CN108276493B - 一种嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体及其应用。所述嵌合抗原受体由信号肽、抗原结合结构域、跨膜区和胞内信号结构域组成，包含4‑1BB信号肽和/或4‑1BB分子跨膜区。本发明分离纯化了多种嵌合抗原受体核酸序列，并提供了一种特异性针对CD19恶性肿瘤抗原的嵌合抗原受体及CAR‑T细胞。在血液细胞系恶性肿瘤杀伤试验中，明显加强了免疫细胞靶向识别肿瘤细胞的能力，也增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

Description

一种嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及一种嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

据《2015全球癌症统计》数据显示，2012年全球新增1410万肿瘤患者，820万患者死亡。据中国肿瘤登记中心的数据显示，2015年中国新增430万癌症病例，癌症死亡病例超过281万，占据全年死亡人数比例的28.82％，即平均每天就有超过7500人死于癌症，居于世界首位。

传统的肿瘤治疗手段主要有手术、放射治疗、化疗，以及近年兴起的干细胞移殖等，往往这些治疗手段治标不治本。随着科学的发展，肿瘤的免疫治疗近年来实现了巨大的突破，其中主要包括免疫检查点抑制剂(例如anti-PD1单克隆抗体)，以及嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor Modified T cell therapy，CAR-T)的临床效果最好。近年来，CAR-T技术在血液性疾病治疗临床试验取得了令人鼓舞的进展，被《Science》杂志评为2013年十大科学突破之首。从2013年宾夕法尼亚大学Carl June小组报道第一例使用靶向CD19CAR-T治疗患有急性B淋巴细胞性白血病的儿童(Emily Whitehead)得到完全缓解开始，短短几年时间CAR-T细胞免疫疗法发展迅猛。CAR-T细胞治疗是当前靶向性最高、疗效最好的细胞免疫疗法。经过技术演变之后，CAR-T已经变得更加灵敏、免疫持续性更久，对淋巴瘤等血液肿瘤具有奇效。目前有多个细胞治疗方法已被FDA授予“突破性疗法”资格，其中，多项临床试验研究结果表明，CD19 CAR-T治疗B细胞淋巴瘤的临床完全缓解率均已经超过90％。

CAR-T细胞是能够经过基因工程手段在T细胞表面表达识别特定抗原并且传递信号的一类T细胞。一般地，CAR-T细胞通过嵌合抗原受体CAR以抗原-抗体或配体-受体识别模式对肿瘤细胞表面的特异分子进行识别，然后通过其胞内的信号传导进行激活、增殖并发挥细胞杀伤功能。经嵌合抗原受体修饰的T细胞，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。

经修饰的T细胞表达这样的一类嵌合抗原受体分子：胞外段一般包含CD8α或GM-CSFRα信号肽，抗原识别区或抗原结合结构域，包含由抗体重链和轻链可变区组成的单链可变区；胞内段是各种信号传导分子的胞内段嵌合体，包括CD28、4-1BB、OX-40、CD3zeta等，跨膜区则来自其他分子，如PD1、CD8、CD4、CD28、CD3zeta(CD3ζ)等。CAR胞外区部分的非抗原识别区，包括信号肽，铰链区(Hinge，scFv和跨膜区之间的连接区，亦有称间隔区spacerdomain)，对于CAR的功能有重要的影响。德国Kober L等人报道通过优选不同来源的信号肽序列对可使双特异性单链抗体(Bi-specific scFv antibody)的表达水平显著提升，这与信号肽引导蛋白进入分泌途径的能力有密切的关系(Biotechnol Bioeng.2013Apr；110(4):1164-73.)。美国Fred Hutchinson Cancer Research Center的Michael Hudecek等人报道，使用不合适的间隔区的CAR尽管在体外实验中有良好的肿瘤细胞杀伤作用，但是在体内由于间隔区与Fc受体有结合作用，导致CAR-T细胞在体内发生被激活引起的T细胞死亡现象(Activation-induced T-Cell death)，导致这样的CAR构造在体内不能持续存在而丧失抗肿瘤活性(Cancer Immunol Res；3(2)；125-35.)。国际申请WO2016/014789A2中，不改变胞外抗原识别区和胞内信号区，仅通过改变跨膜区的序列，即可大幅度实现CAR载体的性能，降低CAR-T对非靶细胞的非特异杀伤作用。目前在CAR-T领域，与CD28胞内信号结构域相比，包含4-1BB胞内信号结构域的CAR结构被认为具有更好的体内肿瘤细胞杀伤活性和持续性。

在B细胞白血病领域，CD19表达于几乎所有的B细胞肿瘤细胞表面，而在其他实质性细胞和造血干细胞中几乎不表达，CD19是B系肿瘤抗原比较特异的靶标。目前在临床上取得重要进展的CD19 CAR结构为CD8α信号肽-抗CD19单链抗体-CD8α铰链区&跨膜区-4-1BB胞内区-CD3ζ胞内区(CD8αsignal peptide-antiCD19scFv-CD8αHinge&TM-4-1BBcyto-CD3ζ)。

人4-1BB分子(NCBI数据库蛋白编号NP_001552.2)，又称CD137，或肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tumor necrosis factor receptor superfamily member 9，TNFRSF9)其一级结构为1-23号氨基酸为信号肽，24-186号氨基酸为胞外区，187-213号氨基酸为跨膜区，214-255号氨基酸为胞内区。目前尚未见报道使用4-1BB的基本结构进行CAR的设计。

本发明提供一种CAR结构，包含4-1BB信号肽和/或4-1BB跨膜区结构，例如4-1BB信号肽-肿瘤抗原识别结合区-4-1BB跨膜区-4-1BB胞内区-CD3zeta胞内区(4-1BB signalpeptide-VH-Linker-VL/VHH-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ)，最大限度地使用4-1BB的氨基酸序列。使用4-1BB信号肽和4-1BB的跨膜区及胞内区，利于CAR-T细胞上胞外肿瘤抗原识别结合区的延展得到优化，不仅在体外和体内有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床治疗急性淋巴瘤病人也实现了完全缓解，而且细胞因子释放反应更为温和。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种嵌合抗原受体及其应用。

本发明的另一目的是提供编码该嵌合抗原受体的核酸。

本发明的又一目的是提供含有该嵌合抗原受体的细胞及其应用。

一种嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中所述胞外信号肽选自4-1BB信号肽、CD8α信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽中的一种，跨膜结构域选自4-1BB分子跨膜区序列。

所述跨膜结构域4-1BB分子跨膜区的氨基酸序列优选SEQ ID NO.1所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

所述的胞外信号肽氨基酸序列优选如SEQ ID NO.2所示的4-1BB信号肽，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。

所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I receptor、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、PD1、CTLA4、IGF1R、mesothelin、PSMA、WT1、ROR1、CEA、GD-2、NY-ESO-1、MAGE A3、GPC3、糖脂F77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型或组合。

所述的抗原结合结构域结合的抗原进一步优选为CD19；CD19抗原结合结构域氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

在一个实施方案中，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域通过配体-受体相互作用结合靶标，可选自IL-3、IL-13或APRIL。

所述的抗原结合结构域由抗体片段组成，优选单克隆抗体、Fab、scFv、sdAb、V_HH或其他抗体片段。其抗原结合结构域抗体可来自鼠源、骆驼源或人源化抗体。在一个具体实施例中，该嵌合抗原受体的抗原结合结构域由CD19特异性单链抗体片段组成，包括单链抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中，所述抗原结合结构域的单链抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)之间由连接肽(Linker)连接，包含GS Linker如(G₃S)₄、(G₄S)₃或GSTSGSGKPGSGEGSTKG，优选(G₃S)₄连接肽。

所述胞内信号结构域优选包括CD3 zeta(CD3ζ)、CD3 gamma、CD3 delta、CD3epsilon、common FcR gamma(FCER1G)、FcR beta(Fc Epsilon R1b)、CD79a、CD79b、Fcgamma RIIa、DAP10 and DAP12分子的胞内信号区序列，或其组合。进一步优选的，胞内信号结构域包括CD3ζ分子的信号传导结构域。

所述胞内信号结构域还优选包括共刺激信号结构域，可选自下列共刺激信号分子：CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、CD2、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、LIGHT、NKG2C、B7-H3、PD-1、ICOS、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、CD7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8alpha、CD8beta、IL2R beta、IL2R gamma、IL7R alpha、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A,Ly108)、SLAM(SLAMFI,CD150,IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、CD83特异性结合的配体或其任意组合。在一个具体实施方案中，进一步优选4-1BB为共刺激信号结构域,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

在一个实施方案中，该嵌合抗原受体在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间不包含铰链区。

在另一个实施方案中，该嵌合抗原受体在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间包含铰链区。在具体实施方案中，该铰链区优选SEQ ID NO.4所示的CD8α铰链区。

在一个特定实施方案中，该嵌合抗原受体优选包括顺序连接的4-1BB信号肽或CD8α信号肽、抗原结合结构域、4-1BB跨膜区、4-1BB胞内共刺激结构域以及CD3ζ信号传导结构域。

本发明嵌合抗原受体结构如下：

4-1BB signal peptide-VH-Linker-VL-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ

CD8αsignal peptide-VH-Linker-VL-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ

4-1BB signal peptide-VH-Linker-VL-TM-4-1BBcyto-CD3ζ

4-1BB signal peptide-V_HH₁-Linker-V_HH₂-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ

CD8αsignal peptide-V_HH₁-Linker-V_HH₂-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ

4-1BB signal peptide-V_HH₁-Linker-V_HH₂-TM-4-1BBcyto-CD3ζ

其中抗原结合结构域可由VH-Linker-VL或VL-Linker-VH或V_HH₁-Linker-V_HH₂组成，V_HH₁和V_HH₂可识别相同抗原，或不同抗原。

作为本发明的优选，该嵌合抗原受体包含SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列，或与其具有85％-99％同一性氨基酸序列。

编码前述嵌合抗原受体的核酸分子。

该核酸分子优选包含SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.24的核苷酸序列。

上述核酸分子的表达载体。

该表达载体优选慢病毒表达载体，包含编码SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.24的核苷酸序列。

表达前述嵌合抗原受体的细胞。

该细胞优选免疫细胞；进一步优选T淋巴细胞、NK细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

一种制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，该方法包括分离和激活待修饰的T细胞，然后以前述表达载体转导该T细胞。

含有所述嵌合抗原受体、表达载体、所述细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

所述的肿瘤优选包括胶质母细胞瘤、头颈癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、乳腺癌或卵巢癌，以及慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、急浆细胞样树突状细胞肿瘤、Burkitt淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤，恶性淋巴组织增生，MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤，边缘区淋巴瘤，多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞肿瘤淋巴瘤等血液系肿瘤。

在具体实施方案中，涉及制备治疗血液系肿瘤的药物用途。

本发明所述的嵌合抗原受体涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

本发明所述的免疫效应细胞涉及在制备抗肿瘤药物及细胞免疫疗法中的应用。

有益效果：

本发明提供一种CAR结构，包含4-1BB信号肽和/或4-1BB跨膜区结构，例如4-1BB信号肽-肿瘤抗原识别结合区-4-1BB跨膜区-4-1BB胞内区-CD3zeta胞内区(4-1BB signalpeptide-VH-Linker-VL/VHH-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ)，最大限度地使用4-1BB分子结构的氨基酸序列。利用4-1BB信号肽、4-1BB跨膜区或胞内区结构，利于CAR-T细胞上胞外肿瘤抗原识别结合区的延展，不仅在体外和体内都有良好的肿瘤杀伤作用，而且在临床上治疗急性淋巴瘤病人也实现了完全缓解，而且细胞因子释放反应更为温和。以CD19抗原靶点为例，与现有技术相比，该嵌合抗原受体显示了较高的抗肿瘤能力，由其修饰的免疫细胞具有较高的靶向识别肿瘤抗原的能力，增强了对肿瘤细胞的杀伤活性。

附图说明

图1为嵌合抗原受体的载体结构图，展示了本发明中涉及的CAR1(A图)和CAR3(B图)嵌合抗原受体载体结构图。

图2为本发明中所构建的稳定细胞系表达的CD19抗原检测。A.用CD19特异性抗体分别检测所构建的Raji.Luc细胞系及同型对照Raji细胞系上CD19的表达。B.为CD19特异性抗体分别检测所构建的K562.CD19.Luc细胞系及对照细胞系中CD19抗原的表达水平。

图3为CAR-T体外杀伤CD19阳性细胞的效果图。A.在E:T ratio 1的条件下，CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为20.2±1.23％，而CAR2-T组剩余98.84±1.60％，UnT组为100±3.54％；在E:T ratio 2的条件下，CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为50.09±2.17％，而CAR2-T组剩余107.07±3.04％，UnT组为100±3.50％。B.CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为26.83±1.97％，而CAR3-T组剩余相对靶细胞为36.86±3.46％，UnT组为100±1.78％。

图4为CAR-T细胞的IFNγ释放水平检测。A.CAR1-T、CAR2-T及UnT、Luc组与Raji.Luc细胞共孵育4h及20h后IFNγ的释放量。B.CAR1-T、CAR2-T及UnT、Luc组与来自于急性B细胞白血病病人的B淋巴细胞共孵育4h及20h后IFNγ的释放量。

图5为CAR1转导的自体T细胞对肿瘤杀伤效果的检测。将CAR1分别转导至来自5例不同B-ALL患者的T细胞中，转导后的细胞分别命名为ALLCT01、ALLCT02、ALLCT03、ALLCT04及ALLCT05。经CAR1转导后的细胞与Raji.Luc靶细胞共孵育后，剩余的Raji.Luc细胞的相对数量为9.33％-37.82％。

图6为人白介素6释放水平图。ALLCT01病人回输CD19 CAR-T细胞后，体温在最后一次回输后6天开始升高，细胞因子检测结果显示白介素6(IL-6)分泌水平显著提高。

具体实施方式

本发明提供了一种嵌合抗原受体、免疫效应细胞及其在抑制肿瘤活性中的应用，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

本文所用的术语“跨膜结构域”(简称TM)可以与“跨膜区”互换使用，指的是锚定在细胞膜内具有热力学稳定的蛋白质结构区域。跨膜区可以从天然蛋白质中获得，选自4-1BB分子。

本发明的嵌合抗原受体包含胞外信号肽结构，例如4-1BB信号肽、CD8α信号肽、GM-CSFRα信号肽或CD4信号肽，优选4-1BB信号肽。

本文所用的术语“胞内信号结构域”指的是能够传导细胞效应功能信号并指导细胞执行特定功能的蛋白质结构区域。胞内信号结构域可以包括信号传导结构域和/或共刺激信号结构域。

本文所用的术语氨基酸序列的“同一性”(identity)可以与“相似性”互换使用，指的是氨基酸序列之间通过序列比对软件例如BLAST确定的相似程度。氨基酸序列比对的方法和软件对于本领域技术人员是公知的。可以通过对已知氨基酸序列进行一个或几个(例如1-15个，例如2、3、5、8、10或12个)氨基酸残基的取代、缺失和/或添加而获得经改造的氨基酸序列。例如，通过常规蛋白质工程手段(例如氨基酸保守取代等)，对本发明SEQ IDNO.1所示的4-1BB跨膜结构域进行改造，可以获得与SEQ ID NO.1具有至少85％(例如85％～99％或90％～99％或95％～99％)序列同一性，并且具有基本相同的跨膜功能的变体序列。

本文所用的术语“抗体片段”是包括具有功能的抗体部分，优选抗原结合和/或完整抗体的可变区。抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv fragments、单链抗体scFv、单域抗体sdAb/V_HH及多特异性抗体。

本文所用的术语“scFv”或“scFv抗体”是指单链抗体(single chain antibodyfragment，scFv)，是由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过15～20个氨基酸的短肽连接而成。此处所用的术语“Linker”也称连接肽或接头，是用于连接两个结构域的柔性氨基酸序列。连接肽的选择和制备对本领域技术人员来说是容易的。

本发明通过优化利用人4-1BB分子结构域进行嵌合抗原受体设计，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1嵌合抗原受体制备

(一)嵌合抗原受体基因片段制备

本发明提供了一种包含CD19抗原结合结构域的嵌合抗原受体。本发明提供的抗原结合结构域抗体由单链抗体的重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)及连接肽(G3S)₄Linker组成。单链抗体的重链可变区及轻链可变区序列分别来源于GenBank:Y14283.1、GenBank:Y14284.1，将其进行密码子及序列优化，以保证其在人类细胞内更适合表达。

本发明提供的嵌合抗原受体可按照以下编码基因的顺序设计及变换嵌合抗原受体融合基因片段：4-1BB信号肽、V_H-(G3S)₄-V_L、4-1BB跨膜区、4-1BB或CD28胞内共刺激信号结构域或CD3ζ胞内信号传导结构域，基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司提供技术服务，通过基因合成技术选取以下编码基因序列进行融合基因合成：

编码4-1BB跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

编码4-1BB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

编码CD8α信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示

编码CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

编码CD8α跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

编码4-1BB胞内共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

编码CD28胞内共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

编码CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

编码CD19抗原结合结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

本发明使用的胞外结构域和胞内信号结构域有多种组合，包含选自如下的结构或组合：

4-1BB跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

4-1BB信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

CD8α信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

CD8α铰链区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

CD8α跨膜区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

4-1BB胞内共刺激信号结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；

CD28胞内共刺激信号结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

CD3ζ胞内信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

CD19抗原结合结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

本发明实施例中涉及的嵌合抗原受体组合物包括但不限于以下结构：

CAR1:4-1BB signal peptide-V_H-(G3S)₄-V_L-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ，其氨基酸序列SEQ ID NO.10所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.22所示；合成SEQ ID NO.22所示

基因序列用于构建重组表达载体；

CAR2:CD8αsignal peptide-V_H-(G3S)₄-V_L-CD8αHinge&TM-4-1BBcyto-CD3ζ，其氨基酸序列SEQ ID NO.11所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.23所示；合成SEQ ID NO.23所示基因序列用于构建重组表达载体；

CAR3:CD8αsignal peptide-V_H-(G3S)₄-V_L-4-1BB TM-4-1BBcyto-CD3ζ，其氨基酸序列SEQ ID NO.12所示，核苷酸编码序列如SEQ ID NO.24所示；合成SEQ ID NO.24所示基因序列用于构建重组表达载体；

其中，在本领域的技术范围内，抗原结合结构域可以替换成不同肿瘤抗原靶点。抗原特异性的抗体重链可变区与轻链可变区连接方向可以是V_H-V_L或V_L-V_H，连接肽Linker可以选择(G3S)₄Linker、(G4S)₃Linker或其他GS Linker或其他蛋白linker，如WhitlowLinker：GSTSGSGKPGSGEGSTKG。

(二)嵌合抗原受体慢病毒表达载体的构建

在一个具体的实施方案中，本发明使用一种自灭活的慢病毒表达载体以表达目的CAR基因序列。首先，提取表达质粒和pCMV-ΔR-8.74及pMD2.G辅助质粒，按一定比例混合，共转染293T细胞。转染48h、96h后，收集含有病毒的细胞培养上清，4℃、3000rpm离心5min。上清经0.45μm滤器过滤后，与PEG6000/NaCl按4:1体积混匀，4℃静置2～3h后高速离心30min。弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬溶解，即获得病毒浓缩液，-80℃保存备用。

实施例2构建表达CD19抗原的K562细胞系K562.CD19.Luc

K562细胞几乎不表达CD19。本发明基因合成编码人CD19分子(蛋白序列为NCBI编号NP_001171569.1)的核苷酸序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司提供基因合成技术服务。合成的CD19核苷酸序列在T4连接酶的作用下，20℃过夜连接到预先进行BamH1和XbaI限制酶切位点酶切后的pLVX-Puro(Clontech，货号#632164)慢病毒载体上。将连接产物转化到DH5α感受态细胞中并涂布细菌平板，挑取多个克隆斑进行质粒的提取(Qiagen EndofreeMega kit)。经酶切鉴定、测序比对，构建成功的载体命名为pLVX-CD19-Puro。

将提取的pLVX-CD19-Puro表达质粒和pCMV-ΔR-8.74(J.Virol.-1998-Dull-Athird-generation lentivirus vector with a conditional packaging system)及pMD2.G辅助质粒，按一定比例混合，共转染293FT细胞。转染96h后，收集含有病毒的细胞培养上清，4℃、3000rpm离心5min。上清经0.45μm滤器过滤后，经4℃、25000rpm高速离心120min。弃上清重悬溶解后即获得病毒浓缩液，-80℃保存备用。携带萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase/Luciferase)报告基因的慢病毒载体也采用同样的方法进行制备。

K562细胞系购自ATCC(货号CCL-243)，使用90％ IMDM(Life technology,货号A10491-01)+10％ FBS(Life technology,货号10099-141)+1％青霉素/链霉素(Lifetechnology,货号15140-122)进行常规培养(以下简称IMDM10培养液)。将构建的携带CD19基因的慢病毒载体与携带萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase/Luciferase)报告基因的慢病毒载体加入到培养的K562细胞上清中，共同转导K562细胞系。转导后24h，加入终浓度为10μg/ml的Puromycin，每三天换一次培养液并添加相同浓度的Puromycin，进一步进行单克隆的筛选获得单克隆细胞，命名为K562.CD19.Luc。本发明同时按照上述方法构建的另一株稳定细胞系K562.CD123.Luc(CD123基因来源：GenBank:NM_002183)作为CD19阴性对照细胞系使用。

CD19阳性的人淋巴瘤细胞株Raji购买自美国ATCC(ATCC#CCL-86^TM)采用RPMI1640+10％FBS+1％青霉素/链霉素进行培养(以下简称R10培养液)。采用与上述相似的方法把萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase/Luciferase)报告基因转导进入Raji细胞中，经过Puromycin压力筛选，获得稳定表达荧光素酶报告基因的细胞系，命名为Raji.Luc。

利用流式细胞检测技术对上述所获得的单克隆细胞进行CD19表达鉴定。如图2A，用CD19特异性抗体分别检测所构建的Raji.Luc细胞系及同型对照Raji细胞系(购自Miltenyi)上CD19的表达，流式细胞检测结果显示所构建的Raji.Luc细胞系具有较高的CD19表达水平。图2B为CD19特异性抗体分别检测所构建的K562.CD19.Luc细胞系及对照细胞系中CD19抗原的表达水平，流式细胞检测结果显示所构建的K562.CD19.Luc细胞系同样具有很高的CD19表达水平。

实施例3嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞制备和体外杀伤活性检测(一)T淋巴细胞的制备

采集50mL健康人新鲜血液，通过淋巴细胞分离液、密度梯度离心方法分离外周血单核细胞(PBMC)。利用Pan T Cell Isolation Kit(购自Miltenyi Biotech)对细胞进行磁珠标记，并分离纯化出T淋巴细胞。纯化后的T细胞，再利用CD3/CD28磁珠进行T淋巴细胞激活及增殖。

(二)慢病毒转导T淋巴细胞

收集激活的T淋巴细胞，重悬在RPMI1640培养基中。用慢病毒感染1x10⁶个活化的T淋巴细胞，将细胞悬液加在6孔板中，置37℃、5％ CO₂培养箱中孵育过夜。第二天，再次离心并换新鲜培养基，每隔2天加入新鲜培养基，继续扩大培养。

(三)CAR-T的表达检测

离心收集按上述方案制备的CAR-T细胞，分别用DPBS洗3次后用人基因组提取试剂盒Gentra Puregene Cell Kit(购自Qiagen)制备基因组DNA。制备的DNA检测OD_260nm和OD_280nm吸光度后计算浓度。调整合适的DNA浓度根据试剂盒SYBR Green Real time PCRMaster mix plus(购自Toyobo)说明书配置Q-PCR反应体系，然后在荧光定量PCR仪(ABI#7300)上进行基因拷贝数的检测。Q-PCR检测采用准确定量的含目的片段的质粒作为阳性对照和标准曲线，Q-PCR获得的标准曲线各个拷贝数浓度的CT值与对应的拷贝数绘制直线拟合标准曲线，其他检测样品根据标准曲线的拟合方程计算相对的拷贝数。

本发明中CAR-T细胞表达嵌合抗原受体的检测，以未转导的T淋巴细胞(UnT)作为空白对照，同时以使用US8399645B2专利中包含CD8α信号肽、铰链区和跨膜区结构的CD19CAR-T(CAR2-T)为对照。

CAR整合拷贝数检测结果如表1所示。结果显示：CAR1-T组细胞基因组中检测到CAR1基因的整合，且其拷贝数为7.46x10⁵拷贝/ng基因组DNA，CAR2-T转导的CAR2基因拷贝数为12.90x10⁵拷贝/ng基因组DNA，空白对照UnT及H₂O检测值极低(约30个拷贝/ng基因组DNA)，属于检测的背景。

表1.Q-PCR法检测CAR基因整合进供体T细胞基因组的拷贝数

实施例4体外杀伤活性检测

收集上述制备的CAR-T细胞，用R10培养液调整至合适密度并接种在384孔板中。CAR-T与靶细胞Raji-Luc按50:1或20:1的效靶比例(E:T)在37℃条件下共培养20h，然后加入等量的荧光素酶活性检测试剂One-Glo^TM Luciferase Assay(购自Promega)。共培养结束后，反应孔中所剩余的荧光素酶相对活性(RLU,relative light unit)对应孔中活细胞的相对量，如果显示的荧光素酶RLU值高，则表示反应孔中剩余的未被杀死的靶细胞多，表明孔中的细胞杀伤作用弱；反之，如果显示的荧光素酶RLU值低，则表示反应孔中的未被杀死的靶细胞少，表明孔中的细胞杀伤作用强。本发明的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤试验，以未转导的T淋巴细胞(UnT)作为空白对照，同时以CAR2作为对照。

如图3A所示，在整合拷贝数相当、不同效靶比(E:T ratio 1＝50:1，E:T ratio 2＝20:1)的条件下，CAR1-T均能明显杀伤Raji.Luc细胞(相对荧光素酶活力RLU％降低)，明显优于对照组CAR2-T的杀伤效果。在E:T ratio 1的条件下，CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为20.2±1.23％，而CAR2-T组剩余98.84±1.60％，UnT组为100±3.54％；在E:T ratio 2的条件下，CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为50.09±2.17％，而CAR2-T组剩余107.07±3.04％，UnT组为100±3.50％。以上结果可揭示包含4-1BB信号肽和跨膜区结构域并缺失铰链区的CAR1修饰的免疫细胞比包含CD8α信号肽和跨膜区结构域的CAR2修饰的免疫细胞具有更优的肿瘤体外杀伤作用。

在另外一组实验中，如图3B所示，CAR1-T与Raji.Luc共培养后剩余的Raji.Luc相对细胞为26.83±1.97％，而CAR3-T组剩余相对靶细胞为36.86±3.46％，UnT组为100±1.78％。CAR1和CAR3相比在于胞外信号肽不同，CAR3包含CD8α信号肽。由图3B结果可推理出包含4-1BB信号肽和跨膜区的CAR1修饰的免疫细胞比包含CD8α信号肽的CAR3修饰的免疫细胞具有更好的肿瘤体外杀伤作用。

综合图3A和3B的数据结果可推出：包含不同信号肽或跨膜区结构的嵌合抗原受体，其修饰的免疫细胞具有不同的体外杀伤能力，跨膜区结构可能对于嵌合抗原受体的性能具有更显著的影响。

进一步地，在靶点特异性地杀伤性实验中，本发明使用构建的表达CD19的K562.CD19.Luc和不表达CD19但表达CD123的K562.CD123.Luc稳定细胞系(实施例2)作为评估CAR1杀伤作用的特异性。如图3C显示，CAR1-T与K562.CD19.Luc共培养后剩余的K562.CD19.Luc相对细胞为6.77±0.84％；而CAR1-T与K562.CD123.Luc共培养后剩余的K562.CD123.Luc相对细胞为107.06±14.39％；而UnT细胞对两种靶细胞均没有明显的杀伤作用；CAR1-T对K562.CD19.Luc细胞具有明显的靶点选择性杀伤作用。

实施例5CAR-T细胞的IFNγ释放水平检测

收集上述制备的CAR-T细胞，用R10培养液调整合适密度接种在96孔板中。IFNγ的释放是T细胞激活的一个标志。本实施例将不同CAR-T细胞分别与靶细胞按E:T＝20:1、37℃条件下共培养，然后移出共培养上清，使用实时荧光分辨技术试剂盒(HTRF，Cisbio#64IL2PEB)检测上清中IFN-γ的释放量。同时以CAR2-T作为对照，未转导的T淋巴细胞(UnT)和仅转导病毒载体的T淋巴细胞(Luc)作为空白对照。

如图4A显示，CAR-T细胞或UnT细胞与CD19阳性的Raji.Luc细胞共孵育4h后，CAR1-T组IFNγ的释放量为894.49±101.64pg/mL，CAR2-T组IFNγ的释放量为343.88±44.30pg/mL，UnT组IFNγ的释放量为59.49±6.52pg/mL，Luc组IFNγ的释放量为67.43±1.52pg/mL；共孵育20h后，CAR1-T组IFNγ的释放量为1572.23±0.60pg/mL，CAR2-T组IFNγ的释放量为808.67±21.42pg/mL，UnT组IFNγ的释放量为240.82±34.11pg/mL，Luc组IFNγ的释放量为239.82±83.47pg/mL。与UnT及Luc对照相比，CAR1-T和CAR2-T能明显释放IFNγ，并且CAR1-T具有比CAR2-T更突出的抗原依赖性的IFNγ释放水平。

如图4B显示，CAR-T细胞或UnT细胞与来自于急性B细胞白血病病人的B淋巴细胞(Bcell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)共孵育4h后，CAR1-T组IFNγ的释放量为411.73±16.14pg/mL，CAR2组IFNγ的释放量为349.41±43.09pg/mL，UnT组IFNγ的释放量为88.66±2.42pg/mL，Luc组IFNγ的释放量为82.87±14.24pg/mL；共孵育20h后，CAR1-T组IFNγ的释放量为1119.37±18.045pg/mL，CAR2-T组IFNγ的释放量为1099.93±75.93pg/mL，UnT组IFNγ的释放量为146.04pg/mL，Luc组IFNγ的释放量为236.45±57.50pg/mL。与UnT和Luc对照组相比，CAR1-T和CAR2-T能都具有明显的IFNγ释放量，CAR1-T释放的IFNγ水平略高于对照组CAR2-T。

实施例6CAR1转导的自体T细胞对CD19阳性的急性B细胞淋巴白血病患者的临床试验治疗效果

采集急性B细胞淋巴细胞白血病患者外周成分血，分离纯化其T细胞(实施例2)，体外激活2天后转导CAR1慢病毒载体。转导后离心洗去培养上清中未进入细胞的的CAR1慢病毒载体。转导后的T细胞重悬在含有终浓度为100IU/mL IL-2和CD3/CD28磁珠的培养基中。以0.5～2x10⁶/mL的培养密度隔天进行扩大培养11～14天。

将CAR1分别转导至来自5例不同B-ALL患者的T细胞中，转导后的细胞分别命名为ALLCT01、ALLCT02、ALLCT03、ALLCT04及ALLCT05。图5结果显示，经CAR1转导后的细胞均显示很强的体外杀伤Raji.Luc靶细胞的能力，与Raji.Luc靶细胞共孵育后剩余的Raji.Luc细胞的相对数量为9.33％-37.82％。

以下以ALLCT01急性B淋巴细胞白血病病人的CD19 CAR-T治疗为例。

ALLCT01病人：经医院检测病症为骨髓增生活跃，淋巴细胞系统异常增生，原始淋巴细胞占65％，以大细胞为主，边缘不规则，胞浆量较多，核型不规则，可见凹陷和折叠，粒细胞系统增生减低，红细胞系统增生减低，血小板少见，临床诊断为B-ALL(NR)。经医院推荐，通过伦理审查，病人签署知情同意书，然后进行CAR-T细胞治疗的临床试验研究。

CAR-T细胞治疗过程为：采集该病人的外周血，经过体外T细胞的分离纯化，体外制备CD19CAR-T细胞，分三个时间点分次经静脉自体回输至病人体内，共计输注约1.5×10⁸细胞。

ALLCT01病人回输CD19 CAR-T细胞后，出现较为温和的反应：体温在最后一次回输后6天开始升高，细胞因子检测结果显示白介素6(IL-6)分泌水平显著提高(图6)，持续发烧6天均未超过40℃。在发烧后3天对症治疗输入少量的IL-6R单抗Tocilizumab后，体温逐渐下降，4日后达到正常体温。而国外报道的CD19 CAR-T治疗B-ALL病人一般在3天即发生高热。本试验结果表明本发明述及的CD19 CAR(CAR1)在治疗B-ALL中有着更温和的反应，对病人副作用更小。

在最后一次回输的14天后对病人的外周血进行检测。如表2结果所示，外周血中CD19阳性(CD19+)细胞所占的百分比由治疗前的63％降低为0％，并且83.59％的细胞为CD3阳性(CD3+)细胞。结合血液学检测结果表明：该病人经过本发明提供的CD19 CAR-T细胞治疗后，外周血中CD19阳性的白血病细胞被完全清除，达到临床完全缓解。

表2.B-ALL病人CART治疗前后血相中T和B淋巴细胞的变化

本申请文件中未详细记载的实验方法均为本领域的常规技术，可通过申请日以前的文献或技术手段实现。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京传奇生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体及其应用

<160> 24

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu

1 5 10 15

Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val

20 25

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser

20

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 7

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 259

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr

130 135 140

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg

145 150 155 160

Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

165 170 175

Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser

180 185 190

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys

210 215 220

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

245 250 255

Ser Ser Asn

<210> 10

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu

1 5 10 15

Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro

20 25 30

Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

35 40 45

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro

50 55 60

Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn

85 90 95

Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp

100 105 110

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr

115 120 125

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp

165 170 175

Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu

180 185 190

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu

225 230 235 240

Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

245 250 255

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro

260 265 270

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ile Ile Ser Phe Phe Leu

275 280 285

Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu

290 295 300

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

305 310 315 320

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

325 330 335

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

340 345 350

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

355 360 365

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

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Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

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Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

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Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

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450 455 460

<210> 11

<211> 503

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu

20 25 30

Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val

35 40 45

Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys

85 90 95

Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala

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Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

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Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile

225 230 235 240

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Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val

260 265 270

Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala

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Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

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500

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<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

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Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val

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<210> 13

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

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acgctccgtt tctctgttgt t 81

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 60

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 120

agggggctgg acttcgcctg tgat 144

<210> 17

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

acc 63

<210> 18

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 19

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 20

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 21

<211> 777

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

ggcggcggca gcggcggcgg cagcggcggc ggcagcggcg gcggcagcga catccagatg 420

acacagacta catcctccct gtctgcctct ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg 480

gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt 540

aaactcctga tctaccatac atcaagatta cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc 600

agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc attagcaacc tggagcaaga agatattgcc 660

acttactttt gccaacaggg taatacgctt ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg 720

gaaataacac gggctgatgc tgcaccaact gtatccatct tcccaccatc cagtaat 777

<210> 22

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atgggaaaca gctgttacaa catagtagcc actctgttgc tggtcctcaa ctttgagagg 60

acaagatcag aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 120

ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 180

cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 240

tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 300

gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 360

cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 420

gtctcctcag gcggcggcag cggcggcggc agcggcggcg gcagcggcgg cggcagcgac 480

atccagatga cacagactac atcctccctg tctgcctctc tgggagacag agtcaccatc 540

agttgcaggg caagtcagga cattagtaaa tatttaaatt ggtatcagca gaaaccagat 600

ggaactgtta aactcctgat ctaccataca tcaagattac actcaggagt cccatcaagg 660

ttcagtggca gtgggtctgg aacagattat tctctcacca ttagcaacct ggagcaagaa 720

gatattgcca cttacttttg ccaacagggt aatacgcttc cgtacacgtt cggagggggg 780

actaagttgg aaataacacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 840

agtaatatca tctccttctt tcttgcgctg acgtcgactg cgttgctctt cctgctgttc 900

ttcctcacgc tccgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 960

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1020

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1080

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1140

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1200

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1260

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1320

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1380

ccccctcgct aa 1392

<210> 23

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 120

gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 180

cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 240

aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 300

ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 360

tactacggtg gtagctatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 420

tcaggcggcg gcagcggcgg cggcagcggc ggcggcagcg gcggcggcag cgacatccag 480

atgacacaga ctacatcctc cctgtctgcc tctctgggag acagagtcac catcagttgc 540

agggcaagtc aggacattag taaatattta aattggtatc agcagaaacc agatggaact 600

gttaaactcc tgatctacca tacatcaaga ttacactcag gagtcccatc aaggttcagt 660

ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc accattagca acctggagca agaagatatt 720

gccacttact tttgccaaca gggtaatacg cttccgtaca cgttcggagg ggggactaag 780

ttggaaataa cacgggctga tgctgcacca actgtatcca tcttcccacc atccagtaat 840

gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 1080

aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 1140

tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 1200

gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 1260

gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 1320

agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 1380

gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1440

taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1500

ccccctcgct aa 1512

<210> 24

<211> 1392

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

atggctctgc ctgtcaccgc tctgctgctg cccctggctc tgctgctgca cgccgcaaga 60

cctgaagtca aactgcagga atctggccca ggcctggtgg cacctagcca gtccctgtct 120

gtgacctgca cagtgagcgg cgtgtccctg cctgactacg gcgtgtcttg gatcagacag 180

ccacctagga agggcctgga gtggctggga gtgatctggg gctccgagac aacatactat 240

aactctgccc tgaagagccg cctgaccatc atcaaggata acagcaagtc ccaggtgttc 300

ctgaagatga atagcctgca gaccgacgat acagccatct actattgcgc caagcactac 360

tattacggcg gcagctatgc catggactac tggggccagg gcacctccgt gacagtgagc 420

tccggaggag gctccggagg aggctctgga ggcggcagcg gcggcggctc cgatatccag 480

atgacccaga ccacatctag cctgtctgca agcctgggcg accgcgtgac aatctcttgt 540

cgggccagcc aggatatctc caagtatctg aattggtacc agcagaagcc cgacggcacc 600

gtgaagctgc tgatctatca caccagccgg ctgcacagcg gagtgccttc caggttctcc 660

ggctctggca gcggaaccga ctactctctg acaatcagca acctggagca ggaggatatc 720

gccacctatt tctgccagca gggcaatacc ctgccttaca catttggcgg cggcaccaag 780

ctggagatca caagagccga tgccgcccca acagtgagca tctttccacc ctcctctaac 840

actagtatca tctccttctt tctggccctg acctctacag ccctgctgtt cctgctgttc 900

tttctgaccc tgaggttttc cgtggtgaag agaggcagga agaagctgct gtacatcttc 960

aagcagcctt ttatgcgccc agtgcagacc acacaggagg aggacggctg ctcttgtcgg 1020

ttcccagagg aggaggaggg cggctgtgag ctgagagtga agttttccag gtctgcagat 1080

gcaccagcat atcagcaggg acagaatcag ctgtacaacg agctgaatct gggccggaga 1140

gaggagtatg acgtgctgga taagaggagg ggacgggacc ccgagatggg aggcaagcca 1200

cggagaaaga acccccagga gggcctgtat aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag 1260

gcctactccg agatcggcat gaagggagag aggaggaggg gaaagggaca cgatggcctg 1320

taccagggcc tgagcaccgc aacaaaagac acttatgacg cactgcacat gcaggctctg 1380

cccccaaggt aa 1392

Claims (22)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于包含胞外信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域，其中所述胞外信号肽为4-1BB信号肽，所述跨膜结构域为4-1BB分子跨膜区序列，所述胞内信号结构域包含4-1BB胞内共刺激结构域以及CD3ζ胞内信号传导结构域，所述抗原结合结构域结合CD19，并且包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述跨膜结构域4-1BB分子跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的胞外信号肽选自氨基酸如SEQ ID NO.2所示的4-1BB信号肽。

4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其抗原结合结构域抗体选自单克隆抗体、Fab或scFv。

5.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述胞内信号结构域包含SEQ IDNO.6所示氨基酸序列的4-1BB胞内共刺激信号结构域。

6.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述胞内信号结构域包含SEQ IDNO.8所示氨基酸序列的CD3ζ胞内信号传导结构域。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的嵌合抗原受体包括顺序连接的4-1BB信号肽、抗原结合结构域、4-1BB跨膜结构域、4-1BB胞内共刺激结合结构域、以及CD3ζ胞内信号传导结构域。

8.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的嵌合抗原受体在胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间还包含铰链区。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中，所述铰链区为CD8α铰链区。

10.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于所述的嵌合抗原受体包含SEQ IDNO.10所示的氨基酸序列。

11.编码权利要求1至10中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸分子。

12.根据权利要求11所述的核酸分子，其特征在于选自SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列。

13.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求11或12所述的核酸分子。

14.表达权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体的细胞。

15.根据权利要求14所述的细胞，其特征在于所述的细胞选自免疫细胞。

16.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于所述的细胞选自T淋巴细胞，NK细胞，或造血干细胞或多能干细胞培养分化的免疫细胞。

17.根据权利要求15所述的细胞，其特征在于所述的细胞为胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。

18.一种制备权利要求1所述的嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，其特征在于该方法包括分离和激活待修饰的T细胞，然后以权利要求13所述的重组表达载体转导该T细胞。

19.一种药物组合物，其特征在于包含有效量的权利要求14-17中任一项所述的细胞和药学上可接受的载体。

20.权利要求1-10中任一项所述的嵌合抗原受体或权利要求14-17中任一项所述的细胞在制备抗肿瘤药物或用于肿瘤细胞免疫疗法的药物中的应用；其中，所述肿瘤选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤。

21.权利要求20所述的应用，其中，所述急性淋巴细胞白血病(ALL)为B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。

22.权利要求20所述的应用，其中，所述非霍奇金淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤或套细胞淋巴瘤。