ES2777305T3

ES2777305T3 - Receptores de antígeno quiméricos específicos de la glicoproteína trofoblástica (5T4, TPBG) para inmunoterapia contra el cáncer

Info

Publication number: ES2777305T3
Application number: ES15757289T
Authority: ES
Inventors: Cècile Schiffer-Mannioui
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2014-09-04
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2035-09-03
Also published as: DK3189073T3; US10759868B2; AU2015310897A1; AU2015310897B2; JP7222954B2; JP2021006033A; CA2959694A1; EP3699188A1; CA2959694C; US11987639B2; JP6810685B2; US20170275374A1; EP3189073B1; EP3189073A1; JP2017527289A; US20200407461A1; WO2016034666A1

Abstract

Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de 5T4 que tiene la estructura polipeptídica V3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-5T4 monoclonal, una región bisagra de CD8a, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de antígeno quiméricos específicos de la glicoproteína trofoblástica (5T4, TPBG ) para inmunoterapia contra el cáncer

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) que son proteínas quiméricas recombinantes que pueden redirigir la especificidad y reactividad de la célula inmunitaria hacia 5T4, una glicoproteína de la superficie celular hallada en la mayoría de células mieloides y usada para diagnosticar tumores sólidos tales como tumores de estómago, colon y ovario, y leucemia linfocítica aguda (LLA) de células B precursoras en pacientes. Los CAR según la invención son particularmente útiles para tratar células malignas que portan el antígeno 5T4, cuando se expresan en células T o células NK. Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética resultantes presentan un alto nivel de especificidad hacia células malignas, lo que confiere seguridad y eficacia para inmunoterapia.

Antecedentes de la invención

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de células T específicas de antígeno autólogas generadas ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones virales y cáncer. Las células T usadas para inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante o bien expansión de células T específicas de antígeno o bien redirección de células T a través de modificación por ingeniería genética (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de células T específicas de antígeno virales es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones virales asociadas a trasplantes y tumores malignos raros relacionados con virus. De manera similar, se ha demostrado que el aislamiento y la transferencia de células T específicas de tumor son exitosos en el tratamiento de melanoma.

Las especificidades novedosas en células T se han generado con éxito a través de la transferencia genética de receptores de células T transgénicas o receptores de antígeno quimérico (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una sola molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), que comprende los fragmentos ligeros y variables de un anticuerpo monoclonal unidos por un ligador flexible. Los restos de unión basados en dominios de ligando o receptor también se han usado con éxito. Los dominios de señalización para los CAR de primera generación se derivan de la región citoplasmática de las cadenas gamma del receptor Fc o CD3zeta . Se ha demostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de las células T. Sin embargo, no pudieron proporcionar una expansión prolongada y una actividad antitumoral in vivo. Los dominios de señalización de moléculas coestimuladoras, así como los dominios transmembrana y bisagra se han añadido para formar CAR de segunda y tercera generación, lo que conduce a algunos ensayos terapéuticos exitosos en seres humanos, en los que las células T podían redirigirse contra células malignas que expresaban CD19 (June et al., 2011). Sin embargo, la combinación particular de dominios de señalización, dominios transmembrana y coestimuladores usados con respecto a scFv de CD19, era más bien específica de antígeno y no puede ampliarse a ningún marcador de antígeno.

Según los datos de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades.

[http://www.cdc.gov/cancer/colorectal/statistics/race.htm], la incidencia de cáncer colorrectal en la población de los EE.UU . durante el año 2011 fue de aproximadamente 50 por cada 100.000 personas para mujeres y de hasta 60 para hombres en la población de personas de raza negra, lo que conduce a una mortalidad del 50%. Esta incidencia sólo ha disminuido en un 10% en la última década.

Un antígeno candidato de inmunoterapias para tumores sólidos, incluyendo el colorrectal, de ovario y gástrico, y también para tumores no sólidos tales como la leucemia linfoblástica aguda (LLA) infantil es la glicoproteína trofoblástica, también conocida como TPBG o 5T4 (UniProt: Q13641). 5T4 a menudo se denomina antígeno oncofetal debido a su expresión en trofoblasto fetal (donde se descubrió por primera vez) o glicoproteína trofoblástica (TPBG). La proteína 5T4 es una glicoproteína transmembrana N-glicosilada de 72 kDa que contiene siete regiones de repetición ricas en leucina (Hole et al, 1988). Se descubrió que el antígeno de 5T4 se expresaba en varios carcinomas incluyendo gástrico (Starzynska et al. 1995), de ovario y carcinoma (Wrigley et al. 1995). Además, el antígeno oncofetal 5T4 se expresa en alto riesgo de recaída de leucemia linfoblástica aguda infantil de células B precursoras (Castro et al. 2012). Tiene una expresión muy limitada en el tejido normal, pero está muy extendido en los tumores malignos en todo su desarrollo (Carsberg et al. 1995).

Por tanto, los presentes inventores han considerado que 5T4 podría ser un antígeno diana valioso para tratar tumores sólidos tales como los tumores colorrectal, de ovario y gástrico, usando células T que expresan CAR.

Guest et al. (2005) describe un estudio sobre el papel de las regiones espaciadoras extracelulares en el diseño de receptores inmunitarios quiméricos (CIR).

Griffiths et al. (2005) describe un estudio sobre la expresión del antígeno oncofetal 5T4 en el carcinoma de células renales usando un receptor quimérico de células T.

Jiang et al. (2006) describe un estudio sobre receptores inmunitarios quiméricos (C IR) contra el antígeno oncofetal 5T4.

Como alternativa a las estrategias anteriores, la presente invención proporciona CAR específicos de 5T4, que pueden expresarse en células inmunitarias para seleccionar como diana células malignas de 5T4 con una ventaja clínica significativa.

Todavía existe la necesidad de mejorar la funcionalidad de CAR mediante el diseño de la arquitectura de CAR y el uso de componentes adecuados, ya que estos parámetros desempeñan un papel importante y puede ser necesario un ajuste fino.

Los inventores han descubierto que, al combinar la arquitectura de CAR con la elección de los componentes adecuados, podían obtener CAR de cadena sencilla de 5T4 específicos con alta citotoxicidad hacia las células diana cancerosas.

Sumario de la invención

Los inventores han generado un CAR específico de 5T4 que tiene una estructura diferente y que comprende un scFV diferente derivado de diferentes anticuerpos específicos de 5T4.

En el marco de la presente invención, han diseñado e implementado un CAR específico de 5T4 que tiene la estructura polipeptídica V3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo monoclonal anti-5T4, una región bisagra de CD8a, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB. Los polipéptidos de CAR preferidos de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 33 y SEQ ID NO. 39. Tras la activación no específica in vitro (por ejemplo, con perlas recubiertas con anticuerpos anti-CD3/CD28 e IL2 recombinante), las células T de los donantes se han transformado con polinucleótidos que expresan estos CAR usando transducción viral. Los polipéptidos de CAR que tienen una estructura polipeptídica seleccionada de V3, V5, V1 (es decir, que tienen el dominio transmembrana de CD8a) han mostrado los mejores e inesperados resultados.

En particular, los CAR específicos de 5T4 que contienen los scFv de los anticuerpos A1, A2, A3 y H8 representan candidatos adecuados para la inmunoterapia tal como se muestra por su actividad y especificidad sometidas a prueba contra líneas celulares tumorales seleccionadas que expresan el antígeno 5T4.

En determinados casos, las células T se modificaron por ingeniería genética adicionalmente para crear células T no alorreactivas, más especialmente mediante la alteración de un componente de TC R (receptores de células T ap) para prevenir la reacción de injerto contra huésped.

Las células T modificadas por ingeniería genética resultantes presentaron reactividad in vitro contra células positivas para 5T4 en diversos grados, lo que demuestra que los CAR de la presente invención contribuyen a la activación dependiente de antígeno, y también a la proliferación, de las células T, haciéndolas útiles para la inmunoterapia. Los polipéptidos y las secuencias de polinucleótidos que codifican para los CAR de la presente invención se detallan en la presente memoria descriptiva.

Las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética de la presente invención son particularmente útiles para aplicaciones terapéuticas, tales como para tratar la leucemia linfocítica crónica o en tumores sólidos tales como tumores de mama, colon, pulmón y riñón.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: representación esquemática de una célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la divulgación. La célula inmunitaria modificada por ingeniería genética presentada en esta figura es una célula T transducida con un polipéptido retroviral que codifica para CAR. Esta célula T se modifica por ingeniería genética adicionalmente para permitir un injerto mejor y más seguro en el paciente, que es opcional dentro del marco de la presente divulgación. El gen X puede ser, por ejemplo, un gen que expresa un componente de TCR (TCRalfa o TCRbeta), Y puede ser un gen implicado en la sensibilidad de las células T a fármacos inmunosupresores como CD52 (con respecto a Campath) o HPRT (con respeto a 6-tioguanina).

Figura 2: representación esquemática de la diferente arquitectura de CAR (V1 a V6).

Figuras 3 a 6: representación esquemática de los CAR de células T v1 a v6 según la figura 2 con las cadenas de VH y VL de los anticuerpos A1, A2, A3 y H8.

Figura 7: prueba de desgranulación de células T para ocho líneas de células T modificadas por ingeniería genética con CAR de 5T4 según la divulgación para evaluar su actividad.

Figura 8: lisis específica de células T para siete líneas de células T modificadas por ingeniería genética con CAR de 5T4 según la divulgación para evaluar su especificidad.

Tabla 1: secuencia de los diferentes componentes de CAR

Tabla 2: secuencia de las cadenas de VH y VL de diferentes scFv y sus respectivas CDR

Tabla 3: CAR de estructura V-1

Tabla 4: CAR de estructura V-2

Tabla 5: CAR de estructura V-3

Tabla 6: CAR de estructura V-4

Tabla 7: CAR de estructura V-5

Tabla 8: CAR de estructura V-6

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan específicamente en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que un experto en la técnica entiende comúnmente en los campos de terapia génica, bioquímica, genética y biología molecular.

Todos los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, describiéndose los métodos y materiales adecuados en el presente documento. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos, a menos que se especifique lo contrario.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, EE.UU .); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente estadounidense n.° 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames y S. J . Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); la serie, Methods in ENZYMOLo Gy (J. Abelson y M. Simon, eds. jefe, Academic Press, Inc., Nueva York), específicamente, vols.154 y 155 (Wu et al. eds.) y vol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller y M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, Londres, 1987); Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986); y Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986).

Receptores de antígeno quimérico específicos de 5T4

La presente invención se refiere a nuevos diseños de receptor de antígeno quimérico (CAR) anti-5T4 que comprende un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un domino de transducción de la señalización, tal como se define en las reivindicaciones.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligopéptido o polipéptido que puede unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como marcador de la superficie celular en células diana asociadas con un estado patológico particular. En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (V ^l) y el pesado (V^h) de un anticuerpo anti-5T4 monoclonal específico de antígeno diana unido por un ligador flexible.

El dominio de unión a antígeno de los CAR de 5T4 de la invención puede ser cualquier dominio que se una al antígeno fuera del tejido incluyendo, pero no se limita a, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional de los mismos.

Por el término “anticuerpo recombinante” tal como se usa en el presente documento, quiere decirse un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se genera usando tecnología de ADN recombinante, tal como, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo expresado por un bacteriófago, un sistema de expresión en levadura o un sistema de expresión en célula de mamífero, y más especialmente por una célula T transducida con un vector viral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para las regiones CDR de un anticuerpo. El término también debe interpretarse como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo y cuya molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o una secuencia de aminoácidos que especifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en el que la secuencia de aminoácidos o de ADN se ha obtenido usando tecnología de secuencia de aminoácidos o de ADN recombinante o sintética que está disponible y se conoce bien en la técnica.

Por el término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento, quiere decirse un anticuerpo producido por un clon celular hecho crecer en laboratorio, o bien de un hibridoma o bien de un linfocito transformado por virus, que es más abundante y uniforme que el anticuerpo natural y puede unirse específicamente a un solo sitio en el antígeno 5T4. Son anticuerpos monoespecíficos que se producen por células inmunitarias idénticas que son todas clones de una célula parental única, a diferencia de los anticuerpos policlonales que se producen a partir de varias células inmunitarias diferentes. Los anticuerpos monoclonales tienen afinidad monovalente, en cuanto a que se unen al mismo epítopo.

En una realización preferida, dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) que comprende el fragmento variable ligero (V ^l) y el pesado (V^h) de un anticuerpo de 5T4 monoclonal específico de antígeno diana unido por un ligador flexible. Dichos V l y Vh se seleccionan preferiblemente de los anticuerpos denominados H8, A1, A2 y A3 tal como se indica en la tabla 2. Se unen preferiblemente entre sí por un ligador flexible que comprende, por ejemplo, la secuencia SEQ ID NO. 10. En otras palabras, dichos CAR comprenden preferentemente un dominio de unión a ligando extracelular que comprende una secuencia polipeptídica que muestra una identidad de al menos el 90%, el 95%, el 97% o el 99% con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 18.

Según una realización preferida, el CAR específico de 5T4 según la presente invención contiene un dominio de unión a ligando extracelular, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 13 (VH de A1) y SEQ ID NO: 14 (VL de A1).

Según otra realización preferida, el CAR específico de 5T4 según la presente invención contiene un dominio de unión a ligando extracelular, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 15 (VH de A2) y SEQ ID NO: 16 (VL de A2).

Según otra realización preferida, el CAR específico de 5T4 según la presente invención contiene un dominio de unión a ligando extracelular, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 17 (VH de A3) y SEQ ID NO: 18 (VL de A3).

Según otra realización preferida, el CAR específico de 5T4 según la presente invención contiene un dominio de unión a ligando extracelular, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con la SEQ ID NO: 11 (VH de H18) y la SEQ ID NO: 12 (VL de H18).

La presente invención da a conocer un receptor de antígeno quimérico específico de 5T4 (CAR de 5T4) tal como anteriormente, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende cadenas de VH y VL que están humanizadas.

Por el término “anticuerpo humanizado” tal como se usa en el presente documento, quiere decirse que los polipéptidos incluyen una región variable de cadena pesada humanizada y una región variable de cadena ligera humanizada. Por ejemplo, los polipéptidos pueden incluir las regiones de entramado (FR ) de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo humano, mientras que conservan sustancialmente la especificidad de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal parental. La región variable de cadena pesada humanizada y/o la región variable de cadena ligera humanizada están humanizadas en al menos aproximadamente el 87%, humanizadas en al menos aproximadamente el 90%, humanizadas en al menos aproximadamente el 95%, humanizadas en al menos aproximadamente el 98% o humanizadas en al menos aproximadamente el 100%, excluyendo las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las moléculas de polipéptidos de unión a antígeno pueden derivarse de donantes de anticuerpos monoclonales (por ejemplo, donantes de anticuerpos monoclonales de ratón) y pueden incluir CDR de los anticuerpos monoclonales (por ejemplo, CDR monoclonales de ratón).

Puede producirse un anticuerpo humanizado usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, injerto de CDR (véase, por ejemplo, la patente europea n.° EP 239.400; la publicación internacional n.° WO 91/09967; y las patentes estadounidenses n.os 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), rebarnizado o rechapado (véanse, por ejemplo, las patentes europeas n.os EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814), intercambio de cadenas (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.565.332) y técnicas dadas a conocer en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0042664, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° US2005/0048617, la patente estadounidense n.° 6.407.213, la patente estadounidense n.° 5.766.886, la publicación internacional n.° W o 9317105. A menudo, los residuos de entramado en las regiones de entramado se sustituirán con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo mejorar, la unión a antígeno. Estas sustituciones de entramado se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos de entramado para identificar los residuos de entramado importantes para la unión a antígeno y la comparación de secuencias para identificar residuos de entramado inusuales en posiciones particulares. (Véase, por ejemplo, Queen et al., patente estadounidense n.° 5.585.089).

Según una realización preferida, el CAR específico de 5T4 de la presente invención comprende cadenas de VH y VL que tienen al menos el 80%, preferiblemente el 90%, más preferiblemente en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende:

- una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H8 de SEQ ID NO. 48 (CDR1), SEQ ID NO. 49 (CDR2) y SEQ ID NO. 50 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H18 de NO. 51 (CDR1), SEQ ID NO. 52 (CDR2) y SEQ ID NO: 53 (CDR3), o;

- una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A1 de SEQ ID NO. 54 (CDR1), SEQ ID NO. 55 (CDR2) y SEQ ID NO. 56 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A1 de NO. 57 (CD r 1), SEQ ID NO. 58 (c Dr 2) y S e Q ID NO: 59 (CDR3), o;

- una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A2 de SEQ ID NO. 61 (CDR1), SEQ ID NO. 61 (CDR2) y SEQ ID NO. 63 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A2 de NO. 64 (CD1), SEQ ID NO. 65 (CD2) y SEQ ID NO: 65 (CDR3), o;

- una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A3 de SEQ ID NO. 66 (CDR1), SEQ ID NO. 67 (CDR2) y SEQ ID NO. 68 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A3 de NO. 69 (CD r 1), SEQ ID NO. 70 (c Dr 2) y S e Q ID NO: 71 (CDR3).

La tabla 2 muestra las secuencias cadenas de VH y VL correspondientes a los anticuerpos anti-5T4 H8, A1, A2 y A3 y de sus respectivas CDR.

El dominio de transducción de señales o el dominio de señalización intracelular de un CAR según la presente invención es responsable de la señalización intracelular tras la unión del dominio de unión a ligando extracelular a la diana, dando como resultado la activación de la célula inmunitaria y la respuesta inmunitaria. En otras palabras, el dominio de transducción de señales es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmunitaria en la que se expresa el CAR. Por ejemplo, la función efectora de una célula T puede ser una actividad citolítica o una actividad cooperadora que incluye la secreción de citocinas. Por tanto, el término “dominio de transducción de señales” se refiere a la porción de una proteína que transduce la señal de función de señal efectora y dirige a la célula para realizar una función especializada.

El dominio de transducción de la señalización del CAR comprende el dominio de señalización CD3zeta que tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, el 95%, el 97% o el 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

El dominio de transducción de señales del CAR de la presente divulgación comprende una molécula de señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmunitaria eficaz. “Ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada por, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de CMH cargada con péptido, media una respuesta de células T, incluyendo, pero no se limita a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, P d-L2, 4-1BBL, OX40L, ligando coestimulador inducible (ICOS-L), molécula de adhesión intercelular (Ic A m , CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de CMH de clase I, BTLA y receptor del ligando Toll. Los ejemplos de moléculas coestimuladoras incluyen CD27, CD28, CD8, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C , B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83.

El dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende un dominio coestimulador de 4-1BB (GenBank: AAA53133.). En particular, el dominio de transducción de señales del CAR de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende una identidad de secuencia de al menos el 70%, preferiblemente de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, el 95%, el 97% o el 99% con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8.

Un CAR según la presente invención se expresa en la membrana superficial de la célula. Por tanto, tal CAR comprende además un dominio transmembrana. Las características distintivas de los dominios transmembrana apropiados comprenden la capacidad de expresarse en la superficie de una célula, preferiblemente en la presente invención, una célula inmunitaria, en particular linfocitos o linfocitos citolíticos naturales (NK), e interactuar en conjunto para dirigir la respuesta celular de una célula inmunitaria contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana del CAR de la presente invención se deriva de la cadena alfa de CD8 humana (por ejemplo, NP_001139345.1). El dominio transmembrana comprende además una región bisagra entre dicho dominio de unión a ligando extracelular y dicho dominio transmembrana. El término “región bisagra” usado en el presente documento significa generalmente cualquier oligopéptido o polipéptido que funcione para unir el dominio transmembrana al dominio de unión a ligando extracelular. En particular, la región bisagra se usa para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. Una región bisagra puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 100 aminoácidos y lo más preferiblemente de 25 a 50 aminoácidos. La región bisagra se deriva de toda o parte de la región extracelular de la cadena alfa de CD8. En una realización preferida, dicho dominio bisagra comprende una parte de la cadena alfa de CD8 humana a la que se hace referencia en esta memoria descriptiva como SEQ ID NO. 4, o polipéptidos bisagra que presentan preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80%, más preferiblemente de al menos el 90%, el 95%, el 97% o el 99% con este polipéptido.

Un CAR según la invención comprende un dominio transmembrana (TM) de CD8a, que muestra preferiblemente una identidad de secuencia de al menos el 80% con el polipéptido de SEQ ID NO. 6.

La regulación por disminución o la mutación de antígenos diana se observa comúnmente en células cancerosas, creando variantes resistentes a pérdida de antígeno. Por tanto, para compensar la resistencia tumoral y hacer que la célula inmunitaria sea más específica para la diana, el CAR específico de 5T4 según la divulgación puede comprender otros dominios de unión a ligando extracelular, para unir simultáneamente diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunitarias. En un caso, los dominios de unión a ligando extracelular pueden colocarse en tándem en el mismo polipéptido transmembrana, y opcionalmente pueden separarse mediante un ligador. En otro caso, dichos dominios de unión a ligando extracelular diferentes pueden colocarse en diferentes polipéptidos transmembrana que componen el CAR. En otro caso, la presente divulgación se refiere a una población de c A r , comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes. En particular, la presente divulgación se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula una población de CAR, comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes. En otro caso particular, la presente divulgación se refiere a un método de modificación por ingeniería genética de una célula inmunitaria que comprende proporcionar una célula inmunitaria e introducir en dicha célula polinucleótidos que codifican para polipéptidos que componen una población de CAR, comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes. Por población de CAR, quiere decirse al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más CAR, comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes. Preferiblemente, los dominios de unión a ligando extracelular diferentes según la presente divulgación pueden unirse simultáneamente a diferentes elementos en la diana, aumentando así la activación y función de las células inmunitarias. La presente divulgación también se refiere a una célula inmunitaria aislada que comprende una población de CAR, comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes.

El CAR específico de 5T4 según la invención tiene una estructura V3 tal como se muestra en la figura 2, que comprende una región bisagra de CD8a y un dominio transmembrana de CD8a.

Polinucleótidos, vectores:

La presente invención también se refiere a polinucleótidos, vectores que codifican para el CAR descrito anteriormente según la invención.

El polinucleótido puede consistir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para su introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector viral tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un vector plasmídico o viral tal como un lentivirus para la transfección de una célula huésped de mamífero).

En una realización particular, las diferentes secuencias de ácido nucleico pueden incluirse en un polinucleótido o vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia de omisión ribosómica tal como una secuencia que codifica para un péptido 2A. Los péptidos 2A, que se identificaron en el subgrupo de picornavirus Aphthovirus, provocan una “omisión” ribosómica de un codón al siguiente sin la formación de un enlace peptídico entre los dos aminoácidos codificados por los codones (véase (Donnelly y Elliott 2001; Atkins, Wills et al.2007; Doronina, Wu et al.2008)). Por “codón” quiere decirse tres nucleótidos en un ARNm (o en la cadena sentido de una molécula de ADN) que se traducen por un ribosoma en un residuo de aminoácido. Por tanto, pueden sintetizarse dos polipéptidos a partir de un único marco abierto de lectura contiguo dentro de un ARNm cuando los polipéptidos están separados por una secuencia de oligopéptido 2A que está en el marco. Tales mecanismos de omisión ribosómica se conocen bien en la técnica y se sabe que se usan por varios vectores para la expresión de varias proteínas codificadas por un solo ARN mensajero.

Para dirigir el polipéptido transmembrana a la ruta secretora de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal secretora (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o secuencia pre) en la secuencia de polinucleótidos o secuencia de vectores. La secuencia de señal secretora está operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico transmembrana, es decir, las dos secuencias se unen en el marco de lectura correcto y se colocan para dirigir el polipéptido recién sintetizado a la ruta secretora de la célula huésped. Las secuencias señal secretoras se colocan comúnmente en el sentido 5' con respecto a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal secretoras pueden colocarse en otra parte de la secuencia de ácido nucleico de interés (véase, por ejemplo, Welch et al., patente estadounidense n.° 5.037.743; Holland et al. patente estadounidense n.° 5.143.830). En una realización preferida, el péptido señal comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y 2.

Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferiblemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención tienen codones optimizados para la expresión en células de mamífero, preferiblemente para la expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que generalmente son raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que generalmente son frecuentes en genes altamente expresados de tales especies, codificando tales codones para los aminoácidos a medida que los codones se van intercambiando.

Métodos de modificación por ingeniería genética de células inmunitarias dotadas de CAR:

La presente divulgación abarca el método de preparación de células inmunitarias para inmunoterapia que comprende introducir ex vivo en dichas células inmunitarias los polinucleótidos o vectores que codifican para uno de los CAR de 5T4 tal como se describió previamente.

Preferiblemente, dichos polinucleótidos se incluyen en vectores lentivirales en vista de expresarse de manera estable en las células inmunitarias.

Dicho método puede comprender además la etapa de modificar genéticamente dicha célula para hacerla más adecuada para el trasplante alogénico.

Según un primer aspecto, la célula inmunitaria puede hacerse alogénica, por ejemplo, inactivando al menos un gen que expresa uno o más componentes del receptor de células T (TCR) tal como se describe en el documento WO 2013/176915, que puede combinarse con la inactivación de un gen que codifica para o regula la expresión de la proteína HLA o p2m. Por consiguiente, el riesgo de síndrome de injerto contra huésped y el rechazo del injerto se reducen significativamente.

Según otro aspecto, las células inmunitarias pueden modificarse genéticamente además para mejorar su resistencia a fármacos inmunosupresores o tratamientos de quimioterapia, que se usan como normas asistenciales para tratar células malignas positivas para 5T4. Por ejemplo, los receptores de CD52 y glucocorticoides (GR), que son dianas farmacológicas de Campath (alemtuzumab) y los tratamientos con glucocorticoides, pueden inactivarse para hacer que las células sean resistentes a estos tratamientos y darles una ventaja competitiva sobre las propias células T del paciente no dotadas de CAR de 5T4 específicos. La expresión del gen CD3 también puede suprimirse o reducirse para conferir resistencia a teplizumab, que es otro fármaco inmunosupresor. La expresión de HPRT también puede suprimirse o reducirse según la invención para conferir resistencia a la 6-tioguanina, un agente citostático que se usa comúnmente en quimioterapia, especialmente para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.

Según otro aspecto de la divulgación, las células inmunitarias pueden manipularse además para hacerlas más activas o limitar el agotamiento, inactivando genes que codifican para proteínas que actúan como “puntos de control inmunitarios” que actúan como reguladores de la activación de células T, tales como PDCD1 o CTLA-4. En la tabla 9 se indican ejemplos de genes, cuya expresión podría reducirse o suprimirse.

Tabla 9: lista de genes que codifican para proteínas de punto de control inmunitario.

Preferiblemente, dicho método de modificación por ingeniería genética adicional de las células inmunitarias implica la introducción de polinucleótidos en dichas células T, en particular ARNm, que codifican para endonucleasa de corte raro específica para inactivar selectivamente los genes, tales como los mencionados anteriormente, por escisión de ADN. En un aspecto más preferido, dichas endonucleasas de corte raro son nucleasas TALE o endonucleasa Cas9. Las nucleasas TAL han demostrado hasta ahora una mayor especificidad y eficacia de escisión con respecto a los otros tipos de endonucleasas de corte raro, lo que las convierte en las endonucleasas de elección para producir células inmunitarias modificadas por ingeniería genética a gran escala con una renovación constante.

Métodos de administración

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la introducción de CAR en una célula. Como ejemplo no limitativo, dicho CAR puede introducirse como transgenes codificados por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico también puede contener un marcador de selección que proporciona identificación y/o selección de células que recibieron dicho vector.

Los polipéptidos pueden sintetizarse in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican para dichos polipéptidos en la célula. Alternativamente, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y luego introducirse en la misma. Los métodos para introducir un constructo de polinucleótido en las células se conocen en la técnica e incluyen, como ejemplos no limitativos, métodos de transformación estable en los que el constructo de polinucleótido se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que el constructo de polinucleótido no se integra en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores virales recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, en vista de expresarse en células.

Células inmunitarias modificadas por ingeniería genética

La presente divulgación también se refiere a células aisladas o líneas celulares susceptibles de obtenerse mediante dicho método para modificar células por ingeniería genética. En particular, dicha célula aislada comprende al menos un CAR tal como se describió anteriormente. En otro caso, dicha célula aislada comprende una población de CAR, comprendiendo cada uno dominios de unión a ligando extracelular diferentes. En particular, dicha célula aislada comprende una secuencia de polinucleótidos exógenos que codifica para CAR. Las células inmunitarias modificadas genéticamente de la presente divulgación se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión a antígeno.

En el alcance de la presente invención también se abarca un sistema inmunitario aislado tal como se define por las reivindicaciones, preferiblemente una célula T obtenida según uno cualquiera de los métodos descritos previamente. Dicha célula inmunitaria se refiere a una célula de origen hematopoyético implicada funcionalmente en el inicio y/o la ejecución de la respuesta inmunitaria innata y/o adaptativa. Dicha célula inmunitaria según la presente invención puede derivarse de una célula madre. Las células madre pueden ser células madre adultas, células madre embrionarias no humanas, más particularmente células madre no humanas, células madre de sangre del cordón umbilical, células progenitoras, células madre de médula ósea, células madre pluripotentes inducidas, células madre totipotentes o células madre hematopoyéticas. Las células humanas representativas son células CD34+. Dicha célula aislada también puede ser una célula dendrítica, una célula dendrítica citolítica, un mastocito, una célula NK, una célula B o una célula T seleccionada del grupo que consiste en linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores. En otra realización, dicha célula puede derivarse del grupo que consiste en linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+. Antes de la expansión y modificación genética de las células, puede obtenerse una fuente de células de un sujeto a través de una variedad de métodos no limitativos. Las células pueden obtenerse de varias fuentes no limitativas, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de los ganglios linfáticos, sangre del cordón umbilical, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, ascitis, derrame pleural, tejido del bazo y tumores. En determinados aspectos, puede usarse cualquier número de líneas de células T disponibles y conocidas por los expertos en la técnica. En otro aspecto, dicha célula puede derivarse de un donante sano, de un paciente diagnosticado con cáncer o de un paciente diagnosticado con una infección. En otro aspecto, dicha célula forma parte de una población mixta de células que presentan diferentes características fenotípicas. En el alcance de la presente divulgación también se incluye una línea celular obtenida de una célula T transformada según el método descrito previamente. Las células modificadas resistentes a un tratamiento inmunosupresor y susceptibles de obtenerse por el método anterior están abarcadas en el alcance de la presente divulgación.

Como aspecto preferido, la presente divulgación proporciona células T o una población de células T dotadas de un CAR de 5T4 tal como se describió anteriormente, que no expresan TCR funcional y que un reactivas hacia las células positivas para 5T4, para su trasplante alogénico en pacientes.

Activación y expansión de células T

Ya sea antes o después de la modificación genética de las células T, incluso si las células inmunitarias modificadas genéticamente de la presente invención se activan y proliferan independientemente de los mecanismos de unión a antígeno, las células inmunitarias, particularmente las células T de la presente invención, pueden activarse adicionalmente y expandirse usando generalmente métodos tal como se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566; 7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 20060121005. Las células T pueden expandirse in vitro.

Generalmente, las células T de la invención se expanden por contacto con un agente que estimula un complejo CD3 TCR y una molécula coestimuladora en la superficie de las células T para crear una señal de activación para la célula T. Por ejemplo, pueden usarse productos químicos como ionóforo de calcio A23187, 12-miristato y 13-acetato de forbol (PMA) o lectinas mitógenas como fitohemaglutinina (PHA) para crear una señal de activación para la célula T.

Como ejemplos no limitativos, las poblaciones de células T pueden estimularse in vitro tal como por contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o por contacto con un activador de la proteína cinasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para la coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se usa un ligando que se une a la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede ponerse en contacto con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Las condiciones apropiadas para el cultivo de células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, medio esencial mínimo o medio RPMI 1640 o, X-vivo 5, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para la proliferación y la viabilidad, incluyendo suero (por ejemplo, suero fetal bovino o humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, 1L-4, 1L-7, GM-CSF, -10, - 2, 1L-15, TGFp y TNF- o cualquier otro aditivo para el crecimiento de células conocido por el experto en la técnica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensioactivo, plasmanato y agentes reductores tales como N-acetilcisteína y 2-mercaptoetanol.

Los medios pueden incluir RPMI 1640, A1M-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 1 y X-Vivo 20, Optimizer, con aminoácidos añadidos, piruvato de sodio y vitaminas, o bien sin suero o bien complementados con una cantidad apropiada de suero (o plasma) o un conjunto definido de hormonas, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y la expansión de células T. Los antibióticos, por ejemplo, penicilina y estreptomicina, se incluyen sólo en cultivos experimentales, no en cultivos de células que se infunden en un sujeto. Las células diana se mantienen en condiciones necesarias para soportar el crecimiento, por ejemplo, una temperatura apropiada (por ejemplo, 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más el 5% de C02). Las células T que se han expuesto a tiempos de estimulación variados pueden presentar características diferentes.

En otro aspecto particular, dichas células pueden expandirse mediante cultivo conjunto con tejido o células.

Aplicaciones terapéuticas

En otro aspecto, la célula aislada obtenida mediante los diferentes métodos o la línea celular derivada de dicha célula aislada tal como se describió previamente se prevén para su uso como medicamento. En otro aspecto, dicho medicamento puede ser para su uso en el tratamiento de cáncer, particularmente para su uso en el tratamiento de carcinoma y leucemia en un paciente que lo necesita. En otro aspecto, dicha célula aislada según la invención o línea celular derivada de dicha célula aislada puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cáncer en un paciente que lo necesita.

Dicho tratamiento puede ser de mejora, curativo o profiláctico. Puede formar o bien parte de una inmunoterapia autóloga o bien parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo, quiere decirse que las células, la línea celular o la población de células usadas para tratar pacientes se originan a partir de dicho paciente o de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico quiere decirse que las células o la población de células usadas para tratar pacientes no se originan a partir de dicho paciente sino de un donante.

Dicho tratamiento puede ser útil para tratar pacientes diagnosticados en los que un estado de cáncer premaligno o maligno caracterizado por células que expresan 5T4, especialmente por un exceso de células que expresan 5T4. Tales estados se encuentran en cánceres sólidos o en cánceres hematológicos, tales como leucemia linfoblástica aguda infantil de células B precursoras.

Los tumores sólidos pueden ser tumores gástricos, tumores colorrectales, tumores de próstata, tumores de mama, tumores de pulmón, tumores renales o tumores de ovario.

Más específicamente, dicho tratamiento puede ser útil para el cáncer de próstata progresivo resistente a hormonas en combinación o no de fármaco(s) tal(es) como docetaxel o factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF).

Además, la célula T modificada por ingeniería genética de la invención puede ser útil para tratar tumores sólidos avanzados tales como cáncer de pulmón de células no pequeñas, carcinoma renal de células claras o cáncer de páncreas, junto con otro(s) fármaco(s) tal(es) como interleucina-2 (IL-2), docetaxel o pemetrexed/cisplatino.

Además, la célula T modificada por ingeniería genética de la invención puede ser útil para tratar cáncer de próstata con o sin ciclofosfamida.

El trastorno linfoproliferativo puede ser leucemia, en particular leucemia linfoblástica aguda infantil de células B precursoras.

Los cánceres que pueden tratarse pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, que incluyen, pero no se limitan a, LLA de células B precursoras (indicación pediátrica), LLA adulta, linfoma de células del manto, linfoma difuso de células B grandes y similares. Los tipos de cánceres que van a tratarse con los CAR de la invención incluyen, pero no se limitan a, leucemia o tumores malignos linfoides. También se incluyen tumores/cánceres adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Además, los tumores sólidos tales como tumores de estómago, colon y ovario pueden tratarse mediante los CAR de la invención

El tratamiento con las células inmunitarias modificadas por ingeniería genética según la invención puede combinarse con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia con citocinas, terapia con células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

Según una realización preferida de la invención, dicho tratamiento puede administrarse a pacientes sometidos a un tratamiento inmunosupresor. De hecho, la presente invención se basa preferiblemente en células o una población de células, que se han hecho resistentes a al menos un agente inmunosupresor debido a la inactivación de un gen que codifica para un receptor para tal agente inmunosupresor. En este aspecto, el tratamiento inmunosupresor debería ayudar a la selección y expansión de las células T según la invención dentro del paciente.

La administración de las células o la población de células según la presente invención puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente, incluyendo mediante inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implantación o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intranodal, intramedular, intramuscular, mediante inyección intravenosa o intralinfática o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención son preferiblemente para administración mediante inyección intravenosa.

La administración de las células o la población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferiblemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros de números de células dentro de esos intervalos. Las células o la población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como una única dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis durante un periodo de tiempo. El momento de la administración está dentro del criterio del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o la población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o estados particulares dentro de la habilidad de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosificación administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

En otra realización, dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende esas células se administran por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

En determinadas realizaciones de la presente invención, las células son para su administración a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o tras) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, que incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, tratamiento con citarabina (también conocida como ARA-C) o nataliziimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En realizaciones adicionales, las células T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias con anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben o bien la fosfatasa dependiente de calcio calcineurina (ciclosporina y FK506) o bien inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factores de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991; Liu, Albers et al. 1992; Bierer, Hollander et al. 1993). Las composiciones celulares pueden ser para su administración a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o tras) trasplante de médula ósea, terapia de ablación de células T usando o bien agentes quimioterápicos tales como fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida, o bien anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. Las composiciones celulares pueden ser para su administración después de una terapia ablativa de células B, tales como agentes que reaccionan con c D20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, los sujetos pueden someterse a un tratamiento convencional con dosis altas de quimioterapia seguido de trasplante de células madre de sangre periférica. Tras el trasplante, los sujetos pueden recibir una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas son para su administración antes o tras la cirugía.

Otras definiciones

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento según el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa residuo de Gln o glutamina, R significa residuo de Arg o arginina y D significa residuo de Asp o ácido aspártico.

- La sustitución de aminoácidos significa el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, por ejemplo, el reemplazo de un residuo de arginina por un residuo de glutamina en una secuencia peptídica es una sustitución de aminoácidos.

- Los nucleótidos se designan de la siguiente manera: se usa el código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- “Tal como se usa en el presente documento, ácido nucleico” o “polinucleótidos” se refiere a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligamiento, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden componerse de monómeros que son nucleótidos que se producen de manera natural (tales como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos que se producen de manera natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo por halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse por estructuras estérica y electrónicamente similares, tales como aza-azúcares y análogos de azúcar carbocíclico. Los ejemplos de modificaciones en un resto de base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden unirse por enlaces fosfodiéster o análogos de tales uniones. Los ácidos nucleicos pueden ser o bien monocatenarios o bien bicatenarios.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) quiere decirse moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular de activación del receptor de células T para generar una proteína quimérica que presenta una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. En general, el CAR consiste en un anticuerpo extracelular de cadena sencilla (scFvFc), fusionado con el dominio de señalización intracelular de la cadena zeta compleja del receptor de antígeno de células T (scFvFc:Q y tiene la capacidad, cuando se expresa en células T, de redirigir el reconocimiento de antígeno basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal. El CAR a veces puede comprender múltiples polipéptidos transmembrana (CAR multicadena) tal como se describe en el documento WO2014039523. Un ejemplo de CAR usado en la presente divulgación es un CAR que se dirige contra el antígeno de 5T4 y puede comprender como ejemplo no limitativo las secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 19 a 42.

- El término “endonucleasa” se refiere a cualquier enzima silvestre o variante que puede catalizar la hidrólisis (escisión) de enlaces entre ácidos nucleicos dentro de una molécula de ADN o ARN, preferiblemente una molécula de ADN. Las endonucleasas no escinden la molécula de ADN o ARN independientemente de su secuencia, pero reconocen y escinden la molécula de ADN o ARN en secuencias de polinucleótidos específicas, también denominadas “secuencias diana” o “sitios diana”. Las endonucleasas pueden clasificarse como endonucleasas de corte raro cuando tienen normalmente un sitio de reconocimiento de polinucleótidos mayor de 12 pares de bases (pb) de longitud, más preferiblemente de 14-55 pb. Las endonucleasas de corte raro aumentan significativamente HR al inducir roturas de doble cadena de ADN (DSB) en un locus definido (Perrin, Buckle et al. 1993; Rouet, Smih et al. 1994; Choulika, Perrin et al. 1995; Pingoud y Silva 2007). Las endonucleasas de corte raro pueden ser, por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento (Paques y Duchateau 2007), una nucleasa quimérica de dedos de zinc (ZFN) resultante de la fusión de dominios de dedos de zinc modificados por ingeniería genética con el dominio catalítico de una enzima de restricción tal como Fokl (Porteus y Carroll 2005), una endonucleasa Cas9 del sistema C R ISP R (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al.

2013) o una endonucleasa química (Eisenschmidt, Lanio et al.2005; Arimondo, Thomas et al.2006). En las endonucleasas químicas, se conjuga un agente escisión químico o peptídico con un polímero de ácidos nucleicos o con otro ADN que reconoce una secuencia diana específica, dirigiendo así la actividad de escisión a una secuencia específica. Las endonucleasas químicas también abarcan nucleasas sintéticas como conjugados de ortofenantrolina, una molécula de escisión de ADN y oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO), conocidos por unirse a secuencias de ADN específicas (Kalish y Glazer 2005). Tales endonucleasas químicas están comprendidas en el término “endonucleasa”.

- Por una “nucleasa TA LE” (TALEN) quiere decirse una proteína de fusión que consiste en un dominio de unión a ácido nucleico derivado normalmente de un efector de tipo activador de la transcripción (TALE) y un dominio catalítico de nucleasa para escindir una secuencia diana de ácido nucleico. El dominio catalítico es preferiblemente un dominio de nucleasa y más preferiblemente un dominio que tiene actividad de endonucleasa, como por ejemplo I-Tevl, ColE7, NucA y Fok-I. En particular, el dominio TALE puede fusionarse con una meganucleasa como, por ejemplo, I-Crel e I-Onul, o una variante funcional de las mismas. En un ejemplo más preferido, dicha nucleasa es una nucleasa TALE monomérica. Una nucleasa TALE monomérica es una nucleasa TALE que no requiere dimerización para el reconocimiento y la escisión específicos, tal como las fusiones de repeticiones TAL modificadas por ingeniería genética con el dominio catalítico de I-Tevl descritas en el documento WO2012138927. El efector de tipo activador de la transcripción (TALE) son proteínas de la especie bacteriana Xanthomonas que comprenden una pluralidad de secuencias de repetición, comprendiendo cada repetición di-residuos en la posición 12 y 13 (RVD) que son específicos para cada base de nucleótidos de la secuencia dirigida a ácido nucleico. Los dominios de unión con propiedades de unión a ácido nucleico modulares base por base similares (MBBBD) también pueden derivarse de nuevas proteínas modulares descubiertas recientemente por el solicitante en una especie bacteriana diferente. Las nuevas proteínas modulares tienen la ventaja de mostrar más variabilidad de secuencia que las repeticiones TAL. Preferiblemente, los RVD asociados con el reconocimiento de los diferentes nucleótidos son HD para reconocer C, NG para reconocer T, NI para reconocer A, NN para reconocer G o A, NS para reconocer A, C, G o T, HG para reconocer T, IG para reconocer T, NK para reconocer G, HA para reconocer C, ND para reconocer C, HI para reconocer C, HN para reconocer G, NA para reconocer G, SN para reconocer G o A e YG para reconocer T, TL para reconocer A, VT para reconocer A o G y SW para reconocer A. Los aminoácidos 12 y 13 críticos pueden mutarse hacia otros residuos de aminoácidos para modular su especificidad hacia los nucleótidos A, T, C y G y, en particular, para mejorar esta especificidad. La nucleasa TALE ya se ha descrito y usado para estimular el direccionamiento génico y modificaciones génicas (Boch, Scholze et al. 2009; Moscou y Bogdanove 2009; Christian, Cermak et al.

2010; Li, Huang et al. 2011). Las nucleasas TAL personalizadas están disponibles comercialmente con el nombre comercial TALEN ™ (Cellectis, 8 rue de la Croix Jarry, 75013 París, Francia).

La endonucleasa de corte raro también puede ser una endonucleasa Cas9. Recientemente, se ha desarrollado una nueva herramienta de modificación por ingeniería genética del genoma basada en la nucleasa Cas9 guiada por ARN (Gasiunas, Barrangou et al. 2012; Jinek, Chylinski et al. 2012; Cong, Ran et al. 2013; Mali, Yang et al. 2013 ) del sistema inmunitario adaptativo C R ISP R procariota tipo II (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) (véase para una revisión (Sorek, Lawrence et al. 2013)). El sistema asociado a C R ISP R (Cas) se descubrió por primera vez en bacterias y funciona como una defensa contra el ADN foráneo, o bien viral o bien plasmídico. La modificación por ingeniería genética del genoma mediada por C R ISP R procede en primer lugar mediante la selección de la secuencia diana a menudo flanqueada por un motivo de secuencia corta, denominado motivo adyacente protoespaciador (PAM). Tras la selección de la secuencia diana, se diseña un ARNcr específico, complementario a esta secuencia diana. El ARNcr de transactivación (ARNtracr) requerido en los sistemas C R ISPR tipo II apareados con el ARNcr y unidos a la proteína Cas9 proporcionada. Cas9 actúa como un ancla molecular que facilita el apareamiento de bases de ARNtracr con ARNc (Deltcheva, Chylinski et al. 2011). En este complejo ternario, la estructura dual ARNtracr:ARNcr actúa como ARN guía que dirige la endonucleasa Cas9 a la secuencia diana relacionada. El reconocimiento de la diana por el complejo Cas9-ARNtracr:ARNcr se inicia examinando la secuencia diana para determinar la homología entre la secuencia diana y el ARNcr. Además de la complementariedad de la secuencia diana-ARNc, el direccionamiento de ADN requiere la presencia de un motivo corto adyacente al protoespaciador (motivo adyacente protoespaciador, PAM). Tras el apareamiento entre el ARN dual y la secuencia diana, Cas9 introduce posteriormente una rotura de cadena doble roma 3 bases en el sentido de 5' del motivo PAM (Garneau, Dupuis et al. 2010).

La endonucleasa de corte raro puede ser una endonucleasa de asentamiento, también conocida con el nombre de meganucleasa. Tales endonucleasas de asentamiento se conocen bien en la técnica (Stoddard 2005). Las endonucleasas de asentamiento reconocen una secuencia diana de ADN y generan una rotura de cadena sencilla o doble. Las endonucleasas de asentamiento son altamente específicas, reconocen sitios diana de ADN que oscilan entre 12 y 45 pares de bases (pb) de longitud, generalmente de 14 a 40 pb de longitud. La endonucleasa de asentamiento puede corresponder, por ejemplo, a una endonucleasa LAGLIDADG, a una endonucleasa HNH o a una endonucleasa GIY-YIG. La endonucleasa de asentamiento preferida puede ser una variante de I-Crel.

- Por “vector de administración” o “vectores de administración” quiere decirse cualquier vector de administración que puede usarse en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, “poner en contacto”) o administrar dentro de células o compartimentos subcelulares (es decir, “introducir”) agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero no se limita a, vectores de administración de liposomas, vectores de administración de virus, vectores de administración de fármacos, portadores químicos, portadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste para ecografía), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de administración permiten la administración de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de administración son portadores de moléculas. Por “vector de administración” o “vectores de administración” también quiere decirse métodos de administración para realizar la transfección.

- Los términos “vector” o “vectores” se refieren a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un “vector” incluye, pero no se limita a, un vector viral, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en ácidos nucleicos cromosómicos, no cromosómicos, semisintéticos o sintéticos. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Los vectores virales incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN bicatenario que incluyen adenovirus, herpesvirus (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y poxvirus (por ejemplo, virus vacuna, viruela aviar y viruela de canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosis-sarcoma aviar, virus de tipo C, virus de tipo B, virus de tipo D de mamífero, grupo HTLV-BLV, lentivirus, spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, tercera edición, B. N. Fields, et al., eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por “vector lentiviral” quiere decirse vectores lentivirales basados en VIH que son muy prometedores para la inserción de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, inmunogenicidad reducida y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficacia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales se generan generalmente después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envuelta y transferencia) o más plásmidos en las células productoras. Al igual que el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de las glicoproteínas de la superficie virales con los receptores en la superficie celular. En la entrada, el ARN viral se somete a transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa viral. El producto de la transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por “vectores lentivirales integradores (o LV)” quiere decirse tales vectores como ejemplo no limitativo, que pueden integrarse en el genoma de una célula diana. Por el contrario, por “vectores lentivirales no integradores (o NILV)” quiere decirse vectores de inserción de genes eficaces que no se integran en el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores y vectores de administración pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular tal como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- Por célula o células quiere decirse cualquier célula viva eucariota, célula primaria y línea celular derivada de estos organismos para cultivos in vitro.

- Por “célula primaria” o “células primarias” quiere decirse células tomadas directamente de tejido vivo (es decir, material de biopsia) y establecidas para el crecimiento in vitro, que han sufrido muy pocas duplicaciones de población y, por tanto, son más representativas de los principales componentes funcionales y características de tejidos de los que se derivan, en comparación con líneas celulares tumorigénicas continuas o inmortalizadas artificialmente.

Como ejemplos no limitativos, las líneas celulares pueden seleccionarse del grupo que consiste en células CHO-K1; células HEK293; células Caco2; células U2-OS; células NIH 3T3; células NSO; células SP2; células CHO-S; células DG44; células K-562, células U-937; células MRC5; células IMR90; células Jurkat; células HepG2; células HeLa; células HT-1080; células HCT-116; células Hu-h7; células Huvec; células Molt 4.

Todas estas líneas celulares pueden modificarse mediante el método de la presente divulgación para proporcionar modelos de líneas celulares para producir, expresar, cuantificar, detectar, estudiar un gen o una proteína de interés; estos modelos también pueden usarse para examinar moléculas biológicamente activas de interés en investigación y producción y diversos campos como la química, los biocombustibles, la terapéutica y la agronomía como ejemplos no limitativos.

- por “mutación” quiere decirse la sustitución, deleción, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar a la secuencia de codificación de un gen o su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- por “variante(s)”, quiere decirse una variante de repetición, una variante, una variante de unión a ADN, una variante de nucleasa TALE, una variante de polipéptido obtenida por mutación o reemplazo de al menos un residuo en la secuencia de aminoácidos de la molécula progenitora.

- por “variante funcional” quiere decirse un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína; tal mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína progenitora o dominio de proteína o propiedades adicionales, o actividad más alta o más baja.

- “identidad” se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos es una función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Pueden usarse diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin), y pueden usarse con, por ejemplo, la configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen una identidad de al menos el 70%, el 85%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que presentan preferiblemente de manera sustancial las mismas funciones, así como polinucleótido que codifica para dichos polipéptidos. A menos que se indique lo contrario, una puntuación de similitud se basará en el uso de BLOSUM62. Cuando se usa BLASTP, el porcentaje de similitud se basa en la puntuación positiva de BLASTP y el porcentaje de identidad de secuencia se basa en la puntuación de identidad de BLASTP. Las “identidades” de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos totales en los pares de secuencia de alta puntuación que son idénticos; y los “positivos” de BLASTP muestra el número y la fracción de residuos para los que las puntuaciones de alineación tienen valores positivos y que son similares entre sí. Las secuencias de aminoácidos que tienen estos grados de identidad o similitud o cualquier grado intermedio de identidad de similitud con las secuencias de aminoácidos dadas a conocer en el presente documento se contemplan y abarcan por esta divulgación. Las secuencias de polinucleótidos de polipéptidos similares se deducen usando el código genético y pueden obtenerse por medios convencionales, en particular mediante traducción inversa de su secuencia de aminoácidos usando el código genético.

- “dominio de transducción de señales” o “ligando coestimulador” se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora relacionada en una célula T, proporcionando así una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de CMH cargada con péptido, media una respuesta de células T, que incluye, pero no se limita a, activación de la proliferación, diferenciación y similares. Un ligando coestimulador puede incluir, pero no se limita a, CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, igando coestimulador inducible (ICOS-L) , molécula de adhesión intercelular (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, M1CB, HVEM, receptor de linfotoxina beta, 3/TR6, ILT3, ILT4, un agonista o anticuerpo que se une al receptor del ligando Toll y un ligando que se une específicamente con B7-H3. Un ligando coestimulador también abarca, entre otros, un anticuerpo que se une específicamente con una molécula coestimuladora presente en una célula T, tal como, pero sin limitarse a, CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno 1 asociado a función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que se une específicamente con CD83.

Una “molécula coestimuladora” se refiere a la pareja de unión relacionada en una célula T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así la célula una respuesta coestimuladora, tal como, pero sin limitarse a, proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero no se limitan a, una molécula de CMH de clase I, BTLA y receptor del ligando Toll.

Una “señal coestimuladora” tal como se usa en el presente documento, se refiere a una señal que, en combinación con la señal primaria, tal como el ligamiento de TCR/CD3, conduce a la proliferación de células T y/o a la regulación por incremento o regulación por disminución de moléculas clave.

El término “dominio de unión a ligando extracelular” tal como se usa en el presente documento se define como un oligopéptido o polipéptido que puede unirse a un ligando. Preferiblemente, el dominio podrá interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de la superficie celular en las células diana asociadas con un

estado patológico particular. Así, los ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen aquellos asociados con infecciones virales, bacterianas y parasitarias, enfermedades autoinmunitarias y células cancerosas.

El término “sujeto” o “paciente” tal como se usa en el presente documento incluye todos los miembros del reino animal, incluyendo primates no humanos y seres humanos.

La descripción escrita anterior de la invención proporciona una manera y un procedimiento de elaborarla y usarla de manera que cualquier persona experta en esta técnica pueda elaborarla y usarla, proporcionándose esta habilitación

en particular para el contenido de las reivindicaciones adjuntas, que constituyen una parte de la descripción original.

Cuando se establece un límite o intervalo numérico en el presente documento, se incluyen los extremos. Además, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si estuvieran explícitamente escritos.

La descripción anterior se presenta para permitir a una persona experta en la técnica elaborar y usar la invención, y

se proporciona en el contexto de una aplicación particular y sus requisitos. Diversas modificaciones a las realizaciones preferidas serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, y los principios genéricos definidos en el presente documento pueden aplicarse a otras realizaciones. En el sentido más amplio, el alcance de

la invención es tal como se define en las reivindicaciones.

Habiendo descrito en general esta invención, puede obtenerse una comprensión adicional por referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento sólo con fines ilustrativos.

Ejemplos

Materiales y métodos

Células primarias

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica por centrifugación por gradiente de densidad a partir de

capas leucocitarias de donantes voluntarios sanos (Etablissement Frangais du Sang). Luego se purificaron linfocitos

T usando el kit de enriquecimiento de células T humanas EasySep (Stemcell Technologies), y se activaron con Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Life Technologies) en medio X-vivo 15 (Lonza) complementado con IL-2

20 ng/ml (Miltenyi) y suero AB humano al 5% (Seralab).

Líneas celulares

Se obtuvieron las líneas celulares HCT116, MCF-7, SK-MEL-28 y Daudi de la Colección Americana de Cultivos Tipo.

Las células HCT116 se cultivaron en McCoy complementado con FC S inactivado por calor al 10%, L-glutamina

2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Las células MCF-7 se cultivaron en DMEM complementado con FC S inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml e insulina humana 0,01 mg/ml. Las células SK-MEL-28 se cultivaron en MEM complementado con FC S inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml. Las células Daudi se cultivaron en RPMI 1640 complementado con FC S inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2 mmol/l y penicilina 100 unidades/ml, y estreptomicina 100 |ig/ml.

Síntesis y clonación de secuencias que codifican para scCAR

Las secuencias de ADN que codifican para los scCAR se sintetizaron mediante GenScript y se clonaron en un plásmido que contenía el promotor T7 para la síntesis in vitro de ARNm de CAR.

Síntesis in vitro de ARNm de CAR

Se sintetizó ARNm que codifica para los scCAR usando como moldes plásmidos linealizados en los que la secuencia que codifica para los CAR está bajo el control del promotor T7. La transcripción y poliadenilación in vitro

se realizaron usando el kit mMessage mMachine T7 Ultra (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante.

Los ARN se purificaron con columnas RNeasy (Qiagen), se eluyeron en medio de citoporación T (Harvard Apparatus) y se cuantificaron midiendo la absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000.

La calidad del ARN se verificó en un gel de agarosa de formaldehído/MOPS desnaturalizante.

Electroporación de ARN de células T

Después de un periodo de 11-12 días de activación, los linfocitos T se transfectaron mediante electrotransferencia

de ARN mensajero usando un sistema AgilePulse MAX (Harvard Apparatus). Tras la eliminación de las perlas de activación, se sedimentaron las células, volvieron a suspenderse en medio de citoporación T a 25x106 células/ml. Se mezclaron 5x106 células con 15 |ng del ARNm que codifica para el scCAR en una cubeta de 0,4 cm. La electroporación consistió en dos pulsos de 0,1 ms a 1200 V seguido por cuatro pulsos de 0,2 ms a 130 V. Tras la electroporación, las células se diluyeron en medio de cultivo y se incubaron a 37°C/el 5% de CO ².

Ensayo de desgranulación

Se cultivó conjuntamente un lote de 5 x 104 células T con 5 x 104 células positivas para 5T4 (MCF7 o HCT116) o negativas para 5T4 (Daudi) en 0,1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. Se añadió anticuerpo anti-CD107a marcado con APC (BD Biosciences) al comienzo del cultivo conjunto además de 1 |ng/ml de anticuerpo anti-CD49d (BD Biosciences), 1 |ng/ml de anticuerpo anti-CD28 (Miltenyi) y 1x disolución de monensina (eBioscience). Después de una incubación de 6 h, las células se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (eBioscience) y anticuerpo anti-CD8 marcado con VioBlue (Miltenyi) y se analizaron usando el citómetro de flujo MACsQuant (Miltenyi). Las células T citotóxicas desgranulantes corresponden a células CD8+CD107a+.

Ensayo de citotoxicidad

Se marcaron células positivas y negativas para 5T4, respectivamente, con CellTrace C FS E y CellTrace Violet. Se cultivó conjuntamente un lote de 2 x 104 células positivas para 5T4 (MCF7 o HCT116) con 2 x 104 células negativas para 5T4 (SKM EL28) con 4 x 105 células T en 0.1 ml por pocillo en una placa de 96 pocillos. Después de una incubación de 4 horas, las células se recogieron y se tiñeron con un colorante de viabilidad fijable (eBioscience) y se analizaron usando el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi).

El porcentaje de lisis específica se calculó usando la siguiente fórmula:

% de células diana viables t ras el cultivo conjunto con células T modificadas con CAR % de lisis celular = 100% - % de células de control viables t ras el cultivo conjunto con células T modificadas con CAR % de células diana viables t ras el cultivo conjunto con células T no modificadas % de células de control viables tras el cultivo conjunto con células T no modificadas

Ejemplo 1: proliferación de células inactivadas con TCRalfa que expresan un CAR de 5T4.

Se diseñó y produjo nucleasa TALE heterodimérica dirigida a dos secuencias de 17 pb de longitud (denominadas medias dianas) separadas por un espaciador de 15 pb dentro del gen de la región constante de cadena alfa del receptor de células T (TRAC). Cada media diana se reconoce por repeticiones de las medias nucleasas TALE enumeradas en la tabla 10

Tabla 10: nucleasas TAL que seleccionan como diana el gen TCRalfa

Cada constructo de nucleasa TALE se subclonó usando digestión con enzimas de restricción en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor T7. El ARNm que codifica para la secuencia genómica TRAC de escisión de nucleasa TALE se sintetizó a partir del plásmido que portaba la secuencia codificante en el sentido 3’ del promotor T7.

Las células T purificadas activadas previamente durante 72 horas con perlas recubiertas con anticuerpo anti-CD3/CD28 se transfectaron con cada uno de los 2 ARNm que codifican para las dos medias nucleasas TALE T R A C _T 01.48 horas después de la transfección, diferentes grupos de células T del mismo donante se transdujeron, respectivamente, con un vector lentiviral que codifica para uno de los CAR de 5T4 descritos anteriormente (s E q ID NO: 19 a 42). 2 días después de la transducción, se purificaron células CD3NEG usando perlas magnéticas anti-CD3, y 5 días después de la transducción, las células se reactivaron con anticuerpo anti-CD28 soluble (5 ^g/ml).

La proliferación celular se siguió durante hasta 30 días después de la reactivación contando las células 2 veces por semana. Se observó un aumento de la proliferación en células inactivadas por TC R alfa que expresan los CAR de 5T4, especialmente cuando se reactivaron con anticuerpo anti-CD28, en comparación con células no transducidas. Para investigar si las células T humanas que expresan el CAR de 5T4 presentan estado activado, la expresión del marcador de activación CD25 se analiza mediante FACS 7 días después de la transducción. Las células purificadas transducidas con el vector lentiviral que codifica para CAR de 5T4 se sometieron a ensayo para determinar la expresión de CD25 en su superficie para evaluar su activación en comparación con las células no transducidas. Se espera un aumento de la expresión de CD25 tanto en condiciones de reactivación de CD28 como de ausencia de reactivación.

Ejemplo 2: selección de línea celular positiva y negativa para 5T4

Se examinaron ocho líneas celulares humanas para determinar la expresión de 5T4 mediante inmunotransferencia de tipo Western y citometría de flujo (véase la tabla 11 a continuación).

Tabla 11: expresión de antígeno de 5T4 en 8 líneas celulares humanas

No se detectó 5T4 en extractos de células Daudi (ATCC CCL-213), SupT1 (ATT CRL-1942) y SK-MEL-28 (ATCC HTB-72), pero se detectó en extractos de células MCF7 (ATCC HTB-22), HCT116 (ATCC CCL-247), MKN45 (JCRB0254) y LS174T (ATCC CL-188). Entre las células que resultaron positivas para el antígeno de 5T4 después del análisis de inmunotransferencia de tipo Western, sólo se encontraron dos que expresaban 5T4 en la superficie celular: células MCF7 y HCT116, expresando MCF7 los niveles más altos de antígeno de 5T4 que las células HCT116.

Ejemplo 3: generación de scCAR anti-5T4

Se crearon CAR de cadena sencilla de segunda generación específicos de 5T4 (mostrados esquemáticamente en las figuras 3 a 6 y y en la tabla 3 a la tabla 6) combinando las secuencias de 4 scFv diferentes con las secuencias de 3 espaciadores diferentes, 2 dominios transmembrana diferentes, 1 dominio coestimulador y 1 dominio estimulador tal como se representa en la figura 2.

Las secuencias usadas en los CAR (presentados en la tabla 1 y la tabla 2) se derivan de:

- los anticuerpos H8, A1, A2 o A3 para el scFv;

- las moléculas IgG1, FceRIIIy o CD8a para el dominio espaciador;

- las moléculas CD8a o 4-1BB para el dominio transmembrana;

- la molécula 4-1BB para el dominio coestimulador;

- la molécula CD3^ para el dominio estimulador.

Ejemplo 4: prueba in vitro de scCAR anti-5T4

Para evaluar la actividad de los CAR de cadena sencilla específicos de 5T4, se activaron células T humanas de voluntarios sanos con perlas CD3/CD28 y, once días tras la activación, se sometieron a electroporación con ARNm que codifica para los CAR. La actividad y la especificidad de los CAR se analizaron 1-2 días después de la transfección midiendo la desgranulación de células T y la citotoxicidad de células T contra células diana positivas y negativas para 5T4.

Los resultados se presentan a continuación para la prueba en un caso (N=1), sin embargo, se realizaron experimentos en otros dos casos que mostraron resultados similares (no mostrados).

La figura 7 muestra que todos los CAR sometidos a prueba indujeron un nivel significativo (>20%) de desgranulación de células T tras el cultivo conjunto con MCF7, pero no tras el cultivo conjunto con células Daudi. Entre los ocho CAR sometidos a prueba, siete también pudieron mediar la desgranulación de células T tras el cultivo conjunto con células HCT116, una línea celular que expresa un nivel más bajo de 5T4 que MCF7.

La figura 8 muestra que todas las células T modificadas con los CAR v3 de A1, v5 de A1, v3 de A2, v5 de A2, v3 de A3, v2 de H8 y v3 de H8 lisaron significativa y específicamente las células MCF7. Las células T modificadas con los CAR v3 de A1, v5 de A1, v3 de A2, v5 de A2, v3 de A3 y v3 de H8 también pudieron lisar las células HCT116, una línea celular que expresa un nivel más bajo de 5T4 que las células MCF7.

Ejemplos de secuencias polipeptídicas de CAR:

Las secuencias enmarcadas corresponden a las secuencias de VH y VL preferidas. VH y VL pueden intercambiarse para mejorar la eficacia del CAR.

v1 de H8

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v2 de H8

v3 de H8

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v4 de H8

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v5 de H8

v i de A1

v3 de A i

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v4 de A i

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v5 de A1

v i de A2

v3 de A2

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v4 de A2

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v5 de A2

v i de A3

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v2 de A3

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v3 de A3

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v4 de A3

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v5 de A3

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de 5T4 que tiene la estructura polipeptídica V3 tal como se ilustra en la figura 2, comprendiendo dicha estructura un dominio de unión a ligando extracelular que comprende VH y VL de un anticuerpo anti-5T4 monoclonal, una región bisagra de CD8a, un dominio transmembrana de CD8a y un dominio citoplasmático que incluye un dominio de señalización CD3 zeta y un dominio coestimulador de 4-1BB.
2. CAR específico de 5T4 según la reivindicación 1, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de al menos el 80%, preferiblemente el 90%, más preferiblemente del 95% e incluso más preferiblemente del 99% con una secuencia polipeptídica seleccionada de SEQ ID NO. 11 a 18.
3. CAR específico de 5T4 según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A1 de SEQ ID NO. 54 (CDR1), SEQ ID NO. 55 (CDR2) y SEQ ID NO. 56 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A1 de SEQ ID NO. 57 (CDR1), SEQ ID NO. 58 (CDR2) y SEQ ID NO: 59 (CDR3); o en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A2 de SEQ ID NO. 60 (CDR1), SEQ ID NO. 61 (CDR2) y SEQ ID NO. 62 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las C d R del anticuerpo monoclonal de ratón A2 de SEQ ID NO. 63 (CD1), SEQ ID NO. 64 (C d 2) y SEQ ID NO: 65 (CDR3); o en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A3 de SEQ ID NO. 66 (CDR1), SEQ ID NO. 67 (CDR2) y SEQ ID NO. 68 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón A3 de SEQ ID NO. 69 (CDR1), SEQ ID NO. 70 (CDR2) y SEQ ID NO: 71 (CDR3); o en el que dicho dominio de unión a ligando extracelular comprende una cadena de VH que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H8 de SEQ ID NO. 48 (CDR1), SEQ ID NO. 49 (CDR2) y SEQ ID NO. 50 (CDR3), y una cadena de VL que comprende las CDR del anticuerpo monoclonal de ratón H8 de SEQ ID NO. 51 (CDR1), SEQ ID NO. 52 (CDR2) y SEQ ID NO: 53 (CDR3).
4. CAR específico de 5T4 según la reivindicación 1 ó 2, en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 13 (VH de A1) y SEQ ID NO: 14 (VL de A1); o en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 15 (VH de A2) y SEQ ID NO: 16 (VL de A2); o en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 17 (VH de A3) y SEQ ID NO: 18 (VL de A3); o en el que dichos VH y VL tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, preferiblemente de al menos el 90%, más preferiblemente de al menos el 95% e incluso más preferiblemente de al menos el 99%, respectivamente, con SEQ ID NO: 11 (VH de H8) y SEQ ID NO: 12 (VL de H8).
5. CAR específico de 5T4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha región bisagra de CD8a tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO: 4 y/o en el que dicho dominio transmembrana de CD8a tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 6.
6. CAR específico de 5T4 según la reivindicación 1, que comprende una secuencia polipeptídica que tiene una identidad de al menos el 80% con SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 33 y SEQ ID NO. 39.
7. CAR específico de 5T4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un péptido señal.
8. Polinucleótido que codifica para un receptor de antígeno quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética que expresa en la membrana de la superficie celular un receptor de antígeno quimérico específico de 5T4 según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 9, que se deriva de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T cooperadores; o que se deriva de una célula NK.
11. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según la reivindicación 9 ó 10, en la que la expresión de TCR se suprime en dicha célula inmunitaria.
12. Célula modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que la expresión de al menos una proteína del CMH, preferiblemente p2m o HLA, se suprime en dicha célula inmunitaria.
13. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que dicha célula se muta para conferir resistencia a al menos un fármaco inmunosupresor o quimioterápico.
14. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para su uso en terapia.
15. Célula inmunitaria modificada por ingeniería genética según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, para su uso en terapia de un estado de cáncer hematológico, en la que el estado de cáncer hematológico es leucemia linfoblástica aguda infantil de células B precursoras.