obtenido mediante ECD (enlace de: antigeno de dominio extra celular) , captura de anti-ID o protéina A o proteina G. | En otra modalidad, la muestra biológica es suero, plasma, tejido o linea celular derivada de un mamífero no humano . , j En una demostración ejemplar del método, el arítibuerpo es anti-HER2 trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech, ;„ Inc.). Otros anticuerpos fueron sometidos a los métodos1 ele la invención. Anticuerpos que han sido dirigidos por tripsina de - 1 plasma no clínico y analizados incluyen anti-MUC16, artti-MSLN (mesotelina) , anti-Steapl, anti-CD20 (2H7 y rituximab):, | anti-HER3 (2C4, pertuzumab) , anti-NRPl, anti-PDLl, antijLRP6, anti-B7-H4, anti-GFRAl 7C9, anti-NRGl y anti-LY6E. ; i En otra modalidad, la muestra de anticuerpo; fue analizada con captura de afinidad por inmunoprecipitación ¡ (IP) mediante proteína A/G perla-soportada, següiída por digestión y análisis en perla. \ PÉPTIDOS DE FIRMA DE ESTRUCTURA ! Las regiones de estructura de anticuerpos humanos son extensamente conservadas. La figura 1 muestra la alineación de secuencia de secuencias de aminoácidos de cadena pesada de I un anticuerpo humano 2H7 o ocrelizumab (SEQ ID NQ: ¡ 11) y cinco anticuerpos anti-CD20 de mono cynomolgus: CynoHC; la D3 1 (SEQ ID NO: 12), CynoHC Ib E5 1 (SEQ ID NO: 13), Cyno1, HC 2a (SEQ ID NO: 14), CynoHC 2b E6 1 (SEQ ID NO: 15), CynoHC ¡3 (SEQ ID NO: 16). Los péptidos de firma de estructura son identificados (FS. 1-8) que son únicos al MAb 2H7 humano (hu 2H7) y no están presentes en la cadena pesada de IgG: de mono cynomolgus cada uno lleva por lo menos una diferencia de ' í aminoácido en las secuencias. En base a la información de secuencia disponible, los péptidos de firma de estructura (FSP1-8) son únicos solamente al anticuerpo humano y no1 a las I variantes de IgG de cynomolgus . Los péptidos de firma de estructura (FS. 1-8) de la tabla 2 están también presentes en IgGl endógena y en algunos casos en IgG2, IgG3 e IgG4. ¡Estos péptidos son también comunes entre otros anticuerpos i terapéuticos humanos o humanizados e IgG humanas. ¡ Tabla 2. Péptidos de firma de estructura de cadena pesada (FS. 1-8) de MAb Hu i 8 péptidos de firma de estructura (FS.) con residuos ; únicos (negritas) a IgG humana. :* < Se uso trastuzumab (HERCEPTIN®, Genentech) qómb un 'i i estándar de referencia modelo y fue proyectado a plasma de mono cynomolgus y rata seguido por dirección de plasma en suero directo con o sin pre-concentración de ;¡SPE o inmunoprecipitación mediante perlas magnéticas de pijoteína A/G y una digestión en perla subsecuente antes del análisis de LC-MS/MS, un intervalo de calibración de trabajo; fue I establecido a 1-1000 ug/ml en ambas matrices de plasma. La especificidad fue también probada y confirmada tahtjo con plasma blanco de testigo negativo y muest proyectadas.

Trastuzumab (HERCEPTIN®, hu Ab4D5-8, Genentech) es una versión de anticuerpo monoclonal dej IgGl I kappa, AND recombinante-derivado humanizado del anticuerpo HER2 murino que se enlaza selectivamente con alta afinidad en i un análisis a base de célula (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de la proteina del receptor 2 del factor de i crecimiento epidérmico humano HER2 (ErbB2) (US 5821337; US 6054297; US 6407213; US 6639055; Coussens L, et al; ( .985) Science 230:1132-9; Slamon DJ, et al (1989) Science 244:707-12) . Trastuzumab contiene regiones de estructura humanas con las regiones que determinan la complementariedad de un anticuerpo murino (4D5) que se enlaza a HER2. Trastuzumab se enlaza al antigeno de HER2 y asi inhibe el crecimierto de células cancerosas. Se ha demostrado tanto en análisis in vitro como en animales, que trastuzumab inhibe ¡ la proliferación de células de tumor humanas que sobre expresan HER2 (Hudziak RM, et al (1989) Mol Cell Biol 9 : 1165-72 ; ,Lewis GD, et al (1993) Cáncer Immunol Immunother; 37:255†63; Baselga J, et al (1998) Cáncer Res. 58:2825-2.831) . i Trastuzumab es un mediador de la citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente, ADCC (Hotaling TE, et al (1996) [abstracto] . Proc. Annual Meeting Am Assoc Cáncer^ Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [abstracto] . Proc Am! Assoc Cáncer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60-70; Yarden Y. and Sliwkowski, M . (2001) Nature Reviews : Molecular Cell Biology, Mácmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137) . HERCEPTIN® fue aprobádo en 1998 para el tratamiento de pacientes con canceres de j pecho mestatáticos que sobre expresan ErbB2 (Baselga et al; (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744) . j i Análogos isótopo-marcados estables (SIL) de FSP1-8 (SEQ introducidos a la muestra antes o después de digestión y función para compensar variaciones que se presentan ; durante el análisis de LC-MS/MS (por ejemplo, cambios en el desempeño del dispositivo de toma de muestras automático, separación de LC y respuestas de MS) . Por ejemplo, una presión marcada por isótopo estable de FSP8 fue preparada en donde la ; l'isina entre fenil alanina (F) y tirosina (Y) fue marcada co,ri:¡13C y N. En base a sus características de MS, FSP8 fue escogido empíricamente debido a sus respuestas de señal mas intensas como el péptido primario para cuantificación . Además,,, .btros i tres péptidos, FSP4, FSP5 y FSP3, fueron monitoreados en cuanto a confirmación cualitativa. Cada uno de estos 'cuatro péptidos podrían ser usados como subrogados para cuantificar el mAb en matrices biológicas de animales. Sus IS ¿le SIL correspondientes fueron usados en el análisis (tabla 3)'. FSP6 puede ser usado solamente en matrices de animal diferentes del mono cynomolgus puesto que se detecto un fondo de interferencia de co-elución en el plasma de mono cynómólgus . Se observó una ionización relativamente más débil para.FSPl, I Tabla 3. Estándares internos marcados con isótopo estables correspondientes i *denota marcación de isotipo estable que contiene ; i aminoácidos ¡ C denota residuo de cisteina que ha sido alquilado con yodo acetamida. ! I Anticuerpos humanos y humanizados La figura 2 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: ¡17) y cadena ligera (SEQ ID NO: 18) de trastuzumab (Herceptin®, Genentech Inc.; rhuMAbHER2 , Anti pl85HER2), un anticuerpo monoclonal humanizado derivado recombinante, número de i registro CAS 180288-69-1. ! La figura 3 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: 11) y cadena ligera (SEQ ID NO: 19) de ocrelizumab, rhuMAb! 2H7, PRO70769, u anticuerpo anti-CD20 humanizado, de registro CAS 637334-45-3. 1 i La figura 4 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: 20) y cadena ligera (SEQ ID NO: 21) de pertuzumab, rhuMAb I2C4, número de registro CAS 380610-27-5. FSP2 , FSP3, FSP8', son identificados como subrayados en la cadena pesada (SÉQ ID NO: 20) . '. : La figura 5 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO:,;2;2) y i cadena ligera (SEQ ID NO: 23) de anti-PDLl, un miembro; de la familia de CD28/CTLA-4 extendida de reguladores de célula T.

FSP2, FSP4, FSP8 son identificados como subrayados en la cadena pesada (SEQ ID NO: 22) . i La figura 6 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO: 24) y cadena ligera (SEQ ID NO: 25) de anti-neuropilina-1 ,> anti- NRP1, MNRP1685A. FSP2, FSP4 , FSP8 son identificados como subrayados en la cadena pesada (SEQ ID. NO: 24). Anti*-N¡RP1 es un anticuerpo monoclonal humano, fago-derivado, recombjinante que apunta específicamente a neuropilina-1 (NRPlj, un receptor de multi-dominio que se sabe que se enlaza >a una variedad de ligandos, incluyendo miembros de la familia de VEGF. Anti-NRPl ha demostrado eficacia en combinación con anti-VEGF en modelos de xenoinjerto de ratón y' fuerte farmacocinética no lineal a través de un amplio intervalo de dosis en especies pre-clínicas . Es actualmente evalúatio en estudios de fase I como un solo agente y en combinación con bevacizumab con o sin paclitaxel. 1 ¡ La figura 7 muestra la cadena pesada (SEQ ID NO1:' 26) y cadena ligera (SEQ ID NO: 27) de anti-MUC16, D Üe4p64A. '. í FSP2, FSP4, FSP8 son identificados como subrayados · e'n la cadena pesada (SEQ ID NO: 26). j La figura 8 la cadena pesada (SEQ ID NO: 28) y, cadena ligera (SEQ ID NO: 19) de rituximab, C2B8, abThera, (Rituxan®, Genentech Inc., Biogen/Idec) . FSP2 , FSP4 FSP8 son identificados como subrayados en la cadena pesada (SEQ ID NO: 28). Rituximab (RITUXAN®, Genentech/Biogen ; · Idee; MABTHERA®, Roche, REDITUX®, CAS Reg. No. 174722-31-;7 )\ es anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico diseñado genéticamente dirigido contra el antígeno de CD20. Rituximab es el anticuerpo llamado "C2B8" en la patente estadounidense 5736137. Rituximab es indicado para el tratamiento de i de célula B (Cartron et al (2002) Blood 99: ,75j4-758; Idusogie et al (2000) J. Immunol . 164: 4178-4184; '.GtiHo-López AJ, et al (1999) Semin Oncol; 26:66-73; US 573¿137).

RITUXAN (patente estadounidense 5677180; pétente estadounidense 5736137) es el anticuerpo monoclortal más ampliamente usado en malignidades hematopoyéticas y1, está establecido en práctica clínica amplia. RITUXAN recibido aprobación por primera vez de la FDA en 1997 para el tratamiento de linfoma no de Hodking (NHL) de célula B 'CD20-positivo, de grado baj o o folicular, o refractario. Fue también aprobado en la Unión el nombre de marca abThera® en junio de 1998. de 2006, rituxan también recibió aprobación de la EDÁ en combinación con metrotexato para reducir signos y síntomas en pacientes adultos con artritis reumatoide modelada a severamente activa que han tenido una respuesta inaprop'iada a una o más terapias de antagonista de TNF. La secuenéia de aminoácidos del anticuerpo rituximab (también designado C2B8) y métodos ejemplares para su producción vía expresión recombinante de células de ovario de hámster chino (CHÓ) son revelados en la patente estadounidense 5736137.

PREPARACION DE MUESTRA La figura 15 muestra una caricatura de la captura ¡de Mab del plasma/suero de animal sobre perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina enlazadas a una zona de captura biotinilada o perla magnética recubierta con proteína I A, G, seguido por aislamiento mediante separación magnética, digestión del anticuerpo capturado y análisis mediañt<3 LC- 1 MS/MS. .. ! La figura 16 muestra modalidades de la perla magnética recubierta con proteínas A, G (parte superior) p|ar,a la captura genérica de anticuerpo y perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina enlazadas a una sonda de captura biotinilada (fondo) para la captura especifica del i anticuerpo. ! I El potencial de inmunoprecipitación para , aislar ;. I eficiente y reproduciblemente el anticuerpo monoclonal objetivo (MAb) con proteína A fue evaluado en dos formatos: (a) proteína A acoplado a perlas magnéticas y (b) protfeína A recubierta sobre una placa de micro título de 96 cavidades. En una prueba preliminar, una placa de micro títuip de proteína A fue demasiado limitada en capacidad en comparación i con perlas magnéticas de proteína A en la captura de la", carga aplicada total de IgG endógenas junto con el Mab objetivo, particularmente de plasma de mono. La digestión sobre -perla utilizando perlas magnéticas de proteína A fue seleccionada para evaluación para aislamiento de FSP tanto de plasma de mono cynomolgus y rata Sprague-Dawley tratada' con I litio/epaina . La digestión de plasma entero seguida por i extracción en fase sólida (SPE) fue también proba,da¡ y se encontró que es menos efectiva para eliminar la interferencia del ruido de fondo. J — S^EPARACI—Ó—N Y AN—ÁLISIS DE MUEST^RAS BIOL—Ó—G—IC—AS ! Se investigaron dos procedimientos para determinar la i especificidad de SPE, sensibilidad de detección y reproducibilidad: (1) digestión de plasma entero/SPE (extracción en fase sólida) y (2) inmunoprecipitación (I|P) · La muestra de plasma de mono (cynomolgus) = 10 lotes cada especie) fue evaluada para la especificidad de lote a lote, efecto de interferencia potenciales y reproducibilidad. Junto con un testigo de plasma blanco, las muestras de plasma blanco fueron fortificadas, esto es "proyectada" con 20 µg/¡ml de trastuzumab. Un conjunto de muestras de trastuzümáb de calibrador que varían de 1-1000 ug/ml de trastuzumab fue preparado en matriz de plasma acumulado y se hizo córrér en paralelo con muestras de plasma de mono y rata individuales.

La figura 12 muestra una curva de calibracián de trastuzumab (utilizando FSP8 como subrogado) proyectado a varias concentraciones de 1-1000 \iq/ml a plasma de mono I cynomolgus de heparina litio preparado mediante el i procedimiento de digestión de plasma entero/SPE. Estándares internos de péptido isótopo estable-marcados (IS) jfueron preparados en acetonitrilo al 20% para elaborar la .solución I de estándar interna de trabajo que contiene! ^-as concentraciones apropiadas. | La figura 14 muestra las etapas para inmunoprecipitación (IP) de anticuerpos monoclonales y generar péptidos dej firma de estructura correspondientes (FSP) en plasma o suero de animal. Los protocolos son definidos en los ejemplos 1-4. ¦ i Muestras de animales fueron preparadas mediante inmunoprecipitación (IP) con perlas paramagnétícá's de proteina A (Millipore) seguido por digestión de tripsina. A i 1 una placa de micro titulo de fondo cónico de 96 cavidades (VWR Scientific) , una alícuota de 25 µ? de plasma o ¡suero diluido [dilución de 1:2 v/v con solución reguladora d i pH de carga (SN1) de 0.1 : 5.0 : 3.0 : 0.2 : 91.7 : 0.1 ; ; ' ¡Tween 20/clorhidrato de trizma (1 M) /cloruro de sodio (5 M)'VEDTA (0.5 M) /agua/BSA, v/v/v/v/v/w] fue colocada, junto con: 1¡25 µ? de solución reguladora de carga. Se agregó una alícuota ;de 25 µ? de perlas magnéticas de proteína A, pre-lavados' { y re-suspendidas en la solución reguladora del pH de carga,! fue agregado a cada cavidad. La mezcla fue luego incúbáda a temperatura ambiente (RT) por 120 minutes bajo ¡iniézcla constante para permitir la captura de mAb. El sobreañádante fue descartado y las perlas fueron lavadas completamente en i solución reguladora del pH de lavado (SN2) de 5.0:3.0:0.2:91.8 de clorhidrato de trizma (1 M) /cloruro de sodio (5 M) /EDTA (0.5 ) /agua, v/v/v/v) . El lavado y i separación magnética fueron efectuados utilizando un , lavador de micro placas (BioTek, VT, Estados Unidos de Amérid 'a)í1, y un imán plano de 96 cavidades (Biotek) , respectivamente. El proceso de lavado/separación podría también ser llevado a cabo con un procesador de partículas magnéticas King Fisher 96 (Thermo Scientific) . ¡ Enseguida de la inmunoprecipitación (IP), una alícuota de 25 µ? de solución de IS de trabajo fue proyectadla! cada cavidad excepto blancos, en donde se agregaron 25' µ? de i acetonitrilo al 20% en lugar de esto. Se agregaron alícuotas de solución RapiGest de 75 µ? (0.05:37.5:10 de polvo RapiGest I /bicarbonato de amonio 50 mM /acetonitrilo, w/v/v) y 1,Q µ? de 0.1 M DTT. La placa fue cubierta por una película de sellado adhesiva (VWR Scientific) y agitada suavemente por aproximadamente 1 minuto, seguida por incubación a 60 ,0G por i 60 minutos. Se agregó un volumen de 25 µ? de ácido lyodo acético (0.1 ) y la placa fue cubierta por una hb a de ¡ aluminio e incubada a temperatura ambiente, i ;¡ por i aproximadamente 20 minutos protegida de la luz. Una alícuota de 10 µ? de solución de tripsina (0.250 mg/ml) fue agregada a cada cavidad y la placa fue subsecuentemente incubada a 37 °C í por aproximadamente 90 minutos. La digestión fue terminada al i agregar 15 µ? de HC1 a 2 M a cada cavidad e incubación de la placa a 37 °C por 30 minutos. Las muestras fueroni luego transferidas mediante Tomtec (CT, Estados Unidos de América) j a una placa de filtro de HTS de multi-tamiz (0.45 µp?, Millipore) colocada encima de una placa de recolección de fondo cónico de 96 cavidades y centrifugadas por 5 minutos a 3000 rpm para recolectar el filtrado. La placa de recolección fue sellada y un volumen de 20 µ? de filtrado fue iñy'ectado directamente sobre LC-MS/MS. ¡ ; í ELISA y LC-MS/MS ! i El análisis ELISA (Figura 19a) y LC-MS/MS (Figura 19b) ; i fueron comparados al medir el anticuerpo total en plasma de 1 rata después de una sola dosis de anticuerpo. La figuría 19a muestra una caricatura del anticuerpo monoclonal ¡ (mAb terapéutico) capturado mediante enlace a un '¡'dominio extracelular inmovilizado (ECD) o anticuerpo policlorial IgG anti-humano y detectado con un anticuerpo policlonal; '. dis IgG anti-humano marcado con peroxidasa de rábano (HRP) , en un análisis de ELISA con detección de sustrato electroquimioluminiscente, colorimétrico o cromofórico .' ¡ La separación cromatográfica liquida se llevó a ¡cabo ya sea mediante un sistema binario de LC serie HP Agilent; 11100 o . ' i un sistema binario Shimadzu LC-10ADvp con una columna de BioSuite C18 PA-A de fase inversa (2.1 x 50 rain, 3 µp?, tóaters) puesto en operación a una velocidad de flujo de 200! µ?/min. La columna fue mantenida a 50 °C por un calentador de, columna (Analytical Sales and Products, NJ, Estados Unidos de ¡ América). La fase móvil consistía de A: ácido fórmico á'l 0.1% en agua y B: ácido fórmico al 0.1% en acetonitrilo/metanol (75:25, v/v) . La condición de gradiente fue mantenida á 5% de B por 0.4 min, aumentada a 40% de B en 3.4 fnínutos, incrementada además a 95% de B en 1 minuto, mantenida, ,95% de B por 0.5 min antes de caerse de regreso a 5% de B én 0.1 ' ? min. Luego fue mantenida a 5% por 0.5 minutos antes de hacerse descender a través de 95% de B en 0.1 min al i ' ! mantenida al nivel por 0.5 min para reducir el acarreo ? potencial. Finalmente, el gradiente fue devuelto a 5%| de B en I 0.1 min y re-equilibrado a 5% de B por 0.9 min. El tiempo de corrida de LC en total fue de 7.5 minutos. Las muestras i ¦ i fueron inyectadas utilizando un dispositivo tomador de I muestras automático CTC HTS PAL (LEAP Technologiés NC, Estados Unidos de América) con un bucle inyector de 20 µ?. El lavado del aparato tomador de muestras automático uno, de fue de acetonitrilo/isopropanol/trifluoroetanol/metanoll/água/-ácido fórmico (60:15:15:5:5:0.2, en volumen) y el lavado 2 fue de agua/acetonitrilo/ácido fórmico (95: 5:0. '2 en volumen) . » ' Un espectrómetro de masas de cuadropolo triple Scp-éx API 4000® (AB Sciex, CA, Estados Unidos de América) equipado con un turbo atomizador de iones fue utilizado | para i cuantificación . El instrumento de MS se puso en operación en el 50 pa 25, el nebulizador de gas a 45 y el gas auxiliar a 40. ¿e usó un gas de colisión de 10. Detalles de las transiciones de monitoreo de reacción múltiple ( RM) para los péptidós de firma y sus estándares internos correspondientes ' son enlistados en la tabla . El tiempo de residencia fue ajustado a 50 ms para cada transición de MRM y el mismo potencial de entrada de 10 voltios fue aplicado.- Ambas i ! resoluciones de Ql y Q3 fueron ajustadas en la unidad. La cuantificación fue efectuada utilizando Inteliquan en base al área pico. '. i Tabla 4. Transiciones de monitoreo de reacción múltiplé (MBM) ; i para los péptidos de firma y sus estándares internos i 1 i correspondientes La "c" inferior indica el residuo de cisteina que ha ; sido alquilado con yodo acetamida. ¡, j í *Denota marcación de isótopo estable que contiene aminoácidos de i;iC, y 15N! ¡ i ' i Se detectó la calificación del método utilizando trastuzumab como modelo. Se prepararon estándares: de calibración al proyectar trastuzumab al plasma de. mono cynomolgus o plasma de rata Sprague-Dawley a 1.00, ' 1;.75, 3.00, 10.0, 25.0, 75.0, 200 y 250 µg/ml. Se prepararon testigos de calidad (QC) a 1.00 (LLOQ) , 2.50 (LQC) , ' I .C (MQC) y 190 µq/ml (UQC) de trastuzumab en plasma. Además, se incluyó una dilución QC de 1000 ug/ml de concentiración original con factor de dilución de lOx. Los QC dé ¡intra- análisis fueron preparados en 6 réplicas y el QC de dilución I fue preparado en tres replicas. Los datos del método de calificación son reportados en la tabla 5. Los datos i'ndican que el análisis de LC-MS/MS tiene buena precisión y exactitud con valores dentro de criterios de aceptación predefinidos.

Tabla 5 : Calificación de mé'todo de precisión y exactitud para trastuzumab en plasma de rata La figura 17a muestra la detección de 1 µg/ l (LLÓQ) de anticuerpo trastuzumab en plasma de rata utilizando FSP8 como i subrogado, con estándar interno de FSP8 marcado con isótopo estable (figura 17b) detectado al mismo tiempo de retención. Se prepararon muestras de acuerdo con el protocolo én el ejemplo 4. Se demostró buena linealidad de 1-250 g/mj del trastuzumab en plasma de rata en la figura 18. ; | La figura 20 muestra los perfiles de concentración-tiempo individuales de ratas (1A, IB, 1C) dosificados' con bolos de 2 mg/kg de trastuzumab, un Ab anti-HER.2¦ i Las muestras de plasma durante 28 horas pos-dosis 'fueron analizadas mediante análisis de LC-MS/MS (figura 19b) y'; ELISA (Figure a) . Se observo buena concordancia entre l s dos métodos de análisis. Los parámetros de PK de la figura 20 son : : ; : ; La figura 21 muestra los perfiles de concentración-tiempo individuales de ratas (2D, 2E, 2F) dosificadas ¿on un bolo de 2 mg/kg de 3A5, un mAb anti-MUC 16. Muestras de plasma durante 28 horas pos-dosis fueron analizadas mejiiante los análisis de LC-MS/MS (figura 19b) y ELISA (figurá a) . Se observo buena concordancia entre los dos métodos J Los parámetros de PK de la figura 21 son: i I ; , , ; i La figura 22 muestra los resultados de ratas "(3'G, 3H, 31) dosificadas con un bolo de 2 mg/kg de un mÁb' anti-mesotelina (Msln) . Muestras de plasma durante 28 horas ¡fueron analizadas post-dosis mediante los análisis de LC-MS/MS (figura 19b) y ELISA (figura a) . Se observó l buena concordancia entre los dos métodos. Los parámetros de J PK de la figura 22 son: 1 | La figura 23 muestra la concordancia entre el análisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de 'ELISA de la figura a en base a la farmacocinética media |(??) de muestras de plasma/suero de mono cynomolgus dosificádo con 3A5, un mAb anti-MUC 16 mediante medición del anticuerpo en la sangre durante 28 días. Los parámetros de PK de la figura 23 son: Todos los valores son la media ± desviación estándar (SD) La figura 24 muestra la concordancia entre al análisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de ELISA de la figura a en base a la farmacocinética media (PK)de muestras de plasma/suero de mono cynomolgus dosificado con un anticuerpo monoclonal mAb anti-mesotelina (Msln) mediante : ¦ · i medición del anticuerpo en la sangre durante 42 días.1 Los parámetros de PK de la figura 24 son: 1 La figura 24 muestra la concordancia entre al análisis de LC-MS/MS mostrado en la figura 19b y el análisis de';ELISA I de la figura a en base a la farmacocinética individual:: (PK) i de muestras de plasma/suero de ratones (A, B, C) dosificados con un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) , anti-Ltjste-MYIC-vc-PAB-MMAE, que tiene la estructura: !' ; i' por medio de un aminoácido de cisteina al grupo mál'eimido caproilo (MC) del enlazador y p es el número de porciones de fármaco ( MAE) per por anticuerpo en una molécula de ADC. El intervalo de p en una mezcla típica de ADC es de alrededor de 0 a alrededor de 20 o 0 alrededor de 8. En donde p es Ó, una cierta cantidad de anticuerpo descubierto, sin conjugar ¡puede estar presente. La carga de fármaco promedio por anticuerpo i puede ser de alrededor de 2 a alrededor de 5 o alrededor de 3 a alrededor de 4. Así, una preparación típica de un Cóhjiugado de anticuerpo-fármaco (ADC) es una mezcla heterogénea de i especies con anticuerpos conjugados con algún número de porciones de fármaco, tales como MMAE. El enlazador también incluye una unidad de di péptido de valina-citruliná; !(Val- ; ; i Cit) susceptible a reconocimiento de catepsina y la unidad de para-aminobenciloximetilo (PAB) (patente estadounidense 7659241; patente estadounidense 7498298; Doronina et ! al. (2006) Bioconjugate Chem. 17:114-124 y Doronina et al .: ;(2003 ) Nat. Biotech. 21:778-784). ; : '¦ La porción de fármaco MMAE (vedotina, ( S ) -N- ( ( 3R, 4S , 15S ) - 1- ( (S) -2- ( (IR, 2R) -3- ( ( (1S, 2R) -1-hidroxi-l-fenilpropan-2-i il) amino) -l-metoxi-2-metil-3-oxopropil ) pirrolidin-l-il ) -34 1 ', 1 metoxi-5-metil-l-oxoheptan-4-il) -N, 3-dimetil-2- ( (S) ÷-m',etil-2- (metilamino) butanamido) butanamida, número de registto CAS 474645-27-7) es un análogo de monometiluauristati'na de dolastatina (patente estadounidense 5635483; 1 patente estadounidense 5780588) enlazado por medio de su térmiñ'o N al anticuerpo. MMAE tiene la estructura: ! I i Los perfiles y parámetros de PK de los dos métodos de análisis (LC-MS/MS y ELISA) de experimento de dosificación de anticuerpos de las figuras 23-28 muestran alta concordancia indicando que la cuantificación de mAb en animales, incluyendo monos cynomolgus, ratas y ratones, mediante un solo análisis de LS-MS/MS genérico utilizando péptidós de firma de estructura comunes como subrogados es factible1 con desempeño robusto. El procedimiento a base de MS individual es apto de generar datos de PK confiables que de otra'. ''.manera necesitan múltiples análisis de ELISA para obtener. Ádémás, el procedimiento de MS no requiere ningún reactivo sobre ;¦ i pedido, lo que puede ayudar a acelerar el procesó de desarrollo del método y hacer la aprobación de PK disponible a etapas prematuras de desarrollo de fármaco. ;' ? ANÁLISIS DE DATOS Curvas de calibración fue establecidas en el procedimiento de inmunoprecipitación para: DWYIHWVR (SEQ ID NO: 9), FSP3, FSP4, FSP5 , FSP8 (todos tanto para mono como para ratas) y NQVSLTCLVK (SEQ ID NO: 10) (rata solame te) y en el procedimiento de digestión de plasma entero/SPE ¡ para : i FSP4, FSP5, FSP8 (todos tanto para mono como para rata) . Se establecieron datos de especificidad para muestras de plasma en blanco y proyectadas. Se han provisto proporciones ,„dé área y CV (coeficiente de variación) correspondiente , para diferentes péptidos con respecto a FSP8 (candidato \ para cuantificación primaria) como medidor de reproducibilidad de 1 digestión. Se usó una regresión cuadrática ( 1/concentráción2 ponderada) para ajustar los datos. 1 j i En el procedimiento de digestión de plasma entero/SPE al tratamiento de muestras de plasma de mono (ejemplo 3b) , i FSP8 ; i es el péptido más sensible. La figura 13 muestra , i cromatogramas de LC-MS/MS que demuestran la detección de ' FSP8 proyectado al plasma de mono cynomolgus heparinisado de, litio a LLOQ (limite inferior de cuantificación) = 1 g/ml después de la preparación de la muestra de digestión de | lasma entero/SPE. Los picos a 4.47 y 5.20 minutos están '¡en el blanco. FSP8 tiene un tiempo de retención de 4.66 minutos. Los únicos otros péptidos cuantificables a ' bajas concentraciones son FSP4 y FSP5. Sin embargo, su proppr ión de señal a ruido (s/n) al nivel de 1 µ?/p??-???) es menor que (<) 5. Como se esperaba, el péptido NQVSLTCLVK (SEQ ID NO: 10) mostró altos niveles de fondo endógenos en todos los plasmas de mono. Nueve de los 10 lotes individuales probados tuvieron especificidad similar y aceptable. El lote ,# ¡5 tuvo un nivel de fondo inusual para todos los péptidos I cuantificables . El patrón es sugerente de que podría j estar contaminado con algo de plasma humano. En generál', las muestras de FSP (esto es, proyectadas) muestran ! buena exactitud y precisión para todos los lotes para FSP8, el i péptido de firma potencial para cuantificación primaria (excepción: FSP7 con un CV de 27%). Las proporciones de área pico de FSP4 y FSP5 comparados con FSP8 mostraron CV menor de 20% a través de diferentes muestras y tipos de muestras.

En el procedimiento de digestión de plasma entero/SPE j para el tratamiento de muestras de plasma de rata (éjiemplo 3b), FSP8 es el péptido más intenso. Los otros péptidos cuantificables a concentraciones de bajo nivel son FSP4 y FSP5. Sin embargo, la s/n para estos péptidos al nivel de LLOQ es menor de 5. Las curvas de calibración mostraron una naturaleza dividida, posiblemente debida a la supresión de señal de muestras inyectadas más tarde. Ninguno de los' lotes individuales probados tuvieron picos de fondo cuantificables para todos los péptidos. Debido a la curva divididá, ! las i muestras de FSP mostraron valores de exactitud y precisión altamente variables. Las proporciones de área pico de FSP4 y FSP5 con respecto a FSP8 mostraron CD mayores de 20%! en la mayoría de los casos, otra vez apuntando a la variabilidad I del análisis. ! I En el procedimiento de inmunoprecipitacjón al tratamiento de muestras de plasma de mono (ejemplo 4)1, FSP8 es el péptido más sensible, esto es, intenso. Todos los', otros péptidos son también cuantificables a concentraciones de bajo nivel. Las s/n para los otros péptidos al nivel de LLOQ es mayor de 5 (excepto SP2) . Como se esperaba, el péptido NQVSLTCLVK (SEQ ID NO: 10) mostró niveles de fondo para! todas ? las muestras de plasma de mono. La relación entre la concentración y respuesta mostró algo de no linealidad a altas concentraciones, posibilidad debida a la saturación de las perlas magnéticas de proteína A y/o de la competencia con IgG de mono cynomolgus endógenas. De los 10 < ilotes individuales probados, las muestras del lote 5 tuvieron ¡picos de fondo para todos los péptidos cuantificables a uñ nivel similar, excepto por el péptido de región variable DTYjlHWVR (SEQ ID NO: 9) . En general, las muestras de FSP mostraron buena exactitud y precisión para todos los lotes paca FSP8 (incluyendo el lote 5 si la concentración de fondo; i en el blanco es tomada en cuenta) . Las proporciones de área pico de casi todos los péptidos mostraron CV menores de 15% a; ¡través de diferentes muestras y tipos de muestras (excepto FS'PS con un CV para CALS de alrededor de 23%; En el procedimiento de inmunoprecipitación ¦(IP) al tratamiento de muestras de plasma de rata (ejemplo 4);, FSP8 es el péptido más intenso. Todos los otros péptidos son también cuantificables a concentraciones de bajo nivel. Las s/n para todos los otros péptidos al nivel de LLOQ es! mayor de 5 (excepto FSP2) . La' relación entre la concentración y la respuesta mostró mejor linealidad que los datds de inmunoprecipitación (IP) de mono, posibilidad debida a ! menos competencia de IgG endógenas de afinidad más baja eh plasma de rata. Ninguno de' los lotes individuales probados) tuvo picos de fondo cuantificables pa ra todos los pépti,dos. En I general, las muestras de FSP mostraron buena exactitud y precisión para todos los lotes para FSP8. Las proporciones de : i área pico para casi todos los péptidos mostraron CV menores de 20% a través de diferentes muestras y tipos dé müéjstras (excepto FSP5 y FSP2 con una CV para CALS mayor de La extracción de inmunoprecipitación (IP) magnéticas de proteina A mostró mejor sensibilidad y reproducibilidad que la extracción de digestión de¦ plasma entero (FSPE) el procedimiento de IP fue mas rápido, jy ' "mas limpio" que el procedimiento de digestión de ' 'matriz entera/SPE. 1 I EJEMPLOS Ejemplo 1. Procedimientos de digestión de plasma ¡entero simple y extracción 1. Alícuota de 10 µ? de plasma (citrato de sodio)¡ a una placa lo-bind. , j 2. Se agregan 95 µ? de una solución de DTT Í0 i mM en bicarbonato de amonio 50 mM. 1 1 3. Se mezcla e incuba a 60°C por 60 minutos. 4. Se agregan 40 µ? de yodo acetamida 100 en bicarbonato de amonio 50 mM. 5. Se incuba en la oscuridad a temperatura por 30 minutos. 6. Se deja en la luz por 20 minutos. 7. Se agregan 15 µ? de una solución de tripsin cié 500 µg/ml de bicarbonato de amonio 50 mM. | 8. Se incuba de la noche a la mañana a 37 °C. 1 Ii 9. Se agregan 15 µ? de una solución de ácido fórmico al , 1 1%. Se mezcla y centrifuga. '' j 10. Se analiza mediante LC-MS/MS (inyección de,i20!. µ? a 0.7 ml/minutos UPLC) . '.¡': j E emplo 2. Protocolo de extracción en fase solida paira ¡placa de µ???^??® MAX/WCX (Waters Corp.) ! 1. Se mezclan 600 µ? de digestión de suero/plSéma con 100 µ? de H3P04 al 8%. ?· !· 2. Se acondiciona la placa SPE de Elución, MAX/WCX (Waters Corp., Milford MA) con 200 µ? de MeOH. ¦ ' 3. Se equilibra la placa de SPE de lElución MAX/WCX con í 200 µ? de H20. 4. Se carga el digesto de suero/plasma diluido la placa de SPE de Elución MAX/WCX (2 x 350 µ? de alicubtas) . Se aplica solo suficiente vacio después de cada adición para permitir que la muestra pase a través del lecho gota a ¿jota. 5. Se lava con 200 µ? de NH4OH al 5%. " j 6. Se lava con 200 µ? de ACN (acetonitrilo) al 2Ó!%J de de . un sello de tapete morado y se somete a vórtice! por aproximadamente 30 segundos. | 9. Se inyectan 25 µ? sobre el sistema 4000,, QTRAP® LC/MS/MS System (AB Sciex, Foster City, CA, Estados Unidos de América ) . ; Ejemplo 3a. Procedimiento de digestión de plasma entero 1. Se toma una alícuota de 10 µ? de plasma a una lo-bind. 2. Se agregan 95 µ? de una solución de DTT 10, m en bicarbonato de amonio 50 mM. 3. Se mezcla e incuba a 60°C por 60 minutos. 4. Se agregan los 20 µ? de yodo acetamida 100 ' mM en bicarbonato de amonio 50 mM. ! 5. Se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Se deja en la luz por 20 minutos. 7. Se agregan 15 µ? de una solución de tripsina 500 g/ml en bicarbonato de amonio 50 mM. 8. Se incuba de la noche a la mañana a 37°C. 9. Se agregan 16 µ? de una solución de acido fórmico al i 1%. Se mezcla y centrifuga.

I 10. Se analiza mediante LC-MS/MS. | | I Ejemplo 3b. Digestión de plasma entero/SPE (extraccipn en i fase sólida) -protocolo 2 ! 1. Se mezclan 25 µ? de muestra de plasma con 100 µ? de (Waters Corp., Milford MA) solución surfactante: : ; de SF (0.05:40:10 RapiGest™/acetato de amonio, 50 mM / ACN, w/,?/?) . Se agregan 400 µ? adicionales de diluyente de RapiGest™ (80:20 acetato de amonio, 50 mM / ACN, v/v) . .,. I 2. Se agregan 10 µ? de DTT (1 M) . Se incuban a 60°C por alrededor de 1 hora. 3. Se agregan 25 µ? de IAA (1 M) . Se incuban a temperatura ambiente por alrededor de 0.5 horas protegido de la luz . 4. Se agregan 20 µg de tripsina. Se incuba a 37°C por alrededor de 16 horas. 1 5. Se agrega otra dosis de 20 µg de tripsina. Se ¡incuba a 37°C por alrededor de 4 horas. , ¡ 6. Se agregan 50 µ? de HC1 6 M. Se incuba a 37°C por alrededor de 0.5 horas. ! 7. Se someten 500 µ? de digestión de plasma entero! a SPE utilizando la placa de µß?????? Oasis MAX Oasis® ¦( (Waters Corp., Milford MA) ) . . , ; ? 8. Se mezclan 500 µ? de digestión de plasma con' Í00 µ? de H3PO4 al 8%. 1 · 9. Se acondiciona la placa de SPE de micro elución Oasis® MAX con 200 µ? de MeOH. ' ¡ 10. Se equilibra la placa de SPE de micro elución MAX con 200 µ? de H20. 11. Se carga el digesto de plasma diluido sobre la placa de SPE de micro elución Oasis® MAX (alícuotas de 2 x 300 µ?) . Se aplica solo suficiente vacio para permitir que la muestra pase a través del lecho gota a gota. \ 12. Se lava con 200 µ? de NH4OH al 5%. 13. Se lava con 200 µ? de acetonitrilo al 20%. : 14. Se eluye bajo vacío moderado con (2 x 25 'µ1) de 75:25:1 de acetonitrilo/agua/TFA, v/v/v. ' 15. Se agregaron 200 µ? de agua y se sella la placa. Se somete a vórtice por aproximadamente 30 segundos. 16. El volumen final del producto eluido de SPE, es de aproximadamente 250 µ?. Se inyectan directamente 2,5 µ? de este extracto.

E emplo 4. Protocolo de inmunoprecipitación j 1. Se mezcla suavemente la suspensión de perla de proteina A de tal manera que todas las perlas 1 están I I suspendidas uniformemente. ;¦ 1 2. Se pipetea el volumen requerido de perlas suspendidas en un tubo de polipropileno. Con la ayuda de un imán externo, se separan las perlas de la solución reguladora del jpH de almacenamiento y se retira suavemente la solución reguladora del pH de almacenamiento con una pipeta sin altér 'r las ! i perlas (nota: se calcula el volumen de perlas requerido en base a un volumen de perla de 25 µ? requerido por cavidad) . i 3. Se agrega un volumen de solución reguladora1' del pH SN1 al tubo de polipropileno igual al volumen dé 'perla inicial. Se somete a vórtice brevemente de manera qúje las perlas son re-suspendidas en la solución reguladora de pH de SNI. 4. Otra vez con la ayuda de un imán externo, se separan las perlas de la solución reguladora del pH SNI y se' separa suavemente la solución reguladora del pH SNI sin alterar las perlas. ' ' ' 5. Se repiten las etapas 3-4 dos veces adicionales'.1 i 6. Después de lavar las perlas, otra vez se agrega un volumen de solución reguladora del pH SNl igual al volumen de 1 perla inicial. Se somete a vórtice brevemente de tal !manera que las perlas son re-suspendidas en la solución reguladora i i del pH SNl . La solución de perla lavada será preparada! nueva 1 ¦ i en el día de uso. Debe ser almacenada a 2-4° si no se 'usa en 1 el transcurso de una hora de lavado. ¡ 7. Se somete a vórtice la muestra de plasma y sé toma una alícuota de 25 µ? en un tubo de micro centrífuga. 8. Se diluye la muestra de plasma con 50 µ? de Solución reguladora del pH SNl. Se somete a vórtice brevemente: ', I 9. Se toma una alícuota de 25 µ? de la muestra de plasma . ¦ i eluida en una placa de micro titulo de 96 cavidades. | 10. Se agregan 125 µ? de solución reguladora deí pH SNl a cada cavidad. , [ 11. Se agregan 25 µ? de las perlas de proteína A lavadas (de la etapa 6) a cada cavidad. Se asegura que las^ ¡ p' rlas '¦ i estén bien suspendidas en solución antes de la adición1. ¡ 12. Se cubre la placa con una película selladora i adhesiva y se sacude suavemente sobre el agitador de placa de titulo por aproximadamente dos horas a temperatura ambiente. ¡ Í 13. Utilizando un imán externo y un lavador de placá, se separan las perlas magnéticas y se descartan las proteínas sin enlazar en el sobrenadante. Se lavan las perlas ¡tres veces con solución reguladora del pH SN2 utilizando el lavador de placa. Se asegura que las perlas estén bien suspendidas en solución antes de cada etapa dé ' lavado mediante agitación sobre un agitador de placa de tituló!. 14. Se agregan 25 µ? de solución interna de trabajo a i cada cavidad excepto blancos sin estándar interno. Se agregan 25 µ? de diluyente estándar interno de trabajo en las cavidades que contienen blancos sin estándar interno .? | 15. Se agregan 75 µ? de la solución RapiGest k cada cavidad. : ¡ 16. Se agregan 10 µ? de DTT 0.1 M a cada cavidad. Se cubre la placa con una película selladora adhesiva y sé| agita suavemente sobre el agitador de placa de titulo I por 1 aproximadamente 1 minuto. j 17. Se incuba la placa a 60°C en un horno pre-cálfentado por aproximadamente una hora. 18. Se agregan 25 µ? de IAA 0.1 a cada cavidád. Se cubre la placa con una película selladora adhesiva y ;se; agita suavemente sobre el agitador de placa de titulo por aproximadamente 1 minuto. Estas etapas deben ser ef ,e,c.tj.uadas protegidas de la luz. Se cubre la placa con una hója de aluminio y se incuba a temperatura ambiente . por aproximadamente 30 minutos. · 19. Se agregan 10 µ? de solución de tripsinai ai cada cavidad. Se cubre la placa con una película ¿hiladora adhesiva y se agita suavemente sobre el agitador de placa de i ¡ titulo por aproximadamente 1 minuto. 20. Se incuba la placa a 37 °C en una incubadórja pre-calentada por aproximadamente 90 minutos. 21. Se agregan 15 µ? de HC1 de 2 M a , cada cavidad. Se cubre la placa con una película selladora adhesiva y ' sé' agita suavemente sobre un agitador de placa de titulo por aproximadamente 1 minuto. ,. j 22. Se incuba la placa a 37 °C en una incubadqrá pre-calentada por 30 minutos. , j 23. Se sacude la placa suavemente sobre un agitador de placa de título por aproximadamente 1 minuto. Utilizando el 1 Tomtec, se transfiere la solución de cada cavidad a unai laca .1 de filtro HTS de multitamiz colocada encima de una placa de recolección de fondo cónico de 96 cavidades. i 24. Se centrifuga la combinación de placa de filtro de HTS de multitamiz/placa de recolección de fondo cónico ide 96 cavidades por 5 minutos a 3000 rpm para recolectar el ¦ i ' i filtrado en la placa de recolección de fondo cónico cié 96 cavidades. i i 25. Se sella la placa de recolección de fondo cóni;co de 96 cavidades con un tapete de inyección amarillo y se ¡inyecta : ; i directamente . .

Solución reguladora del pH de ; ? SN1: I 0.1:5.0:3.0:0.2:91.7:0.1 Tween 20 /clorhidrato de tri'zma (1 M) /cloruro de sodio (5 M) /EDTA (0.5 M) /agua/albúmina dé suero i bovino, v/v/v/v/w. Esta solución es preparada al combinar 1 mi of Tween 20, 50.0 mi de clorhidrato de trizma 1 M,i 30 mi of solución de cloruro de sodio 5 , 2 mi de EDTA 0.5 M y 1.00 g de albúmina de suero bovino en un matraz volumétrico de 1 L. El volumen es luego compensado con agua y me'zclado bien para disolver la albúmina de suero bovino. Es aíma'cenado en un recipiente a 2-8 °C por hasta un mes. ' J Solución reguladora del pH de SN2 : 5.0:3.0:0.2:91.8 clorhidrato de trizma (1 M) /cloruro de sodio (5 M) /É TA (0.5 M)/agua, v/v/v/v. Esta solución es preparada al combinar 50.0 mi de clorhidrato de trizma 1 , 30 mi de solución de cloruro de sodio 5 y 2 mi de EDTA 0.5 M en un matraz volumétrico de 1 M. El volumen es luego compensado con agua y mezclado | bien . Es almacenado en un recipiente cerrado a 2-8 °C por hasta 1 mes .

Método de HPLC ejemplar 1 Perfil de gradiente Método de HPLC ejemplar 2 Columna: Waters BioSuite C18 PA-A, 3 µp?, 2.1 (Parte# 188002425) Fase móvil A: 0.1:100 ácido fórmico/agua, v/v Fase móvil B: 0.1:75:25 fórmico/acetonitrilo/metanol , ?/?/? Velocidad de flujo: 0.20 ml/min Gradiente Condiciones MS/MS i ¡ ! Aunque la invención anterior ha sido descrita en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo por propósitos de claridad de entendimiento, las descripciones y ejemplos no deben ser interpretados como limitantes del alcancié jde la invención. Las revelaciones de toda la literatura de, patente y científica citada en la presente son incorporadas expresamente en su totalidad por referencia. >

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar anticuerpos hüinanos o humanizados, caracterizados porque comprende las etapás' de: (a) tratar una muestra biológica que comprende un anticuerpo humano o humanizado con una enzima digestiva para formar una muestra de anticuerpo digerida, en donde la muestra biológica es suero, plasma, tejido o células de un animal que:ihá sido tratado con un anticuerpo humano o humanizado y (b) analizar la muestra de anticuerpo digerida mediante i espectrometría de masas para detectar uno o más péptidos de ' ! estructura humanos, en donde los péptidos de estructura humanos comprenden una o más secuencias seleccionadas cié SEQ ¡i ID NOS. 1-8: < .',

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima digestiva es tripsina. (; ;

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además poner en contacto la muestra de anticuerpo digerida con un medio de captura de afinidad o absorbente de cromatografía y eluir una muestra de anticuerpo digerida enriquecida. '·

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además poner en contacto la : muestra biológica con un medio de captura de afinidad o absorbé'nte de i ¦ cromatografía y eluir una muestra biológica enriquecida y luego tratar la muestra biológica enriquecida con lá enzima digerida. I

5. El método de las reivindicaciones 3 ¡o 4, caracterizado porque el medio de captura de afinidad consiste de proteína A/G perla-soportada. ;

6. El método de las reivindicaciones 31 \o 4, ? caracterizado porque el absorbente de cromatografía ,es un absorbente de extracción en fase solida (SPE) . ¡ |

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra biológica es suero o plasma. i, . ¡

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque se mide la concentración de la muestra de anticuerpo digerida. ;· ¡

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo humano o humanizado se enlaza :a ;uno o más antígenos tumor-asociados o receptores de superficie i 11 i celular seleccionados de (l)-(36) : (1) BMPR1B (receptor de protema morfo genético de hueso-tipo IB) ; > ¡ (2) E16 (LATI, SLC7A5) ; ' | (3) STEAP1 (antigeno de próstata epitelial de transmembrana seis); ;. j (4) 0772P (CA125, MUC16) ; (5) MPF (MPF, MSLN, SMR, factor de potenciación de megacariocito mesotelina) ; (6) Napi3b (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2 , familia, 34 de portador de soluto (fosfato de sodio), miembro 2, transportador 3b de fosfato sodio-dependiente) ; (7) Sema 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm. 2015, SE AG, semaforina 5b Hlog, dominio sema, siete repeticiones trombopondina (tipo 1 y semejante a tipo 1), dominio de i transmembrana (TM) y dominio citoplásmico corto, (semaforina) 5B); :i | (8) PSCA hlg; (9) ETBR (receptor tipo B de endotelina) ; i; ' (10) MSG783 (RNF124, proteina hipotética FLJ20315 j ; i (11) STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STA P1 ,'; "¡STEAP2 , STMP, gen 1 asociada a cáncer de próstata, prót'eína 1 asociada a cáncer de próstata, antigeno de próstata 2 epitelial de transmembrana 6, proteina de próst t'a de transmembrana 6); .:: ¡i ' ' 1 i ; i (12) TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4 , TRPM4B, canal de catión de potencial de receptor transitorio, subfamilia M, miembro ) ; 1 (13) CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, factor de crecimiento teratocarcinoma-derivado) ; (14) CD21 (CR2 (receptor 2 de complemento) o!, C3DR (receptor C3d/virus de Epstein Barr) o Hs 73792); (15) CD79b (CD79B, ??79ß, IGb (inmunoglobuliná-beta i asociada) , B29) ; i (16) FcRH2 (IFGP , IRTA4, SPAP1A (SH2 proteü a Ia afian SPAP1 (21 ) Brevican; . , ¡ (26) BAFF-R (receptor de factor de activación de , célula b, receptor 2 de BLyS BR3) ; I (27) CD22 (isoforma CD22-B de receptor de célula B) ; ! ? (28) CD79a (CD79A, CD79a, inmunoglobulina-as ciada alfa); (29) CXCR5 (receptor 1 de linfoma de Burkitt) ; (30) HLA-DOB (subunidad beta de molécula clase ?? de MHC (antigeno la) ) ; (31) P2X5 (canal 5 de ion recortado de ligando P2X de receptor purinergico) / (32) CD72 (antigeno de diferenciación de célula ÍB , CD72 , Lyb-2); ". ¡ (33) LY64 (antigeno de linfocito 64 (RP105) , prot ina de membrana tipo I de la familia de repetición rica en léucina (LRR) ) ; ; i (34) FcRHl (proteina 1 semejante a receptor de Fe);' (35) IRTA2 ( FcRH5 , translocación de de superfamilia de inmunoglobulina asociado 2) y I (36) TENB2 (proteoglicana de transmembrana supuesta)!.

10. El método de la reivindicación 1, caracterizado poírque el anticuerpo humano o humanizado es seleccionado' de trastuzumab, ocrelizumab, pertuzumab, anti-PDLl, ;' anti-neuropilina-1, anti-MUC16, rituximab, anti-mesotelina y; ánti-T.Y6E.

11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo humano o humanizado es conj ugado; ¡ a ' una porción de fármaco. ;:

12. El método de la reivindicación 11, caracterizado porque la porción de fármaco es seleccionada de un maitansinoide, dolastatina, auristatina, calich'éá'micina, pirrolobenzodiazepina (PBD), PNU-159682, antraciclina, ? duocarmicina, vinca alcaloide, taxano, tricoteceno CC1065, duocarraicina, camptotecina, elinafide y estereoisomeros, isoésteres, análogos o derivados de los mismos. !