RO114298B1

RO114298B1 - Molecula anticorp cu afinitate pentru un antigen predeterminat si procedeu de preparare

Info

Publication number: RO114298B1
Application number: RO148282A
Authority: RO
Inventors: John Robert Adair; Diljeet Singh Athwal; John Spencer Emtage
Original assignee: Celltech Ltd
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-21
Publication date: 1999-03-30
Also published as: US20060029593A1; GR3017734T3; GB9117611D0; US20060073136A1; DE69022982D1; AU6461294A; DE69033857T2; DE69031591T2; BR9007197A; FI109768B; CA2046904C; CA2046904A1; HU912752D0; AU631481B2; ZA9110129B; RO114980B1; WO1991009967A1; FI108917B; HUT60786A; FI913926A0

Description

Prezenta invenție se referă la o moleculă anticorp cu afinitate pentru un antigen predeterminat precum și la procedeul de preparare a acesteia, fiind utilizată în tehnologia ADN recombinant pentru folosirea în terapeutică.

Termenul de “moleculă anticorp umanizată” este utilizat pentru a descrie o moleculă având o porțiune de legătură antigenică derivată de la o imunoglobulină de la specii neumane și părți derivate de la imunoglobulină rămase din molecula care este derivată din imunoglobulina umană. Porțiunea de legătură antigenică cuprinde în mod tipic regiuni de determinare complementare (CDRs) care determină specificitatea moleculei anticorp și care sunt transportate pe regiuni cadru specifice în domenii variabile. Există trei de astfel de regiuni CDRs (CDR1, CDR2 și CDR3] în fiecare din aceste domenii variabile cu catene grele și scurte.

Imunoglobulinele naturale sunt cunoscute de mai mult timp ca având fragmente, cum ar fi de exemplu fragmentele Fab, (Fab’)2 și Fc care pot fi derivate prin clivaj enzimatic. Imunoglobulinele naturale cuprind în general o moleculă în formă de Y, având o porțiune de legătură antigenică spre capătul fiecărui braț superior. Restul de structură, și în special partea din Y, este mediatoare a funcțiilor efectoare asociate cu imunoglobulinele.

Imunoglobulinele naturale au fost utilizate în analize, în metode de diagnosticare și, cu o extindere mult mai limitată, au fost folosite în terapeutică. Cu toate acestea, astfel de utilizări, în special utilizarea în terapeutică, au fost împiedicate până în prezent prin natura policlonală a imunoglobulinelor naturale. Un pas semnificativ către utilizarea potențialului imunoglobulinelor ca agenți terapeutici a fost descoperirea procedeelor de obținere a anticorpilor monoclonali (MAbs) cu specificate definită.

Cu toate acestea, majoritatea

MAbs sunt produse prin hibridomas care fuzionează cu celulele splenice din rozătoare și celulele mieloma tot din rozătoare. Din această cauză, acestea sunt proteine esențiale din rozătoare. Există puține date în ceea ce privește raportarea de producție MAbs umane.

întrucât cele mai corespunzătoare MAbs sunt acelea care au originea din rozătoare, acestea sunt în mod natural antigenice la oameni și astfel se poate ajunge la un răspuns imun nedorit, având termenul de HAMA (anticorp uman antișoarece) ca răspuns. De aceea, utilizarea MAbs din rozătoare ca agenți terapeutici la oameni este inerent limitată prin faptul că, subiectul uman va purta un răspuns imunologic la MAb și astfel va fi îndepărtat în întregime sau cel puțin; se va reduce eficacitatea. In practică, MAbs de origine de la rozătoare nu se poate utiliza la pacienți mai mult decât unul sau în câteva tratamente, ca un răspuns HAMA dezvoltat de curând și redând unMAb inefectiv ca și o creștere a reacțiilor nedorite. De exemplu, OKT3 la șoarece, lgG2a/kMAb care recunoaște un antigen în complexul CD3 receptor T-celular a fost acceptat pentru utilizare în multe țări din lume, ca un imunosupresant în tratamentul rejecției alografice acute, așa cum este prezentat în literatura de specialitate. Cu toate acestea, în ceea ce privește natura rozătoarelor MAbs și a altor complecși asemănători, un răspuns semnificativ HAMA care poate include un component major anti-idiotip, poate fi desemnat pentru utilizare. In mod clar, ar fi foarte de dorit să se scadă sau să fie abolit acest răspuns HAMA, care este nedorit și astfel să se lărgească suprafața de utilizare a acestor anticorpi care sunt foarte folosiți.

Propunerile au fost făcute în sensul redării MAbs neumani, cu antigenitate mai mică la oameni. Astfel de tehnici pot fi denumite, în general, tehnici de “umanizare” care cuprind în mod tipic folosirea tehnologiei recombinante a ADN în scopul manipulării secvențelor de ADN și codificând catenele de polipeptide ale moleculei de anticorp.

Metodele din trecut cu referire la umanizarea MAbs cuprindeau producerea anticorpilor chimerici în care o porRO 114298 Bl țiune de legătură antigenică cuprinzând domenii complet variabile dintr-un anticorp este legată la domenii constante derivate de la alt anticorp. Metodele pentru realizarea unor astfel de procedee sunt cunoscute din literatura de specialitate. Astfel este descris un procedeu de preparare a moleculei anticorp care are domenii variabile de la șoarecele MAb și domenii constante dintr-o imunoglobulină umană. Astfel de anticorpi chimerici conțin, totuși, încă o proporție semnificativă din secvența de aminoacid neumană, ca de exemplu, domenii variabile complet neumane și astfel se pot obține încă unele răspunsuri HAMA, în special dacă se administrează o perioadă prelungită de timp (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate).

In datele din stadiul tehnicii, ca o propunere alternativă, regiunile de determinare complementare (CDRs) pentru MAb la șoarece au fost grefate în regiunile cadru ale domeniilor variabile ale imunoglobulinei umane prin porțiunea direcționată către mutageneză, utilizându-se oligonucleotide lungi. Prezenta descriere de invenție se referă așadar la molecule anticorp umanizate, preparate, acestei propuneri alternative, cum ar fi de exemplu molecule anticorp umanizate grefate pe CDR. Astfel de anticorpi umanizați grefați pe CDR sunt mult mai puțin asemănători pentru a da un răspuns HAMA crescut, în raport cu anticorpii chimerici umanizați în vederea unei proporții mult mai mici a secvenței de aminoacid neuman pe care aceștia o conțin. Cea mai nouă lucrare privind umanizarea MAbs prin grefare pe CDR a fost realizată pe MAbs, recunoscând antigenii sintetici, cum ar fi de exemplu antigenii Np sau NIP. Totuși, exemplele în care un MAb lizozimă de recunoaștere la șoareci și MAb de recunoaștere la șobolan pe celulele T-umane, sunt umanizate prin grefare pe CDR, așa cum este descris în literatura de specialitate. Prepararea anticorpului grefat pe CDR cu antigenul pe celulele T-umane este așadar descrisă în materialele care sunt cunoscute din literatura de specialitate.

S-a găsit că numai transferul regiunilor CDR (așa cum s-a definit prin referințele Kabat) nu a fost suficient să se prevadă o activitate de legătură antigenică satisfăcătoare în produsul grefat pe CDR. In cercetările efectuate, s-a găsit că este necesar să se acopere un reziduu de serină la poziția 27 a secvenței umane la reziduul de fenilalanină corespunzător la șobolan, pentru a se obține un produs grefat pe CDR având o activitate antigenică de legătură îmbunătățită. Reziduul din poziția 27 al catenei grele este în cadrul lanțului structural adiacent la CDR1. O altă construcție care conține adițional serina umană față de schimbarea de tirozină la.șobolan în poziția 30 a catenei grele,nu are o activitate de legătură schimbată semnificativ față de anticorpul umanizat cu serină prin schimbul de fenialanină numai în poziția 27. Aceste rezultate arată că schimbările față de reziduurile secvenței umane exterioare a regiunilor CDR, în special în lanțul structural adiacent la CDR1, pot fi necesare pentru obținerea efectivă a activității de legare antigenică pentru anticorpii grefați pe CDR care recunosc antigeni mult mai complecși. Astfel, chiar afinitatea de legătură a anticorpilor care sunt cei mai bine grefați pe CDR, este mai mică în mod semnificativ decât MAb original.

Foarte recent, în literatura de specialitate, s-a descris prepararea unui anticorp umanizat care se leagă la receptorul interleukină-2, prin combinarea CDRs a murinei MAb (anti-Tac) cu regiunile constante și imunoglobulină cadru umană. Regiunile cadru umane sunt alese pentru maximizarea homoloagă cu secvența anti-TacMAb. In plus, computerul de modelare este utilizat pentru identificarea reziduurilor cadru ale acidului amino care reacționează, la fel, cu CDRs sau antigenul și aminoacizii de la șoarece sunt utilizați la aceste poziții în anticorpul umanizat.

In literatura de specialitate (WO

90/07861), se propun patru criterii de desemnare a imunoglobulinelor umanizate. Primul criteriu este umanizarea

RO 114298 Bl acceptorului uman cadru din imunoglobulina umană specială, care este de obicei omoloagă cu donorul de imunoglobulină neuman care trebuie umanizat sau pentru utilizarea unei consens cadru din mulți anticorpi umani. Al doilea criteriu este utilizarea donorului aminoacid mai degrabă decât acceptorul, dacă reziduul de acceptor uman este neobișnuit și reziduul donor este tipic pentru secvențele umane la un reziduu specific al acestui cadru. Cel de al treilea criteriu este de utilizare a donorului cadru reziduu de aminoacid mai degrabă decât acceptorul la pozițiile imediat adiacente la CDRs. Cel de al patrulea criteriu este utilizarea reziduului donor de aminoacid la pozițiile cadru la care aminoacidul este prevăzut a avea o catenă parțial atomică în care aproximativ 3 Â de CDRs este de modelul imunoglobulinei tridimensionale și care este capabil de interacțiune cu antigenul sau cu CDRs-ul imunoglobulinei umanizate. S-a propus ca criteriul al doilea, al treilea sau al patrulea să poată fi aplicat în adiție sau alternativ cu criteriul numărul unu, și să poată fi aplicat singur sau în altă combinație.

In acest material, se descrie în detaliu prepararea unui singur anticorp umanizat grefat pe CDR, un anticorp umanizat având specificitate pentru proteina p55 Tac a receptorului IL-2. Combinația celor patru criterii, așa cum s-a menționat mai sus, se utilizează în desemnarea acestui anticorp umanizat, iar cadrele regiunii variabile ale anticorpului uman Eu fiind utilizate ca acceptor. In anticorpul umanizat rezultat, donorul CDRs s-a definit (de către Kabat] în adiție la reziduurile donoare la șoareci care se utilizează în locul reziduurilor acceptoare umane în pozițiile 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94,' 103, 104, 105 și 107 în catena lungă și la pozițiile 48, 60 și 63 la catena scurtă a cadrelor regiunii variabile. Anticorpul umanizat anti-Tac obținut este raportat ca având o afinitate pentru p55 al 3 x 10⁹M’¹, aproximativ o treime din cea a murinei MAb.

In continuare, s-au făcut investi6 gații în ceea ce privește prepararea moleculelor anticorpi umanizați, grefate pe CDR și care au identificată o ierarhie a pozițiilor în cadrul regiunilor variabile (de exemplu lanțurile structurale și care CDRs Kabat ale regiunilor variabile) la care identitățile aminoacidului reziduurilor sunt importante pentru obținerea produselor grefate pe CDR cu o afinitate de legare satisfăcătoare. Acestea au permis stabilirea unui protocol pentru obținerea produselor grefate pe CDR și care pot fi aplicate, pe scară largă, la nivelul homologiei între donorul de imunoglobulină și cadrul acceptor. Setul de reziduuri care a fost identificat ca fiind de o importanță.critică, nu coincide cu reziduurile de identificare.

Este cunoscut, de asemenea, din literatura de specialitate, un anticorp care prezintă specificitate față de limfocitele umane mature și care poate avea utilizări clinice. Mai concret, acest anticorp monoclonal se leagă de un epitop al unui receptor de celule-T α/β uman (TCR), care este distinct de epitopul CD3 recunoscut de anticorpul monoclonal 0KT3. Se cunoaște obținerea de anticorpi himerici, adică acel anticorp în care întreg domeniul variabil este derivat de la un anticorp donor. In literatura de specialitate, însă, nu există o prezentare a unui anticorp în care domeniile variabile cuprind o combinație de reziduuri donoare și acceptoare.

Molecula anticorp cu afinitate pentru antigen predeterminat, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena lungă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 8, 10, 12 până la 17, 19, 21, 22, 40, 42 până la 44, 66, 68, 70, 74, 77, 79, 81, 83 până la 85, 90, 92, 105, 109, 111 și 113 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58, 71, 73, 78 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare. Reziduurile de aminoacid 26 până la 30 și 59 până la 65 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile 1, 3 și 76 din numita

RO 114298 Bl catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36, 94, 104, 106 și 107 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 48, 67 și 69 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 7,9, 11, 18, 20, 25, 37, 39, 41, 45, 47, 48, 72, 75, 80, 82, 86 până la 89, 91, 93, 103, 108, 110 și 112 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.

In conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid

5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23, 39, 41 până la 43, 57, 59. 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104, 106 și 107 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 24, până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare. Reziduurile de aminoacid 1, 3 și 47 din numita catenă scurtă comozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Reziduurile de aminoacid 36, 44, 47, 85 și 87 din numita catenă scurtă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4,

6, 49, 62, 64 până la 69, 98, 99, 101 și 102, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare. Cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3, 10, 12, 21, 40, 60, 63, 70, 73, 80, 103 și 105, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

Procedeul de preparare a moleculei anticorp cu afinitate pentru antigen predeterminat cuprinde următoarele etape: (1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp donor care are afinitate pentru numita antigenă predeterminată; (2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp acceptor nespecific; (3) furnizarea unei catene lungi compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă lungă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare în care, în conformitate cu sistemul de numeroatare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 8, 10, 12 până la 17, 19, 21, 22, 40, 42 până la 44, 66, 68, 70, 74, 77, 79, 81, 83 până la 85, 90, 92, 105, 109, 111 și 113 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58, 71, 73, 78 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare; (4) asocierea catenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numitul antigen predeterminat; (6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 71,73 și 78 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(7) asocierea catenei lungi obținute în etapa (6) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (8) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa [7] față de numitul antigen predeterminat; (9) dacă afinitatea determinată în etapa (8) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi după cum se descrie în etapa (6) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 26 până la 30 sunt reziduuri donoare suplimentare; (10) asocierea catenei lungi obținute în etapa (9) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (11) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (10) față de numitul antigen predeterminat;

(12) dacă afinitatea determinată în etapa (11) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi după cum se descrie în etapa (9) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3 și 76 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(13) asocierea catenei lungi obținute în

RO 114298 Bl etapa (12) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (14) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (13) față de numitul antigen predeterminat; (15) dacă afinitatea determinată în etapa (14) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi după cum se descrie în etapa (12) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36, 94, 1Q4, 106 și 107 sunt reziduuri donoare suplimentare; (16) asocierea catenei lungi obținute în etapa (15) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (17) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (16) față de numitul antigen predeterminat; (18) dacă afinitatea determinată în etapa (17) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizând o catenă lungă după cum se descrie în etapa (15) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6,

38, 48, 67 și 69 sunt reziduuri donoare suplimentare; (19) asocierea catenei lungi obținute în etapa (18) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp. Procedeul mai poate cuprinde și următoarele etape: (1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte din numitul anticorp donor care are afinitate pentru numitul antigen predeterminat;

(2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte dintr-un anticorp acceptor nespecific; (3) furnizarea unei catene scurte compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă scurtă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23,

39, 41 până la 43, 57, 79, 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104 și 106 până la 109 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare; (4) asocierea ca- tenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numita antigenă predeterminată; (6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene scurte după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 1, 2, 3 și 47 sunt reziduuri donoare suplimentare; (7) asocierea catenei scurte obținute în etapa (6) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule de legare antigen; (8) determinarea afinității moleculei de legare antigen formate în etapa (7) față de numitul antigen predeterminat;

(9) dacă afinitatea determinată în etapa (8) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene s curte după cum se descrie în etapa (6) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 36, 44, 47, 85 și 87 sunt reziduuri donoare suplimentare; (10) asocierea catenei scurte obținute în etapa (9) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule anticorp; (11) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (10) față de numitul antigen predeterminat; (12) dacă afinitatea determinată în etapa (11) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene scurte după cum se descrie în etapa (9) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 49, 62, 64 până la 69, 98, 99, 101 sunt reziduuri donoare suplimentare și (13) asocierea catenei scurte obținute în etapa (9) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule anticorp.

Conform unui prim aspect al prezentei descrierii din invenție, se face referire la anticorpul grefat pe CDR având catenă lungă a domeniului regiunii variabile, cuprinzând acceptorul cadru al regiunilor de legătură cu donorul antigenic, în care cadrul cuprinde reziduurile donoare la cel puțin una dintre pozițiile 6, 23 și/sau 24, 48 și/sau 49, 71 și/sau 73, 75 și/sau 76 și/sau 78 și 88 și/RO 114298 Bl sau 91.

Conform unor întruchipări preferate, cadrul catenei lungi cuprinde reziduurile donoare în pozițiile 23, 24, 49, 71, 73 și 78 sau la pozițiile 23, 24 și 49. Reziduurile de la pozițiile 71, 73 și 78 a catenei lungi cadru sunt de preferință fie toate acceptoare sau reziduuri în totalitate donoare.

In special, în întruchipările preferate, catena lungă cadru adițională cuprinde reziduurile donoare la una, câteva sau la toate pozițiile 6, 37, 48 și 94. Așadar, este în special de preferat ca reziduurile din pozițiile catenei cadru lungi, care de obicei sunt conservate ca specii încrucișate, de exemplu pozițiile 2, 4, 25, 36', 39, 47, 93, 103, 104, 106 și 107, dacă nu sunt conservate între donor și acceptor, să cuprindă adițional reziduuri donoare. Mult mai preferabil, catena cadru lungă cuprinde adițional reziduuri la pozițiile 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 și

107.

In adiție, catena lungă cadru cuprinde opțional reziduuri donoare la una, câteva sau la toate pozițiile 1 și 3; 72 și 76; 69 (dacă 48 este diferit între donor și acceptor); 38 și 46 (dacă 48 este un reziduu donor); 80 și 20 (dacă 69 este un reziduu donor); 67; 82 și 18 (dacă 67 este reziduu donor); 91; 88 și oricare sau mai mulți dintre 9, 11,41, 87,

108, 110 și 112.

In primul și celelalte aspecte ale prezentei descrierii de invenție, referințele sunt făcute la produsele anticorpi grefate pe CDR, cuprinzând cadrul acceptor și regiunile de legătură antigenice. Este de apreciat ca invenția să fie aplicată pe scară largă la grefările pe CDR ale anticorpilor, în general. Astfel, anticorpii donori și acceptori pot fi derivați de la animale din aceeași specie și chiar aceeași clasă sau aceleași subclase de anticorpi. Totuși mult mai uzual, anticorpii donori și acceptori sunt derivați de la animale de specii diferite. In mod tipic, anticorpul donor este un anticorp neuman, ca de exemplu MAb la rozătoare și anticorpul acceptor este un anticorp uman.

Conform primului aspect și conform altor aspecte ale prezentei invenții, regiunea tipică de legătură antigenică donoare cuprinde cel puțin un anticorp donor CDR. In mod obișnuit, regiunea de legătură antigenică donoare cuprinde cel puțin două, și de preferință toate cele trei CDRs ale fiecărei catene lungi și/sau catene scurte în regiunile variabile. CDRs pot cuprinde CDRs Kabat, lanțul strctural CDRs sau o compoziție Kabat și lanțul structural CDRs și orice combinație din oricare dintre acestea. De preferință, regiunile de legătură antigenică ale domeniului variabil al catenei lungi grefate pe CDR cuprinde CDRs corespunzând la Kabat CDRs, la CDR2 (reziduurile 50...65) și CDR3 (reziduurile

95.. .100) și o compoziție Kabat și lanț structural CDRs la CDR1 (reziduurile

26.. . 35).

Reziduurile desemnate ca mai sus, din cadrul prezentei invenții, sunt numeroate în conformitate cu numerotarea Kabat (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Astfel, reziduul desemnat nu trebuie totdeauna să corespundă direct cu numerotarea lineară a reziduurilor de aminoacizi. Secvența de aminoacid actual lineară poate conține mai puțini sau adițional aminoacizi, decât în conformitate cu numerotarea Kabat, corespunzătoare scurtării acesteia sau în inserție, un component structural, dacă este cadru sau CDR, în structura domeniului variabil bazic. De exemplu, regiunea variabilă a catenei lungi a anticorpului anti-Tac este descrisă în literatura de specialitate, și în care conține un singur insert aminoacid (reziduul 52a) după reziduul 52 al CDR2 și al treilea aminoacid (reziduurile 82a, 82b, 82c) după reziduul cadru 82, în numerotarea Kabat. Numerotarea corectă Kabat a reziduurilor poate fi determinată pentru un anticorp dat prin alinierea regiunilor omologiei secvenței anticorpului cu o secvență “standard” cu numerotarea Kabat.

Invenția se referă, așadar conform celui de al doilea aspect al anticorRO 114298 Bl pului grefat pe CDR cu catenă ușoară, având un domeniu al regiunii variabile cuprinzând cadrul acceptor și regiunile de legătură antigenică donoare, iar cadrul cuprinde reziduurile donoare la cel puțin una din pozițiile 1 si/sau 3 si 46 si/sau 47.

De preferință, catena ușoară grefată pe CDR în al doilea aspect al invenției, cuprinde reziduurile donoare în pozițiile 46 și/sau 47.

Prezenta invenție se referă așadar, în cel de al treilea aspect, la anticorpul grefat pe CDR cu catenă ușoară, având regiunea din domeniul variabil cuprinzând cadrul acceptor și regiunile de legătură antigenică donoare în care cadrul cuprinde reziduurile donoare la cel puțin una dintre pozițiile 46, 48, 58 si 7l’.

Conform unei întruchipări preferate al celui de al treilea aspect, cadrul cuprinde reziduurile donoare la toate pozițiile 46, 48, 58 și 71.

In întruchipările special prefarate, conform aspectelor doi și trei, cadrul adițional cuprinde reziduurile donoare la pozițiile 36, 44, 47, 85 și 87. Pozițiile similare la cadrul catenei ușoare, care sunt de obicei specii încrucișate, de exemplu pozițiile 2, 4, 6, 35, 49, 62,

64...69, 98, 99, 101 și 102, dacă nu se conservă între donor și acceptor, adițional cuprinde reziduuri donoare. Mult mai preferabil, cadrul catenei ușoare cuprinde adițional reziduuri donoare la pozițiile 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98. 99, 101 si 102.

In adiție, cadrul celui de al doilea sau al treilea aspect cuprinde opțional reziduuri donoare la una, câteva sau la toate următoarele poziții: 1 și 3; 63 ; 60 (dacă 60 și 54 sunt capabile să formeze o sare de legătură potențială); 70 (dacă 70 și 24 sunt capabile să formeze o sare de legătură potențială); 73 și 21 (dacă 47 este diferit între donor și acceptor); 37 și 45 (dacă 47 este diferit între donor și acceptor) și oricare sau mai multe dintre 10, 12, 40, 80, 103, 105.

De preferință, regiunile de legă14 tură antigenice ale catenei ușoare grefate pe CDR din domenii variabile cu catenă lungă cuprind CDRs corespunzătoare la Kabat CDRs la CDR1 (reziduul 24-34), CDR2 (reziduul 50...56] și CDR3(reziduurile 89...97).

In continuare, prezenta invenție descrie cel de al patrulea aspect, și anume a moleculei anticorp grefată pe CDR cuprinzând cel puțin o catenă lungă grefată pe CDR la cel puțin o catenă lungă grefată pe CDR conform cu primul, al doilea și al treilea aspect al prezentei invenții.

Moleculele de anticorp umanizat și catenele conform cu prezenta descriere de invenție, pot cuprinde: o moleculă anticorp completă având catene complete lungi grele și catene scurte; un fragment al acestuia, cum ar fi de exemplu Fab, (Fab’)2 sau fragmentul FV; o catenă scurtă sau o catenă lungă ca monomer sau ca dimer sau un anticorp simplu ca catenă, ca de exemplu o catenă simplă FV în care regiunile variabile cu catenă lungă și catenă scurtă sunt legate prin linkeri de peptide sau orice altă moleculă grefat pe CDR cu aceeași specificitate ca un anticorp donor original. In mod similar, regiunea variabilă cu catenă scurtă și lungă grefate pe CDR, poate fi combinată cu alte domenii de anticorpi specifici. Așadar, catenele lungi sau scurte sau moleculele anticorp ale prezentei invenții pot fi atașate la acele molecule efectoare sau raportoare. De exemplu, ele pot avea un macrociclu, pentru chelarea unui atom de metal greu sau a unei toxine, ca de exemplu ricin atașat la aceasta prin structura de legătură covalentă. In mod alternativ, procedeele de tehnologie recombinantă a ADN pot fi utilizate pentru a produce o moleculă de imunoglobină în care fragmentul Fc sau domeniul CH3 al moleculei complete de imunoglobină a fost înlocuit prin sau este atașat la aceasta printr-o lelgătură peptidică, o proteină funcțională neimunoglobulinică, cum ar fi de exemplu o enzimă sau o moleculă de toxină.

Orice secvențe cadru din regiunea

RO 114298 Bl variabilă acceptoare specifică pot fi utilizate, având legătură cu clasa sau tipul de anticorp donor, din care regiunile de legătură anticorp sunt derivate. De preferință, tipul de cadru acceptor, utilizat, este același, sau similar în ceea ce privește clasa sau tipul cu cel al anticorpului donor. In mod convențional, cadrul poate fi ales pentru a maximiza sau optimiza homologia cu secvența anticorp donoare, în special la pozițiile închise sau adiacente la CDRs. Cu toate acestea, un nivel ridicat de homologie între secvențele donoare și acceptoare nu este important pentru aplicarea prezentei invenții. Prezenta invenție identifică o ierarhie a pozițiilor de reziduu cadru, la care reziduurile donoare pot fi importante sau dorite pentru obținerea unui produs anticorp grefat pe CDR, având proprietăți de legătură satisfăcătoare. Produsele grefate pe CDR de obicei au afinități de legătură la cel puțin 1O⁵M'¹, de preferință la cel puțin aproximativ 10⁸M'¹ sau în special de ordinul 10⁸M'¹ - 1D¹²M'¹. In principiu, prezenta descriere de invenție este aplicabilă la orice combinație de anticorpi donori sau acceptori, cu referire la nivelul de homologie între secvențele acestora. Un protocol pentru aplicarea invenției, la orice pereche de anticorpi, în special la donor-acceptor, este prezentat în cele ce urmează. Exemplele de cadru uman, care pot fi utilizate, sunt: KOL, NEWM.REI, EU, LAY și POM, de exemplu KOL și NEWM pentru catenă lungă și REI pentru catenă scurtă, și EU, LAY și POM pentru ambele tipuri de catene lungi și scurte.

Așadar, domeniile regiunii constante ale produselor din invenția de față, pot fi selectate având în vedere funcția propusă a anticorpului, în special funcțiile efectoare care pot fi necesare. De exemplu, domeniile regiunii constante pot fi domeniile umane IgA, IgE, IgG, IgM. In special, domeniile regiunii constante umane IgG pot fi utilizate, în special izotopii lgG1 și lgG3, când molecula anticorp umanizată este indicată pentru utilizare terapeutică și funcțiile efectoare ale anticorpului sunt necesare. In mod alternativ, izotopii lgG2 și lgG4 pot fi utilizați când molecula de anticorp umanizat este indicată pentru scopuri terapeutice și funcțiile efectoare ale anticorpului nu sunt necesare, ca de exemplu pentru simpla blocare a activității limfokinei.

Totuși, moleculele rămase de anticorpi, nu este necesar să cuprindă numai secvențele de proteine din imunoglobuline. De exemplu, o genă poate fi construită, în care secvența de ADN parțial codificată a catenei de imunoglobulină umană este fuzionată la secvența de ADN, codificând secvența de aminoacid a polipeptidei funcționale astfel ca fiind o moleculă efectoare sau reportoare.

De preferință, produsele cu molecule anticorp și catene lungi și scurte de anticorpi grefați pe CDR sunt produse prin tehnologie recombinantă a ADN-ului.

Astfel, un alt aspect al prezentei invenții include secvențele de ADN pentru catene lungi și scurte, vectori de exprimare și clonizare conținând secvențe de ADN, celulele gazdă fiind transformate cu secvențele de ADN, iar procedeele de producere a catenelor grefate pe CDR și moleculele de anticorp cuprinzând secvențele de exprimare a ADNului, în celulele gazdă transformate.

Metodele generale prin care vectorii pot fi construiți, metodele de trasfectare și metodele de cultură sunt bine cunoscute în domeniu, și nu formează o parte a prezentei invenții. Astfel de metode sunt prezentate în materialele din literatura de specialitate.

Secvențele de ADN care codifică secvența de aminoacid donoare pot fi obținute prin metode care sunt binecunoscute în literatura de specialitate. De exemplu, secvențele codificate donoare pot fi obținute prin clonizare genomică sau prin clonizare cADN din liniile celulare hibridoame convenabile. Clonele pozitive pot fi ecranate, utilizându-se probe specifice pentru genele respective cu catenele lungi și catenele scurte. Așadar, se poate utiliza metoda de clonizare PCR.

Prin codificarea ADN-ului ca acceptor, de exemplu acceptorul uman,

RO 114298 Bl secvențele pot fi obținute prin orice metodă corespunzătoare. De exemplu, secvențele ADN-ului codificând pentru catenele acceptoare umane preferate, ca de exemplu KOL, REI, EU și NEWM, sunt larg convenabile pentru persoanele care lucrează în acest domeniu.

Tehnicile standard ale biologiei moleculare pot fi utilizate pentru prepararea secvențelor de ADN, pentru produsele grefate pe CDR. Secvențele de ADN pot fi sintetizate complet sau parțial, utilizându-se tehnicile de sinteză pentru oligonucleotide. Mutageneza direcționată parțial și reacția în lanț a polimerazei (PCR) sunt tehnici care pot fi utilizate direct în sinteză. De exemplu, oligonucleotida utilizată direct în sinteză, este descrisă în literatura de specialitate. De asemenea, se poate utiliza mutageneza directă în oligonucleotidă în regiunea variabilă preexistentă (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Așadar, completarea enzimatică în oligonucleotidele discontinuie, utilizându-se de exemplu polimeriza T4 a ADN-ului, se poate efectua în conformitate cu cele cunoscute în acest domeniu.

Orice sistem convenabil format din vector/celulă gazdă poate fi utilizat pentru exprimarea secvențelor codificate de ADN pentru catenele lungi și scurte care sunt grefate pe CDR. Se poate utiliza, de exemplu, bacteria E. Coli și alte sisteme microbiene, în special pentru exprimarea fragmentelor de anticorpi, ca de exemplu fragmentele Fab și (Fab’)2 și în special fragmentele FV și fragmentele de anticorpi cu catenă simplă ca de exemplu PVs., Eucariotic, de exemplu sistemul de exprimare celulară cu gazda mamifer se poate utiliza pentru producerea unor produse anticorp mai mari grefate pe CDR, incluzând moleculele complete de anticorpi. Celulele gazdă convenabile includ celulele CHO și liniile celulare hibridoame sau mielom.

Astfel, conform unui alt aspect al invenției, se face referire la procedeul de producere a produselor anticorp grefat pe CDR, care cuprinde următoarele faze:

(a) producerea unui vector de exprimare a operonului având o secvență de ADN care codifică catena lungă de anticorp, conform primului aspect al prezentei descrieri de invenție; și/sau (b) producerea unui vector de exprimare a operonului având secvența de ADN care codifică o catenă scurtă complementară de anticorp, conform celui de al doilea și al treilea aspect al prezentei descrieri de invenție; (c) transfectarea celulelor gazdă la sau cu fiecare vector și (d) cultura liniei celulare de transfer pentru a produce produsul anticorp grefat pe CDR.

Produsul grefat pe CDR poate cuprinde numai polipeptide derivate cu catene lungi sau scurte, în care caz, numai secvențele codificate ale polipeptidei cu catene lungi sau scurte se utilizează pentru transfectarea celulelor gazdă. Pentru producerea produselor care cuprind atât catenele lungi, cât și catenele scurte, linia celulară poate fi transfectată cu doi vectori, primul vector conținând un operon care codifică polipeptida derivată din catena scurtă și al doilea vector care conține operonul care codifică polipeptida derivată dintr-o catenă lungă. De preferință, vectorii sunt identici, exceptând secvențele codificate și markerii selectabili care sunt indicați pentru a asigura cât mai departe posibil o exprimare egală a fiecărei catene de polipeptidă. In mod alternativ, poate fi utilizat un vector simplu, acest vector incluzând secvențele codificate derivate de la polipeptidele cu catene lungi și cu catene scurte.

ADN-ul în secvențele codificate pentru catenele lungi și catenele scurte poate cuprinde cADN sau ADN genomic sau ambii. Totuși, este de preferat ca secvența de ADN, codificând catena lungă sau pe cea scurtă, să cuprindă cel puțin parțial ADN genomic, de preferință o fuziune a cADN și ADN genomic.

Prezenta descriere de invenție este aplicabilă la anticorpii cu o specificitate corespunzătoare. In mod avantajos, este faptul că invenția poate fi aplicată la umanizarea anticorpilor ne-umani care se utilizează pentru terapie- in vivosau pentru diagnoză. Astfel, anticorpii pot fi anticorpi parțial specifici, cum ar fi

RO 114298 Bl de exemplu tumorile specifice sau anticorpi specifici de suprafață din celule care sunt corespunzători pentru utilizare în terapia - in vivo- sau pentru diagnoză, ca de exemplu, o imagine, în cazul tumorilor. Exemple de anticorpi celulari specifici de suprafață sunt anticorpii anti-T celulari, ca de exemplu anti-CD3 și CD4 și moleculele de adeziune, ca de exemplu CR3, ICAM și ELAM. Anticorpii pot avea specificitate pentru interleukine (incluzând limfokinele, factorii de dezvoltare și factorii de stimulare], hormoni și alți compuși biologic activi și receptorii pentru oricare dintre aceștia. De exemplu, anticorpii pot avea specificitate pentru oricare dintre următorii: interferonii α, β, γ sau δ, IL1, IL2, IL3 sau IL4, etc, TNF, GCSF, GMCSF, EPO, hGH sau insulină, etc.

Prezenta descriere de invenție mai include compoziții terapeutice sau de diagnoză, care cuprind produsele grefate pe CDR, care sunt utilizate în terapie sau în vederea diagnosticării.

Conform unui alt aspect al prezentei invenții, se face referire la compoziția terapeutică sau de diagnosticare, cuprinzând un anticorp grefat pe CDR cu moleculă anticorp sau catenă lungă sau scurtă, în conformitate cu cele prezentate mai sus, în combinație cu substanțe suport, diluanți sau excipienți acceptabili din punct de vedere farmaceutic.

Conform unui alt aspect al invenției, se face referire la o metodă terapeutică sau la o metodă de diagnostic care cuprinde administrarea unei cantități efective din anticorpul grefat pe CDR cu catenă lungă sau scurtă și anticorpul molecular, în conformitate cu aspectele prezentate în prezenta invenție, care se administrează la om sau la animal.

Un protocol preferat pentru obținerea anticorpului grefat pe CDR cu catene lungi și scurte, în conformitate cu prezenta invenție, este prezentat în continuare împreună cu formula de structură. Protocolul și formula de structură sunt date fără prejudicii la partea generală, așa cum s-a arătat mai sus.

Protocolul este următorul: mai întâi este necesar să se secvențeze ADN codificat pentru regiunile variabile cu catene lungi și scurte ale anticorpului donor, pentru a determina secvențele de aminoacizi. Este așadar necesar să se aleagă un acceptor specific din regiunile variabile cu catene lungi și scurte din secvențele de aminoacizi cunoscuți. Catena grefată pe CDR este apoi desemnată plecând de la baza secvenței acceptoare. Aceasta va fi de apreciat că, în unele cazuri, reziduurile de aminoacizi acceptoare sau donoare, pot fi identificate la o porțiune specială și astfel nu este necesară nici o schimbare a reziduului cadru acceptor.

1. Ca prim pas, reziduurile donoare sunt substituite cu reziduurile acceptoare în CDRs. Pentru acest scop, CDRs de preferință sunt definite după cum urmează:

Catene lungi: CDR1, reziduurile

26.. .35: CDR2 reziduurile 50...65; CDR3, reziduurile 95... 102.

Catene scurte: CDR1, reziduurile

24.. .34, CDR2, reziduurile 50...56; CDR3, reziduurile 89...97.

Pozițiile la care reziduurile donoare trebuie substituite pentru cele acceptoare în cadru sunt apoi alese după cum urmează, mai întâi cu referire la catena lungă și apoi cu referire la catena scurtă.

2. Catena lungă. Se aleg reziduurile donoare la toate pozițiile 23, 24, 49, 71, 73 și 78 ale catenei lungi sau la toate pozițiile 23, 24 și 49 (71, 73 și 78 sunt totdeauna toate donoare sau toate acceptoare].

Se controlează dacă următoarele reziduuri au aceeași aminoacizi în secvențele donoare și în secvențele acceptoare, și dacă nu, este preferabil să se aleagă donorul: 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106, 107.

O altă afinitate de optimizare consideră alegerea reziduurilor donoare la una, câteva sau la toate dintre următoarele: i, 1,3; ii, 72, 76, iii, dacă 48 este diferit între secvențele donoare și acceptoare, se consideră 69; iv, dacă

RO 114298 Bl este ales reziduul donor, se consideră 38 și 46, v, dacă la 69 este ales reziduul donor, se consideră 80 și apoi 20; vl, 67; vii, dacă la 67 este ales reziduul donor, se consideră 82 și apoi 18; viii, 91; ix, 88 și x, 9, 11,41, 87, 108, 110, 112.

3. Catena scurtă. Donorul ales la

46, 48, 58 și 71.

Se controlează dacă următoarele au aceleași secvențe de aminoacizi donoare și acceptoare, dacă nu se preferă alegerea donorului: 2, 4, 6, 35, 38, 44,

47, 49, 62, 64...69 inclusiv, 85, 87, 98, 99, 101 și 102.

Pentru o altă afinitate de optimizare, se consideră alegerea reziduurilor donoare la una, câteva sau oricare dintre următoarele i, 1,3; ii, 63; iii, 60 dacă 60 și 54 sunt capabile să formeze o sare de legătură potențială; iv, 70, dacă 70 și 24 sunt capabile de a forma o sare potențială de legătură; v, 73 și 21, dacă 47 este diferit între donor și acceptor; vi, 37 și 45, dacă 47 este diferit între donor și acceptor; vii, 10, 12, 40, 80, 103, 105.

Formula de structură. In vederea transferării părții de legătură a anticorpului într-un cadru acceptor diferit, este necesar să fie considerat un număr de factori, astfel:

Extensia CDRs. CDRs (regiunile de determinare complementară] sunt definite de către Wu și Kabat (așa cum este prezentat în literatura de specialitate], pe baza analizei variabilității regiunilor diferite ale regiunilor variabile ale anticorpilor. Aceste regiuni sunt recunoscute în domeniul de specialitate. In secvențele cu catenă scurtă, sunt 24 ...34, 50 ... 56, 89 ...97 (numerotare Kabat, în conformitate cu cele cunoscute), iar în secvențele cu catenă lungă, sunt 31... 35, 50...56 și 95... 102 inclusiv.

Când structurile de anticorp devin corespunzătoare, este aparent că aceste regiuni CDR corespund în principal la regiuni cu lanțuri care se extind de la cadrul β-barrel și domeniilor scurte și lungi. Pentru H1, există o discrepanță în sensul că lanțul este de la 26 la 32 inclusiv, pentru H2 lanțul este de la

52...56 și pentru L2 de la 50 la 53. Totuși cu excepția lui H1, regiunile CDR cuprind regiunile lanț și acestea se extind în cadrul β de filament. In reziduul H1, 26 tinde de a fi serină și 27 este fenilalanină sau tirozină, reziduul 29 este fenilalanină în majoritatea cazurilor. Reziduul 28 și 30, care sunt reziduuri de suprafață expuse la solvent, ar putea fi incluse în legătură antigenică. O definiție prudentă a H1- CDR, ar include reziduurile 26...35, pentru a include atât regiunea de lanț, cât și reziduurile hipervariabile 33...35.

Este interesant să se arate că, în domeniul de specialitate, se utilizează reziduul 31...35 care este ales pentru CDR - H1. In vederea producerii reziduului de legătură antigenică eficientă 27, este necesar ca acesta să fie ales din anticorpul donor (la șobolan).

Reziduurile de CDR care contribuie la legătura antigenică. Prin examinarea structurilor cu raze X, s-au identificat reziduuri care pot avea un efect asupra legăturii antigenice nete și care poate fi demonstrat prin experiment. Aceste reziduuri por fi subdivizate într-un număr de grupe.

Reziduurile de suprafață aproape de CDR (toate numerotările sunt în conformitate cu Kabat, așa cum este prezentat în literatura de specialitate). Reziduurile cu catenă cheie sunt 23, 71 și 73. Alte reziduuri care pot contribui la o extindere mai mică sunt 1, 3 și 76. In final, reziduul 25 este conservat uzual, dar reziduul murinic ar putea fi utilizat dacă există o diferență.

Reziduurile cu multe catene închise la CDRs, de exemplu 63, 65, 67 și 69 sunt conservate. Dacă nu este nici o conservare la reziduurile de suprafață în catena scurtă, este posibil să aibă un efect major. Totuși, dacă reziduurile murinice la aceste poziții este neuzual, ar fi folositor să se analizeze contribuția prealabilă mult mai închisă. Alte reziduuri care pot contribui la legare sunt 1 și 3 și de asemenea 60 și 70, dacă reziduurile la aceste poziții și la pozițiile 54 și 24

RO 114298 Bl respectiv sunt potențial capabile să formeze o sare de legătură, de exemplu

60+54; 70+24.

Reziduurile de legare grupare apropiată de CDRs.

Reziduurile cu catenă cheie sunt 24, 49 și 78. Alte reziduuri ar fi 36, dacă nu este triptofan, 94 dacă nu este arginină, 104 și 106 dacă nu sunt glicină și 107 dacă nu este treonină. Reziduurile care pot contribui în continuare la o grupare stabilă a catenei lungi, și de aici o afinitate îmbunătățită, sunt 2, 4, 6, 38, 46, 67 și 69. S-a observat că ar putea fi 67 grupări față de reziduul CDR 63, și aceste perechi ar putea fi atât pentru șoarece, cât și pentru om. In final, reziduurile care contribuie la grupare în această regiune, dar la o serie mai lungă, sunt 18, 2D, 80, 82, 86. Reziduul 86 se grupează față de 67 și în schimb 18 se grupează față de 82, reziduul 80 se grupează față de 69 și în schimb, 20 se grupează față de 80. Reziduul 86 formează o legătură H cu 38 și 46. Multe diferențe șoarece-om apar ca fiind minore, de exemplu Leu-lle, dar ar putea avea un impact minor pe gruparea corectă, care ar realiza translația în poziționarea schimbată a CDRs.

Reziduurile cu catenă scurtă cheie sunt 48, 58 și 71. Alte reziduuri ar fi 6 dacă nu este glutamină, 35 dacă nu este triptofan, 62 dacă nu este fenilalanină sau tirozină, 64, 66, 99 și 101, dacă nu este glicină și 102, dacă nu este treonină. Reziduurile, care aduc o contribuție ulterioară, sunt 2, 4, 37, 45 și 47. Reziduurile finale 73 și 21 și 19 pot parcurge o lungă distanță în ceea ce privește contribuția de grupare minoră.

Reziduurile la interfața domeniului variabil între catenele lungi și catenele scurte. In ambele catene lungi și scurte, majoritatea reziduurilor interfeței nonCDR, sunt conservate. Dacă un reziduu conservat este înlocuit cu un reziduu cu caracter diferit, de exemplu dimensiunea sau sarcina, acesta ar fi considerat pentru retenție ca reziduu murinic.

Reziduurile cu catenă lungă. Este necesar să fie considerat 37 dacă nu este valină, dar este un volum mai mare cu catenă secundară sau are o sarcină sau are o polaritate. Alte reziduuri sunt 39 dacă nu este glutamină, 45 dacă nu este leucină, 47 dacă nu este triptofan, 91 dacă nu este fenilalanină sau tirozină, 93 dacă nu este alanină și 103 dacă nu este triptofan. Reziduul 89 de asemenea la interfață, dacă nu este într-o poziție în care catena secundară ar putea fi de cel mai mare impact.

Reziduurile cu catenă scurtă, care necesită să fie considerate, sunt 36 dacă nu este tirozină, 38 dacă nu este glutamină, 44 dacă nu este prolină, 46, 49 dacă nu sunt tirozină, reziduul 85, reziduul 87 dacă nu este tirozină și reziduul 98 dacă nu este fenilalanină.

Interfața regiunii constant-variabile. Porțiunea cotită între regiunile variabile și constante care pot fi afectate de modificări privind gruparea reziduurilor cheie în regiunea variabilă față de regiunea constantă, poate fi afectată în poziția V_L și V_H cu referire la una față de cealaltă. De aceea este important de notat reziduurile care vin probabil în contact cu regiunea constantă. In catenă lungă, reziduurile potențiale de suprafață în contact cu regiunea variabilă sunt conservate între anticorpii umani și cei de la șoarece, de aceea reziduurile de contact din regiunea variabilă pot influența interacțiunea V-C. In catenă scurtă, aminoacizii sunt găsiți la un număr de puncte de contact ale regiunii constante care variază, și regiunile V și C nu sunt într-o astfel de proximitate închisă ca cele ale catenei lungi. De aceea influențele interfaței C-V cu catenă scurtă pot fi minore.

Reziduurile de contact cu catenă lungă sunt 7, 11,41, 87, 108, 110 și 112.

Reziduurile potențiale de contact cu catenă scurtă sunt 10, 12, 40, 80, 83, 103 și 105.

Analiza care a fost arătat mai sus și cuplată cu experiența din practică în ceea ce privește grefarea pe CDR a unui număr de diferiți anticorpi, a condus la efectuarea protocolului care a fost prezentat mai sus.

RO 114298 Bl

Se dau, în continuare, 5 exemple de realizare, în legătură cu fig. 1...13, care reprezintă:

- fig.1, prezintă secvențele de ADN și de aminoacizi ale OKT3 cu catenă scurtă;

- fig.2, prezintă secvențele de ADN și de aminoacizi ale OKT3 cu catenă lungă;

-fig.3, prezintă alinierea secvențelor de aminoacizi în regiunea variabilă cu catene scurte DKT3, cu regiunea variabilă cu catene scurte ale anticorpului uman REI;

- fig.5, prezintă alinierea regiunii variabile cu catenă lungă 0KT3 cu cea din regiunea variabilă cu catene lungi, ambele cu secvențe de aminoacizi ale anticorpului uman KOL;

- fig.5, prezintă secvențele de aminoacizi din regiunea variabilă cu catene lungi 0KT3, KOL și altele corespunzătoare grefărilor pe CDR;

-fig.6, arată secvențele de aminoacizi din regiunea variabilă cu catene scurte 0KT3, REI și altele corespunzătoare la grefările CDR;

- fig.7, arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de legare pentru diferiți anticorpi grefați 0KT3;

- fig.8, arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de blocare pentru diferiți anticorpi grefați 0KT3;

- fig.9, arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de blocare;

-fig. 10, arată reprezentările grafice similare pentru rezultatele analizelor de legare, atât pentru legare cât și pentru blocare;

-fig. 11, arată o reprezentare grafică similară pentru rezultatele analizelor de legare și de blocare;

- fig. 12, arată o reprezentare grafică a rezultatelor analizei de competiție pentru anticorpul minimal grefat 0KT3 cu referințe standard murinice 0KT3;

-fig. 13, arată o reprezentare grafică similară a rezultatelor analizei de competiție, comparând anticorpul 0KT3 complet grefat cu standardul de referință murinic.

Exemplul 1. Grefare 0KT3 pe CDR.

Materiale și metode. Celulele ereditare. Celulele hibridoma care produc anticorpii 0KT3 sunt prevăzute de către Ortho (lot de însămânțare 4882.1) și aceste celule se dezvoltă în mediu care nu conține antibiotice Dulbecco Eagles modificat (DMEM) suplimentat cu glutamină și 5% ser fetal de vițel. Acesta este divizat pentru a se obține atât supernatant supradezvoltat pentru evaluare, cât și celule pentru extracția acidului ribonucleic. Supernatantul dezvoltat superior este arătat că conține 250 ug/ml de anticorp murinic lgG2a/kappa. Supernatantul este negativ pentru lambda murinic în catena scurtă și lgG1, lgG2b, lgG3, IgA și IgM pentru catena lungă. In continuare, se analizează 20 ml supernatant pentru a se confirma că anticorpul prezentat este 0KT3.

Procedeul biologic molecular. Procedeele de biologie moleculară de bază au fost descrise în literatura de specialitate, și au unele modificări minore în unele cazuri. Secvențarea ADN este realizată așa cum este descris de către Sânger, în literatura de specialitate cât și secvențarea P1c Amersham Internațional. Mutageneza directă parțială este realizată așa cum a fost descrisă de către Kramer, și cunoscută din literatura de specialitate. Exprimarea celulelor COS și studiile metabolice de marcare sunt descrise de către Whittle, în literatura de specialitate.

Analize de cercetare. Analize generale. Analizele generale sunt efectuate pe supernatantele din celulele COS transfectate pentru a determina cantitatea de IgG intactă care este prezentată.

Celulele transfectate cu gene 0KT3 la șoarece. Analiza de ansamblu pentru IgG intact la șoarece în celulele COS din supernatat se face prin metoda ELISA, astfel: o placă de microtitrare cu 96 godeuri este acoperită cu F(ab’)2 de capră anti-uman IgG Fc. Discurile sunt spălate cu apă, se adaugă probele și sunt ținute timp de o oră la temperatura camerei. Se spală discurile, după care se adaugă F(ab’)2 de capră anti-uman IgG Fc (HRPO conjugat). Se adaugă subRO 114298 Bl stratul pentru inițierea reacției. Ca standard, se utilizează UPC1O, mielom lgG2a de șoarece.

COS și celulele CHO transfe etate cu gene 0KT3 chimerice sau grefate pe CDR. Analiza generală pentru anticorpul chimeric sau anticorpul grefat pe CDR în supernatantele cu celule COS este realizată prin metoda ELISA, cu următorul format: o placă de microtitrare cu 96 godeuri este acoperită cu F(ab’)2 de capră anti-uman IgG Fc. Discurile sunt spălate și probele sunt incubate timp de o oră la temperatura camerei. Se spală iar discurile, și se adaugă catena kappa antiumană monoclonală de șoarece, timp de o oră și la temperatura camerei. Se spală iarăși discurile, se adaugă F(ab’)2 de capră anti-șoarece IgG (HRPO conuugat). Se adaugă substratul enzimatic pentru inițierea reacției. Compusul B72,3 (lgG4) chimeric se utilizează ca standard (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Utilizarea catenei anti-kappa monoclonale în această analiză permite anticorpilor grefați să fie citiți din standardul chimeric.

Analiza pentru activitatea de legare antigenică. Materialele de la supernatantele celulare COS sunt analizate în ceea ce privește activitatea de legare antigenică 0KT3 pe celulele pozitive CD3, în analiza directă. Procedeul este următorul: HUT celule 78 (linie celulară T umană, CD3 pozitive) sunt menținute în cultură. Monostraturile de celule HUT 78 sunt preparate pe 96 discuri ELISA, utilizându-se poli-L-Lizină și glutaraldehidă. Probele sunt adăugate la monostraturi timp de o oră și la temperatura camerei. Se spală ușor discurile, utilizându-se PBS. In continuare, se adaugă F(ab’)2 de capră anti-uman IgG Fc (HRPO confugat) sau F(ab')2 de capră anti-șoarece (HRPO conjugat), ca fiind convenabile pentru probele umanizate sau pentru probele de șoarece. Substratul este adăugat pentru a iniția reacția. Controlul negativ pentru analiză este pe bază de celule B72.3 chimeric. Controlul pozitiv este OKT3 Orthomune la șoarece sau 0KT3 chimeric, când este convenabil.

Această analiză pe bază de celule este dificil de realizat, și ca urmare este efectuată o altă analiză alternativă care este mult mai sensibilă și ușor de efectuat, pentru 0KT3 grefat pe CDR. In acest sistem, 0KT3 grefat pe CDR, este produs de către celulele COS testate în ceea ce privește stabilitatea lor de a se lega la CD3 pozitiv HPB-ALL (leucemie limfocitică acută în sângele periferic uman în linie celulară). Acesta a fost testat pentru abilitatea de blocare a legăturii OKT3 murinice la aceste celule. Legarea este măsurată prin următorul procedeu: celulele HPB-ALL sunt recoltate din cultura tisulară și sunt incubate la temperatura de 4°C timp de o oră și cu diferite diluții din anticorpul de testat, din anticorpul de control pozitiv și control negativ. Celulele sunt spălate o dată și apoi incubate la temperatura camerei timp de o oră cu FlTC-marcat de capră anti-uman IgG (Fc specific absorbit la șoarece).

In continuare, celulele se spală de două ori și apoi sunt analizate prin citofluorografie. 0KT3 chimerice sunt utilizate drept control pozitiv pentru legarea directă. Celulele sunt incubate cu supernatant celular COS stimulat-transfectat, după care este, urmat de IgG anti-uman marcat FITC de capră, conducând la obținerea unui control negativ. Pentru a testa abilitatea 0KT3 grefat pe CDR pentru blocarea legăturii 0KT3 murinice, celulele HPB-ALL sunt incubate la temperatura de 4°C timp de o oră și cu diferite diluții ale anticorpului de testat sau a anticorpului de control. Se adaugă o cantitate fixă de soluție saturată de 0KT3 FITC. Mostrele sunt incubate timp de o oră la temperatura de 4°C, se spală de două ori și se analizează prin citofluorografie. 0KT3 marcat FITC este utilizat ca control pozitiv pentru a determina legătura maximă. 0KT3 murinic care este nemarcat este folosit ca referință standard pentru blocare. Controalele negative sunt celulele necolorate cu sau fără supernatant celular stimulat-transfectat. Abilitatea catenei scurte grefate pe CDR pentru legarea celulelor pozitive CD3 și blocarea legăturii CKT3 murinice este iniRO 114298 Bl țial testată în combinație cu catena lungă □KT3 chimerică. Catena lungă chimerică □KT3 este compusă din regiunea variabilă murinică și regiunea constantă umană lgG4. Gena cu catenă lungă chimerică este exprimată în același vector de exprimare, utilizându-se pentru genele grefate pe CDR. Vectorul de exprimare cu catenă scurtă grefat pe CDR și vectorul de exprimare cu catenă lungă chimerică sunt co-transfectați în celulele COS. Anticorpul 0KT3 chimeric complet (catenă chimerică scurtă și catenă chimerică lungă) este găsit a fi capabil de legare la celulele CD3 pozitive și de blocare a legăturii 0KT3 murinic, în aceste celule.

Determinarea afinității de legare relativă. Afinitățile de legare relative ale anticorpilor monolonali anti-CD3 grefați pe CDR sunt determinate prin legătura de competiție (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate], utilizânduse linia celulară-T umană HPB-ALL, ca sursă de antigen CD3 și 0KT3 murinică fluorescein-conjugată ca anticorp trasor. Afinitatea de legare a anticorpului trasor F1-0KT3 este determinată prin analiza de legare directă, în care cantități crescute de F1-0KT3 sunt incubate cu HPBALL (5 x 10⁵) în PBS care conține 5% ser fetal de vițel, pe o perioadă de o oră la temperatura de 4°C. Celulele sunt spălate și este determinată intensitatea de fluorescență prin folosirea unui citometru cu debit FACScan calibrat cu standarde cantitative microbiene (care este cunoscut din literatura de specialitate). Intensitatea de fluorescență per moleculă de anticorp (F/P, raport] este determinată prin utilizarea microstraturilor care au un număr predeterminat de porțiuni de legare pentru anticorpul IgG la șoarece. F/P egalează intensitatea de fluorescență a straturilor cu F1-0KT3 divizat prin numărul de porțiuni de legare per strat. Cantitatea de F1-DKT3 liberă este calculată din intensitatea fluorescenței per celulă și raportul liber/legat este calculat față de numărul de moli ai anticorpului legat. Adaptarea lineară a fost utilizată pentru determinarea afini30 tății de legare (valoarea absolută a pantei). Pentru legare competitivă, cantitățile crescute ale anticorpului competitor sunt adăugate la doza de subsaturare a F1-0KT3 și incubate cu 5 x 1O^SHPB-ALL în 200 ml de PBS care conține 5% ser fetal de vițel, timp de o oră la temperatura de 4°C. Intensitățile de fluorescență ale celulelor sunt măsurate cu un citometru de debit FACScan calibrat cu standarde microbiene cantitative. Concentrațiile de F1-0KT3 legate și libere, și afinitățile anticorpilor de competiție se calculează în conformitate cu următoarea ecuație (X)-(OKT) = (1/Kx)-(1/Ka), în care Ka este afinitatea 0KT3 murinic, Kx este afinitatea competitorului X, [] este concentrația anticorpului competitor la care raportul legătură legat/liber este de R/2 și este legătura maximală ca raport legat/liber.

Construcția colecției cADN. Prepararea ADN și sinteza cADN. Celulele care produc 0KT3 sunt dezvoltate așa cum s-a descris mai sus, și 1,2 x 10⁹ celule recoltate au fost extrase printr-un procedeu în care s-a folosit guanidina/LiCl.cADN au fost preparate prin primingul de la Oligo-dT pentru generarea cADN de lungime completă. In continuare cADN este metilat și linkerii EcoR1 se adaugă pentru clonizare.

Construcția colecției. Colecția cADN este legată de vectorul pSP65 ADN care a fost fragmentat de grupările 5' fosfat, îndepărtate prin fosfatazele intestinale de vită (EcoR1/C1P). Legarea este utilizată pentru transformarea cu eficiență maximă de transformare de Escherichia coli (E.Coli) HB101. In continuare, este preparată o colecție de cADN. Un număr de 3600 colonii sunt ecranate pentru catena scurtă și 10.000 colonii sunt ecranate pentru catena lungă.

Ecranarea. Coloniile de E. coli pozitive pentru probele cu catene lungi și catene scurte sunt identificate prin ecranarea oligonucleotidelor, și se utilizează următoarele oligonucleotide: 5'TCCAGATGTTAACTGCTGAC pentru catena scurtă, care este complementară la o secvență

RO 114298 Bl în regiunea constantă kappa la șoarece și nucleotidele 5'CAGGGGCCAGTGGATGGATAGAC pentru catena lungă, care este complementară la o secvență din regiunea din domeniul constant CH1 lgG2a la șoarece. Clonele cu 12 catene scurte și 9 catene lungi sunt identificate și folosite pentru a doua serie de ecranare. Clonele pozitive de la a doua serie de ecranare sunt dezvoltate și este preparat ADN. Dimensiunile inserțiile de gene sunt estimate în electroforează gel și se inserează ca dimensiune capabilă să conțină o lungime completă cADN care este subclonizată în M13 pentru secvențarea ADN.

Secventarea ADN. Clonele care reprezintă patru clase de dimensiuni pentru ambele catene lungi și scurte sunt obținute în M13. Secvența ADN pentru regiunile 5' netranslate, secvențele semnal, regiunile variabile și regiunile 3' netranslate cu cADNs având lungimi complete (fig. 1a și 2b) sunt obținute, și secvențele de aminoacizi corespunzătoare sunt arătate în fig. 1b și 2b. In fig. 1a, regiunile netranslate ADN se arată în partea superioară și în ambele fig. 1 și 2, secvențele semnal sunt subliniate.

Construcția vectorilor de exprimare cADN. Vectorii de exprimare Celltech se bazează pe plasmidul pEE6hCMV (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Un polilinker pentru inserția genelor, care trebuie exprimate, a fost introdus după promotorul/agentul de dezvoltare major imediat a citomegalovirusului uman (hCMV). Genele marker pentru selecția plasmidelor în celulele eucariotice transfectate pot fi inserate sub formă de casete BamHI în porțiunea unică BamHI a pEE hCMV; de exemplu, modul marker prevede un nou pEES hCMv. Practic, este uzuală inserția genei de interes, în care markerul GS este inserat ultimul deoarece sunt prezente în casete părțile interne EcoRI. Markerii selectabili sunt exprimați din ultimul promotor SV40 care prevede o origine a replicației astfel ca vectorii să poată fi utilizați pentru exprimare în sistemul COS, de exprimare transient celular.

Secvențele la șoarece sunt excizate din vectorii bazați pe M13 descriși mai sus ca fragmente EcoRI și clonizați în neo pEE6 hCMV pentru catena lungă și în EE6-hCMV-gpt pentru catena scurtă, pentru a produce vectorii pJA136 și pJA135.

Exprimarea cADN în celulele COS. Plasmidele pJA135 și pJA136 sunt cotrasfectate în celulele COS și supernatantul din experimentul de exprimare transient a arătat că acestea conțin asamblați anticorpi care se leagă de celulele T îmbogățite în limfocite. Experimentele metabolice marcate, care utilizeză S³⁵metionină, arată exprimarea și asamblarea catenelor lungi și scurte.

Construcția genelor chimerice. Construcția genelor chimerice este urmată unei strategii așa cum s-a arătat mai sus, și cum este cunoscută din literatura de specialitate. Astfel, o porțiune de restricție apropiată de capătul 5' al secvenței domeniului variabil este identificată și utilizată pentru atașarea oligonucleotidelor adaptoare codificate pentru regiunea variabilă, care rămâne la șoarece, și o porțiune de restricție convenabilă pentru legare la regiunea constantă de selecție.

Construcția genei cu catenă scurtă. Secvența de cADN, care conține o parte Aval aproape de capătul 3' al regiunii variabile, este izolată ca fragment 396 bp EcoRI-Aval. Un adaptor de oligonucleotidă este desemnat să înlocuiască regiunea care rămâne 3' din regiunea variabilă din partea Aval și să includă reziduurile 5' din regiunea constantă umană peste aceasta și incluzând o parte unică Nari care a fost în prealabil energizată în regiunea constantă. O porțiune Hindi 11 a fost introdusă să acționeze ca marker pentru inserția linkerului. Lincherul este legat de fragmentul V_L și fragmentul 413 pb EcoRI-Nari și fragmentul adaptat 413 bp EcoRI-Nari se purifică din amestecul de legare. Regiunea constantă este legată cu o regiune variabilă ADN în vectorul tratat EcoRI / BamHI / C1P pSP65, într-o

RO 114298 Bl reacție pe trei căi, pentru producerea plasmidului JA143, mai înainte fiind izolată ca fragment Narl-BamH1 din clona M13, NW361. Clonele sunt izolate după transformarea în E.coli și secvențele 5 linkeri și de joncțiune sunt confirmate prin prezența porțiunii Hindi 11 și prin secvențarea ADN.

Construcția genei cu catenă scurtă - versiunea 2. Construcția primei gene chimerice cu catenă scurtă produce o fuziune a secvențelor chimerice cu catene lungi și catene scurte la joncțiunea regiunii variabile cu joncțiunea constantă. In cazul catenei scurte 0KT3 de aminoacizi, la joncțiunea chimerică sunt:

.... Leu-Glu-lle-Asn-Arci/ - /Thr-Val-Ala variabilă

-Ala constant

Acest aranjament al secvenței in- 20 traduce o porțiune potențială legată pentru asaparagină (Asn), (N-legatâ) prin glicozilare la joncțiunea V-C. De aceea, o a doua versiune a oligonucleotidei adaptor chimerice cu catenă scurtă este de- 25 semnată, în care treonina (Thr), prima regiune constantă umană de aminoacizi este înlocuită cu echivalentul de aminoacid din regiunea constantă la șoarece, alanina (Ala). O porțiune internă Hindi 11 30 nu este inclusă în acest adaptor, pentru a diferenția cele două gene chimerice cu catenă scurtă. Fragmentul din regiunea variabilă este izolat ca fragment 376 bp EcoR1-Aval. Linkerul oligonucleotidă este 3 5 izolat ca fragment 376 și este legat la fragmentul Nari pNW361 și apoi este adaptat la regiunea constantă 396 bp care este izolat după refragmentarea pNW361 modificat cu EcoR1. Fragmen- 4 o tul din regiunea variabilă și fragmentul din regiunea constantă modificată, ambele sunt legate direct la EcoR1/C1P tratat pEE6hCMVneo pentru a produce pJA137. Inițial, clonele exprimate au in- 45 serția în orientare incorectă. De aceea, inserția este reizolată și clonizată pentru a returna în jur și a produce plasmidul pJA141. Diferitele clone cu inserția în orientarea corectă sunt obținute, și sec- 5 0 vența adaptor a unei inserții este confirmată prin secvențarea ADN.

Construcția genei cu catenă lungă. Alegerea unui izotip al genei cu catenă lungă se face astfel: Izotipul din 55 regiunea constantă ales pentru catena lungă este lgG4 uman.

Construcția genei. Secvențarea cADN cu catenă lungă arată o parte Bani aproape de capătul 3' al regiunii variabile (fig.2a). Majoritatea secvențelor din regiunea variabilă sunt izolate ca un fragment 426bp. EcoR1/C1 P/Ban1. O oligonucleotidă adaptor este desemnată pentru a înlocui regiunea 3' rămasă din regiunea variabilă din porțiunea Bani și incluzând o unică porțiune Hindi 11 care a fost în prealabil energizată în primii doi aminoacizi ai regiunii constante. Linkerul este legat la fragmentul V_H și EcoR1Hindl 11, ca fragment adaptat, este purificat din amestecul de legare. Regiunea variabilă a fost legată la regiunea constantă prin fragmentarea pJA91 cu EcoR1 ^ai Hindi 11, prin îndepărtarea fragmentului intron și înlocuirea acestuia cu V_H pentru a produce pJA142. Clonele sunt izolate după transformarea în E.coli JM1O1, și secvențele de linkeri și secvențele joncțiunii sunt confirmate prin secvențarea ADN (porțiunea Hindi 11 este lipsită de clone).

Construcția vectorilor de exprimare chi merici. Vectorii gpt și neovectorii ADN. Catena scurtă chimerică (versiunea 1) este separată din pJA143 ca fragment EcoR1 și clonizată în EcoR1/ C1P trata tă cu pEE6hCNVneo ca vector de exprimare pentru a produce pJA145. Clonele cu inserție în orientarea corectă sunt identificate prin desenul de restricRO 114298 Bl ție. Catena chimerică scurtă (versiunea 2) este descrisă mai înainte, în ceea ce privește construcția acesteia. Gena chimerică cu catenă lungă este izolată din pJA142 ca un fragment 2,5 Kbp EcoRI/BamH1 și clonizată în EcoRI/ Bc11 /C1P ca fragment de vector tratat al derivatului pEE6h CMVgpt pentru a produce plasmidul pJA144.

Vectorii separați GS. Versiunile GS ale pJA141 și pJA144 sunt construite prin înlocuirea casetelor neo și gpt prin BamH1 /Sa11 / C1P ale plasmidului care a fost tratat, izolarea fragmentului vector și legarea la fragmentul care conține GS din plasmidul pRO49 pentru a produce vectorul cu catenă scurtă pJA179 și vectorul cu catenă lungă pJA18O.

Construcția vectorului simplu. Construcțiile vectorului simplu conținând cL (chimeric cu catenă scurtă], cH (chimeric cu catenă lungă] și GS-gene pe un plasmid, în ordinea cL-cH-GS sau cH-cLGS și cu transcripția genelor fiind de la capăt la coadă, de exemplu cL>cH>GS, sunt construite. Aceste plasmide sunt realizate prin tratarea pJa179 sau pJA18D cu BamH1/C1P și prin legarea în promotorul Bg111/Hindi 11 hCMV a casetei împreună cu alte fragmente Hindi 11/BamH1 din pJA141 în pJA18G pentru a da plasmidul cH-cL-GS pJA182 sau fragmentul Hindi 11/ BamH1 din pJA144 din pJA179 pentru a da cL-cH-GS plasmidul pJA181.

Exprimarea genelor himerice. Exprimarea În celulele COS. Anticorpul chimeric cu plasmidul pJA145 (cL] și pJA144 (cH] este co-transfectat în celulele COS și supernatantul din experimentul de transient conține anticorpul asamblat care este legat la linia celulară T HUT 78 umană. Experimentele de marcare metabolice care utilizează S³⁵mentionina arată exprimarea și asamblarea catenelor lungi și scurte. Totuși, se observă mobilitatea catenelor scurte asupra gelurilor reduse ceea ce sugerează că partea de glicozilare, care ar putea fi glicozilată, a fost efectuată. Exprimarea celulelor COS în prezența tuni36 camicinei arată o reducere ca mărime a catenei scurte față de cea arătată pentru controlul anticorpilor chimerici și catena scurtă OKT3 la șoarece. De aceea, JA141 sunt construite și exprimate. In acest caz, catena scurtă nu arată o mobilitate aberantă sau o dimensiune specială în prezența sau în absența tunicamicinei. In acestă doua versiune a catenei scurte chimerice când este exprimată în asociere cu catena lungă chimerică (cH), se produce anticorpul care arată o bună legare la celulele HUT 78. In ambele cazuri, legătura antigenică este echivalentă la cea a anticorpului la șoarece.

Exprimarea în cazul celulelor din ovarul de hamster chinezesc (CHO). Liniile celulare stabile au fost preparate din plasmidele pJA141/pJA144 și din pJA1 79/pJA1 80, pJA181 și pJA182, prin transfectarea în celulele CHO.

Grefarea pe CDR. Măsura, care a fost luată, a fost să înceapă să se introducă reziduuri suficiente de șoarece în cadrul regiunii variabile umane pentru a genera activitatea de legătură antigenică comparabilă cu cea anticorpilor chimerici și de șoarece.

Analizele regiunii variabile. Dintr-o exprimare a structurilor de baze de date înguste ale anticorpilor și complecșilor anticorp-antigen reiese clar că numai un număr mic de reziduuri de anticorpi vine în contact dirtect cu antigenul. Alte reziduuri pot contribui la legarea antigenului prin poziționarea reziduurilor de contact în configurațiile favorabile și astfel prin inducerea unei grupări stabile a domeniilor variabile cu catene lungi și catene scurte. Reziduurile alese pentru transfer pot fi identificate printr-un număr de căi, astfel: (a] Prin exprimarea structurilor de anticorp cristal cu raze X la suprafața de legare antigenică care poate fi predominant localizată pe o serie de lanțuri, trei pe fiecare domeniu, care se extind de la capătul β-barell; (b] Prin analiza secvențelor regiunilor din domeniul variabil al anticorpului, a hipervariabilității (termenul fiind: regiunile de determinare a complementarității, CDRs prin Wu și

RO 114298 Bl

Kabat care pot fi identificate, și așa cum sunt prezentate în literatura de specialitate). In majoritatea cazurilor, dar nu în toate cazurile, aceste CDRs corespund la (dar se extind după o scurtă cale) regiunile de lanțuri care au fost arătate mai sus; (c) Reziduurile neidentificate prin (a) și (b) pot contribui la legarea directă a antigenului sau la legarea indirectă a acestuia prin topologia părții de legătură antigenică sau prin inducerea unei grupări stabile a domeniilor variabile individuale și de stabilizare a interacțiunii domeniului intervariabil. Aceste reziduuri pot fi identificate prin superimpozarea secvențelor pentru un anticorp dat pe o structură cunoscută și privind la reziduurile cheie pentru construcția acestora sau prin analiza secvenței de aliniere și notarea reziduurilor “idiosincratice” urmată de examinarea localizării structurale și a efectelor probabile.

Catene scurte. Fig. 3 arată o aliniere a secvențelor pentru regiunea cadru umană REI și regiunea variabilă cu catene scurte 0KT3. Lanțurile structurale și CDRs(Kabat) s-ar părea că corespund la regiunea de legătură antigenică și sunt marcate. De asemenea, sunt marcate și un număr de alte reziduuri care pot, de asemenea, contribui la legătura antigenică, așa cum s-a descris mai sus. Secvența de mai sus, din fig.3, indică tipul de reziduu din localizarea spațială a fiecărui reziduu cu catenă secundară a reziduului derivat, prin examinarea structurilor rezolvate prin analiză cristalografică cu raze X. Cheia acestor tipuri de reziduuri este desemnată, după cum urmează: N - aproape de CDR (structurile cu raze X); P - grupare; B cufundat; negrupat; S - suprafață; E - expus; I - interfață; * - interfață; -grupare/expus parțial; ? - reziduuri nonCDR care pot fi îndepărtate ca secvență la șoarece. Reziduurile subliniate din fig.3 sunt aminoacizi.

REI este ales ca un cadru uman deoarece catena scurtă este catena kappa și regiunile variabile arată omologia mai mare cu secvențe de șoarece față de regiunea variabilă lambda cu catenă scurtă, de exemplu KCL (așa cum se va prezenta mai jos). REI este ales, de preferință, la alte catene scurte kappa, deoarece structura cu raze X a catenei scurte a fost determinată, astfel că o examinare structurală a reziduurilor individuale ar putea fi realizată.

Catena lungă. In mod similar, fig.4 arată o aliniere a secvențelor pentru regiunea cadru umană KDL și regiunea variabilă OKT3 cu catenă grea. Lanțurile structurale și CDRs se crede că corespund la regiunea de legare antigenică și sunt marcate. Așadar, este marcat un număr de alte reziduuri care pot să contribuie la legarea antigenică, așa cum s-a descris, mai sus. Tipul de reziduu cheie și alți indicatori care sunt utilizați (arătat în fig.4) sunt aceeași ca și cei utilizați și arătați în fig. 3. KDL este ales ca o catenă cadru lungă, deoarece structura cu raze X a fost determinată la o mai bună rezoluție decât de exemplu NEWM și, așadar secvența se aliniază la regiunea variabilă cu catenă lungă 0KT3 și arată o mai slabă omologie la KOL decât NEWM.

Desemnarea genelor variabile. Domeniile regiunii variabile sunt desemnate cu regiunea variabilă la șoarece cu utilizarea codonului optimal (așa cum este arătat în literatura de specialitate] și se utilizeaă secvențele semnal B 72,3 (de asemenea, cunoscut din literatura de specialitate). Secvențele sunt desemnate a fi legate la regiunea constantă în același mod ca și pentru genele chimerice descrise mai sus. Linele construcții conțin “secvențe consens Kozac” (așa cum se știe din literatura de specialitate] și se leagă direct la secvența 5' semnal al genei. Această secvență motiv, se crede că are un rol hotărâtor și folositor în inițierea translației în eucariote.

Construcția genei. Pentru a construi regiunile variabile, sunt convenabile diferite strategii. Secvența poate fi ansamblată prin utilizarea oligonucleotidelor, într-o manieră similară celei cunoscute din literatura din domeniu sau prin înlocuirea tuturor CDRs sau regiunilor lanț prin oligonucleotide prin mutageRO 114298 Bl neză specifică parțială și într-o manieră care, de asemenea, este cunoscută din literatura de specialitate. Sunt utilizate ambele strategii, iar o listă de construcții este prezentată în tabelul 1 care ur- 5 mează și tabelul 2, precum și în fig.4 și

5. Este de notat, în diferite cazuri, că mutageneza conduce corespunzător la deteriorări, iar aranjamentul în genă este remodelat, în timp ce succesul unui ansamblu convenabil este sensibil la calitatea oligonucleotidelor.

Tabelul 1

Construcții genetice grefate pe CDR

Codul	Secvența la șoarece conținut	Metoda de construcție	Secvența Kozak
Catenă scurtă	Cadrele umane REI
121	26-32, 50-56,91-96 inclusiv	SDM și ansamblul genei	+ n.d.
121A	26-32, 50-56, 91 - 96 inclusiv + 1,3, 46, 47	Ansamblul parțial al genei	n.d. +
121B	26-32, 60-56, 91-96 inclusiv +46, 47	Ansamblu parțial al genei	n.d. +
221	24-24, 50-56,91-96 inclusiv	Ansamblul parțial al genei	++
221A	24-34, 50-56, 91-96 inclusiv + 1,3, 46, 47	Ansamblul parțial al genei	4-4-
221B	24-34, 50-56, 91-96 inclusiv + 1.3	Ansamblul parțial al genei	+4-
221C	24-34, 50-56, 91-96 inclusiv	Ansamblul parțial al genei	4-4-
Catenă lungă	Cadrele umane KOL
121	26-32, 50-56, 95-1OOB inclusiv	Ansamblul genei	nd +
131	26-32, 50-58, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul genei	n.d +
141	26-32, 50-65, 95- 100B inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+ n.d
321	26-35, 50-56, 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul parțial al genei	+ n.d.
331	26-35, 50-58 95-1 OOB inclusiv	Ansamblul parțial al genei Ansamblul genei	4- 4-
341	26-35, 50-65, 95-1 OOB inclusiv	SDM Ansamblul parțial al genei	4- 4-
341B	26-35, 50-65, 95-1 OOB inclusiv +48, 49, 71, 73, 76, 78, 88, 91, [+63 + uman]	Ansamblul genei	n.d. +
341A	26-35, 50-65, 95-1 OOB inclusiv +6, 23, 24, 48, 49, 71, 73, 76, 78, 88, 91, (+63 - uman]	Ansamblul genei	n.d. +

RO 114298 Bl

n.d. = nedeterminat

SDM = mutageneză directă parțială

Ansamblu al genei = regiuni variabile asamblate întreg din oligonucleotide;

Ansamblul parțial al genei = regiuni variabile asamblate prin combinarea fragmentelor de restricție, fie de la alte gene original create prin SDM și ansamblul genei sau din ansamblul oligonucleotidei a unei părți din regiunea variabilă și reconstrucția cu fragmente de restricție din alte gene original create din SDM și ansamblul genei.

Exprimarea genelor grefate pe CDR. Producerea anticorpului constituit din catene scurte [gL] cu catene lungi de șoarece [mH] sau catene lungi chimerice [cH], Toate catenele gL, în asociere cu mH sau cu cH produc cantități rezonabile de anticorp. Inserția secvenței consens Kozak la poziția 5' la ATG (construcții kgL] conduce la o îmbunătățire de 2...5 ori în exprimarea netă. 0 serie extinsă a experimentelor nivelelor de exprimare sunt crescute de la aproximativ 2OD ng/ml la aproximativ 500 ng/ml pentru kgL/cH sau combinațiile kgL/mH. Când legarea directă la antigen pe celulele HUT 78 este măsurată, o construcție este desemnată să includă secvența bazată pe lungimea lanțului (gL121) la anticorpi activi în asociere cu mH sau cu cH. □ construcție desemnată pentru a include secvența de șoarece pe CDRs Kabat (gL221) demonstrează unele legături slabe în asociere cu mH sau cH. Totuși, când reziduurile cadru 1, 3, 46, 47 sunt schimbate de la echivalenții 0KT3 umani la echivalenții murinici bazați pe argumentele subliniate mai sus, legătura antigenică este demonstrată când ambele construcții sunt noi și sunt denumite 121A și 221A și sunt co-exprimate cu cH. Când efectul acestor reziduuri sunt examinate într-un detaliu mai mare, se pare că reziduurile 1 și 3 nu sunt reziduuri cu o contribuție majoră ca produs 11 genei gK221B și arată o activitate de legare puțin detectabilă în asociere cu cH. Produsul cu catenă scurtă al gL221C, în care secvențele la șoarece sunt prezentate la pozițiile 46 și 47, arată o activitate de legare bună în aso42 ciere cu cH.

Producția de anticorpi care constau din catene lungi grefate [gH] cu catene scurte la șoarece [mL] sau catene scurte chimerice [cLJ. Exprimarea genelor gH s-a dovedit a fi mult mai dificilă decât gL. Mai întâi, incluziunea secvenței Kozak pare a nu avea un efect marcat privind exprimarea genelor gH. Exprimarea pare a fi slab îmbunătățită dar nu în același grad, așa șcum s-a observat pentru catena scurtă grefată. Așadar, sa arătat că este dificil să se demonstreze producția cantităților așteptate de material când lanțul ales (aminoacizii de la 26 la 32) pentru CDR1 este utilizat, ca de exemplu gH121, 131, 141 și nu poate fi trasă nici o concluzie despre aceste construcții. Mai mult, co-exprimarea genei gH341 cu cL sau mL a fost variabilă și are tendința de a produce cantități mai mici de anticorp față de cH/cL sau mH/mL ca combinații. Modificările gH341 pentru a produce gH341A și gH341B conduc la nivelele îmbunătățite de exprimare. Aceasta se poate datora fie creșterii generale în fracțiunea secvenței la șoarece în regiunea variabilă sau pentru modificarea la poziția 63 unde reziduul este returnat la aminoacidul uman valină (Val) din fenialanină (Phe), pentru evitarea posibilelor probleme de grupare internă cu restul de cadru uman. Acest aranjament produce, așadar gH331 și 321. Când gH321 sau gH331 sunt exprimați în asociere cu cL, anticorpul este produs, dar activitatea de legare a anticorpului nu este detectată. Când gena gH341 mai conservativă este utilizată, legătura antigenică ar putea fi detectată în asociere cu cL sau mL, dar activitatea este numai marginală peste nivelul de bază. Când reziduurile de șoarece sunt substituite în continuare pe baza unor argumente care au fost arătate mai sus, legarea antigenului ar putea fi clar demonstrată pentru anticorpul produs când kgH341A și kgH341B sunt exprimate în asociere cu cL.

Producerea anticorpului complet grefat pe CUR. Gena kgL221A este coexprimată cu kgH341A sau kgH341B.

RO 114298 Bl

Pentru combinația kgH221 A/kgH341 este produs foarte puțin material într-o exprimare normală a celulelor COS. Pentru combinațiile kgL221 A/kgH341 A sau kgH221A/kgH341B cantități de anticorp similare la gH/cH sunt produse. In diferite exprimente, activitatea de legare antigenică ar putea fi detectată cu kgH221A/gH341 sau combinația kgH221 A/ kgH341, care exprimă nivele foarte scăzute. Legătura de antigen este detectată când kgL221A/kgH341 A sau kgH221 A/kgH341 B sunt exprimate. In cazul anticorpului produs din combinația kgL221 A/kgH341 A, legătura antigenică este foarte similară cu cea a anticorpului chimeric. O analiză a rezultatelor de mai sus este prezentată în cele ce urmează.

Discutarea rezultatelor de grefare pe CPR. In desemnarea anticorpului umanizat complet, scopul a fost de a transfera numărul minim de aminoacizi la șoarece, care ar putea conferi legătura antigenică pe cadrul anticorpului uman.

Extinderea CDRs. Pentru reziduurile cu catenă scurtă care definesc lanțurile cunoscute din studiile structurale ale anticorpilor care conțin reziduurile de contact antigenice și acele secvențe hipervariabile definite de către Kabat (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate). Regiunile de determinare a complementarității (CDRs) sunt echivalente pentru CDR2. Pentru CDR1, regiunea hipervariabilă se extinde de la reziduurile 24...34 inclusiv, în timp ce lanțul structural se extinde de la 26 la 32. Inclusiv în cazul OKT3 există numai o diferență de aminoacizi între două opțiuni, la aminoacidul 24 la care secvența de șoarece este o serină și cadrul uman REI este glutamina. Pentru CDR3, lanțul se extinde de la reziduurile 91 la inclusiv, în timp ce hipervariabilitatea Kabat se extinde de la reziduurile 89 la inclusiv. Pentru aminoacizii 0KT3, 89, 90 și 97 sunt aceeași între 0KT3 și REI (fig.3). Când construcțiile bazate pe lanțul ales pentru CDR1 (gL121) și alegerea Kabat (gL221) sunt efectuate și co-exprimate cu mH sau cH, nici o evidență pentru activitatea antigenică nu ar putea fi găsită pentru gL121, dar urmele de activitate s-ar putea detecta pentru gL221, sugerând că un singur reziduu extra de șoarece în regiunea variabilă grefată ar putea avea vreun efect detectabil. Ambele construcții de gene sunt exprimate rezonabil în sistemul de exprimare pasager.

Reziduurile cadru. Reziduurile cadru, care au rămas, sunt examinate în continuare, în special aminoacizii cunoscuți din analiza cu raze X a altor anticorpi care trebuie închiși la CDRs, care arată diferențe 0KT3 din consensul cadru pentru subgrupa de șoareci (subgrupa VI) la care 0KT3 arată cea mai mare homologie. -Patru poziții 1,3, 46 și 47, sunt identificate și contribuția posibilă a acestora este exprimată prin substituirea aminoacizilor la șoareci pentru aminoacidul uman la fiecare poziție. De aceea, s-a realizat gL221A (gL221 + D1Q, Q3V, L46R, L47W, așa cum este prezentat în fig.3 și tabelul 1], clonizate în EE6hCMVneo și co-exprimate cu cH (pJA144). Anticorpul rezultat este bine exprimat și arată o bună activitate de legare. Când genele menționate gL221B (gL221 + D1Q, Q3V) și gL221 (gL221 + L46R, L47W) sunt realizate și testate în mod similar, ambele gene care produc anticorpii sunt co-exprimate cu cH, numai în combinația gL221C/cH este arătată o legătură antigenică bună. Când genele gL121A (gL121 + D1Q, Q3V, L46R, L47W) sunt realizate și co-exprimate cu genele cH, anticorpul este produs și este legat așadar la antigen.

Catena lungă. Extinderea CDRs. Pentru lanțul cu catene lungi, analizele de hipervariabilitate sunt numai în CDR. Pentru C0R1, regiunea lanțurilor se extinde la reziduurile 26 la 32 inclusiv în care CDR Kabat se extinde de la reziduurile 31...35 inclusiv. Pentru CDR2, regiunea lanțurilor este formată din reziduurile 50...58 inclusiv în timp ce regiunea hipervariabilă acoperă aminoacizii 50...65 inclusiv. De aceea catenele lungi umanizate sunt construite prin utilizarea cadrului de la anticorpul KOL și cu diferite combinații ale acestor CDR alese, inclusiv o combinație mai scurtă pentru

RO 114298 Bl

CDR2 de 5Q...56 inclusiv, așa cum au fost unele nesigure, ca de exemplu definiția punctului final pentru reziduurile din jurul lanțurilor CDR2 56 până la 58. Genele sunt co-exprimate cu ml_ sau cu cL inițial. In cazul genelor gH cu lanțuri alese pentru CDR1, de exemplu gH121m gH131, gH141, anticorpul foarte mic este produs în cultura de supernatant. Deoarece nu s-a detectat nici o catenă scurtă liberă, s-a presupus că anticorpul a fost realizat și analizat în interiorul celulei, însă catena lungă este multiplicată posibil incorect și de aceea anticorpul este degradat intern. In câteva experimente, cantitățile în urme de anticorp ar putea fi detectate cu S³⁵marcat. Deoarece nici un anticorp nu este produs, analiza acestor construcții nu este continuată mai departe. Când totuși, o combinație de lanțuri alese și de sortimente Kabat pentru CDR1 sunt testate (aminoacizii 26...35 inclusiv la șoarece) și în care reziduurile 31 (Ser până la Arg], 33 (Ala până la Thr) și 35 (Tyr până la His) sunt schimbate din reziduurile umane la șoarece și comparate cu primele serii, anticorpul este produs pentru gH321, kgH331, kgH341 când este co-exprimat cu cL. Exprimarea este în general joasă și n-ar putea fi marcat îmbunătățită prin inserția secvenței consens Kabat 5' la ATG al secvenței de semnal a genei, așa cum a fost distinct în cazul genelor gL, și în care astfel de inserții conduc la o creștere de 2...5 ori în producția netă de anticorpi. Totuși, numai în cazul gH341/ml_ sau kgH341/cL s-ar putea demonstra activitatea de legătură antigenică marginală. Când gena kgH341 este co-exprimată cu kgL221A, producția netă de anticorp este tot mai mică pentru a da un semnal deasupra nivelului de bază în analiza de legare antigenică.

Reziduurile cadru. Ca și în cazul cu catene scurte și catene lungi cadru, se efectuează reexaminări. Aceasta este posibil întrucât există o homologie inițială mai joasă între domeniile variabile uman și cele de șoarece, comparate cu cafenele scurte, mulți aminoacizi având pozițiile probate sunt de interes. Două gene kgH341A și kgH341B sunt constituite cu 11 sau 8 reziduuri umane respectiv substituite prin reziduuri la șoarece, comparate cu gH341 și cu reziduul CDR2 63 returnat la aminoacidul uman potențial pentru îmbunătățirea domeniului de grupare. Ambele cazuri arată gruparea de legare antigenică când se combină cu cL sau kgL221A, gene kgH341 A cu toate 11 schimbări părând a fi superior aleasă.

Concluziile interimare. S-a demonstrat pentru 0KT3 că, pentru a transfera abilitatea de legare antigenică la anticorpul umanizat, reziduurile din afara regiunii CDR, definite prin hipervariabilitatea Kabat sau. prin alegeri de lanțuri structurale, sunt necesare pentru ambele tipuri de catene lungi și scurte. Câteva reziduuri extra sunt necesare pentru catena scurtă, posibil datorită unei homologii inițiale înalte între regiunile variabile kappa umane și cele de șoarece. Din cele șapte schimbări (1 și 3 în catena scurtă și 6, 23, 71, 73 și 76 din catena lungă) sunt prevăzute din cunoașterea altor structuri de anticorpi a fi parțial expuse pe suprafața de anticorp. S-a arătat de asemenea că reziduurile de anticorp 1 și 3 în catena scurtă nu este absolut necesar a fi secvențate de șoarece; și pentru cafenele lungi, catena lungă gH341B în combinație cu catena scurtă 221A generează numai o activitate de slabă legare. De aceea, prezența schimbărilor 6 și 23 și 24 este importantă pentru menținerea unei afinități de legătură similară cu cea a anticorpului murinic. Este important să se studieze, în continuare, contribuția individuală a altor 8 reziduuri de șoarece a genei kgH341A, în comparație cu kgH341.

Experimentele de grefare pe CDR, în continuare. Genele cu catene lungi grefate pe CDR adiționale sunt preparate așa cum s-a descris mai sus. Cu referire la tabelul 2 care urmează, următoarele gene cu catene grele bazate pe gH341 (plasmidul pJA178] și gH341A (plasmidul pJA185) cu 0KT3 de șoarece sau cu reziduuri KOL umane la 6, 23, 24, 48, 49, 63, 71, 73, 78, 88 și 91, așa

RO 114298 Bl cum s-a arătat. .Genele cu catenă scurtă grefate pe CDR și utilizate în următoarele experimente sunt: gL221, gL221A, gL221B, gL221C, în conformitate cu cele prezentate mai sus.

Tabelul 2

Grefare pe CDR a 0KT3 cu catene lungi

1. gH341 și derivații acestuia

RES NUM

6

23 24 48

49

63 '

71

73

76

78 88

91

0KT3vh

Q

K

A

I

G

F

T

K

S

A

Y

gH341

E

S

s

V

A

F

R

N

D

G

F

JA178

qH341A

Q

K

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA195

gH341E

Q

K

A

I

G

V

T

K

S

A

G

JA198

gH341+

Q

K

A

I

G

V

T

K

N

A

G

F

JA2O7

gH341+

Q

K

A

I

G

V

R

N

A

G

F

JA209

gH341D

Q

K

A

I

G

V

T

K

N

L

G F

JA197

gH341⁺

Q

K

A

I

G

V

R

N

L

G

F

JA199

gH341C

Q

K

A

V

A

F

R

N

L

.G

F

JA184

gH341⁺

Q

s

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA2O3

gH341⁺

E

s

A

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA205

gH341B

E

s

S

I

G

V

T

K

S

A

Y

JA183

gH341⁺

Q

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA204

gH341⁺

E

s

A

I

G

V

T

K

S

A

G

F

JA206

gH341⁺

Q

s

A

I

G

V

T

K

N

A

G

F

JA208

KOL

E

s

S

V

A

R

N

L

G

F

Grefarea pe CDR a 0KT3 cu catene scurte
2.	gL221 și derivații acestuia
RES NUM 1	3	46	47
□KT3V1	Q	V	R	W
gL221	D	Q	L	L	DA221
gL221A	Q	V	R	W	DA221A
gL221B	Q	V	L	L	□A221B
gL221C	D	Q	R	W	DA221C
REI	D	Q	L	L

Reziduurile murinice sunt subli- 35 niate.

Genele cu catene scurte și cu catene lungi grefate pe CDR sunt co-exprimate în celule COS, fie cu una sau alta din diferitele combinații, dar și cu genele 4o cu catene lungi și catene scurte murinice și chimerice, care au fost descrise mai sus. Produsele de anticorpi, care au rezultat, sunt analizate prin analizele de blocare cu celulele HPB-ALL descrise 4 5 mai sus.

Rezultatele analizelor pentru diferite catene lungi grefate și co-exprimate cu catena scurtă gl_221C sunt prezentate în fig.7 și 8 (pentru JA148, JA185, 50

JA197 și JA198 ca construcții și în conformitate cu tabelul 2), în fig.9 (pentru JA183, JA184, JA185 și JA197 ca construcții], în fig. 10 (pentru construcțiile chimerice JA185, JA199, JA204, ’ JA205,Ja207, JA208 și

JA209) și fig. 11 (pentru construcțiile JA183, JA184, JA185, JA198,

JA203, JA205 și JA206).

Produsele bazic grefat fără vreo schimbare umană în schimbări murinice în cadrul variabil, de exemplu, gL221 coexprimat cu gh341(JA178] și produsul astfel grefat complet, având majoritatea schimbărilor umane către cele murinice în cadrul cu catenă lungă grefată, de exemplu gL221C co-exprimat cu gH341A (JA185) sunt analizate pentru afinitatea de legătură relativă într-o analiză competitivă față de referință stanRO 114298 Bl dard murinică OKT3, utilizându-se celulele HPB-ALL. Analiza care s-a efectuat s-a descris mai sus. Rezultatele obținute sunt prezentate în fig. 12, pentru produsul bazic grefat și în fig. 13, pentru produsul complet grefat. Aceste rezultate arată că produsul complet grefat de bază are o abilitate de legare slabă în comparație cu referințele standard murinice OKT3; prin acesta “produsul grefat complet” are o abilitate de legare foarte similară cu cea a standardului de referință murinic OKT3.

Rezultatele analizei de blocare și legare arată următoarele rezultate: construcțiile JA198 și JA2O7 par a avea cele mai bune caracteristici de legare și abilități de legare similare, ambele fiind substanțial aceleași ca și produsele gH341A complet grefate și produsele chimerice. Aceasta arată că pozițiile 88 și 91 și poziția 76 nu sunt superior critice pentru menținerea abilității de legare a cel puțin câteva din pozițiile 6, 23, 24, 48, 49, 71, 73, 78 care sunt mult mai importante.

La aceasta, se mai adaugă și faptul că s-a descoperit că JA2O9 și JA199 au, de asemenea, abilitatea de legare similară una față de alta, și au o abilitate de legătură joasă față de JA198 și construcția JA2O7. Aceasta arată importanța unor reziduuri de șoarece existente la pozițiile 71, 73 și 78, care sunt fie complet umane, fie parțial umane în construcțiile JA199 și respectiv JA2O9.

Mult mai mult, prin compararea rezultatelor obținute pentru construcțiile JA2O5 și JA183, s-a observat că există o descreștere în legătura care provine de la construcțiile JA 205 și JA183. Aceasta arată importanța reziduului de șoarece reținut la poziția 23, singura poziție schimbată între JA2Q5 și JA183. Aceste rezultate și altele au condus la concluzia că cele 11 reziduuri cadru la șoarece și utilizate în construcția gH341A(JA185) sunt importante la toate pozițiile 6, 23, 24, 48 și 49 și posibil pentru o maximă afinitate, la pozițiile 71, 73 și 78.

Experimente similare sunt efectuate la un număr de anticorpi de roză50 toare grefați pe CDR, incluzând anticorpii care au specificitate pentru CD4(0KT4),

ICAM-1(R6-5), TAG72(B72,3) și a-TNF (61E71, 101,4, hTNF1, hTNF2 și hTNF3).

Exemplul 2. Anticorpul receptor T celular anti-CD4 murinic grefat pe CDR, 0KT4A. Genele cu catene lungi și cu catene scurte anti 0KT4A grefate pe CDR sunt preparate, exprimate și testate așa cum s-a descris în cadrul exemplului 1, pentru 0KT3 grefat pe CDR. Grefarea pe CDR a 0KT4A este descrisă în literatura de specialitate având capitole care sunt intitulate “anticorpi umanizați”. Așadar, s-a preparat un număr de anticorpi DKT4 grefați pe CDR. Selecția 0KT4 grefată pe CDR este în combinație cu catena scurtă grefată LCDR2 și cu catena lungă grefată HCDR10.

Catena scurtă. Cadrul uman acceptor utilizat pentru grefarea catenelor lungi este RE1. Catena scurtă preferată LCDR2 are schimbări de la om la șoarece în pozițiile 33, 34, 38, 49 și 89 în adiție la lanțul structural CDRs. Față de aceste poziții schimbate, pozițiile 33, 34 și 89 scad în CDRs extinse, care sunt preferate în conformitate cu prezenta invenție (pozițiile 33 și 34 în CDR1 și poziția 89 în CDR3], Schimbările umane în murinice, în pozițiile 38 și 49, corespund la pozițiile la care reziduurile de aminoacizi sunt de preferință reziduuri de aminoacizi murinici donoare, în conformitate cu prezenta invenție. O comparație a secvențelor de aminoacizi din domeniul variabil murinic donor, cu catena lungă și RE1 uman acceptor variabil cu catenă scurtă demonstrează că reziduurile murinice și umane sunt identice la toate pozițiile 46, 48 și 71 și la toate pozițiile 2, 4, 6, 35, 36, 44,’ 47, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101 și 102. Totuși, reziduul de aminoacid în poziția 58 în LCDR2 este reziduul uman RE1 și nu reziduul 0KT4 la șoarece, așa cum sar prefera în conformitate cu prezenta invenție.

Catena lungă. Cadrul acceptor uman utiizat pentru cafenele lungi grefate, este KOL. Catena lungă HCDR10 grea grefată pe CDR și preferată are

RO 114298 Bl schimbări de la uman la șoarece la pozițiile 24, 35, 57, 58, 60,' 88, 91 în adiție la lanțul structural CDRs. Dintre acestea, pozițiile 35(CDR1) și pozițiile 57, 58 și 60 (CDR2) scad în cadrul extinderii CDRs din prezenta descriere de invenție. Așadar, schimbarea de la om la șoarece la poziția 24 corespunde la poziția la care reziduul de aminoacid este un reziduu murinic donor, în conformitate cu prezenta invenție. Mai mult decât atât, schimbările de la uman la șoarece la pozițiile 88 și 91 corespund pozițiilor la care reziduurile de aminoacizi sunt opțional reziduuri murinice donoare. Mai mult decât atât, o comparație a 0KT4A murinic și KOL uman cu secvențele de aminoacizi variabile cu catenă lungă arată că reziduurile murinice și umane sunt identice la toate pozițiile 23, 49, 71, 73 și 78 și la toate pozițiile 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 și 107. Astfel 0KT4A cu catenă lungă HCDR1 grefat pe CDR corespunde la o perfectă întruchipare a prezentei invenții.

Exemplul 3. Grefarea pe CDR a unui anticorp murinic specific anti-mucinic, B72.3. Clonizarea genelor codificate pentru anticorpul monoclonal murinic specific anti-mucinic B72,3 și prepararea anticorpilor chimerici B72,3 șoarece-om a fost descrisă în literatura de specialitate (WO 89/01783). Versiunile grefate pe CDR ale B72,3 sunt preparate după cum urmează:

a) Catena scurtă B72,3. Grefarea pe CDR a acestei catene scurte este însoțită de un transfer direct al CDRs murinic în cadrul catenei scurte umane RE1. Regiunile transferate sunt următoarele:

Număr CDR Reziduurile

124-34

250-56

390-96

Activitatea catenei scurte grefate este completată printr-o co-exprimare în celulele COS a genelor pentru recombinanți: B72.3 cH/B72,3 cL și B72.3 cH/B72,3 gL.

Supernatantele sunt analizate pentru concentrarea și abilitatea de le- gare la plăcile microtitrate care sunt acoperite cu mucină. Rezultatele obținute arată că, în combinație cu catena B72.3 cH, B72.3 cL și B72,3 gL au proprietăți de legare similare. Compararea secvențelor de aminoacizi cu catenă scurtă RE1 și B72,3 mucinică arată că reziduurile sunt identice la pozițiile 46, 58 și 71 dar diferă la pozițiile 48. Astfel, schimbarea reziduurilor umane în reziduuri donoare la șoarece la poziția 48 poate duce în continuare la îmbunătățirea caracteristicilor de legare a catenei scurte grefate la CDR (B72,3 gL) în conformitate cu prezenta descriere de invenție.

(b) Catena lungă B72,3: Selecția cadru. Așa cum s-a început, este necesar să se facă o selecție a cadrului uman. Problema, care se pune, este aceea că este nevoie să se utilizeze regiunile cadru din anticorpii a căror structură de cristal este cunoscută, sau s-ar putea face o selecție după alte criterii ?. Pentru catena lungă B72,3, se face remarca că, în timp ce cunoașterea structurii este importantă, transferul CDRs de la șoarece la om a acestor cadre ar putea fi facilitat dacă homologia generală între cadrele donoare și acceptoare este maximizată. Compararea secvenței catenei lungi B72,3 cu cele din Kabat, pentru catenele umane cu lanț lung, arată clar că B72,3 are o homologie săracă pentru KOL și NEWM (pentru care structurile de cristal sunt convenabile), dar aceasta este foarte homoloagă cu catena lungă pentru EU. Pentru această bază, EU este ales pentru grefarea pe CDR și reziduurile următoare sunt transferate pe CDRs:

Număr CDR Reziduurile

27-36

50-63

93-102

Așadar, este de notat că regiunea FR4 a EU este diferită de orice alt anticorp uman (sau de șoarece). In consecință, în genele cu catene lungi grefate deja s-a produs schimbarea pentru a produce “consensul” secvenței umane (experimente preliminare arată că genele cu catene lungi grefate conținând secRO 114298 Bl vența EU FR4 se exprimă foarte slab în sistemele transiente de exprimare).

Rezultatele cu gene grefate cu catene lungi. Exprimarea genelor grefate, cu catene lungi care conțin toate regiunile cadru umane, fie cu gL sau cu gene cL, arată că se produce un anticorp grefat cu o slabă abilitate de legare la mucină. Anticorpul grefat are aproximativ 1% activitate din anticorpul chimeric. In aceste experimente, totuși este de notat că activitatea anticorpului grefat ar putea fi crescută la aproximativ 10% din B 72,3 prin expunere la pH-uri care sunt cuprinse între 2 și 3,5. Această observație duce la concluzia că activitatea anticorpului grefat ar putea fi îmbunătățită fără tratament acid. S-a postulat de asemenea, că expunerea la un pH acid duce la o protonizare aproximativă a reziduului acidic (pKa a acidului aspartic = 3,86 și a acidului glutamic = 4,25) care în schimb cauzează o schimbare în structura lanțaurilor CDR sau permite un acces mai bun la antigen. Din compararea secvențelor de B72,3 și EU (așa cum este arătat în literatura de specialitate) este clar că plecând de la cadrul creat la șoarece la cel de la om, numai două poziții au fost schimbate în acest fel, astfel că reziduurile acidice au fost introduse. Aceste poziții sunt la reziduurile 73 și 81, în care schimbările K la E și □ la E au fost realizate. Care dintre aceste poziții ar putea fi mai importantă, s-a făcut prin examinarea structurii de cristal al anticorpului KOL. In catena lungă KOL, poziția 81 este îndepărtată din lanțurile CDR. Totuși, poziția 73 este închisă la ambele capete 1 și 3 ale catenei lungi, și în această poziție este posibil să se arate că schimbarea de la K la E în această regiune ar putea avea un efect în detrimetrul legăturii antigenice.

Schimbările cadru la gena B72,3gH. Pe baza analizei de mai sus, s-a observat că E73 este mutată la lizină (K). S-a găsit că această schimbare are un efect dramatic asupra abilității de legare la mucină a lui Ab grefat. De asemenea, abilitarea lui B72.3 grefat produsă prin combinația gH/gL de legare la mucină, este similară cu cea a anticorpului chimeric B72,3.

Alte schimbări cadru. In cursul experimentelor de mai sus au fost efectuate alte schimbări în regiunile cadru cu catenă lungă. In cadrul analizelor de acurateță care au fost realizate, a fost măsurată abilitatea Ab grefat, privind legarea mucinei și ca un întreg, se arată că simpla schimbare cadru la poziția 73 este suficientă pentru a genera un anticorp cu proprietăți de legare similare cu cele ale B72,3. Compararea mucinei B72,3 ca secvențe, cu secvențele EU cu catene lungi arată că reziduurile de la șoarece și de la om sunt identice la pozițiile 23, 24, 71 și 78. Astfel, catena lungă B72,3 grefa tă pe CDR mutată, corespunde la o întruchipare preferată a prezentei invenții.

Exemplul 4. Grefarea pe CDR a anticorpului monoclonal murinic antiICAM-1. Un anticorp murinic R6-5-D6 (care este cunoscut din literatura de specialitate, EP 0314863) care are specificitate pentru ICAM-1 (molecula de adeziune intercelulară) este grefat substanțial pe CDR, așa cum s-a prezentat în exemplele de realizare de mai sus. Cadrul uman EU este utilizat ca cadru acceptor atât pentru catenele lungi, cât și pentru catenele scurte. Anticorpul grefat pe CDR ales curent este prevăzut prin co-exprimarea catenei scurte grefate gL221A și a catenei lungi grefate gH341D care are o afinitate de legătură pentru ICAM-1 de aproximativ 75% din cea a anticorpului chimeric corespunzător la șoarece și 50-56(CDR2) și 8997(CDR3). In plus, la reziduurile cadru diferite sunt de asemenea acizi aminici murinici. Aceste reziduuri sunt alese după considerarea contribuției posibile a acestor reziduuri în domeniul de grupare și stabilitate a conformației regiunii de legare antigenică. Reziduurile care au fost reținute ca fiind de la șoarece, sunt la pozițiile 2, 3, 48,(?) 60, 84, 85 și 87. Compararea anti-ICAM 1 murinic a secvenței aminoacide cu catena scurtă cu secvențele de aminoacid cu catenă scurtă EU umane, arată că reziduurile murinice și umane sunt identice la poziRO 114298 Bl țiile 46, 58 și 71.

Cafenele lungi. gH341D are CDRs murinic la pozițiile 26-35 (CDR1), 5056 (CDR2) și 94-1OOB (CDR3). In plus, rezidiile murinice sunt utilizate în pozițiile 24, 48, 69, 71, 73, 80, 88 și 91, în gH341D. Compararea secvențelor murinice anti-ICAM 1 de acizi aminici cu catenă lungă cu secvențele de aminoacizi cu catenă lungă Eu umani, sunt identice la pozițiile 23, 49 și 78.

Exemplul 5. Grefarea pe CDR a anticorpilor muri nici anti-TNFa. Un număr de anticorpi murinici monoclonali anti-TNFa este substanțial grefat pe CDR, așa cum s-a descris în exemplele de realizare de mai sus. Acești anticorpi includ anticorpii monoclonali murinici desemnați ca 61 E71, hTNF1, hTNF3 și 101,4. Un scurt rezumat al grefării pe CDR la fiecare dintre acești anticorpi este prezentat în cele ce urmează, astfel:

61E71: O analiză similară este descrisă mai sus, cum ar fi în exemplul 1 de realizare, care este dată pentru 61 E71 și pentru catena lungă 10 ca reziduuri care se identifică la 23, 24, 48. 49, 68, 69, 71, 73, 75 și 88 ca reziduuri la o reținere potențială ca murină. Cadrele umane alese pentru grefare pe CDR a acestui anticorp și anticorpii hTNF3 și 101,4 sunt RE1 pentru o catenă mai scurtă și KOL pentru o catenă lungă. Aceste gene sunt construite, în primul rând acelea care conțin 23, 24, 48, 49, 71 și 73 (gH341(6) ca reziduuri murinice. A doua genă are, așadar, ca reziduuri murinice 75 și 88 (gH341(8)în timp ce a treia catenă adițională are ca reziduuri murinice 68, 69, 75 și 88 (gH341 (10). Fiecare este co-exprimat cu gL221, catenă scurtă fiind minim grefată (numai CDRs). Anticorpii gL221/ gH341(6] și gL221/gH341 (8) sunt ambii legați la TNF ca murină 61E71. Anticorpul gL221/gH341(10) nu este exprimat și combinația aceasta nu este luată în considerare. In plus, anticorpul gL221/gH341(6) este evaluat în analiza de competiție celulară L929 în care anticorpul intră în competiție față de receptorul TNF pe celulele L929 pentru legare la TNF în soluție. In această analiză, anticorpul gL221/gH341(6) este aproximativ de 10% activ ca și murină 61E71.

hTNF1: Acesta este un anticorp monoclonal care recunoaște un epitop pe TNF-uman. Cadrul uman EU este utilizat pentru grefare pe CDR în ambele domenii variabile cu catene scurte și catene lungi.

Catena lungă. In catena lungă grefată pe CDR (ghTNFI), la șoarece CDRs, se utilizează la pozițiile 26-35 (CDR1), 50-56 (CDR2) și 95-102(CDR3). Așadar, reziduurile la șoarece sunt utilizate în cadrul menționat la pozițiile 48, 67, 69, 71, 73, 76, 89, 91, 94 și 108. Compararea TNF1 la șoarece și reziduurile catenei grele la om EU arată că acestea sunt identice la pozițiile 23, 24, 29 și 78.

Catena scurtă. In catena scurtă grefată pe CDR (gLhTNFI), CDRs la șoarece este utilizat la pozițiile 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) și 89-97(CDR3). In plus, reziduurile la șoarece sunt utilizate în cadrul din pozițiile 3, 42, 48, 49, 83, 106 și 108. Compararea hTNF1 la șoarece și EU uman ca reziduuri cu catene scurte, arată că acestea sunt identice la pozițiile 46, 58 și 71.

Catena lungă hTNF1 grefată este co-exprimată cu catena scurtă himerică și stabilitatea de legare a produsului este comparată cu cea a catenei scurte chimerice/produsul cu catenă lungă chimerică în analiza de lagare TNF. Produsul cu catenă lungă grefată pare a avea o abilitate de legare pentru TNF mai puțin bună decât produsul chimeric complet. In mod similar, produsul cu catenă lungă grefat/produsul cu catenă scurtă grefat este co-exprimat și comparat cu produsul chimeric și este găsit a avea proprietăți de legare similare închise la produsul următor.

hTNF3: Acesta recunoaște un epitop de α-TNF uman. Secvența hTNF3 ara-tă numai 21 diferențe comparate cu

61E71 la regiunile variabile cu catene lungi și cu catene scurte: 10 în catena scurtă (2 în CDRs la pozițiile 50, 96 și 8 în acest cadru la 1,19, 40, 45, 46,

RO 114298 Bl

76, 103 și 106) și 11 la catena lungă (3 în regiunile reziduuale CDR la pozițiile 52 si 60 si 95 si 8 în cadrul acesta la 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 și 105). Catenele lungi și scurte ale anticorpilor chimerici 61E71 și hTNF3 pot fi schimbate fără a pierde activitatea în analiza directă de legare. Totuși, 61E71 este în ordinea magnitudinii mai puțin capabil de a fi competitiv cu receptorul TNF pe celulele L929 pentru TNF comparat cu hTNF3. Bazat pe datele grefate pe CDR, 61E71, gL221 și gH341 (+23, 24, 48, 49, 71 și 73 la șoarece) aceste gene sunt construite pentru hTNF3, și anticorpul rezultat grefat se leagă bine la TNF-a dar intră foarte slab în competiție în analiza L929. Este posibil ca în acest caz reziduurile cadru identificate pentru programul 0KT3 să poată îmbunătăți abilitatea de legare competitivă a acestui anticorp.

101,4: Acesta este un alt anticorp monoclonal murinic capabil de a recunoaște TNF-a uman. Catena lungă a acestui anticorp arată o bună homologie față de KOL și astfel CDR de grefare este bazat pe RE1 pentru catena scurtă și KOL pentru catena lungă. Diferitele gene cu catenă lungă grefate au fost construite cu selecții conservative pentru CDRs (gH341) și care au unul sau un număr mic de reziduuri non-CDR la pozițiile 73, 78 sau 77-79 inclusiv, ca aminoacizi la șoarece. Aceștia au fost co-exprimați cu cL sau gL221. In toate cazurile de legare la TNF echivalent la anticorpul chimeric s-a observat și când co-exprimarea cu cL a anticorpilor rezultați arată că aceștia sunt capabili de competiție bună în analiza L929. Totuși, cu anticorpii rezultați gL221, aceștia sunt cel puțin în ordinea magnitudinii mai puțin capabili de competiție pentru TNF față de receptorul TNF pe celulele L929.

Reziduurile la șoarece la pozițiile din catena lungă, de exemplu la 23 și la 24 la un loc sau la 76 au fost demonstrate ca neducând la o îmbunătățire a abilității competitive a anticorpului grefat în analiza L929.

Un număr de alți anticorpi, incluzând anticorpii care au specificitate pentru interleukine de exemplu IL-1 și mar58 kerii de cancer cum ar fi A5B7 (așa cum este cunoscut din literatura de specialitate) au fost grefați pe CDR cu succes, în conformitate cu cele arătate în prezența invenției. Este de apreciat că exemplele prezentate mai sus sunt date pentru a ilustra invenția, și nu este intenția limitării scopului invenției. Schimbări și modificări pot fi făcute la metodele descrise mai sus, acestea fiind în spiritul și scopul prezentei descrierii de invenție.

Claims

Revendicări

(1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte, din numitul anticorp donor, care are afinitate pentru numitul antigen predeterminat;

(1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp donor, care are afinitate pentru numita antigenă predeterminată;

(1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte, din numitul anticorp donor, care are afinitate pentru numitul antigen predeterminat;

(1) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp donor, care are afinitate pentru numita antigenă predeterminată;

1. Moleculă anticorp cu afinitate pentru un antigen predeterminat, și care conține o catenă lungă compozită și o catenă scurtă complementară, numita catenă lungă compozită având un domeniu variabil care conține reziduuri cadru cu catenă lungă de anticorp acceptor și reziduuri de legare antigen cu catenă lungă de anticorp donor, respectivul anticorp donor având afinitate față de numitul antigen predeterminat, caracterizată prin aceea că, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena lungă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 8, 10, 12 până la 17, 19, 21, 22, 40, 42 până la 44, 66, 68, 70, 74, 77, 79, 81, 83 până la 85. 90, 92, 105, 109, 111 și 113 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58, 71, 73, 78 și 95 până la 102 sunt reziduuri donoare.
(2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte dintr-un anticorp acceptor nespecific;

(2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp acceptor nespecific;

(2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei scurte dintr-un anticorp acceptor nespecific;

(2) determinarea secvenței de aminoacid din domeniul variabil al catenei lungi dintr-un anticorp acceptor nespecific;

2. Moleculă anticorp, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, reziduurile de aminoacid 26 până la 30 și 59 până la 65 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.
(3) furnizarea unei catene scurte compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă scurtă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare, în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23, 39, 41 până la 43, 57, 59, 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104 și 106 până la 109 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin, reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97sunt reziduuri donoare;

(3) furnizarea unei catene lungi compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă lungă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare, în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 8, 10, 12 până la 17, 19, 21, 22, 40, 42 până la 44, 66, 68, 70, 74, 77, 79, 81, 83 până la 85, 90, 92, 105, 109, 111 și 113, sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58, 71, 73, 78 și 95 până la 102, sunt reziduuri donoare;

(3) furnizarea unei catene scurte compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă scurtă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare, în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23, 39, 41 până la 43, 57, 59, 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104 și 106 până la 109 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin, reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46, 48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97sunt reziduuri donoare;

(3) furnizarea unei catene lungi compozite pentru o moleculă anticorp, respectiva catenă lungă compozită având reziduuri cadru acceptoare și reziduuri de legare antigen donoare, în care, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, cel puțin reziduurile de aminoacid 5, 8, 10, 12 până la 17, 19, 21, 22, 40, 42 până la 44, 66, 68, 70, 74, 77, 79, 81, 83 până la 85, 90, 92, 105, 109, 111 și 113, sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 23, 24, 31 până la 35, 49 până la 58, 71, 73, 78 și 95 până la 102, sunt reziduuri donoare;

3. Moleculă anticorp, conform revendicării 1 sau 2, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3 și 76 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.
(4) asocierea catenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(4) asocierea catenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(4) asocierea catenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(4) asocierea catenei lungi obținute în etapa (3) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

4. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 3, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid

RO 114298 Bl

36, 94, 104, 106 și 107 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.
(5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numita antigenă predeterminată;

(5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numitul antigen predeterminat;

5. Moleculă anticorp, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 48, 67 și 69 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donor suplimentare.

(5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numita antigenă predeterminată;

(5) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (4) față de numitul antigen predeterminat;

5. Moleculă anticorp, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 48, 67 și 69 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri suplimentare.
(6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 1, 2, 3 și 47

RO 114298 Bl sunt reziduuri donoare suplimentare;

(6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei caRO 114298 Bl

VERSIUNE CORECTATĂ - CORRECTED VERSION Semnalat In: / Reffered to in: BOPI 5/1999 tene lungi, după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 71, 73 și 78 sunt reziduuri donoare suplimentare;

6. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 5, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 7,9,11,18, 20, 25, 37, 39, 41, 45,

47, 48, 72, 75, 80, 82, 86 până la 89, 91, 93, 103, 108, 110 și 112 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri acceptor suplimentare.

(6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene scurte, după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 1, 2, 3 și 47

RO 114298 Bl

VERSIUNE CORECTATĂ - CORRECTED VERSION Semnalat în: / Reffered to in: BOPÎ 5/1999

36, 94, 104, 106 și 107 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.

(6) dacă afinitatea determinată în etapa (5) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei caRO 114298 Bl tene lungi, după cum se descrie în etapa (3) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 71, 73 și 78 sunt reziduuri donoare suplimentare;

6. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 5, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 7,9,11,18, 20, 25, 37, 39, 41,45,

47, 48, 72, 75, 80, 82, 86 până la 89, 91, 93, 103, 108, 110 și 112 din numita catenă lungă compozită sunt reziduuri donoare suplimentare.
(7) asocierea catenei scurte obținute în etapa (6) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule de legare antigen; 5 (8) determinarea afinității moleculei de legare antigen formate în etapa (7) față de numitul antigen prefeterminat;

(7) asocierea catenei lungi obținute în etapa (6) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

7. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 6, în care numita catenă scurtă complementară este o catenă scurtă compozită, având un domeniu variabil care conține reziduuri cadru cu catenă de anticorp acceptor și reziduuri de legare antigenă cu catenă scurtă de anticorp donor, respectivul anticorp donor având afinitate față de numitul antigen predeterminat, caracterizată prin aceea că, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid, 5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23, 39, 41 până la 43, 57, 59, 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104, 106 și 107 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46,

48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare.

(7) asocierea catenei lungi obținute în etapa (6) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

7. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 1 până la 6, în care numita catenă scurtă complementară este o catenă scurtă compozită, având un domeniu variabil care conține reziduuri cadru cu catenă de anticorp acceptor și reziduuri de legare antigenă cu catenă scurtă de anticorp donor, respectivul anticorp donor având afinitate față de numitul antigen predeterminat, caracterizată prin aceea că, în conformitate cu sistemul de numerotare Kabat, în catena scurtă compozită, cel puțin reziduurile de aminoacid, 5, 7 până la 9, 11, 13 până la 18, 20, 22, 23, 39, 41 până la 43, 57, 59, 61, 72, 74 până la 79, 81, 82, 84, 86, 88, 100, 104, 106 și 107 sunt reziduuri acceptoare și cel puțin reziduurile de aminoacid 24 până la 34, 46,

48, 50 până la 56, 58, 71 și 89 până la 97 sunt reziduuri donoare.
(8) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (7) față de numitul antigen predeterminat;

8. Moleculă anticorp, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că, reziduurile de aminoacid 1,3 și 47, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

(8) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (7) față de numitul antigen predeterminat;

8. Moleculă anticorp, conform revendicării 7, caracterizată prin aceea că, reziduurile de aminoacid 1, 3 și 47, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.
(9) dacă afinitatea determinată în etapa (8) nu este echivalentă cu cea a io anticorpului donor, furnizarea unei catene scurte, după cum se descrie în etapa (6) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 36, 44, 47, 85 și 87 sunt reziduuri donoare suplimentare; 15 (10) asocierea catenei scurte obținute în etapa (9) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei mo- lecule anticorp;

(9) dacă afinitatea determinată în etapa (8) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (6) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 26 până la 30 sunt reziduuri donoare suplimentare;

9. Moleculă anticorp, conform revendicării 7 sau 8, caracterizată prin aceea că, reziduurile de aminoacid 36, 44, 47, 85 și 87, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

(9) dacă afinitatea determinată în etapa (8) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (6) de mai sus, dar în care reziduurile de aminoacid 26 până la 30 sunt reziduuri donoare suplimentare;

9. Moleculă anticorp, conform revendicării 7 sau 8, caracterizată prin aceea că, reziduurile de aminoacid 36, 44, 47, 85 și 87, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.
(10) asocierea catenei lungi obținute în etapa (9) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

10. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 7 până la 9, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 49, 62, 64 până la 69, 98, 99, 101 și 102, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

(10) asocierea catenei lungi obținute în etapa (9) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

10. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 7 până la 9, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 49, 62, 64 până la 69, 98, 99, 101 și 102, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.
(11) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (10) față de numitul antigen predeterminat;

(11) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa a (10) față de numitul antigen predeterminat;

(12) dacă afinitatea determinată în etapa (11) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (9) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3 și 76 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(13) asocierea catenei lungi obținute în etapa (12) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(14) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (13) față de numitul antigen predeterminat;

(15) dacă afinitatea determinată în etapa (14) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (12) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36, 94, 104, 106, 107 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(16) asocierea catenei lungi obținute în etapa (15) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(17) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa a (16) față de numitul antigen predeterminat;

(18) dacă afinitatea determinată în etapa (17) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizând o catenă lungă, după cum se descrie în etapa (15) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 48, 67 și 69 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(19) asocierea catenei lungi obținute în etapa (18) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp.

13. Procedeu conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că, mai cuprinde etapele:

11. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 7 până la 11, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3, 10, 12, 21, 40, 60, 63, 70, 73, 80, 103 și 105, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

12. Procedeu de preparare a moleculei de anticorp cu afinitate pentru un antigen predeterminat, caracterizat prin aceea că cuprinde următoarele etape:

(11) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa a (10) față de numitul antigen predeterminat;

(12) dacă afinitatea determinată în etapa (11) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (9) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3 și 76 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(13) asocierea catenei lungi obținute în etapa (12) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(14) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa (13) față de numitul antigen predeterminat;

(15) dacă afinitatea determinată în etapa (14) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene lungi, după cum se descrie în etapa (12) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 36, 94, 104, 106, 107 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(16) asocierea catenei lungi obținute în etapa (15) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp;

(17) determinarea afinității moleculei anticorp formate în etapa a (16) față de numitul antigen predeterminat;

(18) dacă afinitatea determinată în etapa (17) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizând o catenă lungă, după cum se descrie în etapa (15) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 38, 48, 67 și 69 sunt reziduuri donoare suplimentare;

(19) asocierea catenei lungi obținute în etapa (18) cu o catenă scurtă complementară cu formarea unei molecule anticorp.

13. Procedeu conform revendicării 12, caracterizat prin aceea că, mai cuprinde etapele:

11. Moleculă anticorp, conform cu oricare dintre revendicările de la 7 până la 11, caracterizată prin aceea că, cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 1, 3, 10, 12, 21, 40, 60, 63, 70, 73, 80, 103 și 105, din numita catenă scurtă compozită, sunt reziduuri donoare suplimentare.

12. Procedeu de preparare a moleculei de anticorp cu afinitate pentru un antigen predeterminat, caracterizat prin aceea că cuprinde următoarele etape:
(12) dacă afinitatea determinată în etapa (11) nu este echivalentă cu cea a anticorpului donor, furnizarea unei catene scurte, după cum se descrie în etapa (9) de mai sus, dar în care cel puțin unul dintre reziduurile de aminoacid 2, 4, 6, 49, 62, 64 până la 69, 98, 99, 101 sunt reziduuri donoare suplimentare, și (13) asocierea catenei scurte obținute în etapa (9) cu o catenă lungă complementară cu formarea unei molecule anticorp.