JP3469234B2 - リパーゼ変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は改良された性質を有する新規なリパーゼ酵素
変異体、前記変異体の発現についてコードするDNA構造
体、このDNA構造体からこの変異体を発現することので
きる宿主細胞、及び前記宿主細胞によりこの変異体を生
産する方法に関する。

発明の背景 組換DNA技術の出現及び開発はタンパク質化学の分野
に深遠な影響を及ぼした。これらの技術は特定の規準に
従ってペプチド及びタンパク質、例えば酵素をデザイン
することを可能とするものと考えられ、従って所望の特
性を有する化合物の生産を可能とする。

かかる技術の多様性に基づき、所望のアミノ酸配列を
有する酵素を作製することが可能となり、そして多数の
研究がこの目的にささげられている。

数多くのリパーゼの一次構造が決定され、且つ論文に
詳細されている（Boelら著、Lipids 23,701−706（198
8）,de Caroら著、Biochim.Biophys.Acta 671,129−13
8（1981）,Winkleら著、Nature 343,771−774（199
0））。更に、より限定された数のリパーゼの三次構造
も明らかとなっている（Winkleら著、Nature 343,771
−774（1990）,Bradyら著、Nature 343,767−770（199
0）,J.D.Schragら著、Nature 351,1991頁761−764）。
これらの研究から、リパーゼは共通して一定の構造の特
徴を有することが認められるが、その一方で、これらの
リパーゼの間では大きな構造的多様性もある。

発明の概要 改良されたリパーゼ特性は、かかる改良された特性を
示すリパーゼ変異体をもたらす特定のリパーゼを発現す
るDNA配列における１又は複数の特定の突然変異によっ
て得られうることを、これらの研究は示している。

従って第一の観点において、本発明は親（parent）リ
パーゼのリパーゼ変異体に関連し、この変異体はリパー
ゼ分子の主として疎水性である長い結合性ポケットに位
置している、活性セリンを含むトリプシン様触媒三つ組
残基を含んで成り、ここで親リパーゼの脂質接触帯の静
電荷及び／又は疎水性は、１もしくは複数の負に荷電し
ているアミノ酸基を欠失させるか又は中性もしくは正に
荷電しているアミノ酸残基により置換させるか、及び／
又は１もしくは複数の中性アミノ酸残基を正に荷電して
いるアミノ酸残基により置換させるか、及び／又は１も
しくは複数の親水性アミノ酸残基を欠失させるかもしく
は疎水性アミノ酸残基により置換させるかによって変え
られている。便宜上、このリパーゼ変異体は以降リパー
ゼ変異体Ｉと呼ぶ。

本明細書において、「トリプシン様」とは、トリプシ
ンの活性部位に相当する箇所に、触媒三つ組残基、即
ち、アミノ酸のSer,Hisと、Aspを含んで成る親分子を意
味することを意図する。いくつかのリパーゼは、このリ
パーゼが不活性な形態にあるときに、活性セリンを覆う
表面ループ構造も含んで成る（このようなリパーゼの例
はBradyら著、Nature 343,1990,頁767−770に記載され
ている）。該リパーゼが活性化されると、このループ構
造は移動してこの活性残基を露出させ、加水分解の際に
脂質基質と相互作用する高い表層疎水性を有する表層を
生み出す。本目的のため、この表層を「脂質接触帯」と
呼び、これはこの表層（又はこのようなループ構造を含
んでないリパーゼの相当の表層）に位置する、又はその
部分を形成するアミノ酸残基を含むことを意図する。こ
れらの残基は、該リパーゼが脂質表層との接触によって
活性化されて脂質相からトリグリセリドを加水分解せし
めるとき、この加水分解の際の基質とのリパーゼ相互作
用に参入する。トリグリセリドの加水分解の際、脂肪酸
並びにモノ−及びジ−グリセリドが種々の量で生成され
る。リパーゼをこの脂質接触帯において突然変異させる
ことによってこの帯の静電荷及び／又は疎水性を変える
一つの理由は、加水分解の際に生成される脂肪酸が脂質
相に残って、負に荷電した表層を形成せしめうるからで
ある。洗浄の目的のためにリパーゼを用いるとき、負荷
電した洗浄剤はこの脂質表層上に負電荷を形成せしめう
る。従って負荷電が低い及び／又はより疎水性であるリ
パーゼ変異体を作ることにより、異なる特異性及び／又
は改善された特性を有するリパーゼを獲得することが可
能となりうる。

他の観点において本発明は、リパーゼ分子の主として
疎水性である長い結合性ポケットに位置する、活性セリ
ンを含むトリプシン様触媒三つ組残基を含んで成るリパ
ーゼ変異体に関する。前記リパーゼ変異体は、加水分解
の際に基質との相互作用に参入する、活性セリン残基を
含むリパーゼ構造の部分に位置する残基を含んで成る脂
質接触帯の配列を構成する１又は複数のアミノ酸残基の
位置での、１又は複数のアミノ酸残基の置換、欠失又は
挿入によって、前記脂質接触帯の表層コンホメーション
が変化されていることを更に特徴とする。リパーゼ分子
のかかる表層改質の目的は、リパーゼ基質に対する該リ
パーゼの活性部位の接近のし易さの向上を提供すること
にある。便宜上、このリパーゼ変異体を以降リパーゼ変
異体IIと呼ぶ。

更なる観点において本発明は、リパーゼ変異体であっ
て（ｉ）リパーゼ分子の主として疎水性である長い結合
性ポケットに位置する、活性セリンを含むトリプシン様
触媒三つ組残基、及び（ii）該リパーゼが不活性状態に
あるときはこの活性セリンを覆っており、そしてこのリ
パーゼが活性化されているときは脂質基質にこの活性セ
リンが接近し易くなるようにそのコンホメーションが変
化するような表層ループ構造を含んで成る型のリパーゼ
変異体に関連し；このループ構造はこの結合性ポケット
に面する主として疎水性である内面及び主として親水性
である外面を有しており；前記リパーゼ変異体は、表層
ループ構造の移動又は加水分解の際の基質との相互作用
のいづれかに参入する、ループ構造の配列を構成する及
び／又は活性セリン残基を含むリパーゼ構造の部分に位
置している残基を含んで成る脂質接触帯の配列を構成す
る／もしくは複数個のアミノ酸残基の位置での、１又は
複数個のアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入によって特
徴付けられる。これは、ループ構造がより開放されるよ
うになることをもたらし、これにより活性セリンは基質
により接近し易くなる。便宜上、このリパーゼ変異体を
以降リパーゼ変異体IIIと呼ぶ。

本発明は前記したリパーゼ変異体をコードするDNA配
列を含んで成るDNA構造体、前記DNA構造体を保有する組
換え発現ベクター、このDNA構造体又は発現ベクターに
より形質転換された細胞、及び本発明のリパーゼ変異体
を生産する方法であって、該リパーゼ変異体の生産を助
成する条件のもとで前細胞を培養又は増殖させ、その後
このリパーゼ変異体を培養物から回収することによる方
法にも関連する。

本発明は更に、本発明のリパーゼ変異体を含んで成
る、任意的に無粉塵性顆粒、安定化液体又は保護化酵素
の形態における洗浄添加剤、及び本発明のリパーゼ変異
体を含んで成る洗浄組成物に関連する。

発明の詳細な説明 本明細書及び請求の範囲において以下の略語を用いて
いる： アミノ酸： Ａ＝Ala＝アラニン Ｖ＝Val＝バリン Ｌ＝Leu＝ロイシン Ｉ＝Ile＝イソロイシン Ｐ＝Pro＝プロリン Ｆ＝Phe＝フェニルアラニン Ｗ＝Trp＝トリプトファン Ｍ＝Met＝メチオニン Ｇ＝Gly＝グリシン Ｓ＝Ser＝セリン Ｔ＝Thr＝スレオニン Ｃ＝Cys＝システイン Ｙ＝Tyr＝チロシン Ｎ＝Asn＝アスパラギン Ｑ＝Gln＝グルタミン Ｄ＝Asp＝アスパラギン酸 Ｅ＝Glu＝グルタミン酸 Ｋ＝Lys＝リジン Ｒ＝Arg＝アルギニン Ｈ＝His＝ヒスチジン 本発明に関するリパーゼ変異体の説明において、以下の
用法を参照のし易さのために用いている： （複数の）オリジナルのアミノ酸：（複数の）位置：
（複数の）置換したアミノ酸 この用法に従うと、位置195におけるグリシンに代わ
るグルタミン酸の置換は Gly 195 Glu又はG195Eとして示し； 同じ位置におけるグリシンの欠失は Gly 195^＊又はG195^＊として示し； そして付加されたアミノ酸残基例えばリジンの挿入は Gly 195 Gly Lys又はG195GKとして示す。

特定のリパーゼが他のリパーゼと比べて「欠失」を含
み、且つこのような位置に挿入がなされているときは、 例えば位置36におけるアスパラギン酸の挿入に関して ^＊36Asp又は^＊36Dとして示す。

複数の突然変異はプラスにより分けている、即ち、 Arg 170 Tyr＋Gly 195 Glu又はP170Y＋G195Eは、 位置170及び195における、アルギニン及びグリシンそ
れぞれに代わるチロシン及びグルタミン酸による置換の
突然変異を示している。

本発明に関して、リパーゼ変異体Ｉは好ましくは、リ
パーゼの脂質接触帯の１又は複数のグルタミン酸又はア
スパラギン酸残基が、グルタミン、アスパラギン、アラ
ニン、ロイシン、バリン、セリン、スレオニン、リジン
又はアルギニンによって置換されたものである。

親リパーゼは哺乳動物リパーゼのような種々の起源に
由来するもの、例えば膵臓、胃、肝臓又はリポタンパク
質リパーゼありうるが、微生物リパーゼであることが一
般に好適である。従って、親リパーゼは酵母、例えばキ
ャンディダ属（Candida）のリパーゼ、細菌、例えばシ
ュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼ、又は菌類、
例えばヒュミコラ属（Humicola）もしくはリゾムコール
属（Rhizomucor）のリパーゼより選ばれうる。構造的に
同族なリパーゼの群から親リパーゼを選ぶことが特に好
ましい。

本発明のリパーゼ変異体Ｉの好ましい態様において、
親リパーゼはリゾムコール ミーヘイ（Rhizomucor mi
ehei）リパーゼ、特EP 305 216号に詳細のリパーゼであ
る。この態様において、１又は複数の負に荷電している
アミノ酸残基は以下の通り、１又は複数の正に荷電して
いるか又は中性のアミノ酸残基により置換されていてよ
い。

D91N,K,R,A,V,L,S,T; D256N,K,R,A,V,L,S,T; D226N,K,R,A,V,L,S,T; D61N,K,R,A,V,L,S,T; D113N,K,R,A,V,L,S,T; E201Q,K,R,A,V,L,S,T; D243N,K,R,A,V,L,S,T。

本発明のリパーゼ変異体Ｉの他の好ましい態様におい
て、この親リパーゼはヒュミコラ ラヌギノーザ（Humi
cola lanuginosa）リパーゼ、特にH.ラヌギノーザ株DS
M4106により生産されたリパーゼ（EP 258068号を参照）
である。この態様において、１又は複数の負の荷電して
いるアミノ酸残基は以下の通り１又は複数の中性又は正
に荷電しているアミノ酸残基により置換されていてよ
い。

E87Q,K,R,A,N,T,S,L,V; D254N,K,R,A,Q,T,S,L,V; D242N,K,R,A,Q,T,S,L,V; E210Q,K,R,A,N,T,S,L,V; E56Q,K,R,A,N,T,S,L,V; D96N,K,R,A,Q,T,S,L,V; D111N,K,R,A,Q,T,S,L,V; D62A,Q,N,T,S,K,R,L,V; E219A,Q,N,T,S,K,R,L,V; E234A,Q,N,T,S,K,R,L,V; E57A,Q,N,T,S,K,R,L,V; E99A,Q,N,T,S,K,R,L,V; D27A,Q,N,T,S,K,R,L,V;又は E239A,Q,N,T,S,K,R,L,V。

本発明に関する特に好ましい置換は E87Q＋D254N＋D242N＋E210Q; E87Q＋D254N＋E210Q; D96N＋E87Q＋D254N; R209A＋E210Aである。

他方、１又は複数のアミノ酸残基は以下の通りに１又
は複数の正に荷電しているアミノ酸残基によって置換さ
れていてよい。

T267K,R; S85K,R; T226K,R; N88K,R; N92K,R; I255K,R; I202K,R; L206K,R; L259K,R; V203K,R;又は L227K,R。

ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼとリゾムコール
ミーヘイリパーゼは同一のリパーゼの群に属すること
が理解されるべきである。この２つのリパーゼの三次元
構造全体が非常に似かよっていることと考えられ、そし
てＸ線結晶写真により非常に一致することが示されてい
る（H.ラヌギノーザとRh.ミーヘイ リパーゼのコンピ
ューターモデルをそれぞれ図１のＡとＢ及び図２のＡと
Ｂに示し、これよりこの２種類のリパーゼの脂質接触帯
の類似が明らかに認められる）。従っていづれかのリパ
ーゼを示すタイプの改質は、その他のリパーゼに関して
も機能するであろうことも有望である。

リパーゼ変異体IIの一態様において、１又は複数のア
ミノ酸残基は１又は複数のかさ高さの低いアミノ酸残基
によって置換されうる。このような改質の目的はリパー
ゼの活性部位を露出させ、これによってそれを基質によ
り接触し易くすることにある。特に、かさ高さの低いア
ミノ酸残基はバリン、スレオニン、セリン、グリシン又
はアラニンより選ばれうる。

リパーゼ変異体IIの親リパーゼは哺乳動物リパーゼの
ような種々の起源に由来するもの、例えば膵臓、胃、肝
臓又はリポタンパク質リパーゼでありうるが、これは微
生物リパーゼであることが一般に好ましい。従って、こ
の親リパーゼは酵母、例えばキャンディダ属のリパー
ゼ、細菌、例えばシュードモナス属のリパーゼ、又は菌
類、例えばヒュミコラ属もしくはリゾムコール属のリパ
ーゼから選ばれうる。

例えば、親リパーゼが上記したリゾムコール ミーヘ
イ リパーゼであるとき、以下の置換が好適に行われう
る； I204V,A,T,S,G; L208V,A,T,S,G; F213V,A,T,S,G;又は I254V,A,T,S,G。

親リパーゼが上記したヒュミコラ ラヌギノーザ リ
パーゼであるとき、以下の置換が好適に行われうる； I202V,A,T,S,G; L206V,A,T,S,G; F211V,A,T,S,G,I;又は I255V,A,T,S,G。

リパーゼ変異体IIに１又は複数の表層ループ配列があ
るとき、このループ配列の一部を形成する１又は複数の
アミノ酸残基が好都合には欠失されうる。かかる改質の
目的は基質に対する活性セリンの接近のし易さの向上に
ある。

従って、このループ配列から、２−８、特に２−６の
アミノ酸残基を欠失させることが好都合であることが見
い出せた。例えば、親リパーゼが上記したリゾムコール
ミーヘイのリパーゼであるとき、１又は複数の以下の
位置、即ち、82−113,211−215,235−243,245−269又は
264−269の１又は複数のアミノ酸残基を欠失させること
ができる。適切な欠失（及び記載の第１の例の場合、置
換）の特定の例は以下の通りである； N264^＊＋T265^＊＋G266^＊＋L267^＊＋C268^＊＋T269^＊＋
C22T; F213^＊＋F215^＊； D238^＊＋L239^＊＋E240^＊＋D243^＊；又は S247^＊＋F251^＊＋T252^＊。

親リパーゼが上記したヒュミコラ ラヌギノーザ リ
パーゼであるとき、１又は複数の以下の位置、即ち、84
−112,209−213、238−245,247−254又は264−269の１
又は複数のアミノ酸残基を欠失させることができる。適
切な欠失（及び、記載の第１の例の場合、置換）の特定
の例は以下の通りである； L264^＊＋I265^＊＋G266^＊＋T267^＊＋C268^＊＋L269^＊＋
C22T; R209^＊＋F210^＊； F211^＊＋Y213^＊； D242^＊＋E239^＊＋I241;又は N247^＊＋D254^＊。

リパーゼ変異体IIの特定の態様において、親リパーゼ
は、リパーゼが不活性状態にあるときに活性セリンを覆
い、且つリパーゼが活性化されたときに脂質基質に対し
て活性セリンを接近し易くするように、このコンホメー
ションが変化する表層ループ構造を含んで成る。このル
ープ構造は、結合性ポケットに面する主として疎水性な
内面及び主として親水性な外面を有している。このリパ
ーゼ変異体はこのループ構造を構成する配列の１又は複
数のアミノ酸残基の欠失により特徴付けられる。このル
ープ構造はヒト膵臓リパーゼ（Winkleら著、Nature 34
3,1990,頁771−774を参照）及びリゾムコール ミーヘ
イ リパーゼ（Bradyら著、Nature 343,1990,頁767−77
0を参照）について説明されたものに相当する。ところ
で、このリパーゼ変異体は好ましくは５個以上のアミノ
酸残基を含んで成る短いループ構造を有する。このルー
プ構造は更に１又は複数のアミノ酸残基の置換を含んで
成りうる。しかしながら、このループ内（H.ラヌギノー
ザ リパーゼのW89及びRh.ミーヘイ リパーゼのW88）
に存在するトリプトファンは保存されるべきであるとの
いくつかの指標もある。

リパーゼ変異体IIIにおいて、ループ構造の少なくと
も１個のアミノ酸残基は好ましくはシステインにより置
換され、そして別の少なくとも１個のアミノ酸残基も好
ましくはシステインにより置換されており、このシステ
イン残基はそれらがジスルフィド結合を形成するように
互いに相対して位置している。これはループ構造が移動
して、それらがより大きく開き、活性セリンが基質に対
してより接近し易くなるようにするであろう。

例えば、この親リパーゼが上記したリゾムコール ミ
ーヘイ リパーゼであるとき、以下の置換がされうる； S114C＋A90C; R86C＋D61C; S84C＋D61C; N87C＋D61C; Y60C＋R78C;又は Y60C＋N87C。

一方、親リパーゼが上記したヒュミコラ ラヌギノー
ザ リパーゼであるとき、以下の置換がされうる； G61C＋N88C; G61C＋E87C; D62C＋E87C; D62C＋S85C; D62C＋N88C;又は S116C＋G91C。

他方、水性媒体におけるより大きく開いたループ構造
のコンホメーションは、活性セリンを含む触媒三つ組残
基が位置している結合性ポケットの１又は複数の親水性
アミノ酸残基を、１又は複数のあまり親水性でない残基
により置換することによって得られうる。

例えば、親リパーゼが上記したリゾムコール ミーヘ
イ リパーゼであるとき、以下の置換がされうる； I204V,A,T,S,G; L208V,A,T,S,G; F213V,A,T,S,G; I254V,A,T,S,G; L255V,A,T,S,G; L258V,A,T,S,G; L267V,A,T,S,G;又は F94L,T,K。

特に、アミノ酸置換は以下のように組合せることができ
る； I204T＋L255T＋L267T;又は L208T＋I254T＋L258T。

親リパーゼが上記したヒュミコラ ラヌギノーザ リ
パーゼであるとき、以下の置換がされうる； L93V,T,S,A,G; I90V,T,S,A,G; I86V,T,S,A,G; I202V,T,S,A,G; L206V,T,S,A,G; I255V,T,S,A,G; L259V,T,S,A,G; F95L,T,K;又は F211L,T,K。

リパーゼIVの好ましい態様において、１又は複数のア
ミノ酸残基が以下のように置換されうる； F95K; I86T; I90T; I255T; L259T; L206T;又は L206T＋I255T＋L259T。

本発明に関して、リパーゼ変異体Ｉ−IIIについて前
記したアミノ酸配列のいづれか１つの改質は、前記した
別の改質のいづれか一つと組合せることができることが
理解されるべきである。

本発明のリパーゼ変異体の製造方法 遺伝子に突然変異を導入するいくつかの方法が当業界
において知られている。リパーゼをコードするDNA配列
のクローニングの簡単な所見の後に、このリパーゼをコ
ードする配列における特異的な部位に突然変異を作るた
めの方法について述べる。

リパーゼをコードするDNA配列のクローニング 親リパーゼをコードするDNA配列は当業界によく知ら
れている種々の方法により、問題のリパーゼを生産する
任意の細胞又は微生物から単離できる。まず、調べるべ
きリパーゼを生産する生物由来の染色体DNA又はメッセ
ンジャーRNAを用いてゲノムDNA及び／又はcDNAライブラ
リーを作製すべきである。次にこのリパーゼのアミノ酸
配列がわかっているならば、相同なラベルをオリゴヌク
レオチドプローブを合成し、且つ用いて、細菌DNAのゲ
ノムライブラリー又は菌類cDNAライブラリーからリパー
ゼコード化クローンを同定することができる。他方、そ
の他の細菌又は菌類の株由来のリパーゼに対して相同な
配列を含むラベル化オリゴヌクレオチドプローブが、低
緊張のもとでのハイブリダイゼーション及び洗浄条件を
利用してリパーゼコード化クローンを同定するプローブ
として利用できる。

リパーゼ生産性クローンを同定するための更なる他の
方法は、プラスミドのような発現ベクターの中にゲノム
DNAのフラグメントを挿入し、この生じるゲノムDNAライ
ブラリーをリパーゼ陰性細菌に形質転換せしめ、その後
この形質転換細菌をリパーゼに対する基質を含むアガー
上で平板培養することを包括する。リパーゼ保有プラス
ミドを含むその細菌は、分泌したリパーゼによる基質の
消化に基づいて透明なアガーの輪に囲まれたコロニーを
もたらすであろう。

他方、この酵素をコードするDNA配列は確立されてい
る標準的な方法、例えばS.L.BeaucageとM.H.Caruthers
のTetrahedron Letters 22,1981,頁1859−1869により詳
細されているホスホアミジット法、又はMetthersらのTh
e EMBO J.３,1984,頁801−805により詳細されている方
法によって合成的に製造できうる。ホスホアミジット法
に従うと、例えば自動DNA合成装置でオリゴヌクレオチ
ドを合成し、精製し、アニールし、リゲートし、そして
適当なベクターの中にクローンする。

最後に、該DNA配列はゲノムと合成体の混合物、合成
体とcDNAの混合物又はゲノムとcDNA起源の混合物であっ
て、合成体、ゲノム又はcDNA起源のDNA配列全体の種々
の部分に相当するフラグメントを標準的な方法に従って
（適当に）リゲートすることによって作ったものでよ
い。該DNA配列は例えば米国第4,683,202号又はR.K.Saik
iらのScience 239,1989,頁487−491に詳細の通り、特
異的なプライマーを用いるポリメラーゼを連鎖反応によ
っても作ることができる。

リパーゼコード化配列の部位特異的突然変異誘発 リパーゼコード化DNA配列が単離でき、そして突然変
異に関する所望の部位が同定できたなら、合成オリゴヌ
クレオチドを利用して突然変異を導入することができ
る。これらのオリゴヌクレオチドは所望の突然変異部位
とフランクしたヌクレオチド配列を含む。突然変異ヌク
レオチドはオリゴヌクレオチド合成の際に挿入される。
特定の方法において、リパーゼコード化配列を橋渡しす
るDNAの一本鎖ギャップをこのリパーゼ遺伝子を保有す
るベクターに作り上げる。次に所望の突然変異を保有し
ている合成ヌクレオチドをこの一本鎖DNAの相同部分に
アニールさせる。次いで残っているギャップをDNAポリ
メラーゼＩ（クレノウフラグメント）により補完し、そ
してこの構造体をT4リガーゼを用いてリゲートする。こ
の方法の特定の例はMorinagaら（1984,Biotechnology
2:646−639）に詳細されている。1988年７月26日に承認
されたEstellらの米国特許第4,760,025号は、カセット
のわずかに変化させることによる複数の突然変異をコー
ドするオリゴヌクレオチドの挿入を開示しているが、し
かしながらMorinagaの方法により同時により多種の突然
変異を導入することができ、その理由は種々の長さの複
数のオリゴヌクレオチドを導入できるからである。

リパーゼコード化配列への突然変異の導入のその他の
方法はNelsonとLongのAnalytical Biochemistry 180,19
89,頁147−151に詳細されている。これは、PCRの反応に
おけるプライマーの一つとしての化学合成DNA鎖を利用
することによって導入された所望の突然変異を含むPCR
フラグメントの３段階作製を含む。このPCR作製化フラ
グメントから突然変異を保有するDNAフラグメントが制
限エンドヌクレアーゼによる切断によって単離でき、そ
して発現プラスミドの中に再挿入できうる（この方法を
更に概略した図３及び４を参照のこと）。

リパーゼ変異体の発現 本発明に従うと、上記の方法又はそれに代わる当業界
に知られる任意の方法により作った突然変異化リパーゼ
コード化配列は、プロモーター、オペレーター、リボソ
ーム結合部位、、翻訳開始シグナル及び任意的にリプレ
ッサー遺伝子又は種々の活性化遺伝子をコードするコン
トロール配列を典型的に含む発現ベクターを用い、酵素
形態において発現されうる。発現されたタンパク質の分
泌を可能とするため、「シグナル配列」をコードするヌ
クレオチドをリパーゼコード化配列の前に挿入していて
よい。コントロール配列の方向のもとでの発現のため、
本発明に従って処理すべき標的遺伝子を適当な解読枠に
おいてコントロール配列と作動連結させる。プラスミド
ベクターの中に一体化させることができ、且つ、突然変
異リパーゼ遺伝子の転写を補助することができるプロモ
ーター配列には原核生物のβ−ラクタマーゼプロモータ
ー（Villa−Kamaroffら、1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.
S.A.75:3727−3731）及びtacプロモーター（DeBoerら、
1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21−25）が含まれ
るが、それらに限定されない。更なる参考はScientific
American,1980,242:74−94の「Useful proteins from
recombinant bacteria」にも見い出せうる。

一態様に従うと、B.スブチリス（B.subtilis）を該突
然変異化DNAを保有する発現ベクターにより形質転換さ
せる。発現をB.スブチリスのような分泌型微生物におい
て行うなら、シグナル配列は翻訳開始シグナルに続き、
且つ対象のDNA配列に先行していることができる。この
シグナル配列は発現生成物を細胞壁へト輸送するのに働
き、ここでこの生成物は分泌に基づいて切断される。前
記したコントロール配列は、存在しているならば、シグ
ナル配列を含むことを意図している。

本発明のリパーゼ変異体を生産する現状好ましい方法
において、宿主生物として糸状菌類を利用する。この糸
状菌類宿主生物は好都合には組換えタンパク質を生産す
るために宿主として既に利用されているもの、例えばア
スペルギルス（Aspergillus）属の種の株、例えばA.ニ
ガー（A.niger）、A.ニドゥランス（A.nidulans）又は
A.オリザ（A.oryzae）である。組換えタンパク質の生産
におけるA.オリザの利用は例えばEP 238,023号に詳しく
説明されている。

アスペルギルス属におけるリパーゼ変異体の発現のた
め、リパーゼ変異体をコードするDNA配列にプロモータ
ーが先行する。このプロモーターはアスペルギルス属に
おいて強い転写活性を示す任意のDNA配列であってよ
く、そしてこれは細胞外又は細胞内タンパク質、例えば
アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパー
ゼ、セルラーゼ又は解糖系酵素をコードする遺伝子に由
来しうる。

適切なプロモーターの例はA.オリザ TAKAアミラー
ゼ、リゾムコール ミーヘイ アスパラギン酸プロテナ
ーゼ、A.ニガー 中性α−アミラーゼ、A.ニガー 酸安
定のα−アミラーゼ、A.ニガー グルコアミラーゼ、リ
ゾムコール ミーヘイ リパーゼ、A.オリザ アルカリ
性プロテアーゼ又はA.オリザ トリオースリン酸イソメ
ラーゼをコードする遺伝子に由来するものである。

特に宿主生物がA.オリザのとき、本発明のプロセスに
おいて利用するのに好ましいプロモーターはA.オリザ
TAKAアミラーゼプロモーターであり、なぜならこれはA.
オリザにおいて強い転写活性を示すからである。TAKAア
ミラーゼプロモーターの配列はEP 238,023号に明らかに
されている。

終止及びポリアデニル化配列はプロモーターと同じ起
源に由来することが適切である。

菌類宿主細胞を形質転換させるのに用いる技術はEP 2
38,023号に詳細されている。

宿主細胞からのリパーゼ変異体の分泌を保証するた
め、該リパーゼ変異体をコードするDNA配列の前にシグ
ナル配列があってよく、これは細胞からのタンパク質の
分泌を提供せしめる天然のシグナル配列もしくはその機
能部分、又は合成配列でありうる。特に、このシグナル
配列はアスペルギルス属の種のアミラーゼもしくはグル
コアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコール ミー
ヘイ リパーゼもしくはプロテアーゼをコードする遺伝
子又はヒュミコラ属のセルラーゼ、キシラナーゼもしく
はリパーゼをコードする遺伝子に由来しうる。このシグ
ナル配列は好ましくはA.オリザ TAKAアミラーゼ、A.ニ
ガー 中性α−アミラーゼ、A.ニガー 酸安定α−アミ
ラーゼ又はA.ニガー グルコアミラーゼをコードする遺
伝子に由来する。

形質転換化宿主細胞を培養するのに用いる培地はアス
ペルギルス属の細胞を増殖するのに適する任意の常用の
培地でありうる。この形質転換体は通常安定であり、そ
して淘汰圧の非存在下において培養されうる。ところ
で、形質転換体が不安定であると見い出されたなら、細
胞に導入した選択マーカーを選別のために用いられう
る。

宿主細胞から分泌される成熟リパーゼタンパク質は、
遠心又は濾過により培地から細胞を分離させること、次
いで硫酸アンモニウムのような塩類の手段によりこの培
地のタンパク質性成分を沈殿させること、その後のイオ
ン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ
ラフィー等のようなクロマトグラフィー工程を含むよく
知られた工程により培養培地から好適に回収することが
できる。

本発明は、好ましくは無粉塵性、安定化液体又は保護
化酵素の形態にある本発明の関するリパーゼ変異体を含
んで成る洗浄添加剤にも関連する。無粉塵性顆粒は例え
ば米国4,106,991号及び4,661,452号（両方ともNovo Ind
ustri A/Sに属する）に従って製造でき、そして当業界
に知られる方法によって任意的に被覆化されうる。液状
酵素調製物は例えば確立された方法に従ってポリオー
ル、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコー
ル、乳酸又は硼酸を加えることにより安定化されうる。
その他の酵素安定剤が当業界においてよく知られてい
る。保護化酵素はEP 238,216号に開示されている方法に
従って調製できる。

洗浄添加剤は適切には、添加剤のグラム当り0.02−20
0mgの酵素タンパク質を含みうる。この添加剤は洗浄添
加剤の中に通常含まれる一又は複数種のその他の酵素、
例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又
はアミラーゼを更に含みうることが理解されるであろ
う。

更なる観点において本発明は、本発明のリパーゼ変異
体を含んで成る洗浄組成物に関連する。本発明の洗浄組
成物は陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオン又は
双極子イオン型でありうる界面活性剤、及びこれらの界
面活性剤分類の混合物を更に含んで成る。適切な界面活
性剤の典型例は線状アルキルベンゼンスルホネート（LA
S）、アルファーオレフィンスルホネート（AOS）、アル
コールエトキシスルフェート（AEOS）、アルコールエト
キシレート（AEO）、アルキルスルフェート（AS）、ア
ルキルポリグリコシド（APG）及び中性脂肪酸のアルカ
リ金属塩である。

本発明の洗浄組成物は当業界において知られているそ
の他の洗浄成分、例えばビルダー、漂白剤、漂白活性
剤、耐腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、香料、酵素安定剤等
を含みうる。

本発明の洗浄組成物は任意の常用の形態、例えば粉末
又は液状において製剤化されうる。該酵素は前記の酵素
安定剤の添加により液状洗浄剤において安定化されう
る。通常、本発明の洗浄組成物の溶液のpHは７〜12であ
り、そしてある場合においては7.0〜10.5である。その
他の洗浄酵素、例えばプロテアーゼ、セルラーゼ、ペル
オキシダーゼ又はアミラーゼを本発明の洗浄組成物の中
に、別々に、又は前記した通り組合せ添加剤として含ま
せることができうる。

図面の簡単な説明 本発明は以降において、添付図面を参照しながら説明
し、ここで、 図1A及びＢは、H.ラヌギノーザ リパーゼの脂質接触
帯の三次元構造を示し、ここでこのリパーゼは不活性
（Ａ）及び活性（Ｂ）のそれぞれの型にある。「白色」
残基は疎水性アミノ酸（Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,
Gly及びMet）を表わし、「黄色」残基は親水性アミノ酸
（Thr,Ser,Gln,Asn,Tyr及びCys）を表わし、「青色」残
基は正荷電アミノ酸（Lys,Arg及びHis）を表わし、そし
て「赤色」残基は負荷電アミノ酸（Glu及びAsp）を表わ
しており； 図2A及びＢは、Rh.ミーヘイ リパーゼの脂質接触帯
の三次元構造を示し、ここでこのリパーゼは不活性
（Ａ）及び活性（Ｂ）のそれぞれの型にある。「白色」
残基は疎水性アミノ酸（Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,
Gly及びMet）を表わし、「黄色」残基は親水性アミノ酸
（Thr,Ser,Gln,Asn,Tyr及びCys）を表わし、「青色」残
基は正荷電アミノ酸（Lys,Arg及びHis）を表わし、そし
て「赤色」残基は負荷電アミノ酸（Glu及びAsp）を表わ
しており； 図３はポリメラーゼ連鎖反応によるリパーゼ変異体を
コードするプラスミドの調製の図解であり； 図４はPCRによる３段階突然変異誘発の図解であり； 図５はプラスミドpA01の制限地図を示し； 図６はプラスミドpAHLの制限地図を示し； 図７はプラスミドpARMLの制限地図を示す。

本発明を以下の実施例において更に説明し、ここでこ
れらは本発明の範囲を限定する意図はない。

一般方法 アスペルギルス オリザにおけるヒュミコラ ラヌギノ
ーザ リパーゼ及びリゾムコール ミーヘイ リパーゼ
の発現： ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼ及びリゾムコー
ル ミーヘイ リパーゼのクローニングはそれぞれEP 3
05,216号及びEP 238,023号に詳細されている。これらの
特許出願はアスペルギルス オリザにおける２種類のリ
パーゼの発現及び特徴付けも詳細している。利用されて
いる２つの発現プラスミドはp960（H.ラヌギノーザ リ
パーゼ遺伝子を保有）及びp787（R.ミーヘイ リパーゼ
遺伝子を保有）と呼ばれている。

本用途において用いる発現プラスミドは、リパーゼコ
ード化領域のすぐ3'側の若干の改質を除き、p787及びp9
60に類似している。これらの改質は以下の方法において
なされる:p960をNru I及びBamH I制限酵素により消化す
る。これらの２つの部位の間にプラスミドpBR322由来の
BamH I/Nhe IフラグメントであってNhe Iフラグメント
がクレノウフラグメントにより補完されているものをク
ローンし、これによりBamH I及びNhe I部位を含むプラ
スミドpA01（図５）を作り上げる。これらの固有部位の
間に、p960及びp787に由来のBamH I/Xba Iフラグメント
をクローンしてそれぞれpAHL（図６）及びpARML（図
７）を得る。

リパーゼ遺伝子の部位特異的インビトロ突然変異誘発 リパーゼ遺伝子の中に突然変異を導入するのに三通り
の手法を用いた。

第一の方法はZollerとSmithのDNA第３巻、第６号、47
9−488（1984）に詳細されてているオリゴヌクレオチド
部位特異的突然変異誘発を採用する。この方法を以下に
簡単に説明し、そして例１において詳しく説明する。

発現プラスミドから単離した対象のリパーゼ遺伝子を
環状M13バクテリオファージベクターの中に挿入する。
一本鎖ゲノムに、化学構成した相補性DNA鎖をアニール
させる。このDNA鎖は、環状DNA上のリパーゼ配列に相補
性の配列がフランクした導入すべき突然変異を含んでい
る。次にインビトロで、プライマーをクレノウポリメラ
ーゼを用いて生化学的に環状ゲノムの全長において広げ
る。E.コリ（E.coli）に形質転換させた場合、ヘテロ二
本鎖は、フラグメントを単し、そして発現プラスミドの
中に再挿入することのできる所望の配列を有する二本鎖
DNAをもたらすであろう。

採用する他の方法はNelsonとLongのAnalytical Bioch
emistry,180,147−151（1989）に詳細されている。これ
はPCR反応における一つのプライマーとして化学合成DNA
鎖を用いることにより導入した所望の突然変異を含むPC
R（ポリメラーゼ連鎖反応）フラグメントの３段階作製
を包含する。PCR作製化フラグメントから、制限酵素に
よる切断によって突然変異を保有するDNAフラグメント
が単離でき、そして発現プラスミドの中に再挿入するこ
とができる。この方法は例３において詳しく説明する。
図３及び４においてこの方法を概略する。

更なる方法、通称「カセット突然変異誘発」において
は、リパーゼコード化領域の２つの制限部位の間のセグ
メントを所望の突然変異を保有する合成DNAフラグメン
トにより置き換えている。

リパーゼ変異体Ｉ 例1:ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼのD96L変異を
発現するプラスミドの作製 リパーゼ遺伝子の単離： 発現プラスミドp960はBamH I/Xba I制限フラグメント
上にヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼに関するコー
ド領域を含む（このリパーゼのDNA及びアミノ酸配列を
添付した配列表No.1に示す）。BamH I/Xba Iフラグメン
トは以下の通りに単離した：発現プラスミドを制限エン
ドヌクレアーゼBamH I及びXba Iとインキュベートし
た。その条件は:5μｇのプラスミド、10単位のBamH I、
10単位のXba I、100mMのNaCl、50mMのトリス−HCl、pH
7.5、10mMのMgCl₂及び1mMのDTT、50μｌ容量とした。温
度は37℃、そして反応時間は２時間とした。２つのフラ
グメントを１％のアガロースゲルで分け、そして所望の
フラグメントをこのゲルから単離した。

ベクターM13mp18へのリゲーション： 二本鎖の複製型分子のバクテリオファージベクターM1
3mp18を前記した条件のもとでBamH I及びXba Iにより消
化した。単離した制限フラグメントを以下の反応混合物
中で、消化したバクテリオファージベクターにリゲート
させた：プラスミド0.2μｇ、ベクター0.02μｇ、50mM
のトリス−HCl、pH7.4、10mMのMgCl₂、10mMのDTT及び1m
MのATP、容量20μｌ中で16℃で３時間。この混合物５μ
ｌをE.コリ株JM101に形質転換させた。ベクター中のフ
ラグメントの存在は、この形質転換体から単離した二本
鎖M13−DNAに基づく制限酵素分析によって同定した。

一本鎖（ss）DNA（鋳型）の単離： 前記の形質転換体から、MessingのGene,19,269−276
（1982）に詳細の方法に従ってss−DNAを単離した。

突然変異誘発プライマーの5'リン酸化： 5'−TTTCTTTCAACAAGAAGTTAAGA−3'の配列を有する突
然変異誘発プライマーを、70mMのトリス−HCl、pH7.0、
10mMのMgCl₂、5mMのDTT、1mMのATP、100pmolのオリゴヌ
クレオチド及び3.6単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ
を含む30μｌの反応混合物の中で5'末端にてリン酸化さ
せた。反応は37℃で30分行った。次に65℃で10分この混
合物をインキュベートすることによって酵素を不活性化
させた。

鋳型とリン酸化突然変異誘発プライマーのアニール： 鋳型とプライマーのアニールは、0.5pmolの鋳型、5pm
olのプライマー、20mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのMg
Cl₂、50mMのNaCl及び1mMのDTTを含む10μｌの容量の中
で65℃で10分間熱し、次いでその後０℃に冷却すること
で行った。

伸長／リゲーション反応： 上記の反応混合物に以下の混合物10μｌを加えた:0.3
mMのdATP、0.3mMのdCTP、0.3mMのdGTP、0.3mMのTTP、1m
MのATP、20mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのMgCl₂、10m
MのDTT、３単位のT4 DNAリガーゼ及び2.5単位のクレノ
ウポリメラーゼ。次に、反応を16℃で16時間行った。

JM101の形質転換： 上記の反応混合物を標準の技術を利用してCaCl₂−処
理化E.コリJM101細胞の中に種々の希釈率において形質
転換させ、そして２×のYTアガープレート上の２×のYT
トップアガーにおいて平板培養した（２×のYT＝トリプ
シン16g/L、酵母抽出物10g/L、NaCl5g/L。２×のYTトッ
プアガー＝２×のYTに0.4％のアガロースを加え、そし
てオートクレーブにかけたもの。２×のYTアガープレー
ト＝２×YTに２％のアガーを加え、そしてオートクレー
ブにかけたもの）。このプレートを37℃で一夜インキュ
ベートした。

陽性クローンの同定： 利用する方法は以下に詳細するプラーク−リフトハイ
ブリダイゼーションである：ニトロセルロースフィルタ
ーを適切なプラーク密度を有するプレート上に置き、こ
のフィルターを湿らした。次にこのフィルターを以下の
溶液:1.5MのNaCl、0.5MのNaOHに30秒、1.5MのNaCl、0.5
Mのトリス−HCl、pH8.0に１分、そして２×のSSC（0.3M
のNaCl、0.03Mのクエン酸ナトリウム）にその後使用す
るまで浸した。このフィルターを3MMの濾紙上で乾か
し、そして真空オーブンの中で80℃で２時間ベークし
た。

5'−TTTCTTTCAACAAGAAGTTAAGA−3'の配列を有する突
然変異誘発プライマーを、70mMのトリス−HCl、pH7.5、
10mMのMgCl₂、5mMのDTT、10pmolのオリゴヌクレオチ
ド、20pmolのγ−32P−ATP及び3.5単位のT4ポリヌクレ
オチドキナーゼを含む30μｌの容量の中で、5'末端にて
放射線的にラベルした。この混合物を37℃で30分間、次
いで100℃で５分間インキュベートした。

乾かしたフィルターを６×のSSC、0.2％の牛血清アル
ブミン、0.2％のフィコール、0.2％のポリビニルピロリ
ドン、0.2％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）及び50μ
g/mlの音波処理化サケ精子DNAの中で65℃で２時間予備
ハイブリダイズさせた。次に、ラベル化プローブを含む
反応混合物を15mlの新鮮な予備ハイブリダイゼーション
混合物に加え、そしてこのフィルターをこの中でゆっく
り振盪させながら27℃で一夜浸した。ハイブリダイゼー
ションの後、このフィルターを２×のSSC、0.1％のSDS
の中で３回、15分ずつ洗い、そしてオートラジオグラフ
にかけた。同じ溶液の中でしかしながら５℃での洗浄、
及び更なるオートラジオグラフィーの後、突然変異誘発
プライマーに相補性のDNA配列を含むプラークが同定さ
れた。

同定されたクローンはヘテロ二重鎖の結果であるた
め、このプラークを再度プレートした。ハイブリダイゼ
ーションと同定の工程を繰り返した。

二本鎖M13ファージDNAの精製： 再度スクリーンしたクローンをE.コリ株JM101の感染
のために用いた。約10⁸のファージ及びJM101の５コロニ
ーを含む培養物を5mlの２×のYT培地の中で37℃で５時
間増殖させた。次に二本鎖の環状DNAをBirnboimとDoly
のNucleic Acids Res.,2,1513（1979）に記載の方法に
従ってペレットから精製した。

改質型リパーゼをコードする制限フラグメントの単離： 上記の通りに単離したDNA調製物（約５μｇ）を60μ
ｌの100mMのNaCl、50mMのトリス−HCl、pH7.5、10mMのM
gCl₂及び10mMのDTT中の10単位の各制限エンドヌクレア
ーゼBamH I及びXba Iにより、37℃で２時間消化させ
た。このDNA生成物をアガロースゲル上で分け、そして
プラスミドをこのゲルから精製した。

アスペルギルス発現ベクターpA01へのリゲーション（図
５）： 単離した制限フラグメントを制限酵素BamH I及びNhe
Iにより消化したアスペルギルスベクターpA01に、以下
の反応混合物：フラグメント0.2μｇ、ベクター0.02μ
ｇ、50mMのトリス−HCl、pH7.4、10mMのMgCl₂、10mMのD
TT、1mMのATP、全容量20ml中でリゲートさせた。この反
応混合物５μｌをE.コリ株MC1061の形質転換のために用
い、この中で改質した発現プラスミドを同定及び増殖さ
せた。このプラスミドをpAHLD96Lと呼び、そしてこれは
改質コドン以外pAHLと同じである。

pAHLD96Lの配列確認： 突然変異させたプラスミドをもとはSangerにより詳細
されたジデオキシ連鎖停止方法を利用して二本鎖プラス
ミドに基づいて直接シーケンス化した。

例2:ヒュミコラ リパーゼ以外の変異体を発現するプラ
スミドの作製 その他の突然変異リパーゼ遺伝子を例１に記載と同じ
方法を利用して作製した。改質のために利用したプラス
ミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

例3:ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼのD254N変異
体を発現するプラスミドの作製 プラスミドpAHLの線状化： 環状プラスミドpAHLを以下の反応混合物:50mMのNaC
l、10mMのトリス−HCl、pH7.9、10mMのMgCl₂、1mMのジ
チオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２単位のSp
h Iの中で、制限酵素Sph Iにより線状化した。この消化
は37℃で２時間行った。この反応混合物をフェノール
（トリス−HCl、pH7.5で平衡化）により抽出し、そして
２容量の氷冷96％エタノールを加えて沈殿させた。遠心
しそしてペレットを乾かした後、線状化DNAを50μｌのH
₂Oに溶かし、そしてその濃度をアガロースゲル上で評価
した。

３段階PCR突然変異誘発： 図４に示す通り、３段階突然変異誘発は４種のプライ
マーの利用を含む： ３段階全て、10mMのトリス−HCl、pH8.3、50mMのKC
l、1.5mMのMgCl₂、0.001％のゼラチン、0.2mMのdATP、
0.2mMのdCTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのTTP、2.5単位のTaq
ポリメラーゼを含む緩衝液中で行った。

段階１において、100pmolのプライマーＡ、100pmolの
プライマーＢ及び1fmolの線状化プラスミドを全部で100
μｌの反応混合物に加え、次いで95℃で２分、37℃で２
分及び72℃で３分より成るサイクル15周を実施した。

PCR生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次
に段階２を行った。0.6pmolの段階１の生成物及び1fmol
の線状化プラスミドを全部で100μｌの前記した緩衝液
の中に含ませ、次いで95℃で５分、37℃で２分及び72℃
で10分より成るサイクル１周を実施した。

段階２の反応混合物に100pmolのプライマーＣ及び100
pmolのプライマーＤを加え（それぞれ１μｌ）、そして
95℃で２分、37℃で２分及び72℃で３分より成るサイク
ル20周を実施した。この操作は突然変異誘発工程におけ
る段階３を構成する。

突然変異化制限フラグメントの単離： 段階３からの生成物をアガロースゲルより単離し、そ
して20μｌのH₂Oに再溶解させた。次に、制限酵素BspM
IIにより、以下の組成:100mMのNaCl、50mMのトリス−HC
l、pH7.9、10mMのMgCl₂、1mMのDTT及び10単位のBspM II
により全容量50μｌにおいて消化した。インキュベーシ
ョンは37℃で２時間とした。264bpのBspM IIフラグメン
トをアガロースゲルから単離した。

発現ベクターpAHLへのリゲーション： 発現プラスミドpAHLを前記した条件のもとでBspM II
により切断し、そして大きなフラグメントをアガロース
ゲルから単離した。このベクターに、上記で単離した突
然変異化フラグメントをリゲートさせ、そしてこのリゲ
ーション混合物をE.コリへの形質転換のために用いた。
このフラグメントの存在及び方向を、制限酵素による形
質転換体由来のプラスミド調製物の切断により確認し
た。配列分析はSangerにより開発されたジ−デオキシ連
鎖停止手順を利用して二本鎖プラスミドに基づいて実施
した。このプラスミドをpAHLD254Nと命名し、そしてこ
れは改変したコドンを除き、pAHLと同一である。

例4:ヒュミコラ リパーゼのその他の変異体を発現する
プラスミドの作製 以下の突然変異体を例３に記載と同じ方法を用いて作
製したが、ただしPCR生成物及び突然変異フラグメント
の再クローニングのために用いるベクターの消化のため
にその他の制限酵素を利用した。改質のために用いたプ
ラスミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

例5:有用な突然変異体の組合せによるリパーゼ変異体の
作製： 以下の突然変異体を前記に作製した突然変異体のプラ
スミドのフラグメントを組合せることにより作製した。
例えば、pAHLE87K/D254KはpAHLE87KからBamH I/BstX I
制限フラグメントを単離し、次いでBamH I及びBstX Iに
より消化したpAHLD254Kの中にこのフラグメントを挿入
することによって作製される： プラスミド pAHLE87K/D254K pAHLE87Q/D254N/D242N/E210Q pAHLE87Q/D242N/E210Q pAHLR209A/E210A/D96L pAHLR209A/E210Q/E56Q pAHLE210Q/D242N/D254N pAHLE87Q/E210Q/D242N リパーゼ変異体II 例6:ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼのΔL264→L2
69変異体を発現するプラスミドの作製 プラスミドpAHLの線状化： 環状プラスミドpAHLを以下の50μｌの反応混合物:50m
MのNaCl、10mMのトリス−HCl、pH7.9、10mMのMgCl₂、1m
Mのジチオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２単
位のSpH Iの中で制限酵素Sph Iにより線状化した。消化
は37℃で２時間行った。反応混合物をフェノール（トリ
ス−HCl、pH7.5により平衡化）により抽出し、次いで２
容量の氷冷96％エタノールを加えることによって沈殿さ
せた。遠心及びペレットの乾燥の後、線状化DNAを50μ
ｌのH₂Oに溶かし、そしてその用度をアガロースゲルに
基づいて評価した。

３段階PCQ突然変異誘発： 図４に示す通り、３段階突然変異誘発は４種のプライ
マーの利用を含む： ヘルパー１及びヘルパー２はコード領域の外側の配列
に相補である。３段階全て、10mMのトリス−HCl、pH8.
3、50mMのKCl、1.5mMのMgCl₂、0.001％のゼラチン、0.2
mMのdATP、0.2mMのdCTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのTTP、2.
5単位のTaqポリメラーゼを含む緩衝液中で行った。

段階１において、100pmolのプライマーＡ、100pmolの
プライマーＢ及び1fmolの線状化プラスミドを全部で100
μｌの反応混合物に加え、次いで95℃で２分、37℃で２
分及び72℃で３分より成るサイクル15周を実施した。

PCR生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次
に段階２を行った。0.6pmolの段階１の生成物及び1fmol
の線状化プラスミドを全部で100μｌの前記した緩衝液
の中に含ませ、次いで95℃で５分、37℃で２分及び72℃
で10分より成るサイクル１周を実施した。

段階２の反応混合物に100pmolのプライマーＣ及び100
pmolのプライマーＤを加え（それぞれ１μｌ）、そして
95℃で２分、37℃で２分及び72℃で３分より成るサイク
ル20周を実施した。この操作は突然変異誘発工程におけ
る段階３を構成する。

突然変異化制限フラグメントの単離： 段階３からの生成物をアガロースゲルより単離し、そ
して20μｌのH₂Oに再溶解させた。次に、制限酵素Bgl I
I及びBstX Iにより、以下の組成:100mMのNaCl、50mMの
トリス−HCl、pH7.9、10mMのMgCl₂、1mMのDTT、10単位
のBgl II及び10単位のBstX Iにより全容量50μｌにおい
て消化した。インキュベーションは37℃で２時間とし
た。200bpのBgl II/BstX Iフラグメントをアガロースゲ
ルから単離した。

発現ベクターpAHLへのリゲーション： 発現プラスミドpAHLを前記した条件のもとでBgl II及
びBstX Iにより切断し、そして大きなフラグメントをア
ガロースゲルから単離した。このベクターに、上記で単
離した突然変異化フラグメントをリゲートさせ、そして
このリゲーション混合物をE.コリへの形質転換のために
用いた。このフラグメントの存在及び方向を、制限酵素
による形質転換体由来のプラスミド調製物の切断により
確認した。配列分析はSangerにより開発されたジ−デオ
キシ連鎖停止手順を利用して二本鎖プラスミドに基づい
て実施した。このプラスミドをpAHLΔL264→L269と命名
し、そしてこれは改変したコドンを除き、pAHLと同一で
ある。

例7:ヒュミコラ リパーゼのその他の変異体を発現する
プラスミドの作製 以下の突然変異体を例６に記載と同じ方法を用いて作
製したが、ただしPCR生成物及び突然変異フラグメント
の再クローニングのために用いるベクターの消化のため
にその他の制限酵素を利用した。改質のために用いたプ
ラスミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

例8:カセット突然変異誘発によるリパーゼ変異体の作
製： 例６に記載した方法を利用し、プラスミドpAHL上のコ
ード化配列を固有のAvr II及びMlu I部位を含むように
改質させた。Avr II部位はコード化配列のG681をアデノ
シンに変えることによって作った。Mlu I部位はC759を
Ｇに、そしてA762をＴに変えることにより作った。新た
なプラスミドをpAHL7と命名し、そしてこれはpAHLと同
じリパーゼをコード化する。Avr II−とMlu I−部位と
の間に、以下の合成的に作ったリンカーを挿入した（形
質転換体の容易なるスクリーニングのため、Leuコドン
をValコドンに変え、そしてSca I−部位を欠失させてあ
る）： 生ずるプラスミドをpAHLL206Vと命名し、そしてこれ
は塩基が変っていることを除いてpAHLと同じである。

例9:カセット突然変異誘発を利用するその他のリパーゼ
変異体の作製 例８に記載の通りカセット突然変異誘発により作製し
たその他の突然変異体を以下に挙げる。適当な突然変異
誘発を導入するためにその他のリンカーを用いた。

プラスミドの名称 pAHLL206A pAHLF211V pAHLF211A pAHLDR209/E210 リパーゼ変異体III 例10:ヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼのD62C＋E87
C変異体を発現するプラスミドの作製 プラスミドpAHLの線状化： 環状プラスミドpAHLを以下の50μｌの反応混合物:50m
MのNaCl、10mMのトリス−HCl、pH7.9、10mMのMgCl₂、1m
Mのジチオスレイトール、１μｇのプラスミド及び２単
位のSph Iの中で制限酵素Sph Iにより線状化した。消化
は37℃で２時間行った。反応混合物をフェノール（トリ
ス−HCl、pH7.5で平衡化）により抽出し、そして２容量
の氷冷96％エタノールを加えることにより沈殿させた。
遠心及びペレットの乾燥の後、この線状化DNAを50μｌ
のH₂Oに溶かし、そして濃度をアガロースゲルで評価し
た。

３段階PCR突然変異誘発： 図４に示す通り、３段階突然変異誘発は４種のプライ
マーの利用を含む： リパーゼコード化領域中の２つのコドンを変えること
とは別に、プライマーＡにサイレント突然変異を導入し
てこの変化したコドンの間にHind−III部位を作り上げ
た。

３段階全て、10mMのトリス−HCl、pH8.3、50mMのKC
l、1.5mのMgCl₂、0.001％のゼラチン、0.2mMのdATP、0.
2mMのdCTP、0.2mMのdGTP、0.2mMのTTP、2.5単位のTaqポ
リメラーゼを含む緩衝液中で行った。

段階１において、100pmolのプライマーＡ、100pmolの
プライマーＢ及び1fmolの線状化プラスミドを全部で100
μｌの反応混合物に加え、次いで95℃で２分、37℃で２
分及び72℃で３分より成るサイクル15周を実施した。

PCR生成物の濃度はアガロースゲル上で評価した。次
に段階２を行った。0.6pmolの段階１の生成物及び1fmol
の線状化プラスミドを全部で100μｌの前記した緩衝液
の中に含ませ、次いで95℃で５分、37℃で２分及び72℃
で10分より成るサイクル１周を実施した。

段階２の反応混合物に100pmolのプライマーＣ及び100
pmolのプライマーＤを加え（それぞれ１μｌ）、そして
95℃で２分、37℃で２分及び72℃で３分より成るサイク
ル20周を実施した。この操作は突然変異誘発工程におけ
る段階３を構成する。

突然変異化制限フラグメントの単離： 段階３からの生成物をアガロースゲルより単離し、そ
して20μｌのH₂Oに再溶解させた。次に、制限酵素BamH
I及びBstX Iにより、以下の組成:100mMのNaCl、50mMの
トリス−HCl、pH7.9、10mMのMgCl₂、1mMのDTT、10単位
のBamH I及び10単位のBstX Iにより全容量50μｌにおい
て消化した。インキュベーションは37℃で２時間とし
た。733bpのBamH I/BstX Iフラグメントをアガロースゲ
ルから単離した。

発現ベクターpAHLへのリゲーション： 発現プラスミドpAHLを前記した条件のもとでBamH I及
びBstX Iにより切断し、そして大きなフラグメントをア
ガロースゲルから単離した。このベクターに、上記で単
離した突然変異化フラグメントをリゲートさせ、そして
このリゲーション混合物をE.コリへの形質転換のために
用いた。このフラグメントの存在及び方向を、制限酵素
による形質転換体由来のプラスミド調製物の切断により
確認した。配列分析はSangerにより開発されたジ−デオ
キシ連鎖停止手順を利用して二本鎖プラスミドに基づい
て実施した。このプラスミドをpAHLD62C/E87Cと命名
し、そしてこれは改変したコドンを除き、pAHLと同一で
ある。

例11:ヒュミコラ リパーゼのその他の変異体を発現す
るプラスミドの作製 以下の突然変異体を例10に記載と同じ方法を用いて作
製したが、ただしPCR生成物及び突然変異フラグメント
の再クローニングのために用いるベクターの消化のため
に別の制限酵素を利用した。改質のために用いたプラス
ミドの名称及びプライマーを以下に列挙する。

例12:カセット突然変異誘発によるリパーゼ変異体L206V
の作製： 例３に記載した方法を利用し、プラスミドpAHL上のコ
ード化配列を固有のAvr II及びMlu I部位を含むように
改質させた。Avr II部位はコード化配列のG681をアデノ
シンに変えることによって作った。Mlu I部位はC759を
Ｇに、そしてA762をＴに変えることにより作った。新た
なプラスミドをpAHL7と命名し、そしてこれはpAHLと同
じリパーゼをコード化する。Avr II−とMlu I−部位と
の間に、以下の合成的に作ったリンカーを挿入した（形
質転換体の容易なるスクリーニングのため、Leuコドン
をValコドンに変え、そしてSca I−部位を欠失させてあ
る）： 生ずるプラスミドをpAHLL206Vと命名し、そしてこれ
は塩基が変っていることを除いてpAHLと同じである。

例13:カセット突然変異誘発を利用するその他のリパー
ゼ変異体の作製 例３に記載の通りカセット突然変異誘発により作製し
たその他の突然変異体を以下に挙げる。適当な突然変異
誘発を導入するためにその他のリンカーを用いた。

プラスミドの名称 pAHLL206T pAHLL206S pAHLL206A pAHLL206G pAHLF211L pAHLF211T pAHLF211K 例14:有用な突然変異体の組合せによるリパーゼ変異体
の作製： 以下の突然変異体を、前記で作製した突然変異体のプ
ラスミドのフラグメントを組合せることによって作製し
た。例えば、pAHLG61C＋E87Cを、pAHLD62C＋E87C由来の
Hind III制限フラグメント（作製のために用いたプライ
マーは２箇所の突然変異の間にHind III部位が導入され
ている）を単離し、次いでこのフラグメントをHind III
（これも突然変異と共に導入されている）により消化し
ておいたpAHLG61C＋N88Cの中に挿入することにより作製
した。

プラスミド pAHLD61C＋87C pAHLL206S＋I255T＋L259T 例15 アスペルギルス オリザの形質転換（一般的手順） 100mlのYPD（Shermanら著、Methods in Yeast Geneti
cs,Cold Spring Harbor Laboratory,1981）にA.オリザ
の胞子を接種し、そして約24時間振盪させながらインキ
ュベートした。菌糸をミラクロス（miracloth）を介す
る濾過によって集め、そして0.6MのMgSO₄200mlで洗っ
た。この菌糸を1.2MのMgSO₄、10mMのNaH₂PO₄、pH＝5.8
15mlに懸濁した。この懸濁物を氷上で冷やし、そして12
0mgのノボザイム（商標）234、バッチ番号1687を含む緩
衝液1mlを加えた。５分後、12mg/mlのBSA（Sigmaタイプ
H25）1mlを加え、そして顕微鏡のもとでサンプル中に大
量のプロトプラストが識別されるようになるまで、ゆっ
くり攪拌しながら37℃で1.5〜2.5時間インキュベーショ
ンした。

この懸濁物をミラクロスで濾過し、この濾液を滅菌チ
ューブに移し入れ、そして0.6Mのソルビトール、100mM
のトリス−HCl、pH＝7.0 5mlのその上に載せた。1000g
で15分間の遠心を行い、そしてMgSO₄クッションの上か
らプロトプラストを集める。２容量のSTC（1.2Mのソル
ビトール、10mMのトリス−HCl、pH＝7.5、10mMのCaC
l₂）をこのプロトプラスト懸濁物に加え、そしてこの混
合物を1000gで５分間遠心した。このプロトプラストの
ペレットを3mlのSTCに再懸濁し、そして再ペレット化し
た。これを繰り返した。最後に、このプロトプラストを
0.2−1mlのSTCに再懸濁させた。

100μｌのプロトプラスト懸濁物を10μｌのSTC中の５
−25μｇのp3SR2（Hynesら著、Mol.and Cel.Biol.,第３
巻、第８号、1430−1439,1983年８月に詳細されている
A.ニドゥランスamds遺伝子保有プラスミドと混ぜた。こ
の混合物を室温で25分放置した。60％のPEG 4000（BDH
29576）、10mlのCaCl₂及び10mMのトリス−HCl、pH＝7.5
0.2mlを加え、そして慎重に混合し（２回）、次いで
最後に0.85mlの同じ溶液を加え、そして慎重に混合し
た。この混合物を室温で25分放置し、2,500gで15分遠心
し、そしてこのペレットを1.2Mのソルビトール2mlの中
に再懸濁させた。更にもう一回の沈降化の後、このプロ
トプラストを、1.0Mのスクロース、pH＝7.0、窒素源と
しての10mMのアセトアミド及び20mMのCsClを含む最少プ
レート（Cove,Biochem.Biophs.Acta 113（1966）51−5
6）上においてバックグランド増殖を阻止した。37℃で
４〜７日間のインキュベーションの後、胞子を採取し、
滅菌水に懸濁し、そして単一のコロニーについてまい
た。この手順を繰り返し、そして２回目の単離化の後の
単一コロニーの胞子を定義の形質転換体として保存し
た。

例16 A.オリザにおけるリパーゼ変異体D96Lの発現 pAHLD96LをA.オリザIFO 4177の中に、例15に記載のA.
ニドゥランス由来amdS遺伝子を含むp3SR2とその同時形
質転換によって形質転換させた。上記の通りに調製した
プロトプラストを等容量のpAHLD96L及びp3SR2の混合物
とインキュベートし、ここでそれぞれ約５μｇを用い
た。アセトアミドを唯一の窒素源として利用することの
できる９つの形質転換体を２回再単離した。YPD上で３
日間増殖させた後、例16に記載のリパーゼ活性について
アッセイ（本発明のリパーゼ変異体の精製）を利用して
培養上清液をアッセイした。更なる試験のために最も優
れた形質転換体を選び、そして１の振盪フラスコの中
で、200mlのFG4培地（３％のダイズ肉、３％のマルトデ
キストリン、１％のペプトン、4MのNaOHでpHを7.0に調
整）において30℃で４日間増殖させた。このような条件
のもとで、この形質転換体は培養物1ml当り約500リパー
ゼ単位を示した。

その他のリパーゼ変異体は例15に記載の一般的な手順
を利用して、本質的に前記の通りに作った。

例17 本発明のリパーゼ変異体の精製 リパーゼ活性についてのアッセイ： リパーゼにとっての基質は乳化剤としてアラビアゴム
を用いてグリセリントリブチラット（MERCK）を乳化す
ることにより調製した。リパーゼ活性はpHスタット法を
用いてpH7でアッセイした。１分間に１マイクロモルの
脂肪酸を遊離させるのに必要な量として１単位のリパー
ゼ活性（LU/mg）を定義した。段階1:−発酵上清液を遠
心し、沈渣を廃棄する。この上清液のpHを７に合わせ、
そして等容量の冷96％エタノールをゆっくり加える。氷
浴の中でこの混合物を30分間放置する。遠心し、次いで
沈渣を廃棄する。

段階2:−イオン交換クロマトグラフィー。この上清液を
濾過し、そして50mMのトリス−酢酸塩緩衝液pH7により
平衡にしたDEAE−ファストフロー（Pharmacia TM）カラ
ム上に適用する。280nmでの吸光度が0.05のODを下廻る
まで同じ緩衝液でこのカラムを洗う。結合した酵素活性
を同じ緩衝液中の線状塩勾配（０〜0.5MのNaCl）によ
り、５倍のカラム容量を利用して溶離させる。酵素活性
を含む画分をプールする。

段階3:−疎水性クロマトグラフィー。固形酢酸アンモニ
ウムを加えることにより、酵素活性を含むプールのモル
濃度を0.8Mに合わせる。この酵素を0.8Mの酢酸アンモニ
ウムで予備平衡化させたTSKゲル ブチル−トヨパール6
50Cカラム（東ソー（株）、日本より入手可）に適用す
る。結合している物質を0.8Mの酢酸アンモニウムで洗
い、そして蒸留水によって結合物質を溶離させる。

段階4:リパーゼ活性を含むプールを水で希釈して導電率
を2mS、そしてpHを７に合わせる。このプールを50mMの
トリス−酢酸緩衝液pH7により予備平衡化した高性能Ｑ
セファロース（ファルマシア）カラムに適用する。線状
塩勾配により結合酵素を溶離させる。

例18 本発明のリパーゼ変異体の線状性能 本発明のヒュミコラ ラヌギノーザ リパーゼ変異体
の線状性能を、野生型H.ラヌギノーザ リパーゼと比較
して、OD₂₈₀に従って、リットル当りのタンパク質のmg
における酵素投入量に基づいて評価した。

洗浄試験は恒温湯浴の中に置いた150mlのビーカーの
中で実施した。このビーカーを三角形マクネット棒によ
り攪拌した。

実験条件は以下の通りである： 方 法:3サイクル；各サイクルの間に一夜乾燥が伴う 洗浄液：ビーカーにつき100ml スワッチ（見本）：ビーカーにつき６枚のスワッチ（3.
5×3.5cm） 布 帛：綿100％、試験用布帛スタイル＃400 よごれ：スーダンレッドで着色したラード（0.75mgの染
料／ラードのｇ）。70℃に熱したラード６μｌを各スワ
ッチの中心に適用した。よごれを適用した後、このスワ
ッチをオーブンの中で75℃で30分間熱した。次のこのス
ワッチを一回目の洗浄の前に室温で一夜保存した。

洗浄剤:LAS（Nansa 1169/P,30％ a.m.） 1.17g/ AEO（Dobanol 25−７） 0.15g/ 三リン酸ナトリウム 1.25g/ 硫酸ナトリウム 1.00g/ 炭酸ナトリウム 0.45g/ 珪酸ナトリウム 0.15g/ pH :10.2 リパーゼの濃度：リットル当り0.075,0.188,0.375,0.75
及び2.5mgのリパーゼタンパク質 時 間:20分 温 度:30℃ すすぎ：流水道水中で15分 評 価:3回の洗浄の後、460nmでの反射率を測定。

結 果 リパーゼ変異体と天然H.ラヌギノーザ リパーゼにつ
いての投入量−応答曲線を比較した。投入量−応答曲線
は測定データーを以下の式に入れることによって計算し
た： （式中、ΔＲは反射率の単位で表わす効果 Ｃは酵素濃度（mg/） ΔR_maxは最大の効果を表わす定数 Ｋは定数;K²は最大効果の半分が得られるときの酵素
濃度を表わす）。

各リパーゼ変異体と野生型リパーゼに関して見い出さ
れる特有の定数ΔR_max及びＫに基づき、改良系数が計算
される。この改良系数は f_improve＝C_WT/C （II） として定義し、これは対照の野生型タンパク質0.25mg/
により得られる効果と同等のそれを得るために必要な
リパーゼ変異体のタンパク質量を表わしている
（C_WT）。

従って、改良系数を計算する手順は以下の通りであ
る： １）式（Ｉ）によって0.25mg/での野生型タンパク質
の効果（ΔR_wild-type）を計算し； ２）0.25mg/での野生型と同等の効果をもたらすリパ
ーゼ変異体の濃度を以下の式より計算し； ３）式IIにより改良系数を計算する。

この結果を以下の表１に示す。

表１から、リパーゼ変異体R209A＋E210A,E56Q及びD96
Lは野生型リパーゼよりかなり優れた洗浄性能を有する
ことが認められる。これはおそらく、洗浄中の高められ
た吸収性及びその結果として乾燥期間中のより高い活性
をもたらす、これらの変異体の低められた負の電荷及び
高められた疎水性に起因するであろう。リパーゼ変異体
E87A,D111N及びR209Aの性能は野生型酵素のそれと同程
度であった。

例19 リパーゼ変異体の高められた熱安定性 H.ラヌギノーザ リパーゼの特定の変異体の熱安定性
を示差走査熱量計（DSC）により調べた。この技術を利
用して、熱変性温度Tdを、この酵素溶液を定常にプログ
ラムされた速度（レート）によって決定した。

実 験： Microcal社の示差走査熱量計MC−2Dを試験のために用
いた。その中の50mMの緩衝溶液は、以下のpH値で調製し
た:4（酢酸塩）、７（トリス−酢酸塩）、10（グリシ
ン）。酵素濃度は0.6〜0.9mg/mlの範囲とし、そして各
実験に関して約1.2mlの全容量を利用した。全てのサン
プルを90℃/hrのスキャン速度で５℃から95℃にまで熱
した。

結 果： 野生型と特定の突然変異体の結果を以下の表に示す。

例20 液状洗浄剤におけるH.ラヌギノーザ リパーゼ変異体の
保存安定性 いくつかの変異体を以下の組成を有する標品液状洗浄
剤において試験した： 1gの洗浄剤当り1000LUを加え、そしていくつかのサン
プルには0.025AU/g（Alcalase〔商標〕）を加えた。サ
ンプルを以下の条件に従って保存した（それぞれ三重測
定）： このインキュベーションの後、このサンプルをLU−法
（ノボ ノルディスクAF 95.5）に従って分析した。

リパーゼ活性の衰退が一次反応に従うと仮定すると、
この衰退の速度定数が決定することができる： Ａ（ｔ）＝A₀ ^＊exp（−ｋ^＊ｔ） Ａ（ｔ）はｔ時での酵素活性、A₀は初期活性、そしてｋ
は一次速度定数である。

プロテアーゼを含む洗浄剤に関して、タンパク質分解
についての速度定数は、 Ａ（ｔ）＝A₀ ^＊exp（−〔ｋ＋k_p〕^＊ｔ） （式中、k_pはタンパク質分解の速度定数であり、そして
ｋはプロテアーゼを含まない洗浄剤において決定された
安定性データーから計算される）より計算することがで
きる。

各実験の中には対照として野生型H.ラヌギノーザ リ
パーゼを含ませており、そして変異体と野生型との比較
は実験間での不明確な変動を小さくするためにこの実験
において行ったにすぎない。

以下の結果が得られ、そして野生型に対する変異体の
相対的改良を IF_x＝k_wt/k_x （式中、IFは改良系数を表わし、k_wtは野生型の衰退の
速度定数（一定条件での）であり、そしてk_xは同じ実験
における問題の変異体の相当の速度定数である）として
示される。

IFは半減期の相対的改良を表わす（IF_x＝２は変異体
ｘの半減期が同じ実験において野生型のそれの２倍長い
ことを示す）。

実験における繰り返しの変動の評価に基づき、IF＜0.
7又はIF＞1.3は有意であると考える。ｋの単位は（日）
^-1である。

以上より、試験した数多くの変異体はタンパク質分解
に対する改良された耐性を有し、そしてこれらのほとん
どがアルカリ条件に対する改良された耐性を有してい
た。

例21 比活性 リパーゼ変異体に関して、野生型（wt）よりも高い比
活性（単位量当り、単位時間にて分解される基質分子の
量）が以下に示すように測定された。このことは、これ
らのリパーゼが実質の基質を加水分解する優れた性能を
有することを意味する。

このリパーゼは同じ方法で増殖且つ精製してある。精
製したリパーゼを標準のLUアッセイで試験した（分析
法、内部ノボ ノルディスクAF 95/6−GB 1991.02.0
7）。このサンプルを２回分析し、そしてその平均値を
一覧表にした。タンパク質の量は波長280nmを用い、島
津の分光光度計による光学密度によって評価した。この
サンプルは、OD260により割ったOD280の比の値が1.6よ
り大きいとき、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
の単一バンドとともに純粋であると考えられる。

配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ノボ ノルディスク A/S （ii）発明の名称：リパーゼ変異体 （iii）配列の数:2 （iv）関連住所： （Ａ）宛先：ノボ ノルディスク A/S （Ｂ）通り：ノボ アレ （Ｃ）市：バグスバード （Ｄ）国：デンマーク （Ｅ）郵便番号:2880 （ｖ）コンピューターの読み取り方式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパチブル （Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン リリース＃
1.0、バージョン＃1.25 （vi）現出願のデーター： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii）先の出願のデーター： （Ａ）出願番号:DK 2196/90 （Ｂ）出願日:1990年９月13日 （vii）先の出願のデーター： （Ａ）出願番号:DK 2194/90 （Ｂ）出願日:1990年９月13日 （vii）先の出願のデーター： （Ａ）出願番号:DK 2195/90 （Ｂ）出願日:1990年９月13日 （viii）代理人／代理店の情報： （Ａ）名称：サルソエ−マドセン，バージット （Ｃ）参照／事件番号:3520.204−WO （ix）通信情報： （Ａ）電話：＋45 4444 8888 （Ｂ）テレファックス：＋45 4449 3256 （Ｃ）テレックス:37304 （２）配列No.1に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:918塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型:cDNA （vi）起源： （Ａ）生物：ヒュミコラ ラヌギノーザ （ix）特徴： （Ａ）名称／キー:CDS （Ｂ）位置:1..873 （Ｃ）名称／キー：成熟ペプチド （Ｄ）位置:67..873 （xi）配列の詳細：配列NO:1: （２）配列NO:2に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ:291アミノ酸 （Ｂ）種類：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：線状 （ii）分子の型：タンパク質 （xi）配列の詳細：配列NO:2:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ２１９６／９０ (32)優先日 平成２年９月13日(1990．9．13) (33)優先権主張国 デンマーク（ＤＫ） 前置審査 (72)発明者 パトカル，シャムカント アナント デンマーク国，2800 リングビイ，クリ ストフェルス アレ 91 (72)発明者 ゴルムセン，エリク デンマーク国，2830 ビルム，スネッケ トフテン 15 (56)参考文献 特開 平２−225599（ＪＰ，Ａ) Ｄａｖｉｓ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｈ ｅｐａｔｉｃ ｌｉｐａｓｅ：ｓｉｔｅ −ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ ｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｅｒｉｎｅ ｒｅ ｓｉｄｕｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏ ｒ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉ ｔｙ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，米 国，1990年 ４月15日，265（11) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/09 C11D 3/386 C11D 7/42 C12N 1/15 C12N 9/20 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号２のアミノ酸配列から成るヒュミ
   コラ ラヌギノーザ リパーゼである親リパーゼの酵素
   的に活性なリパーゼ変異体であって、当該親リパーゼは
   リパーゼ分子の疎水性アミノ酸を主として含む結合性ポ
   ケット内に位置する活性セリンを含むSer,His及びAspか
   ら成るトリプシン様触媒三つ組残基を含んで成り、且つ
   当該リパーゼが不活性な形態にあるときに、前記活性セ
   リンを覆う表面ループ構造を含んで成り、ここで当該親
   リパーゼが活性化されると、このループ構造は移動して
   前記活性部位残基を露出させ、加水分解時に脂質基質と
   相互作用する疎水性の高い表層により構成される前記活
   性セリン残基を含む部分内に位置する脂質接触帯を生み
   出すものであり、 ここで当該リパーゼ変異体は、前記脂質接触帯の静電荷
   及び／又は疎水性が、１もしくは複数の負に荷電してい
   るアミノ酸残基の欠失又は中性もしくは正に荷電してい
   るアミノ酸残基による置換により；及び／あるいは１も
   しくは複数の中性アミノ酸残基の正に荷電しているアミ
   ノ酸残基による置換により；及び／あるいは１もしくは
   複数の親水性アミノ酸残基の欠失又は疎水性アミノ酸残
   基による置換により、当該親リパーゼと比べ変えられて
   おり、ここで当該負に荷電しているアミノ酸残基はGlu
   又はAspであり、当該正に荷電しているアミノ酸残基はL
   ys,Arg又はHisであり、当該親水性アミノ酸残基はThr,S
   er,Gln,Asn,Tyr又はCysであり、そして当該疎水性アミ
   ノ酸残基はAla,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,Gly又はMetで
   あり、 また下記の１又は複数のアミノ酸残基置換： E56A; E56Q; E87Q; E87K; E87K＋D254K; E210R; E210K; D96L; D96N; D111N; L206S; L206T; L206V; R209A; F211A; F211I; F211L; F211T; F211V; D242N; T267R; R209A＋E210A; R209A＋E210A＋D96L; E210Q＋D242N＋D254N; R209A＋E210A＋D96L＋E56Q; R209^＊＋E210^＊ を含んで成り、 但し当該リパーゼ変異体は、その位置127のGlnがArgで
   置換されており、及び／又は位置207のPheがThr,Gly,Ly
   sもしくはAlaで置換されているシュードモナス プチダ
   （Pseudomonas putida）ATCC 53552より単離される親
   リパーゼの変異体とは異なるものである、 リパーゼ変異体。
2. 【請求項２】請求項１に記載のリパーゼ変異体をコード
   するDNA配列を含んで成るDNA構造体。
3. 【請求項３】請求項２に記載のDNA構造体を保有する組
   換え発現ベクター。
4. 【請求項４】請求項２に記載のDNA構造体又は請求項３
   に記載のベクターにより形質転換された細胞。
5. 【請求項５】アスペルギルス属の菌類細胞である、請求
   項４に記載の細胞。
6. 【請求項６】請求項４又は５記載の細胞を、リパーゼ変
   異体の生産をもたらす条件のもとで培養し、そしてこの
   リパーゼ変異体をこの培養物から回収することを含んで
   成る、請求項１に記載のリパーゼ変異体を生産する方
   法。
7. 【請求項７】無粉塵性顆粒、安定化液体又は保護化酵素
   の形態にある、請求項１に記載のリパーゼ変異体を含ん
   で成る洗浄添加剤。
8. 【請求項８】0.02−200mgの酵素タンパク質/1gの添加剤
   を含む、請求項７に記載の洗浄添加剤。
9. 【請求項９】プロテアーゼ、アミラーゼ、ペルオキシダ
   ーゼ及びセルラーゼより成る群から選ばれる他の酵素を
   更に含んで成る、請求項７又は８に記載の洗浄添加剤。
10. 【請求項１０】界面活性剤及び請求項１に記載のリパー
    ゼ変異体を含んで成る洗浄組成物。
11. 【請求項１１】プロテアーゼ、アミラーゼ、ペルオキシ
    ダーゼ及びセルラーゼより成る群から選ばれる他の酵素
    を更に含んで成る、請求項10に記載の洗浄組成物。