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CN103619877B - 修饰的可变结构域分子及其产生和使用方法b - Google Patents

修饰的可变结构域分子及其产生和使用方法b Download PDF

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CN103619877B CN201280029269.1A CN201280029269A CN103619877B CN 103619877 B CN103619877 B CN 103619877B CN 201280029269 A CN201280029269 A CN 201280029269A CN 103619877 B CN103619877 B CN 103619877B
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Garvan Institute of Medical Research
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Abstract

本公开提供了一种包含抗体轻链可变结构域(VL)的分离蛋白，所述可变结构域在根据Kabat编号系统的残基49至56之间的位置包含至少一个带负电的氨基酸，所述蛋白能够特异性结合到抗原。

Description

修饰的可变结构域分子及其产生和使用方法B
相关申请
本申请要求于2011年4月21日提交的名称为“Modified variable domainmolecules and methods for producing same3”的澳大利亚专利申请第2011901522号以及于2011年11月21日提交的名称为“Modified variable domain molecules and methodsfor producing same4”的澳大利亚专利申请第2011904856号的优先权。这些申请的整个内容据此以引用方式并入。
序列表
本申请与电子形式的序列表一起提交。该序列表的整个内容据此以引用方式并入。
技术领域
本公开涉及包含抗聚集抗体可变结构域的蛋白及其用途。
发明背景
目前包含抗原结合结构域的抗体和蛋白广泛地用作研究试剂、诊断／预测试剂、工业试剂以及治疗剂。这种宽范围的可应用性是由于包含其抗原结合结构域的抗体和蛋白以高度特异性和亲和力结合到抗原的能力。因此，包含其抗原结合结构域的抗体和蛋白能够特异性结合到样品中的抗原上并且允许检测、定量，或杀死表达该抗原的细胞，或递送治疗性有效载荷。然而，尽管它们具有通用性，但是仅有一小组的抗体具有适合诊断／预测／工业／治疗性应用的生物物理特性。例如，治疗性或体内诊断抗体／蛋白需要在受试者中具有较长的血清半衰期以便在所需的靶标处累积，因此它们必须是抗聚集的(Willuda等人，1999)。工业应用通常需要具有较长半衰期或在暴露于苛刻条件(例如高温)之后能够正常发挥作用而无聚集的抗体／蛋白(Harris，1999)。包含抗体可变结构域的蛋白的聚集会导致在表达和/或纯化、免疫原性、毒性、降解、亲合力受损、或储存之后失去活性方面的困难。
蛋白聚集是与折叠途径竞争的一个过程或可以起因于折叠途径中的中间体，并且通常涉及未折叠蛋白或部分折叠蛋白的缔合。通过使天然状态稳定化(即，抗去折叠)或通过降低蛋白的未折叠或部分折叠状态聚集的倾向，可以实现聚集抗性。使天然状态稳定化的一个缺点在于这些蛋白将有可能暴露于它们将去折叠的环境中。通常，当蛋白变性或去折叠时，在蛋白内部通常介导分子内接触的氨基酸残基被暴露出来。这种暴露通常使蛋白易于形成分子间接触并且聚集。与抗去折叠的蛋白相反，在暴露于这样的环境之后，在去折叠时具有降低的聚集倾向的蛋白将简单地重新折叠成具有生物活性的非聚集状态。
包含其抗原结合结构域的抗体和蛋白的聚集抗性或聚集倾向通常受其中包含的最大聚集倾向结构域限制并且受它与周围结构域(如果存在的话)的相互作用的强度的限制。这是因为一旦该结构域去折叠，如果它不能再折叠，则它可以与同一种蛋白中或其他蛋白中的其他结构域相互作用并且形成聚集体。抗体的恒定结构域通常不聚集并且在序列上不明显变化(如通过它们的名称表明)。因此，抗体的最弱结构域通常被认为是从一种抗体到下一种抗体变化的那些区域，即可变结构域(例如，重链可变结构域(VH)和/或轻链可变结构域(vL))(Ewert等人，2003)。就这一点而言，将易于聚集的scFv分子结合到其他稳定的重组抗体产物中通常会将这些一般不期望的性状赋予给新的重组体设计。如Ewert等人，2008所述，“为了通过合理的工程改造改进任何次优的抗体构建体，必须鉴定并改善“最弱的连接”。Ewert等人还强调了可变结构域通常是抗体或抗体相关分子中的“最弱连接”。因此，使可变结构域具有聚集抗性的工程改造最可能使包含该可变结构域的整个蛋白具有聚集抗性。
为了降低可变结构域的聚集，已经提出了不同的策略，例如合理设计聚集抗性蛋白、互补决定区(CDR)接枝、或将二硫键引入可变结构域。
合理设计聚集抗性蛋白通常涉及使用计算机(insilico)分析来预测点突变对蛋白的聚集倾向的影响。然而，对于这种方法存在许多困难。例如，仅鉴定可能减少去折叠蛋白的聚集的突变是不够的。相反，该突变还必须不增加折叠蛋白的聚集或影响折叠蛋白的功能。此外，合理设计需要对进行改善的特定蛋白进行详细的结构分析，并因此难以与尚未彻底表征的蛋白一起使用并且不易应用于多种不同蛋白。
CDR接枝涉及将来自一个可变结构域的CDR移植到另一个可变结构域的框架区(FR)上。这一策略经证实可用于使抗EGP-2scFv稳定化(Willuda等人，1999)。然而，这一策略通常用于产生抗去折叠的可变结构域，如上面所讨论，这不是最令人希望的蛋白形式。这种方法的缺点包括在CDR接枝之后可能发生亲和力降低。可以通过将突变引入到这些FR中来克服这种亲和力损失，然而此类突变可能在蛋白中产生免疫原性表位，从而从治疗的观点来看使蛋白不可取。此外，CDR接枝通常需要晶体结构的分析或供体和受体可变结构域的同源性建模，以评估接枝的适合性。显然的是，这样的方法是费力的并且需要专门的知识。此外，由于每种可变结构域具有不同的结构，这种方法不易在多种分子中加以应用。
至于涉及将二硫键引入可变结构域的多种方法，虽然该键合可有助于蛋白正确地再折叠，但是它也将刚性引入到可变结构域中。这种刚性可以降低抗体对抗原的亲和力。此外，不是所有的可变结构域都能够支持引入必要的半胱氨酸残基用于二硫键形成，而不损失亲和力或不引入免疫原性表位。此外，在高蛋白浓度下形成二硫键可导致蛋白聚集，从而抵消该键合的任何潜在的正效应。
从上文将显而易见的是，本领域中对于包含聚集抗性可变结构域的蛋白以及它们的生产工艺存在着需要。优选地，这些工艺易于应用到多种不同的可变结构域中。
发明概要
在本发明之前的工作中，发明人力图鉴定赋予聚集(例如在暴露于热或浓缩之后)抗性的抗体可变结构域中的氨基酸残基。这类聚集抗性蛋白可用于多种应用，例如治疗和/或诊断/预测。减少浓缩期间或浓缩之后(例如通过冻干)的聚集的能力还提供可作为冻干蛋白制造的例如治疗性蛋白的生产和/或储存优势。发明人将带负电的氨基酸引入了VL并鉴定了赋予聚集抗性的多种残基。发明人鉴定的残基存在于VL的互补决定区2(CDR2)内或其附近。发明人确定，VL的CDR2中的单个带负电的氨基酸残基对可变结构域赋予了聚集抗性。发明人另外还发现，通过在VL的CDR2中包含两个或更多个带负电的氨基酸，能够进一步增强聚集抗性水平。发明人还发现，能够修饰预先存在的VL以增强聚集抗性并保持结合到抗原的能力。发明人还发现，能够修饰预先存在的VL(单独的或在scFv中)以增强聚集抗性而不明显降低VL或scFv的抗原亲和力。
发明人还产生了包含以下部分的蛋白：在CDR2中或附近具有一个或多个带负电的氨基酸的VL，以及根据Kabat编号系统在横跨氨基酸28-35的区域中包含一个或多个带负电的氨基酸的聚集抗性VH。发明人发现，这些蛋白显示出增强的聚集抗性并保持结合到抗原的能力。
由于发明人鉴定的许多残基位于抗体的CDR中，因此它们能够容易地在不同的抗体之间转移，例如包含不同框架区的不同类或亚类的抗体。这是因为已选择抗体可变结构域来适应CDR中的序列变化，而框架区通常无明显变化，因为它们为呈现CDR环提供支架。
发明人的发现提供具有聚集抗性的含修饰VL的蛋白(或含VL和VH的蛋白)的基础及其多种用途。
因此，本公开提供包含VL的分离蛋白，该VL在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的一个或多个位置包含带负电的氨基酸，该蛋白能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，蛋白还包含在CDR1中含有带电残基的VH。
除此之外或作为另外一种选择，本公开提供包含VL的分离蛋白，该VL在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸，该蛋白能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，蛋白还包含在CDR1中含有带电残基的VH。
本公开还提供包含以下部分的分离蛋白：
(i)在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的VL；以及
(ii)在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的VH。
其中所述蛋白能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，该蛋白包含根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间的两个或更多个位置的带负电的氨基酸，或包含选自由VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置的带负电的氨基酸。
本公开还提供包含以下部分的分离蛋白：
(i)在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸的VL；以及
(ii)在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸的VH。
其中所述蛋白能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，VL在根据Kabat编号系统的选自由残基49、50、51、52、53和56组成的组的一个或多个(或两个或更多个)位置包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，VL在根据Kabat编号系统的选自由残基49、50、51、52、和53组成的组的一个或多个(或两个或更多个)位置包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，VL在根据Kabat编号系统的CDR2内的一个或多个(或两个或更多个)位置包含带负电的氨基酸。
在VL内赋予聚集抗性的带负电氨基酸所处的示例性位置选自由根据Kabat编号系统的残基50、51、52和53组成的组及其组合。
在VL内赋予聚集抗性的带负电氨基酸所处的位置的示例性组合选自由以下组成的组：
(i)根据Kabat编号系统的50和51；
(ii)根据Kabat编号系统的50和52；
(iii)根据Kabat编号系统的50和53；
(iv)根据Kabat编号系统的51和52；
(v)根据Kabat编号系统的52和53；
(vi)根据Kabat编号系统的50、51和53；
(vii)根据Kabat编号系统的51、52和53；
(viii)根据Kabat编号系统的50、52和53；以及
(ix)根据Kabat编号系统的50、51、52和53。
在一个实例中，VL在根据Kabat编号系统的位置50、52和53包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，VL还在CDR1或CDR2中包含带电残基。
在一个实例中，VL还在根据Kabat编号系统的CDR1中的一个或多个位置包含带负电的氨基酸。示例性位置选自由以下组成的组：
(i)根据Kabat编号系统的位置24；
(ii)根据Kabat编号系统的位置29；
(iii)根据Kabat编号系统的位置30和31；以及
(iv)根据Kabat编号系统的位置31和32。
在另一个实例中，该蛋白还在根据Kabat编号系统的VH的选自由残基26、39、40、50、52、52a和53组成的组的一个或多个残基包含带负电的氨基酸。
在一个另外的或替代的实例中，该蛋白包含聚集抗性VL和任选的聚集抗性VH。
在一个实例中，带负电的氨基酸残基在本文所述的区域内是表面暴露的残基。根据该实例，蛋白在根据Kabat编号系统的VL的位置54不含带负电的氨基酸。
在一个实例中，带负电的氨基酸残基位于以下残基处，该残基不与抗原直接发生相互作用或不与抗原形成键合，或经预测不与抗原直接发生相互作用或不与抗原形成键合。确定相互作用或键合形成的方法对本领域的技术人员将是显而易见的，并包括例如分子建模或x射线晶体学研究。
在一个实例中，蛋白与不含上文讨论的带负电的氨基酸的蛋白相比具有降低的聚集趋势。例如，该蛋白与不含带负电的氨基酸的蛋白相比在加热到至少约60℃或70℃或优选80℃后具有降低的聚集趋势。
在一个实例中，该蛋白在加热到至少约60℃或70℃或优选80℃后保持特异性结合到抗原的能力。
在另一个实例中，该蛋白在浓缩(例如冻干或通过渗滤而浓缩)后具有降低的聚集趋势。在一个实例中，浓缩包括干燥。在另一个实例中，浓缩包括将含有蛋白的组合物的体积降低至少50％或60％或70％或80％或85％。
例如，本公开的蛋白在冻干和复原后具有降低的聚集趋势。例如，本公开的蛋白与不含带负电的氨基酸的蛋白相比在冻干和复原后聚集的量少10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％，其中聚集通过测量浊度(例如320nm处的吸光度)而测量。
在另一个实例中，本公开的蛋白在渗滤后具有降低的聚集趋势。例如，本公开的蛋白与不含带负电的氨基酸的蛋白相比在渗滤后聚集的量少10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％，其中聚集通过测量浊度(例如320nm处的吸光度)而测量。
在一个实例中，该蛋白能够结合到(优选地特异性结合到)人类蛋白。
在另一个实例中，该蛋白能够结合到(优选地特异性结合到)与人类病状或其病因相关的蛋白。这样的蛋白可以是人类蛋白，或得自例如感染性生物体的蛋白。在一个实例中，该蛋白是人类蛋白。示例性蛋白是可溶性和/或分泌的蛋白或受体(例如受体的胞外结构域)或膜结合蛋白(例如膜结合蛋白的胞外结构域)。
在一个实例中，带负电的氨基酸是谷氨酸。在另一个实例中，带负电的氨基酸是天冬氨酸。
在一个实例中，VL中带负电的氨基酸是天冬氨酸。
在一个实例中，VH的位置28和／或30和／或31和／或33和／或35的带负电的氨基酸是天冬氨酸。
在一个实例中，VH的位置32的带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。
在一种示例性形式中，该蛋白在根据Kabat编号系统的VH的位置32和33包含带负电的氨基酸。在另一种示例性形式中，该蛋白在根据Kabat编号系统的VH的位置31和32和33包含带负电的氨基酸。
在一种示例性形式中，本公开的蛋白包含VL的位置52和/或53的带负电的氨基酸和VH的位置30的带负电的氨基酸。在一个实例中，带负电的氨基酸是天冬氨酸。
VH中的带负电的氨基酸的另外示例性位置在共同拥有和共同未决的国际专利申请PCT／AU2010／001416中有所描述，该专利的整个内容据此以引用方式并入。
本公开还可用于产生具有改进的聚集抗性的现有蛋白的修饰形式。因此，本公开还提供一种包含能够特异性结合到抗原的修饰VL的蛋白，其中VL包含根据Kabat编号系统选自由残基49、50、51、52、53和56组成的组的一个或多个位置的带负电的氨基酸，并且其中VL的未修饰形式不含带负电的氨基酸。
本公开还提供一种包含能够特异性结合到抗原的修饰VL的蛋白，其中VL包含根据Kabat编号系统在残基49与56之间的两个或更多个位置的带负电的氨基酸，并且其中VL的未修饰形式不含所述位置的两个或更多个带负电的氨基酸。
本公开还提供包含以下部分的蛋白：
(i)在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的修饰VL，其中VL的未修饰形式不在所述位置包含带负电的氨基酸；以及
(ii)在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的修饰VH，其中VH的未修饰形式不在所述位置包含带负电的氨基酸，
其中修饰的蛋白能够特异性结合到抗原。
本公开还提供修饰成包含以下部分的蛋白：
(i)在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的一个或多个位置包含至少一个带负电的氨基酸的VL；以及
(ii)在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置包含至少一个带负电的氨基酸的VH，
其中未修饰的蛋白不含VL中的带负电的氨基酸和VH中的带负电的氨基酸，其中修饰的蛋白能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，未修饰的蛋白结合到与修饰的蛋白相同的抗原(例如相同的表位)。
在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的亲和常数(KD)在未修饰的蛋白的约50％或40％或30％或20％或10％内。在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的亲和常数(KD)在未修饰的蛋白的约5％内。
在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的缔合速率(Ka)在未修饰的蛋白的约50％或40％或30％或20％或10％内。在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的缔合速率(Ka)在未修饰的蛋白的约5％内。
在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的解离速率(Kd)在未修饰的蛋白的约50％或40％或30％或20％或10％内。在一个实例中，修饰的蛋白结合到抗原的解离速率(Ka)在未修饰的蛋白的约5％内。
在一个实例中，蛋白包含修饰的聚集抗性VL和任选的修饰的聚集抗性VH。
这样的蛋白的示例性特征(例如，带负电的氨基酸和/或特定的带负电的氨基酸的另外位点)在本文进行了描述，并将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本公开的形式。
在一个实例中，蛋白是抗体。
在一个实例中，根据任一实例如本文所述的蛋白在CDR内不含二硫键，例如CDR内二硫键，例如在CDR3内。
在另一个实例中，根据任一实例如本文所述的蛋白内的可变结构域不具有总体酸性等电点。
本公开的示例性蛋白是人类、人源化或去免疫的蛋白，或融合到人类蛋白或其区域(例如，为嵌合抗体)。
在一个实例中，本公开的蛋白是单结构域抗体(dAb)或融合到另一蛋白(例如Fc区或能够结合到免疫效应细胞的蛋白)的dAb的形式。
在一个替代实例中，本公开的蛋白包含VL和VH，其中VH和VL缔合形成Fv(例如包含抗原结合位点)。在一个实例中，Fv能够特异性结合到抗原。
在一个实例中，VH和VL在不同的多肽链中。例如，蛋白为抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体或Fv的形式。
在另一个实例中，VH和VL在同一多肽链中。例如，蛋白为(scFv)n或包含(scFv)n的融合蛋白的形式，其中n为数字，例如介于1与10之间。
在一个实例中，蛋白以小于约10μM或5μM，例如小于1μM，例如小于500nM，例如小于200nM，诸如小于100nM以及例如小于10nM，诸如小于1nM的亲和常数(KD)结合到靶抗原或表位。
在一个替代或另外的实例中，本文所讨论的任何蛋白以小于约100pM，诸如小于10pM，例如小于1pM的亲和常数(KD)结合到靶抗原或表位。
在一个另外或替代的实例中，本公开的任一蛋白以300nM或更小，300nM至5pM，优选50nM至20pM，或5nM至200pM或1nM至100pM的Kd从其靶抗原解离。
在一个实例中，根据任一实例的如本文所述的蛋白包含VL，该VL包含如SEQ ID NO：1、3、7或11中任一种(诸如7或11)所示的序列，该序列经修饰成在残基49与56之间包含至少一个或两个带负电的氨基酸，或包含与所述序列至少约80％相同的序列。
在一个实例中，根据任一实例的如本文所述的蛋白包含VL和具有如SEQ ID NO：9所示序列的VH，其中VL经修饰成在残基49与56之间包含至少一个或两个带负电的氨基酸或与其至少约80％相同的序列，并且任选地VH经修饰成在选自由根据Kabat编号系统的VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个或两个或更多个位置包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，根据任一实例的如本文所述的蛋白包含VL和具有如SEQ ID NO：13所示序列的VH，其中VL经修饰成在残基49与56之间包含至少一个或两个带负电的氨基酸或与其至少约80％相同的序列，并且任选地VH经修饰成在选自由根据Kabat编号系统的VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个或两个或更多个位置包含带负电的氨基酸。
任选地，在前面三个段落中所述的蛋白包含替代VL中的N端谷氨酰胺的天冬氨酸。
在一个实例中，根据任一实例的如本文所述的蛋白包含VL，该VL包含如SEQ ID NO：11所示的序列，该序列在根据Kabat编号系统的残基49与56之间包含至少一个或两个带负电的氨基酸，其中该蛋白特异性结合到人表皮生长因子受体2(HER2)。
在一个实例中，该蛋白在根据Kabat编号系统的位置52或53或在两个位置52和53包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，该蛋白还包含下述VH，该VH包含如SEQ ID NO：13所示的序列，该序列在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个或两个或更多个位置包含带负电的氨基酸。
在一个实例中，VH在位置30包含带负电的氨基酸。
本公开还提供偶联到化合物上的本公开的蛋白。例如，该化合物选自放射性同位素、可检测的标记、治疗性化合物、胶质、毒素、核酸、肽、蛋白、延长蛋白在受试者中的半衰期的化合物以及它们的混合物。
本公开还提供包含本公开的蛋白和药学上可接受的载体的组合物。
本公开还提供编码本公开蛋白的核酸。在一个实例中，核酸是表达构建体并可操作地连接到启动子。例如，表达构建体是表达载体。
本公开还提供表达本公开的蛋白的细胞。例如，细胞包含本公开的核酸或表达构建体。示例性细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞和原核细胞。
本公开还提供生产本公开蛋白的方法，该方法包括将本公开的表达构建体维持在足以(或使得)产生编码蛋白的时间和条件下。例如，该方法包括将本公开的蛋白在足以(或使得)产生本公开蛋白的时间和条件下培养。
在一个实例中，该方法还包括分离本公开的蛋白。在一个实例中，该方法还包括在分离蛋白之前、期间或之后将蛋白加热到例如至少约50℃或60℃或70℃或80℃。例如，将蛋白加热从而降低在表达和纯化工艺过程中天然存在的二聚体和/或三聚体的量。这样的方法可有利于回收提高水平的本公开的蛋白。
任选地，该方法还包括将蛋白偶联到化合物或将化合物配制成药物组合物。
本公开还提供包括本公开的多种蛋白的文库。
本公开还提供包括含有VL的蛋白的文库，该VL根据Kabat编号系统在残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸。
本公开还提供包括含有抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)的蛋白的文库，其中该蛋白包含：
(a)在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的VL；以及
(b)在根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置包含带负电的氨基酸的VH。
在一个实例中，文库中蛋白的至少30％(或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％或98％或99％)包含带负电的氨基酸。
本公开还提供包括含有VL的蛋白的文库，其中VL的至少30％(或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％或98％或99％)在如本文所述的位置包含带负电的氨基酸。该蛋白还包含在本文所述的位置含有带负电的氨基酸的VH。
在一个实例中，蛋白展示在颗粒(例如噬菌体或核糖体)或细胞的表面上。
在一个实例中，除了如上所述定位的带负电的氨基酸之外，在VL和VH(若存在)的CDR中(例如在CDR3或在CDR1和3中或在CDR1、2和3中)的氨基酸为随机的或半随机的或衍生自人类抗体。
显然的是，本公开还提供编码所述文库的核酸的文库。
本公开还提供分离本公开蛋白的方法，该方法包括将本公开的文库在足以(或使得)蛋白结合到抗原的时间和条件下与抗原接触，以及分离蛋白。
本公开还提供产生包括本公开的多种蛋白的文库的方法，该方法包括：
(i)获得或产生编码包含VL的多种蛋白的核酸，其中VL在上述位置包含带负电的氨基酸；
(ii)产生包含以下可操作地连接的核酸的表达构建体的文库：
a)启动子；
b)在(i)获得或产生的核酸；和
c)编码促进含VL的蛋白在细胞或颗粒中／上展示的核酸；以及
(iii)表达由表达构建体编码的蛋白，使得它们在细胞或颗粒中／上展示。
在一个实例中，除了带负电的氨基酸之外，在VL的CDR中(例如在CDR3或在CDR1和3中或在CDR1、2和3中)的氨基酸为随机的或半随机的或衍生自人类抗体。
在一个实例中，该方法还包括分离编码蛋白的核酸。这样的核酸可引入表达构建体。任选地，可使蛋白表达。
在一个实例中，该方法还包括将包含VL的一种或多种蛋白暴露于热和/或浓缩该蛋白，并选择与不含带负电的氨基酸的对照蛋白相比具有降低的聚集倾向的蛋白。
本公开还考虑了对分离的蛋白进行修饰，诸如亲和力成熟和/或人源化和/或去免疫化。
这样的分离蛋白可用于产生例如抗体。
本公开还可用于降低包含VL和任选的VH的现有抗体或蛋白的聚集倾向或增强聚集抗性。例如，本公开提供了增强包含VL的蛋白的聚集抗性的方法，该方法包括通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基49、50、51、52、53和56组成的组的一个或多个位置的氨基酸而修饰VL。
本公开还提供了增强包含VL的蛋白的聚集抗性的方法，该方法包括对VL进行修饰，使得其在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸，其中未修饰的蛋白不含根据Kabat编号系统的CDR2内的两个或更多个带负电的氨基酸。
本公开还提供增强包含VL和VH的蛋白的聚集抗性的方法，该方法包括对蛋白进行修饰使得其包含：
(i)根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的带负电的氨基酸；以及
(ii)根据Kabat编号系统的选自由VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的带负电的氨基酸，
其中蛋白在修饰前在VL和VH的位置中不含带负电的氨基酸。
在一个实例中，该方法包括：
(i)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的氨基酸而修饰VL；以及
(ii)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的氨基酸而修饰VH。
本公开还提供增强包含VL和VH的蛋白的聚集抗性的方法，该方法包括对蛋白进行修饰使得其包含：
(i)根据Kabat编号系统的所述VL的残基49与56之间两个或更多个位置的带负电的氨基酸；以及
(ii)根据Kabat编号系统的选自由所述VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置的带负电的氨基酸，
其中蛋白在修饰前在VL和VH的位置中不含带负电的氨基酸。
例如，该方法包括：
(i)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间两个或更多个位置的氨基酸而修饰VL；以及
(ii)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置的氨基酸而修饰VH。
在一个实例中，该方法还包括对蛋白进行修饰，使得VL还在CDR1中包含一个或多个带负电的氨基酸和/或VH还在根据Kabat编号系统的选自由残基26、39、40、50、52、52a和53组成的组的一个或多个残基包含带负电的氨基酸。
另外的修饰位点和／或可取代的特定氨基酸残基在本文进行了描述并被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本发明的实例。
在一个实例中，该方法包括从蛋白中分离VL(和任选的VH)，根据本公开的方法对VL(和任选的VH)进行修饰，以及产生包含VL(和任选的VH)的蛋白。例如，该方法包括从抗体中分离VL(和任选的VH)，根据本公开的方法对VL(和任选的VH)进行修饰，以及产生包含修饰的VL(和任选的VH)的抗体。
在一个实例中，该方法还包括确定修饰的蛋白结合到抗原的能力。在一个实例中，该方法还包括选择结合到抗原的修饰蛋白，其亲和力(例如3/4、Ka和/或3/4)与未修饰的蛋白相似(例如在约10％内)。
在一个实例中，本公开的方法还包括在根据本公开修饰后使VL(和任选的VH)或包含它的蛋白亲和力成熟和/或使蛋白去免疫化和/或使蛋白人源化和/或使蛋白嵌合。
在一个实例中，该方法还包括将修饰的蛋白暴露于热和／或将蛋白浓缩，然后选择与未修饰的蛋白相比聚集趋势降低的蛋白。
在一个实例中，本公开的方法不涉及将任何另外的氨基酸残基插入(与取代相对)VL(和任选的VH)。
上述方法将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于以下方面的方法：用于增加蛋白的表达，和/或用于产生能够以高浓度储存而不明显聚集的蛋白，和／或增加从层析树脂的蛋白回收率，或用于降低从层析树脂回收蛋白所需的溶液体积。
例如，本公开提供增加包含抗体VL的可溶性蛋白的产生水平的方法，该方法包括通过用带负电的氨基酸对根据Kabat编号系统的选自由残基51、52和53组成的组的一个或多个位置的氨基酸进行取代从而修饰VL，其中所产生的可溶性蛋白的水平与不含带负电的氨基酸的蛋白的产生水平相比得以升高。
本公开还提供增加包含抗体VL的可溶性蛋白的产生水平的方法，该方法包括对VL进行修饰使得其在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸，其中未修饰的蛋白在根据Kabat编号系统的CDR2内不含所述两个或更多个带负电的氨基酸，并且其中所产生的可溶性蛋白的水平与不含带负电的氨基酸的蛋白的产生水平相比得以升高。
本公开还提供增加包含抗体VL和VH的可溶性蛋白的产生水平的方法，该方法包括对蛋白进行修饰使得其包含：
(i)根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的带负电的氨基酸；以及
(ii)根据Kabat编号系统的选自由VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的带负电的氨基酸，
其中蛋白在修饰前在VL和VH中的所述位置不含带负电的氨基酸，并且其中所产生的可溶性蛋白的水平与不含带负电的氨基酸的蛋白的产生水平相比得以升高。
在一个实例中，该方法包括：
(i)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的氨基酸而修饰VL；以及
(ii)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的氨基酸而修饰VH。
本公开还提供降低从层析树脂中回收蛋白所需的溶液体积的方法，该方法包括对根据任一实例如本文所述的蛋白或修饰蛋白进行层析。
本公开还提供降低从层析树脂回收包含抗体VL的蛋白所需的溶液体积的方法，该方法包括通过带负电的氨基酸对根据Kabat编号系统的选自由残基51、52和53组成的组的一个或多个位置的氨基酸进行取代从而修饰蛋白的VL，以及进行层析，从层析树脂回收蛋白所需的溶液体积水平与不含带负电的氨基酸的蛋白的体积相比得以降低。
本公开还提供降低从层析树脂回收包含抗体VL的蛋白所需的溶液体积的方法，该方法包括修饰VL使得其在根据Kabat编号系统的残基49与56之间的两个或更多个位置包含带负电的氨基酸，其中未修饰的蛋白在根据Kabat编号系统的CDR2内不含所述两个或更多个带负电的氨基酸，以及进行层析，其中回收蛋白所需的溶液体积与不含带负电的氨基酸的蛋白的体积相比得以降低。
本公开还提供降低从层析树脂回收包含抗体VL和VH的蛋白所需的溶液体积的方法，该方法包括对蛋白进行修饰使得其包含：
(i)根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的带负电的氨基酸；以及
(ii)根据Kabat编号系统的选自由VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的带负电的氨基酸，
以及进行层析，其中蛋白在修饰前在VL和VH中的所述位置不含带负电的氨基酸，并且回收蛋白所需的溶液体积与不含带负电的氨基酸的蛋白的体积相比得以降低。
在一个实例中，该方法包括：
(i)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的VL的残基49与56之间一个或多个位置的氨基酸而修饰VL；以及
(ii)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的一个或多个位置的氨基酸而修饰VH。
在一个实例中，层析是尺寸排阻层析或结合-洗脱层析。
本公开还提供了本公开的蛋白或本公开的组合物在医学中的用途。
本公开还提供了一种治疗或预防受试者中的病状的方法，该方法包括将本公开的蛋白或组合物施用给对其有需要的受试者。在一个实例中，受试者患有癌症和/或炎性疾病和/或自身免疫疾病和/或神经病状。
本公开还提供本公开的蛋白在制造用于治疗或预防病状的药物中的用途。
本公开还提供将化合物递送到细胞的方法，该方法包括将细胞与本公开的蛋白或组合物接触。
本公开还提供诊断或预测受试者病状的方法，该方法包括将得自受试者的样本与本公开的蛋白或组合物接触使得蛋白结合到抗原并形成复合物，以及检测复合物，其中复合物的检测对受试者的病状作出诊断或预测。在一个实例中，该方法包括测定复合物的水平，其中所述复合物的水平升高或降低对受试者的病状作出诊断或预测。
本公开还提供一种定位或检测受试者中的抗原的方法，所述方法包括：
(i)向受试者施用本公开的蛋白或组合物使得蛋白结合到抗原，其中将蛋白偶联到可检测的标记；以及
(ii)在体内检测或定位可检测的标记。
附图简述
图1是示意图，显示了在CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的DPK9中的VL的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。Y轴示出当在本文举例说明的噬菌体上接受“热／冷”测定时蛋白L结合的保留百分比。DPK9是具有低聚集抗性水平的VL的实例。
图2是示意图，显示了在残基49与56之间包含单个带负电氨基酸(天冬氨酸)改变以及它们的组合的DPK9中的VL的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。Y轴示出当在本文举例说明的噬菌体上接受“热／冷”测定时蛋白L结合的保留百分比。
图3是示意图，显示了在位置52和53包含带负电的氨基酸的VL的文库的各个成员的聚集抗性。图中还显示了野生型可变结构域(WT)的聚集抗性。Y轴示出与未处理的对照相比在噬菌体上加热和冷却的可变结构域与蛋白L的结合百分比。***p＜0.001
图4A是示意图，显示了加热到85℃后VL的浊度。图中示出了使用以下VL产生的结果：不含带负电的氨基酸(DPK9)、含一个带负电的氨基酸(50D、5ID、52D或53D)、含两个带负电的氨基酸(50／52DD、50／53DD、51／53DD、52／53DD)、含三个带负电的氨基酸(50-53DADD)以及含四个带负电的氨基酸(50-53DDDD)。X轴示出将VL维持在85℃的持续时间。Y轴示出在360nm处测得的吸光度。
图4B是示意图，显示了在100μM下作为可溶性蛋白的在VL的CDR2中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的DPK9中的VL在加热到85℃后的聚集抗性。VL的聚集通过作为浊度度量的320nm处的吸光度而测定(如Y轴上所示)。DPK9是具有低聚集抗性水平的VL的实例。
图5包括含有带负电的氨基酸的种系VL结构域DPK9的一系列图示，其具有改善的生物物理特性，诸如可溶性表达水平(图5A)、在凝胶过滤柱上的保留(图5B)和纯化蛋白在加热后的聚集抗性(图5B)。“1x”是一个带负电的氨基酸；“2x”是两个带负电的氨基酸；而“3x”是三个带负电的氨基酸。
图6是示意图，显示了在残基50与53之间包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的阿达木单抗(Humira)中的VL的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。DPK9是具有低聚集抗性水平的VL的实例。“WT”是阿达木单抗中的VL。
图7是示意图，显示了在残基50与53之间包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的抗体4D5中的VL的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。DPK9是具有低聚集抗性水平的VL的实例。“WT”是4D5中的VL。
图8A是示意图，显示了在VL的CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。“WT”是4D5中的scFv。
图8B是示意图，显示了在VL的CDR2中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。“WT”是4D5中的scFv。
图9是示意图，显示了在Her2的残基50与53之间包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5及其突变形式中scFv的结合(如X轴所示)。Y轴显示在450nm处测得的吸光度。“WT”是4D5中的scFv。
图10是示意图，显示了在Her2的残基50与53之间包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5及其突变形式中的scFv在加热到80℃后的结合，以加热前结合水平的百分比表示。“WT”是4D5中的scFv。
图11是示意图，显示了在VL的CDR2和VH的CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。“WT”是4D5中的scFv。
图12是示意图，显示了在VL的CDR2和VH的CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv的聚集抗性。任何取代的定位在X轴上指出。“WT”是4D5中的scFv。
图13是示意图，显示了在VL的CDR2和VH的CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv的结合。任何取代的定位在X轴上指出。Y轴显示450nm处的吸光度。“WT”是4D5中的scFv。
图14是示意图，显示了在VL的CDR2和VH的CDR1中包含单个带负电氨基酸改变以及它们的组合的4D5中的scFv在加热到80℃后与抗原的结合。任何取代的定位在X轴上指出。“WT”是4D5中的scFv。
图15是示意图，显示了由4D5产生的scFv的突变形式的聚集。图中指出了每条线的突变位置，其中VH突变列于顶部，而VL突变列于底部。“WT”表示野生型4D5序列。X轴表示时间(分钟)，其中0是加热到80℃的开始时间。Y轴表示作为浊度度量的在360nm处测得的吸光度。
图16A是示意图，显示了在VH的CDR1和VL的CDR2中包含突变的作为全IgG的4D5与SK-BR-3细胞的结合曲线，如通过流式细胞术所测量。
图16B是示意图，显示了通过在VH(30D／WT)、VL(WT／52D)、VH和VL(30D／52D)中包含带负电的氨基酸的4d5(WT／WT)及其变体或同种型对照抗体对SK-BR-3细胞增殖的抑制。数据表示为在同种型对照存在下的增殖百分比。
图17A是包含分别在CDRH1和/或CDRL2中含有种系VH3DP47和种系VLk DPK9的人IgG1的洗脱图的示意图，如通过尺寸排阻层析所测量。X轴显示总洗脱体积。Y轴显示280nm处的吸光度。
图17B是在CDRH1和/或CDRL2中包含带负电氨基酸的作为全IgG的4D5的洗脱图的示意图，如通过尺寸排阻层析所测量。X轴显示总洗脱体积。Y轴显示280nm处的吸光度。
图17C是在CDRL2中包含带负电氨基酸(单个或三个；如图所示)的DPK9VL的洗脱图的示意图，如通过尺寸排阻层析所测量。X轴显示总洗脱体积。Y轴显示280nm处的吸光度。
序列表检索表
SEQ ID NO：1是DPK9VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2是编码DPK9VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3是VLk VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4是编码VLk VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：5是对照scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是编码对照scFv的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7是阿达木单抗的VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是编码阿达木单抗的VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9是衍生自阿达木单抗的scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是编码衍生自阿达木单抗的scFv的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11是4D5的VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：12是编码4D5的VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是4D5的VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14是编码4D5的VH的核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是衍生自4D5的scFv的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16是编码衍生自4D5的scFv的核苷酸序列。
具体实施方式
概述
贯穿本说明书，除非另外明确地说明或上下文另有要求，否则提及单个步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组应当被理解成包括这些步骤、物质构成、步骤的组或物质构成的组的一个和多个(即一个或多个)。
本领域的技术人员将理解本公开是容易进行改变和变更的，除外确切地说明的那些。应当理解的是本公开包括所有此类改变和变更。本公开还包括在本说明书中逐个地或共同地提及或指出的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有的组合或其中的任何两种或更多种。
本公开并不局限于本文所述的特定实例的范围内，这些实例仅旨在用于举例说明目的。功能上等效的产物、组合物和方法显然地在本公开的范围内，如本文所述。
本公开的任一实例将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本公开的任何其他实例，除非另外明确说明。
涉及包含抗体VL的蛋白的本文所述的任一实例或其用途将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于包含免疫球蛋白可变结构域的蛋白或其用途。
除非另外明确地定义，本文使用的所有技术和科学术语应当认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白化学和生物化学中)普通技术人员通常理解的相同含义。
除非另外说明，本公开中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫技术是本领域的技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了说明和解释，诸如J.Perbal，APractical Guide to Molecular Cloning，John Wiley and Sons(1984)，J.Sambrook etal.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(editor)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，Volumes1and2，IRL Press(199D，D.M.Glover and B.D.Hames(editors)，DNA Cloning：APractical Approach，Volumes1-4，IRL Press(1995and 1996)，and F.M.Ausubel et al.(editors)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988，包括至今的所有更新)，Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory，(1988)，andJ.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(包括至今的所有更新)。
通过Kabat(1987和/或1991)、Bork等人(1994)和/或Chothia和Lesk(1987和1989)或Al-Lazikani等人(1997)中的讨论可以进一步阐明本文的可变结构域及其部分、免疫球蛋白、抗体及其片段的说明和定义。
术语“和/或”(例如“X和/或Y”)应当理解为是指“X和Y”或“X或Y”并且应当理解成为两种含义或为任一含义提供明显支持。
在本说明书全文中，词语“包含”或变型形式诸如“包括”或“含有”将被理解为意在包含所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的群组。
如本文所用，术语“衍生自”应当被认为是指特定的整体可以从特定的来源获得，尽管不需要直接从该来源获得。
术语“之间”当涉及氨基酸残基或位置时包括所列的末端残基。例如，“参见49与56之间”包括残基49、50、51、52、53、54、55和56。
在本公开的上下文中，提及马库什(Markush)组(即，“选自由......组成的组”)将被理解为涵盖“逐个地或共同地选自由......组成的组”并为其提供明显支持。
对于“逐个地”表示本公开单独地涵盖所列的残基或多个残基的组，并表示尽管单独的残基或多个残基的组可能并未在本文单独地列出，但是随附的权利要求可以单独地定义此类残基或多个残基的组并且可以彼此分开。
对于“共同地”表示本公开涵盖任何数目或组合的所列残基或多个残基的组，并表示尽管此类数目的或组合的残基或多个残基的组可能并未在本文具体列出，但是随附的权利要求可以单独地定义此类组合或亚组合，并且可以与残基或残基的组的任何其他组合分开。
所选的定义
如本文所用，术语“聚集”是指在不用将蛋白再折叠成天然或未聚集状态的试剂对蛋白进行处理的情况下是不可逆的蛋白之间的缔合或结合。这种聚集可导致功能的丧失，天然折叠的丧失，和/或细胞毒性或免疫原性的获得。该定义包括在体内形成的有害的无功能蛋白组装以及在生物医药研究以及生物技术中在体外形成的无功能蛋白组装两者。然而，它不包括等电的或“盐析的”沉淀，其中当转移到类似天然缓冲剂条件时，组成性蛋白立即回到它们可溶的天然形式。
对于“聚集抗性”是指在暴露于使蛋白变性或者诱导或促使蛋白或其结构域聚集的条件(例如热或储存一段时间，诸如长期储存(例如，至少约1周或1个月或两个月或三个月或12个月)或浓缩)后，本公开的蛋白与不含本文所述的带负电的氨基酸和／或能够以构象特异性方式再折叠并结合到结合伴侣的蛋白相比不聚集或以降低的水平聚集(例如低10％或低20％或低30％或低40％或低50％或低60％或低70％或低80％或低90％)。例如，在暴露于该条件后，蛋白能够特异性结合到抗原和/或超抗原，例如蛋白A或蛋白L。在一个实例中，在部分或完全变性(或去折叠)后，蛋白能够再折叠成允许特异性结合到抗原或超抗原的构象。示例性蛋白在暴露于通常使蛋白或其结构域变性的条件(例如热)后不明显聚集。例如，在暴露于热(例如60℃或70℃或80℃)后，在包含多种所述蛋白的组合物中本公开的蛋白多于约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％不发生聚集。因此，本公开的蛋白可被视为能够热再折叠的。在另一个实例中，蛋白在例如通过冻干和/或室温浓缩而浓缩时不发生聚集。例如，该蛋白与不含带负电的氨基酸的蛋白相比在冻干和／或室温浓缩(例如通过渗滤)后聚集量低约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％。
如本文所用，术语“抗体”应当理解成表示包含由多条多肽链组成的可变结构域(例如轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH))的蛋白。抗体通常还包含恒定结构域，这些恒定结构域可以排列成恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)。抗体可以特异性结合到一种或一些密切相关的抗原。通常，抗体包含四链结构作为它们的基本单元。全长抗体包含共价连接的两条重链(约50-70kD)和两条轻链(每条约23kD)。轻链通常包含可变结构域和恒定结构域，并且在哺乳动物中为K轻链或λ轻链。重链通常包含可变结构域和通过铰链区连接到另外的恒定结构域上的一个或两个恒定结构域。哺乳动物的重链具有以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每条轻链还共价地连接到这些重链之一。例如，通过链间二硫键并且通过非共价相互作用将两条重链以及重链和轻链保持在一起。在不同类型的抗体之中，链间二硫键的数量可以变化。每条链具有N端可变结构域(VH或VL，其中各自为约110个氨基酸长)并且在C端具有一个或多个恒定结构域。轻链的恒定结构域(约110个氨基酸长的CL)与重链的第一恒定结构域(约330-440个氨基酸长的CH)对齐并通过二硫键键合到其上。轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。抗体重链可以包含2个或更多个另外的CH结构域(例如，CH2、CH3等)并且可以包含可以在CHI与CH2恒定结构域之间进行鉴定的铰链区。抗体可以具有任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2)或亚类。优选地，抗体是IgG，诸如IgG3。优选地，抗体是鼠类(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(诸如人类)抗体。术语“抗体”还涵盖人源化抗体、灵长类化抗体、去免疫化抗体、人类抗体以及嵌合抗体。该术语不涵盖抗体样分子，诸如T细胞受体，此类分子由术语“免疫球蛋白”涵盖。
如本文所用，“可变结构域”是指包含CDR(即CDR1、CDR2和CDR3以及FR)的氨基酸序列的如本文所定义的抗体或免疫球蛋白的轻链和重链的部分。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据本公开中使用的方法，分配给CDR和FR的氨基酸位置根据Kabat(1987和1991)定义并根据Kabat编号系统进行编号。技术人员将能够容易地将其他编号系统用于执行本公开，例如Clothia和Lesk(1987)和/或Chothia(1989)和/或Al-Lazikani等人(1997)的高变区环编号系统。例如，使用Kabat或Clothia和Lesk(1987)和/或Chothia(1989)的编号系统，VL的CDR2限定在相同的位置。
如本文所用，术语“重链可变结构域”或“VH”应当理解成表示能够结合到一种或更多种抗原，优选地特异性结合到一种或更多种抗原，并且至少包含CDR1的蛋白。优选地，重链连同三个CDR一起包含三个或四个FR(例如FRI、FR2、FR3以及任选地FR4)。在一个实例中，重链包含根据Kabat编号系统编号的以下残基1-30(FRI)、26-35或31-35(或35b)(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)定位的FR和CDR。在一个实例中，重链从包含所述重链和多个(优选3个或4个)恒定结构域的抗体衍生或连接到恒定片段(Fc)。
如本文所用，术语“轻链可变结构域”或“VL”应当理解成表示能够结合到一种或更多种抗原，优选地特异性结合到一种或更多种抗原，并且至少包含CDR1的蛋白。优选地，轻链连同三个CDR一起包含三个或四个FR(例如FR1、FR2、FR3以及任选地FR4)。优选地，轻链包含根据Kabat编号系统编号的以下残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)定位的FR和CDR。在一个实例中，轻链从包含连接到一个恒定结构域和/或不连接到恒定片段(Fc)的所述轻链的抗体衍生。
在本公开的一些实例中，术语“框架区”将理解为表示除了CDR残基之外的那些可变结构域残基。天然存在的抗体的每个可变结构域典型地具有鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR根据Kabat而定义，则示例性轻链FR(LCFR)残基定位在残基1-23(LCFR1)、35-49(LCFR2)、57-88(LCFR3)以及98-107(LCFR4)的附近。注意，λLCFR1不含包含在KLCFRI中的残基10。示例性重链FR(HCFR)残基定位在残基1-30(HCFR1)、36-49(HCFR2)、66-94(HCFR3)和103-113(HCFR4)的附近。
如本文所用，术语“互补决定区”(同义词CDR；即CDR1、CDR2和CDR3或高变结构域)是指其存在对于抗原结合所必需的抗体可变结构域的氨基酸残基。每个可变结构域典型地具有鉴定为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR区。每个互补决定区可以包含来自如Kabat(1987或1991或1992)定义的“互补决定区”的氨基酸残基。在本公开的一个实例中，在重链可变结构域中，CDRH1在残基26至35(或35b)之间，CDRH2在残基50至65之间，而CDRH3在残基95至102之间(根据Kabat编号系统进行编号)。在轻链中，CDRL1在残基24至34之间，CDRL2在残基50至56之间，而CDRL3在残基89至97之间(根据Kabat编号系统进行编号)。这些CDR还可以包含多个插入，例如，如Kabat(1987和／或1991和／或1992)中所述。
如本文所用，术语“Fv”应当理解为表示任何蛋白，无论是由多个多肽还是由单个多肽构成，其中VL和VH缔合并形成具有抗原结合位点(即能够特异性结合到抗原)的复合物。形成抗原结合位点的VH和VL可在单条多肽链中或在不同的多肽链中。此外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白)可具有可以或可以不结合相同抗原的多个抗原结合位点。该术语应当理解成涵盖从抗体直接衍生的片段以及对应于使用重组手段生产的这种片段的蛋白。在一些实例中，VH不连接到重链恒定结构域(CH)1和／或VL不连接到轻链恒定结构域(CL)。示例性的包含Fv的多肽或蛋白包括Fab片段、Fab′片段、F(ab′)片段、scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体、或更高级的复合物、结构域抗体(例如VH)或连接到恒定区或其结构域的上述中的任何一项，例如CH2或CH3结构域。“Fab片段”由抗体的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用木瓜酶消化整个免疫球蛋白而产生，从而得到由完整的轻链和重链的一部分组成的片段，或可以使用重组手段产生。“Fab′片段”可通过用胃蛋白酶处理整个抗体然后进行还原而获得，从而得到由完整的轻链和重链的一部分组成的分子。以这种方式处理的每个抗体得到两个Fab′片段。还可以通过重组手段产生Fab′片段。抗体的“F(ab′)2片段”由通过两个通过二硫键保持在一起的Fab′片段的二聚体组成，并且通过用胃蛋白酶处理整个抗体而获得，后续不进行还原。“Fab2”片段是包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段的重组片段。“单链Fv”或“scFv”是包含抗体的可变结构域片段(Fv)的重组分子，其中VL和VH通过适当的柔性多肽接头共价连接。落在该术语范围内的示例性的包含Fv的蛋白的详细讨论将在下文提供。
如本文所用，术语“抗原结合位点”应当理解成表示由能够特异性结合到抗原的蛋白形成的结构。抗原结合位点不需要是一系列的连续氨基酸，或甚至单条多肽链中的氨基酸。例如，在由两条不同的多肽链产生的Fv中，抗原结合位点由VL和VH的一系列区域构成，这些区域与抗原相互作用并通常但不总是在每个可变结构域中的一个或多个CDR中。在一个实例中，本文提及抗原结合位点是提及抗体的CDR或其可变区。
“恒定结构域”是抗体中的结构域，其序列在相同类型的抗体(例如IgG或IgM或IgE)中是高度相似的。抗体的恒定区通常包含多个恒定结构域，例如γ、α和δ重链的恒定区包含三个恒定结构域并且γ、α和δ重链的Fc包含两个恒定结构域。μ和ε重链的恒定区包含四个恒定结构域并且Fc区包含两个恒定结构域。
如本文所用的术语“可结晶片段”或“Fc”是指包含至少一个恒定结构域的抗体的一部分，并且它通常(但不必定)糖基化并结合到一个或多个Fc受体和/或补体级联的组分(例如赋予效应子功能)。可以从五种同种型(α、δ、ε、γ、或μ)的任何一项中选择重链恒定区。此外，不同亚类的重链(诸如重链的IgG亚类)负责不同的效应子功能并因此通过选择所需的重链恒定区，可以产生具有所需效应子功能的蛋白。优选的重链恒定区为γ1(IgG1)、γ2(IgG2)以及γ3(IgG3)。
对于“Kabat编号系统”表示用于以与Kabat(1987和/或1991和/或1992)中提出的系统一致的形式对免疫球蛋白的可变结构域中的残基进行编号的系统。
术语“表面暴露的”应理解为是指氨基酸的侧链在折叠时处于蛋白的表面上，使得它们能够与其中存在或悬浮有蛋白的溶剂接触。就VL而言，表面暴露的残基例如选自由根据Kabat编号系统的残基49、50、51、52、53和55组成的组。根据Kabat编号系统的VL的位置54通常不表面暴露。预测氨基酸是否表面暴露的方法在本领域是已知的并例如在Holbrook等人，1990中有所描述。
术语“蛋白”应当理解成包括单一多肽，即通过肽键连接的一系列连续氨基酸，或者共价地或非共价地彼此连接的一系列多肽(即，多肽复合物)。例如，该系列多肽可以使用合适的化学或二硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力以及疏水性相互作用。本公开考虑的非共价键是VH与VL之间的相互作用，例如在双链抗体、三链抗体或四链抗体或抗体的一些形式中。
术语“多肽”将理解成是指来自上述段落，表示通过肽键连接的一系列连续氨基酸。
如本文所用，术语“抗原”应当理解成表示可以针对它而产生免疫球蛋白反应(例如抗体反应)的任何物质组合物。示例性抗原包括蛋白类、肽类、多肽类、碳水化合物类、磷酸根基团、磷酸肽类或多肽类、糖基化肽或肽类等。
如本文所用，术语“特异性结合”或“以特异性方式结合”应当理解成表示与本公开的蛋白与替代的抗原或细胞反应或缔合相比较，它以更长的持续时间和/或以更大的亲和力更频繁地、更迅速地与一种特定抗原或多种抗原或表达它们的细胞反应或缔合。例如，与特异性结合到抗原的蛋白结合到其他抗原相比较，它以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合该抗原。通过阅读本定义还将理解的是，例如特异性结合到第一抗原的蛋白可以或可以不特异性结合到第二抗原。这样，“特异性结合”不必要求专一地结合或不可检出地结合另一种抗原。通常但非必须，提及结合表示特异性结合，并且每个术语应当理解成为另一术语提供明确支持。
如本文所用，在VL(以及任选VH)的背景下术语“修饰的”表示与亲本(或未修饰的)VL相比较VL的序列发生改变。例如，将在残基49与56之间包含除带负电的氨基酸之外的氨基酸的VL进行修饰，以用带负电的氨基酸取代那些氨基酸中的一个或多个。例如，在残基49与56之间对VL进行修饰以增加在这些位置的带负电的氨基酸的数量，例如增加到总共1个或2个或3个或4个或5个或更多个。在一个示例性形式中，将所列位置处带负电的氨基酸的数量增加到至少两个。
包含可变结构域的蛋白
本公开考虑了包含特异性地或选择性地结合到一种或更多种抗原并且如根据任何一个实例如本文所述进行修饰的免疫球蛋白轻链可变结构域的任何蛋白。技术人员将会理解术语“免疫球蛋白”包括符合Kabat编号系统的免疫球蛋白超家族的任何蛋白。免疫球蛋白超家族成员的实例包括T细胞受体。
在一个实例中，本公开考虑了包含特异性地或选择性地结合到一种或更多种抗原(例如通过抗原结合位点)并且根据任何一个实例如本文所述进行修饰的抗体VL的任何蛋白。
抗体可变结构域
基于本文的说明对技术人员将显而易见的是，本公开的蛋白可以包含来自经修饰以在本文所述的位置包含带负电的氨基酸的抗体的一个或多个VL(以及在一些情况下，可进行修饰但不必定如本文所述进行修饰的VH)。此类蛋白包括多种抗体(例如整个抗体或全长抗体)。可以通过首先产生针对感兴趣抗原的抗体然后对该抗体进行修饰(例如使用重组手段)或通过对之前产生的抗体进行修饰来生产此类抗体。作为另外一种选择，产生了包含本公开的VL的蛋白，然后对该蛋白进行修饰或用来生产抗体。
用于生产抗体的方法是本领域已知的。例如，用于生产单克隆抗体的方法(诸如杂交瘤技术)由Kohler和Milstein(1975)进行了说明。在杂交瘤方法中，典型地用免疫原或抗原或表达它们的细胞来免疫小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物，以引发淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合到免疫原或抗原的抗体。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使来自免疫动物的淋巴细胞或脾细胞与永生化细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞(Goding，1986)。可以将所得的杂交瘤细胞在合适的培养基中进行培养，该培养基优选地含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或更多种物质。例如，如果亲本蛋白缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包含次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质将阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。本公开还考虑了用于生产抗体的其他方法，例如使用一般在Largaespada(1990)或Weissinger等人(1991)中详细说明的ABL-MYC技术。
作为另外一种选择，抗体或其编码序列由之前产生的表达感兴趣抗体的细胞(例如杂交瘤或转染瘤)生成。此类杂交瘤和/或转染瘤的多种来源对技术人员将是显而易见的，并包括例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)和／或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。用于分离和／或修饰编码抗体中的VL的序列的方法对技术人员将是显而易见的和／或在本文进行说明。可根据本公开进行修饰的示例性抗体包括但不限于：(帕利珠单抗；MedImmune)，它是一种人源化抗呼吸道合胞体病毒(RSV)单克隆抗体；(曲妥珠单抗；Genentech)，它是一种人源化抗HER2单克隆抗体；(英夫利昔单抗；Centocor)，它是一种嵌合的抗TNFcc单克隆抗体；(阿昔单抗；Centocor)，它是一种抗糖蛋白Iib／IIIa受体抗体；(达利珠单抗；Roche Pharmaceuticals)，它是一种人源化抗CD25单克隆抗体；RITUXANTM／MAB THERATM(利妥昔单抗)，它是一种嵌合的抗CD20IgG1抗体(IDEC Pharm／Genentech，Roche)；STIMULECTTM(巴利昔单抗；Novartis)，它是一种嵌合的抗IL-2Ra抗体；ERBITUX(西妥昔单抗；ImClone)，它是一种嵌合的抗EGFR抗体；MYLOTARGTM(吉姆单抗；Celltech／Wyeth)，它是一种人源化抗CD33抗体；Campath1H／LDP-03(阿仑单抗；ILEX／Schering／Millenium)，它是一种人源化抗CD52IgG1抗体；XOLAIRTM(奥马佐单抗；Tanox／Genentech／Novartis)，一种人源化抗IgE Fc抗体；(贝伐单抗；Genentech)人源化抗VEGF抗体；RAPTIVATM(依法珠单抗；Genentech／Merck Serono)，它是一种人源化抗CD11a抗体；LUCENTIS(兰尼单抗；Genentech／Novartis)，它是一种人源化抗VEGF-A抗体；TYSABRITM(那他珠单抗；BiogenPharmaceuticals)，它是一种人源化抗整联蛋白a4抗体；SOLIRISTM(依库珠单抗；Alexion Pharmaceuticals)，它是一种人源化抗补体蛋白C5抗体；(帕尼单抗；Amgen)全人抗EGFR单克隆抗体；(阿达木单抗；Abbott／MedImmune Cambridge)全人抗TNFa；(戈利木单抗抗TNFαt；Centocor Ortho Biotech，Inc)；(奥法木单抗抗CD20；Glaxo Group andGenMab AS)；(帕妥珠单抗抗Her2；Genentech，Inc)。包含抗体VL的其他抗体和蛋白是本领域已知的并且不排除在外。
本领域的技术人员将能够容易地获得已知抗体的VLS的序列。示例性序列包括阿达木单抗的VL(SEQ ID NO：7)或4D5的VL(SEQ ID NO：11)。根据本公开可以容易地修饰这些序列。
在生产抗体和／或将其编码序列分离之后，将抗体或其VL修饰成在必要的位置包含带负电的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)以赋予聚集抗性，例如根据任何一个实例如本文所述。通常，这包括分离编码VL或抗体的核酸然后将其序列修饰成在必要的位点处包括编码天冬氨酸(即GAA或GAG)或谷氨酸(即GAT或GAC)的一个或多个密码子。
嵌合的人源化和人类抗体
本公开的蛋白可以是人源化抗体或人类抗体或从中得到的VL。术语“人源化抗体”应当理解成是指嵌合蛋白，该嵌合蛋白通常使用重组技术而制备，具有从来自非人类物种的抗体衍生的抗原结合位点并且该分子的剩余抗体结构基于人类抗体的结构和/或序列。抗原结合位点包含接枝到人类抗体可变结构域中的适当FR(即，VL中除了CDR之外的区域)上的来自非人类抗体的CDR而剩余区域来自人类抗体。抗原结合位点可以是野生型的或被一个或多个氨基酸取代所修饰。在一些情况下，人类抗体的框架残基被相应的非人类残基替换。人源化抗体还可以包含在受者抗体或输入的CDR或框架序列中均不存在的残基。通常，人源化抗体将包含非人类抗体的CDR以及人类抗体或其一致序列的所有或基本上所有FR区。用于人源化非人类抗体的方法是本领域已知的。基本上可以按照US5225539、US6054297或US5585089的方法进行人源化。不排除用于人源化抗体的其他方法。
如结合抗体和结合性蛋白在本文使用的术语“人类抗体”是指具有可变的以及任选地恒定的衍生自或对应于在人类中(例如在人类种系细胞或体细胞中)存在的序列的抗体区的抗体。“人”抗体可以包含不由人类序列编码的氨基酸残基，例如，通过随机或体外定点突变引入的突变(具体地讲，在抗体的少量残基中涉及保守取代或突变的突变，例如在抗体的1、2、3、4或5个残基中，优选地例如在构成抗体的一个或多个CDR的1、2、3、4或5个残基中)和/或在本文所述的位置处的带负电的氨基酸。示例性人类抗体或蛋白包含人类框架区(例如，来自人类种系)以及在除了包含带负电的氨基酸的位置之外的CDR中的任意氨基酸。这些“人类抗体”实际上并不必须由人类产生，相反，它们可以使用重组手段产生和/或从包含编码人类抗体恒定和／或可变结构域的核酸的转基因动物(例如小鼠)中分离。可以使用本领域已知的多种技术，包括噬菌体展示文库(例如，如在Hoogenboom和Winter1991、US5,885,793中所述的和/或在下面说明的)或使用表达人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，如在WO2002／066630、Lonberg等人(1994)或Jakobovits等人(2007)中所述的)来产生人类抗体或其片段。
在一个实例中，本公开的蛋白包含人VL。例如，该蛋白包含全部人框架区。
在一个实例中，该蛋白不包含人源化VL或不包含从人源化抗体衍生的VL。在一个实例中，该蛋白不包含从人源化Fab4D5(例如，如US6407213中所述，诸如humAb4D5，诸如humAb4D5-1)衍生的VL。
在一个实例中，如本文所述的蛋白不结合到鸡蛋溶菌酶。
在一个实例中，如本文所述的蛋白不结合到人血管内皮生长因子A(VEGF-A)和／或人her2／neu。
在一个实例中，本公开的蛋白是嵌合抗体。术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与从特定物种(例如鼠类，诸如小鼠)得到的抗体中相应的序列相同或同源或属于特定抗体类别或亚类，而该链的剩余部分与从另一个物种(例如灵长类，诸如人类)得到的抗体中相应的序列相同或同源或属于另一个抗体类别或亚类，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物活性即可(US4816567)。典型地，嵌合抗体利用啮齿类动物或兔可变结构域以及人恒定区，以便产生主要具有人类结构域的抗体。例如，嵌合抗体包含来自根据本公开进行修饰的融合到人类恒定区上的小鼠抗体的可变结构域。此类嵌合抗体的生产是本领域已知的，并且可以通过标准手段实现(如例如在US5807715、US4816567和US4816397中所述)。
包含VL的蛋白
单结构域抗体
在一些实例中，本公开的蛋白是单结构域抗体(它与术语“结构域抗体”或“dAb”可互换使用)。单结构域抗体是包含抗体的轻链可变结构域的全部或一部分的单条多肽链。在某些实例中，单结构域抗体是人类单结构域抗体(Domantis，Inc.，Waltham，MA；参见例如US6,248,516、WO90／05144、WO2003／002609和/或WO2004／058820)。在一个实例中，单结构域抗体由能够特异性结合到抗原并且能够根据本公开进行修饰的抗体轻链可变结构域的全部或一部分组成。本公开还涵盖融合到另一分子(例如，另一结构域抗体或Fc区)的结构域抗体。
双链抗体、三链抗体、四链抗体
包含VL的示例性蛋白是双链抗体、三链抗体、四链抗体以及更高级的蛋白复合物，诸如在WO98／044001和WO94／007921中所述的那些。
如本文所用，术语“双链抗体”应当理解成表示包含两条缔合的多肽链的蛋白，每条多肽链包括结构VL-X-VH或VH-X-VL，其中VL是抗体轻链可变结构域，VH是抗体重链可变结构域，X是包含不足以允许单条多肽链中的VH和VL相缔合(或形成Fv)的残基的接头或不存在，并且其中一条多肽链的VH结合到另一条多肽链的VL以形成抗原结合位点，即形成能够特异性结合到一种或更多种抗原的Fv分子。每条多肽链中的VL和VH可以相同或每条多肽链中的VL和VH可以不同以便形成双特异性双链抗体(即，包含两个具有不同特异性的Fv)。
如本文所用，术语“三链抗体”应当理解成表示包含三条缔合的多肽链的蛋白，每条多肽链包括如上关于双链抗体所提出的结构，其中一条多肽链的VH与另一条多肽链的VL相缔合从而形成三聚体蛋白(三链抗体)。
如本文所用，术语“四链抗体”应当理解成表示包含四条缔合的多肽链的蛋白，每条多肽链包括如上关于双链抗体所提出的结构，并且其中一条多肽链的VH与另一条多肽链的VL相缔合从而形成四聚体蛋白(四链抗体)。
技术人员将知道双链抗体、三链抗体和/或四链抗体以及它们的生产方法。VH和VL可以任何顺序定位，即VL-VH或VH-VL。通常，这些蛋白包含多肽链，其中VH和VL直接地或使用接头连接，该接头具有不足以允许VH和VL缔合的长度。包含VH和VL的蛋白根据接头(如果存在的话)的长度和/或VH和VL结构域的顺序相缔合形成双链抗体、三链抗体和/或四链抗体。优选地，接头包含12个或更少的氨基酸。例如，在多肽链具有以下以N到C顺序按VH-X-VL排列的结构的情况下(其中X为接头)，具有3-12个残基的接头通常导致形成双链抗体，当接头具有1或2个残基或当接头不存在时通常导致形成三链抗体。在多肽链具有以下以N到C顺序按VL-X-Vh排列的结构的情况下(其中X为接头)，具有3-12个残基的接头通常导致形成双链抗体，具有1或2个残基的接头通常导致形成双链抗体、三链抗体和四链抗体，而不含接头的多肽通常形成三链抗体或四链抗体。
单链Fv(scFv)
技术人员将知道的是scFv在单条多肽链中包含VH和VL区。优选地，多肽链还包含VH与VL之间的多肽接头，它使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构(即，用于单条多肽链的VH和VL彼此缔合从而形成Fv)。这与其中来自不同多肽链的可变结构域彼此缔合或结合的双链抗体或更高级的多聚体不同。例如，接头包含超过12个氨基酸残基，其中(Gly4Ser)3是针对scFv更偏爱的接头之一。
本公开还考虑了二硫键稳定的Fv(或diFv或dsFv)，其中将单个半胱氨酸残基引入VH的FR和VL的FR，并且半胱氨酸残基通过二硫键连接从而产生稳定的Fv(参见例如Brinkmann等人，1993)。
作为另外一种选择或除此之外，本公开提供了二聚体scFv，即包含两个通过非共价键或共价键连接的scFv分子的蛋白。此类二聚体scFv的实例包括例如连接到亮氨酸拉链结构域(例如，从Fos或Jun衍生的)的两个scFv，由此这些亮氨酸拉链结构域相缔合从而形成二聚体化合物(参见例如Kostelny1992或Kruif和Logtenberg，1996)。作为另外一种选择，通过具有允许两个scFv形成并且允许结合到抗原上的足够长度的肽接头来连接两个scFv(例如，如在US20060263367中所述)。
本公开还考虑了scFv的修饰形式，例如包含经修饰以允许糖基化的接头的scFv(例如，如在US6323322中所述)。
技术人员将能够容易地产生scFv或其修饰形式，后者包含根据本公开的基于本文公开内容的合适的修饰VL。关于scFv的综述，参见Pliickthun(1994)。另外的scFv说明将见于例如Bird等人，1988。
微抗体
技术人员将知道的是微抗体包含融合到抗体的CH2和/或3／43结构域的抗体的VH和VL结构域。任选地，微抗体包含VH和VL与CH2和/或CH3结构域之间的铰链区，有时这种构象被称为柔性微抗体(Flex Minibody)(Hu等人，1996)。微抗体不含CH1或CL。优选地，VH和VL结构域融合到抗体的铰链区以及CH3结构域。每个区域可以从同一个抗体衍生。作为另外一种选择，VH和VL结构域可以从一个抗体衍生而铰链和CH2／CH3来自另一个抗体，或铰链和CH2／CH3也可以从不同抗体衍生。本公开还考虑了包含来自一个抗体的VH和VL以及来自另一个抗体的VH和VL的多特异性微抗体。
示例性微抗体以及它们的生产方法例如在WO94／09817中进行了说明。
包含其他可变结构域的蛋白
US5731168说明了其中一对Fv的界面经工程改造以便使异源二聚体的百分比最大化的分子，该异源二聚体从重组细胞培养物中回收而得，由此产生双特异性蛋白。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在这种方法中，来自第一蛋白的界面的一条或更多条小氨基酸侧链被更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换较大的氨基酸侧链在第二蛋白的界面上产生了与较大侧链具有相同或相似尺寸的补偿性“空腔”。
包含可变结构域的双特异性蛋白包括交联的或“异共轭的”(heteroconjugate)蛋白。例如，处于异共轭状态的蛋白之一可以偶合到亲和素上而另一个偶合到生物素上。例如已经提出此类蛋白将免疫系统细胞靶向到不想要的细胞上(US4676980)。可以使用任何便利的交联方法制备包含可变结构域的异共轭蛋白。合适的交联剂是本领域已知的，并连同多种交联技术在US4676980中有所公开。
还可以使用化学键来制备包含可变结构域的双特异性蛋白。Brennan(1985)说明了一种程序，其中将完整的抗体蛋白水解切割从而生成F(ab′)2片段。在二硫醇络合剂、亚砷酸钠的存在下将这些片段还原，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将生成的Fab′片段转化成硫代硝基苯甲酸(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺还原将这些Fab′-TNB衍生物中的一种再转化成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合从而形成双特异性蛋白。
包含另外的可变结构域的蛋白包括例如单链Fab(例如，Hust等人，2007)或Fab3(例如，如在EP19930302894中所述)。
恒定结构域融合物
本公开涵盖了包含本公开的修饰VL以及恒定区(例如Fc)或其结构域(例如CH2和/或CH3结构域)的蛋白。例如，本公开提供了微抗体(如上面所讨论)或结构域抗体-Fc融合物或scFv-Fc融合物或双链抗体-Fc融合物或三链抗体-Fc融合物或四链抗体-Fc融合物或结构域抗体-CH2融合物、SCFC-CH2融合物或双链抗体-CH2融合物或三链抗体-CH2融合物或四链抗体-Cn2融合物或结构域抗体-CH3融合物或SCFV-CH3融合物或双链抗体-CH3融合物或三链抗体-CH3融合物或四链抗体-CH3融合物。这些蛋白中的任何一种可以在可变结构域与恒定区或恒定结构域之间包含接头，优选抗体铰链区。优选地，这种Fc融合蛋白具有效应子功能。
如本文所用，术语“CH2结构域”包含重链抗体分子的部分，该部分例如从根据Kabat EU编号系统(如在Kabat1991或1992中所公开)的位置231-340附近之间延伸。两条N连接的分支碳水化合物链通常插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。在一个实例中，本公开的蛋白包含从IgG1分子(例如人类IgG1分子)衍生的CH2结构域。在另一个实例中，本公开的蛋白包含从IgG4分子(例如，人类IgG4分子)衍生的CH2结构域。
如本文所用，术语“CH3结构域”包含重链抗体分子的部分，该部分从CH2结构域的N端延伸大约110个残基，例如从位置341-446b附近(KabatEU编号系统)。CH3结构域典型地形成IgG抗体的C-端部分。然而，在一些抗体中，另外的结构域可以从C3/43结构域延伸从而形成分子的C端部分(例如，IgM的μ链和IgE的e链中的CH4结构域)。在一个实例中，本公开的蛋白包含从IgG1分子(例如人类IgG1分子)衍生的CH3结构域。在另一个实例中，本公开的蛋白包含从IgG4分子(例如人类IgG4分子)衍生的CH3结构域。
可以从多种不同来源获得用于生产本公开的蛋白的恒定区序列。在优选的实例中，蛋白的恒定区或其部分从人类抗体衍生。然而应当理解的是，恒定区或其部分可以从另一种哺乳动物物种的免疫球蛋白或抗体衍生，包括例如啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如黑猩猩、恒河猴)物种。此外，恒定区结构域或其部分可以从任何抗体类别衍生。
如本文所用，术语“效应子功能”是指Fc区或其部分(例如CH2结构域)结合免疫系统的蛋白和／细胞并调节各种生物效应的功能性能力。效应子功能可以是抗原依赖性的或抗原非依赖性的。“抗原依赖性效应子功能”是指通常在抗体结合到抗原之后诱导的效应子功能。典型的抗原依赖性效应子功能包括结合补体蛋白(例如C1q)的能力。例如，补体的CI组分结合到Fc区可活化经典的补体系统，从而导致调理作用和细胞病原体的溶解(称为补体依赖性细胞毒性(CDC)的一个过程)。补体的活化还刺激炎症反应，并且也可涉及自体免疫超敏反应。其他抗原依赖性效应子功能通过抗体经由它们的Fc区结合到细胞上的某些Fc受体(“FcR”)而介导。存在针对不同类别的抗体(包括IgG(γ受体或IgXR)、IgE(ε受体或IgsR)、IgA(α受体或IgaR)以及IgM(μ受体或i^R))特异性的多种Fc受体。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要的并且多样化的生物学反应，包括免疫复合物的内吞作用、抗体包被的颗粒或微生物的吞食和破坏(也称为抗体依赖性吞噬作用或ADCP)、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞溶解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎性介质的释放、免疫系统细胞活化的调节、胎盘转移以及抗体生产的控制。
如本文所用，术语“抗原非依赖性效应子功能”是指可通过抗体诱导的效应子功能，无论它是否结合其相应的抗原。典型的抗原非依赖性效应子功能包括抗体的细胞运输、循环半衰期和清除率，以及纯化的促进。结构上独特的Fc受体“新生儿Fc受体”或“FcRn”(也称为挽救受体)在调节半衰期和细胞运输方面起着重要作用。从微生物细胞纯化的其他Fc受体(例如葡萄球菌蛋白A或G)能够以高亲和力结合到Fc区并且可用于促进含Fc的蛋白的纯化。
例如可以使用聚合酶链式反应以及被选择用来扩增感兴趣结构域的引物来克隆恒定区结构域。抗体序列的克隆在例如US5658570中进行了说明。
本公开的蛋白可以包含任何数量的不同类型的恒定区／结构域。
构成蛋白恒定区的恒定结构域或其部分可以从不同的抗体分子衍生。例如，蛋白可以包括从IgG1分子衍生的CH2结构域或其部分以及从IgG3分子衍生的CH3区或其部分。
在本公开的另一个实例中，本公开的蛋白包含足以赋予FcRn结合的Fc的至少一个区域。例如，结合到FcRn的Fc区的部分包含根据Kabat EU编号的IgG1的从大约氨基酸282至438。
在一个实例中，本公开的改变的蛋白包括修饰的恒定区，其中一个或多个恒定区结构域部分地或完全地缺失(“结构域缺失的恒定区”)。本公开还涵盖修饰的Fc区或已经改变的部分(例如，提高的或降低的效应子功能)。许多此类修饰的Fc区是本领域已知的并且例如在WO2005／035586、WO2005／063815或WO2005／047327中进行了说明。
本公开还涵盖包含能够诱导效应子功能的附加区域的蛋白。例如，该蛋白包含能够结合到T细胞(例如结合到CD4，诸如BiTE)或NK细胞(例如结合到CD19)的抗体可变区。
去免疫化的蛋白
本公开还考虑了去免疫化的蛋白。去免疫化的蛋白将一个或多个表位(例如B细胞表位或T细胞表位)移除(即突变)，由此降低受试者将产生针对该蛋白的免疫反应的可能性。用于生产去免疫化的蛋白的方法是本领域已知的并且例如在WO00／34317、WO2004／108158和WO2004／064724中进行了说明。例如，该方法包括执行计算机分析以预测蛋白中的表位并且使预测表位中的一个或多个残基突变，由此降低其免疫原性。然后对该蛋白进行分析(例如，计算机方式或体外地或体内地)以确保其保持结合到抗原上的能力。例如，存在于CDR内的表位不发生突变，除非该突变不可能降低抗原结合。用于预测表位的方法是本领域已知的并且例如在Saha(2004)中进行了说明。
基于本文的说明，用于引入适当的突变以及表达和分析所得蛋白的方法对于技术人员将是显而易见的。
文库和筛选方法
本公开还涵盖了包含多种根据本公开修饰的VL(以及任选地VH)的蛋白的文库，例如该文库包括具有不同结合特性的多种蛋白。
本公开的实例包括天然文库、免疫文库或合成文库。天然文库从适当宿主的B淋巴细胞得到，该宿主尚未用任何免疫原激发，也未展示出感染或炎症的症状。免疫文库通过由适当地“免疫的”宿主(即，已用免疫原激发的宿主)获得的B细胞和浆细胞的混合物制备。在一个实例中，使用本领域已知的方法(例如，寡dT引物和逆转录酶)将来自这些细胞的mRNA翻译成cDNA。在一个可供选择的实例中，用适当的引物通过PCR扩增编码来自宿主细胞的抗体的核酸(mRNA或基因组DNA)。用于此类抗体基因扩增的引物是本领域已知的(例如US6096551和WO00／70023)。在一个另外的实例中，将来自宿主细胞的mRNA合成为cDNA，然后在PCR反应中用抗体特异性引物对这些cDNA进行扩增(例如US6319690)。作为另外一种选择，可以通过常规cDNA克隆技术(Sambrook and Russell，eds，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rd Ed，vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)来克隆所有组成部分，而不使用PCR。在克隆过程中或之后将DNA修饰成在必要的位点处包含带负电的氨基酸。
在另一个实例中，建立了公开的人源抗体序列数据库，其中将抗体序列彼此进行比对。该数据库用来定义抗体序列的亚群，这些序列在CDR环的序列和经典折叠两个方面显示出高度的相似性(如通过抗体结构分析而确定)。对于每个亚群而言，推导出一致序列，该序列代表该亚群的多个成员；因此一致序列的全部集合表示人类抗体的全部结构清单。
然后例如通过全基因分析或通过使用合成的遗传亚基来构建这些人工基因。这些遗传亚基对应于多肽水平上的结构亚元件。在DNA水平上，这些遗传亚基通过在这些亚元件的每一个的起点和终点处的切割位点而定义，在载体系统中这些切割位点是唯一的。作为一致序列集合的成员的所有基因的构建使得它们包含相应的遗传亚序列的相似模式。例如，所述多肽为或衍生自HuCAL一致基因：VKI、VK2、VK3、VK4、Vλl、Vλ2、Vλ3、VHlA、VHlB、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、CK、Cλ、CHl或所述HuCAL一致基因的任何组合。然后可以使用DNA分子的该集合来产生抗体的“合成文库”，优选地Fv、二硫键连接的Fv、单链Fv(scFv)、Fab片段或Fab′片段，它们可用作特异性结合到抗原的蛋白的来源。US6,300,064公开了用于制备合成文库的方法。此类合成文库经修饰成包含根据本公开的带负电的氨基酸。在另一个实例中，通过合成方法由限定的V基因元件制备合成的人类抗体。Winter(EP0368684)提供了一种用于扩增(例如通过PCR)、克隆以及表达抗体可变结构域基因的方法。以这些基因开始，他能够通过对重链和/或轻链的CDR3进行随机化处理而产生功能性抗体片段的文库。这个过程在功能上等效于在免疫系统的B细胞发育过程中发生的VJ和VDJ重组的天然过程。例如，可以在体外通过连接到五个随机氨基酸残基的合成“D片段”和J片段来重排人类种系VH基因片段的所有组成部分，以产生具有八个残基的合成的第三互补决定区(CDR)。US5885793公开了制备诸如这些的此类抗体文库的方法。对技术人员将显而易见的是，包括本公开的蛋白的文库的产生使得扩增的V区包含编码本文所述位置处的带负电的氨基酸的密码子。
根据本公开的蛋白可以是可溶性分泌蛋白或者可以作为融合蛋白递呈在细胞或颗粒(例如噬菌体或其他病毒、核糖体或孢子)的表面上。
各种展示文库形式是本领域已知的，并且综述见于例如Levin和Weiss(2006)。例如，文库是体外展示文库(即，使用体外展示来展示蛋白，其中所表达的结构域连接到其从中表达的核酸上，使得所述结构域在不存在宿主细胞的情况下递呈)。因此，通过体外展示技术产生的文库不受转化或转染效率的限制。体外展示方法的实例包括核糖体展示、共价展示以及mRNA展示。
在一个实例中，体外展示文库是核糖体展示文库。技术人员将知道的是，核糖体展示文库直接地将由表达文库编码的mRNA连接到其编码的蛋白。用于产生核糖体展示文库的方法包括以可操作地与适当的启动子序列和核糖体结合序列相连接的方式布置编码包含VL(以及任选VH)的蛋白的核酸。优选的启动子序列是噬菌体T3和T7启动子。优选地，以可操作地与间隔区序列以及终止密码子被去除的修饰终止序列相连接的方式布置核酸。如本发明上下文中所使用，术语“间隔区序列”应当理解成表示编码融合到肽上的肽的一系列核酸。将间隔区序列结合到基因构建体中，因为在翻译之后由间隔区序列编码的肽保留在核糖体通道中，同时允许包含VL(以及任选VH)的蛋白自由地折叠并与另一种蛋白或核酸相互作用。优选的间隔区序列是例如编码丝状噬菌体M13mp19的基因III的氨基酸211-299的核酸。
使用本领域已知的和/或例如在Ausubel等人(1987)以及Sambrook等人(2001)中所述的方法在体外对展示文库进行转录和翻译。用于体外转录和翻译的市售系统的实例包括例如得自Promega的体外转录和翻译系统中的TNT。在冰上将表达反应物冷却通常使翻译终止。通过添加诸如乙酸镁或氯霉素的试剂对抗肽和／或其编码mRNA的解离而稳定核糖体复合物。通过如本文所述的多种方法筛选此类体外展示文库。
在另一个实例中，本公开的展示文库是核糖体失活展示文库。根据该实例，将核酸可操作地连接到编码第一间隔区序列的核酸。优选的是，该间隔区序列是富含甘氨酸／丝氨酸的序列，该序列允许含有由其编码的VL(以及任选VH)的蛋白自由地折叠并与目标抗原相互作用。第一间隔区序列连接到编码使核糖体失活的毒素的核酸。优选的是，毒素包括蓖麻毒蛋白A链，它使真核核糖体失活并且使核糖体停滞在翻译复合物上而不释放mRNA或编码的肽。将编码毒素的核酸连接到编码第二间隔区序列的另一核酸上。第二间隔区是占据核糖体通道的锚，并允许肽和毒素两者都正确地折叠并且变得具有活性。此类间隔区序列的实例是从M13噬菌体的基因III衍生的序列。通常使用诸如可从Promega获得的兔网织红细胞裂解物系统的系统对核糖体失活展示文库进行体外转录和翻译。当翻译编码毒素的mRNA并正确折叠这种蛋白时，核糖体失活，同时仍然结合到所编码的多肽和其从中翻译的mRNA两者上。
在另一个实例中，展示文库是mRNA展示文库。根据该实例，将核酸可操作地连接到编码间隔区序列的核酸上，诸如富含甘氨酸／丝氨酸的序列，该序列允许包含由本公开的表达文库编码的VL(以及任选VH)的蛋白自由地折叠并与靶抗原相互作用。将编码间隔区序列的核酸可操作地连接到转录终止子。通常使用本领域已知的方法体外转录mRNA展示文库，诸如使用可从Promega得到的HeLaScribe核提取体外转录系统(HeLaScribe NuclearExtract IN Vitro Transcription System)。随后使用本领域已知的技术将编码的mRNA共价连接到DNA寡核苷酸上，该DNA寡核苷酸共价连接到结合到核糖体的分子上，诸如嘌呤霉素上，并且在例如Roberts和Szostak(1997)中进行了说明。优选地，将寡核苷酸共价连接到补骨脂素部分上，由此寡核苷酸光交联到由本公开的表达文库编码的mRNA上。然后使用本领域已知的方法翻译从表达文库转录的mRNA。当核糖体到达mRNA与寡核苷酸的接点时，核糖体停滞并且嘌呤霉素部分进入核糖体的磷酸转移酶位点并因此将编码的多肽共价连接到其从中表达的mRNA上。
在又一个实例中，展示文库是共价展示文库。根据该实例，将编码包含vL(以及任选VH)的蛋白的核酸可操作地连接到第二核酸上，该第二核酸编码与其从中编码的DNA相互作用的蛋白。DNA相互作用蛋白的实例包括但不限于大肠杆菌噬菌体P2病毒A蛋白(P2A)以及从噬菌体186、HP1和PSP3分离的等效蛋白。使用诸如可从Promega得到的兔网织红细胞裂解物系统的系统对共价展示基因构建体进行体外转录和翻译。当翻译包含VL(以及任选VH)的蛋白与P2A蛋白的融合物时，P2A蛋白在其所结合的核酸中产生切口并与其形成共价键。因此，核酸片段共价地连接到其编码的多肽上。
在又一个实例中，展示文库是噬菌体展示文库，其中包含VL(以及任选VH)的表达蛋白展示在噬菌体的表面上(如例如在US5821047、US6248516和US6190908中所述)。所述的基本原理涉及将包含编码含有VL(以及任选VH)的蛋白的序列的第一核酸融合到包含编码噬菌体外壳蛋白的序列的第二核酸，诸如选自M13蛋白-3、M13蛋白-7或M13蛋白-8的噬菌体外壳蛋白。然后将这些序列插入合适的载体，即能够在细菌细胞中复制的载体。然后，用重组载体转化适当的宿主细胞(诸如大肠杆菌)。还用编码核酸片段可操作地连接到其上的衣壳蛋白的未修饰形式的辅助噬菌体颗粒来感染所述宿主细胞。在适合在颗粒表面上形成包含不止一个融合蛋白拷贝的重组噬菌粒颗粒的条件下培养转化的、感染的宿主细胞。在产生病毒颗粒(诸如λ噬菌体、T4噬菌体、M13噬菌体、T7噬菌体和杆状病毒)方面，该系统经证实是有效的。然后对此类噬菌体展示颗粒进行筛选，以鉴定具有足以结合到靶抗原的构象的展示结构域。
其他病毒展示文库包括逆转录病毒展示文库，其中所表达的肽或蛋白结构域展示在逆转录病毒颗粒的表面上，例如，如在US6297004中所述。
本公开还考虑了细菌展示文库(例如，如在US5516637中所述)、酵母展示文库(例如，如在US6423538中所述)或哺乳动物展示文库(例如，如在Strenglin等人1988中所述)。
用于筛选展示文库的方法是本领域已知的。在一个实例中，使用亲和纯化来筛选本公开的展示文库。亲和纯化技术是本领域已知的，并在例如Scopes(1994)中进行了说明。亲和纯化的方法典型地涉及：使包含由文库展示的VL(以及任选VH)的蛋白与靶抗原和/或超抗原(例如，蛋白A或蛋白L)接触，然后在洗涤之后，对仍然结合到抗原上的那些结构域进行洗脱。抗原优选地结合到另一分子上以便于纯化，诸如选自以下的分子：蛋白G、琼脂糖凝胶、琼脂糖、生物素、谷胱甘肽S转移酶(GST)和FLAG表位。因此，通过离心或通过结合到另一分子(例如链霉亲和素)上或结合特异性抗体(例如抗FLAG抗体或抗GST抗体)而简单地分离靶蛋白或核酸。
在另一个实例中，对本公开的展示文库进行表达从而允许使用FACS分析来鉴定结合的肽。使用FACS分析筛选文库在US645563中进行了说明。优选地，通过FACS分选来筛选体外展示文库。体外展示蛋白共价连接到适于FACS分选的颗粒或珠粒上，诸如玻璃、聚合物类，诸如聚苯乙烯、乳胶或交联葡聚糖例如琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、特氟隆等。将结合到颗粒或珠粒上的展示文库添加到抗原或超抗原上，该抗原或超抗原已用可检测的标记进行标记，诸如荧光分子或可通过第二荧光分子检出的分子。然后对珠粒进行洗涤并接受FACS分选，这允许具有结合的荧光抗原或超抗原的珠粒与未结合到荧光靶蛋白或核酸的珠粒分离。
作为另外一种选择，使用基于生物传感器的测定法来筛选文库，诸如Biacore传感器芯片技术(Biacore AB，UK)。Biacore传感器芯片是涂覆有用羧甲基化葡聚糖修饰的金薄层的玻璃表面，而靶蛋白或核酸共价连接到其上。然后使本公开的文库暴露于包含抗原的Biacore传感器芯片。
蛋白生产
诱变
使用本领域的标准方法来分离编码包含可变结构域的蛋白的DNA。例如，将引物设计成退火到位于感兴趣区域侧翼的可变结构域内的保守区上，然后使用这些引物来扩增插入的核酸，例如通过PCR进行扩增。合适的方法和/或引物是本领域已知的和／或例如在Borrebaeck(编辑)，1995和/或Froyen等人，1995中进行了说明。用于此类扩增方法的模板DNA的合适来源源于例如杂交瘤、转染瘤和／或表达包含可变结构域的蛋白的细胞(例如，如本文所述)。
在分离之后，通过本领域已知的多种方法中的任何一种将DNA修饰成包含编码必要位置处带负电的氨基酸的密码子。这些方法包括但不限于通过前面制备的编码蛋白的DNA进行定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变以及盒式诱变来制备。还可以通过限制性片段操纵或通过用合成的寡核苷酸进行重叠延伸PCR来构建重组蛋白的变体。诱变引物编码带负电的氨基酸，例如包括组成编码带负电的氨基酸(例如天冬氨酸(即GAA或GAG)或谷氨酸(即GAT或GAC))的密码子的残基。可以使用标准诱变技术来生成编码这种突变DNA的DNA。一般性指导原则可见于Sambrook等人1989和/或Ausubel等人1993。
定点诱变是一种用于制备取代变体(即突变蛋白)的方法。该技术是本领域已知的(参见例如Carter等人1985；或Ho等人1989)。简而言之，在进行DNA的定点诱变中，通过首先将编码所需突变的寡核苷酸杂交到(例如，插入一个或多个编码带负电的氨基酸的密码子)起始DNA的单链上而改变这种起始DNA。在杂交之后，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板，将DNA聚合酶用于合成完整的第二链。因此，编码所需突变的寡核苷酸被结合在所得的双链DNA中。可以在表达蛋白的基因内进行定点诱变从而在表达质粒中发生诱变，然后可以对所得的质粒测序以确认所需的带负电的氨基酸置换突变的引入。定点方案和方式包括市售试剂盒，例如多位点定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)。
PCR诱变还适合于制备起始蛋白的氨基酸序列变体。参见Higuchi，1990；Ito等人，1991。简而言之，当将少量的模板DNA用作PCR中的起始材料时，可以使用在序列上与模板DNA中的相应区域略有不同的引物来生成相对大量的特异性DNA片段，该特异性DNA片段仅在引物与模板不同的位置处与模板序列不同。
用于制备变体的另一种方法盒式诱变基于Wells等人，1985所述的技术。起始材料是包含待突变的起始蛋白DNA的质粒(或其他载体)。对需要突变的起始DNA中的密码子进行鉴定。在所鉴定的突变位点的每一侧上必须存在唯一的限制性内切酶位点。如果不存在此类限制位点，则可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法来生成这些位点以将它们引入到起始DNA中的适当位置。在这些位点处对质粒DNA进行切割从而将其线性化。使用标准程序来合成编码位于限制位点之间但是包含所需突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中单独地合成寡核苷酸的两条链然后使用标准技术杂交到一起。这种双链寡核苷酸被称为盒。该盒被设计成具有与线性化质粒的末端相容的5′和3′末端，从而使得它可以直接地连接到质粒上。现在该质粒包含突变的DNA序列。可以通过DNA测序来确认包含所编码的带负电的氨基酸置换的突变DNA。
还通过基于PCR的诱变使用双链质粒DNA作为模板通过寡核苷酸定向诱变来生成单个突变(Sambrook等人，2001)。
在一个实例中，如果本公开的蛋白包含位置50的天冬氨酸和位置56的谷氨酸，则以下一项或更多项适用：
(i)位置51的氨基酸不是丙氨酸；
(ii)位置52的氨基酸不是丝氨酸；
(iii)位置53的氨基酸不是天冬酰胺或丝氨酸；
(iv)位置54的氨基酸不是亮氨酸；和/或
(v)位置56的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸。
在一个实例中，如果本公开的蛋白包含位置50的天冬氨酸和位置53的天冬氨酸，则以下一项或更多项适用：
(i)位置51的氨基酸不是丙氨酸；
(ii)位置52的氨基酸不是赖氨酸；
(iii)位置54的氨基酸不是亮氨酸；
(iv)位置55的氨基酸不是组氨酸；和/或
(v)位置56的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸。
在一个实例中，如果本公开的蛋白包含位置50或位置55的一个带负电的氨基酸，则以下一项或更多项适用：
(i)位置51的氨基酸不是丙氨酸；
(ii)位置52的氨基酸不是赖氨酸；
(iii)位置53的氨基酸不是天冬酰胺或丝氨酸或苏氨酸；
(iv)位置54的氨基酸不是亮氨酸或精氨酸或色氨酸或赖氨酸；和/或
(v)位置56的氨基酸不是苏氨酸或丝氨酸或苯丙氨酸。
在一个实例中，本公开的蛋白不含一个或多个(例如两个或三个或四个)FR或不来源于或基于选自08、018、L18、L4、L12、L22、A2、DPK14、A17、A1、A11、L20、L6和B3的人类种系VK片段。
在一个实例中，本公开包含两个或更多个带负电的氨基酸的蛋白不含一个或多个(例如两个或三个或四个)FR或不来源于或基于选自08、018、L18、L4、L12和L22的人类种系VK片段。
在一个实例中，本公开的蛋白不含VL的全人类CDR2。对于“VL的全人类CDR2”将理解成表示CDR2可来自非人的物种或可以为合成的或可以为人类CDR2的突变形式，例如通过亲和力成熟产生。
重组表达
就重组蛋白而言，优选地将编码该蛋白的核酸置于表达载体中，然后将表达载体转染到宿主细胞中，优选可以产生二硫桥或键的细胞，诸如大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，诸如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或原本不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，从而获得在重组宿主细胞中的蛋白的合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述论文包括Skerra等人(1993)和Pluckthun(1992)。用于实现这些目的的分子克隆技术是本领域已知的并且例如在Ausubel等人(1987)和Sambrook等人(2001)中进行了说明。广泛多样的克隆以及体外扩增方法适于构建重组核酸。生产重组抗体的方法也是本领域已知的。参见US4816567。
在分离之后，优选地将编码本公开的蛋白的核酸插入表达构建体或可复制载体中，用于进一步克隆(DNA的扩增)或用于在无细胞系统中或在细胞中进行表达。优选地，将核酸可操作地连接到启动子上。
如本文所用，术语“启动子”应当在其最广义的背景下理解并且包括基因组基因的转录调节序列，包括在具有或不具有另外的调节元件(例如上游活化序列、转录因子结合位点、增强子和沉默子)下对于精确转录起始所必需的TATA盒或起始子元件，这些调节元件例如响应于发育和/或外部刺激或以组织特异性方式改变核酸的表达。在本发明的上下文中，术语“启动子”还用来说明赋予、活化或增强其可操作地连接的核酸的表达的重组核酸、合成核酸或融合核酸或衍生物。优选的启动子可以包含一个或多个特异性调节元件的另外拷贝，以进一步增强表达和/或改变所述核酸的空间表达和/或时间表达。
如本文所用，术语“可操作地连接到”表示将启动子相对于核酸定位使得核酸的表达受启动子的控制。
本公开还考虑了无细胞表达系统。例如，将编码本公开蛋白的核酸可操作地连接到合适的启动子上，例如T7启动子，并使所得的表达构建体暴露于足以转录和翻译的条件下。用于体外表达或无细胞表达的典型表达载体已有说明并且包括但不限于TNT T7和TNTT3系统(Promega)、pEXP1-DEST和pEXP2-DEST载体(Invitrogen)。
用于在细胞中表达的许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一者或更多者：信号序列、编码本公开的蛋白的序列(例如，从本文提供的信息中得到的)、增强子元件、启动子以及转录终止序列。技术人员将知道合适的用于蛋白表达的序列。例如，示例性信号序列包括原核分泌信号(例如pelB、碱性磷脂酶、青霉素酶、Ipp或热稳定性肠毒素II)、酵母分泌信号(例如转化酶前导序列、因子前导序列或酸性磷酸酶前导序列)或哺乳动物分泌信号(例如单纯疱疹gD信号)。
示例性启动子包括在原核生物中具有活性的那些(例如phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统以及杂合启动子，诸如tac启动子)。这些启动子可用于在原核生物中表达，原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠细菌科，诸如埃希杆菌属(Escherichia)例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及杆菌，诸如枯草芽孢杆菌；(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)，假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，和链霉菌属(Streptomyces)。优选地，宿主是大肠杆菌。一个优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但其他菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)以及大肠杆菌W3110(ATCC27,325)、DH5a或DH10B也是合适的。
在哺乳动物细胞中具有活性的示例性启动子包括巨细胞病毒立即早期启动子(CMV-IE)、人延长因子1-a启动子(EF1)、小核RNA启动子(U1a和U1b)、a-肌球蛋白重链启动子、猿猴病毒40启动子(SV40)、劳氏肉瘤病毒启动子(RSV)、腺病毒主要晚期启动子、β-肌动蛋白启动子、包含CMV增强子／β肌动蛋白启动子的杂合调节元件，或免疫球蛋白启动子或其活性片段。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCCCRL165D；人胚肾系(经亚克隆用于在悬浮培养中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
适于在酵母细胞诸如选自巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(S.pombe)的酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于：ADH1启动子、GAL1启动子、GAL4启动子、CUP1启动子、PH05启动子、nmt启动子、RPR1启动子或TEF1启动子。
适于在昆虫细胞中表达的典型启动子包括但不限于OPEI2启动子、从家蚕(Bombyxmuri)分离的昆虫肌动蛋白启动子、果蝇(Drosophila sp.)Dsh启动子(Marsh等人，2000)以及诱导型金属硫蛋白启动子。用于表达重组蛋白的优选昆虫细胞包括选自以下的昆虫细胞：BT1-TN-5B1-4细胞和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(例如sf19细胞、sf21细胞)。适于表达核酸片段的昆虫包括但不限于果蝇。还考虑了草地贪夜蛾的用途。
用于将分离的核酸分子或包含该核酸分子的基因构建体引入细胞进行表达的手段对于本领域的技术人员而言是已知的。用于给定细胞的技术取决于已知的成功技术。用于将重组DNA引入细胞中的手段包括微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染(诸如通过使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和／或cellfectin(Gibco，MD，USA))、PEG介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击(诸如通过使用DNA包被的钨或金颗粒(AgracetusInc.，WI，USA))等等。
可以在多种培养基中培养用于生产本公开蛋白的宿主细胞，具体取决于所用的细胞类型。诸如Ham's Fl0(Sigma)、最低必需培养基((MEM)，Sigma)、RPMl-1640(Sigma)以及Dulbecco氏改良Eagle氏培养基((DMEM)，Sigma)的市售培养基适用于培养哺乳动物细胞。用于培养本文讨论的其他细胞类型的培养基是本领域已知的。
蛋白的分离
本公开的蛋白优选地得到分离。对于“分离的”表示蛋白基本上得以纯化或从其天然存在的环境中移出，例如处于异源环境中。对于“基本上纯的”表示蛋白基本上不含污染剂，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％不含污染剂。
用于纯化本公开的蛋白的方法是本领域已知的和／或本文说明的。例如，使蛋白与能够结合到其上的试剂在足以使结合发生的时间和条件下接触。任选地，在洗涤以除去未结合的蛋白之后，本公开的蛋白得以分离(例如洗脱)。
当使用重组技术时，本公开的蛋白可以在细胞内、在周质间隙中产生或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生蛋白，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤将微粒碎片(宿主细胞或溶解片段)除去。Carter等人(1992)说明了用于分离分泌到大肠杆菌周质间隙中的抗体的程序。简而言之，在乙酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在下将细胞糊(cell paste)经大约30分钟融化。可以通过离心除去细胞碎片。当将蛋白分泌到培养基中时，通常首先使用市售蛋白浓缩过滤器例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元将得自此类表达系统的上清液浓缩。可以将蛋白酶抑制剂诸如PMSF包括在上述步骤的中任一种中以抑制蛋白水解，并且可以包括多种抗生素以防止偶发污染物的生长。
从这些细胞制备的蛋白可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析以及亲和层析进行纯化，其中亲和层析是优选的纯化技术。作为亲和配体的蛋白A的适应性取决于蛋白中存在的任何抗体Fc结构域的种类和同种型(如果确实存在的话)。可以使用蛋白A来纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，1983)。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型以及用于人γ3(Guss等人，1986)。另外可以使用本公开蛋白中的可变结构域结合到其上或升高到其上的抗原或表位决定簇来进行亲和层析。亲和配体所附连的基质最常见的是琼脂糖，但是其他基质也是可用的。与使用琼脂糖可以实现的相比较，机械稳定的基质诸如受控多孔玻璃或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)允许更快的流速和更短的加工时间。用于蛋白纯化的其他技术诸如离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀法、反相高效液相色谱、硅石上的层析、肝素上的层析、阴离子或阳离子交换树脂上的SEPHAROSETM层析(诸如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀法也是可用的，具体取决于待回收的蛋白。
技术人员还将知道的是，本公开的蛋白可以修饰成包含标签以促进纯化或检测，例如聚组氨酸标签，例如六聚组氨酸标签，或流感病毒血凝素(HA)标签、或猿猴病毒5(V5)标签、或FLAG标签、或谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。优选地，标签是六聚组氨酸标签。然后使用本领域已知的方法诸如亲和纯化对所得的蛋白进行纯化。例如，包含六聚组氨酸标签的蛋白通过以下方式纯化：使包含蛋白的样品与固定在固体或半固体载体上特异性结合六聚组氨酸标签的氮川三乙酸镍(Ni-NTA)接触，将该样品洗涤以除去未结合的蛋白，随后将结合蛋白洗脱。作为另外一种选择或除此之外，将结合到标签上的配体或抗体用于亲和纯化方法。
在任何初步纯化步骤之后，可以使包含本公开的蛋白和污染物的混合物接受低pH疏水相互作用层析。
蛋白合成
使用标准技术(例如使用BOC或FMOC化学)从其确定的氨基酸序列可容易地合成本公开的蛋白。合成肽使用固相、液相或肽缩合或它们的任何组合的已知技术而制备，并且可以包含天然的和/或非天然的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是具有Merrifield，1963的原固相程序的脱保护、中和、偶合以及洗涤方案或由Carpino和Han，1972说明的碱不稳定性Na-氨基保护的9-芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸的标准Boc(Na-氨基保护的Na-叔丁氧羰基)氨基酸树脂。Fmoc和Boc Nα-氨基保护的氨基酸均可以从多种商业来源获得，诸如Fluka、Bachem、Advanced Chemtech、Sigma、Cambridge Research Biochemical、Bachem或Peninsula Labs。
评估蛋白聚集抗性的方法
可以使用本领域已知的方法分析本公开的蛋白或组合物的聚集抗性。可以使用本领域的技术人员可接受的聚集抗性参数。示例性参数在下文有更详细的说明。在示例性实例中，评估了热再折叠能力(refoldability)。在一些实例中，评估了本公开的蛋白的表达水平(例如，如通过％产率度量)。在其他实例中，评估了本公开的蛋白的聚集水平。在某些实例中，将本公开的蛋白或组合物的聚集抗性与合适的对照进行比较。
可以使用本领域已知的多种非限制性生物物理或生物化学技术来分析本公开的蛋白的聚集抗性。这种技术的实例是分析光谱学，诸如圆二色(CD)光谱。CD光谱测量随增加的温度而变化的蛋白的光学活性。圆二色(CD)光谱测量由于结构不对称性产生的左手偏振光对比右手偏振光的吸收差异。无序或去折叠的结构导致CD光谱与有序或折叠结构的光谱差异巨大。CD光谱反映蛋白对于增加温度的变性作用的灵敏度并因此指示蛋白的聚集抗性(参见van Mierlo和Steemsma，2000)。
用于测量聚集抗性的另一种示例性分析光谱方法是荧光发射光谱(参见vanMierlo和Steemsma，上文)。用于测量聚集抗性的又一种示例性分析光谱方法是核磁共振(NMR)光谱(参见例如van Mierlo和Steemsma，上文)。
在其他实例中，以生物化学方式测量本公开的组合物或蛋白的聚集抗性。用于评定聚集抗性的示例性生物化学方法是热挑战测定法（thermal challenge assay)。在“热挑战测定法”中，使本公开的蛋白接受一定范围的高温持续一个设定的时间段。例如，使测试蛋白接受一定范围的升高的温度。然后通过相关生物化学测定法来测定蛋白的活性。例如，可以通过功能或定量ELISA来测定结合蛋白的结合活性。用于测定结合亲和力的另一种方法采用表面等离子体共振。表面等离子体共振是允许例如使用BIAcore系统(PharmaciaBiosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变对实时双特异性相互作用进行分析的一种光学现象。
在其他实例中，通过测量其聚集倾向来确定本公开的组合物或蛋白的聚集抗性。可以通过许多非限制性生物化学或生物物理技术对聚集进行测量。例如，本公开的组合物或蛋白的聚集可使用浊度测量而评估。为此，监测320nm处或作为另外一种选择330nm、340nm或350nm处的吸光度。
作为另外一种选择或作为另外一种选择，可以使用层析法例如尺寸排阻层析(SEC)来评估组合物或蛋白的聚集抗性。SEC基于尺寸大小而分离分子。柱子填充有聚合物凝胶的半固体珠粒，该凝胶将允许离子和小分子进入它们内部但是较大的分子不能进入。当将蛋白或组合物施加到柱子顶部时，与大的蛋白聚集体可获得的相比较，紧密折叠的蛋白(即非聚集蛋白)通过更大体积的溶剂进行分配。因此，大的聚集体更快地移动通过该柱子，并且以此方式，混合物可以被分离或分级分离成其组分。当每个馏分从凝胶中洗脱时，可以单独地对它们进行定量(例如，通过光散射)。因此，可以通过将馏分浓度与施加到凝胶上蛋白的总浓度进行比较来确定本公开的蛋白或组合物的聚集百分比。聚集抗性组合物基本上作为单个馏分从柱子中洗脱出来，并在洗脱谱图或层析图中基本上作为单峰出现。
在其他实例中，在表达蛋白(例如重组表达)之后，通过测量回收的蛋白的量(本文为“％产率”)对本公开的组合物的聚集抗性进行评估。例如，可以通过针对每毫升宿主培养基确定回收蛋白的毫克数(例如，mg／ml蛋白)来测量％产率。在一个优选的实例中，在哺乳动物宿主细胞(例如CHO细胞)中表达之后评估％产率。
在又一个实例中，在储存一个限定的时间段之后通过在一定范围的温度下(例如，从约25℃至约80℃)监测蛋白的损失而评估本公开的组合物的聚集抗性。可以使用本领域已知的任何蛋白定量方法来测定回收蛋白的量或浓度，并与蛋白的初始浓度进行比较。示例性蛋白定量方法包括SDS-PAGE分析或Bradford测定。
在另外其他实例中，可以通过对标记化合物与结合性分子的变性或去折叠部分的结合进行定量而评估本公开的蛋白的聚集抗性。此类分子优选地为疏水的，因为它们优选地与通常埋在天然蛋白内部的氨基酸(但是在变性或去折叠的结合性分子中它们是暴露的)的较大疏水补丁相结合或相互作用。一种示例性标记化合物是疏水性荧光染料1-苯胺基-8-萘磺酸盐(ANS)。
其他实例涉及检测仅结合到正确折叠的可变结构域上的蛋白的结合(例如，蛋白A结合到正确折叠的IgG3vH上)。
偶联物
本公开还提供了偶联到另一种化合物上的本公开的蛋白，例如，包含偶联到不同部分上的本公开的蛋白的偶联物(免疫偶联物)，例如直接地或间接地结合到蛋白上的治疗剂。其他部分的实例包括但不限于酶、荧光团、细胞毒素、放射性同位素(例如碘-131、钇-90或铟-111)、免疫调节剂、抗血管生成剂、抗新生血管形成和／或其他血管生成剂、毒素、抗增殖剂、促凋亡剂、化学治疗剂以及治疗性核酸。
细胞毒素包括对细胞有害(例如杀死)的任何试剂。有关本领域已知的这些类别的药物及其作用机理，参见Goodman等人(1990)。与制备抗体免疫毒素相关的另外技术在例如US5,194,594中有所提供。示例性毒素包括白喉A链、白喉毒素的未结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类。参见例如WO93／21232。
用于形成本公开的免疫偶联物的合适治疗剂包括：紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、以及嘌罗霉素、抗代谢药类(诸如甲氨蝶呤、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺、羟基脲、门冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂类(诸如氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲菌素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C、顺铂和其他铂衍生物类，诸如卡铂)、抗生素类(诸如更生霉素(以前称为放线菌素)、博来霉素、柔红霉素(以前称为道诺霉素)、多柔比星、伊达比星、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、安曲霉素(AMC))。
多种放射性核素可用于产生放射性偶联的抗体。实例包括但不限于212Bi、131I、90Y和186Re。
在另一个实例中，蛋白可以偶联到“受体”(诸如链霉亲和素)以用于预靶向，其中将蛋白-受体偶联物施用给患者，紧接着使用清除剂从循环中除去未结合的偶联物，然后施用偶联到治疗剂(例如放射性核素)的“配体”(例如亲和素)。
本公开的蛋白可进一步修饰成包含本领域已知的并且易于获得的另外的非蛋白部分。优选地，适于蛋白衍生的部分是水溶性的聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇／丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖或聚乙烯醇。
用于将化合物偶联到本领域已知的蛋白残基上的多种方法是本领域已知的并且对于技术人员将是显而易见的。
用途
本公开的蛋白可用于多种应用，包括研究、诊断/预测、工业和治疗应用。取决于蛋白所结合的抗原，该蛋白可以用于将化合物递送到细胞，例如以杀死该细胞或阻止生长和／或用于成像和／或用于体外测定。在一个实例中，蛋白可用于成像以及将细胞毒性剂递送到细胞，即，它偶联到可检测标记上，并且细胞毒性剂或组合物包含其中一些偶联到细胞毒性剂上而其中一些偶联到可检测标记上的蛋白的混合物。
本文所述的蛋白还可以充当拮抗剂以抑制(可以是降低或阻止)(a)(例如配体、抑制剂)结合到受体上，(b)受体信号传导功能，和／或(c)刺激功能。充当受体功能拮抗剂的蛋白可以直接或间接地阻断配体结合(例如通过引起构象改变)。
本公开的蛋白还可以是受体的激动剂，从而例如(a)增强或诱导(例如配体)结合到受体上，(b)增强或诱导受体信号传导功能，和／或(c)提供刺激功能。
抗原
本公开考虑了包含能够特异性结合到除了在本文的任一实例、实施例或权利要求书中明确除外的那些之外的任何抗原上的根据本公开修饰的至少一个VL(以及任选VH)的蛋白，即本公开的实例与要求特异性抗原相对是一般性的。
在一个实例中，本公开的蛋白不结合到来自微生物和/或来自鸟类的蛋白上。
在一个实例中，蛋白不结合到溶菌酶(例如鸡蛋溶菌酶)和/或β-半乳糖苷酶和/或淀粉酶(例如α淀粉酶)和/或脱水酶(例如碳酸酐酶)和/或B5R(例如来自牛痘(Vaccinia))上。在一个实例中，蛋白不结合到人白蛋白上。在一个实例中，蛋白不结合到人VEGF上。
示例性蛋白特异性结合到人蛋白上或衍生自针对人蛋白产生的抗体。
本公开的实例考虑了特异性结合到与疾病或障碍(即病状)相关的抗原上的蛋白，例如与癌或癌性／转化细胞相关或由所述细胞表达，和／或与自身免疫疾病相关，和／或与炎性疾病或病状相关，和／或与神经退行性疾病相关，和/或与免疫缺陷障碍相关。
针对其可以产生本公开的蛋白的示例性抗原包括BMPRIB(骨形态生成蛋白受体IB型；WO2004063362)、EI6(LATl，SLC7A5，WO2004048938)、STEAPI(前列腺的六跨膜上皮细胞抗原，WO2004065577)、CA125(MUC16，WO2004045553)、MPF(MSLN，SMR，巨核球增强因子，间皮素，WO2003101283)、Napi3b(WO2004022778)、Sema5b(WO2004000997)、PSCA(US2003129192)、ETBR(WO2004045516)、MSG783(WO2003104275)、STEAP2(WO2003087306)、TrpM4(US2003143557)、CRIPTO(US2003224411)、CD21(WO2004045520)、CD79b(WO2004016225)、SPAPIB(WO2004016225)、HER2(WO2004048938)、NCA(WO2004063709)、MDP(WO2003016475)、IL-20Ra(EP1394274)、短蛋白聚糖(US2003186372)、EphB2R(WO2003042661)、ASLG659(US20040101899)、PSCA(WO2004022709)、GEDA(WO2003054152)、BAFF-R(WO2004058309)、CD22(WO2003072036)、CD79a(WO2003088808)、CXCR5(WO2004040000)、HLA-DOB(WO9958658)、P2X5(WO2004047749)、CD72(WO2004042346)、LY64(US2002193567)、FcRHI(WO2003077836)、IRTA2(WO2003077836)、TENB2(WO2004074320)、CD20(WO94/11026)、vEGF-A(Presta等人，1997)、p53、EGFR、孕酮受体、组织蛋白酶D、Bcl-2、E钙粘蛋白、CEA、Lewis X、Ki67、PCNA、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11c、CD11d、c-Mvc、tau、PrPSC、TNFa、音猬因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、EPHA2、催乳素受体、催乳素、IL-2、TNF-受体、IL-21、IL-21受体、CXCR7、FGFR2、FGF2或Aβ。
在另一个实例中，本公开的蛋白结合到可溶性蛋白上，优选体内分泌的可溶性蛋白。示例性可溶性蛋白包括细胞因子类。术语“细胞因子”是由一个细胞群释放的蛋白或多肽的通称，它们在另一个细胞上作为细胞间介质发挥作用。细胞因子的实例包括淋巴因子、单核因子、生长因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素类诸如卵泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)、肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α和-β；缪勒管抑制物质、促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子类诸如NGF-B、血小板生长因子、转化生长因子类(TGF)诸如TGF-a和TGF-β，胰岛素样生长因子I或II，促红细胞生成素(EPO)，骨诱导性因子、干扰素类例如干扰素α、β或γ；集落刺激因子类(CSF)诸如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)，白介素类(li)诸如IL-1、IL-Ia、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21和LIF。优选的细胞因子选自由白介素2、13或21、TNFa、TGFβ、BAFF和GM-CSF组成的组。
在另一个实例中，可溶性蛋白是趋化因子。趋化因子通常作为化学引诱物发挥作用，以将免疫效应细胞募集到趋化因子表达位点。趋化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MlPl-a或MIPl-β。技术人员将认识到，某些细胞因子还已知具有化学引诱物作用并且也可归类到术语趋化因子下。优选的趋化因子是RANTES。
在另一个实例中，可溶性蛋白是肽类激素。示例性肽类激素包括胰岛素、NPY、PYY、高血糖素和催乳素。
在一个另外的实例中，可溶性蛋白是蛋白酶。示例性蛋白酶包括因子X、因子VII、因子Ⅸ或激肽释放酶。
在另一个实例中，本公开的蛋白结合到受体或膜相关蛋白上。示例性抗原包括G-蛋白偶联受体(诸如CXCR7、CXCR5、CXCR3、C5aR或β-2-肾上腺素能受体)或离子通道(诸如钠通道或钾通道或钙通道，优选地烟碱乙酰胆碱受体)或单跨膜蛋白(诸如T-细胞受体或催乳素受体或细胞因子受体(例如IL-21受体)或1类MHC或2类MHC或CD4或CD8)。
在一个另外的实例中，本公开的蛋白结合到以下一者或更多者：干扰素α受体1(IFNAR1)、血管生成素-2、IL-4Ra、IL-33、CXCL13、晚期糖基化终末产物的受体(RAGE)、ICOS、IgE、干扰素a、IL-6、IL-6受体、EphB4、CD19、GM-CSF受体、CD22、IL-22、EphA2、IL-13、高迁移率族蛋白1(HMG1)、间变型淋巴瘤激酶(ALK)、整联蛋白(例如整联蛋白αvβ3)、Eph受体、IL-9、EphA4、PC细胞衍生生长因子(PCDGF)、神经生长因子(NGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR，例如PDGFRa或PDGFR^)或IL-5。
本公开的蛋白可以从中衍生的示例性抗体对于技术人员将是显而易见的并且包括上文列出的那些。
示例性双特异性蛋白可以结合到感兴趣抗原的两个不同表位上。其他此类蛋白可以使一个抗原结合位点与另一种蛋白的结合位点相结合。作为另外一种选择，感兴趣区域的抗抗原可以与结合到白细胞上的触发分子上的区域相结合，触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG(FcyR)的Fc受体，诸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和/或FcyRIII(CDl6)，从而将细胞防御机制集中和定位到表达感兴趣抗原的细胞上。还可以使用双特异性蛋白将细胞毒性剂定位到表达感兴趣抗原的细胞。这些蛋白具有结合感兴趣抗原的区域以及结合细胞毒性剂(例如肥皂草素、抗干扰素-a、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的区域。WO96／16673说明了一种双特异性抗ErbB2／抗FcyRIII抗体，美国专利5,837,234公开了一种双特异性抗ErbB2／抗FcyRI抗体。一种双特异性抗ErbB2／Fca抗体在WO98／02463中示出。US5,821,337教导了一种双特异性抗ErbB2／抗CD3抗体。
药物组合物和治疗方法
本公开的蛋白(义词活性成分)可用于肠胃外、外用、口腔或局部给药、气溶胶给药或经皮给药以用于预防性或治疗性治疗。能够以多种单位剂型施用这些药物组合物，这取决于给药方法。例如，适于经口给药的单位剂型包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂或锭剂或通过肠胃外给药。应当认识到，本公开的药物组合物当经口给药时应当保护避免消化。这典型地通过使蛋白与组合物复合从而使它抗酸水解或酶水解，或通过将化合物包装到适当的抗性载体诸如脂质体中来实现。避免蛋白消化的手段是本领域已知的。
典型地，将治疗有效量的蛋白配制成组合物以便施用给受试者。短语“治疗有效量”是指足以在受试者中促进、诱导和/或增强治疗或其他疗效的量。将显而易见的是，在这些制剂中本公开的蛋白的浓度可以广泛地变化，并将根据所选的特定给药模式和患者的需要主要基于体液量、粘度、体重等进行选择。取决于疾病的类型和严重性，治疗有效量可为约1μg／kg至100mg／kg(例如0.1-10mg／kg)蛋白，无论是例如通过一次或更多次单独给药还是通过连续输注。典型的每日剂量可在从约1μg／kg至100mg／kg或更多的范围内。对于经数天或更长时间的反复给药，取决于病状，治疗持续到直至发生所需的疾病状状抑制。示例性给药分案包括施用约4mg／kg的初始负荷剂量，接着约2mg／kg蛋白的每周维持剂量。其他给药方案也是可用的。例如，以约375mg／m2的剂量来施用抗CD20抗体，诸如利妥昔单抗。以5mg／kg-10mg／kg的剂量施用抗VEGF抗体，诸如贝伐单抗。以4mg／kg-8mg／kg的负荷剂量以及2mg／kg-6mg／kg的每周一次／每两周一次维持剂量施用抗Her2／neu抗体，诸如曲妥珠单抗。以约400mg／周的剂量施用抗TNFa抗体诸如阿达木单抗以治疗类风湿性关节炎，或以160mg的负荷剂量持续第一周以及40mg／周的维持剂量，或以80mg的负荷剂量以及40mg／周的维持剂量用于治疗银屑病。通过常规技术和测定法可容易地监测治疗过程。
本公开的蛋白的合适剂量将根据特定的蛋白、待诊断／治疗/预防的病状和/或进行治疗的受试者而变化。确定合适的剂量在熟练医生的能力范围之内，例如通过以次优剂量开始并逐渐增加地改变剂量以确定最佳或可用剂量。作为另外一种选择，为了确定用于治疗/预防的适当剂量，使用得自细胞培养测定或动物研究的数据，其中合适的剂量在包括具有很小或无毒性的活性化合物的ED50的循环浓度的范围之内。剂量可以在这个范围内改变，具体取决于采用的剂型以及使用的给药途径。最初可以从细胞培养测定法来估计治疗/预防有效剂量。可以在动物模型中配制剂量，以达到包括在细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的化合物浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定人体中的有用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法测量。
作为另外一种选择，以浓缩剂量配制本公开的蛋白，在施用给受试者之前将该浓缩剂量稀释成治疗有效剂量。
本公开的组合物尤其可用于肠胃外给药，例如配制成通过静脉内、肌内、皮下、经皮或其他此类途径进行注射，包括蠕动给药以及直接滴注到肿瘤或疾病位置(腔内给药)。用于给药的组合物通常将包括溶于药学上可接受的载体(优选水性载体)中的本公开蛋白的溶液。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。其他示例性载体包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液以及5％人血清白蛋白。还可以使用非水性载体，诸如混合的油和油酸乙酯。脂质体也可以用作载体。载体可以含有增强等渗性和化学稳定性的微量添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。组合物可根据需要包含药学上可接受的辅助物质以接近生理条件，诸如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
用于制备药物组合物的技术通常是本领域已知的，如通过Remington’sPharmaceutical Sciences，16th Ed.Mack Publishing Company，1980举例说明。
WO2002／080967说明了用于施用包含用于治疗例如哮喘的蛋白的气雾化组合物的组合物和方法，它们也适于施用本公开的蛋白。
本公开的蛋白可以与第二化合物结合在药物组合物、制剂或给药方案中作为联合疗法。药物联合制剂或给药方案的第二化合物具有与联合制剂的蛋白的互补活性，使得它们不对彼此造成不利影响。
第二化合物可以是化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子以对于预期的目的有效的量而适当地存在于联合制剂中。包含本公开蛋白的药物组合物还可以具有治疗有效量的化学治疗剂，诸如微管蛋白形成抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA结合剂。
还可以使用药物“缓释”胶囊或组合物。缓释制剂通常被设计成在延长的时期内提供恒定的药物水平并且可以用来递送本公开的化合物。
本公开还提供了一种治疗或预防受试者中的病状的方法，该方法包括将治疗有效量的本公开的蛋白施用给对其有需要的受试者。
如本文所用，在防止病状的背景中的术语“防止”包括施用足以停止或抑制特定疾病或病状的至少一种症状发展的一定量的本文所述的蛋白。
如本文所用，术语“治疗”包括施用足以降低或消除特定疾病或病状的至少一种症状的治疗有效量的本文所述的抑制剂和/或药剂。
如本文所用，术语“受试者”应当理解成表示任何动物，包括人类，优选哺乳动物。示例性受试者包括但不限于人类、灵长类、家畜(例如绵羊、牛、马、驴、猪)、宠物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)、俘获的野生动物(例如狐狸、鹿)。优选地，哺乳动物是人或灵长类。更优选地，哺乳动物是人。
如本文所用，“病状”是对正常功能的破坏或干扰，并且不限于任何特定病状，并将包括疾病或障碍。在一个实例中，病状是癌症或自身免疫或炎性障碍。
示例性癌症包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤以及白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体实例包括血癌(例如淋巴瘤或白血病)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈癌。优选地，癌症是乳腺癌或肺癌或卵巢癌或前列腺癌。
炎性或自身免疫病状是由免疫球蛋白或T细胞受体对抗原的反应而引起的病状。这些病状包括自身免疫疾病和超敏反应(例如，I型：过敏反应、荨麻疹、食物过敏、哮喘；II型：自身免疫溶血性贫血、输血反应；III型：血清病、坏死性血管炎、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、狼疮；Iv型：接触性皮炎、移植排斥)。自身免疫疾病包括类风湿性障碍(诸如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、硬皮病、狼疮诸如SLE和狼疮肾炎、多发性肌炎／皮肌炎、冷球蛋白血症、抗磷脂抗体综合征和银屑病关节炎)、骨性关节炎、自身免疫胃肠和肝障碍(诸如炎性肠疾病(例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、自身免疫性胃炎和恶性贫血、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬变、原发性硬化性胆管炎和乳糜泻)、血管炎(诸如ANCA相关性血管炎，包括丘-施二氏血管炎、韦格纳肉芽肿病和多动脉炎)、自身免疫性神经障碍(诸如多发性硬化、斜视性眼阵挛肌阵挛综合征、重症肌无力、视神经脊髓炎和自身免疫性多神经病)、肾障碍(诸如肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征和伯格病)、自身免疫性皮肤学障碍(诸如银屑病、风疹、荨麻疹、寻常天疱疮、大疱性类天疱疮和皮肤红斑狼疮)、血液学障碍(诸如血小板减少性紫癜、血栓性血小板减少性紫癜、输血后紫癜和自身免疫性溶血性贫血)、动脉硬化、葡萄膜炎、自身免疫听力疾病(诸如内耳疾病和听力损失)、贝切特病、雷诺综合征、器官移植以及自身免疫性内分泌障碍(诸如糖尿病相关自身免疫疾病，例如胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、阿狄森病和自身免疫性甲状腺病(例如格雷夫斯病和甲状腺炎))。更优选的此类疾病包括例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、ANCA相关性血管炎、狼疮、多发性硬化、斯耶格伦综合征、格雷夫斯病、IDDM、恶性贫血、甲状腺炎以及肾小球肾炎。
在另一个实例中，炎性病状是涉及嗜中性细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞的病状，其中发生细胞因子释放、组胺释放、氧化爆发、吞噬作用、其他颗粒酶的释放和趋化性。超敏反应(上述)也可以被认为是炎性疾病(急性或慢性)，因为它们通常涉及补体激活以及各种白细胞诸如嗜中性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞等的募集／浸润。
将本公开的组合物以与制剂相容的方式以及以具有治疗／预防有效性的量施用。制剂易于以多种方式施用，例如通过摄取或注射或吸入。
其他治疗性方案可以与施用本公开的蛋白相结合。联合治疗可以作为同时的或序贯的方案施用。当序贯施用时，可以两次或更多次给药的方式施用该组合。联合给药包括同时给药(使用单独的制剂或单一药物制剂)和以任一顺序的顺序给药，其中当两种(或所有)活性剂都同时地产生它们的生物学活性时，优选地存在一个时间段。
在治疗性用途之前，优选地在体外和／或体内对本公开的蛋白进行测试，例如如下所述。
体外测试
在一个实例中，本公开的蛋白结合到抗原上，即使偶联到化合物上也是如此。在蛋白从预先存在的蛋白(例如抗体)衍生的情况下，本公开的蛋白可以至少与它从中衍生的蛋白同样好地结合到抗原上。作为另外一种选择，本公开的蛋白以它从中衍生蛋白的至少约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％的亲和力或亲合力结合到抗原或不含带负电残基的蛋白的一种形式上。
用于确定蛋白结合亲和力的示例性方法包括简单的免疫测定法，该免疫测定法显示出蛋白阻断抗体结合到靶抗原上的能力，例如竞争性结合测定法。在一个测定法中确定竞争性结合，其中测试的蛋白抑制参考蛋白与共同抗原的特异性结合。多种类型的竞争结合测定法是已知的，例如固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心式竞争测定(参见Stahli等人，1983)、固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人，1986)、固相直接标记的测定、固相直接标记的夹心式测定(参见Harlow和Lane，1988)、固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，1990)或直接标记的RIA(Moldenhauer等人，1990)。典型地，这样的测定涉及使用结合到固体表面或具有未标记的测试蛋白和标记的参考蛋白之一的细胞上的纯化抗原。在测试蛋白存在下通过确定结合到固体表面或细胞的标记的量来测量竞争性抑制。
本公开还涵盖用于测试本公开蛋白的活性的方法。多种测定法可用于体外评定本公开的蛋白的活性。例如，将本公开的蛋白施用到细胞或其群体中，以确定它是否能够结合到所述细胞上和/或被所述细胞内化。这样的测定法通过用可检测标记来标记本公开的蛋白而促进(即，产生偶联物)，然而，这不是必要的，因为本公开的蛋白也能够用标记的蛋白检测。这样的测定法可用于评定本公开的蛋白将化合物(即有效载荷)递送到细胞中的能力和/或它在成像中的实用性。优选地，细胞表达本公开的蛋白所结合的抗原并且更优选地是需要检测或处理的细胞类型的细胞系或原代细胞培养物。
通常，例如偶联到细胞毒性分子上的本公开蛋白的细胞毒性或细胞抑制活性通过如下方式测量：将表达本公开蛋白所结合的抗原的细胞暴露于本公开的蛋白；将细胞培养一段合适的时间(例如从约6小时至约5天)使蛋白产生生物效应；然后测量细胞活力、细胞毒性和/或细胞死亡。可用于测量活力(增殖)、细胞毒性和细胞死亡的基于细胞的体外测定是本领域已知的。
例如，发光细胞活力测定法LuminescentCell Viability Assay)是一种基于鞘翅目萤光素酶重组表达的市售(Promega Corp.，Madison，WI)均相测定法(美国专利5583024、5674713和5700670)。这种细胞增殖测定法基于细胞中存在的ATP(代谢活性细胞的一个指示物)的量而确定培养物中活细胞的数量。作为另外一种选择，使用无荧光刃天青测定细胞活力，在本公开的蛋白存在下将它添加到培养的细胞中。活细胞将刃天青还原成红色荧光的试卤灵，可以使用例如显微术或荧光酶标仪容易地检出。用于分析细胞活力的试剂盒可以例如从Molecular Probes，Eugene，OR，USA获得。
细胞活力的其他测定法包括在DNA合成时确定3H-胸腺嘧啶核苷或4C-胸腺嘧啶核苷向DNA的结合(即，确定与细胞分裂相关的DNA合成)。在这样的测定中，在标记的胸腺嘧啶核苷存在下将细胞孵育足以使细胞分裂发生的一段时间。在洗涤以便除去任何未结合的胸腺嘧啶核苷之后，例如使用闪烁计数器检测标记(例如放射性标记)。用于确定细胞增殖的替代测定法包括例如通过BrdU结合来测量DNA合成(通过ELISA或免疫组织化学，可从Amersham Pharmacia Biotech获得的试剂盒)。
用于检测细胞死亡的示例性测定法包括APOPTEST(可从Immunotech获得)染色凋亡早期细胞，并且不需要将细胞样品固定(Martin等人，1994)。这种方法利用膜联蛋白V抗体来检测经历凋亡的细胞所特有的细胞膜重配置。然后可通过荧光激活细胞分选(FACS)、ELISA或通过使用固定的膜联蛋白V抗体进行粘附和淘选(panning)，将以这种方式染色的凋亡细胞进行分选。作为另外一种选择，使用末端脱氧核苷酸基转移酶介导的生物素酰化UTP切口末端标记(TUNEL)测定法来确定细胞死亡的水平。TUNEL测定法使用末端脱氧核苷酰基转移酶，用生物素酰化的核苷酸标记在凋亡期间产生的3′-OH DNA末端。然后使用偶联到可检测标记物上的链霉亲和素来检测生物素酰化的核苷酸。用于TUNEL染色的试剂盒可以从例如Intergen Company，Purchase，NY获得。
还可以通过将本公开的蛋白暴露于血清和／或细胞随后使用例如免疫亲和纯化来分离本公开的蛋白而评定或预测本公开的蛋白的体内稳定性。回收的本公开的蛋白的减少量表明本公开的蛋白在血清中或当暴露于细胞时被降解。
在另一个实例中，使用标准放射免疫测定发或荧光免疫测定发来评定本公开的蛋白阻断配体结合到受体上的能力。
还可以通过在蛋白存在或不存在下确定受体的信号传导来评定本公开的蛋白激动或拮抗受体的能力。
体内测试
还可以测试本公开蛋白的体内稳定性和／或疗效。例如，将本公开的蛋白施用给受试者，然后例如使用ELISA或通过检测偶联到蛋白上的可检测标记，以检测随着时间变化的蛋白血清水平。这允许确定本公开的蛋白的体内稳定性。
还可以将本公开的蛋白施用给人类疾病的动物模型并确定其对症状的影响。技术人员将能够基于本公开的蛋白所结合的抗原而容易地确定合适的模型。例如人类癌症的示例性模型是本领域已知的。例如，乳腺癌的小鼠模型包括过表达成纤维细胞生长因子3(Muller等人，1990)、TGF-α(Matsui等人，1990)、erbB2(Guy等人，1992)的小鼠；或将人类乳腺癌癌细胞移植到SCID小鼠中。卵巢癌的模型包括将卵巢癌细胞移植到小鼠(例如如Roby等人，2000中所述)、慢性地分泌促黄体激素的转基因小鼠(Risma等人，1995)或Wx／Wv小鼠中。前列腺癌的小鼠模型也是本领域已知的，并且包括例如从增强表达SV40早期基因中得到的模型(例如TRAMP模型，它利用最小限度的大鼠probasin启动子来表达SV40早期基因，或使用长probasin启动子来表达大T抗原的转基因小鼠，统称为‘LADY'模型，或表达c-myc或Bcl-2或FgfSb或表达显性负相TGFB的小鼠(有关前列腺癌转基因模型的综述，参见Matusik等人，2001)。
本公开的蛋白还可以施用给除了癌症之外的疾病的动物模型，例如NOD小鼠，以测试它们抑制、预防、治疗或延迟糖尿病的能力(例如，如Tang等人，2004中所述)和/或用于GVHD小鼠模型(例如，如Trenado，2002中所述)和/或用于银屑病小鼠模型(例如，Wang等人，2008)和／或用于类风湿性关节炎模型，例如SKG品系小鼠(Sakaguchi等人)，大鼠II型胶原关节炎模型，小鼠II型胶原关节炎模型或在多个物种中抗原诱导的关节炎模型(Bendele，2001))和/或多发性硬化模型(例如，实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE；Bradl和Linington，1996))和/或炎性气道病(例如，OVA挑战或蟑螂抗原挑战(Chen等人，2007)和/或炎性肠病模型(例如，葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎或结肠炎的Muc2缺陷型小鼠模型(Van derSluis等人，2006)。
诊断／预测方法
在一个实例中，本公开提供了用于诊断或预测病状的方法。
如本文所用，术语“诊断(diagnosis)”及其变型形式(例如但不限于“诊断(diagnose)”、“诊断(diagnosed)”、“诊断(diagnosing)”)包括临床状态的任何初步诊断或复发性疾病的诊断。
如本文所用，“预测(Prognosis)”、“预测(prognosing)”及其变型形式是指疾病的可能结果或过程，包括恢复或复发的可能性。
在一个实例中，方法包括确定样品中抗原的量。因此，本公开的蛋白可用于诸如细胞分选(例如流式细胞术、荧光激活细胞分选)的多种应用，以用于诊断或研究目的。例如，使样品与本公开的蛋白在足以使蛋白与抗原结合并形成复合物的时间和条件下接触，然后对复合物进行检测或确定复合物的水平。为了这些目的，可将蛋白进行标记或不进行标记。蛋白可直接标记，例如使用本文所述的标记。未标记时，可以使用合适的手段例如在凝集测定法中来检测这些蛋白。未标记的抗体或片段还可以与另一种(即，一种或更多种)可用来检测蛋白的合适试剂结合使用，诸如与蛋白具有反应性的标记抗体(例如第二抗体)或其他合适的试剂(例如标记的蛋白A)。
优选地，将本公开的蛋白用于免疫测定。优选地，使用选自以下的测定法：免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光联接免疫吸附测定(FLISA)Western印迹、RIA、生物传感器测定、蛋白芯片测定以及免疫染色测定(例如免疫荧光)。
标准固相ELISA或FLISA形式尤其可用于从多种样品中测定蛋白的浓度。
在一种形式中，这样的测定涉及将生物学样品固定到固体基质上，诸如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或测验片、膜或玻璃载体(例如载玻片)。使特异性结合到感兴趣抗原上的本公开的蛋白与固定的样品直接接触，并形成与所述样品中存在的其靶抗原的任何一种的直接结合。本公开的蛋白通常用可检测的报告分子进行标记，诸如就FLISA而言的荧光标记(例如FITC或德克萨斯红)或荧光半导体纳米晶体(如US6,306,610中所述)，或就ELISA而言的酶(例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶)，或作为另外一种选择可以使用结合到本公开的蛋白上的标记抗体。在洗涤以便除去任何未结合的蛋白之后，直接地(就荧光标记而言)或通过添加诸如过氧化氢、TMB或甲苯胺或5-溴代-4-氯代-3-吲哚-β-D-半乳吡喃糖酐(x-gal)的底物(就酶标记而言)来检测标记。此类基于ELISA或FLISA的系统尤其适于通过针对已知量的蛋白所结合到的蛋白标准品(诸如分离的和/或重组的蛋白或其免疫原性片段或其表位)校准检测系统而定量样品中蛋白的量。
在另一种形式中，ELISA或FLISA包括将本公开的蛋白或结合到感兴趣抗原上的抗体固定到固体基质上，诸如膜、聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔板、聚苯乙烯或聚碳酸酯测验片或玻璃载体。然后使样品与本公开的所述蛋白或抗体物理接触，而所述化合物所结合的蛋白被结合或“捕获”。然后使用本公开的标记蛋白对结合蛋白进行检测，该标记蛋白结合到不同的蛋白或同一抗原的不同位点。作为另外一种选择，可以使用第三标记抗体，该抗体结合第二(检测)蛋白。
成像方法
通过上述内容，对技术人员将显而易见的是，本公开还考虑了使用本公开的蛋白的成像方法。为了成像，将本公开蛋白偶联到可检测标记上，该标记可以是能够发射可以被成像技术检出的信号的任何分子或试剂。例如，可检测标记可以是蛋白、放射性同位素、荧光团、发射可见光的荧光团、发射红外线的荧光团、金属、铁磁性物质、发射电磁波的物质、具有特异性磁共振(MR)光谱特征的物质、吸收或反射X射线的物质或改变声音的物质。
在成像程序之前，可以将本公开的蛋白全身性地或局部地施用给待成像的肿瘤、器官或组织。通常，以有效实现所需的肿瘤、组织或器官光学图像的剂量来施用蛋白。此类剂量可以根据所用的特定蛋白，接受成像程序的肿瘤、组织或器官，所用的成像设备等而在很大程度上变化。
在本公开的一些实例中，将本公开的蛋白作为组织和器官的体内光学成像剂用于多种生物医学应用，包括但不限于肿瘤成像、器官断层成像、器官功能监测、冠状动脉造影术、荧光内窥镜术、激光引导手术、光声和声致荧光方法等。其中本公开的蛋白可用于成像的示例性疾病例如癌症在本文进行了说明，并且应当理解成将被考虑为在细节上加上必要的改动而应用于本公开的实例中。在一个实例中，本公开的蛋白偶联物可用于通过监测本公开的特定蛋白在受试者体内的集中位置而检测肿瘤和其他异常的存在。在另一个实例中，本公开的蛋白可用于激光辅助的引导手术，以在腹腔镜检查时检测肿瘤的微小转移。在又一个实例中，本公开的蛋白可用于诊断动脉粥样硬化斑块以及血块。
成像方法的实例包括磁共振成像(MRI)、MR光谱学、放射线照相术、CT、超声、平面γ射线照相机成像、单光子发射计算断层摄影术(SPECT)、正电子发射断层摄影术(PET)、其他基于核医学的成像、使用可见光的光学成像、使用荧光素酶的光学成像、使用荧光团的光学成像、其他光学成像、使用近红外线的成像或使用红外线的成像。
本公开方法的某些实例还包括在对受试者进行手术操作期间对组织成像。
用于成像的多种技术是本领域的普通技术人员已知的。这些技术中的任何一种均可用在本公开成像方法的背景中，以测量来自可检测标记的信号。例如，光学成像是在医学特定领域中已经得到广泛接受的一种成像模式。实例包括细胞组分的光学标记以及血管造影术，诸如荧光素血管造影术和吲哚氰绿血管造影术。光学成像剂的实例包括例如荧光素、荧光素衍生物、吲哚青绿、俄勒冈绿、俄勒冈绿衍生物的衍生物、罗丹明绿、罗丹明绿的衍生物、曙红、赤藓红(erytlirosin)、德克萨斯红、德克萨斯红的衍生物、孔雀绿、磺基琥珀酰亚胺酯纳米金、级联蓝、香豆素衍生物、萘、吡啶基噁唑衍生物、级联黄染料、dapoxyl染料。
考虑了γ照相机成像作为成像方法，该方法可用于测量从可检测标记得到的信号。本领域的普通技术人员应当熟悉γ照相机成像的应用技术。在一个实例中，测量信号可以涉及i11In或99mTc偶联物具体地讲i11In-奥曲肽或99mTC-促生长素抑制素类似物的γ照相机成像的用途。
在本公开的背景中，考虑了计算机断层摄影术(CT)作为成像模式。通过从不同角度取得一系列X射线然后用计算机软件将它们组合，CT使得其可能构建出身体任何部分的三维图像。计算机被编程为从任何角度并以任何深度展示二维切片。可以将这些切片合并来建立三维画像。
在CT中，当初始CT扫描不是诊断性的时，静脉注射偶联到本公开蛋白(结合到感兴趣抗原)的辐射不透性造影剂可有助于鉴定和描绘组织块(例如软组织块)。类似地，造影剂有助于评定软组织损伤的血管供应。例如，使用造影剂可以帮助描绘肿瘤和相邻血管结构的关系。
CT造影剂包括例如碘化造影剂。这些试剂的实例包括碘酞酸盐、碘海醇、泛影葡胺、碘帕醇、乙碘醇和碘番酸盐。也已经报道了钆试剂能够用作CT造影剂，例如钆喷胺。
磁共振成像(MRI)是使用高强度磁体和射频信号来产生图像的成像模式。在MRI中，将待成像的样品置于强静止磁场中并用射频(RF)辐射的脉冲激发而在样品中产生净磁化。然后不同的磁场梯度和其他RF脉冲发挥作用，将空间信息编码到记录的信号中。通过收集和分析这些信号，有可能计算出三维图像，类似于CT图像，它通常以二维切片来展示。可以将这些切片合并来建立三维画像。
用于MRI或MR光谱成像的造影剂与用于其他成像技术中的那些不同。MRI造影剂的实例包括钆螯合物、锰螯合物、铬螯合物以及铁颗粒。例如，将本公开的蛋白偶联到包括选自以下的顺磁性金属的螯合物的化合物上：钪、钪、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、钼、钌、铈、铟、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥和镱。可用于本公开的成像剂的一个另外的实例是基于卤烃的纳米颗粒诸如PFOB或其他基于氟的MRI试剂。CT和MRI两者提供解剖学信息，该信息有助于区别组织边界和血管结构。
提供关于细胞水平信息诸如细胞活力的信息的成像模式包括正电子发射断层摄影术(PET)和单光子发射计算机断层摄影术(SPECT)。在PET中，患者咽下或注射有发射正电子的放射性物质，当该物质移动通过身体时这些正电子可以被监测。
PET与SPECT之间的主要区别在于替代正电子发射物质，SPECT使用发射高能光子的放射性示踪剂。SPECT对于诊断包括冠状动脉疾病的多种疾病具有价值，并且每年在美国已经进行了大约250万例SPECT心脏研究。
对于PET，将本公开的蛋白通常用诸如11C、13N、15O、18F、82Rb、62Cu和68Ga的正电子发射体标记。对于SPECT，将本公开的蛋白用诸如99mTc、201Tl和67Ga、111In的正电子发射体标记。
动物和人的非侵入性荧光成像也可提供体内诊断信息并用于广泛多样的临床专业方向。例如，过去多年已经开发出了多种技术，包括在荧光团的UV激发后的简单观察直到使用先进的设备进行复杂的光谱学成像(参见例如Andersson-Engels等人，1997)。本领域已知的用于体内检测荧光(例如来自荧光团或荧光蛋白)的特定设备或方法包括但不限于体内近红外荧光(参见例如Frangioni，2003)、MaestroTM体内荧光成像系统(CambridgeResearch&Instrumentation，Inc.；Woburn，MA)、使用飞点扫描仪的体内荧光成像(参见例如Ramanujam等人，2001)等。
用于检测光学响应的其他方法或设备包括但不限于视觉检查、CCD照像机、录像照相机、照相胶片、激光扫描设备、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或使用光电倍增管的信号放大。
在一些实例中，在用于人体中之前使用体外或体内测定法对成像剂进行测试(例如使用本文所述的模型)。
制品
本公开还提供了包含本公开蛋白的制品或“试剂盒”。制品可以包括容器和在容器上或与容器相关的标签或包装插页，例如从而提供本公开的蛋白在根据任一实例在本文所述的方法中的使用说明。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、泡罩包装等。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳本公开组合物的蛋白并可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉注射溶液袋或具有可通过皮下注射针头刺穿的胶塞的小瓶)。作为另外一种选择或除此以外，制品还可以包含第二(或第三)容器，该容器容纳药学上可接受的缓冲剂，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格尔氏溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业和用户观点来看合乎需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针和注射器。试剂盒还可以或作为另外一种选择包括用于检测本公开的蛋白和／或用于偶联到本公开的蛋白的试剂。
在下面的非限制性实施例中将对本公开进行进一步说明。
实施例1：材料与方法
1.1突变VL和scFv的生成
使用Zoller和Smith(1987)说明的方法，加以由Kunkel等人(1987)引入的改进生成了人可变结构域的突变体。为此目的，将编码所需突变的合成寡核苷酸退火到包含尿嘧啶的单链模板DNA(dU-ssDNA)上，在酶作用下延伸并连接从而形成共价闭环DNA。通过使用ApaLl和Notl位点将编码单个人轻链可变(VL)结构域(DPK9(SEQ ID NO：2)或得自阿达木单抗(SEQ ID NO：8)或4D5(SEQ ID NO：12)的VL的DNA片段克隆到噬菌体展示载体FdMyc中生成了模板。通过电穿孔将共价闭环DNA转化到ung+大肠杆菌株TGI中，从而引起未突变dU-ssDNA的优先破坏。通过DNA序列分析确认了构建的突变体的序列。
为了生成scFv突变体，使用ApaLl和Sail克隆位点将编码VH结构域和合成接头区的DNA片段克隆到相应的VL-FdMyc构建体中。通过DNA序列分析确认了构建的突变体的序列。编码对照scFv的序列如SEQ ID NO：6所示，编码衍生自阿达木单抗的scFv的序列如SEQID NO：10所示，而编码衍生自4D5的scFv的序列如SEQ ID NO：14所示。
当VL作为可溶性蛋白表达时，N端谷氨酰胺被天冬氨酸取代。当VH或scFv作为可溶性蛋白表达时，N端谷氨酰胺被谷氨酸取代。
基于VK1／DPK9生成了人类VL结构域的噬菌体展示文库。使用合成的寡核苷酸介导的多样化在FdMyc中构建了文库(Kunkel等人，1987)(氨基酸编号根据Kabat，而核苷酸编码根据IUPAC-IUB，Cornish-Bowden，1985)。为此，使用编码位置28、30、31和32的简并密码子KMT(Y／A／D／S)的合成寡核苷酸将多样性引入了LI。使用编码(20％Y；17％G；15％S；7％D／A；4％T／P／V／R／Ｉ/L；2％W／F／M／Q／N／H／K／E)的三核苷酸亚磷酰胺寡核苷酸(Virnekas等人，1994)在位置91、92、93、94和96引入了L3多样性。L2限于种系VK1／DPK9一致序列(WT)或位置52和53(52D／53D)的天冬氨酸。
1.2聚集抗性的噬菌体ELISA(“热／冷测定”)
在噬菌体ELISA形式中通过测量热孵育之后的信号保留对克隆的聚集抗性进行了分析(McCafferty等人，1990；Jespers等人，2004)。用碳酸盐缓冲液(pH9.6)中的蛋白A、蛋白L或靶抗原将Nunc Maxisorp Immuno板的孔包被过夜。用PBS将板洗涤一次，然后用在PBS中稀释的约4％(w／v)奶粉(MPBS)封闭。从琼脂板中挑取单个克隆，然后在补充有约15μg／ml四环素的2xTY培养基(含约16g／L胰蛋白胨、约1Og／L酵母提取物、约5g／L NaCl、pH7.0)中在约30℃和震荡下生长过夜。通过离心将细胞移除，通过添加生物素-PEO4-N-羟基琥珀酰亚胺(Pierce；约50μM终浓度)在培养物上清液中直接将噬菌体生物素化。将过量的生物素化试剂用100mM TrisHcl pH7.5猝灭。对于热选择，首先将上清液在约80℃孵育约10分钟，然后在约4℃持续约10分钟。将上清液添加到封闭的ELISA孔中。在用PBS洗涤三次后，使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测结合的噬菌体颗粒。通过减去在450nm和650nm处的测量值而计算吸光度。
在噬菌体ELISA形式中通过测量热孵育之后的信号保留对克隆针对靶抗原的聚集抗性进行了分析(McCafferty等人，1990；Jespers等人，2004)。用PBS缓冲液中的链霉亲和素将Nunc Maxisorp Immuno板的孔包被过夜。用PBS将板洗涤一次，然后用在PBS中稀释的约4％(w／v)奶粉(MPBS)封闭。然后将生物素化的抗原加到板中。从琼脂板中挑取单个克隆，然后在补充有约15μg／ml四环素的2xTY培养基(含约16g／L胰蛋白胨、约1Og／L酵母提取物、约5g／LNaCl、pH7.0)中在约30℃和震荡下生长过夜。通过离心将细胞移除。将100mMTrisHCl pH7.5加入上清液中。对于热选择，首先将上清液在约80℃孵育约10分钟，然后在约4℃持续约10分钟。将上清液添加到封闭的ELISA孔中。在用PBS洗涤三次后，使用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物来检测结合的噬菌体颗粒。通过减去在450nm和650nm处的测量值而计算吸光度。
1.3VL结构域的表达和纯化
开展了实验以确定天然和突变VL的可溶性表达水平。为此，使用Sail和BamHl位点将编码结构域的DNA片段克隆进表达载体pET12。将质粒转化进大肠杆菌BL21-Gold(克隆DE3)(Novagen)，通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG；1mM的最终浓度)而诱导可溶性蛋白表达。然后使细胞在30℃生长48小时，其中在24小时后执行再次诱导步骤。通过离心移除细胞，将含有表达蛋白的上清液过滤(0.22μm)。将VL结构域的上清液加到rProtein L树脂(Genscript)中，在4℃孵育过夜。将蛋白L树脂加到重力柱中，其中让上清液经过树脂，然后用PBS洗涤。通过添加0.1M甘氨酸盐酸pH2.7而洗脱VL结构域，然后通过添加0.1MTris-HCl pH8.0对馏分进行中和。将结构域针对PBS渗析并浓缩。通过SDS-PAGE在4-12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上评估了蛋白纯度。
1.4测定VT结构域的可溶性表达水平Domains
使用蛋白L ELISA测定了各VL变体的可溶性表达水平，其中针对相同的纯化蛋白的标准曲线测量可溶性结构域的浓度。为此，使新转化的大肠杆菌BL21-Gold的三个单独克隆生长，如上所述诱导表达48小时。通过离心移除细胞，通过添加生物素-PE04-N-羟基琥珀酰亚胺(Pierce；50μM的最终浓度)而在培养上清液中将片段直接生物素化。将培养上清液和已知浓度的相同突变体的生物素化纯化片段加到用5μg／ml蛋白L(Sigma)包被过夜并用PBS中的4％(w／v)脱脂奶粉封闭的96孔Maxisorp免疫板(Nunc)。在用PBST洗涤三次后，将结合的抗体片段用Extravidin-HRP偶联物(Sigma)和TMB底物进行检测。测量了450nm(参考650nm)处的吸光度，使用线性回归分析从标准曲线外推了各样品的浓度。
1.5加热后的尺寸排阻层析和再折叠能力
通过尺寸排阻层析测定了加热后的VL洗脱体积和再折叠复性。为此，将20mM PO4(pH7.4)中100μM的纯化VL变体加热到85℃维持20min，然后在4℃维持10min；或不进行加热。将加热和未加热的样品在16,000xg下离心10min，然后在用PBS平衡的连接到AKTAPurifier(GEHealthcare)的Superdex-G75柱(GE Healthcare)上分析。将样品以0.5ml／min的流速和500μl的体积进样。通过测量加热样品的曲线下面积测定了各变体的回收率，表示为未加热样品的百分比。
还通过尺寸排阻层析测量了全IgG分子的洗脱体积。为此，将包含种系VH结构域DP47和种系VL结构域DPK9(在CDR-H1(31-33DED)、CDR-L2(50,52-53DDD)或两个结构域一起(31-33DED／50,52-53DDD)中具有天冬氨酸和/或谷氨酸取代)的人IgG1在用PBS平衡的连接到AKTA净化器(GE Healthcare)的Superdex-S200柱(GE Healthcare)上纯化。将PBS中0.5mg／ml的样品以100μl的体积和0.5ml/min的流速进样。同样，通过如上所述的尺寸排阻层析，评估了在CDR-H1(位置30)、CDR-L2(位置52)或两者中包含天冬氨酸取代的4D5的IgG的洗脱体积。
1.6浊度测量
通过在加热下测量纯化片段360nm处的吸光度，进行了含有突变种系VL和scFv片段的溶液的浊度测量。各片段类型的条件如下：种系VL突变体以100μM处于20mM PO4(pH7.4)中，85℃；scFv突变体以10μM处于磷酸盐缓冲盐水中，85℃。测量使用光程长度为1cm的QS-24石英比色皿在Varian Cary50Bio紫外-可见光分光光度计(Agilent Technologies)上进行。
1.7SK-BR-3细胞结合测定
在SK-BR-3人乳腺癌细胞系上进行了使用4D5变体作为全IgG的全细胞结合测定。为此，将不同的浓度的在CDR-H1(位置30)、CDR-L2(位置52)或两者中含有突变的作为人IgG1的4D5加到细胞(2.5×104个细胞/样品)中，一式两份，在冰上保持1小时。在含有1％BSA的PBS中洗涤后，将二抗抗人IgG-FITC(Sigma)加入，在冰上保持30min。使用FACSCalibur(BD Biosciences)记录了活细胞群的荧光强度，使用FlowJo7.6.5软件(TreeStar)进行了分析。
1.8SK-BR-3细胞增殖测定
将SK-BR-3细胞保持在补充了10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将细胞使用0.05％胰蛋白酶／EDTA(Invitrogen)脱离，以2×104个细胞／ml悬浮在完全培养基中。将500μl的等分试样加到48孔细胞培养板(Corning，Lowell，MA)中，让细胞贴壁30分钟，然后将4D5IgG变体以10μg／ml的最终浓度加入。7天后，将细胞用RPMI培养基(不含FBS)洗涤、脱离(如上所述)并对活细胞计数。将细胞增殖水平计算为在不存在IgG下生长的细胞的百分比。
1.9亲和力测量
使用表面等离子体共振(BIAcore，GE Healthcare)测量了4D5scFv变体的结合亲和力。将生物素化HER2胞外结构域固定在链霉亲和素传感器芯片上。将各scFv变体的稀释序列以20μl／min的流速进样，将曲线拟合到1：1朗缪尔结合模型。
实施例2：DPK9CDR1突变体的聚集抗性
开展了实验以研究将单个或多个带负电的氨基酸引入DPK9的CDR1的作用。如上详述(参见材料与方法章节)，构建了突变VL并针对聚集抗性进行了测试。简而言之，将噬菌体展示的VL加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白L ELISA捕获了正确折叠的VL并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
结果在图1中示出。总之，将带负电的氨基酸引入DPK9VL的CDR1稍微改善了聚集抗性，而在位置24和29的取代赋予了最高水平的聚集抗性。
实施例3：DPK9FR2／CDR2突变体的聚集抗性
然后开展了实验以研究将单个或多个带负电的氨基酸引入DPK9的CDR2和相邻的FR2的作用。
如上详述(参见材料与方法章节)，构建了DPK9VL结构域的CDR2和相邻FR2区域中的单个氨基酸变化和变化的组合，并针对聚集抗性进行了测试。简而言之，将噬菌体展示的VL加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白L ELISA捕获了正确折叠的VH并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
结果如图2所示。总之，在FR2的位置49或CDR2的位置50、51、52和53的中任一种引入带负电的氨基酸导致了VL结构域相当大的聚集抗性。此外，两个、三个或四个突变的组合导致了聚集抗性，其中这些组合的许多都实现了几乎100％的聚集抗性。
实施例4：聚集抗性可变结构域的文库的产生
通过随机化表面暴露的CDR残基、模拟抗体库中的天然氨基酸分布而产生了VH和VL变体的文库。在VH的位置32和33或VL的位置52和53引入天冬氨酸明显增加了文库的平均聚集抗性(图3)。观察到的效应在很大程度上与其他CDR残基无关，从而突出突变在热点位置的支配性作用。
实施例5：溶液中聚集抗性的表征
将代表性蛋白变体作为单个结构域表达，以评定它们作为可溶性蛋白的聚集倾向。种系VH和VL结构域在加热到它们的熔解温度之上后快速聚集。在VL内(包括位置50、51、52或53)引入单个负电荷适度增加了聚集抗性(图4)。在选自位置50至53的两个或更多个位置的电荷进一步增加了聚集抗性(图4A和B)。引入逐渐增多的负电荷数还改善了抗体可变结构域的一系列其他生物物理特性(表1和图5)。随着突变数从无增加至三，VL结构域的表达水平提高2倍。其他常见的度量指标(诸如在凝胶过滤上的洗脱体积和再折叠复性)也明显改善(表1和图5)。
表1：带负电的残基在VL中的作用。
实施例6：从阿达木单抗衍生的突变VL的聚集抗性
将阿达木单抗的VL在LCDR2内的一个或多个位置引入带负电的氨基酸，展示在噬菌体的表面上，然后如上详述(参见材料与方法)针对聚集抗性进行了测试。简而言之，将噬菌体加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白L ELISA捕获了正确折叠的VL并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。蛋白L ELISA的结果在图6中示出。简而言之，所有测试的带负电的氨基酸及其组合与野生型(非突变)VL相比都增加了加热后VL与蛋白L的结合。在位置50和52的带负电的氨基酸的组合提供了最大程度的聚集抗性。
实施例7：从4D5衍生的突变VL的聚集抗性
开展了实验以研究将单个或多个带负电的氨基酸引入4D5的VL的CDR2的作用。
如上详述(参见材料与方法章节)，构建了4D5VL结构域的cDR2中的单个氨基酸变化和变化的组合，并针对聚集抗性进行了测试。
简而言之，将噬菌体展示的VL加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白L ELISA捕获了正确折叠的VL并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
蛋白L ELISA的结果在图7中示出。总之，在位置50至53的中任一种及其测试组合的中任一种引入带负电的氨基酸与野生型(非突变)VL相比增强了VL的聚集抗性。
实施例8：从4D5衍生的突变scFv的聚集抗性
以scFv形式通过接头将4D5的VL和VH配对(有关实验详情，参见材料与方法章节)。另外，使VL突变以在CDR1或CDR2内的单个或多个位置引入带负电的氨基酸。将单链Fv展示在噬菌体表面上，并如上详述(参见材料与方法章节)针对聚集抗性进行了测试。简而言之，将噬菌体加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白L ELISA或使用固定化Her2的ELISA捕获了正确折叠的scFv，并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
蛋白L ELISA的结果在图8中示出。简而言之，在CDR2内的一个或多个位置引入带负电的氨基酸与野生型(非突变)scFv相比大大增加了scFv的聚集抗性。CDR1中带负电的氨基酸与野生型scFv相比也增加了聚集抗性(图8A)，然而程度与CDR2中的突变不同(图8B)。提供最大作用的CDR1中的位置为29,30和31的组合，以及31和32的组合。
图9显示了将带负电的氨基酸引入从4D5衍生的scFv的CDR2未防止scFv结合到Her2。在多种情况下，带负电的氨基酸与野生型(非突变)scFv检测到的水平相比不实质性改变所检测到的结合水平。
图10显示在如上所述的加热和冷却后，在位置50至53之间的单个带负电的氨基酸或在位置52和53的负电荷组合与野生型(非突变)scFv相比增加了聚集抗性，如通过在加热后结合到Her2所测定。
实施例9：VL和VH中带负电氨基酸的组合
将4D5的VL和VH作为scFv进行了表达。还产生了在VL的CDR2内包含一个或多个带负电的氨基酸以及在VH的CDR1内包含一个或多个带负电的氨基酸的这些scFv的突变形式。将单链Fv展示在噬菌体表面上，并如上详述(参见材料与方法章节)针对聚集抗性进行了测试。简而言之，将噬菌体加热到80℃持续10分钟，之后在4℃下冷却10分钟。通过蛋白AELISA或蛋白L ELISA或使用固定化抗原的ELISA捕获了正确折叠的scFv，并将处理样品的吸光度信号计算为未处理样品的百分比。
蛋白A ELISA的结果在图11中示出。带负电氨基酸的所有组合都将scFv的聚集抗性水平增加到野生型(衍生自非突变4D5的)scFv所观察到的水平以上。
蛋白L ELISA的结果在图12中示出。带负电氨基酸的所有组合都将突变scFv的聚集抗性水平增加到野生型(非突变)对应scFv所观察到的水平以上。
图13显示了即使在VL CDR2和VH CDR1中具有带负电的氨基酸，scFv也能够结合到靶抗原，一些突变scFv的结合水平接近通过相应野生型(非突变)scFv观察到的水平。
图14显示了在加热和冷却后，一些突变scFv与野生型(非突变)scFv相比增加了保留的抗原结合水平。所有测试组合的表现均优于野生型(非突变)scFv。
实施例10：VL和/或VH中带负电氨基酸的组合不抑制生物活性
作为一个模型系统，研究了结合HER2的治疗性抗体4D5的突变形式。将带负电的氨基酸取代到4D5的HCDR1的位置30，和/或LCDR2的位置52和/或53之一或两者，将变体作为抗体片段进行了表达。为了研究聚集抗性，将4D5变体在高浓度下加热，并测量了浊度。抗性随着突变数的增加显著改善，即使通过简单的视觉观察也能发现明显的差异。对于4D5的VH和VL两结构域，均观察到了这一趋势。当以scFv片段形式通过结构域间接头将结构域配对时，也观察到了与在单结构域形式中观察到的相似结果(图15)。
还测定了重组HER2抗原的代表性4D5变体的结合亲和力(表2)。scFv片段形式中的亲和力在4D5的约1nM至一些变体的约500nM的范围内。多个位置的变化耐受良好，所观察到的平衡结合力(KD)无损失。此外，当在VH和VL内将变化相结合时，未观察到KD损失。高度聚集抗性的scFv双突变体(4D5-d)之一以野生型(4D5)相似的亲和力结合到HER2(表2)。
表2：4D5scFv突变体的亲和力。
为了进一步研究HCDR1(位置30)和/或LCDR2(位置52)内带负电氨基酸对抗原结合的作用，将4D5变体以免疫球蛋白G(人IgG1)形式进行了表达。通过流式细胞术评定了与未突变的4D5IgG相比带负电氨基酸取代对变体的全细胞(SK-BR-3)结合的作用(图16A)。这些实验证实了4D5IgG变体的结合曲线和EC50值与未突变的4D5IgG无明显差异(图16和表3)。
图16B还显示了4D5变体将SK-BR-3细胞的增殖抑制到了与野生型4D5相同的程度。
表3.通过SK-BR-3结合测定法测定的包含带负电氨基酸取代的作为人IgG1的4D5的EC50值。
实施例11：带负电氨基酸对全长抗体的作用
为了研究带负电氨基酸对全长抗体其他特性的作用，通过尺寸排阻层析法分析了包含种系VH结构域DP47和种系VL结构域DPK9(在CDR-H1(31-33DED)、CDR-L2(50,52-53DDD)或两个结构域一起(31-33DED／50,52-53DDD)中具有天冬氨酸和/或谷氨酸取代)的人IgG1分子。结果在图17A中示出。洗脱图显示了在VH和VL结构域(31-33DED／50,52-53DDD)中均包含三个带负电氨基酸的IgG比在单独的VH(31-33DED／WT)或VL(WT／50,52-53DDD)中包含三个突变的IgG以较低的体积洗脱，后者又比不含带负电突变(WT／WT)的IgG以低得多的体积洗脱。
相似地，通过尺寸排阻层析评估了包含带负电氨基酸取代的作为IgG的4D5的变体。结果在图17B中示出。洗脱图显示了在VH和VL结构域中均包含带负电氨基酸取代：VH的位置30和VL的位置52(30D／52D)的4D5IgG与在单独的单一结构域中包含带负电氨基酸取代(30D／WT或WT／52D)的4D5IgG相比以较低的体积洗脱。这些又比不含另外的带负电氨基酸取代(WT／WT)的4D5IgG以较低的体积洗脱。
这些数据表明，在HCDR1或LCDR2位置中包含带负电氨基酸取代的IgG显示出与不含此类突变的IgG相比较低的非特异性相互作用或与凝胶纯化基质的“粘性”，如Jespers等人(2004)所述。这可在全IgG的生产和制造期间得到更高水平的纯化抗体。通过抗体片段例如DPK9VL(图17C)也得到了相似的结果。
实施例12：可溶性蛋白的纯化和浊度测量
将得自DPK9或4D5的VL的野生型和突变形式作为可溶性蛋白进行了表达，并使用蛋白L树脂通过亲和层析进行了纯化。图4B显示了在加热和冷却后，在位置51包含单个带负电氨基酸或在位置50至53之间包含多个带负电氨基酸的突变VL与野生型(非突变)VL相比增加了聚集抗性，如通过浊度所测定。在位置50至53之间的带负电的氨基酸的组合提供了最大程度的聚集抗性。
实施例13：带负电氨基酸对浓缩后的稳定性的作用
为了研究带负电氨基酸对浓缩(即冻干或渗滤)后聚集抗性的作用，对与在CDR-L2(50,52-53DDD)中具有天冬氨酸取代或无取代(对照)的DPK9相对应的VL结构域进行了分析。
对于冻干实验，将20mM磷酸盐缓冲液pH7.4中的IOOμM(1.15mg／ml)的蛋白首先在液氮中速冻，然后转移到真空离心干燥机(speed-vac)中在“室温条件”下保持2小时。冻干后，将蛋白复原或重悬在水中，并使用分光光度计(Biophotometer，Eppendorf)测量了320nm处的吸光度分析了浊度。冻干后，对照DPK9VL具有2.444的吸光度，而突变VL具有0.023的吸光度。
还基本如上所述分析了在使用Superdex75的凝胶过滤后的蛋白回收率。该分析的结果表明能够回收约69％的对照DPK9VL，而能够回收87％的突变VL。
对于渗滤实验，在13,200x g下将200μlPBS缓冲液中2mg／ml的样品在AmiconUltracel(0.5ml，10K；Millipore)中离心总共20min。将20μlPBS加到30μl渗余物中，使用分光光度计(Biophotometer，Eppendorf)测量了320nm处的吸光度。在通过渗滤浓缩后，对照DPK9VL具有0.580的吸光度，而突变VL具有0.064的吸光度。
这些结果表明，VL的CDR2中带负电的氨基酸大大减少了浓缩后可变结构域的聚集。
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Claims (9)

1.一种增强包含抗体轻链可变结构域(VL)的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括：
通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基49、50、51、52、53和56组成的组的两个或多个位置的氨基酸而修饰所述VL；以及
将修饰的蛋白暴露于热和/或浓缩该蛋白，并选择与未修饰的蛋白相比具有降低的聚集倾向的蛋白；以及
确定修饰的蛋白结合到抗原的能力，并选择结合到抗原的修饰的蛋白。
2.一种增强包含抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)的蛋白的聚集抗性的方法，所述方法包括：
对所述蛋白进行修饰，使得其包含：
(i)根据Kabat编号系统的所述VL的残基49与56之间两个或更多个位置的带负电的氨基酸；以及
(ii)根据Kabat编号系统的选自由所述VH的残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置的带负电的氨基酸，
其中所述蛋白在修饰前在所述VL和所述VH的所述位置中不含带负电的氨基酸；以及
将修饰的蛋白暴露于热和/或浓缩该蛋白，并选择与未修饰的蛋白相比具有降低的聚集倾向的蛋白；以及
确定修饰的蛋白结合到抗原的能力，并选择结合到抗原的修饰的蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，包括：
(i)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的所述VL的残基49与56之间两个或更多个位置的氨基酸而修饰所述VL；以及
(ii)通过带负电的氨基酸取代根据Kabat编号系统的选自由残基28、30、31、32、33和35组成的组的两个或更多个位置的氨基酸而修饰所述VH。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，还包括对所述蛋白进行修饰，使得所述VL还在CDR1中包含一个或多个带负电的氨基酸和/或所述VH还在根据Kabat编号系统的选自由残基26、39、40、50、52、52a和53组成的组的一个或多个位置包含带负电的氨基酸。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述带负电的氨基酸为天冬氨酸。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述带负电的氨基酸为天冬氨酸。
7.根据权利要求1至3和6任一项所述的方法，其中所述蛋白选自：
(i)抗体；
(ii)单结构域抗体；
(iii)含单链Fv(scFv)的蛋白；
(iv)双链抗体、三链抗体或四链抗体；
(v)包含(ii)-(iv)中任一种和抗体Fc结构域或其结构域的融合蛋白；以及
(vi)包含(ii)-(iv)中任一种和能够结合到免疫效应细胞的蛋白的融合蛋白。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白选自：
(i)抗体；
(ii)单结构域抗体；
(iii)含单链Fv(scFv)的蛋白；
(iv)双链抗体、三链抗体或四链抗体；
(v)包含(ii)-(iv)中任一种和抗体Fc结构域或其结构域的融合蛋白；以及
(vi)包含(ii)-(iv)中任一种和能够结合到免疫效应细胞的蛋白的融合蛋白。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述蛋白选自：
(i)抗体；
(ii)单结构域抗体；
(iii)含单链Fv(scFv)的蛋白；
(iv)双链抗体、三链抗体或四链抗体；
(v)包含(ii)-(iv)中任一种和抗体Fc结构域或其结构域的融合蛋白；以及
(vi)包含(ii)-(iv)中任一种和能够结合到免疫效应细胞的蛋白的融合蛋白。
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