[go: up one dir, main page]

EA018836B1 - Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение - Google Patents

Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA018836B1
EA018836B1 EA200900424A EA200900424A EA018836B1 EA 018836 B1 EA018836 B1 EA 018836B1 EA 200900424 A EA200900424 A EA 200900424A EA 200900424 A EA200900424 A EA 200900424A EA 018836 B1 EA018836 B1 EA 018836B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
amino acid
variable region
acid sequence
antibody
human
Prior art date
Application number
EA200900424A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900424A1 (ru
Inventor
Мишель Кунэ
Петер Брамс
Дон М. Танамачи
Алан Корман
Джозефин М. Кардарелли
Original Assignee
Медарекс, Л.Л.К.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39402166&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA018836(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Медарекс, Л.Л.К. filed Critical Медарекс, Л.Л.К.
Publication of EA200900424A1 publication Critical patent/EA200900424A1/ru
Publication of EA018836B1 publication Critical patent/EA018836B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

В данном изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, которые специфично связываются с CXCR4 с высоким сродством, конкретно человеческие моноклональные антитела. Также предлагаются молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела в соответствии с данным изобретением, векторы экспрессии, клетки-хозяева и способы экспрессии антител в соответствии с данным изобретением. Также предлагаются иммуноконъюгаты, молекулы с двойной специфичностью и фармацевтические композиции, содержащие антитела в соответствии с данным изобретением. В данном изобретении также предлагаются способы обнаружения CXCR4, а также способы лечения различных видов рака, воспалительных расстройств и ВИЧ-инфекции с применением анти-CXCR4 антитела в соответствии с данным изобретением.

Description

Хемокины - это семейство приблизительно из 50 белков небольшого размера, которые модулируют направленную миграцию клеток и ангиогенез, а также играют существенную роль в микроокружении опухоли (Уюап, А.Р. апй Саих, С. (2002) Су1о1йпс Сго\\111 Рас1ог Вес. 13:143-154). В зависимости от их структуры хемокины классифицированы как хемокины С-С (содержащие мотив цистеин-цистеин) или хемокины С-Х-С (содержащие мотив цистеин-Х-цистеин). Таким образом, рецепторы, которые связываются с такими хемокинами, классифицированы как члены семейства ССЯ или семейства СХСЯ соответственно. Один из членов семейства СХСЯ - это СХСЯ4, рецептор, связанный с семью трансмембранными О-протеинами, который в основном экспрессируется на лимфоцитах и который активизирует хемотаксис. СХСЯ4 связывается с хемокином СХСЬ12 (8ΌΡ-1).
СХСЯ4 играет роль в эмбриогенезе, гомеостазе и воспалении. Исследования на мышах с искусственно вызванным дефицитом СХСЯ4 или 8ΌΡ-1 показывают вовлечение пути СХСК4/8ЭР-1 в васкуляризацию органов, а также в иммунные и гемопоэтические системы (ТасЫЬапа, К. с! а1. (1998) Ыа1иге 393:591-594). Кроме того, показано, что СХСЯ4 функционирует как корецептор для Т-лимфотропных штаммов ВИЧ-1 (Репд, Υ. е! а1. (1996) 8с1епсе 272:872-877). Также показано, что СХСЯ4 экспрессируется на широком спектре видов раковых клеток. Дополнительно показано, что путь СХСК4/8ЭР-1 вовлечен в стимуляцию метастатического процесса во многих видах новообразований (Мигрйу, Р.М. (2001) N. Епд1. 1. Мей. 345:833-835). Например, показано, что СХСЯ4 и 8ΌΡ-1 опосредуют специфический для органа метастаз, создавая хемотаксический градиент между участком первичной опухоли и участком метастаза (Ми11ег, А. е! а1. (2001) №11иге 410:50-56; Мигакатц Т. е! а1. (2002) Сапсег Яе§. 62:7328-7334; Напайап, Ό. е! а1. (2003) Сапсег Яе§. 63:3005-3008).
Сущность изобретения
В данном изобретении предлагаются выделенные моноклональные антитела, в частности человеческие моноклональные антитела, которые связываются с человеческим СХСЯ4 и которые демонстрируют многочисленные желательные свойства. Такие свойства включают способность связываться с природным человеческим СХСЯ4, экспрессированным на поверхности клетки, способность ингибировать связывание 8ΌΡ-1 с человеческим СХСЯ4, способность ингибировать индуцированный 8ΌΡ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСЯ4, способность ингибировать индуцированную 8ΌΡ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСЯ4, способность ингибировать образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека (НиУЕС), способность индуцировать апоптоз в клетках, экспрессирующих СХСЯ4, способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток ш νίΐτο, способность ингибировать пролиферацию опухолевых клеток ш νίνο, способность ингибировать метастазы СХСЯ4+ опухолевых клеток и/или способность увеличивать продолжительность жизни субъекта с СХСЯ4' опухолью.
В одном аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело связывается с природным человеческим СХСЯ4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В одном варианте антитело также ингибирует связывание 8ΌΡ-1 с человеческим СХСЯ4, предпочтительно с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или меньше, или 30 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше, или 10 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 3 нМ или меньше (например, ЕС50 для ингибирования 28,60 нМ или меньше, или 12,51 нМ или меньше, или 2,256 нМ или меньше). В другом варианте антитело связывается с природным человеческим СХСЯ4, экспрессирующимся на поверхности клетки, но не ингибирует связывания 8ΌΡ-1 с человеческим СХСЯ4. В других вариантах антитело также ингибирует индуцированный 8ΌΡ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСЯ4, предпочтительно с ЕС50 для ингибирования 3 нМ или меньше, или 2 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше, или 0,9 нМ или меньше, или 0,8 нМ или меньше, или 0,7 нМ или меньше, или 0,6 нМ или меньше, или 0,5 нМ или меньше, или 0,4 нМ или меньше (например, 0,9046 нМ или меньше, 0,5684 или меньше, или 0,3219 нМ или меньше). В других вариантах антитело также ингибирует индуцированную 8ΌΡ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСЯ4, предпочтительно с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или меньше, или 30 нМ или меньше, или 20 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше (например, 18,99 нМ или меньше, или 12,44 или меньше). В других вариантах антитело также ингибирует образование НиУЕС капиллярных трубочек, индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих СХСЯ4, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток ш νίΐτο, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток или индуцирует апоптоз опухолевых клеток ш νίνο, ингибирует метастаз СХСЯ4+ опухолевых клеток и/или увеличивает продолжительность жизни субъекта с СХСЯ4' опухолью.
Предпочтительно антитело связывается с человеческим СХСЯ4 с высоким сродством, например с К 1х10-7 М или меньше или с Кс 5х10-8 М или меньше. Предпочтительно антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой антитела полной длины (т.е. содержащие вариабельный и константный участки). Кроме того, антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно обладают конфигурацией против человеческого СХСЯ-4 полной длины, экспрессированного в его природной конформации на клетке-хозяине или в искусственной мембране.
В предпочтительном аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моно
- 1 018836 клональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело:
(a) связывается с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
(b) ингибирует связывание 8ΌΕ-1 с человеческим СХСК4;
(c) ингибирует индуцированный 8ЭЕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4;
(б) ингибирует индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4; и (е) ингибирует образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека.
Даже более предпочтительно антитело также индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4, и/или ингибирует рост СХСК4+ опухолевых клеток и/или индуцирует апоптоз опухолевых клеток ίη νίνο.
В другом аспекте данное изобретение относится к выделенному человеческому моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, где антитело перекрестно конкурирует за связывание с СХСК.4 с антителом сравнения, где антитело сравнения включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8ЕО Ш N0:
25, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 29; или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
26, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 30; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
27, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 31; или (б) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
28, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 32.
В некоторых вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого νΗ 3-48, где антитело специфично связывается с человеческим СХСК4. В других вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого νκ Ь15, где антитело специфично связывается с человеческим СХСК4. В других вариантах данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого νΗ 3-48, и вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого νκ Ь15, где антитело специфично связывается с человеческим СХСК4.
В другом аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, который включает последовательности СЭКЕ СЭК2 и СЭК3; и вариабельный участок легкой цепи, который включает последовательности СЭКЕ СЭК2 и СЭК3. где (a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭКЛ включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 9-12 и их консервативных модификаций;
(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи СЭК3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 21-24 и их консервативных модификаций; и (c) антитело связывается с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки.
В предпочтительных вариантах данное антитело также обладает одной или больше из следующих характеристик: ингибирует связывание 8ΌΕ-1 с СХСК4, ингибирует индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, ингибирует индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСК-4; ингибирует образование НиУЕС капиллярных трубочек; индуцирует апоптоз в клетках, экспрессирующих СХСК4 (ίη νίΐτο и/или ίη νίνο), ингибирует рост СХСК4+ опухолевых клеток ίη νίΐτο и/или ίη νίνο и/или ингибирует метастазы СХСК4+ опухолевых клеток.
Предпочтительно последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭК2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 5-8 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи ί.ΌΒ2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 17-20 и их консервативных модификаций. Предпочтительно последовательность вариабельного участка тяжелой цепи ί.ΌΒ1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 1-4 и их консерва
- 2 018836 тивных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи С.ПК1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8ЕО ΙΌ N0: 13-16 и их консервативных модификаций.
Предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.1, содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 1;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΕ2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 5;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΕ3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 9;
(б) вариабельный участок легкой цепи СПКЕ содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 13;
(е) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΕ2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 17; и (ί) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΕ3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 21.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СПКЕ содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 2;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΕ2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 6;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СОК3, содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 10;
(б) вариабельный участок легкой цепи СПКЕ содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 14;
(е) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΕ2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 18; и (ί) вариабельный участок легкой цепи 0ΌΕ3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 22.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СПКЕ содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 3;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи 0ΌΕ2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 7;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СПК.3, содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 11;
(б) вариабельный участок легкой цени С.ПК1. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 15;
(е) вариабельный участок легкой цепи СОК2, содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 19; и (ί) вариабельный участок легкой цепи С.ПК3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 23.
Другая предпочтительная комбинация включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи С.ПК1. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 4;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи С.ПК2. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 8;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи С.ПК3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 12;
(б) вариабельный участок легкой цепи С.ПК1. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 16;
(е) вариабельный участок легкой цепи СОК2, содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 20; и (ί) вариабельный участок легкой цепи С.ПК3. содержащий 8Ε0 ΙΌ N0: 24.
Другие предпочтительные антитела в соответствии с данным изобретением или их части, связывающиеся с антигеном, включают: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Ε0 ΙΌ N0: 25-28 и 41-44; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из δΕΟ ΙΌ N0: 29-32 и 45-48; где антитело специфично связывается с СХСК4.
Предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 25 или 41; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 29 или 45.
Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 26 или 42; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 30 или 46.
Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 27 или 43; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 31 или 47.
Другая предпочтительная комбинация включает: (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 28 или 44; и (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Ε0 ΙΌ N0: 32 или 48.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются антитела или их части, связывающиеся с антигеном, которые конкурируют за связывание с СХСК4 с любым из вышеупомянутых антител.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут представлять собой, например, антитела полной длины, например изотипа Ι§01 или ΙβΟ4. Альтернативно, антитела могут представлять собой фрагменты антитела, например фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' или ЕаЬ'2, или одноцепочечные антитела.
В данном изобретении также предлагается иммуноконъюгат, содержащий антитело в соответствии с данным изобретением, или его часть, связывающуюся с антигеном, присоединенное к терапевтическому агенту, например цитотоксину или радиоактивному изотопу. В данном изобретении также предлагается молекула с двойной специфичностью, содержащая антитело или его часть, которая связывается с антигеном, в соответствии с данным изобретением, присоединенное к второму функциональному фрагменту, обладающему другой специфичностью связывания, чем указанное антитело или его часть, которая связывается с антигеном.
Также предлагаются композиции, содержащие антитело, или его часть, которая связывается с антигеном, или иммуноконъюгат, или молекулу с двойной специфичностью в соответствии с данным изобре
- 3 018836 тением и фармацевтически приемлемый носитель.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или их части, связывающиеся с антигеном, в соответствии с данным изобретением, также включены в данное изобретение, а также векторы экспрессии, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы экспрессии. Способы получения анти-СХСК4 антител с использованием клеток-хозяев, содержащих такие векторы экспрессии, также предлагаются и могут включать стадии (ί) экспрессии антитела в клетке-хозяине и (ίί) выделения антитела из клетки-хозяина.
Другой аспект данного изобретения относится к способам модулирования активности СХСК4 в клетке, где клетки контактируют с антителом или его частью, которая связывается с антигеном, в соответствии с данным изобретением. Контакт клеток может обеспечиваться ίη νίΐτο путем культивирования клеток с антителом, или контакт клеток может обеспечиваться ίη νίνο путем введения антитела субъекту. В предпочтительном варианте клетки представляют собой опухолевые клетки, экспрессирующие СХСК.4, и способ приводит к ингибированию роста опухолевых клеток и/или ингибированию метастаза опухолевых клеток. В другом варианте клетки представляют собой Т-клетки, экспрессирующие СХСК4, и способ приводит к ингибированию входа ВИЧ в клетки. В другом варианте клетки представляют собой лимфоциты при воспалительном расстройстве, и способы приводят к ингибированию воспаления. В другом варианте клетки принимают участие в васкуляризации, и способ приводит к модуляции ангиогенеза.
В другом аспекте данное изобретение относится к способу стимуляции мобилизации стволовых клеток СЭ34' из костного мозга в периферическую кровь субъекта, где способ включает введение субъекту антитела или его части, связывающейся с антигеном, в соответствии с данным изобретением, таким образом, что стимулируется мобилизация стволовых клеток СЭ34' из костного мозга в периферическую кровь. Способ может дополнительно включать сбор стволовых клеток СЭ34' из периферической крови, например, для использования с целью аутологичной трансплантации стволовых клеток.
Другие особенности и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего детального описания и примеров, которые не должны интерпретироваться как ограничивающие. Содержимое всех ссылок, инвентарные номера СепЬапк, содержание патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в данной заявке, явно включено в данное описание путем ссылки.
Краткое описание фигур
На фиг. 1А показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 33) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 25) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Е7. Участки СЭК1 (5ЕС ГО N0: 1), С12К2 >ЕГ) ГО N0: 5) и СЭК3 (5ЕС ГО N0: 9) обведены, и указано происхождение V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 1В показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 37) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 29) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела Е7. Участки СЭК1 (5ЕС ГО N0: 13), С12К2 >ЕГ) ГО N0: 17) и СЭК3 (5ЕС ГО N0: 21) обведены, и указано происхождение V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 2А показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 34) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 26) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Е9. Участки С12К1 (5ЕС ГО N0: 2), С12К2 (5ЕС ГО N0: 6) и СЭК3 (5ЕС ГО N0: 10) обведены, и указано происхождение V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 2В показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 38) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 30) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела Е9. Участки С0К1 (5ЕС ГО N0: 14), С0К2 (5ЕС ГО N0: 18) и 0ΌΚ3 (5ЕС ΙΌ N0: 22) обведены, и указано происхождение V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 3А показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 35) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 27) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Ό1. Участки С1)К1 (5ЕС ГО N0: 3), С0К2 (5ЕС ГО N0: 7) и 0ΌΚ3 (5ЕС ΙΌ N0: 11) обведены, и указано происхождение V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 3В показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 39) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 31) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела Ό1. Участки С1)К1 (5ЕС ГО N0: 15), С0К2 (5ЕС ГО N0: 19) и 0ΌΚ3 (5ЕС ΙΌ N0: 23) обведены, и указано происхождение V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 4А показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 36) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 28) вариабельного участка тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела Е2. Участки С1Ш1 (5ЕС ГО N0: 4), С0К2 (5ЕС ГО N0: 8) и 0ΌΚ3 (5ЕС ΙΌ N0: 12) обведены, и указано происхождение V, Ό и 1 зародышевой линии.
На фиг. 4В показана нуклеотидная последовательность (8ЕС ГО N0: 40) и последовательность аминокислот (8ЕС ГО N0: 32) вариабельного участка легкой цепи человеческого моноклонального антитела Е2. Участки С1)К1 (5ЕС ГО N0: 16), С0К2 (5ЕС ГО N0: 20) и 0ΌΚ3 (5ЕС ΙΌ N0: 24) обведены, и указано происхождение V и 1 зародышевой линии.
На фиг. 5А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи Е7 (8ЕС ГО N0: 25) и Е7СЬ (5ЕС ГО N0: 41) с человеческой последовательностью амино
- 4 018836 кислот νΗ 3-48 зародышевой линии (8Е0 ΙΌ N0: 49) (зародышевая линия ШбЬ раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 52).
На фиг. 5В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е7 (8Е0 ΙΌ N0: 29) и Е7СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 45) с человеческой последовательностью аминокислот νκ Е15 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 50) (зародышевая линия 1К1 раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 53).
На фиг. бА показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи Е9 (8Е0 ΙΌ N0: 2б) и Е9СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 42) с человеческой последовательностью аминокислот νΗ 3-48 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 49) (зародышевая линия ШбЬ раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 52).
На фиг. бВ показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е9 (8ЕС ΙΌ N0: 30) и Е9СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 4б) с человеческой последовательностью аминокислот νκ Ь15 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 50) (зародышевая линия 1К1 раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 53).
На фиг. 7А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи Ό1 (8ЕС ΙΌ N0: 27) и О1СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 43) с человеческой последовательностью аминокислот νΗ 3-48 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 49) (зародышевая линия ШбЬ раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 52).
На фиг. 7В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи Ό1 (8Е0 ΙΌ N0: 31) и О1СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 47) с человеческой последовательностью аминокислот νκ Ь15 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 50) (зародышевая линия 1К1 раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 53).
На фиг. 8А показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельных участков тяжелой цепи Е2 (8ЕС ΙΌ N0: 28) и Е2СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 44) с человеческой последовательностью аминокислот νΗ 3-48 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 49) (зародышевая линия ШбЬ раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 52).
На фиг. 8В показано выравнивание последовательностей аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е2 (8ЕС ΙΌ N0: 32) и Е2СЬ (8ЕС ΙΌ N0: 48) с человеческой последовательностью аминокислот νκ Ь15 зародышевой линии (8ЕС ΙΌ N0: 50) (зародышевая линия 1К1 раскрыта как 8ЕС ΙΌ N0: 53).
На фиг. 9 представлен график, показывающий связывание человеческих анти-СХСК4 антител Е7, Е9, Ό1 и Е2 с клетками СЕМ, которые экспрессируют природный человеческий СХСК4 на поверхности клетки.
На фиг. 10 представлен график, показывающий конкуренцию за связывание с клетками СЕМ между МТС-меченным анти-СХСК.4 антителом Е9 и панелью не меченных человеческих анти-СХСК.4 антител.
На фиг. 11 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-СХСК4 антителами Е7, Е9 и Ό1 связывания меченного 125Ι8ΌΕ-1 с клетками СЕМ.
На фиг. 12 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-СХСК4 антителами Е7, Е9 и Ό1 индуцированного 8ΌΕ-1 притока кальция в клетки СЕМ.
На фиг. 13 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-СХСК4 антителами Е7 и Е9 индуцированной 8ΌΕ-1 миграции клеток СЕМ.
На фиг. 14 представлен график, показывающий ингибирование человеческими анти-СХСК4 антителами Е7, Е9 и Е2 пролиферации опухолевых клеток Каток ίη νίίτο.
На фиг. 15А-С представлены графики, показывающие ингибирование человеческими анти-СХСК4 антителами Е7 и Е9 пролиферации опухолевых клеток Каток ίη νίνο на модели подкожной опухоли. На фиг. 15А показана кривая роста среднего объема опухоли. На фиг. 15В показана кривая роста медианного объема опухоли. На фиг. 15С показан медианный % изменения массы тела.
На фиг. 1б показан график % выживания мышей, леченных человеческим анти-СХСК4 антителом Е9 на модели системного введения опухолевых клеток Каток.
Подробное описание данного изобретения
Данное изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, особенно человеческим моноклональным антителам, которые специфично связываются с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. В некоторых вариантах антитела в соответствии с данным изобретением происходят от конкретных последовательностей тяжелой и легкой цепей зародышевой линии и/или включают конкретные структурные признаки, например участки СЭК, содержащие конкретные последовательности аминокислот. В данном изобретении предлагаются выделенные антитела, способы создания таких антител, иммуноконъюгаты и молекулы с двойной специфичностью, содержащие такие антитела, и фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением. Данное изобретение также относится к способам применения антител, например, для обнаружения СХСК4, а также модулирования активности СХСК4 при заболеваниях или расстройствах, связанных с экспрессией СХСК4 или вовлечением пути СХСК4/8ОЕ-Е например раковые заболевания, метастаз опухоли, ВИЧ-инфекция, воспаление и ангиогенез. Соответственно, в данном изобретении также предлагаются способы применения анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением для лечения ракового заболевания, например для лечения такого ракового заболевания, как рак молочной железы, яичника, предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак поджелудочной железы, щитовидной железы, меланома, рак назофарингеальной
- 5 018836 области, почечно-клеточный рак, лимфома, нейробластома, глиобластома, рабдомиосаркома, рак ободочной и прямой кишки, рак почек, остеосаркома, острая лимфобластная лейкемия или острая миелоидная лейкемия. Кроме того, в данном изобретении предлагаются способы применения анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением для ингибирования метастаза опухоли.
Для лучшего понимания настоящего изобретения сначала даются определения некоторых терминов. Дополнительные определения приведены в подробном описании.
Термин СХСК4 включает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. Например, антитела, специфичные в отношении СХСК4, могут в определенных случаях перекрестно реагировать с СХСК.4 других видов, кроме человека. В других вариантах антитела, специфичные в отношении человеческого СХСК4, могут быть полностью специфичными для человеческого СХСК4 и могут не демонстрировать перекрестной реактивности с другими родами или видами. Термин человеческий СХСК4 обозначает человеческую последовательность СХСК4, например полная последовательность аминокислот человеческого СХСК4 с инвентарным номером СеиЬаик Р61073 (8Е0 Ш N0: 51). СХСК4 также известен в данной области как, например, ЬЕ8ТК, Рикш или СЭ184. Человеческая последовательность СХСК4 может отличаться от человеческого СХСК4 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 51 и содержать, например, консервативные мутации или мутации в неконсервативных участках, и СХСК4 обладает в существенной мере такой же биологической функцией, как человеческий СХСК4 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 51. Например, биологическая функция человеческого СХСК4 состоит в наличии эпитопа во внеклеточном домене СХСК4, который специфично связывается с антителом в соответствии с данным изобретением, или биологическая функция человеческого СХСК4 представляет собой связывание с хемокином или вовлечение в метастатический процесс.
Конкретная последовательность человеческого СХСК4 в общем как минимум на 90% идентична последовательности аминокислот человеческого СХСК4 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 51 и содержит остатки аминокислот, которые идентифицируют последовательность аминокислот как человеческую при сравнении с последовательностями аминокислот СХСК4 других видов (например, мыши). В некоторых случаях последовательность аминокислот человеческого СХСК4 может быть как минимум на 95% или даже как минимум на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности аминокислот СХСК4 с последовательностью 8Е0 ГО N0: 51. В некоторых вариантах последовательность человеческого СХСК4 демонстрирует не более 10 отличий аминокислот от СХСК4 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 51. В некоторых вариантах человеческий СХСК4 может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 отличия аминокислот от СХСК4 с последовательностью 8ЕС ГО N0: 51. Процент идентичности может быть определен, как описано в данном описании.
Термин 8ΌΕ-1 обозначает фактор 1 из стромальных клеток, который является лигандом для СХСК4. Термин 8ΌΕ-1 включает различные изоформы 8ΌΕ-1, например 8ΌΕ-1α и 8ΌΕ-1β. Инвентарный номер СеиЬаик последовательности аминокислот человеческого 8ΌΕ-1β ИР_954637. Инвентарный номер СеиЬаик последовательности аминокислот человеческого 8ΌΕ-1β ИР_000600. Человеческий 8ΌΕ1 также описан в патенте США 5756084. 8ΌΕ-1 также известен как СХСЬ12. Последовательность аминокислот человеческого 8ΌΕ-1 может отличаться от 8ΌΕ-1 ИР_954637 или ИР_000600, как описано в данном описании для СХСК4.
Термин иммунная реакция обозначает действие, например, лимфоцитов, антигенпредставляющих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцированных вышеупомянутыми клетками или печенью (в том числе антитела, цитокины и комплемент), которое приводит к избирательному повреждению, уничтожению или элиминации из человеческого организма вторгшихся патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток, или, в случаях аутоиммунных явлений или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.
Путь преобразования сигнала обозначает биохимические взаимоотношения между различными молекулами преобразования сигнала, которые играют роль в передаче сигнала от одной части клетки к другой части клетки. В данном описании фраза рецептор на поверхности клетки включает, например, молекулы и комплексы молекул, способные к получению сигнала и передаче такого сигнала через плазматическую мембрану клетки. Пример рецептора на поверхности клетки в соответствии с данным изобретением представляет собой рецептор СХСК4.
Термин антитело в данном описании включает антитела целиком и их антигенсвязывающие (связывающиеся с антигеном) фрагменты (т.е. антигенсвязывающая часть) или их одинарные цепи. Антитело обозначает гликопротеин, содержащий как минимум две тяжелые (Н) цепи и две легкие (Ь) цепи, связанные между собой дисульфидными связями, или его часть, которая связывается с антигеном. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (в данном описании сокращенно обозначается νΗ) и константного участка тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи состоит из трех доменов, Сн1, Сн2 и Сн3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (в данном описании сокращенно обозначается УС и константного участка легкой цепи. Константный участок легкой цепи состоит из одного домена, Сь Участки νΗ и ν9 могут быть дополнительно подразделены на
- 6 018836 участки гиперизменчивости, которые называются участками, определяющими комплементарность (СЭЕ), перемежающимися более консервативными участками, которые называются каркасными участками (ЕЯ). Каждый νΗ и состоит из трех СОЕ и четырех ЕЯ, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: ЕЯ1, СЭКЕ ЕЯ2, СЦЯ2, ЕЯ3, СЦЯ3, ЕЯ4. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами гостя, в том числе различными клетками иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (О1с.|) классической системы комплемента.
Термин антигенсвязывающая часть (часть, связывающаяся с антигеном) антитела (или просто часть антитела) в данном описании обозначает один или больше фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, СХСЯ4). Показано, что функция связывания антитела с антигеном может выполняться фрагментами антитела с полной длиной. Примеры связывающихся фрагментов, которые охватываются термином антигенсвязывающая часть (часть, связывающаяся с антигеном) антитела, включают (ί) фрагмент ЕаЬ, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов νΣ, νΗ, Сь и Сн1; (ίί) фрагмент Е(аЬ')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента ЕаЬ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент ЕаЬ', который, по существу, представляет собой ЕаЬ с частью шарнирной области (см. ΒυΝΟΛΜΕΝΤΛΕ ΙΜΜϋΝΘΤΟΟΥ (Раи1 еб., З.кир.гб еб. 1993); (ίν) фрагмент Еб, состоящий из доменов νΗ и Сн1; (V) фрагмент Еу, состоящий из доменов V,. И νΗ одного плеча антитела, (νί) фрагмент бАЬ (\Уагб е! а1., (1989) №11иге 341:544-546), который состоит из домена νΗ; (νίί) выделенный участок, определяющий комплементарность (СОЯ); и (νίίί) нанотело (папоЬобу), вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий одинарный вариабельный домен и два константных домена. Кроме того, хотя два домена фрагмента Еу, ν2 и νΗ, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который позволяет получить их как одноцепочечный белок, в котором участки ν2 и νΗ спарены для образования одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Еу |5сЕу|; см., например, В1гб е! а1. (1988) 8с1епсе 242:423-426; и Ηιι4οη е! а1. (1988) Ргос. №11. Асаб. 8ст И8А 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином антигенсвязывающая часть (часть, связывающаяся с антигеном) антитела. Такие фрагменты антител получают, используя обычные техники, известные специалисту в данной области, и проводят скрининг фрагментов на предмет пригодности таким же способом, как и для интактных антител.
Выделенное антитело в данном описании обозначает антитело, которое в существенной мере свободно от других антител, обладающих другой специфичностью по отношению к антигенам (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с СХСЯ4, в существенной мере свободно от антител, которые специфично связываются с другими антигенами, кроме СХСЯ4). Выделенное антитело, которое специфично связывается с СХСЯ4, может, однако, обладать перекрестной реактивностью по отношению к другим антигенам, таким как молекулы СХСЯ4 других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть в существенной мере свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.
Термин моноклональное антитело или композиция моноклонального антитела в данном описании обозначает препарат молекул антитела единого молекулярного состава. Композиция моноклонального антитела демонстрирует единую специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.
Термин человеческое антитело в данном описании предназначен включать антитела, содержащие вариабельные участки, в которых как каркасные участки, так и участки СОЯ происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Кроме того, если антитело содержит константный участок, константный участок также происходит от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. Человеческие антитела в соответствии с данным изобретением могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевой линии (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфическим мутагенезом ίη νίίτο или соматическими мутациями ίη νίνο). Однако термин человеческое антитело в данном описании не предназначен включать антитела, в которых последовательности СОЯ происходят из зародышевой линии другого вида млекопитающих, таких как мышь, пересажены на человеческие каркасные последовательности.
Термин человеческое моноклональное антитело обозначает антитела, демонстрирующие единую специфичность связывания, которые содержат вариабельные участки, где как каркасные участки, так и участки СОЯ происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В одном варианте человеческие моноклональные антитела продуцированы гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, не относящегося к роду Ηοιηο 8ар1еп8, например трансгенной мыши, с геномом, содержащим трансген человеческой тяжелой цепи и трансген легкой цепи, слитые с бессмертной клеткой.
Термин рекомбинантное человеческое антитело в данном описании включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными средствами, например (а) антитела, выделенные у животного (например, мыши), трансгенного или трансхромосомаль
- 7 018836 ного для генов человеческого иммуноглобулина, или из гибридомы, полученной из такого животного (описана ниже), (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и (б) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сращивание последовательностей человеческого гена иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых каркасные участки и участки СОК. происходят от последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии. В некоторых вариантах, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты мутагенезу ίη νίίτο (или при использовании трансгенного животного для последовательностей человеческого 1д соматическому мутагенезу ίη νίνο) и, таким образом, последовательности аминокислот участков Ун и Уъ рекомбинантных антител представляет собой последовательности, которые, хотя происходят из и родственны последовательностям человеческих Ун И Уъ зародышевой линии, могут не существовать в природе в пределах репертуара антител зародышевой линии человека ίη νίνο.
В данном описании изотип обозначает класс (например, 1дМ или 1дС1) антитела, который кодируется генами константного участка тяжелой цепи.
Фразы антитело, распознающее антиген и антитело, специфическое в отношении антигена в данном описании используются равнозначно с термином антитело, которое специфично связывается с антигеном.
Термин производные человеческого антитела обозначает любую модифицированную форму человеческого антитела, например конъюгат антитела и другого агента или антитела.
Термин гуманизированное антитело предназначен для обозначения антител, в которых последовательности СОК, полученные из зародышевой линии или другого вида млекопитающих, например мыши, пересажены на последовательности человеческого каркаса. Дополнительные модификации каркасного участка могут быть осуществлены в пределах человеческих каркасных последовательностей.
Термин химерное антитело предназначен для обозначения антител, в которых последовательности вариабельного участка происходят из одного вида, и последовательности константного участка происходят из другого вида, например антитело, в котором последовательности вариабельного участка происходят от антитела мыши и последовательности константного участка происходят от человеческого антитела.
В данном описании антитело, которое специфично связывается с человеческим СХСК4, предназначено для обозначения антитела, которое связывается с человеческим СХСК4 (и, возможно, СХСК4 одного или больше видов, не относящихся к Ното 8ар1еп8), но не связывается в существенной мере с белками, которые не являются СХСК4. В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением специфично связывается с человеческим СХСК4 с последовательностью ЗЕО Ш N0: 51 или его вариантом. Предпочтительно антитело связывается с человеческим СХСК4 с Кс 1х 10-7 М или меньше, более предпочтительно 5х10-8 М или меньше, более предпочтительно 3х10-8 М или меньше, более предпочтительно 1х 10-8 М или меньше, даже более предпочтительно 5х 10-9 М или меньше.
Термин не связывается в существенной мере с белком или клетками в данном описании означает не связывается или не связывается с высоким сродством с белком или клетками, т.е. связывается с белком или клетками с Кс 1х10-6 М или больше, более предпочтительно 1х10-5 М или больше, более предпочтительно 1х10-4 М или больше, более предпочтительно 1х 10-3 М или больше, даже более предпочтительно 1х 10-2 М или больше.
Термин Кажос или Ка в данном описании предназначен для обозначения скорости ассоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело, тогда как термин Кб18 или Кб в данном описании предназначен для обозначения скорости диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело. Термин Кс в данном описании предназначен для обозначения константы диссоциации, которая получена из отношения Кб к Ка (т.е., Кб/Ка) и выражена как молярная концентрация (М). Значения Кс для антител могут быть определены с использованием способов, хорошо известных в данной области. Предпочтительный способ определения Кс антитела состоит в использовании резонанса поверхностного плазмона предпочтительно с применением системы биодатчика, например системы В1асоге®.
В данном описании термина высокое сродство для антитела 1дС обозначает антитело с Кс для целевого антигена 1х 10-7 М или меньше, более предпочтительно 5х10-8 М или меньше, даже более предпочтительно 1х10-8 М или меньше, даже более предпочтительно 5х10-9 М или меньше и даже более предпочтительно 1х 10-9 М или меньше. Однако связывание с высоким сродством может варьировать для других изотипов антитела. Например, связывание с высоким сродством для изотипа 1дМ обозначает антитело с Кс 10-6 М или меньше, более предпочтительно 10-7 М или меньше, даже более предпочтительно 10-8 М или меньше.
В данном описании термин субъект включает любого человека или животное, не относящееся к Ното 8ар1еп8. Термин животное, не относящееся к Ното 8ар1еп8 включает всех позвоночных животных, например млекопитающие и не млекопитающие, таких как не относящиеся к Ното 8ар1еп8 прима
- 8 018836 ты, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и т.п.
Различные аспекты данного изобретения описаны более подробно в следующих подразделах. Анти-СХСК.4 антитела.
Антитела в соответствии с данным изобретением характеризуются конкретными функциональными признаками или свойствами антител. Например, антитела связываются с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки. Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением связывается с СХСК.4 с высоким сродством, например с Кс 1 х 10-7 М или меньше. Анти-СХСК.4 антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно демонстрируют одну или больше из следующих характеристик:
(a) связывание с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
(b) ингибирование связывания 8ΌΕ-1 с СХСК4;
(c) ингибирование индуцированного 8ΌΡ-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие СХСК.4;
(ά) ингибирование индуцированной 8ΌΡ-1 миграции клеток, экспрессирующих СХСК4;
(е) ингибирование образования капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека;
(I) связывание с человеческим СХСК4 с Кс 1х 10-7 М или меньше;
(д) индуцирование апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСК4;
(II) ингибирование пролиферации опухолевых клеток ίη νίΐτο;
(ί) ингибирование пролиферации опухолевых клеток и/или индуцирование апоптоза опухолевых клеток ίη νίνο;
(ί) ингибирование метастазов СХСК4+ опухолевых клеток и/или (к) увеличение продолжительности жизни субъекта с опухолью СХСК4+.
В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим СХСК4 на поверхности клетки, но не ингибирует связывания 8ΌΡ-1 к СХСК4 и не ингибирует индуцированного 8ΌΡ-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, и не ингибирует индуцированной 8ΌΡ-1 миграции клеток, экспрессирующих СХСК4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим СХСК4 на поверхности клетки и ингибирует связывание 8ΌΡ-1 с СХСК4 и ингибирует индуцированный 8ΌΡ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, но не ингибирует индуцированной 8ΌΡ-1 миграции клеток, экспрессирующих СХСК4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим СХСК4 на поверхности клетки и ингибирует связывание 8ΌΡ-1 с СХСК4 и ингибирует индуцированный 8ΌΡ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, и ингибирует индуцированную 8ΌΡ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСК4. В других вариантах антитело в соответствии с данным изобретением связывается с природным человеческим СХСК4 на поверхности клетки, ингибирует связывание 8ΌΡ-1 с СХСК4, ингибирует индуцированный 8ΌΡ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4, ингибирует индуцированную 8ΌΡ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСК4, и ингибирует образование НиУЕС капиллярных трубочек.
Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением связывается с человеческим СХСК4 с Кс 5х10-8 М или меньше, связывается с человеческим СХСК4 с Кс 2х10-8 М или меньше, связывается с человеческим СХСК4 с Кс 5х10-9 М или меньше, связывается с человеческим СХСК4 с Кс 4х10-9 М или меньше, связывается с человеческим СХСК4 с Кс 3х10-9 М или меньше или связывается с человеческим СХСК4 с Кс 2х 10-9 М или меньше.
Предпочтительно антитело ингибирует связывание 8ΌΕ-1 с человеческим СХСК4 с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или меньше, более предпочтительно 30 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше, или 10 нМ или меньше, или 5 нМ или меньше, или 3 нМ или меньше (например, ЕС50 для ингибирования составляет 28,60 нМ или меньше, или 12,51 нМ или меньше, или 2,256 нМ или меньше).
Предпочтительно антитело в соответствии с данньм изобретением ингибирует индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4 с ЕС50 для ингибирования 3 нМ или меньше, более предпочтительно 2 нМ или меньше, или 1 нМ или меньше, или 0,9 нМ или меньше, или 0,8 нМ или меньше, или 0,7 нМ или меньше, или 0,6 нМ или меньше, или 0,5 нМ или меньше, или 0,4 нМ или меньше (например, 0,9046 нМ или меньше, 0,5684 или меньше, или 0,3219 нМ или меньше).
Предпочтительно антитело в соответствии с данным изобретением ингибирует индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4, с ЕС50 для ингибирования 50 нМ или меньше, более предпочтительно 30 нМ или меньше, или 20 нМ или меньше, или 15 нМ или меньше (например, 18,99 нМ или меньше, или 12,44 или меньше).
Стандартные анализы для оценки способности связывания антител с природным человеческим СХСК4, экспрессированным на поверхности клетки, известны в данной области, в том числе, например, анализ методов проточной цитометрии с использованием линии клетки, которая природным образом экспрессирует природный СХСК4, или которая была трансфицирована для экспрессии природного СХСК4. Подходящие анализы подробно описаны в примерах. Предпочтительная линия клеток, которая экспрессирует природный СХСК4, представляет собой линию Т-клеток СЕМ. Подходящие анализы для
- 9 018836 оценки ингибирования связывания 8ΌΕ-1, ингибирования индуцированного 8ЭЕ-1 притока кальция, ингибирования индуцированной 8ЭЕ-1 миграции клеток, ингибирования образования НиУЕС капиллярных трубочек, индукции апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСК4 ίη νίΐτο и/или ίη νίνο, ингибирование роста СХСК4+ опухолевых клеток ίη νίΐτο и/или ίη νίνο, и/или ингибирование метастазов СХСК4' опухолевых клеток также подробно описаны в примерах. Сродство связывания антител также может быть определено стандартными способами, например, такими как анализ Скэтчарда (8са1сНагб).
Моноклональные антитела Е7, Е9, Ό1 и Е2.
Предпочтительные антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела Е7, Е9, Ό1 и Е2, выделенные и структурно охарактеризованные, как описано в примерах 1 и 2. Последовательности аминокислот УН Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8ЕО Ш N0: 25, 26, 27 и 28 соответственно. Последовательности аминокислот Уь Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 29, 30, 31 и 32 соответственно. Дополнительно были созданы альтернативные формы Е7, Е9, Ό1 и Е2, в которых некоторые остатки каркаса были заменены на остаток зародышевой линии, и здесь и в дальнейшем называются Е7СЬ, Е9СЬ, ϋ16ΐ· и Е2СЬ. Последовательности аминокислот УН Е7СЬ, Е9СЬ, ОЮЬ и Е2СЬ показаны в 8Е0 Ш N0: 41, 42, 43 и 44 соответственно. Последовательности аминокислот Уъ Е7СЬ, Е9СЬ, ϋ16ΐ· и Е2СЬ показаны в 8Е0 Ш N0: 45, 46, 47 и 48 соответственно.
При условии, что каждое из этих антител может связываться с СХСК4, последовательности УН и Уъ могут комбинироваться и выравниваться (т1хеб аиб та(сНсб). чтобы создать другие анти-СХСК4 молекулы со свойством связывания в соответствии с данным изобретением. Связывание с СХСК4 таких комбинированных и выровненных антител может быть проверено с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, проточной цитометрией с клетками СЕМ). Предпочтительно, если цепи УН и Уъ комбинируют и выравнивают, последовательность УН конкретной пары УН/УЪ заменяют на структурно подобную последовательность УН. Подобным образом, последовательность Уъ из конкретной пары УН/УЪ предпочтительно заменяют на структурно подобную последовательность Уь.
Соответственно, в одном аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело, или его часть, связывающаяся с антигеном, содержащее:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 25-28 и 41-44; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 29-32 и 45-48;
где антитело специфично связывается с СХСК.4, предпочтительно человеческим СХСК4. Предпочтительные комбинации тяжелой и легкой цепи включают:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
или 41, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 29 или 45; или (b) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
или 42, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 30 или 46; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
или 43, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 31 или 47; или (б) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0:
или 44, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 Ш N0: 32 или 48.
В другом аспекте данного изобретения предлагаются антитела, которые включают участки СЭК1, СЭК2 и СЭК3 тяжелой цепи и легкой цепи Е7, Е9, Ό1 или Е2, или их комбинации. Последовательности аминокислот участков СЭК1 УН Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 1-4 соответственно. Последовательности аминокислот участков СЭК2 УН Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 5-8 соответственно. Последовательности аминокислот участков СЭК3 УН Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 9-12 соответственно. Последовательности аминокислот участков СЭК1 Ук Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 13-16 соответственно. Последовательности аминокислот участков СЭК2 Ук Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 17-20 соответственно. Последовательности аминокислот участков СЭК3 Ук Е7, Е9, Ό1 и Е2 показаны в 8Е0 Ш N0: 21-24 соответственно. Участки СЭК выделены (обведены) с использованием системы (КаЬа1, Е.А., е1 а1. (1991) Зециеисех οί Ρ^οΐе^η8 οί Iттиηο1οд^са1 Шегей, ίίίΐΗ Εάίΐίοη, И.8. ЭерайтеШ οί Неа1111 аиб Нитаη 8етсе5, МН ΡιιΝΑιΙίοη №. 91-3242).
При условии, что каждое из этих антител может связываться с СХСК4 и что специфичность связывания антигена обеспечивается в основном участками СЭК1, СЭК2 и СЭК3, последовательности участков СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 УН и последовательности участков СЭКЕ СЭК2 и СЭК3 Ук могут комбинироваться и выравниваться (т.е. участки СЭК от различных антител могут комбинироваться и выравниваться, хотя каждое антитело должно содержать участки СЭК1, СЭК2 и СЭК3 УН и участки СЭК1, СЭК2 и СЭК3 Ук), чтобы создать другие анти-СХСК4 молекулы, обладающие свойством связывания в соответствии с данным изобретением. Связывание с СХСК4 таких комбинированных и выровненных анти
- 10 018836 тел может быть проверено с использованием анализов связывания, описанных выше и в примерах (например, ЕЬ1§Л, анализ Ыасоге ®). Предпочтительно если последовательности участков СЭК νΗ комбинируют и выравнивают, последовательность(и) участков СЭЮ. СЭК2 и/или СЭК3 конкретной последовательности νΗ заменяют структурно подобной последовательностью(ями) участков СОК. Также, если последовательности участков СОК νκ комбинируют и выравнивают, последовательности участков СЭК.1, СЭК2 и/или СЭК3 конкретной последовательности νκ предпочтительно заменяют структурно подобной последовательностью(ями) участков СОК. Для среднего специалиста в данной области будет очевидно, что новые последовательности νΗ и могут быть созданы путем замены одной или больше последовательностей участков СОК νΗ и/или У3 структурно подобными последовательностями из последовательностей участков СОК, раскрытых в данном описании для моноклональных антител Т7, Т9, Ό1 и Е2.
Соответственно, в другом аспекте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, связывающаяся с антигеном, содержащая:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 1-4;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 5-8;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 9-12;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК1, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 13-16;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 17-20; и (ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК3, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС Ш N0: 21-24;
где антитело специфично связывается с СХСК4, предпочтительно человеческим СХСК4.
В предпочтительном варианте антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 1;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 5;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 9;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 13;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 17; и (ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 21.
В другом предпочтительном варианте, антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 2;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 6;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 10;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 14;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 18; и (ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 22.
В другом предпочтительном варианте, антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 3;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 7;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 11;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 15;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 19; и (ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 23.
В другом предпочтительном варианте, антитело включает:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 4;
(b) вариабельный участок тяжелой цепи СИК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 8;
(c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 12;
(б) вариабельный участок легкой цепи СЭК1, содержащий 8Е0 Ш N0: 16;
(е) вариабельный участок легкой цепи СЭК2, содержащий 8Е0 Ш N0: 20; и (ί) вариабельный участок легкой цепи СЭК3, содержащий 8Е0 Ш N0: 24.
Из уровня техники хорошо известно, что домен СЭК3, независимо от домена(ов) СЭК1 и/или СЭК2, отдельно может определить специфичность связывания антитела с родственным антигеном и что может быть создано множество антител, которые прогнозируемо обладают одинаковой специфичностью связывания, основанной на общей последовательности СЭК3. См., например, Кйтка е1 а1., Βπΐίδΐι 1. οί Сапсег 83(2):252-260 (2000) (описывает выработку гуманизированного анти-СЭ30 антитела с использованием только СЭК3 вариабельного домена тяжелой цепи мышиного анти-СЭ30 антитела Κί-4); Ве&оег е1 а1., 1. Мо1. Βίο1. 296:833-849 (2000) (описывает рекомбинантные антитела против эпителиального гликопротеина-2 [ЕСР-2] с использованием только последовательности тяжелой цепи СЭК3 материнского
- 11 018836 мышиного анти-Е6Р-2 антитела МОС-31); Набег е! а1., Ргос. №1!1. Асаб. 8с1. И.8.А. 95:8910-8915 (1998) (описывает панель гуманизированных антител ανβ3 против интегрина с использованием вариабельного домена СИКЗ тяжелой и легкой цепи мышиного антитела ανβ3 против интегрина ЬМ609, где каждое антитело-член содержит другую последовательность за пределами домена СИКЗ и способно связываться с тем же эпитопом, что и материнское мышиное антитело со сродством, таким же высоким или выше, чем у материнского мышиного антитела); ВагЬак е! а1., 1. Ат. СНет. 8ос. 116:2161-2162 (1994) (раскрывает, что домен СИКЗ обеспечивает наиболее значительный вклад в связывание с антигеном); ВагЬак е! а1., Ргос. №1!1. Асаб. 8сг И.8.А. 92:2529-2533 (1995) (описывает пересадку последовательностей СИКЗ тяжелой цепи трех ЕаЬ (81-1, 81-40 и 81-32) против человеческой плацентарной ДНК на тяжелую цепь ЕаЬ столбнячного анатоксина, таким образом заменяя существующий СИК3 тяжелой цепи и демонстрируя, что домен СИК3 сам по себе обеспечивает специфичность связывания); 0Н/е1 е! а1., 1. 1ттипо1. 157:739-749 (1996) (описывает исследования по пересадке, где перенос только СИК3 тяжелой цепи материнского полиспецифического ЕаЬ ЬИА3 на тяжелую цепь моноспецифического 1дС антитела ЕаЬ р313, связывающегося со столбнячным анатоксином, был достаточен для сохранения специфичности связывания материнского ЕаЬ); Вегехот е! а1., В1А_)оигпа1 8:8с1еп1Шс Вет1е\у 8 (2001) (описывает пептидомиметики, основанные на СИК3 моноклонального анти-НЕК2 антитела); 1дага8Й1 е! а1., 1. Вюскет (Токуо) 117:452-7 (1995) (описывает синтетический полипептид длиной 12 аминокислот, соответствующий домену СИК3 антитела против фосфатидилсерина); Воигдеош е! а1., 1. У1го1. 72:807-10 (1998) (показывает, что одинарный пептид, полученный из домена СИК3 тяжелой цепи антитела против респираторного синцитиального вируса (К8У), был способен нейтрализовать вирус ίη тОго); Ьеу1 е! а1., Ргос. №1!1. Асаб. 8с1. И.8.А. 90:4374-8 (1993) (описывает пептид, основанный на домене СИК3 тяжелой цепи мышиного анти-ВИЧ антитела); Ро1утеш§ апб 8!о11ег. 1. 1ттипо1. 152:5218-5329 (1994) (описывает возможность связывания с ксЕу в результате пересадки участка СИК3 тяжелой цепи антитела, связывающегося с ΖДНК) и Хи апб Иау18, 1ттипйу 13:37-45 (2000) (описание того, что разнообразия в СИК3 тяжелой цепи достаточно, чтобы позволить идентичным в других отношениях молекулам 1дМ различать разнообразные полуантигены и белковые антигены). См. также патенты США №№ 6951646; 6914128; 6090382; 6818216; 6156313; 6827925; 5833943; 5762905 и 5760185, где описаны патентованные антитела, определенные одинарным доменом СИК. Каждая из этих ссылок, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте.
Соответственно, настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из антитела, полученного от человека или животного, не относящегося к Ното 8ар1еп8, где моноклональное антитело способно специфично связываться с СХСК4. В пределах определенных аспектов в данном изобретении предлагаются моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из нечеловеческого антитела, например антитела мыши или крысы, где моноклональное антитело способно специфично связываться с СХСК4. В пределах некоторых вариантов такие антитела по изобретению, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из нечеловеческого антитела (а), способны к конкуренции за связывание с; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом; и/или (б) обладают сродством связывания, подобным соответствующему материнскому нечеловеческому антителу.
В пределах других аспектов настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из человеческого антитела, такого как человеческое антитело, полученное от животного, не относящегося к Ното 8ар1еп8, где человеческое антитело способно специфично связываться с СХСК4. В пределах других аспектов, настоящее изобретение предлагает моноклональные антитела, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, такого как человеческое антитело, полученное от животного, не относящегося к Ното 8ар1еп8, где первое человеческое антитело способно специфично связываться с СХСК4 и где домен СИК3 из первого человеческого антитела заменяет домен СИК3 в человеческом антителе, не способном специфично связываться с СХСК4, чтобы генерировать второе человеческое антитело, которое способно специфично связываться с СХСК4. В пределах некоторых вариантов, такие антитела по изобретению, содержащие один или больше доменов СИК3 тяжелой и/или легкой цепи из первого человеческого антитела, (а) способны конкурировать за связывание с; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) связываются с тем же эпитопом; и/или (б) обладают сродством связывания, сходным с соответствующим материнским первым человеческим антителом.
Антитела, содержащие конкретные последовательности зародышевой линии.
В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи из тяжелой цепи конкретного гена иммуноглобулина зародышевой линии и/или вариабельный участок легкой цепи из легкой цепи конкретного гена иммуноглобулина зародышевой линии.
Например, в предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок
- 12 018836 тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого Ун 3-48, где антитело специфично связывается с СХСК4. В другом предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого Ук Ь15, где антитело специфично связывается с СХСВ4. В другом предпочтительном варианте данного изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, где антитело включает вариабельный участок тяжелой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого Ун 3-48, и включает вариабельный участок легкой цепи, который является продуктом или происходит от гена человеческого Ук Ь15, где антитело специфично связывается с СХСК4, предпочтительно человеческим СХСВ4. Такие антитела также могут обладать одной или больше функциональных характеристик, подробно описанных выше, например связывание с природным СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки, ингибирование связывания 8ΌΕ-1 к СХСР4, ингибирование индуцированного 8ΌΡ-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4-, ингибирование индуцированной 8ΌΡ-1 миграции клеток, экспрессирующих СХСК4-, ингибирование образования НиУЕС капиллярных трубочек, индуцирование апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСР4 ίη νίίτο и/или ίη νίνο, ингибирование роста СХСР4' опухолевых клеток ίη νίίτο и/или ίη νίνο, и/или ингибирование метастазов СХСР4' опухолевых клеток.
Примеры антител, содержащих Ун и Ук Ун 3-48 и Ук Ь15 соответственно, представляет собой антитела Е7, Е9, Ό1 и Е2.
В данном описании человеческое антитело включает вариабельные участки тяжелой или легкой цепи, которые являются продуктом или происходят от конкретной последовательности зародышевой линии, если вариабельные участки антитела получены из системы, где используются человеческие гены иммуноглобулина зародышевой линии. Такие системы включают иммунизацию трансгенной мыши, несущей человеческие гены иммуноглобулина, целевым антигеном или скрининг библиотеки человеческого гена иммуноглобулина, показанной на фаге, с целевым антигеном. Человеческое антитело, которое является продуктом или происходит из человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, может быть идентифицировано как таковое сравнением последовательности аминокислот человеческого антитела с последовательностями аминокислот иммуноглобулинов зародышевой линии человека и выбором человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, последовательность которой наиболее близка (т.е. самый высокий % идентичности) к последовательности человеческого антитела. Человеческое антитело, которое является продуктом или происходит от конкретной человеческой последовательности иммуноглобулина зародышевой линии, может включать отличия аминокислот по сравнению с последовательностью зародышевой линии за счет, например, природных соматических мутаций или умышленного введения сайт-специфической мутации. Однако последовательность аминокислот выбранного человеческого антитела обычно как минимум на 90% идентична последовательности аминокислот, кодируемой человеческим геном иммуноглобулина зародышевой линии, и содержит остатки аминокислот, которые идентифицируют человеческое антитело как человеческое при сравнении с последовательностями аминокислот иммуноглобулина зародышевой линии других видов (например, мышиные последовательности зародышевой линии). В определенных случаях последовательность аминокислот человеческого антитела может быть как минимум на 95% или даже как минимум на 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии. Обычно человеческое антитело, происходящее из конкретной человеческой последовательности зародышевой линии, демонстрирует не более 10 отличий аминокислот от последовательности аминокислот, кодируемой человеческим геном иммуноглобулина зародышевой линии. В определенных случаях человеческое антитело может демонстрировать не более 5 или даже не более 4, 3, 2 или 1 отличий аминокислот от последовательности аминокислот, кодируемой геном иммуноглобулина зародышевой линии.
Г омологичные антитела.
В другом варианте антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, содержащие последовательности аминокислот, гомологичные последовательностям аминокислот предпочтительных антител, описанных в данном описании, где антитела сохраняют желательные функциональные свойства анти-СХСР4 антител в соответствии с данным изобретением.
Например, в данном изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи, где:
(a) вариабельный участок тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая как минимум на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из 5ЕО ГО N0: 25-28 и 41-44;
(b) вариабельный участок легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая как минимум на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 29-32 и 45-48;
(c) антитело связывается с природным человеческим СХСК4-, экспрессирующимся на поверхности
- 13 018836 клетки.
Дополнительно или альтернативно, антитело может обладать одним или больше следующих функциональных свойств: (ί) связываться с человеческим СХСВ4 с Кс 1 х 10-7 М или меньше; (п) ингибировать связывание 8ΌΕ-1 с СХСВ4; (ш) ингибировать индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСВ4; (ίν) ингибировать индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСВ4; (ν) ингибировать образование НиУЕС капиллярных трубочек; (νί) индуцировать апоптоз в клетках, экспрессирующих СХСВ4 ίη νίίτο и/или ίη νίνο; (νίί) ингибировать рост СХСВ4+ опухолевых клеток ίη νίίτο и/или ίη νίνο и/или (νίίί) ингибировать метастазы СХСВ4' опухолевых клеток.
В различных вариантах антитело может быть, например, человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом.
В других вариантах последовательности аминокислот УН и/или Уъ могут быть на 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% гомологичными последовательностям, описанным выше. Антитело, содержащее участки УН и Уъ с высокой степенью гомологии (т.е. 80% или выше) к участкам УН и Уъ последовательностей, описанных выше, может быть получено мутагенезом (например, сайт-специфическим или ПЦРопосредованным мутагенезом) молекул нуклеиновых кислот, кодирующих 8ЕО ΙΌ N0: 25-32 или 41-48, с последующей проверкой кодируемого измененного антитела на предмет сохранения функции (т.е. описанных выше функций), с использованием функциональных анализов, описанных в данном описании.
В данном описании процент гомологии между двумя последовательностями аминокислот эквивалентен проценту идентичности между двумя последовательностями. Процент идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию количества идентичных для последовательностей положений (т.е. % гомологии = количество идентичных положений/общее количество положений х 100), принимая во внимание количество промежутков и длину каждого промежутка, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями может быть осуществлено с использованием математического алгоритма, как описано в не ограничивающих примерах ниже.
Процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот может быть определен с использованием алгоритма Е. Меуетк αηά XV. МШет (СетриР Αρρί. ВюксС 4:11-17 (1988)), который встроен в программу ΑΕΙΟΝ (версия 2.0) с использованием таблицы массы остатков РАМ 120, штрафа длины промежутка 12 и штрафа промежутка 4. Кроме того, процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот может быть определен с использованием алгоритма Nееб1етаη и Χνιιηδοίι (1. Μοί. Βίοί. 48:444-453 (1970)), который встроен в программу САР в пакете программ ССС (доступен по адресу йίίρ://^^^.дсд.сοт) с использованием матрицы Βίοδδΐιιη 62 или матрицы РАМ250, веса промежутка 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4, и веса длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Дополнительно или альтернативно, белковые последовательности в соответствии с данным изобретением могут, кроме того, применяться в качестве поисковой последовательности, чтобы выполнять поиск в общедоступных базах данных, например, для идентификации родственных последовательностей. Такой поиск может быть проведен с использованием программы ХВЬА8Т (версия 2.0) А118сЬы1, еί а1. (1990) 1. Μοί. Βίοί. 215:403-10. Поиск белков ВЬА8Т может быть проведен с помощью программы ХВЬА8Т, баллы = 50, длина слова = 3, чтобы получить последовательности аминокислот, гомологичные по отношению к молекулам антител в соответствии с данным изобретением. Чтобы получить выравнивания с промежутками для целей сравнения, можно использовать ВЬА8Т Сарреб, как описано в АЕксЕЫ еί аР, (1997) ШсШс Ас1бк Век. 25(17):3389-3402. При применении программ ВЬА8Т и ВЬА8Т Сарреб подходят параметры по умолчанию соответствующих программ (например, ХВЬА8Т и NΒ^Α8Т). См. \ν\ν\ντκ:Ν.ηίιη.ηίΕ.8ον.
Антитела с консервативными модификациями.
В некоторых вариантах антитело в соответствии с данным изобретением включает вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменов СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов СЭВ1, СЭВ2 и СЭВ3, где одна или больше таких последовательностей СЭВ включает указанные последовательности аминокислот на основе предпочтительных антител, описанных в данном описании (например, Е7, Е9, Ό1 или Е2), или их консервативных модификаций, и где антитела сохраняют желательные функциональные свойства антиСХСВ4 антител в соответствии с данным изобретением. Специалисту в данной области будет понятно, что может быть осуществлена определенная консервативная модификация последовательности, которая не исключает связывания с антигеном. См., например, ВтиттеП еί аР (1993) ВюсЕет 32:1180-8 (описание мутационного анализа в домене СЭВ3 тяжелой цепи антител, специфичных в отношении 8ηίιηοгеИа); бе νίί6ί еί аР (1997) Ρτοί. Епд. 10:835-41 (описание исследования мутаций в анти-иА1 антителах); ΚοιηίκκΗΓον еί аР (1997) 1. ВюР СЕет. 272:26864-26870 (показывает, что мутации в середине НСЭВ3 приводили к потере или снижению сродства); НаП еί аР (1992) 1. Iттиηο1. 149:1605-12 (описание того, как изменение одной аминокислоты в участке СЭВ3 привело к потере связывающей активности); КеНеу апб ΟΌοη^ίί (1993) ВюсЕет. 32:6862-35 (описание вклада остатков Туг в связывание с антигенами); Аб1ЬСсодиу еί аР (1998) Ιηί. Iттиηο1. 10:341-6 (описание влияния гидрофобности в связывании) и Веегк еί аР
- 14 018836 (2000) С11п. Сан. Кез. 6:2835-43 (описание аминокислотных мутантов НСЭК3). Соответственно, в данном изобретении предлагается выделенное моноклональное антитело или его часть, которая связывается с антигеном, содержащее вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменов СЭК1, СЭК2 и СЭК3, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов СЭКЕ ССК2 и СПК3, где:
(a) последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭК3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8ЕО Ш N0: 9-12 и их консервативных модификаций;
(b) последовательность вариабельного участка легкой цепи СЭК3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 21-44 и их консервативных модификаций; и (c) антитело связывается с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки.
Дополнительно или альтернативно, антитело может обладать одним или больше из следующих функциональных свойств: (ί) связывается с человеческим СХСК4 с Кс 1 х 10-7 М или меньше; (ίί) ингибирует связывание 8ΌΕ-1 с СХСК4; (ίίί) ингибирует индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4; (ίν) ингибирует индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих СХСК4; (ν) ингибирует образование НиУЕС капиллярных трубочек; (νί) индуцирует апоптоз в клетках, экспрессирующих СХСК4 ίη νίΐτο и/или ίη νίνο; (νίί) ингибирует рост СХСК4+ опухолевых клеток ίη νίΐτο и/или ίη νίνο; и/или (νίίί) ингибирует метастазы СХСК4+ опухолевых клеток.
В предпочтительном варианте последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭК2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 5-8 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи СЭК2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 17-20 и их консервативных модификаций. В другом предпочтительном варианте последовательность вариабельного участка тяжелой цепи СЭК1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 1-4 и их консервативных модификаций; и последовательность вариабельного участка легкой цепи СЭК1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот 8Е0 Ш N0: 13-16 и их консервативных модификаций.
В различных вариантах антитело может быть, например, человеческим антителом, гуманизированным антителом или химерным антителом.
В данном описании термин консервативные модификации последовательности предназначен для обозначения модификаций аминокислот, которые не оказывают существенного воздействия и не изменяют в значительной степени характеристик связывания антитела, содержащего последовательность аминокислот. Такие консервативные модификации включают замены, добавление и делеции аминокислот. Модификации могут быть введены в антитело в соответствии с данным изобретением стандартными методами, известными из уровня техники, например сайт-специфический мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. Консервативные замены аминокислот представляют собой такие, при которых остаток аминокислоты заменяют на остаток аминокислоты, содержащий подобную боковую цепь. Семейства остатков аминокислот, содержащих подобные боковые цепи, определены в уровне техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), полярными незаряженньми боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или больше остатков аминокислот в пределах участков СЭК антитела в соответствии с данным изобретением могут быть заменены на другие остатки аминокислот из того же семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть проверено на предмет сохранения функции (т.е. функций, описанных выше), с использованием функциональных анализов, описанных в данном описании.
Антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и анти-СХСК4 антитела.
В другом варианте данного изобретения предлагаются антитела, которые связываются с таким же эпитопом на человеческом СХСК4, как и любое из моноклональных анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением (т.е. антитела, которые обладают способностью перекрестно конкурировать за связывание с СХСК4 с любым из моноклональных антител в соответствии с данным изобретением). В предпочтительных вариантах антитело сравнения для изучения перекрестной конкуренции может быть моноклональным антителом Е7 (содержащим последовательности νΗ и как показано в 8Е0 Ш N0: 25 и 29 соответственно), или моноклональным антителом Е9 (содержащим последовательности νΗ И как показано в 8Е0 Ш N0: 26 и 30 соответственно), или моноклональным антителом Ό1 (содержащим последовательности νΗ И Уъ, как показано в 8Е0 Ш N0: 27 и 31 соответственно), или моноклональным
- 15 018836 антителом Е2 (содержащим последовательности νΗ И Уь, как показано в 8ЕС ΙΌ N0: 28 и 32 соответственно).
Такие перекрестно-конкурирующие антитела могут быть идентифицированы на основе их способности перекрестно конкурировать с Е7, Е9, Ό1 или Е2 в стандартных анализах связывания с СХСК4. Например, проточная цитометрия с клетками СЕМ может быть использована для демонстрации перекрестной конкуренции с антителами в соответствии с данным изобретением, где антитело сравнения несет метку Е1ТС и оценивается способность исследуемого антитела ингибировать связывание Е1ТСмеченного антитела сравнения с клетками СЕМ. Способность исследуемого антитела ингибировать связывание, например, Е7, Е9, Ό1 или Е2, с человеческим СХСК4 демонстрирует, что исследуемое антитело может конкурировать с Е7, Е9, Ό1 или Е2 за связывание с человеческим СХСК4 и, таким образом, связывается с таким же эпитопом на человеческом СХСК4, как Е7, Е9, Ό1 или Е2. В предпочтительном варианте антитело, которое связывается с таким же эпитопом на СХСК4, как и Е7, Е9, Ό1 или Е2, представляет собой человеческое моноклональное антитело. Такие человеческие моноклональные антитела могут быть получены и выделены, как описано в примерах.
Сконструированные и модифицированные антитела.
Антитело в соответствии с данным изобретением дополнительно может быть получено с использованием антитела, содержащего одну или больше последовательностей νΗ и/или Уь, раскрытых в данном описании, как исходного материала для конструирования модифицированного антитела, причем модифицированное антитело может обладать измененными свойствами по сравнению с исходным антителом. Антитело может быть сконструировано путем модификации одного или больше остатков в пределах одного или обоих вариабельные участков (т.е. νΗ и/или Уь), например в пределах одного или больше участков СОК и/или в пределах один или больше каркасных доменов. Дополнительно или альтернативно, антитело может быть сконструировано путем модификации остатков в пределах константного участка(ов), например, для изменения эффекторной функции(й) антитела.
В некоторых вариантах, пересадка СОК может применяться для конструирования вариабельных участков антител. Антитела взаимодействуют с целевыми антигенами в основном посредством остатков аминокислот, которые расположены в шести определяющих комплементарность участках (участки СОК) тяжелой и легкой цепи. Для этого последовательности аминокислот в пределах участков СОК в большей степени различаются между индивидуальными антителами, чем последовательности за пределами участков СОК. Поскольку последовательности СОК ответственны за большинство взаимодействий антителоантиген, можно экспрессировать рекомбинантные антитела, которые имитируют свойства специфичных природных антител, конструируя векторы экспрессии, которые включают последовательности СОК специфичных природных антител, пересаженный на каркасные последовательности из другого антитела с другими свойствами (см., например, К1есйтапп, Ь. е! а1. (1998) №Шге 332:323-327; 1опек, Р. е! а1. (1986) Хаип-е 321:522-525; Сиеен, С. е! а1. (1989) Ргос. КаЙ. Асай 8ее. И.8.А. 86:10029-10033; патент США № 5225539, выданный ^ш!ет, в также патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Сиееп е! а1.).
Соответственно, другой вариант в соответствии с данным изобретением относится к выделенному моноклональному антителу или его части, связывающейся с антигеном, содержащему вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательности доменов СБК1, СЭК2 и СЭК3. содержащие последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 1-4, 8ЕС ΙΌ N0: 5-8 и 8ЕС ΙΌ N0: 9-12 соответственно, и вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательности доменов СЭК1, СЭК2 и СБК3, содержащие последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 13-16, 8ЕС ΙΌ N0: 17-20 и 8ЕС ΙΌ N0: 21-24 соответственно. Таким образом, такие антитела содержат последовательности СОК νΗ И ν!. моноклональных антител Е7, Е9, Ό1 или Е2, могут также содержать различные каркасные последовательности этих антител.
Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают генные последовательности антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепи могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека УБаке (доступна в Интернет по адресу в ^^^.тгс-сре.сат.ас.ик/уЬахе), а также в КаЬа!, Е.А., е! а1. (1991) 8ес.|иепсек оГ Рто!е1П8 оГ [1ппшпо1ощса1 [Шегек!, ΓίΠΙι Εάί!ίοη, И.8. Берайтеп! оГ ЖаИй апб Ηυтап 8егу1сек, ΜΗ РиЬНсайои №. 91-3242; ТотИпкоп, Ι.Μ., е! а1. (1992) Тйе Керейойе оГ Ηιιιηηη Сегтбпе νΗ 8ес.|иепсек Кеуеа1к аЬои! Е1йу Сгоирк оГ νΗ 8едтеп!к тейй Б|ГГегеп1 Ηуре^νа^^аЬ1е Ьоорк 1. Мо1. Бю1. 227:776-798; и Сох, 1.Р.Б. е! а1. (1994) А Бпейогу оГ ΗνιππΗΐ Сегт-йпе νΗ 8едтеп!к Кеуеа1к а 8!гопд В1ак т !йей икаде Еиг. 1. Iттииο1. 24:827-836; содержание каждой из которых явно включено в данное описание путем ссылки. В качестве другого примера последовательности ДНК зародышевой линии для человеческих генов вариабельных участков тяжелой и легкой цепи могут быть найдены в базе данных СепЬапк. Например, доступны следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, найденные у мышей НСо7 ΗιιΜΛΚ со следующими инвентарными номерами СепЬапк: 1-69 (КС_0010109, №Г_024637 и ВС070333), 3-33 (N^0010109 и ЭТ_024637) и 3-7 (N^0010109 и ЭТ_024637). Как другой пример доступны следующие последовательности тяжелой цепи зародышевой линии, найденные у мы
- 16 018836 шей НСо12 НиМАЬ, с инвентарными номерами СепЬапк: 1-69 (Ν0_0010109, ΝΤ_024637 и ВС070333), 551 (Ν0_0010109 и ΝΤ_024637), 4-34 (Ν6_0010109 и ΝΤ_024637), 3-30.3 (СА1556644) и 3-23 (А1406678). Еще одним источником человеческих последовательностей тяжелой и легкой цепи зародышевой линии является база данных генов человеческого иммуноглобулина, доступная от ΙΜΟΤ (1Шр://ппд1.сте5.1г).
Белковые последовательности антител сравнивают с компилированной базой данных белковых последовательностей с использованием одного из методов поиска сходства последовательностей под названием ВБА8Т Саррей (Л115сНн1 е1 а1. (1997) ШсШс Ас1Й5 КехеагсН 25:3389-3402), который хорошо известен специалистам в данной области. ВЬА8Т представляет собой эвристический алгоритм, где статистически значимое выравнивание между последовательностью антитела и последовательностью базы данных, вероятно, содержит сегментные пары с высоким баллом (Н8Р) выровненных слов. Сегментные пары, баллы для которых не могут быть улучшены удлинением или упорядочением, называются хитом (1ιίΐ). Если коротко, транслируют нуклеотидные последовательности УВА8Е происхождения (1Шр://уЬа5е.тгс-сре.сат.ас.икЛ'Ьа5е1/11512.рНр). и участок между (включительно) ЕВ1-ЕВ3 каркасного участка сохраняется. Средняя длина последовательностей баз данных составляет 98 остатков. Двойные последовательности, которые точно соответствуют друг другу по всей длине белка, исключают. Поиск ВЬА8Т для белков с использованием программы Ь1айр и стандартных параметров по умолчанию, кроме фильтра низкой сложности, который выключен, и матрицы замены ВЬО§иМ62, фильтры для 5 последовательностей, дающих хиты, дает пары. Нуклеотидные последовательности транслируют во всех шесть каркасов, и каркасы без стоп-кодонов в сегменте соответствия последовательности базы данных рассматривают как потенциальный хит. Это, в свою очередь, подтверждается с использованием программы ВЬА8Т 1Ь1аз1х, которая транслирует последовательность антитела во все шесть каркасов и сравнивает такие трансляции с нуклеотидными последовательностями УВА8Е, динамически транслированными во все шесть каркасов. Поиск в других базах данных последовательностей зародышевой линии человека, например, доступная от 1МСТ (Ьйр://1тдЕсше8.1г), может быть проведен так же, как изложено выше для УВА8Е.
Идентичность представляет собой точное соответствие аминокислот между последовательностью антитела и базой данных белков для полной длины последовательности. Позитив (идентичность + соответствие замены) не идентичен, но замены аминокислот проводятся матрицей замены ВЬО8иМ62. Если последовательность антитела соответствует двум последовательностям из базы данных с одинаковой идентичностью, хит с большинством позитивов был бы принят как хит соответствия последовательностей.
Предпочтительными каркасными последовательностями для использования в антителах в соответствии с данным изобретением являются такие, которые структурно подобны каркасным последовательностям, используемым в выбранных антителах в соответствии с данным изобретением, например подобны каркасным последовательностям УН 3-48 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 49) и/или каркасной последовательности УК Ь15 (8ЕС ΙΌ ΝΟ: 50), используемой в предпочтительных моноклональных антителах в соответствии с данным изобретением. Последовательности доменов СЭВ1, СЭК2 и СЭК3 УН и последовательности доменов СЭВ1, СЭК2 и СЭК3 УК могут быть пересажены на каркасные участки, последовательность которых идентична найденной в гене иммуноглобулина зародышевой линии, из которого получена каркасная последовательность, или последовательности СЭВ могут быть пересажены на каркасные участки, которые содержат одну или больше мутаций по сравнению с последовательностями зародышевой линии. Например, было обнаружено, что в некоторых случаях выгодно осуществлять мутации остатков в рамках каркасных участков для поддержания или усиления способности антитела к связыванию с антигеном (см., например, патенты США №№ 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, выданные Оиеен е! а1.).
Другой вид модификации вариабельного участка состоит в мутации остатков аминокислот в пределах участков СЭВ1, СЭК2 и/или СЭК3 УН и/или УК, чтобы таким образом улучшить одно или больше свойств (например, сродство) связывания целевого антитела. Сайт-специфический мутагенез или ПЦРопосредованный мутагенез может осуществляться с целью введения мутации(й), и влияние на связывание антитела или другое целевое функциональное свойство может быть оценено в анализах ίη νίΐτο или ίη νίνο, как описано в данном описании и предложено в примерах. Предпочтительно вводят консервативные модификации (как обсуждалось выше). Мутации могут представлять собой замены, добавление или делеции аминокислот, но предпочтительными являются замены. Кроме того, обычно изменяют не более чем один, два, три, четыре или пять остатков в пределах участка СЭВ.
Соответственно, в другом варианте данного изобретения предлагаются выделенные моноклональные анти-СХСК4 антитела или их части, связывающиеся с антигеном, содержащие вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: (а) участок СЭВ1 УН, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1-4, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 1-4; (Ь) участок СЭВ2 УН, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 5-8, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 5-8; (с) участок СЭВ3 УН, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ ΝΟ: 9
- 17 018836
12, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 9-12; (ά) участок СЭК1 νκ, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 13-1б, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 13-1б; (е) участок СЭК2 νκ, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 17-20, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 17-20; и (Г) участок СЭК3 νκ, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 21-24, или последовательность аминокислот, содержащую одну, две, три, четыре или пять замен, делеций или добавлений аминокислот по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0: 21-24.
Сконструированные антитела в соответствии с данным изобретением включают такие, в которых осуществлены модификации остатков каркаса в пределах νΗ и/или νκ, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие модификации каркаса осуществляют с целью уменьшения иммуногенности антитела. Например, один из подходов состоит в обратной мутации одного или больше остатков каркаса в последовательности соответственной зародышевой линии. Более конкретно, антитело, которое содержит соматическую мутацию, может содержать остатки каркаса, которые отличаются от последовательности зародышевой линии, из которых антитело получено. Такие остатки могут быть идентифицированы сравнением каркасной последовательности антитела с последовательностями зародышевой линии, из которых антитело получено.
Например, для участка νΗ Е7 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации ЕлЬа!) отличаются от зародышевой линии: 1, б и 25. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: 01Е. ОбЕ и Л258. Предпочтительная модифицированная форма участка νΗ Е7 представляет собой νΗ Е7СЬ (последовательность аминокислот, которая показана на фиг. 5А и в 8Е0 ΙΌ N0: 41), которая содержит следующие замены в каркасе: 01Е и ОбЕ.
Кроме того, для участка νκ Е7 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации 1<аЬа1) отличаются от зародышевой линии: 1, 3 и 84. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: Ά1Ό, К30 и ν84Α. Предпочтительная модифицированная форма участка νκ Е7 представляет собой νκ Е7СЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 5В и в 8Е0 ΙΌ N0: 45), которая содержит следующие замены в каркасе: Α1Ό и К30.
Кроме того, для участка νΗ Е9 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации 1<аЬа1) отличаются от зародышевой линии: 1, б и 25. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: 01Е, ОбЕ и Α258. Предпочтительная модифицированная форма участка Е9 νΗ представляет собой νΗ Е9СЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. бА и в 8Е0 ΙΌ N0: 42), которая содержит следующие замены в каркасе: 01Е и ОбЕ.
Кроме того, для участка νκ Е9 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации 1<аЬа1) отличаются от зародышевой линии: 1, 3, 4 и б0. Одно, два, три или все четыре из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух, трех или всех четырех из следующих замен: ЕЮ, У30, Ь4М и Рб08. Предпочтительная модифицированная форма участка νκ Е9 представляет собой νκ Е9СЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. бВ и в 8Е0 ΙΌ N0: 4б), которая содержит следующие замены в каркасе: ЕЮ, У30 и Ь4М.
Кроме того, для участка νΗ Ό1 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации 1<аЬа1) отличаются от зародышевой линии: б, 25 и 7б. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: ОбЕ, Α258 и К7б1<. Предпочтительная модифицированная форма участка νΗ Ό1 представляет собой νΗ ОЮЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 7А и в 8Е0 ΙΌ N0: 43), которая содержит следующую замену в каркасе: ОбЕ.
Кроме того, для участка νκ Ό1 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации 1<аЬа1) отличаются от зародышевой линии: 1, 3, 4, 45 и 4б. Одно, два, три, четыре или все пять из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной, двух, трех, четырех или всех пяти из следующих замен: ν1Ό, \У30, ν4Μ, Е45< и Ь4б8. Предпочтительная модифицированная форма участка νκ Ό1 представляет собой νκ ОЮЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 7В и в 8Е0 ΙΌ N0: 47), которая содержит следующие замены в каркасе: ν1Ό, \У30 и ν4Μ.
- 18 018836
Кроме того, для участка νΗ Е2 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации КаЬа!) отличаются от зародышевой линии: 6 и 25. Одно или оба из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностях зародышевой линии с помощью одной или обеих из следующих замен: 06Е и А258. Предпочтительная модифицированная форма участка νΗ Е2 представляет собой νΗ Е2СЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 8А и в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 44), которая содержит следующую замену в каркасе: 06Е.
Кроме того, для участка νκ Е2 следующие положения аминокислот каркасного участка (с использованием системы нумерации КаЬа!) отличаются от зародышевой линии: 1, 3 и 4. Одно, два или все три из этих положений могут быть подвергнуты обратной мутации в последовательностям зародышевой линии с помощью одной, двух или всех трех из следующих замен: ЕГО, ν30 и Ь4М. Предпочтительная модифицированная форма участка νκ Е2 представляет собой νκ Е2СЬ (последовательность аминокислот которой показана на фиг. 8В и в 8Е0 ГО ΝΟ: 48), которая содержит следующие замены в каркасе: ЕГО, \'3Е) и Ь4М.
Другой вид модификации каркаса включает мутацию в одном или больше остатков в рамках каркасного участка или даже в пределах одного или больше участков СОЯ, чтобы исключить эпитопы Тклеток и, таким образом, уменьшить, сократить потенциальную иммуногенность антитела. Данный подход также называется деиммунизация (бепптишха!юп) и подробно описан Сагг е! а1. в патентной публикации США № 20030153043.
Дополнительно или альтернативно модификациям, осуществленным в каркасных участках или участках СЭЯ, антитела в соответствии с данным изобретением могут быть сконструированы таким образом, чтобы включать модификации в пределах участка Ес, обычно с целью изменения одного или больше функциональных свойств антитела, например периода полувыведения из сыворотки, фиксации комплемента, связывания с рецептором Ес и/или антигензависимой клеточной цитотоксичности. Кроме того, антитело в соответствии с данным изобретением может быть модифицировано химически (например, один или больше химических фрагментов могут быть присоединены к антителу), или оно может быть модифицировано таким образом, чтобы изменить его гликозилирование, снова изменить одно или больше функциональных свойств антитела. Каждый из этих вариантов подробнее описан ниже. Нумерация остатков в участке Ес представляет собой нумерацию индекса ЕС по КаЬаЕ
В одном варианте шарнирная область СН1 модифицирована таким образом, что количество остатков цистеина в шарнирной области изменено, например увеличено или уменьшено. Данный подход описан подробнее Βο6ιι'κγ е! а1. в патенте США № 5677425. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН1 изменяют, например, с целью облегчения сборки легких и тяжелых цепей или для увеличения или уменьшения стабильности антитела.
В другом варианте в шарнирную область Ес антитела введены мутации с целью уменьшения периода полувыведения антитела из биологических систем. Более конкретно одна или больше мутаций аминокислот введены в участок домена СН2-СН3 на границе фрагмента Ес-шарнир таким образом, что снижается способность антитела связываться с протеином А стафилококков (8рА) относительно связывания природного домена Ес-шарнир со 8рА. Данный подход описан более подробно \Уагб е! а1. в патенте США 6165745.
В другом варианте антитело модифицируют с целью увеличения его периода полувыведения из биологических систем. Возможны различные подходы. Например, могут быть введены одна или больше из следующих мутаций: Т252Б, Т2548, Т256Е, как описано в патенте США 6277375, выданном \Уагб. Альтернативно, для увеличения периода полувыведения из биологических систем, антитело может быть изменено в пределах участка СН1 или Сь, чтобы включить эпитоп связывания с рецептором спасения (5а1маде гесерФг), взятый из двух петель домена СН2 участка Ес 1дС, как описано РгеЧа е! а1. в патентах США №№ 5869046 и 6121022.
В других вариантах участок Ес изменяют, заменяя как минимум один остаток аминокислоты на другой остаток аминокислоты, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Например, одна или больше аминокислот, выбранных из остатков аминокислот 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322, может быть заменена на другой остаток аминокислоты таким образом, что изменится сродство антитела к эффекторному лиганду, но сохранится способность связывания с антигеном материнского антитела. Эффекторный лиганд, сродство к которому изменено, может представлять собой, например, рецептор Ес или компонент С1 комплемента. Данный подход описан более подробно в патентах США №№ 5624821 и 5648260, оба выданы \Уш!ег е! а1.
В другом примере одна или больше аминокислот, выбранных из остатков аминокислот 329, 331 и 322, может быть заменена другим остатком аминокислоты таким образом, что изменяется связывание антитела с С1с.| и/или уменьшается или устраняется комплементзависимая цитотоксичность (СЭС). Данный подход подробнее описан Ииюще е! а1. в патенте США № 6194551.
В другом примере изменяют один или больше остатков аминокислот в пределах положений аминокислот 231 и 239, чтобы таким образом изменить способность антитела к связыванию комплемента. Данный подход подробнее описан Βο6ιικγ е! а1. в публикации РСТ \УО 94/29351.
Еще в одном примере участок Ес модифицируют с целью повышения способности антитела опо
- 19 018836 средовывать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС) и/или увеличения сродства антитела к рецептору Есу путем модификации одной или больше аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Данный подход подробнее описан Ргейа в публикации РСТ \У0 00/42072. Более того, была построена карта сайтов связывания на человеческом !дС1 для ЕсуШ, ЕсуКЛ, ЕсуКШ и ЕсКп, и описаны варианты с улучшенным связыванием (см. §Ые1б§, К.Ь. е1 а1. (2001) 1. ΒίοΙ. С’Неш. 276:6591-6604). Было показано, что конкретные мутации в положениях 256, 290, 298, 333, 334 и 339 улучшают связывание с ЕсуКШ. Кроме того, описаны следующие комбинационные мутанты для улучшения связывания с ЕсуКШ: Т256А/8298А, 8298А/Е333А, 8298А/К224А и 8298А/Е333А/К334А.
В другом варианте модифицируют гликозилирование антитела. Например, может быть получено негликозилированное антитело (т.е. антитело без гликозилирования). Гликозилирование может быть изменено, например, для увеличения сродства антитела к антигену. Такие модификации углеводорода могут быть осуществлены, например, изменением одного или больше сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, могут быть осуществлены одна или больше замен аминокислот, что приводит к устранению одного или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке каркаса, таким образом, исключая гликозилирование на данном сайте. Такое отсутствие гликозилирования может увеличивать сродство антитела к антигену. Такой подход подробнее описан Со е1 а1. в патентах США №№ 5714350 и 6350861.
Дополнительно или альтернативно, может быть получено антитело с измененным типом гликозилирования, например гипофукозилированное антитело, содержащее уменьшенные количества фукозильных остатков, или антитело, содержащее увеличенное количество разделенных пополам структур С1с№1с. Продемонстрировано, что такой измененный характер гликозилирования увеличивает способность антител к АЭСС. Такие модификации углеводородов могут быть осуществлены, например, экспрессией антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в уровне техники и могут использоваться в качестве клетокхозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела в соответствии с данным изобретением, чтобы таким образом получить антитело с измененным гликозилированием. Например, в линиях клеток М§704, М§705 и М§709 отсутствует ген фукозилтрансферазы, ЕИТ8 (а(1,6)фукозилтрансферазы), таким образом, что в антителах, экспрессированных в линиях клеток М§704, М§705 и М§709, отсутствует фукоза в углеводородных цепях. Линии клеток М§704, М§705 и М§709 ЕИТ8-/- были созданы целенаправленным разрушением гена ЕИТ8 в клетках СН0/ИС44, с использованием двух векторов замены (см. патентную публикацию США № 20040110704 Уатаие е1 а1. и Уатапе-01ишк| е1 а1. (2004) Вю1ес1то1 Вюеид 87:614-22). В качестве другого примера Наиа1 е1 а1. в ЕР 1176195 описывают линию клеток с функционально разрушенным геном ЕИТ8, который кодирует фукозилтрансферазу, таким образом, что антитела, экспрессированные в такой линии клеток, демонстрируют гипофукозилирование с уменьшением или устранением а-1,6-связи для соответствующего фермента. Напа1 е1 а1. также описывают линии клеток с низкой ферментной активностью для добавления фукозы к №ацетилглюкозамину, который связывается с участком Ес антитела, или которые не обладают ферментной активностью, например линия клеток миеломы крыс ΥΒ2/0 (АТСС СКЬ 1662). Ргейа в публикации РСТ \У0 03/035835 описывает вариант линии клеток СНО, клетки Ьес13, со сниженной способностью к присоединению фукозы к связанным с А§и(297) углеводородам, что также приводит к гипофукозилированию антител, экспрессирующихся в такой клетке-хозяине (см. также 8Ые1б5, К.Ь. е1 а1. (2002) 1. Βίο1. С1ет. 277:26733-26740). Антитела с измененным профилем гликозилирования также могут быть продуцированы в куриных яйцах, как описано в патентной заявке США № РСТ/И8 06/05853. Альтернативно, антитела с модифицированным профилем гликозилирования могут быть продуцированы в клетках растений, например Ьетиа. Способы продуцирования антител в системе растения раскрыты в патентной заявке США, соответствующей регистрационному номеру поверенных АМоп & В1гб ЬЬР № 040989/314911, поданной 11 августа 2006 г. Итапа е1 а1. в публикации РСТ \У0 99/54342 описывают линии клеток, сконструированные для экспрессии гликопротеин-модифицирующих гликозилтрансфераз (например, в(1,4)-Ы-ацетилглюкозаминилтрансфераза ΙΙΙ [СиТШ]) таким образом, что антитела, экспрессированные в сконструированных клеточных линиях, демонстрируют увеличенное содержание разделенных пополам структур С1с№с, что приводит к увеличенной активности АЭСС антител (см. также Итапа е1 а1. (1999) №11. Вю1ес11. 17:176-180). Альтернативно, остатки фукозы в антителе могут быть отщеплены с применения фермента фукозидазы. Например, фукозидаза α-Ь-фукозидаза удаляет фукозильные остатки из антител (Тага^то, А.Ь. е1 а1. (1975) Вюскет. 14:5516-23).
Другая модификация антител в данном описании, которая предусматривается данным изобретением, - пегилирование. Антитело может быть пегилировано, например, для увеличения периода полувыведения антитела из биологических систем (например, сыворотки). Для пегилирования антитела обычно проводят реакцию антитела или его фрагмента с полиэтиленгликолем (ПЭГ), таким как реакционноспо
- 20 018836 собный эфир или альдегидное производное ПЭГ, в условиях, в которых одна или больше групп ПЭГ присоединяются к антителу или фрагменту антитела. Предпочтительно пегилирование осуществляют посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционноспособной молекулой ПЭГ (или аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером). В данном описании термин полиэтиленгликоль предназначен включать любую из форм ПЭГ, которые применяются для дериватизации других белков, например моно(С1-С10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль или полиэтиленгликоль малеинимид. В некоторых вариантах антитело для пегилирования представляет собой агликозилированное антитело. Способы пегилирования белков известны из уровня техники и могут быть применены к антителам в соответствии с данным изобретением. См., например, ЕР 0154316 (Νίδΐιίιηιιπι е! а1.) и ЕР 0401384 (НЫкатеа е! а1.).
Фрагменты антитела и миметики антитела.
Данное изобретение не ограничивается традиционными антителами и может практиковаться посредством применения фрагментов антитела и миметиков антитела. Как подробно описано ниже, на сегодняшний день создан и широко известен из уровня техники широкий спектр технологий фрагментов антитела и миметиков антитела. Хотя в целом ряде таких технологий, например доменные антитела, нанотела (папоЬой1е§) и юнитела (ипЬоФек), используют фрагменты или другие модификации традиционной структуры антител, существуют также альтернативные технологии, например аффитела (АГПЬой1е5). ΟΑΒΡίπ. антикалины (Апйсайпк), авимеры и версатела (УегкаЬоФек), где используются обеспечивающие связывание структуры, которые, хотя и имитируют традиционное связывание антител, созданы и функционируют посредством других механизмов.
Доменные антитела (йАЬ) представляют собой наименьшие функциональные единицы связывания антител, соответствующие вариабельным участкам тяжелой (УН) или легкой (Уь) цепей человеческих антител. Молекулярный вес доменных антител составляет приблизительно 13 кДа. ЭотапЮ разработаны серии больших и чрезвычайно функциональных библиотек полностью человеческих йАЬ УН И Уъ (более 10 млрд. различных последовательностей в каждой библиотеке), и использует эти библиотеки, чтобы выбрать йАЬ, специфичных в отношении терапевтических мишеней. В противоположность многим обычным антителам доменные антитела хорошо экспрессируются в системах бактериальных, дрожжевых клеток и клеток млекопитающих. Более подробное описание доменных антител и способов их продуцирования может быть найдено в патентах США 6291158; 6582915; 6593081; 6172197; 6696245; публикации США, серийный № 2004/0110941; европейской патентной заявке № 1433846 и европейских патентах 0368684 & 0616640; АО 05/035572, АО 04/101790, АО 04/081026, АО 04/058821, АО 04/003019 и АО 03/002609, каждый из которых включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте.
Нанотела представляют собой полученные из антитела терапевтические белки, которые обладают уникальными структурными и функциональными свойствами природных антител с тяжелой цепью. Такие антитела с тяжелой цепью содержат одинарный вариабельный домен (УНН) и два константных домена (СН2 и СН3). Важно, что клонированный и выделенный домен УНН представляет собой полипептид с отличной стабильностью, сохраняющий полностью способность связывания с антигеном исходного антитела с тяжелой цепью. Нанотела демонстрируют высокую степень гомологии с доменами УН человеческих антител и могут быть дополнительно гуманизированы без какого-либо снижения активности. Важно, что нанотела обладают низким иммуногенным потенциалом, что подтверждено в исследованиях на приматах ведущих соединений нанотел.
Нанотела сочетают преимущества обычных антител с важными признаками низкомолекулярных лекарственных средств. Подобно обычным антителам, нанотела показывают высокую специфичность в отношении мишени, высокое сродство в отношении мишени и низкую собственную токсичность. Однако, подобно низкомолекулярным лекарственным средствам, они могут ингибировать ферменты и легко получают доступ к расщелинам рецептора. Кроме того, нанотела чрезвычайно стабильны, могут вводиться другими способами, помимо инъекции (см., например, АО 04/041867, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте), а также их легко производить. Другие преимущества нанотел включают распознавание необычных или скрытых эпитопов как результат их небольшого размера, связывание во впадинах или на активных сайтах белковых мишеней с высоким сродством и селективностью за счет их уникальной 3-мерной структуры, гибкости формата лекарственного средства, адаптация периода полувыведения, а также легкость и быстрота разработки лекарственных средств.
Нанотела кодируются одинарными генами и эффективно продуцируются практически во всех прокариотных и эукариотных хозяевах, например Е. сой (см., например, патент США 6765087, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте), плесневых грибах (например, АкрегдШик или Тпсйойегта) и дрожжах (например, Бассйаготусек, К1иууеготусе5, Наи8епи1а или РюЫй) (см., например, патент США 6838254, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте). Производственный процесс поддается масштабированию, с производством многих килограммов нанотел. Поскольку нанотела демонстрируют превосходящую стабильность по сравнению с обычными антителами, они могут быть введены в готовый к употреблению раствор с длительным сроком хранения.
Способ №пос1опе (см., например, АО 06/079372, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте) представляет собой частный способ генерации нанотел против целевой мишени,
- 21 018836 основанный на автоматизированной высокопродуктивной селекции В-клеток, и может использоваться в контексте данного изобретения.
Юнитела представляют собой другую технологию фрагментов антитела, однако данная технология базируется на удалении шарнирной области из 1дС4 антител. Делеция шарнирной области приводит к образованию молекулы, которая, по существу, вдвое меньше традиционных 1дС4 антител и содержит одновалентный участок связывания вместо двухвалентного участка связывания 1дС4 антител. Также хорошо известно, что 1дС4 антитела инертны и поэтому не взаимодействуют с иммунной системой, что может быть предпочтительным при лечении заболеваний, где иммунная реакция нежелательна, и данное преимущество передается юнителам. Например, юнитела могут функционировать таким образом, чтобы ингибировать или глушить, но не убивать клетки, с которыми они связываются. Дополнительно связывание юнитела с раковыми клетками не стимулирует их пролиферацию. Кроме того, поскольку размер юнител составляет половину размера традиционных 1дС4 антител, они могут показывать лучшее распределение в больших солидных опухолях с потенциально лучшей эффективностью. Юнитела выводятся из организма со скоростью, подобной цельным 1дС4 антителам, и могут связываться с целевыми антигенами со сродством, подобным сродству цельных антител. Более подробное описание юнител можно найти в патентной заявке \¥0 2007/059782, которая включена в данное описание путем ссылки во всей ее полноте.
Молекулы аффител представляют новый класс аффинных белков, основанных на домене белка длиной 58 остатков аминокислот, происходящем от одного из 1дС-связывающихся доменов стафилококкового протеина А. Данный домен в виде связки трех спиралей используется в качестве платформы для конструирования комбинаторных библиотек фагемид, из которых могут быть выбраны варианты аффител, направленных на целевые молекулы, с использованием технологии показа фага Щогб К., Сиппепиззоп Е., КтпдбаЫ 1., 81аН1 8., ИЫеп М., Ждгеп Р.А., Вшбшд ргсИепъ 8е1ес1еб Ггот сотЫпаШгкб НЬгапез оГ ап а-йейса1 Ьас1епа1 гесер!ог ботам, №11 Вю1ес1то1 1997;15:772-7. Коптагк 1., Сгоп1ипб Н., ИЫеп М., дгеп Р.А., Нитап 1ттипод1оЬи1т А (1дА)-зрес1йс йдапбз Ггот сотЫпа1опа1 епдтееппд оГ рго1ет А, Еиг. 1. Вюскет. 2002;269:2647-55.). Простая прочная структура молекул аффител в комбинации с их низкой молекулярной массой (6 кДа) делает их подходящими для широкого спектра применения, например в качестве реактивов (Коптагк 1., Напззоп М., Nдиуеη Т., е! а1., Сопзйисйоп апб с11агас1еп/абоп оГ аГПЬобуРс сЫтетаз ргобисеб ίη ЕзскепсЫа сок, к 1ттипо1. МеШобз 2002; 261:199-211) для обнаружения и ингибирования взаимодействия рецептора (ЗапбЧогт К., Хи Ζ., РотзЬетд С., Ждгеп Р.А., 1п1иЬШоп оГ Ле СЭ28-СЭ80 со-зйти1айоп з1дпа1 Ьу а СО28-Ьтбшд АГйЬобу йдапб беνе1οреб Ьу сотЬтаШгкб рго1ет епдшееппд, Рго1ет Епд 2003; 16:691-7). Более подробное описание аффител и способов их продуцирования можно найти в патенте США № 5831012, который включен в данное описание путем ссылки во всей его полноте.
Меченные аффитела также могут быть пригодными для приложений, связанных с обработкой изображений с целью определения встречаемости изоформ.
ОАКРш (Эезщпеб Апкупп Кереа! Рго1етз) представляет собой один из примеров миметического антитела ЭКР (Эезщпеб Кереа! Рго1ет), который разработан, чтобы использовать способности связывания полипептидов, которые не являются антителами. Повторяющиеся белки, такие как анкирин или богатые лейцином повторяющиеся белки, представляют собой встречающиеся повсюду молекулы со свойствами связывания, которые, в отличие от антител, встречаются в клетках и вне клеток. Особенностью их уникальной модульной архитектуры является повторение структурных единиц (повторы), которые складываются в связку, чтобы сформировать удлиненные повторные домены, демонстрирующие вариабельные и модульные поверхности связывания с мишенью. На основе такой модульной структуры могут быть сгенерированы комбинаторные библиотеки полипептидов с чрезвычайно разнообразной специфичностью связывания. Данная стратегия включает консенсусный дизайн самосовместимых повторов, демонстрирующих вариабельные внешние остатки, и их случайную сборку в повторяющиеся домены.
ОАКРш могут быть продуцированы в бактериальных системах экспрессии с очень высокими выходами, и они принадлежат к наиболее устойчивым из известных белков. Были отобраны ОАКРт с высокой специфичностью и высоким сродством к широкому спектру целевых белков, в том числе человеческим рецепторам, цитокинам, киназам, человеческим протеазам, вирусам и белкам мембран. Могут быть получены ПАКР1п, демонстрирующие значения сродства в интервале одного знака от наномолярного до пикомолярного.
ОАКРш применяются в широком спектре областей, в том числе ЕБ18А, сэндвичевый ЕБ18А, анализ методом проточной цитометрии (РАС8), иммуногистохимия (1НС), применение с микрочипами, аффинная очистка или Вестерн-блоттинг. Также оказалось, что ОАКРш чрезвычайно активны во внутриклеточном отсеке, например, как внутриклеточные маркерные белки, слитые с белком зеленой флуоресценции (СРР). Кроме того, ОАКР1п применяли для ингибирования вход вирусов с 1С50 в интервале пМ. ОАКРт идеальны не только для блокирования взаимодействия белок-белок, но и для ингибирования ферментов. Протеазы, киназы и носители успешно ингибировались, чаще всего в аллостерическом режиме ингибирования. Очень быстрое и специфичное обогащение на опухоли и крайне благоприятное соотношение содержания в опухоли к содержанию в крови делают ОАКРт подходящими для диагно
- 22 018836 стики ίη νίνο или терапевтических подходов.
Дополнительная информация относительно ΌΛΚΡίη и других технологий ΌΚΡ может быть найдена в публикации патентной заявки США № 2004/0132028 и публикации международной патентной заявки \У0 02/20565, обе из которых, таким образом, включены путем ссылки во всей их полноте.
Антикалины (Айюа11И8) представляют собой дополнительную технологию миметиков антител, однако, в данном случае специфичность связывания происходит от липокалинов, семейства низкомолекулярных белков, которые природным образом обильно экспрессируются в тканях человека и жидкостях биологического происхождения. Липокалины ίη νίνο принимают участие в широком спектре функций, связанных с физиологическим транспортом и хранением химически чувствительных или нерастворимых соединений. Липокалины содержат прочную внутреннюю структуру, включающую высококонсервативную 6-складчатую конформацию белка, которая поддерживает четыре петли на одном конце белка. Эти петли формируют вход в карман связывания и конформационные различия в данной части молекулы, ответственные за вариации в специфичности связывания между индивидуальными липокалинами.
Хотя общая структура гипервариабельных петель, поддерживаемых консервативным β-листовым каркасом, напоминает иммуноглобулины, липокалины значительно отличаются от антител размером, будучи составлены из одинарной цепи полипептида длиной 160-180 аминокислот, которая немного больше, чем одинарный домен иммуноглобулина.
Липокалины клонировали и их петли подвергали конструированию с целью создания антикалинов. Сгенерированы библиотеки структурно различных антикалинов, и показ антикалина позволяет селекцию и скрининг функции связывания, с последующей экспрессией и продуцированием растворимого белка для дальнейшего анализа в прокариотных или эукариотных системах. Исследования успешно продемонстрировали, что могут быть созданы антикалины, которые являются специфичными фактически по отношению к любому белку-мишени человека, который может быть выделен, и могут быть получены значения сродства связывания в наномолярном интервале или выше.
Антикалины также могут быть форматированы как белки с двойными мишенями, так называемые дуокалины. Дуокалин связывается с двумя отдельными терапевтическими мишенями в один легкопродуцированный мономерный белок с использованием стандартных производственных процессов, при сохранении целевой специфичности и сродства, независимо от структурной ориентации его двух доменов связывания.
Модуляция множественных мишеней через единую молекулу особенно предпочтительна при заболеваниях, с доказанным участие более чем одного этиологического фактора. Кроме того, би- или поливалентные форматы связывания, такие как дуокалины, обладают значительным потенциалом с точки зрения нацеливания на молекулы поверхности клетки при заболевании, опосредованном агонистическими эффектами на пути преобразования сигнала или индуцированием усиленных эффектов интернализации посредством связывания и объединения в кластеры рецепторов на поверхности клетки. Кроме того, высокая внутренняя стабильность дуокалинов сравнима с мономерными антикалинами, что обеспечивает гибкость лекарственных форм и потенциал доставки для дуокалинов.
Дополнительная информация относительно антикалинов может быть найдена в патенте США 7250297 и публикации международной патентной заявки \У0 99/16873, обе из которых, таким образом, включены путем ссылки во всей их полноте.
Другая технология миметиков антител, пригодная в контексте данного изобретения, представляет собой авимеры. Авимеры развились из большого семейства человеческих внеклеточных доменов рецепторов путем перестановки экзонов ίη νίίΓο и показа фага, с генерацией многодоменных белков, обладающих свойствами связывания и ингибирования. Показано, что связывание множественных независимых доменов связывания создает авидность и приводит к улучшению сродства и специфичности по сравнению с обычными белками, связывающимися с одинарным эпитопом. Другие потенциальные преимущества включают простое и эффективное продуцирование полиспецифических (в отношении многих мишеней) молекул в Е^сНспсЫа отИ улучшенную термостабильность и устойчивость к действию протеаз. Получены авимеры с суб-наномолярными значениями сродства в отношении разнообразных мишеней.
Дополнительная информация относительно авимеров может быть найдена в публикациях патентных заявок США №№ 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, все из которых, таким образом, включены ссылки во всей их полноте.
Версатела (νοΓ5;ώοάίθ5) представляет собой другую технологию миметиков антитела, которая может применяться в контексте данного изобретения. Версатела представляет собой низкомолекулярные белки размером 3-5 кДа, содержащие >15% остатков цистеина, которые формируют платформу с высокой плотностью дисульфидных связей, заменяющую гидрофобное ядро, которое содержат типичные белки. Замена большого количества гидрофобных аминокислот, составляющих гидрофобное ядро, небольшим количеством дисульфидных связей приводит к образованию белка меньшего размера, с большими гидрофильными свойствами (меньшая степень агрегации и неспецифического связывания), более устойчивых к действию протеаз и нагревания, с меньшей плотностью эпитопов Т-клеток, поскольку остатки, которые в наибольшей степени способствуют представлению МНС, гидрофобны. Известно, что
- 23 018836 все четыре из этих свойств влияют на иммуногенность, и ожидают, что вместе они приведут к значительному снижению иммуногенности.
Идея версател возникла из природных инъекционных биофармацевтических средств, вырабатываемых пиявками, змеями, пауками, скорпионами, улитками и анемонами, которые неожиданно продемонстрировали низкую иммуногенность. Начиная с выбранных семейств природных белков, с помощью дизайна и скрининга размер, гидрофобность, протеолитическая обработка антигена и плотность эпитопов были минимизированы до уровней намного ниже среднего для природных инъекционных белков.
С учетом структуры версател, эти миметики антител обеспечивают многосторонний формат, который включает поливалентность, полиспецифичность, разнообразие механизмов регулирования периода полувыведения, модули, направленные на ткани, и отсутствие участка Ес антитела. Кроме того, версатела продуцируются в Е. со11 с высоким выходом, и благодаря своей гидрофильности и небольшому размеру, версатела хорошо растворимы и могут быть введены в препараты в высоких концентрациях. Версатела являются исключительно устойчивыми к нагреванию (их можно кипятить) и обеспечивают длительный срок хранения.
Дополнительная информация относительно версател может быть найдена в публикации патентной заявки США № 2007/0191272, которая, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте.
Подробное описание технологий фрагментов антител и миметиков антитела, описанных выше, не является исчерпывающим перечнем всех технологий, которые могут применяться в контексте данного описания. Например, не ограничиваясь ими, разнообразные дополнительные технологии, включая альтернативные технологии на базе полипептидов, например, слияние определяющих комплементарность участков, как обрисовано в Οιιί е! а1., Ыа1иге Вю!ес11по1оду. 25(8) 921-929 (2007), которая, таким образом, включена путем ссылки во всей ее полноте, а также технологии на основе нуклеиновых кислот, например технологии аптамера (ар!атег) РНК, описанные в патентах США №№ 5789157, 5864026, 5712375, 5763566, 6013443, 6376474, 6613526, 6114120, 6261774 и 6387620, все из которых, таким образом, включены путем ссылки, могут применяться в контексте данного изобретения.
Физические свойства антител.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть дополнительно охарактеризованы различными физическими свойствами анти-СХСК4 антител. Различные анализы могут применяться для обнаружения и/или дифференциации различных классов антител на основе таких физических свойств.
В некоторых вариантах антитела в соответствии с данным изобретением могут содержать один или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке легкой или тяжелой цепи. Присутствие одного или больше сайтов гликозилирования в вариабельном участке может приводить к повышению иммуногенности антитела или изменению рК антитела за счет измененного связывания с антигеном (МагкЬаИ е! а1. (1972) Аппи Кеу Вюскет 41:673-702; Са1а Е.А. апб Моткоп 8.Ь. (2004) 1. 1ттипо1. 172:5489-94; ^а111ск е! а1. (1988), 1. Ехр. Меб. 168:1099-109; 8р1го К.С. (2002) С1усоЬю1оду 12:43К-56К; РагекЬ е! а1. (1985), №1!иге 316:452-7; М1тига е! а1. (2000) Мо1. 1ттипо1. 37:697-706). Известно, что гликозилирование происходит в мотивах, содержащих последовательность Ν-Χ-8/Τ. Гликозилирование вариабельного участка может быть исследовано с использованием анализа С1усоЬ1о1, в котором антитело расщепляется с образованием ЕаЬ, с последующими анализами гликозилирования, с применением испытания, в котором измеряют окисление перйодатом и образование основания Шиффа. Альтернативно, гликозилирование вариабельного участка может быть исследовано с использованием световой хроматографии Эюпех (ΌΙΟΝΕΧ-ЬС), где сахариды отщепляются от ЕаЬ с образованием моносахаридов и анализом индивидуального содержания сахаридов. В некоторых случаях, предпочтительным будет анти-СХСК4 антитело, в котором отсутствует гликозилирование вариабельного участка. Это может быть достигнуто селекцией антител, не содержащих мотива гликозилирования в вариабельном участке, или мутацией остатков в пределах мотива гликозилирования с использованием стандартных методов, хорошо известных из уровня техники.
В предпочтительном варианте антитела в соответствии с данным изобретением не содержат изомерии сайтов аспарагина. Дезамидирование или влияние изоаспарагиновой кислоты могут происходить на последовательностях Ν-С или Э-С соответственно. Дезамидирование или влияние изоаспарагиновой кислоты приводят к образованию изоаспарагиновой кислоты, которая уменьшает стабильность антитела, создавая перекрученную структуру от боковой цепи карбоксиконца скорее, чем от основной цепи. Образование изоаспарагиновой кислоты может быть измерено с использованием количественного анализа изоформ, в котором используют обращенно-фазовую ВЭЖХ для проверки на изоаспарагиновую кислоту.
Каждому антителу будет присуща уникальная изоэлектрическая точка (р1), но в общем антитела будут находиться в интервал рН от 6 до 9,5. р1 для антитела 1дС1 обычно находится в пределах интервала рН 7-9,5, и р1 для антитела 1дС4 обычно находится в пределах интервала рН 6-8. Антитела могут демонстрировать р1 за пределами данного интервала. Хотя такой эффект в общем не доказан, существует гипотеза, что антитела с р1 за пределами нормального интервала могут демонстрировать некоторое разворачивание и нестабильность в условиях ш у1уо. Изоэлектрическая точка может быть определена с использованием анализа методом капиллярного изоэлектрического фокусирования, в котором создается градиент рН и может применяться лазер, фокусирующийся для увеличения точности (Ειπίπί е! а1. (2002)
- 24 018836
Е1ес1горйоге818 23:1605-11; Ма е! а1. (2001), Сйгота!одгарЫа 53:875-89; Ηπηΐ е! а1. (1998), 1. Сйгота!одг А 800:355-67). В некоторых случаях предпочтительным будет анти-СХСК4 антитело со значением р1 в рамках нормального интервала. Это может быть достигнуто селекцией антитела с р1 в нормальном интервале или мутацией заряженных поверхностных остатков с использованием стандартных методов, хорошо известных из уровня техники.
Температура плавления каждого антитела будет указывать на его термическую стабильность (КгЫтатигШу К. апб Маптпд М.С. (2002) Сигг. Рйагт. Вю!есйпо1. 3:361-71). Более высокая термическая стабильность указывает на более высокую общую стабильность антитела ш νί\Ό. Температура плавления антитела может быть измерена с использованием таких методов, как дифференциальная сканирующая калориметрия (Сйеп е! а1. (2003) Рйагт. Кез. 20:1952-60; С1пг1апбо е! а1. (1999) 1ттипо1. Ьей. 68:47-52).
ТМ1 показывает температуру начального разворачивания антитела. ТМ2 показывает температуру полного разворачивания антитела. В общем, ТМ1 антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно превышает 60°С, предпочтительно превышает 65°С, даже более предпочтительно превышает 70°С. Альтернативно, термическая стабильность антитела может быть измерена с использованием дугового дихроизма (Миггау е! а1. (2002) 1. Сйгота!одг. 8сг 40:343-9).
В предпочтительном варианте выбраны антитела, которые не подвергаются быстрому разложению. Фрагментация анти-СХСК4 антитела может быть измерена с использованием капиллярного электрофореза (СЕ) и МАЬЭ1-МС, как хорошо известно из уровня техники (А1ехапбег ЛЭ. апб ИндИех Э.Е. (1995) Апа1. ('Нет. 67:3626-32).
В другом предпочтительном варианте выбраны антитела, которые подвергаются минимальной агрегации. Агрегация может приводить к запуску нежелательной иммунной реакции и/или измененных или неблагоприятных фармакокинетических свойств. В целом, приемлемы антитела с агрегацией 25% или меньше, предпочтительно 20% или меньше, даже более предпочтительно 15% или меньше, даже более предпочтительно 10% или меньше и даже более предпочтительно 5% или меньше. Агрегация может быть измерена несколькими методами, хорошо известными из уровня техники, в том числе высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на эксклюзионной колонке (СЕК), с рассеиванием света для идентификации мономеров, димеров, тримеров или мультимеров.
Способы конструирования антител.
Как обсуждалось выше, анти-СХСК4 антитела, содержащие последовательности νΗ и νκ, раскрытые в данном описании, могут использоваться для создания новых анти-СХСК4 антител путем модификации последовательностей νΗ и/или νκ, или присоединенного к ним константного участка(ков). Таким образом, в другом аспекте данного изобретения, используются структурные признаки анти-СХСК4 антитела в соответствии с данным изобретением, например Е7, Е9, Ό1 или Е2, для создания структурно родственных анти-СХСК4 антител, которые сохраняют как минимум одно функциональное свойство антител в соответствии с данным изобретением, например, связывание с человеческим СХСК4. Например, один или больше участков СЭК Е7, Е9, Ό1 или Е2, или его мутации, могут быть объединены рекомбинантными методами с известными каркасными областями и/или другими участками СЭК для создания дополнительных, рекомбинантно сконструированных анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением, как обсуждалось выше. Другие виды модификаций включают описанные в предыдущем разделе. Исходным материалом для способа конструирования служат одна или больше последовательностей νΗ и/или νκ, предложенных в данном описании, или один или больше их участков СЭК. Для создания сконструированного антитела нет необходимости фактически получать антитело (т.е. экспрессировать как белок), содержащее один или больше последовательностей νΗ и/или νκ, предложенных в данном описании, или один или больше их участков СЭК. Скорее, информация, содержащаяся в последовательностях), используется в качестве исходного материала для создания последовательности(ей) второго поколения, происходящих от оригинальной последовательности(ей), после чего получают последовательность(и) второго поколения и экспрессируют как белок.
Соответственно, в другом варианте данного изобретения предлагается способ получения антиСХСК4 антитела, включающий:
(a) обеспечение: (ί) последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность СЭК1, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш N0: 1-4, последовательность СЭК2, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО Ш N0: 5-8, и/или последовательность СЭК3, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0:9-12; и/или (ίί) последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела, содержащей последовательность СЭК1, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 13-16, последовательность СЭК2, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 17-20, и/или последовательность СЭК3, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 Ш N0: 21-24;
(b) изменение как минимум одного остатка аминокислоты в пределах последовательности вариабельного участка тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельного участка легкой цепи антитела для создания как минимум одной измененной последовательности антитела; и (c) экспрессия измененной последовательности антитела как белка.
- 25 018836
Стандартные методы молекулярной биологии могут применяться для получения и экспрессии измененной последовательности антитела.
Предпочтительно антитело, кодируемое измененной последовательностью(ями) антитела, является таким, которое сохраняет один, некоторые или все функциональные свойства анти-СХСК4 антител, описанных в данном описании, где функциональные свойства включают, не ограничиваясь ими:
(ΐ) связывание с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
(ίί) ингибирование связывания 8ЭЕ-1 с СХСК4;
(ίίί) ингибирование индуцированного 8ЭЕ-1 притока кальция в клетки, экспрессирующие СХСК4;
(ίν) ингибирование индуцированной 8ЭЕ-1 миграции клеток, экспрессирующих СХСК4;
(ν) ингибирование образования НиУЕС капиллярных трубочек;
(νί) связывание с человеческим СХСК4 с кс 1х 10-7 М или меньше;
(νίί) индуцирование апоптоза в клетках, экспрессирующих СХСК4;
(νίίί) ингибирование пролиферации опухолевых клеток ίη νίΐτο;
(ίχ) ингибирование пролиферации опухолевых клеток и/или индуцирование апоптоза опухолевых клеток ίη νίνο;
(х) ингибирование метастазов СХСК4+ опухолевых клеток и/или (χί) увеличение продолжительности жизни субъекта с СХСК4+ опухолью.
Функциональные свойства измененных антител могут быть оценены с использованием стандартных анализов, доступных из уровня техники и/или описанных в данном описании, таких как описанные в примерах (например, проточная цитометрия, анализы связывания, функциональные анализы).
В некоторых вариантах способов конструирования антител в соответствии с данным изобретением мутации могут быть введены случайным образом или избирательно вдоль всей длины или части последовательности, кодирующей анти-СХСК4 антитело, и может быть проведен скрининг полученных модифицированных анти-СХСК4 антител на предмет активности связывания и/или других функциональных свойств, как описано в данном описании. Способы введения мутаций описаны в уровне техники. Например, 81ют1 в публикации РСТ \У0 02/092780 описывает способы создания и скрининга мутаций антител с использованием мутагенеза насыщения, сборки синтетического лигирования или их комбинации. Альтернативно, в публикации РСТ \У0 03/074679 Ьа/ат еΐ а1. описывают способы применения вычислительных методов скрининга для оптимизации физико-химических свойств антител.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела в соответствии с данным изобретением.
Другой аспект данного изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела в соответствии с данным изобретением. Нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток, или в частично очищенный или в существенной мере чистой форме. Нуклеиновая кислота является выделенной или в существенной мере чистой, если она очищена от других компонентов клетки или других загрязняющих веществ, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, стандартными методами, в том числе, обработкой щелочью/натрия додецилсульфатом, бэндингом СТСТ колоночной хроматографией, электрофорезом на агарозном геле и другими способами, хорошо известными из уровня техники. 8ее, Е. Аи8иЬе1, еΐ а1., еб. (1987) СитгегИ Ρτοΐο^Η ίη Μο№ι.ι1аг Βίοίοβν, Стееие РиЫЫпид аиб \УПеу Iηΐе^8с^еηсе, №\ν ΥοτΕ. Нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением может представлять собой, например, ДНК или РНК, и может содержать или не содержать интронных последовательностей. В предпочтительном варианте нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК.
Нуклеиновые кислоты в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Для антител, экспрессированных гибридомами (например, гибридомы, полученные от трансгенных мышей, несущих гены человеческого иммуноглобулина, как подробнее описано ниже), молекулы кДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи антитела, продуцированного гибридомой, могут быть получены стандартными техниками ПЦР амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулина (например, с использованием методов показа фага), нуклеиновая кислота, кодирующая такие антитела, может быть выделена из библиотеки генов.
Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот в соответствии с данным изобретением представляют собой молекулы, кодирующие последовательности УН и Уь моноклональных антител Е7, Е9, Ό1 и Е2. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности УН Е7, Е9, Ό1 и Е2, показаны в 8ЕЦ Ш N0: 33-36, соответственно. Последовательности ДНК, кодирующие последовательности Уь Е7, Е9, Ό1 и Е2, показаны в 8ЕЦ Ш N0: 37-40, соответственно.
Как только получены фрагменты ДНК, кодирующие сегменты УН и Уь, с такими фрагментами ДНК можно производить дополнительные манипуляции стандартными методами рекомбинации ДНК, например, чтобы превратить гены вариабельных участков в гены цепи антитела с полной длиной, в гены ЕаЬ фрагмента или в ген 5сЕу. В ходе таких манипуляций, фрагмент ДНК, кодирующий Уъ или УН, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, например, константный участок антитела или гибкий линкер. Термин функционально связанный в контексте данного изобретения означает, что два фрагмента ДНК соединяются таким образом, что последовательности аминокислот,
- 26 018836 кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.
Выделенная ДНК, кодирующая участок УН, может быть превращена в ген тяжелой цепи с полной длиной, путем функционального связывания ДНК, кодирующей УН, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константных участков тяжелой цепи человека известны из уровня техники (см., например, КаЬа!, Е.А., е1 аР (1991) Зесщеисек οί РгсЛеюк οί Iттиηο1οд^са1 1йегекр ΕίίίΕ Ε6ίίίοη, и.З. ОераПтеШ οί НеаЕН αη6 Нитаη Зетсек, МН ΡιιΝΚαΙίοη Νο. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены стандартной ПЦР амплификацией. Константный участок тяжелой цепи может представлять собой константный участок 1дС1, 1дС2, 1дС3, 1дС4, 1дА, 1дЕ, 1дМ или Ι§Ό, но, наиболее предпочтительно, представляет собой константный участок 1дС1 или 1дС4. Для гена тяжелой цепи фрагмента ЕаЬ кодирующая УН ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок тяжелой цепи СН1.
Выделенная ДНК, кодирующая участок Уъ, может быть превращена в ген легкой цепи с полной длиной (а также ген легкой цепи ЕаЬ), путем функционального связывания кодирующей Уъ ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи, Сь. Последовательности генов константных участков легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, КаЬа!, Е.А., е! эР (1991) Зес-Щеисек οί РгсЛетк οί Ιιηιηιιηοίοβχαί 1тегек1, ΕίΠΙι Ε6ίίίοη, И.8. ЭераПтет οί НеаНН апб Нитаη 8егу1сек, ΝΙ4 ΡιιΝκαΙίοη Νο. 91-3242), и фрагменты ДНК, включающие такие участки, могут быть получены стандартной ПЦР амплификацией. В предпочтительных вариантах константный участок легкой цепи может представлять собой константный участок каппа или лямбда.
Чтобы создать ген ксЕу, кодирующие УН и Уъ фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим последовательность аминокислот (С^-Зег^, таким образом, что последовательности УН и Уъ могут экспрессироваться как непрерывный одноцепочечный белок, с участками Уъ и УН, соединенными гибким линкером (см., например, В1гб е! эР (1988) Заенсе 242:423-426; НияЮп е! аР (1988) Ргос. №ίΡ Асаб. δοΐ. ИЗА 85:5879-5883; МсСайейу е! аР, (1990) МНиге 348:552-554).
Продуцирование моноклональных антител в соответствии с данным изобретением.
Моноклональные антитела (тАЬ) в соответствии с данным изобретением могут быть продуцированы разнообразными способами, в том числе традиционной для моноклональных антител методологией, например, стандартная техника гибридизации соматических клеток Ι<ο1ιΕγ эп6 МПк!ет (1975) МНиге 256: 495. Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе, могут применяться другие способы продуцирования моноклонального антитела, например, вирусная или антигенная трансформация В-лимфоцитов.
Предпочтительной животной системой получения гибридом являются мыши. Продуцирование гибридомы мышью представляет собой лучше всего изученную методику. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны из уровня техники. Партнеры для слияния (например, клетки миеломы мышей) и методики слияния также известны.
Химерные или гуманизированные антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены на основе последовательности нечеловеческого моноклонального антитела, полученного, как изложено выше. ДНК, кодирующая тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, может быть получена из нечеловеческой целевой гибридомы и сконструирована таким образом, чтобы включать последовательности не мышиного (например, человеческого) иммуноглобулина с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Например, для создания химерное антитело, мышиные вариабельные участки могут быть соединены с человеческими константными участками с помощью способов, известных из уровня техники (см., например, патент США 4816567, выданный СаЬШу е! аР). Для создания гуманизированного антитела мышиные участки СОВ могут быть вставлены в человеческий каркас с использованием способов, известных из уровня техники (см., например, патент США № 5,225,539, выданный νίώΌΓ, и патенты США №№ 5530101; 5585,89; 5,693,762 и 6,180,370, выданные Оиеен е! аР).
В предпочтительном варианте антитела в соответствии с данным изобретением представляют собой человеческие моноклональные антитела. Такие человеческие моноклональные антитела, направленные против СХСВ4, могут быть сгенерированы скорее с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих части человеческой иммунной системы, чем обычных мышей. Такие трансгенные и трансхромосомные мыши включают мышей, которые в данном описании носят название НиМАЬ Μοике ® и КМ Μοике ®, соответственно, и здесь и в дальнейшем совокупно обозначаются как мыши с человеческим 1д.
НиМАЬ Μοике ® (Мебагех ®, 1пс.) содержит мини-локусы гена человеческого иммуноглобулина, которые кодируют не перестроенные последовательности тяжелой (μ и γ) и легкой (к) цепей иммуноглобулина человека, вместе с целенаправленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусы цепи μ и к (см., например, Εοη^Γ§, е! аР (1994) МНиге 168(6474): 856-859). Соответственно, у мышей наблюдается сниженная экспрессия мышиного 1дМ или к, и в ответ на иммунизацию, введенные трансгены тяжелой и легкой цепи человека подвергаются переключению класса и соматической мутации для
- 27 018836 генерации человеческих моноклональных антител 1дСК с высоким сродством (ЬопЬегд, N. е! а1. (1994), выше; обзор в ЬопЬегд, N. (1994) НапбЬоок оГ ЕхрептеШа1 Рбагтасо1оду 113:49-101; ЬоиЬегд, N. апб Ник/аг Ό. (1995) 1п!ет. Кеу. 1ттипо1. 13: 65-93, и Нагбшд, Р. апб ЬопЬегд, N. (1995) Апп. Ν.Υ. Асаб. 8ск 764:536-546). Получение и использование НиМАЬ Мойке ®, а также модификации генома, которые несут такие мыши, дополнительно описаны в Тау1ог, Ь. е! а1. (1992) М.1с1е1с Ас1бк Кекеагсб 20:6287-6295; СНеп. 1. е! а1. (1993) 1п1егпа1юпа1 1ттипо1оду 5: 647-656; ТиаШоп е! а1. (1993) Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 90:37203724; СЬо1 е! а1. (1993) №Пиге Сепебск 4:117-123; СНеп, 1. е! а1. (1993) ЕМВО 1. 12: 821-830; ТиаШоп е! а1. (1994) 1. 1ттипо1. 152:2912-2920; Тау1ог, Ь. е! а1. (1994) 1п!егпабопа1 1ттипо1оду 6: 579-591; апб Р1кбвд1б, Ό. е! а1. (1996) №Ш1ге В1о1есНпо1оду. 14: 845-851, содержание всех из которого, таким образом, конкретно включено путем ссылки во всей их полноте. См. также патенты США №№ 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 и 5,770,429; все выданы ЬопЬегд и Кау; патент США № 5,545,807, выданный 8игаш е! а1.; публикации РСТ АО 92/03918, АО 93/12227, АО 94/25585, АО 97/13852, АО 98/24884 и АО 99/45962, все ЬопЬегд и Кау; и публикацию РСТ АО 01/14424, Когтап е! а1.
В другом варианте человеческие антитела в соответствии с данным изобретением могут быть получены с использованием мыши, которая несет последовательности иммуноглобулина человека на трансгенах и трансхромосомах, например, мышь, которая несет трансген тяжелой цепи человека и трансхромосому легкой цепи человека. Такая мышь здесь и в дальнейшем носит название КМ тоике ® и подробно описана 1кб1ба е! а1. в публикации РСТ АО 02/43478.
Кроме того, альтернативные трансгенные животные системы, экспрессирующие человеческие гены иммуноглобулина, доступны из уровня техники и могут использоваться для получения анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением. Например, можно использовать альтернативную трансгеную систему, которая носит название Хепотоике (АЬдешх, 1пс.); такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5939598; 6075181; 6114598; 6150584 и 6162963, выданных Кисбег1араб е! а1.
Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие человеческие гены иммуноглобулина, доступны из уровня техники и могут применяться для получения и антиСХСК4 антител в соответствии с данным изобретением. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосому человеческой тяжелой цепи, так и трансхромосому человеческой легкой цепи, которые носят название мыши ТС; такие мыши описаны в Топи/ика е! а1. (2000) Ргос. №Ш. Асаб. 8ск США 97:722-727. Кроме того, коровы, несущие трансхромосомы человеческих тяжелой и легкой цепей, (например, Кигобга е! а1. (2002) №Ш1ге Вю1ес11по1оду 20:889-894 и заявка РСТ АО 2002/092812) описаны в уровне техники и могут быть использованы для получения анти-СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением.
Человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением могут также быть получены с использованием способов показа фага для скрининга библиотек человеческих генов иммуноглобулина. Такие способы показа фага для выделения человеческих антител описаны в уровне техники. См., например, патенты США №№ 5223409; 5403484 и 5571698, выданные Ьабпег е! а1.; патенты США №№ 542908 и 5580717, выданные Эо^ег е! а1.; патенты США №№ 5969108 и 6172197, выданные МсСаГГейу е! а1.; и патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081, выданные СпГШНк е! а1.
Человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением также могут быть получены с использованием мышей 8СШ, которым человеческие иммунные клетки пересажены таким образом, что реакция в виде человеческих антител может быть получена в результате иммунизации. Такие мыши описаны, например, в патентах США №№ 5476996 и 5698767, выданных Абкоп е! а1.
В особенно предпочтительном варианте человеческие анти-СХСК.4 антитела получают с использованием комбинации техник мыши с человеческим 1д и показа фага, как описано ВиесЫег е! а1. в патенте США 6794132. Более конкретно способ сначала включает стимулирование реакции в виде анти-СХСК4 антител у мыши с человеческим 1д (например, мышь НиМаЬ или мышь КМ, как описано выше), путем иммунизации мыши антигеном СХСК4, с последующим выделением нуклеиновых кислот, кодирующих цепи человеческого антитела, из лимфатических клеток мыши, и введением полученных нуклеиновых кислот в вектор для показа (например, фаг), чтобы обеспечить библиотеку пакетов для показа. Таким образом, каждый член библиотеки содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую цепь человеческого антитела, и каждая цепь антитела показана в пакетах для показа. Далее осуществляют скрининг библиотеки с антигеном СХСК4 для выделения членов библиотеки, которые специфично связываются с СХСК4. Вставки нуклеиновых кислот отобранных членов библиотеки далее выделяют и секвенируют стандартными способами для определения вариабельных последовательностей легкой и тяжелой цепи отобранных молекул, которые связываются с СХСК4. Вариабельные участки могут быть превращены в цепи антитела с полной длиной стандартными методами рекомбинации ДНК, такими как клонирование вариабельных участков в вектор экспрессии, который несет константные участки человеческой тяжелой и легкой цепи, таким образом, что участок УН функционально связан с участком СН, и участок Уь функционально связан с участком Сь Дальнейшее описание получения человеческих анти-СХСК.4 антител с
- 28 018836 использованием данной комбинированной трансгенной системы мыши/показа фага см. в примере 1.
Иммунизация мышей с человеческим Ι§.
Если мышей с человеческим Ι§ используют для получения человеческих антител в соответствии с данным изобретением, такие мыши могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом антигена СХСК4 и/или рекомбинантного СХСК4, или клеток, экспрессирующих СХСК4, или слитого белка СХСК4, как описано ЬопЬетд, N. е! а1. (1994) №11иге 368(6474): 856-859; Είκΐίλνίΐά. Ό. е! а1. (1996) №11иге В1о!есЬпо1оду 14: 845-851; а также в публикациях РСТ \Х0 98/24884 и \Х0 01/14424. Предпочтительно возраст мышей на момент первой инфузии составляет 6-16 недель. Например, очищенный или рекомбинантный препарат (5-50 мкг) антигена СХСК4 может применяться для внутрибрюшинной иммунизации мышей с человеческим Ι§. Наиболее предпочтительно иммуногенное средство, используемое для получения антител в соответствии с данным изобретением, включает человеческий СХСК4 в его природной конформации в пределах мембраны, не ограничивающие примеры которого включают клетки, трансфицированные таким образом, чтобы экспрессировать СХСК4 на поверхности клетки, клетки, которые природным образом экспрессируют СХСК4 (например, клетки СЕМ), и искусственные мембраны (например, липосомы), в которые инкорпорирован СХСК4, например магнитные протеолипосомы (МРЬ), в которые инкорпорирован СХСК4 (описаны далее в примере 1).
Подробные методики генерирования полностью человеческих моноклональных антител против СХСК4 описаны в примере 1 ниже. Совокупный опыт в отношении различных антигенов показал, что трансгенные мыши реагируют при начальной внутрибрюшинной иммунизации (в/б) антигеном в полном адъюванте Фрейнда, с последующей в/б иммунизацией каждую вторую неделю (до общего срока 6 недель) антигеном в неполном адъюванте Фрейнда. Однако, обнаружено, что эффективны также другие адъюванты, кроме адъюванта Фрейнда. Кроме того, обнаружено, что цельные клетки в отсутствие адъюванта обладают высокой степенью иммуногенности. Иммунная реакция может контролироваться в ходе протокола иммунизации с помощью образцов плазмы, полученных ретроорбитальным забором крови. Может быть осуществлен скрининг плазмы методом ЕЫ8А (как описано ниже), и мыши с достаточным титром человеческого анти-СХСК4 иммуноглобулина могут использоваться для слияния. Реакцию у мышей можно усиливать внутривенным введением антигена за 3 дня перед забоем и извлечением селезенки. Ожидается, что может возникнуть необходимость в проведении 2-3 слияний для каждой иммунизации. От 6 до 24 мышей обычно иммунизируют для каждого антигена. Обычно используют породы НСо7 и НСо12. Кроме того, как НСо7, так и НСо12 трансгены могут быть воспроизведены вместе в одной мыши, несущей два различных трансгена человеческий тяжелой цепи (НСо7/НСо12). Альтернативно или дополнительно, можно использовать породу Мойке® КМ, как описано в примере 1.
Генерация гибридом, вырабатывающих человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением.
Для генерации гибридом, вырабатывающих человеческие моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением, спленоциты и/или клетки лимфатического узла иммунизированных мышей могут быть выделены и слиты с подходящей бессмертной линией клеток, например линия клеток миеломы мыши. Для полученных гибридом может быть осуществлен скрининг на предмет выработки специфических в отношении антигена антител. Например, суспензии единичных клеток селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей могут быть слиты с 1/6 количества несекретирующих клеток миеломы мыши Р3Х63-Ад8.653 (АТСС, СКТ 1580) с 50 % ПЭГ. Альтернативно, суспензия единичных клеток селезеночных лимфоцитов от иммунизированных мышей может быть слита с применением способа электрослияния на основе электрического поля, с использованием большой камеры для слияния клеток электропоратора СуФРике (Су!оРике 8с1епсек, Шс., О1еп Витше Мату1апф. Клетками покрывают планшет для микротитрования с плоским дном (плотность приблизительно 2х105), с последующей инкубацией на протяжении двух недель в селективной среде, содержащей 20% эмбриональной сыворотки клона, 18% кондиционированной среды 653, 5% оригена (опдеп, ЮЕ№), 4 мМ Ь-глутамина, 1 мМ натрия пирувата, 5 мМ НЕРЕ8, 0,055 мМ 2-меркаптоэтанола, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина, 50 мг/мл гентамицины и 1Х гипоксантина-аминоптерина-тимидина (НАТ, 81дша; НАТ добавляют через 24 ч после слияния). По прохождении приблизительно двух недель клетки можно культивировать в среде, где НАТ заменен на гипоксантин-тимидин (НТ). Далее может быть проведен скрининг методом ЕЫ8А для отдельных лунок на предмет человеческих моноклональных антител ЦМ и [дС. Как только происходит экстенсивный рост гибридомы, за средой можно вести наблюдение как обычно, по прохождении 10-14 дней. Секретирующими антитело гибридомами могут быть повторно покрыты планшеты, с повторным скринингом, и если результаты для человеческого ЦС по-прежнему положительные, моноклональные антитела могут быть субклонированы как минимум дважды путем ограничивающего разведения. Стабильные субклоны далее могут быть культивированы ш νίΙΐΌ для генерации небольших количеств антитела в среде для культивирования тканей с целью характеристики.
Для очистки человеческих моноклональных антител отобранные гибридомы можно выращивать в роллерных колбах объемом 2 л для очистки моноклональных антител. Супернатант можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией протеин А-сефарозой (Рйагшааа, Ркса!атау, N.1.).
- 29 018836
Очистку элюированного ΙβΟ можно проверить гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией, чтобы гарантировать чистоту. Может быть произведен обмен буферного раствора на фосфатный буферный раствор, и концентрация может быть определена по показателю оптической плотности на длине волны 280 нм (0Ό280) с использованием коэффициента экстинции 1,43. Можно отобрать аликвоты моноклональных антител и хранить их при температуре -80°С.
Генерация трансфектом, вырабатывающих моноклональные антитела в соответствии с данным изобретением.
Антитела в соответствии с данным изобретением также могут быть продуцированы в трансфектоме клетки-хозяина с использованием, например, комбинации методов рекомбинации ДНК и методов трансфекции гена, как хорошо известно из уровня техники (например, Μοιτίδοη, 8. (1985) 8с1снсс 229:1202).
Например, для экспрессии антител или фрагментов таких антител ДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи частичной или полной длины, могут быть получены стандартными методами молекулярной биологии (например, ПЦР амплификация или клонирование кДНК с применением гибридомы, которая экспрессирует целевое антитело) и ДНК могут быть вставлены в векторы экспрессии таким образом, что гены функционально связываются с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В данном контексте термин функционально связанный обозначает, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что последовательности для контроля транскрипции и трансляции в пределах вектора выполняют предназначенную функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставлены в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела вставляют в вектор экспрессии стандартными способами (например, лигирование комплементарных рестрикционных сайтов на фрагменте гена антитела и векторе, или лигирование тупых концов в отсутствие рестрикционных сайтов). Вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антител, описанных в данном описании, могут использоваться для создания генов антитела с полной длиной любого изотипа антитела путем вставки их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные участки тяжелой цепи и легкой цепи желательного изотипа, таким образом, что сегмент Ун функционально связан с сегментом(ами) Сн в пределах вектора, и сегмент Ук функционально связан с сегментом(ами) Съ в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клеткихозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, что сигнальный пептид связан в пределах рамки считывания с аминоконцом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальный пептид белка, не являющегося иммуноглобулином).
В добавление к генам цепи антитела, рекомбинантные векторы экспрессии в соответствии с данным изобретением несут регуляторные последовательности, которые управляют экспрессией генов цепи антитела в клетке-хозяине. Термин регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы (например, сигналы полиаденилирования) контроля экспрессии, которые управляют транскрипцией или трансляцией генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Οοοάάοΐ (Сспс ΕχρΓβδδίοη Тесйгюкду. Ме11юЙ8 ίη Еηζутο1οду 185, Асайешк Ргезз, 8αη Όίβ^ο, СА (1990)). Специалистам в данной области будет понятно, что дизайн вектора экспрессии, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии целевого белка и т.п. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, например, промоторы и/или энхансеры, происходящие из цитомегаловируса (СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса, АйМЬР) и полиомы. Альтернативно, регуляторные последовательности невирусного происхождения могут быть использованы, например, промотор убихитин или промотор β-глобин. Кроме того, регуляторные элементы, состоящие из последовательностей из различных источников, таких как система промотора 8Κα , которая содержит последовательности из раннего промотора 8У40 и длинный концевой повтор человеческого вируса Т-клеточной лейкемии типа 1 (ТакеЬе, Υ. е1 а1. (1988) Μοί. Се11. Βΐοί. 8:466-472).
В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные векторы экспрессии в соответствии с данным изобретением могут нести дополнительные последовательности, например последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, источники репликации) и гены селекционных маркеров. Ген селекционного маркера облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые введен вектор (см., например, патенты США № 4399216, 4634665 и 5179017, все выданы Ахе1 еί а1.). Например, обычный ген селекционного маркера обеспечивает устойчивость к действию лекарственных средств, например, 0418, гигромицина или метотрексата, для клетки-хозяина, в которую введен вектор. Предпочтительные гены селекционных маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (ИнРЕ, для применения в клетках-хозяевах й!1Гг- с селекцией с помощью метотрекса
- 30 018836 та/амплификацией) и ген ικο (для селекции с помощью 0418). Для экспрессии легких и тяжелых цепей, вектор(ы) экспрессии, кодирующий тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяин стандартными методами. Различные формы термина трансфекция предназначены охватывать широкий спектр методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотную или эукариотную клеткухозяин, например, электропорация, осаждение кальция фосфатом, трансфекция диэтиламиноэтил (ПЕАЕ)-декстраном, трансфекция и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела в соответствии с данным изобретением в прокариотных или эукариотных клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотных клетках, и, наиболее предпочтительно, в клетках-хозяевах млекопитающих, является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотные клетки, и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотные клетки, будут собирать и секретировать надлежащим образом уложенное и иммунологически активное антитело.
Сообщалось, что экспрессия генов антител в прокариотах неэффективна с точки зрения выработки активного антитела с высоким выходом (Βο55, М.А. аиб \νοο6, С.К. (1985) Ιιηιηιιηοίοβν Το6;·ιν 6:12-13).
Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител в соответствии с данным изобретением включают клетки яичника китайского хомяка (клетки СНО; в том числе клетки СНО бЫт-, описанные в Иг1аиЬ аиб СЫазт, (1980) Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А 77:4216-4220, которые используют с селекционным маркером ΌΗΕΡ, например, как описано в К.Р Каиίтаη аиб Р.А. 8Ыагр (1982) 1. Μοί. ΒίοΙ. 159:601-621), клетки миеломы N80, клетки С08 и клетки 8Р2. В частности, для использования с клетками миеломы N80, другая предпочтительная система экспрессии представляет собой систему экспрессии гена 08, раскрытую в ν0 87/04462 (νίΗοη), ν0 89/01036 (ΒеЬЬ^ηдιοη) и ЕР 338841 (ΒеЬЬ^ηдιοη). Если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антител, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются при культивировании клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного, чтобы позволить экспрессию антитела в клетках-хозяевах, или более предпочтительно происходит секреция антитела в среду культивирования, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из среды культивирования с применением стандартных способов очистки белка.
Характеристика связывания антитела с антигенов.
Антитела в соответствии с данным изобретением могут быть изучены на предмет связывания с СХСК4, например, стандартными методами проточной цитометрии. Поскольку антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно распознают СХСК4 в его природной конформации в пределах мембраны, испытания на связывание с СХСК4 предпочтительно проводят в форме анализов (например, методом проточной цитометрии), где используется реактив, экспрессирующий природную конформацию СХСК4. Не ограничивающие примеры реактивов, экспрессирующих природную конформацию СХСК4, которая может использоваться в анализах связывания, включают клетки, которые природным образом экспрессируют СХСК4 (например, клетки СЕМ), клетки, трансфицированные для экспрессии СХСК4 (например, клетки К1610, трансфицированные вектором экспрессии СХСК4), и липосомы, в которые инкорпорирован СХСК4 (например, магнитные протеолипосомы с инкорпорированным СХСК4); каждый из перечисленных типов подробнее описан в примерах. Если коротко, для анализов методом проточной цитометрии, клетки, экспрессирующие СХСК4, инкубируют с исследуемым антителом, промывают, инкубируют с меченным вторичным реактивом, способным связываться с тестовым антителом, снова промывают и проводят анализ для обнаружения связывания вторичного реактива с клетками (например, с использованием прибора ЕАС8). Предпочтительно мыши, у которых развивается самый высокий титр по данным метода проточной цитометрии, будут использоваться для слияния или для дальнейшего выделения антител (например, скринингом методом показа фага библиотек антитела, созданных из В-клеток мыши).
Анализ методом проточной цитометрии, как изложено выше, также может применяться для скрининга гибридом, которые демонстрируют положительную реактивность с иммуногенным средством СХСК4. Гибридомы, экспрессирующие антитела, которые связываются с СХСК4 с высокой авидностью, субклонируют, после чего характеризуют. Один клон от каждой гибридомы, который сохраняет реактивность родительских клеток (по данным проточной цитометрии), может быть выбран для создания банка клеток из 5-10 флаконов, которые хранят при температуре -140°С, а также для очистки антитела.
Для очистки анти-СХСК4 антител отобранные гибридомы могут быть выращены в роллерных колбах объемом 2 л для очистки моноклональных антител. Супернатант можно фильтровать и концентрировать перед аффинной хроматографией протеин А-сефарозой (РЫагташа, Р1зса1атау, N.1.). Очистку элюированного ΙβΟ можно проверить гель-электрофорезом и высокоэффективной жидкостной хроматографией, чтобы гарантировать чистоту. Может быть произведен обмен буферного раствора на фосфатный буферный раствор, и концентрация может быть определена по показателю оптической плотности на длине волны 280 нм (0Ό280) с использованием коэффициента экстинции 1,43. Можно отобрать аликвоты моноклональных антител и хранить их при температуре -80°С.
Чтобы определить, связываются ли отобранные моноклональные анти-СХСК4 антитела с уникальными эпитопами, каждое антитело может быть биотинилировано с применением коммерчески доступ
- 31 018836 ных реактивов (Р1егсе, Яοскίο^б, 1Ь). Исследования конкуренции с применением не меченных моноклональных антител и биотинилированных моноклональных антител можно выполнять с использованием цельноклеточного анализа ЕЬ18А, в котором планшеты ЕЬ18А покрывают клетками, экспрессирующими СХСЯ4, и исследуют способность не меченного антитела конкурировать с биотинилированным антителом за связывание с клетками, экспрессирующими СХСЯ4. Связывание биотинилированного тАЬ может быть обнаружено с помощью зонда стрептавидина-щелочной фосфатазы.
Чтобы определить изотип очищенных антител, анализы изотипов методом ЕЬ18А могут быть проведены с применением реагентов, специфичных для антител конкретного изотипа. Например, для определения изотипа человеческого моноклонального антитела лунки планшетов для микротитрования можно покрыть 1 мкг/мл античеловеческого иммуноглобулина на ночь при 4°С. После блокирования 1% раствором альбумина телячьей сыворотки планшеты реагируют с исследуемыми моноклональными антителами очищенных контрольных изотипов в концентрации 1 мкг/мл или меньше при комнатной температуре на протяжении 1-2 ч. Затем лунки реагируют с конъюгированными со щелочной фосфатазой зондами, специфичными в отношении человеческого 1дС1 или человеческого 1дМ. Планшеты проявляют и анализируют, как описано выше.
Дополнительно может быть исследована реактивность человеческих анти-СХСЯ4 1дС с антигеном СХСЯ4 методом Вестерн-блоттинга. Если коротко, СХСЯ4 может быть получен и подвергнут электрофорезу на геле натрия додецилсульфата. После электрофореза отделенные антигены переносят на микроцеллюлозные мембраны, блокированные 10% сывороткой телячьего эмбриона, и зондируют с исследуемыми моноклональными антителами. Связывание с человеческим 1дС может быть обнаружено с помощью античеловеческого 1дС щелочной фосфатазы и проявления с таблетками субстрата ВСIР/NВТ (81дта СЬет. СЬ., 8ΐ. Εουίδ, Μο.).
Специфичность связывания антитела в соответствии с данным изобретением может также быть определена мониторингом связывания антитела с клетками, экспрессирующими СХСЯ4, например, методом проточной цитометрии. Обычно линия клеток, например линия клеток СНО, может быть трансфицирована вектором экспрессии, кодирующим трансмембранную форму СХСЯ4. Трансфицирующий белок может включать метку, например тус-метку, предпочтительно на Ν-конце для обнаружения с использованием антитела к метке. Связывание антитела в соответствии с данным изобретением с СХСЯ4 может быть определено инкубацией трансфицированных клеток с антителом и обнаружения связанного антитела. Связывание антитела с меткой на трансфицирующем белке может быть использовано в качестве положительного контроля.
Иммуноконъюгаты.
В другом аспекте данного изобретения описано анти-СХСЯ4 антитело или его фрагмент, конъюгированный с терапевтическим фрагментом, например цитотоксином, лекарственным средством (например, иммуносупрессантом) или радиотоксином. Такие конъюгаты здесь и в дальнейшем носят название иммуноконъюгатов. Иммуноконъюгаты, которые содержат один или больше цитотоксинов, называются иммунотоксинами. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который причиняет вред клеткам (например, вызывает их гибель). Примеры включают таксол, цитохалазин В, грамицидин Ό, этидия бромид, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Ό, 1дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин, а также их аналоги или гомологи. Терапевтические агенты также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин [ΒδΝυ] и ломустин [ССКи], циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цисхлордиаминплатину (II) (ЦЦР, цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин [в прошлом дауномицин] и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин [в прошлом актиномицин], блеомицин, митрамицин и антрамицин [АМС]), а также антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).
Другие предпочтительные примеры терапевтических цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителом в соответствии с данным изобретением, включают дуокармицины, калихеамицины, мейтанзины и ауристатиньт а также их производные. Коммерчески доступен пример конъюгата калихеамицин-антитело (Му^агд®; Атепсап Ηοπκ РгобнсЕ).
Цитотоксины могут быть конъюгированы с антителами в соответствии с данным изобретением с использованием технологии линкера, доступной из уровня техники. Примеры типов линкера, которые использовали для конъюгации цитотоксина с антителом, включают, не ограничиваясь ими, гидразоны, тиоэфиры, эфиры, дисульфиды и пептидсодержащие линкеры. Может быть выбран линкер, например чувствительный к расщеплению в условиях низких значений рН в пределах лизосомального отсека или восприимчивый к расщеплению протеазами, например протеазами, предпочтительно экспрессирующимися в опухолевой ткани, такими как катепсины (например, катепсины В, С, Ό).
Для дальнейшего обсуждения типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгации терапевтиче
- 32 018836 ских агентов с антителами см. также 8айо, О. е! а1. (2003) Айу. Эгид Эейу. Κεν. 55:199-215; ТгаП, Р.А. е! а1. (2003) Сапсег 1ттипо1. 1ттипо!йег. 52:328-337; Раупе, О. (2003) Сапсег Се11 3:207-212; А11еп, Т.М. (2002) №11. Κεν. Сапсег 2:750-763; Ра81ап, I. апй Кгейтап, Я. 1. (2002) Сигг. Орт. 1пуе8Йд. Эгидк 3:10891091; 8еп!ег, Р.Э. апй 8ргтдег, С! (2001) Айу. Эгид ЭеНу. Яеν. 53:247-264.
Антитела в соответствии с данным изобретением также могут быть конъюгированы с радиоактивным изотопом для создания цитотоксических радиофармацевтических средств, которые также называются радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые могут быть конъюгированы с антителами для диагностического или терапевтического применения, включают, не ограничиваясь ими, йод-131, индий-111, иттрий-90 и лютеций-177. Способ получения радиоиммуноконъюгатов известен из уровня техники. Коммерчески доступны примеры радиоиммуноконъюгатов, в том числе 2еуа1т® (ЮЕС Рйагтасеийсак) и Веххаг® (Сопха Рйагтасеийсак), и подобные способы могут применяться для получения радиоиммуноконъюгатов с использованием антител в соответствии с данным изобретением.
Конъюгаты антител в соответствии с данным изобретением могут применяться для изменения заданной биологической реакции, и фрагмент лекарственного средства не должен интерпретироваться как ограниченный классическими химиотерапевтическими агентами. Например, фрагмент лекарственного средства может представлять собой белок или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин с ферментной активностью или его активный фрагмент, например абрин, рицин А, экзотоксин Ркеийотопак или дифтерийный токсин; белок, например фактор некроза опухоли или интерферон-γ; или модификаторы биологической реакции, например, такие как лимфокины, интерлейкин-1 (ГС-1), интерлейкин-2 (1Ь-2), интерлейкин-6 (1Ь-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ОМ-С8Ρ), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Ο-ί’8Ρ) или другие факторы роста.
Методы конъюгации такого терапевтического фрагмента с антителами хорошо известны, см., например, Атоп е! а1., Мопос1опа1 Ап!1Ьой1е8 Ρο^ 1ттипо!агде!тд ОГ Эгидк 1п Сапсег Тйегару, ш Мопос1опа1 АпйЬоФек Апй Сапсег Тйегару, Яе1кГе1й е! а1. (ейк.), рр. 243-56 (А1ап Я. Ыкк, 1пс. 1985); НеИйгот е! а1., Ап!1Ьой1е8 Ρο^ Эгид Пе1Яегу, т Соп!го11ей Эгид Оейуегу (2пй Ей.), ЯоЬткоп е! а1. (ейк.), рр. 623-53 (Магсе1 Эеккег, 1пс. 1987); Тйогре, АпЦЬойу Сатегк ОГ Су!о!ох1с Адеп!к 1п Сапсег Тйегару: А Веу1ете, т Мопос1опа1 АпйЬоФек '84: В1о1од1са1 Апй С11шса1 АррНсаНопк- Ртсйега е! а1. (ейк.), рр. 475-506 (1985); АпаЕкк, Яекийк, Апй ΡιιΙιιιό РгокресРуе ОГ Тйе Тйегареийс Ике ОГ Яайю1аЬе1ей АпйЬойу 1п Сапсег Тйегару, т Мопос1опа1 АпРЬоШек Ρο^ Сапсег Ое!ес!юп Апй Тйегару, Ва1йтет е! а1. (ейк.), рр. 303-16 (Асайетк Ргекк 1985), и Тйогре е! а1., 1ттипо1. Яеν., 62:119-58 (1982).
Молекулы с двойной специфичностью.
В другом аспекте настоящего изобретения описаны молекулы с двойной специфичностью, содержащие анти-СХСЯ4 антитело или его фрагмент в соответствии с данным изобретением. Антитело в соответствии с данным изобретением или его часть, связывающаяся с антигеном, может быть дериватизированным или присоединенным к другой функциональной молекуле, например другому пептиду или белку (например, другому антителу или лиганду рецептора) для создания молекулы с двойной специфичностью, которая связывается как минимум с двумя различными сайтами связывания или целевыми молекулами. Антитело в соответствии с данным изобретением фактически может быть дериватизированным или присоединенным к более чем одной функциональной молекуле другого типа для создания полиспецифических молекул, которые связываются более чем с двумя различными сайтами связывания и/или целевыми молекулами; подразумевается, что термин молекула с двойной специфичностью в данном описании также включает такие полиспецифические молекулы. Для создания молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением антитело в соответствии с данным изобретением может быть функционально связано (например, химическим соединением, генетическим слиянием, не ковалентной связью или иначе) с одной или больше молекул другого типа со свойствами связывания, например, другим антителом, фрагментом антитела, пептидом или миметиком со свойствами связывания, таким образом, что образуется молекула с двойной специфичностью.
Соответственно, данное изобретение включает молекулы с двойной специфичностью, обладающие как минимум одной первой специфичностью связывания с СХСЯ4 и второй специфичностью связывания со вторым целевым эпитопом. В конкретном варианте данного изобретения, второй целевой эпитоп представляет собой рецептор Ρ^ например человеческий Ρс γЯI (СЭ64) или человеческий рецептор Ρс α (ί.Ό89). Таким образом, данное изобретение включает молекулы с двойной специфичностью, способные к связыванию с эффекторными клетками, экспрессирующими как Ρс γЯ, так и Ρс аЯ (например, моноциты, макрофаги или полиморфоядерные клетки [РМК]), а также с клетками-мишенями, экспрессирующими СХСЯ4. Такие молекулы с двойной специфичностью нацеливают экспрессирующие СХСЯ4 клетки на эффекторную клетку и запускают опосредованную рецептором Ρс активность эффекторной клетки, например фагоцитоз экспрессирующих СХСЯ4 клеток, антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЭСС), высвобождение цитокинов или генерацию супероксид-аниона.
В варианте данного изобретения, где молекула с двойной специфичностью является полиспецифической, молекула может дополнительно обладать третьей специфичностью связывания в дополнение к
- 33 018836 анти-Ес специфичности связывания и анти-СХСК4 специфичности связывания. В одном варианте третья специфичность связывания представляет собой часть против фактора усиления (ЕЕ), например, молекула, которая связывается с поверхностным белком, принимающим участие в цитотоксической активности, и, таким образом, усиливает иммунную реакцию против клетки-мишени. Часть против фактора усиления может быть антителом, функциональным фрагментом антитела или лигандом, который связывается с данной молекулой, например, антигеном или рецептором, и, таким образом, приводит к усилению влияния детерминантов связывания для рецептора Ес или антигена клетки-мишени. Часть против фактора усиления может связываться с рецептором Ес или антигеном клетки-мишени. Альтернативно, часть против фактора усиления может связываться с объектом, отличным от объекта, связывание с которым определяют первая и вторая специфичность связывания. Например, часть против фактора усиления может связываться с цитотоксической Т-клеткой (например, через СЭ2, СЭ3, СЭ8, СЭ28, СЭ4, СЭ40, Ιί.ΆΜ-1 или другую иммунную клетку, что приводит к усилению иммунной реакции против клеткимишени).
В одном варианте молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением включают в качестве специфичности связывания как минимум одно антитело или фрагмент такого антитела, в том числе, например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Εν, Εά, άЛЬ или одноцепочечный Εν. Антитело может также представлять собой димер легкой цепи или тяжелой цепи или любой его минимальный фрагмент, например Εν или одноцепочечный конструкт, как описано в патенте США 494б778, выданном Ьабпет с1 а1., содержание которого явно включено путем ссылки.
В одном варианте специфичность связывания с Ес γ рецепторами обеспечивается моноклональным антителом, связывание с которым не блокируется человеческим иммуноглобулином С (Ι§0). В данном описании термин рецептор Ιβ>' обозначает любой из восьми генов γ-цепи, расположенных на хромосоме 1. Эти гены кодируют общее количество 12 трансмембранных или растворимых изоформ рецептора, которые сгруппированы в три класса рецептора Ес γ Ес γΒΙ (СЭб4), Ес γΒΙΙ (СЭ32) и Ес γΡΙΙΙ (СЭ1б). В одном из предпочтительных вариантов рецептор Ес γ представляет собой человеческий рецептор Ес γΒΙ с высоким сродством. Человеческий Ес γΒΙ представляет собой молекулу размером 72 кДа, которая демонстрирует высокое сродство к мономерному ^С (108-109 М-1).
Продуцирование и характеристика некоторых предпочтительных анти-Ес γ моноклональных антител описаны в публикации РСТ \У0 88/00052 и в патенте США № 4954б17, выданном Еапдег е1 а1., содержание которых включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Такие антитела связываются с эпитопом ΕсγКI, ΕсγКII или ΕсγКIII на сайте, который отличается от сайта связывания с Εсγ рецептором, и, таким образом, физиологические уровни ^С в существенной мере не блокируют связывания с ними. Специфические анти-Ес γ антитела КТ, пригодные в соответствии с данным изобретением, представляют собой тΑЬ 22, тΑЬ 32, тΑЬ 44, тΑЬ б2 и тΑЬ 197. Гибридома, продуцирующая тΑЬ 32, доступна от Американской коллекции типов культур, инвентарный номер АТСС НВ94б9. В других вариантах антитело против Ес γ рецептора представляет собой гуманизированную форму моноклонального антитела 22 (Н22). Продуцирование и характеристика антитела Н22 описана в Ста71апо, К.Е. е1 а1. (1995) Р Iттиηο1. 155 (10): 499б-5002 и публикации РСТ \У0 94/10332 (Тетрек! е! а1.). Линия клеток, продуцирующих антитело Н22, депонирована в Американской коллекции типов культур как ΗΑ022ΟΕ1, инвентарный номер СКЬ 11177.
В других предпочтительных вариантах специфичность связывания с рецептором Ес обеспечивается антителом, которое связывается с человеческим рецептором Ι§Α, например, рецептором Ес-α (Ес αΡΙ |СЭ89|), связывание с которым, предпочтительно не блокируется человеческим иммуноглобулином Α (ΙβΑ). Термин рецептор ΙβΑ предназначен включать генный продукт одного α-гена (Ес αΕΙ), расположенного на хромосоме 19. Известно, что данный ген кодирует несколько альтернативно сращенных трансмембранных изоформ размером 55-110 кДа. Ес аШ (СЭ89) конститутивно экспрессируется на моноцитах/макрофагах, эозинофильных и нейтрофильных гранулоцитах, но не экспрессируется на популяциях не эффекторных клеток. Ес αΗΙ обладает умеренным сродством (»5χ 107 М-1) как в отношении ΙβΑ1, так и ΙβΑ2, причем сродство увеличивается при контакте с цитокинами, такими как С-С8Е или СМ-С8Е (Мойоп, Н.С. е! а1. (199б) СпЕса1 Кеу1е^к ίη Iттиηο1οду 1б:423-440).
Описаны четыре Ес аРТ-специфических моноклональных антитела, идентифицированные как Α3, А59, Аб2 и А77, которые связываются с Ес аШ за пределами домена связывания лиганда ΙβΑ (Моп!епо. К.С. е! а1. (1992) Р ]ттипо1. 148:17б4).
Ес аШ и Ес γΕΙ представляют собой предпочтительные триггерные рецепторы для применения в молекулах с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением, поскольку они (1) экспрессируются в основном на иммунных эффекторных клетках, например моноцитах, РМН макрофагах и дендритных клетках; (2) экспрессируются в больших количествах (например, 5000-100000 на клетку); (3) выступают медиаторами цитотоксической активности (например, ЛЭСС, фагоцитоз); и (4) опосредуют усиленное антигенное представление антигенов, в том числе аутоантигенов, нацеленных на них.
Хотя человеческие моноклональные антитела являются предпочтительными, другие антитела, которые могут быть использованы в молекулах с двойной специфичностью в соответствии с данным изо
- 34 018836 бретением, - мышиные, химерные и гуманизированные моноклональные антитела.
Молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением могут быть получены конъюгированием конститутивной специфичности связывания, например, специфичности связывания анти-ЕсВ и анти-СХСВ4, с использованием способов, известных из уровня техники. Например, каждая специфичность связывания молекулы с двойной специфичностью может быть сгенерирована отдельно, а затем конъюгирована с другой. Если специфичность связывания представлена белками или пептидами, могут применяться разнообразные агенты сочетания или перекрестного сшивания для ковалентного соединения. Примеры агентов перекрестно-связывающихся включают протеин А, карбодиимид, Νсукцинимидил-З-ацетил-тиоацетат (ЗАТА), 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (ОТИВ), офенилендималеинимид (οΡΌΜ), N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (8ΡΌΡ) и сульфосукцинимидил-4-(Ы-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-ЗМСС) (см., например, Ка^^ку е1 а1. (1984) 1. Ехр. Мей. 160:1686; Ь1и, МА е1 а1. (1985) Ргос. Асай. 8ск И8А 82:8648). Другие способы включают описанные в Раи1ик (1985) ВеЬгтд Ιηκ. Мш. Νο. 78, 118-132; Вшишц·! е1 а1. (1985) Заенсе 229:81-83 и Ските е1 а1. (1987). Iттиηο1. 139: 2367-2375). Предпочтительные агенты для конъюгирования - ЗАТА и сульфо-ЗМСС, оба доступны от Р1егсе СЬетюа1 Οο. (Кοск1ο^й. ΙΕ).
Если специфичность связывания представлена антителами, они могут быть конъюгированы посредством сульфгидрильной связи между С-концевыми шарнирными областями двух тяжелых цепей. В особенно предпочтительном варианте шарнирная область модифицирована таким образом, что она содержит нечетное количество сульфгидрильных остатков, предпочтительно один, до конъюгирования.
Альтернативно, оба вида специфичности связывания могут кодироваться в одном и том же векторе, причем экспрессия и сборка могут производиться в одной и той же клетке-хозяине. Данный способ особенно пригоден в случаях, где молекула с двойной специфичностью представляет собой тАЬ х тАЬ, тАЬ х ЕаЬ, ЕаЬ х Е(аЬ')2 или лиганд х ЕаЬ слитый белок. Молекула с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением может представлять собой одноцепочечную молекулу, содержащую одно одноцепочечное антитело и детерминанту связывания, или одноцепочечную молекулу с двойной специфичностью, содержащую две детерминанты связывания. Молекулы с двойной специфичностью могут содержать как минимум две одноцепочечные молекулы. Способы получения молекул с двойной специфичностью описаны, например, в патентах США №№ 5260203; 5455030; 4881175; 5132405; 5091513; 5476786; 5013653; 5258498 и 5482858, все из которых явно включены в данное описание путем ссылки.
Связывание молекул с двойной специфичностью с их специфическими мишенями может быть подтверждено, например, твердофазным иммуноферментным анализом (ЕЫЗА), радиоиммуноанализом (ША), анализом ЕАСЗ, биологическим анализом (например, ингибированием роста) или анализом методом Вестерн-блоттинга. Каждый из этих анализов в целом обнаруживает присутствие целевых комплексов белок-антитело с использованием меченного реактива (например, антитело), специфичного для целевого комплекса. Например, комплексы ЕсВ-антитело могут быть обнаружены с использованием, например, присоединенного к ферменту антитела или фрагмента антитела, который распознает и специфично связывается с комплексами антитело-ЕсВ. Альтернативно, комплексы могут быть обнаружены с использованием любого из многочисленных других иммуноанализов. Например, антитело может нести радиоактивный изотоп и использоваться в радиоиммуноанализе (ША) (см., например, ХУейИганЬ, В., Ргтс1р1ек ο1 Вай^ο^ттиηοа88ау8, ЗегеШк Тгаштд С'оигке οη Вайю^аМ Аккау ТесЬтдиек, Т1е Επάο^ίικ δο^Κ, Магск, 1986, которая включена в данное описание путем ссылки). Радиоактивный изотоп может быть обнаружен такими средствами, как использование γ-счетчика или сцинтилляционного счетчика, или методом ауторадиографии.
Фармацевтические композиции.
В другом аспекте данного изобретения предлагается композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию моноклональных антител, или его часть(и), связывающуюся с антигеном в соответствии с данным изобретением, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Такие композиции могут содержать одно или комбинацию (например, два или более различных) антител или иммуноконъюгатов или молекул с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением. Например, фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением может содержать комбинацию антител (или иммуноконъюгатов или молекул с двойной специфичностью), которые связываются с различными эпитопами на целевом антигене или которые обладают дополняющей активностью.
Фармацевтические композиции в соответствии с данным изобретением также можно вводить в составе комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать анти-СХСВ4 антитело в соответствии с данным изобретением, в сочетании как минимум с одним другим противовоспалительным или иммуносупрессантным агентом. Более подробно примеры терапевтических агентов, которые можно применять в комбинированной терапии, описаны ниже в разделе, посвященном применению антител в соответствии с данным изобретением.
В данном описании фармацевтически приемлемый носитель включает любые и все физиологически совместимые растворители, среды для диспергирования, покрытия, противобактериальные и проти
- 35 018836 вогрибковые агенты, агенты для обеспечения изотоничности, агенты, замедляющие абсорбцию и т.п. Предпочтительно носитель подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, инъекцией или инфузией). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. антитело, иммуноконъюгат или молекула с двойной специфичностью, может быть покрыто материалом для защиты соединения от воздействия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать соединение.
Фармацевтические соединения в соответствии с данным изобретением могут включать одну или больше фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемая соль обозначает соль, которая сохраняет желательную биологическую активность родительского соединения и не оказывает нежелательного токсического воздействия (см., например, Вегде, 8.М., е! а1. (1977) 1. РЬагт. 8сг 66:1-19). Примеры таких солей включают кислотно-аддитивные соли и основно-аддитивные соли. Кислотноаддитивные соли включают полученные из нетоксичных неорганических кислот, например хлористоводородной, азотной, фосфорной, серной, бромисто-водородной, йодисто-водородной, фосфористой и т.п., а также из нетоксичных органических кислот, например алифатических моно- и дикарбоновых кислот, фенилзамещенных алкановых кислот, гидроксиалкановых кислот, ароматических кислот, алифатических и ароматических сульфоновых кислот и т.п. Основно-аддитивные соли включают полученные из щелочно-земельных металлов, например натрия, калия, магния, кальция и т.п., а также из нетоксичных органических аминов, например Ν,Ν'-дибензилэтилендиамина, Ν-метилглюкамина, хлорпрокаина, холина, диэтаноламина, этилендиамина, прокаина и т.п.
Фармацевтическая композиция в соответствии с данным изобретением также может включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, например аскорбиновую кислоту, цистеина гидрохлорид, натрия бисульфат, натрия метабисульфит, натрия сульфит и т.п.; (2) жирорастворимые антиоксиданты, например аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, α-токоферол и т.п.; и (3) агенты, образующие хелатные комплексы с металлами, например лимонную кислоту, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТК), сорбитол, винную кислоту, фосфорную кислоту и т.п.
Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях в соответствии с данным изобретением, включают воду, этанол, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и их подходящие смеси, растительные масла, например оливковое масло, и инъекционные органические эфиры, например этилолеат. Необходимая текучесть может поддерживаться, например, использованием материалов покрытия, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частицы в случае дисперсий, а также применением поверхностноактивных веществ.
Такие композиции могут содержать также адъюванты, например консерванты, увлажняющие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может обеспечиваться как процедурами стерилизации, выше, так и включением различных противобактериальных и противогрибковых агентов, например парабена, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и т.п. Также может быть желательным включить в композиции агенты для обеспечения изотоничности, например сахар, натрия хлорид. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъекционной лекарственной формы может обеспечиваться включением агентов, которые замедляют абсорбцию, например, алюминия моностеарата и желатина.
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных субстанций известно из уровня техники. За исключением случаев, когда любые обычные среды или агенты несовместимы с активным соединением, изобретение охватывает их применение в фармацевтических композициях в соответствии с данным изобретением. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.
Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может приобретать форму раствора, микроэмульсии, липосомы или другой заказанной структуры, пригодной для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их пригодными смесями. Необходимая текучесть может поддерживаться, например, использованием материалов покрытия, таких как лецитин, поддержанием необходимого размера частицы в случае дисперсий, а также применением поверхностно-активных веществ. Во многих случаях будет предпочтительным включить в композиции агенты для обеспечения изотоничности, например сахара, полиспирты, такие как маннитол, сорбитол, или натрия хлорид и т.п. Пролонгированная абсорбция инъекционной лекарственной формы может обеспечиваться включением агентов, которые замедляют абсорбцию, например, соли моностеарата и желатина.
Стерильные инъекционные растворы могут быть получены введением активного соединения в не
- 36 018836 обходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией микрофильтрацией. В целом, дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желательный ингредиент из его предварительно обработанного стерильной фильтрацией раствора.
Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения однодозовой лекарственной формы, варьирует в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Количество активного ингредиента, который может быть объединен с материалом носителя для получения однодозовой лекарственной формы, в целом будет таким, чтобы получить количество композиции, которое оказывает терапевтическое воздействие. В общем, из 100% данное количество будет варьировать от приблизительно 0,01 до приблизительно 99% активного ингредиента, предпочтительно от приблизительно 0,1 до приблизительно 70%, наиболее предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 30% активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Схемы введения корректируют таким образом, чтобы обеспечить оптимальную желательную реакцию (например, терапевтический ответ). Например, может вводиться один болюс, несколько разделенных доз можно вводить через некоторое время, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с требованиями терапевтической ситуации. Особенно предпочтительно приготовление композиций для парентерального введения в дозированной лекарственной форме для легкости введения и единообразия доз. Дозированная лекарственная форма в данном описании обозначает физически дискретные единицы, подходящие в качестве отдельных доз для субъектов, которые получают лечение; причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы обеспечить желательное терапевтическое воздействие, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация для дозированных лекарственных форм в соответствии с данным изобретением диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который необходимо обеспечить, и (Ь) ограничений, свойственных приготовлению препаратов такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Для введения антитела интервал доз составляет приблизительно 0,0001-100 мг/кг, чаще 0,01-5 мг/кг массы тела хозяина. Например, дозы могут составлять 0,3, 1, 3, 5 или 10 мг/кг массы тела или могут находиться в пределах интервала 1-10 мг/кг массы тела. Пример схемы лечения включает введение 1 раз в неделю, 1 раз каждые две недели, 1 раз каждые три недели, 1 раз каждые четыре недели, ежемесячно, 1 раз каждые 3 месяца или 1 раз каждые 3-6 месяцев. Предпочтительные схемы введения для анти-СХСК4 антитела в соответствии с данным изобретением включают 1 или 3 мг/кг массы тела внутривенно, где антитело вводят в соответствии с одной из следующих схем введения: (ί) каждые четыре недели для 6 доз, затем каждые 3 месяца; (ίί) каждые 3 недели; (ίίί) 3 мг/кг массы тела однократно и далее 1 мг/кг массы тела каждые 3 недели.
В некоторых способах два или больше моноклональных антител с различной специфичностью связывания вводят одновременно, и в этом случае дозы каждого антитела для введения находятся в пределах указанных интервалов. Антитело обычно вводят в виде множественных доз. Интервалы между введением отдельных доз могут составлять, например, еженедельно, ежемесячно, каждые 3 месяца или ежегодно. Интервалы также могут быть нерегулярными, как указывают результаты измерения уровней антитела к целевому антигену в крови больного. В некоторых способах дозы корректируют таким образом, чтобы достичь концентрации антитела в плазме приблизительно 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах приблизительно 25-300 мкг/мл.
Альтернативно, антитело можно вводить в форме препарата длительного высвобождения, который требует менее частого введения. Дозы и частота введения варьируют в зависимости от периода полувыведения антитела из организма больного. В целом, человеческие антитела демонстрируют более длинный период полувыведения, далее следуют гуманизированные антитела, химерные антитела и не человеческие антитела. Дозы и частота введения могут варьировать в зависимости от характера лечения (профилактическое или терапевтическое). При профилактическом применении относительно низкие дозы вводят относительно редко в течение длительного периода времени. Некоторые больные продолжают получать лечение пожизненно. При терапевтическом применении иногда необходимо вводить относительно высокие дозы через относительно короткие промежутки времени до замедления или остановки прогресса заболевания и предпочтительно до частичного или полного облегчения симптомов заболевания у пациента. В дальнейшем препарат можно вводить больному в профилактическом режиме.
Фактические уровни доз активных ингредиентов в фармацевтических композициях в соответствии с данным изобретением могут варьировать таким образом, чтобы получить количество активного ингредиента, эффективное с точки зрения обеспечения желательного терапевтического ответа для конкретного
- 37 018836 больного, композицию и способ введения, нетоксичные для больного. Выбранный уровень доз будет зависеть от различных фармакокинетических факторов, в том числе активности конкретных применяемых соединений в соответствии с данным изобретением, или их эфира, соли или амида, способа введения, времени введения, скорости экскреции конкретного применяемого соединения, продолжительности лечения, других лекарственных средств, соединений и/или материалов, используемых в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраста, пола, массы тела, общего состояния здоровья и медицинского анамнеза больного, который получает лечение, а также подобных факторов, хорошо известных в медицине из уровня техники.
Терапевтически эффективная доза анти-СХСК4 антитела в соответствии с данным изобретением предпочтительно приводит к уменьшению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и продолжительности периодов заболевания, свободных от симптомов, или предотвращению ущерба или инвалидности в результате заболевания. Например, для лечения СХСК4+ опухолей, терапевтически эффективная доза предпочтительно ингибирует рост клеток или рост опухоли как минимум приблизительно на 20%, более предпочтительно как минимум приблизительно на 40%, даже более предпочтительно как минимум приблизительно на 60% и еще более предпочтительно как минимум на приблизительно 80% относительно не получавших лечения субъектов. Способность соединения ингибировать рост опухоли может быть оценена в модельной системе на животных, которая позволяет предсказать эффективность против опухолей человека. Альтернативно, данное свойство композиции может быть оценено путем исследования способности соединения ингибировать рост клеток, причем такое ингибирование может быть измерено ш νίΐτο в анализах, известных практикующему специалисту в данной области. Терапевтически эффективное количество терапевтического соединения может уменьшить размер опухоли или иначе облегчить симптомы у субъекта. Средний специалист в данной области может определить такие количества на основе таких факторов, как размеры субъекта, тяжесть симптомов у субъекта и конкретная выбранная композиция или способ введения.
Композицию в соответствии с данным изобретением можно вводить одним или больше способов введения, с использованием одного или больше различных способов, известных из уровня техники. Как будет понятно специалистам в данной области, путь и/или способ введения варьирует в зависимости от желательных результатов. Предпочтительные способы введения антител в соответствии с данным изобретением включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный, спинальный или другие способы парентерального введения, например инъекцией или инфузией. Фраза парентеральное введение в данном описании подразумевает способы введения, за исключением энтерального введения и местного применения, обычно инъекцией, и включает, не ограничиваясь ими, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, интраорбитальную, внутрисердечную, внутрикожную, внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, субкутикулярную, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную, эпидуральную и интрастернальную инъекцию и инфузию.
Альтернативно, антитело в соответствии с данным изобретением можно вводить не парентеральным способом, например местно, эпидермально или через слизистую, например интраназально, перорально, интравагинально, ректально, сублингвально или местно.
Активные соединения могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого высвобождения, например препарат с контролируемым высвобождением, в том числе имплантанты, пластыри для трансдермального введения и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биологически разлагаемые, биосовместимые полимеры, например этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких препаратов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. См., например, 8ийатеб апб Соп1го11еб Ке1еа§е Эгид ЭеЮ'егу Зуйетк, ГК. КоЬткоп, еб., Магсе1 Эеккег, Юс., №\ν Υο^к, 1978.
Терапевтические композиции можно вводить с помощью медицинских устройств, известных из уровня техники. Например, в предпочтительном варианте терапевтическую композицию в соответствии с данным изобретением можно вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций, такого как устройства, раскрытые в патентах США №№ 5399163; 5383851; 5312335; 5,064,413; 4941880; 4790824 или 4596556. Примеры известных имплантантов и модулей, пригодных в соответствии с настоящим изобретением, включают патент США № 4487603, где раскрыт вживляемый микроинфузионный насос для доставки лекарственного средства с управляемой скоростью; патент США № 4486194, где раскрыто терапевтическое устройство для введения лекарственных средств через кожу; патент США № 4447233, где раскрыт медицинский инфузионный насос для доставки лекарственного средства с точно определенной скоростью инфузии; патент США № 4447224, где раскрыта вживляемая инфузионная аппаратура с варьирующим потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патент США № 4439196, где раскрыта осмотическая система доставки лекарственного средства с многокамерными отсеками; и патент США № 4475196, где раскрыта осмотическая система доставки лекарственного средства. Перечисленные патенты включены в данное описание путем ссылки. Многие другие имплантанты, системы доставки и модули такого типа известны специалистам в данной области.
- 38 018836
В некоторых вариантах для человеческих моноклональных антител в соответствии с данным изобретением может быть разработана такая рецептура, чтобы гарантировать надлежащее распределение ίη νίνο. Например, гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) не пропускает многие высокогидрофильные соединения. Чтобы гарантировать, что терапевтические соединения в соответствии с данным изобретением будут проникать сквозь ГЭБ (при желании), они могут быть введены, например, в липосомы. Способы производства липосом см., например, в патентах США №№ 4522811; 5374548 и 5399331. Липосомы могут включать один или больше фрагментов, которые избирательно переносятся в специфические клетки или органы, таким образом, усиливая целенаправленную доставку лекарственного средства (см., например, У.У. Капабе (1989) ί. С1ш. РИататок 29:685). Примеры фрагментов для нацеливания включают фолат или биотины (см., например, патент США № 5416016, выданный Б-ον еΐ а1.); маннозиды (итеха\\'а еΐ а1. (1988) ВюсНет. ВюрБук. Кек. Ссттш. 153:1038); антитела (Р.С. Β1οетаη еΐ а1. (1995) ЕЕВ8 Ьей 357:140; М. 0\νηίκ еΐ а1. (1995) ΑπΙιπιχιόΚ Адейк СНеи-юШет 39:180); рецептор поверхностно-активного вещества протеина А (Виктое еΐ а1. (1995) Ат. I. РБукю1. 1233:134); р120 (8сЬте1ет еΐ а1. (1994) I. Βίο1. СНет. 269:9090); см. также к. кета^й М.Ь. ^аиккаηеη (1994) ЕЕВ8 Ьей. 346:123; ЕЕ кШюп; 1.1. Е1б1ег (1994) IттиποтеιНοбκ 4:273.
Применение и способы.
Антитела, особенно человеческие антитела, композиции антител и способы в соответствии с данным изобретением обладают многочисленными диагностическими и терапевтическими полезными функциями ίη νίΐτο и ίη νίνο, включая диагностику и лечение опосредованных СХСК4 расстройств. Например, такие молекулы можно вводить в культуру клеток, ίη νίΐτο или ех νίνο, или человеческим субъектам, например ίη νίνο, для лечения, предупреждения и диагностики разнообразных расстройств. В данном описании термин субъект включает человека и животных, не относящихся к Нοтο кар1ет1к. Животные, не относящиеся к Нοтο кар^епк. включают всех позвоночных животных, например млекопитающих и не млекопитающих, таких как приматы, не относящиеся к Нοтο кархещ, овцы, собаки, кошки, коровы, лошади, куры, амфибии и рептилии. Предпочтительные субъекты включают пациентов-людей с расстройствами, которые опосредованы или модулируются активностью СХСК4 или в которые вовлечены пути СХСК4/8ЭГ-1. Если антитела к СХСК4 вводят вместе с другим агентом, они могут быть введены последовательно или одновременно.
С учетом специфического связывания с СХСК4 антител в соответствии с данным изобретением антитела в соответствии с данным изобретением могут применяться для специфичного выявления экспрессии СХСК4 на поверхности клеток и, кроме того, могут применяться для очистки СХСК4 методом иммуноаффинной очистки.
Подходящие способы введения композиций антител (например, человеческих моноклональных антител, полиспецифических молекул и молекул с двойной специфичностью, а также иммуноконъюгатов) в соответствии с данным изобретением ίη νίνο и ίη νίΐτο хорошо известны из уровня техники и выбор может быть осуществлен средним специалистом в данной области. Например, композиции антител можно вводить инъекцией (например, внутривенной или подкожной). Подходящие дозы применяемых молекул будут зависеть от возраста и массы тела субъекта, а также от концентрации и/или рецептуры композиции антитела.
Как было описано ранее, человеческие анти-СХСК4 антитела в соответствии с данным изобретением можно вводить совместно с одним или больше других терапевтических агентов, например, цитотоксический агент, радиотоксичный агент или иммуносупрессивный агент. Антитело может быть присоединено к агенту (как иммунокомплекс) или может вводиться отдельно от агента. В последнем случае (отдельное введение), антитело можно вводить перед, после или параллельно с агентом, или можно вводить совместно с другими известными видами лечения, например, противораковая терапия, например облучение. Такие терапевтические агенты включают, среди прочих, антинеопластические агенты, например доксорубицин (адриамицин), цисплатин, блеомицина сульфат, кармустин, хлорамбуцил и циклофосфамид, гидроксимочевину, которые сами по себе демонстрируют эффективность только в уровнях, которые токсичны или субтоксичны для больного. Цисплатин вводят внутривенно в дозе 100 мг/кг массы тела 1 раз каждые четыре недели и адриамицин вводят внутривенно в дозе 60-75 мг/мл 1 раз каждые 21 день. Совместное введение человеческих анти-СХСК4 антител или их фрагментов, связывающихся с антигеном в соответствии с данным изобретением, с химиотерапевтическими агентами обеспечивает два противораковых агента с различными механизмами действия, которые оказывают цитотоксическое действие на клетки опухоли человека. Такое совместное введение может решить проблемы, связанные с приобретением устойчивости к лекарственным средствам или изменением антигенности опухолевых клеток, которое может сделать их не реагирующими с антителом.
Специфические в отношении мишени эффекторные клетки, например эффекторные клетки, связанные с композициями (например, человеческих антител, полиспецифических молекул и молекул с двойной специфичностью) в соответствии с данным изобретением, могут также применяться в качестве терапевтических агентов. Эффекторные клетки для нацеливания могут быть человеческими лейкоцитами, например макрофагами, нейтрофилами или моноцитами. Другие клетки включают эозинофилы, природные клетки-киллеры и другие клетки, несущие рецептор 1дС или 1дА. При желании эффекторные клетки
- 39 018836 могут быть получены от субъекта, который получает лечение. Специфические в отношении мишени эффекторные клетки можно вводить в виде суспензии в физиологически приемлемом растворе. Количество клеток для введения может находиться в пределах 108-109, но будет варьировать в зависимости от терапевтической мишени. В целом, количество будет достаточным для достижения локализации в области целевой клетки, например клетки опухоли, экспрессирующей СХСК4, гибели клетки, например фагоцитоз. Способы введения также могут варьировать.
Лечение специфическими в отношении мишени эффекторными клетками может проводиться в сочетании с другими способами удаления клеток-мишеней. Например, противоопухолевая терапия с применением композиций (например, человеческих антител, полиспецифических молекул и молекул с двойной специфичностью) в соответствии с данным изобретением и/или эффекторных клеток, вооруженных такими композициями, может применяться в сочетании с химиотерапией. Дополнительно может применяться комбинированная иммунотерапия, чтобы направить две различные цитотоксические эффекторные популяции в направлении отторжения опухолевых клеток. Например, анти-СХСК4 антитела, присоединенные к анти-Ес-γ К1 или анти-СО3, могут применяться в сочетании с агентами, которые специфично связываются с рецептором 1дС или 1дА.
Молекулы с двойной специфичностью и полиспецифические молекулы в соответствии с данным изобретением также могут применяться для модулирования уровня Ес γК или Ес γК на эффекторных клетках, например, путем кэппинга и устранения рецепторов с поверхности клетки. Смеси анти-Ес рецепторов также могут применяться для данной цели.
Композиции (например, человеческих, гуманизированных или химерных антител, полиспецифических молекул и молекул с двойной специфичностью, а также иммуноконъюгатов) в соответствии с данным изобретением, которые содержат сайты связывания комплемента, например части 1дС1, -2 или -3, или 1дМ, которые связываются с комплементом, также могут применяться в присутствии комплемента. В одном варианте обработка ех у1уо популяции клеток, содержащих клетки-мешени, агентом связывания в соответствии с данным изобретением и подходящими эффекторными клетками может быть дополнена добавлением комплемента или содержащей комплемент сыворотки. Фагоцитоз клеток-мишеней, покрытых агентом связывания в соответствии с данным изобретением, может быть усилен связыванием белков комплемента. В другом варианте клетки-мишени, покрытые композициями (например, человеческих антител, полиспецифические молекул и молекул с двойной специфичностью) в соответствии с данным изобретением, также могут быть лизированы комплементом. В другом варианте композиции в соответствии с данным изобретением не активизируют комплемент.
Композиции (например, человеческих, гуманизированных или химерных антител, полиспецифических молекул и молекул с двойной специфичностью, а также иммуноконъюгатов) в соответствии с данным изобретением также можно вводить вместе с комплементом. Соответственно, в рамках данного изобретения находятся композиции, содержащие человеческие антитела, полиспецифические молекулы или молекулы с двойной специфичностью и сыворотку или комплемент. Преимущество таких композиций состоит в том, что комплемент находится в непосредственной близости от человеческих антител, полиспецифических молекул или молекул с двойной специфичностью. Альтернативно, человеческие антитела, полиспецифические молекулы или молекулы с двойной специфичностью в соответствии с данным изобретением и комплемент или сыворотку можно вводить отдельно.
Антитела в соответствии с данным изобретением также можно применять в комбинации с одним или больше дополнительными терапевтическими антителами или другими агентами связывания, такими как слитые белки 1д Ие ограничивающие примеры других антител или агентов связывания, с которыми анти-СХСК4 антителом в соответствии с данным изобретением можно вводить в комбинации, включают антитела или агенты связывания с СТЬА-4, Р8МА, СЭ30, 1Р-10, ШЫ^, СЭ70, ΡΌ-1, ΡΌ-Ы, ТИР, ТИР-К, УЕСЕ, УЕСЕ-К, ССК5, 1Ь-1, 1Ь-18, 1Ь-18К, ΟΌ19, Сатра!й-1, ЕСЕК, ΟΌ33, ΟΌ20, ^γ-2, ΟΌ25, дрИЬ/Ша, 1дЕ, СЭ11а, интегрин α4, ΙΙΑ-α и ШМАК1.
Также в пределах данного изобретения находятся наборы, содержащие композиции антител в соответствии с данным изобретением (например, человеческих антител, молекул с двойной специфичностью или полиспецифических молекул, а также иммуноконъюгатов) и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать один или более дополнительных реагентов, например иммуносупрессивный реагентов, цитотоксический агент или радиотоксический агент или одно или больше дополнительных человеческих антител в соответствии с данным изобретением (например, человеческое антитело, обладающее большей комплементарной активностью, которое связывается с другим эпитопом на антигене СХСК4, чем первое человеческое антитело).
Соответственно, больным, получающим лечение композициями антител в соответствии с данным изобретением, можно дополнительно вводить (до, одновременно или после введения человеческого антитела в соответствии с данным изобретением) другой терапевтический агент, например цитотоксический или радиотоксический агент, который увеличивает или усиливает терапевтический эффект человеческих антител.
В других вариантах субъект может дополнительно получать лечение агентом, который модулирует,
- 40 018836 например увеличивает или ингибирует экспрессию или активность Рс γ или рецепторов Рс γ, например, путем лечения субъекта цитокином. Предпочтительные цитокины для введения в ходе лечения полиспецифической молекулой включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (С-С8Р), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (СМ-С8Р), интерферон-γ (ΙΡΝ-γ) и фактор некроза опухоли (ΤΝΡ).
Композиции (например, человеческие антитела, полиспецифические молекулы и молекулы с двойной специфичностью) в соответствии с данным изобретением могут также применяться для нацеливания на клетки, экспрессирующие СХСК4, например для маркировки таких клеток. Для такого применения агент связывания может быть присоединен к молекуле, которая может быть обнаружена. Таким образом, в данном изобретении предлагаются способы локализации ех νί\Ό или ίη νίίΐΌ клеток, экспрессирующих СХСК4. Поддающаяся обнаружению метка может представлять собой, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента.
В конкретном варианте данного изобретения предлагаются способы обнаружения присутствия антигена СХСК4 в образце или измерения количества антигена СХСК4, включающие контакт образца и контрольного образца с человеческим моноклональным антителом или его частью, которая связывается с антигеном, которое специфично связывается с СХСК4, в условиях, которые позволяют образование комплекса между антителом или его частью и СХСК4. Далее образование комплекса выявляют, причем разница между образованием комплекса в образце и контрольном образце указывает на присутствие антигена СХСК4 в образце.
В другом варианте, иммуноконъюгаты в соответствии с данным изобретением могут применяться для нацеливания соединений (например, терапевтических агентов, меток, цитотоксинов, радиотоксинов, иммуносупрессантов и т.п.) на клетки, которые содержат на поверхности клетки рецепторы СХСК4, путем присоединения таких соединений к антителу. Таким образом, в данном изобретении также предлагаются способы локализации ех νί\Ό или ίη νί\Ό клеток, экспрессирующих СХСК4 (например, с помощью поддающейся обнаружению метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента). Альтернативно, иммуноконъюгаты могут применяться, чтобы вызвать гибель клеток, на поверхности которых присутствуют рецепторы СХСК4, нацеливая цитотоксины или радиотоксины на СХСК4.
Известно, что СХСК4 экспрессируется на широком спектре типов опухолевых клеток, а также известно, что он принимает участие в метастазировании опухоли. Кроме того, как сорецептор входа ВИЧ в Т-клетки известно, что СХСК4 принимает участие в ВИЧ-инфицировании. Кроме того, показано, что путь СХСК4/8ЭР-1 принимает участие в воспалительных состояниях. Дополнительно показано, что путь СХСК4/8ЭР-1 принимает участие в ангиогенезе или неоваскуляризации. Соответственно, анти-СХСК4 антитела (а также иммуноконъюгаты и молекулы с двойной специфичностью) в соответствии с данным изобретением могут применяться для модулирования активности СХСК4 в каждой из описанных ниже клинических ситуаций:
А. Рак.
Показано, что СХСК4 экспрессируется различными видами злокачественных новообразований, и для некоторых ситуаций установлена обратная корреляция между экспрессией СХСК4 и прогнозом или выживаемостью пациентов. Не ограничивающие примеры видов злокачественных новообразований, сопровождающихся экспрессией СХСК4, включают рак молочной железы (Ми11ег, А. е! а1. (2001) №!иге 410:50-56); яичника (8со!!оп, С. е! а1. (2001) Вг. I. Сапсег 85:891-897; предстательной железы (ТаюЬтап, К.8. е! а1. (2002) Сапсег Кез. 62:1832-1837; немелкоклеточный рак легкого (8рапо !Р. е! а1. (2004) Апп. 0псо1. 15:613-617); рак поджелудочной железы (КозЫЬа, Т. е! а1. (2000) С1т. Сапсег Кез. 6:3530-3535); щитовидной железы (Нтапд, кН. е! а1. (2003) I. С1т. Епбосппо1. Ме!аЬ. 88:408-416); назофарингеальную карциному (\Уапд, Ν. е! а1. (2005) I. Тгапз1. Меб. 3:26-33); меланому (8са1а, 8. е! а1. (2005) С1т. Сапсег Кез. 11:1835-1841); почечно-клеточную карциному (8(а11ег, Р. е! а1. (2003) №!иге 425:307-311); лимфому (ВегЮйш, Р. е! а1. (2002) Сапсег Кез. 62:3530-3535); нейробластому (Сеттбег, Н. е! а1. (2001) I. 1ттипо1. 167:4747-4757); глиобластому (Кетре1, 8.А. е! а1. (2000) С1т. Сапсег Кез. 6:102-111); рабдомиосаркому (Ь1Ьига, I. е! а1. (2002) В1ооб 100:2597-2606); рак ободочной и прямой кишки Щее1епЬегд, Ι.8. е! а1. (2003) Сапсег Кез. 63:3833-3839); почки (8сЬгабег, А.к е! а1. (2002) Вг. I. Сапсег 86:1250-1256); остеосаркому (Ьауегб1еге, С. е! а1. (2005) С1т. Сапсег Кез. 11: 2561-2567); острую лимфобластную лейкемию (Сгаххо1ага, К. е! а1. (2001) Вг. I. Наета!о1. 115:545-553) и острую миелоидную лейкемию (КотЬои!з, Е.1.С. е! а1. (2004) В1ооб 104:550-557).
Принимая во внимание вышеизложенное, анти-СХСК4 антитела в соответствии с данным изобретением могут применяться в лечении рака, в том числе, не ограничиваясь ими, ракового заболевания, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, яичника, предстательной железы, немелкоклеточного рака легкого, рака поджелудочной железы, щитовидной железы, назофарингеальной карциномы, меланомы, почечно-клеточной карциномы, лимфомы, нейробластомы, глиобластомы, рабдомиосаркомы, рака ободочной и прямой кишки, рака почки, остеосаркомы, острой лимфобластной лейкемии и острой миелоидной лейкемии. Антитело может применяться отдельно или в комбинации с другими
- 41 018836 видами терапии рака, например хирургическим вмешательством и/или облучением, и/или с другими антинеопластическими агентами, такими как обсуждались и перечислены выше, в том числе химиотерапевтические лекарственные средства и другие антитела против антигенов опухоли, например, такие, которые связываются с СИ20, Нег2, РЗМА, Сатра!Н-1, ЕСЕВ и т.п.
B. Вирусные инфекция, в том числе ВИЧ-инфекция.
Показано что СХСВ4 представляет собой сорецептор для входа ВИЧ в Т-клетки и, кроме того, некоторые мышиные анти-СХСВ4 антитела продемонстрировали способность ингибировать вход штаммов ВИЧ в Т-клетки (см. ^и, Т. е! а1. (1998) 1. Iттиηο1. 160:180-188; Сатес, Х. е! а1. (2005) 1. У1го1. 79:19301938). Таким образом, СХСВ4 может использоваться вирусами в качестве рецептора для входа в клетку, и антитела к СХСВ4 можно применять для ингибирования входа в клетки таких вирусов, которые используют СХСВ4 в качестве рецептора. Соответственно, человеческие анти-СХСВ4 антитела в соответствии с данным изобретением могут применяться для ингибирования входа вируса в клетку, где вирус использует СХСВ4 в качестве рецептора для входа в клетки, таким образом, что вирусная инфекция ингибируется. В предпочтительном варианте антитела применяются для ингибирования входа ВИЧ в Тклетки, например, в лечении или предотвращении ВИЧ/СПИДа. Антитело может применяться отдельно или в комбинации с другими противовирусными агентами, например антиретровирусными лекарственными средствами, такими как азидотимидин (А2Т) или ингибиторы протеазы.
C. Воспалительные состояния.
Показано, что путь СХСВ4/ЗИЕ-1 играет роль в различных воспалительных состояниях, в том числе, не ограничиваясь ими, воспалительном заболевании печени (Тегаба, В. е! а1. (2003) ЬаЬ. 1пуек(. 83:665672); аутоиммунном воспалении суставов (Ма!!Нук, Р. е! а1. (2001) 1. Iттиηο1. 167:4686-4692); аллергическом заболевании дыхательных путей (Όοηζαίο, ТА. е! а1. (2000) 1. Iттиηο1. 165:499-508) и заболевании периодонта ^ο^α™, Υ. е! а1. (2005) С1т. Ехр. Iттиηο1. 141:467-474).
Соответственно, человеческие анти-СХСВ4 антитела в соответствии с данным изобретением, которые ингибируют связывание ЗИЕ-1 с СХСВ4, могут применяться для ингибирования воспаления при воспалительных расстройствах, в том числе расстройствах, выбранных из группы, состоящей из воспалительного заболевания печени, аутоиммунного воспаления суставов, аллергического заболевания дыхательных путей, заболевания периодонта, ревматоидного артрита, воспалительного заболевания кишечника, красной системной волчанки, диабете Ι типа, воспалительных расстройств кожи (например, псориаз, красный плоский лишай), аутоиммунное заболевание щитовидной железы, синдром Сьоргена, воспалении легких (например, хроническое обструктивное заболевание легких, саркоидоз легких, лимфоцитарный альвеолит) и воспалительное заболевание почек (например, 1дА нефропатия, гломерулонефрит). Антитело может применяться отдельно или в комбинации с другими противовоспалительными агентами, например, нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (НПВП), кортикостероидами (например, преднизон, гидрокортизон), метотрексатом, ингибиторами ЦОГ -2, антагонисты фактора некроза опухоли (Т№; например, этанерсепт, инфликсимаб, адалимумаб) и иммуносупрессанты (например, 6-меркаптопурин, азатиоприн и циклоспорин А).
И. Ангиогенез.
Продемонстрировано, что ЗИЕ-1 индуцирует неоваскуляризацию посредством рекрутмента экспрессирующих СХСВ4 гемангиоцитов (Лп, И.К. е! а1. (2006) Να!. Меб. 12:557-567). Кроме того, блокада пути ЗИЕ-1/СХСВ4 может ослабить рост опухоли ίη νίνο, ингибируя ангиогенез УЕСЕ-независимым способом (6и1епд, В. е! а1. (2005) Рак. Век. 65:5864-58-71). Кроме того, как продемонстрировано в примере 2, антитела в соответствии с данным изобретением способны к ингибированию образования капиллярных трубочек ίη νί!το. Соответственно, анти-СХСВ4 антитела в соответствии с данным изобретением, которые ингибируют связывание ЗИЕ-1 с СХСВ4, могут применяться для ингибирования ангиогенеза, препятствуя пути ЗИЕ-1/СХСВ4. Ингибирование ангиогенеза может применяться, например, для ингибирования роста опухоли или метастаза опухоли (несмотря на то, является ли опухоль СХСВ4+). Антитело может применяться отдельно или в комбинации с другими антиангиогенными агентами, например анги-УЕСЕ антитела.
Е. Аутологичная пересадка стволовых клеток.
Стволовые клетки периферической крови представляют собой предпочтительный источник стволовых клеток для применения с целью аутологичной трансплантации стволовых клеток, например, в лечении некоторых гематологических злокачественных новообразований. Сбор стволовых клеток из периферической крови требует мобилизации стволовых клеток СИ34+ из костного мозга в периферическую кровь. Различные цитокины, хемокины и адгезионные молекулы вовлечены в регулирование данного процесса (обзор в ΟαζίΙΙ, Υ. (2001) ί. НешаЮШег. З!ет Се11 Век. 10:229-236), в том числе взаимодействие СХСВ4 и ЗИЕ-1. Кроме того, низкомолекулярный антагонист СХСВ4 продемонстрировал способность стимулировать быструю мобилизацию стволовых клеток СИ34+ из костного мозга в периферические отделы (см., например, Иехте, З.М. е! а1. (2004) 1. С1т. Οηοοί. 22:1095-1102; Вгохтеуег, Н.Е. е! а1. (2005) 1. Ехр. Меб. 201:1307-1318: Е1οтеηЬе^д. Ν. е! а1. (2005) В^б 106:1867-1874). Соответственно, анти-СХСВ4 антитела в соответствии с данным изобретением, которые ингибируют активности СХСВ4 (т.е. антителаантагонисты), могут применяться для стимуляции мобилизации стволовых клеток СИ34+ из костного
- 42 018836 мозга в периферическую кровь, чтобы позволить применение таких стволовых клеток для трансплантации (например, аутологичная пересадка), например в лечении гематологических расстройств, таких как множественная миелома и неходжкинская лимфома. Антитело может применяться отдельно или в комбинации с другими агентами, применяемыми для стимуляции мобилизации стволовых клеток, таких как 0-С8Р и/или 0М-С8Р. Таким образом, в другом варианте изобретения предлагается способ стимулирования мобилизации стволовых клеток СЭ34' из костного мозга в периферическую кровь субъекта, где способ включает введение субъекту анти-СХСЕ4 антитела по изобретению таким образом, что стимулируется мобилизация стволовых клеток СЭ34' из костного мозга в периферическую кровь. Способ может дополнительно включать получение стволовых клеток СЭ34' из периферической крови, например, для применения в аутологичной пересадке стволовых клеток.
Данное изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые не должны интерпретироваться как ограничивающие. Содержание всех рисунков и всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в данной заявке, явно включено в данное описание путем ссылки.
Примеры
Пример 1. Генерация человеческих моноклональных антител против СХСК4.
Человеческие моноклональные анти-СХСК4 антитела генерировали с использованием комбинированного подхода, где мышей, экспрессирующих гены человеческих антител, во-первых, иммунизировали, чтобы у мыши началась выработка репертуара человеческих иммуноглобулинов, специфичных в отношении человеческого СХСК4, и, во-вторых, готовили библиотеку человеческих антител из клеток селезенки мышей и осуществляли показ на фаге таким образом, что затем проводили скрининг фага на предмет экспрессии антител, специфичных в отношении СХСЕ4. Такой комбинированный подход, в общем, описан ВиесЫег еί а1. в заявке США № 20030091995.
Антиген.
Клетки Κ1610 (линия клеток легкого китайского хомяка, первоначально описанная в Τΐιίποη, ЕР. еί а1. (1976) СемеНсх 83:137-147) трансфицировали вектором экспрессии, кодирующим человеческий белок СХСК4 с полной длиной, таким образом, что белок экспрессировался на поверхности клеток. В векторе экспрессии использовали кодон-оптимизированную форму кДНК СХСЕ4, которую получали, как описано в Μ^^ζаЬекον, Т. еί а1. (1999) 1. Βίο1. СНет. 274:28745-28750. Для повышения иммуногенности клеток клетки покрывали тринитрофенолом (ТНФ) путем инкубации с водным раствором тринитробензолсульфоновой кислоты (ТНБС), коммерчески доступной в виде 5% раствора (81дта, кат № Р2297). Более конкретно, 1 х 108 клеток промывали 1 раз стерильным фосфатным буферным раствором, инкубировали с 50 мкл коммерческого 5% раствора ТНБС в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре, после чего трижды промывали фосфатным буферным раствором. Полученные в результате экспрессирующие СХСК-4 клетки Κ1610, покрытые ТНФ, использовали в качестве антигена для иммунизации. Готовое иммуногенное средство представляло собой смесь 100 мкл покрытых ТНФ, промытых клеток (1х107 клеток) плюс 100 мкл адъюванта Риби (ΚΛί). В ходе курса иммунизации мыши получали шесть доз иммуногенного средства.
Порода трансгенных трансхромосомных мышей Μοιι^® КМ.
Полностью человеческие моноклональные антитела против СХСК4 были получены, во-первых, иммунизацией трансгенных трансхромосомных мышей породы КМ, которые экспрессируют гены человеческих антител. У данной породы мышей эндогенный ген мышиной к легкой цепи гомозиготно разрушен, как описано в СНеи еί а1. (1993) ЕМВ0 1. 12:811-820, и эндогенный мышиный ген тяжелой цепи гомозиготно разрушен, как описано в примере 1 публикации РСТ \Х0 01/09187. Кроме того, данная порода мышей несет человеческий трансген легкой цепи к, 1<ί.'ο5 (как описано в Εΐ51ι\νί1ά еί а1. (1996) №1Шге Βίο(есНгюкду 14:845-851), а также содержит трансхромосому 8С20, которая несет локус тяжелой цепи человеческого 1д, как описано в публикации РСТ \Х0 02/43478. Мыши КМ также описаны подробно в заявке США № 20020199213.
Иммунизация КМ.
Чтобы индуцировать выработку полностью человеческих моноклональных антител к СХСК4, мышей породы Μοιι^® КМ иммунизировали клетками Κ1610, трансфицированными таким образом, чтобы экспрессировать СХСК4, и покрытыми ТНФ (как изложено выше для антигена). Общие схемы иммунизации с целью индукции выработки человеческих антител для пород мышей, несущих человеческие гены антител, описаны в Εοη^Γ§, N. еί а1. (1994) №11иге 368 (6474): 856-859; Εί51ι\νί1ά, Ό. еί а1. (1996) №11иге Βΐοΐ£θΗηο1ο^ 14: 845-851 и публикации РСТ \Х0 98/24884. Возраст мышей составлял 6-16 недель на момент первой инфузии антигена.
Мышей КМ иммунизировали антигеном в адъюванте Риби внутрибрюшинно (в/б), подкожно (п/к) или через подушечку лапы (п/л), с последующей иммунизацией в/б, п/к или п/л в пределах 3-21 дня (всего 6 сеансов иммунизации) антигеном в адъюванте Риби. Иммунную реакцию контролировали ретроорбитальным забором крови. Осуществляли скрининг плазмы окрашиванием РАС8 клеток Κ1610, экспрессирующих СХСК4 (против нетрансфицированных материнских клеток Κ1610). Мышей с достаточным
- 43 018836 титром человеческого анти-СХСК4 иммуноглобулина использовали для извлечения селезенки.
Получение библиотеки показа фага и скрининг на анти-СХСК4 антитела.
Селезенки, извлеченные у иммунизированных мышей, описанных выше, использовали для получения библиотеки показа фага, экспрессирующей тяжелые и легкие цепи человеческих антител. Более конкретно, общую РНК выделяли из селезенки, кДНК получали из РНК и кДНК вариабельного участка человеческих антител специфично амплифицировали ПЦР, по существу, как описано ВиесЫег е! а1. в патентной заявке США 20030091995. Библиотеку вариабельных участков человеческих антител клонировали в векторы экспрессии фага в существенной мере, как описано ВиесЫег е! а1. в патентной заявке США 20030091995. Осуществляли скрининг библиотеки показа фага на предмет членов библиотеки, обладающих сродством к СХСК4, путем пэннинга с человеческим СХСК4, инкорпорированным в магнитные протеолипосомы (СХСК4-МРБ). МРЦ экспрессирующие СХСК4, или другие семь трансмембранных рецепторов (7ТМ; например, ССК5), таким образом, что сохраняется природная конформация рецептора 7ТМ, были описаны ранее (см., например, М1г/аЬекоу, Т. е! а1. (2000) №11. Вю!есЬпо1. 18:649-654; ВаЬсоск, СБ е! а1. (2001) 1. Вю1. СЬет. 276:38433-38440; публикация РСТ \Х0 01/49265; патентная заявка США 20010034432). Если коротко, рекомбинантный человеческий СХСК4, который содержит метку эпитопа, солюбилизировали из линии трансфицированных клеток, экспрессирующих СХСК4, с использованием детергента СНАР80, и белок захватывали на магнитные гранулы посредством метки эпитопа. Липидную мембрану ресуспендировали в ходе удаления детергента, таким образом, что сохранялась природная конформация мембраны СХСК4, чтобы образовались СХСК4-МРБ. Три круга пэннинга библиотеки показа фага на СХСК4-МРБ приводили к 30-кратному обогащению молекулами, которые связываются с СХСК4, по сравнению с исходным уровнем. Целевые фрагменты вариабельного участка были повторно клонированы в вектор экспрессии ЕаЬ и проведен повторный анализ ЕаЬ на предмет связывания с антигеном против трансфицированных клеток, экспрессирующих СХСК4. Далее из ЕаЬ были генерированы цельные антитела с использованием стандартных методов молекулярной биологии.
ЕаЬ клоны Е7, Е9, Ό1 и Е2 были выбраны для дальнейшего анализа.
Пример 2. Структурная характеристика человеческих анти-СХСК4 моноклональных антител Е7, Е9, Ό1 и Е2.
Последовательности кДНК, кодирующие вариабельные участки тяжелой и легкой цепи ЕаЬ клонов Е7, Е9, Ό1 и Е2, полученных в результате скрининга библиотеки показа фага, как описано в примере 1, секвенированы стандартными методами секвенирования ДНК.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка тяжелой цепи Е7 показаны на фиг. 1А и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 33 и 25 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е7 показаны на фиг. 1В и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 37 и 29 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Е7 с известными человеческими последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в тяжелой цепи Е7 используется сегмент Υη из Υη 3-48 человеческой зародышевой линии, сегмент Ό из 423 человеческой зародышевой линии и сегмент Ц из Ц 6В человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности Υη Е7 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭК2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 1А и в 8ЕЦ ΙΌ N0:
1, 5 и 9 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Е7 с известными человеческими последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в легкой цепи Е7 используется сегмент VI, из УК Ь15 человеческой зародышевой линии и сегмент Ц из Ц 1 человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности V Е7 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭК2 и СЭ3 легкой цепи, как показано на фиг. 1В и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, 17 и 21 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка тяжелой цепи Е9 показаны на фиг. 2А и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 34 и 26 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е9 показаны на фиг. 2В и в 8ЕЦ ΙΌ N0: 38 и 30 соответственно.
Сравнение последовательности иммуноглобулина тяжелой цепи Е9 с известными человеческим последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в тяжелой цепи Е9 используется сегмент Υη из Υη 3-48 человеческой зародышевой линии, сегмент Ό из 423 человеческой зародышевой линии и сегмент Ц из Ц 6В человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности Ун Е9 с применением системы КаЬа! для определения участка СОВ привел к изображению участков СЭКЕ СЭК2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 2А и в 8ЕЦ ΙΌ N0:
2, 6 и 10 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Е9 с известными человеческими последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в легкой цепи Е9 используется сегмент из УК Ь15 человеческой зародышевой линии и сегмент Ц из Ц 1
- 44 018836 человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности У|, Е9 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 легкой цепи, как показано на фиг. 2В и в 8Е0 ΙΌ N0: 14, 18 и 22 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка тяжелой цепи Ό1 показаны на фиг. 3А и в 8Е0 ΙΌ N0: 35 и 27 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка легкой цепи Ό1 показаны на фиг. 3В и в 8Е0 ΙΌ N0: 39 и 31 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Ό1 известными человеческим последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в тяжелой цепи Ό1 используется сегмент νΗ из νΗ 3-48 человеческой зародышевой линии, сегмент Ό из 423 человеческой зародышевой линии и сегмент 1Η из 1ц 6Β человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности νΗ Ό1 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 3А и в 8Е0 ΙΌ N0:
3, 7 и 11 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Ό1 с известными человеческими последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в легкой цепи Ό1 используется сегмент Уъ из νκ Ь15 человеческой зародышевой линии и сегмент 1К из 1К 1 человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности νι, Ό1 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭЕ2 и СЭЕ3 легкой цепи, как показано на фиг. 3В и в 8Е0 ΙΌ N0: 15, 19 и 23 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка тяжелой цепи Е2 показаны на фиг. 4А и в 8Е0 ΙΌ N0: 36 и 28 соответственно.
Нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислот вариабельного участка легкой цепи Е2 показаны на фиг. 4В и в 8Е0 ΙΌ N0: 40 и 32 соответственно.
Сравнение последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина Е2 с известными человеческим последовательностями тяжелой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в тяжелой цепи Е2 используется сегмент νΗ из νΗ 3-48 человеческой зародышевой линии, сегмент Ό из 423 человеческой зародышевой линии и сегмент 1Η из 1Η 6Β человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности νΗ Е2 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 тяжелой цепи, как показано на фиг. 4А и в 8Е0 ΙΌ N0:
4, 8 и 12 соответственно.
Сравнение последовательности легкой цепи иммуноглобулина Е2 с известными человеческими последовательностями легкой цепи иммуноглобулина зародышевой линии продемонстрировало, что в легкой цепи Е2 используется сегмент νι, из УК Ь15 человеческой зародышевой линии и сегмент 1К из 1К 1 человеческой зародышевой линии. Дальнейший анализ последовательности У|, Е2 с применением системы КаЬа! для определения участка СОК привел к изображению участков СЭКЕ СЭЕ2 и СЭ3 легкой цепи, как показано на фиг. 4В и в 8Е0 ΙΌ N0: 16, 20 и 24 соответственно.
Анализ каркасных последовательностей участков νΗ и Уъ Е7, Е9, Ό1 и Е2 по сравнению с последовательностями зародышевой линии, из которых они были получены, идентифицировал различные остатки аминокислот каркаса, которые отличались от зародышевой линии. Некоторые остатки каркаса в N концевых участках сегментов νΗ и Уъ были выбраны для обратной мутации, чтобы восстановить остаток каркаса последовательности зародышевой линии, поскольку данные остатки в №концевой части, не соответствующие зародышевой линии, кодировались праймерами, используемыми для создания библиотеки показа фага, описанной в примере 1. В частности, следующие модифицированные формы сегментов νΗ и Уъ Е7, Е9, Ό1 и Е2 (которые носят название форм СЬ, для зародышевой линии) были созданы с использованием стандартных методов молекулярной биологии, чтобы заменить остаток аминокислоты зародышевой линии в указанном положении каркаса
- 45 018836
Ε70ίνΗ: ρΐΕ, фбЕ
Р7СЬ Ук: АЮ.КЗО
РЭОЬУн: ρΐΕ. 96Е·.
Р9ОЬ Ук: ЕЮ, УЗО, Ь4М
О1С.1.Ун:06Е
О1СЬ Ук: УЮ, ТОО, У4М
Е2ОЬУН: 06Е
Е2ОЬ Ук: ЕЮ, УЗО, Ь4М
На фиг. 5А показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот тяжелой цепи Е7 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 25) и Е76Ь (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 41) с кодируемой νΗ 3-48 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 49). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 5В показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот легкой цепи Е7 (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 29) и Е76Ь (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 45) с кодируемой νκ Ь15 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 50). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 6А показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот тяжелой цепи Е9 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 26) и Е96Ь (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 42) с кодируемой νΗ 3-48 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 6В показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот легкой цепи Е9 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30) и Е96Ь (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 46) с кодируемой νκ Ь15 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 7А показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот тяжелой цепи Ό1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 27) и ОЮЬ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 43) с кодируемой νΗ 3-48 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 7В показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот легкой цепи Ό1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 31) и ОЮЬ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 47) с кодируемой νκ Ь15 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 8А показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот тяжелой цепи Е2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 28) и Е26Ь (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 44) с кодируемой νΗ 3-48 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 49). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
На фиг. 8В показано выравнивание вариабельных последовательностей аминокислот легкой цепи Е2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32) и Е26Ь (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 48) с кодируемой νκ Ь15 зародышевой линии последовательностью аминокислот (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 50). Участки ΟΌΕΕ 0ΌΕ2 и 0ΌΕ3 обведены.
ЕаЬ фрагменты Е7, Е9, Ό1 и Е2 превращены в антитела с полной длиной с использованием стандартных методов рекомбинации ДНК. Например, ДНК, кодирующая участки νΗ И νκ одного из ЕаЬфрагментов, может быть имитирована в вектор экспрессии, который несет константные участки тяжелой и легкой цепи таким образом, что вариабельные участки функционально связаны с константными участками. Альтернативно, отдельные векторы могут применяться для экспрессии тяжелой цепи с полной длиной и легкой цепи с полной длиной. Не ограничивающие примеры векторов экспрессии, подходящих для применения в создании антител с полной длиной, включают векторы рГЕ, описанные В1аск в патентной заявке США № 20050153394.
Пример 3. Характеристики связывания человеческих моноклональных анти-СХСЯ4 антител.
В данном примере характеристики связывания анти-СХСЯ4 антител исследовали методом проточной цитометрии.
Линию человеческих Т-клеток СЕМ, которые экспрессирует природный человеческий СХСЯ4 на поверхности клетки, использовали для исследования способности антител Е7, Е9, Ό1 и Е2 связываться с природным СХСЯ4 на поверхности клетки. Е7, Е9, Ό1 и Е2 с полной длиной титровали в сериях серийных разведений 1:3, с получением интервала концентраций от 300 нМ до 5 пМ. Затем антитела смешивали с клетками СЕМ и позволяли связываться перед обнаружением с помощью конъюгированного с флуоресцеина изотиоцианатом (ЛТС) античеловеческого вторичного ΙβΟ антитела. Затем клетки анализировали методом флуоресцентной цитометрии. Полученные средние значения интенсивности флуоресценции показаны на графике фиг. 9, который демонстрирует, что все четыре анти-СХСЯ4 антитела связываются с клетками СЕМ. Значения ЕС50 для связывания Е7, Е9, Ό1 и Е2 составила 21, 14, 80 и 290 нМ соответственно.
Для определения способности панели анти-СХСЯ4 антител конкурировать за связывание с СХСЯ4 проводили исследование конкуренции. Использовали четыре человеческих анти-СХСЯ4 антитела Е9, Е7, Е2 и Ό1 наряду с четырьмя коммерчески доступными мышиными моноклональными анти-СХСЯ4 анти- 46 018836 телами (12С5, 708, 716 и 717; К&П 8ук1етк, кат. № МАВ170, МАВ171, МАВ172 и МАВ173 соответственно). Анти-СХСК4 антитела титровали в сериях серийных разведений 1:3, с получением интервала концентраций от 300 нМ до 5 пМ в присутствии постоянной концентрации меченного Е1ТС анти-СХСК4 антитела Е9. Далее смесь антител добавляли к клеткам СЕМ и позволяли связывание. Способность каждого антитела конкурировать с Е9 за связывание с клетками СЕМ оценивали методом флуоресцентной цитометрии и обнаружения Е1ТС. Полученные средние значения интенсивности флуоресценции показаны на графике фиг. 10, который демонстрирует, что все семь исследуемых антител (Е7, Е2, Ό1, 12С5, 708, 716 и 717) могли конкурировать с Е9 за связывание с клетками СЕМ, хотя антитело Е2 продемонстрировало только частичное ингибирование в высоких концентрациях по сравнению с другими антителами.
В другой серии экспериментов исследовали способность Е7 тАЬ связываться с различными линиями клеток методом проточной цитометрии, проводя титрование ЕАС8. Увеличивающиеся количества тАЬ (с менее 0,001 мкг/мл до более 100 мкг/мл) инкубировали с 100,00 клетками, и связывание оценивали методом проточной цитометрии. Также было определено значение Втах, которое приблизительно показывало, сколько молекул СХСК4 присутствует на каждой клетке. На основе кривых связывания была определена ЕС50 для связывания антитела; результаты определения кратко представлены в табл. 1 ниже.
Таблица 1 Результаты ЕАС8 титрования для связывания тАЬ Е7 с различными линиями клеток
Тип клеток ЕС$(> (мкг/мл) Вшах
Кашоа 0,48 106 000
К.а]1 0,34 52 536
ΝίίττιαΙν,'Η 1,57 116 000
Ь540 3,69 31 868
ЭМ579 3,99 24 587
МОА-МВ-231 9,24 14 186
Втах - максимальное связывание (единицы СМЕ1 [геометрическое среднее значение интенсивности флуоресценции])
Результаты показывают, что Е7 тАЬ способно эффективно связываться с каждой из исследованных шести линий клеток, причем самые низкие значения ЕС50 наблюдаются для линий клеток Каток и Кар. Полученные данные также показывают, что экспрессия рецептора СХСК4 наиболее высока для клеток Каток и Ната1^а, и самая низкая для клеток МОА-МВ-231 и клеток ЭМ879.
В другом эксперименте по исследованию связывания изучали способность Е7 тАЬ связываться с различными подмножествами моноядерных клеток периферической крови человека (РВМС). Человеческие РВМС выделяли стандартными способами и различные подмножества клеток изолировали методом ЕАС8. В частности, следующие подмножества клеток были выделены: (ί) ί.Ό3\ (ίί) СЭ20'; (ίίί) СЭ11Ь' и (ίν) ί.Ό14'. Эксперименты методом проточной цитометрии, проводимые с Е7 тАЬ (в концентрации 33 мкг/мл), продемонстрировали, что Е7 тАЬ способно эффективно связываться с каждым из четырех подмножеств по сравнению с контрольным антителом соответствующего изотипа.
Пример 4. Ингибирование связывания 8ЭЕ-1 с СХСК4 анти-СХСК4 антителами.
Чтобы определить способность человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать связывание 8ЭЕ-1 с СХСК4, было проведено исследование конкуренции с использованием меченных 125Ι 8ЭЕ-1 и СЕМ клеток, которые природным образом экспрессируют СХСК4. Сравнение влияния анти-СХСК4 антител на блокирование связывания 8ЭЕ-1 с клетками СЕМ выполняли с помощью стандартного анализа связывания с лигандом, меченным радиоактивным изотопом.
Анти-СХСК4 антитела титровали в сериях серийных разведений 1:3, с получением интервала концентраций от 300 нМ до 137 пМ. Антитела добавляли к 750000 клеток СЕМ в 100 мкл в присутствии 100 пМ 1251-8ОЕ-1 со специфической активностью 2000 Ки/ммоль (АтегкЬат, кат. № 1М314-25ИС1). Постороннее антитело с таким же изотипом применяли в качестве негативного контроля. Общее возможное связывание с лигандом, меченным радиоактивным изотопом, определяли, позволяя связывание 1251-8ОЕ1 с клетками СЕМ в отсутствие антител в течение 2 ч при 4°С. Неспецифическое связывание с лигандом, меченным радиоактивным изотопом, определяли, позволяя связывания 1251-8ОЕ-1 в присутствии 1 мкМ не меченного 8ЭЕ-1 (Рерго1есЬ, кат. № 300-28А). Количество связанного с клеткой 1251-8ОЕ-1 определяли стандартными способами. Результаты показаны на фиг. 11, которая демонстрирует, что антитело Е7 обеспечивает наиболее эффективную блокаду связывания 8ЭЕ-1 с СХСК4, экспрессированным на клетках СЕМ. Антитела Е9 и Ό1 также блокировали связывание 8ОЕ-1, хотя менее эффективно, чем Е7. Антитело Е2, хотя и связывалось с СХСК4 на клетках СЕМ (как продемонстрировано в примере 3), не блокировало эффективно связывание 8ЭЕ-1 с СХСК4 на клетках СЕМ. Значения ЕС50 для блокирования 8ОЕ-1 Е7, Е9 и Ό1 составили 2,3, 12,5 и 28,6 нМ соответственно.
Пример 5. Ингибирование индуцированного 8ЭЕ-1 притока кальция анти-СХСК4 антителами.
Для определения способности человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать приток кальция в
- 47 018836 клетки СЕМ, индуцированный 8БР-1, клетки СЕМ сначала метили с флуоресцентным красителем Са1сшт 3 (Мо1еси1аг Бетюек). Анти-СХСК4 антитела титровали в сериях серийных разведений 1:3 с получением интервала концентраций от 100 нМ до 1 пМ, позволяли связываться с 200 000 клеток СЕМ в 200 мкл и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре до загрузки в аппарат Р1ехк!аБоп (Мо1еси1аг Бе\тсек). В качестве негативного контроля применяли постороннее антитело с таким же изотипом. Далее клетки стимулировали рекомбинантным человеческим 8βΕ-1β (Рерго!есй) в конечной концентрации 50 нМ, который добавляли как 500 нМ в объеме 22 мкл до конечного объема 222 мкл. Результирующий приток кальция измеряли на протяжении 200 с на лунку. В качестве позитивного контроля клетки в отсутствие антитела стимулировали 8βΡ-1β (в буферизованном солевом растворе Ханка [ХБР], содержащем 0,1% альбумина телячьей сыворотки или ХБР), чтобы достичь максимально возможного сигнала притока кальция. Чтобы определить базовый уровень, клетки стимулировали ХБР, содержащим 0,1% альбумина телячьей сыворотки. Стимулированное 8БР-Щ высвобождение кальция измеряли по развитию кальцийзависимой флуоресценции во времени. Область под кривой полученного следа флуоресценции была зарегистрирована как показатель притока кальция. Результирующее ингибирование притока кальция анти-СХСК4 антителами представлено на фиг. 12. Данные были нанесены на график, значения ЕС50 были вычислены с использованием программного обеспечения СгарйРаб Рикш, нелинейной аппроксимации кривой и сигмовидной формулы доза-реакция. Антитела Р7, Р9 и Б1 ингибировали индуцированный 8БР-1 β приток кальция. Антитело Е2, хотя и связывалось с СХСК4 (как продемонстрировано в примере 3), не ингибировало значительно индуцированного 8БР-1 β притока кальция. Значения ЕС50 для ингибирования индуцированного 8БР-1 притока кальция Р7, Р9 и Б1 составили 0,90, 0,32 и 0,57 нМ соответственно.
Пример 6. Ингибирование индуцированной 8БР-1 миграции клеток СЕМ анти-СХСК4 антителами.
Для определения способности человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать миграцию клеток СЕМ, индуцированную 8БР-1, клетки СЕМ сначала метили реактивом ВАТБА (Реткш Е1тег). АнтиСХСК4 антитела титровали в сериях последовательных разведений 1:3 с получением интервала концентраций от 100 нМ до 1 пМ и позволяли связываться с меченньми клетками СЕМ с плотностью 10 млн клеток на 1 мл. В качестве негативного контроля применяли постороннее антитело с таким же изотипом. Рекомбинантный человеческий 8БР-1 β (Рерго!есй) добавляли в концентрации 5 нМ в количестве 30 мкл на лунку в нижнюю камеру 96-луночного планшета для изучения миграции НеигоргоЬе с фильтрами диаметром 5,7 мм на лунку. Каждая лунка содержала поры размером 5 мкм. Меченные клетки СЕМ с антителом и без него загружали на фильтры в концентрации 0,5 млн клеток на лунку в объеме 50 мкл. Планшет для изучения миграции инкубировали при 37°С в течение 2,5 ч. Мигрирующие клетки захватывали в нижней камере планшета, подвергали лизису и обнаруживали с помощью раствора для обнаружения Еиторшт (Реткт Е1тег). Хемилюминесцентный сигнал регистрировали на приборе Рикюп. Результирующее ингибирование индуцированной 8БР-1 β миграции анти-СХСК4 антителами показано на фиг. 13. Результаты демонстрируют, что антитела Р7 и Р9 эффективно ингибировали миграцию, в то время как антитела Б1 и Е2 не ингибировали значительно миграцию. Значения ЕС50 для ингибирования Р7 и Р9 индуцированной 8БР-1 миграции клетки СЕМ составили 12,44 и 18,99 нМ соответственно.
Пример 7. Ингибирование образования ^УЕС капиллярных трубочек анти-СХСК4 антителами.
В данном примере изучали способность человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека (ЧиУЕС). Ма!пде1 разбавляли 1: 1 средой КРМР наносили на лунки 96-луночного планшета и позволяли полимеризоваться в течение 30 мин при 37°С. ^УЕС (от СатЬгех, кат. № СС-2519) с 80% слияния трипсинизировали и ресуспендировали в концентрации 1 х 106 клеток на мл в среде КРМР содержащей 0,5% фосфатного буферного раствора (ФБР). Антитела тщательно перемешивали с ^УЕС в конечной концентрации 3 мкг/мл и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Постороннее антитело с таким же изотипом или только среду использовали в качестве негативного контроля. В качестве позитивного контроля ингибирования образования трубочек использовали мышиное антитело против αν β3 человека (К&Б 8ук!етк, кат. № МАВ3050) (СБ51/СБ61). ШУЕС, с антителами или без них, покрывали покрытые та!пде1 лунки и инкубировали при 37°С в течение 18 ч.
^УЕС, инкубированные только со средой или с контрольным антителом соответствующего изотипа, образовывали капиллярные трубочки, что приводило к появлению соединенных клеток на планшете с 3-5 точками связи или точками ответвлений на клетку. ^УЕС, инкубированные с человеческими антиСХСК4 антителами или анти-α,, β3 антителом, не образовывали капиллярных трубочек. Клетки выглядели выделенными, с немногими или отсутствием точек ответвления. Анти-СХСК4 антитела, которые были наиболее эффективны с точки зрения блокирования связывания 8БР-1, индуцированного 8БР-1 притока кальция и индуцированной 8БР-1 миграции, а именно Р7 и Р9, были также наиболее эффективны с точки зрения ингибирования образования капиллярных трубочек. Анти-СХСК4 антитело Е2, которое связывается с СХСК4, но не блокирует связывания 8БР-1 или индуцированных 8БР-1 эффектов, не ингибировало образования капиллярных трубочек.
Пример 8. Ингибирование ш νίΙΐΌ пролиферации опухолевых клеток анти-СХСК4 антителами.
- 48 018836
В данном примере исследовали способность человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать пролиферацию клеток опухоли Каток (линия клеток лимфомы Беркитта человека) ш νίΙΐΌ. В испытании, 1х104 клеток/лунку инкубировали с увеличением доз (от 10-3 до 300 нМ) антитела Р7 ГдО4, антитела Р9 1дС1, антитела Е2 ГдО1, антитела Р9 РаЬ' или контрольных изотипов. Клетки инкубировали с антителом в течение 72 ч, причем добавляли 3Н-тимидин на последние 24 ч инкубации, чтобы позволить мониторинг пролиферации клеток. После инкубации инкорпорацию 3Н-тимидина в клетки измеряли стандартными методами. Результаты показаны на графике фиг. 14. Результаты демонстрируют, что каждое из антител Р7 ГдО4, Р9 ГдО1 и Е2 ГдО1 могло ингибировать пролиферацию клеток Каток, что показано сниженной инкорпорацией 3Н-тимидина, при инкубировании с данными антителами, тогда как фрагмент Р9 РаЬ' не ингибировал пролиферацию клетки. Полученные результаты показывают, что человеческие антиСХСК4 антитела оказывают прямое антипролиферативное воздействие на опухолевые клетки ш νίΙΐΌ и, таким образом, не требуют вторичного перекрестного связывания, чтобы достичь антипролиферативного эффекта.
Пример 9. Ингибирование ш у|уо пролиферации клеток солидной опухоли анти-СХСК4 антителами.
В данном примере исследовали способность человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать пролиферацию прижившейся солидной опухоли ш у1уо с использованием модели подкожной имплантации опухолевых клеток Каток. В данном испытании 10х106 клеток Каток/мышь были имплантированы в область бока каждой мыши, и опухоли позволили достичь среднего размера 40 мм, вычисленного как ширина х длину х высоту/2 опухолей. Далее мышам вводили внутрибрюшинной (в/б) инъекцией первую дозу антитела (обозначена как день 0 лечения) и вторую дозу антитела в/б в день 7. Мыши, которые получали антитело фрагмента РаЬ', также получали в/б дозу антитела в дни 3 и 10. Группы мышей (п = 8) получали одно из следующего: (ί) растворитель; (ίί) контрольное антитело соответствующего изотипа (15 мг/кг); (ΐϊϊ) Р7 ГдО4 (15 мг/кг); (ίν) Р9 ГдО1 (15 мг/кг); (ν) Р9 РаЬ' (10 мг/кг) или (νί) позитивный контроль анти-СЭ20 (15 мг/кг). Объем опухоли и массу тела мыши измеряли с регулярными промежутками времени (приблизительно 2-3 раза в неделю) между днем 0 и днем 30 после введения дозы. Результаты эксперимента представлены на фиг. 15А, 15В и 15С, которые показывают средний объем опухоли (на фиг. 15А), медианный объем опухоли (на фиг. 15В) и медианный % изменения массы тела (на фиг. 15С). Продемонстрированные результаты показывают, что подобно позитивному контролю антитела Р7 ГдО4 и Р9 1дС1 существенно ингибировали рост опухолевых клеток по данным увеличенного объема опухоли, тогда как фрагмент Р9 РаЬ' не препятствовал росту опухолевых клеток по сравнению с контрольным антителом соответствующего изотипа. Все терапевтические средства хорошо переносились, на что указывает отсутствие существенных изменений массы тела. Различия в массе тела между группами лечения были, вероятнее всего, результатом массы опухолей. Результаты показывают, что человеческие анти-СХСК4 антитела способны ингибировать рост прижившейся солидной опухоли ш νί\Ό.
Пример 10. Увеличение продолжительности жизни на мышиной модели системного введения клеток опухоли при лечении анти-СХСК4 антителом.
В данном примере способность человеческого анти-СХСК4 антитела увеличивать продолжительность жизни мышей исследовали с использованием модели системного введения опухолевых клеток Каток. В данном исследовании 1х106 клеток Каток/мышь вводили внутривенно (в/в) каждой мыши в день 0. Затем мышам инъекционно вводили внутрибрюшинно (в/б) первую дозу антитела в день 1 (т.е. через 1 день после в/в введения опухолевых клеток) и еще четыре дозы антитела в/б в дни 5, 8, 15 и 22 (мыши, получавшие антитело позитивного контроля, получали лечение только в день 1). Группы мышей (п = 8) получали одно из следующего: (ί) растворитель; (ίί) контрольное антитело соответствующего изотипа (15 мг/кг); (ш) Р9 ГдО1 (15 мг/кг) или (ίν) позитивный контроль анти-СИ19 (15 мг/кг). Процент выживания измеряли через регулярные промежутки между днями 0 и 50 после дня введения дозы (паралич задних лап использовали в качестве конечной точки эксперимента). Результаты эксперимента представлены на фиг. 16, где показан процент выживания с течением времени. Медианное количество дней продолжительности жизни для мышей, получавших растворитель или контрольное антитело соответствующего изотипа, составило 23 и 25,5 дней соответственно, тогда как медианное количество дней продолжительности жизни мышей, получавших лечение одной дозой позитивного контроля анти-СИ19, составило 39 дней. Существенно, что 100% мышей в группе, получавшей 5 доз антитела Р9 ГдО1, дожили до конца эксперимента. Полученные результаты показывают, что человеческое анти-СХСК4 антитело способно увеличивать продолжительность жизни мышей в модели системного введения опухолевых клеток.
Пример 11. Индукция апоптоза моноклональным анти-СХСК4 антителом Р7.
В данном примере исследовали способность анти-СХСК4 тАЬ Р7 индуцировать апоптоз в различных клетках. В исследовании апоптоза Р7 тАЬ в концентрации 10 мкг/мл инкубировали с клетками Каток (500000 клеток), клетками №та1га (500000 клеток) или клетками К1610, трансфицированными для экспрессии СХСК4 (100000 клеток). Не трансфицированные клетки К1610 использовали в качестве негативного контроля. Анти-СХСК4 тАЬ Р7 или контрольное антитело соответствующего изотипа инкубировали с клетками при 37°С и образцы по 250 мкл отбирали в точках 24, 48 и 72 ч. Для оценки апоптоза клетки из различных точек времени инкубировали с аннексином У-РГТС-РЫ и пропидия йодидом
- 49 018836
ЕЬ3, с последующей проточной цитометрией. Объединенный процент клеток, собранных в двойных позитивных квадрантах ЕЬ1, ЕЬ3 и ЕЬ1-ЕЬ3, считался апоптотическим. Для исключения фона процент клеток с апоптозом, индуцированным антителами изотипа, вычитали из процента Е7 тАЬ-индуцированных апоптотических клеток.
Результаты суммированы в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Индукция апоптоза анти-СХСК4 тАЬ Е7
Клетки Время (часы) % апоптоза
К1610 72 <1
К1610-СХСК4 24 39
К1610-СХСК4 48 58
К1610-СХСК4 72 46
Каток 24 22
Каток 48 31
Каток 72 22
Ыата^а 24 17
№та1м/а 48 24
ИатаЮ'а 72 44
Общий % значений апоптоза скорректирован для изменений базовой линии, индуцированных контрольными антителами соответствующего изотипа.
Результаты демонстрируют, что Е7 тАЬ способны индуцировать апоптоз в клетках Каток, №таКта и К1610-СХСК4, в то время как Е7 не оказывают влияния на индукцию апоптоза материнских клеток К1610, показывая, что реакция была СХСК4-специфичной.
Пример 12. Дополнительные исследования, показывающие ингибирование пролиферации клеток солидной опухоли ш νί\Ό анти-СХСК4 антителами.
В данном примере исследовали способность человеческих анти-СХСК4 антител ингибировать пролиферацию или индуцировать апоптоз прижившихся твердых опухолей ш νί\Ό с использованием дополнительных моделей опухолевых клеток, подобных модели Каток, описанной выше в примере 9. Исследовали различные линии опухолевых клеток. Характерные эксперименты и результаты описаны ниже.
В одном из экспериментов 7,5х106 клеток рака молочной железы человека МОА-МВ231/мышь имплантировали в область бока каждой мыши и позволяли достичь среднего размера 100 мм3, рассчитанного как ширина х длину х высоту/2 опухоли, что произошло на 7-й день после имплантации. Мыши были рандомизированы в различные группы лечения и получали внутрибрюшинной (в/б) инъекцией первую дозу антитела на 7-й день после имплантации, и вторую дозу антитела в/б в день 14 после имплантации, а затем получали третью дозу в день 46 после имплантации. Группы мышей (п = 9) получали одно из следующего: (ί) растворитель (фосфатный буферный раствор); (ίί) контрольное антитело ΙβΟ1 соответствующего изотипа (15 мг/кг); (ш) контрольное антитело ΙβΟ4 соответствующего изотипа (15 мг/кг); (ίν) Е7 Ιβ61 (15 мг/кг) или (ν) Е7 ΙβΟ4 (15 мг/кг). Объем опухолей измеряли через регулярные промежутки времени и средний и медианный объем опухоли определяли для каждой группы лечения в каждом интервале. Результаты данного эксперимента суммированы в табл. 3 ниже, где показан средний объем опухоли (в мм3) и % ингибирования роста опухоли (ТСЦ в день 52, а также медианный объем опухоли (в мм3) и % Т^ в день 59 после имплантации.
- 50 018836
Таблица 3
Ингибирование тЛЬ Е7 роста клеток опухоли Μ^Л-ΜВ231 ίη νί\Ό
Лечение День 52 День 59
Среднее значение τσι (%) Медиана ТСК%)
Растворитель 154 187
Контрольное антитело 1§С1 соответствующего изотипа 172 216
Контрольное антитело 1§С4 соответствующего изотипа 188 226
Анти-СХСК.4 Ιε61 Р7 86 50 130 40
Анти-СХСК4 1дС4 Р7 79 58 108 52
Дополнительно, у одной из мышей в группе лечения Е7 Ι^4 опухоль отсутствовала в день 59. Результаты демонстрируют, что Е7 тЛЬ способно ингибировать рост клеток рака молочной железы Μ^ЛМВ231 ίη νί\Ό.
Во втором эксперименте 5x10 клеток мелкоклеточной карциномы легкого человека ОМ879/мышь имплантировали в область бока каждой мыши и позволяли достичь среднего размера 1б0 мм3, рассчитанного как ширина χ длину χ высоту/2 опухоли, что произошло на 7-й день после имплантации. Мыши были рандомизированы в различные группы лечения и получали внутрибрюшинной (в/б) инъекцией антитела по схеме введения каждые 3 дня χ 5 (каждые три дня, пять доз). Группы мышей (η = 10) получали одно из следующего: (ί) растворитель (фосфатный буферный раствор); (ίί) контрольное антитело Ι^4 соответствующего изотипа (10 мг/кг) или (ίίί) Е7 Ι^4 (10 мг/кг). Объем опухоли измеряли через регулярные промежутки и определяли средний и медианный объем опухоли для каждой группы лечения в каждом интервале. Результаты данного эксперимента суммированы в табл. 4 ниже, где показаны средний и медианный объем опухоли (в мм3) и % ингибирования роста опухоли (ТСр в день 34 после имплантации.
Таблица 4
Ингибирование тЛЬ Е7 роста клеток опухоли ЭМ879 ίη νί\Ό
Лечение День 34
Среднее значение ΤΟΙ (%) Медиана ΤΟΙ (%)
Растворитель 900 882
Контрольное антитело 1^64 соответствующего изотипа 992 903
Анти-СХСК.4 1§С4 Р7 620 38 599 34
Результаты демонстрируют, что Е7 тЛЬ способно ингибировать рост клеток мелкоклеточной карциномы легкого человека ЭМ879 ίη νί\Ό.
На дополнительных моделях подкожного введения ксенотрансплантата опухоли исследовали способность анти-СХСК4 антител ингибировать рост опухоли в экспериментах, подобных описанным выше, и в примере 9. В эксперименте с использованием клеток лимфомы В-клеток ЗИ-ОНЬ-б результаты показали, что лечение Е7 Ι^4 тЛЬ в дозе 15 мг/кг приводит приблизительно к б0% иигибированию роста опухоли. Также в эксперименте с использованием клеток лимфомы Беркитта №1та1\\а результаты показали, что лечение Е7 Ι^4 тЛЬ в дозе 3 мг/кг приводит приблизительно к 70% ингибированию роста опухоли. И наоборот, ингибирование роста опухоли Е7 тЛЬ не наблюдалось в экспериментах с использованием клеток карциномы легкого МН-Н22б или клеток аденокарциномы поджелудочной железы человека ΗΡΑΟ Однако окрашивание этих клеток Е7 тЛЬ в экспериментах проточной цитометрии показало минимальную экспрессию ίη νίΙΐΌ. Хотя опухолевые клетки ίη νί\Ό поддавались окрашиванию тЛЬ по данным иммуногистохимических исследований, не ясно, на какой стадии роста опухоли начал экспрессироваться СХСК4. Полученные данные свидетельствуют, что экспрессия СХСК4 двумя указанными линиями клеток была недостаточной, чтобы позволить ингибирование роста опухоли или индукцию апоптоза ίη νί\Ό анти-СХСК4 лечением.
Пример 13. Ингибирование легочных метастазов ίη νί\Ό анти-СХСК4 антителами.
В данном примере исследовали способность анти-СХСК4 тЛЬ Е7 ингибировать легочные метаста
- 51 018836 зы с использованием модели системного введения опухоли мыши С57. Более конкретно, 0,4х10б клеток В16-СХСВ4 (клетки В16 трансфицировали для экспрессии человеческого СХСВ4) вводили внутривенно каждой из 30 мышей породы С57. Мыши были рандомизированы на 3 группы по 10 мышей в каждой, которые далее получали одно из следующего: (ί) растворитель (фосфатный буферный раствор); (и) контрольное антитело соответствующего изотипа !дС4 (5 мг/кг) или (ш) Е7 !дС4 (5 мг/кг). Антитело или растворитель вводили внутрибрюшинной инъекцией через 30 мин после внутривенного введения клеток В16-СХСВ4. Легкие извлекали в день 14, производили подсчет количества узелков метастазов в легких. Результаты суммированы в табл. 5 ниже, где показано среднее и медианное значение количества метастазов в легких для каждой группы.
Таблица 5
Ингибирование тАЬ Е7 легочных метастазов ίη νίνο
Лечение
Количество легочных метастазов % ингибирование легочных метастазов (среднее значение)
среднее значение медиана
Растворитель 364 397
Контрольное антитело 1§С4 309 294 15%
соответствующего изотипа
Анти-СХСК.41§С4 Г7 157 186 56%
Результаты показывают, что лечение Е7 тАЬ приводило к уменьшению среднего количества метастатических узелков в легких на 56%, тогда как уменьшение в группе контрольного антитела соответствующего изотипа составило только 15%, демонстрируя, что Е7 тАЬ способно ингибировать легочные метастазы в модели системного введения опухоли.
- 52 018836
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> МЕДАРЕКС. ИНК.
<120> Человеческие антитела, которые включают СХСЯ4 и используют его <130> МХ1-375РС <140>
<141>
<150> 60/827,851 <151> 2006-10-02 <160> 53 <170> Патент в версии 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 1
Зег Туг Зег Мер Азп
5 <210> 2 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> кото заргепз <400> 2
Зег Туг Зег Мер Азп
5 <210> 3 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 3
Зег Туг Зег Мек Азп
5 <210> 4 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 4
Зег Туг Зег Мек Азп
5 <210> 5 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 5
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Ткг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 С1у 5 10 15
<210> 6 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 6 Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз
1 5 10 15
<210* 7 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 7
Туг Не Бег Зег Агд Зег Ьуз ТНг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15
О1у <210> 8 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 8
Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Ткг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз 15 10 15 (31у <210> 9 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 9
Азр Туг <31у С1у (31п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мек Азр Уа1
1 5 10 15
<210> 10 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 10 Азр Туг С1у С1у С1П Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мек Азр Уа1
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 11 16 БЕЛОК Ното заргепз
<400> 11
Азр Туг С1у С1у <31п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мер Азр Уа1
10 15 <210> 12 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 12
Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Нхз Туг Туг Туг С1у Мер Азр Уа1 15 10 15 <210> 13 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 13
Агд А1а Зег <31п О1у Не Зег Зег Тгр Ьеи А1а 15 10 <210> 14 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 14
Агд А1а Зег 01η. О1у Г1е Зег Зег Тгр Ьеи А1а
10 <210> 15 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 15
Агд Ткг Зег 61п С1у Не Бег Зег Тгр Ьеи А1а
10 <210> 16 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 16
Агд А1а Зег С1п С1у Не Зег Азп Тгр Ьеи А1а
10 <210> 17 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепэ <400> 17
А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег
5 <210> 18 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 18
А1а А1а Зег Зег Ьеи 61п Зег
5 <210> 19 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 19
А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег
5 <210> 20 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 20
А1а А1а Зег Бег Ьеи С1п Бег
5 <210> 21 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 21
61п С1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд ТЬг
5 <210 22 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 22
О1п О1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд ТЬг
5 <210> 23 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 23
С1п С1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд ТЬг
5 <210 24 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз <400> 24
С1п <31п Туг Азп Бег Туг Рго Агд ТЬг <210> 25 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 25
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа1 О1п Зег Сгу <Э1у <31у Ьеи Уа1 С1п Рго О1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег Мес Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз О1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи <31п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у О1у О1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мес
100 105 110
Азр Уа! Тгр О1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа! Зег Зег
115 120 125 <210> 26 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 26
С1п Уа1 С1п Ьеи Уа! <31п Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа! <31п Рго С1у <31у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд Зег Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз <31у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п Мес Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у 01у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеС
100 105 НО
Азр Уа! Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 27 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 27
<31и Уа1 <31п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у <31у С1у Ьеи Уа! <Э1п Рго <Э1у <31у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суе А1а А1а А1а <31у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег Мес Азп Тгр Уа1 Агд С1п А! а Рго <31у Ьуз б1у Ьеи (51и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег ьуз ТЬг Не Туг Туг А1а Аер Зег Уа1
50 55 60
Ьуз 61у Агд РЬе Ткг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Агд Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи <31п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у б1у <31п Рго ₽го Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мес
100 105 110
Авр Уа! Тгр С1у С1п (31у ТЬг ТЬг Уа! ТЬг Уа! Зег Зег
115 120 125 <210> 28 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 28 (31п Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Уа! С1п Рго С1у 15 <31у
С1и Уа! 1 С1п Ьеи Уа! 5
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суе А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Αδη А!а ьуз АЗп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1П Мес Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа! Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг <Э1у С1у βΐη Рго Рго Туг Н!з Туг Туг Туг С1у меъ
100 105 110
Азр Уа! Тгр С1у С1п (31у ТЬг ТЬг Уа! ТЬг Уа! Зег Зег
115 120 125
<210> 29
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Ното ; заргепз
<400> 29 А1а Бег Уа1 15 С1у
А1а 1 Не Агд Мер ТЬг С1п Бег Рго Зег Зег Ьеи Бег
5 10
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег <з1п С1у Не Бег Бег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг <51п О1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Бег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Зег Ьеи С1п Бег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег <31у
50 55 60
Зег (31у Зег С1у ТЪг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЫ 11е Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе Уа1 ТЬг Туг Туг Суз О1п <31п Туг Азп Бег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЫ Ьуз Уа1 О1и Не ьуз
100 105 <210> 30 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 30 С1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Зег А1а Бег Уа1 С1у
<31и 1 Не Уа1 Ьеи ТЫ 5
10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Бег <31п <31у 11е Бег Бег тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 01п С1п ьуз Рго (31и Ьуз А1а Рго Ьуз Бег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Бег ьеи б1п Бег <31у Уа1 Рго Рго Агд РЬе Бег <31у
50 55 60
Бег 01у Бег 01у ТЫ Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЪг Не Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
61и Азр РЬе А1а ТЫ Туг Туг Суз 61п О1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд
90 95
ТЬг Рке С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 <210> 31 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<40( )> 31
Уа1 Не Тгр Уа1 ТЬг С1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 <31у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЫ Не ТЫ Суз Агд ТЬг Бег С1п 61у 11е Бег Бег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а тгр Туг С1п <31п Ьуз Рго <31и Ьуз А1а Рго (31и Ьеи Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Бег Бег Ьеи С1п Бег О1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Бег С1у
50 55 60
Бег С1у Бег <31у тЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи Θ1Π Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 <210> 32 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 32
С1и 1 11е Уа1 Ьеи ТЫ С1п Зег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Зег Уа1 15 <31у
5 10
Азр Агд Уа1 ТЫ Не тЬг Суз Агд А1а Зег <31п С1у Не Зег Азп Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Бег С1у Бег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЫ Не Зег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п <31п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЫ РЬе С1у С1п С1у ткг Ьуз Уа1 01и Не Ьуз
100 105
<210> <211> <212> <213> 33 375 ДНК Ното заргепз
<220> <221> <222> КДП (1}..(375)
<400> 33
сад дед сад сед дед сад есе ддд дда ддс сед деа сад ссе ддд ддд 48
<31п Уа1 <31п Ьеи Уа1 С1п Зег С1у С1у С1у Ьеи Уа1 (31п Рго С1у О1у
1 5 10 15
Ссс сед ада сес есс еде дса дсс дсе дда еес асе еес адС аде еас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
аде аСд аас Сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад ддд сСд дад едд дсе 144
Зег МеС Азп Тгр Уа1 Агд <31п А1а Рго <31у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
сса Сас аСС аде адС ада адС ада асе аСа Сас сас дса дас ссе дед 192
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
- 56 018836
аад ддс Ьуз С1у 65 еда РЬе асе аСс Ссс ада дас ааС дсс аад аас Сса сСд Сас 240
Агд РЬе ТЬг Не Зег 70 Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
75 80
сЕд саа аЕд аас аде сСд ада дас дад дас асд дсС дьд СаС сас сдЕ 288
Ьеи С1п Мес Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Ча1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ада даС Сас ддС ддс саа ссс ссС Сас Сас Сас Сас Сас ддс аСд 336
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у МеС
100 105 НО
дас дЕс Сдд ддс саа ддд асе асд дсс асе дСс Ссс сса 375
Азр Ча1 Тгр (31у С1п С1у ТЬг ТЬг Ча1 ТЬг Ча! Зег Зег
115 120 125
<210> 34
<211> 375
<212> ДНК
<213> Ното заргепз
<220>
<221> КДП
<222> (1).. . (375)
<400> 34
сад С1п 1 дед сад сед дед Ьеи Ча1 5 сад <31п СсС ддд дда ддс ССд дСа сад ссе ддд ддд 48
Ча1 С1п Зег С1у С1у С1у Ьеи 10 Ча1 С1п Рго <31у С1у 15
Ссс сед ада сСс Ссс сдс дса дсс дсс дда ЕЕс асе есс аде аде ЕаЕ 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
аде аСд аас Сдд дСс сдс сад дсС сса ддд аад ддд сСд дад Сдд дСС 144
Зег Мес Азп Тгр Ча1 Агд <31п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи (31и Тгр Ча!
35 40 45
Сса сас асе аде адС ада аде ада аде аСа Сас Сас дса дас ЕсЕ дСд 192
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд Зег Не Туг Туг А1а Азр Зег Ча1
50 55 60
аад ддс еда есс асе аСс Ссс ада дас ааС дсс аад аас Сса сед Сас 240
Ьуз С1у Агд РЬе ТЫ Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
сСд саа асд аас аде сСд ада дас дад дас асд дсС дед СаС Сас ЕдЕ 288
Ьеи С1п Мес Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Ча1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ада дас Сас ддс ддс саа ссс ссС Сас Сас Сас еас Сас ддь асд 336
А1а Агд Азр Туг С1у 31у <31п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг <31у МеС
100 105 110
дас дСс едд ддс саа ддд асе асд дСс асе дСс Ссс Сса 375
Азр Ча! Тгр С1у С1п (31у ТЬг ТЫ Ча! ТЬг Ча! Зег Зег
115 120 125
<210> 35 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> КДП <222> (1)..(375) <400> 35
дад дСд сад сСд дСд 61и Ча! <31п Ьеи Ча! сад СсС ддд дда ддс ССд дса сад ссС ддд ддд С!у Ьеи Ча! <31п Рго С1у <31у 48
С1п Зег <31у С1у
1 5 10 15
Ссс сСд ада сСс есс еде дса дсс дсс дда СЕс асе есс аде аде сас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А! а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
аде асд аас сдд дес сдс сад дсс сса ддд аад ддд сед дад едд дес 144
Зег Мес Азп Тгр ча1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Ча1
35 40 45
Сса Сас аСС адС аде сдс ад с ааа асе аса Сас Сас дса дас есс дед 192
5ег Туг Не Зег Зег Агд Зег Ьуз ТЬг Не Туг Туг А1а Азр Зег Ча!
50 55 60
аад ддс Ьуз С1у 65 еда Ссс асе аЕс Ссс ада дас ааС дсс адд аас Сса сЕд Сас Зег Ьеи Туг 80 240
Агд РЬе ТЫ Не Зег 70 Агд Азр Азп А1а Агд 75 Азп
сед саа асд аас аде сед ада дас дад дас асд дсс дед Рас. Рас сдс 288
Ьеи С1п мее Азп Зег Ьеи Агд Азр О1и Азр ТЬг А1а ча1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ада дас Сас дде ддс саа ссс ссе сас рас Сас Сас Рас ддс аЕд 336
А1а Агд Азр Туг О1у <31у (31п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг <31у МеС
100 105 110
дас дсс едд ддс саа ддд асе асд дсс асе дСс ССС Сса 375
Азр Ча! Тгр С1у С!п С1у ТЬг ТЬг Ча! ТЬг Ча! Зег Зег
115 120 125
<210> 36 <211> 375 <212> ДНК <213> Ното зархепв <220 <221> КДП <222> (1)..(375) <400 36
дад дрд сад сРд дрд С1и Ча! С1п Ьеи Ча! сад СсЕ ддд дда ддс РСд дРа сад ссР ддд ддд 48
С1п Зег С1у С1у С1у 10 Ьеи Ча1 С1п Рго С1у 15 С1у
1 5
РСС сРд ада СЕС Рсс еде дса дсс дсс дда ссс асе ссс ад С аде Рас 96
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А! а А!а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
аде аЕд аас Сдд дЕс сдс сад дсС сса ддд аад ддд сСд дад Сдд дсс 144
Зег Мер Азп Тгр Ча! Агд С1п А1а Рго <3!у ьуз С1у Ьеи О!и Тгр Ча!
35 40 45
Еса Сас асе адС адр ада адЕ ада асе аса Рас Рас дса дас Ссе дед 192
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд ТЫ Не Туг Туг А! а Азр Зег ча!
50 55 60
аад ддс Ьуз С1у 65 еда ссс асе асе Ссс ада дас аас дсс аад аас Сса сСд Зег Ьеи еае Туг 80 240
Агд РЬе ТЬг Не Зег 70 Агд Азр Азп А1а Ьуз 75 Азп
сСд саа асд аас аде сед ада дас дад дас асд дсе дед Сае сас СдС 288
Ьеи <Э1п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
дед ада дае Сас ддс ддс саа ссс ссС еае сас еас Сас сас ддс аСд 336
А1а Агд Азр Туг С1у <31у С1п Рго Рго Туг ΗΪ5 Туг Туг Туг С1у МеС
100 105 110
дас дес Сдд ддс саа ддд асе асд дсс асе дсс Ссс Сса 375
Азр Уа1 Тгр С1у (31п (31у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125
<210> 37 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> КДП <222> (1)· · (321) <400> 37 дсс аСс едд аСд асе А1а Не Агд МеС ТЬг
5 дас ада дес асе аес Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ееа дсс едд еае сад Ьеи А1а Тгр Туг С1п
Сае дсе дса есс аде туг А1а А1а Зег Зег аде дда есс ддд аса Зег С1у Зег <31у ТЬг даа дас ССС дса асе С1и Азр РЬе Уа1 ТЬг асд ССс ддс саа ддд ТЬг РЬе О1у С1п
100 сад есе сса Ссс еса сСд СсС <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег 10 асе еде едд дед аде сад ддс ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п О1у 25 сад ааа сса дад ааа дсс ссе 61п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго 40 сед саа аде ддд дес сса сса ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег 55 60 дас есс асе ссс асе асе аде Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег 70 75
Сае Сас сдс саа сад сас аае Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп 90 асе аад дед даа асе ааа
ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
105 дса есе дса дда 48
А1а Зег Уа1 С1у асе аде аде Сдд 96
11е Зег Зег Тгр аад Ссс сед аСс 144
Ьуз Зег Ьеи 11е адд есс аде ддс 192 Агд РЬе Зег (31у аде сСд сад ссе 240
Зег Ьеи С1п Рго аде Сас ссе сдд 288
Зег Туг Рго Агд
321 <210> 38 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> КДП <222> (1)..(321) <400> 38
даа аее <31и Не 1 дед сес асе сад есе сса есс Сса сСд есе дса Ссе дса дда 48
Уа1 ьеи ТЬг 5 С1п Зег Рго Зег Зег 10 Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у 15
дас ада дСс асе аСс асе еде сдд дед адС сад ддС аСС аде аде едд 96
Азр Агд Уа1 ТЬг 11е ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п <31у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
ССа дсс едд сас сад сад ааа сса дад ааа дсс ссе аад Ссс сСд асе 144
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
сас дсС дса есс аде сед саа аде ддд дсс сса сса адд еес аде ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у νβΐ Рго Рго Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
аде дда ссе ддд аса дас еес асе сес асе асе аде аде сСд сад ссС 240
Зег С1у Зег (31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи <31п Рго
65 70 75 80
даа дае есе дса асе еае Сас сдс саа сад сас аае аде Сас ссе сдд 288
<31и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд еес ддс саа ддд асе аад дед даа аре ааа 321
ТЬг РЬе С1у (31п С1у ТЬг Ьуз νβί <31и 11е Ьуз
100 105 <210> 39 <211> 321 <212> ДНК <213> Ното заргепз <220>
<221> КДП
<222> (1)..(321)
<400> 39
дес аСс едд дед асе сад СсС сса есс сса ерд СсС дса СсС дСа дда 48
Уа1 Не Тгр Уа1 ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас ада дсс асе асе асе Сде. сдд асд адС сад ддс аес аде аде едд 96
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд ТЬг Зег О1п О1у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
сса дсс едд Сае сад сад ааа сса дад ааа дсс ссе дад сес сед аес 144
Ьеи А1а Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго О1и Ьуз А1а Рго С1и Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
еаС дсе дса есс аде сед саа ад С ддд дес сса Сса адд еес аде ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи <31п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
адС дда есе ддд аса да С еес асе ССС асе аСс аде аде сед сад ссе 240
Зег С1у Зег О1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи б>1п РГО
65 70 75 80
даа дас сес дса асе СаС Рас Сдс саа сад еае аае аде Сас ссе сдд 288
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд есс ддс саа ддд асе аад дед даа аСс ааа 321
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и 11е Ьуз
100 105 <210> 40 <211> 321 <212> ДНК
<213> Ното заргепз
<220> <221> КДП <222> (1)..< !321)
<400> 40 даа аее дед сес асе сад СсС сса Ссс Сса сед СсС дса ссе деа ддд 48
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг <31п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
дас ада дсс асе асе асе еде едд дед аде сад ддс аСС аде аас едд 96
Азр Агд \7а1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п <31у Не Зег Азп Тгр
20 25 30
СС.а дсс Сдд Сае сад сад ааа сса дад ааа дсс ссе аад Ссс сед аСс 144
Ьеи А1а Тгр Туг (31п (31η Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
еас дсс дса ссс аде ССд саа аде ддд дсс сса Сса адд есс аде ддс 192
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег <31у
50 55 60
аде дда ссс ддд аса дас есс асе сбс асе аСс аде аде сед сад ссе 240
Зег (31у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п РГО
65 70 75 80
даа дае еее дед асе еае Сас Ьдс саа сад еае аае аде еас ссе едд 288
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
асд есс ддс саа ддд асе аад дед даа аес ааа 321
ТЬг РЬе С1у С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз
100 105
<210> 41 <211> 125 <212> БЕЛОК
<213> Ното : заргепз
<400> 41 С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 61и Зег (31у 61у 61у Ьеи Уа1 О1п Рго 61у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а <31у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег Мее Азп Тгр \7а1 Агд С1п А1а Рго <31у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг 11е Зег Зег Агд Зег Агд ТЬг Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мее Азп Зег Ьеи Агд Азр <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг <31у <31у <31п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг <51у Мес
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 12 0 125
<21С |> 42
<211 > 12 ;5
<212 :> БЕЛОК
<213 > Ното зархепз
<40С |> 42
<31и Уа1 (31п Ьеи Уа1 С1и Зег С1у <31у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго <31у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег МеС Азп Тгр νβΐ Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Агд Зег Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у О1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг С1у Мее
100 105 110
Азр νβΐ Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 43 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 43
С1и Уа1 С1п ьеи νβΐ С1и Зег <31у С1у С1у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у <31у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег Мес Азп Тгр νβΐ Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз <31у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Зег Агд Зег Ьуз ТЬг Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Агд Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи О1п МеС Азп Зег Ьеи Агд Азр С1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Туг Туг Туг Туг <31у МеС
100 105 110
Азр Уа1 Тгр (31у О1п С-1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120 125 <210> 44 <211> 125 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз <400> 44
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 <31п 5ег СЯу СЯу С1у 10 Ьеи Уа1 С1п Рго <31у 15 С1у
1 5
5ег Ьеи Агд Ьеи Бег Суз А1а А1а А1а С1у РЬе ТЬг РЬе Бег Бег Туг
20 25 30
Бег Мек Азп Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго О1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Бег Туг Не Бег Бег Агд Бег Агд ТЬг 11е Туг Туг А1а Азр Бег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Бег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Бег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи 61п Мек Азп Бег Ьеи Агд Азр <31и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Агд Азр Туг С1у С1у С1п Рго Рго Туг Н18 Туг Туг Туг С1у Мек
100 105 110
Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Бег Бег
115 120 125 <210> 45 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400 |> 45
Азр Не С1п Мек ТЬг <Яп Зег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Бег С1п <31у Не Бег Бег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг αΐη С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Бег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Бег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Бег <31у Бег <31у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Бег Бег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе Уа1 ТЬг Туг Туг Суз С1п С1п Туг Азп Бег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у (31п СЯу ТЬг Ьуз Уа1 <31и Не Ьуз
100 105
<21С )> 46
<213 .> 107
<21; !> БЕЛОК
<212 !> Ното ; зар!епз
<40С )> 46
Азр Не С1п Мек ТЬг О1п Бег Рго Бег Бег Ьеи Бег А1а Бег Уа1 С1у
10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1П С1у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Тук С1п С1п Ьуз Рго С1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег О1у Уа1 Рго Рго Агд РЬе Зег О1у
50 55 60
Зег СЯу Бег СЯу ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
01и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п (31 п Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у □1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 <210> 47 <211> 107 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 47 Зег Рх'о Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Зег Уа1 С1у Тгр
Азр Не 1 Азр Агд СЯп Мек ТЬг С1п
Уа1 ТЬг 20 5 Не ТЬг С1у Не Зег 50 15 Зег
Суз Агд ТЬг 5ег 25 С1п
Ьеи А1а Тгр Туг <31п С1п Ьуз Рго <31и Ьуз А1а его <31и Ьеи Ьеи 11е
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег (31у νβΐ Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ьеи СЯп Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п σΐη Туг Азп Бег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе СЯу СЯп СЯу ТЬг Ьуз Уа1 С1и 11е Ьуз
100 105 <210? 48 <211> 107 <212? БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 48
Азр 11е С1п Мек ТЬг О1п Зег Рго Зег Зег Ьеи Зег А1а Зег Уа1 С1у
1 5 10 15
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег С1п С1у 11е Зег Азп Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг 31п С1п Ьуз Рго σΐυ Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи 01п Зег <Э1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи О1п Рго
65 70 75 80
С1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз <31п Οίη Туг Азп Зег Туг Рго Агд
85 90 95
ТЬг РЬе С1у βΐη (31у ТЬг Ьуэ Уа1 С1и Не Ьуз
100 105 <210> 49 <211> 98 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепз
<400> 49
С1и Уа1 С1п Ьеи Уа1 (31и Зег <31у С1у С1у Ьеи Уа1 61п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61у РЬе ТЫ РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
Зег меь Азп. Тгр Уа1 Агд αΐη А1а Рго С1у ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег Туг Не Зег Зег Зег Зег Зег ТЫ Не Туг Туг А1а Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг Не Зег Агд Азр Азп А1а Ьуз Азп Зег Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п Мек Азп Зег Ьеи Агд Азр б!и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг Туг Суз
90 95
А1а Агд <210> 50 <211> 95 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 50 ТЫ <31п 5 Зег Рго Зег Зег Ьеи 10 Зег А1а Зег Уа1 15 С1у
Азр 11е 1 С1п Мес
Азр Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а Зег <31п (31у Не Зег Зег Тгр
20 25 30
Ьеи А1а Тгр Туг (51п О1п Ьуз Рго О1и Ьуз А1а Рго Ьуз Зег Ьеи Не
35 40 45
Туг А1а А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег (31у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у
50 55 60
Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго
65 70 75 80
О1и Азр РЬе А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п С1п Туг Азп Зег Туг Рго
85 90 95
<210> 51 <211> 352 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 51
Мес 1 С1и С1у Не Зег 11е Туг ТЬг Зег Азр Азп Туг ТЫ С1и С1и Мес
5 10 15
61у Зег С1у Азр Туг Азр Зег Мес Ьуз С1и Рго Суз РЬе Агд С1и С1и
20 25 30
Азп А1а Азп РЬе Азп Ьуз Не РЬе Ьеи Рго ТЬг Не Туг Зег Не Не
35 40 45
РЬе Ьеи ТЬг С1у Не Уа1 С1у Азп С1у Ьеи Уа1 Не Ьеи Уа1 МеС С1у
50 55 60
Туг С1п Ьуз Ьуз Ьеи Агд Зег Мес ТЫ Азр Ьуз Туг Агд Ьеи Н1з Ьеи
65 70 75 80
Зег Уа1 А1а Азр Ьеи Ьеи РЬе νβΐ Не ТЬг Ьеи Рго РЬе Тгр А1а Уа1
85 90 95
Азр А1а νβΐ А1а Азп тгр Туг РЬе (31у Азп РЬе Ьеи Суз ьуз А1а Уа1
100 105 но
Н1з Уа1 Не Туг ТЬг Уа1 Азп Ьеи Туг Зег Зег Уа1 Ьеи Не Ьеи А1а
115 120 125
РЬе Не Зег Ьеи Азр Агд Туг Ьеи А1а Не Уа1 ΗΪ3 А1а ТЬг Азп Зег
130 135 140
С1п Агд Рго Агд Ьуз Ьеи Ьеи А1а С1и Ьуз Уа1 Уа1 Туг Уа1 С1у Уа1
145 150 155 160
Тгр Не Рго А1а Ьеи Ьеи Ьеи ТЬг Не Рго Азр РЬе Не РЬе А1а Азп
165 170 175
Уа1 Зег (31и А1а Азр Азр Агд Туг Не Суз Азр Агд РЬе Туг Рго АЗП
180 185 190
Азр Ьеи Тгр νβΐ Уа1 ν*1 РЬе С1п РЬе <31п ΗΪ3 Не МеС Уа1 <31у Ьеи
195 200 205
11е Ьеи Рго С1у Не ’/а! Не Ьеи Зег Суз Туг Суз Не Не Не Зег
210 215 220
Ьуз Ьеи Зег ΗΪ3 Зег Ьуз С1у Н18 С1п Ьуз Агд Ьуз А1а Ьеи Ьуз ТЬг
225 230 235 240
ТЬг Уа1 Не Ьеи Не Ьеи А1а РЬе РЬе А1а Суз Тгр Ьеи Рго Туг Туг
245 250 255
11е О1у Не Зег Не Азр Зег РЬе 11е Ьеи Ьеи С1и Не Не Ьуз С1п
260 265 270
С1у Суз С1и РЬе С1и Азп ТЬг 57а1 Н15 Ьуз Тгр Не Зег 11е ТЬг С1и
275 280 285
А1а Ьеи А1а РЬе РЬе Н13 Суз Суз Ьеи Азп Рго Не Ьеи Туг А1а РЬе
290 295 300
Ьеи С1у А1а Ьуз РЬе Ьуз ТЬг Зег А1а С1п Ηίδ А1а Ьеи ТЬг Зег Уа1
305 310 315 320
Зег Агд С1у Зег Зег Ьеи Ьуз 11е Ьеи Зег Ьуз С1у Ьуз Агд С1у С1у
325 330 335
Ηίδ Зег Зег Уа1 Зег ТЬг С1и Зег С1и Зег Зег Зег РНе Н1з Зег Зег
340 345 350 <210> 52 <211> 20 <212> БЕЛОК <213> Ното еар1епе <400> 52
Туг Туг Туг Туг Туг С1у Меб Азр Уа1 Тгр С1у С1п С1у ТНг ТНг УаХ
10 15
ТНг Уа1 Зег Зег <210> 53 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Ното зархепе <400> 53 ТЬг РЬе О1у (31п (Э1у тЬг Ьуз Уа1 б1и Не ьуз

Claims (56)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Моноклональное антитело или его часть, которые связываются с СХСК4 человека и включают:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8ЕО ΙΌ N0: 1, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8ЕО ΙΌ N0: 5, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8ЕО ΙΌ N0: 9; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 13, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0:
    17, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 21, или ее консервативную модификацию;
    (b) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 2, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 6, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 10; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 14, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0:
    18, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 22, или ее консервативную модификацию;
    (c) вариабельный участок тяжелой цепи СЭК.1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 3, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 7, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 11; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 15, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0:
    19, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 23, или ее консервативную модификацию;
    (й) вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 4, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 8, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок тяжелой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 12; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ1, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 16, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ2, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0:
    20, или ее консервативную модификацию; вариабельный участок легкой цепи ί.ΌΚ3, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 24, или ее консервативную модификацию.
  2. 2. Моноклональное антитело или его часть по п.1, которые включают:
    (a) СОК! вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 1;
    (b) СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 5;
    (c) ί.ΌΚ3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 9;
    - 62 018836 (ά) СЭК1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 13;
    (е) ί.ΌΕ2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 17;
    (Г) СЭК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 21.
  3. 3. Моноклональное антитело или его часть по п.1, которые включают:
    (a) ί.ΌΕ1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 2;
    (b) СЭК2 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: б;
    (c) ί.ΌΕ3 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 10;
    (ά) ί.ΌΕ1 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 14;
    (е) ί.ΌΕ2 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 18;
    (Г) СЭК3 вариабельного участка легкой цепи, содержащего последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 22.
  4. 4. Моноклональное антитело или его часть, которые связываются с СХСК4 человека и включают:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 25-28 и 41-44, и их консервативных модификаций; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ΙΌ N0: 29-32 и 45-48, и их консервативных модификаций.
  5. 5. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 25 или 41, и их консервативных модификаций; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 29 или 45, и их консервативных модификаций.
  6. 6. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 2б или 42, и их консервативных модификаций; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 30 или 4б, и их консервативных модификаций.
  7. 7. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 27 или 43, и их консервативных модификаций; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 31 или 47, и их консервативных модификаций.
  8. 8. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 28 или 44, и их консервативных модификаций; и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 32 или 48, и их консервативных модификаций.
  9. 9. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    25, и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    29.
  10. 10. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    26, и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    30.
  11. 11. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    27, и (b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    31.
  12. 12. Моноклональное антитело или его часть по п.4, включающие:
    (а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8Е0 ΙΌ N0:
    28, и
    - б3 018836 (Ь) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот 8ЕЦ ΙΌ N0: 32.
  13. 13. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с СХСК4 человека и включают:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой иммуноглобулиновым геном зародышевой линии человека Ун 3-48, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 49; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, кодируемой иммуноглобулиновым геном зародышевой линии человека УК Ь15, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 50.
  14. 14. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с СХСК4 человека и включают:
    (a) вариабельный участок тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая проявляет отличие не более чем по 10 аминокислотам от аминокислотной последовательности, кодируемой иммуноглобулиновым геном зародышевой линии человека Ун 3-48, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 49; и (b) вариабельный участок легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность, которая проявляет отличие не более чем по 10 аминокислотам от аминокислотной последовательности, кодируемой иммуноглобулиновым геном зародышевой линии человека УК Ь15, указанной в 8ЕЦ ΙΌ N0: 50.
  15. 15. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, связывающиеся с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки.
  16. 16. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие связывание 8ΌΕ1 с человеческим СХСК4.
  17. 17. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, не ингибирующие связывание 8ΌΕ-1 с человеческим СХСК4.
  18. 18. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4.
  19. 19. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4.
  20. 20. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека.
  21. 21. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, индуцирующие апоптоз в клетках, экспрессирующих человеческий СХСК4.
  22. 22. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие рост или индуцирующие апоптоз СХСК4+ опухолевых клеток ш νί\Ό.
  23. 23. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, ингибирующие метастазирование СХСК4+ опухолевых клеток.
  24. 24. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, увеличивающие время выживания субъекта, несущего СХСК4+ опухоль.
  25. 25. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, которое относится к изотипу ЦС1 или ЦС4 или является их антигенсвязывающей частью.
  26. 26. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, которое относится к изотипу ЦС4 или является его антигенсвязывающей частью.
  27. 27. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, связывающиеся с человеческим СХСК4 с Кс 1х 10-7 М или меньше.
  28. 28. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, связывающиеся с человеческим СХСК4 с Кс 5х 10-8 М или меньше.
  29. 29. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-16 и 18-28, которое ингибирует связывание 8ΌΕ-1 с человеческим СХСК4 с ЕС50, равным 50 нМ или меньше.
  30. 30. Моноклональное антитело или его часть по п.29, которое ингибирует индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4, с ЕС50, равным 3 нМ или меньше.
  31. 31. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-16 и 18-28, которое ингибирует индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4, с ЕС50, равным 50 нМ или меньше.
  32. 32. Моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-14, которые:
    a) связываются с природным человеческим СХСК4, экспрессирующимся на поверхности клетки;
    b) ингибируют связывание 8ΌΕ-1 с человеческим СХСК4;
    c) ингибируют индуцированный 8ΌΕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4;
    ά) ингибируют индуцированную 8ΌΕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4; и
    - 64 018836
    е) ингибируют образование капиллярных трубочек эндотелиальными клетками пупочной вены человека.
  33. 33. Моноклональное антитело или его часть по п.32, индуцирующие апоптоз в клетках, экспрессирующих человеческий СХСК4.
  34. 34. Моноклональное антитело или его часть по п.32, ингибирующие рост или индуцирующие апоптоз СХСК4+ опухолевых клеток ίη νίνο.
  35. 35. Моноклональное антитело или его часть по п.32, ингибирующие связывание 5>ЭЕ-1 с человеческим СХСК4 с ЕС50 50 нМ или меньше.
  36. 36. Моноклональное антитело или его часть по п.32, ингибирующие индуцированный &ОЕ-1 приток кальция в клетки, экспрессирующие человеческий СХСК4, с ЕС50 3 нМ или меньше.
  37. 37. Моноклональное антитело или его часть по п.32, ингибирующие индуцированную 8ЭЕ-1 миграцию клеток, экспрессирующих человеческий СХСК4, с ЕС50 50 нМ или меньше.
  38. 38. Часть антитела по любому из пп.1-37, выбранная из ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Еб, Еν и фрагмента доменного антитела (бАЬ), нанотела, унитела и одноцепочечного Еν (ксЕν).
  39. 39. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по любому из предшествующих пунктов, которые представляют собой человеческое антитело или его часть.
  40. 40. Композиция, содержащая моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-39 и фармацевтически приемлемый носитель.
  41. 41. Иммуноконъюгат, содержащий моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-39, присоединенные к терапевтическому агенту.
  42. 42. Иммуноконъюгат по п.41, в котором терапевтический агент представляет собой цитотоксин или радиоактивный изотоп.
  43. 43. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п.41 или 42 и фармацевтически приемлемый носитель.
  44. 44. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело или его часть по любому из пп.1-39.
  45. 45. Вектор экспрессии, включающий нуклеиновую кислоту по п.44.
  46. 46. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п.45.
  47. 47. Способ получения анти-СХСК4 антитела или его части по любому из пп.1-39, включающий обеспечение экспрессии нуклеиновой кислоты по п.44 в клетке-хозяине по п.46 и выделение антитела или его части из клетки-хозяина.
  48. 48. Способ модулирования активности СХСК4 в клетке, включающий обеспечение контакта клетки с моноклональным антителом или его частью по любому из пп.1-39, таким образом, что модулируется активность СХСК4 в клетке.
  49. 49. Способ по п.48, в котором активность СХСК4 модулируют ίη νίΐτο путем культивирования клетки с моноклональным антителом или его частью.
  50. 50. Способ по п.48, в котором активность СХСК4 модулируют у субъекта ίη νίνο путем введения субъекту моноклонального антитела или его части.
  51. 51. Способ по п.48, в котором клетка представляет собой опухолевую клетку, которая экспрессирует СХСК4, и способ приводит к ингибированию роста опухолевой клетки или ингибированию метастаза опухолевой клетки.
  52. 52. Способ по п.48, в котором клетка представляет собой Т-клетку, которая экспрессирует СХСК4, и способ приводит к ингибированию проникновения ВИЧ в клетку.
  53. 53. Способ по п.48, в котором клетка представляет собой лимфоцит при воспалительном расстройстве, и способ приводит к ингибированию воспаления.
  54. 54. Способ по п.48, в котором клетка принимает участие в васкуляризации, и способ приводит к модуляции ангиогенеза.
  55. 55. Способ стимулирования мобилизации стволовых клеток СЭ34+ из костного мозга в периферическую кровь субъекта, включающий введение субъекту моноклонального антитела или его части по любому из пп.1-39 таким образом, что стимулируется мобилизация стволовых клеток СЭ34+ из костного мозга в периферическую кровь.
  56. 56. Способ по п.55, дополнительно включающий сбор стволовых клеток СЭ34+ из периферической крови.
EA200900424A 2006-10-02 2007-10-01 Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение EA018836B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US82785106P 2006-10-02 2006-10-02
PCT/US2007/021152 WO2008060367A2 (en) 2006-10-02 2007-10-01 Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900424A1 EA200900424A1 (ru) 2009-08-28
EA018836B1 true EA018836B1 (ru) 2013-11-29

Family

ID=39402166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900424A EA018836B1 (ru) 2006-10-02 2007-10-01 Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение

Country Status (30)

Country Link
US (3) US8450464B2 (ru)
EP (2) EP2486941B1 (ru)
JP (4) JP5417175B2 (ru)
KR (3) KR101722261B1 (ru)
CN (2) CN101528259B (ru)
AR (2) AR063086A1 (ru)
AU (1) AU2007320024B2 (ru)
BR (1) BRPI0718197A2 (ru)
CA (1) CA2665239A1 (ru)
CL (1) CL2007002835A1 (ru)
CY (2) CY1117036T1 (ru)
DK (2) DK2486941T3 (ru)
EA (1) EA018836B1 (ru)
ES (2) ES2625798T3 (ru)
HK (1) HK1131904A1 (ru)
HU (2) HUE033630T2 (ru)
IL (1) IL197831A (ru)
LT (1) LT2486941T (ru)
ME (1) ME02269B (ru)
MX (1) MX2009003306A (ru)
NO (1) NO345287B1 (ru)
NZ (1) NZ575924A (ru)
PL (2) PL2486941T3 (ru)
PT (2) PT2486941T (ru)
RS (2) RS55740B1 (ru)
SG (2) SG178712A1 (ru)
SI (2) SI2486941T1 (ru)
TW (2) TWI522366B (ru)
WO (1) WO2008060367A2 (ru)
ZA (1) ZA200902256B (ru)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101561652B1 (ko) 2006-07-18 2015-10-20 녹손 파르마 아게 Sdf-1 결합형 c형 핵산분자
SI2486941T1 (sl) * 2006-10-02 2017-08-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo CXCR4 in njihova uporaba
FR2915102B1 (fr) * 2007-04-23 2014-05-16 Pf Medicament Utilisation d'un anticorps anti-cxcr4 pour le traitement du cancer
CA2695061C (en) 2007-08-06 2021-10-19 Noxxon Pharma Ag Sdf-1 binding nucleic acids and the use thereof
EA201071300A1 (ru) * 2008-05-14 2011-06-30 Эли Лилли Энд Компани Антитела к cxcr4
US7892546B2 (en) 2008-05-14 2011-02-22 Eli Lilly And Company Anti-CXCR4 antibodies
WO2010141801A2 (en) 2009-06-05 2010-12-09 Cellular Dynamics International, Inc. Reprogramming t cells and hematophietic cells
EP2486056A1 (en) * 2009-10-09 2012-08-15 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4 and other cell associated proteins and methods to generate them
NO2499161T3 (ru) * 2009-11-11 2018-02-03
WO2011083140A1 (en) * 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domain directed against human cxcr4
GB201002238D0 (en) * 2010-02-10 2010-03-31 Affitech As Antibodies
EP2371863A1 (en) * 2010-03-30 2011-10-05 Pierre Fabre Médicament Humanized anti CXCR4 antibodies for the treatment of cancer
WO2011161266A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Improved immunoglobulin single variable domains and constructs thereof directed against cxcr4
US20140120555A1 (en) * 2011-06-20 2014-05-01 Pierre Fabre Medicament Anti-cxcr4 antibody with effector functions and its use for the treatment of cancer
WO2012178137A1 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Gillies Stephen D Light chain immunoglobulin fusion proteins and methods of use thereof
CA2840687C (en) 2011-07-01 2020-04-28 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Discovery of a somatic mutation in myd88 gene in lymphoplasmacytic lymphoma
JP2014523745A (ja) * 2011-07-20 2014-09-18 メディミューン リミテッド 抗ｃｘｃｒ４抗体及び使用方法
AR087364A1 (es) * 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Anticuerpo anti-cxcr4 y su uso para la deteccion y dianostico de canceres
AR087363A1 (es) * 2011-07-29 2014-03-19 Pf Medicament Uso del anticuerpo i-3859 para la deteccion y diagnostico de los canceres
CA2855155A1 (en) 2011-11-09 2013-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of hematologic malignancies with an anti-cxcr4 antibody
EA031214B1 (ru) * 2013-02-26 2018-12-28 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
US10370651B2 (en) 2013-06-28 2019-08-06 X-Body, Inc. Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes
SG11201600171SA (en) * 2013-08-02 2016-02-26 Pfizer Anti-cxcr4 antibodies and antibody-drug conjugates
CA2920377A1 (en) * 2013-08-05 2015-02-12 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
CA2922398C (en) * 2013-09-12 2023-08-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for evaluating and treating waldenstrom's macroglobulinemia
CA2924879C (en) * 2013-09-23 2023-01-10 X-Body, Inc. Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens
WO2015069874A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of c1013g/cxcr4-associated waldenström's macroglobulinemia with an anti-cxcr4 antibody
AU2014360426B2 (en) 2013-12-06 2020-05-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to distinguish Waldenstrom's Macroglobulinemia from IgM monoclonal gammopathy of undetermined significance
EP3079683A4 (en) 2013-12-13 2017-12-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods to treat lymphoplasmacytic lymphoma
ES2795727T3 (es) 2014-01-15 2020-11-24 Medimmune Llc Anticuerpos específicos del vrs y partes funcionales de los mismos
JP2017527615A (ja) * 2014-09-02 2017-09-21 シーダーズ−サイナイ メディカル センター 線維化疾患及び癌を治療するための組成物及び方法
US9982057B2 (en) 2014-11-17 2018-05-29 Pelican Therapeutics, Inc. Human TNFRSF25 antibody
EP3242685B1 (en) * 2015-01-09 2022-05-04 AdAlta Limited Cxcr4 binding molecules
US9526801B2 (en) 2015-01-14 2016-12-27 Bristol-Myers Squibb Company Heteroarylene-bridged benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
CA2988388C (en) 2015-04-23 2022-11-22 Nantomics, Llc Cancer neoepitopes
JP2018516969A (ja) * 2015-06-12 2018-06-28 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｐｄ−１およびｃｘｃｒ４シグナル伝達経路の組合せ遮断による癌の処置
WO2017112624A1 (en) 2015-12-21 2017-06-29 Bristol-Myers Squibb Company Variant antibodies for site-specific conjugation
US10525060B2 (en) 2016-04-29 2020-01-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. HCK as a therapeutic target in MYD88 mutated diseases
JP2019518013A (ja) 2016-05-10 2019-06-27 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 安定性が向上したツブリシン類似体の抗体薬物結合体
RU2746314C2 (ru) 2016-06-09 2021-04-12 Пеликан Терапьютикс, Инк. Антитела анти-tnfrsf25
BR112018076281A2 (pt) 2016-06-20 2019-03-26 Kymab Limited imunocitocina, uso de uma imunocitocina, método, composição farmacêutica, método para tratar uma doença proliferativa em um animal, ácido nucleico, vetor, hospedeiro e anticorpo ou fragmento do mesmo
WO2018035391A1 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Bristol-Myers Squibb Company Seco-cyclopropapyrroloindole compounds, antibody-drug conjugates thereof, and methods of making and use
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
CA3052070A1 (en) * 2017-01-31 2018-08-09 Msm Protein Technologies Inc. Anti-cxcr4 antibodies
US10487084B2 (en) 2017-08-16 2019-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a heterobiaryl moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10472361B2 (en) 2017-08-16 2019-11-12 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a benzotriazole moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10494370B2 (en) 2017-08-16 2019-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a pyridine or pyrazine moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10508115B2 (en) 2017-08-16 2019-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having heteroatom-linked aromatic moieties, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US10457681B2 (en) 2017-08-16 2019-10-29 Bristol_Myers Squibb Company Toll-like receptor 7 (TLR7) agonists having a tricyclic moiety, conjugates thereof, and methods and uses therefor
US20230181635A1 (en) * 2018-03-13 2023-06-15 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario La Paz Anti-cxcr4 antibody combined with activated and expanded natural killer cells for cancer immunotherapy
WO2019209811A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic toll-like receptor 7 (tlr7) agonists
IL278938B2 (en) 2018-05-29 2024-09-01 Bristol Myers Squibb Co Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
SG11202012339WA (en) 2018-07-13 2021-01-28 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Co-receptor systems for treating infectious diseases
US11554120B2 (en) 2018-08-03 2023-01-17 Bristol-Myers Squibb Company 1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidine compounds as toll-like receptor 7 (TLR7) agonists and methods and uses therefor
SMT202300159T1 (it) 2018-11-30 2023-07-20 Bristol Myers Squibb Co Anticorpo comprendente un’estensione carbossiterminale della catena leggera contenente glutammina, suoi coniugati e metodi ed usi
US20220031860A1 (en) 2018-12-12 2022-02-03 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
AU2020279974B2 (en) 2019-05-21 2024-12-19 Novartis Ag CD19 binding molecules and uses thereof
WO2021055306A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Bristol-Myers Squibb Company Dual capture method for analysis of antibody-drug conjugates
EP4051298A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for the mobilization of hematopoietic stem and progentor cells
WO2021142086A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Synthis Therapeutics, Inc. Alk5 inhibitor conjugates and uses thereof
US20230330185A1 (en) 2020-04-27 2023-10-19 Magenta Therapeutics, Inc. Methods and compositions for transducing hematopoietic stem and progenitor cells in vivo
CN112661845B (zh) * 2020-12-25 2022-06-21 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及其应用
CN112521500B (zh) * 2020-12-25 2022-06-24 暨南大学 与cxcr4结合的亲和力成熟结合蛋白及应用
EP4308694A1 (en) 2021-03-16 2024-01-24 Magenta Therapeutics, Inc. Dosing regimens for hematopoietic stem cell mobilization for stem cell transplants in multiple myeloma patients
CN118255888A (zh) * 2023-08-31 2024-06-28 恺佧生物科技(上海)有限公司 一种Anti-CXCR4膜蛋白抗体及其制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1316801A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US20030206909A1 (en) * 2002-02-08 2003-11-06 Shaobing Hua Human monoclonal antibodies against membrane proteins
WO2004059285A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Protein Design Labs, Inc. Tumor killing/tumor regression using cxcr4 antagonists
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4954617A (en) 1986-07-07 1990-09-04 Trustees Of Dartmouth College Monoclonal antibodies to FC receptors for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1991010741A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5763566A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US5864026A (en) 1990-06-11 1999-01-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5789157A (en) 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5712375A (en) 1990-06-11 1998-01-27 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6261774B1 (en) 1990-06-11 2001-07-17 Gilead Sciences, Inc. Truncation selex method
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0814159B1 (en) 1990-08-29 2005-07-27 GenPharm International, Inc. Transgenic mice capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9021679D0 (en) * 1990-10-05 1990-11-21 Gorman Scott David Antibody preparation
GB9108652D0 (en) 1991-04-23 1991-06-12 Antisoma Ltd Immunoreactive compounds
EP2224006A1 (en) 1991-12-02 2010-09-01 MedImmune Limited Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP0640094A1 (en) 1992-04-24 1995-03-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
JP3976333B2 (ja) 1992-09-16 2007-09-19 ザ スクリップス リサーチ インスティチュート 呼吸合胞体ウイルスに対するヒト中和性モノクローナル抗体
GB9223377D0 (en) 1992-11-04 1992-12-23 Medarex Inc Humanized antibodies to fc receptors for immunoglobulin on human mononuclear phagocytes
JP3919830B2 (ja) 1992-11-28 2007-05-30 財団法人化学及血清療法研究所 抗ネコヘルペスウイルス−１組換え抗体および該抗体をコードする遺伝子断片
EP0754225A4 (en) 1993-04-26 2001-01-31 Genpharm Int HETEROLOGIC ANTIBODY-PRODUCING TRANSGENIC NON-HUMAN ANIMALS
DE69427974T2 (de) 1993-04-29 2001-12-06 Unilever N.V., Rotterdam Herstellung von antikörpern oder funktionstüchtig gemachten teilen davon, abgeleitet von schweren ketten von immunglobulinen von camelidae
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
CA2117953C (en) 1993-10-14 2001-12-11 Tasuku Honjo Human stromal derived factor 1 alpha and 1 beta and dnas encoding the same
WO1995018634A1 (en) 1994-01-04 1995-07-13 The Scripps Research Institute Human monoclonal antibodies to herpes simplex virus and methods therefor
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6013443A (en) 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
US6114120A (en) 1995-05-03 2000-09-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
US5840598A (en) 1997-08-14 1998-11-24 Micron Technology, Inc. LOC semiconductor assembled with room temperature adhesive
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP2180007B2 (en) 1998-04-20 2017-08-30 Roche Glycart AG Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
GB9814383D0 (en) 1998-07-02 1998-09-02 Cambridge Antibody Tech Improvements relating to antibodies
JP4593783B2 (ja) 1998-07-21 2010-12-08 ゲンマブ・アクティーゼルスカブ 抗ｃ型肝炎ウイルス抗体およびその使用
CN1763097B (zh) 1999-01-15 2011-04-13 杰南技术公司 具有改变的效应功能的多肽变体
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
CA2369292C (en) 1999-04-09 2010-09-21 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Method of modulating the activity of functional immune molecules
US6387620B1 (en) 1999-07-28 2002-05-14 Gilead Sciences, Inc. Transcription-free selex
CA2380813A1 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to her2/neu
CA2589418A1 (en) 1999-08-24 2001-03-01 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US7605238B2 (en) 1999-08-24 2009-10-20 Medarex, Inc. Human CTLA-4 antibodies and their uses
US6794132B2 (en) 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
CA2395882C (en) 1999-12-30 2012-07-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Proteoliposomes containing an integral membrane protein having one or more transmembrane domains
DE60140474D1 (de) 2000-09-08 2009-12-24 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
US6818216B2 (en) 2000-11-28 2004-11-16 Medimmune, Inc. Anti-RSV antibodies
PT1354034E (pt) 2000-11-30 2008-02-28 Medarex Inc Roedores transgénicos transcromossómicos para produção de anticorpos humanos
US20040001822A1 (en) 2000-12-29 2004-01-01 Avigdor Levanon Y1-isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US7476536B2 (en) 2001-05-11 2009-01-13 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Artificial human chromosome containing human antibody a light chain gene
WO2002092780A2 (en) 2001-05-17 2002-11-21 Diversa Corporation Novel antigen binding molecules for therapeutic, diagnostic, prophylactic, enzymatic, industrial, and agricultural applications, and methods for generating and screening thereof
JP4303105B2 (ja) 2001-06-28 2009-07-29 ドマンティス リミテッド 二重特異性リガンドとその利用
ES2326964T3 (es) 2001-10-25 2009-10-22 Genentech, Inc. Composiciones de glicoproteina.
US20040110226A1 (en) 2002-03-01 2004-06-10 Xencor Antibody optimization
AU2003236022A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells with modified genome
AU2003253621A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Centocor, Inc. Modified "s" antibodies
DE60305919T2 (de) 2002-06-28 2007-01-18 Domantis Limited, Cambridge Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
PT1537878E (pt) 2002-07-03 2010-11-18 Ono Pharmaceutical Co Composições de imunopotenciação
EP1558648B1 (en) 2002-10-17 2012-01-11 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd20
EP1558646A2 (en) 2002-11-08 2005-08-03 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against interferon- gamma and uses thereof
US20050013809A1 (en) 2002-12-02 2005-01-20 Owens Samuel M. Antibodies against drugs of abuse
EP1578801A2 (en) 2002-12-27 2005-09-28 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
US9259459B2 (en) 2003-01-31 2016-02-16 Celldex Therapeutics Inc. Antibody vaccine conjugates and uses therefor
AU2004239065B2 (en) 2003-05-14 2008-05-15 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
JP4999158B2 (ja) 2003-05-21 2012-08-15 メダレツクス・インコーポレーテツド 炭疽菌（ｂａｃｈｉｌｌｕｓａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
JP4751326B2 (ja) 2003-09-04 2011-08-17 メダレックス インコーポレイテッド 発現ベクター
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
US20050249723A1 (en) * 2003-12-22 2005-11-10 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
CA2587424A1 (en) 2004-11-16 2006-05-26 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
EP1836294A4 (en) * 2004-12-21 2009-06-17 Centocor Inc ANTI-IL-12 ANTIBODIES, EPITOPES, COMPOSITIONS, METHODS AND USES
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
MX2007009935A (es) 2005-02-18 2007-10-10 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales que carecen de residuos fucosilo contra antigeno membranal especifico de prostata (psma).
AR054233A1 (es) 2005-03-08 2007-06-13 Pharmacia & Upjohn Co Llc Composiciones de anticuerpos igg2
US20070212703A1 (en) 2005-09-27 2007-09-13 Stemmer Willem P Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof
KR20080090406A (ko) 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
SI2486941T1 (sl) * 2006-10-02 2017-08-31 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Humana protitelesa, ki vežejo CXCR4 in njihova uporaba
CA2855155A1 (en) * 2011-11-09 2013-05-16 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of hematologic malignancies with an anti-cxcr4 antibody
WO2015069874A1 (en) * 2013-11-06 2015-05-14 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of c1013g/cxcr4-associated waldenström's macroglobulinemia with an anti-cxcr4 antibody

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1316801A1 (en) * 2001-11-30 2003-06-04 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
US20030206909A1 (en) * 2002-02-08 2003-11-06 Shaobing Hua Human monoclonal antibodies against membrane proteins
WO2004059285A2 (en) * 2002-12-23 2004-07-15 Protein Design Labs, Inc. Tumor killing/tumor regression using cxcr4 antagonists
WO2006089141A2 (en) * 2005-02-18 2006-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Antibodies against cxcr4 and methods of use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BARIBAUD FREDERIC ET AL.: "Antigenically distinct conformations of CXCR4" JOURNAL OF VIROLOGY, THE AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 75, no. 19, 1 October 2001 (2001-10-01), pages 8957-8967, XP002234668 ISSN: 0022-538X the whole document *
ENDRES M.J. ET AL.: "CD4-INDEPENDENT INFECTION BY HIV-2 IS MEDIATED BY FUSIN/CXCR4" CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 87, 15 November 1996 (1996-11-15), pages 745-756, XP002920421 ISSN: 0092-8674 the whole document *
GHOBRIAL IRENE M. ET AL.: "The role of CXCR4 inhibitors as novel antiangiogenesis agents in cancer therapy" BLOOD, W.B. SAUNDERS COMPANY, ORLANDO, FL, vol. 104, no. 11 PARTI, 1 November 2004 (2004-11-01), pages 365A-366A, XP002458710 ISSN: 0006-4971 the whole document *
GULENG BAYASI ET AL.: "Blockade of the stromal cell-derived factor-l/CXCR4 axis attenuates in vivo tumor growth by inhibiting angiogenesis in a vascular endothelial growth factor-independent manner" CANCER RESEARCH, vol. 65, no. 13, July 2005 (2005-07), pages 5864-5871, XP002491075 ISSN: 0008-5472 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2665239A1 (en) 2008-05-22
SI2486941T1 (sl) 2017-08-31
JP6496673B2 (ja) 2019-04-03
WO2008060367A2 (en) 2008-05-22
SG10201608268RA (en) 2016-11-29
TWI592425B (zh) 2017-07-21
JP6097650B2 (ja) 2017-03-15
DK2486941T3 (en) 2017-06-26
AU2007320024A1 (en) 2008-05-22
JP2010505830A (ja) 2010-02-25
MX2009003306A (es) 2009-04-23
DK2066351T3 (en) 2015-12-14
AR063086A1 (es) 2008-12-23
CN101528259A (zh) 2009-09-09
EP2066351A2 (en) 2009-06-10
CN101528259B (zh) 2014-04-09
AR113225A2 (es) 2020-02-19
JP2013227339A (ja) 2013-11-07
HUE027165T2 (en) 2016-08-29
RS54424B1 (en) 2016-04-28
CY1118949T1 (el) 2018-01-10
LT2486941T (lt) 2017-06-12
TWI522366B (zh) 2016-02-21
HK1131904A1 (en) 2010-02-12
US8450464B2 (en) 2013-05-28
CN103897058B (zh) 2018-06-15
RS55740B1 (sr) 2017-07-31
US20190031763A1 (en) 2019-01-31
NO20091283L (no) 2009-04-24
PT2066351E (pt) 2015-11-30
US10106615B2 (en) 2018-10-23
US11312777B2 (en) 2022-04-26
NZ575924A (en) 2012-05-25
US20100104508A1 (en) 2010-04-29
TW200831535A (en) 2008-08-01
KR101722261B1 (ko) 2017-04-03
WO2008060367A9 (en) 2008-07-10
KR20090064589A (ko) 2009-06-19
SI2066351T1 (sl) 2016-02-29
ME02269B (me) 2016-04-28
EP2486941B1 (en) 2017-03-15
EP2066351B1 (en) 2015-09-09
NO345287B1 (no) 2020-11-30
BRPI0718197A2 (pt) 2014-09-30
IL197831A0 (en) 2011-08-01
JP5417175B2 (ja) 2014-02-12
JP2016105719A (ja) 2016-06-16
CY1117036T1 (el) 2017-04-05
AU2007320024B2 (en) 2012-11-08
ZA200902256B (en) 2019-02-27
SG178712A1 (en) 2012-03-29
KR20150065959A (ko) 2015-06-15
ES2553553T3 (es) 2015-12-10
JP2019054798A (ja) 2019-04-11
KR20170123712A (ko) 2017-11-08
CN103897058A (zh) 2014-07-02
EA200900424A1 (ru) 2009-08-28
PL2066351T3 (pl) 2016-02-29
US20130251729A1 (en) 2013-09-26
HUE033630T2 (en) 2017-12-28
PT2486941T (pt) 2017-05-30
EP2486941A1 (en) 2012-08-15
ES2625798T3 (es) 2017-07-20
WO2008060367A3 (en) 2008-11-06
IL197831A (en) 2017-01-31
CL2007002835A1 (es) 2008-05-30
PL2486941T3 (pl) 2017-08-31
TW201604208A (zh) 2016-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA018836B1 (ru) Человеческие антитела, которые связываются с cxcr4, и их применение
JP5868593B2 (ja) Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３に対するモノクローナル抗体
EA017812B1 (ru) Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
EA017086B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение
EA028336B1 (ru) Полностью человеческие антитела, специфические в отношении cadm1
JP2024012382A (ja) Ｃｄ７０に特異的な抗体およびその使用
EA019344B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
EA016186B1 (ru) Человеческие моноклональные антитела к cd70 и их применение
EA030182B1 (ru) Антитела, специфические для кадгерина-17
TW201800106A (zh) 新穎之抗ｕｐｋ１ｂ抗體及使用方法
US20220356248A1 (en) Antibodies specific to glycosylated lag3 and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Registration of transfer of a eurasian patent in accordance with the succession in title
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU