NO316074B1 - CDR-podet antistoffmolekyl, DNA-molekyl, klonings- eller ekspresjonsvektor,vertscelle samt diagnostisk preparat - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et CDR-podet antistoffmolekyl, og dets anvendelse som diagnostisk middel

Oppfinnelsen vedrører også et DNA-molekyl, klonings- eller ekspresjonsvektor samt vertscelle

Uttrykket "humanisert antistoffmolekyl" anvendes for å be-skrive et molekyl med et antigenbmdende sete avledet fra et immunoglobulin fra en ikke-human spesies, og hvor de gjen-værende immunoglobulin-avledede deler av molekylet er avledet fra et humant immunoglobulin Det antigenbindende sete omfatter typisk hypervariable regioner ("Complementary Determinmg Regions") (CDR'er) som bestemmer bindingsspesifisi-teten for antistoffmolekylet og som er båret på passende strukturregioner i de variable domener Der er tre CDR'er (CDR1, CDR2 og CDR3) i hver av de tung og lett kjede variable domener

I beskrivelsen vises det til en rekke publikasjoner ved hjelp av tallangivelser Publikasjonene er angitt i numerisk rekke-følge på slutten av beskrivelsen

Naturlige immunoglobuliner har vært kjent i en rekke år, og likeledes de forskjellige fragmenter derav som Fab, (Fab')2 og Fc-fragmentene, som kan utvinnes ved hjelp av enzymatisk spalting Naturlige immunoglobuliner omfatter et molekyl som generelt er Y-formet og med et antigenbmdende sete i nærheten av enden av hver øvre arm Resten av strukturen, og særlig stammen i det Y-formede molekyl formidler virkningsfunk-sjonene forbundet med immunoglobuliner

Naturlige immunoglobuliner har vært anvendt i forbindelse med analyser, diagnose og, i mere begrenset utstrekning, terapi Slike anvendelser, særlig i terapi, har imidlertid inntil nylig vært forhindret pga de naturlige immunoglobuliners polyklonale natur Et betydelig skritt frem mot bruk av lmmu-noglobmer som terapeutiske midler var oppdagelsen av prosedyrene for fremstilling av monoklonale antistoff (MAb'er) med definert spesifisitet (1)

De fleste MAb'er er imidlertid, dannet ved hjelp av hybridomer som er fusjoneringer av miltceller og myelomaceller fra gnagere De er derfor i alt vesentlig gnager-proteiner Der er svært få rapporter vedrørende fremstilling av humane MAb'er

Da de fleste tilgjengelige MAb'er er av gnageroppnnnelse, er de av naturen antigeniske i mennesker og kan således føre til en uønsket immunrespons betegnet HAMA ("Human Anti-Mouse Antibody") respons Anvendelse av MAb'er fra gnagere som terapeutiske midler i mennesker er derfor følgelig begrenset ved det faktum at det menneskelige individ vil sette i verk en immunologisk respons mot MAb og vil enten fjerne det fullstendig eller i det minste redusere dets virknmgsfullhet I praks6s kan MAb'er av gnageroppnnnelse ikke anvendes i pasi-enter ved mer enn en eller noen få behandlinger, da det snart utvikles en HAMA-re spons som gjør MAb ineffektivt så vel som at det oppstår uønskede reaksjoner 0KT3, et IgG2a/k MAb fra mus som gjenkjenner et antigen i T-cellereseptor-CD3-komplek-set har f eks vært godkjent for anvendelse i en rekke land i verden som en immuno-undertrykker ved behandling av akutt allograft-forkastelse (Chatenoud et al (2) og Jeffers et al (3)) Sett på bakgrunn av gnager-naturen for dette og andre slike MAb'er, vil imidlertid en signifikant HAMA-respons som kan inkludere en viktig anti-ldiotype-komponent, kunne bygges opp ved anvendelse Det er derfor klart at det er meget ønskelig å nedsette eller avskaffe denne uønskede HAMA-respons og således utvide anvendelsesområdene for disse svært nyttige antistoffer

Det er derfor foreslått at ikke-humane MAb'er gjøres mindre antigeniske i mennesker Slike teknikker kan generelt betegn-es som "humaniserings"-teknikker Disse teknikker omfatter typisk anvendelse av rekombinant DNA-teknikk for å manipulere DNA-sekvensen som koder for polypeptidkjedene i antistoffmolekylet

Tidligere metoder for humanisering av MAb1 er involverte dan-nelse av chimeriske antistoffer hvor et antigenbmdende sete som omfattet de totale variable domener av ett antistoff er bundet til konstante domener avledet fra et annet antistoff Metoder for å gjennomføre slike chimerisermgsprosedyrer er beskrevet i EP 0120694 (Celltech Limited), EP 0125023 (Genentech Inc og City of Hope), EP-A-0 171496 (Res Dev Corp , Japan), EP-A-0 173494 (Stanford University), og WO 86/01533 (Celltech Limited) Denne sistnevnte Celltech-søkna-den (WO 86/01533) omhandler en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som har de variable domener fra et mus-MAb og de konstante domener fra et humant immunoglobulin Slike humaniserte chimeriske antistoffer inneholder imidlertid fremdeles en betydelige andel av ikke-human ammosyresekvens, dvs de fullstendige ikke-humane variable domener, og kan således fremdeles utløse noe HAMA-respons, særlig ved tilførsel over en forlenget tidsperiode (Begent et al (referanse 4) )

I en alternativ fremgangsmåte beskrevet i EP-A-0239400 (Wmter) , har de hypervariable regioner (CDR'er) i et muse-MAb blitt podet på rammeverkregionene("framework regions") av de variable domener i et humant immunoglobulin ved hjelp av sete-rettet mutagnese ved anvendelse av lange oligonukleotider Den foreliggende oppfinnelse vedrører humaniserte antistoffmolekyler som er fremstilt i henhold til denne alte-rnative fremgangsmåte, dvs CDR-podede humaniserte antistoffmolekyler Slike CDR-podede humaniserte antistoffer vil i mye mindre utstrekning føre til en HAMA-respons enn de humaniserte chimeriske antistoffer på bakgrunn av at de inneholder en mye mindre andel av ikke-human ammosyresekvens

Det tidligste arbeid i forbindelse med humanisering av MAb'er ved hjelp av CDR-poding ble gjennomført på MAb'er som gjenkjenner syntetiske antigener, slik som NP- eller NIP-antigener Eksempler hvor et muse-MAb som gjenkjenner et lysozym og et rotte-MAb som gjenkjenner et antigen på humane T-celler ble humanisert ved hjelp av CDR-podmg, er imidlertid henholdsvis beskrevet av Verhoeyen et al (5) og Riechmann et al (6) Fremstillingen av CDR-podet antistoff mot antigenet på humane T-celler er også beskrevet i WO 89/07452 (Medical Research Council)

I Riechmann et al/Medical Research Council er det funnet at overføring av CDR-regionene alene (som definert av Kabat, referanse (7) og (8)) ikke var tilstrekkelig til å gi tilfredsstillende antigen-bindingsaktivitet i det CDR-podede produkt Riechmann et al fant at det var nødvendig å bytte en sermrest i stilling 27 i den humane sekvens med den tilsvarende rotte-fenylalaninrest for å oppnå et CDR-podet produkt med forbedret antigen-bindingsaktivitet Denne rest i stilling 27 i den tunge kjede er innenfor den strukturelle sløyfe ved siden av CDRl En ytterligere sammenstilling som i tillegg inneholdt en endring fra humant senn til rottetyrosin i stilling 3 0 i den tunge kjede hadde ikke en signifikant endret bindingsaktivitet i forhold til det humaniserte antistoff hvor senn var endret til fenylalamn i stilling 27 alene Disse resultater indikerer at forandringer av rester i den humane sekvens utenfor CDR-regionene, særlig i den strukturelle sløyfe i nærheten av CDRl, kan være nødvendig for å oppnå effektiv antigen-bindingsaktivitet for CDR-podede antistoffer som gjenkjenner mer komplekse antigener Likevel var bindingsaffmiteten for de beste CDR-podede antistoffer som ble oppnådd fremdeles betydelig mindre enn det opprinnelige MAb

Nylig har Queen et al (9) beskrevet fremstillingen av et humanisert antistoff som binder til mterleukin-2-reseptoren, ved at CDR'er av et murint MAb (anti-Tac) kombineres med humane immunoglobulinrammeverk- og konstante regioner De humane rammeverkregioner ble valgt for å gjøre homologien med anti-Tac MAb-sekvensen så stor som mulig I tillegg ble det anvendt data for å identifisere rammeverk-aminosyrerester som det var sannsynlig ville virke sammen med CDR'ene eller antigenet, og det ble anvendt muse-aminosyrer i disse posisjoner i det humaniserte antistoff

I WO 90/07861 foreslo Queen et al fire kriterier for utforming av humaniserte immunoglobuliner Det første kriterium er å anvende, som den humane akseptor, rammeverket {"framework") fra et spesielt humant immunoglobulin som er særlig homologt til det ikke-humane donor-immunoglobulin som skal humanise-res, eller å anvende en konsensus-struktur fra flere humane antistoffer Det andre kriterium er å heller anvende donor-aminosyren enn akseptoren dersom den humane akseptorrest er uvanlig og donorresten er typisk for humane sekvenser i en spesifikk rest av strukturen Det tredje kriterium er å heller anvende donorstuktur-ammosyreresten enn akseptoren i stillinger i umiddelbar nærhet av CDR'ene Det fjerde kriterium er å anvende donor-aminosyreresten i rammeverk-posisjoner hvor aminosyren er forutsagt til å ha et sidekjedeatom innen omtrent 3 Å av CDR1 ene i en tredimensjonal lmmunoglo-bulinmodell og til å være i stand til å interagere gjensidig med antigenet eller med CDR'ene i det humaniserte immunoglobulin Det er foreslått at kriterium 2, 3 eller 4 kan anvendes i tillegg til eller alternativt til kriterium en, og kan anvendes alene eller i enhver kombinasjon

WO 90/07861 beskriver detaljert fremstillingen av et enkelt CDR-podet humanisert antistoff, et humanisert antistoff med spesifisitet for p55 Tac-protemet i IL-2-reseptoren Kombinasjonen av alle fire kriterier, som nevnt over, ble anvendt for å utforme dette humaniserte antistoff, idet variabel region rammeverkene av det humane antistoff Eu (7) anvendes som akseptor I det oppnådde humaniserte antistoff var donor-CDR'ene som definert av Kabat et al (7 og 8) og i tillegg ble muse-donorrestene anvendt i stedet for de humane akseptorrester i stillingene 27, 30, 48, 66, 67, 89, 91, 94, 103, 104, 105 og 107 i den tunge kjede og i stillingene 48, 60 og 63 i den lette kjede i variabel region rammeverkene Det oppnådde humaniserte anti-Tac-antistoff er rapportert til å ha en affinitet for p55 på 3 x IO<9> M-<1>, noe som er omtrent en tredjedel av det som ble oppnådd for murmt MAb

Videre er fremstillingen av CDR-podede humaniserte antistoffmolekyler blitt undersøkt og det er identifisert et stil-lmgshierarki innenfor rammeverket av de variable regioner

(dvs utenfor både Kabat CDR'ene og de strukturelle sløyfer i de variable regioner), hvor aminosyre-identitetene av restene er viktige for å oppnå CDR-podede produkter med tilfredsstillende bindmgsafflnitet Dette har gjort det mulig å etablere

et oppsett for å oppnå tilfredsstillende CDR-podede produkter som kan anvendes i utstrakt grad uavhengig av graden av homologi mellom donor-immunoglobulmet og akseptor-rammeverket Gruppen av rester som er identifisert til å være av kritisk viktighet faller ikke sammen med restene som er identifisert av Queen et al (9)

De foran beskrevne fordeler oppnås med det CDR-podede antistoff, DNA-molekylet, klonings- eller ekspresjonsvektoren, vertscellen samt det diagnostiske preparat slik de er definert med de i kravene anførte trekk

Følgelig, i et første aspekt av oppfinnelsen tilveiebringes et CDR-podet antistoff til bruk som diagnostikum omfattende en tung kjede med et variabelt region-domene omfattende akseptorstruktur og donor-antigenbindings-regioner hvori strukturen omfatter donorrester i minst en av posisjonene 6, 23 og/eller 24, 48 og/eller 49, 71 og/eller 73, 75 og/eller

76 og/eller 78 og 88 og/eller 91, med en betingelse at nevnte CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

I foretrukne utførelsesformer omfatter rammeverket av den tunge kjede donorrester i posisjonene 23, 24, 49, 71, 73 og 78 eller i posisjonene 23, 24 og 49 Restene i posisjonene 71, 73 og 78 i rammeverket av den tunge kjede er foretrukket alle enten akseptorrester eller alle donorrester

I særlig foretrukne utførelsesformer omfatter rammeverket av den tunge kjede i tillegg donorrester i en, noen eller i alle posisjonene 6, 37, 48 og 94 Det er også særlig foretrukket at restene i posisjoner i rammeverket av den tunge kjede som vanligvis beholdes på tvers av spesies, dvs posisjonene 2, 4, 25, 36, 39, 47, 93, 103, 104, 106 og 107 ytterligere omfatter donorrester dersom de ikke er beholdt mellom donor og akseptor Mest foretrukket omfatter rammeverket av den tunge kjede i tillegg donorrester i posisjoner 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93 og 94, 103, 104, 106 og 107

I tillegg omfatter rammeverket av den tunge kjede eventuelt donorrester i en, noen eller i alle posisjonene l og 3, 72 og 76,

69 (dersom 48 er forskjellig mellom donor og akseptor),

38 og 46 (dersom 48 er donorresten),

80 og 2 0 (dersom 69 er donorresten),

67,

82 og 18 (dersom 67 er donorresten),

91,

88, og

hvilken som helst eller flere av 9, 11, 41, 87, 108, 110 og 112

I det første og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelse skal det vises til CDR-podede antistoffprodukter til bruk som diagnostikum som omfatter akseptorrammeverk og donoranti-genbmdende regioner Det skal forståes at oppfinnelsen i stor utstrekning kan anvendes for CDR-podmg av antistoffer generelt Donor- og akseptorantistoffene kan således avledes fra dyr av den samme spesies og til og med fra samme anti-stoffgruppe eller undergruppe Det er imidlertid mer vanlig at donor- og akseptorantistoffene er avledet fra dyr av forskjellig spesies Donorantistoffet er typisk et ikke-humant antistoff, slik som et gnager-MAb, og akseptorantistoffet er et humant antistoff

I det første og andre aspekter av den foreliggende oppfinnelse, omfatter den donorantigenbindende regionen typisk minst ett CDR fra donorantistoffet Vanligvis omfatter den donorantigenbindende regionen minst to og foretrukket alle tre CDR'er av hver av de tung kjede og/eller lett kjede variable regioner CDR'ene kan omfatte Kabat CDR'er, strukturell sløyfe CDR'er eller en kompositt av Kabat CDR'er og strukturell sløyfe CDR'er og enhver kombinasjon av disse Foretrukket omfatter de antigenbmdende regionene i det variable domene av den CDR-podede tunge kjede CDR'er som tilsvarer Kabat CDR'er ved CDR2 (restene 50 - 65) og CDR3 (restene 95 -

100) og en kompositt av Kabat CDR'er og strukturell sløyfe CDR1 er ved CDRl (restene 2 6 - 35)

Angivelsene av restene som er gitt over og andre steder i den foreliggende søknad er nummerert i henhold til Kabat-nummereringen (referansene (7) og (8)) Således vil rest-angivelser ikke alltid tilsvare direkte til den lineære nummerering av aramosyrerestene Den virkelige lineære aminosyresekvens kan inneholde færre eller ytterligere aminosyrer enn i den strenge Kabat-nummerering tilsvarende til en forkortning av, eller mnføyning inn i, en strukturkomponent, enten rammeverk eller CDR, av den grunnleggende variable domene struktur Den variable region i den tunge kjede i anti-Tac-antistoffet som beskrevet av Queen et al (9) inneholder f eks en enkel aminosyre-mnføyning (rest 52a) etter rest 52 i CDR2 og en mnføyning omfattende tre aminosyrer (rester 82a, 82b og 82c) etter rammeverk-rest 82 i Kabat-nummereringen Den korrekte Kabat-nummerering av rester kan bestemmes før et gitt antistoff ved at regioner med homologi i antistoffets sekvens ordnes med en "standard" Kabat-nummerert sekvens

I et andre aspekt tilveiebringer også den foreliggende oppfinnelse et CDR-podet antistoffmolekyl til bruk som diagnostikum omfattende en lett kjede med et variabel region domene omfattende akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner hvor rammeverket omfatter donorrester i det minste i en av posisjonene 1 og/eller 3 og 46 og/eller 47, med den betingelse at det CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren Den CDR-podede lette kjede i følge det andre aspekt av oppfinnelsen omfatter foretrukket donorrester i posisjonene 46 og/eller 47

I et tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes også et CDR-podet antistoffmolekyl til bruk som diagnostikum omfattende en lett kjede med et variabelt region domene omfattende akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner hvor rammeverket omfatter donorrester i minst en av posisjonene 46, 48, 58 og 71, med den betingelse at det CDR-

podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

I en foretrukket utførelsesform av det tredje aspekt, omfatter rammeverket donorrester i alle posisjoner 46, 48, 58 og 71

I særlig foretrukne utførelsesformer av det andre og tredje aspekt, omfatter strukturen ytterligere donorrester i posisjoner 36, 44, 47, 85 og 87 Likeledes, vil posisjoner i lett kjede rammeverket som vanligvis beholdes på tvers av spesies, dvs posisjoner 2, 4, 6, 35, 49, 62, 64 - 69, 98, 99, 101 og 102 i tillegg omfatte donorrester dersom de ikke er beholdt mellom donor og akseptor Mest foretrukket omfatter lett kjede rammeverket i tillegg donorrester i posisjoner 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64 - 69, 85, 87, 98, 99, 101 og 102

Dessuten, inneholder rammeverket i det andre eller tredje aspekt eventuelt donorrester i en, noen eller alle av posisjonene

1 og 3,

63 , 6 0 (dersom 60 og 54 er i stand til å danne en potensiell saltbro), 70 (dersom 70 og 24 er i stand til å danne potensiell saltbro), 73 og 21 (dersom 47 er forskjellig mellom donor og akseptor), 37 og 45 (dersom 47 er forskjellig mellom donor og akseptor), og

hvilken som helst eller flere av 10, 12, 40, 80, 103 og 105

Foretrukket omfatter de antigenbmdende regionene i det CDR-podede lett kjede variable domene CDR'er tilsvarende til Kabat CDR'er i CDRl (rest 24 - 34), CDR2 (rest 50 - 56) og CDR3 (rest 89 - 97)

I et fjerde aspekt tilveiebringer oppfinnelsen ytterligere et CDR-podet antistoffmolekyl til bruk som diagnostikum som omfatter minst en CDR-podet tung kjede og mmst en CDR-podet lett kjede i henhold til det første og andre eller første og tredje aspekt av den foreliggende oppfinnelse, med den betingelse at nevnte CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

De humaniserte antistoffmolekyler og kjeder i henhold til oppfinnelsen kan omfatte et fullstendig antistoffmolekyl, med tunge og lette kjeder i full lengde, et fragment derav som et Fab, (Fab')2 eller FV-fragment, en lett kjede eller tung kjede monomer eller dimer, eller et enkeltkjedet antistoff, f eks enkelkjedet FV hvor tung og lett kjede variable regioner er bundet sammen ved hjelp av en peptidbindmg, eller et hvilket som helst annet CDR-podet molekyl med den samme spesifisitet som det opprinnelige donorantistoff Likeledes kan den CDR-podede tung og lett kjede variable region passende kombineres med andre antistoff-domener De tunge eller de lette kjeder eller de humaniserte antistoffmolekyler i henhold til oppfinnelsen kan også ha et effektor-eller reportermolekyl festet dertil Det kan f eks ha en tnakrosyklus for chelatering av et tungt metallatom, eller et toksin, som nem, festet dertil ved hjelp av en kovalent brobindmgsstruktur Alternativt kan prosedyrene for rekombinant DNA-teknologi anvendes for å fremstille et lmmunoglobu-lmmolekyl hvor Fc-fragmentet eller CH3-domenet i et fullstendig immunoglobulinmolekyl er blitt erstattet med, eller har festet dertil ved hjelp av peptidbindmg, et funksjonelt lkke-immunoglobulmprotem som et enzym eller et toksinmole-kyl

Hvilke som helst passende akseptor variabel region rammeverk-sekvenser kan anvendes under hensyntagen til klasse/type av

donorantistoffet hvorfra de antigenbmdende regionene er avledet Typen akseptorrammeverk som anvendes er foretrukket av samme/lignende klasse/type som donorantistoffer Følgelig kan rammeverket velges for å maksimere/optimalisere homologi med donorantistoffsekvensen, særlig i posisjoner nær eller i nabostilling til CDR'ene En høy grad av homologi mellom donor-og akseptorsekvenser er imidlertid ikke viktig for an-

vendelsen av den foreliggende oppfinnelse Ved den foreliggende oppfinnelse identifiseres et system av rammeverkrest-posisjoner hvor donorrester kan være viktige eller ønske-lige for å oppnå et CDR-podet antistoffprodukt med tilfredsstillende bmdmgsegenskaper De CDR-podede produkter har vanligvis bmdmgsaffmiteter på minst IO<5> M"<1>, foretrukket minst omtrent IO<8>M"<1>, eller særlig i området IO<8> - IO<12> M"<1 >Prinsippielt kan den foreliggende oppfinnelse anvendes for enhver kombinasjon av donor- og akseptorantistoffer uten hensyn til graden av homologi mellom deres sekvenser Et oppsett for anvendelse av den foreliggende oppfinnelse på et hvilket som helst spesielt donor-akseptor antistoffpar er gitt i det etterfølgende Eksempler på humane rammeverk som kan anvendes er KOL, NEWM, REI, EU, LAY og POM (referanse 4 og 5) og lignende, f eks KOL og NEWM for den tunge kjede og REI for den lette kjede og EU, LAY og POM for både den tunge kjede og den lette kjede

Også konstant region domenene i produktene i henhold til oppfinnelsen kan velges under hensyntagen til antistoffets fore-slåtte funksjon og særlig de effektorfunksjoner som kreves Konstant region domenene kan f eks være human IgA-, IgE-, IgG- eller IgM-domener Spesielt kan humane IgG konstant region domener anvendes, særlig av isotypene IgGl og IgG3, når det humaniserte antistoffmolekyl er bestemt til terapeutiske anvendelser, og antistoff-effektorfunksjoner kreves Alternativt kan IgG2- og IgG4-isotyper anvendes når det humaniserte antistoffmolekyl er beregnet for terapeutiske formål og når antistoff-effektorfunksjonen ikke er nødvendig, f eks for enkel blokkering av lymfokinaktivitet

Resten av antistoffmolekylene behøver imidlertid ikke omfatte bare proteinsekvenser fra immunoglobuliner Et gen kan f eks konstrueres hvori en DNA-sekvens som koder for en del av en human immunoglobulinkjede fusjoneres til en DNA-sekvens som koder for ammosyresekvensen av et funksjonelt polypeptid slik som et effektor- eller reportermolekyl

Den CDR-podede tunge og lette kjede i antistoffet og anti-stoffmolekylproduktene fremstilles foretrukket ved rekombinant DNA-teknikk

Ytterligere aspekter av den foreliggende oppfinnelse inkluderer således også DNA-sekvenser som koder for de CDR-podede tunge og lette kjeder, klonings- og ekpresjonsvektorer som inneholder DNA-sekvensene, vertsceller som er transformert med DNA-sekvensene og diagnostisk preparat som omfatter et antistoffmolekyl som angitt over

De generelle metoder for konstruksjon av vektorene, transfek-sjonsmetoder og dyrkingsmetoder er i seg selv velkjente og utgjør ingen del av oppfinnelsen Slike metoder er f eks vist i referansene 10 og 11

DNA-sekvensene som koder for donoraminosyresekvensen kan oppnås ved hjelp av metoder som er velkjente innen teknikkens stand De donor-kodende sekvenser kan f eks oppnås ved genomisk kloning, eller cDNA-kloning fra passende hybridom-cellelinjer Positive kloner kan screenes ved anvendelse av passende prober for de aktuelle gener for den tunge og lette kjede Også PCR-klonmg kan anvendes

DNA som koder for akseptor, f eks human akseptor, sekvenser kan oppnås på en hvilken som helst passende måte DNA-sekvenser som koder for foretrukne humane akseptor-rammeverk som KOL, REI, EU og NEWM, er f eks lett tilgjengelige for de som arbeider innen dette området

Standardteknikker innen molekylær biologi kan anvendes for fremstilling av DNA-sekvenser som koder for de CDR-podede produkter Ønskede DNA-sekvenser kan syntetiseres helt eller delvis ved anvendelse av oligonukleotidsynteseteknikker Sete-rettet mutagenese og polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikker kan passende anvendes Oligonukleotid-rettet syntese som beskrevet av Jones et al (referanse 20) kan f eks anvendes Også oligonukleotid-rettet mutagenese av en variabel region som på forhånd er fjernet, som f eks beskrevet av Verhoeyen et al (referanse 5) eller Riechmann et al (referanse 6) kan anvendes Også enzymatisk tilføying i avbrutte oligonukleotider ved anvendelse av T4 DNA-polymerase som f eks beskrevet av Queen et al (referanse 9) kan anvendes

Ethvert passende vertscelle/vektorsystem kan anvendes for ekspresjon av DNA-sekvensene som koder for de CDR-podede tunge og lette kjeder Bakterielle f eks E coli og andre mikrobielle systemer kan anvendes, særlig for ekspresjon av antistoff-fragmenter som FAb og (Fab<1>)2-fragmenter, og særlig FV-fragmenter og antistoff-fragmenter med en enkelt kjede, f eks FVer med enkelt kjede Eukaryotiske f eks ekspresjons-systemer fra pattedyr-vertsceller kan anvendes for fremstilling av større CDR-podede antistoffprodukter, inkluderende fullstendige antistoffmolekyler Passende pattedyr-vertsceller inkluderer CHO-celler og myelom- eller hybridomcelle-lmjer

I et ytterligere aspekt tilveiebringer således den foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et CDR-podet antistoffprodukt omfattende

(a) fremstilling, i en ekspresjonsvektor, av et operon med DNA-sekvens som koder for en tung kjede av et antistoff i henhold til det første aspekt av oppfinnelsen, og/eller (b) fremstilling, i en ekspresjonsvektor, av et operon med en DNA-sekvens som koder for en komplementær lett kjede av et antistoff i henhold til det andre eller tredje aspekt av oppfinnelsen, (c) transfeksjon av en vertscelle med den eller hver vektor,

og

(d) dyrking av den transfekterte cellelinje for fremstilling av det CDR-podede antistoffprodukt

Det CDR-podede produkt kan omfatte polypeptid avledet fra kun den tunge eller den lette kjede, hvor kun en tung eller lett kjede polypeptid-kodende sekvens anvendes for å transfektere vertscellene

For fremstilling av produkter som omfatter både tunge og lette kjeder, kan cellelinjen transfekteres med to vektorer, idet den første vektor kan inneholde et operon som koder for et peptid avledet fra en lett kjede og den andre vektor kan inneholde et operon som koder for et polypeptid avledet fra en tung kjede Vektorene er foretrukket identiske, unntatt når det gjelder kodesekvenser og selekterbare markører, for å sikre, så langt som mulig, at hver polypeptidkjede uttrykkes likt Alternativt kan en enkel vektor anvendes, idet vektoren inkluderer sekvensene som koder for polypeptider som er avledet fra både den lette og den tunge kjede

DNA i de sekvenser som koder for de lette og tunge kjeder kan omfatte cDNA eller genomisk DNA eller begge Det er imidlertid foretrukket at DNA-sekvensen som koder for den tunge eller lette kjede omfatter i det minste delvis genomisk DNA, foretrukket fusjonert cDNA og genomisk DNA

Den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for antistoffer med en hvilken som helst passende spesifisitet Oppfinnelsen kan imidlertid fordelaktig anvendes for å humanisere ikke-humane antistoffer som anvendes for m vivo diagnose Antistoffene kan således være steds-spesifikke antistoffer slik som tumor-spesifikke eller celleoverflate-spesifikke antistoffer som passende kan anvendes i m vivo diagnose, f eks innen tumor-avbildmg Eksempler på celleoverflate-spesifikke antistoffer er anti-T-celle antistoffer, som anti-CD3, og CD4 og adhe-sjonsmolekyler som CR3, ICAM og ELAM Antistoffene kan ha spesifisitet for mterleukmer (inkluderende lymfokiner, vekstfaktorer og stimulerende faktorer), hormoner og andre biologisk aktive forbindelser, og reseptorer for hvilken som helst av disse Antistoffene kan f eks ha spesifisitet for hvilken som helst av de følgende interferoner a, S, y eller

8, ILI, 112, IL3 eller IL4 OSV, TNF, GCSF, GMCSF, EPO, hGH

i eller insulin osv

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer som nevnt også diagnostiske preparater som omfatter de CDR-podede produkter i henhold til oppfinnelsen for anvendelse av slike preparater innen diagnose

Et ytterligere aspekt ved den foreliggende oppfinnelse tilveiebringes således et diagnostisk preparat som omfatter et

antistoff eller molekyl med CDR-podet tung eller lett kjede i henhold til tidligere aspekter av den foreliggende oppfinnelse sammen med en farmasøytisk tålbar bærer, fortynnmgsmiddel eller hjelpestoff

For diagnose tilføres en effektiv mengde av et antistoff eller molekyl med CDR-podet tung eller lett kjede i henhold til de tidligere aspekter av oppfinnelsen, til et menneske eller et dyr

En foretrukket protokoll for oppnåelse av antistoff med CDR-podede tunge og lette kjeder fremstilt i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse er angitt i det etterfølgende sammen med den logiske begrunnelse som denne protokoll er utledet fra

Protokoll

Det er først og fremst nødvendig å sekvensere det DNA som koder for de variable regioner i den tunge og lette kjede i donorantistoffet, for å bestemme deres aminosyresekvenser Det er også nødvendig å velge passende akseptor variable regioner i den tunge og lette kjede, med kjent aminosyresekvens Den CDR-podede kjede utformes deretter med utgangs-punkt i basisen av akseptorsekvensen Det skal forstås at donor- og akseptor-ammosyrerestene i noen tilfeller kan være identiske i en spesiell posisjon og det kreves således ingen forandringer av akseptor-rammeverkresten

1 I et første trinn ble akseptorrester erstattet med donorrester i CDR'ene For dette formål er CDR'ene foretrukket definert som følger

De posisjoner hvori akseptor skal erstattes med donorrester i rammeverket velges deretter som følger, først og fremst med hensyn til den tunge kjede og deretter med hensyn til den lette kjede

2 Tung kjede

2 1 Velg donorrester i alle posisjoner 23, 24, 49, 71, 73 og 78 i den tunge kjede og i alle posisjoner 23, 24 og 49 (71, 73 og 78 er alltid enten alle donor eller alle akseptor) 2 2 Undersøk at de følgende har den samme aminosyre i donor-og akseptorsekvenser, og dersom ikke velg foretrukket donoren 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103,

104, 106 og 107

2 3 For å optimalisere affiniteten ytterligere, overvei valg av donorrester i en, noen eller hvilke som helst av i 1,3

li 72, 76

in Dersom 48 er forskjellig mellom donor- og akseptorsekvenser, overvei 69

iv Dersom donorresten velges i 48, overvei 3 8 og 4 6

v Dersom donorresten velges i 69, overvei 80 og

deretter 20

vi 67

vu Dersom donorresten velges i 67, overvei 82 og

deretter 18

vin 91

lx 88

X 9, 11, 41, 87, 108, 110, 112

3 Lett kjede

3 1 Velg donor i 46, 48, 58 og 71

3 2 Undersøk at de følgende har den samme aminosyre i donor-og akseptorsekvenser, og dersom dette ikke er tilfelle velg foretrukket donor

2, 4, 6, 35, 38, 44, 47, 49, 62, 64 - 69, 85, 87, 98,

99, 101 og 102

3 3 For å optimalisere affiniteten ytterligere, overvei valg av donorrester i en, noen eller hvilken som helst av

1,3

li 63

ni 60, dersom 60 og 54 er i stand til å danne en

potensiell saltbro

iv 70, dersom 70 og 24 er i stand til å danne en

potensiell saltbro

v 73, og 21 dersom 47 er forskjellig mellom donor og

akseptor

vi 3 7, og 45 dersom 47 er forskjellig mellom donor og

akseptor

Vil 10, 12, 40, 80, 103, 105

Praksis

For å overføre bindingsstedet i et antistoff mn i en forskjellig akseptorrammeverk, må en rekke faktorer tas i betraktning

1 Omfanget av CDR'ene

CDR'ene ("Complementary Determining Regions") ble definert av Wu og Kabat (referansene 4 og 5) på grunnlag av en analyse som vedrører varierbarheten av forskjellige regioner i anti-stof f -variable regioner Tre regioner pr domene ble aner-kjent I den lette kjede er sekvensen 24 til og med 34, 50 til og med 56, og 8 9 til og med 97 (nummerering i henhold til Kabat (referanse 4), Eu Index) og i den tunge kjede er sekvensene 31 til og med 35, 50 til og med 65 og 95 til og med 102

Når antistoffstrukturene ble tilgjengelige var det tydelig at disse CDR-regioner hovedsakelig tilsvarer sløyferegioner som strekker seg fra )3-"barrel" (lukket p-plate)-rammeverket i de lette og tunge variable domener For Hl var der er en uover-ensstemmelse ved at sløyfen var fra 26 til og med 32 og for H2 var sløyfen 52 til 56 og for L2 fra 50 til 53 Med unntak av Hl, omfattet imidlertid CDR-regionene sløyferegionene og strakk seg mn i S-"barrel"-rammeverket I Hl, har rest 26 en tendens til å være senn og 27 fenylalanin eller tyrosin, rest 29 er fenylalanin i de fleste tilfeller Restene 28 og 3 0 som er overflaterester som utsettes for løsningsmiddel kan være involvert i antigenbinding En forsiktig definisjon av Hl-CDR vil derfor kunne inkludere rester 26 - 35, som derfor inkluderer både sløyferegioner og de hypervariable rester 33

- 35

Det er interessant å merke seg eksempelet etter Riechmann et al (referanse 3), som valgte resten 31 - 35 for CDR-H1 For å danne effektiv antigenbinding, må også rest 27 være rekrut-tert fra donor (rotte) antistoffet

2 Ikke-CDR-rester som bidrar til antigenbinding Ved undersøkelse av tilgjengelige røntgenstråle-strukturer er det blitt identifisert en rekke rester som kan ha en virkning på netto antigenbinding og som kan vises ved forsøk Disse rester kan oppdeles i en rekke grupper 2 l Overflaterester nær CDR (all nummerering som i Kabat et al (referanse 7)) 2 11 Tung kjede - Nøkkelrester er 23, 71 og 73 Andre rester som kan bidra i mindre utstrekning er 1, 3 og 7 6 Endelig er 2 5 vanligvis bevart, men murinresten

bør anvendes dersom der er en forskjell

2 12 Lett kjede - Mange rester nær CDR1 ene, f eks er 63, 65, 67 og 69 bevart Dersom de er bevart, har sannsyn-ligvis ingen av disse overflaterester i den lette kjede en viktig effekt Dersom murinresten i disse posisjoner imidlertid er uvanlig, vil det være fordelaktig å analysere det sannsynlige bidrag nærmere Andre rester som også kan bidra til binding er 1 og 3, og også 60 og 70 dersom restene i disse posisjoner og i henholdsvis 54 og 24 eventuelt er i stand til å

danne en saltbro dvs 60+54, 70+24

2 2 Sammenfoldmgsrester nær CDR'ene

2 2 1 Tung kjede - Nøkkelrester er 24, 49 og 78 Andre nøk-kelrester ville være 36 dersom ikke et tryptofan, 94 dersom ikke et arginm, 104 og 106 dersom ikke glyciner og 10 7 dersom ikke threonin Rester som kan gi ytterligere bidrag til stabil sammenfolding av den tunge kjede og således forbedret affinitet er 2, 4, 6, 38, 46, 67 og 69 67 sammenfolder mot CDR-resten 63 og dette par vil begge enten være fra mus eller begge fra menneske Rester som bidrar til sammenfolding i denne region men fra en større avstand er til slutt 18, 20, 80, 82 og 86 82 sammenfolder mot 67 og 18 sammenfolder igjen mot 82 80 sammenfolder mot 6 9 og 2 0 sammenfolder igjen mot 80 86 danner et H-bindingsnettverk med 3 8 og 4 6 Mange av forskjellene mellom mus og menneske er av mindre betydning, f eks Leu-Ile, men vil kunne ha en mindre virkning på korrekt sammenfolding som vil kunne overføres til endret plassering av

CDR'ene

2 2 2 Lett kjede - Nøkkelrester er 48, 58 og 71 Andre nøk-kelrester vil kunne være 6 dersom ikke glutamm, 3 5 dersom ikke tryptofan, 62 dersom ikke fenylalanin eller tyrosin, 64, 66, 68, 99 og 101 dersom ikke glyciner og 102 dersom ikke threonm Rester som ytterligere bidrar er 2, 4, 37, 45 og 47 Endelig kan rester 73 og 21 og 19 i mindre utstrekning bidra til

sammenfolding over større avstand

2 3 Rester i det variable domenes grenseflate mellom tunge og lette kjeder - I både den tunge og den lette kjede er de fleste ikke-CDR-grenseflaterester bevart Dersom en bevart rest erstattes av en rest med forskjellig karakter, f eks størrelse eller ladning, bør det

anses for retensjon som murinresten

2 3 1 Tung kjede - Rester som man behøver å vurdere er 37 dersom resten ikke er valin, men har et større side-kjedevolum eller har en ladning eller polaritet Andre rester er 39 dersom ikke et glutamin, 45 dersom ikke et leucm, 47 dersom ikke et tryptofan, 91 dersom ikke et fenylalanin eller tyrosin, 93 dersom ikke et alanin og 103 dersom ikke et tryptofan Rest 89 er også i grenseflaten, men er ikke i en posisjon hvor sidekje-den vil kunne ha stor innvirkning 2 3 2 Lett kjede - Rester som man behøver å vurdere er 36, dersom ikke et tyrosin, 3 8 dersom ikke et glutamin, 44 dersom ikke et prolm, 46, 49 dersom ikke et tyrosin, rest 85, rest 8 7 dersom ikke et tyrosin og 98 dersom ikke et fenylalanin 2 4 Variabel-konstant region grenseflate - Vinkelen mellom variable og konstante regioner kan påvirkes ved forandringer i sammenfolding av nøkkelrester i den variable region mot den konstante region som kan påvirke posisjonen av VL og VH med hensyn til hverandre Man skal derfor legge merke til restene som passende kan være i kontakt med den konstante region I den tunge kjede er overflaterestene som eventuelt er i kontakt med den variable region beholdt mellom antistoffer fra mus og menneske og derfor kan kontaktrestene i den variable region innvirke på V-C-interaksjonen I den lette kjede varierer aminosyrene som er funnet i en rekke av kontaktpunktene i den konstante region, og V- og C-regionene er ikke i en slik nær tilknytning som i den tunge kjede Derfor vil innvirkningene av V-C-grense-flåtene i den lette kjede være av mindre betydning 2 4 1 Tung kjede - Kontaktrester er 7, 11, 41, 87, 108, 110, 112 2 4 2 Lett kjede - I den lette kjede er eventuelle kontaktrester 10, 12, 40, 80, 83, 103 og 105

De overnevnte analyser sammen med søkernes betydelige prak-tiske eksperimentelle erfaring i CDR-podmg av en rekke forskjellige antistoffer har ført til det overnevnte oppsett

Den foreliggende oppfinnelse skal nå eksempelvis beskrives med henvisning til de vedlagte figurer 1-13

Kort beskrivelse av figurene

Fig 1 viser DNA og ammosyresekvenser av den OKT3 lette

kjede,

Fig 2 viser DNA og ammosyresekvenser av den OKT3 tunge

kjede,

Fig 3 viser oppstillingen av 0KT3 ammosyresekvensen av den lette variable region sammen med den for den lette variable region av det humane antistoff REI, Fig 4 viser oppstillingen av 0KT3 ammosyresekvensen av den tunge variable region sammen med den for den tunge variable region av det humane antistoff KOL, Fig 5 viser ammosyresekvensene av den tunge variable region av 0KT3, KOL og forskjellige tilsvarende CDR-podmger, Fig 6 viser ammosyresekvensen av den lette variable region av 0KT3, REI og forskjellige tilsvarende CDR-podmger, Fig 7 viser en grafisk fremstilling av bindmgsf orsøks- resultater for forskjellige podede 0KT3-antistoffer, Fig 8 viser en grafisk fremstilling av blokkeringsforsøks- resultater for forskjellige podede 0KT3-antistoffer, Fig 9 viser en lignende grafisk fremstilling av blokker- ingsf orsøksresultater, Fig 10 viser lignende grafiske fremstillinger for både bindmgsforsøks- og blokkeringsforsøksresultater, Fig 11 viser ytterligere lignende grafiske fremstillinger for både bindmgsforsøks- og blokkeringsforsøks-resultater , Fig 12 viser en grafisk fremstilling av konkurranse-for-søksresultater for et minimalt podet 0KT3-antistoff sammenlignet med 0KT3 munn referansestandard, og Fig 13 viser en lignende grafisk fremstilling av konkur-ranse -f orsøksresultater som sammenligner et fullstendig podet 0KT3-antistoff med den munne referansestandard

Detaljert beskrivelse av utførelsesformer av oppfinnelsen

EKSEMPEL 1

CDR-poding av OKT3

Material og metoder

1 Utaanasceller

Hybndomceller som danner antistoff 0KT3 ble tilveiebragt fra Ortho (seedlot 4882 1) og blir dyrket i et Dulbecco's Modified Eagles Medium uten antibiotika (DMEM) som var tilsatt glutamin og 5 % føtalt kalveserum, og som ble skilt til å gi en overliggende supernatant for evaluering og celler for ekstraksjon av RNA Den overliggende supernatant inneholdt 2 50 ^g/ml murint IgG2a/kappa antistoff Supernatanten inne-holdt ikke munn lambda lett kjede og IgGl, IgG2b, IgG3, IgA og IgM tung kjede 2 0 ml supernatant ble undersøkt for å bekrefte at det tilstedeværende antistoff var OKT3

2 Molekylær bioloaiprosedyrer

De grunnleggende prosedyrer for molekylær biologi var som beskrevet i Maniatis et al (referanse 9) med noen mindre modifikasjoner i enkelte tilfeller DNA-sekvensering ble gjennomført som beskrevet i Sanger et al (referanse 11) og i Amersham International Plc sekvensermgshåndboken Seterettet mutagenese var som beskrevet i Kramer et al (referanse 12) og i Anglian Biotechnology Ltd håndboken COS-celleekspresjon og metabolsk merking var som beskrevet i Whittle et al (referanse 13)

3 Undersøkelsesforsøk

3 1 Samleforsøk

Samleforsøk ble gjennomført på supernatanter fra trans-fiserte COS-celler for å bestemme mengden tilstedeværende intakt IgG

3 11 COS-celler transfektert med 0KT3-gener fra mus Forsøket som ble gjennomført for intakt mus-IgG i COS-celle supernatanter var ELISA med følgende format mikrotiterplater med 96 brønner ble belagt med F(ab<1>)2-geit anti-mus IgG Fc Platene ble vasket i vann og prøver ble tilsatt i løpet av en time ved romtemperatur Platene ble vasket og F(ab')2-geit anti-mus IgG F(ab')2 (HRPO-konjugert) ble deretter tilsatt Substrat ble tilsatt for å vise reaksjonen UPC10, et IgG2a-myelom fra mus ble anvendt som en

standard

3 12 COS- og CHO-celler transfektert med chimeriske eller CDR-podede 0KT3-gener

Bestemmelsen som ble anvendt i forbindelse med chimerisk eller CDR-podet antistoff i COS-celle supernatanter var ELISA med følgende format

mikrotiterplater med 96 brønner ble belagt med F(ab')2-geit anti-humant IgG Fc Platene ble deretter vasket og prøver ble tilsatt og inkubert i en time ved romtemperatur Platene ble vasket og monoklonal anti-human kappa-kjede fra mus ble tilsatt i løpet av en time ved romtemperatur Platene ble vasket og F(ab')2-geit anti-mus IgG Fc (HRPO-konjugert) ble tilsatt

Enzymsubstratet ble tilsatt for å vise reaksjonen Chimerisk B72 3 (IgG4) (referanse 13) ble anvendt som standard Anvendelse av en monoklonal anti-kappa-kjede i dette forsøk tillater at podede antistoffer kan av-leses ut fra den chimeriske standard

3 2 Bestemmelse av antigen-bindingsaktivitet Material fra COS-cellesupernatanter ble analysert for 0KT3-antigen-bindingsaktivitet på CD3 positive celler i en direkte analyse Prosedyren var som følger HUT 78-celler (human T-cellelinje, CD3-positiv) ble holdt i cellekultur Monolag av HUT 78-celler ble fremstilt på ELISA-plater med 96 brønner ved anvendelse av poly-L-lysin og glutaraldehyd Prøver ble tilsatt til monolagene i løpet av en time ved romtemperatur

Platene ble vasket forsiktig ved anvendelse av PBS F(ab')2-geit anti-humant IgG Fc (HRPO-konjugert) eller F(ab')2-geit anti-mus IgG Fc (HRPO-konjugert) ble tilsatt som passende for humaniserte eller museprøver Substrat ble tilsatt for å vise reaksjon Den negative kontroll for den cellebaserte bestemmelse var chimerisk B72 3 Den positive kontroll var Orthomune 0KT3 av mus eller chimerisk 0KT3 når det var tilgjengelig Dette cellebaserte forsøk var vanskelig å gjennomføre, og en alternativ analyse ble utviklet for CDR-podet 0KT3 som var mer sensitiv og lettere å gjennomføre

I dette system ble CDR-podet 0KT3 dannet ved hjelp av COS-celler testet for dets evne til å binde til den CD3-positive HPB-ALL ("human peripheral blood acute lymphocytic leukemia") cellelinje Det ble også testet for dets evne til å blokkere binding av murmt 0KT3 til disse celler Bindingen ble målt ved hjelp av føl-gende prosedyre HPB-ALL-celler ble høstet fra vevs-kultur Cellene ble inkubert ved 4°C i en time med forskjellige fortynninger av test-antistoff, positiv kontroll-antistoff eller negativ kontroll-antistoff Cellene ble vasket en gang og inkubert ved 4°C i en time med FITC-merket geit anti-humant IgG (Fc-spesifikk, museabsorbert) Cellene ble vasket to ganger og analysert ved hjelp av cytofluorografi Chimerisk 0KT3 ble anvendt som en positiv kontroll for direkte binding Celler inkubert med mock-transfektert COS-celle supernatant, etterfulgt av FITC-merket geit anti-humant IgG, var den negative kontroll For å teste den evnen som CDR-podet 0KT3 har til å blokkere munn 0KT3-binding, ble HPB-ALL-cellene inkubert ved 4°C i en time med forskjellige fortynninger av et antistoff eller kontrollantistoff En fast mettende mengde FITC 0KT3 ble tilsatt Prøvene ble inkubert i en time ved 4°C, vasket to ganger og analy-sert ved hjelp cytofluorografi FITC-merket 0KT3 ble anvendt som en positiv kontroll for å bestemme maksimal binding Umerket murin 0KT3 tjente som en referansestandard for blokkering Negative kontroller var ikke-merkede celler med eller uten mock-transfektert cellesupernatant Den evnen som CDR-podet 0KT3 lett kjede har til å binde CD3-positive celler og blokkere bindingen av munn 0KT3 ble først testet sammen med den chimeriske 0KT3 tunge kjede Den chimeriske 0KT3 tunge kjede består av den munne 0KT3 variable region og den humane IgG4 konstante region Gener for den chimeriske tunge kjede uttrykkes i den samme ekspresjonsvektor som anvendes for de CDR-podede gener Ekspresjonsvektoren for CDR-podet lett kjede og ekspresjonsvektoren for den chimeriske tunge kjede ble ko-transfektert mn i COS-celler Hele det chimeriske 0KT3-antistoff (chimerisk lett kjede og chimerisk tung kjede) ble funnet å være i stand til å binde til CD3 positive celler og blokkere bindingen av murint 0KT3 til disse celler

3 3 Bestemmelse av relativ bindmgsaffinitet

De relative bindmgsaffmiteter av CDR-podede anti-CD3 monoklonale antistoffer ble bestemt ved konkurrerende binding (referanse 6) ved anvendelse av den HPB-ALL humane T-cellelinje som en kilde for CD3-antigen, og fluorescem-konjugert murint 0KT3 (F1-0KT3) med en dm<g>saf f miteten av Fl-0KT3-markørantistoffet ble bestemt ved hjelp av en direkte bindmgsbestemmelse hvori økende mengde F1-0KT3 ble inkubert med HPB-ALL (5xl0<5>) i PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 4°C Cellene ble vasket og den fluorescerende intensitet ble bestemt på et FACScan flowcytometer som var kalibrert med kvantitative mikrokule-standarder

(Flow Cytometry Standards, Research Triangle Park,

NC) Fluorescerende intensitet per antistoffmolekyl (F/P-forhold) ble bestemt ved anvendelse av mikrokuler som har et forhåndsbestemt antall mus IgG-antistoff-bindingsseter (Simply Cellular beads, Flow Cytometry Standards) F/P er lik den fluorescerende intensitet av kuler mettet med F1-OKT3 dividert med antall bin-dingsseter pr kule Mengden av bundet og fritt F1-OKT3 ble beregnet fra den gjennomsnittlige fluorescerende intensitet pr celle, og forholdet bundet/fritt ble plottet mot antall mol bundet antistoff En lineær til-pasning ble anvendt for å bestemme bindingsaf f miteten (absolutt verdi av helningen("slope")) For konkurrerende binding, ble økende mengder konkurrerende antistoff tilsatt til en sub-mettende dose av F1-OKT3 og inkubert med FxlO<5> HPB-ALL i 200 ml PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 4°C De fluorescerende intensiteter av cellene ble målt på et FACScan flowcytometer som er kalibrert med kvantitative mikrokule- standarder Konsentrasjonene av bundet og fritt F1-0KT3 ble beregnet Affinitetene av konkurrerende antistoffer ble beregnet fra ligningen [X] - [OKT3] =

(l/Kx) - (l/Ka), hvori Ka er affiniteten av murint 0KT3, Kx er affiniteten av det konkurrerende X, er konsentrasjonen av konkurrerende antistoff hvor bundet/fri binding er R/2, og R er maksimal bundet/fri binding

4 Oppbygning av cDNA-bibliotek

4 1 Fremstilling av mRNA og syntese av cDNA 0KT3-produserende celler ble dyrket som beskrevet over og 1,2 x 10<9->celler ble høstet og mRNA ble ekstrahert

0KT3-produserende celler ble dyrket som beskrevet over og 1,2 x lo<9->celler ble høstet og mRNA ble ekstrahert ved anvendelse av guanidm/LiCl ekstraksjonsprosedy-ren cDNA ble fremstilt ved priming fra Oligo-dT til å danne cDNA med full lengde cDNA ble metylert og

EcoRl-linkere ble tilsatt for kloning

4 2 Oppbygning av bibliotek cDNA-biblioteket ble ligert til pSP65-vektor DNA som var kuttet med EcoRl og 5'-fosfatgruppene ble fjernet ved kalvet arm-f osf atase (EcoRI/CTP) Ligermgen ble anvendt for å transformere Eschericia coil (E coil) HB101 med høy transformasjonseffektivitet Et cDNA-bibliotek ble fremstilt 3 60 0 kolonier ble screenet for den lette kjede og 10 000 kolonier ble screenet

for den tunge kjede

5 Screening

E coli-kolonier som var positive med hensyn til prober for enten tung eller lett kjede ble identifisert ved oligonukleotid-screening med anvendelse av ollgonukleotidene

5'-TCCAGATGTTAACTGCTCAC for den lette kjede som er komplementær til en sekvens i den konstante kappa-region i mus, og 5'-CAGGGGCCAGTGGATGGATAGAC for den tunge kjede som er komplementær til en sekvens i den IgG2a konstante CHl-domene-region i

mus Tolv lett kjede kloner og ni tung kjede kloner ble identifisert og tatt ut for en ytterligere screening Positive kloner fra den ytterligere screening ble dyrket og DNA ble fremstilt Størrelsene av geninnskuddene ble estimert ved gelelektroforese og de med en størrelse som er i stand til å inneholde en uforkortet cDNA ble sub-klonet inn i M13 for DNA-sekvensering

6 DNA- sekvensering

Kloner som representerer fire størrelsesgrupper for både tunge og lette kjeder ble oppnådd i M13 DNA-sekvensen for de 5' ikke-translaterte regioner, signalsekvenser, variable regioner og 3' ikke-translaterte regioner av uforkortede cDNA1 er (figurene l(a) og 2 (a)) ble oppnådd og de tilsvarende ammosyresekvenser ble beregnet {(figurene 1 (b) og 2 (b) ) I fag l(a) er de ikke-oversatte DNA-regioner vist øverst, og i begge figurene 1 og 2 er signalsekvensene understreket

7 Konstruksjon av cDNA- ekspresjonsvektorer

Celltech-ekspresjonsvektorer er basert på plasmidet pEE6hCMV (referanse 14) En polylmker for innskuddet av gener som skal uttrykkes er innført etter den største tidlige direkte promotor/enhancer av det humane Cytomegalovirus (hCMV) Markørgener for seleksjon av plasmidet i transfekterte euka-ryot iske celler kan innskytes som BamHI-kassetter i det unike BamHI-sete av pEE6hCMV, f eks neomarkøren for å gi pEE6hCMV-neo Det er vanlig praksis å innskyte neo- og gpt-markører før genet av interesse innskytes, mens GS-markøren innskytes til sist pga tilstedeværelse av interne EcoRI-seter i kasset-ten

De selekterbare markører uttrykkes fra den SV4 0 sene promoter som også tilveiebringer et replikasjonsorigo slik at vektorene kan anvendes for ekspresjon i det COS-celle transiente ekspresjonssystem

Musesekvensene ble fjernet fra de M13-baserte vektorer som er beskrevet over som EcoRI-fragmenter og klonet inn i enten pEE6-hCMV-neo for den tunge kjede eller inn i EE6-hCMV-gpt for den lette kjede til å gi henholdsvis vektorene pJA13 6 og pJAI35

8 Ekspresjon av cDNA' er i COS- celler

Plasmidene pJA135 og pJA136 ble ko-transfektert inn i COS-celler og supernatant fra transient-ekspresjonsforsøket ble vist til å inneholde sammensatt antistoff som bandt til T-celle-anrikede lymfocytter Metabolske merkingsforsøk med anvendelse av <35>S-methionm viste ekspresjon og sammensetning av tunge og lette kjeder

9 Konstruksjon av chimeriske gener

Konstruksjon av chimeriske gener fulgte en tidligere beskrevet strategi (Whittle et al (referanse 13)) Et restriksjonssete nær 3<1->enden av den variable domenesekvens identfiseres og anvendes til å feste en oligonukleotidadapter som koder for resten av den variable region fra mus og et passende restriksjonssete for festing til den valgte konstante region

9 1 Konstruksjon av lett kjede gen

Lett kjede cDNA-sekvensen fra mus inneholder et Aval-sete nær 3<1->enden av den variable region (fig l(a)) Størsteparten av sekvensen av den variable region ble isolert som et EcoRI-Aval-fragment med 396 basepar En oligonukleotid-adapter ble utformet til å erstatte resten av 3'-regionen i den variable region fra Aval-setet og til å inkludere 5'-restene av den humane konstante region opp til og inkluderende et eneste Narl-sete som tidligere var innarbeidet i den konstante region

Et Hmdlll-sete ble innført til å virke som en markør for innskyt mg av lmkeren Lmkeren ble ligert til VL-fragmentet og det EcoRI-Narl-tilpassede fragment med 413 basepar ble renset fra ligermgsblandmgen

Den konstante region ble isolert som et Narl-BamHl-fragment fra et M13-klon-NW361 og ble ligert med det variable region-DNA mn i en EcoRl/BamHI/CIP pSP65-behandlet vektor i en treveis-reaksjon til å gi plasmid JA143 Kloner ble isolert etter transformasjon inn i E coil og lmkeren og koblingssekvenser ble bekreftet ved tilstedeværelse av HindiII-setet og ved DNA-sekvensering

9 2 Konstruksjon av lett kjede gen - versjon 2 Konstruksjonen av det første chimeriske lett kjede gen gir en fusjon av mus- og humane ammosyresekvenser i koblingen variabel-konstant region I tilfellet med 0KT3-lett kjede er aminosyrene i den chimere kobling

Dette sekvensarrangement introduserer et potensielt sete for asparagm (Asn) bundet (N-bundet) glykosylering av V-C-koblingen Derfor ble en annen versjon av den chimeriske lett kjede ollgonukleotid-adapteren utformet hvor threonm (Thr), den første aminosyre i den humane konstante region, ble erstattet med den ekvivalente aminosyre fra den konstante region i mus, alamn (Ala)

Et internt Hindlll-sete var ikke inkludert i denne adapter, for å differensiere de to chimeriske lett kjede gener

Variabel region fragmentet ble isolert som et EcoRI-Aval-fragment med 3 76 baserpar Oligonukleotidlinkeren ble ligert til Narl-kuttet pNW361 og deretter ble den tilpassede konstante region med 3 96 basepar isolert etter at det modifiserte pNW3 61 var kuttet på nytt med EcoRI Variabel region fragmentet og det modifiserte konstant region fragmentet ble ligert direkte inn i EcoRI/CIP-behandlet pEE6hCMV-neo til å gi pJA137 Opp-rinnelig hadde alle de undersøkte kloner innskuddet i den ukorrekt orientering Innskuddet ble derfor isolert på nytt og klonet på nytt for å vende innskuddet om og gi plasmid pJAl41 Det ble oppnådd flere kloner med innskudd i korrekt orientering og adapter-sekvensen av ett

ble bekreftet ved DNA-sekvensering

9 3 Konstruksjon av tung kjede gen

9 3 1 Valg av gen-isotype for tung kjede

Konstant region isotypen som ble valgt for den tunge

kjede var human IgG4

9 3 2 Genkonstruksjon

Tung kjede cDNA-sekvenser viste et Banl-sete nær 3'-enden av den variable region (fig 2 (a)) Det meste av sekvensen av den variable region ble isolert som et EcoRI/CIP/Banl-fragment med 42 6 basepar En oligonukleotid-adapter ble utformet til å erstatte resten av 31-regionen av den variable region fra Banl-setet opp til og inkluderende et eneste Hindlll-sete som tidligere var blitt innført mn i de første to aminosyrer av den konstante region Lmkeren ble ligert til VH-fragmentet og det EcoRI-HindiII-tilpassede fragment ble renset fra ligermgsblandmgen

Den variable region ble ligert til den konstante region ved at pJA9l ble kuttet med EcoRI og HindiII med fjerning av mtron-fragmentet og erstatning av dette med VH til å gi pJA142 Kloner ble isolert etter transformasjon inn i E coli JM101 og linker-og koblmgssekvenser ble bekreftet ved DNA-sekvensering (Merk Hmdlll-setet er tapt ved kloning)

10 Konstruksjon av chimeriske ekspresjonsvektorer

10 1 Neo-og gpt-vektorer

Den chimeriske lette kjede (versjon 1) ble fjernet fra pJA143 som et EcoRI-fragment og klonet inn i EcoRI/CIP-behandlet pEE6hCMVneo-ekspresjonsvektor til å gi pJA145 Kloner med innskuddet i korrekt orientering ble identifisert ved restriksjonskartlegging

Den chimeriske lette kjede (versjon 2) ble konstruert som beskrevet over Det chimeriske tung kjede gen ble isolert fra pJA142 som et 2,5 kbp EcoRI/BamHI-fragment med 2,5 kilobasepar og klonet mn i det EcoRI/BclI/CIP-behandlede vektorfragment av et derivat av pEE6hCMVgpt

til å gi plasmid pJA144

10 2 GS separate vektorer

GS-versjoner av pJA141 og pJA144 ble konstruert ved at neo- og gpt-kassettene ble erstattet ved en BamHI/Sall/- CIP-behandlmg av plasmidene, isolering av vektorfrag-mentet og ligermg til et GS-holdig fragment av plasmidet pR04 9 til å gi lett kjede vektoren pJA179 og tung

kjede vektoren pJA18 0

10 3 GS enkeltvektor-konstruksjon

Enkeltvektor-konstruksjoner som inneholder cL (chimerisk lett) , cH (chimerisk tung) og GS-gener på ett plasmid i rekkefølgen cL-cH-GS, eller cH-cL-GS og med transkrip-sjon av genene som er hode til hale ("head to tail")f eks cL>cH>GS ble konstruert Disse plasmider ble fremstilt ved at pJA179 eller pJA18 0 ble behandlet med BamHI/CIP og ligert i en Bglll/Hindlll hCMV-promoter-kassett sammen med enten Hmdlll/BamHI-fragmentet fra pJAl4l inn i pJA180 til å gi cH-cL-GS-plasmidet pJA182 eller HmdIII/BamHI-f ragmentet fra pJAl44 inn i pJA179 til å gi cL-cH-GS-plasmidet pJAl8l

11 Ekspresjon av chimeriske gener

11 1 Ekspresjon x COS-celler

Det chimeriske antistoff-plasmid pJA145 (cL) og pJA144 (cH) ble ko-transfektert inn i COS-celler og supernatant fra transient-ekspresjonsforsøket ble vist til å inneholde ("assembled") antistoff som bandt til den humane T-cellelmje HUT 78 Metabolske merkmgsforsøk ved anvendelse av <3>SS-methionm viste ekspresjon og sammensetning av tunge og lette kjeder Mobiliteten av den lette kjede som ses på reduserte geler foreslår imidlertid at det potensielle glykosyleringssted var blitt glykosy-lert Ekspresjon i COS-celler i nærvær av tunicamycin viste en reduksjon av den lette kjedes størrelse i forhold til den som er vist for kontroll-chimeriske antistoffer og den 0KT3 lette kjede fra mus Derfor ble JA141 konstruert og uttrykt I dette tilfelle viste ikke den lette kjede en varierende mobilitet eller endring av størrelsen i nærvær eller fravær av tunicamycin Denne andre versjon av den chimeriske lette kjede, når den uttrykkes sammen med chimerisk tung (cH) kjede, dannet antistoff som viste god binding til HUT 78-celler I begge tilfeller var antigenbinding ekvivalent med den

for museantistoffet

11 2 Ekspresjon i ovane (CHO) celler fra kinesisk hamster Stabile cellelinjer er fremstilt fra plasmidet pJA141/- pJA144 og fra pJA179/pJA18 0, pJAI81 og pJA182 ved transfeksjon inn i CHO-celler

12 CDR- poding

Den metode som anvendes var et forsøk på å innføre til-strekkelige muserester inn i et humant variabel region rammeverk for å danne antigen-bindingsaktivitet som var sammenlignbar med museantistoffene og de chimeriske

antistoffer

12 1 Analyser av den variable region

Fra en undersøkelse av en liten database av strukturer av antistoffer og antigen-antistoff-komplekser er det klart at kun et lite antall antistoffrester er i direkte kontakt med antigenet Andre rester kan bidra til antigen binding ved plassering av kontaktrestene i ønskelige konfigurasjoner og også ved å indusere en stabil sammen-foldmg av de inviduelle variable domener og stabil interaksjon av de variable domener i den lette og tunge kjede De rester som velges for overføring kan identi-fisering på en rekke måter

(a) Ved eksaminasjon av antistoff røntgenkrystall-strukturer kan antigen-bmdingsoverflaten i alt vesentlig lokaliseres på en rekke sløyfer, tre pr domene, som strekker seg fra p-"barrel" rammeverket (b) Ved analyse av variabelt domene sekvenser av antistoffet kan hypervariable regioner (betegnet "the Complementary Determinmg Regions" (CDR'er) av Wu og Kabat (referanse 5)) identifiseres I de fleste, men ikke alle tilfeller tilsvarer disse CDR'er, men strekker seg litt utenfor, de overnevnte sløyfe-regioner (c) Rester som ikke identifiseres ved (a) og (b) kan bidra til antigenbinding direkte eller indirekte ved at de påvirker topologien i antigen-bindings-setet, eller ved at de induserer en stabil sammen-foldmg av de individuelle variable domener og en stabilisering av den inter-variable domenemterak-sjon Disse rester kan enten identifiseres ved at sekvensene for et visst antistoff legges oppå en kjent struktur og man ser på nøkkelrester for deres bidrag, eller ved sekvens-oppstillingsanalyser i det man merker seg "ldiosynkratiske" rester med

etterfølgende undersøkelse av deres strukturelle lokalisering og lignende effekter

12 1 1 Lett kjede

Fig 3 viser en oppstilling av sekvenser for den humane rammeverkregion REI og den 0KT3-variable region i den lette kjede De strukturelle sløyfer (LOOP) og CDR'er (Kabat) som man antar svarer til antigen-bmdmgsregionen er markert En rekke andre rester som også eventuelt bidrar til antigenbinding som beskrevet i 13 l(c) er også markert Over sekvensene i fig 3 indikerer resttypen den romlige lokalisering av hver rest-sidekjede, utledet ved. eksaminasjon av oppløste strukturer fra røntgen-krystallografl-analyser Nøkkelen til denne rest-type-angivelse er som følger

N - nær CDR (Fra røntgenstrukturer)

P - Sammenfolding

S - Overflate

I - Grenseflate

B - Begravet

ikke-sammenfolding E - Synlig

* - Grenseflate ;- Sammenfoldmg/Synlig del ;- Ikke-CDR-rester som kunne være nødvendig å etterlate som musesekvens De rester som er understreket i fig 3 er aminosyrer REI ble valgt som det humane rammeverk fordi den lette kjede er en kappa-kjede og de kappa-variable regioner viser større homologi med musesekvensene enn en lambda lett kjede variabel region, f eks KOL (se under) REI ble valgt fremfor en annen kappa lett kjede fordi røntgenstrukturen av den lette kjede har vært bestemt slik at en struktur-undersøkelse av de individuelle rester vil kunne ;gj ennomføres ;12 1 2 Tung kjede ;Likeledes viser fig 4 en sammenstilling av sekvenser for den humane rammeverkregion KOL og den 0KT3 variable region i den tunge kjede De strukturelle sløyfer og CDR'er som antas å korrespondere med antigen-bmdmgsregionen er markert En rekke andre rester som også kan bidra til antigenbinding er markert, som beskrevet i 12 l(c) Nøkkel-resttypen og andre indikatorer som anvendes i fig 4 er de samme som dem som ble anvendt i fig 3 KOL ble valgt som tung kjede rammeverket fordi røntgen-strukturen er blitt bestemt til en bedre oppløsning enn f eks NEWM og sekvensoppstillingen av den 0KT3 variable region i den tunge kjede viste en noe ;bedre homologi med KOL enn med NEWM ;12 2 Utforming av variable gener ;Variabel region domenene ble utformet med anvendelse av variabel region optimal kodon fra mus (Grantham og Perrin (referanse 15)) og ved anvendelse av B72 3 signalsekvenser (Whittle et al (referanse 13)) Sekvensene ble utformet til å festes til den konstante region på samme måte som for de overnevnte chimeriske gener Enkelte sammenstillinger inneholdt "Kozak konsensus -sekvensen" (Kozak (referanse 16)) direkte bundet til 5' av signalsekvensen i genet Dette sekvens-motiv antas å spille en viktig rolle i translasjons-initiering i eukaryoter ;12 3 Genkonstruksjon ;For å bygge de variable regioner er forskjellige strategier tilgjengelig Sekvensen kan sammenstilles ved anvendelse av oligonukleotider på en lignende måte som hos Jones et al (referanse 17) eller ved samtidig erstatning av alle CDR'er eller sløyferegioner ved oligonukleotid-rettet setespesifikk mutagenese på samme måte som i henhold til Verhoeyen et al (referanse 2) Begge strategier ble anvendt og en liste over konstruksjoner er angitt i tabellene 1 og 2 og i fig 4 og 5 I en rekke tilfeller ble det notert at mutagenese -metoden førte til delesjoner og rearrangementer i genet som remodelleres, mens en vellykket sammenstilling var meget følsom med hensyn til kvaliteten av oligonukleotidene ;13 Konstruksjon av ekspresjonsvektorer ;Gener ble isolert fra M13- eller SP65-baserte inter-mediære vektorer og klonet inn i pEE6hCMVneo for de lette kjeder og pEE6hCMVgpt for de tunge kjeder på samme måte som for de overnevnte chimeriske gener ;14 Ekspresjon av CDR- podede gener ;14 1 Fremstilling av antistoff bestående av podede lette (gL) kjeder med tunge (mH) kjeder fra mus eller chimeriske tunge (cH) kjeder ;Alle gL-kjeder i forening med mH eller cH ga rimelige mengder antistoff Innskudd av Kozak-konsensus-sekvensen i en posisjon 5' til ATG (kgL-konstrukter) førte imidlertid til en 2 - 5 dobbel forbedring i netto ekspresjon Over en omfattende serie med forsøk ble ekspresjonsnivåene økt fra omtrent 200 ng/ml til omtrent 500 ng/ml for kgL/cH- eller kgL/mH-kombinasjoner ;Når den direkte binding til antigen på HUT 78-celler ble målt, førte et konstrukt som var utformet til å inkludere musesekvens basert på sløyfelengde (gLl2l) ikke til aktivt antistoff i forening med mH eller cH Et konstrukt utformet til å inkludere musesekvens basert på Kabat CDR'er (gL221) viste noe svak binding i forening med mH eller cH Når rammeverkrester 1, 3, 46, 47 imidlertid ble forandret fra de humane til de munne 0KT3-ekvivalenter basert på de argumenter som er angitt i avsnitt 12 1, ble det vist antigen binding når begge de nye konstrukter, som ble betegnet 121A og 221A var ko-uttrykt med cH Når virkningen av disse rester ble undersøkt mer detaljert, fremkom det at rester 1 og 3 ikke er viktige medvirkende rester da produktet av gL22lB-genet viser liten påvisbar bindingsaktivitet sammen med cH Lett kjede produktet av gL221C, hvor musesekvenser er tilstede i 46 og 47, viser god bindingsaktivitet i forening med cH ;14 2 Fremstilling av antistoff bestående av podede tunge (gH) kjeder med lette (mL) kjeder fra mus eller chimeriske lette (cL) kjeder ;Ekspresjon av gH-genene viste seg å være vanskeligere å oppnå enn for gL For det første viste det seg at inklu-dering av Kozak-sekvensen ikke hadde noen markert virkning på ekspresjon av gH-gener Ekspresjonen synes å være noe forbedret, men ikke i samme grad som man ser for den podede lette kjede ;Det viste seg også å være vanskelig å demonstrere fremstilling av forventede mengder material når sløyfevalget (aminosyre 26-32) for CDRl anvendes , f eks gH121, 131, 141 og man kan ikke trekke noen konklusjoner i forbindelse med disse konstrukter ;Ko-ekspresjonen av gH341-genet med cL eller mL har dessuten variert og har hatt en tendens til å danne mindre mengder antistoff enn cH/cL- eller mH/mL-kombinasjoner Endringene til gH341 for å danne gH3 41A og gH341B førte til forbedrede ekspresjonsnivåer ;Dette kan enten skyldes en generell økning i musesekvens- fraksjonen i den variable region, eller endrin-gen i posisjonen 63 hvor resten er bragt tilbake til den humane aminosyre valm (Val) fra fenylalanin (Phe) for å unngå mulige interne sammenfoldingsproblemer med resten av det humane rammeverk Dette arrangement forekommer også i gH331 og gH3 21 ;Når gH32l eller gH331 ble uttrykt i forening med cL, ble det dannet antistoff, men antistoff-bindingsaktivitet ble ikke påvist Når det mer konservative gH34l-gen ble anvendt kunne antigen binding påvises sammen med cL eller mL, men aktiviteten var akkurat like over bakgrunnsnivået Når ytterligere muserester ble substituert basert på argumentene i 12 1, kunne antigen binding klart demonstreres for antistoffet som var dannet når ;kgH341A og kgH34lB ble uttrykt i forening med cL ;14 3 Fremstilling av fullstendig CDR-podet antistoff kgL221A-genet ble uttrykt sammen med kgH34l, kgH34lA eller kgH341B For kombinasjonen kgH221A/kgH341 ble det dannet svært lite material i en normal COS-celleekspresjon For kombinasjonene kgL221A/kgH341A eller kgH221A/- kgH34lB ble det dannet antistoffmengder som var tilsvarende dem for gL/cH ;I flere forsøk kunne ingen antigen-bindingsaktivitet påvises med kgH221A/gH34l eller kgH22lA/kgH341-kombma-sjoner, skjønt ekspresjonsnivåene var svært lave Antigen binding ble påvist når kgL221A/kgH341A eller kgH221A/kgH341B-kombinasjoner ble uttrykt Når antistoffet var dannet fra kombinasjonen kgL22lA/kgH341A var antigen bindingen svært lik den for det chimeriske antistoff ;En analyse av de overnevnte resultater er gitt i det etterfølgende 15 Diskusjon i forbindelse med resultatene fra CDR- podmg I utformingen av det fullstendige humaniserte antistoff var målet å overføre det minimale antall muse-aminosyrer som vil gi antigen binding på et humant antistofframmeverk 15 1 Lett kjede ;15 1 1 Omfanget av CDR'ene ;For den lette kjede er de regioner som definerer sløy-fene og som er kjent fra strukturstudier for andre antistoffer til å inneholde antigen-kontaktrester, og de hypervariable sekvenser som er definert av Kabat et al (referanser 4 og 5) som "Complementarity Determining Regions" (CDR'er), ekvivalente for CDR2 For CDRl strekker den hypervariable region seg fra rester 24 til og med 34 mens den strukturelle sløyfe strekker seg fra 26 til og med 32 Når det gjelder 0KT3 er der kun en aminosyre som er forskjellig mellom de to valg, ved aminosyre 24, hvor musesekvensen er et senn og den humane struktur REI har glutamin For CDR3 strekker sløyfen seg fra rest 91 til og med 96 mens Kabat hypervariabiliteten strekker seg fra rester 8 9 til og med 97 For 0KT3, er aminosyrer 89, 90 og 97 de samme mellom 0KT3 og REI (fig 3) Når konstrukter basert på sløyfevalget for CDRl (gL121) og Kabat-valget (gL22l) ble gjennomført og uttrykt sammen med mH eller cH, fant man intet bevis for antigen bindingsaktivitet for gL121, men spor av aktivitet kunne påvises for gL221, noe som foreslår at en enkelt ekstra muserest i den podede variable region kunne ha noen påvisbar effekt Begge genkonstrukter var rimelig godt uttrykt i det transiente ekspresjonssystem ;15 12 Rammeverkrester ;De gjenværenderammeverkrester ble deretter ytterligere undersøkt, særlig aminosyrer som var kjent fra rønt-genanalyser av andre antistoffer til å være nær CDR'ene og også de aminosyrer som i 0KT3 viste forskjeller fra konsensus-rammeverket for musesubgruppen (subgruppe VI) hvortil 0KT3 viser mest homologi Fire posisjoner 1, 3, 46 og 47 ble identifisert og deres eventuelle bidrag ble undersøkt ved at den humane aminosyre ble erstattet med aminosyren fra mus i hver posisjon Derfor ble gL221A (gL221 + D1Q, Q3V, L46R, L47W, se fig 3 og tabell 1) dannet, klonet i EE6hCMVneo og ko-uttrykt med cH (pJA144) Det resulterende antistoff var godt uttrykt og viste god bindingsaktivitet Når de relaterte gener gL221B {gL221 + D1Q, Q3V) og gL221C (gL221 + L46R, L47W) ble dannet og likeledes testet, mens begge gener dannet antistoff når ko-uttrykt med cH, viste kun gL221C/cH-kombinasjonen god antigen binding Når gL121A (gL121 + D1Q, Q3V, L46R, L47W) genet ble dannet og ko-ttrykt med cH, ble ;det dannet antistoff som også bandt til antigenet 15 2 Tung kjede ;15 2 1 Omfanget av CDR'ene ;For den tunge kjede var analyser av sløyfen og hypervariabilitet kun overenstemmende i CDR3 For CDRl strakk sløyferegionen seg fra rester 2 6 til og med 32 mens Kabat-CDR strakk seg fra rester 31 til og med 3 5 For CDR2 er sløyferegionen fra 50 til og med 58 mens den hypervariable region dekker aminosyrer 50 til og med 65 De humaniserte tunge kjeder ble derfor konstruert ved anvendelse av rammeverket fra antistoff KOL og med forskjellige kombinasjoner av disse CDR-valg, inkluderende et kortere valg for CDR2 av 50 til og med 56 idet der var noe usikkerhet når det gjaldt definisjonen av endepunktet for CDR2-sløyfen rundt rester 56 til 58 Genene ble ko-uttrykt initialt med mL eller cL Når det gjaldt gH-genene med sløyfevalg for CDRl f eks gHl2i, gHl3l, gHl4l, ble det dannet svært lite antistoff i kultursupernatantene Da det ikke ble påvist noen fri lett kjede ble det antatt at antistoffet var dannet og sammenstilt inne i cellen, men at den tunge kjede på en eller annen måte var avvikende, eventuelt ukorrekt foldet, og derfor ble antistoffet nedbrutt internt I enkelte forsøk kunne spormengder av antistoff påvises i studier hvor det ble anvendt merking med <35>S ;Da intet netto antistoff ble dannet, ble analyser av disse konstrukter ikke videreført ytterligere ;Når en kombinasjon av sløyfevalget og Kabat-valget for CDRl imidlertid ble testet (muse-aminosyrer 26 til og med 35) og hvor rester 31 (Ser til Arg), 33 (Ala til Thr) og 3 5 (Tyr til His) ble endret fra humane rester til muserester og sammenlignet med den første serien, ble antistoff dannet for gH321, kgH331 og kgH341 når ko-uttrykt med cL Ekspresjonen var generelt liten og kunne ikke forbedres særlig ved innskudd av Kozak-konsensus-sekvensen 5' til ATG i signalsekvensen av genet, til forskjell fra tilfellet med gL-genene hvor et slikt innskudd førte til en 2 - 5 dobbel økning i netto antistoffproduksjon Kun i tilfellet med gH34l/mL eller kgH341/cL kunne imidlertid marginal antigen-bindingsaktivitet demonstreres Når kgH341-genet var uttrykt sammen med kgL221A, var nettout-byttet av antistoff alt for lavt til å gi et signal ;over bakgrunnsnivået i antigen-bindingsforsøket 15 2 2 Rammeverkrester ;Som i tilfellet med den lette kjede ble rammeverkene av den tunge kjede undersøkt på nytt Muligens pga den mindre opprinnelige homologi mellom de variable domener i den humane tunge kjede og den tunge kjede fra mus sammenlignet med de lette kjeder, viste det seg at flere ammosyreposisjoner var av interesse To gener kgH341A og kgH34lB ble konstruert, hvor henholdsvis li eller 8 humane rester var erstattet av muserester sammenlignet med gH34l, og med CDR2-resten 63 tilbake til den humane aminosyre even-tuelt for å forbedre domene-sammenfolding Begge viste antigen binding når de ble kombinert med cL eller kgL221A, idet kgH341A-genet med alle 11 forandringer viste seg ;å være et overlegent valg ;15 3 Foreløpelige konklusjoner ;Det har derfor blitt demonstrert for 0KT3 at for å overføre antigen bmdmgsevne til det humaniserte antistoff, vil muserester utenfor CDR-regionene som definert ved Kabat-hypervariabilitet eller strukturelle sløyfe-valg kreves for både de lette og tunge kjeder Færre ekstra rester behøves for den lette kjede, noe som even-tuelt skyldes den større initiale homologi mellom de variable humane kappa-regioner og dem fra mus ;Av forandringene, er syv (1 og 3 fra den lette kjede og 6, 23, 71, 73 og 76 fra den tunge kjede) forutsagt ut fra kjennskap til andre antistoff-strukturer til å være enten delvis eksponert eller på antistoff-overflaten Det er her blitt vist at rester 1 og 3 i den lette kjede ikke absolutt nødvendigvis må være musesekvensen, og for den tunge kjede dannet den gH341B-tunge kjede i kombinasjon med den 221A-lett kjede kun svak bindingsaktivitet Tilstedeværelse av 6, 23 og 24 forandringene er derfor viktige for å opprettholde en bindingsaffmitet som er lik den for det munne antistoff Det var derfor viktig å ytterligere studere det individuelle bidrag fra åtte andre muserester av kgH341A-genet sammenlignet med kgH341 ;16 Ytterligere CDR-podinosforsøk ;Ytterligere CDR-podede tung kjede gener ble i alt vesentlig fremstilt som beskrevet over Med henvisning til tabell 2 var de ytterligere gener for den tunge kjede basert på gH341 (plasmid pJAl78) og gH34lA (plasmid pJAl85) med enten mus-0KT3 eller humane KOL-rester i 6, 23, 24, 48, 49, 63, 71, 73, 76, 78, 88 og 91 som indikert De CDR-podede lett kjede gener som ble anvendt i disse ytterligere forsøk var gL221, gL22lA, gL2 2lB og gL22iC som beskrevet over ;De CDR-podede tung og lett kjede gener var ko-uttrykt sammen i COS-celler, enten med hverandre i forskjellige kombinasjoner, men også med de tilsvarende munne og chimeriske tung og lett kjede gener, i alt vesentlig som beskrevet over De oppnådde antistoffprodukter ble deretter analysert i bindings- og blokkeringsanalyser med HPB-ALL-celler som beskrevet over ;Resultatene fra forsøkene i forbindelse med de forskjellige podede tunge kjeder ko-uttrykt sammen med den gL221C-lette kjede er gitt i figurene 7 og 8 (for JA184, JA185, JA197 og JA198 sammenstillingene - se tabell 2), i fig 9 (for JA183, JA184, JA185 og JA197 sammenstillingene) i fig 10 (for de chimeriske JA185, JA199, JA204, JA205, JA207, JA208 og JA209 sammenstillinger) og i fig 11 (for JA183, JA184, JA185, JA198, JA203, JA205 og JA206 sammenstillingene) ;Det basis-podede produkt uten forandringer fra human til munn i de variable rammeverk, dvs gL221 uttrykt sammen med gH341 (JA178), og også det "fullstendig podede" produkt som mest har humane til munne forandringer i rammeverket av den podede tunge kjede, dvs gL221C ko-uttrykt med gH341A (JA185), ble målt for relativ bindmgsaffmitet i et konkurrerende forsøk mot munn 0KT3-referansestandard ved anvendelse av HPB-ALL-celler Forsøket som anvendes var som beskrevet over i avsnitt 3 3 De oppnådde resultater er gitt i fig 12 for det basis-podede produkt og fig 13 for det fullstendig podede produkt Disse resultater indikerer at det basis-podede produkt hadde ubetydelig bindingsevne sammenlignet med 0KT3 munn referansestandard, mens det "fullstendig podede" produkt hadde en bindingsevne som er svært lik den for den 0KT3 munne referansestandard ;Bindings- og blokkeringsforsøksresultatene indikerer følgende ;JA198- og JA207-sammenstillingene synes å ha de beste bindmgsegenskaper og tilsvarende bindmgsevner, som begge i alt vesentlig er de samme som for de chimeriske og fullstendig podede gH34lA-produkter Dette indikerer at posisjoner 88 og ;91 og posisjon 76 ikke er særdeles kritiske for opprett-holdelse av 0KT3-bindmgsevnen, mens minst noen av posisjonene 6, 23, 24, 48, 49, 71, 73 og 78 er svært viktige ;Dette er et resultat av det funn at JA209 og JA199, skjønt de har lignende bindingsevne til hverandre, har mindre bindingsevne enn JA198- og JA207-sammenstillingene Dette indikerer viktigheten med å ha muserester i posisjonene 71, 73 og 78, som er enten helt eller delvis human i henholdsvis JA199-og JA209-sammenstillingene ;Ved sammenligning av resultatene oppnådd for JA205- og JA183-sammenstillmgene ses det dessuten at det er en reduksjon i binding fra JA205- til JA183-sammenstillingene Dette indikerer viktigheten av å beholde en muserest i posisjon 23, den eneste posisjon som er forandret mellom JA205 og JA183 ;Disse og andre resultater fører til den konklusjon at av de elleve muse-rammeverkrester som anvendes i gH34lA (JA185) sammenstillingen, er det viktig å beholde muserester i alle posisjoner 6, 23, 24, 48, 49, og eventuelt for maksimal bindmgsaf f mitet i 71, 73 og 78 ;Tilsvarende forsøk ble gjennomført for å CDR-pode en rekke av gnager-antistoffene inkluderende antistoffer med spesifisitet for CD4 (0KT4), ICAM-1 (R6-5), TAG72 (B72 3), og TNFa (61E71, 101 4, hTNFl, hTNF2 og hTNF3) ;EKSEMPEL 2 ;CDR-poding av et murint anti-CD4 T-celle receptorantistoff, OKT 4 A ;Ant1-0KT4A CDR-podede tung og lett kjede gener ble fremstilt, uttrykt og i alt vesentlig testet som beskrevet over i eksempel 1 for CDR-podet 0KT3 CDR-podmg av OKT4A er beskrevet detaljert i Ortho patentsøknad PCT/GB90 med samme dato som den foreliggende søknad og med tittelen "Humanised Antibodies" En rekke CDR-podede 0KT4-antistoffer er blitt fremstilt Det valgte CDR-podede 0KT4A er kombinasjonen av den podede lette kjede LCDR2 og den podede tunge kjede HCDR10 ;Den lette kjede ;Det humane akseptorrammeverk anvendt for de podede lette kjeder var REI Den foretrukne LCDR2-lette kjede har forandringer fra human til mus i posisjoner 33, 34, 38, 49 og 89 i tillegg til strukturell sløyfe CDR'ene Av disse endrede posisjoner, faller posisjonene 33, 34 og 89 innenfor de foretrukne utstrakte/utvidede CDR'er fremstilt i henhold til oppfinnelsen {posisjoner 33 og 34 i CDRl og posisjon 89 i CDR3) De humane til murine forandringer i posisjoner 3 8 og 4 9 tilsvarer posisjoner hvor ammosyrerestene foretrukket er donor-murine aminosyrerester ;En sammenligning av ammosyresekvensene for det donor-murme variable domene av lett kjede og det REI humane akseptor variable domene av lett kjede viser ytterligere at murine og humane rester er identiske i alle posisjoner 46, 48 og 71 og 1 alle posisjoner 2, 4, 6, 35, 36, 44, 47, 62, 64 - 69, 85, 87, 98, 99, 101 og 102 Aminosyreresten i posisjon 58 i LCDR2 er imidlertid den humane REI-rammeverkrest og ikke OKT4-museresten som ville vært foretrukket ;Den tunge kjede ;Den humane akseptorrammeverk anvendt for de podede tunge kjeder var KOL ;Den foretrukne CDR-podede HCDR10-tunge kjede har forandringer fra human til mus i posisjonene 24, 35, 57, 58, 60, 88 og 91 i tillegg til strukturell sløyfe CDR'ene Av disse posisjoner, faller posisjon 35 (CDRl) og posisjoner 57, 58 og 60 (CDR2) innenfor de foretrukne utstrakte CDR'er i overensstemmelse med oppfinnelsen Også forandringen fra human til mus i posisjon 24 tilsvarer en posisjon hvor aminosyreresten er en donor-murin rest Forandringer fra human til mus i posisjonene 88 og 91 tilsvarer dessuten til posisjoner hvor ammosyrerestene eventuelt er donor-murine rester ;En sammenligning av de murine 0KT4A og humane KOL variable ammosyresekvenser av tung kjede viser at de murine og humane rester er identiske i alle posisjoner 23, 49, 71, 73 og 78 og l alle posisjoner 2, 4, 6, 25, 36, 37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106 og 107 ;Således tilsvarer den OKT4A CDR-podede tunge kjede HCDR10 en særlig foretrukket utførelsesform i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse ;EKSEMPEL 3 ;CDR-poding av et anti-mucin spesifikt murint antistoff, B72 3 Kloning av genet som koder for det anti-mucin spesifikke munne monoklonale antistoff B72 3 og fremstillingen av B723 mus-humane chimeriske antistoffer er tidligere beskrevet (referanse 13 og WO 89/01783) CDR-podede versjoner av B72 3 ble fremstilt som følger ;(a) B72 3 Lett kiede ;CDR-poding av denne lette kjede ble gjennomført ved direkte overføring av de munne CDR'er mn i rammeverket av den humane lette kjede REI De regioner som ble overført var ;;Aktiviteten av den resulterende podede lette kjede ble målt ved ko-ekspresjon i COS-celler, av gener for kombinasjonene ;B72 3 CH/B72 3 cL ;og B72 3 CH/B72 3 gL ;Supernatanter ble målt for antistoffkonsentrasjon og for evnen til å binde til mikrotiterplater som var belagt med mucin De oppnådde resultater indikerte at, i kombinasjonen med B72 3 cH-kjeden, hadde B72 3 cL og B72 3 gL tilsvarende bmdmgsegenskaper ;Sammenligning av de murine B72 3 og REI ammosyresekvenser av lett kjede viser at restene er identiske i posisjoner 46, 58 og 71 men er forskjellige i posisjonen 48 Således kan forandring av den humane rest til donor-museresten i posisjon 4 8 ytterligere forbedre bindingsegenskapene av den CDR-podede lette kjede, (B72 3 gL)i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse ;(b) B72 3 Tung kjede ;i Valg av rammeverk ;Det var først nødvendig å gjøre et valg med hensyn til humant rammeverk Spørsmålet var som følger var det nødvendig å anvende rammeverkregionene fra et antistoff hvis krystallstruktur var kjent eller kunne valget gjøres på bakgrunn av andre kriterier"' For B72 3 tung kjede ble det resonert at, mens kunn-skap vedrørende struktur var viktige, kunne over-føring av CDR1 ene fra mus til humane rammeverk for-enkles dersom den totale homologi mellom donor- og reseptor-rammeverkene maksimeres Sammenligning av B72 3 tung kjede sekvenser med dem i Kabat (referanse 4) for humane tunge kjeder viste klart at B72 3 hadde dårlig homologi for KOL og NEWM (for hvilke krystallstrukturer er tilgjengelig), men var svært homolog med den tunge kjede for EU På dette grunnlag, ble EU valgt for CDR-poding og de følgende rester ble overført som CDR'er ;;Det ble også notert at FR4-regionen i EU var forskjellig fra den i et hvilket som helst annet humant (eller mus) antistoff Følgelig, i genene for podet tung kjede var dette også forandret til å gi en ;"konsensus" human sekvens (Innledende forsøk viste at podet tung kjede gener som inne-holdt EUFR4 sekvensen hadde svært dårlig ekspresjon i transiente ekspre-sjonssystemer) ;li Resultater med podet tung kjede gener ;Ekspresjon av podet tung kjede gener som inneholdt alle humane rammeverkregioner med enten gL- eller cL-gener ga et podet antistoff med liten evne til å binde til mucm Det podede antistoff hadde omtrent 1 % av aktiviteten til det chimeriske antistoff I disse forsøk ble det imidlertid bemerket at aktiviteten av det podede antistoff økte til omtrent 10 % av B72 3 ved eksponering for pH verdier fra 2 -3,5 Denne observasjon tilveiebragte en peke-pmn for hvordan aktiviteten av det podede antistoff kunne forbedres uten syrebehandlmg Det ble postulert at syreeksponermg bevirket protonermg av en sur rest {pKa for asparaginsyre = 3,86 og glutammsyre = 4,25) som således ga forandring i strukturen av CDR-sløyfene, eller tillot bedre tilgang for antigen For sammenligning av sekvensene av B72 3 (referanse 13) og EU (referansene 4 og 5), var det klart at ved ;å gå fra muse-rammeverkene til humane rammeverk, hadde kun to posisjoner blitt forandret på en slik måte at sure rester var blitt innført Disse ;posisjonene er i rester 73 og 81, hvor henholdsvis K til E og Q til E forandringer var blitt gjennomført ;Hvilke av disse posisjoner som kunne være viktige ble bestemt ved at krystallstrukturen av KOL-antistoffet ble undersøkt I KOL tung kjede, er posisjon 81 langt fra begge CDR-sløyfene Posisjon 7 3 er imidlertid nær begge CDR'ene 1 og 3 av den tunge kjede og i denne posisjon var det mulig å tenke seg at en K til E forandring i denne region ville kunne ;ha en ødeleggende virkning på antigen binding ;in Rammeverkt"orandringer i B72 3 gH-genet ;På grunnlag av de ovennevnte analyser ble E73 mutert til et lysm (K) Det ble funnet at denne forandring hadde en dramatisk effekt på den evnen som det podede Ab har til å binde seg til mucin Videre, var den evnen som det podede B72 3 har, som dannet ved hjelp av den muterte gH/gL-kombinasjon, til å binde til mucm tilsvarende den for det B72 3 chimeriske antistoff ;iv Andre rammeverkforandringer ;Under de ovennevnte forsøk ble det gjennomført andre forandringer i rammeverkregionen i den tunge kjede Innen nøyaktigheten av de anvendte forsøk, synes ingen av forandringene, enten alene eller sammen, å være fordelaktige ;v Andre ;Alle de anvendte forsøk målte den evnen som det podede Ab har til å binde til mucin og indikerte som et hele at den enkle rammeverkforandrmg i posisjon 33 er tilstrekkelig til å danne et antistoff med tilsvarende bmdingsegenskaper som B72 3 ;Sammenligning av B72 3 murine og EU tunge kjede sekvenser viste at muserestene og de humane rester er identiske l posisjonene 23, 24, 71 og 78 ;Således utgjør den muterte CDR-podede B72 3 tunge kjede en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse ;EKSEMPEL 4 ;CDR- poding av et murint anti- ICAM- 1 monoklonalt antistoff Et murint antistoff, R6-5-D6 (EP 0314863) med spesifisitet for intercellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1) ble CDR-podet som hovedsakelig beskrevet over i de foregående eksempler Dette arbeid er beskrevet mer detaljert i den samtidige patentsøknad, GB patentsøknad nr 90 0 9549 8 ;Det humane EU-rammeverk ble anvendt som akseptor-rammeverket for både tunge og lette kjeder Det aktuelle CDR-podede antistoff tilveiebringes ved ko-eksepresjon av podet lett kjede gL22lA og podet tung kjede gH34lD som har en bindmgsaf f mitet for ICAM-1 på omtrent 75 % av den for det tilsvarende mus-humane chimeriske antistoff ;Lett kjede ;gL221A har murine CDR'er i posisjonene 24 - 34 (CDRl), 50 - 56 (CDR2) og 89 - 97 (CDR3) I tillegg er også flere rammeverkrester den murine aminosyre Disse rester velges etter overveielse av disse resters mulig bidrag til domene-sammenfolding og stabilitet av komformasjonen av antigen-bmdmgsregionen Restene som er beholdt som muserester er i posisjoner 2, 3, 48 C), 60, 84, 85 og 87 Sammenligning av de murine anti-ICAM-1 og humane EU lett kjede ammosyresekvenser viser at de murine og humane rester er identiske i posisjonene 46, 58 og 71 ;Tung kjede ;gH341D har murine CDR<*>er i posisjoner 26 - 35 (CDRl), 50 - 56 (CDR2) og 94 - 100B (CDR3) I tillegg ble det anvendt murine rester i gH341D i posisjoner 24, 48, 69, 71, 73, 80, 88 og 91 Sammenligning av de murine anti-ICAM-1 og humane EU ammosyresekvenser av den tunge kjede er identiske i posisjoner 23, 49 og 78

EKSEMPEL 5

CDR-podina av murine anti-TNFa- antistoffer

En rekke murine anti-TNFa-monoklonale antistoffer ble CDR-podet som i alt vesentlig beskrevet i de foregående eksempler Disse antistoffer inkluderer de murine monoklonale antistoffer betegnet 61E71, hTNFl, hTNF3 og 101 4 En kort oppsummering av CDR-podingen av hvert av disse antistoffer er gitt i det etterfølgende

61E71

En tilsvarende analyse som beskrevet over (eksempel l, avsnitt 12 1) ble gjennomført for 61E71 og for den tunge kjede ble ti rester identifisert i 23, 24, 48, 49, 68, 69, 71, 73, 75 og 88 som rester som eventuelt beholdes som murine De humane strukturer som velges for CDR-poding av dette antistoff, og hTNF3- og 101 4-antistoffene var REI for den lette kjede og KOL for den tunge kjede Det ble dannet tre gener, hvorav det første inneholdt 23, 24, 48, 49, 71 og 73 (gH34l(6)) som munne rester Det andre genet hadde også 78 og 88 som munne rester (gh341(8)) mens det tredje genet ytterligere hadde 68, 69, 75 og 88 som murine rester (gH341(10)) Hver ble ko-uttrykt med gL221, den minimalt podede lette kjede (bare CDR'er) gL221/gH341(6) og gl221/- gH341(8) antistoffene bandt begge like godt til TNF som murint 61E71 gL22l/gH341(10) antistoffet uttrykkes ikke og denne kombinasjon ble ikke bragt videre

Deretter ble gL22l/gH341(6) antistoffet vurdert i en L929-celle konkurrerende bestemmelse hvor antistoffet konkurrerer mot TNF-reseptoren på L929-celler for binding til TNF i oppløsning I dette forsøk var gL22l/gH341(6) antistoffet omtrent 10 % så aktivt som murint 61E71

hTNFl

hTNFl er et monoklonalt antistoff som gjenkjenner en epitop på human TNF- Den EU humane struktur ble anvendt for CDR-poding av både tung og lett kjede variable domener

Tung kjede

I den CDR-podede tunge kjede (ghTNFl) ble muse-CDR'er anvendt 1 posisjoner 26 - 35 (CDRl), 50 - 65 (CDR2) og 95 - 102 (CDR3) Muserester ble også anvendt i rammeverkene i posisjoner 48, 67, 69, 71, 73, 76, 89, 91, 94 og 108 Sammenligning av TNFl-muse- og EU humane tung kjede rester viser at disse er identiske i posisjoner 23, 24, 29 og 78

Lett kjede

I den CDR-podede lette kjede (gLhTNFl) ble muse-CDR'er anvendt i posisjonene 24 - 34 (CDRl), 50-56 (CDR2) og 89 - 97 (CDR3) I tillegg ble muserester anvendt i rammeverkene i posisjoner 3, 42, 48, 49, 83, 106 og 108 Sammenligning av hTNFl-muse- og EU humane lett kjede rester viste at disse er identiske posisjonene 46, 5 8 og 71

Den podede hTNFl tunge kjede ble uttrykt sammen med den chimeriske lette kjede og produktets bindingsevne ble sammenlignet med den for produktet med chimerisk lett kjede/- chimerisk tung kjede i et TNF-bindmgsforsøk Produktet med den podede tunge kjede viste seg å ha en bindingsevne for TNF som var noe bedre enn det fullstendige chimeriske produkt

Likeledes ble et produkt av podet tung kjede/podet lett kjede ko-uttrykt og sammenlignet med det fullstendige chimeriske produkt og funnet til å ha nærmest like bindmgsegenskaper som det sistnevnte produkt

hTNF3

hTNF3 gjenkjenner en epitop på human TNF-a Sekvensen av hTNF3 viser kun 21 forskjeller sammenlignet med 61E71 i de variable regioner av den lette og tunge kjede, 10 i den lette kjede (2 i CDR'ene i posisjoner 50, 96 og 8 i rammeverket i 1, 19, 40, 45, 46, 76, 103 og 106) og 11 i den tunge kjede {3 i CDR-regionene i posisjoner 52, 60, 95 og 8 i rammeverket i 1, 10, 38, 40, 67, 73, 87 og 105) De lette og tunge kjeder av de 61E71 og hTNF3 chimeriske antistoffer kan byttes uten tap av aktivitet i det direkte bmdingsforsøk 61E71 har

imidlertid mindre evne til å konkurrere med TNF-reseptoren på L929-celler for TNF-a sammenlignet med hTNF3 Basert på 61E71 CDR-podmgsdata har gL221 og gH341 (+23, 24, 48, 49, 71 og 73 som mus) gener blitt bygget for hTNF3 og testet og det

oppnådde podede antistoff binder godt til TNF-a, men konkurrerer svært dårlig i L929-forsøket Det er mulig at også rammeverkrestene som er identifisert for OKT3-programmet i dette tilfelle kan forbedre den konkurrerende bindmgsevnen for dette antistoff

101 4

101 4 er et ytterligere murint monoklonalt antistoff som er i stand til å gjenkjenne humant TNF-a Den tunge kjede i dette antistoff viser god homologi til KOL og CDR-podingen har således blitt basert på REI for den lette kjede og KOL for den tunge kjede En rekke podede gener av den tunge kjede er konstruert med konservative valg for CDR'ene (gH341) og som kun har en eller et lite antall ikke-CDR-rester i stillingene 73, 78 eller 77 til og med 79, som muse-aminosyrene Disse er uttrykt sammen med cL eller gL221 I alle tilfeller ses binding til TNF som er ekvivalent med det chimeriske antistoff

og ved ko-ekspresjon med cL er de resulterende antistoff i stand til å konkurrere godt i L929-forsøket Med gL221 er imidlertid de resulterende antistoffer minst en størrelses-orden mindre i stand til å konkurrere for TNF mot TNF-reseptoren på L929-celler

Muserester i andre posisjoner i den tunge kjede, f eks både 2 3 og 24 eller i 76 har ikke vist forbedring av den konkurrerende evne for det podede antistoff i L929-forsøket

En rekke andre antistoffer som inkluderer antistoffer med spesifisitet for interleukmer, f eks ILI og cancer-markører som carcinoembryonisk antigen (CEA) f eks det monoklonale antistoff A5B7 (referanse 21), er blitt CDR-podet på en vellykket måte

Referanser

1. Kohler & Milstem, Nature, 265, 295-497, 1975.

2. Chatenoud et al, ( 1986), J. Innnunol. 137 , 830-838. 3. Jeffers et al, (1986), Trannplantation, 41, 572-578.

4. Begent et al, Br. J. Cancer 62^: 487 (1990).

5. Verhoeyen et al, Science, 239, 1534-1536, 1988.

6. Riechmann et al, Nature, 332, 323-324, 1988.

7. Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, B.M., Gottesman, K.S., 1987, in Seguences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA. 8. Wu, T T., and Kabat, E.A., 1970, J. Exp. Med. 132 211-250 9 Queen et al, (1989), Proe Nati. Acad. Sei USA, 8_6, 10029-10033 and WO 90/07861 10 Maniatis et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, 19B9 11 Pnmrose and Old, Prmciples of Gene Manipulation, Blackwell, Oxford, 19B0 12 Sanger, F , Nicklen, S , Coulson, A R , 1977, Proe Nati. Acad. Sei USA, 21 5463 13 Kramer, W , Drutsa, V , Jansen, H -W , Kramer, B , Plugfelder, M , Fritz, H -J , 1984, Nucl. Acids Res 12, 9441 14. Whittle, N., Adair, J., Lloyd, J.C., Jenkms, E., Devine, J , Schlom, J., Raubitshek, A., Colcher, D., Bodmer, M., 1987, Protein Engineering 1_, 499. 15 Sikder, S.S., Akolkar, P N. , Kaledas, P.M , Morrison, S.L., Kabat, E.A , 1985, J. Immunol. 135, 4215.

16. Wallick, S.C., Kabat, E.A., HorriBon, S.L., 19BB,

J. Exp. Med. 168, 109 9

17 Bebbmgton, CR , Published International Patent Application WO 89/01036.

18 Granthan and Pemn 1986, Immunology Today 1_, 160.

19 Kozak, M. , 19B7, J Hol. Biol. 196, 947 .

20. Jones, T.P , Dear, P H., Foote, J., Neuberger, M S , Winter, G.r 1986, Nature, 32J., 522

21 Harvood et al, Br. J Cancer, 54^ 75-82 (1986)

Claims (11)

1 CDR-podet antistoffmolekyl til bruk som diagnostikum, karakterisert ved at det omfatter en tung kjede og/eller en lett kjede med et variabel region domene som omfatter akseptor-rammeverk og donorantigenbindende regioner, hvori rammeverket av den tunge kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 6, 23 og/eller 24, 48 og/eller 49, 71 og/eller 73, 75 og/eller 76 og/eller 78 og 88 og/eller 91, og hvori rammeverket av den lette kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 1 og/eller 3 og 46 og/eller 47, og med den betingelse at nevnte CDR-podede antistoff ikke binder p55 Tac proteinet av IL-2 reseptoren

2 Antistoffmolekyl som angitt i krav 1, karakterisert ved at den tunge kjede omfatter donorrester i posisjonene 23, 24, 49, 71, 73 og 78 eller i posisjonene 23, 24 og 49

3 Antistoffmolekyl som angitt i krav 1 og 2, karakterisert ved at den lette kjede omfatter donorrester i posisjonene 46 og 47

4 Antistoffmolekyl som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at rammeverket av den lette kjede omfatter donorrester i minst en av posisjonene 4 6 og 48, 58 og 71

5 Antistoffmolekyl som angitt i krav 4, karakterisert ved at den lette kjede omfatter donorrester i posisjonene 46, 48, 58 og 71

6 Antistoffmolekyl som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter minst en CDR-podet tung kjede og minst en CDR-podet lett kjede

7 Antistoffmolekyl som angitt i ett eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det omfatter humane akseptorrester og ikke-humane donorrester

8 DNA-molekyl, karakterisert ved at en DNA-sekvens som koder for antistoffmolekylet ifølge ett eller flere av kravene 1-7 er i kombinasjon med translasjons-, transkrip-sjons- og reguleringssekvenser

9 Klonings- eller ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder DNA-sekvensen som angitt i krav 8

10 Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med et DNA-molekyl som angitt i krav 8, og som er i stand til å uttrykke DNA-sekvensen

11 Diagnostisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et antistoffmolekyl som angitt i ett eller flere av kravene 1-7 i kombinasjon med en diagnostisk aksepterbar bærer, fortynnmgsmiddel eller hjelpestoff