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CN101636168B - Sp35抗体及其用途 - Google Patents

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CN101636168B CN2008800076855A CN200880007685A CN101636168B CN 101636168 B CN101636168 B CN 101636168B CN 2008800076855 A CN2008800076855 A CN 2008800076855A CN 200880007685 A CN200880007685 A CN 200880007685A CN 101636168 B CN101636168 B CN 101636168B
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邵朝晖
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Abstract

内源Sp35是神经元存活，轴突再生，少突细胞分化和髓鞘形成的负调控因子。能够阻断内源Sp35功能的抗Sp35抗体分子可用于治疗神经元和少突细胞的机能障碍。本发明提供了专一性针对Sp35的抗体，以及使用该抗体作为内源Sp35功能拮抗剂的方法。本发明进一步提供了专一性杂交瘤和噬菌体库衍生的单克隆抗体，编码这些抗体的核酸，以及包含这些抗体的载体和宿主细胞。本发明进一步提供了在脊椎动物中促进少突细胞存活和髓鞘形成的方法，其包括向需要进行该治疗的脊椎动物施用有效量的抗Sp35抗体。

Description

SP35抗体及其用途
技术领域
本发明涉及神经学，神经生物学和分子生物学。本发明进一步涉及治疗脊髓损伤等神经生物学疾病、紊乱和损伤的分子和方法。
背景技术
轴突和树突自神经元向外延伸。伸展的轴突或神经突的尖端包含了一个专化的区域，该区域被称作生长锥。生长锥感受局部环境并引导轴突向神经元靶细胞生长。生长锥可响应表面粘性、生长因子、神经传递素和电场等环境线索。神经锥通常以每天一或两毫米的速率生长。生长锥通过分类为片状伪足和丝状伪足的延长物对前方和两侧的区域进行探索。当延长物接触到不适宜的表面时，它将缩回。当延长物接触到适宜的生长表面时，它将继续延伸并将生长锥导向该方向。生长锥到达合适的靶细胞后将建立突触联系。
神经细胞的功能受神经元与其直接环境中的其它细胞的接触所影响(Rutishauser，等人，1988，Physiol.Rev.68：819)。这些细胞包括中枢神经系统(CNS)中的特殊神经胶质细胞、少突细胞以及以髓磷脂包覆神经元轴突的周围神经系统(PNS)的施万细胞(Lemke，1992，in An Introduction to Molecular Neurobiology，Z.Hall，Ed.，p.281，Sinauer)。
CNS神经元具有损伤后再生的天然潜力，但他们的再生可通过髓磷脂中存在的抑制蛋白进行抑制(Brittis等人，2001，Neuron 30：11-14；Jones等人，2002，J.Neurosci.22：2792-2803；Grimpe等人，2002，J.Neurosci.：22：3144-3160)。
在少突细胞上发现的多种髓磷脂抑制蛋白已得到鉴定。已知的髓鞘抑制蛋白的范例包括NogoA(Chen等人，Nature，2000，403，434--439；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444)，髓鞘相关糖蛋白(MAG)(McKerracher等人，1994，Neuron 13：805-811；Mukhopadhyay等人，1994，Neuron 13：757-767)以及少突细胞糖蛋白(OM-gp)，Mikol等人，1988，J.Cell.Biol.106：1273-1279)。这些蛋白各自显示为神经元Nogo受体-1的配体(NgR1(Wang等人，Nature2002，417，941-944；Grandpre等人，Nature 2000，403，439-444；Chen等人，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi等人，Neuron 2002，2002年6月28日在线发表)。
Nogo受体1(NgR1)是一种包含了含8个富亮氨酸重复序列的GPI锚定的膜蛋白(Fournier等人，2001，Nature409：341-346)。在与抑制蛋白(例如，NogoA，MAG和OM-gp)相互作用后，该NgR1复合物转导了可导致生长锥萎缩和神经突生长抑制的信号。
对能够抑制NgR1介导的生长锥萎缩和神经突生长的分子和方法的需求仍未得到满足。另外还存在对能提高神经元存活率和轴突再生的分子的需求。特别针对包括轴突损伤、神经元或少突细胞死亡、髓鞘脱失或脱髓鞘变性或与神经系统总体相关的疾病、紊乱或损伤的治疗。
该种疾病、紊乱或损伤包括，但不限于，多发性硬化症(MS)、进行性多灶性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质营养不良、亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)、球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)以及华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脊髓损伤、颅脑损伤、辐射后损伤、化疗后的神经系统并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏症、单独的维生素E缺乏综合症、AR、巴康氏综合症、Marchiafava-Bignami综合症、异染性脑白质营养不良症、三叉神经痛和贝尔麻痹症。MS是这些疾病中传播最广的一种，在全世界约有250万患者。
MS在初期通常为复发缓解型神经系统损害，随后进入慢性期，同时神经损伤逐步加重。MS伴有破坏髓磷脂、少突细胞和轴突的局部慢性病灶。在MS中观察到的髓鞘脱失并不一直持续，曾有过在该疾病的早期阶段髓鞘再生的记录。神经元的髓鞘再生需要少突细胞。
对MS可进行多种疾病调节治疗，包括干扰素beta和
Figure G2008800076855D00031
等皮质类固醇和免疫调节剂的使用。此外，由于少突细胞和髓鞘形成在MS中的重要地位，人们在开发能够提高少突细胞数量或增强髓鞘形成的疗法上投入了许多努力。例如，参见Cohen等人，美国专利5,574,009；Chang等人，N.Engl.J.Med，346：165-73(2002)。然而，对于MS和其它髓鞘脱失和髓鞘形成障碍的紊乱的附加疗法仍存在迫切的需求。发明内容发明概述
本发明基于如下发现：Sp35(Sp35在文献中也被称为LINGO-1和LRRN6)可在少突细胞和神经元细胞中表达，并可负向调节少突细胞/神经元分化、存活和轴突髓鞘形成。此外，一些Sp35的拮抗剂可以促进少突细胞和神经元细胞的存活、增殖和分化，以及神经元的髓鞘形成。基于这些发现，本发明一般涉及可被用作Sp35拮抗剂的抗体，其抗原结合片段或衍生物。此外，本发明一般涉及通过施用Sp35拮抗剂抗体或其抗原结合片段治疗有关髓鞘脱失、髓鞘形成障碍、少突细胞/神经元细胞死亡或轴突损伤的各种疾病、紊乱或损伤的方法。
在特定实施方式中，本发明包括与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的参考单克隆抗体特异性结合相同Sp35表位的分离抗体或其抗原结合片段。
本发明的特定实施方式包括了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离多肽，其中的CDR1，CDR2和CDR3区选自表4所示的多肽序列，或者与表4所示的多肽序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性，或者与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链的VH CDR1、CDR2和CDR3区或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链的VH CDR1、CDR2和CDR3区具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。
本发明的特定实施方式包括了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离多肽，其中该CDR1，CDR2和CDR3区选自表5所示的多肽序列，或者与表5所示的多肽序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性，或者与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链的VL CDR1、CDR2和CDR3区或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链的VL CDR1、CDR2和CDR3区具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。
本发明的特定实施方式包括了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)的分离多肽，其中该重链可变区选自表6所示的SEQ IDNOs：158-172、372、376、380、384和416，或者与表6所示的SEQID NOs：158-172、372、376、380、384和416具有至少80％、85％、90％或95％的一致性，或者与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。
本发明的特定实施方式包括了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)的分离多肽，其中该轻链可变区选自表8所示的SEQ IDNOs：273-286、373、377、381、385和417，或者与表8所示的SEQID NOs：273-286、373、377、381、385和417具有至少80％、85％、90％或95％的一致性，或者与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。
在附加的实施方式中，本发明包括包含了编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸的分离多聚核苷酸，其中的CDR1，CDR2和CDR3区选自表4中显示的多聚核苷酸序列，或与表4中显示的多聚核苷酸序列至少具有80％、85％、90％或95％的一致性。
在另一实施方式中，本发明包括了包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸的分离多聚核苷酸，其中的CDR1，CDR2和CDR3区选自表5中显示的多聚核苷酸序列，或与表5中显示的多聚核苷酸序列至少具有80％、85％、90％或95％的一致性。
本发明的其它实施方式包括包含了编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VH选自表7所示的SEQ ID NOs：173-184、370、374、378、382和422，或者与表7所示的SEQ ID NOs：173-184、370、374、378、382和422具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。
本发明的其它实施方式包括包含了编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸的分离多聚核苷酸，其中该VL选自表9所示的SEQ ID NOs：185-194、371、375、379、383和423，或者与表9所示的SEQ ID NOs：185-194、371、375、379、383和423具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。
在特定的实施方式中，本发明包括了包含此处所述的抗体或抗原结合片段的组合物。
在附加实施方式中，本发明包括了治疗CNS损伤、ALS、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、糖尿病神经病变和中风的方法，其包括向需要该种治疗的动物施用有效量的选自分离Sp35抗体或其片段或是包含所述抗体或其片段的组合物的药剂。
在其它实施方式中，本发明包括通过向需要该种治疗的动物施用有效量的选自分离Sp35抗体或其片段或是包含所述抗体或其片段的组合物的药剂，治疗包括多发性硬化症(MS)、进行性多灶性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、华勒氏变性、脑白质营养不良、亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)的有关少突细胞生长或分化抑制、CNS神经元的髓鞘脱失或髓鞘形成障碍的疾病或紊乱的方法。
本发明的其它实施方式包括抑制Nogo受体1(NgR1)介导的信号转导的方法，其包括将NgR1与有效量的选自分离Sp35抗体或其片段或是包含所述抗体或其片段的组合物的药剂相接触。
本发明的附加实施方式包括降低中枢神经系统(CNS)神经元的轴突生长抑制的方法，其包括将神经元与有效量的选自分离Sp35抗体或其片段或是包含所述抗体或其片段的组合物的药剂相接触。
本发明的其它实施方式包括抑制CNS神经元生长锥萎缩的方法，其包括将神经元与有效量的选自分离Sp35抗体或其片段或是包含所述抗体或其片段的组合物的药剂相接触。
附图说明
图1：SDS-PAGE凝胶显示Sp35被单克隆抗体1A7和2F3免疫沉淀。
图2：FACS结果显示MAbs 1A7和2F3与表达Sp35的COS-7或293细胞相结合，但与不表达Sp35的对照细胞不结合。
图3：单克隆抗体1A7和2F3保护DRG神经元不受髓磷脂介导的神经突生长抑制。
图4A-G：对经过单克隆抗体1A7和2F3或对照抗体进行处理的DRG神经元和少突细胞的共培养进行免疫组化染色(″IHC″)。图D和E分别为对图B和C的放大。以抗-βIII-微管蛋白抗体染色鉴定轴突，或以抗-MBP-抗体染色鉴定少突细胞。F：通过以1A7或2F3处理共培养对MBP+髓鞘形成细胞进行定量。G：以Western印迹分析定量经单克隆抗体1A7和2F3处理的DRG神经元和少突细胞共培养生成的MBP。
图5A-C：A：对cuprizone模型中的小鼠少突细胞使用CC1抗体染色。B：对cuprizone模型中的小鼠神经元使用抗-MBP蛋白抗体或luxol fast blue染色。C：对第4周和第6周的CC1抗体阳性少突细胞进行定量。
图6：存活的RGC。以抗体1A7进行治疗。经抗Sp35抗体1A7治疗的动物显示的神经元存活率(80％)明显高于经对照抗体或PBS治疗的动物，后两者分别仅显示出约50％的神经元存活率。
图7：患有如实施例8所述的脊髓损伤的小鼠在接受抗-Sp35抗体1A7后的BBB分值。
图8：少突细胞和DRG的共培养与如实施例9所述的抗Sp35抗体Li05、Li06和3、10和30mg的Sp35-Fc(LINGO-1-Ig)孵育后的Western印迹分析。
图9：以下动物的视神经图象A)普通大鼠；B)髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠；以及C)经Sp35抗体1A7治疗的髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠。各视神经的电子显微图显示在各视神经图象的下方。
图10：视神经挤压伤后的动物经玻璃体内注射Sp35抗体1A7后计数得到的每个切片的再生神经元纤维数量的图示。
图11：FACS结果显示单克隆抗体3B5.2(3B5)和7P1D5.1G9(1D5)结合稳定转染Sp35(LINGO-1)的CHO细胞。发明详述I.定义
应当注意：术语“一个”或“一种”实体指一个或多个该种实体；例如，“一个p35抗体”应理解为代表一个或多个p35抗体。因此，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在此处可互换使用。
此处所用的术语“多肽”意在包括单数和复数的“多肽”，并指由酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)所组成的一种分子。术语“多肽”指任何两个或多个氨基酸的链，且不指定产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸链”或任何其它指代两个或多个氨基酸链的术语都包含在“多肽”的定义之内，且术语“多肽”可取代任何上述术语或与之互换。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，该种修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解裂解、或通过非天然存在的氨基酸进行修饰。多肽可衍生自天然的生物来源或通过重组技术生产，但不一定需要从指定的核酸序列翻译。它可通过任何方式生成，包括化学合成。
本发明的多肽的大小约为3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多或者2000个或更多的氨基酸。多肽可具有指定的三维结构，但并非必须具有该种结构。具有指定三维结构的多肽被称为折叠结构，而不具有指定三维结构，但可采用多种构型的多肽被称为未折叠结构。此处所用的术语糖蛋白指至少与一个糖部分连接的蛋白，该糖部分通过氨基酸残基(例如丝氨酸残基或天冬氨酸残基)的含氧或含氮侧链与蛋白连接。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不存在于其天然环境中的多肽。不要求达到特定的纯化水平。例如，分离的多肽可取自其自然的或天然的环境中。在宿主细胞中表达的重组生产的多肽和蛋白被认为对于本发明的目的而言是分离的，因为它们是通过任何合适的技术分离、分级或者部分或基本纯化的天然或重组多肽。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任意组合。在涉及本发明的Sp35抗体或抗体多肽时术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括任何至少保留了相应天然抗体或多肽的部分抗原结合属性的多肽。本发明的多肽片段包括蛋白水解片段、删除片段，以及在其它地方讨论的特定抗体片段。本发明的Sp35抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，还包括具有由氨基酸替换、删除或插入所得的变更氨基酸序列的多肽。变体可以是天然存在的或是非天然存在的。非天然存在的变体可通过本领域已知的突变技术进行制备。变体多肽可包含保守或非保守氨基酸替换、删除或添加。本发明的Sp35抗体和抗体多肽的衍生物为经过变更后可显示出未在天然多肽上发现的附加特性的多肽。其范例包括融和蛋白。变体多肽在此也可称为“多肽类似物”。此处所用的Sp35抗体或抗体多肽“衍生物”指具有一个或多个经过功能性侧基团反应化学衍生得到的残基的主题多肽。“衍生物”还包括包含了二十个标准氨基酸的一个或多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可替换脯氨酸；5-羟基赖氨酸可替换赖氨酸；3-甲基组氨酸可替换组氨酸；高丝氨酸可替换丝氨酸；以及鸟氨酸可替换赖氨酸。
术语“多聚核苷酸”包括了单数或复数的核酸，并指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多聚核苷酸可包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，于肽核酸(PNA)等发现的酰胺键)。术语“核酸”指在多聚核苷酸中存在的任何一个或多个核酸片段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多聚核苷酸指从其天然环境中分离的核酸分子，DNA或RNA。例如，包含在载体中的编码Sp35抗体的重组多聚核苷酸被认为对于本发明的目的而言是分离的。分离多聚核苷酸的进一步范例包括存在于外源宿主细胞中的重组多聚核苷酸或在溶液中(部分或完全)纯化的多聚核苷酸。分离的RNA分子包括对本发明多聚核苷酸的体内或体外RNA转录物。如本发明所述的分离的多聚核苷酸或核酸进一步包括合成制备的该种分子。此外，多聚核苷酸或核酸可以是启动子，核糖体结合位点或转录终止子等调节元件或是包含该种调节元件。
此处所用的“编码区”指由翻译为氨基酸的密码子组成的一部分核酸。尽管“终止密码子”(TAG，TGA，或TAA)不翻译成氨基酸，它仍可被认为是编码区域的一部分，但如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等侧翼序列不是编码区域的一部分。本发明的两个或多个编码序列可存在于一个单独的多聚核苷酸构建体(例如，单独的载体)中或分离的多聚核苷酸构建体(例如，分离的(不同)载体)中。此外，任何载体可包含一个单独的编码区，或包含两个或多个编码区，例如，一种单独载体可分别编码一种免疫球蛋白的重链可变区和一种免疫球蛋白的轻链可变区。此外，本发明的载体、多聚核苷酸或核酸可编码融和或未融合至编码Sp35抗体或其片段、变体或衍生物的核酸的外源编码区。外源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌腺信号肽或外源功能性结构域。
在特定的实施方式中，该多聚核苷酸或核酸为DNA。当为DNA时，包含了编码多肽的核酸的多聚核苷酸通常包括与一个或多个编码区可操作地连接的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。可操作地连接指当某种基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调节序列以一种特定方式连接时，基因产物的表达受到调节序列的影响或控制。如启动子功能的诱导可使mRNA的转录编码目标基因产物，并且如果两个DNA片段之间的接头的性质不干扰表达调节序列引导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如一个多肽编码区域和与之连接的启动子)被“可操作地连接”。因此，如果一个启动子能够影响一种编码多肽的核酸的转录，则该启动子区将被可操作地连接至该核酸。该启动子可以是仅能在预定细胞中引导DNA的充分转录的细胞特异性启动子。初启动子外的其它转录控制元件，如增强子、操作子、阻遏子以及转录终止信号可与多聚核苷酸进行可操作连接以引导细胞特异性转录。此处披露了合适的启动子和其它转录控制区。
各种转录控制区已为本领域技术人员所熟知。其包括，但不限于，在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如，但不限于，来自细胞巨化病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，与内含子-A相连接)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录酶病毒(例如禽劳斯肉瘤病毒)。其它的转录控制区包括衍生自肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-球蛋白的脊椎动物基因的区域以及其它能够在真核细胞中控制基因表达的序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如，受干扰素或白介素诱导的启动子)。
类似地，各种翻译控制元件已为本领域的普通技术人员所熟知。其包括，但不限于核糖体结合位点、翻译启动和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或是IRES，也被称为CITE序列)。
在其它的实施方式中，本发明的多聚核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式存在。
本发明的多聚核苷酸和核酸编码区可与编码分泌腺或信号肽的附加编码区(引导本发明的多聚核苷酸编码的多肽的分泌)相连接。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌型前导序列，后者在生长蛋白链向粗面内质网的输出被启动时从成熟蛋白上被裂解。本领域的普通技术人员均了解由脊椎动物分泌的多肽通常具有融合到多肽N末端的信号肽，它从完整或“全长”多肽序列裂解以生产分泌或“成熟”型多肽。在特定实施方式中采用了如免疫球蛋白重链或轻链信号肽等天然信号肽，或保留了引导与之可操作连接的多肽分泌能力的该序列的功能性衍生物。此外还可以使用外源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖苷羧酶的前导序列所取代。
本发明的目标在于特定的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非另行指明为天然存在的抗体等全长抗体，术语“Sp35抗体”包含了全长抗体以及该种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如，天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化抗体分子或以类似方式与抗体分子结合的片段。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此处可以互换使用。抗体或免疫球蛋白至少包含重链的可变区，并通常至少包含重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已得到较为充分的了解。例如，参见Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。
如将在下文具体讨论的那样，术语“免疫球蛋白”包括了能够以生化方式区分的多种多肽类别。本领域的技术人员均了解：重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有小类(例如，γ1-γ4)。由该链的性质决定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白小类(同型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等均得到了很好的鉴别并赋予了功能定位。熟练的技术人员能够轻易辨别这些类别和同型的各修饰型，且它们均在本发明的范围之内。所有免疫球蛋白类别均明确落入本发明范围内，下述讨论将一般指向免疫球蛋白分子的IgG分类。对于IgG，一个标准的免疫球蛋白分子包含了两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽，以及两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”构型连接，其中轻链自“Y”的嘴部围住重链的整个可变区。
轻链被分类为kappa或lambda(κ，λ)。各重链分类均能与kappa或lambda轻链的任意一种相结合。一般而言，轻链和重链彼此共价连接，而两条重链的”尾”部以二硫键彼此共价连接或当免疫球蛋白产自杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞时彼此非共价连接。在重链中，氨基酸序列自Y构型叉端的N末端延续至各链底部的C末端。
轻链和重链均被划分为具有结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”具有功能性含义。就此而言，应当理解轻(VL)和重(VH)链区的可变域决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域则赋予了重要的生物功能，例如分泌、经胎盘活动性、Fc受体结合、补体结合等。根据惯例随恒定区结构域越为远离抗体的抗原结合位点或氨基酸末端，其编号也随之上升。N末端部分为可变区而C末端部分为恒定区；CH3和CL结构域实际分别包含了重链和轻链的羧基末端。
如上文指出，可变区允许抗体选择性识别特异性结合抗原上的表位。即，抗体的VL结构域和VH结构域，或决定簇互补区(CDRs)的亚群结合形成定义三维抗原结合位点的可变区。该四级抗体结构形成了存在于Y上各臂末端的抗原结合位点。更具体的说，该抗原结合位点可通过各VH和VL链上的决定簇互补区(CDRs)定义。在一些情况下，例如对于源自骆驼类或基于骆驼类免疫球蛋白工程化的免疫球蛋白分子，完整的免疫球蛋白分子可能仅由重链组成，而不含轻链。例如，参见Hamers-Casterman等人，Nature363：446-448(1993)。
在自然存在的抗体中，各抗原结合结构域的六个“决定簇互补区”或“CDRs”是当抗体在水环境中呈现三维构型时经特别定位形成抗原结合结构域的非相邻的短序列。抗原结合结构域的剩余氨基酸称为“框架”区，显示了较低的分子间可变性。框架区大体呈β-折叠构型，而CDRs形成与β-折叠结构连接(在某些情况下形成其一部分)的环形。因此，框架区通过链间非共价相互作用形成了支持CDRs以正确方向定位的支架。由定位CDRs形成的抗原结合结构域定义了免疫反应性抗原上的表位补体。该互补表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。由于已有明确的描述，本领域的普通技术人员可简单地在任何给定重或轻链可变区鉴别该种分别包含了CDRs和框架区的氨基酸(参见，″Sequences of Proteins ofImmunological Interest，″Kabat，E.，等人，U.S.Department of Healthand Human Services，(1983)；以及Chothia和Lesk，J.MoI.Biol.，796：901-917(1987)，在此全文引入作为参考)。
当一个术语有两个或更多地定义为本领域所使用和/或接受时，除非另行指明，此处所用的术语定义意在包括所有该种含义。一个具体的范例为使用术语“决定簇互补区”(″CDR″)描述重链和轻链多肽的可变区范围内均发现的非邻近抗原结合位点。该特定区域的描述参见Kabat等人，U.S.Dept.of Health and HumanServices，″Sequences of Proteins of Immunological Interest″(1983)以及Chothia等人.，J.MoI.Biol.196：901-917(1987)，其在此引入作为参考，其中该定义在彼此进行比较时包括氨基酸残基的重叠或亚群。然而，抗体或其变体的CDR的任意定义的采用均意在落入此处所定义和使用的术语的范围之内。下文表1中列举了包含分别由上述引用的参考文献定义的CDRs的适当氨基酸残基以供比较。包含特定CDR的确切残基数将随着该CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可在给定抗体可变区氨基酸序列的情况下确定包含特定CDR的残基。表1.CDR定义1
  Kabat   Chothia
  VHCDR1   31-35   26-32
  VHCDR2   50-65   52-58
  VHCDR3   95-102   95-102
  VLCDR1   24-34   26-32
  VLCDR2   50-56   50-52
  VLCDR3   89-97   91-96
1表1中所有CDR定义的编号均参照Kabat等人(见下文)制定的编号规则。
Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区序列编号系统。本领域普通技术人员可毫无疑义地将该“Kabat编号系统”指定给任意可变区序列，且无需依赖该序列本身以外的任何实验数据。此处所用的“Kabat编号”指由Kabat等人.，U.S.Dept.of Healthand Human Services，″Sequence of Proteins of Immunological Interest″(1983)提出的编号系统。除非另行指明，对本发明的Sp35抗体或抗原结合片段、变体、或其衍生物的特定氨基酸残基位置的编号均参照Kabat编号系统。
在骆驼类物种中，该重链可变区(称为VHH)形成了完整的抗原结合结构域。骆驼类VHH可变区和来自常规抗体(VH)的可变区的主要区别包括(a)与VH中的相应区域相比，VH的轻链接触表面中具有更多的疏水氨基酸，(b)VHH中具有更长的CDR3，以及(c)VHH中的CDR1和CDR3之间二硫键出现的频率。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人源的、人源化的、灵长源化的、或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达库制备的片段以及抗独特型(抗-Id)抗体(例如，包括此处披露的Sp35抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子已为本领域所知，其描述参见美国专利5,892,019等。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何形式(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或小类。
包括单链抗体在内的抗体片段可以仅单独包含可变区，或是结合包含铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的全部或部分。本发明还包括了同样包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域任意组合的抗原结合片段。此处披露的用于诊断或治疗方法的抗体或其抗原特异性片段可来源于包括鸟类和哺乳动物在内的任何动物。该抗体优选人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、羊驼、马或鸡抗体。在另一实施方式中，可变区可来自不同的来源(例如，来自鲨鱼)。此处所述的“人类”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白库或从表达一种或多种人免疫球蛋白且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文描述，并可参见Kucherlapati等人的美国专利5,939,598。
此处所用的术语“重链部分”包括来自于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽至少包含CH1结构域、铰链结构域(例如，上、中和/或下铰链区)、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段之一。例如，本发明中采用的结合多肽可以包括含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域，至少铰链区的一部分，以及CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域，至少铰链结构域的一部分，以及CH3结构域的多肽链，或含有CH1结构域，至少铰链结构域的一部分，CH2结构域以及CH3结构域的多肽链。在另一实施方式中，本发明的多肽包括了含有CH3结构域的多肽链。本发明中所采用的结合多肽可进一步至少缺失CH2结构域的一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。如上所述，本领域的普通技术人员应当可以理解：这些结构域(例如，重链部分)可以进行修饰，从而不同于天然存在的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列。
在此处所披露的特定Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，多聚体的一条多肽链中的重链部分与该多聚体的其它多肽链的重链部分相同。替代性地，本发明中含重链部分的单体并不相同。例如，各单体可包含不同的目标结合位点，形成例如双特异性抗体。
此处披露的用于诊断和治疗方法的结合多肽的重链部分可来自于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含了来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3分子的铰链区。在另一范例中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG3分子的铰链区。在另一范例中，重链部分可包含部分来自于IgG1分子及部分来自于IgG4分子的嵌合铰链。
此处所用的术语“轻链部分”包括来自于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，该轻链部分至少包含VL或CL结构域之一。
此处披露的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过抗原的表位或部分(例如可被它们识别或特异结合的目标多肽(Sp35))进行描述或说明。目标多肽中与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分为“表位”或“抗原决定簇”。根据抗原的大小、构型和类型，目标多肽可能包含单个表位，但通常包含至少两个表位，并可能包含任意数量的表位。此外，应当指出目标多肽上的“表位”可以是非多肽元件或包含非多肽元件，例如，“表位”可包含糖类侧链。
抗体的肽或多肽表位的最小大小约为4-5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少七个氨基酸，更优选至少包含九个氨基酸，最优选包含约15-约30个氨基酸。由于CDR可在其三级形态识别抗原性肽或多肽，包含表位的氨基酸不需要相邻，并且在某些情况下，甚至不需要在同一肽链上。在本发明中，由本发明的Sp35抗体识别的肽或多肽表位包含Sp35的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选至少8个、至少9个、至少10、至少15个、至少20个、至少25个、或是约15至约30个邻近或非邻近的氨基酸的序列。
“特异性结合”通常指抗体通过其抗原结合结构域与表位结合，且该种结合需要抗原结合结构域和表位之间互补。根据该定义，当一种抗体通过其抗原结合区与一种表位的结合比它与任意的、不相关的表位的结合更为容易时，则称该抗体“特异性结合”该表位。术语“特异性”在此处用于限定一种特定抗体与一种特定表位结合的相对亲和性。例如，抗体“A”可能被认为比抗体“B”对一种给定表位具有更高的特异性，或是可认为抗体“A”与表位“C”的结合比其与相关表位“D”的结合具有更高的特异性。
“优先结合”指该抗体与一种表位的特异性结合比它与相关的、相似的、同源的或是类似的表位的结合更为容易。因此，与一种给定表位“优先结合”的抗体与该表位的结合比与相关的表位更为容易，即使该种抗体可能与该相关表位交叉反应。
作为非限制性范例，如抗体与第一表位结合的解离常数(KD)小于该抗体对第二表位的KD，则认为该抗体优先结合所述第一表位。在另一非限定范例中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一抗原。在另一非限定范例中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的KD小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
在另一非限定范例中，如抗体与第一表位结合的解离速率(k(off))小于该抗体对第二表位的k(off)，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定范例中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的k(off)小一个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。在另一非限定范例中，如抗体与第一表位结合的亲和性至少比该抗体对第二表位的k(off)小两个数量级，则认为该抗体优先结合该第一表位。
此处披露的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的解离速率小于或等于5X10-2/秒、10-2/秒、5X10-3/秒或10-3/秒。更优选地，此处披露的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的解离速率(k(off))小于或等于5X10-4/秒、10-4/秒、5X10-5/秒、或10-5/秒5X10-6/秒、10-6/秒、5X10-7/秒或10-7/秒。
此处披露的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的结合速率(k(on))大于或等于103M-1/秒，5X103M-1/秒，104M-1/秒或5X104M-1/秒。更优选地，本发明的抗体可认为与此处披露的目标多肽或其片断或变体结合的结合速率(k(on))大于或等于105M-1/秒，5X105M-1/秒，106M-1/秒或5X106M-1/秒或107M-1/秒。
如果一种抗体以能够一定程度阻断一种参考抗体与一种特定表位结合的方式与该表位优先结合，则认为该抗体竞争性地抑制该参考抗体与该表位的结合。竞争性抑制可通过竞争ELISA分析等任何本领域已知的方法进行测定。当一种抗体对参考抗体与给定表位的结合的抑制为至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％时，则认为该抗体竞争性抑制该参考抗体与该表位的结合。
此处所用的术语“亲和性”指一种单独表位与免疫球蛋白分子的CDR结合强度的量度。例如，参见Harlow等人.，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)，页码27-28。此处所用的术语“亲和力”指一组免疫球蛋白和抗原的复合物的整体稳定性，即一种免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度。例如，参见Harlow，第29-34页。亲和力既与该组中的个体免疫球蛋白分子与特定表位的亲和性相关，也与该免疫球蛋白和该抗原的化合价相关。例如，二价单克隆抗体与聚合体等具有高度重复表位结构的抗原的相互作用将具有较高的亲和力。
本发明的Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物同样可根据它们的交叉反应性进行描述或说明。此处所用的术语“交叉反应性”指一种对某种抗原具有特异性的抗体与一种第二抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间相关性的衡量。因此，当一种抗体能与未包含在其构成中的表位结合时该抗体具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有与诱导表位相同的多个互补结构特征，在某些情况下可能比原始表位更为匹配。
例如，某些抗体具有一定程度地交叉反应性，因此它们可以结合相关但并不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法计算得到)的表位。如果一种抗体不结合与一种参考表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％、小于50％的一致性(通过本领域已知的并在此处描述的方法进行计算)的表位，则认为该抗体不具有或具有极小的交叉反应性。如果一种抗体不与某种表位的任何其它类似物、直系同源物或同源物相结合，则可认为该抗体对该表位具有“高度特异性”。
本发明的Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物同样可根据它们与本发明的多肽的结合亲和性进行描述或说明。优选的结合亲和性包括解离常数或Kd小于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x10-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的情况。
本发明的Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以具有“多特异性”，例如，双特异性、三特异性或更大的多特异性，这意味着它可同时识别和结合在一个或多个不同的抗原(例如，蛋白)上的两个或多个不同的表位。因此，Sp35抗体为“单特异性”或“多特异性”(例如，“双特异性”)指与结合多肽反应的不同表位的数量。多特异性抗体可对此处所述的目标多肽的不同表位具有特异性，或可能对目标多肽和外源表位(如外源多肽或固相支持材料)具有特异性。
此处所用的术语“化合价”指Sp35抗体、结合多肽或抗体中的潜在结合结构域(例如，抗原结合结构域)的数量。每个结合结构域特异性结合一个表位。当一种Sp35抗体，结合多肽或抗体包含了超过一个结合结构域时，对于带有两个结合结构域且各结合结构域可特异性结合相同的表位，称为“二价单特异性”，对于带有两个结合结构域且各结合结构域特异性结合不同表位，称为“二价双特异性”。抗体对每一种特异性也可以是双特异性和二价的(称为“双特异性四价抗体”)。在另一实施方式中，可制备四价微抗体或结构域缺失的抗体。
双特异性二价抗体及其制备方法可参见，例如美国专利5,731,168、5,807,706、5,821,333；以及美国专利申请公开2003/020734和2002/0155537，上述文献在此全文引入作为参考。双特异性四价抗体及其制备方法的描述可参见WO 02/096948和WO 00/44788，上述文献在此全文引入作为参考。一般可参见PCT公布WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360、WO 92/05793，Tutt等人，J.Immunol.147：60-69(1991)、美国专利4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920、5,601,819，Kostelny等人，J.Immunol.74S：1547-1553(1992)。
如前文所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型已众所周知。此处所用的术语“VH结构域”包含了免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包含了免疫蛋白重链的第一(大多数为氨基末端)恒定区结构域。该CH1结构域邻近VH结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
此处所用的术语“CH2结构域”包含了重链分子的一部分，例如采用常规编号方案时从促凝剂244至残基360(Kabat编号系统中为残基244至360；EU编号系统中为残基231-340；参见KabatEA等人，在前文所用的引文中)。CH2结构域的独特之处在于它不与其它结构域紧密配对。但有两条N末端连接的分支糖链插入完整的自然IgG分子的两个CH2结构域之间。另有记录显示CH3结构域由CH2结构域延伸至IgG分子的C末端并包含约108个残基。
此处所用的术语“铰链区”包含了将CH1区连接至CH2区的重链分子部分。该铰链区包含了约25个残基并且是柔性的，从而使得两个N末端抗原结合区可以独立移动。铰链区可以被细分为三个不同的区域：上、中、下铰链区(Roux等人，J.Immunol 161：4083(1998))。
此处所用的术语“二硫键”包括了两个硫分子间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含了能与另一硫醇基团形成二硫键或桥的硫醇基团。在多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，且两条重链在Kabat编号系统的239和242位置(EU编号系统的226或229位置)通过两个二硫键相连接。
此处所用的术语“嵌合抗体”将用于指代任何免疫反应性区域或位点来自于一个物种而(根据本发明为完整的、部分的或修饰的)恒定区来自于另一物种的抗体。在优选实施方式中，该目标结合区域或位点来自于非人类来源(例如，小鼠或灵长动物)而恒定区来自人类。
此处所用的术语“工程化抗体”指重链和轻链中的一个或全部可变结构域通过被来自已知特异性的抗体的一个或多个CDRs至少部分替换，或在需要时通过部分框架区替换和序列更改所修饰得到抗体。尽管CDRs可来自于与获得该框架区的抗体相同的类别或小类，应考虑来自于不同类别抗体的CDRs，并优先考虑来自于不同种类抗体的CDRs。将一个或多个来自于已知特异性的非人类抗体的“供体”CDRs嫁接至人重链或轻链框架区的工程化抗体在此称为“人源化抗体”。无需将来自供体可变区的完整CDRs替换所有的CDRs以将一个可变结构域的抗原结合能力转换至另一个。事实上仅需要转移那些维持该目标结合位点活性所必需的残基。通过美国专利5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370等所给出的解释，本领域的技术人员应当能够通过常规试验或试错法试验获取功能性的工程化或人源化抗体。
此处所用的术语“正确折叠的多肽”包括了所有由多肽组成的功能结构域均具有明显活性的多肽(例如，Sp35抗体)。此处所用的“不正确折叠的多肽”包括至少一个多肽功能区没有活性的多肽。在一个实施方式中，正确折叠的多肽包含了至少由一个二硫键连接的多肽链，不正确折叠的多肽包含了未经至少一个二硫键连接的多肽链。
此处所用的术语“工程化”包括通过人工方法(例如，通过重组技术、体外肽合成、肽的酶催化或化学偶合或是这些技术的组合)处理核酸或多肽分子。
此处所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合”可相互替换。这些术语指通过化学连接或重组技术等任何方法连接两个或多个元件或成分。“框内融合”指以能够维持原始开放阅读框架(ORFs)的正确翻译阅读框的方式连接两个或多个多聚核苷酸ORFs以形成一个更长的连续ORF。因此，重组融合蛋白是一种含有两个或更多与原始ORFs所编码的多肽相应的片段的单独蛋白(该片段一般在天然状态下不进行该种连接)。尽管该阅读框架在融合片段中彼此连续，该片段可被框内接头序列等序列物理或空间分隔。例如，编码免疫球蛋白可变区CDRs的多聚核苷酸可框内融合，但只要该”融合的”CDRs被共翻译为连续多肽的一部分，它可被编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多聚核苷酸所分隔。
在有关多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”指多肽中的由氨基向羧基末端方向排列的氨基酸，其中序列内彼此相邻的残基在多肽的一级结构内邻近。
此处所用的术语”表达”指通过基因生产RNA或多肽等生化物质的过程。该过程包括任何该基因的功能存在的显现，包括但不限于，基因阻抑以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于将基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及将mRNA翻译为多肽。如果该最终产物是一种生化产物，则表达包括了该种生化产物和任何前体的生成。基因的表达产生了“基因产物”。此处所用的基因产物既可以是核酸(例如，由基因转录生成的信使RNA)，也可以是通过转录物翻译得到的多肽。此处所述的基因产物进一步包括经过转录后修饰(例如，多聚腺苷酸化)的核酸，或是经翻译后修饰(例如，甲基化，糖基化，以及脂质的添加，与其它蛋白亚基的结合，蛋白水解裂解等)的多肽。
此处所用的术语“治疗“指治疗性或预防性措施，其目的为预防或延缓(减轻)有害的生理变化或紊乱，例如多发性硬化症的发展。有益或目标临床结果包括，但不限于，可测或不可测的症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即，不恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及(部分或完全)消除。“治疗”还指与未接受治疗的预计存活相比更长的存活时间。需要接受治疗的对象包括已经患有疾病或紊乱以及容易患该疾病或紊乱的对象或是需要预防该疾病或紊乱的对象。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”指需要进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、驯养动物、畜牧动物以及动物园、运动或宠物动物、例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、家畜、牛等。
此处所用的短语如“可由Sp35抗体的施用获益的对象”和“需要接受该种治疗的动物”等包括了可从用于Sp35多肽的检测(例如，用于诊断过程)和/或治疗(即，使用Sp35抗体对MS等疾病的减轻或预防)的Sp35抗体的施用受益的对象，例如哺乳动物对象。如此处更为具体的描述，该Sp35抗体可在与药物、前药或同位素等物质相结合或不相结合的形式下进行使用。II.Sp35
天然存在的人Sp35(Sp35)是一种糖基化的中枢神经系统特异性蛋白，据预测它具有614个氨基酸(SEQ ID NO：2)，其中包括一个33个氨基酸的信号序列。Sp35在本领域中还被称为LINGO-1、LRRN6、LRRN6A、FLJ14594、LERN1、MGC17422和UNQ201。人全长野生型Sp35多肽包含了一种由14个富亮氨酸重复序列(包括N和C末端帽子)、一个Ig结构域、一个跨膜区以及一个细胞质结构域组成的LRR结构域。该细胞质结构域包含了一个标准的酪氨酸磷酸化位点。此外，该天然存在的Sp35蛋白包含了信号序列，介于LRRCT和Ig结构域之间的短碱性区，以及介于Ig结构域和细胞质结构域之间的跨膜区。该人Sp35基因(SEQ IDNO：1)包含了替代的翻译起始密码子，因此Sp35信号序列的N末端可能存在或不存在六个附加氨基酸，即MQVSKR(SEQ ID NO：3)。表2基于此处作为SEQ ID NO：2的Sp35氨基酸序列，依照氨基酸残基号列举了Sp35结构域及其它区域。该Sp35多肽在PCT公布WO 2004/085648中得到了更具体的表征，其全文在此引入作为参考。表2--Sp35结构域
  区域   起始残基   末端残基
  信号序列   1   33或35
  LRRNT   34或36   64
  LRR   66   89
  LRR   90   113
  LRR   114   137
  LRR   138   161
  LRR   162   185
  LRR   186   209
  LRR   210   233
  LRR   234   257
  LRR   258   281
  LRR   282   305
  LRR   306   329
  LRR   330   353
  LRRCT   363   414或416
  碱性   415或417   424
  Ig   419   493
  连接序列   494   551
  跨膜   552   576
  细胞质   577   614
Sp35在人和大鼠中的组织分布和发育表达已得到研究。Sp35生物学已在实验动物(大鼠)模型中进行研究。经northern印迹和免疫组化染色测定，大鼠Sp35的表达定位于神经元和少突细胞。大鼠Sp35mRNA表达水平受发育调节，在出生后的短时间内(即，约出生后第一日)达到峰值。在大鼠脊髓横切损伤模型中，经RT-PCR检测，Sp35在损伤位点受到上调。参见Mi等人NatureNeurosci.7：221-228(2004)。
在包含Sp35多肽的各种结构和功能结构域的氨基酸中，术语“约”包括了特别列举的数值和比该值多或少数个(例如，10、9、8、7、6、5、4、3、2或1)氨基酸的数值。由于表1中列举的这些区域的位置已通过计算机图形学进行预测，本领域的普通技术人员应当可以理解组成该结构域的氨基酸残基可以在该结构域定义的标准基础上有细微(例如，约1至15个残基)变化。
本发明发现了与NgR1结合的全长野生型Sp35。参见PCT公布WO 2004/085648。本发明还发现Sp35在少突细胞中表达，且Sp35包含在少突细胞介导的轴突髓鞘形成的调节中。参见美国专利公开2006/0009388A1，在此全文引入作为参考。
全长Sp35分子的核苷酸序列如下：ATGCTGGCGGGGGGCGTGAGGAGCATGCCCAGCCCCCTCCTGGCCTGCTGGCAGCCCATCCTCCTGCTGGTGCTGGGCTCAGTGCTGTCAGGCTCGGCCACGGGCTGCCCGCCCCGCTGCGAGTGCTCCGCCCAGGACCGCGCTGTGCTGTGCCACCGCAAGCGCTTTGTGGCAGTCCCCGAGGGCATCCCCACCGACACGCGCCTGCTGGACCTAGGCAAGAACCGCATCAAAACGCTCAACCAGGACGAGTTCGCCAGCTTCCCGCACCTGGAGGAGCTGGAGCTCAACGAGAACATCGTGAGCGCCGTGGAGCCCGGCGCCTTCAACAACCTCTTCAACCTCCGGACGCTGGGTCTCCGCAGCAACCGCCTGAAGCTCATCCCGCTAGGCGTCTTCACTGGCCTCAGCAACCTGACCAAGCTGGACATCAGCGAGAACAAGATTGTTATCCTGCTGGACTACATGTTTCAGGACCTGTACAACCTCAAGTCACTGGAGGTTGGCGACAATGACCTCGTCTACATCTCTCACCGCGCCTTCAGCGGCCTCAACAGCCTGGAGCAGCTGACGCTGGAGAAATGCAACCTGACCTCCATCCCCACCGAGGCGCTGTCCCACCTGCACGGCCTCATCGTCCTGAGGCTCCGGCACCTCAACATCAATGCCATCCGGGACTACTCCTTCAAGAGGCTCTACCGACTCAAGGTCTTGGAGATCTCCCACTGGCCCTACTTGGACACCATGACACCCAACTGCCTCTACGGCCTCAACCTGACGTCCCTGTCCATCACACACTGCAATCTGACCGCTGTGCCCTACCTGGCCGTCCGCCACCTAGTCTATCTCCGCTTCCTCAACCTCTCCTACAACCCCATCAGCACCATTGAGGGCTCCATGTTGCATGAGCTGCTCCGGCTGCAGGAGATCCAGCTGGTGGGCGGGCAGCTGGCCGTGGTGGAGCCCTATGCCTTCCGCGGCCTCAACTACCTGCGCGTGCTCAATGTCTCTGGCAACCAGCTGACCACACTGGAGCAATCAGTCTTCCACTCGGTGGGCAACCTGGAGACACTCATCCTGGACTCCAACCCGCTGGCCTGCGACTGTCGGCTCCTGTGGGTGTTCCGGCGCCGCTGGCGGCTCAACTTCAACCGGCAGCAGCCCACGTGCGCCACGCCCGAGTTTGTCCAGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTGATGTGCTACTGCCCAACTACTTCACCTGCCGCCGCGCCCGCATCCGGGACCGCAAGGCCCAGCAGGTGTTTGTGGACGAGGGCCACACGGTGCAGTTTGTGTGCCGGGCCGATGGCGACCCGCCGCCCGCCATCCTCTGGCTCTCACCCCGAAAGCACCTGGTCTCAGCCAAGAGCAATGGGCGGCTCACAGTCTTCCCTGATGGCACGCTGGAGGTGCGCTACGCCCAGGTACAGGACAACGGCACGTACCTGTGCATCGCGGCCAACGCGGGCGGCAACGACTCCATGCCCGCCCACCTGCATGTGCGCAGCTACTCGCCCGACTGGCCCCATCAGCCCAACAAGACCTTCGCTTTCATCTCCAACCAGCCGGGCGAGGGAGAGGCCAACAGCACCCGCGCCACTGTGCCTTTCCCCTTCGACATCAAGACCCTCATCATCGCCACCACCATGGGCTTCATCTCTTTCCTGGGCGTCGTCCTCTTCTGCCTGGTGCTGCTGTTTCTCTGGAGCCGGGGCAAGGGCAACACAAAGCACAACATCGAGATCGAGTATGTGCCCCGAAAGTCGGACGCAGGCATCAGCTCCGCCGACGCGCCCCGCAAGTTCAACATGAAGATGATATGA    (SEQ IDNO：1).
全长Sp35多肽的多肽序列如下：MLAGGVRSMPSPLLACWQPILLLVLGSVLSGSATGCPPRCECSAQDRAVLCHRKRFVAVPEGIPTETRLLDLGKNRIKTLNQDEFASFPHLEELELNENIVSAVEPGAFNNLFNLRTLGLRSNRLKLIPLGVFTGLSNLTKLDISENKIVILLDYMFQDLYNLKSLEVGDNDLVYISHRAFSGLNSLEQLTLEKCNLTSIPTEALSHLHGLIVLRLRHLNINAIRDYSFKRLYRLKVLEISHWPYLDTMTPNCLYGLNLTSLSITHCNLTAVPYLAVRHLVYLRFLNLSYNPISTIEGSMLHELLRLQEIQLVGGQLAVVEPYAFRGLNYLRVLNVSGNQLTTLEESVFHSVGNLETLILDSNPLACDCRLLWVFRRRWRLNFNRQQPTCATPEFVQGKEFKDFPDVLLPNYFTCRRARIRDRKAQQVFVDEGHTVQFVCRADGDPPPAILWLSPRKHLVSAKSNGRLTVFPDGTLEVRYAQVQDNGTYLCIAANAGGNDSMPAHLHVRSYSPDWPHQPNKTFAFISNQPGEGEANSTRATVPFPFDIKTLIIATTMGFISFLGVVLFCLVLLFLWSRGKGNTKHNIEIEYVPRKSDAGISSADAPRKFNMKMI  (SEQ ID NO：2).III.Sp35抗体
在一个实施方式中，本发明涉及Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。例如，本发明至少包括表3A和3E中显示的特定单克隆抗体的抗原结合结构域，及其片段、变体和衍生物。
表3A描述了与特定的全长噬菌体库衍生多肽相结合的Sp35多肽。如图3B所示，这些抗体与衍生自噬菌体展示库1的Fab片段具有相同的可变区(例如，表3A中的D05与表3B中的Li05具有相同的可变区，表3A中的D06与表3B中的Li06具有相同的可变区，等等)。通过本领域公知的方法对抗体进行了结合如表3A定义的Sp35片段的测试。
表3B-3E描述了指定单克隆抗体或Fab片段在各种分析(例如：荧光激活细胞分类(FACS)、免疫沉淀(IP)、Western印迹分析、免疫组化(IHC)和酶联免疫吸收分析(ELISA))中检测Sp35的能力。进行这些测试的具体方案在此描述或已公知，并为本领域普通技术人员所理解。表3B和3C中列举的杂交瘤衍生单克隆抗体可通过向小鼠注射可溶性Sp35，随后采用本领域公知并在此处描述的杂交瘤技术分离制备。表3B中列举的单克隆抗体和抗体Fab片段通过本领域已知技术从两个不同的噬菌体展示库进行分离。表3A
 Sp35片段  D03(Li03可变区)  D05(Li05可变区)  D06(Li06可变区)  D08(Li08可变区)  D11(Li03可变区)  D13(Li13可变区)  D33(Li33可变区)
 1-432大鼠Fc  +  +  +  -  +  -  -
 417-493大鼠Fc  -  +/-  +/-  -  -  -  -
 Ap-Sp35(1-419)  N/D  +  -/+  -/+  N/D  N/D  N/D
 Ap-Sp35(418-498)  N/D  -  -  -  N/D  N/D  N/D
  417-498人Fc  -  -  -  -  -  -  -
  417-503人Fc  -  -  -  -  -  -  -
  363-498人Fc  -  -  -  -  -  -  -
  244-498人Fc  -  -  -  -  -  -  -
Figure G2008800076855D00331
Figure G2008800076855D00341
Figure G2008800076855D00351
Figure G2008800076855D00371
Figure G2008800076855D00381
Figure G2008800076855D00391
Figure G2008800076855D00401
Figure G2008800076855D00421
表3D表3D(续)
Figure G2008800076855D00441
表3D(续)
Figure G2008800076855D00461
表3D(续)
Figure G2008800076855D00462
Figure G2008800076855D00471
Figure G2008800076855D00481
表3E
Figure G2008800076855D00511
表3E(续)
Figure G2008800076855D00512
Figure G2008800076855D00531
此处所用的术语“抗原结合结构域”包括特异性结合抗原上的表位(例如，Sp35的表位)的位点。抗体的抗原结合结构域通常包括至少部分的免疫球蛋白重链可变区和至少部分的免疫球蛋白轻链可变区。由这些可变区形成的结合位点决定了该抗体的特异性。
本发明更特别地涉及Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该Sp35抗体与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体结合相同Sp35表位。
本发明进一步涉及Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该Sp35抗体竞争性地抑制选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体与Sp35的结合。
本发明还涉及Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该Sp35抗体至少包含选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体的抗原结合区。
如下杂交瘤已于2006年12月27日保藏于美国菌种保藏中心(ATCC，Manassas，Va)：2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)，7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)。所保藏的杂交瘤2.P3B5.2生成单克隆抗体3B5.2，此处所述并保藏的杂交瘤7.P1D5.1.G9生成此处所述的单克隆抗体7P1D5.1.G9。该杂交瘤可参照本领域公知并在此处描述的方法进行培养。
特定的实施方式中，本发明涉及能与特定Sp35多肽片段或结构域特异性或优先结合的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。该Sp35多肽片段包括，但不限于，由SEQ ID NO：2的氨基酸34-532；34-417；34-425；34-493；66-532；66-417；66-426；66-493；66-532；417-532；417-425(Sp35碱性区)；417-493；417-532；419-493(Sp35Ig区)；或425-532组成或主要由其组成的Sp35多肽；或与SEQ ID NO：2的氨基酸34-532；34-417；34-425；34-493；66-532；66-417；66-426；66-493；66-532；417-532；417-425(Sp35碱性区)；417-493；417-532；419-493(Sp35Ig区)或425-532至少有70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性的Sp35变体多肽。
与本发明的特定抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，但不限于，包含Sp35的一个或多个富亮氨酸重复序列(LRR)，主要由其组成，或由其组成的片段。该片段的范例包括，包含SEQ ID NO：2的氨基酸66-89；66-113；66-137；90-113；114-137；138-161；162-185；186-209；210-233；234-257；258-281；282-305；306-329或330-353，主要由其组成，或由其组成的片段。还预期包括与SEQ ID NO：2的氨基酸66-89；66-113；90-113；114-137；138-161；162-185；186-209；210-233；234-257；258-281；282-305；306-329或330-353至少具有70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性的变体Sp35多肽的相应片段。
与本发明的特定抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，但不限于，包含Sp35的LRR侧翼的一个或多个富半胱氨酸区，主要由其组成，或由其组成的片段。该片段的范例包括，包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-64(N末端LRR侧翼区(LRRNT))，主要由其组成，或由其组成的片段，或包含SEQ ID NO：2的氨基酸363-416(C末端LRR侧翼区(LRRCT))，主要由其组成，或由其组成的片段，还预期包括与SEQ ID NO：2的氨基酸34-64和363-416至少具有70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性的变体Sp35多肽的相应片段。
如本领域所知，两个多肽之间的“序列一致性”可通过将一个多肽的氨基酸序列与另一个多肽的序列比较得到。此处讨论的任何特定多肽与另一多肽是否具有至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性可通过本领域已知的方法和计算机程序/软件(例如，但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711))进行测定。BESTFIT采用了Smith和Waterman，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)的局部同源性算法以发现两个序列间的最佳同源性片段。在采用BESTFIT或任何其它序列比对程序测定一个特定序列与如本发明所述的参考序列是否具有如95％的一致性时，该参数当然会设定为对参考多肽序列的全长计算相似度百分比且允许最大同源性差距为参考序列中总氨基酸数的5％。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的附加Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的41-525、SEQ ID NO：2的40-526、SEQ ID NO：2的39-527、SEQ ID NO：2的38-528、SEQ ID NO：2的37-529、SEQ ID NO：2的36-530、SEQ ID NO：2的35-531、SEQ ID NO：2的34-531、SEQ IDNO：2的46-520、SEQ ID NO：2的45-521、SEQ ID NO：2的44-522、SEQ ID NO：2的43-523以及SEQ ID NO：2的42-524，主要由其组成，或由其组成的片段。
其它与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的1-33、SEQ ID NO：2的1-35、SEQ ID NO：2的34-64、SEQID NO：2的36-64、SEQ ID NO：2的66-89、SEQ ID NO：2的90-113、SEQ ID NO：2的114-137、SEQ ID NO：2的138-161、SEQ ID NO：2的162-185、SEQ ID NO：2的186-209、SEQ ID NO：2的210-233、SEQ ID NO：2的234-257、SEQ ID NO：2的258-281、SEQ ID NO：2的282-305、SEQ ID NO：2的306-329、SEQ ID NO：2的330-353、SEQ ID NO：2的363-416、SEQ ID NO：2的417-424、SEQ ID NO：2的419-493、SEQ ID NO：2的494-551，主要由其组成，或由其组成的片段。
其它与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的1-33、SEQ ID NO：2的1-35、SEQ ID NO：2的1-64、SEQ IDNO：2的1-89、SEQ ID NO：2的1-113、SEQ ID NO：2的1-137、SEQID NO：2的1-161、SEQ ID NO：2的1-185、SEQ ID NO：2的1-209、SEQ ID NO：2的1-233、SEQ ID NO：2的1-257、SEQ ID NO：2的1-281、SEQ ID NO：2的1-305、SEQ ID NO：2的1-329、SEQ ID NO：2的1-353、SEQ ID NO：2的1-416、SEQ ID NO：2的1-424、SEQ IDNO：2的1-493、SEQ ID NO：2的1-551、SEQ ID NO：2的1-531和SEQ ID NO：2的1-532，主要由其组成，或由其组成的片段。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的34-64、SEQ ID NO：2的34-89、SEQ ID NO：2的34-113、SEQ ID NO：2的34-137、SEQ ID NO：2的34-161、SEQ ID NO：2的34-185、SEQ ID NO：2的34-209、SEQ ID NO：2的34-233、SEQ IDNO：2的34-257、SEQ ID NO：2的34-281、SEQ ID NO：2的34-305、SEQ ID NO：2的34-329、SEQ ID NO：2的34-353、SEQ ID NO：2的34-416、SEQ ID NO：2的34-424、SEQ ID NO：2的34-493以及SEQID NO：2的34-551，主要由其组成，或由其组成的片段。
其它与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的34-530、SEQ ID NO：2的34-531、SEQ ID NO：2的34-532、SEQ ID NO：2的34-533、SEQ ID NO：2的34-534、SEQ ID NO：2的34-535、SEQ ID NO：2的34-536、SEQ ID NO：2的34-537、SEQ IDNO：2的34-538、SEQ ID NO：2的34-539、SEQ ID NO：2的30-532、SEQ ID NO：2的31-532、SEQ ID NO：2的32-532、SEQ ID NO：2的33-532、SEQ ID NO：2的34-532、SEQ ID NO：2的35-532、SEQ IDNO：2的36-532、SEQ ID NO：2的30-531、SEQ ID NO：2的31-531、SEQ ID NO：2的32-531、SEQ ID NO：2的33-531、SEQ ID NO：2的34-531、SEQ ID NO：2的35-531以及SEQ ID NO：2的36-531，主要由其组成，或由其组成的片段。
此外，与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQID NO：2的36-64、SEQ ID NO：2的36-89、SEQ ID NO：2的36-113、SEQ IDNO：2的36-137、SEQ ID NO：2的36-161、SEQ ID NO：2的36-185、SEQ ID NO：2的36-209、SEQ ID NO：2的36-233、SEQ IDNO：2的36-257、SEQ ID NO：2的36-281、SEQ ID NO：2的36-305、SEQ ID NO：2的36-329、SEQ ID NO：2的36-353、SEQ ID NO：2的36-416、SEQ ID NO：2的36-424、SEQ ID NO：2的36-493以及SEQID NO：2的36-551，主要由其组成，或由其组成的片段。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ IDNO：2的36-530、SEQ ID NO：2的36-531、SEQ ID NO：2的36-532、SEQ ID NO：2的36-533、SEQ ID NO：2的36-534、SEQ ID NO：2的36-535、SEQ ID NO：2的36-536、SEQ ID NO：2的36-537、SEQ IDNO：2的36-538以及SEQ ID NO：2的36-539，主要由其组成，或由其组成的片段。
其它与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，但不限于，包含氨基酸SEQ ID NO：2的417-493、SEQ ID NO：2的417-494、SEQ ID NO：2的417-495、SEQ ID NO：2的417-496、SEQ ID NO：2的417-497、SEQ ID NO：2的417-498、SEQ ID NO：2的417-499、SEQ ID NO：2的417-500、SEQ ID NO：2的417-492、SEQ ID NO：2的417-491、SEQ ID NO：2的412-493、SEQ ID NO：2的413-493、SEQ ID NO：2的414-493、SEQ ID NO：2的415-493、SEQ ID NO：2的416-493、SEQ ID NO：2的411-493、SEQ ID NO：2的410-493、SEQ ID NO：2的410-494、SEQ ID NO：2的411-494、SEQ ID NO：2的412-494、SEQ ID NO：2的413-494、SEQ ID NO：2的414-494、SEQ ID NO：2的415-494、SEQ ID NO：2的416-494、SEQ ID NO：2的417-494以及SEQ ID NO：2的418-494，主要由其组成，或由其组成的片段。
在附加实施方式中，与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，包含Sp35或该多肽的片段、变体、或衍生物，主要由其组成，或由其组成的Sp35多肽。该多肽特别包含下列多肽序列：ITX1X2X3(SEQ ID NO：287)、ACX1X2X3(SEQ ID NO：288)、VCX1X2X3(SEQ ID NO：289)和SPX1X2X3(SEQ ID NO：290)(其中X1为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，X2为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，X3为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸)，主要由上述序列组成，或由上述序列组成。例如，与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，包含下列多肽序列：SPRKH(SEQ ID NO：291)、SPRKK(SEQ IDNO：292)、SPRKR(SEQ ID NO：293)、SPKKH(SEQ ID NO：294)、SPHKH(SEQ ID NO：295)、SPRRH(SEQ ID NO：296)、SPRHH(SEQID NO：297)、SPRRR(SEQ ID NO：298)、SPHHH(SEQ ID NO：299)SPKKK(SEQ ID NO：300)、LSPRKH(SEQ ID NO：301)、LSPRKK(SEQ ID NO：302)、LSPRKR(SEQ ID NO：303)、LSPKKH(SEQ IDNO：304)、LSPHKH(SEQ ID NO：305)、LSPRRH(SEQ ID NO：306)、LSPRHH(SEQ ID NO：307)、LSPRRR(SEQ ID NO：308)、LSPHHH(SEQ ID NO：309)LSPKKK(SEQ ID NO：310)、WLSPRKH(SEQ TDNO：311)、WLSPRKK(SEQ TD NO：312)、WLSPRKR(SEQ TDNO：313)、WLSPKKH(SEQ TD NO：314)、WLSPHKH(SEQ TDNO：315)、WLSPRRH(SEQ TD NO：316)、WLSPRHH(SEQ TDNO：317)、WLSPRRR(SEQ TD NO：318)、WLSPHHH(SEQ IDNO：319)WLSPKKK(SEQ ID NO：320)，主要由上述序列组成，或由上述序列组成的片段。该Sp35多肽在Sp35的Ig结构域包含了碱性“RKH环”(精氨酸-赖氨酸-组氨酸氨基酸456-458)。包含碱性三肽的附加Sp35肽为ITPKRR(SEQ ID NO：321)、ACHHK(SEQ IDNO：322)和VCHHK(SEQ ID NO：323)。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，包含Sp35或该多肽的片段、变体、或衍生物，主要由其组成，或由其组成的Sp35多肽。特别地，该肽包含下列多肽序列：X4X5RKH(SEQ ID NO：324)、X4X5RRR(SEQ ID NO：325)、X4X5KKK(SEQ ID NO：326)、X4X5HHH(SEQ IDNO：327)、X4X5RKK(SEQ ID NO：328)、X4X5RKR(SEQ ID NO：329)、X4X5KKH(SEQ ID NO：330)、X4X5HKH(SEQ ID NO：331)、X4X5RRH(SEQ ID NO：332)和X4X5RHH(SEQ ID NO：333)(其中X4和X5是任何氨基酸)，主要由上述序列组成，或由上述序列组成。
在其它实施方式中，与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，包含Sp35或该多肽的片段、变体、或衍生物，主要由其组成，或由其组成的Sp35多肽。特别地，该多肽包含下列多肽序列：ITX6X7X8(SEQ IDNO：334)、ACX6X7X8(SEQ ID NO：335)、VCX6X7X8(SEQ ID NO：336)和SPX6X7X8(SEQ ID NO：337)(其中X6为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸，X7为任何氨基酸，X8为赖氨酸，精氨酸，组氨酸，谷氨酸或天冬氨酸)，主要由上述序列组成，或由上述序列组成。例如，包含下列多肽序列SPRLH(SEQ ID NO：338)，主要由该序列组成，或由该序列组成的多肽。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的Sp35肽片段包括，包含Sp35或其衍生物的Ig结构域的氨基酸452-458(其中氨基酸452为色氨酸或苯丙氨酸残基)，主要由其组成，或由其组成的肽的Sp35多肽。
与本发明的特定抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物相结合的其它Sp35肽片段包括，包含Sp35碱性结构域的肽，主要由其组成，或由其组成的Sp35多肽。特别地，该肽包含下列多肽序列：RRARIRDRK(SEQ ID NO：339)、KKVKVKEKR(SEQ IDNO：340)、RRLRLRDRK(SEQ ID NO：341)、RRGRGRDRK(SEQ IDNO：342)和RRIRARDRK(SEQ ID NO：343)，主要由上述序列组成，或由上述序列组成。
其它的示范性可溶性Sp35多肽，以及用于生产本发明抗体或抗体片段的该种分子的制备方法和材料可参见国际专利申请PCT/US2004/008323，其全文在此引入作为参考。
制备抗体的方法在本领域公知并在此描述。一旦制备得到对各种片段或对无信号序列的全长Sp35的抗体，该抗体或抗原结合片段所结合的Sp35的氨基酸或表位可通过此处所述并为本领域公知的表位定位方案(例如，在″Chapter 11-Immunology，″Current Protocols in Molecular Biology，Ed.Ausubel等人.，v.2，JohnWiley & Sons，Inc.(1996)中描述的双抗体夹心ELISA)进行测定。其它的表位定位方案可参见Morris，G.Epitope Mapping Protocols，New Jersey：Humana Press(1996)，其全文在此引入作为参考。表位定位还可以采用现有的商业方法(即，ProtoPROBE，Inc.(Milwaukee，Wisconsin))进行。
此外，可对生产得到的与Sp35任意部分结合的抗体作为Sp35拮抗剂的能力进行筛选，从而促进神经突生长、神经元和少突细胞存活、扩增和分化并促进髓鞘形成。可采用实施例10和11中描述的方法筛选针对少突细胞神经元存活的抗体。此外，可采用实施例9中的方法筛选抗体促进髓鞘形成的能力。最后，可采用实施例7描述的方法筛选抗体促进少突细胞扩增和分化以及神经突生长的能力。本发明抗体的其它拮抗功能可采用此处实施例中的其它测定方法进行。
在其它实施方式中，本发明包括特异性或优先结合Sp35的至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位包含SEQ ID NO：2的至少四至五个、至少七个、至少九个、或介于至少约15至约30个氨基酸，主要由其组成或由其组成。所述的SEQ ID NO：2的给定表位的氨基酸可以是(但并非必需)邻近或线性的。在特定的实施方式中，Sp35的至少一个表位包括在细胞表面表达的或作为可溶性片段(例如，融合至IgG Fc区)的Sp35胞外结构域形成的非线性表位，主要由其组成，或由其组成。因此，在特定的实施方式中，Sp35的至少一个表位包括SEQ ID NO：2的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少25个、介于约15至约30个、或至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个邻近或非邻近氨基酸，主要由其组成，或由其组成，其中非邻近氨基酸通过蛋白折叠形成表位。
在其他实施方式中，本发明包括特异性或优先结合Sp35至少一个表位的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该表位在上述的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个SEQ ID NO：2的邻近或非邻近氨基酸的基础上包括修饰蛋白的附加部分(例如，可包括糖部分，从而使Sp35抗体能够对修饰目标蛋白以高于未修饰蛋白的亲和性进行结合)，主要由其组成，或由其组成。替代性地，该Sp35抗体完全不与未经修饰的该目标蛋白相结合。
在特定方面，本发明包括了通过特征为解离常数(KD)小于所述参考单克隆抗体KD的亲和性特异性结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽的抗体，其抗原结合片段、变体或衍生物。
在特定实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物特异性地结合上述Sp35或片段或变体的至少一个表位，即，与该表位的结合比它与相关的、相似的、同源的或是类似的表位更容易结合；竞争性地抑制(自身与上述特定Sp35或片段或变体的表位特异性或优先结合的)参考抗体的结合；或通过特征为解离常数KD小于约5x10-2M、约10-2M、约5x10-3M、约10-3M、约5x10-4M、约10-4M、约5x-5-5M、约10-5M、约5x10-6M、约10-6M、约5x10-7M、约10-7M、约5x10-8M、约10-8M、约5x10-9M、约10-9M、约5x10-10M、约10-10M、约5x10-11M、约10-11M、约5x10-12M、约10-12M、约5x10-13M、约10-13M、约5x10-14M、约10-14M、约5x10-15M或约10-15M的亲和性与上述Sp35或片段或变体的至少一个表位相结合。在特定的方面，该抗体或其片段相对于鼠Sp35多肽或其片段优先结合人Sp35多肽或其片段。
在抗体结合解离常数上下文所用的术语“约”允许了用于测量抗体亲和性的方法的内在变差程度。例如，依据所用仪器的精度，基于所测样本的样本数的标准误差，以及常规误差，术语约“10-2M”可包括，如从0.05M至0.005M。
在特定实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，以解离速率(k(off))小于或等于5X10-2/秒，10-2/秒，5X10-3/秒或10-3/秒，与Sp35多肽或其片段或变体相结合。此外，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物，以解离速率(k(off))小于或等于5X10-4/秒、10-4/秒、5X10-5/秒、or 10-5/秒5X10-6/秒、10-6/秒、5X10-7/秒或10-7/秒，与Sp35多肽或其片段或变体相结合。
在其它实施方式中，本发明的抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物以大于或等于103M-1/秒、5X103M-1/秒，104M-1/秒或5X104M-1/秒的结合速率(k(on))与Sp35多肽或其片段或变体相结合。替代性地，本发明的抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物以大于或等于105M-1/秒、5X105M-1/秒，106M-1/秒或5X106M-1/秒或107M-1/秒的结合速率(k(on))与Sp35多肽或其片段或变体相结合。
在各实施方式中，此处所述的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物为Sp35活性的拮抗剂。在特定实施方式中，例如，拮抗剂Sp35抗体与神经元上表达的Sp35的结合阻断了髓磷脂相关的神经突生长抑制或神经元细胞死亡。在其它实施方式中，该Sp35抗体与少突细胞上表达的Sp35的结合阻断了少突细胞生长或分化抑制，或阻断了CNS神经元的髓鞘脱失或髓鞘形成障碍。
除非另行指出，此处所用的“其片段”指与一种抗原结合片段有关的抗体，即，与该抗原特异性结合的该抗体的部分。在一个实施方式中，Sp35抗体(如本发明抗体)为一种双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体，例如对超过一个表位具有结合特异性(例如，在相同抗原具有一个以上抗原或一个以上表位)的双特异性抗体、微抗体、结构域删除抗体或融合蛋白。在一个实施方式中，双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体对此处所述的目标多肽(例如，Sp35)的至少一个表位具有至少一个特异性的结合结构域。在另一个实施方式中，双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体对目标多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合结构域，或对药物或毒素具有至少一个目标结合结构域。在另一个实施方式中，双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体对此处所述的目标多肽的一个表位具有至少一个特异性的结合结构域域，或对一种前药具有至少一个特异性的结合结构域。双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体可以是一种四价抗体，其带有两个对此处所述的目标多肽的表位具特异性的目标结合结构域，以及两个对第二目标具有特异性的目标结合结构域。因此，四价双特异性Sp35抗体、结合多肽或抗体可以对每种特异性呈二价。
如本领域普通技术人员所知，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可包含介导一种或多种效应器功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可激活该补体系统。补体的激活对于细胞病原体的调理和溶解非常重要。补体的激活还能刺激炎症应答，并在自体免疫超敏反应中涉及。此外，抗体通过Fc区结合各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点与细胞上的Fc受体(FcR)相结合。Fc受体有多种，对多类别的抗体具有特异性，包括IgG(gamma受体)、IgE(epsilon受体)、IgA(alpha受体)和IgM(mu受体)。抗体与细胞表面上Fc受体的结合可引发一系列重要的和多样的生物应答，包括抗体包裹粒子吞没和破坏，免疫复合物的清除，杀伤细胞对抗体包裹的目标细胞的溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒，或ADCC)，炎症介质的释放，胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
相应地，本发明特定的实施方式包括Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区结构域的部分被删除或修改，从而提供所需的生化特性，例如降低的效应功能，形成非共价二聚物的能力，提高的肿瘤位点定位能力，降低的血浆半衰期，或与整体相比提高的血浆半衰期，具有大致相同免疫原性的未改变的抗体。例如，此处所述的诊断和治疗方法中采用的特定抗体为结构域缺失抗体，其包含了与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但缺失了一个或多个重链结构域的至少一部分。例如，在特定的抗体中，修饰抗体的恒定区中的一个完整结构域将被删除，例如，CH2结构域的全部或部分将被删除。
在此处所述的特定Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，可采用本领域已知技术对Fc部分进行突变以减少效应器功能。例如，恒定区结构域的删除或灭活(通过点突变或其它方法)可减少Fc受体结合与循环修饰抗体的结合，从而提高肿瘤定位。在其它情况下，恒定区的修饰与本发明的适当补体结合相一致从而减少共轭细胞毒素的血浆半衰期和非特异性结合。其它对恒定区的修饰可用于修饰二硫键或寡糖部分，从而由于抗原特异性或抗体灵活性的提高而增强定位。通过修饰得到的生理规律、生物相容性以及其它生物化学效应(例如肿瘤定位、生物分布以及血清半衰期)可通过公知的免疫技术在不采取不正当试验的情况下进行简单测定和定量。
本发明的Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可采用本领域已知技术由完整前体或亲代抗体制备。示范性技术在此作了更具体的描述。
在特定实施方式中，Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变和恒定区均为完全人源的。全人源抗体可通过本领域已知的且在此处描述的技术进行制备。例如，针对特定抗原的完全人源抗体可通过向经改造在应答抗原性攻击时生产该种抗体，且其内源性基因座被失活的转基因动物给用抗原进行制备。用于制备该种抗体的示范性技术参见美国专利：6,150,584；6,458,592；6,420,140，其全文在此引入作为参考。其它技术已为本领域所知。完全人源抗体可通过各种展示技术进行类似的制备，例如，在此处得到更具体描述的噬菌体展示或其它病毒展示系统。
本发明的Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域已知的技术进行制备或生产。在特定的实施方式中，抗体分子或其片段可进行“重组生产”，即，采用重组DNA技术进行生产。用于制备抗体分子或其片段的示范性技术将在本文其它部分作更具体的讨论。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括经修饰的衍生物，例如，通过任何类型的分子与抗体的共价连接以使共价连接不妨碍该抗体与其同源表位的特异性结合。例如，但并非意在限制，该抗体衍生物包括通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
在特定的实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物不会引发待治疗动物体内(例如，人体内)的有害免疫应答。在一个实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域认可的技术进行修饰以降低其免疫原性。例如，可对抗体进行人源化、灵长源化、去免疫化或可制备嵌合抗体。这些抗体类型来自于保留或基本上保留了父代抗体的抗原结合功能，但在人体内具有更低免疫原性的非人源抗体，通常为鼠或灵长动物抗体。这可通过多种方法实现，包括(a)将完整非人类可变结构域嫁接至人恒定区以生成嵌合抗体；(b)将一个或多个非人类决定簇互补区(CDRs)的至少部分嫁接至保留或未保留关键框架残基的人框架和恒定区；或(c)移植整个非人类可变结构域，但通过替换表面残基以类人切片将其“包覆”。该类方法参见Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.57：6851-6855(1984)；Morrison等人，Adv.Immunol.44：65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science239：1534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.25：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.57：169-217(1994)，以及美国专利5,585,089，5,693,761，5,693,762和6,190,370，其全文在此引入作为参考。
去免疫化还可用于降低抗体的免疫原性。此处所用的术语“去免疫化”包括对抗体进行改造以修饰T细胞表位(例如，参见WO9852976A1，WO0034317A2)。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行分析，来自各V区的人T细胞表位“图谱”显示了与序列内的决定簇互补区(CDRs)和其它关键残基相关的表位定位。对来自于T细胞表位图谱的单独T细胞表位进行分析，以在不轻易改变终抗体活性的情况下鉴定选择性的氨基酸替代物。经设计得到了一系列包括氨基酸替代物组合物的的VH和VL序列，随后这些序列被整合进入一系列的结合多肽(例如，Sp35特异性抗体或其免疫特异性片段)以用于此处所述的诊断和治疗方法，并对功能进行测验。通常可生成和测验12-24个变体抗体。然后将包含修饰后的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进入表达载体，将该后续质粒导入细胞系进行全抗体生产。对该类抗体通过适当的生化和生物测定进行比较，并鉴定得到最佳变体。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片断、变体或衍生物可通过本领域已知的任何方法生成。针对目标抗原的多克隆抗体可通过各种本领域公知的方法生产。例如，一种Sp35抗体(如一种Sp35特异性抗体或其免疫特异性片段等结合多肽)可给用至各种宿主动物，包括但不限于，兔子、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等，以诱导包含了对该抗原特异的多克隆抗体的血浆的生产。依据宿主种类不同，各种佐剂可用于提高免疫应答，其包括但不限于，弗氏试剂(完全或不完全)、矿物凝胶(如氢氧化铝)、表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚以及潜在有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。该类佐剂已为本领域熟知。
单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括杂交瘤、重组和噬菌体展示技术的应用及其组合。例如，单克隆抗体可通过本领域已知的杂交瘤技术进行生产，该技术还在许多文献中得到描述，例如，Harlow等人，Antibodies：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.(1988)；Hammerling等人，于：Monoclonal Antibodies and T-CeIlHybridomas Elsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述文献在此全文引入作为参考)。此处所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”指由单个克隆(包括真核，原核或噬菌体克隆)得到的抗体，而非它的生产方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。单克隆抗体可采用Sp35敲除小鼠生产以增加表位识别的区域。单克隆抗体可通过本领域已知的多种技术进行制备，包括此处所述的杂交瘤和重组和噬菌体展示技术的应用。
在一个实施方式中，采用本领域认可的方案，可通过多次皮下或腹腔注射相关抗原(例如，纯化的肿瘤相关的抗原，如包含该种抗原的Sp35或细胞或细胞萃取物)和佐剂在哺乳动物体内产生抗体。该免疫作用通常可引发包含了从激活的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应抗体的免疫应答。尽管可从动物血浆获取所得的抗体以进行多克隆制备，通常可从脾，淋巴结或外周血分离单独的淋巴细胞以进行单克隆抗体(MAbs)的均一制备。优选地，该淋巴细胞脾获取。
在该公知方法中(Kohler等人，Nature 256：495(1975))，该取自注射了抗原的哺乳动物的相对短命或死亡的淋巴细胞与一个永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)相融合，从而得到了永生的并能生产B细胞的转基因编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。所得的杂交物通过挑选和稀释分离得到单独遗传株系，对包含了能够形成单独抗体的特定基因的单独株系进行再生。它们可生产针对目标抗原的相似抗体，并由于其单纯的遗传亲缘而被称为“单克隆”。
将由此制备的杂交瘤细胞接种和培养至适当的培养基中，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合的，亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域的技术人员均了解用于杂交瘤形成，挑选和培养的试剂，细胞系和介质可从多个来源购买，且已充分建立了标准化的方案。通常对杂交瘤细胞生长的培养基进行分析以测定针对目标抗原的单克隆抗体的生产。优选地，由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀，放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸收分析(ELISA)等体外分析进行测定。当杂交瘤经鉴定能够生产具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体后，该克隆可通过有限稀释法进行亚克隆并以标准方法培养(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice，Academic Press，pp 59-103(1986))。由亚克隆分泌的单克隆抗体可从培养基、腹水或血浆中通过蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析等传统方法进行纯化。
识别特定表位的抗体片段可通过已知技术生成。例如，可采用木瓜蛋白酶(生产Fab片段)或胃蛋白酶(生产F(ab′)2片段)等酶通过蛋白水解裂解免疫球蛋白分子获得Fab和F(ab′)2片段。F(ab′)2片段包含了可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。
本领域技术人员还可理解编码抗体或抗体片段(例如，抗原结合位点)的DNA还可以从抗体库(例如噬菌体展示库)获得。该种噬菌体可特别用于展示由抗体库或组合抗体库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达能够结合目标抗原的抗原结合结构域的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择和鉴别。在这些方法中使用的噬菌体通常为丝状噬菌体，包括fd和M13，结合结构域可由Fab，Fv OEDAB(单独轻或重链Fv区)或二硫键稳定的Fv抗体结构域融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的噬菌体进行表达。示范性方法可参见，例如，EP 368 684 B1；美国专利5,969,108，Hoogenboom，H.R.以及Chames，Immunol.Today 21：371(2000)；Nagy等人.Nat.Med.5：801(2002)；Huie等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2682(2001)；Lui等人.，J.MoI.Biol.375：1063(2002)，分别在此引入作为参考。许多文献(例如，Marks等人，Bio/Technology 70：779-783(1992))均已描述了通过链替换，以及作为构建大型噬菌体库的策略的组合感染和体内重组对高亲和性人抗体的生产。在另一实施方式中，可采用核糖体展示替代噬菌体作为展示平台(例如，参见Hanes等人，Nat.Biotechnol 75：1287(2000)；Wilson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3750(2001)；或Irving等人，J.Immunol Methods 248：31(2001))。在另一实施方式中，可通过细胞表面库筛选抗体(Boder等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：10701(2000)；Daugherty等人.，J.Immunol.Methods 243：211(2000))。该类方法可为用于单克隆抗体的分离和后续克隆的传统杂交瘤技术提供替代方法。
在噬菌体展示方法中，功能性抗体区被展示在携带了对其编码的多聚核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。例如，可从cDNA库(例如，人或鼠淋巴组织cDNA库)或合成cDNA库扩增编码VH和VL区的DNA序列。在特定实施方式中，该编码VH和VL区的DNA在PCR中通过scFv接头相连接并被克隆进入一个噬菌粒载体(例如，p CANTAB或pComb 3HSS)。将该载体导入E.coli并以辅助噬菌体感染E.coli。这些方法中常用的噬菌体通常为包括fd和M13的丝状噬菌体，且VH或VL区通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达能够结合目标抗原(即，Sp35多肽或其片段)的抗原结合区的噬菌体可通过抗原(例如，采用标记抗原或者固体表面或珠子结合或捕获的抗原)进行选择和鉴别。
可用于制备该抗体的噬菌体展示方法的附加示范可参见Brinkman等人，J.Immunol.Methods 752：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods 754：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.24：952-958(1994)；Persic等人，Gene 757：9-18(1997)；Burton等人，Advances in Immunology 57：191-280(1994)；PCT公布PCT/GB91/01134；PCT公布WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO95/20401；以及美国专利5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；其全文在此引入作为参考。
如上述参考文献所述，在噬菌体筛选后，可从该噬菌体分离该抗体编码区并用于生成包括人抗体或任何其它目标抗原结合片段的完整抗体，并在包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌的目标宿主中表达。例如，用于重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术也可采用本领域已知的技术，例如参见PCT公布WO 92/22324；Mullinax等人，BioTechniques 12(6)：864-869(1992)；以及Sawai等人，AJRI 34：26-34(1995)；和Better等人，Science 240：1041-1043(1988)(所述参考文献全文引入作为参考)。
可用于生产单链Fvs和抗体的技术示范可参见美国专利4,946,778和5,258,498；Huston等人，Methods in Enzymology205：46-88(1991)；Shu等人，PNAS 90：7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science 240：1038-1040(1988)。对于某些用途，包括抗体在人体的体内应用和体外检测分析，优选使用嵌合、人源化或人抗体。嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如一种包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法在已为本领域所知。例如，参见Morrison，Science229：1202(1985)；Oi等人，BioTechniques 4：214(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods 725：191-202(1989)；美国专利5,807,715；4,816,567；和4,816397，其全文在此引入作为参考。人源化抗体指能够与具有一个或多个来自非人类决定簇互补区(CDRs)和人免疫球蛋白分子框架区的目标抗原相结合的由非人类抗体衍生的抗体分子。人框架区的框架残基通常可被CDR供体抗体的相应残基所替代从而改变，优选提高抗原结合。这些框架替换可通过本领域公知的方法进行鉴定，例如，可通过对CDR和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，可通过序列比较鉴定在特定位点的反常框架残基。(例如，参见Queen等人，美国专利5,585,089；Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，其全文在此引入作为参考)。抗体可通过多种本领域已知的技术进行人源化，例如，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公布WO 91/09967；美国专利5,225,539；5,530,101；和5,585,089)，镶饰或重塑(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人.，Protein Engineering 7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，PNAS97：969-973(1994))，以及链替换(美国专利5,565,332，其全文引入作为参考)。
完整人类抗体用于人类患者的治疗由其理想。人类抗体可通过本领域已知的多种方法制备，包括上述采用来自人免疫球蛋白序列的抗体库进行的噬菌体展示方法。还可参见美国专利4,444,887和4,716,111；以及PCT公布WO 98/46645，WO98/50433，WO98/24893，WO98/16654，WO96/34096，WO96/33735，和WO91/10741；分别全文引入作为参考。
人类抗体还可采用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但能表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行生产。例如，人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物可随机导入或通过同源重组进入小鼠胚胎干细胞。除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多样区导入鼠胚胎干细胞。鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可通过同源重组导入的人免疫球蛋白基因座进行单独或同时的非功能性修饰。特别地，JH区纯合子的删除防止了内源抗体的生产。扩增该修饰后的胚胎干细胞并注射进入胚泡以生产亲和小鼠。饲养该嵌合小鼠以生产表达人抗体的纯合子型后代。该转基因小鼠以选择抗原(例如，所需目标多肽的全部或部分)通过常规方式进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可采用常规杂交瘤技术从免疫后的转基因小鼠获取。转基因小鼠包含的人免疫球蛋白转基因在B-细胞分化时重排，随后进行类型转换和体细胞突变。因此，通过该种技术可生产治疗有效的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。该技术生产人类抗体的综述可参见Lonberg和Huszar Int.Rev.Immunol.73：65-93(1995)。对技术用于生产人类抗体和人类单克隆抗体以及生产该类抗体的方案的具体讨论可参见PCT公布WO 98/24893；WO 96/34096；WO96/33735；美国专利5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318和5,939,598等，其全文在此引入作为参考。此外，可委托Abgenix，Inc.(Freemont，Calif.)和GenPharm(San Jose，Calif.)等公司通过与上述类似的技术提供针对选定抗原的人类抗体。
识别选定表位的完整人类抗体可通过一种称为“定向选择”的技术进行生产。在该方法中采用一种选定的非人类单克隆抗体(例如，小鼠抗体)引导识别相同表位的完整人类抗体的筛选。(Jespers等人，Bio/Technology 72：899-903(1988))。还可参见美国专利5,565,332，其全文在此引入作为参考)。
此外，针对本发明目标多肽的抗体可通过本领域技术人员公知的技术用于生成“模仿”目标多肽的抗个体型抗体(例如，参见Greenspan和Bona，FASEB J.7(5)：437437(1989)和Nissinoff，J.Immunol.147(8)：2429-2438(1991))。例如，结合和竞争性抑制多肽多聚化和/或本发明多肽与配体的结合的抗体可用于生成”模仿″该抗体多聚化和/或结合区，从而结合和中和多肽和/或其配体的抗独特型。该中和性抗独特型或该抗独特型的Fab片段可用于在治疗领域中和多肽配体。例如，该抗独特型抗体可用于结合所需的目标多肽和/或结合其配体/受体，从而阻断其生物活性。
在另一实施方式中，编码所需单克隆抗体的DNA可采用常规方法简单分离和测序(例如，可采用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)。分离的亚克隆杂交瘤细胞可用作该DNA的优选来源。该DNA在分离后可导入表达载体，随后将后者转染进入不生产免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更具体的说，如1995年1月25日Newman等人提交的美国专利5,658,570所述(在此引入作为参考)，该分离DNA(如此处所述，可为合成DNA)可用于为制备抗体克隆恒定和可变区序列。简要而言，将来自该选定细胞的RNA遗传提取物转化为cDNA，然后以Ig特异性引物进行PCR扩增。能够完成该目的的合适引物还可参见美国专利5,658,570。如下文所将详述，可相对大量培养该表达所需抗体的转化细胞以提供临床或商业所需的免疫球蛋白。
在一个实施方式中，本发明的Sp35抗体包含一种抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDRs。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDRs。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDRs。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDRs。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDRs。示范性抗体分子至少包含一个能包含在此处所述的对象Sp35抗体的CDR。
在特定的实施方式中，该重链和/或轻链可变区的氨基酸序列可通过本领域公知的方法检查以确定决定簇互补区(CDRs)的序列，例如，可通过比较已知氨基酸序列和其它重链和轻链可变区以确定高可变序列区。可采用常规重组DNA技术将一个或多个CDRs插入框架区，例如，插入人框架区以将非人类抗体人源化。该框架区可以是天然存在的或为共有框架区，且优选人框架区(例如，参见Chothia等人.，J.MoI.Biol.278：457-479(1998)的人框架区列表)。优选地，由框架区和CDRs的组合生成的多聚核苷酸编码一种能与所需多肽(例如，SP35)的至少一个表位特异性结合的抗体。优选地，在框架区内可进行一个或多个氨基酸替换，该氨基酸替换优选能够提高抗体与其抗原的结合。此外，该类方法可用于对参与链间二硫键的半胱氨酸残基的一个或多个可变区进行氨基酸替换或删除，从而生成缺失一个或多个链间二硫键的抗体分子。其它对多聚核苷酸的改造在本发明和本领域的现有技术范围内。
此外，可采用通过拼接具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子基因和具有适当生物活性的人类抗体分子基因生产“嵌合抗体”的技术(Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci 81：851-855(1984)；Neuberger等人，Nature 572：604608(1984)；Takeda等人，Nature314：452-454(1985))。此处所用的嵌合抗体是一种抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，例如包含了鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体，如人源化抗体。
此外，可用美国专利4,694,778；Bird，Science242：423-442(1988)；Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA55：5879-5883(1988)；以及Ward等人，Nature 334：544-554(1989)描述的单链抗体生产技术来生产单链抗体。可通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段生成单链抗体。也可采用在大肠杆菌内组装功能性Fv片段的技术(Skerra等人，Science 242：1038-1041(1988))。
本发明的另一实施方式包括了在不能生成内源免疫球蛋白的转基因动物(例如，小鼠)体内生成人或实质人抗体(例如，参见美国专利6,075,181，5,939,598，5,591,669和5,589,369，分别在此引入作为参考)。例如，据描述在嵌合和胚系突变小鼠中的抗体重链结合区的纯合子缺失可导致内源抗体生产的完全抑制。人免疫球蛋白基因阵列向该胚系突变小鼠的转移可导致在抗原攻击下的人抗体生产。另一使用SCID小鼠生成人抗体的优选方法可参见美国专利5,811,524，该文献在此引入作为参考。应当可以理解与这些人抗体相关的遗传材料也可以依照此处所述进行分离和操作。
用于生成重组抗体的另一高效方法可参见Newman，Biotechnology 10：1455-1460(1992)。该技术可特别生成包含了猴可变结构域和人恒定序列的灵长源化抗体。该参考文献在此全文引入作为参考。此外，该技术还可参见共同受让的美国专利5,658,570，5,693,780和5,756,096，该文献在此引入作为参考。
在另一实施方式中，可通过显微操作选择淋巴细胞并分离可变基因。例如，可从免疫哺乳动物分离外周血单核细胞并在体外培养7天。筛选该培养物以获得达到筛选标准的IgGs。可对阳性孔的细胞进行分离。可通过FACS或补体介导的溶血空斑检测的鉴定分离得到生产Ig的单独B细胞。可通过显微操作将生成Ig的B细胞转移至试管，并可采用RT-PCR等方法扩增VH和VL基因。将VH和VL基因克隆至抗体表达载体并转染进入细胞(例如，真核或原核细胞)以进行表达。
替代性地，可采用本领域技术人员公知的技术筛选抗体生成细胞系并进行培养。该类技术可从各种试验手册和出版物中得到描述。在此方面，适用于本发明的技术的描述可见下文，并可参见Current Protocols in Immunology，Coligan等人.，Eds.，GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and Sons，New York(1991)，其内容全文(包括附录)在此引入作为参考。
用于此处所述的诊断和治疗方法的抗体可通过本领域已知的任何抗体合成方法，特别是化学合成方法或是优选的此处所述的重组表达技术进行制备。
在一个实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物包含了一种其中一个或多个结构域被部分或全部删除的合成恒定区(“结构域缺失抗体”)。在特定实施方式中，相容性修饰抗体包含了整个CH2结构域被去除的结构域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在其它实施方式中可采用短连接肽替换缺失结构域以提供可变区的灵活性和自由移动性。本领域的技术人员将可以理解由于CH2结构域对抗体分解率的调节属性，因而特别优选该构建体。结构域缺失构建体可从编码IgG1人恒定区的载体(例如，来自Biogen IDEC Incorporated)获得(例如，参见WO02/060955 A2和WO02/096948A2，其全文在此引入作为参考)。这些示范性载体经工程改造缺失了CH2结构域并提供了表达区域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在特定实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物为微抗体。微抗体可通过本领域已有描述的方法进行制备(例如，参见美国专利5,837,821或WO 94/09817A1，其全文在此引入作为参考)。
在一个实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物包含了一种具有能支持单体亚基间结合的数个或者甚至单个氨基酸缺失或替换的免疫球蛋白重链。例如，在CH2结构域选定部位的单个氨基酸突变可足以降低Fc结合并从而增强肿瘤定位。类似地，可能仅需要删除控制带调节效应功能(例如，补体结合)的一个或多个恒定区结构域。该恒定区的部分缺失可能提高该抗体的选定特性(血浆半衰期)，同时保留其它与对象恒定区结构域相关的所需功能的完整性。此外，如上文指出，所披露抗体的恒定区可通过对增强所得构建体作用的一个或多个氨基酸的突变或替换进行合成。就此而言，可以在破坏保守结合位点(例如，Fc结合)的活性的同时充分保留修饰抗体的构型和免疫原性作用。另一实施方式包含了向恒定区添加一个或多个氨基酸以增强所需的特性(例如效应功能)或者提供更多细胞毒素或糖附着。在该类实施方式中可能需要插入或复制来自选定恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了包含此处所述的抗体分子(例如，VH区和或VL区)的变体(包括衍生物)，主要由其组成，或由组成的抗体，该抗体或其片段免疫特异性结合Sp35多肽或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可用于在编码Sp35抗体的核苷酸序列引入突变，包括但不限于，可导致氨基酸替换的定点突变和PCR介导的突变。优选地，该变体(包括衍生物)相对参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3编码少于50个氨基酸替换、少于40个氨基酸替换、少于30个氨基酸替换、少于25个氨基酸替换、少于20个氨基酸替换、少于15个氨基酸替换、少于10个氨基酸替换、少于5个氨基酸替换、少于4个氨基酸替换、少于3个氨基酸替换、或少于2个氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是以具有类似电荷侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。替代性地，该突变可沿全部或部分编码序列进行(例如饱和突变)，对所得的突变进行生物活性筛选以鉴定保留活性(例如，结合Sp35多肽的能力)的突变体。
例如，可以仅在抗体分子的框架区或CDR区引入突变。所引入的突变可以是同义或中性错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或具有很少的影响。这些类型的突变可能对优化密码子用途或提高杂交瘤的抗体生产非常有用。替代性地，非中性错义突变可改变一种抗体结合抗原的能力。多数同义或中性错义突变的位点可能在框架区中，而多数非中性错义突变的位点可能在CDR中，尽管这并非绝对。本领域的技术人员均能设计和测试具有所需属性(例如未改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如，提高了抗原结合活性或改变了抗体特异性))的突变分子。突变后可对编码蛋白进行常规表达，编码蛋白的功能性和/或生物活性(例如，免疫特异性结合Sp35多肽的至少一个表位的能力)可通过此处所述的技术或本领域已知的常规修饰技术进行测定。IV.编码Sp35抗体的多聚核苷酸
本发明还提供了编码本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸分子。
在一个实施方式中，本发明提供了一种包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该重链可变区的至少一个CDR或该重链可变区的至少两个CDRs与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考重链CDR1，CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。替代性地，该VH的CDR1、CDR2和CDR3区与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施方式所述的本发明的重链可变区具有与表4中多肽序列相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列：
Figure G2008800076855D00831
Figure G2008800076855D00841
Figure G2008800076855D00851
Figure G2008800076855D00861
Figure G2008800076855D00871
在特定实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码一种免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区具有与表4所示的CDR1，CDR2和CDR3基团已知的多肽序列。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，主要由其组成，或由组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链多肽的VH CDR1、CDR2和CDR3区或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链多肽的VH CDR1、CDR2和CDR3区具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的核苷酸序列所编码。
在另一方面，本发明提供了包含编码一种免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与编码表4所示的CDR1、CDR2和CDR3基团的多聚核苷酸相一致的核苷酸序列所编码。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，主要由其组成，或由组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与编码杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链的VHCDR1、CDR2和CDR3区的多聚核苷酸或者编码杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链的VH CDR1、CDR2和CDR3区的多聚核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的核苷酸序列所编码。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B 10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该轻链可变区的至少一个CDR或该轻链可变区的至少两个CDRs与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。替代性地，该VL的CDR1、CDR2和CDR3区与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施方式所述的本发明的轻链可变区具有与表5中多肽序列相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列：
Figure G2008800076855D00911
Figure G2008800076855D00921
Figure G2008800076855D00931
Figure G2008800076855D00941
Figure G2008800076855D00951
在特定实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，主要由其组成，或由组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链多肽的VL CDR1、CDR2和CDR3区或者杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链多肽的VL CDR1、CDR2和CDR3区具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的核苷酸序列所编码。
在另一实施方式中，本发明提供了包含编码一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区具有与表5所示的CDR1、CDR2和CDR3基团已知的多肽序列。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明提供了包含编码一种免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与编码表5所示的CDR1、CDR2和CDR3基团的多聚核苷酸相一致的核苷酸序列所编码。在特定实施方式中，包含该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在本发明的另一实施方式中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸，主要由其组成，或由组成的分离多聚核苷酸，其中该CDR1、CDR2和CDR3区由与编码杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链的VLCDR1、CDR2和CDR3区的多聚核苷酸或者编码杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链的VL CDR1、CDR2和CDR3区的多聚核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的核苷酸序列所编码。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2 M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在另一实施方式中，本发明包括包含了能编码与选自表6所示的SEQ ID NOs：158-172、372、376、380、384和416的参考VH多肽序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VH的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括一种包含了能编码具有选自表6所示的SEQ ID NOs：158-172、372、376、380、384和416的多肽序列的VH的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。表6-VH多肽序列
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li02   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYEMIWVRQAPGKGLEWVSGPSGGLTWYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCVRIDDSGWAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP   158
  Li09   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYSMVWVRQAPGKGLEWVISPSGGKTMYADSVKGRFTISRDNSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCARDSRRYYDFWSGYHNYYYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP   159
  Li06   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEYPMDWVRQAPGKGLEWVSYSSGGSTVYADSIKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGDSAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP   160
  Li05   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMGWVRQAPGKGLEWVIVSSGGYTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGTNAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP   161
  Li04   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYNMGWVRQAPGKGLEWVIYPSGGGTHYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSIAIAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP   162
  Li08   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYEMVWVRQAPGKGLEWVRSSGGATKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKESPDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP   163
  Li11   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMYWVRQAPGKGLEWVSTSGGYTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDTSDDYYYMDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP   164
  Li10   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYPMVWVRQAPGKGLEWVSIGPSGGVTAYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPYSWWDFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP   165
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li01   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYQMTWVRQAPGKGLEWVYPSGGNTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASGTTVFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP   166
  Li07   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYFMGWVRQAPGKGLEWVISPSGGFTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRHDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAP   167
  Li03   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYPMEWVRQAPGKGLEWVSYPSGGSTVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAGQLGDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAP   168
  Li12   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSQYNMFWVRQAPGKGLEWVSSSGGMTMYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREALYCSGGSCYSDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAP   169
  1A7   QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWNWINTDTGEPTYTEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAREGFDYWGQGTTVTVSS   170
  2F3   EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFIFSDAWLDWVRQSPEKGLEWVIRSKANNHATNYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYFCTPSFWGQGTTVTVSS   171
  3P1D10.2C3和3P1E11.3B7   QVQLQQSGAELARPGASVKLSCRASGYTFTSSWTQWVKQRPGQGLEWICIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARHNSGMDYWGQGTSVTVSS   172
  Li13   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYEMYWVRQAPGKGLEWVSRIVSSGGFTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGDNDAFDIWGQGTTVTVSS   372
  Li32   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYMMQWVRQAPGKGLEWVSSISPSGGNTKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDYGYWFDPWGQGTLVTVSS   376
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li33   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYPMFWVRQAPGKGLEWVSWIGPSGGITKYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCAREGHNDWYFDLWGRGTLVTVSS   380
  Li34   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYEMYWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARAAILDWYFDLWGRGTLVTVSS   384
  3B5.2   QVQLQQPGAELVRPGTSVKLSCRASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGVIDPSDSYTNYNQKFRGKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARPYYGSHWFFDVWGTGTTVTVSS   416
  P1A7var.2   QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVkQAPGQGLkWMGWINTDTGEPTYTEDFQGRFVFSIDTSASTvYLQISSLKAEDMAMYYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS   432
  Li81   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYEMKWVRQAPGKGLEWVSVIGPSGGFTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGDNDAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG   433
  Li81(无糖基化)   EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYEMKWVRQAPGKGLEWVSVIGPSGGFTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGDNDAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSAYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG   435
在另一实施方式中，本发明包括包含了能编码与选自SEQ ID NOs：158-172、372、376、380、384和416的参考VH多肽序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VH的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括包含了能编码具有选自SEQID NOs：158-172、372、376、380、384和416的本发明VH的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在附加的实施方式中，本发明包括包含与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链多肽和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链多肽的参考VH多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VH的编码核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9和3B5.2的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M，10-2M，5x10-3M，10-3M，5x10-4M，10-4M，5x10-5M，10-5M，5x10-6M，10-6M，5x-11-7M，10-7M，5x10-8M，10-8M，5x10-9M，10-9M，5x10-10M，10-10M，5x10-11M，10-11M，5x1013M，10-12M，5x1042-13M，10-13M，5x10-14M，10-14M，5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在附加实施方式中，本发明包括了包含编码与下文所示的SEQ ID NO：420的多聚核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的重链的核酸，主要由其组成，或由其组成的编码免疫球蛋白重链的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的重链的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35和/或与单克隆抗体3B5.2结合相同的表位。
人鼠嵌合单克隆抗体3B5.2的免疫球蛋白重链多聚核苷酸序列：ATGGGATGGAGCTGTGTAATGCTCTTGGTATCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGGCCTGGGACTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACCTTACTACGGTAGTCACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGA (SEQ ID NO：420).
在附加的实施方式中，本发明包括了编码重链可变区(VH)的分离多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸包含了选自表7所示的SEQ ID NOs 173-184、370、374、378、382和422的VH核酸序列。在特定实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VH的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。表7-VH多聚核苷酸序列
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li02   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACGAGATGATTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCGGTCCTTCTGGTGGCCTTACTTGGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACCGCCATGTATTACTGTGTACGGATTGATGATAGTAGTGGTTGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   173
  Li09   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATGTACTCTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTATATCTCTCCTTCTGGTGGCAAGACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTTTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATTCGAGACGCCGGTATTACGATTTTTGGAGTGGTTATCACAACTACTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   174
  Li06   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGAGTACCCTATGGATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTATTCTTCTGGTGGCTCTACTGTTTATGCTGACTCCATTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGGGTGACTCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   175
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li05   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGCTATGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCGTTTCTTCTGGTGGCTATACTGATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCAGAGAGGGTGACCATAATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   176
  Li04   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCGTTACAATATGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTTATCTATCCTTCTGGTGGCGGTACTCATTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTTCTATAGCAGATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   177
  Li08   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCCGTTCTTCTGGTGGCGCTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTCCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAAGAGTCGCCAGACGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   178
  Li11   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTTCTTACGCTATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTCTACTTCTGGTGGCTATACTGGTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATACCAGCGATAATGACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   179
  Li10   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTACTTACCCTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGGATCGGTCCTTCTGGTGGCGTTACTGCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACCCTATAGCAGTGGCTGGTGGGACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   180
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li01   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAAGTACCAGATGACTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTATCCTTCTGGTGGCAATACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGTGGGACTACAGAGGCAGTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   181
  Li07   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATGTACTTTATGGGTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTCTCCTTCTGGTGGCTTTACTTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCAGTCTACTATTGTGCGAGAGATCGGCATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   182
  Li03   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCAGTACCCTATGGAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCTATCCTTCTGGTGGCTCTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGCGGGGCAGTGGCTGGGGGACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   183
  Li12   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCAGTACAATATGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTCGTATCTCTTCTTCTGGTGGCATGACTATGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAAGCGTTACGGCCTTATTGTAGTGGTGGTAGCTGCTACTCCGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCGCTAGCACCC   184
  Li13   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACGAGATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTCGTATCGTTTCTTCTGGTGGCTTTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGTGATAATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGC   370
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li32   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACATGATGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTCTATCTCTCCTTCTGGTGGCAATACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGATTATGGATACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGC   374
  Li33   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTATTTACCCTATGTTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTTGGATCGGTCCTTCTGGTGGCATTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCGAGAGAGGGGCATAACGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGC   378
  Li34   GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTAATTACGAGATGTATTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCTATTCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCTAGGGCAGCCATCCTCGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCAAGC   382
  3B5.2   CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAGGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATCGGAGTGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTCAGGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACACATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACCTTACTACGGTAGTCACTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCACAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA   422
  VH   序列   SEQIDNO：
  Li81   GAAGTACAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGAGATGAAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTTATCGGTCCTTCTGGTGGCTTTACTTTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGTGATAATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGT   448
  VH   序列   SEQIDNO：
  无糖基化Li81   GAAGTACAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGAGATGAAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTTATCGGTCCTTCTGGTGGCTTTACTTTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGTGATAATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCGCGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGT   450
在进一步的实施方式中，本发明包括一种包含了与选自表7中SEQ ID NOs：173-184、370、374、378、382和422的参考核酸序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VH编码核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，该多聚核苷酸编码能特异性或优先结合Sp35的VH多肽。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2CC3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(Lia.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VH，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在附加的实施方式中，本发明包括包含与选自编码杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链的多聚核苷酸和编码杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链的多聚核苷酸参考VH多聚核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VH的编码核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。
在另一实施方式中，本发明包括包含了能编码与选自表8所示的SEQ ID NOs：273-286、373、377、381、385和417的参考VL多肽序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VL的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括包含了能编码具有选自表8所示的SEQ ID NOs：273-286、373、377、381、385和417的多肽序列的VL的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。表8-VL多肽序列
  VL   序列   SEQIDNO：
  Li02   FYSHSAQYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKFASWYQQKAGQSPVLVIFQDRKRLSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDTNTVVFGGGTKLTVLGQPKAAP   273
  Li09   FYSHSAQDIQMTQSPSSLSAFVGDRVAITCRASQSIDTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASKLEDGVPSRFSGSGTGTDFTLTIRSLQPEDFGTYYCQQSYSPPLTFGGGTKVEIKRTVAAP   274
  Li06   FYSHSAQDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYAASSLRTGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQDYSTPLTFGQGTKLEIKRTVAAP   275
  Li05   FYSHSAQSVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGDNIGSKSVHWYQQRPGQAPVLVVYDDYDRPSGIPERFSGSNSGDTAILTITRVEVGDEADFYCQVRDSRTEERVFGGGTKVTVLGQPKAAP   276
  Li08   FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCQASQDISYYLNWYQQKPGKAPKVLIYDVSNLQTGVPSRFSGSASATDFTLTISSLQPEDIATYYCQQSDNLPLTFGGGTKVEIKRTVAAP   277
  Li11   FYSHSAQDIQMTQSPSSVSAPIGDRVTITCRASQEIANYLAWYQQKPGKAPKLLIYDTYTLQTDVPPRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDTATYFCQQADIFPLSFGGGTKVEIKRTVAAP   278
  Li10   FYSHSAQDIQMTQSPSSMSASVGDTVTITCRASQGIGNWLAWYQQKPGKAPTLLIYAASSLESGVPSRFTGSGSSSGIDFTLTISDLHPEDLATYYCQQAQTFPLTFGGGTRVDLKRTVAAP   279
  Li01   FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQADRFPAVTFGGGTKVEIKRTVAAP   280
  Li07   FYSHSAQSELTQPPSVSVSPGQTAIITCSGDQLGDKHVAWYQQKPGQSPVLVIYLDIKRPAGISERFSGSNSGNTATLTIRGTQAMDEADYYCQAWDIKTVFGGGTKLTVLSQPKAAP   281
  Li03   FYSHSAQDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAP   282
  1A7   QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIK   283
  2F3   DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWFQQKQGKSPQLLVYNAKTLPDGVPSRFSGSGSGTQYFLKINSLQPEDFGSYYCQHFWAIPYTFGGGTKLEIKR   284
  VL   序列   SEQIDNO：
  3P1D10.2C3   DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLFTFGSGTKLEIR   285
  3P1E11.3B7   DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKSYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLFTFGSGTKLEIR   286
  Li13   DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPMYTFGQGTKLEIK   373
  Li32   DIQMTQSPDSLSASVGDRVTITCQASQDISYYLNWYQQKPGMAPKLLIYDAFILEGGAPSRFSGSGSGTDFSFTISNLQPEDIATYFCQQSDQLPVTFGQGTKVEIR   377
  Li33   DIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPLTFGGGTKVEIK   381
  Li34   DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCHASQDISNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDAFNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQHYDNLPFTFGPGTRVAIR   385
  3B5.2   QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVSYVHWYQQKSGTSPKRWLYDTSNLASGVPARFGGNGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSTNPPTFGGGTKLEIK   417
  P1A7var.1   EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRrLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDyTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK   430
  P1A7var.2   qIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRrLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDyTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK   431
  Li81   DIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPMYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC   434
在进一步的实施方式中，本发明包括包含了能编码与选自表8所示的SEQ ID NOs：273-286、373、377、381、385和417的参考VL多肽序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VL的核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括包含了能编码具有选自SEQID NOs：273-286、373、377、381、385和417的本发明VL的核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在附加的实施方式中，本发明包括包含与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链多肽和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链多肽的参考VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VL的编码核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P 1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x1013M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在附加实施方式中，本发明包括了编码免疫球蛋白轻链的分离多聚核苷酸，其中该分离多聚核苷酸包含编码与下文所示的SEQ ID NO：421的多聚核苷酸具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的轻链的核酸，主要由其组成，或由其组成。在特定的实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的轻链的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35和/或与单克隆抗体3B5.2结合相同的表位。
鼠和人嵌合抗体3B5.2的免疫球蛋白轻链多聚核苷酸序列：ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCACGTGTAAGTTACGTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGCTTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCGGTGGCAATGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTACTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG(SEQ ID NO：421).
在附加的实施方式中，本发明包括了编码轻链可变区(VL)的分离多聚核苷酸，其中该多聚核苷酸包含了选自表9所示的SEQ ID NOs 185-194、371、375、379、383和423的VL核酸序列。在特定实施方式中，包含了该多聚核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。表9-VL多聚核苷酸序列
  VL   序列   SEQIDNO：
  Li02   TTCTATTCTCACAGTGCACAGTACGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGGAGATAAATTGGGGGATAAATTTGCTTCCTGGTATCAGCAGAAGGCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTTTCAAGATAGGAAGCGTCTCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACTCTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACACCAACACTGTGGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC   185
  Li09   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATTTGTGGGAGACAGAGTCGCCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGAGCATCGACACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTATGCTGCATCCAAGTTGGAAGACGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGAACTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGAAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGGAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA   186
  Li06   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTACGAACTGGGGTCCCATCAAGATTCAGGGGCAGTGGATCTGGCACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACGTATTACTGTCTACAAGATTACAGTTACCCTCTCACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA   187
  Li05 TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGTCTTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGCCAGACGGCCAGGATTTCCTGTGGGGGAGACAACATTGGAAGTAAGAGTGTCCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTCCTGGTCGTGTATGATGATTATGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGGACACGGCCATCCTGACCATCACCAGGGTCGAAGTCGGGGATGAGGCCCACTTTTATTGTCAGGTGAGGGACAGCCGTACTGAGGAACGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCTTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC   188
  Li08   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGTTACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAGCCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTACGATGTATCCAATTTGCAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGCGTCTGCGACAGATTTTACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCGACATATTACTGTCAACAGTCTGATAATCTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCA   189
  VL   序列   SEQIDNO：
  Li11   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCTGTGTCTGCACCTATAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGAGATTGCCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATACATACACTTTGCAGACTGACGTCCCACCGAGGTTCAGCGGCAGTGGTTCGGGGACAGATTTCACTCTCACTATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATACTGCAACTTACTTTTGTCAACAGGCTGACATTTTCCCGCTCTCTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA   190
  Li10 TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTCTGCTTCTGTAGGGGACACAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTGGCAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCAACTCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCACCGGCAGCGGCAGTTCCTCTGGGATAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGCACCCTGAAGATTTGGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTCAGACTTTCCCGCTCACCTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGACCTCAAGCGAACTGTGGCTGCACCA   191
  Li01   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTGACAGGTTCCCTGCGGTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA   192
  Li07   TTCTATTCTCACAGTGCACAGAGCGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCCCCAGGACAGACAGCCATCATCACCTGCTCTGGAGATCAGTTGGGTGACAAACATGTGGCTTGGTATCAACAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTGTGCTGGTCATCTATCTAGACATTAAGAGGCCCGCAGGGATTTCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGAAATACAGCCACTCTGACCATCAGAGGGACCCAGGCTATGGATGAAGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACATCAAGACGGTCTTCGGCGGGGGGACCAAGCTGACCGTCCTGAGTCAGCCCAAGGCTGCCCCC   193
  Li03   TTCTATTCTCACAGTGCACAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCA   194
  Li13   GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA   371
  VL   序列   SEQIDNO：
  Li32   GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAAGACATTAGCTACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGATGGCCCCTAAACTCCTCATCTACGATGCCTTCATTTTGGAAGGAGGGGCCCCATCACGGTTCAGTGGGAGCGGCTCTGGGACAGATTTTTCTTTCACCATCAGCAATCTACAGCCTGAGGATATTGCAACTTATTTCTGTCAACAGTCTGATCAACTGCCCGTGACCTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAGA   375
  Li33   GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAGGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGATAAGTGGCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA   379
  Li34   GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCATGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAGTTGGTATCAGCAGAAACCAGGTAAAGCCCCTAAACTCCTGATCTACGATGCTTTCAATTTGGAGACAGGAGTCCCATCGAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGCACAGATTTTACATTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCACTATGATAATCTCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAGAGTGGCGATCAGA   383
  3B5.2   CAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCACGTGTAAGTTACGTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGCTTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCGGTGGCAATGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTACTAACCCACCCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA   423
  Li81   GATATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCGATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG   449
在进一步的实施方式中，本发明包括包含了与选自表9中SEQ ID NOs：185-194、371、375、379、383和423的VL多聚核苷酸至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VL编码核酸，主要由其组成或由其组成的分离多聚核苷酸。在特定的实施方式中，该多聚核苷酸编码能多肽特异性或优先结合Sp35的VL多肽。
在特定的实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述多聚核苷酸编码的VL，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、10-5M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、10-10M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x1013M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在附加的实施方式中，本发明包括包含与选自编码杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链的多聚核苷酸和编码杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链的多聚核苷酸参考VL多聚核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VL的编码核酸，主要由其组成，或由其组成的分离多聚核苷酸。
上述多聚核苷酸的任意一种可进一步包括附加核苷酸，其可编码如引导编码多肽分泌的信号肽、此处所述的抗体恒定区、或此处所述的其它外源多肽等。
此外，如别处所详述，本发明包括了包含上述一个或多个多聚核苷酸组合物。在一个实施方式中，本发明包括了包含一种第一多聚核苷酸和一种第二多聚核苷酸的组合物，其中所述的第一多聚核苷酸编码一种此处所述的VH多肽，而所述的第二核苷酸编码一种此处所述的VL多肽。特别是一种包含了如表7所示的VH多聚核苷酸，以及如表9所示的VL多聚核苷酸，主要由其组成或由其组成的组合物，其中所述的VH多聚核苷酸和所述的VL多聚核苷酸选自下列组合：i)SEQ ID NO：173和SEQ ID NO：185；ii)SEQ ID NO：174和SEQ ID NO：186；iii)SEQ ID NO：175和SEQ ID NO：187；iv)SEQ ID NO：176和SEQ ID NO：188；v)SEQ ID NO：178和SEQ ID NO：189；vi)SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：190；vii)SEQ ID NO：180和SEQ ID NO：191；viii)SEQ ID NO：181和SEQ ID NO：192；ix)SEQ ID NO：182和SEQ ID NO：193；x)SEQ ID NO：183和SEQ ID NO：194；xi)SEQ ID NO：370和SEQ ID NO：371；xii)SEQ ID NO：374和SEQ ID NO：375；xiii)SEQ ID NO：378和SEQ ID NO：379；xiv)SEQ ID NO：382和SEQ ID NO：385；xv)SEQ ID NO：422和SEQ ID NO：423；xvi)SEQ ID NO：448和SEQ ID NO：449；以及xvii)SEQ ID NO：450和SEQ ID NO：449。
如别处所述，本发明还包括了本发明多聚核苷酸的片段。此外如此处所述的编码融合多聚核苷酸的多聚核苷酸、Fab片段，以及其它衍生物同样在本发明的预期之内。
该多聚核苷酸可通过任何本领域已知的方法进行生产或制备。例如，如果已知该抗体的核苷酸序列，编码该抗体的多聚核苷酸可通过化学合成的寡聚核苷酸进行装配(例如，如Kutmeier等人，BioTechniques 17：242(1994))所述)，其主要包括包含编码该抗体的部分序列的重叠寡聚核苷酸的合成，该寡聚核苷酸的退火和连接，以及通过PCR对连接寡聚核苷酸进行扩增。
替代性地，编码Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可通过来自于适当来源的核酸生成。如果没有包含编码特定抗体的核酸的克隆，但已知抗体分子的序列，编码该抗体的核酸可通过化学合成，或采用从该序列的3’到5’端杂交的合成引物通过PCR扩增从适当来源(例如，抗体cDNA库，或从任何表达该抗体或其它Sp35抗体的组织或细胞(例如经选定用于表达一种抗体的杂交瘤细胞)分离得到的cDNA库或和核酸，优选poly A+RNA)获取，或采用对待鉴定的特定基因序列(例如，一种来自编码该抗体或其它Sp35抗体的cDNA库的cDNA克隆)具有特异性的寡聚核苷酸探针进行克隆。然后可用本领域公知的任何技术将PCR生成的扩增核酸克隆进入可复制克隆载体。
当对该核苷酸序列和该Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的相应氨基酸进行测定后，可采用本领域公知的操作核苷酸序列的方法(如重组DNA技术，定点突变，PCR等(例如，参见Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)以及Ausubel等人，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，NY(1998)所述的技术，其全文在此引入作为参考))对其核苷酸序列进行操作，以生成具有不同氨基酸序列的抗体，例如形成氨基酸替换、删除和/或插入。
编码SP35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由任何可以是未修饰RNA或DNA或者修饰RNA或DNA的多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码SP35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由单链和双链DNA，由单链和双链区混合得到的DNA，单链和双链RNA，以及由单链和双链区混合得到的RNA，包含了可能是单链，或者更典型为双链或单链和双链区混合物的DNA和RNA的杂交分子所组成。此外，编码SP35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸可由包含RNA或DNA或者同时包含RNA和DNA的三链区所组成。编码SP35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多聚核苷酸还可包含为稳定或为其它目的进行修饰的一个或多个修饰碱基或者DNA或RNA骨架。“修饰”碱基包括，三苯甲基化碱基和异常碱基如肌苷。DNA和RNA可进行多种修饰；因此，”多聚核苷酸”包括了化学、酶或代谢修饰的形式。
通过对免疫球蛋白的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸替代，添加或删除可生成编码免疫球蛋白多肽(例如，免疫球蛋白重链区或轻链区)非天然变体的分离多聚核苷酸，从而在编码蛋白中引入一个或多个氨基酸替换、添加或删除。可通过定点突变和PCR介导突变等标准技术引入突变。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基上进行保守氨基酸替换。V.SP35抗体多肽
本发明进一步提供了形成Sp35抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的分离多肽。本发明的Sp35抗体包含了如编码来自免疫球蛋白分子的Sp35特异性抗原结合区的氨基酸序列等多肽。多肽或氨基酸序列“来自于”指定蛋白指出了该多肽的来源。在某些情况下，来自于特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有与该其实序列或其部分充分一致的氨基酸序列，其中该部分至少由10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或者本领域的普通技术人员可以确认其来源于该起始序列。
在一个实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，主要由其组成，或由其组成的分离多肽，其中该重链可变区的至少一个CDR或该重链可变区的至少两个CDRs与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。替代性地，该VH的CDR1、CDR2和CDR3区与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施例所述的本发明的重链可变区具有与表4中所示的基团相关的CDR1，CDR2或CDR3多肽序列。在特定实施方式中，包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，主要由其组成或由其组成的分离多肽，其中该CDR1、CDR2和CDR3区具有与表4所示的CDR1、CDR2和CDR3基团一致的多肽序列。在特定实施方式中，包含该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在一个实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)，主要由其组成，或由其组成的分离多肽，其中该重链可变区的至少一个CDR或该重链可变区的至少两个CDRs与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链的VH CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链的VH CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的参考重链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。
在进一步的实施方式中，本发明包括包含了与选自表6所示的SEQ ID NOs：158-172、372、376、380、384、416和433以及SEQ ID NO：435的参考VH多肽序列至少具有80％、85％、90％、95％或100％一致性的VH多肽，主要由其组成或由其组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括一种包含了选自表6所示的SEQ ID NOs：158-172、372、376、380、384、416和433以及SEQID NO：435的VH多肽，主要由其组成或由其组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VH多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在进一步的实施方式中，本发明包括包含与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白重链和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白重链的参考VH多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VH多肽，主要由其组成，或由其组成的分离多肽。
在特定的实施方式中，包含一个或多个上述VH多肽，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C6.3G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2B9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含一个或多个上述VH多肽，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、103-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、103M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、109M、5x10-10M、1010M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x1013M、10-13M、5x10-13M、10-14M、5x1014M或1015M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在另一实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，主要由其组成，或由其组成的分离多肽，其中该轻链可变区的至少一个CDR或该轻链可变区的至少两个CDRs与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。替代性地，该VL的CDR1、CDR2和CDR3区与来自此处所述的单克隆Sp35抗体的参考轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。因此，如该实施方式所述的本发明的轻链可变区具有与上文表5中所示的多肽相关的CDR1、CDR2或CDR3多肽序列。在特定实施方式中，包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，主要由其组成或由其组成的分离多肽，其中该CDR1、CDR2和CDR3区具有与表5所示的CDR1、CDR2和CDR3基团一致的多肽序列。在特定实施方式中，包含该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在一个实施方式中，本发明提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)，主要由其组成，或由其组成的分离多肽，其中该轻链可变区的至少一个CDR或该轻链可变区的至少两个CDRs与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链的VL CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链的VL CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的参考轻链CDR1、CDR2或CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的一致性。
在另一实施方式中，本发明包括包含了与选自表8所示的SEQ ID NOs：273-286、373、377、381、385、417和434的参考VL多肽序列至少具有80％、85％、90％或95％一致性的VL多肽，主要由其组成或由其组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在另一方面，本发明包括包含了选自表8所示的SEQID NOs：273-286、373、377、381、385、417和434的VL多肽，主要由其组成或由其组成的分离多肽。在特定的实施方式中，包含了该VL多肽的抗体或抗原结合片段特异性或优先结合Sp35。
在进一步的实施方式中，本发明包括包含与选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的免疫球蛋白轻链的VL和杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的免疫球蛋白轻链的VL的参考VL多肽序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性的VL多肽，主要由其组成，或由其组成的分离多肽。
在特定的实施方式中，包含一个或多个上述VL多肽，主要由其组成的抗体或其抗原结合片段与选自201′、3A3、3A6、1A7、1G7、2B10、2C11、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C63.G10.2H7、3P2C9.2G4、3P4A6.1D9、3P4A1.2R9、3P4C2.2D2、3P4C5.1D8、3P4C8.2G9、30-C12(Li01)、38-D01(Li02)、35-E04(Li03)、36-C09(Li04)、30-A11(Li05)、34-F02(Li06)、29-E07(Li07)、34-G04(Li08)、36-A12(Li09)、28-D02(Li10)、30-B01(Li11)、34-B03(Li12)、Li13、Li32、Li33、Li34、3383(Lla.1)、3495(Lla.2)、3563(Lla.3)、3564(Lla.4)、3565(Lla.5)、3566(Lla.6)、3567(Lla.7)、3568(Lla.8)、3569(Lla.9)、3570(LIa.10)、3571(Lla.11)、3582(Lla.12)、1968(Lla.13)、7P1D5.1G9、3B5.2和Li81的单克隆抗体特异性或优先结合相同表位，或者竞争性抑制该种单克隆抗体结合Sp35。
在特定实施方式中，包含由一个或多个上述VL多肽，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段通过以特征为解离常数(KD)不大于5x10-2M、10-2M、5x10-3M、10-3M、5x10-4M、10-4M、5x10-5M、105M、5x10-6M、10-6M、5x-11-7M、10-7M、5x10-8M、10-8M、5x10-9M、10-9M、5x10-10M、1010M、5x10-11M、10-11M、5x10-12M、10-12M、5x10-13M、10-13M、5x10-14M、10-14M、5x10-15M或10-15M的亲和性特异性或优先结合Sp35多肽或其片段，或Sp35变体多肽。
在其它实施方式中，包含了如表6所示的VH多肽以及如表8所示的VL多肽，主要由其组成，或由其组成的抗体或其抗原结合片段选自以下组合：i)SEQ ID NO：170和SEQ ID NO：283；ii)SEQ ID NO：171和SEQ ID NO：284；iii)SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：285；iv)SEQ ID NO：172和SEQ ID NO：286；v)SEQ ID NO：158和SEQ ID NO：273；vi)SEQ ID NO：159和SEQ ID NO：274；vii)SEQ ID NO：160和SEQ ID NO：275；viii)SEQ ID NO：161和SEQ ID NO：276；ix)SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：277；x)SEQ ID NO：164和SEQ ID NO：278；xi)SEQ ID NO：165和SEQ ID NO：279；xii)SEQ ID NO：166和SEQ ID NO：280；xiii)SEQ ID NO：167和SEQ ID NO：281；xiv)SEQ ID NO：168和SEQ ID NO：282；xv)SEQ ID NO：372和SEQ ID NO：373；xvi)SEQ ID NO：376和SEQ ID NO：377；xvii)SEQ ID NO：380和SEQ ID NO：381；xviii)SEQ ID NO：384和SEQ ID NO：385；xix)SEQ ID NO：416和SEQ ID NO：417；XX)SEQ ID NO：433和SEQ ID NO：434；xxi)SEQ ID NO：435和SEQ ID NO：434。
在其它实施方式中，抗体或其抗原结合片段包含选自杂交瘤2.P3B5.2(ATCC保藏编号PTA-8106)生成的VH多肽和VL多肽以及杂交瘤7.P1D5.1.G9(ATCC保藏编号PTA-8107)生成的VH多肽和VL多肽的VH多肽和VL多肽，主要由其组成，或由其组成
上述多肽的任意一种可进一步包括附加多肽，例如，引导编码多肽分泌的信号肽，此处所述的抗体恒定区，或此处所述的其它外源多肽。此外，本发明的多肽包括了别处所述的多肽片段。本发明的附加多肽包括此处所述的融合多肽、Fab片段以及其它衍生物。
此外，如此处更为具体的描述，本发明包括了包含上述多肽的组合物。
本领域的普通技术人员应当能够理解此处披露的Sp35抗体多肽可进行修饰，从而与作为其来源的天然结合多肽具有不同的氨基酸序列。例如，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列具有一定的一致性，例如，它可与起始序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的一致性。
此外，还可通过核苷酸或氨基酸替换、删除或插入进行保守替换或“非必需”氨基酸区的改变。例如，除了一个或多个氨基酸替换，插入或删除外(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多单独氨基酸替换、插入或删除)，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列可与起始序列相一致。在特定实施例中，来自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对起始序列具有一至五个、一至十个、一至十五个、或一至二十个单独氨基酸替换、插入或删除。
本发明的特定Sp35抗体多肽包含来自人氨基酸序列的氨基酸序列，主要由其组成，或由其组成。然而，特定Sp35抗体多肽包含了一个或多个来自另一哺乳动物种类的毗邻氨基酸。例如，本发明的Sp35抗体可包括一种灵长类动物的重链区、铰链区或抗原结合区。在其它范例中，非鼠抗体多肽(例如，Sp35抗体的抗原结合位点)中可能存在一个或多个鼠源氨基酸。在特定的治疗应用中，可设计Sp35特异性抗体，或其抗原结合片段、变体或类似物，使其对给用该抗体的动物没有免疫原性。
在特定实施方式中，Sp35抗体多肽包含通常与抗体无关的氨基酸序列或者一个或多个部分。下文更为具体地描述了示范性修饰。例如，本发明地一种单链fv抗体片段可包含一个柔性接头序列，或经修饰添加一个功能性部分(例如，PEG、药物、毒素或标记)。
本发明的Sp35抗体多肽可包括一种融合蛋白，主要由其组成，或由其组成。融合蛋白为一种嵌合蛋白，其包括，例如一种具有至少一个目标结合区和至少一个外源部分(即，天然情况下不与其连接的部分)的免疫球蛋白抗原结合区。在融合多肽中，通常存在于单独蛋白中的氨基酸序列被放在一起，或是通常在同一蛋白的氨基酸序列被重新排列。融合蛋白可通过化学合成、生成和翻译以所需关系编码肽区的多聚核苷酸等方法生成。
应用于多聚核苷酸或多肽的术语“外源”指该多聚核苷酸或多肽来自与其余实体相比不同的实体。例如，如此处所述，融合至Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或类似物的“外源多肽”来自于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
“保守氨基酸替换”是以具有类似侧链的氨基酸残基替换其中一个氨基酸残基。本领域内已经定义了有类似电荷侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸，谷氨酸)，未带电极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，无极性侧链(例如，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)的氨基酸。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸优选被来自同一侧链家族的另一氨基酸残基所替代。在另一实施方式中，可使用侧链家族成员的顺序和/或组成不同的一种结构类似串来替换氨基酸串。
替代性地，在另一实施方式中，也可通过饱和突变等引入任意长度的全部或部分免疫球蛋白编码序列，将突变体整合进入Sp35抗体以用于此处披露的诊断和治疗方法，并对其结合所需抗原(例如，Sp35)的能力进行筛选。VI.融合蛋白和抗体结合物
如本文别处更为具体的描述，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体，或衍生物可进一步在N或C末端重组融合至外源多肽或者化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其它组合物。例如，Sp35特异性Sp35抗体可重组融合或结合至可用于检测测定标记的分子或外源多肽、药物、放射性核素或毒素等效应分子。例如，参见PCT公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO89/12624；美国专利5,314,995和EP 396,387，其全文在此引入作为参考。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物包括经修饰的衍生物，即，将任何类型的分子共价连接至该抗体，并使该共价连接不阻碍抗体结合Sp35。例如，但并非意在限制，该抗体衍生物包括通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酰化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解裂解、与细胞配体或其它蛋白连接等方法修饰得到的抗体。各种化学修饰中的任意一种均可通过已知技术实现，包括，但不限于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素代谢合成等。此外，该衍生物可能包含一个或多个非传统氨基酸。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可由通过肽键或修饰肽键(即，肽等排物)彼此连接的氨基酸所组成，并可包含20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。Sp35特异性抗体可通过翻译后加工等天然加工，或通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。该修饰在基本文本和更具体的专著，以及大量的研究文献中得到了具体的描述。Sp35特异性抗体的任何部位均可进行修饰，包括肽骨架、氨基酸侧链以及氨基或羧基终端，或在糖等部分上。应当可以理解在给定Sp35特异性抗体的多个位点可出现相同或不同程度的相同类型的修饰。此外，给定Sp35特异性抗体可包含多种类型的修饰。Sp35特异性抗体可因为泛素化等原因而带有分支，它们也可呈带或不带分支的环状。环状、分支和带分支的环状Sp35特异性抗体可通过翻译后自然作用或合成方法形成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价结合、亚铁血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂质或脂质衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、形成二硫键、脱甲基、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘处理、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解作用、磷酸化、异戊烯化、外消旋、硒化、硫酸盐化、如精胺酰化等经转移RNA介导向蛋白添加氨基酸、泛素化。(例如，参见Proteins-StructureAnd Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman andCompany，New York 2nd Ed.，(1993)；Posttranslational CovalentModification Of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，pgs 1-12(1983)；Seifter等人.，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等人.，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明还提供了包含Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体、或衍生物以及一种外源多肽的融和蛋白。该抗体融合的外源多肽可具有功能性或可用于靶向Sp35多肽表达细胞。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包括具有本发明抗体任意一个或多个VH区氨基酸序列或本发明抗体或其片段或变体的任意一个或多个VL区氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成。在另一实施方式中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有Sp35特异性抗体或其片段、变体或衍生物的任意一个、两个、三个VHCDRs氨基酸序列，或一种Sp35特异性抗体或其片段、变体或衍生物的任意一个、两个、三个VLCDRs氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成。在一个实施方式中，该融合蛋白包含了本发明Sp35特异性抗体或其片段、变体或衍生物的一种VHCDR3氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，该融合蛋白特异性结合Sp35的至少一个表位。在另一实施方式中，融合蛋白包含了一种具有本发明Sp35特异性抗体的至少一个VH区氨基酸序列和一种本发明Sp35特异性抗体或其片段，衍生物或变体的至少一个VL区氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽。优选地，该融合蛋白的VH和VL区对应一种特异性结合Sp35至少一个表位的单独来源抗体(或scFv或Fab片段)。在另一实施方式中，用于此处披露的诊断和治疗方法的融合蛋白包括具有一种Sp35特异性抗体的任意一个、两个、三个或更多VHCDRs氨基酸序列以及一种Sp35特异性抗体或其片段或变体的任意一个、两个、三个或更多VLCDRs氨基酸序列，以及一种外源多肽序列的多肽，主要由其组成，或由其组成。优选得，对应本发明单独来源抗体(或scFv或Fab片段)的两个、三个、四个、五个、六个或更多VHCDR(s)或VLCDR(s)。本发明还包含了编码这些融和蛋白的核酸分子。
文献报导的示范性融和蛋白包括与T细胞受体(Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 54：2936-2940(1987))；CD4(Capon et ah，Nature 357：525-531(1989)；Traunecker等人，Nature 339：68-70(1989)；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USAP：347-353(1990)；以及Byrn等人，Nature 344：667-670(1990))；L-选择素(homing receptor)(Watson等人，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；以及Watson等人，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等人，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等人，J.Exp.Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等人，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等人，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA55：10535-10539(1991)；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)以及Peppel等人，J.Exp.Med.774：1483-1489(1991))；以及IgE受体a(Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.Vol.115，Abstract No.1448(1991))相融合。
在特定实施方式中，Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体进一步包含一种靶标部分。靶标部分包括引导定位至身体特定部位(如脑部或其分区)的肽。在特定实施方式中，Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体被结合或融合至一种脑部靶标部分。该脑部靶向部分被共价连接(例如，引导、翻译融合、或者直接或通过可选择性裂解的间隔分子进行化学连接)或非共价连接(例如，通过抗生物素蛋白、生物素、蛋白A、IgG等进行可逆相互作用)。在其它实施方式中，该Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体被结合至一个或多个靶标部分。在附加实施方式中，该脑部靶标部分被连接至多个Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体。
与Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体连接的脑部靶标部分增强了Sp35抗体，抗体片段，其衍生物和变体等物质的脑部传递。据描述多种多肽在融合至蛋白或治疗剂时可将该蛋白或治疗剂传递通过血脑屏障(BBB)。非限制范例包括单域抗体FC5(Abulrob等人.(2005)J.Neurochem.95，1201-1214)；mAB 83-14，一种针对人胰岛素受体的单克隆抗体(Pardridge等人.(1995)Pharmacol.Res.12，807-816)；结合至人铁传递蛋白受体(hTfR)的B2、B6和B8肽(Xia等人.(2000)J.Virol.74，11359-11366)；结合至人铁传递蛋白受体的OX26单克隆抗体(Pardridge等人.(1991)J.Pharmacol.Exp.Ther.259，66-70)；以及美国专利6,306,365的SEQ ID NOs：1-18。上述参考文献的全文在此引入作为参考。
Sp35抗体，抗体片段，其衍生物或变体的增强的脑部传递可通过本领域所建立的多种方法进行测定。例如，向一种动物给用连接至脑部靶标部分的一种放射、酶或荧光标记的Sp35抗体，抗体片段，其衍生物或变体；检测脑部定位；与未连接脑部靶标部分的放射性、酶或荧光标记的Sp35抗体，抗体片段，其衍生物或变体比较定位。其它检测增强靶向的方法参见上述参考文献。
如此处讨论，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域已知方法融合至外源多肽以提高该多肽的体内半衰期或用于免疫测定。例如，在一个实施方式中，可将PEG连接至本发明Sp35抗体提高其体内半衰期。Leong，S.R.，等人，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等人.，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
此外，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可融合至标记序列(如肽)以促进其纯化或检测。在优选实施方式中，该标记氨基酸序列为一种六组氨酸肽，例如pQE载体中所提供的标签(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)，其中多数已上市销售。如Gentz等人，Proc.Natl Acad.Sd.USA 5(5：821-824(1989)所述，例如，用于融和蛋白快速纯化的六组氨酸。其它可用于纯化的肽标签包括，但不限于，对应一种来自流行性感冒血红球凝集素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等人.，Cell 37：767(1984))以及“flag”标签。
融和蛋白可通过本领域公知的方法进行制备(例如，参见美国专利5,116,964和5,225,538)。可根据经验选择进行融合的精确位点以优化该融和蛋白的分泌或结合特性。然后将编码该融合蛋白的DNA转染进入表达宿主细胞。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以非结合形式使用或与多种分子中的至少一种相结合，例如，可提高该分子的治疗属性，促进靶标检测，或患者的显像或治疗。本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可在纯化前或纯化后，纯化进行时进行标记或连接。
特别地，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物可连接至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药物制剂或PEG。
本领域的技术人员应能理解根据待连接的选定试剂的不同，可通过多种技术实现该连接。例如，与生物素的连接物可通过结合多肽与生物素的活化酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)的反应进行制备。类似地，与荧光标记的结合物可在偶合剂(例如，此处所列举的偶合剂)的存在下，或通过与异硫氰酸(优选荧光素-异硫氰酸)的反应进行制备。本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合物可以类似方式进行制备。
本发明进一步包含了与诊断或治疗剂相结合的本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。该Sp35抗体可在作为检测特定治疗和/或预防方案的有效性的临床测试步骤中，用于检测神经疾病的发展或进展。可通过将该Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物与可测物质偶合以促进检测。可测物质的范例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射断层的正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。例如，可连接至抗体并用于本发明所述诊断的金属离子可参见美国专利4,741,900。适用酶的范例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或是乙酰胆碱酯酶；适用辅基的范例包括抗生蛋白链菌素-生物素和亲和素-生物素；适用荧光材料的范例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸萤光素、丹磺酰、二氯三嗪野芝麻碱荧光素、丹磺酰氯或藻红素；发光材料的范例包括发光氨；生物发光材料的范例包括荧光素酶、虫荧光素和发光蛋白质；适用放射性物质的范例包括125I、131I、111In或99Tc。
Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过与化学发光化合物偶合进行可测标记。然后可通过检测化学反应过程中产生的发光以测定化学发光标记Sp35抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的范例为发光氨、异鲁米诺、theromatic吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
对Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物进行可测标记的方法之一为将其连接至一种酶并将连接产物用于酶免疫测定(EIA)(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)″Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等人.，J.Clin.Pathol.31：501-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482520(1981)；Maggio，E.(ed.)，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FIa.，(1980)；Ishikawa，E.等人.，(eds.)，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。该种与Sp35抗体连接的酶将以特定方式适当的底物(优选发色底物)反应从而生成可通过分光光度计、荧光计或视觉方法检测的化学部分。可用于可测标记该抗体的酶包括，但不限于，苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、delta-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、alpha-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸盐异构酶、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、beta-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。此外，可通过采用针对该酶的发色底物的比色法实现该检测。还可通过对底物的酶反应程度与类似建立的标准的视觉比较实现该检测。
还可通过多种其它免疫测定方法实现该检测。例如，在放射性标记该Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物后，可采用放射性免疫测定(RIA)检测该抗体(例如，参见Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，(March，1986))，其内容在此引入作为参考)。该放射性同位素的检测手段包括，但不限于，伽马计数器、闪烁计数器、自动射线显影。
Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物还可采用152Eu或其它镧系元素等荧光发射金属进行可测标记。这些金属可通过二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)等金属鳌合基团连接该抗体。
将各种部分连接至Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物的技术已总所周知，例如，参见Arnon等人，″Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy″，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人.243-56(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等人，″Antibodies ForDrug Delivery″，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人.623--53(1987)；Thorpe，″Antibody Carriers Of Cytotoxic AgentsIn Cancer Therapy：A Review″，in Monoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in Monoclonal AntibodiesFor Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人.(eds.)，AcademicPress pp.303-16(1985)，以及Thorpe等人.，″The Preparation AndCytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates″，Immunol.Rev.(52：119-58(1982)。VII.抗体多肽的表达
众所周知，RNA可通过标准技术(例如在异硫氰酸胍萃取和沉淀后进行离心或层析)从原始杂交瘤细胞或其它转化细胞分离。在需要时可通过oligo dT纤维素层析等标准技术从总RNA分离mRNA。适用的技术已为本领域熟知。
在一个实施方式中，编码该抗体轻链和重链的cDNAs可参照公知的方法采用逆转录酶和DNA聚合酶同时或单独制备。可通过共有恒定区引物或基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更具特异性的引物启动PCR。如上文讨论，PCR还可用于分离编码该抗体轻链和重链的DNA克隆。在此处可用共有引物或更具同源性探针如鼠恒定区探针筛选该库。
DNA，通常是质粒DNA，可采用本领域已知技术从细胞分离，并参考标准的，公知技术(例如，其具体内容可参见前述有关重组DNA技术的参考文献)获得限制性酶图谱和测序。当然，该DNA可在分离过程或后续分析中参照本发明在任意点进行合成。
在对分离的遗传物质进行操作以提供本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物后，编码该Sp35抗体的多聚核苷酸通常被插入一种表达载体并引导进入可用于生产所需数量Sp35抗体的宿主细胞。
抗体，或其片段、衍生物或类似物，例如结合此处所述的目标分子(例如，Sp35)的抗体的重链或轻链的重组表达需要构建一种包含了编码该抗体的多聚核苷酸的表达载体。在获得编码本发明抗体分子或者抗体的重链或轻链，或其部分(优选包含该重链或轻链可变区)的多聚核苷酸后，可通过本领域公知的重组DNA技术制备生产该抗体分子的载体。因此，此处描述了通过表达包含抗体编码核苷酸序列的多聚核苷酸制备蛋白的方法。可采用本领域技术人员公知的方法构建包含抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体内重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。因此，本发明提供了包含可操作地连接至启动子的编码本发明抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变区的核苷酸序列的可复制载体。该类载体可包含编码该抗体分子恒定区的核苷酸序列(例如，参见PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO 89/01036以及美国专利5,122,464)，且该抗体的可变区可被克隆进入该种载体以表达完整的重或轻链。
该宿主细胞可被两个本发明的表达载体共转染，该第一载体编码一种重链衍生多肽，该第二载体编码一种轻链衍生多肽。这两种载体可包含相同的能使重和轻链多肽同等表达的可选择标记。替代性地，也可使用一种同时编码重和轻链多肽的单独载体。在该种情况下，该轻链被优先放置在重链之前以防止过量的无毒重链(Proudfoot，Nature 322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。该重和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
此处所用的术语“载体”或“表达载体”指根据本发明所用的作为导入和在宿主细胞表达目标基因的工具的载体。如本领域技术人员所知，该种载体可从由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒构成的组合简单地进行选择。一般而言，适用本发明的载体将包含一种选择性标记，帮助目标基因进行克隆的适当限制性酶切位点以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
可采用多种表达载体系统实现本发明目的。例如，一类利用来自动物病毒(例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒)的DNA元件的载体。其它包括了具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的应用。此外，将该DNA整合至其染色体的细胞可通过导入一个或多个支持转染宿主细胞选择的标记进行选择。该标记可向一种营养缺陷型宿主提供原营养，耐受抗微生物剂(例如，抗生素)或耐受铜等重金属。该选择性标记基因既可直接连接至待表达的DNA序列，也可通过共转化导入相同的细胞。为优化mRNA的合成可能还需要附加的元件。这些元件可包括信号序列、剪接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特定优选实施例中该克隆可变区基因与上述方法合成的(优选人)重和轻链恒定区一起插入表达载体。在一个实施方式中，这可通过称为NEOSPLA(美国专利6,159,730)的Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体作用。该载体包含了细胞巨化病毒启动子/增强子、小鼠beta球蛋白主启动子、SV40复制起始区、牛生长激素多聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。据发现通过结合可变和恒定区基因，在CHO细胞内转染，在含G418培养基筛选并通过氨甲喋呤扩增时，该载体可导致极高水平的抗体表达。当然，任何能在真核细胞引发表达的表达载体均可用于本发明。适用载体的范例包括，但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA购买)、以及质粒pCI(可从Promega，Madison，WI购买)。一般而言，对大量的转染细胞进行筛选以确定其是否表达了适当高水平免疫球蛋白重和轻链是一种常规实验，其可通过机器人系统等形式开展。载体系统的描述还可参见美国专利5,736,137和5,658,570，其全文在此引入作为参考。该系统提供了很高的表达水平，例如，＞30pg/细胞/天。其它示范性载体系统披露于美国专利6413,777。
在其它优选实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可采用多顺反子构建体进行表达，例如可参见2002年11月18日提交的美国专利申请公布2003-0157641A1，其全文在此引用。在这些新型表达系统中，多个目的基因产物例如抗体的重和轻链可通过单个多顺反子构建体生产。这些系统利用了一种内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞内提供相对高水平的Sp35抗体，例如，结合多肽，例如，Sp35特异性抗体或其免疫特异性片段。适用IRES序列可参见在此引用的美国专利6,193,980。本领域技术人员应当可以理解该种表达系统可被用于有效生产本发明披露的全系列的Sp35抗体。
更普遍而言，一旦制备得到编码Sp35抗体的单体亚基的载体或DNA序列，该表达载体可被导入合适的宿主细胞。质粒相宿主细胞的导入可采用本领域技术人员公知的多种技术实现。这些技术包括，但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、带有套膜DNA的细胞融合、显微注射以及用完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.″Mammalian ExpressionVectors″Vectors，Rodriguez and Denhardt，Eds.，Butterworths，Boston，Mass.，Chapter 24.2，pp.470-472(1988)。质粒通常通过电穿孔导入宿主细胞。在适于轻链和重链生产的条件下培养带有表达构建体的宿主细胞，并对重和/或轻链蛋白合成进行检测。示范性的检测技术包括酶联免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分类分析(FACS)、免疫组化等。
该表达载体通过常规技术转入宿主细胞，然后以常规技术培养该转染细胞以生产用于此处所述方法的抗体。因此，本发明包括了包含可操作地连接至一种外源启动子的编码本发明抗体，或其重或轻链的多聚核苷酸的宿主细胞。在针对表达双链抗体的优选实施例中，如下文详述，同时编码重和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以表达完整免疫球蛋白分子。
此处所述的“宿主细胞”指能够接受使用重组DNA技术构建并至少编码一种外源基因的载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的方法的描述中所用的术语“细胞”和“细胞培养物”可相互替换地说明抗体的来源(除非另行清楚指明)。换言之，可回收多肽的“细胞”即可指离心得到的全细胞，也可指包含了培养基和悬浮细胞的细胞培养。
可采用多种宿主表达载体系统来表达用于此处所述方法的抗体分子。该种宿主表达系统代表了可生产和后续纯化目标编码序列的载体，还代表了在以适当核苷酸编码序列进行转化或转染后原位表达本发明抗体分子的细胞。其包括但不限于微生物，如以包含了抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染的细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)；以包含抗体编码序列的重组酵母表达载体转染的酵母(例如，毕赤酵母)；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；以包含抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转染的植物细胞系统；或包含了带有哺乳动物细胞基因组启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或哺乳动物病毒启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，可使用细菌细胞如大肠杆菌，更优选使用真核细胞表达重组抗体分子，特别是完整重组抗体分子。例如，结合来自人细胞巨化病毒的中间早期基因启动子元件等载体的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是一种有效的抗体表达系统(Foecking等人.，Gene 45：101(1986)；Cockett等人.，Bio/Technology8：2(1990))。
该用于蛋白表达的宿主细胞系通常来源于哺乳动物；本领域技术人员应当具有优选适用于表达目标基因产物的特定宿主细胞系的能力。示范性宿主细胞系包括，但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、DG44和DUXBI1(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR缺陷型)、HELA(人子宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(带有SV40T抗原的CVI衍生物)、VERY、BHK(y幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠纤维原细胞)、BALBC/3T3(小鼠纤维原细胞)HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-Ic IBPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)以及293(人肾)。特别优选CHO细胞。通常可从商业服务机构，美国组织培养保藏中心(American Tissue Culture Collection)或公开文献获取。
此外，还可选择以特定形式调节插入序列表达，或修饰和处理基因产物的宿主细胞株。对该蛋白产物的该种修饰(例如，糖基化)和处理(例如，裂解)可对该蛋白的功能非常重要。不同的宿主细胞可对蛋白和基因产物的转译后处理和修饰均有不同的特性和特殊的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和处理。为此，可使用具有正确处理基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核宿主细胞。
优选稳定表达以进行重组蛋白的长期高产量生产。例如，可通过工程改造得到稳定表达该抗体分子的细胞系。宿主细胞可通过由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA进行转化，而非使用包含病毒复制起始区的表达载体。在导入外源DNA后，将工程细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转入选择性培养基。重组质粒中的选择性标记可带来对选择因素的耐受并使细胞将该质粒稳定整合进入其染色体，然后生长得到可进行后续克隆并扩展成细胞系的细胞转化灶。该方法可用于工程改造可稳定表达抗体分子的细胞系。
多种选择系统可供使用，包括但不限于可分别应用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223(1977))，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci USA 48：202(1992))，以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.，Cell 22：817 1980)基因。此外，抗代谢物抗性可用作下列基因选择的基础：具有对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人.，Natl.Acad.Sci USA 77：357(1980)；O′Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：1521(1981))；具有对麦考酚酸的抗性的gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：2012(1981))；具有对氨基糖苷G-418的抗性的neo(Clinical Pharmacy 72：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：513-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.(62：191-211(1993)；，TIBTECH 11(5)：55-215(1993年5月)；具有对潮霉素的抗性的hygro(Santerre等人.，Gene 30：141(1984)。本领域公知的可供使用的重组DNA技术可参见Ausubel等人.(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY(1990)；以及Dracopoli等人.(eds)，Current Prolocols in HumanGenetics，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其全文在此引入作为参考。
抗体分子的表达水平可通过载体扩增得到提高(其综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning，Academic Press，New York，Vol.3.(1987))。当表达抗体的载体系统中的标记可进行扩增时，宿主细胞培养中抑制剂水平的提升可提高标记基因拷贝数。由于扩增区与抗体基因关联，因而抗体的产量也会得到提高(Grouse等人，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
体外生产可以放大，以获得大量的所需多肽。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术已为本领域所知并包括均匀悬浮培养(例如，在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或是固定化或包埋细胞培养(例如，在中空纤维，微胶囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷芯上)。在必须和/或需要时，例如，在合成铰链区多肽的生物合成后，或在此处所述的HIC层析步骤前后，该多肽溶液可通过常规层析方法进行纯化，例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
编码本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因还可通过非哺乳动物细胞(例如细菌或酵母或植物细胞)进行表达。较容易接受核酸的细菌包括肠杆菌成员，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌，以及流感嗜血杆菌。应当进一步指出，在细菌中表达时该外源多肽通常作为包含体的一部分。该外源多肽可进行分离，纯化然后组装入功能性分子。在需要抗体的四价形式时，该亚基将自动装配进入四价抗体(WO 02/096948 A2)。
在细菌系统中，根据被表达的抗体分子的目标用途，可选择使用多种表达载体。例如，当需要生产大量该种蛋白，以得到一种抗体分子的药物组合物时，可采用能够引导高水平表达易纯化融和蛋白产物的载体。该类载体包括，但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2：1791(1983))，其中该抗体克隆序列可在与lacZ编码区同框的情况下单独连接至该载体从而生产融和蛋白；pIN载体(Inouye和Inouye，Nucleic Acids Res.73：3101-3109(1985)；Van Heeke和Schuster，J.Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；pGEX载体也可用于将外源多肽以谷胱甘肽S转移酶(GST)融和蛋白的形式进行表达。一般而言，该种融和蛋白具有可溶性，并能通过吸附，结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠，然后在自由谷胱甘肽存在下洗脱进行简单的纯化。通过设计该pGEX载体包括了凝血酶或Xa因子蛋白酶裂解位点，从而使该克隆的目标基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物外，还可采用真核微生物。尽管许多其它的菌株(例如，毕赤酵母)已上市销售，酿酒酵母，或普通面包酵母在真和微生物中最为常用。
通常可使用质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature 252：39(1979)；Kingsman等人.，Gene 7：141(1979)；Tschemper等人，Gene10：157(1980))等在酵母中进行表达。该质粒已包含了可为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics 55：12(1977)))提供选择性标记的TRP1基因。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的Trp1病斑的存在为色氨酸缺失生长下转化的检测提供了有效的环境。
在昆虫系统中，通常使用苜蓿尺蠖核多角体病毒(AcNPV)作为表达外源基因的载体。该病毒在草地夜蛾细胞中生长。该抗体编码序列可单独克隆进入该病毒的非必须区(例如多角体蛋白基因)并位于AcNPV启动子(例如该多角体蛋白启动子)的控制下。
当本发明的抗体分子被重组表达后，可通过本领域已知的任意免疫球蛋白分子纯化方法对其进行纯化，例如，层析(例如，离子交换层析，亲和层析，特别是对蛋白A特异性抗原的亲和层析，筛分柱层析)、离心、微分溶出，或通过任何其它蛋白纯化标准技术。替代性地，提高本发明抗体亲和性的优选方法参见US2002 0123057 A1。VIII.应用Sp35抗体的治疗方法
如此处所述，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可缓解常见于CNS神经元的NgR1介导轴突伸展抑制。这在脑部或脊髓中需要轴突伸展或神经突抽芽的情况下非常重要。需要轴突伸展，但又通常被Nogo途径的作用抑制的一个范例为脊髓损伤(包括部分或完全压伤或断绝)。可由轴突伸展和/或神经突抽芽受益的疾病或紊乱包括中风、多发性硬化症、以及其它神经退化疾病或紊乱，例如多发性硬化症(MS)、进行性多灶性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质营养不良、亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)、球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)以及华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脊髓损伤、颅脑损伤、辐射后损伤、化疗后的神经系统并发症、中风、神经病变、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏症、单独的维生素E缺乏综合症、AR、巴康氏综合症、Marchiafava-Bignami综合症、异染性脑白质营养不良症、三叉神经痛和贝尔麻痹症、脊髓损伤和所有与神经元细胞死亡相关的神经疾病。
本发明进一步发现了Sp35在少突细胞中表达，及其对少突细胞生物学的贡献。Sp35的可溶性衍生物，特定多聚核苷酸(例如，RNAi)，以及特异性结合Sp35的特定抗体，如此处所述在少突细胞内可作为Sp35功能的拮抗剂，促经少突细胞的扩增，分化和存活并且在体外和体内促经神经元的髓鞘形成。这对于涉及髓鞘脱失和髓鞘形成障碍的疾病、紊乱或症状非常有益。少突细胞扩增、分化和存活，和/或髓鞘形成或髓鞘再生将会受益的疾病或紊乱的范例包括多发性硬化症(MS)、进行性多灶性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、脑白质营养不良、亚历山大病，佩-梅病(PMZ)、球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)，华勒氏变性、视神经炎、横贯性脊髓炎、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、脊髓损伤、颅脑损伤、辐射后损伤、化疗后的神经系统并发症、中风、急性缺血性视神经病变、维生素E缺乏症、单独的维生素E缺乏综合症、AR、巴康氏综合症、Marchiafava-Bignami综合症、异染性脑白质营养不良症、三叉神经痛和贝尔麻痹症。
相应地，本发明的一个实施方式提供了在患有下列损伤或疾病或者易于遭受该类疾病的动物体内治疗脊髓损伤，与CNS中神经元生长抑制相关地疾病或紊乱，与少突细胞生长或分化抑制相关地疾病或紊乱，以及有关CNS神经元髓鞘脱失或髓鞘形成障碍的疾病的方法，该方法包括向该类动物施用有效量的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，主要由其组成，或由其组成。本发明的抗体已在此描述，并包括表3A和3B中列举的单克隆抗体，特异性结合表3A和3B中列举的单克隆抗体的相同表位的抗体，竞争性抑制表3A和3B中列举的单克隆抗体与Sp35的结合的抗体，以及包含了来自表3A和3B中列举的单克隆抗体的多肽的抗体。
用于此处披露的治疗方法的治疗性Sp35抗体可作为促进CNS神经突生长、神经元存活、轴突导向和轴突再生，促进少突细胞存活、生长和/或分化，以及促进CNS神经元髓鞘形成或髓鞘再生的治疗剂进行制备和使用。适当治疗性Sp35抗体的特性包括：与Sp35表位结合从而阻断Sp35活性，已足够的亲和性与Sp35结合以引发治疗作用，以及比普通结合伴侣(如Nogo受体)相比优先结合Sp35。
治疗性Sp35抗体可以是特异性结合Sp35的单克隆、嵌合或人源化抗体，或抗体片段。该抗体可以是单价、二价、多价或双功能抗体。抗体片段包括但不限于Fab、F(ab′)2和Fv片段。
如本发明所述的治疗性Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可在未标记或未结合的状态下使用，或与具有或不具有附加疗效的的药物、标记或稳定剂相偶合或连接。
对任意特定患者的具体剂量和治疗方案取决于多种因素，包括所用的特定Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，患者年龄、体重、总体健康、性别，以及饮食、给药时间、排泄率、药物组合，以及具体的待治疗疾病的严重性。医疗看护者对该类因素的判断属于本领域的普通技术。该给药量还取决于待治疗的个体患者、给药途径、剂型、所用化合物的性质、疾病的严重性以及所需的效果。该给药量可采用本领域公知的药理和药代动力学原理进行制定。
如下文更具体的描述，在本发明的方法中该Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可经脑室或鞘内直接施用至神经系统，例如施用至MS的慢性病灶。
在各种实施方式中，如上所述的Sp35抗体为Sp35活性的拮抗剂。在特定实施方式中，例如，拮抗剂Sp35抗体与神经元上表达的Sp35的结合阻断了髓磷脂相关的神经突生长抑制或神经元细胞死亡。在其它实施方式中，该Sp35抗体与少突细胞上表达的Sp35的结合阻断了少突细胞生长或分化抑制，或阻断了CNS神经元的髓鞘脱失或髓鞘形成障碍。
在本发明的方法中该Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，特别是此处所述的Sp35抗体，可作为一种预制多肽直接施用，或通过核酸载体间接施用，从而得到有益的轴突生长，促进少突细胞扩增、分化和存活，和/或促进髓鞘形成或髓鞘再生。
在特定实施方式中，可采用(例如，在载体中的)编码Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体或类似物的核酸治疗对象。编码多肽的核酸的剂量范围为每个患者约10ng至1g、100ng至100mg、1μg至10mg或30-300μg DNA。传染性病毒载体的剂量在每剂10-100或更多病毒体。
在本发明的一些实施方式中，Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体，或衍生物在包含以下步骤的治疗方法中施用：(1)使用表达Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的核酸，例如载体，转化或转染可移植宿主细胞；以及(2)在疾病、紊乱或损伤位点将该转化宿主细胞植入哺乳动物。例如，该转化宿主细胞可植入脊髓损伤或髓鞘形成障碍的位点。在本发明的一些实施方式中，该可移植宿主细胞被取出哺乳动物，临时培养，以编码Sp35抗体的分离核酸转化或转染，并重新移植进入原先的哺乳动物。该细胞可以是(但不要求)从其移植的同一位点取出。该类实施方式(有时被称为体外体内基因治疗)可于短时间内在作用位点提供连续的Sp35多肽。
在人体使用前，该种包括施用本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的治疗脊髓损伤，与CNS中神经元生长抑制相关地疾病或紊乱，与少突细胞生长或分化抑制相关地疾病或紊乱，以及有关CNS神经元髓鞘脱失或髓鞘形成障碍疾病的方法的治疗或预防活性通常可先进行体外试验，然后在可接受的动物模型中进行体内试验。合适的动物模型(包括转基因动物)可为本领域普通技术人员所知。例如，验证此处所述Sp35抗体治疗作用的体外测试包括Sp35抗体对细胞系或患者组织样本的作用。Sp35抗体对细胞系和/或组织样本的作用可通过本领域技术人员已知的技术(例如本文别处披露的测试)进行测定。本发明还提供了可用于决定是否施用特定Sp35抗体的体外测试，包括体外细胞培养测定，其中患者组织样本生长于培养基中，被暴露至或施用一种化合物，然后观察该种化合物对该组织样本的作用。
本发明的组合物还可结合辅助活性化合物。例如，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可与一种或多种附加治疗剂共同制剂或共同施用。
本发明包含了向选定目标组织给用本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的任意给药方法，包括水溶液的弹丸注射或控释系统的植入。控制植入减少了重复注射的需求。IX.药物组合物和施用方法
本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的制备和向需要该药物的对象给药的方法已为本领域技术人员熟知。Sp35抗体，或其抗原结合片段，变体或衍生物的给药途径可以是，例如，口服、肠胃外、通过吸入或局部给药。此处所用的术语肠胃外施用包括，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。尽管所有这些施用的剂型均明确在本发明的预期范围内，其中一种给药剂型可以是供注射，特别是供静脉或动脉注射或者滴注的溶液。注射用的合适的药物组合物通常包含缓冲液(例如，醋酸盐，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)，可选择性包含稳定剂(例如，人白蛋白)等。然而，在另一种与此技术一致的方法中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接传递至有害细胞群，从而提高该疾病组织对该治疗剂的暴露。
如前文讨论，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以药学有效量进行给药，以在体内治疗哺乳动物脊髓损伤，与CNS中神经元生长抑制相关地疾病或紊乱，与少突细胞生长或分化抑制相关地疾病或紊乱，以及有关CNS神经元髓鞘脱失或髓鞘形成障碍的疾病。在这方面，可以理解所披露的抗体将被做成制剂以帮助给药并提高活性剂的稳定性。优选地，如本发明所述的药物组合物包含药学可接受的、无毒的、无菌载体，例如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。为达到本发明的目的，Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的药学有效量应当指一种足以实现对靶标的有效结合并取得成效(例如，改善疾病或紊乱的症状或是检测一种物质或细胞)的数量。
本发明中采用的药物组合物包含了药学可接受的载体，例如包括离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，氨基乙酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，氯化钠，锌盐，硅胶，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙烯乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙烯乙二醇和羊毛脂。
肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液、乳剂。非水溶液的范例为丙二醇、聚乙烯乙二醇、植物油(例如橄榄油)，以及可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。水溶液载体包括水，酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。本发明中药学可接受的载体包括，但不限于，0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常用的肠胃外载体包括磷酸钠溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化钠、Ringer乳酸盐或固定油。静脉内载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂，例如基于Ringer右旋糖的电解质补充剂等。还可包括防腐剂和其它添加剂，例如，抗菌剂、抗氧化剂、鳌合剂以及惰性气体等。
更具体地，适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(溶于水时)或分散液以及用作可无菌注射溶液或分散液的临时制剂的无菌粉末。此时，该组合物应当无菌且具有足够的流动性以进行注射。它应在生产和贮存条件下保持稳定，并优选可耐受微生物(例如细菌和真菌)的污染。该载体可以是一种溶剂或分散介质，其包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物(丙三醇、丙二醇以及液体聚乙二醇等)，及其适当的混合物。适当的流动性可通过多种方式维持，例如，通过适用卵磷脂等覆层，对于分散剂通过保持所需的颗粒尺寸以及通过表面活性剂的使用。用于此处披露的治疗方法的合适制剂披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，16th ed.(1980)。
微生物作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂(例如，防腐剂、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、噻汞撒等)实现。在许多情况下该组合物中优选包含等张剂，例如，糖、多元醇(例如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的长期吸收可通过在组合物中包含一种延缓吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和白明胶)来实现。
在任意情况下，无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如，Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，其自身或与其它活性试剂的组合物)与此处所列成份的一种或组合溶于一种适当的溶剂中，并根据要求过滤灭菌而制备得到。一般而言，分散剂可通过将活性化合物与包含了基础分散介质和所需其它上述成分的无菌载体结合得到。对于可用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，其优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，通过制备得到的粉末包含活性成分和从其无菌过滤溶液得到的任何附加所需成分。该注射制剂经处理后将根据本领域已知方法填充入容器(例如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶)，并在无菌条件下密封。此外，该制剂可经过包装以试剂盒的形式出售，如共同未决申请U.S.S.N.09/259,337(US-2002-0102208 A1)所述，其全文在此引入作为参考。该产品优选包含标签或说明书以指示该相关组合物可用于治疗患有或易患自体免疫或新生细胞紊乱的对象。
肠胃外剂型可以是单剂量，灌输或在负荷剂量后加以维持剂量。这些组合物可以固定或可变的间隔(例如，一天一次，或“按需”给药)给药。
本发明所用的特定药物组合物可通过可接受剂型(例如，胶囊、片剂、水悬浮液或溶液)进行口服给药。特定的药物组合物还可通过鼻腔喷雾或吸入的方式给药。改种组合物可制备成盐溶液，采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂(以增加生物相容性)和/或其它常规增溶或分散剂。
可与载体材料结合生产单剂型的Sp35抗体，或其片段、变体或衍生物的数量随待治疗宿主和特定给药模式而变化。该组合物可以单剂量，多剂量或在一定时间段内灌输的方式进行给药。还可对给药方案进行调整以获得最佳的目标响应(例如，治疗或预防响应)。
在当前披露的范围内，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过上述治疗方法在足以产生治疗效果的数量下施用于人或其它动物。本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以常规剂型施用于人或其它动物，该剂型可参照已知技术将本发明抗体结合常规药学可接受载体或稀释液进行制备。本领域技术人员均可理解该药学可接受的载体或稀释液的形式和特征由其结合的活性成分的量，给药途径和其它公知变量所决定。本领域技术人员将进一步理解包含一种或多种本发明Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的混合剂可能会特别有效。
用于治疗脊髓损伤，与CNS中神经元生长抑制相关地疾病或紊乱，与少突细胞生长或分化抑制相关地疾病或紊乱，以及有关CNS神经元髓鞘脱失或髓鞘形成障碍的疾病的本发明组合物的有效剂量取决于多种因素，包括给药方法，靶标位点，患者的生理状态，该患者是人或动物，给药的其它药物，以及用于治疗还是预防。该患者通常为人，但也可治疗包括转基因动物在内的非人类哺乳动物。可采用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定测量以获得最佳的安全性和有效性。
在以Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物治疗脊髓损伤，与CNS中神经元生长抑制相关地疾病或紊乱，与少突细胞生长或分化抑制相关地疾病或紊乱，以及有关CNS神经元髓鞘脱失或髓鞘形成障碍的疾病时，其剂量范围可以是，例如，从约0.0001至100mg/kg宿主体重，更普遍为0.01至5mg/kg宿主体重(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.75mg/kg、2mg/kg等)。例如该剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。上述范围的中间剂量在本发明的范围之内。对象给药可采取每天给药、隔日给药、每周给药或根据任何其它通过实证分析得到的进度给药。示范性的治疗需要在较长的期限内(例如，至少六个月)进行多剂量给药。示范性的治疗方案需要每两周或每月一次或是每3至6个月一次给药。示范性的剂量给法包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔日30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中同时给用两种或多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，其中各抗体的给用剂量均在指示的范围之内。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可在多种时间给药。单独剂量之间的间隔可以以日、周、月或年计算。根据对患者体内目标多肽或目标分子血液水平的测量所示，该间隔也可是不规律的。在一些方法中可对剂量进行调整以使血浆多肽浓度在1-1000μg/ml，在一些方法中该浓度为25-300μg/ml。替代性地，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以作为缓释制剂给药，此时可减少给药频率。剂量和频率的变化取决于抗体在患者体内的半衰期。Sp35抗体还可通过与稳定多肽或部分(例如，白蛋白或PEG)相融合来延长半衰期。一般而言，人源化抗体显示了最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人抗体。在一个实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以在不结合的形式给药，在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可以结合形式多次给药。在另一实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可先以不结合方式，再以结合方式，或以相反的顺序给药。
本发明的组合物可通过任何适用方法(例如，肠胃外、心室内、经口、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或通过植入药盒)给药。此处所用的术语“肠胃外给药”包括皮下，静脉内、肌肉内、关节内、滑液内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或灌输技术。如前文所述，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物通过在神经系统的作用促进了少突细胞的存活、扩增和分化，神经元的髓鞘形成，以及神经元存活，轴突再生和轴突导向。相应的，在本发明方法中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的给药方式可使其穿越血脑屏障。这种穿越可通过Sp35抗体分子本身固有的物理化学属性，药物制剂中的其它成分，或通过可到达血脑屏障的仪器设备(如针，套管或外科器具)得以实现。当该Sp35抗体是一种不能天然穿越血脑屏障的分子时，例如，与帮助穿越的部分相融合时，适用的给药途径为，例如鞘内或颅内注射，例如直接注射至MS的慢性病灶。当该Sp35抗体是一种能够天然穿越血脑屏障的分子时，其给药途径可以是下述多种途径中的一种或多种。在一些方法中，该抗体作为缓释组合物或仪器(例如MedipadTM仪)进行给药。载体分子，例如抗Fc受体、铁传递蛋白、抗胰岛素受体或毒素结合物或渗透促进剂可以增强穿越血脑屏障的传递。
本发明的方法中所用的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接灌输至脑部。已知有多种直接向脑部灌输化合物的方法，且这些方法对于向患有神经紊乱的人类患者传递治疗化合物非常有效。这些方法包括适用泵向脑部慢性灌输、立体定向灌输、临时间质导管、永久颅内导管灌输以及外科手术植入的可生物降解的灌输。例如，参见Gill等人，″Direct brain infusion of glial cellline-derived neurotrophic factor in Parkinson disease，″Nature Med.9：589-95(2003)；Scharfen等人，″High Activity Iodine--125 InterstitialImplant For Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)：58391(1992)；Gaspar等人，″Permanent 125I Implants forRecurrent Malignant Gliomas，″Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.43(5)：977-82(1999)；chapter 66，pages 577-580，Bellezza等人，″Stereotactic Interstitial Brachytherapy，″in Gildenberg等人，Textbookof Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill(1998)；andBrem等人，″The Safety of Interstitial Chemotherapy withBCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in theTreatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas：Phase I Trial，″J.Neuro-Oncology 26：111-23(1995)。
该组合物还可包括分散于作为该化合物适当传递或支持系统的生物相容载体材料的Sp35拮抗剂。缓释载体的适当范例包括成形(例如栓剂或胶囊)的半透性聚合物基质。可植入的或是微胶囊状的缓释基质包括具乳酸(U.S.Patent No.3,773,319；EP58,481)，L-谷氨酸和gamma-乙基-L-谷氨酸酯共聚物(Sidman等人，Biopolymers 22：547-56(1985))；聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)，乙烯醋酸乙烯(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.12：98-105(1982))或聚-D-(-)-3羟基丁酸(EP133，988)。
在本发明的一些实施方式中，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物通过直接灌输至脑部适当区域的方式施用至患者。例如，参见上文Gill等人。此外还存在其它技术并可用于施用本发明所述的Sp35抗体。例如，可采用Riechert-Mundinger设备和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位设备实现立体定向安置导管或灌输。一种对比增强计算机断层摄影术(CT)扫描(注射120ml欧乃派克，350mg碘酒/ml，层厚2mm)可支持三维多层治疗计划(STP，Fischer，Freiburg，Germany)。该技术支持在磁共振影像研究的基础上进行计划，融合CT和MRI目标信息以进行明确的目标确认。
经改造后可配合使用GE CT扫描仪(General ElectricCompany，Milwaukee，WI)的Leksell立体定向系统(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)立体定向系统(Radionics，Burlington，MA)可用于该种用途。因此，在灌输初期，可将BRW立体定向框架的环状底座圈可附着在患者的头骨上。可以3mm的间隔对带有夹在底盘上的石墨棒定位框的(目标组织)区域获取连续CT层。计算机治疗计划程序可以在采用石墨棒成像的CT坐标在CT空间和BRW空间之间绘图的VAX 11/780计算机(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上运行。
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可选择与其它对紊乱或症状的治疗(例如，预防或治疗)有效的试剂组合给药。X.诊断
本发明进一步提供了一种可用于神经元紊乱或损伤诊断的诊断方法，其包括检测一种个体的组织或其它细胞或体液中的Sp35蛋白或转录物表达水平，并将测得的表达水平与普通组织或体液中的标准Sp35表达水平相比较，表达水平与标准相比的提高变意味着紊乱。
Sp35特异性抗体可通过本领域技术人员已知的经典免疫组化方法用于测定生物样本中的蛋白水平(例如，参见Jalkanen，等人，J.Cell.Biol.707：976-985(1985)；Jalkanen，等人，J.Cell Biol.705：3087-3096(1987))。其它可用于检测蛋白表达的基于抗体的方法包括免疫测定，例如酶联免疫吸收分析(ELISA)、免疫沉淀或Western印迹。适用测定在本文别处有更具体的描述。
“测定Sp35多肽的表达水平”意在直接地(例如，测量或估计绝对蛋白水平)或相对地(例如，与第二生物样本的癌症相关多肽水平相比较)定性或定量测量或估计Sp35多肽在第一生物样板中的水平。第一生物样本中的Sp35多肽表达水平被测量或估计后与标准Sp35多肽水平向比较，该标准取自于来自未患有紊乱的个体的第二生物样本，或由未患该紊乱的群体的平均水平制定。如本领域所能理解，一旦已知该“标准”Sp35多肽水平，它可作为比较的标准重复使用。
“生物样本”指任何取自于潜在表达Sp35的个体、细胞系、组织培养或其它细胞来源的生物样本。从哺乳动物获取组织切片和体液的方法已为本领域公知。
如本文别处所述，用于上述诊断方法的Sp35抗体包括了特异性结合Sp35基因产物的任何Sp35抗体。XI.免疫测定
本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物可通过本领域的任何已知方法测定其免疫特异性结合。可采用的免疫测定包括但不限于，使用western印迹、放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸收分析)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀分析、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体-固定测定、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统。这些均为常规测定并在本领域公知(例如，参见Ausubel等人，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)，其全文在此引入作为参考)。下文简述了示范性的免疫测定(但并非进行限制)。
免疫沉淀方案通常包括在添加了蛋白磷酸酯酶和/或蛋白酶抑制剂(例如，EDTA、PMSF、抑肽酶、钒酸钠)的溶解缓冲液如RIPA缓冲液(1％NP-40或Triton X-100，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS，0.15M NaCl，pH7.2的0.01M磷酸钠，1％特血尔(Trasylol))中溶解一定量的细胞，向细胞溶解产物添加目标抗体，在4摄氏度下培养一定时间(例如，1-4小时)，向细胞溶解产物添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠，在4摄氏度下培养一小时或更多时间，以溶解缓冲液洗涤珠子并将珠子重新悬浮于SDS/样本缓冲液中。目标抗体免疫沉淀特定抗原的能力可通过例如western印迹分析进行评估。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高抗体与抗原的结合，并降低背景干扰(例如，以琼脂糖珠预先去除细胞溶解产物)。有关免疫沉淀方案的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人.，eds，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)at 10.16.1。
Western印迹分析通常包括制备蛋白样本，将蛋白样本在聚丙烯酰胺凝胶(例如，根据抗原的分子量选择8％-20％SDS-PAGE)中进行电泳，将蛋白样本从聚丙烯酰胺凝胶转移到一种膜(例如硝化纤维，PVDF或尼龙)上，在封闭液(例如，带有3％BSA或脱脂牛奶的PBS)中封闭膜，以洗涤缓冲液(例如，PBS-Tween 20)清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的一抗(该目标抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，以稀释于封闭缓冲液的结合至酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)或放射性分子(例如，32p或1251)的二抗(可识别该一抗，例如，抗人抗体)封闭膜，以洗涤缓冲液清洗膜，并检测抗原的存在。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高测得信号并降低背景噪音。有关免疫沉淀方案的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人.，eds，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)第10.16.1节。
ELISAs包括制备抗原，以抗原涂布96孔微量滴定板的孔，向孔中添加与可测化合物如酶底物(例如，辣根过氧化酶，碱性磷酸酶)结合的目标抗体并培养一段时间，检测抗原的存在。在ELISAs中该目标抗体并非必须连接至可测化合物；事实上可向孔中添加一种结合了可测化合物的第二抗体(可识别目标抗体)。此外，除了用抗原涂布微孔外，也可以使用抗体涂布微孔。在这一情况下，在添加目标抗原后可能要向涂布微孔添加结合了可测化合物的一种第二抗体。本领域的技术人员应能理解可对该参数进行调整以提高测得信号以及其它本领域已知的ELISAs变量。有关ELISAs的进一步讨论可参见，例如Ausubel等人，eds，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，New York，Vol.1(1994)第11.2.1节。
抗体与抗原的结合亲和性以及抗体-抗原相互作用的解离速率可通过竞争性结合测定进行检测。竞争性结合测定的一个范例是放射性免疫测定，其包括在未标记抗原的数量不断增长的情况下培养标记抗原(例如，3H或125I)和目标抗体，并检测结合至标记抗原的抗体。目标抗体对特定抗原的亲和性以及结合解离速率可通过scatchard作图分析的数据测定。与一种第二抗体的竞争性也可通过放射性免疫测定进行检测。此时，该抗原与结合了标记化合物(例如，3H或125I)的目标抗体在未标记第二抗体逐渐增加的情况下进行培养。
此外，本发明的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以通过免疫荧光，免疫电镜或非免疫学分析等组织学方法原位测定癌症抗原基因产物或其保留变体或肽片段。原位检测可通过从患者体内取出一个组织学样本，并使其接触一种标记的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物，优选将标记抗体(或片段)覆盖至组织学样本上得以实现。通过采用改种方法不仅可以检测Sp35蛋白，或其保守变体或肽片段的存在，还可测得其在被检组织中的分布。通过本发明，普通技术人员均能理解可对各种各样的组织学方法(例如染色法)中的任意方法进行改造以实现该种原位检测。
对Sp35基因产物或其保守变体或肽片段的免疫测定或非免疫测定通常包括在能够结合Sp35基因产物或其保守变体或肽片段的标记抗体的存在下培养一种样本(例如，生物流体、组织萃取物、新鲜采集的细胞或经细胞培养后的细胞溶解产物)，并通过本领域公知的任意技术检测结合抗体。
该生物样本可接触或固定至一种固相支持物或载体(例如硝化纤维)，或其它能够固定细胞，细胞颗粒或可溶蛋白的固相支持物。使用适当的缓冲液洗涤支持物后以可检测标记Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物进行处理。然后以缓冲液在此清洗该固相支持物以去除未结合抗体。该抗体可根据需要进行后续标记。然后可通过常规方法检测固相支持物上结合标记的数量。
“固相支持物或载体”指任何能够结合抗原或抗体的支持物。公知支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然或修饰纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩、以及磁铁矿。根据本发明的目的，该载体的性质可以是一定程度可溶的或是不溶的。只要偶合分子能够集合抗体或抗原，该支持材料可采用任何可能的构型。因此，该支持物的构型可以是球形(例如，珠子)，或圆柱形(例如试管的内表面或是棒的外表面)。此外，该表面可以是平面的，例如薄片、试纸等。优选支持物包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员将了解多种能够结合抗体或抗原的适用载体，或可通过常规实验进行验证。
给定量的Sp35抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合活性和通过公知技术进行测定。本领域的技术人员应当能够进行有效测定并通过常规实验优化每次测定的测试条件。
多种方法可用于测定抗体-抗原相互作用的亲和性，但可测定速率常数的则相对较少。多数方法依赖于标记抗体或抗原，从而不可避免地使常规测定复杂化，并对测定数量引入了不确定性。
运行于BIAcore的表面等离子共振仪(SPR)相对传统的测量抗体-抗原相互作用亲和性的方法带来了多种优点：(i)无需标记抗体或抗原；(ii)无需事先纯化抗体，可直接使用细胞培养悬浮液；(iii)实时检测，支持对不同单克隆抗体相互作用进行快速半定量比较，可支持和满足多种评估用途；(iv)生物特异性表面可再生，从而使一系列不同的单克隆抗体可在相同的条件下简单地进行比较；(v)分析过程完全自动化，多种测量可在无用户干涉的情况下进行。BIAapplications Handbook，version AB(1998再版)，BIACORE codeNo.BR-1001-86；BIAtechnology Handbook，version AB(1998再版)，BIACORE code No.BR1001-84。
基于SPR的结合研究要求将一定量的结合对固定在传感器表面上。固定的结合伴侣指配体。溶液中的结合伴侣称为被分析物。在某些情况下，该配体通过与另一固定化分子(称为捕获分子)的结合间接附着在表面上。SPR响应反映了当分析物结合或解离时探测器表面质量浓度的变化。
基于SPR，实时BIAcore测量可在相互作用发生时对其直接监测。该技术非常适于检测动力学参数。相对亲和性排序可极为简单的实现，动力学和亲和性常数均可从感应图数据获得。
当被分析物以不连续脉冲注射至配体表面时，所得的感应图可分为三个基本阶段：(i)样本注射过程中被分析物与配体的结合；(ii)样本注射过程中的平衡或稳定状态，此时被分析物的结合与其从复合物的解离向平衡；(iii)缓冲液流过时被分析物从表面的解离。
该结合和解离阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的动力学信息(ka和kd，复合物形成和解离速率，ka/ka＝KD)。该平衡阶段提供了有关被分析物-配体相互作用的亲和性信息(KD)。
BIAevaluation软件提供了使用数值积分和全面拟合算法进行曲线拟合的全面的工具。通过对数据的适当分析可从单次BIAcore考察获得相互作用的分离速率和亲和常数。该技术可检测的亲和性范围非常宽广，可从mM到pM。
表位特异性是一种单克隆抗体的重要性质。与采用放射性免疫测定，ELISA或其它表面吸附方法的传统技术不同，通过BIAcore进行的表位定位不需要标记或纯化抗体，并支持采用一种多个单克隆抗体的序列进行多位点特异性测试。此外，还可自动化处理大量的分析。
成对结合实验测试了两个MAbs同时结合相同抗原的能力。针对不同表位的MAbs可单独结合，而针对相同或相近表位的MAbs则会干扰彼此的结合。这一通过BIAcore进行的结合实验非常易于开展。
例如，可采用一种捕获分子结合该第一Mab，然后先后添加抗原和第二Mab。该感应图可以显示：1.多少抗原与第一Mab结合，2.第二MAb与表面附着抗原的结合程度，3.如果该第二MAb未结合，逆转成对测试的顺序是否改变结果。
肽抑制是另一种用于表位定位的技术。该方法可完善成对抗体结合研究，并能在抗原的初级序列已知的情况下关联功能性表位与结构特征。该方法将对肽或抗原片段对不同MAbs与固定化抗原结合的抑制进行测试。能干扰给定MAb结合的肽被认为与该MAb所定义的表位结构相关。
本发明的实施将采用(除非另行指出)细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA、以及免疫学的常规技术，其均在本领域的技术范围之内。该类技术在文献中得到了充分的解释。例如，参见Molecular Cloning ALaboratory Manual，2nd Ed.，Sambrook等人，ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press：(1989)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Sambrook等人，ed.，Cold  Springs Harbor Laboratory，New York(1992)，DNA Cloning，D.N.Glover ed.，Volumes I and II(1985)；Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gait ed.，(1984)；Mullis等人U.S.Pat.No：4，683，195；Nucleic Acid Hybridization，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Transcription And Translation，B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1984)；Culture Of Animal Cells，R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，(1987)；Immobilized Cells And Enzymes，IRL Press，(1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.，N.Y.；Gene TransferVectors For Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos eds.，ColdSpring Harbor Laboratory(1987)；Methods In Enzymology，Vols.154and 155(Wu等人eds.)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology，Mayer和Walker，eds.，Academic Press，London(1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-TV，D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，(1986)；Manipulating the MouseEmbryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1986)；以及Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)。
抗体工程的一般原则可参见Antibody Engineering，2ndedition，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，Oxford Univ.Press(1995)。蛋白工程的一般原则可参见Protein Engineering，A Practical Approach，Rickwood，D.，等人，Eds.，IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.(1995)。抗体和抗体-半抗原结合的一般原则可参见Nisonoff，A.，Molecular Immunology，2nd ed.，Sinauer Associates，Sunderland，MA(1984)；以及Steward，M.W.，Antibodies，Their Structure and Function，Chapman and Hall，New York，NY(1984)。此外，本领域已知且未具体描述的免疫学标准方法可参照Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Stites等人.(eds)，Basic and Clinical-Immunology(8th ed.)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)以及Mishell和Shiigi(eds)，Selected Methods in CellularImmunology，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)。
阐述了免疫学基本原理的标准参考著作包括CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons，New York；Klein，J.，Immunology：The Science of Self-Nonself Discrimination，John Wiley& Sons，New York(1982)；Kennett，R.，等人，eds.，MonoclonalAntibodies，Hybridoma：A New Dimension in Biological Analyses，Plenum Press，New York(1980)；Campbell，A.，″Monoclonal AntibodyTechnology″in Burden，R.，等人，eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.13，Elsevere，Amsterdam(1984)，Kuby Immunnology 4th ed.Ed.Richard A.Goldsby，Thomas J.Kindt and Barbara A.Osborne，H.Freemand & Co.(2000)；Roitt，L，Brostoff，J.和Male D.，Immunology 6th ed.London：Mosby(2001)；Abbas A.，Abul，A.和Lichtman，A.，Cellular and MolecularImmunology Ed.5，Elsevier Health Sciences Division(2005)；Kontermann和Dubel，Antibody Engineering，Springer Verlan(2001)；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.ColdSpring Harbor Press(2001)；Lewin，Genes VIII，Prentice Hall(2003)；Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress(1988)；Dieffenbach和Dveksler，PCR Primer Cold SpringHarbor Press(2003)。
前文及此处引入的所有参考文献均在此全文引用作为参考。实施例实施例1Sp35与少突细胞生物学有关
少突细胞的成熟经过了多个发育阶段，从A2B5祖细胞(表达A2B5)，分化为髓鞘形成前少突细胞(表达O1和O4)并最终成为成熟的髓鞘形成少突细胞(表达O1、O4和MBP)。因此，通过对A2B5、O1、O4和MBP标记的存在和缺失进行监测便可测定一种给定细胞的发育阶段并评估Sp35-Fc在少突细胞生物学中的作用。少突细胞生物学的总体综述可参见，例如Baumann和Pham-Dinh，Physiol.Rev.81：871-927(2001)。
针对O4、MBP和CNPase的单克隆抗体购自SternbergerMonoclonals公司；针对APC的抗体(克隆CC-1；ref.29)购自Calbiochem公司。其它抗体针对βIII微管蛋白(Covance)、Sp35(Biogen Idee)，Fyn(Santa Cruz Biotechnology)以及磷酸-Fyn(Biosource)。针对A2B5的单克隆抗体可从Chemicon购得。Sp35在少突细胞中表达
纯化大鼠P13CG神经元、P2少突细胞以及P4星形胶质细胞培养物中的Sp35表达可通过反转录后的聚合酶链式反应(RT-PCR)进行分析。使用一种来自Ambion，Inc.的试剂盒根据生产商的指示从大鼠脑细胞中提取mRNA。采用正向引物5′AGAGACATGCGATTGGTGA 3′(SEQ ID NO：344)和反向引物5′AGAGATGTAGACGAGGTCATT 3′(SEQ ID NO：345)进行的半定量RT-PCR显示在神经元中有较高表达，在少突细胞中表达较少，在星形胶质细胞中无表达。
Sp35在少突细胞中的表达通过来自成熟大鼠视神经的切片的原位杂交得到了确认。大鼠视神经切片可参照Mi等人.，″Sp35 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex，″Nat.Neurosci.7：221-28(2004)进行制备和处理，并以地高辛标记的Sp35反义或正义RNAs采用Sp35编码序列前500个核苷酸制备探针。采用酪胺信号放大试剂盒(Amersham Biosciences)和荧光抗地高辛结合抗体试剂盒(Perkin Elmer)参照生产商的指示将切片染色。为进行联合原位和免疫荧光测定，该抗体先后以地高辛标记RNAs和抗体(例如，CC1抗体(Calbiochem；一种成熟少突细胞标记)或抗Sp35抗体)进行探测。我们发现与反义Sp35探针杂交的少突细胞还可与一种CC1抗体共染色(数据未显示)。采用正义Sp35探针未发现特异性标记。少突细胞中的Sp35表达还可通过对来自P7大鼠皮层侧脑室区的组织切片的免疫组化研究得到证实。大部分以CC1抗体标记的皮质细胞也可用抗Sp35抗体进行标记。数据未显示。该相互作用的特异性可通过以Sp35-Fc(见实施例2)预先吸附抗Sp35抗体后对信号的消除得以证实。Sp35表达中Sp35-特异性RNAi的敲除可以促进少突细胞生长和分化
Sp35-特异性RNAi可用于消除少突细胞前体细胞中的Sp35表达以检验Sp35如何作用于少突细胞生长和分化。以携带了Sp35-特异性RNAi序列或按下文制备的对照RNAi的慢病毒感染50,000A2B5少突细胞前体细胞。
比较小鼠和大鼠Sp35DNA以发现可用作候选小发夹RNAs(shRNA)的同源区。用于慢病毒Sp35 RNAi表达的CH324可通过将寡核苷酸LV1-035和LV1-036退火并连接至Hpal和Xhol消化的pLL3.7进行构建。该pLL3.7载体，其它方法及病毒生产可参见Rubinson等人，Nat.Genet.33，401-06(2003)。该Sp35 RNAi寡核苷酸购自MWG并具有如下序列：LV1-035(正义寡核苷酸)5′-TGA TCG TCA TCC TGC TAG ACT TCA AGA GAG TCT AGCAGG ATG ACG ATC TTT TTT C-3′(SEQ ID NO：346)和LV1-036(反义寡核苷酸)5′-TCG AGA AAA AAG ATC GTC ATC CTG CTAGAC TCT CTT GAA GTC TAG CAG GAT GAC GAT CA-3′(SEQED NO：347)。
除了以小写字母标记的核苷酸变化外对照RNAi以相同的寡核苷酸序列进行设计：5′-TGA TCc TCA TcC ttC Tat ACTTCA AGA GAG TgT AGC AGG ATG AcG ATC TTT TTT CTCGA-3′(SEQ ID NO：348)以及5′-TCG AGA AAA AAG ATC GTCATCCTG CTA GAC TCT CTT GAA GTa TAG aAG GAT GACGAT CA-3′(SEQ ID NO：349)。
在生成慢病毒前，来自pLL3.7的DNA或pLL3.7中的候选shRNA将与鼠Sp35-HA标记质粒以5比1的比例共转染至6孔板中的CHO细胞。可通过对转染CHO细胞溶解产物的Sp35-HA标签进行western印迹检测或对由重复微孔制备的总RNA的northen印迹进行敲除分析。该印迹以Sp35 cDNA片段进行探测。分析在转染后48小时进行。与预计相同，CH324 RNAi-处理的CHO细胞中的Sp35 mRNA比对照处理细胞少10倍。数据未显示。携带绿色荧光蛋白(GFP)的RNAi慢病毒的生成如Rubinson等人所述。不管在对照还是Sp35 RNAi处理的培养中均有约80％的少突细胞为GFP阳性。RNAi处理未改变总细胞数。为定量RNAi对分化的作用，仅需对表达的GFP少突细胞计数。
雌性Long Evans P2大鼠中富集少突细胞的生成可参照Conn，Meth.Neurosci.2：1-4(Academic Press；1990)的描述并经调整如下。简单的说，该前脑被切开并置于Hank缓冲盐溶液(HBSS；Invitrogen)中。该组织被切成1mm片段并在37℃下于0.01％胰岛素和10μg/ml DNase中孵育15分钟。分离的细胞被涂布在覆有聚-L-赖氨酸的T75组织培养瓶中并在37℃下于含有20％胎牛血清(Invitrogen)的DMEM培养基中生长10天。通过将瓶子在37℃下以200rpm的速度摇晃过夜收集少突细胞前体(A2B5+)，从而得到95％的纯群体。在含有FGF/PDGF(10ng/ml；Peprotech)的高葡萄糖DULBECCO改良EAGLE培养基(DMEM)中保持培养1周。去除FGF/PDGF可使A2B5+细胞在3-7天后分化成为O4+髓鞘形成前少突细胞并在7-10天后形成MBP+成熟少突细胞。这些分化状态可从外观上的形态改变轻易区分：A2B5+细胞的具有双极形状，O4+髓鞘形成前少突细胞具有更长和更多分支的突起，而MBP+成熟少突细胞则在突起间包含了髓磷脂层。
以带有CH324 RNAi的慢病毒感染A2B5少突细胞前体细胞。将所得细胞培养3天并对O4(一种少突细胞分化标记)阳性少突细胞进行计数。通过Sp35 RNAi慢病毒感染减少内源Sp35表达并以RT-PCT确认。Sp35的减少可导致与对照感染细胞相比更高度分化和成熟的少突细胞，这可通过细胞突起长度的增加和大量髓磷脂层结构的存在得到证实(数据未显示)。在表达Sp35 RNAi的细胞中的成熟(O-4阳性)少突细胞数量为对照培养的三倍。该数据显示Sp35可负向调节少突细胞分化。显性-阴性Sp35促进少突细胞生长和分化
通过构建得到表达野生型和显性-阴性型Sp35的慢病毒载体。通过采用引物5′-GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCATGG AGA CAG ACA CAC TCC TG-3′(SEQ ID NO：350)和5′-GGG GCG GAA TTG GAT CCT CAC AGA TCC TCT TCT GAGATG AG-3′(SEQ ID NO：351)的PCR扩增编码小鼠全长Sp35(FL-Sp35，SEQ ID NO：2的氨基酸残基34-614)的DNA序列，并将其插入HRST-IRESeGFP慢病毒载体的NotI和BamHI位点。类似地，通过采用引物5′-GAG GAT CTC GAC GCG GCC GCA TGGAGA CAG ACA CAC TCC TG-3′(SEQ ID NO：352)和5′-GAT ACGGAT CCT CAG CCT TTG CCC CGG CTC CAT AGA AAC AGC-3′(SEQ ID NO：353)的PCR扩增编码显性阴性Sp35(DN-Sp35，SEQ IDNO：2的氨基酸残基34-581)的DNA序列。如Rubinson等人.，″Alentivirus-based system to functionally silence genes in primarymammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference，″Nat.Genet.33：401-06(2003)所述，该FL-Sp35和DN-Sp35质粒被转染进入293细胞以获得慢病毒。以每细胞2MOI的慢病毒感染少突细胞，并以western印迹验证FL-Sp35和DN-Sp35的表达。
DN-Sp35促进了少突细胞分化，导致了成熟少突细胞数量的上升。相反地，全长Sp35(FL-Sp35)的过量表达则具有相反的效果并且抑制了分化，这可通过与对照相比成熟少突细胞数量的减少得到证实(数据未显示)。实施例2Sp35-Fc蛋白的构建和纯化
为研究Sp35的生物功能，可制备一种融合了人Sp35(残基1-532)胞外部分和人IgG1的铰链和Fc区的构建体。人Sp35的部分编码序列可通过采用正向引物5′-CAG CAG GTC GACGCG GCC GCA TGC TGG CGG GGG GCG T-3′(SEQ ID NO：354)和反向引物5′-CAG CAG GTC GAC CTC GCC CGG CTG GTTGGC CAA CCA GCC GGG CGA GGT CGA CCT CGA GG-3′(SEQID NO：355)的PCR从克隆227.2获得。
该平头末端PCR产物被亚克隆至PCR SCRIPT AMP载体(Stratagene)的SrfI位点以创建PCR SCRIPT AMP-Sp35。从PCR SCRIPT AMP-Sp35分离SalI片段并亚克隆进入PCRCAMP Ig载体(来自Stratagene载体PCR SCRIPT AMP)。在PCRCAMP Ig载体中，铰链和Fc gamma序列被作为SalI(5′)亚克隆至NotI(3′)片段。该SalI Sp35片段被亚克隆至PCRCAMP Ig载体的SalI位点，从而在编码人Ig1铰链和Fc区序列的相同框架内融合了Sp35信号序列和胞外区(密码子1-532)。对分离物进行鉴定，并将包含了Sp35 Fc片段的NotI片段亚克隆至CHO表达载体PV90(Biogen Idee)的单NotI克隆位点。所得质粒以DNA测序验证，并命名为GT 123。
表达Sp35-Fc融和蛋白的稳定细胞系可通过以质粒GT123对CHO宿主细胞DG44进行电穿孔生成。在含有10％透析血清和4mM谷胺酰胺的alpha-MEM中培养转染CHO细胞以筛选非核苷酸依赖型生长。转染后14天以新鲜培养基培养细胞。为筛选表达Sp35-Fc的细胞，以藻红蛋白(PE)-标记的山羊抗人IgG(JacksonLabs)标记CHO细胞并在FACS Mo-Flo(Cytomation)中进行高速流式细胞分选。选择Sp35-Fc表达水平最高的细胞。将细胞扩增培养7天，然后再次标记和分选。Sp35-Fc表达水平最高的细胞作为单独克隆从96孔板分离。将克隆培养2周，然后在FACS分析的1天前施用新鲜培养基以检查表达水平。扩增Sp35-Fc表达水平最高的克隆，并建立冷冻细胞库。将细胞系在无血清培养基BCM16中进行悬浮培养。由这些克隆生产的Sp35-Fc的效价的检测可通过将细胞系在37℃下培养4-5代，然后将细胞培养至最大细胞密度的50％并在28℃下培养10-15天直至活细胞密度降至75％。此时收集培养基，离心去除细胞和碎片，通过使用抗人Ig抗体(Jackson Lab)作为探针的Western印迹分析滴定培养悬浮液的Sp35-Fc水平。
按如下步骤从澄清培养基纯化Sp35-Fc融和蛋白：向900ml条件培养基添加9ml pH 7.51M HEPES。在4℃下向3ml蛋白A琼脂糖(Amersham Bioscience)批量添加培养基3小时。在一个1.5cm(I.D.)柱上收集树脂，以3ml PBS洗涤四次，以含有800mMNaCl的4ml PBS洗涤两次，并再次以3ml PBS洗涤。以含有pH2.8的25mM NaH2PO4和100mM NaCl的1.5ml组分从柱上洗脱Sp35-Fc，并添加75μl pH8.6的0.5M NaH2PO4进行中和。通过280nm下的吸收对含蛋白的峰组分进行鉴定，合并，并在1mL蛋白A柱上进一步纯化。在加载前，添加NaCl至600mM并添加pH7.5的HEPES至50mM。以600μl pH7.5的10mM HEPES和1M NaCl洗涤柱子两次，然后以1ml PBS洗涤。以含有pH2.8的25mMNaH2PO4和100mM NaCl从柱上洗脱Sp35-Fc，收集0.5ml组分，并添加25μl pH8.6的0.5M NaH2PO4进行中和。通过280nm下的吸收对含蛋白的峰组分进行鉴定并合并。通过还原SDS-PAGE，该Sp35-Fc蛋白作为表观质量90kDa的单独条带(＞95％纯)进行迁移。在非还原条件下，该蛋白作为近似质量为180kDa的二聚体进行迁移。将纯化Sp35-Fc蛋白等分并储存在-70℃下。实施例3Sp35-特异性单克隆抗体的生产
特异结合本发明Sp35多肽的抗Sp35抗体可采用下列方法和步骤进行制备。A.抗体筛选分析1.ELISA分析
向96孔MaxiSorpTM平板(NuncTM)的每一个微孔添加Sp35-Fc(0.5μg溶于50μl pH9.0的0.1M重碳酸钠缓冲液中)。将平板在37℃下孵育1小时或在4℃下孵育16小时。以含有0.1％BSA、0.1％卵白蛋白、0.1％(溶于150mM NACE的5％(w/v)脱脂奶粉)以及0.001％叠氮化物的pH 7.4的25mM HEPES封闭平板上的非特异性结合位点。向平板上那个的每一排添加血清或杂交瘤悬浮液的稀释液(例如，连续三倍稀释液)，然后在25℃下培养1小时。以PBS洗涤三次后，向每个微孔添加50μl的一种辣根过氧化酶结合的山羊抗小鼠二级抗体(Jackson ImmunoResearch Inc.)的1∶10,000稀释液并继续孵育1小时。三次洗涤后，以TMB(Pierce)显色并以2M硫酸终止。以分光光度计在450nm下监测色彩强度。2.FACS分析
参照销售商描述以0.1μM CellTrackerTM绿色CMFDA(分子探针，Eugene，OR)标记COS-7细胞。在以抗Sp35测试血清或杂交瘤悬浮液进行培养前将等量的CellTrackerTM标记细胞与洗涤后的Sp35-COS-7细胞(通过Sp35表达载体的瞬时转染获得)相混合。将50微升的细胞混合物分布到96孔V形底聚苯乙烯板(3877，Corning，NY)上，并添加100μl的小鼠血清，杂交瘤悬浮液，或对照抗Sp35抗体。在4℃下培养30分钟后，洗涤细胞并培养于50μl溶于PBS中的藻红蛋白结合亲和性纯F(ab′)2片段山羊抗小鼠IgG Fc gamma特异性第二抗体(1∶200，Jackson ImmunoResearchLaboratory，West Grove，PA)。在孵育末期，以PBS洗涤细胞两次并悬浮于200μl含1％胎牛血清(FBS)的PBS中，然后进行FACS分析。替代性地，将Sp35-COS-7细胞或Sp35-CHO-细胞与小鼠血清或杂交瘤悬浮液混合，并以R-藻红蛋白-结合山羊抗-小鼠第二抗体处理，然后直接进行标准FACS分析。B.鼠单克隆抗-Sp35抗体的杂交瘤生产
以含有50μg Sp35-Fc(SEQ ID NO：2的氨基酸34-532融合至人IgG1的铰链和Fc区，按实施例2的描述制备)的乳状液或含有50μg人Sp35-Fc和50μl完全弗氏佐剂(Chemical Co.，St.Louis，MO)的乳状液每两周一次腹腔免疫八周大雌性RBF小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)。在第一次免疫前及第二和第三次免疫后1周采集免疫小鼠的血清，按如上所述通过对Sp35表达COS-7细胞进行FACS分析以测定抗-Sp35抗体效价。在第三次免疫后和杂交瘤融合启动前三天给用增强最终剂量。
按照上述方法以ELISA筛选经各种Sp35肽免疫的小鼠的血清。按照上述方法以流式细胞仪(FACS)鉴定对特异结合Sp35表达COS-7细胞的抗体呈阳性的小鼠，并将其处死。如Monoclonal Antibodies.Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses，ed.Kennett，R.H.，McKearn，TJ.and Bechtol，K.B.New York：PlenumPress(1982)所述从该小鼠分离脾细胞并融合至FL653骨髓瘤(一种Ig-/HGPRT-Balb/c小鼠脾细胞APRT-衍生物，保存在含10％FBS、4500mg/L葡萄糖、4mM L-谷胺酰胺和20mg/ml 8-氮鸟嘌呤的DMEM中)。将融和细胞涂布于24-或48-孔板(Corning Glass Works，Corning，NY)，并以含有腺嘌呤、氨喋呤和胸苷(AAT，可购自
Figure G2008800076855D01802
Chemical Co.，St.Louis，MO)的培养基进行培养。按照上述方法以ELISA或流式细胞仪筛选AAT抗性培养物对Sp35-COS-7细胞或Sp35-Fc的结合。通过有限稀释法进一步亚克隆阳性杂交瘤。
从Sp35-Fc免疫小鼠中分离得到17个生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系。表3A和3B中显示了来自杂交瘤的单克隆抗体的特性。
通过PCR分离编码单克隆抗体1A7、2F3、3P1D10.2C3和3P1E11.3B7可变区(VH和VL)的多聚核苷酸，将其克隆后按照下列方法进行序列分析。在标准条件下使用
Figure G2008800076855D01811
微型试剂盒从杂交瘤细胞提取总RNA，并使用RT-PCR从分离RNA生成cDNA。该RT-PCR使用一种引物的混合物。一种优选引物组合包括一种引物的5′端杂交至信号序列且引物的3′端杂交至FR4/恒定结构域3′端的引物。这可以支持对单克隆抗体N末端和V/C接头没有误读的完整可变结构域的扩增。本领域的技术人员应当理解对于扩增不同的模板以及不同的PCR条件需要修饰该引物对。有时可生产得到高度丰富的非生产信息(例如，来自融合伴侣的CDR3-FR4移码非生产轻链)或非特异性生产信息并使可变链的克隆复杂化。解决方案的一种是使用来自真正纯化抗体的N末端序列数据设计可进行克隆的简并引物。替代性地，可以使用Orlandi等人，PNAS86：3833(1989)所述的“固定”可变结构域N-和C-末端(即，该FR1的N-末端和FR4的C-末端均为引物确定)的“通用框架”引物。
此外，可用于设计更为有效引物的序列数据可从经凝胶纯化然后测序的主体RT-PCR产物获得。该PCR产物还能采用如TOPO克隆试剂盒(Invitrogen)等进行亚克隆，然后测序。然后从多个独立亚克隆或凝胶纯化片段获取序列数据以稳固建立共有序列。
P1E11.3B7的轻链序列可采用5′鼠kappa轻链信号序列引物：(i)5′GGG GAT ATC CAC CAT GGA TTT TCA GGT GCAGAT TTT CAG 3′(SEQ ID NO：356)，(ii)5′GGG GAT ATC CACCAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3′(SEQ IDNO：357)，(iii)5′GGG GAT ATC CAC CAT GAA GTT GCC TGTTAG GCT GTT G 3′(SEQ ID NO：358)，和(iv)5′GGG GAT ATCCAC CAT GAG GKC CCC WGC TCA GYT YCT KGG A 3′(SEQ IDNO：359)与3′鼠kappa恒定结构域引物：5′GCG TCT AGA ACT GGATGG TGG GAG ATG GA 3′(SEQ ID NO：4)的混合物测定，其中K＝G/T，R＝A/G，W＝A/T，Y＝C/T。对所得的PCR产物进行亚克隆并对多个独立亚克隆进行测序。该推导共有序列与Edman降解序列数据相一致。测序结果显示简并信号序列5′端序列5′GGG GAT ATCCAC CAT GRA GTC ACA KAC YCA GGT CTT YRT A 3′(SEQ IDNO：357)是可在扩增过程中得到3P1E11.3B7轻链可变结构域的引物。
3P1E11.3B7重链序列可采用鼠重链信号序列5′PCR引物：(i)5′GGG GAT ATC CAC CAT GGR ATG SAG CTG KGT MATSCT CTT 3′，(SEQ ID NO：360)(ii)5′GGG GAT ATC CAC CATGRA CTT CGG GYT GAG CTK GGT TTT 3′(SEQ ID NO：361)和(iii)5′GGG GAT ATC CAC CAT GGC TGT CTT GGG GCT GCT CTTCT 3′(SEQ ID NO：362)与简并鼠IgG CH1恒定结构域3′引物5′AGGTCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3′(SEQ ID NO：363)的混合物测定，其中K＝G/T，M＝A/C，R＝A/G，Y＝C/T。采用该混合引物的PCR在各种不同的循环条件下未能获得其推导N末端与纯化3P1E11.3B7抗体的Edman降解测得的序列相一致的重链可变结构域序列。因此我们采用了重链通用引物：FR15′AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3′(SEQ ID NO：364)和FR45′TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G 3′(SEQ ID NO：365)，其中M＝A/C，R＝A/G，S＝C/G，W＝A/T。该组合可得到其推导序列与实验3P1E11.3B7数据相一致的鼠重链可变结构域。
为了验证该重链可变结构域N-和C-末端是真实的而非引物确定的，可通过简并信号序列引物5′ATG GAR TGY AAYTGG ATH CTN CCN TTY A 3′(SEQ ID NO：366)和前述恒定结构域3′引物5′AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAGTGG ATA GAC 3′(SEQ ID NO：367)进行另一PCR反应，其中H＝A/C/T，N＝A/C/G/T，R＝A/G，Y＝C/T。简并信号序列引物的设计基于使用以上述“通用引物”进行的PCR反应得到的3P1E11.3B7共有推导FR1序列在基因库啮齿动物数据库TFASTA检索得到的最佳信号序列。该PCR可得到具有完整鼠重链可变结构域的产物。
该完整的3P1E11.3B7鼠可变结构域(根据需要可具有引导限制性酶切位点的沉默突变)可用于结合人IgG1和kappa恒定结构域cDNAs以分别构建嵌合重和轻链cDNAs。将该全长免疫球蛋白cDNAs亚克隆至一种称为pNE001的表达载体，后者为商用EBV哺乳动物细胞游离表达载体pCEP4的衍生物。重和轻链表达载体(分别称为pXW372和pXW363)被共转染至293-EBNA细胞。对瞬时转染细胞的培养基进行的Western印记分析(以人IgG-特异性试剂进行探测)确认了嵌合3P1E11.3B7-huIgG1、kappa mAb的表达。所得的3P1E11.3B7VH和VL多肽序列分别为表6和表8的SEQ ID NOs：173和209。1A7、2F3和3P1D10.2C3单克隆抗体的重和轻链序列可通过类似的方法测定。C.通过噬菌体展示鉴定抗-Sp35单克隆抗体
抗-Sp35单克隆抗体Fab片段可参照Hoet等人，Nat.Biotech.23：344-348(2005)；Rauchenberger，等人.，J.Biol.Chem.278：194-205(2003)；以及Knappik，等人.，J.MoI.Biol.296：57-86(2000)的描述从噬菌体展示库鉴定和分离。
可通过标准ELISA和IHC筛选方法从包含人源化合成抗体可变区的MorphoSys Fab-噬菌体展示库
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GOLD(表3B中的“噬菌体库-2”)筛选重组人可溶性Sp35-Fc蛋白。例如，参见Ostendorp，R.，Frisch，C.及Urban M，″Generation，engineering andproduction of human antibodies using
Figure G2008800076855D01842
″Antibodies，Volume 2Novel Technologies and Therapeutic Use.New York：KluwerAcademic/Plenum 13-52(2004)。对特异性结合Sp35的Fab噬菌体进行纯化和鉴别。表3B中的”噬菌体库-2-衍生单克隆Fab片段”显示了这些噬菌体展示衍生单克隆抗体Fab片段的特性。分离Fab-噬菌体1968被选择用于进一步分析。实施例4通过抗-Sp35单克隆抗体对Sp35进行免疫沉淀
为进行免疫沉淀，可通过用表达带HA标签的全长Sp35蛋白的DNA构建体瞬时转染COS-1细胞，以生成表达在N末端与血凝素蛋白标签(HA)融合的Sp35的COS-1细胞。在转染48小时后收集细胞并于1ml溶解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mMNaCl、1.5mM MgCl2、1mM EGTA、1％Triton X-100以及10％甘油)中在4℃下溶解30分钟。经14,000xg离心15分钟后，将上清液与蛋白A/G-琼脂糖珠(Santa Cruz)在4℃下孵育1小时，然后与1A7或2F3抗-Sp35鼠单克隆抗体在4℃下孵育1小时。以溶解缓冲液洗涤珠子3次，在Laemmli样本缓冲液中煮沸，上样至4-20％SDS-PAGE，并采用识别HA标签的抗体进行Western印迹分析。SDS-PAGE凝胶显示了单克隆抗体1A7或2F3免疫沉淀的人和鼠Sp35(图1)。如图1所示，单克隆抗体2F3可同时强烈免疫沉淀人和鼠Sp35，而强烈免疫沉淀人Sp35的单克隆抗体1A7仅能微弱识别鼠Sp35蛋白。类似的，单克隆抗体1G7、2B10、2F3、3P4C2.2D2、3P4C8.2G9、Li01、Li03、Li05、Li06、Li07、Li08、Li11和Li12可免疫沉淀人或小鼠或者人和小鼠Sp35(见表3B)。此外，Li08免疫沉淀Ap-Sp35而单克隆抗体1B6.4和3E3.1免疫沉淀内源Sp35(见表3B)。实施例5抗-Sp35抗体特异性结合Sp35的ELISA测定
为测定Sp35多肽的那些区域可被实施例2中制备的各种杂交瘤和噬菌体展示衍生的单克隆抗体所结合，可采用一组参照实施例1所述的方法融合至IgG1的铰链和Fc区的平头Sp35多肽进行ELISA测定。该组合由下列Sp35片段组成：SEQ ID NO：2的氨基酸34-425，SEQ ID NO：2的氨基酸417-532，，SEQ ID NO：2的氨基酸417-493，，SEQ ID NO：2的氨基酸34-532。卵白蛋白和BSA被用作对照。如表3B所示，杂交瘤衍生的mAbs 2F3、2B10、3A3、3P4c2.2d2和3P4c8.2g9以及Fab-噬菌体衍生的mAbs 3383、3563、3564、3565、3568、3569、3570和3582均特异性结合1-417和1534Sp35片段，说明这些抗体结合Sp35 LRR区的表位。杂交瘤衍生的1A7、3P1B 11F9、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、3P2C63G10.2H7、2P2C9.2G4、3P4A61D9和394C51D8以及Fab-噬菌体衍生的3495、3566、3567和1968特异性结合至34-532Sp35片段并微弱结合417-532Sp35，显示这些抗体可能与至少包括Sp35LRR区C末端的一部分表位相结合。在类似的试验中，这些后述抗体还能特异性结合由人Sp35氨基酸34-534组成的Sp35多肽，并对小鼠和大鼠Sp35具有较低的亲和性。当小鼠或大鼠Sp35的氨基酸419由组氨酸(H)变为精氨酸(R)时，这些后述抗体对小鼠和大鼠Sp35的亲和性可恢复至与使用人Sp35时相当的水平。精氨酸是人Sp35的419位上的氨基酸。经测定单克隆抗体1A7结合人Sp35的KD为10nM(1x10-9M)而结合鼠Sp35的KD为20μM(2x10-5M)。对于检测抗体与417-532区的结合的Ap-Sp35ELISA，该ELISA可按如下步骤进行：将Mabs涂布于ELISA平板，然后与一种Sp35-AP融和蛋白在4℃下培养过夜，随后在RT中加入AP-连接的抗-人(H+L)(1∶5,000，Jackson ImmunoResearch)1小时，或与AP-融合蛋白在4℃下培养过夜。然后以pH10.5的溶于0.1M甘氨酸、1mM MgCl2、1mM ZnCl2的10mg/ml 4NPP使AP底物显色，并在O.D.405下读数。
在类似的实验中，通过ELISA测试考察了单克隆抗体3B5.2和7P1D5.1G9以及7P1D5.1G9抗体的Fab片段结合人Sp35、Sp35的完整LRR区、Sp35和鼠Sp35的Ig区的能力。如图3C所示，3B5.2、7P1D5.1G9以及7P1D5.1G9的Fab片段结合人和鼠Sp35。3B5.2和7P1D5.1G9单克隆抗体还结合Sp35的LRR区。见表3C。
在以固定至组织培养微孔底部的3B5.2单克隆抗体进行的Sp35结合测试中，如下抗体未阻断3B5.2与Sp35的结合：Li03、Li05、Li08、Li011以及Li013的Fab片段。实施例6抗-Sp35抗体特异性结合Sp35的FACS测定
为进一步鉴定参照实施例3的描述制备的杂交瘤衍生的抗-Sp35mAbs 1A7和2F3的结合属性，可对固定和游离的COS-7或293细胞表达的小鼠或人Sp35进行比较。固定Sp35转染和非转染细胞并进行FACS分析(FACS：将人或小鼠Sp35或载体对照转染的细胞从培养平板解离，以2％FBS/PBS洗涤，然后在冰上与1μg/ml一抗孵育1小时。以2％FBS/PBS洗涤细胞3次，然后在冰上与PE标记的二级抗体(1∶100，JacksonlmmunoResearch)孵育30分钟。在以2％FBS/PBS洗涤2次后，以2％PFA固定细胞并通过PE进行FACS分析)。FACS结果显示MAbs 1A7和2F3可结合表达Sp35的COS-7或293细胞，但不结合不表达Sp35的对照细胞(图2)。
在类似的实验中，以Sp35稳定转染的CHO细胞被用于FACS分析，以进一步鉴定3B5.2和7P1D5.1G9的结合特性。如图11所示，3B5.2和7P1D5.1G9结合转染CHO细胞上的Sp35。特别地，测试了3B5.2和7P1D5.1G9抗体结合用人或鼠Sp35转染或者表达人或鼠Sp35的CHO细胞的能力。如图11所示，通过平均荧光(MCF)测得的3B5.2和7P1D5.1G9抗体结合的细胞数随着所用抗体的浓度而上升。此外，通过平均荧光(MCF)测量，3B5.2抗体比7P1D5.1G9结合更多的细胞。实施例7神经突生长测定
为检测上述制备的杂交瘤衍生和Fab噬菌体衍生的单克隆抗体对髓磷脂抑制剂(例如，OMgp)的神经元抑制作用的逆转，使用0.1mg/ml聚-D-赖氨酸
Figure G2008800076855D01871
涂布Lab-
Figure G2008800076855D01872
培养玻片(4孔)。将Ap-OMgp(1μg/点)或PBS作为3μl微滴点样。然后以10μg/ml层粘蛋白(GibcoTM)洗涤和涂布Lab-
Figure G2008800076855D01873
玻片。以1mg/ml 1型胶原酶(Worthington)解离P6-7 Sprague Dawley大鼠幼鼠的背根神经节(DRG′s)，用预涂布的火抛光巴斯德移液管进行粉碎以富集神经元细胞并最终以10,000细胞/孔在预涂层Lab-
Figure G2008800076855D01881
培养玻片上进行涂布。在DRGs涂布后立即加入10μg/ml mAb 1A7或2F3。采用含有5％热灭活供体马血清，5％热灭活胎牛血清以及50ng/ml小鼠神经生长因子(mNGF)的F12培养基(购自Gibco/Invitrogen)，在37℃5％CO2存在下孵育6小时。孵育过后，以4％多聚甲醛/20％蔗糖固定玻片并在16小时后以抗-βIII-微管蛋白TUJ1抗体(Covance)进行染色。
随后添加以1∶300稀释的抗-小鼠Alexa-
Figure G2008800076855D01882
594二级抗体(Molecular Probes)至玻片并在室温下孵育2小时。用Gel/MountTM
Figure G2008800076855D01883
覆盖玻片。使用OpenLabTM软件(Improvision，Inc.，Lexington，MA)获取5x数字图象，并使用OPENLABTM软件分析对图象进行神经突生长定量分析，以上过程均参照生产商指定的参数。
MAbs 1A7和2F3均可保护DRG神经元不受OMgp介导的神经突生长抑制。(图3)。3B5.2也可保护DRG神经元不受OMgp介导的神经突生长抑制(数据未显示)。实施例8单克隆抗体1A7促进大鼠脊髓损伤模型的功能恢复
脊髓损伤(“SCI”)可参照经改造的前述方法(Li，S.等人.J.Neiirosci.24，10511-10520(2004))通过下述脊髓半切进行引导。对麻醉的雌性Long Evans大鼠(7周大，Charles River)进行手术前止痛(丁丙诺啡/布诺啡，0.05mg/kg s.c.)和镇静(咪哒唑仑，2.5mg/kgi.p.)，然后在胸椎6/7进行脊髓半切从而阻断主背内侧和背外侧皮质脊髓束(CST)。皮质脊髓束(CST)的脊髓和背外侧部分完全中断，CST的腹部部分保持完整。在各治疗组中腹侧组织桥在半切后约占脊髓的20％(数据未显示)。
Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)采用开放空间评分方法对后肢功能进行定量(Eby，M.T.等人，J.Biol.Chem.275，15336-15342(2000)，incorporated herein by reference)，所有动物在SCI后均有显著的功能缺陷，且在术后患有几乎完全的后肢瘫痪。在CST横切后立即向蛛网膜下空间的T7插入一个鞘内导管，并连接至插入皮下空间的预充微型渗透泵(Alzet model 2004，AlzaCorp)。微型渗透泵可超过5周以0.25μl/h的速率连续传递人IgG同型对照蛋白(5mg/ml)或单克隆抗体1A7(4.8mg/ml)。对照(人IgG治疗的)动物在5周的试验中恢复了实质功能，在3-4周达到峰值，最终得到9±0.45的平均BBB分值(图7)。而在脊髓横切后连续5星期鞘内灌输1A7可相对对照动物明显提高BBB分值，其功能在2-5周的时间段内连续提升，达到11.1±0.7的BBB分值(图4)。这些结果显示以抗-Sp35单克隆抗体1A7进行治疗可促进脊髓损伤后的功能恢复，这可通过BBB分值的提高，以及轴突免疫组化染色观察到的轴突再生和轴突收缩得到证明。3B5.2也可促进脊髓损伤后的恢复(数据未显示)。实施例9抗-Sp35抗体1A7、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、6P4F4.1D3、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、Li05、Li06、Li08、Li13、Li28、Li33、D05、D08和3B5.2体外促进髓鞘形成
抗-Sp35抗体1A7和2F3对髓鞘形成的作用可通过以抗-Sp35抗体1A7和2F3处理背根神经节(DRG)神经元和少突细胞的共培养并以免疫组化和Western印迹测试髓鞘形成进行体外观察。在这些研究中需要生成DRG神经元和少突细胞的原代培养。
雌性Long Evans大鼠E14-E17的胚胎背根神经中枢的培养可参照Plant等人，J.NeuroSci 22：6083-91(2002)。将切开的DRGs覆盖于聚-L-赖氨酸-涂布的玻片(100μg/ml)两周。将细胞在氟脱氧尿苷存在下培养2-6天，并在含1x B27，100ng/ml NGF(Gibco)的NLA培养基中培养8-11天。
雌性Long Evans新生2日(P2)大鼠少突细胞的培养可参照Conn，Meth.NeuroSci 2：1-4(Academic Press；1990)并作如下的修改。简单的说，将前脑从P2大鼠中摘除并置于冷HBSS培养基(Gibco)中。该组织片段被切成1mm切片并在37℃下于0.01％胰岛素和10μg/ml DNase中培养15分钟。将解离细胞置于涂布了聚-L-赖氨酸的T75组织培养瓶中并在含20％胎牛血清的DMEM中于37℃下培养10天。将A2B5少突细胞在含有25mM D-葡萄糖、4mM L-谷胺酰胺、1mM丙酮酸钠、50μg/ml人apo-铁传递蛋白、5μg/ml牛胰腺胰岛素、30nM硒酸钠、10nM氢化可的松、10nM D-生物素、1mg/ml BSA、10ng/ml FGF以及PDGF的DMEM(Gibco)中培养7天。然后以胰蛋白酶化处理收集细胞。将细胞与DRG神经元在1、3、10或30μg/ml的抗Sp35单克隆抗体1A7或2F3，或是在含有2％胎牛血清、50μg/ml抗坏血酸、100ng/ml NGF(Gibco)的NLA培养基中的阴性对照抗体存在或缺失的情况下进行共培养。该种测试中施用的有效抗体剂量随抗体而不同，并在0.1μg/ml至10μg/ml的范围内。本领域的技术人员应当能够采用此处的测定确定有效剂量。
每三天更换培养基并补充不同的单克隆抗体。经37℃培养30天后，对共培养细胞使用抗-βIII-微管蛋白抗体进行神经丝免疫组化(“IHC”)染色以鉴别轴突，或使用抗-MBP抗体鉴别少突细胞(图4A-E)。还可溶解共培养细胞并进行Western印迹分析以对MBP定量(图4G)。根据IHC和Western印记分析，以抗-Sp35抗体1A7和2F3处理的共培养细胞显示出少突细胞和神经元存活，轴突束数量以及MBP阳性细胞数量均得到了提高(图4F，与对照抗体处理的共培养相比有多10倍的MBP阳性细胞)。
在类似的试验中，少突细胞和DRG共培养物在抗-Sp35抗体Li05或Li06，或者阴性对照抗体存在或缺失的情况下进行孵育。可溶解共培养细胞并进行Western印迹分析以对MBP定量(图8)。根据Western印记分析，以抗-Sp35抗体Li05和Li06处理的共培养细胞显示出MBP阳性细胞数量的上升，这与以3、10和30μg的Sp35-Fc(LINGO-1-Fc)处理的共培养类似。
在类似的试验中少突细胞和DRG共培养在抗-Sp35抗体3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、6P4F4.1D3、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、Li08、Li13、Li28和Li33存在或缺失的情况下进行孵育，并同样促进了髓鞘形成。类似的，全长抗体D05和D08同样促经了髓鞘形成。在DRG共培养实验中促进髓鞘生成所需的3B5.2和7P1D5.1G9抗体的最低有效剂量为0.1μg/ml。
此外，在体外髓鞘形成测试中对7P1D5.1G9Fab片段进行了类似的测验。该7P1D5.1G9Fab片段在1.0μg/ml的浓度下促进髓鞘形成。
这些结果显示以抗-Sp35抗体1A7、2F3、3P1D10.2C3、3P1E11.3B7、6P4F4.1D3、6P4F4.1F9、7P1D5.1G9、Li05、Li06、Li08、Li13、Li28、Li33、D05、D08和3B5.2处理DRG-少突细胞共培养与对照抗体处理的共培养相比可促进成熟少突细胞轴突相互作用和髓鞘形成。实施例10抗-Sp35抗体和Fab片段在体内促进少突细胞存活和髓鞘形成
参照Morell P等人，Mol Cell Neurosci 12：220-7(1998)描述的方法以cuprizone(按重量0.2％与研磨的小鼠食物混合磨碎)喂养成年野生型C57B1/6雄性小鼠6周以引导胼胝体内的髓鞘脱失。简单的说，通过下述方法在cuprizone喂养的第2、2.5和3周将抗-Sp35单克隆抗体1A7立体定向注射至脱髓鞘胼胝体。以含有对照抗体的无菌培养基在相同的间隔下进行立体定向注射至脱髓。在6周的cuprizone喂养完成后，将小鼠恢复正常食物喂养2、4和6周(仅研磨的老鼠食物)以进行髓鞘再生。
1A7和对照单克隆抗体按如下方式传递。以克他命(80mg/kg体重)和甲苯噻嗪(10mg/kg体重)麻醉该cuprizone处理的小鼠并将其固定在专为立体定向手术设计的固定化装置(DavidKopf Instruments)上。将头皮打开并使用在前囱的背面0.7mm及侧面0.3mm以及1.7mm深度的立体定向坐标，通过10μl汉密尔顿注射器将该无菌化合物(1μM溶于1ml HBSS)单面注射至野生型受体小鼠的急性髓鞘脱失胼胝体(Messier等人，Pharmacol.Biochem.Behav.63：313-18(1999))。以不含化合物的HBSS立体定向注射对照受体小鼠。以明胶海绵填充头骨开口，以青霉素和链霉素(Gibco)擦洗该区域，然后缝合伤口。在试验过程中每周处死注射后的小鼠并取出并处理其大脑，然后进行分子、生物化学和组织学分析。
该种接受抗-Sp35抗体1A7处理的动物显示成熟少突细胞存活(基于CC1抗体染色，图5A)和轴突髓鞘形成得到了提高(基于采用抗MBP蛋白抗体或luxol fast blue的IHC，图5B)。对CC1抗体阳性少突细胞在4周和6周进行定量(图5C)。这些结果显示抗-Sp35抗体1A7处理与对照抗体处理的小鼠相比促进了成熟少突细胞存活和轴突髓鞘形成。类似的，接受1A7抗体或1μg/ml的7P1D5.1G9Fab片段的髓鞘脱失的溶血卵磷脂模型动物与对照动物相比也可以促进轴突髓鞘形成。实施例11抗-Sp35抗体1A7在视神经转染模型中促进视网膜神经节细胞(RGC)存活
在视神经转染模型中对抗-Sp35抗体1A7进行测试，考察影响神经元功能的因素。本研究中使用青年雌性Sprague Dawley(SD)大鼠。从各动物视神经盘1.5mm处框内切断右视神经。以一片浸有6％的氟-金(FG)的明胶海绵处理视神经盘后的新横切位点以标记存活视网膜神经节细胞(RGCs)。动物被分为三组(每组n＝6)，分别通过玻璃体内注射抗-Sp35抗体1A7，对照抗体或仅PBS。每次玻璃体内注射量为4μl，剂量2μg。在视神经横切后立即进行玻璃体内注射。
所有动物均存活一周。在处死动物前两天，横切各动物的左视神经并按如上所示使用6％FG标记存活RGCs，以作为内对照。使用过量戊巴比妥钠处死动物，在4％的多聚甲醛中切开视网膜。通过四次径向切割将视网膜分成四等分(上部，下部，鼻部以及颞部)。在使用封固剂(Dako)进行平面封固前将视网膜在相同的定色剂中固定1小时。在使用紫外滤光器的荧光显微镜中检查玻片(激发波长＝330-380nm)。沿各象限的中线从视神经盘到视网膜的外部边界以的500μm间隔，使用200X200μm2的目镜网格对标记RGCs进行计数。各种处理所得的存活RGCs的百分比可通过将损伤眼睛与另一侧的眼睛的存活RGCs数量相比较进行表达。所有的数据均以平均±SEM表达。统计显著性可先后通过单因素方差分析和Tukey-Kramer事后检定进行估计。当p＜0.05时可认为有显著性差异。经抗Sp35抗体1A7治疗的动物显示的神经元存活率(80％)明显高于经对照抗体或PBS治疗的动物，后两者分别仅显示出约50％的神经元存活率(图6)。实施例12在视神经压伤模型中测试抗-Sp35抗体对髓鞘再生的作用
在玻璃体内注射2ml给用2μ1的单克隆抗体1A7、2F3、Li05和Li06后立即使用#5镊子在眼球后方1.5mm处的眼眶内完全夹住右视神经10秒钟。
在手术后一周再次向动物玻璃体内注射同一治疗剂。术后两周，以EM定色剂灌注动物，固定后处理以进行半薄和超薄切片。制备和染色纵向视神经切片以进行髓磷脂观察。在不同的治疗组中比较压伤视神经的邻近和末梢部分的髓鞘形成。对Sp35-Fc以及1A7、2F3、Li05和Li06治疗的动物相对于适当的对照在视神经末梢部分的髓鞘再生进行分析。实施例13在视神经压伤模型中测试抗-Sp35抗体对轴突再生的作用
在玻璃体内注射给用2μg的溶于PBS的单克隆抗体1A7后立即使用#5镊子在眼球后方1.5-2mm处的眼眶内夹住右视神经10秒钟。4只大鼠接受1A7抗体，8只大鼠用作对照动物。在手术后一周再次向动物玻璃体内注射同一治疗剂。在处死试验动物前3天(试验11日)玻璃体内注射2ml CTB-FITC以顺行性标记再生视神经轴突。术后14日，灌注并固定动物。处理该压伤视神经进行冷冻纵向切片。在压伤部位外不同距离处的CTB-FITC标记的跨越病灶的轴突被作为再生纤维计数。当向眼部注射1A7时，压伤位点处观察到的再生轴突可达250μm。见图10。实施例14使用MOG诱导的EAE大鼠模型测试抗-Sp35抗体促进髓鞘再生以及视神经修复的作用
在这些试验中采用了髓磷脂少突细胞糖蛋白(MOG)诱导的实验自体免疫脑脊髓炎(EAE)大鼠模型。该模型可用于人多发性硬化症。50μl的200ng完全弗氏佐剂(Chondrex Inc.)与50μl的50μg MOG在盐水中乳化(1∶1)并在皮内注射至各动物尾底部前置于冰上。所有试验中均采用8-10周大的雌性brown Norway大鼠。本领域的一般观察显示该EAE模型在MOG注射后约15日被诱导。按EAE的临床症状对大鼠进行分类。该症状分类如下：0.5级，尾部末梢局部麻痹；1分，尾部完全麻痹；1.5分，尾部麻痹以及后腿轻微麻痹；2.0分，单侧严重后腿麻痹；2.5分，双侧严重后腿麻痹；3.0分，完全双侧后腿麻痹；3.5分，完全双侧后腿麻痹及一条前腿的局部麻痹；级别，完全麻痹(四肢麻痹)，垂死状态，或死亡。在EAE模型被诱导后对动物进行治疗。
MOG-EAE诱导后15日在玻璃体内注射2μg/μl的抗-Sp35抗体(1A7)。在22日和28日再次注射2μg/μl的抗-Sp35抗体，1A7。试验终止后向动物灌注4％PFA。将视神经以1％OsO4固定，并在环氧树脂中脱水和包埋。半薄切片(1μM)后使用甲苯胺蓝染色以进行髓鞘形成的评估。对治疗动物和未治疗动物的视神经中的轴突再生和髓鞘再生进行比较。所有的程序均参照经实验动物管理与使用委员会(IACUC)认可的方案。
接受抗-Sp35抗体1A7治疗的动物与未接受治疗的MOG-诱导EAE动物或普通的视神经相比显示出了髓鞘再生和视神经修复(图9)。在图9C中，箭头指向有髓鞘的轴突。接受一种识别链球菌蛋白G的III区(MOPC21)但对Sp35没有特异性的抗体的动物与未治疗动物或普通视神经相比未显示出髓鞘再生或视神经修复的现象(数据未显示)。Sp35拮抗剂抗体1A7在大鼠MOG-诱导EAE视神经炎模型中促进了髓鞘再生和视神经修复(图9)。实施例15使用MOG诱导的EAE小鼠模型测试抗Sp35抗体对促进CNS髓鞘再生的作用
使用以完全弗氏佐剂(CFA)乳化的100μg MOG1-125蛋白对小鼠129B6混合株进行皮内免疫(0日)以诱导EAE。注射量为每只小鼠100μl，并分布至3个位点(耳廓，背部和皮肤)。乳剂以1∶1的体积比进行制备并含有1mg/ml MOG1-125和2mg/ml结核分枝杆菌(菌株H37Ra，Chondrex)。在免疫当日及其后2日腹膜内给用百日咳毒素(200ng/小鼠)。每日记录体重和临床EAE评分(0＝无临床表现；1＝跛腿；2＝后腿虚弱，翻正反射减弱或步态蹒跚；3＝后腿完全麻痹或无翻正反射；4＝后腿完全麻痹且前腿一定程度麻痹；5＝动物完全麻痹；6＝垂死或死亡)。所有的程序均参照经我们的实验动物管理与使用委员会(IACUC)认可的方案。该动物在试验0日以1A7、2F3、Li05和Li06单克隆抗体或对照抗体治疗。在整个试验过程中的不同时间通过眼球后采血技术采取血样。从PBMC离心分离血浆并通过FACS染色确定细胞表型。通过采用亚类/同型特异性mAbs(Pharmingen)的ELISA进行体液抗-MOG抗体响应分型。在各试验末尾，灌注后采集脑、脊髓、视神经和坐骨神经。
同样的方案可用于在Sp35敲除小鼠和同胎仔畜中进行EAE诱导。Sp35敲除小鼠通常比对照具有更低的EAE分值(1.5)且没有复发(45天期限内)，其次是野生型同胎仔畜(EAE分值3.5)。
将Sp35-Fc和1A7、2F3治疗的动物与对照比较分析髓鞘再生。
组氨酸标记的MOG1-125蛋白可在采用强力霉素可诱导TetO-AOX1启动子的毕赤酵母中表达(M.Levesque，D.Krushinskie和K.Strauch，手稿准备中)。大鼠MOG的胞外编码序列(去除信号序列的成熟蛋白中从G1y1至Gly125)可通过PCR采用下列引物扩增：5′GGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGCATCATCATCATCATCATATGGGACAGTTCAGAGTGATAGGG 3′(SEQ ID NO：368)，和5′TTCGCGGCCGCTATTAGCCAGGGTTGATCCAGTAGAAGGG3′(SEQ ID NO：369)。实施例163B5.2变体的构建
如下为3B5.2抗体的可变轻链(VL)的氨基酸序列，CDRs以下划线显示，N-连接的糖基化位点以粗体和双下划线显示：QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSRVS YVHWYQQKSGTSPKRWLYDT SNLASGVPAR FGG
Figure G2008800076855D01981
GTSY SLTISSMEAEDAATYYCQQW STNPPTFGGG TKLEIK(SEQ ID NO：417)。为了确定3B5.2抗体的表达和/或该抗体与Sp35的结合是否受到糖基化位点去除的影响，构建了3B5.2变体。特别地，FR3中的Kabat位置63-38被突变为人和鼠kappa轻链共有序列SGSGSG(SEQ IDNO：418)。所得的突变3B5.2可变轻链如下，突变的氨基酸以粗体和双下划线显示：QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSRVS YVHWYQQKSG TSPKRWLYDT SNLASGVPAR F
Figure G2008800076855D01982
G
Figure G2008800076855D01983
GSGTSYSLTISSMEAE DAATYYCQQW STNPPTFGGG' TKLEIK(SEQ IDNO：419)。
经测试3B5.2抗体和变体3B5.2抗体结合Sp35蛋白的能力相同。此外，根据电泳迁移率数据，显示该3B5.2可变轻链被糖基化，而变体轻链未被糖基化。最后，两种抗体在转染细胞中的表达水平相同。实施例17人源化1A7抗体的构建
1A7轻链和重链的序列轻链：1 Q
Figure G2008800076855D01991
VLTQSPAI MSASPGEKVT MTCWYQQKSGTSPKRW
Figure G2008800076855D01993
5051
Figure G2008800076855D01994
GVPA RFS
Figure G2008800076855D01995
SGSGTSSLTISSMEA EDAATYYC
Figure G2008800076855D01998
FGS  100101 GTKLEIK (SEQ ID NO：283)重链1 QVQLVQSGPE LKKPGETVKI SCK
Figure G2008800076855D01999
S
Figure G2008800076855D019910
WVKQAPGKGLKWMG
Figure G2008800076855D019911
5051
Figure G2008800076855D019912
RFAFS
Figure G2008800076855D019913
ETSASTVYL QFNNLKNEDTATYFCA100101
Figure G2008800076855D019915
WGQGTTVT VSS (SEQ ID NO 170)粗体下划线：Kabat CDR残基 斜体下划线：Chotia CDR残基标准残基参照Kabat方案进行编号鼠可变区的分析
决定簇互补区(CDRs)包含了极可能结合抗原的残基，并必须保留在改造的抗体内。CDRs可参照Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition，U.S.Dept.Health and Human Services.U.S.Govt.Printing Office(其全文在此引入作为参考)的序列进行定义。CDRs落入标准类别(Chothia，C，Lesk，A.M.，Tramontano，A.，Levitt，M.，Smith-Gill，SJ.，Air，G.，Sheriff，S.，Padlan，E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，P.M.，Spinelli，S.，Alzari，P.M.和Poljak，RJ.(1989)Nature 342：877-883，其全文在此引入作为参考)，其中关键残基很大程度上决定了该CDR环的结构构象。这些残基几乎始终保留在改造的抗体内。重和轻链的CDRs被分为如下的标准类别：轻链  重链L1：10残基 1类  H1：5残基   1类L2：7残基  1类  H2：17残基  2类L3：9残基  1类  H3：7残基   无标准类别表10中显示了对这些CDR类别重要的标准残基。表10L1 1类 2(I)25(A)30(V)33(M)71(Y)L2 1类 48(I)51(T)52(S)64(G)L3 1类 90(Q)95(P)H1 1类 24(A)，26(G)，27(F)，29(F)，34(M)，94(R)H2 2类 52a(T)55(G)71(L)H3 无标准类别
采用BLAST程序和内部编辑的共有和种系blast蛋白序列数据库对可变轻和重链与共有(Kabat等人，1991)和种系序列(Brensing-Kuppers J，Zocher I，Thiebe R，Zachau HG.(1997).Gene.191(2)：173-81和Matsuda F，Ishii K，Bourvagnet P，Kuma K，Hayashida H，Miyata T，Honjo T.(1998)J Exp Med.188(11)：2151-62，其内容在此全文引入作为参考)进行鼠和人亚基型的比较。
可变轻链是鼠亚型Kappa6的成员，在109氨基酸重叠中具有94％一致性，并来自于鼠kk4种系(100％ID)(参见下文)>mukk4Query：1QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR60QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARSbjct：1QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAR60Query：61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ IDNO：451)FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP (SEQ IDNO：451)Sbjct：61 FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94 (SEQ IDNO：451)
可变重链是鼠亚型HVMS的成员，在132氨基酸重叠中具有55％一致性，并来自于鼠VGK6种系(92％ID)(参见下文)>muVGK6Query：1QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY60Q+QLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINT+TGEPTYSbjct：1QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTY60Query：61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFC 96(SEQ IDNO：452)+DF+GRFAFSLETSAST YLQ NNLKNEDTATYFC    (SEQ IDNO：453)Sbjct：61 ADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC 96(SEQ IDNO：454)
可变轻链对应于人亚型Kappa3，在109氨基酸重叠中具有67％一致性，并最接近人L6种系(64％ID)(参见下文)>huL6Query：1 QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVS-YMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPA 59+IVLTQSPA +S SPGE+ T++C AS SVS Y+ WYQQK G +P+ IYDS A+G+PASbjct：1EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA60Query：60 RFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNP 94(SEQ IDNO：455)RFSGSGSGT ++LTISS+E ED A YYCQQ S+ P    (SEQ IDNO：456)Sbjct：61 RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP 95(SEQ IDNO：457)
可变重链对应于人亚型MHV1，在129氨基酸重叠中具有59％一致性，并最接近人huVH7-81种系(70％ID)(参见下文)Query：1QVQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTDTGEPTY60QVQLVQSG E+K+PG +VK+SCKASGY+FT YGMNWV QAPG+GL+WMGWNT TG PTYSbjct：1QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYSFTTYGMNWVPQAPGQGLEWMGWFNTYTGNPTY60Query：61 TEDFQGRFAFSLETSASTVYLQFNNLKNEDTATYFCAR  98(SEQ IDNO：458)+F GRF FS++TSAST YLQ ++LK ED A Y+CAR   (SEQ IDNO：459)Sbjct：61 AQGFTGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCAR 98(SEQ IDNO：460)可变区结构建模
为了该种人源化，我们根据OKT3(PDB ED 1SY6-用于轻链建模)和TE33(PDB ED ITET-用于重链建模)抗体的晶体结构构建了P1A7可变区的模型。改造可变区的分析
我们尝试寻找不需要在位置(L4、38、43、44、58、62、65-69、73、85、98和H2、4、36、39、43、45、69、70、74、92)中回复突变的(backmutated)最类似人表达抗体序列(例如，参见美国专利6,407,213，其内容在此全文引入作为参考)，并将其用作抗体框架。我们使用该内部设计的抗体序列数据库和查询工具，以鉴定在标准、界面和覆盖区具有最类似于鼠P1A7序列的合适模板，从而减少回复突变的数量。在FR4区以共有残基填入的种系序列被单独考虑。在考虑多个框架后，种系序列huL6和VH7-81被分别选择作为重和轻链的受体框架。
设计了三种可变轻改造链的类型，和三种可变重改造链的类型。第一种类型包含了最少的回复突变，而第三种类型包含了最多的回复突变(即，“人源化”最少)。在改造的VL中的回复突变huL6
e1Q Q1指向抗原，电荷变化可能改变结合。存在于类型2和3中。L46R R46是支持CDR-L1和CDR-H3的VH/VL界面上的非常见残基。存在于所有类型中。L47W-W47位于CDR-L2下的簇中。仅存在于类型3中。I58V-V58位于CDR-L2下的簇中。仅存在于类型3中。F71Y-Y71是对于支持CDR-L1和CDR-L3很重要的标准残基。存在于所有类型中。在改造的VH中的回复突变huVH7-81P38K K38支持CDR-H2。存在于类型2和3中。E46K K46支持CDR-H2。存在于类型2和3中。M71LL71是支持CDR-H1的标准残基。存在于所有类型中。A78V V78由种系A超突变(hypermutated)得到，并支持CDR-H1。I82F F82是核心包装残基(core packing residue)。仅存在于类型3中。Y91F F91是VH/VL界面上的残基。仅存在于类型3中。对P1A7的人源化设计框架来自于序列：轻链：huL6重链：huVH7-81回复突变以小写粗体显示CDRs以下划线显示＞轻链变体1EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTD
Figure G2008800076855D02052
TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK    (SEQ IDNO：430)>轻链变体2
Figure G2008800076855D02053
IVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTD
Figure G2008800076855D02055
TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK    (SEQ IDNO：431)>轻链变体3IVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPR
Figure G2008800076855D02057
IYDTSKLASG
Figure G2008800076855D02058
PARFSGSGSGTD
Figure G2008800076855D02059
TLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSNPFTFGQGTKVEIK    (SEQ IDNO：471)>重变体1QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVPQAPGQGLEWMGWINTDTGEPTY TEDFQGRFVFS
Figure G2008800076855D020510
DTSASTYLQISSLKAEDMAMYYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：472)>重变体2QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWV
Figure G2008800076855D020512
QAPGQGL
Figure G2008800076855D020513
WMGWINTDTGEPTY TEDFQGRFVFSDTSAST
Figure G2008800076855D020515
YLQI SSLKAEDMAMYYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：432)>重变体3QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWV
Figure G2008800076855D020516
QAPGQGL
Figure G2008800076855D020517
WMGWINTDTGE PTY TEDFQGRFVFS
Figure G2008800076855D020518
DTSASTYLQ
Figure G2008800076855D020520
SSLKAEDMAMYCAREGVHFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：473)重变体2的全长多肽和多聚核苷酸重链序列huP1A7-IgGl H2重链的DNA序列(pXW465)1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAGCACCAGGTGC51 CCACTCCCAG GTCCAACTGG TACAGTCTGG ACACGAGGTGAAGCAGCCTG101 GAGCATCAGT CAAGGTCTCC TGCAAGGCCT CTGGGTATACCTTCACAAAC151 TATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCT GGACAAGGTTTAAAGTGGAT201 GGGCTGGATA AACACCGACA CTGGAGAGCC AACATATACTGAAGATTTCC251 AGGGACGGTT TGTCTTCTCT TTGGACACCT CTGCCAGCACTGTTTATTTG301 CAGATCAGCA GCCTCAAAGC TGAGGACATG GCAATGTATTACTGTGCAAG351 AGAGGGGGTC CACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGGACCCTTGTCACCGTCT401 CCTCAGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCC451 AAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTA501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCG551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTC601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACAT651 CTGCAACGTG AATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAAGTTG701 AGCCCAAATC TTGTGACAAG ACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCT751 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGA801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACG851 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTG901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCAC951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATG1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATC1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTA1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAGGTCAGCCTGA1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAG1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGTTGGA1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCA1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTG1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCCG GTTGA(SEQ ID NO：461)huP1A7H2重链的预测蛋白序列(信号序列以下划线显示)1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGHEV KQPGASVKVSCKASGYTFTN51 YGMNWVKQAP GQGLKWMGWI NTDTGEPTYT EDFQGRFVFSLDTSASTVYL101 QISSLKAEDM AMYYCAREGV HFDYWGQGTL VTVSSASTKGPSVFPLAPSS151 KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSL201 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAP251 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGV301 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPI351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE401 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEAL451 HNHYTQKSLS LSPG*(SEQ ID NO：462)轻变体1的全长多肽和多聚核苷酸重链序列huP1A7 L1 kappa轻链的DNA序列(pXW480)1 ATGGATTTTC AGGTTCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGT51 CATAATATCC AGAGGAGAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCAGCAACCTTGT101 CTTTATCTCC AGGGGAGAGA GCCACCTTGT CCTGCAGTGCCAGCTCAAGT151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGCCAAGCGCCCAGAAG201 ACTGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAATCCCTGCTCGCTTCA251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC GATTACACTC TCACCATCAGCAGCTTGGAG301 CCTGAAGATT TCGCCGTTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTAGTAACCCATT351 CACGTTCGGC CAGGGGACAA AGGTGGAAAT AAAACGTACGGTGGCTGCAC401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACT451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGT501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCCCAGGAGAGTG551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTG601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGT651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAG701 AGTGTTAG(SEQ ID NO：463)huP1A7L2轻链的预测蛋白序列(信号序列以下划线显示)1   MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGEIVLTQSP ATLSLSPGER ATLSCSASSS51  VSYMHWYQQK PGQAPRRLIY DTSKLASGIP ARFSGSGSGT DYTLTISSLE101 PEDFAVYYCQ QWSSNPFTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC*(SEQ ID NO：464)轻变体2的全长多肽和多聚核苷酸重链序列huP1A7L2kappa轻链的DNA序列(pXW476)1 ATGGATTTTC AGGTTCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGT51 CATAATATCC AGAGGACAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCAGCAACCTTGT101 CTTTATCTCC AGGGGAGAGA GCCACCTTGT CCTGCAGTGCCAGCTCAAGT151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGCCAAGCGCCCAGAAG201 ACTGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAATCCCTGCTCGCTTCA251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC GATTACACTC TCACCATCAGCAGCTTGGAG301 CCTGAAGATT TCGCCGTTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTAGTAACCCATT351 CACGTTCGGC CAGGGGACAA AGGTGGAAAT AAAACGTACGGTGGCTGCAC401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACT451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGT501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCCCAGGAGAGTG551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTG601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGT651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAG701 AGTGTTAG(SEQ ID N0：465)huP1A7L2轻链的预测蛋白序列(信号序列以下划线显示)1   MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGQIVLTQSP ATLSLSPGER ATLSCSASSS51  VSYMHWYQQK PGQAPRRLIY DTSKLASGIP ARFSGSGSGT DYTLTISSLE101 PEDFAVYYCQ QWSSNPFTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC*(SEQ ID NOS：466)
来自鼠和人嵌合1A7抗体的重和轻链多肽和多聚核苷酸序列显示如下：chP1A7 kappa轻链的DNA序列(pEAG2110)1 ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGT51 CATAATATCC AGAGGACAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCAGCAATCATGT101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGTGCCAGCTCAAGT151 GTAAGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG TCAGGCACCTCCCCCAAAAG201 ATGGATTTAT GACACATCCA AACTGGCTTC TGGAGTCCCTGCTCGCTTCA251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAGCAGCATGGAG301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTAGTAACCCATT351 CACGTTCGGC TCGGGGACAA AGTTGGAAAT AAAACGTACGGTGGCTGCAC401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAAATCTGGAACT451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGT501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCCCAGGAGAGTG551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAGCAGCACCCTG601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACGCCTGCGAAGT651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTCAACAGGGGAG701 AGTGTTAG(SEQ ID NO：467)chP1A7轻链的预测蛋白序列(信号序列以下划线显示)1   MDFQVQIFSF LLISASVIIS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCSASSS51  VSYMHWYQQK SGTSPKRWIY DTSKLASGVP ARFSGSGSGTSYSLTISSME101 AEDAATYYCQ QWSSNPFTFG SGTKLEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC*(SEQ ID NO：468)chP1A7 huIgG1重链的DNA序列(pEAG2112)1 ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAGCACCAGGTGC51 CCACTCCCAG GTCCAACTGG TACAGTCTGG ACCTGAGCTGAAGAAGCCTG101 GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCCT CTGGGTATACCTTCACAAAC151 TATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGGTTTAAAGTGGAT201 GGGCTGGATA AACACCGACA CTGGAGAGCC AACATATACTGAAGATTTCC251 AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCACTGTTTATTTG301 CAGTTCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATTTCTGTGCAAG351 AGAGGGGGTC CACTTTGACT ACTGGGGCCA AGGGACCACGGTCACCGTCT401 CCTCAGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCC451 AAGAGCACCT CTGGGGGCAC AGCGGCCCTG GGCTGCCTGGTCAAGGACTA501 CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCG551 GCGTGCACAC CTTCCCGGCT GTCCTACAGT CCTCAGGACTCTACTCCCTC601 AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAGC TTGGGCACCCAGACCTACAT651 CTGCAACGTG AATCACAAGC CCAGCAACAC CAAGGTGGACAAGAAAGTTG701 AGCCCAAATC TTGTGACAAG ACTCACACAT GCCCACCGTGCCCAGCACCT751 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGA801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACG851 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTG901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGTACAACAGCAC951 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATG1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATC1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAACCACAGGTGTA1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAGGTCAGCCTGA1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGTGGAGTGGGAG1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTCCCGTGTTGGA1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCA1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCATGAGGCTCTG1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCCG GTTGA(SEQ ID NO：469)chP1A7重链的预测蛋白序列(信号序列以下划线显示)1 MDWTWRVFCL LAVAPGAHSQ VQLVQSGPEL KKPGETVKISCKASGYTFTN51 YGMNWVKQAP GKGLKWMGWI NTDTGEPTYT EDFQGRFAFSLETSASTVYL101 QFNNLKNEDT ATYFCAREGV HFDYWGQGTT VTVSSASTKGPSVFPLAPSS151 KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSL201 SSVVTVPSSS LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KKVEPKSCDKTHTCPPCPAP251 ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGV301 EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPI351 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWE401 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEAL451 HNHYTQKSLS LSPG*(SEQ ID NO：470)实施例18对Li33Ig2进行工程再造以减少效应功能、糖化和聚集
在Li33中进行各种突变，以潜在减少效应功能、糖化和聚集。测定了这些突变中每一种对蛋白表达、溶解性、少突细胞-DRG共培养测试中的抗体活性以及糖化或CD32结合的作用。该结果总结于下文的表11中。表11：LI33IG2工程再造
  效应功能   构建体表达   溶解性(mg/mL)   CD32结合的IC50(μg/mL)   活性测试(共培养)
  Li33Ig2wt   Y   ＞20   4.3   +
  Li33Ig2 agly   Y   0.3   25   +
  Li33Ig2 Rinat   Y   ＞5   9.5   +
  Li33Ig2 PDL   Y   5.8   ＞100   +
  Li33Ig2 Alexion   进行中   ND   ND   ND
  糖化   构建体表达   溶解性(mg/mL)   糖化％   活性测试(共培养)
  Li33wt   Y   ＞20   25   +
  Li33Ig2 PDL   Y   5.8   15(5)   +
  Li33Ig2 PDL W94G   Y   ND   ＞2   -
  Li33Ig2 PDL W94V   Y   ND   ＜2   +
  Li33Ig2 PDL W94Q   Y   ND   ＜2   -
  Li33Ig2 PDL W93N   Y   ND   ＜2   -
  Li33Ig2 PDL K93R   Y   0.4   ＜2   +
  聚集   构建体表达   溶解性(mg/mL)   糖化％   活性测试(共培养)
  Li33Ig1a94V157P   Y   ND   ND   +
  Li33Ig1a94V157S   Y   ND   ND   +
  Li33Ig1a94V157T   Y   ND   ND   -
  Li33Ig1a94V157V   Y   ND   ND   +
  Li33Ig2PDL94V157S   Y   ND   ND   +
  Li33Ig2PDL94V157A   Y   ND   ND   +
  Li33Ig2PDL94VW103Q   Y   ND   ND   -
  Li33Ig2PDL94VW103A   Y   ND   ND   -
  Li33Ig2PDL94V103Q57S Y ND ＜2 +
  Li33Ig2PDL94V103Q57A   Y   ND   ＜2   +
实施例19Li81变体的构建
抗体Li81是抗体Li13的亲和性成熟型。通过改变该Li81重链序列中的单个氨基酸可生成该Li81抗体的糖基化型。以下为该糖基化变体的可变重链(VH)的氨基酸序列。EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYEMKWVRQAPGKGLEWVSVIGPSGGFTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATEGDNDAFDIWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ IDNO：474)
在成熟蛋白中不存在的前导序列(前19个氨基酸)以粗体显示，CDRs以下划线显示。与Li81可变重链序列(SEQ ID NO：433)相比改变的单个氨基酸以粗体和双下划线显示。以下为该糖基化变体的可变重链(VH)的核苷酸序列。GAAGTACAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTTTCTCTGCTTACGAGATGAAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGTTATCGGTCCTTCTGGTGGCTTTACTTTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAACAGAGGGTGATAATGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCAAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAGACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCGCGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGTTGAGGATCCCTGCCCGG  (SEQ IDNO：450).***
本发明中的特定实施例意在对本发明的某一方面进行单独阐述，并非对本发明进行限制，且任意功能性相同的组合物或方法亦在本发明范围之内。事实上，通过前述描述和附图，在本文所述的基础上对本发明所进行的各种调整对本领域的技术人员而言是显而易见的。该种调整意在落入权利要求的范围之内。
本说明书中所涉及的所有出版物和专利申请均引入作为参考，其引用程度如同每一个单独的出版物和专利申请均为特定的单独的引入作为参考。
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Claims (25)

1.分离抗体或其抗原结合片段，其包括
VH区，所述VH区包含SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：437和SEQ ID NO：438分别所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列；和
VL区，所述VL区包括SEQ ID NO：442、SEQ ID NO：443和SEQ ID NO：444分别所示的VH CDR1、CDR2和CDR3序列；
其中该抗体或其抗原结合片段能特异性结合Sp35多肽。
2.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中该抗体包含SEQ IDNO：433和SEQ ID NO：434的序列。
3.如权利要求1所述的抗体或其片段，其为Sp35-介导的神经元细胞死亡的拮抗剂。
4.如权利要求1所述的抗体或其片段，其为Sp35-介导的髓鞘形成抑制的拮抗剂。
5.如权利要求1所述的抗体或其片段，其为Sp35介导的少突细胞分化抑制的拮抗剂。
6.如权利要求1所述的抗体或其片段，进一步包含与之融合的异源性多肽。
7.如权利要求1所述的抗体或其片段，其中该抗体与选自治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物应答调节剂、药物制剂或PEG的试剂相结合。
8.包含如权利要求1所述的抗体或其片段以及载体的组合物。
9.分离的多聚核苷酸，其包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸，其包含除了少于4个的保守氨基酸替换外分别与SEQID NO：436、SEQ ID NO：437和SEQ ID NO：438的VH CDR1、CDR2和CDR3序列一致的VH CDR1、CDR2和CDR3区，
且其中包含该VH的抗体或其抗原结合片段能特异性结合Sp35多肽。
10.如权利要求9所述的分离多聚核苷酸，其中该VH CDR1、CDR2和CDR3区除了少于2个的保守氨基酸替换外分别与SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：437和SEQ ID NO：438的VHCDR1、CDR2和CDR3序列一致。
11.如权利要求10所述的分离多聚核苷酸，其中该VH CDR1、CDR2和CDR3区分别与SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：437和SEQ ID NO：438的VH CDR1、CDR2和CDR3序列一致。
12.由权利要求9-11任意一项所述的多聚核苷酸编码的分离多肽。
13.组合物，其包含：
编码免疫球蛋白重链可变区(VH)多肽的多聚核苷酸，该重链可变区包含分别与SEQ ID NO：436、SEQ ID NO：437和SEQ ID NO：438的VH CDR1、CDR2和CDR3序列一致的VHCDR1、CDR2和CDR3区；
编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)多肽的多聚核苷酸，该轻链可变区包含分别与SEQ ID NO：442、SEQ ID NO：443和SEQ ID NO：444的VL CDR1、CDR2和CDR3序列一致的VLCDR1、CDR2和CDR3区；
其中该VH和VL编码多聚核苷酸一起编码了能特异性结合Sp35多肽的抗体或其抗原结合片段。
14.包含权利要求13所述组合物的宿主细胞。
15.生产抗-Sp35抗体或其抗原结合片段的体外方法，其包括培养权利要求14所述的宿主细胞，并回收该抗体或其抗原结合片段。
16.由权利要求15所述的方法生产的抗-Sp35抗体或其抗原结合片段。
17.如权利要求1-7或16任一项所述的分离Sp35抗体或其片段在制备治疗动物CNS损伤的药物中的用途。
18.如权利要求1-7或16任一项所述的分离Sp35抗体或其片段在制备治疗选自ALS、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、糖尿病神经病变和中风的疾病或紊乱的药物中的用途。
19.如权利要求1-7或16任一项所述的分离Sp35抗体或其片段在制备治疗选自多发性硬化症(MS)、进行性多灶性脑白质病(PML)、脑脊髓炎(EPL)、桥脑中央髓鞘溶解症(CPM)、华勒氏变性、脑白质营养不良、亚历山大病以及佩-梅病(PMZ)的疾病或紊乱的药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中该疾病或紊乱为多发性硬化症。
21.抑制NgR1的信号转导的体外方法，其包括将该NgR1与有效量的权利要求1所述的分离Sp35抗体或其片段相接触。
22.减少中枢神经系统(CNS)神经元的轴突生长抑制的体外方法，其包括将该神经元与有效量的权利要求1所述的分离Sp35抗体或其片段相接触。
23.抑制CNS神经元生长锥萎缩的体外方法，其包括将该神经元与有效量的权利要求1所述的分离Sp35抗体或其片段相接触。
24.如权利要求1-7任一项所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是无糖基化变体。
25.如权利要求24所述的抗体或其片段，其包括SEQ ID NO：474所示的序列。
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