ES2625798T3

ES2625798T3 - Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2625798T3
Application number: ES12155398.6T
Authority: ES
Inventors: Michelle Kuhne; Peter Brams; Dawn M. Tanamachi; Alan Korman; Josephine M. Cardarelli
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2006-10-02
Filing date: 2007-10-01
Publication date: 2017-07-20
Anticipated expiration: 2027-10-01
Also published as: US10106615B2; LT2486941T; JP6496673B2; CN101528259B; WO2008060367A2; HUE027165T2; KR20170123712A; WO2008060367A9; TWI522366B; CY1117036T1; JP2013227339A; CN103897058A; US20190031763A1; HK1131904A1; JP5417175B2; IL197831A; JP6097650B2; JP2010505830A; HUE033630T2; EA200900424A1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal o una porción de unión al antígeno del mismo que se unen específicamente a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular y que comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID Nº: 49 codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal Vh 3-48 humana y una región variable de la cadena ligera que comprende aminoácidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % idéntica a la secuencia expuesta en SEQ ID Nº: 50 codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal Vk L15 humana, en donde dichos anticuerpo monoclonal o porción de unión al antígeno del mismo inducen la apoptosis en células que expresan CXCR4 humano e inhiben el crecimiento y/o inducen la apoptosis de células tumorales CXCR4+ in vivo.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos Antecedentes

Las quimiocinas son una familia de aproximadamente 50 proteinas pequenas que modulan la circulacion celular y la angiogenesis, y tambien desempenan una funcion significativa en el microambiente tumoral (Vicari, A.P. y Caux, C. (2002) Cytokine Growth Factor Rev. 13:143-154). Dependiendo de su estructura, las quimiocinas se clasifican, como quimiocinas C-C (que contienen un motivo cistema-cistema) o quimiocinas C-X-C (que contienen un motivo cistema- X-cisteina). Los receptores que se unen a tales quimiocinas se clasifican, por lo tanto, como miembros de la familia CCR o de la familia CXCR, respectivamente. Un miembro de la familia CXCR es CXCR4, un receptor de siete dominios transmembrana acoplado a proteinas G que se expresa predominantemente en linfocitos y que activa la quimiotaxia. CXCR4 se une a la quimiocina CXCL12 (SDF-1).

CXCR4 desempena una funcion en la embriogenesis, homeostasis e inflamacion. Estudios con ratones modificados para ser deficientes en CXCR4 o SDF-1 involucran a la via de CXCR4/SDF-1 en la vascularizacion de los organos, asi como en los sistemas inmunitario y hematopoyetico (Tachibana, K. et al. (1998) Nature 393:591-594). Ademas, se ha mostrado que CXCR4 funciona como un correceptor para cepas aisladas del VIH-1 linfotrofico T (Feng, Y. et al. (1996) Science 272:872-877). Tambien se ha mostrado que CXCR4 se expresa en una amplia variedad de tipos de celulas cancerosas. Adicionalmente, se ha mostrado que la via de CXCR4/SDF-1 esta involucrada en la estimulacion del proceso metastasico en muchos neoplasmas diferentes (Murphy, P.M. (2001) N. Engl. J. Med. 345:833-835). Por ejemplo, se ha mostrado que CXCR4 y SDF-1 median en metastasis especificas de organo creando un gradiente quimiotactico entre el sitio tumoral primario y el sitio metastasico (Muller, A. et al. (2001) Nature 410:50-56; Murakami, T. et al. (2002) Cancer Res. 62:7328-7334; Hanahan, D. et al. (2003) Cancer Res. 63:3005-3008).

Los anticuerpos anti-CXCR4 se describen en los documentos WO 2006/089141, US 2003/206909, EP 1 316 801, Ghobrial et al. (Blood 104(11):365A-366A, 2004), Endres et al. (Cell 87:745-756, 1996) y Vaday et al. (Clin Cancer Res 10(16):5630-5639, 2004).

Sumario

La presente divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal o una porcion de union al antigeno del mismo que se une especificamente a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular y comprende una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % identica a la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 49 codificada por un gen de inmunoglobulina de la linea germinal Vh 3-48 humana y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % identica a la secuencia expuesta en SEQ iD N°: 50 codificada por un gen de inmunoglobulina de la linea germinal Vk L15 humana, en el que dicho anticuerpo monoclonal o porcion de union al antigeno del mismo induce la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 humano, e inhibe el crecimiento y/o induce la apoptosis de celulas tumorales CXCR4+ in vivo. Los anticuerpos monoclonales de la invencion pueden ser anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a CXCR4 humano y que presentan numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen la capacidad de unirse a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular, la capacidad de inhibir la union de SDF-1 a CXCR4 humano, la capacidad de inhibir el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4, la capacidad de inhibir la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4, la capacidad de inhibir la formacion de tubos capilares por celulas endoteliales de la vena umbilical humana (HuVEC), la capacidad de inhibir la proliferacion de celulas tumorales in vitro, la capacidad de inhibir la metastasis de celulas tumorales CXCR4+ y/o la capacidad de aumentar el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece un tumor CXCR4+.

En una realization, el anticuerpo tambien inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 humano, preferentemente con una CE50 para la inhibition de 50 nM o menos, o 30 nM o menos, o 15 nM o menos, o 10 nM o menos, o 5 nM o menos, o 3 nM o menos (por ejemplo, una CE50 para la inhibicion de 28,60 nM o menos, o 12,51 nM o menos, o 2,256 nM o menos). En otra realizacion, el anticuerpo se une a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular, pero no inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 humano. En otras realizaciones mas, el anticuerpo tambien inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 humano, preferentemente con una CE50 para la inhibicion de 3 nM o menos, o 2 nM o menos, o 1 nM o menos, o 0,9 nM o menos, o 0,8 nM o menos, o 0,7 nM o menos, o 0,6 nM o menos, o 0,5 nM o menos, o 0,4 nM o menos (por ejemplo, 0,9046 nM o menos, 0,5684 o menos, o 0,3219 nM o menos). En otras realizaciones mas, el anticuerpo tambien inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4 humano, preferentemente con una CE50 para la inhibicion de 50 nM o menos, o 30 nM o menos, o 20 nM o menos, o 15 nM o menos (por ejemplo, 18,99 nM o menos, o 12,44 nM o menos). En otras realizaciones mas, el anticuerpo tambien inhibe la formacion de tubos capilares por HuVEC, induce la apoptosis de celulas que expresan CXCR4, inhibe la proliferacion de celulas tumorales in vitro, inhibe la proliferacion de celulas tumorales o induce la apoptosis de celulas tumorales in vivo, inhibe la metastasis de celulas tumorales CXCR4+ y/o aumenta el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece un tumor CXCR4+.

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Preferentemente, el anticuerpo se une a CXCR4 humano con afinidad alta, tal como una KD de 1 x 10-7 M o menos o con una Kd de 5 x 10-8 M o menos. Preferentemente, los anticuerpos de la presente divulgacion son anticuerpos de longitud completa (es decir, que comprenden regiones variables y constantes). Ademas, los anticuerpos de la presente divulgacion se dirigen preferentemente contra CXCR-4 humano de longitud completa expresado en su conformacion nativa sobre una celula huesped o en una membrana artificial.

En una realizacion preferida, el anticuerpo o porcion de union al antlgeno de anticuerpo de la invencion es un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porcion de union a antlgeno del mismo, en la que el anticuerpo:

(a) se une a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular;

(b) inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 humano;

(c) inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 humano;

(d) inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4 humano; y

(e) inhibe la formacion de tubos capilares por celulas endoteliales de la vena umbilical humana.

Ademas, en el presente documento se describe un anticuerpo monoclonal humano aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, en el que el anticuerpo compite de forma cruzada por la union a CXCR4 con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende:

(a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29; o

(b) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30; o

(c) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31; o

(d) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N° una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32.

En una realizacion, el anticuerpo o porcion de union al antlgeno de anticuerpo de la invencion es un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende:

una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3; y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en las que:

(a) la secuencia CDR3 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 9-12 y modificaciones conservativas de las mismas;

(b) la secuencia CDR3 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 21-24 y modificaciones conservativas de las mismas; y

(c) el anticuerpo se une a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular.

En realizaciones preferidas, este anticuerpo tambien tiene una o mas de las siguientes caracterlsticas: inhibe la union de SDF-1 a CXCR4, inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4, inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR-4; inhibe la formacion de tubos capilares por HuVEC; induce la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 (in vitro y/o in vivo), inhibe el crecimiento de celulas tumorales CXCR4+ in vitro y/o in vivo, y/o inhibe la metastasis de celulas tumorales CXCR4+.

Preferentemente, la secuencia CDR2 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 5-8 y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR2 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 17-20 y modificaciones conservativas de las mismas. Preferentemente, la secuencia CDR1 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 1-4 y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR1 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 13-16 y modificaciones conservativas de las mismas.

Una combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 1;

(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 5;

(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 9;

(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 13;

(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 17; y

(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 21.

: 25 y : 26 y : 27 y : 28 y

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(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 2;

(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 6;

(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 10;

(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 14;

(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 18; y

(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 22.

Otra combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 3;

(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 7;

(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 11;

(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 15;

(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 19; y

(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 23.

Otra combinacion preferida comprende:

(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 4;

(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 8;

(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende SEC ID N°: 12;

(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 16;

(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 20; y

(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende SEC ID N°: 24.

Otros anticuerpos preferidos de la presente divulgation, o porciones de union a antlgeno de los mismos, comprenden: (a) una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 25-28 y 41-44; y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 29-32 y 45-48; en el que el anticuerpo se une especlficamente a CXCR4.

Una combinacion preferida comprende: (a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 25 o 41; y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 29 o 45.

Otra combinacion preferida comprende: (a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 26 o 42: y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 30 o 46.

Otra combinacion preferida comprende: (a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 27 o 43; y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 31 o 47.

Otra combinacion preferida comprende: (a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 28 o 44; y (b) una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEC ID N°: 32 o 48.

En otro aspecto de la presente divulgacion, se proporcionan anticuerpos, o porciones de union a antlgeno de los mismos, que compiten por la union a CXCR4 con cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente.

Los anticuerpos de la presente divulgacion pueden ser, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, de un isotipo IgG1 o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fab' o Fab'2, o anticuerpos monocatenarios.

La presente divulgacion tambien proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la presente divulgacion, o portion de union a antlgeno del mismo, enlazado a un agente terapeutico, tal como una citotoxina o un isotopo radiactivo. La presente divulgacion tambien proporciona una molecula biespeclfica que comprende un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, de la presente divulgacion enlazado a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union diferente a dicho anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo.

Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, o porcion de union a antlgeno del mismo, o un inmunoconjugado o molecula biespeclfica de la presente divulgacion, y un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

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Tambien quedan englobadas por la presente divulgacion moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de union a antigeno de los mismos, de la presente divulgacion, asi como vectores de expresion que comprenden tales acidos nucleicos y celulas huesped que comprenden tales vectores de expresion. Tambien se proporcionan metodos de preparacion de anticuerpos anti-CXCR4 que utilizan las celulas huesped que comprenden tales vectores de expresion y pueden incluir las etapas de (i) expresar el anticuerpo en la celula huesped y (ii) aislar el anticuerpo de la celula huesped.

Otro aspecto de la presente divulgacion se refiere a metodos in vitro para modular la actividad de CXCR4 en una celula, y a un anticuerpo o porcion de union al antigeno de anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo terapeutico para modular la actividad de CXCR4 en una celula, en el que las celulas se ponen en contacto con un anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, de la presente divulgacion. Las celulas pueden ponerse en contacto in vitro cultivando las celulas con el anticuerpo, o las celulas pueden ponerse en contacto in vivo administrando el anticuerpo a un sujeto. En una realizacion preferida, las celulas son celulas tumorales que expresan CXCR4 y el metodo produce la inhibicion del crecimiento de celulas tumorales y/o la inhibicion de la metastasis de las celulas tumorales. En otra realizacion, las celulas son linfocitos T que expresan CXCR4 y el metodo produce la inhibicion de la entrada del VIH en las celulas. En otra realizacion mas, las celulas son linfocitos en un trastorno inflamatorio y los metodos producen la inhibicion de la inflamacion. En una realizacion mas, las celulas estan involucradas en la vascularizacion y el metodo produce la modulation de la angiogenesis.

En otro aspecto, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo o porcion de union al antigeno de anticuerpo de la invencion para su uso en un metodo para estimular la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica en un sujeto. El metodo comprende administrar al sujeto un anticuerpo, o porcion de union a antigeno del mismo, de la presente divulgacion de forma que se estimule la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica. El metodo puede comprender ademas recoger las celulas madre CD34+ de la sangre periferica tal como su uso en trasplante autologo de celulas madre.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 33) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

25) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano F7. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 1), CDR2 (SEC ID N°: 5) y CDR3 (SEC ID N°: 9) estan delineadas y las derivaciones V, D y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 1B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 37) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

29) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano F7. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 13), CDR2 (SEC ID N°: 17) y CDR3 (SEC ID N°: 21) estan delineadas y las derivaciones V y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 2A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 34) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

26) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano F9. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 2), CDR2 (SEC ID N°: 6) y CDr3 (SEC ID N°: 10) estan delineadas y las derivaciones V, D y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 2B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 38) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

30) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano F9. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 14), CDR2 (SEC ID N°: 18) y CDR3 (SEC ID N°: 22) estan delineadas y las derivaciones V y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 3A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 35) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

27) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano D1. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 3), CDR2 (SEC ID N°: 7) y CDR3 (SEC ID N°: 11) estan delineadas y las derivaciones V, D y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 3B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 39) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

31) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano D1. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 15), CDR2 (SEC ID N°: 19) y CDR3 (SEC ID N°: 23) estan delineadas y las derivaciones V y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 4A muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 36) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

28) de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano E2. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 4), CDR2 (SEC ID N°: 8) y CDR3 (SEC ID N°: 12) estan delineadas y las derivaciones V, D y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 4B muestra la secuencia de nucleotidos (SEC ID N°: 40) y la secuencia de aminoacidos (SEC ID N°:

32) de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano E2. Las regiones CDR1 (SEC ID N°: 16), CDR2 (SEC ID N°: 20) y CDR3 (SEC ID N°: 24) estan delineadas y las derivaciones V y J de la linea germinal estan indicadas.

La Figura 5A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada de F7 (SEC ID N°: 25) y F7GL (SEC ID N°: 41) con la secuencia de aminoacidos Vh 3-48 de la linea germinal humana (SEC ID N°: 49) (linea germinal JH6b divulgada como SEC ID N°: 52).

La Figura 5B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena ligera de F7 (SEC ID N°: 29) y F7GL (SEC ID N°: 45) con la secuencia de aminoacidos Vk L15 de la linea germinal humana (SEC ID N°: 50) (linea germinal JK1 divulgada como SEC ID N°: 53).

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La Figura 6A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada de F9 (SEC ID N°: 26) y F9GL (SEC ID N°: 42) con la secuencia de aminoacidos VH 3-48 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 49) (llnea germinal JH6b divulgada como SEC ID N°: 52).

La Figura 6B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena ligera de F9 (SEC ID N°: 30) y F9GL (SEC ID N°: 46) con la secuencia de aminoacidos Vk L15 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 50) (llnea germinal JK1 divulgada como SEC ID N°: 53).

La Figura 7 A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada de D1 (SEC ID N°: 27) y D1GL (SEC ID N°: 43) con la secuencia de aminoacidos Vh 3-48 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 49) (llnea germinal JH6b divulgada como SEC ID N°: 52).

La Figura 7B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena ligera de D1 (SEC ID N°: 31) y D1GL (SEC ID N°: 47) con la secuencia de aminoacidos Vk L15 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 50) (llnea germinal JK1 divulgada como SEC ID N°: 53).

La Figura 8A muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de las regiones variables de la cadena pesada de E2 (SEC ID N°: 28) y E2GL (SEC ID N°: 44) con la secuencia de aminoacidos Vh 3-48 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 49) (llnea germinal JH6b divulgada como SEC ID N°: 52).

La Figura 8B muestra el alineamiento de la secuencia de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de E2 (SEC ID N°: 32) y E2GL (SEC ID N°: 48) con la secuencia de aminoacidos Vk L15 de la llnea germinal humana (SEC ID N°: 50) (llnea germinal JK1 divulgada como SEC ID N°: 53).

La Figura 9 es una grafica que muestra la union de anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7, F9, D1 y E2 a celulas CEM que expresan CXCR4 humano nativo sobre la superficie celular.

La Figura 10 es una grafica que muestra la competicion de los anticuerpos por la union a celulas CEM entre el anticuerpo anti-CXCR4 F9 marcado con FITC y un panel de anticuerpos anti-CXCR4 humanos sin marcar.

La Figura 11 es una grafica que muestra la inhibicion de la union de SDF-1 marcado con 125I a celulas CEM por anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7, F9 y D1.

La Figura 12 es una grafica que muestra la inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas CEM por anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7, F9 y D1.

La Figura 13 es una grafica que muestra la inhibicion de la migracion inducida por SDF-1 de celulas CEM por anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7 y F9.

La Figura 14 es una grafica que muestra la inhibicion de la proliferacion de celulas Ramos tumorales in vitro por anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7, F9 y E2.

Las Figuras 15A-C son graficas que muestran la inhibicion de la proliferacion de celulas Ramos tumorales in vivo en un modelo de tumor subcutaneo por anticuerpos anti-CXCR4 humanos F7 y F9. La Figura 15A muestra la curva del volumen medio de crecimiento tumoral; la Figura 15B muestra la mediana de la curva del volumen de crecimiento tumoral; la Figura 15C muestra la mediana del % de cambio de peso.

La Figura 16 es una grafica que muestra el % de supervivencia de ratones tratados con el anticuerpo anti- CXCR4 humano F9 en un modelo de celulas Ramos tumorales sistemicas.

Descripcion detallada de la presente divulgacion

La presente divulgacion se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen especlficamente a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular y se derivan de secuencias de la llnea germinal de la cadena pesada y ligera particulares. La presente divulgacion proporciona anticuerpos aislados, metodos de preparacion de tales anticuerpos, inmunoconjugados y moleculas biespeclficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moleculas biespeclficas de la presente divulgacion. La presente divulgacion tambien se refiere a metodos para usar los anticuerpos, tal como para detectar CXCR4, ademas de para modular la actividad de CXCR4 en enfermedades o trastornos asociados a la expresion de CXCR4 o que involucran a la via de CXCR4/SDF-1, tales como canceres, metastasis tumoral, infeccion por el VIH, inflamacion y angiogenesis. Por consiguiente, la presente divulgacion tambien proporciona metodos para usar los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion para tratar cancer, por ejemplo, para tratar un cancer tal como de mama, de ovario, de prostata, de pulmon de celulas no pequenas, pancreatico, de tiroides, melanoma, nasofarlngeo, de celulas renales, linfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarcoma, colorrectal, renal, osteosarcoma, leucemia linfoblastica aguda o leucemia mieloide aguda. Adicionalmente, la presente divulgacion proporciona metodos para usar los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion para inhibir la metastasis tumoral.

Con el fin de que la presente divulgacion pueda comprenderse mas facilmente, se definen, en primer lugar, ciertos terminos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripcion detallada.

El termino “CXCR4” incluye variantes, isoformas, homologos, ortologos y paralogos. Por ejemplo, los anticuerpos especlficos para CXCR4 pueden, en ciertos casos, reaccionar de forma cruzada con CXCR4 de especies distintas de humanas. En otras realizaciones, los anticuerpos especlficos para CXCR4 humano pueden ser completamente especlficos para CXCR4 humano y pueden no presentar reactividad cruzada con otras especies o de otro tipo. La expresion “CXCR4 humano” se refiere a la secuencia de CXCR4 humano, tal como la secuencia de aminoacidos completa de CXCR4 humano que tiene el numero de acceso a Genbank P61073 (SEC ID N°:51). CXCR4 tambien se conoce en la materia como, por ejemplo, LESTR, fusina o CD184. La secuencia de CXCR4 humano puede diferenciarse de la secuencia de CXCR4 humano de SEC ID N°: 51 por tener, por ejemplo, mutaciones conservadas

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o mutaciones en regiones no conservadas, y el CXCR4 tiene sustancialmente la misma funcion biologica que el CXCR4 humano de SEC ID N°: 51. Por ejemplo, una funcion biologica de CXCR4 humano es tener un epitope en el dominio extracelular de CXCR4 al que se une especificamente un anticuerpo de la presente divulgacion, o la funcion biologica de CXCR4 humano es la union a la quimiocina o la participation en el proceso metastasico.

Una secuencia particular de CXCR4 humano sera, generalmente, al menos el 90 % identica en la secuencia de aminoacidos al CXCR4 humano de SEC ID N°: 51 y contiene residuos de aminoacidos que identifican la secuencia de aminoacidos como humana cuando se compara con secuencias de aminoacidos de CXCR4 de otras especies (por ejemplo, murinas). En ciertos casos, un CXCR4 humano puede ser al menos el 95 %, o incluso al menos el 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % identico en la secuencia de aminoacidos al CXCR4 de SEC ID N°: 51. En ciertas realizaciones, una secuencia de CXCR4 humano no presentara mas de 10 diferencias de aminoacidos de CXCR4 de SEC ID N°: 51. En ciertas realizaciones, el CXCR4 humano no puede presentar mas de 5, o incluso no mas de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoacidos de CXCR4 de SEC ID N°: 51. El porcentaje de identidad puede determinarse como se describe en el presente documento.

El termino “SDF-1” se refiere al factor 1 derivado de celulas del estroma, que es un ligando de CXCR4. El termino “SDF-1” engloba las isoformas diferentes de SDF-1, tales como SDF-1a y SDF-1p. La secuencia de aminoacidos de SDF-1a humano tiene el numero de acceso a Genbank NP_954637. La secuencia de aminoacidos de SDF-1P humano tiene el numero de acceso a Genbank NP_000600. El SDF-1 humano se describe tambien en la patente de EE.UU. N° 5.756.084. El SDF-1 tambien se conoce como CXCL12. La secuencia de aminoacidos de SDF-1 humano puede diferenciarse de la de SDF-1 de NP_954637 o NP_000600, como se describe en el presente documento para CXCR4.

La expresion “respuesta inmunitaria” se refiere a la action de, por ejemplo, linfocitos, celulas presentadoras de antigeno, celulas fagociticas, granulocitos y macromoleculas solubles producidas por las celulas anteriores o por el higado (incluyendo anticuerpos, citocinas y el complemento) que produce el dano selectivo a, destruction de o elimination del cuerpo humano de patogenos invasores, celulas o tejidos infectados por patogenos, celulas cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamacion patologica, celulas o tejidos humanos normales.

Una “via de transduction de senales” se refiere a la relation bioquimica entre varias moleculas de transduction de senales que desempenan una funcion en la transmision de una senal de una portion de una celula a otra portion de una celula. Como se usa en el presente documento, la expresion “receptor de la superficie celular” incluye, por ejemplo, moleculas y complejos de moleculas capaces de recibir una senal y la transmision de una senal tal a traves de la membrana plasmatica de una celula. Un ejemplo de un “receptor de la superficie celular” de la presente divulgacion es el receptor CXCR4.

El termino “anticuerpo”, como se hace referencia en el presente documento, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de union a antigeno (es decir, “porcion de union a antigeno”) o cadenas simples del mismo. Un “anticuerpo” se refiere a una glicoprotema que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porcion de union a antigeno del mismo. Cada cadena pesada comprende una region variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como Vh) y una region constante de la cadena pesada. La region constante de la cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una region variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como Vl) y una region constante de la cadena ligera. La region constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, llamadas regiones estructurales (FR). Cada Vh y Vl se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de union que interacciona con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la union de la inmunoglobulina a tejidos huesped o factores, que incluyen varias celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, celulas efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema clasico del complemento.

La expresion “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo (o simplemente “porcion de anticuerpo”), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse especificamente a un antigeno (por ejemplo, CXCR4). Se ha mostrado que la funcion de union a antigeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de union englobados dentro de la expresion “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (vease FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3a ed., 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios Vh y Ch1; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un anticuerpo de un solo brazo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 34L544-546), que consiste de un dominio Vh; (vii) una region aislada determinante de la complementariedad (CDR); y (viii) un Nanobody, una region variable de la cadena pesada que contiene un dominio variable simple y dos dominios constantes. Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, son

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codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un conector sintetico que permite que estos se preparen como una cadena de proteina simple en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moleculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenarios (scFv)); vease, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios tambien pretenden estar englobados dentro de la expresion “porcion de union a antigeno” de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando metodos convencionales conocidas para aquellos expertos en la materia, y los fragmentos se criban para utilidad del mismo modo que con los anticuerpos intactos.

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo aislado” pretende referirse a un anticuerpo que esta sustancialmente libre de otros anticuerpos que tengan especificidades antigenicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une especificamente a CXCR4 esta sustancialmente libre de anticuerpos que se unen especificamente a antigenos distintos de CXCR4). Un anticuerpo aislado que se une especificamente a CXCR4 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antigenos, tales como moleculas CXCR4 de otras especies. Ademas, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos quimicos.

La expresion “anticuerpo monoclonal” o “composicion de anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se refiere a una preparacion de moleculas de anticuerpo con una unica composicion molecular. Una composicion de anticuerpo monoclonal muestra una unica especificidad y afinidad de union por un epitope particular.

La expresion “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto las regiones estructurales como las CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Ademas, si el anticuerpo contiene una region constante, la region constante tambien se deriva de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente divulgacion pueden incluir residuos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria o especifica de sitio in vitro o por mutacion somatica in vivo). Sin embargo, la expresion “anticuerpo humano”, como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, se han injertado en secuencias de la region estructural humanas.

La expresion “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que muestran una unica especificidad de union que tienen regiones variables en las que tanto las regiones estructurales como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En una realization, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye un linfocito B obtenido de un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera fusionados a una celula inmortalizada.

La expresion “anticuerpo recombinante humano”, como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un raton) que es transgenico o transcromosomico para genes de inmunoglobulina humanos o un hibridoma preparado a partir de estos (se describe con mas detalle a continuation);

(b) anticuerpos aislados de una celula huesped transformada para expresar el anticuerpo humano, por ejemplo, de un transfectoma; (c) anticuerpos aislados de una biblioteca recombinante combinatoria de anticuerpos humanos, y

(d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique cortar y empalmar secuencias de genes de inmunoglobulina humanas con otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones estructurales y regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Sin embargo, en ciertas realizaciones, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagenesis in vitro (o, si se emplea un animal transgenico para secuencias de Ig humana, mutagenesis somatica in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoacidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de y estan relacionadas con las secuencias VH y VL de la linea germinal humana, puede que no existan de forma natural en el repertorio de anticuerpos de la linea germinal humana in vivo.

Como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgG1) que esta codificada por los genes de la region constante de la cadena pesada.

Las expresiones “un anticuerpo que reconoce un antigeno” y “un anticuerpo especifico para un antigeno” se usan intercambiablemente en el presente documento con la expresion “un anticuerpo que se une especificamente a un antigeno”.

La expresion “derivados de anticuerpos humanos” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

La expresion “anticuerpo humanizado” tiene por objeto hacer referencia a anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la linea germinal de otra especie de mamifero, tal como un raton, se han injertado en secuencias de la region estructural humanas. Pueden hacerse modificaciones adicionales de las regiones estructurales dentro de las

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secuencias de la region estructural humanas.

La expresion “anticuerpo quimerico” pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de la region variable se derivan de una especie y las secuencias de la region constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la region variable se derivan de un anticuerpo de raton y las secuencias de la region constante se derivan de un anticuerpo humano.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que “se une especlficamente a CXCR4 humano” pretende referirse a un anticuerpo que se une a CXCR4 humano (y posiblemente a CXCR4 de una o mas especies no humanas), pero no se une sustancialmente a protelnas no CXCR4. En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgacion se une especlficamente al CXCR4 humano de SEC ID N°: 51 o una variante del mismo. Preferentemente, el anticuerpo se une a CXCR4 humano con una Kd de 1 x 10-7 o menos, mas preferentemente 5 x 10-8 o menos, mas preferentemente 3 x 10-8 M o menos, mas preferentemente 1 x 10-8 M o menos, incluso mas preferentemente 5 x 10-9 M o menos.

La expresion “no se une sustancialmente” a una protelna o celulas, como se usa en el presente documento, significa que no se une o no se une con afinidad alta a la protelna o las celulas, es decir, se une a la protelna o las celulas con una Kd de 1 x 10-6 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-5 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-4 M o mas, mas preferentemente 1 x 10-3 M o mas, incluso mas preferentemente 1 x 10-2 M o mas.

El termino “Kas” o “Ka”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la velocidad de asociacion de una interaccion anticuerpo-antlgeno particular, mientras que el termino “Kdis” o “Kd”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la velocidad de disociacion de una interaccion anticuerpo-antlgeno particular. El termino “Kd”, como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constate de disociacion, que se obtiene a partir de la relacion de Kd con respecto a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentracion molar (M). Los valores de Kd para anticuerpos pueden determinarse usando metodos muy establecidos en la materia. Un metodo preferido para determinar la Kd de un anticuerpo es usando resonancia de pasmones superficiales, preferentemente usando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.

Como se usa en el presente documento, la expresion “alta afinidad” por un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1 x 10-7 M o menos, mas preferentemente 5 x 10-8 M o menos, incluso mas preferentemente 1 x 10-8 M o menos, incluso mas preferentemente 5 x 10-9 M o menos e incluso mas preferentemente 1 x 10-9 M o menos para un antlgeno diana. Sin embargo, la union con “afinidad alta” puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la union con “afinidad alta” para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-6 o menos, mas preferentemente 10-7 M o menos, incluso mas preferentemente 10-8 M o menos.

Como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” incluye cualquier animal humano o no humano. La expresion “animal no humano” incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Se describen con mayor detalle varios aspectos de la presente divulgacion en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-CXCR4

Los anticuerpos de la presente divulgacion se caracterizan por caracterlsticas o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular. Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 con alta afinidad, por ejemplo con una Kd de 1 x 10-7 M o menos. Los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion presentan preferentemente una o mas de las siguientes caracterlsticas:

(a) se unen a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular;

(b) inhiben la union de SDF-1 a CXCR4;

(c) inhiben el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4;

(d) inhiben la migration inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4;

(e) inhiben la formation de tubos capilares por celulas endoteliales de la vena umbilical humana.

(f) se unen a CXCR4 humano con una Kd de 1 x 10-7 M o menos;

(g) inducen la apoptosis en celulas que expresan CXCR4;

(h) inhiben la proliferation de celulas tumorales in vitro;

(i) inhiben la proliferacion de celulas tumorales y/o inducen la apoptosis de celulas tumorales in vivo;

(j) inhiben la metastasis de celulas tumorales CXCR4+; y/o

(k) aumentan el tiempo de supervivencia de un sujeto que padece un tumor CXCR4+.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 humano nativo sobre una superficie celular, pero no inhibe la union de sDF-1 a CXCR4 y no inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 y no inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4. En otras realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 humano nativo sobre una superficie celular

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e inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 e inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4, pero no inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4. En otras realizaciones mas, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 humano nativo sobre una superficie celular e inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 e inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 e inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4. En otras realizaciones mas, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 humano nativo sobre una superficie celular, inhibe la union de SDF-1 a CXCR4, inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4, inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4 e inhibe la formacion de tubos capilares por HuVEC.

Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion se une a CXCR4 humano con una KD de 5 x 10-8 M o menos, se une a CXCR4 humano con una Kd de 2 x 10-8 M o menos, se une a CXCR4 humano con una Kd de 5 x 10-9 M o menos, se une a CXCR4 humano con una Kd de 4 x 10-9 M o menos, se une a CXCR4 humano con una Kd 3 x 10-9 M o menos, o se une a CXCR4 humano con una Kd de 2 x 10-9 M o menos.

Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion inhibe la union de SDF-1 a CXCR4 humano con una CE50 para la inhibicion de 50 nM o menos, mas preferentemente 30 nM o menos, o 15 nM o menos, o 10 nM o menos, o 5 nM o menos, o 3 nM o menos (por ejemplo, una CE50 para la inhibicion de 28,60 nM o menos, o 12,51 nM o menos,

0 2,256 nM o menos).

Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 humano con una CE50 para la inhibicion de 3 nM o menos, mas preferentemente 2 nM o menos, o

1 nM o menos, o 0,9 nM o menos, o 0,8 nM o menos, o 0,7 nM o menos, o 0,6 nM o menos, o 0,5 nM o menos, o 0,4 nM o menos (por ejemplo, 0,9046 nM o menos, 0,5684 o menos, o 0,3219 nM o menos).

Preferentemente, un anticuerpo de la presente divulgacion inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4 humano con una CE50 para la inhibicion de 50 nM o menos, mas preferentemente 30 nM o menos, o 20 nM o menos, o 15 nM o menos (por ejemplo, 18,99 nM o menos, o 12,44 o menos).

Los ensayos estandar para evaluar la capacidad de union de los anticuerpos a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular son conocidos en la materia, que incluyen, por ejemplo, analisis de citometrla de flujo usando una llnea celular que expresa naturalmente CXCR4 nativo o que se ha transfectado para expresar CXCR4 nativo. Se describen ensayos adecuados en detalle en los ejemplos. Una llnea celular preferida que expresa CXCR4 nativo es la llnea de linfocitos T CEM. Ensayos adecuados para evaluar la inhibicion de la union de SDF-1, la inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1, la inhibicion de la migracion celular inducida por SDF-1, la inhibicion de la formacion de tubos capilares por HuVEC, la induccion de la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 in vitro y/o in vivo, la inhibicion del crecimiento de celulas tumorales CXCR4+ in vitro y/o in vivo y/o la inhibicion de la metastasis de celulas tumorales CXCR4+ tambien se describen en detalle en los ejemplos. Tambien puede determinarse la afinidad de union de los anticuerpos por metodos estandar, tales como por el analisis de Scatchard.

Anticuerpos monoclonales F7, F9, D1 y E2

Los anticuerpos preferidos de la presente divulgacion son los anticuerpos monoclonales humanos F7, F9, D1 y E2, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoacidos Vh de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos Vl de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 29, 30, 31 y 32, respectivamente. Adicionalmente, se crearon formas alternativas de F7, F9, D1 y E2, en las que ciertos residuos de la region estructural se substituyeron con un residuo de la llnea germinal, y se denominan en la presente F7GL, F9GL, D1GL y E2GL. Las secuencias de aminoacidos Vh de F7GL, F9GL, D1GL y E2GL se muestran en SEC ID N°: 41, 42, 43 y 44, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos VL de F7GL, F9GL, D1GL y E2GL se muestran en SeC ID N°: 45, 46, 47 y 48, respectivamente.

Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a CXCR4, las secuencias Vh y Vl pueden “'mezclarse y combinarse” para crear otras moleculas de union a anti-CXCR4 de la presente divulgacion. Puede probarse la union a CXCR4 de tales anticuerpos “mezclados y combinados” usando los ensayos de union descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, citometrla de flujo con celulas CEM). Preferentemente, cuando las cadenas Vh y Vl se mezclan y combinan, una secuencia Vh de una combination Vh / Vl particular se sustituye por una secuencia Vh estructuralmente similar. Asimismo, se sustituye preferentemente una secuencia VL de una combinacion VH / VL por una secuencia VL estructuralmente similar.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o portion de union a antlgeno del mismo, que comprende:

(a) una region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 25-28 y 41-44; y

(b) una region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°; 29-32 y 45-48;

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en el que el anticuerpo se une especlficamente a CXCR4, preferentemente a CXCR4 humano. Las combinaciones preferidas de cadena pesada y ligera incluyen:

(a) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de

41, y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de 45; o

(b) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de

42, y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de 46; o

(c) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de

43, y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de 47; o

(d) una region variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de

44, y una region variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de 48.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y de la cadena ligera de F7, F9, D1 o E2, o sus combinaciones. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vh de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 1-4, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vh de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 5-8, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de Vh de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 9-12, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR1 de Vk de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 13-16, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR2 de Vk de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 17-20, respectivamente. Las secuencias de aminoacidos de las CDR3 de Vk de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 21-24, respectivamente. Las regiones CDR son delineadas usando el sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a edicion, U.S. Department of Health and Human Services, Publicacion NIH N° 91-3242).

Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a CXCR4 y que la especificidad de union a antlgeno se proporciona fundamentalmente por las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh y CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk pueden “mezclarse y combinarse” (es decir, las CDR de anticuerpos diferentes pueden mezclarse y combinarse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh y una CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk) para crear otras moleculas de union anti-CXCR4 de la presente divulgacion. La union a CXCR4 de tales anticuerpos “mezclados y combinados” puede probarse usando los ensayos de union descritos anteriormente y en los ejemplos (por ejemplo, ELISA y analisis Biacore®). Preferentemente, cuando se mezclan y combinan secuencias CDR de Vh, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vh particular se sustituye por una secuencia(s) CDR estructuralmente similar(es). Asimismo, cuando se mezclan y combinan secuencias cDr de Vk, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vk particular se sustituye preferentemente por una secuencia(s) CDR estructuralmente similar(es). Sera facilmente evidente para un experto en la materia que pueden crearse secuencias Vh y Vl novedosas sustituyendo una o mas secuencias de las regiones CDR de Vh y/o Vl por secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR descritas en el presente documento para los anticuerpos monoclonales los anticuerpos F7, F9, D1 y E2.

Por consiguiente, en otro aspecto, la presente divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende:

(a) una CDR1 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 1-4;

(b) una CDR2 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 5-8;

(c) una CDR3 de la region variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 9-12;

(d) una CDR1 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 13-16;

(e) una CDR2 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 17-20; y

(f) una CDR3 de la region variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 21-24;

en el que el anticuerpo se une especlficamente a CXCR4, preferentemente a CXCR4 humano.

En una realizacion preferida, el anticuerpo comprende:

SEC ID N°: 25 o SEC ID N°: 29 o

SEC ID N°: 26 o SEC ID N°: 30 o

SEC ID N°: 27 o SEC ID N°: 31 o

SEC ID N°: 28 o SEC ID N°: 32 o

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En otra realizacion preferida, el anticuerpo comprende:

Se conoce bien en la materia que el dominio CDR3, independientemente del (de los) dominio(s) CDR1 y/o CDR2, puede determinar por si solo la especificidad de union de un anticuerpo por un antlgeno relacionado, y que pueden generarse predeciblemente multiples anticuerpos que tienen la misma especificidad de union basandose en una secuencia CDR3 comun. Vease, por ejemplo, Klimka et al, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (que describe la produccion de un anticuerpo anti-CD30 humanizado usando unicamente CDR3 del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo murino anti-CD30 Ki-4); Beiboer et aI., J Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (que describe anticuerpos recombinantes de glicoprotelna-2 epitelial (EGP-2) usando unicamente la secuencia CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo parental murino MOC-31 anti-EGP-2); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 95:89108915 (1998) (que describe un panel de anticuerpos anti-integrina a^3 humanizados usando una CDR3 del dominio variable de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo murino anti-integrina a^ LM609, en el que cada anticuerpo integrante comprende una secuencia distinta fuera del dominio CDR3 y capaz de unirse al mismo epitope que el anticuerpo murino parental con afinidades tan altas como el anticuerpo parental murino o mayores); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que divulga que el dominio CDR3 proporciona la contribucion mas significativa a la union de antlgeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de secuencias CDR3 de la cadena pesada de tres Fab (SI-1, SI-40 y SI-32) contra el ADN placentario humano en la cadena pesada de un Fab anti-toxoide tetanico sustituyendo de este modo la CDR3 de la cadena pesada existente y demostrando que el dominio CDR3 por si solo conferla especificad de union); y Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que describe estudios de injerto en los que la transferencia de unicamente CDR3 de la cadena pesada de un Fab poliespeclfico parental LNA3 a una cadena pesada de un Fab de un anticuerpo IgG monoespeclfico p313 de union al toxoide tetanico era suficiente para retener la especificidad de union del Fab parental); Berezov et al., BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (que describe mimeticos de peptidos basados en la CDR3 de un anticuerpo monoclonal anti-HER2; Igarashi et al., J. Biochem (Tokio) 117:452-7 (1995) (que describe un polipeptido sintetico de 12 aminoacidos que se corresponde con el dominio CDR3 de un anticuerpo anti- fosfatidilserina); Bourgeois et al., J. Virol 72:807-10 (1998) (que muestra que un unico peptido derivado del dominio CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo anti-virus sincitial respiratorio (VSR) fue capaz de neutralizar el virus in vitro); Levi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993) (que describe un peptido basado en el dominio CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo murino anti-VIH); Polymenis y Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (que describe posibilitar la union de un scFv mediante el injerto de la region CDR3 de la cadena pesada de un anticuerpo de union a ADN-Z); y Xu y Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (que describe que la diversidad en la CDR3 de la cadena pesada es suficiente para permitir que moleculas IgM, por lo demas identicas, distingan entre varios antlgenos de hapteno y de protelna). Veanse tambien las patentes de EE.UU. N° 6.951.646; 6.914.128; 6.090.382; 6.818.216; 6.156.313; 6.827.925; 5.833.943; 5.762.905 y 5.760.185, que describen anticuerpos patentados definidos por un unico dominio CDR.

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Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un animal humano o no humano, en el que el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse especlficamente a CXCR4. Dentro de ciertos aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios cDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de raton o de rata, en el que el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse especlficamente a CXCR4. Dentro de algunas realizaciones, tales anticuerpos inventivos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir por la union con; (b) retienen las caracterlsticas funcionales; (c) se unen al mismo epitope; y/o (d) tienen una afinidad de union similar a la del anticuerpo no humano parental correspondiente.

Dentro de otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en el que el anticuerpo humano es capaz de unirse especlficamente a CXCR4. Dentro de otros aspectos, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en el que el primer anticuerpo humano es capaz de unirse especlficamente a CXCR4 y en el que el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano sustituye a un dominio CDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de union a CXCR4 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse especlficamente a CXCR4. Dentro de algunas realizaciones, tales anticuerpos que comprenden uno o mas dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por la union con; (b) retienen las caracteristicas funcionales; (c) se unen al mismo epitope; y/o (d) tienen una afinidad de union similar a la del primer anticuerpo humano parental correspondiente.

Anticuerpos que tienen secuencias de la linea germinal particulares

Los anticuerpos monoclonales y porciones de union al antigeno de los mismos de la presente invencion, como se definen en la reivindicacion 1, comprenden una region variable de la cadena pesada que es el producto de, o se deriva de, un gen Vh 3-48 humano y comprenden una region variable de la cadena ligera que es el producto de, o se deriva de, un gen Vk L15 humano, en el que el anticuerpo se une especlficamente a CXCR4, preferentemente a CXCR4 humano. Tales anticuerpos tambien pueden poseer una o mas de las caracteristicas funcionales descritas en detalle anteriormente, tales como la union a CXCR4 nativo expresado sobre una superficie celular, la inhibicion de la union de SDF-1 a CXCR4, la inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4, la inhibicion de la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4, la inhibicion de la formation de tubos capilares por HuVEC, la induction de la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 in vitro y/o in vivo, la inhibicion del crecimiento de celulas tumorales CXCR4+ in vitro y/o in vivo, y/o la inhibicion de la metastasis de celulas tumorales CXCR4+.

Ejemplos de anticuerpos que tienen Vh y Vk de Vh 3-48 y Vk L15, respectivamente, son los anticuerpos F7, F9, D1 y E2.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera que es “el producto de” o “se deriva de” una secuencia particular de la linea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la linea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un raton transgenico que lleva genes de inmunoglobulina humana con el antigeno de interes o cribar una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana expresados en fago con el antigeno de interes. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “se deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoacidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulinas de la linea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la linea germinal humana que esta mas proxima en secuencia (es decir, el mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo humano que es “el producto de” o “se deriva de” una secuencia particular de inmunoglobulina de la linea germinal humana puede contener diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de la linea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somaticas que existen de forma natural o a la introduction intencional de una mutation dirigida a sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es al menos el 90 % identico en la secuencia de aminoacidos a una secuencia de aminoacidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la linea germinal humana, y contiene residuos de aminoacidos que identifican el anticuerpo humano como que es humano cuando se compara con las secuencias de aminoacidos de inmunoglobulina de la linea germinal de otra especie (por ejemplo, secuencias de la linea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos el 95 %, o incluso al menos el 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % identico en la secuencia de aminoacidos a la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de la linea germinal humana no presentara mas de 10 diferencias de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano no puede presentar mas de 5, o incluso mas de 4, 3, 2 o 1 diferencia de aminoacidos de la secuencia de aminoacidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la linea germinal.

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Anticuerpos homologos

En otra realizacion mas, un anticuerpo de la presente divulgacion comprende reqiones variables de la cadena pesada y liqera que comprenden secuencias de aminoacidos que son homologas a las secuencias de aminoacidos de los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento, y en el que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion.

Por ejemplo, la presente divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlqeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada y una region variable de la cadena ligera, en el que:

(a) la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N°: 25-28 y 41-44;

(b) la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos que es al menos el 80 % homologa a una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N°: 29-32 y 45-48;

Adicionalmente o alternativamente, el anticuerpo puede poseer una o mas de las siguientes propiedades funcionales: (i) se une a CXCR4 humano con una Kd de 1x10-7 M o menos; (ii) inhibe la union de SDF-1 a CXCR4; (iii) inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4; (iv) inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4; (v) inhibe la formation de tubos capilares por HuVEC; (vi) induce la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 in vitro y/o in vivo; (vii) inhibe el crecimiento de celulas tumorales CXCR4+ in vitro y/o in vivo; y/o (viii) inhibe la metastasis de celulas tumorales CXCR4+.

En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

En otras realizaciones, las secuencias de aminoacidos Vh y/o Vl pueden ser el 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % homologas a las secuencias expuestas anteriormente. Puede obtenerse un anticuerpo que tiene regiones Vh y Vl que tienen alta homologla (es decir, el 80 % o superior) a las regiones Vh y Vl de las secuencias expuestas anteriormente por mutagenesis (por ejemplo, mutagenesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moleculas de acidos nucleicos que codifican SEC ID N°: 25-32 o 41-48, seguido de probar el anticuerpo alterado codificado para la funcion retenida (es decir, las funciones expuestas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el porcentaje de homologla entre dos secuencias de aminoacidos es equivalente al porcentaje de identidad entre las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (es decir, % de homologla = n° de posiciones identicas/ n° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el numero de huecos y la longitud de cada hueco, que necesitan ser introducidos para el alineamiento optimo de las dos secuencias. La comparacion de secuencias y la determination del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matematico, como se describe en los ejemplos no limitantes mas adelante.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (version 2.0), usando una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalization por longitud de hueco de 12 y una penalizacion por hueco de 4. Ademas, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informatico GCG (disponible en
http://vvww.gcg.com), usando tanto una matriz Blossum 62 como una matriz PAM250, y un peso por hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Adicionalmente o alternativamente, las secuencias de las protelnas de la presente divulgacion pueden usarse adicionalmente como “secuencia de consulta” para realizar una busqueda por comparacion con bases de datos publicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Tales busquedas pueden realizarse usando el programa XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las busquedas de protelnas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de anticuerpos de la divulgacion. Puede utilizarse Gapped BLAST para obtener alineaciones con huecos para fines de comparacion, como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17);3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, son utiles los parametros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Vease
www.ncbi.nlm.nih.gov.

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Anticuerpos con modificaciones conservativas

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de la presente divulgacion comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en el que una o mas de estas secuencias CDR comprende secuencias de aminoacidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en el presente documento (por ejemplo, F7, F9, D1 o E2), o modificaciones conservativas de las mismas, y en el que los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion. Se entiende en la materia que pueden hacerse ciertas modificaciones conservativas de las secuencias que no eliminan la union a antlgeno. Veanse, por ejemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8 (que describe el analisis mutacional en el dominio CDR3 de la cadena pesada de anticuerpos especlficos para la Salmonella); de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41 (que describe estudios de mutaciones en anticuerpos anti-UA1); Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870 (que muestra que mutaciones en la parte intermedia de HCDR3 condujeron a tanto una afinidad suprimida como reducida); Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12 (que describe que un unico cambio de aminoacido en la region CDR3 suprimio la actividad de union); Kelley y O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35 (que describe la contribucion de residuos Tyr en la union a antlgeno); Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. j_0: 341 -6 (describe el efecto de la hidrofobicidad en la union) y Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (que describe mutantes de aminoacidos de HCDR3). Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o porcion de union a antlgeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3, en el que:

(a) la secuencia CDR3 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos

seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 9-12 y modificaciones

conservativas de las mismas;

(b) la secuencia CDR3 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos

seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 21-44 y modificaciones

conservativas de las mismas; y

Adicionalmente o alternativamente, el anticuerpo puede poseer una o mas de las siguientes propiedades funcionales: (i) se une a CXCR4 humano con una Kd de 1x10-7 M o menos; (ii) inhibe la union de SDF-1 a CXCR4; (iii) inhibe el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4; (iv) inhibe la migracion inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4; (v) inhibe la formation de tubos capilares por HuVEC; (vi) induce la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 in vitro y/o in vivo; (vii) inhibe el crecimiento de celulas tumorales CXCR4+ in vitro y/o in vivo; y/o (viii) inhibe la metastasis de celulas tumorales CXCR4+,

En una realization preferida, la secuencia CDR2 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de sEc ID N°: 58 y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR2 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 17-20 y modificaciones conservativas de las mismas. En otra realizacion preferida, la secuencia CDR1 de la region variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de sEc ID N°: 1-4 y modificaciones conservativas de las mismas; y la secuencia CDR1 de la region variable de la cadena ligera comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 13-16 y modificaciones conservativas de las mismas.

En diversas realizaciones, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quimericos.

Como se usa en el presente documento, la expresion “modificaciones de secuencia conservativas” pretende referirse a modificaciones de aminoacidos que no afectan o alteran significativamente las caracterlsticas de union del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoacidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoacidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la presente divulgacion por tecnicas estandar conocidas en la materia, tales como mutagenesis dirigida al sitio y mutagenesis mediada por PCR. Sustituciones conservativas de aminoacidos son aquellas en las que el residuo de aminoacido se sustituye con un residuo de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la materia familias de residuos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistelna, triptofano), cadenas laterales apolares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Asl, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la presente divulgacion pueden sustituirse con otros residuos de aminoacidos de la misma familia de cadenas laterales, y el anticuerpo alterado

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puede probarse para funcion retenida (es decir, las funciones expuestas anteriormente) usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento.

Anticuerpos que se unen al mismo epitope que los anticuerpos anti-CXCR4

Ademas, en el presente documento se describen anticuerpos que se unen al mismo epitope sobre CXCR4 humano que cualquiera de los anticuerpos monoclonales anti-CXCR4 de la presente divulgacion (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de competir de forma cruzada por la union a CXCR4 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion). Preferentemente, el anticuerpo de referencia para estudios de competicion cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal F7 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestran en SEC ID N°: 25 y 29, respectivamente) o el anticuerpo monoclonal F9 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestran en SEC ID N°: 26 y 30, respectivamente) o el anticuerpo monoclonal D1 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestran en SEC ID N°: 27 y 31, respectivamente) o el anticuerpo monoclonal E2 (que tiene secuencias Vh y Vl como se muestran en SEC ID N°: 28 y 32, respectivamente).

Tales anticuerpos de competicion cruzada pueden identificarse basandose en su capacidad de competir de forma cruzada con F7, F9, D1 o E2 en ensayos estandar de union a CXCR4. Por ejemplo, puede usarse citometrla de flujo con celulas CEM para demostrar la competicion cruzada con los anticuerpos de la presente divulgacion, en el que el anticuerpo de referencia esta marcado con FITC y se evalua la capacidad de un anticuerpo de prueba de inhibir la union del anticuerpo de referencia marcado con FITC a celulas CEM. La capacidad de un anticuerpo de prueba de inhibir la union de, por ejemplo, F7, F9, D1 o E2, a CXCR4 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con F7, F9, D1 o E2 por la union a CXCR4 humano y, por lo tanto, se une al mismo epitope de CXCR4 humano que F7, F9, D1 o E2. Preferentemente, el anticuerpo que se une al mismo epitope sobre CXCR4 que F7, F9, D1 o E2 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en los ejemplos.

Anticuerpos manipulados y modificados

Un anticuerpo de la presente divulgacion puede prepararse adicionalmente usando un anticuerpo que tiene una o mas de las secuencias Vh y/o Vl divulgadas en el presente documento como material de partida para manipular un anticuerpo modificado, pudiendo dicho anticuerpo modificado tener propiedades alteradas del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede manipularse modificando uno o mas residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir. Vh y/o Vl), por ejemplo, dentro de una o mas regiones CDR y/o dentro de una o mas regiones estructurales. Adicionalmente o alternativamente, un anticuerpo puede manipularse modificando de residuos dentro de la(s) region (regiones) constante(s), por ejemplo, para alterar la(s) funcion (funciones) efectora(s) del anticuerpo.

En ciertas realizaciones, puede usarse injerto de CDR para manipular regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interaccionan con antigenos diana predominantemente a traves de residuos de aminoacidos que estan localizados en las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de las cadenas pesada y ligera. Por esta razon, las secuencias de aminoacidos dentro de las CDR son mas diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Dado que las secuencias CDR son responsables de la mayoria de las interacciones anticuerpo-antigeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos especificos que existen de forma natural construyendo vectores de expresion que incluyen secuencias CDR del anticuerpo especifico que existe de forma natural injertado en secuencias de la region estructural de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (veanse, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al (1989) Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 86:1002910033; patente de EE.UU. N° 5.225.539 de Winter, y patentes de EE.UU. N° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.)

Por consiguiente, otra realization de la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o portion de union a antigeno del mismo, que comprende una region variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 1-4, SEC ID N°: 5-8 y SEC ID N°: 9-12, respectivamente, y una region variable de la cadena ligera que comprende secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 13-16, SEC ID N°: 17-20 y SEC ID N°: 21-24, respectivamente. Asi, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR de Vh y Vl de anticuerpos monoclonales F7, F9, D1 o E2, pero pueden contener secuencias de la region estructural diferentes de estos anticuerpos.

Tales secuencias de la region estructural pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN publicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la linea germinal. Por ejemplo, pueden encontrarse secuencias de ADN de la linea germinal para genes de las regiones variables de la cadena pesada y ligera humanas en la base de datos de secuencias de la linea germinal humana “VBase” (disponible de Internet en wmv.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), ademas de en Kabat, E, A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edition, U.S. Department of Health and Human Services, Publication NIH N° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al (1992) “The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol Biol. 227:776-798; y Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line

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VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836. Como otro ejemplo, las secuencias de ADN de la linea germinal para genes de la region variable de la cadena pesada y ligera humanas pueden encontrarse en la base de datos Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la linea germinal encontradas en el raton HCo7 HuMAb estan disponibles en los numeros de acceso a Genbank que se indican a continuacion: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de la cadena pesada de la linea germinal encontradas en el raton HCo12 HuMAb estan disponibles en los numeros de acceso a Genbank que se indican a continuacion: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678). Otra fuente adicional de secuencias de la cadena pesada y ligera de la linea germinal humana es la base de datos de genes de inmunoglobulina humana disponibles de iMGT (
http://imgt.cines.fr).

Se comparan secuencias de proteinas del anticuerpo con una base de datos de secuencias de proteinas recopiladas usando uno de los metodos de busqueda de similitud de secuencias llamado Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que es muy conocido para aquellos expertos en la materia. BLAST es un algoritmo heuristico en el que una alineacion estadisticamente significativa entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de la base de datos es probable que contenga pares de segmentos de alto puntuacion (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmentos cuyas puntuaciones no pueden mejorarse por extension o recorte se conocen como un hit (acierto). Resumidamente, las secuencias de nucleotidos de origen VBASE (
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php) se traducen y se retiene la region entre y que incluye las regiones estructurales de FR1 a FR3. Las secuencias de la base de datos tienen una longitud promedio de 98 residuos. Se descartan las secuencias duplicadas que son coincidencias exactas en toda la longitud de la proteina. Una busqueda BLAST para proteinas usando el programa blastp con parametros estandar por defecto, excepto el filtro de baja complejidad, que esta desconectado, y la matriz de sustitucion de BLOSUM62, filtra los 5 aciertos principales que dan coincidencias de secuencia. Las secuencias de nucleotidos se traducen en los seis marcos y el marco sin codones de parada en el segmento coincidente de la secuencia de la base de datos se considera el posible acierto. Esto se confirma a su vez usando el programa tblastx de BLAST, que traduce la secuencia del anticuerpo en los 6 marcos y compara aquellas traducciones con las secuencias de nucleotidos VBASE traducidas dinamicamente en los seis marcos. Pueden consultarse similarmente a VBASE otras bases de datos de secuencias de la linea germinal humana, tales como la disponible de IMGT (
http://imgt.cines.fr), como se describio anteriormente.

Las identidades son coincidencias exactas de aminoacidos entre la secuencia del anticuerpo y la base de datos de proteinas en toda la longitud de la secuencia. Los positivos (identidades + coincidencia de sustitucion) no son identicos, sino sustituciones de aminoacidos guiadas por la matriz de sustitucion BLOSUM62. Si la secuencia del anticuerpo coincide con dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, se decidiria que el acierto con mas positivos es el acierto de la secuencia coincidente.

Secuencias de la region estructural preferidas para uso en los anticuerpos de la presente divulgacion son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de la region estructural usadas por anticuerpos seleccionados de la presente divulgacion, concretamente similares a las secuencias de la region estructural Vh 3-48 (SEC ID N°: 49) y la secuencia de la region estructural Vk L15 (SEC ID N°: 50) usadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la presente divulgacion. Las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de Vh y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de Vk pueden injertarse en regiones estructurales que tengan una secuencia identica a la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la linea germinal del que se deriva la secuencia de la region estructural, o las secuencias CDR pueden injertarse en regiones estructurales que contienen una o mas mutaciones en comparacion con las secuencias de la linea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es beneficioso mutar residuos dentro de las regiones estructurales para mantener o mejorar la capacidad de union a antigeno del anticuerpo (veanse, por ejemplo, las patentes de Ee.UU. N° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.)

Otro tipo de modificacion de la region variable es mutar residuos de aminoacidos dentro de las regiones Vh y/o Vk de CDR1, CDR2 y/o CDR3 para asi mejorar una o mas propiedades de union (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interes. Pueden realizarse mutagenesis dirigida a sitio o mutagenesis mediada por PCR para introducir la(s) mutacion (mutaciones) y el efecto sobre la union del anticuerpo u otra propiedad funcional de interes puede evaluarse en ensayos in vitro o in vivo como se describe en el presente documento y se proporciona en los ejemplos. Se introducen modificaciones preferentemente conservativas (como se trato anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoacidos, pero preferentemente son sustituciones. Ademas, normalmente no se alteran mas de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una region CDR.

Por consiguiente, en otra realizacion, la presente divulgacion proporciona anticuerpos monoclonales anti-CXCR4 aislados, o porciones de union a antigeno de los mismos, que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende: (a) una region CDR1 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 1-4 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 1-4; (b) una region CDR2 de Vh que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 5-8 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de

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aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 5-8; (c) una region CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 9-12 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 9-12; (d) una region CDR1 de Vk que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 13-16 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 13-16; (e) una region CDR2 de Vk que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 17-20 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 17-20; y (f) una region CDR3 de Vk que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 21-24 o una secuencia de aminoacidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoacidos en comparacion con SEC ID N°: 21-24.

Los anticuerpos manipulados de la presente divulgacion incluyen aquellos en los que se han hecho modificaciones a residuos de la region estructural dentro de Vh y/o Vk, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, tales modificaciones de la region estructural se hacen para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en “retromutar” uno o mas residuos de la region estructural a la secuencia de la llnea germinal correspondiente. Mas especlficamente, un anticuerpo que ha sufrido una mutacion somatica puede contener residuos de la region estructural que se diferencian de la secuencia de la llnea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden identificarse comparando las secuencias de la region estructural del anticuerpo con las secuencias de la llnea germinal de la que se deriva el anticuerpo.

Por ejemplo, para la region Vh de F7, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 6 y 25. Pueden retromutarse una, dos o las tres posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos o tres de las siguientes sustituciones: Q1E, Q6E y A25S. Una forma modificada preferida de la region Vh de F7 es la Vh de F7GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 5A y en SEC ID N°: 41), que tiene las siguientes sustituciones de la region estructural: Q1E y Q6E.

Ademas, para la region Vk de F7, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 3 y 84. Pueden retromutarse una, dos o las tres posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos o tres de las siguientes sustituciones; A1D, R3Q y V84A. Una forma modificada preferida de la region Vh de F7 es la Vk de F7GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 5B y en SEC ID N°: 45), que tiene las siguientes sustituciones de la region estructural: A1D y R3Q.

Ademas, para la region Vh de F9, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 6 y 25. Pueden retromutarse una, dos o las tres posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos o tres de las siguientes sustituciones: Q1E, Q6E y A25S. Una forma modificada preferida de la region Vh de F9 es la Vh de F9GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 6A y en SEC ID N°: 42), que tiene las siguientes sustituciones de la region estructural: Q1E y Q6E.

Ademas, para la region Vk de F9, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 3, 4 y 60. Pueden retromutarse una, dos, tres o las cuatro posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos, tres o cuatro de las siguientes sustituciones: E1D, V3Q, L4M y P60S. Una forma modificada preferida de la region Vk de F9 es la Vk de F9GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 6B y en sEc ID N°: 46), que tiene las siguientes sustituciones de la region estructural: E1D, V3Q y L4M.

Ademas, para la region VH de D1, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 6, 25 y 76. Pueden retromutarse una, dos o las tres posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos o tres de las siguientes sustituciones: Q6E, A25S y R76K. Una forma modificada preferida de la region Vh de D1 es la Vh de D1GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 7a y en SEC ID N°: 43), que posee la siguiente sustitucion de la region estructural: Q6E.

Ademas, para la region VK de D1, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 3, 4, 45 y 46. Pueden retromutarse una, dos, tres, cuatro o las cinco posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos, tres, cuatro o las cinco de las siguientes sustituciones: V1D, W3Q, V4M, E45K y L46S. Una forma modificada preferida de la region Vk de D1 es la Vk de D1GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 7B y en SEC ID N°: 47), que tiene las siguientes sustituciones de la region estructural: V1D, W3Q y V4M.

Ademas, para la region Vh de E2, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 6 y 25. Pueden retromutarse una o las dos

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posiciones a las secuencias de la llnea germinal si se realiza una o dos de las siguientes sustituciones: Q6E y A25S. Una forma modificada preferida de la region Vh de E2 es la Vh de E2GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 8A y en SEC ID N°: 44), que posee la siguiente sustitucion de la region estructural: Q6E.

Ademas, para la region Vk de E2, las siguientes posiciones de aminoacidos de la region estructural (usando el sistema de numeracion de Kabat) se diferencian de la llnea germinal: 1, 3 y 4. Pueden retromutarse una, dos o las tres posiciones a las secuencias de la llnea germinal haciendo una, dos o tres de las siguientes sustituciones: E1D, V3Q y L4M. Una forma modificada preferida de la region Vk de E2 es la Vk de E2GL (cuya secuencia de aminoacidos se muestra en la Figura 8b y en SEC ID N°: 48), que posee las siguientes sustituciones de la region estructural: E1D, V3Q y L4M.

Otro tipo de modificacion de la region estructural implica mutar uno o mas residuos dentro de la region estructural, o incluso dentro de una o mas regiones CDR, para eliminar epitopes de los linfocitos T para asi reducir la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque tambien se denomina “desinmunizacion” y se describe con mayor detalle en la publicacion de Patente de EE.UU. N° 20030153043 de Carr et al.

Ademas o alternativamente a las modificaciones hechas dentro de las regiones estructurales o CDR, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden manipularse para incluir modificaciones dentro de la region Fc, normalmente para alterar una o mas propiedades funcionales del anticuerpo, tales como semivida en suero, fijacion del complemento, union a receptores Fc y/o citotoxicidad celular dependiente del antigeno. Ademas, un anticuerpo de la presente divulgacion puede modificarse quimicamente (por ejemplo, pueden unirse uno o mas restos quimicos al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilacion, para alterar de nuevo una o mas propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con mas detalle a continuacion. La numeracion de residuos en la region Fc es la del indice EU de Kabat.

En una realizacion, la region bisagra de CH1 se modifica de tal manera que el numero de residuos de cisteina en la region bisagra se altere, por ejemplo, aumente o se reduzca. Este enfoque se describe adicionalmente en la patente de EE.UU. N° 5.677.425 de Bodmer et al. El numero de residuos de cisteina en la region bisagra de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas, o para aumentar o reducir la estabilidad del anticuerpo.

En otra realizacion, la region bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para acortar la semivida biologica del anticuerpo. Mas especificamente, se introducen una o mas mutaciones de aminoacidos en la region bisagra de la interfase de los dominios CH2-CH3 del fragmento bisagra de Fc de tal modo que el anticuerpo tenga una union a la protelna estafilococica A (SpA) alterada con relacion a la union del dominio bisagra de Fc nativo a la SpA. Este enfoque se describe mas detalladamente en la patente de EE.UU. N° 6.165.745 de Ward et al.

En otra realizacion, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biologica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, pueden introducirse una o mas de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de EE.UU. N° 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la semivida biologica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la region CH1 o CL para que contenga un epitope de union a un receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una region Fc de una IgG, como se describe en las patentes de EE.UU. N° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.

En otras realizaciones adicionales, la region Fc se altera sustituyendo al menos un residuo de aminoacido por un residuo de aminoacido diferente para alterar la(s) funcion (funciones) efectora(s) del anticuerpo. Por ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden sustituirse por un residuo de aminoacido diferente, de tal modo que se el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de union a antigeno del anticuerpo parental. El ligando efector para el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe mas detalladamente en las patentes de EE.UU. N° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.

En otro ejemplo, uno o mas aminoacidos seleccionados de los residuos de aminoacidos 329, 331 y 322 pueden sustituirse con un residuo de aminoacido diferente de modo que el anticuerpo tenga la union de C1q alterada, y/o se reduzca o anule la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe mas detalladamente en la patente de EE.UU. N° 6.194.551 de Idusogie et al.

En otro ejemplo, uno o mas residuos de aminoacidos dentro de las posiciones de los aminoacidos 231 y 239 se alteran para asi alterar la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la publicacion PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otro ejemplo adicional, la region Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcg modificando uno o mas aminoacidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301,

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En otra realization adicional, se modifica la glicosilacion de un anticuerpo. Por ejemplo, puede producirse un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilacion). La glicosilacion puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Tales modificaciones con hidratos de carbono pueden realizarse, por ejemplo, alterando uno o mas sitios de glicosilacion dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden hacerse una o mas sustituciones de aminoacidos que producen la elimination de uno o mas sitios de glicosilacion de las regiones estructurales de la region variable para as! eliminar la glicosilacion en ese sitio. Tal aglicosilacion puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antlgeno. Un enfoque tal se describe mas detalladamente en las patentes de EE.UU. N°: 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.

Adicionalmente o alternativamente, puede producirse un anticuerpo que tiene un tipo alterado de glicosilacion, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac de bisection aumentadas. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilacion alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones con hidratos de carbono pueden realizarse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una celula huesped con una maquinaria de glicosilacion alterada. Se han descrito en la materia celulas con maquinaria de glicosilacion alterada, y pueden usarse como celulas huesped en las que se expresan los anticuerpos recombinantes de la presente divulgation para as! producir un anticuerpo con glicosilacion alterada. Por ejemplo, las llneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa-(1,6)-fucosiltransferasa), de tal modo que los anticuerpos expresados en las llneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus hidratos de carbono. Se crearon las llneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FuT8+/- por la alteration dirigida como diana del gen FUT8 en celulas CHO/DG44 usando dos vectores de reposition (vease la publicacion de patente de EE.UU. N° 20040110704 de Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hanai et al. describen una llnea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosiltransferasa, de tal modo que los anticuerpos expresados en una llnea celular tal presentan hipofucosilacion reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace alfa-1,6. Hanai et al. tambien describen llneas celulares que tienen una baja actividad enzimatica por la adicion de fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la region Fc del anticuerpo o no tiene la actividad enzimatica, por ejemplo, la llnea de celulas de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La publicacion PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la llnea celular CHO, las celulas Lec13, con capacidad reducida de unir fucosa a hidratos de carbono enlazados a Asn(297), lo que produjo tambien la hipofucosilacion de los anticuerpos expresados en esa celula huesped (vease tambien Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Tambien pueden producirse anticuerpos con un perfil de glicosilacion modificado en huevos de pollo, como se describe en la publicacion de patente de EE.UU. N° PCT/US06/05853. Alternativamente, pueden producirse anticuerpos con un perfil de glicosilacion modificado en celulas vegetales, tales como Lemna. Se divulgan metodos para la production de anticuerpos en un sistema vegetal en la solicitud de patente de EE.UU. correspondiente de Alston & Bird LLP, expediente de agente N° 040989/314911, presentado el 11 de agosto de 2006. La publicacion PCT WO 99/54342 de Umana et al. describen llneas celulares manipuladas para expresar glicosiltransferasas que modifican glicoprotelnas (por ejemplo, beta(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de forma que los anticuerpos expresados en las llneas celulares manipuladas presenten estructuras GlcNac de biseccion aumentadas, que produce elevada actividad de ADCC de los anticuerpos (vease tambien Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden escindirse usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L- fucosidasa elimina residuos de fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Otra modification de los anticuerpos en el presente documento que se contempla por la presente divulgacion es la pegilacion. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, aumentar la semivida biologica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado reactivo de ester o de aldehldo de PEG, en condiciones en las que se consigue unir uno o mas grupos PEG al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilacion se lleva a cabo mediante una reaction de acilacion o una reaction de alquilacion con una molecula de PEG reactiva (o un pollmero soluble en agua reactivo analogo). Como se usa en el presente documento, el termino “polietilenglicol” pretende englobar cualquiera de las formas de PEG que han sido usadas para derivatizar otras protelnas, tales como monoalcoxi (C1-C10)- o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Se conocen metodos para pegilar protelnas en la materia y pueden aplicarse a los anticuerpos de la presente divulgacion. Veanse, por ejemplo, los documentos EP 0 154 316 de Nishimura et al. y EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

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Ademas, en el presente documento se describen fragmentos de anticuerpo y mimeticos de anticuerpo. Como se detalla a continuacion, se han desarrollado recientemente una amplia variedad de tecnologlas de fragmentos de anticuerpos y de mimeticos de anticuerpos, y son ampliamente conocidas en la materia. Aunque varias de estas tecnologlas, tales como anticuerpos de dominio, Nanobodies y UniBodies, hacen uso de fragmentos de, u otras modificaciones a, estructuras de anticuerpos tradicionales, tambien existen tecnologlas alternativas, tales como Affibodies, DARPins, anticalinas, avlmeros y Versabodies, que emplean estructuras de union que, aunque imitan la union del anticuerpo tradicional, se generan de y funcionan mediante distintos mecanismos.

Los anticuerpos de dominio (dAb) son las unidades de union funcionales mas pequenas de los anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis ha desarrollado una serie de bibliotecas extensas y sumamente funcionales de dAb de VH y VL completamente humanos (mas de 10 billones de secuencias diferentes en cada biblioteca), y usa estas bibliotecas para seleccionar dAb que son especlficos para dianas terapeuticas. A diferencia de los muchos anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio se expresan bien en sistemas bacterianos, de levadura y de celulas de mamlfero. Pueden obtenerse mas detalles de los anticuerpos de dominio y los metodos de produccion de los mismos por referencia a las patentes de EE.UU. 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; 6.696.245; de EE. UU. N° de serie 2004/0110941; solicitud de patente europea N° 1433846 y patentes europeas 0368684 y 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/0810 WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.

Los Nanobodies son protelnas terapeuticas derivadas de anticuerpos que contienen las propiedades estructurales y funcionales unicas de los anticuerpos de cadena pesada que existen de forma natural. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un dominio variable simple (vHh) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). Es importante que el dominio VHH clonado y aislado sea un polipeptido perfectamente estable que albergue la capacidad total de union a antlgeno del anticuerpo de cadena pesada original. Los Nanobodies tienen una alta homologla con los dominios VH de anticuerpos humanos y pueden humanizarse adicionalmente sin perdida alguna de actividad. Es importante que los Nanobodies tengan un potencial inmunogenico bajo, que se ha confirmado en estudios en primates con cabezas de serie de Nanobodies.

Los Nanobodies combinaron las ventajas de los anticuerpos convencionales con caracterlsticas importantes de farmacos de molecula pequena. Al igual que los anticuerpos convencionales, los Nanobodies muestran alta especificidad por la diana, alta afinidad por su diana y baja toxicidad inherente. Sin embargo, al igual que los farmacos de molecula pequena pueden inhibir enzimas y acceder facilmente a las hendiduras de los receptores. Ademas, los Nanobodies son extremadamente estables, pueden administrarse por medios distintos de por inyeccion (vease, por ejemplo, el documento WO 04/041867) y son faciles de fabricar. Otras ventajas de los Nanobodies incluyen el reconocimiento de epitopes poco frecuentes u ocultos como resultado de su pequeno tamano, la union a cavidades o sitios activos de dianas proteinicas con afinidad y selectividad alta debido a su flexibilidad tridimensional unica en formato de farmaco, la adaptacion de su semivida, y la facilidad y velocidad de descubrimiento de farmacos.

Los Nanobodies son codificados por genes simples y se producen eficazmente en casi todos los huespedes procariotas y eucariotas, por ejemplo, E. coli (vease, por ejemplo, el documento US 6.765.087), mohos (por ejemplo, Aspergillus o Trichoderma) y levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (vease, por ejemplo, el documento 6.838.254). El proceso de produccion puede llevarse a cabo a gran escala y se han producido cantidades de multikilogramos de Nanobodies. Debido a que los Nanobodies presentan una estabilidad superior en comparacion con la de los anticuerpos convencionales, pueden formularse como una solucion lista para uso con larga estabilidad en almacen.

El metodo Nanoclone (vease, por ejemplo, el documento WO 06/079372) es un metodo patentado para generar Nanobodies contra una diana deseada, basandose en la seleccion automatica de alto rendimiento de linfocitos B.

Los UniBodies son otra tecnologia de fragmentos de anticuerpos, sin embargo, esta se basa en la eliminacion de la region bisagra de anticuerpos IgG4. La delecion de la region bisagra produce una molecula que tiene esencialmente la mitad del tamano de los anticuerpos IgG4 tradicionales y tiene una region de union univalente en lugar de la region de union bivalente de los anticuerpos IgG4. Tambien se conoce bien que los anticuerpos lgG4 son inertes y, asi, no interaccionan con el sistema inmunitario, que puede ser ventajoso para el tratamiento de enfermedades en las que no se desea una respuesta inmunitaria, y esta ventaja se extiende a los UniBodies. Por ejemplo, los UniBodies pueden desempenar la funcion de inhibir o silenciar, pero no de destruir, las celulas a las que se unen. Adicionalmente, la union de los UniBodies a celulas cancerosas no estimula su proliferacion. Ademas, debido a que los UniBodies tienen la mitad del tamano de los anticuerpos lgG4 tradicionales, pueden mostrar mejor distribucion en tumores solidos mas grandes con eficacia posiblemente ventajosa. Los UniBodies se eliminan del cuerpo a una velocidad similar a los anticuerpos IgG4 completos y son capaces de unirse con una afinidad similar por sus antigenos como los anticuerpos completos. Pueden obtenerse mas detalles de los Unibodies por referencia a la patente WO2007/059782.

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Las moleculas de Affibodies representan una nueva clase de protelnas de afinidad basadas en un dominio de residuo de protelna de 58 aminoacidos, derivado de uno de los dominios de union a IgG de la protelna A estafilococica. Este dominio del haz de tres helices se ha usado como andamiaje para la construccion de bibliotecas combinatorias de fagemidos, de las que pueden seleccionarse variantes de Affibodies que se dirigen a las moleculas deseadas usando tecnologla de expresion en fagos (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). La estructura simple y robusta de las moleculas de Affibodies, en combination con su bajo peso molecular (6 kDa), las hace adecuadas para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de detection (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) y para inhibir las interacciones de receptores (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28- CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Pueden obtenerse mas detalles de los Affibodies y metodos de production de los mismos por referencia a la patente de EE.UU. N° 5831012.

Los Affibodies marcados tambien pueden ser utiles en aplicaciones de obtencion de imagenes para determinar la abundancia de isoformas.

Las DARPins (protelnas de repetition de anquirina disenadas) son un ejemplo de una tecnologla de DRP (protelna de repeticion disenada) de mimeticos de anticuerpos que se ha desarrollado para explotar las capacidades de union de polipeptidos no de anticuerpos. Las protelnas de repeticion, tales como las protelnas de repeticion ricas en anquirina y leucina, son moleculas de union ubicuas que existen, al contrario que los anticuerpos, intra- y extracelularmente. Su arquitectura modular unica caracteriza unidades estructurales repetitivas (repeticiones) que se apilan juntas para formar dominios de repeticion alargados que muestran superficies de union a dianas variables y modulares. Basandose en esta modularidad, pueden generarse bibliotecas combinatorias de polipeptidos con especificidades de union altamente diversificadas. Esta estrategia incluye el diseno consensuado de repeticiones autocompatibles que muestran residuos superficiales variables y su ensamblaje aleatorio en dominios de repeticion.

Las DARPins pueden producirse en sistemas de expresion bacteriana con rendimientos muy altos y pertenecen a las protelnas mas estables conocidas. Se han seleccionado DARPins de alta afinidad, sumamente especlficas, para una gran variedad de protelnas diana, que incluyen receptores humanos, citocinas, cinasas, proteasas humanas, virus y protelnas de membrana. Pueden obtenerse DARPins que tienen afinidades en el intervalo de nanomolar a picomolar de un solo dlgito.

Las DARPins se han usado en una gran variedad de aplicaciones, que incluyen ELISA, ELISA tipo sandwich, analisis de citometrla de flujo (FACS), inmunohistoqulmica (IHC), aplicaciones de chip, purification por afinidad o transferencia Western. Se demostro tambien que las DARPins eran altamente activas en el compartimento intracelular, por ejemplo, como protelnas marcadoras intracelulares fusionadas a la protelna verde fluorescente (GFP). Las DARPins se usaron ademas para inhibir la entrada viral con CI50 en el intervalo de pM. Las DARPins no son solo ideales para bloquear interacciones protelna-protelna, sino que tambien inhiben enzimas. Se han inhibido satisfactoriamente proteasas, cinasas y transportadores, en la mayorla de los casos un modo de inhibition alosterico. Enriquecimientos muy rapidos y especlficos en el tumor y relaciones de tumor con respecto a sangre muy favorables hacen que las DARPins sean muy adecuadas para diagnosticos in vivo o enfoques terapeuticos.

Puede encontrarse information adicional referentes a las DARPins y otras tecnologlas de DRP en la publication de patente de EE.UU. N° 2004/0132028 y la publicacion de solitud de patente internacional N° WO 02/20565.

Las anticalinas son una tecnologla de mimeticos de anticuerpos adicional, sin embargo, en este caso, la especificidad de union se deriva de las lipocalinas, una familia de protelnas de peso molecular bajo que se expresan natural y abundantemente en tejidos y fluidos corporales humanos. Las lipocalinas han evolucionado para realizar varias funciones in vivo asociadas con el transporte y almacenamiento fisiologico de compuestos qulmicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una estructura intrlnseca robusta que comprende un barril b altamente conservado que soporta cuatro bucles en un extremo de la protelna. Estos bucles forman la entrada a un sitio de union y las diferencias conformacionales en esta parte de la molecula representan la variation en la especificidad de union entre lipocalinas individuales.

Aunque la estructura global de los bucles hipervariables soportada por una region estructural de hoja b conservada es reminiscente de las inmunoglobulinas, las lipocalinas se diferencian considerablemente de los anticuerpos en terminos de tamano, estar compuestas de una sola cadena polipeptldica de 160-180 aminoacidos que es ligeramente mayor que un dominio simple de inmunoglobulina.

Las lipocalinas se clonan y sus bucles se someten a modificaciones por ingenierla genetica para crear anticalinas. Se han generado bibliotecas de anticalinas estructuralmente diversas y la expresion de las anticalinas permite la selection y el cribado de la funcion de union, seguido por la expresion y produccion de protelna soluble para el analisis adicional en sistemas procariotas o eucariotas. Los estudios han demostrado satisfactoriamente que pueden

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desarrollarse anticalinas que son especlficas para practicamente cualquier protelna diana humana, pueden aislarse y pueden obtenerse afinidades de union en el intervalo nanomolar o en uno mayor.

Tambien pueden presentarse las anticalinas como protelnas de doble diana, llamadas duocalinas. Una duocalina se une a dos dianas terapeuticas separadas en una protelna monomerica facilmente producida usando procesos de fabricacion estandar mientras que se retiene la especificidad y afinidad por la diana independientemente de la orientacion estructural de sus dos dominios de union.

La modulacion de dianas multiples mediante una unica molecula es particularmente ventajosa en enfermedades conocidas por implicar mas de un unico factor causante. Ademas, los formatos de union bi- o multivalentes, tales como duocalinas, tienen un potencial significativo para elegir como diana moleculas de la superficie celular en enfermedades, mediar en efectos agonistas en sistemas de transduccion de senales o inducir efectos de internalizacion potenciados mediante la union y agrupacion de receptores de la superficie celular. Ademas, la alta estabilidad intrlnseca de las duocalinas es comparable a la de las anticalinas monomericas, ofreciendo una formulacion flexible y potencial de administration para las duocalinas.

Puede encontrarse information adicional referente a las anticalinas en la patente de EE.UU. N° 7.250.297 y la publication de solicitud de patente internacional WO 99/16873.

Otra tecnologla de mimeticos de anticuerpos util son los avlmeros. Los avlmeros se han desarrollado a partir de una gran familia de dominios de receptores extracelulares humanos por barajado de exones in vitro y expresion en fagos, generando protelnas de dominios multiples con propiedades de union e inhibidoras. Se ha mostrado que el enlace de dominios de union independientes multiples crea avidez y produce afinidad y especificidad mejoradas en comparacion con las protelnas de union convencionales con un solo epitope. Otras posibles ventajas incluyen la production simple y eficaz de moleculas especificas de dianas multiples en Escherichia coli, estabilidad termica y resistencia frente a proteasas mejoradas. Se han obtenido avimeros con afinidades inferiores a nanomolares contra varias dianas.

Puede encontrarse informacion adicional referente a los avimeros en las publicaciones de solicitud de patente N° 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756.

Los Versabodies son otra tecnologia de mimeticos de anticuerpos util. Los Versabodies son proteinas pequenas de 3-5 kDa con >15 % de cisternas, que forma un andamiaje con alta densidad de disulfuros, sustituyendo al nucleo hidrofobo que tienen las proteinas tipicas. La sustitucion de un gran numero de aminoacidos hidrofobos, que comprenden el nucleo hidrofobo, con un pequeno numero de disulfuros produce una proteina que es mas pequena, mas hidrofila (menor agregacion y union no especifica), mas resistente a proteasas y al calor, y tiene una menor densidad de epitopes de linfocitos T, debido a que los residuos que mas contribuyen a la presentation del MHC son hidrofobos. Se sabe bien que estas cuatro propiedades afectan la inmunogenicidad y se espera que juntas provoquen una gran disminucion en la inmunogenicidad.

La inspiration de los Versabodies procede de los biofarmacos inyectables naturales producidos por sanguijuelas, serpientes, aranas, escorpiones, caracoles y anemonas, que se sabe que presentan una inmunogenicidad inesperadamente baja. Al partir de familias de protelnas naturales seleccionadas, se minimizan, mediante el diseno y cribado, el tamano, la hidrofobia, el procesamiento proteolltico de antlgenos y la densidad de epitopes a niveles muy por debajo del promedio para protelnas inyectables naturales.

Dada la estructura de los Versabodies, estos mimeticos de anticuerpos ofrecen un formato versatil que incluye multivalencia, multiespecificidad, diversos mecanismos de semivida, modulos que eligen como diana tejidos y la ausencia de la region Fc del anticuerpo. Ademas, los Versabodies se fabrican en E. coli con altos rendimientos y, debido a su hidrofilia y pequeno tamano, los Versabodies son altamente solubles y pueden formularse a altas concentraciones. Los Versabodies son excepcionalmente termoestables (pueden hervirse) y ofrecen semivida prolongada.

Puede encontrarse informacion adicional referente a los Versabodies en la publicacion de solitud de patente de EE.UU. N° 2007/0191272.

La description detallada de las tecnologlas de fragmentos de anticuerpos y de mimeticos de anticuerpos proporcionada anteriormente no pretende ser una lista exhaustiva de todas las tecnologlas que podrian usarse. Por ejemplo, y tampoco de modo limitante, varias tecnologlas adicionales, que incluyen tecnologlas alternativas basadas en polipeptidos, tales como fusiones de regiones determinantes de la complementariedad como se describe brevemente en Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), asi como tecnologlas basadas en acidos nucleicos, tales como las tecnologlas de aptameros de ARN descritas en las patentes de EE.UU. N° 5.789.157, 5,864.026, 5.712.375, 5.763.566, 6.013.443, 6.376.474, 6.613.526, 6.114.120, 6.261.774 y 6.387.620, podrian usarse.

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Los anticuerpos de la presente divulgacion pueden caracterizarse adicionalmente por las diversas propiedades fisicas de los anticuerpos anti-CXCR4. Pueden usarse diversos ensayos para detectar y/o diferenciar diferentes clases de anticuerpos basandose en estas propiedades fisicas.

En algunas realizaciones, los anticuerpos de la presente divulgacion pueden contener uno o mas sitios de glicosilacion en tanto la region variable de la cadena ligera como pesada. La presencia de uno o mas sitios de glicosilacion en la region variable puede producir un aumento de la inmunogenicidad del anticuerpo o una alteration del pK del anticuerpo debido a la union a antigeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 4L673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol lmmunol 37:697706). Se sabe que la glicosilacion se produce en motivos que contienen una secuencia N-X-S/T. La glicosilacion en la region variable puede probarse usando un ensayo Glycoblot, que escinde el anticuerpo para producir un Fab y, posteriormente, prueba la glicosilacion usando un ensayo que mide la oxidation con peryodato y la formation de bases de Schiff. Alternativamente, la glicosilacion de la region variable puede probarse usando cromatografia ionica Dionex (Dionex-LC), que escinde los sacaridos de un Fab en monosacaridos y analiza el contenido individual de sacaridos. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-CXCR4 que no contenga glicosilacion en la region variable. Esto puede lograrse o bien seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilacion en la region variable, o bien mutando residuos dentro del motivo de glicosilacion usando tecnicas estandar muy conocidas en la materia.

En una realization preferida, los anticuerpos de la presente divulgacion no contienen sitios de isomeria de la asparagina. Un efecto de desamidacion o de acido isoaspartico puede producirse en secuencias N-G o D-G, respectivamente. El efecto de desamidacion o de acido isoaspartico produce la creation de acido isoaspartico que reduce la estabilidad de un anticuerpo creando una estructura curvada a partir del extremo carboxi de una cadena lateral en lugar de la cadena principal. La creacion de acido isoaspartico puede medirse usando un ensayo de isocuanta, que usa una HPLC en fase inversa para probar acido isoaspartico.

Cada anticuerpo tendra un unico punto isoelectrico (pl), pero, generalmente, los anticuerpos entraran dentro del intervalo de pH entre 6 y 9,5. El pl para un anticuerpo IgG1 entra normalmente dentro del intervalo de pH de 7-9,5 y el pl para un anticuerpo lgG4 entra normalmente dentro del intervalo de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pl que quede fuera de este intervalo. Aunque, generalmente, se desconocen los efectos, existe la especulacion de que los anticuerpos con un pl fuera del intervalo normal pueden tener cierto despliegue e inestabilidad en condiciones in vivo. El punto isoelectrico puede probarse usando un ensayo de isoelectroenfoque capilar, que crea un gradiente de pH y puede utilizar un enfoque laser para aumentar la exactitud (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-CXCR4 que contenga un valor pl que entre en el intervalo normal. Esto puede conseguirse tanto seleccionando anticuerpos con un pl en el intervalo normal como mutando residuos superficiales cargados usando tecnicas estandar bien conocidas en la materia.

Cada anticuerpo tendra una temperatura de fusion que es indicativa de estabilidad termica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una mayor estabilidad termica indica mayor estabilidad global del anticuerpo in vivo. El punto de fusion de un anticuerpo puede medirse usando tecnicas tales como calorimetria diferencial de barrido (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). Tm1 indica la temperatura del despliegue inicial del anticuerpo. Tm2 indica la temperatura del despliegue completo del anticuerpo. Generalmente, se prefiere que Tm1 de un anticuerpo de la presente divulgacion sea mayor de 60 °C, preferentemente mayor de 65 °C, incluso mas preferentemente mayor de 70 °C. Alternativamente, la estabilidad termica de un anticuerpo puede medirse usando dicroismo circular (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:3439).

En una realizacion preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degradan rapidamente. La fragmentation de un anticuerpo anti-CXCR4 puede medirse usando electroforesis capilar (CE) y EM-MALDI, como es bien entendido en la materia (Alexander AJ y Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

En otra realizacion preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregacion minimos. La agregacion puede dar lugar a que se desencadene una respuesta inmunitaria no deseada y/o a propiedades farmacocineticas alteradas o desfavorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con agregacion del 25 % o menos, preferentemente del 20 % o menos, incluso mas preferentemente del 15 % o menos, incluso mas preferentemente del 10 % o menos e incluso mas preferentemente del 5 % o menos. La agregacion puede medirse por varias tecnicas bien conocidas en la materia, que incluyen cromatografia de exclusion de tamanos (SEC), cromatografia liquida de alta resolution (HPLC) y dispersion de la luz para identificar monomeros, dimeros, trimeros o multimeros.

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Como se ha tratado anteriormente, los anticuerpos anti-CXCR4 que tienen secuencias Vh y Vk divulgadas en el presente documento pueden usarse para crear nuevos anticuerpos anti-CXCR4 modificando las secuencias Vh y/o Vk, o la(s) region (regiones) constantes unida(s) a las mismas. Asl, las caracterlsticas estructurales de un anticuerpo anti-CXCR4 de la presente divulgacion, por ejemplo, F7, F9, D1 o E2, pueden usarse para crear anticuerpos anti- CXCR4 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la presente divulgacion, tal como la union a CXCR4 humano. Por ejemplo, una o mas regiones CDR de F7, F9, D1 o E2, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse recombinantemente con regiones estructurales conocidas y/u otras CDR para crear anticuerpos anti-CXCR4 recombinantemente modificados adicionales de la presente divulgacion, como se ha tratado anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen las aquellas en la seccion anterior. El material de partida para el metodo de manipulacion es una o mas de las secuencias Vh y/o Vk proporcionadas en el presente documento, o una o mas regiones CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo manipulado, en realidad, no es necesario preparar (es decir, expresar como protelna) un anticuerpo que tenga una o mas de las secuencias Vh y/o Vk proporcionadas en el presente documento, o una o mas regiones CDR de las mismas. Mas bien se usa la information contenida en la(s) secuencia(s) como material de partida para crear secuencia(s) de “segunda generation” derivada(s) de la(s) secuencia(s) original(es), y posteriormente se prepara(n) la(s) secuencia(s) de “segunda generacion” y se expresa(n) como una protelna.

Por consiguiente, en el presente documento se describe un metodo para preparar un anticuerpo anti-CXCR4, comprendiendo el metodo:

(a) proporcionar: (i) una secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 1-4, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 5-8 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 9- 12; y/o (ii) una secuencia de la region variable de la cadena ligera del anticuerpo que comprende una secuencia CDR1 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 13-16, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 17-20 y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en SEC ID N°: 21-24;

(b) alterar al menos un residuo de aminoacido dentro de la secuencia de la region variable de la cadena pesada del anticuerpo y/o la secuencia de la region variable de la cadena ligera de anticuerpo para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y

(c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una protelna.

Pueden usarse tecnicas estandar de biologla molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.

Preferentemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia(s) de anticuerpo alterada(s) es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-CXCR4 descritos en el presente documento, propiedades funcionales que incluyen, pero no se limitan a:

(i) la union a CXCR4 humano nativo expresado sobre una superficie celular;

(ii) la inhibition de la union de SDF-1 a CXCR4;

(iii) la inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4;

(iv) la inhibicion de la migration inducida por SDF-1 de celulas que expresan CXCR4;

(v) la inhibicion de la formation de tubos capilares por HuVEC;

(vi) la union a CXCR4 humano con una Kd de 10x10-7 M o menos;

(vii) la induction de la apoptosis en celulas que expresan CXCR4;

(viii) la inhibicion de la proliferation de celulas tumorales in vitro;

(ix) la inhibicion de la proliferacion de celulas tumorales y/o la induccion de la apoptosis de celulas tumorales in vivo;

(x) la inhibicion de la metastasis de celulas tumorales CXCR4+; y/o

(xi) el incremento del tiempo de supervivencia de un sujeto que padece un tumor CXCR4+.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse usando ensayos estandar disponibles en la materia y/o descritos en el presente documento, tales como aquellos brevemente explicados en los ejemplos (por ejemplo, citometrla de flujo, ensayos de union, ensayos funcionales).

En los metodos de manipulacion de los anticuerpos, pueden introducirse mutaciones aleatoria o selectivamente a lo largo de la totalidad o en parte de una secuencia codificante de anticuerpos anti-CXCR4, y los anticuerpos anti- CXCR4 modificados resultantes pueden cribarse para actividad de union y/u otras propiedades funcionales como se describe en el presente documento. Se han descrito en la materia metodos de mutation. Por ejemplo, la publication PCT WO 02/092780 de Short describe metodos para la creation y el cribado de mutaciones de anticuerpos usando mutagenesis de saturation, ensamblaje sintetico por ligation, o una combination de estos. Alternativamente, la publicacion PCT WO 03/074679 de Lazar et al. describen metodos de uso de metodos de cribado por ordenador para optimizar las propiedades fisicoqulmicas de los anticuerpos.

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Moleculas de acido nucleico que codifican anticuerpos de la presente divulqacion

Otro aspecto de la presente divulqacion se refiere a moleculas de acido nucleico aisladas que codifican los anticuerpos de la presente divulqacion. Los acidos nucleicos pueden estar presentes en celulas completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un acido nucleico esta “aislado” o “se presenta sustancialmente puro” cuando se ha purificado de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protelnas celulares, por tecnicas estandar, que incluyen tratamiento con alcali/SDS, formacion de bandas en CsCl, cromatoqrafla en columna, electroforesis en qel de aqarosa y otras bien conocidas en la materia. Vease F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Bioloqy, Greene Publishinq and Wiley Interscience, Nueva York. Un acido nucleico de la presente divulqacion puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intronicas. En una realization preferida, el acido nucleico es una molecula de ADNc.

Los acidos nucleicos de la presente divulqacion pueden obtenerse usando tecnicas estandar de bioloqla molecular. Para los anticuerpos expresados por hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transqenicos que llevan qenes de inmunoqlobulina humana, como se describe adicionalmente a continuation) pueden obtenerse ADNc que codifican las cadenas liqera y pesada del anticuerpo producido por el hibridoma por amplification estandar por PCR o tecnicas de donation de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos de una biblioteca de qenes de inmunoqlobulina (por ejemplo, usando tecnicas de expresion en faqos), el acido nucleico que codifica tales anticuerpos puede obtenerse de la biblioteca de qenes.

Las moleculas de acidos nucleicos preferidas de la presente divulqacion son aquellas que codifican las secuencias Vh y Vl de los anticuerpos monoclonales F7, F9, D1 y E2. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias Vh de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 33-36, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias Vl de F7, F9, D1 y E2 se muestran en SEC ID N°: 37-40, respectivamente.

Una vez que se obtienen los fraqmentos de ADN que codifican los seqmentos Vh y Vl, estos fraqmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente por tecnicas estandar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los qenes de la reqion variable en qenes de cadenas de anticuerpos de lonqitud completa, en qenes de fraqmentos Fab o en un qen de scFv. En estas manipulaciones, un fraqmento de ADN que codifica Vl o Vh se enlaza operativamente a otro fraqmento de ADN que codifica otra protelna, tal como una reqion constante de anticuerpo o un conector flexible. La expresion “enlazado operativamente”, como se usa en este contexto, pretende siqnificar que los dos fraqmentos de ADN estan unidos de tal manera que las secuencias de aminoacidos codificadas por los dos fraqmentos de ADN se mantienen en marco.

El ADN aislado que codifica la reqion Vh puede convertirse en un qen de la cadena pesada de lonqitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica VH a otra molecula de ADN que codifica reqiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Se conocen en la materia las secuencias de qenes de la reqion constante de la cadena pesada humana (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, quinta edition, U.S. Department of Health and Human Services, publication NIH N° 91-3242) y los fraqmentos de ADN que enqloban estas reqiones pueden obtenerse por amplificacion estandar por PCR. La reqion constante de la cadena presada puede ser una reqion constante de IqG1, IqG2, IqG3, IqG4, IqA, IqE, IqM o IqD, pero mas preferentemente es una reqion constante de IqG1 o IqG4. Para un qen de la cadena pesada del fraqmento Fab, el ADN que codifica Vh puede estar enlazado operativamente a otra molecula de ADN que codifique unicamente la reqion constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la reqion de Vl puede convertirse en un qen de la cadena liqera de lonqitud completa (as! como en un qen de la cadena liqera de Fab) enlazando operativamente el ADN que codifica Vl a otra molecula de ADN que codifica la reqion constante de la cadena liqera, CL. Se conocen en la materia las secuencias de qenes de la reqion constante de la cadena liqera humana (vease, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, quinta edicion, U.S. Department of Health and Human Services, publicacion NIH N° 91-3242) y los fraqmentos de ADN que enqloban estas reqiones pueden obtenerse por amplificacion estandar por PCR. En realizaciones preferidas, la reqion constante de la cadena liqera puede ser una reqion constante kappa o lambda.

Para crear un qen de scFv, los fraqmentos de ADN que codifican Vh y Vl se enlazan operativamente a otro fraqmento que codifica un conector flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoacidos (Gly4-Ser)3, de tal modo que las secuencias VH y VL puedan expresarse como una protelna monocatenaria contiqua, con las reqiones VL y VH unidas por el conector flexible (veanse, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferly et al., (1990) Nature 348:552-554).

Production de anticuerpos monoclonales de la presente divulqacion

Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la presente divulqacion pueden producirse por varias tecnicas, que incluyen la metodoloqla de anticuerpos monoclonales convencional, por ejemplo, la tecnica de hibridacion de celulas somaticas estandar de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridacion

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de celulas somaticas, en principio, pueden emplearse otras tecnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformacion viral u oncogenica de linfocitos B.

El sistema animal preferido para la preparation de hibridomas es el sistema murino. La production de hibridomas en el raton es un procedimiento muy bien establecido. Se conocen en la materia protocolos y tecnicas de inmunizacion para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusion. Tambien se conocen componentes de fusion (por ejemplo, celulas de mieloma murino) y procedimientos de fusion.

Los anticuerpos quimericos o humanizados de la presente divulgation pueden prepararse basandose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal no humano preparado como se ha descrito anteriormente. Puede obtenerse ADN que codifica la cadena pesada y la ligera de las inmunoglobulinas a partir del hibridoma no humano de interes y manipularse para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) usando tecnicas estandar de biologla molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimerico, pueden enlazarse regiones variables murinas a regiones constantes humanas usando metodos conocidos en la materia (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, pueden insertarse regiones CDR murinas en una region estructural humana usando metodos conocidos en la materia (veanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.225.539 de Winter y las patentes de EE.UU. N° 5.530.101; 5.585.089: 5.693.762 y 6.180.370 de Queen).

En una realization preferida, los anticuerpos de la presente divulgacion son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CXCR4 pueden generarse usando ratones transgenicos o transcromosomicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema del raton. Estos ratones transgenicos y transcromosomicos incluyen los ratones denominados en el presente documento HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y se denominan de manera colectiva en el presente documento “ratones de Ig humana “.

El HuMAb Mouse® (Medarex® Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de las cadenas pesadas (my g) y ligera k de inmunoglobulina humana sin reordenar, junto con mutaciones dirigidas que desactivan los loci endogenos de las cadenas m y k (vease, por ejemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Por consiguiente, los ratones presentan expresion reducida de IgM o k de raton, y en respuesta a la inmunizacion, los transgenes de las cadenas pesada y ligera humanas introducidos sufren cambio de clase y mutation somatica para generar anticuerpos monoclonales IgGk humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), arriba; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparacion y uso de HuMAb Mouse®, y las modificaciones genomicas llevadas por tales ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J 12:821-830; Tuaillon et al. (1994). J. Immunol 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. Veanse, adicionalmente, las patentes de EE.UU. N° 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la patente de EE.UU. N° 5.545.807 de Surani et al.; las publicaciones PCT N° WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y la publication PCT N° WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realizacion, pueden producirse anticuerpos humanos de la presente divulgacion usando un raton que lleva secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un raton que lleva un transgen de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Este raton se denomina en el presente documento un “KM Mouse®” y se describe en detalle en la publicacion PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Mas aun, en la materia estan disponibles sistemas de animales transgenicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y que pueden usarse para producir anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgenico alternativo denominado Xenomouse (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N° 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati et al.

Ademas, en la materia estan disponibles sistemas de animales transcromosomicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y pueden usarse para producir anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion. Por ejemplo, pueden usarse ratones que llevan tanto un transcromosoma de la cadena pesada humana como un transcromosoma de la cadena ligera humana, denominados “ratones TC”; tales ratones se describen en Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:722-727. Ademas, se han descrito en la materia vacas que llevan transcromosomas de la cadena pesada y ligera humanos (por ejemplo, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 y la solicitud PCT N° WO 2002/092812) y pueden usarse para producir los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion.

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Tambien pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion usando metodos de expresion en fagos para el cribado de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Tales metodos de expresion en fagos para el aislamiento de anticuerpos humanos estan establecidos en la materia. Veanse, por ejemplo: las patentes de EE.UU. N° 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las patentes de EE.UU. N° 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las patentes de EE.UU. N° 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las patentes de los EE.UU. N° 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.

Tambien pueden prepararse anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion usando ratones SCID en los que se han reconstituido celulas inmunitarias humanas de tal modo que puede generarse una respuesta de anticuerpos humanos tras la inmunizacion. Tales ratones se describen, por ejemplo, en las patentes de Ee.UU. N° 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.

En una realizacion preferida particular, se preparan anticuerpos anti-CXCR4 humanos usando una combinacion de raton de Ig humana y de tecnicas de expresion en fagos, como se describe en la patente de EE.UU. N° 6.794.132 de Buechler et al. Mas especlficamente, el metodo implica primero producir una respuesta de anticuerpos anti-CXCR4 en un raton de Ig humana (tal como un raton HuMab o raton KM como se ha descrito anteriormente) inmunizando el raton con un antlgeno CXCR4, seguida de aislamiento de acidos nucleicos que codifican cadenas de anticuerpos humanos a partir de celulas linfaticas de raton e introduccion de estos acidos nucleicos en un vector de expresion (por ejemplo, fago) para proporcionar una biblioteca de conjuntos de expresion. Asl, cada miembro de la biblioteca comprende un acido nucleico que codifica una cadena de anticuerpo humano y cada cadena de anticuerpo es expresada por el conjunto de expresion. A continuacion, la biblioteca se criba con un antlgeno CXCR4 para aislar los miembros de la biblioteca que se unen especlficamente a CXCR4. Las inserciones de acido nucleico de los miembros seleccionados de la biblioteca se alslan a continuacion y se secuencian por metodos estandar para determinar las secuencias variables de la cadena ligera y pesada de los ligantes CXCR4 seleccionados. Las regiones variables pueden convertirse en cadenas de anticuerpo de longitud completa por tecnicas estandar de ADN recombinante, tales como clonacion de las regiones variables en un vector de expresion que lleva las regiones constantes de la cadena pesada y ligera humanas, de tal modo que la region VH se enlaza operativamente a la region CH y la region VL se enlaza operativamente a la region CL. Vease el Ejemplo 1 para una descripcion adicional de la preparacion de anticuerpos anti-CXCR4 humanos usando este sistema combinado de raton transgenico/expresion en fagos.

Inmunizacion de ratones de Ig humana

Cuando se usan ratones de Ig humana para producir anticuerpos humanos de la presente divulgacion, tales ratones pueden inmunizarse con una preparacion purificada o enriquecida de antlgeno CXCR4 y/o CXCR4 recombinante, o celulas que expresan CXCR4, o una protelna de fusion de CXCR4, como se describe por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y las publicaciones PcT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferentemente, los ratones tendran una edad de 6-16 semanas tras la primera infusion. Por ejemplo, puede usarse una preparacion purificada o recombinante (5-50 mg) de antlgeno CXCR4 para inmunizar los ratones de Ig humana intraperitonealmente. Lo mas preferentemente, el inmunogen usado para producir los anticuerpos de la presente divulgacion comprende CXCR4 humano en su conformacion nativa dentro de una membrana, ejemplos no limitantes de esto incluyen celulas transfectadas para expresar CXCR4 sobre su superficie celular, celulas que expresan nativamente CXCR4 (por ejemplo, celulas CEM) y membranas artificiales (por ejemplo, liposomas) en las que se ha incorporado CXCR4, tales como proteoliposomas magneticos (MPL) que incorporan CXCR4 (descrito adicionalmente en el Ejemplo 1).

Se describen procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para CXCR4 en el Ejemplo 1 mas adelante. La experiencia acumulada con diferentes antlgenos ha mostrado que los ratones transgenicos responden cuando se inmunizan inicialmente intraperitonealmente (IP) con antlgeno en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antlgeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, tambien se ha encontrado que son eficaces otros adyuvantes distintos de los de Freund. Adicionalmente, se ha encontrado que en ausencia de adyuvante las celulas completas son sumamente inmunogenicas. La respuesta inmunitaria puede monitorizarse durante el transcurso del protocolo de inmunizacion con muestras de plasma que se obtienen por extracciones de sangre retroorbitales. El plasma puede cribarse por ELISA (como se describe a continuacion), y los ratones con tltulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-CXCR4 pueden usarse para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con antlgeno 3 dlas antes de ser sacrificados y de extirparles el bazo. Se espera que pueda ser necesario realizar 2-3 fusiones para cada inmunizacion. Se inmunizan, normalmente, entre 6 y 24 ratones para cada antlgeno. Normalmente se usan tanto las cepas HCo7 como HCo12. Adicionalmente, pueden cruzarse juntos transgenes HCo7 y HCo12 en un unico raton que tiene dos transgenes de la cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12). Alternativamente o adicionalmente, puede usarse la cepa de KM Mouse®, como se describe en el Ejemplo 1.

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Generacion de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulqacion

Para qenerar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulqacion, pueden aislarse esplenocitos y/o celulas de qanqlios linfaticos de ratones inmunizados y fusionarse a una llnea celular inmortalizada apropiada, tal como una llnea de celulas de mieloma de raton. Los hibridomas resultantes pueden cribarse para la production de anticuerpos especlficos de antlqeno. Por ejemplo, pueden fusionarse suspensiones de celulas simples de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados a un sexto del numero de celulas de mieloma de raton P3X63-Aq8.653 (ATCC, CRL 1580) no secretantes con 50 % de PEG. Alternativamente, la suspension de celulas simples de linfocitos esplenicos de ratones inmunizados puede fusionarse usando un metodo de electrofusion basado en un campo electrico, usando un electroporador de fusion de celulas en camara qrande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Las celulas se siembran a aproximadamente 2 x 105 en placa de microtitulacion de fondo plano, sequido por una incubation de 2 semanas en medio selectivo que contiene 20 % de suero de clon fetal, 18 % de medio acondicionado “653”, 5 % de oriqen (IGEN), L-qlutamina 4 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mq/ml de estreptomicina, 50 mq/ml de qentamicina y 1X HAT (Siqma; HAT se anade 24 horas despues de la fusion). Despues de aproximadamente 2 semanas, las celulas pueden cultivarse en un medio en el que HAT se reemplaza con HT. Los pocillos individuales pueden cribarse posteriormente por ELISA para anticuerpos monoclonales humanos IqM e IqG. Una vez que se produce el crecimiento extenso de hibridomas, normalmente puede observarse el medio despues de 10-14 dlas. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden colocarse nuevamente en placas, cribarse de nuevo y, si son todavla positivos para IqG humana, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces por dilution limitante. Los subclones estables pueden cultivarse a continuation in vitro para qenerar pequenas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular para la caracterizacion.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces de centrifuqacion de dos litros para la purification de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatoqrafla por afinidad con protelna A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IqG eluida puede comprobarse por electroforesis en qel y cromatoqrafla llquida de alta resolution para asequrar la pureza. La solution tampon puede intercambiarse por PBS, y la concentration puede determinarse por DO280 usando el coeficiente de extincion 1,43. Los anticuerpos monoclonales pueden dividirse en allcuotas y almacenarse a -80 °C.

Generacion de transfectomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente divulqacion

Los anticuerpos de la presente divulqacion tambien pueden producirse en un transfectoma de celulas huesped usando, por ejemplo, una combination de tecnicas de ADN recombinante y metodos de transfection de qenes como es bien conocido en la materia (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fraqmentos de anticuerpos de los mismos, pueden obtenerse ADN que codifican las cadenas liqera y pesada parciales o de lonqitud completa, por tecnicas estandar de bioloqla molecular (por ejemplo, amplification por PCR o donation de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interes) y los ADN pueden insertarse en vectores de expresion de tal modo que los qenes esten enlazados operativamente a secuencias de control de la transcription y la traduction. En este contexto, la expresion “enlazado operativamente” pretende siqnificar que un qen de anticuerpo esta liqado a un vector de tal modo que las secuencias de control de la transcripcion y la traduccion dentro del vector cumplen su funcion prevista de requlacion de la transcripcion y la traduccion del qen del anticuerpo. El vector de expresion y las secuencias de control de la expresion se eliqen para ser compatibles con la celula huesped de expresion usada. El qen de la cadena liqera de anticuerpo y el qen de la cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, mas normalmente, ambos qenes se insertan en el mismo vector de expresion. Los qenes de anticuerpo se insertan en el vector de expresion por metodos estandar (por ejemplo, liqacion de sitios de restriction complementarios en el fraqmento del qen de anticuerpo y vector, o liqacion de extremos romos si no estan presentes sitios de restriccion). Las reqiones variables de la cadena liqera y pesada de los anticuerpos descritos en el presente documento pueden usarse para crear qenes de anticuerpo de lonqitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertandolos en vectores de expresion que ya codifican las reqiones constantes de la cadena pesada y de la cadena liqera del isotipo deseado de tal modo que el seqmento Vh se enlace operativamente al (a los) seqmento(s) Ch dentro del vector, y el seqmento Vk se enlace operativamente al seqmento Cl dentro del vector. Adicionalmente o como alternativa, el vector de expresion recombinante puede codificar un peptido senal que facilita la secretion de la cadena de anticuerpo de una celula huesped. El qen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el peptido senal se enlace en marco al extremo amino del qen de la cadena de anticuerpo. El peptido senal puede ser un peptido senal de inmunoqlobulina o un peptido senal heteroloqo (es decir, un peptido senal de una protelna no de inmunoqlobulina).

Ademas de los qenes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresion recombinantes de la presente divulqacion llevan secuencias requladoras que controlan la expresion de los qenes de la cadena de anticuerpo en una celula huesped. La expresion “secuencia requladora” pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion) que controlan la transcripcion o traduccion de los qenes de la cadena de anticuerpo. Tales secuencias requladoras se describen, por ejemplo, en

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Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press. San Diego, CA (1990)). Sera apreciado por los expertos en la materia que el diseno del vector de expresion, que incluye la seleccion de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la eleccion de la celula huesped a transformar, el nivel de expresion de la protelna deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresion de celulas huesped de mamlfero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresion de protelna en celulas de mamlfero, tales como promotores y/o potenciadores derivados del citomegalovirus (CMV), virus 40 de los simios (SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardlo mayor de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, pueden usarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotor de b-globina. Mas aun, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRa, que contiene secuencias del promotor SV40 temprano y la repeticion terminal larga del virus de la leucemia de linfocitos T humanos tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Ademas de los genes de la cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresion recombinantes de la presente divulgacion pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas huesped (por ejemplo, orlgenes de replicacion) y genes marcadores de seleccion. El gen marcador de seleccion facilita la seleccion de celulas huesped en las que se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente, el gen marcador de seleccion confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de seleccion preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas dhfr- huesped con seleccion/amplificacion de metotrexato) y el gen neo (para la seleccion de G418).

Para la expresion de las cadenas ligera y pesada, el (los) vector(es) de expresion que codifica(n) las cadenas pesada y ligera se transfecta(n) en una celula huesped por tecnicas estandar. Las diversas formas del termino “transfeccion” pretenden englobar una amplia variedad de tecnicas comunmente usadas para la introduccion de ADN exogeno en una celula huesped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporacion, precipitation con fosfato de calcio, transfeccion con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teoricamente posible expresar los anticuerpos de la presente divulgacion en tanto celulas huesped procariotas como eucariotas, la expresion de anticuerpos en celulas eucariotas, y mas preferentemente celulas huesped de mamlfero, es la mas preferida debido a que es mas probable que tales celulas eucariotas, y en particular las celulas de mamlfero, se ensamblen que las celulas procariotas y secreten un anticuerpo plegado adecuadamente e inmunologicamente activo. Se ha informado que la expresion procariota de genes de anticuerpos es ineficaz para la production de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Celulas huesped de mamlfero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la presente divulgacion incluyen las de ovario de hamster chino (celulas CHO) (que incluyen las celulas dhfr" CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador DHFR de seleccion, por ejemplo, como se describio en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), celulas NSO de mieloma, celulas COS y celulas SP2. En particular, para uso con celulas NSO de mieloma, otro sistema de expresion preferido es el sistema de expresion del gen GS descrito en los documentos WO 87/04462 (de Wilson), WO 89/01036 (de Bebbington) y EP 338.841 (de Bebbington). Cuando se introducen vectores de expresion recombinantes que codifican genes de anticuerpos en celulas huesped de mamlfero, los anticuerpos se producen cultivando las celulas huesped durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresion del anticuerpo en las celulas huesped o, mas preferentemente, la secretion del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las celulas huesped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando metodos estandar de purification de protelnas.

Caracterizacion de la union del anticuerpo al antigeno

Los anticuerpos de la presente divulgacion pueden probarse para la union a CXCR4, por ejemplo, por metodos estandar de citometrla de flujo. Debido a que los anticuerpos de la presente divulgacion reconocen preferentemente CXCR4 en su conformation nativa dentro de una membrana, la prueba para la union a CXCR4 se hace preferentemente con un ensayo (por ejemplo, citometrla de flujo) que utiliza un reactivo que expresa la conformacion nativa de CXCR4. Ejemplos no limitantes de reactivos que expresan la conformacion nativa de CXCR4 que pueden usarse en los ensayos de union incluyen celulas que expresan naturalmente CXCR4 (por ejemplo, celulas CEM), celulas que han sido transfectadas para expresar CXCR4 (por ejemplo, celulas R1610 transfectadas con un vector de expresion de CXCR4) y liposomas en los que se ha incorporado CXCR4 (por ejemplo, proteoliposomas magneticos que incorporan CXCR4), cada uno de los cuales se describe mas detalladamente en los ejemplos. Brevemente, para el ensayo de citometrla de flujo, las celulas que expresan CXCR4 se incuban con el anticuerpo de prueba, se lavan, se incuban con un reactivo secundario marcado capaz de unirse al anticuerpo de prueba, se lavan de nuevo y se someten a analisis para detectar la union del reactivo secundario a las celulas (por ejemplo, usando un equipo FACS). Preferentemente, los ratones que desarrollen los tltulos mas altos al evaluarlos con citometrla de flujo se usaran para fusiones o para la seleccion adicional de anticuerpos (por ejemplo, por cribado de expresion en fagos de bibliotecas de anticuerpos creadas a partir de linfocitos B de raton).

Tambien puede usarse un ensayo de citometrla de flujo como se ha descrito anteriormente para cribar hibridomas que muestran reactividad positiva con un inmunogen CXCR4. Los hibridomas que expresan anticuerpos que se unen con alta avidez a CXCR4 se subclonan y se caracterizan posteriormente. Puede elegirse un clon de cada

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hibridoma, que retiene la reactividad de las celulas parentales (por citometrla de flujo), para producir un banco de celulas de 5-10 viales conservadas a -140 °C y para la purification de anticuerpos.

Para purificar los anticuerpos anti-CXCR4, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces de centrifugation de dos litros para la purificacion de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografla de afinidad con protelna A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida puede comprobarse por electroforesis en gel y cromatografla llquida de alta resolution para asegurar la pureza. La solution tampon puede intercambiarse por PBS, y la concentration puede determinarse por DO280 usando el coeficiente de extincion 1,43. Los anticuerpos monoclonales pueden dividirse en allcuotas y almacenarse a -80 °C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CXCR4 seleccionados se unen a epitopes unicos, cada anticuerpo puede biotinilarse usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Pueden realizarse estudios de competition usando anticuerpos monoclonales sin marcar y anticuerpos monoclonales biotinilados usando un ensayo ELISA de celulas completas en el que placas ELISA se recubren con celulas que expresan CXCR4 y se examina la capacidad del anticuerpo sin marcar de competir con el anticuerpo biotinilado por la union a las celulas que expresan CXCR4. La union de mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de estreptavidina- fosfatasa alcalina.

Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, pueden realizarse ELISA de isotipo usando reactivos especlficos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pueden recubrirse pocillos de placas de microtitulacion con 1 mg/ml de anti-inmunoglobulina humana durante la noche a 4 °C. Despues del bloqueo con 1 % de BSA, las placas se hacen reaccionar con 1 mg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pocillos pueden hacerse reaccionar luego con tanto IgG1 humana como sondas conjugadas con fosfatasa alcalina especlficas de IgM humana. Las placas se revelan y se analizan como se ha descrito anteriormente.

Pueden probarse adicionalmente IgG anti-CXCR4 humanas para la reactividad con el antlgeno CXCR4 por transferencia Western. En resumen, puede prepararse CXCR4 y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Despues de la electroforesis, los antlgenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con 10 % de suero de ternera fetal y se sondan con los anticuerpos monoclonales que van a probarse. La union de IgG humana puede detectarse usando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y revelarse con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

La especificidad de union de un anticuerpo de la presente divulgation tambien puede determinarse monitorizando la union del anticuerpo a celulas que expresan CXCR4, por ejemplo, por citometrla de flujo. Normalmente, una linea celular, tal como una linea celular CHO, puede transfectarse con un vector de expresion que codifica una forma de transmembrana de CXCR4. La proteina transfectada puede comprender una marca, tal como una marca myc, preferentemente en el extremo N, para la detection usando un anticuerpo para la marca. La union de un anticuerpo de la presente divulgacion a CXCR4 puede determinarse incubando las celulas transfectadas con el anticuerpo y detectando el anticuerpo unido. La union de un anticuerpo a la marca en la proteina transfectada puede usarse como control positivo.

Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente divulgacion caracteriza un anticuerpo anti-CXCR4, o un fragmento del mismo, conjugado con un resto terapeutico, tal como una citotoxina, un farmaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se denominan en el presente documento “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o mas citotoxinas se denominan “inmunotoxinas”. Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial (por ejemplo, mata) para celulas. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposido, teniposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi-antracin-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- deshidrotestosterona, glucocorticoides, procalna, tetracalna, lidocalna, propranolol y puromicina, y analogos u homologos de estos. Los agentes terapeuticos tambien incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina), antibioticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitoticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapeuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la presente divulgacion incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de estas. Esta comercialmente disponible un ejemplo de un conjugado de caliqueamicina-anticuerpo (Mylotarg®; American Home Products).

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Las citotoxinas pueden conjugarse con anticuerpos de la presente divulgacion usando tecnologla de conectores disponible en la materia. Ejemplos de tipos de conectores que se han usado para conjugar una citotoxina con un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioeteres, esteres, disulfuros y conectores que contienen peptidos. Puede elegirse un conector que sea, por ejemplo, susceptible a la escision por pH bajo dentro del compartimento lisosomico o susceptible a la escision por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en tejido tumoral, tales como catepsinas (por ejemplo, catepsinas B, C, D).

Para mas informacion sobre tipos de citotoxinas, conectores y metodos para conjugar agentes terapeuticos con anticuerpos veanse tambien Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail. P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Tambien pueden conjugarse anticuerpos de la presente divulgacion con un isotopo radiactivo para generar radiofarmacos citotoxicos, tambien denominados radioinmunoconjugados. Ejemplos de isotopos radiactivos que pueden conjugarse con anticuerpos para uso en diagnosticos o terapeutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90y lutecio177. Los metodos para preparar radioinmunoconjugados estan establecidos en la materia. Ejemplos de radioinmunoconjugados comercialmente disponibles incluyen Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), y pueden usarse metodos similares para preparar radioinmunoconjugados usando anticuerpos de la presente divulgacion.

Los conjugados de anticuerpo de la presente divulgacion pueden usarse para modificar una respuesta biologica dada y el resto farmaceutico no debe interpretarse como limitado a los agentes terapeuticos qulmicos clasicos. Por ejemplo, el resto farmaceutico puede ser una protelna o un polipeptido que posee una actividad biologica deseada. Tales protelnas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimaticamente activa, o fragmento activo de la misma, tales como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina de la difteria; una protelna tal como el factor de necrosis tumoral o interferon-g o modificadores de respuestas biologicas, tales como, linfocinas, interleucina-1 (“IL- 1”), interleucina-2 (“1L-2”), interleucina-6 (“IL-6”), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (“GM- CSF”), factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”) u otros factores de crecimiento.

Las tecnicas para conjugar tal resto terapeutico con anticuerpos son bien conocidas, veanse, por ejemplo, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy” en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pags. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery” en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pags. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review” en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pags. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy” en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pags. 303-16 (Academic Press 1985) y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Moleculas biespecificas

En otro aspecto, la presente divulgacion caracteriza moleculas biespecificas que comprenden un anticuerpo anti- CXCR4, o un fragmento del mismo, de la presente divulgacion. Un anticuerpo de la presente divulgacion, o porciones de union a antlgeno del mismo, puede derivatizarse o enlazarse a otra molecula funcional, por ejemplo, otro peptido o protelna (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molecula biespecifica que se une a al menos dos sitios de union o moleculas diana diferentes. El anticuerpo de la presente divulgacion puede de hecho derivatizarse o enlazarse a mas de una molecula funcional distinta para generar moleculas multiespecificas que se unen a mas de dos sitios de union y/o moleculas diana diferentes; tambien se considera que tales moleculas multiespecificas estan englobadas por la expresion “molecula biespecifica”, como se usa en el presente documento. Para crear una molecula biespecifica de la presente divulgacion, un anticuerpo de la presente divulgacion puede enlazarse funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento quimico, fusion genetica, asociacion no covalente o por otro modo) a una o mas moleculas de union distintas, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, peptido o mimetico de union, de tal modo que resulte una molecula biespecifica.

Por consiguiente, la presente divulgacion incluye moleculas biespecificas que comprenden al menos una primera especificidad de union para CXCR4 y una segunda especificidad de union para un segundo epitope diana. En una realizacion particular de la presente divulgacion, el segundo epitope diana es un receptor de Fc, por ejemplo, FcgRI humano (CD64) o un receptor de Fca humano (CD89). Por lo tanto, la presente divulgacion incluye moleculas biespecificas capaces de unirse tanto a celulas efectoras que expresan FcgR como FcaR (por ejemplo, monocitos, macrofagos o celulas polimorfonucleares (PMN)) y a celulas diana que expresan CXCR4. Estas moleculas biespecificas dirigen celulas que expresan CXCR4 a celulas efectoras y desencadenan actividades de celulas efectoras mediadas por el receptor de Fc, tales como fagocitosis de las celulas que expresan CXCR4, citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpos (ADCC), liberacion de citocinas o generacion de anion superoxido.

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En una realizacion de la presente divulgacion en la que la molecula biespeclfica es multiespeclfica, la molecula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de union, ademas de una especificidad de union anti-Fc y una especificidad de union anti-CXCR4. En una realizacion, la tercera especificidad de union es una porcion anti-factor de intensification (EF), por ejemplo, una molecula que se une a una protelna superficial implicada en la actividad citotoxica y, por consiguiente, aumenta la respuesta inmunitaria contra la celula diana. La “porcion anti-factor de intensificacion” puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molecula dada, por ejemplo, un antlgeno o un receptor y as! produce una intensificacion del efecto de los determinantes de la union para el receptor de Fc o el antlgeno de la celula diana. La “porcion anti-factor de intensificacion” puede unirse a un receptor de Fc o un antlgeno de la celula diana. Alternativamente, la porcion anti-factor de intensificacion puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las especificidades de union primera y segunda. Por ejemplo, la porcion anti-factor de intensificacion puede unirse a un linfocito T citotoxico (por ejemplo, por medio de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra celula inmunitaria que produzca una respuesta inmunitaria incrementada contra la celula diana).

En una realizacion, las moleculas biespeclficas de la presente divulgacion comprenden como especificidad de union al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o un Fv monocatenario. El anticuerpo tambien puede ser un dlmero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mlnimo del mismo, tal como un Fv o una construction monocatenaria como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.946.778 de Ladner et al.

En una realizacion, la especificidad de union para un receptor Fcg se proporciona por un anticuerpo monoclonal, cuya union no esta bloqueada por la inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en el presente documento, la expresion “receptor de IgG” se refiere a cualquiera de los ocho genes de la cadena g localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembranario o solubles que estan agrupadas en tres clases de receptores de Fcg FcgRI (CD64), FcgRII (CD32) y FcgRIII (CD16). En una realizacion preferida, el receptor de Fcg un FcgRI humano de afinidad alta. FcgRI humano es una molecula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para IgG monomera (108 - 109 M-1),

La production y caracterizacion de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcg preferidos se describen en la publication PCT WO 88/00052 y en la patente de EE.UU. N° 4.954.617 de Fanger et al. Estos anticuerpos se unen a un epitope de FcgRI, FcgRII o FcgRIII en un sitio que es distinto del sitio de union a Fcg del receptor y, por tanto, su union no esta sustancialmente bloqueada por niveles fisiologicos de IgG. Los anticuerpos especificos anti-FcgRI utiles en la presente divulgacion son mAb22, mAb32, mAb44, mAb62 y mAb197. El hibridoma que produce mAb32 esta disponible de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, N° de Acceso ATCC HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-receptor de Fcg es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La produccion y caracterizacion del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y la publicacion PCT WO 94/10332 de Tempest et al. La linea celular que produce el anticuerpo H22 fue depositada en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo con la designation HA022CL1 y tiene el N° de acceso CRL 11177.

En otras realizaciones preferidas adicionales, la especificidad de union para un receptor de Fc se proporciona por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, por ejemplo, un receptor de Fc-alfa (FcaRI (CD89)), cuya union preferentemente no esta bloqueada por la inmunoglobulina A humana (IgA). L expresion “receptor de IgA” pretende incluir el producto genico de un gen a (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembranarias sometidas a corte y empalme alternativo de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrofagos, granulocitos eosinofilos y neutrofilos, pero no en poblaciones de celulas no efectoras. FcaRI tiene una afinidad intermedia ( » 5 x 107 M-1) tanto por IgA1 como IgA2, que aumenta tras la exposition a citocinas, tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H,C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales especificos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que unen FcaRI fuera del dominio de union del ligando IgA (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).

FcaRI y FcgRI son receptores de desencadenamiento preferidos para usar en las moleculas biespeclficas de la presente divulgacion debido a que (1) se expresan primariamente en celulas efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrofagos y celulas dendriticas; (2) se expresan a niveles altos (por ejemplo, 5000-100.000 por celula); (3) son mediadores de actividades citotoxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); y (4) median en la presentation de antigenos incrementada de antigenos, que incluyen auto-antigenos, dirigidos a ellos.

Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moleculas biespeclficas de la presente divulgacion son anticuerpos monoclonales murinos, quimericos y humanizados.

Las moleculas biespeclficas de la presente divulgacion pueden prepararse conjugando las especificidades de union constituyentes, por ejemplo, las especificidades de union anti-FcR y anti-CXCR4, usando metodos conocidos en la materia. Por ejemplo, cada especificidad de union de la molecula biespecifica puede generarse por separado y conjugarse luego unas a otras. Cuando las especificidades de union son proteinas o peptidos, pueden usarse varios agentes de acoplamiento o reticulation para la conjugation covalente. Ejemplos de agentes de reticulation incluyen

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protelna A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA), acido 5,5'-ditiobis(2- nitrobenzoico) (DTNB), o- fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidiI-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1- carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (veanse, por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686: Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros metodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83 y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). SATA y sulfo-SMCC son agentes de conjugation preferidos, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de union son anticuerpos, estos pueden conjugarse por enlace sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realization particularmente preferida, la region bisagra esta modificada para contener un numero impar de residuos de sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la conjugacion.

Alternativamente, ambas especificidades de union pueden estar codificadas en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma celula huesped. Este metodo es particularmente util cuando la molecula biespeclfica es una protelna de fusion mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molecula biespeclfica de la presente divulgation puede ser una molecula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y un determinante de la union, o una molecula biespeclfica monocatenaria que comprende dos determinantes de la union. Las moleculas biespeclficas pueden comprender al menos dos moleculas monocatenarias. Los metodos para la preparation de moleculas biespeclficas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N° 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476,786; 5.013.653; 5.258.498; y 5.482.858.

La union de las moleculas biespeclficas a sus dianas especlficas puede confirmarse por, por ejemplo, ensayo inmunosorbente unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), analisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibition del crecimiento) o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos protelna-anticuerpo de interes particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) especlfico para el complejo de interes. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden detectarse usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo unido a enzimas que reconoce y se une especlficamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse usando cualquiera de otros varios inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radiactivamente y usarse en un radioinmunoensayo (RIA) (vease, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo, 1986). El isotopo radiactivo puede detectarse por medios tales como, por ejemplo, el uso de un contador g o un contador de centelleo o por autorradiografla.

Composition farmaceutica

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, que contiene uno o una combination de anticuerpos monoclonales, o portion (porciones) de union a antlgeno de los mismos, de la presente divulgacion, formulada junto con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinacion de (por ejemplo, dos o mas diferentes) anticuerpos o inmunoconjugados o moleculas biespeclficas de la presente divulgacion. Por ejemplo, una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede comprender una combinacion de anticuerpos (o inmunoconjugados o moleculas biespeclficas) que se unen a diferentes epitopes en el antigeno diana o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion tambien pueden administrarse en terapia de combinacion, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo anti-CXCR4 de la presente divulgacion combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapeuticos que pueden usarse en terapia de combinacion se describen en mayor detalle a continuation en la section sobre los usos de los anticuerpos de la presente divulgacion.

Como se usa en el presente documento, “vehiculo farmaceuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares, que son fisiologicamente compatibles. Preferentemente, el vehiculo es adecuado para administration intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, raquidea o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, inmunoconjugado o molecula biespeclfica, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la action de acidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.

Los compuestos farmaceuticos de la presente divulgacion pueden incluir una o mas sales farmaceuticamente aceptables. Una “sal farmaceuticamente aceptable” se refiere a una sal que retiene la actividad biologica deseada del compuesto original y no confiere ningun efecto toxicologico no deseado (vease, por ejemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adicion de acido y sales de adicion de base. Las sales de adicion de acido incluyen las derivadas de acidos inorganicos no toxicos, tales como acido clorhidrico, nitrico, fosforico, sulfurico, bromhidrico, yodhidrico, fosforoso y similares, asi como de acidos organicos no toxicos, tales como acidos alifaticos mono- y dicarboxilicos, acidos alcanoicos sustituidos con fenilo, acidos

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hidroxialcanoicos, acidos aromaticos, acidos sulfonicos alifaticos y aromaticos, y similares. Las sales de adicion de base incluyen las derivadas de metales alcalinoterreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, as! como de aminas organicas no toxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocalna, colina, dietanolamina, etilendiamina, procalna y similares.

Una composicion farmaceutica de la presente divulgacion puede tambien incluir un antioxidante farmaceuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como acido ascorbico, clorhidrato de cistelna, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metalicos, tales como acido cltrico, acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), sorbitol, acido tartarico, acido fosforico y similares.

Ejemplos de vehlculos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de estos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres organicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, por el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de las dispersiones y por el uso de tensioactivos.

Estas composiciones tambien pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevencion de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilizacion, arriba, como por la inclusion de diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, acido fenolsorbico y similares. Tambien puede ser deseable incluir agentes isotonicos en las composiciones, tales como azucares, cloruro de sodio y similares. Adicionalmente, puede provocarse la absorcion prolongada de la forma farmaceutica inyectable por la inclusion de agentes que retardan la absorcion tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehlculos farmaceuticamente aceptables incluyen disoluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de disoluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas es conocido en la materia. Excepto en la medida de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso del mismo en las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion. Tambien pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Las composiciones terapeuticas deben ser normalmente esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion puede formularse como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentracion alta de farmaco. El vehlculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol llquido y similares) y mezclas adecuadas de estos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamano de partlcula requerido en el caso de dispersion y por el uso de tensioactivos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio, en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composicion un agente que retarda la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Pueden prepararse disoluciones inyectables esteriles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinacion de los componentes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido por la esterilizacion por microfiltracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehlculo esteril que contiene un medio basico de dispersion y los otros componentes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vaclo y secado por congelacion (liofilizacion) que dan un polvo del principio activo junto a cualquier componente deseado adicional de una solucion previamente filtrada en condiciones esteriles del mismo.

La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehlculo para producir una forma de dosificacion individual variara dependiendo del sujeto a tratar y del modo de administration particular. La cantidad de principio activo que puede combinarse con un material de vehlculo para producir una forma de dosificacion individual sera generalmente aquella cantidad de la composicion que produce un efecto terapeutico. Generalmente, de cada cien por ciento, esta cantidad oscilara de aproximadamente el 0,01 por ciento a aproximadamente el noventa y nueve por ciento de principio activo, preferentemente de aproximadamente el 0,1 por ciento a aproximadamente el setenta por ciento, mas preferentemente de aproximadamente el 1 por ciento a aproximadamente el treinta por ciento de principio activo en combinacion con un vehlculo farmaceuticamente aceptable.

Las pautas de dosificacion se ajustan para proporcionar la respuesta optima deseada (por ejemplo, una respuesta terapeutica). Por ejemplo, puede administrarse un unico bolo, puede administrarse varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente segun indiquen las exigencias de la situation

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terapeutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificacion unitaria para facilitar la administracion y la uniformidad de la dosificacion. La forma de dosificacion unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades flsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con el vehlculo farmaceutico requerido. La especificacion para las formas de dosificacion unitaria de la presente divulgacion viene dictada por, y es directamente dependiente de, (a) las caracterlsticas unicas del compuesto activo y el efecto terapeutico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la tecnica de preparacion de composiciones de un compuesto activo tal para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.

Para la administracion del anticuerpo, la dosis oscila de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y mas usualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del huesped. Por ejemplo, las dosis pueden ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Una pauta de tratamiento a modo de ejemplo implica la administracion una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez de cada tres a 6 meses. Las pautas de dosificacion preferidas para un anticuerpo anti-CXCR4 de la presente divulgacion incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal por administracion intravenosa, administrandose el anticuerpo usando uno de los siguientes programas de dosificacion: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez, seguidos por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos metodos, dos o mas anticuerpos monoclonales con especificidades de union diferentes se administran simultaneamente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra normalmente en ocasiones multiples. Los intervalos entre las dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos pueden ser tambien irregulares segun indique midiendo los niveles en sangre de anticuerpo para el antlgeno diana en el paciente. En algunos metodos, la dosis se ajusta para alcanzar una concentracion de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 mg/ml y en algunos metodos de aproximadamente 25-300 mg/ml.

Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulacion de liberacion sostenida, en cuyo caso se requiere administracion menos frecuente. La dosis y la frecuencia varlan dependiendo de la semivida del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos presentan la semivida mas prolongada, seguidos por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos y anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de la administracion pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profilactico o terapeutico. En aplicaciones profilacticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente poco frecuentes durante un periodo de tiempo prolongado. Algunos pacientes continuan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En aplicaciones terapeuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresion de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los slntomas de la enfermedad. Despues de lo cual, se puede administrar al paciente una pauta profilactica.

Los niveles reales de dosificacion de los principios activos en las composiciones farmaceuticas de la presente divulgacion pueden variarse de manera que se obtenga una cantidad del principio activo que sea eficaz para alcanzar la respuesta terapeutica deseada para un paciente, composicion y modo de administracion particulares, sin que sea toxica para el paciente. El nivel de dosificacion seleccionado dependera de varios factores farmacocineticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente divulgacion empleadas o el ester, sal o amida de las mismas, la via de administracion, el tiempo de administracion, la velocidad de eliminacion del compuesto particular que se emplea, la duracion del tratamiento, otros farmacos, compuestos y/o materiales usados en combination con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, afeccion, estado general de salud e historia medica anterior del paciente que se trata, y factores similares conocidos en el campo medico.

Una “dosis terapeuticamente eficaz” de un anticuerpo anti-CXCR4 de la presente divulgacion produce preferentemente una disminucion en la gravedad de los slntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duracion de los periodos libres de slntomas de la enfermedad o una prevention del deterioro o la incapacidad debidos a la afliccion de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores CXCR4+, una “dosis terapeuticamente eficaz” inhibe preferentemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral al menos aproximadamente el 20 %, mas preferentemente al menos aproximadamente el 40 %, incluso mas preferentemente al menos aproximadamente el 60 % e incluso mas preferentemente al menos aproximadamente el 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto de inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de un modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composicion puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibition puede medirse in vitro por ensayos conocidos para el medico experto. Una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto terapeutico puede reducir el tamano del tumor o mejorar de otro modo los slntomas en un sujeto. Un experto habitual en la materia serla capaz de determinar tales cantidades basandose en factores tales como la corpulencia del sujeto, la gravedad de los slntomas del sujeto y la composicion particular o via de administracion seleccionada.

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Una composicion de la presente divulgacion puede administrarse por una o mas vlas de administration usando uno o mas de varios metodos conocidos en la materia. Como apreciara un experto en la materia, la via y/o modo de administracion variaran dependiendo de los resultados deseados. Las vlas de administracion preferidas para los anticuerpos de la presente divulgacion incluyen vlas de administracion intravenosa, intramuscular, intradermica, intraperitoneal, subcutanea, raquldea u otras vlas parenterales, por ejemplo, por inyeccion o infusion. La expresion “administracion parenteral”, como se usa en el presente documento, significa modos de administracion distintos de administracion enteral y topica, normalmente por inyeccion, e incluye, sin limitation, inyeccion e infusion intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardlaca, intradermica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutanea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquldea, epidural e intraesternal.

Alternativamente, un anticuerpo de la presente divulgacion puede administrarse por una via no parenteral, tal como una via de administracion topica, epidermica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o topica.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehlculos que protegeran el compuesto contra la liberation rapida, tales como una formulation de liberacion controlada, que incluye implantes, parches transdermicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse pollmeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhldridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para la preparation de tales formulaciones estan patentados o, generalmente, son conocidos para aquellos expertos en la materia. Veanse, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapeuticas pueden administrarse con dispositivos medicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en una realization preferida, una composicion terapeutica de la presente divulgacion puede administrarse con un dispositivo de inyeccion hipodermica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados en las patentes de EE.UU. N° 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y modulos bien conocidos utiles en la presente divulgacion incluyen: patente de EE.UU. N° 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusion implantable para dispensar medication a una velocidad controlada; patente de EE.UU. N° 4.486.194, que divulga un dispositivo terapeutico para la administracion de medicamentos a traves de la piel; patente de EE.UU. N° 4.447.233, que divulga una bomba de infusion de medicacion para suministrar medicacion a una velocidad de infusion precisa; patente de EE.UU. N° 4.447.224, que divulga un equipo de infusion implantable de flujo variable para el suministro continuo de farmaco; patente de Ee.UU. N° 4.439.196, que divulga un sistema de suministro osmotico de farmacos que tiene multiples compartimientos de camaras; y patente de EE.UU. N° 4.475.196, que divulga un sistema de suministro osmotico de farmacos. Muchos otros implantes, sistemas de suministro y modulos son conocidos para aquellos expertos en la materia.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente divulgacion pueden formularse para asegurar la distribution apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefalica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrofilos. Para asegurar que los compuestos terapeuticos de la presente divulgacion atraviesan la BHE (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para metodos de fabrication de liposomas veanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 4.522.811; 5.374,548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o mas restos que son transportados selectivamente a celulas u organos especlficos, potenciandose as! el suministro dirigido del farmaco (vease, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Restos de direccionamiento a modo de ejemplo incluyen folato o biotina (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5.416.016 de Low et al.), manosidos (Umezawa et al, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de protelna A surfactante (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vease tambien K. Keinanen; M.L, Laukkanen (1994) FEbS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y metodos

Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos humanos, las composiciones de anticuerpos y los metodos de la presente divulgacion tienen numerosas utilidades diagnosticas y terapeuticas in vitro e in vivo que implican el diagnostico y el tratamiento de trastornos mediados por CXCR4. Por ejemplo, estas moleculas pueden administrarse a celulas en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar varios trastornos. Como se usa en el presente documento, el termino “sujeto” pretende incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamlferos y no mamlferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por o modulados por la actividad de CXCR4 o que implican a la via de CXCR4/SDF-1. Cuando los anticuerpos para CXCR4 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultaneamente.

Dada la union especlfica de los anticuerpos de la presente divulgacion a CXCR4, los anticuerpos de la presente

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divulgacion pueden usarse para detectar especlficamente la expresion de CXCR4 sobre la superficie celular y, ademas, pueden usarse para purificar CXCR4 por purificacion por inmunoafinidad.

Vlas de administration adecuadas de las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas, e inmunoconjugados) de la presente divulgacion in vivo e in vitro son muy conocidas en la materia y pueden ser seleccionadas por un experto en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse por inyeccion (por ejemplo, intravenosa o subcutanea). Dosis adecuadas de las moleculas usadas dependeran de la edad y peso del sujeto, y la concentration y/o formulation de la composition de anticuerpos.

Como se ha descrito previamente, los anticuerpos anti-CXCR4 humanos de la presente divulgacion pueden co- administrarse con uno o mas agentes terapeuticos diferentes, por ejemplo, un agente citotoxico, un agente radiotoxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede estar enlazado al agente (con un inmunocomplejo) o puede administrarse separado del agente. En el ultimo caso (administracion separada), el anticuerpo puede administrarse antes, despues o simultaneamente al agente, o puede co-administrarse con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia contra el cancer, por ejemplo, radiation. Tales agentes terapeuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplasicos, tales como doxorubicina (adriamicina), cisplatino-sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo y ciclofosfamida-hidroxiurea que, por si solos, son eficaces solamente a niveles que son toxicos o subtoxicos para un paciente. El cisplatino se administra intravenosamente como una dosis de 100 mg/kg una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra intravenosamente como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 dlas. La co-administration de los anticuerpos anti-CXCR4 humanos, o fragmentos de union a antlgeno de los mismos, de la presente divulgacion junto con agentes quimioterapeuticos proporciona dos agentes antineoplasicos que operan por mecanismos diferentes que dan un efecto citotoxico a las celulas tumorales humanas. Tal co-administracion puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a los farmacos o un cambio en la antigenicidad de las celulas tumorales que las harla no reactivas con el anticuerpo.

Las celulas efectoras especlficas de diana, por ejemplo, celulas efectoras enlazadas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas) de la presente divulgacion tambien pueden usarse como agentes terapeuticos. Las celulas efectoras para direccionamiento pueden ser leucocitos humanos tales como macrofagos, neutrofilos o monocitos. Otras celulas incluyen eosinofilos, linfocitos citollticos espontaneos y otras celulas que llevan receptores de IgG o IgA. Si se desea, pueden obtenerse celulas efectoras del sujeto a tratar. Las celulas efectoras especlficas de diana pueden administrarse como una suspension de celulas en una solution fisiologicamente aceptable. El numero de celulas administradas puede ser del orden de 108-109, pero variara dependiendo del proposito terapeutico. En general, la cantidad sera suficiente para obtener la localization en la celula diana, por ejemplo, una celula tumoral que expresa CXCR4, y para efectuar la muerte celular por, por ejemplo, fagocitosis. Tambien pueden variar las vlas de administracion.

La terapia con celulas efectoras especlficas de diana puede realizarse en asociacion con otras tecnicas para la elimination de celulas elegidas como diana. Por ejemplo, puede usarse terapia antitumoral usando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas) de la presente divulgacion y/o celulas efectoras provistas de estas composiciones en asociacion con quimioterapia. Adicionalmente, puede usarse inmunoterapia de combination para dirigir dos poblaciones efectoras citotoxicas distintas al rechazo de celulas tumorales. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos anti-CXCR4 enlazados a anti-Fc-gamma RI o anti- CD3 en asociacion con agentes de union especlficos de receptores de IgG o IgA.

Tambien pueden usarse moleculas biespeclficas y multiespeclficas de la presente divulgacion para modular FcgR o los niveles de FcgR en celulas efectoras, tal como por protection terminal y eliminacion de receptores sobre la superficie celular. Tambien pueden usarse para este fin mezclas de receptores anti-Fc.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, humanizados o quimericos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas, e inmunoconjugados) de la presente divulgacion que tienen sitios de union del complemento, tales como porciones de IgG1, -2 o -3 o IgM que se unen al complemento, tambien pueden usarse en presencia del complemento. En una realization, el tratamiento ex vivo de una poblacion de celulas, que comprende celulas diana con un agente de union de la presente divulgacion y celulas efectoras apropiadas, puede suplementarse por la adicion del complemento o suero que contiene el complemento. La fagocitosis de celulas diana recubiertas con un agente de union de la presente divulgacion puede mejorarse por la union de protelnas del complemento. En otra realizacion, las celulas diana recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas) de la presente divulgacion tambien pueden ser lisadas por el complemento. En otra realizacion mas, las composiciones de la presente divulgacion no activan el complemento.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, humanizados o quimericos, moleculas multiespeclficas y biespeclficas, e inmunoconjugados) de la presente divulgacion tambien pueden administrarse junto con el complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la presente divulgacion estan composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moleculas multiespeclficas o biespeclficas, y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas ya que el complemento esta localizado en estrecha proximidad a los anticuerpos humanos, moleculas multiespeclficas o biespeclficas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moleculas

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multiespecificas o biespecificas de la presente divulgacion, y el complemento o suero pueden administrarse por separado.

Los anticuerpos de la presente divulgacion tambien pueden usarse en combinacion con uno o mas anticuerpos terapeuticos adicionales u otros agentes de union tales como protelnas de fusion de Ig. Ejemplos no limitantes de otros anticuerpos o agentes de union con los que puede administrarse en combinacion un anticuerpo anti-CXCR4 de la presente divulgacion incluyen anticuerpos o agentes de union a CTLA-4, PSMA, CD30, IP-10, IFN-g, CD70, PD-1, PD-L1, INF, TNF-R, VEGF, VEGF-R, CCR5, IL-1, IL-18, IL-18R, CD19, Campath-1, EGFR, CD33, CD20, Her-2, CD25, gpllb/llla, IgE, CD11a, a4 integrina, IFNa e 1FNAR1.

Dentro del alcance de la presente divulgacion tambien estan kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la presente divulgacion (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas biespecificas o multiespecificas, o inmunoconjugados) e instrucciones para su uso. El kit puede contener ademas uno o mas reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotoxico o un agente radiotoxico, o uno o mas anticuerpos humanos adicionales de la presente divulgacion (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epitope en el antigeno CXCR4 diferente del primer anticuerpo humano).

Por consiguiente, se puede administrar adicionalmente a los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la presente divulgacion (antes de, simultaneamente con o tras la administracion de un anticuerpo humano de la presente divulgacion) otro agente terapeutico, tal como un agente citotoxico o radiotoxico, que potencia o aumenta el efecto terapeutico de los anticuerpos humanos.

En otras realizaciones, el sujeto puede tratarse adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, potencia o inhibe, la expresion o actividad de Fcg o receptores de Fcg por ejemplo, tratando el sujeto con una citocina. Citocinas preferidas para la administracion durante el tratamiento con la molecula multiespecifica incluyen el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (GM- CSF), interferon-g (IFN-g) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moleculas multiespecificas y biespecificas) de la presente divulgacion tambien pueden usarse para dirigir celulas que expresan CXCR4, por ejemplo, para marcar tales celulas. Para tal uso, el agente de union puede enlazarse a una molecula que pueda detectarse. En el presente documento se describen metodos para la localizacion ex vivo o in vitro de celulas que expresan CXCR4. La marca detectable puede ser, por ejemplo, un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico.

En particular, en el presente documento se describen metodos para detectar la presencia de antigeno CXCR4 en una muestra o medir la cantidad de antigeno CXCR4, comprendiendo los metodos poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo monoclonal humano, o una porcion de union a antigeno del mismo, que se une especificamente a CXCR4, en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo, o porcion del mismo, y CXCR4. Posteriormente se detecta la formacion de un complejo, en el que una diferencia de formacion del complejo entre la muestra en comparacion con la de la muestra de control es indicativa de la presencia de antigeno CXCR4 en la muestra.

Los inmunoconjugados de la presente divulgacion pueden usarse para dirigir compuestos (por ejemplo, agentes terapeuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a celulas que tienen receptores CXCR4 en la superficie celular enlazando tales compuestos al anticuerpo. Asi, en el presente documento se describen metodos para la localizacion ex vivo o in vivo de celulas que expresan CXCR4 (por ejemplo, con una marca detectable, tal como un radioisotopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimatico). Alternativamente, los inmunoconjugados pueden usarse para destruir celulas que tienen receptores CXCR4 en la superficie celular dirigiendo las citotoxinas o radiotoxinas a CXCR4.

Se sabe que CXCR4 se expresa en una amplia variedad de tipos de celulas tumorales y tambien se sabe que participa en la metastasis tumoral. Ademas, como co-receptor para la entrada de VIH en linfocitos T, se sabe que CXCR4 participa en la infeccion por VIH. Adicionalmente, se ha mostrado que la via de CXCR4/SDF-1 participa en afecciones inflamatorias. Mas aun, se ha mostrado que la via de CXCR4/SDF-1 participa en la angiogenesis o la neovascularizacion. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CXCR4 (e inmunoconjugados y moleculas biespecificas) de la presente divulgacion pueden usarse para modular la actividad de CXCR4 en cada una de estas situaciones clinicas, como sigue:

A. Cancer

Se ha mostrado que CXCR4 se expresa por varios tipos de canceres y en ciertas situaciones se ha establecido una correlacion inversa entre la expresion de CXCR4 y el pronostico o supervivencia del paciente. Ejemplos no limitantes de tipos de canceres asociados con la expresion de CXCR4 incluyen: cancer de mama (Muller, A. et al (2001) Nature 410:50-56); ovarico (Scotton, C. et al. (2001) Br. J. Cancer 85:891-897; de prostata (Taichman, R.S. et al.

(2002) Cancer Res. 62:1832-1837; carcinoma de pulmon de celulas no pequenas (Spano J.P. et al. (2004) Ann. Oncol. 15:613-617); pancreatico (Koshiba, T. et al. (2000) Clin. Cancer Res. 6:3530-3535); de tiroides (Hwang, J.H.

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et al. (2003) J. Clin. Endocrinol. Metab. 88:408-416); carcinoma nasofarlngeo (Wang, N. et al. (2005J J. Trans. Med. 3:26-33); melanoma (Scala, S. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1835-1841); carcinoma de celulas renales (Staller, P. et al (2003) Nature 425:307-311); linfoma (Bertolini, F. et al. (2002) Cancer Res. 62:3530-3 535); neuroblastoma (Geminder, H. et al. (2001) J. Immunol. 167:4747-4757); glioblastoma (Rempel, S.A. et al (2000) Clin. Cancer Res. 6:102-111); rabdomiosarcoma (Libura, J. et al. (2002) Blood 100:2597- 2606); colorrectal (Zeelenberg, I.S. et al

(2003) Cancer Res. 63:3833-3839); de rinon (Schrader, A.J. et al. (2002) Br. J. Cancer 86:1250-1256): osteosarcoma (Laverdiere, C. et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:2561-2567); leucemia linfoblastica aguda (Crazzolara, R. et al. (2001) Br. J. Haematol. 1 15:545-553): y leucemia mieloide aguda (Rombouts, E.J.C. et al.

(2004) Blood 104:550-557).

En vista de lo anterior, los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion pueden usarse en el tratamiento de canceres, que incluyen, pero no se limitan a, un cancer seleccionado del grupo que consiste en cancer de mama, ovarico, de prostata, carcinoma de pulmon de celulas no pequenas, pancreatico, de tiroides, carcinoma nasofarlngeo, melanoma, carcinoma de celulas renales, linfoma, neuroblastoma, glioblastoma, rabdomiosarcoma, colorrectal, de rinon, osteosarcoma, leucemia linfoblastica aguda y leucemia mieloide aguda. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros tratamientos de cancer, tales como cirugla y/o radiacion, y/o con otros agentes antineoplasicos, tales como los agentes antineoplasicos tratados y expuestos anteriormente, que incluyen farmacos quimioterapeuticos y otros anticuerpos de antlgenos antitumorales, tales como aquellos que se unen a CD20, Her2, PSMA, Campath-1, EGFR y similares.

B. Infecciones virales, incluida infection por el VIH

Se ha mostrado que CXCR4 es un co-receptor para la entrada del VIH en linfocitos T y, adicionalmente, se ha demostrado que ciertos anticuerpos anti-CXCR4 murinos son capaces de inhibir la entrada de cepas aisladas del VIH en linfocitos T (veanse Hou, T. et al. (1998; J. Immunol. 160:180-188; Carnec, X. et al. (2005) J. Virol. 79:19301938). Por lo tanto, CXCR4 puede ser usado como receptor por virus para entrar en la celula, y los anticuerpos para CXCR4 pueden usarse para inhibir la entrada en la celula de tales virus que usan CXCR4 como receptor. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CXCR4 humanos de la presente divulgacion pueden usarse para inhibir la entrada de un virus en una celula, en la que el virus usa CXCR4 como receptor para la entrada en la celula, de modo que se inhiba la infeccion viral. En una realization preferida, los anticuerpos se usan para inhibir la entrada del VIH en linfocitos T, por ejemplo, en el tratamiento o la prevention del VIH/SIDA. El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes antivirales, tales como farmacos antirretrovirales, tales como AZT o inhibidores de proteasas.

C. Afecciones inflamatorias

Se ha mostrado que la via de CXCR4/SDF-1 desempena una funcion en varias afecciones inflamatorias, que incluyen, pero no se limitan a, enfermedad inflamatoria del hlgado (Terada, R. et al. (2003) Lab. Invest. 83:665-672); inflamacion articular autoinmunitaria (Matthys, P. et al (2001) J. Immunol 167:4686-4692); enfermedad alergica respiratoria (Gonzalo, J.A. et al. (2000) J. Immunol. 165:499-508); y enfermedad periodontal (Hosokawa, Y. et al.

(2005) Clin. Exp. Immunol. 144:467-474).

Por consiguiente, los anticuerpos anti-CXCR4 humanos de la presente divulgacion que inhiben la union de SDF-1 a CXCR4 pueden usarse para inhibir la inflamacion en trastornos inflamatorios, que incluyen trastornos seleccionados del grupo que consiste en: enfermedad inflamatoria del hlgado, enfermedad articular autoinmunitaria, enfermedad alergica respiratoria, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, lupus eritematoso sistemico, diabetes de tipo 1, trastornos inflamatorios de la piel (por ejemplo, psoriasis, liquen plano), enfermedad autoinmunitaria de la tiroides, slndrome de Sjogren, inflamacion pulmonar (por ejemplo, enfermedad pulmonar obstructiva cronica, sarcoidosis pulmonar, alveolitis linfocltica) y enfermedad inflamatoria del hlgado (por ejemplo, nefropatla por IgA, glomerulonefritis). El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes antiinflamatorios, tales como farmacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), corticosteroides (por ejemplo, prednisona, hidrocortisona), metotrexato, inhibidores de COX-2, antagonistas de TNF (por ejemplo, etanercept, infliximab, adalimumab) e inmunosupresores (tales como 6-mercaptopurina, azatioprina y ciclosporina A).

D. Angiogenesis

Se ha demostrado que SDF-1 induce la neovascularization mediante el reclutamiento de hemangiocitos que expresan CXCR4 (Jin, D.K. et al. (2006) Nat. Med. 12:557-567). Ademas, el bloqueo de la via de SDF-1/CXCR4 puede atenuar el crecimiento tumoral in vivo inhibiendo la angiogenesis de una forma independiente de VEGF (Guleng, B. et al. (2005) Cancer Res. 65:5864-58-71). Mas aun, como se demuestra en el Ejemplo 2, los anticuerpos de la presente divulgacion son capaces de inhibir la formation de tubos capilares in vitro. Por consiguiente, los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgacion que inhiben la union de SDF-1 a CXCR4 pueden usarse para inhibir la angiogenesis interfiriendo con la via de SDF-1/CXCR4. La inhibition de la angiogenesis puede usarse, por ejemplo, para inhibir el crecimiento tumoral o la metastasis tumoral (independientemente de si el tumor es CXCR4+). El anticuerpo puede usarse solo o en combinacion con otros agentes antiangiogenicos, tales como anticuerpos anti- VEGF.

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E. Trasplante autoload de celulas madre

Las celulas madre de la sangre periferica son la fuente preferida de celulas madre para uso en el trasplante autologo de celulas madre, por ejemplo, en el tratamiento de ciertos tumores malignos hematologicos. La obtencion de celulas madre a partir de la sangre periferica requiere la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica. Han participado varias citocinas, quimiocinas y moleculas de adhesion en la regulation de este proceso (revisado en Gazitt, Y. (2001) J. Hematother. Stem Cell Res. 10:229-236), que incluye la interaction de CXCR4 y SDF-1. Ademas, se ha demostrado que un antagonista de CXCR4 de molecula pequena estimula la rapida movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la periferia (vease, por ejemplo, Devine, S.M. et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:1095-1102; Broxmeyer, H.E. et al. (2005) J. Exp. Med. 201:1307-1318; Flomenberg, N. et al. (2005) Blood 106:1867-1874). Por consiguiente, los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente divulgation que inhiben la actividad de CXCR4 (es decir, anticuerpos antagonistas) pueden usarse para estimular la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica para permitir el uso de tales celulas madre en trasplantes (por ejemplo, trasplante autologo), por ejemplo, en el tratamiento de trastornos hematologicos, tales como mieloma multiple o linfoma no Hodgkin. El anticuerpo puede usarse solo o en combination con otros agentes usados para estimular la movilizacion de celulas madre, tales como G-CSF y/o GM-CSF. Asl, en otra realization, la invention proporciona el anticuerpo monoclonal o portion de union al antigeno del mismo de la invension para su uso en un metodo para estimular la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica en un sujeto, comprendiendo el metodo administrar al sujeto un anticuerpo anti-CXCR4 de la invention tal que se estimule la movilizacion de celulas madre CD34+ de la medula osea a la sangre periferica. El metodo puede comprender ademas obtener celulas madre CD34+ de sangre periferica, tal como para uso en el trasplante autologo de celulas madre.

La presente divulgation se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generacion de anticuerpos monoclonales humanos contra CXCR4

Se generaron anticuerpos monoclonales humanos anti-CXCR4 usado un enfoque de combination en el que, primero, se inmunizaron ratones que expresaban genes de anticuerpos humanos para producir en los ratones un repertorio de inmunoglobulinas humanas especlficas para CXCR4 humano y, despues, segundo, se preparo una biblioteca de anticuerpos humanos a partir de celulas del bazo del raton y se expresaron en fagos, de forma que los fagos se cribaron posteriormente para la expresion de anticuerpos con especificidad para CXCR4. Este enfoque de combination se describe generalmente en la solicitud de EE.UU. N° 20030091995 de Buechler et al.

Antigeno

Se transfectaron celulas R1610 (una llnea celular pulmonar de hamster chino, descrita originariamente en Thirion, J.P. et al. (1976) Genetics 83:137-147) con un vector de expresion que codificaba la protelna CXCR4 de longitud completa humana, de forma que la protelna se expreso sobre la superficie de las celulas. Se uso una forma con codones optimizados del ADNc de CXCR4 en el vector de expresion, que se preparo como se describe en Mirzabekov, T. et al. (1999), J. Biol. Chem. 274:28745-28750. Para potenciar la inmunogenicidad de las celulas, las celulas se recubrieron con trinitrofenol (TNP), por incubacion con una solucion acuosa de acido trinitrobencenosulfonico (TNBS), comercialmente disponible como una solution al 5 % (Sigma, Cat. n° P2297). Mas especlficamente, se lavaron 1 x 108 celulas una vez con PBS esteril, se incubaron con 50 ml de la solution de TNBS comercial al 5 % durante una hora a oscuras a temperatura y a continuation se lavaron tres veces con PBS. Las celulas R1610 que expresaban CXCR4 recubiertas de TNP resultantes se usaron como antigeno para la inmunizacion. El inmunogen final fue una mezcla de 100 ml de celulas lavadas recubiertas de TNP (1x107 celulas) mas 100 ml de adyuvante de Ribi. Los ratones recibieron seis dosis de inmunogen con el tiempo.

Cepa KM Mouse® transcromosomica transgenica

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos para CXCR4 inicialmente inmunizando la cepa KM de ratones transcromosomicos transgenicos, que expresa genes de anticuerpos humanos. En esta cepa de raton, el gen de la cadena ligera kappa endogena de raton se ha alterado homocigoticamente como se describe en Chen et al. (1993) EMBO J. 12:81 1-820 y el gen de la cadena pesada endogena de raton se ha alterado homocigoticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la publication PCT WO 01/09187. Adicionalmente, esta cepa de raton lleva un transgen de la cadena ligera kappa humana, KCo5 (como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) y tambien contiene el transcromosoma SC20, que lleva el locus de la cadena pesada de Ig humana, como se describe en la publication PCT WO 02/43478. Los ratones KM tambien se describen en detalle en la solicitud de EE.UU. N° 20020199213.

Inmunizacion de KM

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Para producir anticuerpos monoclonales completamente humanos para CXCR4, ratones de la cepa KM Mouse® se inmunizaron con celulas R1610 transfectadas para expresar CXCR4 y recubiertas con TNP (como se describio anteriormente para el antlgeno). Los esquemas de inmunizacion generales para la produccion de anticuerpos humanos en cepas de ratones que llevan genes de anticuerpos humanos se describen en Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la publicacion PCT WO 98/24884. Los ratones tenlan 6-16 semanas de edad tras la primera infusion de antlgeno.

Los ratones KM se inmunizaron con antlgeno en adyuvante de Ribi intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) o a traves de las almohadillas de las patas (FP), seguido de re-inmunizacion IP, Sc o FP a los 3-21 dlas (durante un total de 6 inmunizaciones) con el antlgeno en adyuvante de Ribi. La respuesta inmunitaria se monitorizo mediante extracciones de sangre retroorbitales. El plasma se cribo por tincion FACS de celulas R1610 que expresaban CXCR4 (frente a celulas R1610 parentales sin tranfectar). Se usaron ratones con suficientes tltulos de inmunoglobulina humana anti-CXCR4 para recoger los bazos.

Preparacion de la biblioteca de expresion en fagos y cribado para anticuerpos anti-CXCR4

Se usaron los bazos recogidos de los ratones inmunizados descritos anteriormente para crear una biblioteca de expresion en fagos que expresaba las cadenas pesada y ligera de anticuerpos humanos. Mas especlficamente, se aislo el ARN de los bazos, se preparo el ADNc a partir del RNA, y el ADNc de la region variable del anticuerpo humano se amplifico especlficamente por PCR, esencialmente como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 20030091995 de Buechler et al. La biblioteca de las regiones variables de anticuerpo humano se clono en vectores de expresion en fagos, de nuevo esencialmente como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 20030091995 de Buechler et al. La biblioteca de expresion en fagos se cribo para miembros de la biblioteca con afinidad por CXCR4 inmunopurificando con CXCR4 humano incorporado en proteoliposomas magneticos (CXCR4- MPL). Se han descrito previamente MPL que expresan CXCR4, u otros siete receptores transmembranarios (7TM) (por ejemplo, CCR5), de forma que la conformacion nativa del receptor de 7TM se mantuviera (vease, por ejemplo, Mirzabekov, T. et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:649-654; Babcock, G.J. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:3843338440; publicacion PCT WO 01/49265; solicitud de patente de EE.UU. 20010034432). En resumen, CXCR4 humano recombinante que contenla una marca de epitope se solubilizo a partir de una linea celular transfectada que expresaba CXCR4 usando el detergente CHAPSO, y la proteina se capturo sobre perlas magneticas por medio de la marca de epitopes. Se reconstituyo una membrana lipidica durante la eliminacion del detergente, de tal forma que se mantuvo la conformacion nativa en la membrana de CXCR4, para crear las CXCR4-MPL. Tres rondas de inmunopurificacion de la biblioteca de expresion en fagos en las CXCR4-MPL condujeron a un enriquecimiento de 30 veces de ligantes de CXCR4 en comparacion con el nivel basal. Se volvieron a clonar los fragmentos de la region variable de interes en un vector de expresion Fab y se volvio a ensayar el Fab para la union a antlgeno frente a celulas transfectadas que expresaban CXCR4. Entonces se generaron anticuerpos completos a partir de los Fab usando tecnicas estandar de biologia molecular.

Se seleccionaron los clones de Fab de F7, F9, D1 y E2 para analisis posteriores.

Ejemplo 2: Caracterizacion estructural de los anticuerpos monoclonales humanos anti-CXCR4 F7, F9, D1 y E2

Se secuenciaron las secuencias de ADNc que codificaban las regiones variables de la cadena pesada y ligera de los clones de Fab de F7, F9, D1 y E2, obtenidos del cribado de la biblioteca de expresion en fagos como se describio en el Ejemplo 1, usando tecnicas estandar de secuenciacion de ADN.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de F7 se muestran en la Figura 1A y en SEC ID N°: 33 y 25, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de F7 se muestran en la Figura 1B y en SEC ID N°: 37 y 29, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina F7 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la linea germinal humana conocidas demostro que la cadena pesada de F7 utiliza un segmento VH de la linea germinal humana VH 3-48, un segmento D de la linea germinal humana 4-23 y un segmento JH de la linea germinal humana JH 6B. Analisis posteriores de la secuencia VH de F7 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 1A y en SEC ID N°: 1, 5 y 9, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina F7 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la linea germinal humana conocidas demostro que la cadena ligera de F7 utiliza un segmento Vl de la linea germinal humana Vk L15 y un segmento JK de la linea germinal humana JK 1. Analisis posteriores de la secuencia VL de F7 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 1B y en SEC ID

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N°: 13, 17 y 21, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de F9 se muestran en la Figura 2A y en SEC ID N°: 34 y 26, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de F9 se muestran en la Figura 2B y en SEC ID N°: 38 y 30, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina F9 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena pesada de F9 utiliza un segmento Vh de la llnea germinal humana Vh 3-48, un segmento D de la llnea germinal humana 4-23 y un segmento JH de la llnea germinal humana JH 6B. Analisis posteriores de la secuencia Vh de F9 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 2A y en SEC ID N°: 2, 6 y 10, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina F9 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena ligera de F9 utiliza un segmento Vl de la llnea germinal humana Vk L15 y un segmento JK de la llnea germinal humana JK 1. Analisis posteriores de la secuencia Vl de F9 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 2B y en SEC ID N°: 14, 18 y 22, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de D1 se muestran en la Figura 3A y en SEC N°: 35 y 27, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de D1 se muestran en la Figura 3B y en SEC ID N°: 39 y 31, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina D1 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena pesada de D1 utiliza un segmento Vh de la llnea germinal humana Vh 3-48, un segmento D de la llnea germinal humana 4-23 y un segmento JH de la llnea germinal humana JH 6B. Analisis posteriores de la secuencia Vh de D1 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 3A y en SEC ID N°: 3, 7 y 11, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina D1 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena ligera de D1 utiliza un segmento Vl de la llnea germinal humana Vk L15 y un segmento JK de la llnea germinal humana JK 1. Analisis posteriores de la secuencia Vl de D1 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 3B y en SEC ID N°: 15, 19 y 23, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de E2 se muestran en la Figura 4A y en SEC ID N°: 36 y 28, respectivamente.

Las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de E2 se muestran en la Figura 4B y en SEC ID N°: 40 y 32, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina E2 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena pesada de E2 utiliza un segmento Vh de la llnea germinal humana Vh 3-48, un segmento D de la llnea germinal humana 4-23 y un segmento JH de la llnea germinal humana JH 6B. Analisis posteriores de la secuencia Vh de E2 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada como se muestra en la Figura 4A y en SEC ID N°: 4, 8 y 12, respectivamente.

La comparacion de la secuencia de la cadena ligera de inmunoglobulina E2 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la llnea germinal humana conocidas demostro que la cadena ligera de E2 utiliza un segmento Vl de la llnea germinal humana Vk L15 y un segmento JK de la llnea germinal humana JK 1. Analisis posteriores de la secuencia Vl de E2 usando el sistema de Kabat de determinacion de las regiones CDR condujeron a la delineacion de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera como se muestra en la Figura 4B y en SEC ID N°: 16, 20 y 24, respectivamente.

El analisis de las secuencias de la region estructural de las regiones Vh y Vl de F7, F9, D1 y E2, en comparacion con las secuencias de la llnea germinal de las que se derivaron, identifico varios residuos de aminoacidos de la region estructural que se diferenciaban de los de la llnea germinal. Se eligieron ciertos residuos de la region estructural en las regiones del extremo N de los segmentos Vh y Vl para “retromutacion” para restaurar los residuos

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de la region estructural a la secuencia de la ilnea germinal, debido a que estos residuos no pertenecen de la ilnea germinal en la porcion del extremo N estuvieron codificados por los cebadores usados para crear las bibliotecas de expresion en fagos descritas en el Ejemplo 1. En particular, las siguientes formas modificadas de los segmentos Vh y Vl de F7, F9, D1 y E2 (denominadas formas “GL”, de la llnea germinal) se crearon usando tecnicas estandar de biologla molecular para sustituir el residuo de aminoacido de la llnea germinal en la posicion de la region estructural indicada:

F7GL Vh: Q1E, Q6E F7GL Vk AID, R3Q

F9GL Vh: Q1E, Q6E F9GL Vk E1D, V3Q y L4M.

D1GL Vh: Q6E

D1GL Vk VID, W3Q y V4M

E2GL Vh: Q6E

E2GL Vk: E1D, V3Q y L4M.

La Figura 5A muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de F7 (SEC ID N°: 25) y de F7GL (SEC ID N°: 41) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh 3-48 (SEC ID N°: 49). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 5B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de F7 (SEC ID N°: 29) y de F7GL (SEC ID N°: 45) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh L15 (SEC ID N°: 50). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 6A muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de F9 (SEC ID N°: 26) y de F9GL (SEC ID N°: 42) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh 3-48 (SEC ID N°: 49). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 6B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de F9 (SEC ID N°: 30) y de F9GL (SEC ID N°: 46) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh L15 (SEC ID N°: 50). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 7A muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de D1 (SEC ID N°: 27) y de D1GL (SEC ID N°: 43) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh 3-48 (SEC ID N°: 49). Las regiones CDR1, CdR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 7B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de D1 (SEC ID N°: 31) y de D1GL (SEC ID N°: 47) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vk L15 (SEC ID N°: 50). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 8A muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena pesada de E2 (SEC ID N°: 28) y de E2GL (SEC ID N°: 44) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vh 3-48 (SEC ID N°: 49). Las regiones CDR1, CdR2 y CDR3 estan delineadas.

La Figura 8B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoacidos de la region variable de la cadena ligera de E2 (SEC ID N°: 32) y de E2GL (SEC ID N°: 48) con la secuencia de aminoacidos de la llnea germinal codificada por Vk L15 (SEC ID N°: 50). Las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 estan delineadas.

Los fragmentos Fab de F7, F9, D1 y E2 se convierten en anticuerpos de longitud completa usando tecnicas estandar de ADN recombinante. Por ejemplo, el ADN que codifica las regiones Vh y Vk de uno de los fragmentos Fab puede clonarse en un vector de expresion que lleva las regiones constantes de la cadena pesada y ligera, de tal forma que las regiones variables se enlacen operativamente a las regiones constantes. Alternativamente, pueden usarse vectores separados para la expresion de la cadena pesada de longitud completa y la cadena ligera de longitud completa. Ejemplos no limitantes de vectores de expresion adecuados para uso en la creacion de anticuerpos de longitud completa incluyen los vectores pIE descritos en la solicitud de patente de EE.UU. N° 20050153394 de Black.

Ejemplo 3: Caracterfsticas de union de anticuerpos monoclonales humanos anti-CXCR4

En este ejemplo, se examinaron las caracterlsticas de union de los anticuerpos anti-CXCR4 por citometrla de flujo.

Se uso la llnea de linfocitos T humana CEM, que expresa CXCR4 nativo humano sobre su superficie celular, para examinar la capacidad de los anticuerpos F7, F9, D1 y E2 para unirse a CXCR4 nativo de la superficie celular. Se valoraron F7, F9, D1 y E2 de longitud completa en una serie de diluciones en serie 1:3, produciendo un intervalo de

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concentraciones de 300 nM a 5 pM. A continuacion, los anticuerpos se mezclaron con celulas CEM y se dejo que se unieran antes de ser detectados con un anticuerpo anti-IgG humana secundario conjugado con FITC. Las celulas se analizaron a continuacion por citometrla fluorescente. Las intensidades de fluorescencia medias resultantes se muestran en la grafica de la Figura 9, que demuestra que los cuatro anticuerpos anti-CXCR4 se unen a celulas CEM. Las CE50 para la union de F7, F9, D1 y E2 fueron 21 nM, 14 nM, 80 nM y 290 nM, respectivamente.

Para determinar la capacidad de un panel de anticuerpos anti-CXCR4 para competir por la union a CXCR4, se realizaron estudios de competicion. Se usaron los cuatro anticuerpos anti-CXCR4 humanos F9, F7, E2 y D1, junto con cuatro anticuerpos anti-CXCR4 monoclonales murinos comercialmente disponibles (12G5, 708, 716 y 717; n° de catalogo de R&D Systems: MAB170, MAB171, MAB172 y MAB173, respectivamente). Los anticuerpos anti-CXCR4 se valoraron en una serie de diluciones en serie 1:3, produciendo un intervalo de concentraciones de 300 nM a 5 pM en presencia de una concentracion constante de anticuerpo anti-CXCR4 F9 marcado con FITC. A continuacion, la mezcla de anticuerpos se anadio a celulas CEM y se dejo que se unieran. La capacidad de cada anticuerpo para competir con F9 por la union a las celulas CEM se evaluo por citometrla fluorescente y deteccion de FlTC. Las intensidades de fluorescencia medias resultantes se muestran en la grafica de la Figura 10, que demuestra que los siete anticuerpos examinados (F7, E2, D1, 12G5, 708, 716 y 717) fueron capaces de competir con F9 por la union a celulas CEM, aunque el anticuerpo E2 solo demostro inhibicion parcial a concentraciones altas en comparacion con los otros anticuerpos.

En otro conjunto de experimentos, se examino la capacidad del mAb F7 para unirse a varias llneas celulares diferentes por citometrla de flujo llevando a cabo una valoracion FACS. Se incubaron cantidades crecientes de mAb (desde menos de 0,001 mg/ml a mas de 100 mg/ml) con 100,00 celulas y se evaluo la union por citometrla de flujo. Tambien se determino el valor de Bmax, que indica aproximadamente cuantas moleculas de CXCR4 estan presentes en cada celula. Basandose en las curvas de union, se determino una CE50 para la union de los anticuerpos, cuyos resultados se resumen a continuacion en la Tabla 1:

Tabla 1: Resultados de la valoracion FACS para la union de mAb F7 a diferentes llneas celulares

Tipo de celula: CE50 (mg/ml) Bmax

Ramos: 0,48 106.000

Raji: 0,34 52.536

Namalwa: 1,57 116.000

L540: 3,69 31.868

DMS79: 3,99 24.587

MDA-MB-231: 9,24 14.186

Bmax = union maxima (unidades de GMFI)

Los resultados muestran que el mAb F7 es capaz de unirse eficazmente a cada una de las seis llneas celulares probadas, con las CE50 mas bajas observadas con las llneas celulares Ramos y Raji. Estos datos tambien muestran que la expresion del receptor CXCR4 es la mayor para las celulas Ramos y Namalwa, y la menor para las celulas MDA-MB-231 y las celulas DMS79.

En otro experimento de union, se examino la capacidad del mAb F7 para unirse a diferentes subconjuntos de celulas mononucleares de sangre periferica humanas (CMSP). Se aislaron CMSP humanas por metodos estandar y los diferentes subconjuntos celulares se aislaron por FACS. En particular, se aislaron los siguientes subconjuntos celulares: (i) CD3+, (ii) CD20+; (iii) CD11b+ y (iv) CD14+. Los experimentos de citometrla de flujo realizados con el mAb F7 (a 33 mg/ml) demostraron que el mAb F7 fue capaz de unirse eficazmente a cada uno de los cuatro subconjuntos, en comparacion con un anticuerpo de control del mismo isotipo.

Ejemplo 4: Inhibicion de la union de SDF-1 a CXCR4 por anticuerpos anti-CXCR4

Para determinar la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la union de SDF-1 a CXCR4, se realizo un estudio de competicion usando sDF-1 marcado con 125I y celulas CEM, que expresan CXCR4 de forma natural. Se realizo una comparacion de los anticuerpos anti-CXCR4 en el bloqueo de la union de SDF-1 a celulas CEM por un ensayo de union de radioligandos estandar. Los anticuerpos anti-CXCR4 se diluyeron en serie 1:3 para dar un intervalo de concentraciones de 300 nM a 137 pM. Los anticuerpos se anadieron a 750.000 celulas CEM en 100 ml en presencia de I-SDF-1 100 pM con una actividad especlfica de 2000 Ci/mmol (Amersham, n° de catalogo

IM314-25UC1). Se uso un anticuerpo irrelevante del mismo isotipo como control negativo. Se determino el ligando radiomarcado unido total posible dejando que 125I-SDF-1 se uniera a celulas CEM en ausencia de anticuerpos durante 2 horas a 4 °C. Se determino la union no especlfica del ligando radiomarcado dejando que 125I-SDF-1 se uniera en presencia de SDF-1 sin marcar 1 mM (Peprotech, n° de catalogo 300-28A). La cantidad de 125I-SDF-1 asociado a celulas se determino por metodos estandar. Los resultados se muestran en la Figura 11, que demuestra que el anticuerpo F7 proporciona el bloqueo mas eficaz de la union de SDF-1 a CXCR4 expresado en celulas CEM. Los anticuerpos F9 y D1 tambien bloquearon la union de SDF-1, aunque de forma mas moderada que F7. El anticuerpo E2, aunque se une a CXCR4 en celulas CEM (como se demostro en el Ejemplo 3), no bloqueo eficazmente la union de SDF-1 a CXCR4 en celulas CEM. Las CE50 para el bloqueo de SDF-1 por F7, F9 y D1

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Ejemplo 5: Inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1 por anticuerpos anti-CXCR4

Para determinar la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir el flujo de calcio en celulas CEM inducido por SDF-1, primero se marcaron celulas CEM con el colorante fluorescente Calcium 3 (Molecular Devices). Se valoraron los anticuerpos anti-CXCR4 en una serie de diluciones en serie 1:3, produciendo un intervalo de concentraciones de 100 nM a 1 pM, y se dejo que se uniera a 200.000 celulas CEM en 200 ml y se incubo 10 minutos a temperatura ambiente antes de cargarse en un equipo Flexstation (Molecular Devices). Como control negativo se uso un anticuerpo irrelevante del mismo isotipo. A continuation, las celulas se estimularon con una concentration final de SDF-1a humano recombinante 50 nM (Peprotech), anadido como 500 nM en un volumen de 22 ml para un volumen final de 222 ml. El flujo de calcio resultante se midio durante 200 segundos por pocillo. Como control positivo, se estimularon celulas en ausencia de anticuerpo con SDF-1a (preparado en solution salina tamponada con Hank (HBS) con 0,1 % de BSA o HBS) para obtener una senal de flujo calcio posible maxima. Para determinar un nivel inicial, las celulas se estimularon con HBS con 0,1 % de BSA. Se midio la liberation de calcio estimulada por SDF-1a por el desarrollo de fluorescencia dependiente de calcio con el tiempo. El area bajo la curva de la traza de fluorescencia resultante se informo como una indication del flujo de calcio. La inhibicion resultante del flujo de calcio por los anticuerpos anti-CXCR4 se representa en la Figura 12. Se representaron los datos y se calcularon las CE50 usando el software GraphPad Prism y el ajuste no lineal de la curva, y la formula de respuesta sigmoidal a la dosis. Los anticuerpos F7, F9 y D1 inhibieron el flujo de calcio inducido por SDF-1a. El anticuerpo E2, aunque se unio a CXCR4 (como se demostro en el Ejemplo 3), no inhibio significativamente el flujo de calcio inducido por SDF-1a. Las CE50 para la inhibicion del flujo de calcio inducido por SDF-1 por F7, F9 y D1 fueron 0,90 nM, 0,32 nM y 0,57 nM, respectivamente.

Ejemplo 6: Inhibicion de la migracion inducida por SDF-1 de celulas CEM por anticuerpos anti-CXCR4

Para determinar la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la migracion de celulas CEM inducida por SDF-1, primero se marcaron celulas CEM con el reactivo BATDA (Perkin Elmer). Se valoraron los anticuerpos anti-CXCR4 en una serie de diluciones en serie 1:3, produciendo un intervalo de concentraciones de 100 nM a 1 pM, y se dejo que se unieran a celulas CEM marcadas a una densidad de 10 millones de celulas por ml. Como control negativo se uso un anticuerpo irrelevante del mismo isotipo. Se anadieron 30 ml de SDF-1a humano recombinante (Peprotech) 5nM por pocillo a la camara inferior de una placa de migracion Neuroprobe de 96 pocillos con filtros de 5,7 mm de diametro por pocillo. Cada pocillo contenla poros 5 mM. Se cargaron celulas CEM marcadas con y sin anticuerpo sobre los filtros a una concentracion de 0,5 millones de celulas por pocillo en un volumen de 50 ml. La placa de migracion se incubo a 37 °C durante 2,5 horas. Las celulas migradas se capturaron en la camara inferior de la placa, se lisaron y se detectaron con solucion de detection de europio (Perkin Elmer). La senal quimioluminiscente se registro en un instrumento Fusion. La inhibicion resultante de la migracion inducida por SDF- 1a por los anticuerpos anti-CXCR4 se muestra en la Figura 13. Los resultados demostraron que los anticuerpos F7 y F9 inhibieron la migracion eficazmente, mientras que los anticuerpos D1 y E2 no inhibieron significativamente la migracion. Las CE50 para la inhibicion de la migracion de celulas cEm inducida por SDF-1 por F7 y F9 fueron 12,44 nM y 18,99 nM, respectivamente.

Ejemplo 7: Inhibicion de la formacion de tubos capilares por HuVEC por anticuerpos anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la formacion de tubos capilares por celulas endoteliales de la vena umbilical (HuVEC). Se diluyo Matrigel 1:1 con RPMI y se coloco sobre los pocillos de una placa de 96 pocillos y se dejo polimerizar durante 30 minutos a 37 °C. Se tripsinaron HuVEC (de Cambrex, n° de cat. CC-2519) al 80 % de confluencia y se resuspendieron a 1 x 106 celulas por ml en RPMI con 0,5 % de FBS. Los anticuerpos se mezclaron bien con HuVEC a una concentracion final de 3 mg/ml y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se uso un anticuerpo irrelevante del mismo isotipo o medio solo como control negativo. Como control positivo de la inhibicion de la formacion de tubos se uso un anticuerpo de raton anti-avp3 (CD51/CD61) humano (R&D Systems, n° de cat. MAB3050). Se colocaron HuVEC con o sin anticuerpos sobre los pocillos recubiertos de Matrigel y se incubaron a 37 °C durante 18 horas.

Las HuVEC incubadas con medio solo o con el anticuerpo de control del mismo isotipo formaron tubos capilares, produciendo la aparicion de celulas conectadas a lo largo de la placa con 3-5 puntos de conexion o puntos de ramification por celula. Las HuVEC incubadas con tanto los anticuerpos humanos anti-CXCR4 como el anticuerpo anti-avp3 no formaron tubos capilares. Las celulas pareclan estar aisladas y con pocos o ningun punto de ramificacion. Los anticuerpos anti-CXCR4 que fueron mas eficaces en el bloqueo de la union SDF-1, el flujo de calcio inducido por SDF-1 y la migracion inducida por SDF-1, concretamente F7 y F9, fueron tambien los mas eficaces en inhibir la formacion de tubos capilares. El anticuerpo anti-CXCR4 E2, que se une a CXCR4 pero no bloquea la union de SDF-1 o los efectos inducidos por SDF-1, no inhibio la formacion de tubos capilares.

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Ejemplo 8: Inhibicion de la proliferacion de celulas tumorales in vitro por anticuerpos anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la proliferacion de celulas tumorales Ramos (una linea celular de linfoma de Burkitt humano) in vitro. En el ensayo, se incubaron 1 x 104 celulas/pocillo con dosis crecientes (10-3 a 300 nM) de anticuerpo IgG4 F7, anticuerpo IgG1 F9, anticuerpo IgG1 E2, Fab' de anticuerpo F9 o isotipos de control. Las celulas se incubaron con anticuerpo durante 72 horas, anadiendose 3H-timidina durante las 24 horas finales de incubacion para permitir la monitorizacion de la proliferacion celular. Tras la incubacion, se midio la incorporacion de 3H-timidina por las celulas por tecnicas estandar. Los resultados se muestran en la grafica de la Figura 14. Los resultados demuestran que cada uno de los anticuerpos IgG4 F7, IgG1 F9 y IgG1 E2 fue capaz de inhibir la proliferacion de celulas Ramos, como se indico por el descenso de la incorporacion de 3H-timidina cuando se incubo con estos anticuerpos, mientras que el fragmento Fab' de F9 no inhibio la proliferacion celular. Estos resultados indican que los anticuerpos humanos anti-CXCR4 tienen un efecto antiproliferativo directo sobre las celulas tumorales in vitro y, por lo tanto, no requieren entrecruzamiento secundario para conseguir un efecto antiproliferativo.

Ejemplo 9: Inhibicion de la proliferacion de celulas de un tumor solido in vitro por anticuerpos anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad de los anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la proliferacion de un tumor solido establecido in vivo usando un modelo de celulas tumorales Ramos subcutaneas. En este ensayo, se implantaron 10 x 106 celulas Ramos/raton en la region del costado de cada raton y se dejaron crecer hasta un tamano medio de 40 mm3, calculado por longitud x anchura x altura/2 de los tumores. A continuacion, los ratones recibieron una inyeccion intraperitoneal (i.p.) de una primera dosis de anticuerpo (designada como dia 0 del tratamiento) y recibieron una segunda dosis i.p. de anticuerpo el dia 7. Los ratones tratados con un fragmento Fab' de anticuerpo tambien recibieron dosis i.p. de anticuerpo el dia 3 y el dia 10. Se trataron grupos de ratones (n=8) con cualquiera de (i) vehiculo; (ii) control de isotipo (15 mg/kg); (iii) lgG4 F7 (15 mg/kg); (iv) IgG1 F9 (15 mg/kg); (v) Fab' de F9 (10 mg/kg); o (vi) control positivo de anti-CD20 (15 mg/kg). El volumen tumoral y el peso corporal del raton se midieron a intervalos regulares (aproximadamente 2-3 veces/semana) entre el dia 0 y el dia 30 despues de la dosis. Los resultados del experimento se presentan en las Figuras 15A, 15B y 15C, que muestran el volumen tumoral medio (Figura 15A), la mediana del volumen tumoral (Figura 15B) y la mediana del % de cambio en el peso corporal (Figura 15C). Los resultados mostraron que, como en el caso del control positivo, los anticuerpos IgG4 F7 e IgG1 F9 inhibieron significativamente el crecimiento celular tumoral como se mide por el aumento de volumen tumoral, mientras que el fragmento Fab' de F9 no inhibio el crecimiento celular tumoral en comparacion con el control de isotipo. Todos los tratamientos fueron bien tolerados como indico el que no se produjera ningun cambio de peso corporal significativo. Lo mas probable es que las diferencias en los pesos corporales entre los tratamientos se debieran a los pesos de los tumores. Los resultaron indicaron que los anticuerpos humanos anti-CXCR4 son capaces de inhibir el crecimiento de un tumor solido establecido in vivo.

Ejemplo 10: Aumento del tiempo de supervivencia en un modelo de celulas tumorales sistemicas de raton por tratamiento con un anticuerpo anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad de un anticuerpo humano anti-CXCR4 para aumentar el tiempo de supervivencia de ratones usando un modelo de celulas Ramos tumorales sistemicas. En este ensayo, se inyectaron 1 x 106 celulas Ramos/raton intravenosamente (i.v.) en cada raton el dia 0. A continuacion los ratones recibieron una inyeccion intraperitoneal (i.p.) de una primera dosis de anticuerpo el dia 1 (es decir, un dia despues de la administracion i.v. de las celulas tumorales) y recibieron cuatro dosis i.p. mas de anticuerpo, los dias 5, 8, 15 y 22 (los ratones tratados con el anticuerpo de control positivo se trataron unicamente el dia 1). Se trataron grupos de ratones (n=8) con cualquiera de (i) vehiculo; (ii) control de isotipo (15 mg/kg); (iii) IgG1 F9 (15 mg/kg); o (iv) control positivo de anti-CD19 (15 mg/kg). Se midio el porcentaje de supervivencia a intervalos regulares entre el dia 0 y el dia 50 despues de la dosis (se utilizo la paralisis de las patas traseras como punto final del experimento). Los resultados del experimento se presentan en la Figura 16, que muestra el porcentaje de supervivencia con el tiempo. La mediana del n° de dias de supervivencia para los ratones tratados bien con vehiculo o con el control de isotipo fueron 23 y 25,5 dias, respectivamente, mientras que la mediana del n° de dias de supervivencia de los ratones tratados con una dosis del control positivo de anti-CD19 fue de 39 dias. Significativamente, el 100 % de los ratones en el grupo tratado con cinco dosis del anticuerpo IgG1 F9 sobrevivieron hasta el final del experimento. Estos resultados indican que el anticuerpo humano anti-CXCR4 es capaz de aumentar los tiempos de supervivencia de ratones en un modelo de celulas tumorales sistemicas.

Ejemplo 11: Induccion de la apoptosis por el anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 F7

En este ejemplo se examino la capacidad de mAb anti-CXCR4 F7 para inducir la apoptosis en celulas diferentes. En el ensayo de apoptosis, se incubo el mAb F7 a 10 mg/ml con celulas Ramos (500.000 celulas), celulas Namalwa (500.000 celulas) o celulas R1610 transfectadas para expresar CXCR4 (100.000 celulas). Se usaron celulas R1610 sin transfectar como control negativo. Se incubo el mAb anti-CXCR4 F7 o anticuerpo de control de isotipo con celulas a 37 °C y se tomaron muestras de 250 ml a las 24, 48 y 72 horas. Para evaluar la apoptosis, se incubaron las celulas de distintos puntos de tiempo con anexina V-FITC-FL1 y yoduro de propidio-FL3, seguido por citometna de flujo. El porcentaje combinado de celulas recogidas en FL1, FL3 y los cuadrantes doblemente positivos FL1-FL3 se

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consideraron apoptosicas. Para eliminar el fondo, los porcentajes de celulas apoteoticas inducidas por el anticuerpo de isotipo se restaron del porcentaje de celulas apoptosicas inducidas por el mAb F7.

Los resultados se resumen a continuacion en la Tabla 2:

Tabla 2: Induccion de la apoptosis por el mAb anti-CXCR4 mAb F7

Celulas: Tiempo (horas) % de apoptosis

R1610: 72 <1

R1610-CXCR4: 24 39

R1610-CXCR4: 48 58

R1610-CXCR4: 72 46

Ramos: 24 22

Ramos: 48 31

Ramos: 72 22

Namalwa: 24 17

Namalwa: 48 24

Namalwa: 72 44

Los valores del % de apoptosis total estan corregidos para los cambios del nivel inicial inducidos por los anticuerpos de control de isotipo.

Los resultados demuestran que el mAb F7 es capaz de inducir la apoptosis en celulas Ramos, Namalwa y R1610- CXCR4, mientras que F7 no tuvo efecto sobre la induccion de la apoptosis de celulas R1610 parentales, que indica que la respuesta era especlfica para CXCR4.

Ejemplo 12: Estudios adicionales que muestran la inhibicion de la proliferacion de celulas de tumores solidos in vivo por anticuerpos anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad de anticuerpos humanos anti-CXCR4 para inhibir la proliferacion o inducir la apoptosis de tumores solidos establecidos in vivo usando modelos de celulas tumorales adicionales similares al modelo Ramos descrito en el Ejemplo 9 anterior. Se examinaron varias llneas celulares tumorales. Los experimentos y resultados representativos son los siguientes:

En un experimento, se implantaron 7,5 x 106 celulas MDA-MB231 de cancer de mama humanas/raton en la region del costado de cada raton y se dejaron crecer hasta un tamano medio de 100 mm3, calculado por longitud x anchura x altura/2 de los tumores, que era el dla 7 despues de la implantacion. Los ratones se dividieron de forma aleatoria en grupos de tratamiento diferentes y recibieron una inyeccion intraperitoneal (i.p.) de una primera dosis de anticuerpo el dla 7 despues de la implantacion, recibieron una segunda dosis i.p. de anticuerpo el dla 14 despues de la implantacion y luego recibieron una tercera dosis el dla 46 despues de la implantacion. Se trataron grupos de ratones (n=9) con cualquiera de (i) vehlculo (PBS); (ii) control de isotipo IgG1 (15 mg/kg); (iii) control de isotipo IgG4 (15 mg/kg); (iv) IgG1 F7 (15 mg/kg) o (v) IgG4 F7 (15 mg/kg). Los volumenes tumorales se midieron a intervalos regulares y se determino la media y mediana del volumen tumoral para cada grupo de tratamiento a cada intervalo. Los resultados de este experimento se resumen a continuacion en la Tabla 3, que muestra la media del volumen tumoral (en mm3) y el % de inhibicion del crecimiento tumoral (TGI) el dla 52, y la mediana del volumen tumoral (en mm3) y el % de TGI el dla 59 despues de la implantacion:

Tratamiento: Dla 52 Dla 59

Media: TGI (%) Mediana TGI (%)

Vehlculo: 154 187

Control de isotipo IgG1: 172 216

Control de isotipo IgG4: 188 226

IgG1 anti-CXCR4 F7: 86 50 130 40

lgG4 anti-CXCR4 F7: 79 58 108 52

Adicionalmente, uno de los ratones del grupo de tratamiento IgG4 F7 estuvo libre de tumor el dla 59. Los resultados demuestran que el mAb F7 es capaz de inhibir el crecimiento de celulas MDA-MB231 de cancer de mama in vivo.

En un segundo experimento, se implantaron 5 x 106 celulas DMS79 de carcinoma de pulmon de celulas pequenas humano/raton en la region del costado de cada raton y se dejaron crecer hasta un tamano medio de 160 mm3, calculado por longitud x anchura x altura/2 de los tumores, que fue el dla 7 despues de la implantacion. Los ratones se dividieron de forma aleatoria en grupos de tratamiento diferentes y recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de anticuerpo siguiendo un programa de dosificacion de Q3Dx5 (cinco veces cada tres dlas). Los grupos de ratones (n=10) se trataron con cualquiera de (i) vehlculo (PBS); (ii) control de isotipo lgG4 (10 mg/kg) o (iii) IgG4 F7 (10 mg/kg). Los volumenes tumorales se midieron a intervalos regulares y se determino la media y la mediana del volumen tumoral para cada grupo de tratamiento a cada intervalo. Los resultados de este experimento se resumen a

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continuacion en la Tabla 4, que muestra la media y la mediana del volumen tumoral (en mm3) y el % de inhibicion del crecimiento tumoral (TGI) el dia 34 despues de la implantacion:

Tabla 4: Inhibicion del crecimiento tumoral de celulas DMS79 in vivo i

el mAb F7

: Dia 34

Tratamiento: Media TGI (%) Mediana TGI (%)

Vehiculo: 900 882

Control de isotipo IgG1: 992 903

IgG4 anti-CXCR4 F7: 620 38 599 34

Los resultados demuestran que el mAb F7 es capaz de inhibir el crecimiento de celulas DMS79 de carcinoma de pulmon de celulas pequenas humano in vivo.

Se probaron modelos de tumor de xenoinjerto subcutaneo adicionales para la capacidad de los anticuerpos anti- CXCR4 para inhibir el crecimiento tumoral, en experimentos similares a los descritos anteriormente y en el Ejemplo 9. En un experimento usando celulas SU-DHL-6 de linfoma de linfocitos B, los resultados mostraron que el tratamiento con el mAb IgG4 F7 a 15 mg/kg produjo aproximadamente el 60 % de inhibicion del crecimiento tumoral. Similarmente, en un experimento usando celulas Namalwa de linfoma de Burkitt, los resultados mostraron que el tratamiento con el mAb IgG4 F7 a 3 mg/kg produjo aproximadamente el 70 % de inhibicion del crecimiento tumoral. Por el contrario, no se observo inhibicion del crecimiento tumoral por el mAb F7 en experimentos usando celulas NIH-H226 de carcinoma pulmonar o celulas HPAC de adenocarcinoma pancreatico humano. Sin embargo, la tincion de estas celulas por el mAb F7 en experimentos de citometria de flujo mostro una expresion minima in vitro. Aunque las celulas tumorales in vivo se tineron por el mAb por inmunohistoquimica, no esta claro en que etapa de su crecimiento tumoral empezo a expresarse CXCR4. Esto sugiere que la expresion de CXCR4 por estas dos lineas celulares fue insuficiente para permitir la inhibicion del crecimiento tumoral o la induccion de apoptosis in vivo mediante el tratamiento con anti-CXCR4.

Ejemplo 13: Inhibicion de metastasis pulmonares in vivo por anticuerpos anti-CXCR4

En este ejemplo se examino la capacidad del mAb anti-CXCR4 F7 para inhibir metastasis pulmonares usando un modelo tumoral sistemico de raton C57. Mas especificamente, se inyectaron intravenosamente 0,4 x 106 celulas B16-CXCR4 (celulas B16 transfectadas para expresar CXCR4 humano) en cada uno de los 30 ratones de la cepa C57. Los ratones se dividieron de forma aleatoria en tres grupos de diez ratones cada uno, que a continuacion se trataron con cualquiera de (i) vehiculo (PBS); (ii) control de isotipo IgG4 (5 mg/kg) o (iii) F7 lgG4 (5 mg/kg). El anticuerpo o vehiculo se inyecto intraperitonealmente 30 minutos despues de que se inyectaran las celulas B16- CXCR4 intravenosamente. Se recogieron los pulmones el dia 14 y se cuantifico el numero de nodulos de metastasis pulmonares. Los resultados se resumen a continuacion en la Tabla 5, que muestra la media y la mediana del numero de metastasis pulmonares en cada grupo:

Tabla 5: Inhibicion de metastasis pulmonares in vivo por el mAb F7

Tratamiento

Numero de metastasis pulmonares: % de inhibicion de metastasis pulmonares (media)

: Media Mediana

Vehiculo: 364 397

Control de isotipo IgG4: 309 294 15 %

IgG4 anti-CXCR4 F7: 157 186 56 %

Los resultados muestran que el tratamiento con el mAb F7 condujo a una reduction en el numero medio de nodulos de metastasis pulmonares del 56 %, mientras que la reduccion fue solo del 15 % con el anticuerpo de control de isotipo, que demuestra que el mAb F7 es capaz de inhibir metastasis pulmonares en un modelo tumoral sistemico.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MEDAREX, INC.

<120> ANTICUERPOS HUMANOS QUE SE UNEN A CXCR4 Y USOS DE LOS MISMOS

<130> MXI-375PC

<140>

<141>

<150> 60/827.851 <151 >

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<160> 53

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Ser Tyr Ser Met Asn 1 5

<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 2

Ser Tyr Ser Met Asn 1 5

<210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 3

Ser Tyr Ser Met Asn. 1 5

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

Ser Tyr Ser Met Asn 1 5

<210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tyr IIe Ser Ser Arg Ser Arg Ser lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 7

Tyr lie Ser Ser Arg Ser Lys Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>8

Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400>9

Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15

<210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 10

Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15

<210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 11

Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15

<210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 15 10 15

<210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 13

Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 14

Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 15

Arg Thr Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp Leu Ala 15 10

<210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 16

Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Trp Leu Ala 15 10

<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 17

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5

<210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 18

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5

<210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

<400> 19

<210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25 <211 > 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5

Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5

5

10

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 26 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 26

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Ser lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 27 <211 > 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

Glu Val 1

Ser Leu

Ser Met

Ser Tyr 50

Lys Gly 65

Leu Gin

Ala Arg

Asp Val

<210> 28 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 28

Glu: Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

1: 5 10 15

Ser: Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr



: 20 25 30

Ser: Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val


: 35 40 45

Ser: Tyr He Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

: 50 55 60

Lys: Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65: 70 75 80

Leu: Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys




: 85 90 95

Ala: Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met



: 100 105 110

Asp: Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 29 <211 > 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 29

Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

lie Ser Ser Arg Ser Lys Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 55 60

Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

5

10

Ala lie Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105

<210> 30 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 30

Glu 1: lie Val Leu Thr 5 Gin

Asp: Arg Val Thr 20 lie Thr

Leu: Ala Trp 35 Tyr Gin Gin

Tyr: Ala 50 Ala Ser Ser Leu

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp 70

Glu: Asp Phe Ala Thr 85 Tyr

Thr: Phe Gly Gin 100 Gly
Thr

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp

25 30

Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 40 45

Gin Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 55 60

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg

90 95 ’

Lys Val Glu lie Lys

105 "

<210> 31 <211 > 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 31

Val 1: He Trp Val

Asp: Arg Val Thr 20

Leu: Ala Trp 35 Tyr

Tyr: Ala 50 Ala Ser

Ser 65: Gly Ser Gly

Glu: Asp Phe Ala

Thr: Phe Gly Gin 100

Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser

5 10

lie Thr Cys Arg Thr Ser Gin Gly

25

Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro

~ 40 “

Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser

55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 70 75

Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn

85 90

Gly Thr Lys Val Glu lie Lys

105

Ala: Ser Val 15 Gly

lie: Ser 30 Ser Trp

Glu 45: Leu Leu lie

Arg: Phe Ser Gly

Ser: Leu Gin Pro 80

Ser: Tyr Pro 95 Arg

<210> 32 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 32

10

15

Glu 1: lie Val Leu Thr 5 Gin

Asp: Arg Val Thr 20 lie Thr

Leu: Ala Trp 35 Tyr Gin Gin

Tyr: Ala 50 Ala Ser Ser Leu

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp 70

3: Asp Phe Ala Thr 85 Tyr

Thr: Phe Gly Gin 100 Gly
Thr

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Trp * ~ 25 30

Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 40 45

Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60 "

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 90 95

Lys Val Glu lie Lys 105

<210> 33 <211 > 375 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(375)

5

10

cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

tcc ctg aga etc tcc tgt gca gcc get gga ttc acc ttc agt age tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

age atg aac tgg gtc ego cag get oca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt 144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

tea tac att agt agt aga agt aga acc ata tac tac gca gac tct gtg 192

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat gcc aag aac tea ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

ctg caa atg aac age ctg aga gac gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

geg aga gat tac ggt ggt caa ccc cct tac tac tac tac tac ggt atg 336

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

gac gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea 375

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 34 <211> 375 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(375)

<400> 34

5

10

cag gtg cag ctg gtg cag tot ggg gga ggc ttg

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu

15 10

tcc ctg aga etc tcc tgt gca gcc get gga ttc

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe

20 25

age atg aac tgg gtc ege cag get cca ggg aag

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys

35 40

tea tac att agt agt aga agt aga age ata tac

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Ser lie Tyr

50 55

aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat gcc

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala

65 70 75

ctg caa atg aac age ctg aga gac gag gac aeg

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr

85 90

geg aga gat tac ggt ggt caa ccc cct tac tac

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr

100 105

gta: cag cct ggg ggg

Val: Gin Pro Gly 15 Gly

acc: ttc agt age tat

Thr: Phe Ser 30 Ser Tyr

ggg: ctg gag tgg gtt

Gly: Leu 45 Glu Trp Val

tac: gca gac tet gtg

Tyr Ala 60: Asp Ser Val

aag: aac tea ctg tac

Lys Asn: Ser Leu Tyr 80

get: gtg tat tac tgt

Ala: Val Tyr Tyr 95 Cys

tac
tac
tac: ggt atg

Tyr
Tyr: Tyr 110 Gly Met

48

96

144

192

240

288

336

gac gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea 375

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 35 <211> 375 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(375)

<400> 35

5

10

gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

10

15

48

tcc ctg aga etc tcc tgt gca gcc get gga ttc acc ttc agt age tat Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20

25

30

96

age atg aac tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt 144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35

40

45

tea tac att agt agt cgt agt aaa acc ata tac tac gca gac tct gtg 192

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Lys Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50

55

60

aag ggc ega ttc acc ate tcc aga gac aat gcc agg aac tea ctg tat Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ser Leu Tyr

65

70

75

80

240

Ctg caa atg aac age Ctg aga gac gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85

90

95

geg aga gat tac ggt ggt caa ccc cct tac tac tac tac tac ggt atg 336

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100

105

110

gac gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tcc tea Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 36 <211> 375 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(375)

120

125

375

<400> 36

gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48

Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15

5

10

tcc ctg aga etc tee tgt gca gee get gga ttc ace ttc agt age tat 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

age atg aac tgg gtc ege cag get cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtt 144

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

tea tac att agt agt aga agt aga ace ata tac tac gca gac tet gtg 192

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc ega ttc ace ate tec aga gac aat gee aag aac tea ctg tat 240

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Ctg caa atg aac age Ctg aga gac gag gac aeg get gtg tat tac tgt 288

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95 ~

geg aga gat tac ggt ggt caa ccc cct tac cac tac tac tac ggt atg 336

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr His Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

gac gtc tgg ggc caa ggg acc aeg gtc acc gtc tec tea 375

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 37 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(321)

<400> 37

5

10

gcc ate egg atg ace cag tet cca tee tea ctg tet gca tet gta gga Ala lie Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10

15

gae aga gte ace ate act tgt egg geg agt eag ggt att age age tgg Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp

20 25 30

96

tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tee Ctg ate Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Ly$ Ser Leu lie 35 40 45

144

tat get gca tee agt ttg caa agt ggg gte cca tea agg ttc age ggc Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly * 50 55 60

192

agt gga tet ggg aca gat ttc act etc ace ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65 70 75 80

240

gaa gat ttt gta act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cct egg Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 ’

288

aeg ttc ggc caa ggg ace aag gtg gaa ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys

321

100

105

<210> 38 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(321)

<400> 38

gaa att gtg etc Glu lie Val Leu 1

gac aga gtc acc Asp Arg Val Thr 20

tta gec tgg tat Leu Ala Trp Tyr 35

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agt gga tet ggg Ser Gly Ser Gly 65

gaa gat ttt gca Glu Asp Phe Ala

aeg tte gge caa Thr Phe Gly Gin 100

<210> 39 <211> 321

5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

10 <222> (1)..(321)

<400> 39

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Val 1: He Trp Val

gac: aga gtc acc

Asp: Arg Val Thr 20

tta: gee tgg tat

Leu: Ala Trp 35 Tyr

tat: get gca tee

Tyr: Ala 50 Ala Ser

ace: cag tet cca tee tea etg

Thr 5: Gin Ser Pro Ser Ser 10 Leu

ate: act tgt egg geg agt cag

lie: Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gin

cag
cag: aaa cca gag aaa gee

Gin
Gin: Lys Pro 40 Glu Lys Ala

agt: ttg Caa agt ggg gtc Cca

Ser: Leu Gin 55 Ser Gly Val Pro

aca: gat tte act etc acc ate

Thr: Asp 70 Phe Thr Leu Thr lie 75

act: tat tac tge Caa cag tat

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5 10

ate act tgt egg aeg agt cag

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cag cag aaa cca gag aaa gee

Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala

40 "

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Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro

55

tet gca tet gta gga 48

Ser Ala Ser Val Gly

15

ggt att age age tgg 96

Gly lie Ser Ser Trp

30

cct aag tee etg ate 144

Pro Lys Ser Leu lie

45

cca agg tte age gge 192

Pro Arg Phe Ser Gly

60 ’

age age etg cag cct 240

Ser Ser Leu Gin Pro

80

aat agt tac cct egg 288

Asn Ser Tyr Pro Arg

” 95 ’

321

tet Ser: gca Ala tet Ser gta Val 15 gga Gly 48

ggt Gly: att lie age Ser 30 age Ser tgg Trp 96

cct Pro: gag Glu 45 etc Leu etg Leu ate lie 144

tea Ser 60: agg Arg tte Phe age Ser gge Gly 192

agt

Ser

65

gaa

Glu

acg

Thr

gga: tct ggg aca gat ttc act etc acc ate

Gly: Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie




: 70 75

gat: ttt gca act tat tac tgc caa cag tat

Asp: Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr



: 85 90

ttc: ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa

Phe: Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys

age
age: etg cag cct

Ser
Ser: Leu Gin Pro 80

aat: agt tac cct egg

Asn: Ser Tyr Pro 95 Arg

288

321

100

105

10

<210> 40 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(321)

<400> 40

15

gaa: att gtg etc acc cag tct cca tee tea ctg tct gca tct gta ggg

Glu: lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1: 5 10 15

gac: aga gtc acc ate act tgt egg geg agt cag ggt att age aac tgg

Asp Arg: Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Asn Trp



: 20 25 30

tta: gee f+ 03 ig tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate

Leu: Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie


: 35 40 45

tat: get gca tee agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc age ggc

Tyr: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

: 50 55 60

agt: gga tct ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct

Ser: Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

65: 70 75 80

gaa: gat ttt geg act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac cct egg

Glu: Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg




: 85 90 95

acg: ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa

Thr: Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys



: 100 105

48

96

144

192

240

288

321

<210> 41 <211 > 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

Glu 1: Val Gin Leu Val 5

Ser: Leu Arg Leu 20
Ser

Ser: Met Asn 35 Trp Val

Ser: Tyr 50 He
Ser
Ser

Lys 65: Gly Arg Phe Thr

Leu: Gin Met Asn Ser 85

Ala: Arg Asp Tyr 100 Gly

Asp: Val Trp Gly 115 Gin

Glu Ser Gly Gly Gly 10

Cys Ala Ala Ala Gly 25

Arg Gin Ala Pro Gly 40

Arg Ser Arg Thr lie

~ 55 '

lie Ser Arg Asp Asn 70 '

Leu Arg Asp Glu Asp

90

Gly Gin Pro Pro Tyr 105 ~

Gly Thr Thr Val Thr 120

Leu: Val Gin Pro Gly 15 Gly

Phe: Thr Phe Ser 30 Ser Tyr

Lys: Gly Leu 45 Glu Trp Val

Tyr: Tyr 60 Ala Asp Ser Val

Ala 75: Lys Asn Ser Leu Tyr 80

Thr: Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Tyr
Tyr
Tyr: Tyr 110 Gly Met

Val: Ser Ser 125

<210> 42 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 42

10

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 15 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ala Gly

20 25

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 35 40

Ser Tyr lie Ser Ser Arg Ser Arg Ser lie 50 55

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn 65 70

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp 85 90

Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Gin Pro Pro Tyr 100 105

Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr 115 120

<210> 43 <211 > 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

Leu: Val Gin Pro Gly 15 Gly

Phe: Thr Phe Ser 30 Ser Tyr

Lys: Gly Leu 45 Glu Trp Val

Tyr: Tyr 60 Ala Asp Ser Val

Ala 75: Lys Asn Ser Leu Tyr 80

Thr: Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Tyr
Tyr
Tyr: Tyr 110 Gly Met

Val: Ser Ser 125

<400> 43

5

10

imagen1

<210> 44 <211> 125 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 44

imagen2

<210> 45 <211 > 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 45

Asp 1: He Gin Met Thr 5 Gin

Asp: Arg Val Thr 20 lie Thr

Leu: Ala Trp 35 Tyr Gin Gin

Tyr: Ala 50 Ala Ser Ser Leu

Ser: Gly Ser Gly Thr Asp

65: 70

Glu: Asp Phe Val Thr 85 Tyr

Thr: Phe Gly Gin 100 Gly
Thr

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp 25 30

Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 40 45

Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro

75

80

Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 90 95 ’

Lys Val Glu lie Lys * 105 ^

<210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 46

10

Asp 1: lie Gin Met Thr 5 Gin

Asp: Arg Val Thr 20 lie Thr

Leu: Ala Trp 35 Tyr Gin Gin

Tyr: Ala 50 Ala Ser Ser Leu

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp 70

Glu: Asp Phe Ala Thr 85 Tyr

Thr: Phe Gly Gin 100 Gly
Thr

Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Ser Ser Trp

25 30

Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie " 40 45

Gin Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 55 60

Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 75 80

Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg

90 95 ’

Lys Val Glu lie Lys

105

15

<210> 47 <211 > 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

5

10

15

Asp: He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu

1: 5 10

Asp: Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Thr Ser Gin



: 20 25

Leu: Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala


: 35 40

Tyr: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro

: 50 55

Ser: Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie

65: 70 75

Glu: Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr




: 85 90

Thr: Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys



: 100 105

<210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 48

Asp: lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu

1: 5 10

Asp: Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin



: 20 25

Leu: Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Lys Ala


: 35 40

Tyr: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro

: 50 55

Ser: Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie

65: 70 75

Glu: Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr




: 85 90

Thr: Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys



: 100 105

<210> 49 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens

Ser Ala Ser Val Gly 15

Gly lie Ser Ser Trp

~ 30

Pro Glu Leu Leu lie 45

Ser Arg Phe Ser Gly 60 ^

Ser Ser Leu Gin Pro

80

Asn Ser Tyr Pro Arg 95

Ser Ala Ser Val Gly 15

Gly lie Ser Asn Trp 30

Pro Lys Ser Leu lie 45

Ser Arg Phe Ser Gly 60

Ser Ser Leu Gin Pro 80

Asn Ser Tyr Pro Arg 95

5

10

15

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Tyr lie Ser Ser Ser Ser Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg

<210> 50 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 50

Asp: He Gin Met Thr Gin Ser Pro

1: 5

Asp: Arg Val Thr 20 lie Thr Cys Arg

Leu: Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40

Tyr: Ala 50 Ala Ser Ser Leu Gin 55 Ser

Ser 65: Gly Ser Gly Thr Asp Phe 70 Thr

Glu: Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

Ala 25: Ser Gin Gly lie Ser 30 Ser Trp

Glu: Lys Ala Pro Lys 45 Ser Leu lie

Gly Val: Pro Ser 60 Arg Phe Ser Gly

Leu: Thr lie Ser 75 Ser Leu Gin Pro 80

Gin: Gin 90 Tyr Asn Ser Tyr Pro 95

<210> 51 <211 > 352 <212> PRT <213> Homo sapiens

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

1. Un anticuerpo monoclonal o una porcion de union al antlgeno del mismo que se unen especlficamente a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular y que comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % identica a la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 49 codificada por un gen de inmunoglobulina de la llnea germinal Vh 3-48 humana y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 90 % identica a la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 50 codificada por un gen de inmunoglobulina de la llnea germinal Vk L15 humana, en donde dichos anticuerpo monoclonal o porcion de union al antlgeno del mismo inducen la apoptosis en celulas que expresan CXCR4 humano e inhiben el crecimiento y/o inducen la apoptosis de celulas tumorales CXCR4+ in vivo.
2. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de la reivindicacion 1 que comprenden:

(a) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 1 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 5 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 9; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 13 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 17 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; y una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 21 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma;

(b) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 2 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 6 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 10; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 14 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 18 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; y una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 22 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma;

(c) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 3 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 7 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 11; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 15 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 19 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; y una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 23 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; o

(d) una region variable de la cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 4 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 8 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 12; una region variable de la cadena ligera CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 16 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; una region variable de la cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 20 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma; y una region variable de la cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 24 o una sustitucion de aminoacidos conservativa de la misma.
3. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de la reivindicacion 2 que comprenden:

(a) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 80 % homologa a la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 25 o 41, y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen una secuencia que es al menos el 80 % homologa a la secuencia expuesta en sEq ID N°: 29 o 45;

(b) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 26 o 42 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma, y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 30 o 46 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma;

(c) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

SEQ ID N°: 27 o 43 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma, y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 31 o 47 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma; o

(d) una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 28 o 44 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma, y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 32 o 48 o una secuencia al menos el 80 % homologa a la misma.
4. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de la reivindicacion 2 que comprenden:

(a) una region variable de la cadena pesada que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 26 y una region variable de la cadena ligera que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 30;

(b) una region variable de la cadena pesada que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 27 y una region variable de la cadena ligera que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 31; o

(c) una region variable de la cadena pesada que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 28 y una region variable de la cadena ligera que consiste en aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 32.
5. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 que

(a) inhiben la union de SDF-1 a CXCR4 humano;

(b) inhiben el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 humano;

(c) inhiben la migracion de celulas inducida por SDF-1 que expresan CXCR4 humano; y/o

(d) inhiben la formation de tubos capilares por celulas endoteliales de la vena umbilical humana;

(e) inhiben la metastasis de celulas tumorales CXCR4+;

(f) aumentan el tiempo de supervivencia de un sujeto que tiene un tumor CXCR4+;

(g) son de un isotipo IgG 1 o IgG4 o una porcion de union al antlgeno del mismo; y/o

(h) son un anticuerpo quimerico, humanizado o humano, o una porcion de union al antlgeno del mismo.
6. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que

(a) se unen a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular con una Kd de 1 x 10"8 M o menos;

(b) se unen a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular con una Kd de 5 x 10"9 M o menos;

(c) inhiben la union de SDF-1 a CXCR4 humano con una CE50 de 50 nM o menos;

(d) inhiben el flujo de calcio inducido por SDF-1 en celulas que expresan CXCR4 humano con una CE50 de 3 nM o menos; y/o

(e) inhiben la migracion de celulas inducida por SDF-1 que expresan CXCR4 humano con una CE50 de 50 nM o menos.
7. El anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo de longitud completa.
8. La porcion de union al antlgeno de anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha porcion de union al antlgeno es un fragmento F(ab')2 bivalente.
9. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, unido a un agente terapeutico tal como una citotoxina o un isotopo radiactivo.
10. Una molecula biespeclfica que comprende el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, unido a un segundo resto funcional que tiene una especificidad de union diferente que dichos anticuerpo monoclonal o porcion de union al antlgeno del mismo.
11. Una composition que comprende:

(a) el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 18;

(b) el inmunoconjugado de la reivindicacion 9; o

(c) la molecula biespeclfica de la reivindicacion 10; y

un vehlculo farmaceuticamente aceptable.
12. Un acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de

5

10

15

20

25

30

35

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65

cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o un vector de expresion que comprende el acido nucleico.
13. Una celula huesped que comprende el vector de expresion de la reivindicacion 12.
14. Un metodo de preparacion de un anticuerpo anti-CXCR4 o una porcion de union al antlgeno del mismo que comprende expresar el anticuerpo o una porcion de union al antlgeno del mismo en la celula huesped de la reivindicacion 13 y aislar el anticuerpo o una porcion de union al antlgeno del mismo de la celula huesped.
15. Un metodo in vitro de modulacion de la actividad de CXCR4 en una celula que expresa el receptor CXCR4, que comprende poner en contacto la celula con el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 de forma que se module la actividad de CXCR4 en la celula.
16. El metodo de la reivindicacion 15, en el que

(a) la celula es una celula tumoral que expresa CXCR4 y el metodo produce la inhibicion de crecimiento de dicha celula tumoral; o

(b) la celula es un linfocito T que expresa CXCR4 y el metodo produce la inhibicion de la entrada del VIH en la celula.
17. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en un metodo terapeutico de:

(a) modular la actividad de CXCR4 en una celula de un sujeto;

(b) inhibir el crecimiento o la metastasis de una celula tumoral en un sujeto, opcionalmente en donde la celula tumoral se elige de una celula de una leucemia de linfocitos B, un linfoma, una leucemia linfoblastica aguda, una leucemia mieloide aguda, un carcinoma de pulmon de celulas pequenas, un cancer de pulmon de celulas no pequenas, un cancer de mama, un cancer de ovario, un cancer de prostata, un cancer pancreatico, un cancer de tiroides, un carcinoma nasofarlngeo, un melanoma, un carcinoma de celulas renales, un neuroblastoma, un glioblastoma, un rabdomiosarcoma, un cancer colorrectal, un cancer de rinon, un osteosarcoma y un cancer de pulmon metastasico;

(c) inhibir la entrada del VIH en un linfocito T en un sujeto, en donde dicho VIH usa CXCR4 como co-receptor para la entrada en el linfocito T;

(d) inhibir la inflamacion en un sujeto afectado de un trastorno inflamatorio;

(e) inhibir la angiogenesis en un sujeto; o

(f) estimular la movilizacion de celulas madre CD34+ de medula osea a sangre periferica en un sujeto, opcionalmente en donde el metodo comprende ademas recoger las celulas madre CD34+ de la sangre periferica.
18. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso, en combinacion con otro agente terapeutico, en un metodo de tratamiento de cancer en un sujeto.
19. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 18, en donde el otro agente terapeutico es un anticuerpo que se une a CTLA-4, PD-1 o PD-L1.
20. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 18, en donde el cancer es un cancer pancreatico o un carcinoma de pulmon de celulas pequenas.
21. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 18, en donde el otro agente terapeutico es un anticuerpo que se une a PD-1.
22. Un anticuerpo monoclonal o una porcion de union al antlgeno del mismo que se unen especlficamente a CXCR4 humano expresado sobre una superficie celular para su uso, en combinacion con otro agente terapeutico, en un metodo de tratamiento de cancer en un sujeto, en donde el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 1; una cadena pesada CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 5; una cadena pesada CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 9; una cadena ligera cDR1 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 13; una cadena ligera CDR2 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 17; y una cadena ligera CDR3 que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 21.
23. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 22, en donde el anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo comprenden una region variable de la cadena pesada que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 25 y una region variable de la cadena ligera que comprende aminoacidos que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID N°: 29.
24. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 22 o la reivindicacion 23, en donde el otro agente terapeutico es un anticuerpo que se une a CTLA-4, PD-1 o PD-L1.
25. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 22 o la reivindicacion 23, en donde el cancer es un cancer pancreatico o un carcinoma de pulmon de celulas pequenas.
26. El anticuerpo monoclonal o la porcion de union al antlgeno del mismo para su uso segun la reivindicacion 22 o la 5 reivindicacion 23, en donde el otro agente terapeutico es un anticuerpo que se une a PD-1.

imagen1

Segmento V: L15

Segmento J: JK1

AIRMTQS PSSLSASVGDR 1 GCC ATC CGG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

CDRl

VTITCRASQGISSWLAWY 55 GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT

CDR2

QQKPEKAPKSLIYAASSL 109 CAG CAG AAA CCA GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT TTG

CDR2

qsgvpsrfsgsgsgtdft

163 CAA AGT GGG GTC CCA TCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT

CDR3

LTISSLQPEDFVTYYCQQ 217 CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GTA ACT TAT TAC TGC CAA CAG

CDR3

YNSYPRTFGQGTKVE IK 271 TAT AAT AGT TAC CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA

FIGURA IB

Segmento V: Segmento D: Segmento J:

3- 48 4- 23 JH6b

Q V 0 L V Q S G

1

CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG

R L S C A A A G

55

AGA CTC TCC TGT GCA GCC GCT GGA

V R Q A P G K G

109

GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG

CDR2

SRSIYYAD

163

AGT AGA AGC ATA TAC TAC GCA GAC

D N A K N S L Y

217

GAC AAT GCC AAG AAC TCA CTG TAC

T A V Y Y C A R

271

ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA

CDR3

Y Y G M D V W G

325

TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC

FIGURA

GGLVQPGGSL GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG

CDR1

FTFSSYSMNW TTC ACC TTC AGT AGC TAT AGC ATG AAC TGG

CDR2

LEWVSYI SSR CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT AGA

SVKGRFTISR TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA

LQMNSLRDED CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GAC GAG GAC

CDR3

DYGGQPPYYY GAT TAC GGT GGT CAA CCC CCT TAC TAC TAC

QGTTVTVSS CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

2A

Segmento V: L15

Segmento J: JK1

EIVLTQSPSSLSASVGDR 1 GAA ATT GTG CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCA CTG TCT GCA TCT GTA GGA GAC AGA

CDR1

VTITCRASQG ISSWLAWY 55 GTC ACC ATC ACT TGT CGG GCG AGT CAG GGT ATT AGC AGC TGG TTA GCC TGG TAT

CDR2

QQKPEKAPKSLIYAASSL 109 CAG CAG AAA CCA GAG AAA GCC CCT AAG TCC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT TTG

CDR2

QSGVP PRFSGSGSGTDFT 163 CAA AGT GGG GTC CCA CCA AGG TTC AGC GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT

CDR3

LTISSLQPEDFATYYCQQ 217 CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGC CAA CAG

CDR3

ynsyprtfgqgtkveik

271 TAT AAT AGT TAC CCT CGG ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA

FIGURA 2B

imagen2

imagen3

Segmento V: Segmento D: Segmento J:

3- 48 4- 0. JH6b

E V Q L V Q S G

1

GAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG

R L S C A A A G

55

AGA CTC TCC TGT GCA GCC GCT GGA

V R 0 A P G K G

109

GTC CGC CAG GCT CCA GGG AAG GGG

CDR2

S R T I Y Y A D

163

AGT AGA ACC ATA TAC TAC GCA GAC

D N A K N S L Y

217

GAC AAT GCC AAG AAC TCA CTG TAT

T A V Y Y C A R

271

ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA

CDR3

Y Y G M D V W G

325

TAC TAC GGT ATG GAC GTC TGG GGC

FIGURA

GGLVQPGGSL GGA GGC TTG GTA CAG CCT GGG GGG TCC CTG

CDRl

FTFSSYSMNW TTC ACC TTC AGT AGC TAT AGC ATG AAC TGG

CDR2

LEWVSYISSR CTG GAG TGG GTT TCA TAC ATT AGT AGT AGA

SVKGRFTISR TCT GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA

LQMNSLRDED CTG CAA ATG AAC AGC CTG AGA GAC GAG GAC

CDR3

DYGGQPPYHY GAT TAC GGT GGT CAA CCC CCT TAC CAC TAC

QGTTVTVSS CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA

4A

imagen4

imagen5

Region VK del Fab anti-CXCR4 FI ,

____m____

Lines germinal 115 3 i q w t Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q GIS $

F1U A - R...............................................................

F7GL VK ......................................................................

_ _______

Lines germinsl U5WLAWYQQKPSKAPKSLIYAASSIQSGVPSRF

F? VK ......................................................................

P7GL vk ......................................................................

_CER3_

Lines germinsl L15 S6S6SGTDFTLTISSLQPEDFATYYC o"o Y B S

F7 VK ...............................................V....................

F7GL VK ............................................. V ...................

Lines germinsl L15 y p

Lines germinsl JK1 TFGQGTKV3IK

in - -R.........................(JKl)

F1GLVK - • R.........................(JI1)

FIGURA 5B

Region VI del Fib anti-001 FS

_OT1_

liinjemalJ-ll EjJlVESCCCLVOPGGSLRLSClSSCFTFSSySHM

F) VI {--0..............A........

FSGl VH .................. A ........

C®

Liui 3-il VKQi?GKGLBIfVSTISSSSSTIYYi.DSV/:<GRPTISE

FS1 ............R - R 3...........

MVS ............R - R S...........

luajKiumiwi DutlStIt5HISLSD!DUVI!CIII

Linea germinal JH6b Y Y Y

FS VH ....................CYGGQPP - - -

F9GL VH ....................D Y G G Q ? P - - -

_0R3__

Lines germinal JH6b H (I N D H G Q G " T V T V S 3

FS VH ............(JH6b

FSGl VH ............iJHBl

fiotasa

____mi____

lirajemiiuiUS DIQNTQSFSSLSASV6DKVT1TCKA3Q6IS3

F31 £ - V L........................................................

F35L VK .......................................................................

__ __CD52__

L“ 5*““1115 »L A1U 0 QIP E It J H S L H A A S S15 S G V P S R P

F91 ..........................................................? • •

F9GL VK ................................................................

_CD5]_

iim*jimiulUS SGSJSGTDJTLTISSLQPEDFftTYICQQYBS

H VE ................................................................................................

F9GL W .......................................................................

imagen6

FIGOEA 6B

imagen7

CDJ?1

Linea germinal L15 DIQMTQ3P3SLSASVGDRVTITCRASQGISS

D1 VK V • W V............................. • T...........

DlGL VI ‘ * * " ■' * ..................................

CI2

Linea germinal L15 W L A W Y Q Q K P S UP K 3 l IY US $ L Q 3 G V P 5 P F

D1 VK ...........................EL....................................

DlGL VK ...........................EL....................................

_CDJ?J_

Linea germinal L15 SGSG3GTDFTLTISSLQFEDFATYYCQQYNS

D1 VK .............................................................................................

DlGL VK .........................

_CDR3_

Linea germinal L15 y p

Linea germinal JK1 TFGQGTXVEIK

D1 VK - • R................................!JKi|

OIGIVK - • R................................(JT|

FIGDSA 7B

imagen8

___________________

DIQNTQSESSLSASVGDRVTITCRASQGISS

E • V L.....................................................If

..............................................................N

___ _£H2___

LineagerminalL15 WLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSEF

E2 VK ................................................................

E2GL VK' ................................................................

Linea germinal 115 g G S G S G T B P T L TIS S L Q ? E D F A T Y Y C Q |) Y E S

E2 VR .............................................*.................

E2GL I .................................................................

_CDR3.

Linea germinal L15 y p

Limi geainal JKl TFGQGTKVEIK

E2 VK ■ - 8......................(JK1)

■ I • • 8.......................(JR1)

FIGORA 8B

Linea germinal L15

E2 VK E2GLVK

imagen9

imagen10

CPM

□ F7 A F9 V E2

□ D1

0 Control de isotipo

imagen11

Figura 11

imagen12

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Ensayo de prolif eracion de 72 hi de Ramos

imagen15

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