BRPI0611069A2 - anticorpo monoclonal, anticorpo humanizado, fragmento de anticorpo, uso de um antagonista, e, hibridoma - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL, ANTICORPO HUMANIZADO, FRAGMENTO DE ANTICORPO, USO DE UM ANTAGONISTA, E, HIBRIDOMA. A presente invenção diz respeito a métodos de tratar doenças pruríticas, incluindo mas não limitadas à Dermatite de contato, Dermatite atópica, Reações alérgicas cutâneas do tipo demorada induzidas por medicamento, Necrólise epidérmica tóxica, Linfoma de célula T cutâneo, Pênfigo bolhoso, Alopecia wereata, Vitiligo, Acne Rosácea, Prurigo nodular, Escleroderma, Vírus do herpes simples ou combinação destes pela administração de anticorpos monoclonais IL-3 1. A invenção fornece ainda os hibridomas que geram os anticorpos monoclonais.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL, ANTICORPO HUMANIZADO,FRAGMENTO DE ANTICORPO, USO DE UM ANTAGONISTA, E,HIBRIDOMA"

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O sistema imune hospeda uma ampla faixa de tipos de célulaespecíficos incluindo linfócitos. Os linfócitos determinam a especificidade dareação imune em um hospedeiro e incluem duas classes, os linfócitos B, quesão precursores de células que produzem anticorpo e os linfócitos T, que sãorequeridos para certas funções reguladoras tais como o desenvolvimento derespostas imunes específicas.

As células T maduras podem ser ativadas, isto é, por umantígeno ou outro estímulo, para produzir, por exemplo, citocinas, moléculasde sinalização bioquímica ou receptores que influenciam ainda o destino dapopulação de célula T.

As células B podem ser ativadas por intermédio de receptoresna sua superfície celular incluindo receptor de célula B e outras moléculasacessórias para realizar as funções de célula acessória, tais como a produçãode citocinas.

Os monócitos/macrófagos e células T podem ser ativadospelos receptores na sua superfície celular e desempenham um papel central naresposta imune pela apresentação de antígeno aos linfócitos e também atuamcomo células acessórias para linfócitos pela secreção de numerosas citocinas.

As células exterminadoras naturais (NK) têm uma célulaprogenitora comum com as células T e células B e desempenham um papel nasupervisão imune. As células NK, que compreendem até 15% de linfócitossangüíneos, não expressam receptores antigênicos e portanto não usam oreconhecimento de MHC como exigência para a ligação a uma célula alvo. Ascélulas NK estão envolvidas no reconhecimento e morte de certas células detumor e células viralmente infectadas. In vivo, acredita-se que as células NKrequeiram ativação, entretanto, in vitro, as células NK mostraram mataralguns tipos de células de tumor sem ativação.

As interleucinas são uma família de citocinas que medeiamrespostas imunológicas, incluindo inflamação. As interleucinas medeiam umavariedade de patologias inflamatórias. Centrais a uma resposta imune estão ascélulas T, que produzem muitas citocinas e imunidade adaptativa aosantígenos. As citocinas produzidas pelas células T foram classificadas comotipo 1 e tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76: 300-317, 1998). As citocinastipo 1 incluem IL-2, IFN-γ, LT-α e estão envolvidas em respostasinflamatórias, imunidade viral, imunidade parasítica intracelular e rejeição dealoenxerto. As citocinas tipo 2 incluem IL-4, IL-5, IL-6, IL-IO e IL-13 e estãoenvolvidas em respostas humorais, imunidade helmíntica e resposta alérgica.

As citocinas compartilhadas entre Tipo 1 e 2 incluem IL-3, GM-CSF e TNF-a. Existe alguma evidência para sugerir que as populações de célula T queproduzem Tipo 1 e Tipo 2 preferencialmente migram em tipos diferentes detecido inflamado.

A pele desempenha um papel importante no sistema imune econsiste de camadas. A epiderme é uma camada de superfície. Por debaixo daepiderme está a derme, uma camada de tecido conectivo. Por debaixo daderme, está a hipoderme, uma camada de quantidades grandes de tecidoadiposo. Os linfócitos T circulantes migram para a pele sob condiçõesnormais e inflamatória. O antígeno de linfócito cutâneo (CLA) é consideradoum receptor residente para as células T com tropismo para a pele. Santamaria-Babi, L., Eur. J. Dermatol. 14: 13-18, 2004.

Diversas doenças da pele são conhecidas para expressar níveisaltos de células T CLA+, incluindo dermatite atópica, dermatite de contato,reações alérgicas induzidas por medicamento, vírus trópico de pele e pruridoassociado com vírus, vitiligo, linfoma de célula T cutâneo, alopecia aerada,acne rosácea, acne vulgar, prurido nodular e pênfigo bolhoso. Existe umanecessidade para tratar tais doenças mediadas pela célula T da pele.

As atividades demonstradas in vivo da família da citocinailustra o enorme potencial clínico de e necessidade quanto a, outras citocinas,agonistas de citocina e antagonistas de citocina. IL-31, uma citocina recémidentificada. A IL-31, quando super-expressada em camundongos, resulta emsintomas equivalentes à dermatite. Tanto as células T residentes da pelequanto os queratinócitos epidérmicos foram implicados na patologia dedoenças de pele em seres humanos. A presente invenção trata estasnecessidades pelo fornecimento de antagonistas para a citocina IL-31 pró-inflamatórias. Tais antagonistas da presente invenção, que podem bloquear,inibir, reduzir, antagonizar ou neutralizar a atividade de IL-31, incluemreceptores IL-31RA solúveis e anticorpos anti-IL-31 neutralizadores. Ainvenção fornece ainda usos para estes em doença inflamatória, assim comocomposições e métodos relacionados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes de apresentar a invenção em detalhes, pode ser útil parao seu entendimento definir os seguintes termos:

Como aqui usado, o termo "anticorpos" inclui anticorpospoliclonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, anticorposmonoclonais e fragmentos de ligação de antígeno, tais como fragmentosproteolíticos F(ab')2 e Fab. Anticorpos intactos ou fragmentos geneticamenteengendrados, tais como anticorpos quiméricos, fragmentos Fv, anticorpos decadeia única e outros, assim como peptídeos e polipeptídeos de ligação deantígeno sintéticos, também são incluídos. Anticorpos não humanos podemser humanizados enxertando-se CDRs não humanas sobre as regiões de matrize constantes humanas ou incorporando-se os domínios variáveis não humanosinteiros (opcionalmente "ocultando" os mesmos com uma superfícieequivalente à humana pela substituição de resíduos expostos, em que oresultado é um anticorpo "embutido"). Em alguns casos, os anticorposhumanizados podem reter resíduos não humanos dentro dos domínios deestrutura da região variável humana para realçar as características de ligaçãoapropriadas. Através da humanização de anticorpos, a meia-vida biológicapode ser aumentada e o potencial para as reações imune adversas naadministração aos seres humanos é reduzido.

Os termos "anticorpo quimérico" ou "anticorpos quiméricos"referem-se aos anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foramconstruídos, tipicamente pela engenharia genética, a partir dos genes dasregiões variáveis e constante da imunoglobulina que pertencem às espéciesdiferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpomonoclonal de camundongo podem ser unidos aos segmentos constanteshumanos, tais como gama 1 e gama 3. Um anticorpo quimérico terapêuticotípico é assim uma proteína híbrida composta do domínio variável ou domíniode ligação de antígeno de um anticorpo de camundongo e o domínio constantede um anticorpo humano, embora outras espécies de mamífero possam serusadas.

Como aqui usado, o termo "imunoglobulina" refere-se a umaproteína que consiste de um ou mais polipeptídeos substancialmentecodificados pelos genes da imunoglobulina. Uma forma de imunoglobulinaconstitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é umtetrâmero e consiste de dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina,cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiõesvariáveis de cadeia leve e pesada são juntas responsáveis pela ligação a umantígeno e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras doanticorpo.

As "cadeias leves" da imunoglobulina de tamanho natural(cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene da regiãovariável no terminal NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene da regiãoconstante capa ou lambda no terminal COOH. As "cadeias pesadas" deimunoglobulina de tamanho natural (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos), sãosimilarmente codificadas por um gene da região variável (cerca de 116aminoácidos) e um dos outros genes da região constante anteriormentemencionada (cerca de 330 aminoácidos). As cadeias pesadas são classificadascomo gama, mu, alfa, delta ou épsilon e define o isótipo do anticorpo comoIgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leve e pesada,as regiões variáveis e constantes são unidos por uma região "J" de cerca de 12ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D"de cerca de 10 mais aminoácidos. (ver no geral, Fundamental Immunology(Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (incorporada porreferência em sua totalidade para todos os propósitos).

Uma região variável de cadeia leve ou pesada daimunoglobulina consiste de uma região de "estrutura" interrompida por trêsregiões hipervariáveis. Assim, o termo "região hipervariável" refere-se aosresíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação deantígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma"Região Determinadora de Complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos24-34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) nos domínios variáveis de cadeia leve e31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) nos domínios variáveis de cadeiapeada (Kabat et al., Seqüences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (isto é, resíduos 26-32(LI), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) nos domínios variáveis de cadeia leve e 26-32(Hl), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) nos domínios variáveis de cadeia pesada;Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917) (ambas as quais são aquiincorporadas por referência). "Região Estrutural" ou resíduos "FR" sãoaqueles resíduos de domínio variável outro que não os resíduos da regiãohipervariável como aqui definidos. As seqüências das regiões de estrutura decadeias leves ou pesadas diferentes são relativamente conservadas dentro deuma espécie. Assim, uma "região estrutural humana" é uma região estruturalque é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, usualmente 90 a 95%ou mais) com a região estrutural de uma imunoglobulina humana que ocorrenaturalmente. A região estrutural de um anticorpo, isto é as regiões estruturaiscombinadas do constituinte de cadeias leves e pesadas, serve para posicionar ealinhar as CDR's. As CDR's são primariamente responsáveis pela ligação aum epítopo de um antígeno.

Conseqüentemente, o termo imunoglobulina "humanizada"refere-se a um imunoglobulina que compreende uma região estrutural humanae uma ou mais CDR's de uma imunoglobulina não humana (usualmente umcamundongo ou rato). A imunoglobulina não humana que fornece as CDR's échamada de "doadora" e a imunoglobulina humana que fornece a estrutura échamada de "aceitadora". As regiões constantes não necessitam estarpresentes, mas se elas estiverem devem ser substancialmente idênticas àsregiões constantes da imunoglobulina humana, isto é, pelo menos de cerca de85 a 90%, preferivelmente de cerca de 95% ou mais idênticas. Por estemotivo, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, excetopossivelmente as CDR's, são substancialmente idênticas às partescorrespondentes das seqüências humanas da imunoglobulina natural. Um"anticorpo humanizado" é um anticorpo que compreende umaimunoglobulina de cadeia leve humanizada e uma de cadeia pesadahumanizada. Por exemplo, um anticorpo humanizado não abrangeria umanticorpo quimérico típico como definido acima, por exemplo, porque aregião variável inteira de um anticorpo quimérico não é humana.

O termo "anticorpos geneticamente alterados" significaanticorpos em que a seqüência de aminoácido foi variada a partir daquela deum anticorpo nativo. Por causa da relevância de técnicas de DNArecombinante na geração de anticorpos, não se tem necessidade de estarconfinado às seqüências de aminoácidos encontradas em anticorpos naturais;os anticorpos podem ser replanejados para se obter características. Asvariações possíveis são muitas e variam da mudança de apenas um ou umpoucos aminoácidos ao replanejamento completo, por exemplo, das regiõesvariáveis ou constantes. As mudanças nas regiões constantes, no geral, serãofeitas de modo a melhorar ou alterar características, tais como fixação decomplemento, interação com membranas e outras funções efetoras. Asmudanças nas regiões variáveis serão feitas de modo a melhorar ascaracterísticas de ligação de antígeno.

Além de anticorpos, as imunoglobulinas podem existir em umavariedade de outras formas incluindo, por exemplo, anticorpos de cadeiaúnica ou Fv, Fab e (Fab')2, assim como diacorpos, linear, anticorposmultivalentes ou multiespecíficos híbridos (como descritos acima e emdetalhes em: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e emcadeias únicas (por exemplo, Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 85,5879-5883 (1988) e Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), que são aquiincorporadas por referência). (Ver, no geral, Hood et al., "Immunology",Benjamin, N.Y., 2a ed. (1984) e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16(1986), que são aqui incorporadas por referência).

Como aqui usado, os termos "Fv de cadeia única," "anticorposde cadeia única," "Fv" ou "scFv" referem-se aos fragmentos de anticorpo quecompreendem as regiões variáveis das cadeias tanto leve quanto pesada, mascarece das regiões constantes, mas dentro de uma única cadeia depolipeptídeo. No geral, um anticorpo de cadeia única compreende ainda umligador polipeptídico entre os domínios VH e VL que possibilitam que eleforme a estrutura desejada que possibilitaria a ligação de antígeno. Osanticorpos de cadeia única são debatidos em detalhes por Pluckthun em ThePharmacology of Monoclonals Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds.Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994); ver também a Publicaçãodo Pedido de Patente Internacional N2 WO 88/01649 e a Pat. U.S. Nes4.946.778 e 5.260.203, as divulgações dos quais são incorporadas porreferência para qualquer propósito. Em formas de realização específicas, osanticorpos de cadeia única também podem ser bi-específicos e/ouhumanizados.

Um "fragmento Fab" é compreendido de uma cadeia leve e asregiões CHi e variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de umamolécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com uma outramolécula de cadeia pesada.

Um "fragmento Fab'" contém uma cadeia leve e uma cadeiapesada que contém mais das regiões constantes, entre os domínios CHi e Cm,tal que uma ligação de dissulfeto intercadeia possa ser formada entre duascadeias pesadas para formar uma molécula F(ab')2.

Um "fragmento F(ab')2" contém duas cadeias leves e duascadeias pesadas contendo uma porção das regiões constantes entre osdomínios Chi e C m, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeia sejaformada entre duas cadeias pesadas.

Os pesos moleculares e comprimentos de polímerosdeterminados pelos métodos analíticos imprecisos (por exemplo, eletroforeseem gel) serão entendidos ser valores aproximados. Quando um tal valor éexpressado como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor estabelecidode X será entendido ser preciso até ± 10%.

Todas as referências aqui citadas são incorporadas porreferência em sua totalidade.

A presente invenção está fundamentada em parte nadescoberta do uso de anticorpos como antagonistas para IL-31 inibindo destemodo a inflamação no geral e os sintomas de dermatite e doenças pruríticas.

A invenção fornece o uso de anticorpos monoclonais para inibir, reduzir,prevenir ou minimizar os efeitos de dermatite e doenças pruríticas como aindadescrito aqui. Em uma forma de realização, a dermatite é a dermatite atópica.Em uma outra forma de realização a dermatite é o prurigo nodular. Em umaoutra forma de realização, a dermatite é eczema. IL-31 é um citocina de célulaT recém descoberta que, quando super-expressada em camundongos, resultaem sintomas equivalentes à dermatite. Ver também, Dillon, et ai., NatureImmunol. 5: 752-760, 2004. Tanto as células T residentes na pele quanto osqueratinócitos epidérmico foram implicados na patologia de doenças de peleem seres humanos. O mRNA de IL-3 Iea expressão de proteína são restritosà população de célula T CLA+ residentes na pele tanto em pacientes dedermatite atópica (AD) quanto indivíduos normais, embora a análise doreceptor para IL-31, IL-3 IRA, pela imunoistoquímica (IHC) sugira níveislevemente mais altos de expressão de IL-3 IRA nos queratinócitos dérmicosem biópsias de pele de enfermos de AD aguda e crônica comparados comindivíduos normais.

IL-31 é o nome HUGO para um citocina que foi previamentedescrita como Zcyto 17rlig em um pedido de patente U.S. publicado (Ver apublicação número 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003, aquiincorporada por referência). Ver também, Dillon, et ai., Nature Immunol.,supra. O receptor heterodimérico para IL-31 foi também descrito na20030224487 como zcytorl7 (nome HUGO, IL-3 IRA) que forma umheterodímero com o receptor beta da Oncostatina M (OSMRbeta). A IL-31 foiisolada de uma biblioteca de cDNA gerada a partir de células de sangueperiférico humano ativadas (hPBCs), que foram selecionadas para CD3. CD3é um marcador de superfície celular único para as células de origem linfóide,particularmente células T. As seqüências de polinucleotídeo e polipeptídeopara IL-31 humana são mostradas nas SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente.As seqüências de polinucleotídeo e polipeptídeo para IL-31 de murino sãomostradas nas SEQ ID NOs: 10 e 11, respectivamente. Como aqui usado otermo, IL-31 significa IL-31 como usado na publicação de patente U.S.número 20030224487, como mostrado acima. A seqüência de sinal secretorde IL-31 é compreendida dos resíduos de aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala) e opolipeptídeo maduro é compreendido dos resíduos de aminoácido 24 (Ser) a164 (Thr) (como mostrado na SEQ ID NO: 2). Outra análise deseqüenciamento de terminal N de IL-31 purificada a partir de células 293Tmostrou um terminal N no resíduo 27 (Leu) como mostrado na SEQ ID NO:2, com o polipeptídeo maduro compreendido dos resíduos de aminoácido 27(Leu) a 164 (Thr) (como mostrado na SEQID NO: 2).

a seqüência de polipeptídeo para o IL-31RA (receptor de IL-31) é mostrado na SEQ ID NO: 5 e a seqüência de polipeptídeo para oreceptor beta de Oncostatina M (OSMRbeta) é mostrado na SEQ ID NO: 7.

Os receptores IL-31RA e OSMRbeta pertencem à subfamíliado receptor de citocina de Classe I que inclui, mas não é limitado aosreceptores para IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF e G-CSF (para uma revisão ver, Cosman, "The Hematopoietin ReceptorSuperfamily" em Cytokine 5(2): 95-106, 1993). A subunidade IL-31RA étotalmente descrita no Pedido de Patente PCT de propriedade comum NfiUSO 1/20484 (Publicação WIPO N- WO 02/00721). A análise da distribuiçãode tecido do mRNA da subunidade de IL-31RA revelou a expressão emsubconjuntos de células T CD4+ e CD8+ ativadas, monócitos de CDl4+ eexpressão mais fraca em células N CD19+. Além disso, o mRNA foi presentetanto linhagens de célula monocíticas THP-1 em repouso ou ativadas (ATCCNe TIB-202), U937 (ATCC N2 CRL-1593.2) e HL60 (ATCC N2 CCL-240).

A inibição, neutralização, transdução de sinal bloqueador pelosantagonistas de IL-31 aqui descritos podem ser medidos por vários ensaiosconhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Por exemplo, os ensaios quemedem uma redução na proliferação incluem ensaios para a redução de umcorante tal como Azul de Alamar® (AccuMed International, Inc. Westlake,Ohio), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (Mosman, J1Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3,(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5,3-carboximetoxifenil-2H-tetrazólio; hidróxido de 2,3-bis(2-metóxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)-carbonil]-2H-tetrazólio; e cloreto de cianoditolil-tetrazólio (que são comercialmente disponíveis da Polysciences, Inc.,Warrington, PA); ensaios de mitogênese, tal como a medição da incorporaçãode 3H-timidina; ensaios de exclusão de corante usando, por exemplo, negro denaftaleno ou azul de triptano; captação de corante usando diacetilfluoresceína; e liberação de cromo. Ver, no geral, Freshney, Culture ofAnimal Cells: A Manual of Basic Technique, 3a ed., Wiley-Liss, 1994, que éaqui incorporada por referência. Além do acima, ver a publicação de patenteU.S. publicada número 20030224487, (Sprecher, Cindy et al., 2003) para umexemplo de células BaF3 que expressam IL-31RA e OSMRbeta de tamanhonatural.

No geral, as citocinas são prognosticadas ter uma estrutura dehélice quatro-alfa, com hélices A, C e D sendo mais importante nas interaçõesde ligando-receptor e são mais altamente conservadas entre os membros dafamília. Referindo-se à seqüência de aminoácido de IL-31 humana mostradana SEQ ID NO: 2, o alinhamento de IL-31 humana, IL-3 humana eseqüências de aminoácido de citocina humana é prognosticado que a hélice AIL-31 é definido pelos resíduos de aminoácido 38-52; hélice B pelos resíduosde aminoácido 83-98; hélice C pelos resíduos de aminoácido 104-117; ehélice D pelos resíduos de aminoácido 137-152; como mostrado na SEQ IDNO: 2. A análise estrutural sugere que a alça A/B é longa, a alça B/C é curta ea alça C/D é longa. Esta estrutura de alça resulta em uma organizaçãohelicoidal para cima-para cima-para baixo-para baixo. Com base na estruturade feixe de 4-hélices, os resíduos de cisteína dentro de IL-31 que sãoconservadas correspondem aos resíduos de aminoácido 72, 133 e 147 da SEQID NO: 2; e 74, 137 e 151 da SEQ ID NO: 11 aqui descritas. A colocação decisteína compatível é outra confirmação da estrutura de feixe de quatro hélice.Também altamente conservado na IL-31 está o resíduo Glu como mostrado naSEQ ID NO: 2 no resíduo 43. Estas hélices de IL-31 podem ser alvosespecíficos para a inibição, redução ou neutralização pelos anticorposdescritos aqui para bloquear os efeitos da sinalização de IL-31 através do seureceptor cognato.

Com base na comparação entre as seqüências de resíduosconservados de IL-31 humana e de murino foram encontrados nas regiõesprognosticadas para codificar hélices alfa C e D. Os polinucleotídeoscorrespondentes que codificam as regiões de polipeptídeo da IL-31 humana,domínios, motivos, resíduos e seqüências aqui descritas são como mostradasna SEQ ID NO: 1. Estas hélices de IL-31 podem ser alvos específicos para ainibição, redução ou neutralização pelos anticorpos aqui descritos parabloquear os efeitos da sinalização de IL-31 através do seu receptor cognato.

Embora a hélice D seja relativamente conservada entre a IL-31humana e de murino, a hélice C é a mais conservada. Embora ambas asespécies tenham aminoácidos ácidos predominantes nesta região, asdiferenças podem ser responsáveis pela especificidade de espécie eminteração entre IL-31 e seu receptor, a IL-3 IRA que compreende receptoresmonoméricos, heterodiméricos ou multiméricos. As alças A/B e a hélice B deIL-31 são marginalmente conservadas e a hélice C até a Alça C/D na hélice Dé a mais conservada entre as espécies; a conservação através desta regiãosugere que a mesma é funcionalmente significante. As hélices D de IL-31humana e de murino também são conservadas. Os antagonistas do receptor deIL-3 IRA podem ser planejados através das mutações dentro da hélice D deIL-31. Estas podem incluir a truncagem da proteína a partir do resíduo Thrl56(SEQ ID NO: 2) ou conservação dos resíduos que conferem a ligação doligando ao receptor, mas diminui a atividade de sinalização.

Os métodos para preparar os polinucleotídeos que codificamos anticorpos aqui descritos (incluindo DNA e RNA) são bem conhecidos natécnica. O RNA total pode ser preparado usando a extração pelo isotiocianatode guanidínio seguido pela isolação pela configuração em um gradiente deCsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poli (A)+ RNA épreparado a partir de RNA total usando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl.Acad. Sei. USA 69: 1408-12, 1972). O DNA complementar (cDNA) épreparado a partir de poli(A)+ RNA usando métodos conhecidos. Naalternativa, o DNA genômico pode ser isolado. Os polinucleotídeos quecodificam anticorpos IL-31 são depois identificados e isolados, por exemplo,pela hibridização ou PCR.

A seqüência de polinucleotídeo para o ortólogo decamundongo de IL-31 foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO: 3. Aseqüência madura para a IL-31 de camundongo putativamente começa emMeti, como mostrado na SEQ ID NO: 4, que corresponde a Met1, comomostrado na SEQ ID NO: 2, na seqüência humana. A análise de tecidorevelou que a expressão de IL-31 de camundongo é encontrada em testículos,cérebro, células CD90+, células prostáticas, glândulas salivares e pele. Outraanálise de seqüenciamento de terminal N de IL-31 purificada a partir decélulas 293T mostrou um terminal N no resíduo 31 (Ala) como mostrado naSEQ ID NO: 4, com o polipeptídeo maduro compreendido de resíduos deaminoácido 31 (Ala) a 163 (Cys) (como mostrada na SEQ ID NO: 4).

Um perfil de hidrofilicidade Hopp/Woods da seqüência deproteína IL-31 como mostrado na SEQ ID NO: 2 pode ser gerado (Hopp etal, Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Met. 88: 1-18, 1986 e Triquier et al., Protein Engineering JJ.: 153-169, 1998). O perfilestá fundamentado em uma janela de seis resíduos deslizante. Os resíduos G,SeT encobertos e os resíduos Η, Y e W expostos foram ignorados. Porexemplo, na IL-31 humana, as regiões hidrofílicas incluem os resíduos deaminoácido de 54 a 59 da SEQ ID NO: 2, os resíduos de aminoácido de 129 a134 da SEQ ID NO: 2, os resíduos de aminoácido de 53 a 58 da SEQ ID NO:2, os resíduos de aminoácido de 35 a 40 da SEQ ID NO: 2 e os resíduos deaminoácido de 33 a 38 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, na IL-31 decamundongo, as regiões hidrofílicas incluem os resíduos de aminoácido de 34a 39 da SEQ ID NO: 11, os resíduos de aminoácido de 46 a 51 da SEQ IDNO: 11, os resíduos de aminoácido de 131 a 136 da SEQ ID NO: 11, osresíduos de aminoácido de 158 a 163 da SEQ ID NO: 11 e os resíduos deaminoácido de 157 a 162 da SEQ ID NO: 11.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que ahidrofilicidade ou hidrofobicidade serão levadas em conta quando doplanejamento de modificações na seqüência de aminoácido de umpolipeptídeo de IL-31, de modo a não romper o perfil estrutural e biológicoglobal. De interesse particular para a substituição são os resíduos hidrofóbicosselecionados do grupo que consiste de Vai, Leu e Ile ou do grupo que consistede Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp. Por exemplo, os resíduos tolerantes desubstituição poderiam incluir Vai, Leu e Ile ou o grupo que consiste dosresíduos Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp como mostrado na SEQ ID NO: 2. OsResíduos de cisteína conservados nas posições dentro da SEQ ID NO: 2 eSEQ ID NO: 11, serão relativamente intolerantes de substituição.

A presente invenção também inclui anticorpos que se ligam afragmentos funcionais de polipeptídeos e moléculas de ácido nucleico de IL-31 que codificam tais fragmentos funcionais. Uma IL-31 "funcional" oufragmento deste como aqui definido é caracterizado pela sua atividadeproliferativa ou de diferenciação, pela sua capacidade para induzir ou inibirfunções de célula especializadas ou pela sua capacidade para ligarespecificamente a um anticorpo anti-IL-31 ou IL-31 RA ou anticorpo ouheterodímeros IL-31 RA/OSMRbeta destes receptores (solúveis ouimobilizados). Como previamente aqui descrito, IL-31 é caracterizado poruma estrutura de feixe helicoidal quádruplo que compreende a hélice A(resíduos de aminoácido 38 a 52), hélice B (resíduos de aminoácido de 83 a98), hélice C (resíduos de aminoácido de 104 a 117) e hélice D (resíduos deaminoácido de 137 a 152), como mostrado na SEQ ID NO: 2. Assim, apresente invenção fornece ainda proteínas de fusão que abrangem: (a)moléculas de polipeptídeo que compreendem uma ou mais das hélicesdescritas acima; e (b) fragmentos funcionais que compreendem uma ou maisdestas hélices. A outra porção de polipeptídeo da proteína de fusão pode sercontribuída por uma outra citocina de feixe helicoidal quádruplo, tal como IL-15, IL-2, IL-4 e GM-CSF ou por um peptídeo de sinal secretor não nativoe/ou um não relacionado que facilite a secreção da proteína de fusão.

A presente invenção também fornece anticorpos que se ligamaos fragmentos de polipeptídeo ou peptídeos que compreendem uma porçãoque carrega epítopo de um polipeptídeo de IL-31 aqui descrito. Taisfragmentos ou peptídeos podem compreender um "epítopo imunogênico," queé uma parte de uma proteína que evoca uma resposta de anticorpo quando aproteína inteira é usada como um imunógeno. Os peptídeos que portamepítopo imunogênico podem ser identificados usando métodos padrão (ver,por exemplo, Geysen et ai., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 81: 3998 (1983)). Aligação dos anticorpos para estes fragmentos funcionais resulta na inibição,bloqueio, neutralização e/ou redução na transdução de sinal de IL-31 no seureceptor cognato.

Ao contrário, os fragmentos de polipeptídeo ou peptídeospodem compreender um "epítopo antigênico," que é uma região de umamolécula de proteína à qual um anticorpo pode especificamente ligar-se.Certos epítopos consistem de um trecho linear ou contíguo de aminoácidos e aantigenicidade de um tal epítopo não é rompida pelos agentes desnaturantes.

E conhecido na técnica que os peptídeos sintéticos relativamente curtos quepodem imitar epítopos de uma proteína podem ser usados para estimular aprodução de anticorpos contra a proteína (ver, por exemplo, Sutcliffe et al.,Science 219: 660 (1983)). Conseqüentemente, os peptídeos e polipeptídeosque portam epítopo antigênico da presente invenção são úteis para incitaranticorpos (por exemplo, anticorpos neutralizadores) que se ligam com ospolipeptídeos aqui descritos. Os perfis de hidrofilicidade de Hopp/Woodspodem ser usados para determinar regiões que têm o potencial maisantigênico (Hopp et al., 1981, ibid. e Hopp, 1986, ibid.). Por exemplo, na IL-31 humana, as regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido de 54 a 59da SEQ ID NO: 2, os resíduos de aminoácido de 129 a 134 da SEQ ID NO: 2,os resíduos de aminoácido de 53 a 58 da SEQ ID NO: 2, os resíduos deaminoácido de 35 a 40 da SEQ ID NO: 2 e os resíduos de aminoácido de 33 a38 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, na IL-31 de camundongo, as regiõeshidrofílicas incluem resíduos de aminoácido de 34 a 39 da SEQ ID NO: 11, osresíduos de aminoácido de 46 a 51 da SEQ ID NO: 11, os resíduos deaminoácido de 131 a 136 da SEQ ID NO: 11, os resíduos de aminoácido de158 a 163 da SEQ ID NO: 11 e os resíduos de aminoácido de 157 a 162 daSEQ ID NO: 11.

Os peptídeos e polipeptídeos que portam epítopo antigênicopreferivelmente contêm pelo menos de quatro a dez aminoácidos, pelo menosde dez a catorze aminoácidos ou de cerca de catorze a cerca de trintaaminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Tais peptídeos epolipeptídeos que portam epítopo podem ser produzidos pela fragmentação deum polipeptídeo de IL-31 ou pela síntese química de peptídeo, como aquidescrita. Além disso, os epítopos podem ser selecionados pela demonstraçãode fago de bibliotecas de peptídeo aleatórias (ver, por exemplo, Lane e Stefen,Curr. Opin. Immunol. 5: 268 (1993); e Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol.7: 616 (1996)). Os métodos padrão para identificar epítopos e produziranticorpos a partir de peptídeos pequenos que compreendem um epítopo sãodescritos, por exemplo, por Mole, "Epitope Mapping," em Methods inMolecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105 a 116 (The HumanaPress, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of SyntheticPeptide-Derived Antibodies," em Monoclonals Antibodies: Production,Engineering and Clinicai Application, Ritter e Ladyman (eds.), páginas 60 a84 (Cambridge University Press 1995) e Coligan et al. (eds.), CurrentProtocols in Immunology, páginas 9.3.1 a 9.3.5 e páginas 9.4.1 a 9.4.11 (JohnWiley & Sons 1997).

A atividade dos anticorpos como aqui descritos pode sermedida pela sua capacidade para inibir ou reduzir a proliferação usando umavariedade de ensaios que medem a proliferação de e/ou ligação às células queexpressam o receptor de IL-31RA. De interesse particular são as mudançasnas células dependentes de IL-31. As linhagens de célula adequadas a seremengendradas para serem dependentes de IL-31 incluem a linhagem de célulaBaF3 dependente de IL-3 (Palacios e Steinmetz, Çell 41: 727-734, 1985;Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-Pl (Hapel etal., Blood 64: 786-790, 1984) e M07e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240,1993). As linhagens de célula dependentes do fator de crescimento podem serestabelecidas de acordo com métodos publicados (por exemplo Greenbergeret al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., em Baum et al. Eds.,Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soe. Exp. Hematol1979, 145-156, 1980).

A atividade dos anticorpos anti-IL-31 aqui descritos pode sermedida por um microfisiômetro biosensor com base em silício que mede ataxa de acidificação extracelular ou a excreção de próton associadas com aligação de receptor e as respostas celulares fisiológicas subseqüentes. Umdispositivo exemplar é o Microfisiômetro Cytosensor® fabricado pelaMolecular Devices, Sunnyvale, CA. Uma variedade de respostas celulares,tais como proliferação de célula, transporte de íon, produção de energia,resposta inflamatória, ativação regulatória e de receptor e outras, podem sermedidos por este método. Ver, por exemplo, McConnell, Η. M. et al., Science257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. et aL Met. Enzymol. 228: 84-108, 1997;Arimilli, S. et al., J. Immunol. Met. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. et ai,Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998.

Os antagonistas também são úteis como reagentes de pesquisapara caracterizar sítios de interação de ligando-receptor. Os antagonistas sãoúteis para inibir a expansão, proliferação, ativação e/ou diferenciação decélulas envolvidas na regulagem da hematopoiese. Os inibidores da atividadede IL-31 (antagonistas de IL-31) incluem anticorpos anti-IL-31 e receptoresde IL-31 solúveis, assim como outros agentes peptídicos e não peptídicos(incluindo ribozimas).

A inibição da atividade de IL-31 pode ser medida por váriosensaios. Além daqueles ensaios aqui divulgados, amostras podem ser testadasquanto a inibição da atividade de IL-31 dentro de uma variedade de ensaiosplanejados para medir a ligação de receptor, a estimulação/inibição derespostas celulares dependentes de IL-31 ou proliferação de células queexpressam o receptor de IL-3 IRA.

Um polipeptídeo de ligação de IL-31 também pode ser usadopara a purificação de ligando. O polipeptídeo é imobilizado em um suportesólido, tal como pérolas de agarose, agarose reticulada, vidro, resinascelulósicas, resinas com base em sílica, poliestireno, poliacrilamida reticuladaou materiais equivalentes que são estáveis sob as condições de uso. Osmétodos para a ligação de polipeptídeos aos suportes sólidos são conhecidosna técnica e incluem a química da amina, ativação pelo brometo decianogênio, ativação pela N-hidroxissuccinimida, ativação pelo epóxido,ativação pela sulfidrila e ativação pela hidrazida. O meio resultante no geralserá configurado na forma de uma coluna e os fluidos contendo ligando sãopassados através da coluna uma ou mais vezes para permitir que o ligando seligue ao polipeptídeo receptor. O ligando é depois eluído usando mudanças naconcentração salina, agentes caotrópicos (guanidina HCl) ou pH para rompera ligação de ligando do receptor.

Um sistema de ensaio que usa um receptor da ligação deligando (ou um anticorpo, um membro de um par de complemento/anti-complemento) ou um fragmento de ligação deste e um instrumento biossensorcomercialmente disponível (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)pode ser vantajosamente utilizado. Tal receptor, anticorpo, membro de um parde complemento/anti-complemento ou fragmento é imobilizado sobre asuperfície de um chip receptor. O uso deste instrumento é divulgado porKarlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 e Cunningham e Wells, J,Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Um receptor, anticorpo, membro ou fragmentosão covalentemente ligados, usando a química da amina ou sulfidrila, às fibrasde dextrano que são ligadas a películas de ouro dentro da célula de fluxo.Uma amostra de teste é passada através da célula. Se um ligando, epítopo oumembro oposto do par complemento/anti-complemento estiverem presentesna amostra, os mesmos ligar-se-ão ao receptor, anticorpo ou membroimobilizados, respectivamente, causando uma mudança no índice refrativo domeio, que é detectada como uma mudança na ressonância de plasma desuperfície da película de ouro. Este sistema permite a determinação de valoresdentro e fora, a partir dos quais a afinidade de ligação pode ser calculada e aavaliação da estequiometria de ligação. Alternativamente, a ligação deligando/receptor pode ser analisada usando a tecnologia de SELDI(TM)(Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).

Os anticorpos IL-31 podem ser usados para bloquear a açãobiológica de IL-31 pró-inflamatória e são úteis como produtos terapêuticosanti-infíamatórios em uma variedade de doenças como aqui descritas. Umapessoa de habilidade na técnica reconheceria que polipeptídeos antigênicos,que portam epítopo contêm uma seqüência de pelo menos 6, preferivelmentepelo menos 9 e mais preferivelmente pelo menos 15 a cerca de 30 resíduos deaminoácido contíguos de um polipeptídeo IL-31 (por exemplo, a SEQ ID NO:2). Os polipeptídeos que compreendem uma porção maior de um polipeptídeode IL-31, isto é, de 30 a 100 resíduos até o comprimento total da seqüência deaminoácido são incluídos. Antígenos ou epítopos imunogênicos tambémpodem incluir rótulos, adjuvantes, veículos e carregadores ligados, como aquidescritos. Os antígenos adequados incluem o polipeptídeo IL-31 codificadopela SEQ ID NO: 2 do aminoácido número 24 ao aminoácido número 164 ouum fragmento deste. Outros antígenos adequados incluem, o comprimentocompleto e a IL-31 madura, hélices AaDe hélices individuais ou múltiplasA, B, C e D, da estrutura de feixe helicoidal quádruplo de IL-31, como aquidescrito. Os peptídeos preferidos para o uso como antígenos são peptídeoshidrofílicos tais como aqueles prognosticados por uma pessoa de habilidadena técnica a partir de uma plotagem de hidrofobicidade, como aqui descritos,por exemplo, os resíduos de aminoácido de 114a 119, 101 a 105, 126 a 131,113all8el58a 162 da SEQ ID NO: 2; e os resíduos de aminoácido de 34 a39, 46 a 51, 131 a 136, 158 a 163 e 157 a 162 da SEQ ID NO: 11. Além disso,epítopos antigênicos de IL-31 como prognosticados por uma plotagem deJameson-Wolf, por exemplo, usando DNASTAR Protean program(DNASTAR, Inc., Madison, WI) servem como antígenos preferidos e sãofacilmente determinados por uma pessoa de habilidade na técnica.

Os anticorpos de uma resposta imune gerada pela inoculaçãode um animal com estes antígenos podem ser isolados e purificados comoaqui descritos. Os métodos para preparar e isolar anticorpos policlonais emonoclonais são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, CurrentProtocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes ofHealth, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratorv Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY,1989; e Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hvbridoma Antibodies:Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

Como estaria evidente a uma pessoa de habilidade comum natécnica, os anticorpos policlonais podem ser gerados a partir da inoculação deuma variedade de animais de sangue quente tais como cavalos vacas, cabras,ovelhas, cães, galinhas, coelhos, camundongos e ratos com um polipeptídeode IL-31 ou um fragmento deste. A imunogenicidade de um polipeptídeo deIL-31 pode ser aumentada através do uso de um adjuvante, tal como alúmen(hidróxido de alumínio) ou adjuvante completo ou incompleto de Freund. Ospolipeptídeos úteis para a imunização também incluem polipeptídeos defusão, tais como as fusões de IL-31 ou uma porção desta com um polipeptídeode imunoglobulina ou com proteína de ligação de maltose. O imunógeno depolipeptídeo pode ser uma molécula de tamanho natural ou uma porção desta.Se a porção de polipeptídeo é "equivalente a hapteno", tal porção pode servantajosamente unida ou ligada a um carregador macromolecular (tal como ahemocianina do lapa buraco de fechadura (KLH), albumina sérica bovina(BSA) ou toxóide do tétano) para imunização.

Os anticorpos são considerados estar especificamente ligadosse: 1) eles exibem um nível de limiar de atividade de ligação e 2) eles nãoreagem cruzado de modo significante com moléculas de polipeptídeorelacionadas. Um nível de limiar de ligação é determinado se anticorpos anti-IL-31 aqui ligam a um polipeptídeo, peptídeo ou epítopo de IL-31 com umaafinidade pelo menos 10 vezes maior do que a afinidade de ligação aopolipeptídeo de controle (não IL-31). E preferido que os anticorpos exibamuma afinidade de ligação (Ka) de IO6 M"1 ou maior, preferivelmente 107 M"1ou maior, mais preferivelmente 10 M" ou maior e o mais preferivelmente 10M"1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser facilmentedeterminada por uma pessoa de habilidade comum na técnica, por exemplo,pela análise de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-672,1949).

Se os anticorpos anti-IL-31 não reagem cruzado de modosignificante com as moléculas de polipeptídeo relacionadas é mostrado, porexemplo, pelo anticorpo detectando polipeptídeo de IL-31 mas nãopolipeptídeos relacionados conhecidos usando uma análise de Western blotpadrão (Ausubel et al., ibid.). Os exemplos de polipeptídeos relacionadosconhecidos são aqueles divulgados na técnica anterior, tal como ortólogos eparálogos conhecidos e membros conhecidos similares de uma família deproteína. A triagem também pode ser feita usando polipeptídeos de IL-31 emutante de IL-31 não humanos. Além disso, os anticorpos podem ser "triadoscontra" polipeptídeos relacionados conhecidos, para isolar uma população queespecificamente se liga aos polipeptídeos de IL-31. Por exemplo, anticorposincitados a IL-31 são adsorvidos pelos polipeptídeos relacionados aderidos àmatriz insolúvel; os anticorpos específicos para IL-31 fluíram através damatriz sob as condições de tampão apropriadas. A triagem permite a isolaçãode anticorpos policlonais e monoclonais não reativos cruzados com ospolipeptídeos intimamente relacionados conhecidos (Antibodies: ALaboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.),National Institutes of Health, John Wiley e Sons, Inc., 1995). A triagem eisolação de anticorpos específicos são bem conhecidas na técnica. Ver,Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al.,Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonais Antibodies: Principies andPractice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al.,Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Especificamente a ligação deanticorpos anti-IL-31 pode ser detectada por vários métodos na técnica edivulgados abaixo.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados, porexemplo, pela imunização de Ratos Sprague-Dawley (Charles RiverLaboratories, Wilmington, MA), com o polipeptídeo de IL-31 humanorecombinante maduro purificado (resíduos de aminoácido de 27 (Leu) a 167(Thr) da SEQ ID NO: 2) ou o ortólogo de camundongo, produzidos a partirdos sistemas de expressão aqui listados. Os ratos são cada um administradoscom uma injeção intraperitoneal (IP) inicial de 100 μ§ da proteína de IL-31recombinante humana purificada em Adjuvante de Freund Completo (Pierce,Rockford, IL) seguida por injeções IP de reforço de 50 μg da proteínarecombinante purificada em Adjuvante de Freund Incompleto a cada duassemanas. Sete a dez dias depois da administração da terceira injeção dereforço, os animais são sangrados e o soro é coletado.

As amostras de soro de rato específico da IL-31 humanaamostras são caracterizadas pelo ELISA quanto ao título para o alvo deanticorpo específico da IL-31 humana biotinilado.

As células de esplenócitos e nódulo linfático são colhidas de 2ratos de título alto e fundidas às células de mieloma SP2/0 (camundongo)usando PEG 1500 em dois procedimentos de fusão separados (razão de fusãode 4:1, células de esplenócitos para mieloma, "Antibodies A LaboratoryManual, E. Harlow e D. Lane, Cold Spring Harbor Press). A seguir dos 10dias de cultivo pós-fusão, as reuniões de hibridoma que produz o anticorpoespecífico são identificadas pelo ELISA. As reuniões de hibridoma positivasem ambos os protocolos de ELISA são ainda analisadas quanto a suacapacidade para bloquear ou reduzir a ligação da atividade de receptor("ensaio de neutralização") de IL-31 recombinante purificada.

As reuniões de hibridoma que produzem resultados positivospelo ELISA apenas ou ELISA e o "ensaio de neutralização" são clonados pelomenos duas vezes pela diluição limitante.

Os anticorpos monoclonais purificados a partir do meio decultura de tecido são caracterizados quanto a sua utilidade em um ELISA paraa determinação quantitativa de IL-31 humana recombinante e nativa. Osanticorpos são selecionados e um ensaio quantitativo é desenvolvido.

Os anticorpos monoclonais purificados a partir dos meios decultura de tecido são caracterizados quanto a sua capacidade para bloquear oureduzir a atividade de ligação do receptor ("ensaio de neutralização") dehuIL-31 recombinante purificada em células BaF3/MPL-IL-31. Váriosanticorpos monoclonais "neutralizantes" são identificados desta maneira. Oshibridomas que expressam os anticorpos neutralizadores monoclonais para aIL-31 humana descritos podem ser depois depositados com o depósito depatente American Type Tissue Culture Collection (ATCC; Manassas VA)como depósitos originais sob o Tratado de Budapeste.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados pelaimunização de Ratos Lewis (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA),com a proteína de fusão clivada e IL-31 purificada recombinante. Os ratos sãocada um administrados com uma injeção intraperitoneal (IP) inicial de 100 μgda proteína de fusão purificada recombinante em Adjuvante de FreundCompleto (Pierce, Rockford, IL) seguido por injeções IP de reforço de 50 μgda proteína recombinante purificada em Adjuvante de Freund Incompleto acada duas semanas por quatro semanas. A seguir das quatro primeirassemanas de imunizações, injeções IP de reforço de 50 μg da proteínarecombinante purificada clivada ligada à proteína carregadora de hemocianinado lapa buraco de fechadura (KLH, Pierce, Rockford, IL) em Adjuvante deFreund Incompleto são administrados a cada duas semanas por quatrosemanas. De sete a dez dias depois da administração da quarta injeção dereforço, os animais são sangrados e o soro foi coletado. As amostras de sorode rato específicas de IL-31 são caracterizadas pelo ELISA usando 500 ng/mlda proteína recombinante purificada de fusão IL-31-Fc como o alvo deanticorpo específico e uma proteína de fusão não relacionada como um alvode anticorpo não específico. Os esplenócitos são colhidos de um ou mais ratosde título alto e fundidos às células de mieloma SP2/0 (camundongo) em umprotocolo de fusão mediado pelo PEG otimizado (RocklandImmunochemicals). Os seguintes 12 dias de cultivo pós fusão, as reuniões dehibridoma que produzem anticorpo específicas são identificadas pelo ELISAusando 500 ng/ml cada da proteína de fusão purificada recombinante de EL-31como o alvo de anticorpo específico e uma proteína de fusão não relacionadacomo um alvo de anticorpo não específico. As reuniões de hibridomapositivas apenas para o alvo de anticorpo específico são analisadas aindaquanto a sua capacidade para bloquear ou reduzir a atividade de ligação dereceptor ("ensaio de neutralização") de huIL-31 recombinante em célulasBaF3/MPL-IL-31 e uma capacidade para ligar por intermédio de análiseFACS como alvo de anticorpo. As reuniões de hibridoma que produzem umresultado positivo específico no ensaio de ELISA e resultados positivos noFACS ou "ensaio de neutralização" são clonados pelo menos duas vezes peladiluição limitante.

Cinco hibridomas anti-camundongo de rato foram gerados emuma maneira similar e foram dados as seguintes designações de clone: clone271.9.4.2.6, clone 271.26.6.6.1, clone 271.33.1.2.2, clone 271.33.3.2.1 e clone271.39.4.6.5. Ver o Exemplo 1. Os anticorpos monoclonais produzidos porestes clones foram caracterizados em vários modos incluindocompartimentação (isto é, a determinação se cada anticorpo pode inibir aligação de qualquer outra ligação), afinidade relativa e neutralização. Osanticorpos monoclonais parecem cair em dois compartimentos separados coma ligação do clone 271.33.3.2.1 a um epítopo separado além dos outrosquatro. A afinidade de ligação relativa para quatro destes anticorposmonoclonais está descrita no Exemplo 14.

A afinidade de ligação dos anticorpos monoclonais pode sergerada. O anticorpo específico de IgG-Fc gama anti-Rato de cabra (Jackson) éimobilizado em um chip CM5 Biacore. O ensaio é otimizado para ligar cadamAb na superfície de captura anti-Rato e depois uma série de concentração deIL-31 é injetada através de mAb para ver a associação (Ka) e a dissociação(Kd). Depois de cada rodada, a superfície é regenerada de volta para oAnticorpo anti-Rato com 2 injeções de 20 mM de HCl. Os dados são geradospara cada um e o software de avaliação (software BIAevaluation versão 3.2,Pharmacia BIAcore, Uppsala, Suécia) é usado para avaliar as cinéticas daligação de anticorpo anti-IL-31 à proteína IL-31.

mAbs anti-IL-31 humana de murino podem ser gerados comosegue. Camundongos silenciados em IL-31 de seis a doze semanas de idadesão imunizados pela injeção intraperitoneal com 25 a 50 μg de proteína IL-31humana-muFc solúvel) misturados 1:1 (v:v) com adjuvante Ribi (Sigma) emum programa bi-semanal. Sete a dez dias a seguir da terceira imunização, asamostras de sangue são tiradas por intermédio da sangria retroorbital, o sorocolhido e avaliado quanto a sua capacidade para inibir a ligação de IL-31 emensaios de neutralização (por exemplo, aqui descritos) e para tingir células293 transfectadas versus não IL-31 transfectadas com IL-31 em um ensaio detingimento de FACS. Os camundongos continuaram a ser imunizados e asamostras de sangue coletadas e avaliadas como descrito acima até que ostítulos de neutralização atingissem um platô. Neste momento, oscamundongos com os títulos de neutralização mais altos são injetadosintravascularmente com 25 a 50 μg de4 proteína IL-31-Fc solúvel em PBS.

Três dias mais tarde, o baço e linfonodos destes camundongos são colhidos eusados para a geração de hibridoma, por exemplo usando células de mielomade camundongo (P3-X63-Ag8.653.3.12.11) ou outras linhagens de célulaapropriadas na técnica, usando métodos padrão conhecidos na técnica (porexemplo, ver Kearney, J. F. et ai., J Immunol. 123: 1548-50, 1979; e Lane, R.D. J Immunol Methods 81: 223-8, 1985).

A triagem primária pode ser realizada nos sobrenadantes dehibridoma em 8 a 10 dias após a fusão quanto a sua capacidade para ligar aproteína IL-31-muFc pelo ELISA usando reagentes da segunda etapa anti-camundongo de cabra conjugado a HRP capa e anti-cadeia leve lambda paraidentificar anticorpos de camundongo ligados.

A confirmação bioquímica de que a molécula alvo, IL-31,reconhecida pelos mAbs anti-IL-31 putativo é de fato IL-31 é realizada pelaimunoprecipitação padrão seguida pela análise de SDS-PAGE ouprocedimentos de western blotting, ambos utilizando preparações demembrana solúvel de células IL-31 transfectadas versus Baf3 nãotransfectadas. Os mAbs são testados quanto a sua capacidade paraimunoprecipitar especificamente ou western blot a proteína IL-31-muFcsolúvel.

Os anticorpos monoclonais purificados a partir dos meios decultura de tecido foram caracterizados quanto a sua capacidade para bloquearou inibir a capacidade de IL-31 para ligar ao seu receptor em um ensaio deneutralização. Vinte anticorpos monoclonais "neutralizadores" foramidentificados desta maneira. Dez destes foram identificados como "bonsneutralizadores" depois da primeira rodada de clonagem: o clone 292.72.3,clone 292.118.6, clone 292.63.5, clone 292.64.6, clone 292.84.1, clone292.109.4, clone 292.12.3, clone 292.51.5, clone 292.39.5 e clone 292.105.4.Os outros dez têm as seguintes designações de clone depois da primeirarodada de clonagem: clone 294.35.2, clone 294.146.5, clone 292.152.4, clone292.154.4, clone 294.154.5, clone 294.35.3, clone 291.78.4, clone 294.155.6,clone 294.158.5, clone 294.163.2 e clone 294.144.3.

Os anticorpos monoclonais específicos foram coletadosatravés de uma segunda rodada de clonagem e, mais uma vez, caracterizadosquanto a sua capacidade para bloquear ou inibir a capacidade da IL-31 paraligar ao seu receptor em um ensaio de neutralização. As designações de clonedepois da segunda rodada de clonagem quanto aos "bons neutralizadores"são: clone 292.12.3.1, clone 292.63.5.3, clone 292.72.3.1, clone 292.84.1.6,clone 292.118.6.4, clone 292.64.6.5.5, clone 292.39.5.3, clone 292.51.5.2,clone 292.109.4.4 e clone 292.105.4.1. Seis dos outros dez têm as seguintesdesignações de clone: clone 292.152.4.1, clone 294.158.5.2, clone294.32.2.6.3, clone 294.144.3.5, clone 294.154.5.3 e clone 294.163.2.1.Os hibridomas que expressam os anticorpos neutralizadoresmonoclonais para a IL-31 humana descritos acima foram depositados com odepósito de patente da American Type Tissue Culture Collection (ATCC;

Manassas VA) como depósitos originais sob o Tratado de Budapeste e foramdados os seguintes N- de Acesso ATCC: clone 292.12.3.1 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6815); clone 292.72.3.1 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6816); clone 292.63.5.3 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6829); clone 292.118.6.4 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6830); clone 294.163.2.1 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6831); clone 292.84.1.6 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6871); clone 294.35.2.6.3 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6872); clone 294.154.5.6 Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6875); e clone 294.144.3.5 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6873).

Um hibridoma que expressa os anticorpos neutralizadoresmonoclonais para a IL-31 camundongo aqui descritos foi depositado com odepósito de patente da American Type Tissue Culture Collection (ATCC;Manassas VA) como um depósito original sob o Tratado de Budapeste e foidado o seguinte N- de Acesso ATCC: clone 271.26.6.6.1 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6874)

Os anticorpos monoclonais produzidos por estes clones dehibridoma podem ser cultivados em um meio de cultivo de 90% de meio deDulbecco modificado de Iscove com 2 mM de L-glutamina, 100 μg/ml depenicilina e 100 μg/ml de sulfato de estreptomicina e 10% de Soro de CloneFetal I (Hyclone Laboratories). Os clones podem ser propagados partindo-sede culturas a 2 X IO5 células/ml e mantendo entre lX105e5X105 célula/mla 37°C e 5 a 6% de CO. As células podem ser adaptadas às condições isentasde soro nas transferências subseqüentes. As células que são congeladas sãoarmazenadas em 90% de soro, 10% de DMSO e armazenadas na fase devapor do congelador de nitrogênio líquido.

Os anticorpos monoclonais em meios de cultura de tecido sãocaracterizados quanto a sua capacidade para bloquear, inibir, prevenir oureduzir a ligação de receptor quando cultivado na presença da proteína de IL-31 humana recombinante purificada. Por exemplo, os anticorpos monoclonaisproduzidos por estes clones foram caracterizados em vários modos incluindocompartimentação (isto é, a determinação se cada anticorpo poderia inibir aligação de qualquer outra ligação), a afinidade e neutralização relativas. Osdez bons anticorpos neutralizadores parecem estar no mesmo compartimento,com o outro agrupamento de anticorpos monoclonais em três compartimentosseparados. Além disso, oito dos bons anticorpos neutralizadores são isótiposde IgGl e os outros dois são isótipos de IgG2a.

Os anticorpos monoclonais de sobrenadantes de hibridomaforam capturados usando Fc pAb anti murino de cabra e a afinidade deligação aparente (EC50) de IL31 biotinilada foi medida. Sob estas condiçõesde ensaio, os bons neutralizadores têm os valores EC50 mais baixos ecomparáveis de ~4 ng/ml de Bt-IL31. A afinidade aparente dosneutralizadores fracos transpõem uma faixa de ~10 ng/ml a 236 ng/ml de Bt-IL31.

Os anticorpos monoclonais gerados pelos métodos aquidescritos podem ser testados quanto a neutralização por uma variedade demétodos. Por exemplo o ensaio da luciferase como descrito no pedido depatente U.S. publicado (Ver, a publicação número 20030224487, Sprecher,Cindy et al., 2003) pode ser usado. Além disso, a neutralização pode sertestada pela medição de uma diminuição na produção de quimiocinas pró-inflamatórias tais como TARC e MDC a partir de culturas de queratinócitosna presença de ligando e do anticorpo monoclonal. A neutralização tambémpode ser medida pelos modelos in vivo aqui descrita.

Em uma forma de realização, os anticorpos da presenteinvenção são fragmentos de anticorpo que liga antígeno humano da presenteinvenção e incluem, mas não são limitados a, Fab5 Fab' e F(ab')2, Fd5 Fvs decadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados a dissulfeto(sdFv) e fragmentos que compreendem um domínio VL ou VH. Osfragmentos de anticorpo que ligam antígeno, incluindo anticorpos de cadeiaúnica, podem compreender a(s) região(ões) variável(is) sozinha(s) ou emcombinação com a totalidade ou uma porção das seguintes: região dedobradiça, domínios CHi, Cm e Cro. Também incluídos na invenção estão osfragmentos de ligação de antígeno que compreendem também qualquercombinação de região(ões) variável(is) com uma região de fechadura,domínios Chi, Cm e Ch3.

Em uma outra forma de realização, os anticorpos da presenteinvenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou demultiespecificidade maior. Os anticorpos multiespecífícos podem serespecíficos para epítopos diferentes de um polipeptídeo da presente invençãoou podem ser específicos tanto para um polipeptídeo da presente invençãoassim como para um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogoou material de suporte sólido. Ver, por exemplo, as publicações PCT WO93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., J.Immunol. 147: 60-69 (1991); Pat. U.S. N- 4.474.893, 4.714.681, 4.925.648,5.573.920, 5.601.819; Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).

A presente invenção também inclui anticorpos geneticamentealterados que são funcionalmente equivalentes aos anticorpos acima descritos.Os anticorpos modificados que fornecem estabilidade e/ou eficáciaterapêutica melhoradas são preferidos. Os exemplos de anticorposmodificados incluem aqueles com substituições conservativas de resíduos deaminoácido e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que nãoalteram de modo significantemente nocivo a utilidade da ligação de antígeno.As substituições podem variar de mudar ou modificar um ou mais resíduos deaminoácido para o replanejamento completo de uma região contanto que autilidade terapêutica seja mantida. Os anticorpos da presente invenção podemser modificadas pós translacionalmente (por exemplo, acetilação efosforilação) ou podem ser sinteticamente modificados (por exemplo, aligação de um grupo de rotulação).

Os anticorpos geneticamente alterados também incluemanticorpos quiméricos que derivaram dos anticorpos anti-IL-31. Os anticorposquiméricos compreendendo uma região variável derivada de um camundongoou rato e uma região constante derivada de um ser humano de modo que oanticorpo quimérico tenha uma meia vida mais longa e seja menosimunogênico quando administrado a um paciente humano. O método defabricar anticorpos quiméricos é conhecido na técnica. As regiões variáveisdestes anticorpos podem ser conectadas com uma região constante de umaIgG humana para formar o anticorpo quimérico desejado.

Os anticorpos anti-IL-31 geneticamente alterados usados napresente invenção incluem a versão humanizada dos anticorpos aqui descritos.

Os anticorpos humanizados compreendendo CDRs de uma imunoglobulinadoadora de camundongo e estruturas de cadeia pesada e cadeia leve de umaimunoglobulina aceitadora humana. O método de fabricar anticorpohumanizado é divulgado nas Pat. U.S. N- 5.301.101; 5.585.089, 5.693.762 e6.180.370 (cada uma das quais é incorporada por referência em suatotalidade). As CDRs destes anticorpos podem ser depois enxertadas emqualquer estrutura humana selecionada, que seja conhecida na técnica, paragerar o anticorpo humanizado desejado.

Os anticorpos da presente invenção podem ser descritos ouespecificados em termos do(s) epítopo(s) ou porção(ões) de um polipeptídeoda presente invenção que eles reconhecem ou especificamente se ligam. 0(s)epítopo(s) ou porção(ões) de polipeptídeo podem ser especificados como aquidescritos, por exemplo, pelas posições de terminal N e terminal C, pelotamanho em resíduos de aminoácido contíguos ou listados nas Tabelas eFIGS. Os anticorpos que especificamente se ligam a qualquer epítopo oupolipeptídeo da presente invenção também podem ser excluídos. Portanto, apresente invenção inclui anticorpos que especificamente se ligam aospolipeptídeos da presente invenção e permitem a exclusão dos mesmos.

A invenção também fornece anticorpos que competitivamenteinibem a ligação de um anticorpo monoclonal a um polipeptídeo da invenção,preferivelmente o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4. Ainibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido natécnica, por exemplo, usando os ensaios de ligação competitiva aqui descritos.

Em formas de realização preferidas, o anticorpo competitivamente inibe aligação de um anticorpo monoclonal da invenção em pelo menos 90%, pelomenos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60% ou pelo menos 50% aopolipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

A invenção também fornece anticorpos que competitivamenteinibem a ligação de um anticorpo a um epítopo da invenção comodeterminado por qualquer método conhecido na técnica para determinar aligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios aqui descritos. Em formasde realização preferidas, o anticorpo competitivamente inibe a ligação aoepítopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos60% ou pelo menos 50%.

Os anticorpos da presente invenção incluem derivados que sãomodificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula aoanticorpo tal que a ligação covalente não impeça o anticorpo de gerar umaresposta anti-idiotípica. Por exemplo, mas não por via de limitação, osderivados de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados, porexemplo, pela glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação,derivação pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagemproteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer umade numerosas modificações químicas podem ser realizadas pelas técnicasconhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica,acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc.Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos nãoclássicos.

Os anticorpos da presente invenção também abrangemanticorpos ou fragmentos destes que têm meias vidas (por exemplo, meiasvidas séricas) em um mamífero, preferivelmente um ser humano, de mais doque 15 dias, preferivelmente mais do que 20 dias, mais do que 25 dias, maisdo que 30 dias, mais do que 35 dias, mais do que 40 dias, mais do que 45 dias,mais do que 2 meses, mais do que 3 meses, mais do que 4 meses ou mais doque 5 meses. As meias vidas aumentadas dos anticorpos da presente invençãoou fragmentos destes em um mamífero, preferivelmente um ser humano,resulta em um título sérico mais alto dos ditos anticorpos ou fragmentos deanticorpo no mamífero e assim, reduzir a freqüência da administração dosditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo e/ou reduzir a concentração dosditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo a serem administrados.

Os anticorpos ou fragmentos destes tendo meias vidas in vivoaumentadas podem ser gerados pelas técnicas conhecidas por aqueles dehabilidade na técnica. Por exemplo, anticorpos ou fragmentos destes commeias vidas in vivo aumentadas podem ser gerados pela modificação (porexemplo, substituição, deleção ou adição) de resíduos de aminoácidoidentificados como envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptorFcRn (ver, por exemplo, Publicação Internacional N- WO 97/34631 e WO02/060919, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades). Osanticorpos ou fragmentos destes com meias vidas in vivo aumentadas podemser geradas pela ligação aos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpo demoléculas poliméricas tais como polietileno glicol (PEG) de peso molecularalto. O PEG pode ser ligado aos ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpocom ou sem um ligador multifuncional através da conjugação específica desítio do PEG ao terminal N ou C dos ditos anticorpos ou fragmentos deanticorpo ou por intermédio de grupos épsilon-amino presentes nos resíduosde lisina. A derivação de polímero linear ou ramificada que resulta em perdamínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação seráintimamente monitorado pela SDS-PAGE e espectrometria de massa paragarantir a conjugação apropriada de moléculas de PEG aos anticorpos. O PEGnão reagido pode ser separado dos conjugados de anticorpo-PEG, porexemplo, pela exclusão de tamanho ou cromatografia de troca iônica.

É entendido que os anticorpos humanizados planejados pelopresente método podem ter substituições de aminoácido conservativasadicionais que substancialmente não têm nenhum efeito sobre a ligação deantígeno ou outras funções de imunoglobulina. Por substituiçõesconservativas é intencionada combinações tais como gly, ala; vai, ile, leu; asp,glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; e phe, tyr.

Os métodos para humanizar anticorpos não humanos são bemconhecidos na técnica. No geral, as imunoglobulinas humanizadas, incluindoanticorpos humanizados, foram construídos por meio da engenharia genética.

As imunoglobulinas mais humanizadas que foram previamente descritas(Jones et al., op. cit.; Verhoeyen et al., op. cit.; Riechmann et al., op. cit.)compreenderam uma estrutura que é idêntica à estrutura de uma cadeia daimunoglobulina humana particular, a aceitadora e as três CDR's de umacadeia de imunoglobulina não humana doadora. Especificamente, osanticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécie não humanaque se ligam ao antígeno desejado tendo uma ou mais regiões determinadorasde complementaridade (CDRs) da espécie não humana e regiões de estruturade uma molécula de imunoglobulina humana.

A presente invenção inclui critérios pelos quais um númerolimitado de aminoácidos na estrutura de uma cadeia de imunoglobulinahumanizada é escolhido como sendo o mesmo como os aminoácidos naquelasposições no doador ao invés de no aceitador, de modo a aumentar a afinidadede um anticorpo que compreende a cadeia de imunoglobulina humanizada.

Os anticorpos da presente invenção são gerados com base emparte no modelo que duas causas contribuintes da perda de afinidade emmeios anteriores de produzir anticorpos humanizados (usando como exemploanticorpos de camundongo como a fonte de CDR's) são:

(1) Quando as CDR's de camundongo são combinadas com aestrutura humana, os aminoácidos na estrutura próxima às CDR's se tornamhumanas ao invés de camundongo. Sem intencionar estar ligado pela teoria,estes aminoácidos trocados podem distorcer levemente as CDR's, porque elescriam forças eletrostáticas ou hidrofóbicas diferentes daquelas no anticorpo decamundongo doador e as CDR's distorcidas podem não fazer contatos tãoeficazes com o antígeno como as CDR's o fazem no anticorpo doador; e

(2) Aminoácidos no anticorpo de camundongo original queestão próximos, mas não parte das CDR's (isto é, ainda parte da estrutura),podem fazer contatos com o antígeno que contribuem para a afinidade. Estesaminoácidos são perdidos quando o anticorpo é humanizado, porque todos osaminoácidos da estrutura são feitos humanos.

Para evitar estes problemas e para produzir anticorposhumanizados que tenham uma afinidade muito forte para um antígenodesejado, a presente invenção usa um ou mais dos seguintes princípios paradesignar imunoglobulinas humanizadas. Também, os critérios podem serusados isoladamente ou quando necessário em combinação, para obter aafinidade desejada ou outras características.

Um princípio é que como aceitador, uma estrutura é usada apartir de uma imunoglobulina humana particular que não é usualmentehomóloga à imunoglobulina doadora a ser humanizado ou usar uma estruturade consenso de muitos anticorpos humanos. Por exemplo, a comparação daseqüência de uma região variável de cadeia pesada (ou leve) de camundongocontra regiões variáveis pesadas (ou leves) humanas em um banco de dados(por exemplo, o National Biomedical Research Foundation ProteinIdentification Resource) mostra que o grau de homologia para regiõeshumanas diferentes varia enormemente, tipicamente de cerca de 40% a cercade 60 a 70%. Escolhendo-se como a imunoglobulina aceitadora uma dasregiões variáveis de cadeia pesada humana (respectivamente leve) que é amais homóloga para a região variável de cadeia pesada (respectivamente leve)da imunoglobulina doadora, menos aminoácidos serão mudados indo daimunoglobulina doadora para a imunoglobulina humanizado. Por este motivoe mais uma vez sem intencionar estar ligado pela teoria, acredita-se que existauma chance menor de mudar um aminoácido próximo das CDR's quedistorcem a sua conformação. Além disso, a forma global precisa de umanticorpo humanizado que compreende a cadeia de imunoglobulinahumanizada pode mais intimamente ser parecida com a forma do anticorpodoador, reduzindo também a chance de distorcer as CDR's.

Tipicamente, uma das 3 a 5 seqüências da região variável decadeia pesada mais homólogas em uma coleção representativa de pelo menoscerca de 10 a 20 cadeias pesadas humanas distintas serão escolhidas comoaceitadoras para fornecer a estrutura de cadeia pesada e similarmente para acadeia leve. Preferivelmente, uma das 1 a 3 regiões variáveis mais homólogasserão usadas. A cadeia de imunoglobulina aceitadora selecionada maispreferivelmente terá pelo menos cerca de 65% de homologia na regiãoestrutural para imunoglobulina doadora.

Em muitos casos, pode ser considerado preferível usar cadeiasleves e pesadas do mesmo anticorpo humano como seqüências aceitadoras,para estar certo de que as cadeias leves e pesadas humanizadas tornarão oscontatos favoráveis entre si. Neste caso, o doador de cadeias leves e pesadasserão comparados apenas contra cadeias de anticorpos humanos cujaseqüência completa seja conhecida, por exemplo, os anticorpos Eu, Lay, Pom,Wol, Sie, Gal ou e WEA (Kabat et al., op. cit.; ocasionalmente, os últimospoucos aminoácidos de uma cadeia humana não são conhecidos e devem serdeduzidos pela homologia a outros anticorpos humanos). O anticorpo humanoserá escolhido em que as seqüências das regiões variáveis de cadeia leve epesada, quando juntas, são de lado a lado mais homólogos às seqüências davariável de cadeia leve e pesada doadoras. Algumas vezes maior peso serádado à seqüência de cadeia pesada. O anticorpo humano escolhido forneceráentão as seqüências aceitadora tanto de cadeia leve quanto pesada. Na prática,é freqüentemente encontrado que o anticorpo Eu humano servirá para estepapel.

De acordo com o chamado método "de melhor ajuste", aseqüência do domínio variável de um anticorpo de roedor é triado contra abiblioteca inteira de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. Aseqüência humana que está mais próxima daquela do roedor é depois aceitacomo a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J.Immunol., 151: 2296 (1993); Chotia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)).Um outro método usa uma estrutura particular derivada da seqüência deconsenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular decadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para diversosanticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA,89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

Independente de como a imunoglobulina aceitadora éescolhida, afinidade mais alta pode ser obtida pela seleção de um númeropequeno de aminoácidos na estrutura da cadeia de imunoglobulinahumanizada para ser a mesma como os aminoácidos naquelas posições nodoador ao invés de no aceitador. Freqüentemente, os resíduos estruturais nasregiões de estrutura humana serão substituídos com o resíduo correspondentedo anticorpo doador de CDR para alterar, preferivelmente melhorar, a ligaçãode antígeno. Estas substituições de estrutura são identificadas pelos métodosbem conhecidos na técnica, por exemplo, pela modelagem das interações daCDR e resíduos estruturais para identificar resíduos estruturais importantespela ligação de antígeno e comparação de seqüência para identificar resíduosestruturais não usuais nas posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen etal., Pat. U.S. N- 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), quesão aqui incorporadas por referência nas suas totalidades). Os anticorpospodem ser humanizados usando uma variedade de técnicas conhecidas noramo incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (EP 239.400; publicação PCTWO 91/09967; Pat. U.S. Ν25 5.225.539; 5.530.101; e 5.585.089),embutimento ou revestimento (EP 592.106; EP 519.596; Padlan, MolecularImmunology 28(4/5): 489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering7(6): 805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91: 969-973 (1994)) eembaralhamento de cadeia (Pat. U.S. N° 5.565.332). Conseqüentemente, taisanticorpos "humanizado" são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. N° 4.816.567)em que substancialmente menos do que um domínio variável humano intactofoi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana.

Um segundo princípio é que as seguintes categorias definemquais aminoácidos podem ser selecionados do doador. Preferivelmente, emmuitas ou todas as posições de aminoácido em uma destas categorias, oaminoácido doador de fato será selecionado.

Categoria 1: A posição de aminoácido está em uma CDR édefinido por Kabat et al., op. cit.

Categoria 2: Se um aminoácido na estrutura daimunoglobulina aceitadora humana não é usual (isto é, "raro", que como aquiusado indica um aminoácido que ocorre naquela posição em menos do quecerca de 20% mas usualmente menos do que cerca de 10% das seqüências daregião V da cadeia pesada (respectivamente leve) humanas em um banco dedados representativo) e se o aminoácido doador nesta posição é típico para asseqüências humanas (isto é, "comum", que como aqui usado indica umaminoácido que ocorre em mais do que cerca de 25% mas usualmente maisdo que cerca de 50% das seqüências em um banco de dados representativo),então o aminoácido doador ao invés do aceitador pode ser selecionado. Estecritério ajuda a garantir que um aminoácido atípico na estrutura humana nãorompe a estrutura do anticorpo. Além disso, pela substituição de umaminoácido não usual com um aminoácido do anticorpo doador que resultaser típico para anticorpos humanos, o anticorpo humanizado pode ser feitomenos imunogênico. Todas as seqüências da região variável de cadeia leve epesada humanas são respectivamente agrupadas em "subgrupos" dasseqüências que são especialmente homólogas entre si e têm os mesmosaminoácidos em certas posições críticas (Kabat et al., op. cit.). Quando dadecisão de que um aminoácido em uma seqüência aceitadora humana é "raro"ou "comum" entre as seqüências humanas, freqüentemente será preferívelconsiderar apenas aquelas seqüências humanas no mesmo subgrupo como aseqüência aceitadora.

Categoria 3: Nas posições imediatamente adjacente a uma oumais das 3 CDR's na seqüência primária da cadeia de imunoglobulinahumanizada, o(s) aminoácido(s) doador(es) ao invés do aminoácido aceitadorpodem ser selecionados. Estes aminoácidos são particularmente prováveis deinteragir com os aminoácidos nas CDR's e, se escolhidos do aceitador, paradistorcer as CDR's do doador e reduzir a afinidade. Além disso, osaminoácidos adjacentes podem interagir diretamente com o antígeno (Amit etal., Science, 233, 747-753 (1986), que é aqui incorporada por referência) eselecionar estes aminoácidos do doador pode ser desejável para manter todosos contatos de antígeno que fornecem afinidade no anticorpo original.

Categoria 4: Um modelo 3-dimensional, tipicamente doanticorpo doador original, mostra que certos aminoácidos fora das CDR'sestão próximos às CDR's e têm uma boa probabilidade de interagir com osaminoácidos nas CDR's pela ligação de hidrogênio, forças de Van der Waals,interações hidrofóbicas, etc. Nestas posições de aminoácido, o aminoácido daimunoglobulina doadora ao invés do aminoácido da imunoglobulinaaceitadora pode ser selecionado. Os aminoácidos de acordo com este critériono geral terão um átomo de cadeia lateral dentro de cerca de 3 unidadesângstrom de algum átomo nas CDR's e devem conter um átomo que possainteragir com os átomos da CDR de acordo com forças químicasestabelecidas, tais como aquelas listadas acima.

No caso de átomos que podem formar uma ligação dehidrogênio, os 3 ângstroms são medidos entre seus núcleos, mas para osátomos que não formam uma ligação, os 3 ângstroms são medidos entre assuas superfícies de Van der Waals. Conseqüentemente, no último caso, osnúcleos devem estar dentro de cerca de 6 ângstroms (3 + a soma dos raios deVan der Waals) para que os átomos sejam considerados capazes de interagir.Em muitos casos os núcleos serão separados em 4 ou 5 a 6.ANG. Nadeterminação se um aminoácido pode interagir com as CDRs, é preferido nãoconsiderar os últimos 8 aminoácidos da CDR 2 de cadeia pesada como partedas CDRs, porque do ponto de vista de estrutura, estes 8 aminoácidoscomportam-se mais como parte da estrutura.

Os aminoácidos na estrutura que são capazes de interagir comos aminoácidos nas CDR's e que portanto pertencem à Categoria 4, podemser distinguidos de um outro modo. A área de superfície acessível ao solventede cada aminoácido da estrutura é calculada de duas maneiras: (1) noanticorpo intacto e (2) em uma molécula hipotética que consiste do anticorpocom as suas CDRs removidas. Uma diferença significante entre estes númerosde cerca de 10 ângstroms quadrados ou mais mostra que o acesso aoaminoácido da estrutura pelo solvente é pelo menos parcialmente bloqueadopelas CDRs e portanto que o aminoácido está fazendo contato com as CDRs.A área de superfície acessível ao solvente de um aminoácido pode sercalculada com base em um modelo 3-dimensional de um anticorpo, usandoalgoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Connolly, J. Appl. Cryst. 16,548 (1983) e Lee e Richards, J. Mol. Biol. 55, 379 (1971), ambas as quais sãoaqui incorporadas por referência). Os aminoácidos da estrutura tambémpodem ocasionalmente interagir com as CDR's indiretamente, pelainfluenciação da conformação de um outro aminoácido da estrutura que porsua vez contata as CDR's.

Os aminoácidos em diversas posições na estrutura sãoconhecidos serem capazes de interagir com as CDRs em muitos anticorpos(Chotia e Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chotia et al., Nature 342, 877(1989) e Tramontano et al, J. Mol. Biol. 215, 175 (1990), todas as quais sãoaqui incorporadas por referência), notavelmente nas posições 2, 48, 64 e 71 dacadeia leve e 26 a 30, 71 e 94 da cadeia pesada (numeração de acordo comKabat, op. cit.) e portanto estes aminoácidos no geral estarão na Categoria 4.

Tipicamente, as imunoglobulinas humanizadas, da presente invençãoincluirão aminoácidos doadores (onde diferente) na Categoria 4 além destes.

Os aminoácidos nas posições 35 na cadeia leve e 93 e 103 na cadeia pesadatambém são prováveis de interagir com as CDRs. Em todas estas posiçõesnumeradas, a escolha do aminoácido doador ao invés do aminoácido aceitador(quando eles diferirem) para estar na imunoglobulina humanizada é preferido.

Por outro lado, certas posições que podem estar na Categoria 4 tal como osprimeiros 5 aminoácidos da cadeia leve algumas vezes podem ser escolhidasda imunoglobulina aceitadora sem perda de afinidade na imunoglobulinahumanizada. Chotia e Lesk {op. cit.) definem as CDRs de modo diferente deKabat et al {op. cit.). Notavelmente, a CDRl é definida como incluindo osresíduos de 26 a 32. Conseqüentemente, Riechmann et al, {op. cit.) escolhemestes aminoácidos das imunoglobulinas doadoras.

Também é importante que os anticorpos sejam humanizadoscom a retenção de alta afinidade quanto ao antígeno e outras propriedadesbiológicas favoráveis. Para se alcançar esta meta, de acordo com um métodopreferido, os anticorpos humanizados são preparados por um processo deanálise das seqüências precursoras e vários produtos humanizados conceituaisusando modelos tri-dimensionais das seqüências precursoras e humanizadas.

Programas de computador são disponíveis que ilustram e demonstram asestruturas conformacionais tridimensionais prováveis de seqüências deimunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas demonstraçõespermite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento daseqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos queinfluenciam a capacidade da imunoglobulina candidata para ligar seuantígeno. Deste modo, os resíduos FR podem ser selecionados e combinadosa partir das seqüências receptoras e importadoras de modo que ascaracterística de anticorpo desejadas, tais como afinidade aumentada para o(s)antígeno(s) alvo, sejam obtidas. No geral, os resíduos de CDR estão direta emais substancialmente envolvidos na influenciação da ligação de antígeno.Programas de computador para criar modelos de proteínas tais comoanticorpos são no geral disponíveis e bem conhecidos por aqueles habilitadosna técnica (ver, Levy et al., Biochemistry, 28, 7168-7175 (1989); Bruccoleriet al., Nature, 335, 564-568 (1988); Chotia et al., Science, 233, 755-758(1986), todas as quais são aqui incorporadas por referência). Estes nãoformam parte da invenção. De fato, porque todos os anticorpos têm estruturassimilares, as estruturas de anticorpo conhecidas, que são disponíveis daBrookhaven Protein Data Bank, podem ser usados se necessário comomodelos brutos de outros anticorpos. Os programas de computadorcomercialmente disponíveis podem ser usados para demonstrar estes modelosem um monitor de computador, para calcular a distância entre os átomos epara estimar a probabilidade de aminoácidos diferentes interagirem (ver,Ferrin et al., J. Mol. Graphics, 6, 13-27 (1988)).

Além das categorias acima, que descrevem quando umaminoácido na imunoglobulina humanizada pode ser tirado do doador, certosaminoácidos na imunoglobulina humanizada podem ser tirados nem dodoador nem do aceitador, se depois caem na:

Categoria 5: Se o aminoácido em uma dada posição naimunoglobulina doadora é "raro" para as seqüências humanas e o aminoácidonesta posição na imunoglobulina aceitadora também é "raro" para asseqüências humanas, como definido acima, então o aminoácido nesta posiçãona imunoglobulina humanizado pode ser escolhido ser algum aminoácido"típico" das seqüências humanas. Uma escolha preferida é o aminoácido queocorre mais freqüentemente naquela posição nas seqüências humanasconhecidas pertencentes ao mesmo subgrupo como a seqüência aceitadora.

Os anticorpos humanizados no geral têm pelo menos trêsvantagens potenciais em relação ao de camundongo ou em alguns casosanticorpos quiméricos para o uso em terapia humana:

(1) Porque a porção efetora é humana, a mesma pode interagirmelhor com as outras partes do sistema imune humano (por exemplo, destruiras células alvo mais eficientemente pela citotoxicidade dependente decomplemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC)).

(2) O sistema imune humano não deve reconhecer a estruturaou região constante do anticorpo humanizado como estranhos e portanto aresposta de anticorpo contra um tal anticorpo injetado deve ser menor do quecontra um anticorpo de camundongo totalmente estranho ou um anticorpoquimérico parcialmente estranho.

(3) Os anticorpos de camundongo injetados foram relatados teruma meia-vida na circulação humana muito mais curta do que a meia-vida deanticorpos normais (D. Shaw et ai, J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)). Osanticorpos humanizados injetados presumivelmente terão uma meia-vida maissimilar a dos anticorpos humanos que ocorrem naturalmente, possibilitandoque doses menores e menos freqüentes sejam dadas.

Em um aspecto, a presente invenção está direcionada aoplanejamento de anticorpos humanizados que são produzidos pelos segmentosde DNA que expressam segmentos de DNA recombinantes que codificam asCDR's de cadeia pesada e leve de uma imunoglobulina doadora capaz deligação a um antígeno desejado, tal como IL-31, ligado aos segmentos deDNA que codificam as regiões de estrutura aceitadora humanas.

Os segmentos de DNA tipicamente incluirão ainda umaseqüência de DNA de controle de expressão operavelmente ligada àsseqüências que codificam a imunoglobulina humanizada, incluindo as regiõespromotoras naturalmente associadas ou heterólogas. As seqüências decontrole de expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetorescapazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas asseqüências de controle para hospedeiros procarióticos também podem serusadas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiroapropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para a expressãoem alto nível das seqüências de nucleotídeo, e, como desejado, a coleta epurificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesadaou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas deimunoglobulina humanizados pode seguir (ver, S. Beychok, Cells ofImmunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979), que é aquiincorporada por referência).

As seqüências de DNA da região constante humanas podemser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos a partir de umavariedade de células humanas, mas preferivelmente células B imortalizadas(ver, Kabat op. cit. e WP87/02671). As CDR's para produzir asimunoglobulinas da presente invenção serão similarmente derivadas deanticorpos monoclonais capazes de ligação ao antígeno pré determinado, talcomo IL-31 e produzidas por métodos bem conhecidos em qualquer fonte demamífero conveniente incluindo, camundongos, ratos, coelhos ou outrosvertebrados, capazes de produzir anticorpos. As células fontes adequadas paraas seqüências de DNA da região constante e estrutura e as células hospedeiraspara a expressão e secreção da imunoglobulina, podem ser obtidas de váriasfontes, tais como da American Type Culture Collection ("Catalogue of CellLines and Hybridomas," sexta edição (1988) Rockville, Md. U.S.A., que éaqui incorporada por referência).

Além das imunoglobulinas humanizadas especificamente aquidescritas, outras imunoglobulinas "substancialmente homólogas" modificadasem relação às seqüências nativas podem ser facilmente planejadas efabricadas utilizando várias técnicas de DNA recombinante bem conhecidaspor aqueles habilitados na técnica. Uma variedade de regiões de estruturahumana diferentes pode ser usada isoladamente ou em combinação como umabase para as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção. No geral, asmodificações dos genes podem ser facilmente realizadas por uma variedadede técnicas bem conhecidas, tais como a mutagênese direcionada ao sítio (ver,Gillman e Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) e S. Roberts et ai, Nature, 328, 731-734 (1987), ambas as quais são aqui incorporadas por referência).

Os anticorpos humanizados da invenção incluem fragmentosassim como anticorpos intactos. Tipicamente, estes fragmentos competemcom o anticorpo intacto a partir do qual eles foram derivados pela ligação deantígeno. Os fragmentos tipicamente se ligam com uma afinidade de pelomenos 10 M" e mais tipicamente 10 ou 10 M" (isto é, dentro das mesmasfaixas como o anticorpo intacto). Os fragmentos de anticorpo humanizadosincluem cadeias pesadas, cadeias leves, Fab, Fab', F(ab')2 e Fv separados. Osfragmentos são produzidos pelas técnicas de DNA recombinante ou pelaseparação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.

Para mais detalhes sobre a humanização de anticorpos, ver asPatentes Européias Nfis EP 239.400, EP 592.106 e EP 519.596; PublicaçãoInternacional N- WO 91/09967 e WO 93/17105; Pat. U.S. Nes 5.225.539,5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.766.886 e 6.407.213; e Padlan, 1991,Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka et al., 1994, ProteinEngineering 7(6): 805 814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969 973; Tan etal., 2002, J. Immunol. 169: 1119 25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13: 35360; Maisa et al., 2000, Methods 20: 267 79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem.272: 10678 84; Roguska et al., 1996, Proteína Eng. 9: 895 904; Couto et al.,1995, Câncer Res. 55 (Supl 23): 5973s 5977s; Couto et al., 1995, Câncer Res.55: 1717 22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen et al., 1994, J. Mol.Biol. 235: 959 73; Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Reichmann et al.,1988, Nature 332: 323-329; e Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.

Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivadospor intermédio da digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, porexemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Entretanto,estes fragmentos podem ser agora produzidos diretamente pelas célulashospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podemser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo debatidas acima.

Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados daE. coli e quimicamente ligado para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al.,Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com um outro método, osfragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente da cultura de célulahospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos deanticorpo estarão evidentes ao técnico habilitado. Além disso, exemplos detécnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única e anticorposincluem aqueles descritos nas Pat. U.S. 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al.,Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999(1993); e Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).A presente invenção abrange anticorpos recombinantementefundidos ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações tantocovalentes quanto não covalentes) a um polipeptídeo (ou porção deste,preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) dapresente invenção para gerar proteínas de fusão. Assim, a invenção tambémdiz respeito a imunoconjugados que compreendem o anticorpo aqui descritoconjugado a um agente citotóxico tal como um agente quimioterapêutico,toxina (por exemplo uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana,fungica, vegetal ou animal ou fragmentos destes) ou um isótopo radioativo(isto é, um radioconjugado).

A presente invenção abrange anticorpos recombinantementefundidos ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações tantocovalentes quanto não covalentes) a um polipeptídeo (ou porção deste,preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) dapresente invenção para gerar proteínas de fusão. A fusão não precisa sernecessariamente direta, mas pode ocorrer através de seqüências ligadoras. Osanticorpos podem ser específicos para antígenos outros que não ospolipeptídeos (ou porção destes, preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50aminoácidos do polipeptídeo) da presente invenção. Por exemplo, osanticorpos podem ser usados para alvejar os polipeptídeos da presenteinvenção a tipos de célula particulares, in vitro ou in vivo, fimdindo-se ouconjugando-se os polipeptídeos da presente invenção aos anticorposespecíficos para receptores de superfície celular particulares. Os anticorposfundidos ou conjugados aos polipeptídeos da presente invenção tambémpodem ser usados em imunoensaios in vitro e os métodos de purificaçãousando métodos conhecidos na técnica. Ver por exemplo, Harbor et al., suprae publicação PCT WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol.Lett. 39: 91-99 (1994); Pat. U.S. N2 5.474.981; Gillies et al., PNAS 89: 1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146: 2446-2452 (1991), que sãoincorporadas por referência em suas totalidades.

A presente invenção inclui ainda composições quecompreendem os polipeptídeos da presente invenção (por exemplo, aquelesque compreendem um epítopo imunogênico ou antigênico) fundido ouconjugado às seqüências de polipeptídeo heterólogas (por exemplo, domíniosde anticorpo outros que não as regiões variáveis). Por exemplo, ospolipeptídeos da presente invenção podem ser fundidos ou conjugados a umaregião de anticorpo Fc ou porção desta. Por exemplo, os polipeptídeos dapresente invenção (incluindo fragmentos ou variantes destes), podem serfundidos com os domínios constantes de imunoglobulina (IgA, IgE, IgG,IgM) ou porções destes (CHi, CH2, CH3 ou qualquer combinação destes eporções destes, resultando em polipeptídeos quiméricos. A porção deanticorpo fundida a um polipeptídeo da presente invenção pode compreendera região constante, a região de fechadura, o domínio Chi, o domínio Cu2 e odomínio Ch3 ou qualquer combinação de domínios inteiros ou porções destes.

Os polipeptídeos também podem ser fundidos ou conjugados às porções deanticorpo acima para formar multímeros. Por exemplo, porções Fc fundidasaos polipeptídeos da presente invenção podem formar dímeros através daligação de dissulfeto entre as porções Fe. As formas multiméricas superiorespodem ser fabricadas fundindo-se os polipeptídeos às porções de IgA e IgM.Os métodos para fundir ou conjugar os polipeptídeos da presente invenção àsporções de anticorpo são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Pat.U.S. N- 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.112.946,EP 307.434, EP 367.166, publicações PCT WO 96/04388, WO 91/06570,Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 10535-10539 (1991), Zhenget al., J. Immunol. 154: 5590-5600 (1995), e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89: 11337-11341 (1992) (as ditas referências incorporadas porreferência em suas totalidades). Por via de um outro exemplo não limitante, ospolipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ouvariantes destes) podem ser fundidos com albumina (incluindo mas nãolimitada à albumina sérica humana recombinante ou fragmentos ou variantesdesta (ver, por exemplo, a Pat. U.S. N- 5.876.969, concedida em 2 de marçode 1999, Patente EP 0 413 622 e Pat. U.S. N2 5.766.883, concedida em 16 dejunho de 1998, aqui incorporada por referência em sua totalidade)). Ospolipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ouvariantes destes) podem ser fundidos à extremidade dos terminais N ou C daproteína heteróloga (por exemplo, polipeptídeo de imunoglobulina Fc oupolipeptídeo da albumina sérica humana). Os polinucleotídeos que codificamproteínas de fusão da invenção também são abrangidos pela invenção.

Como debatido acima, os polipeptídeos da presente invençãopodem ser fundidos ou conjugados às porções de anticorpo acima paraaumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos ou para o uso emimunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Além disso, ospolipeptídeos da presente invenção podem ser fundidos ou conjugados àsporções de anticorpo acima para facilitar a purificação. Um exemplo relatadodescreve proteínas quiméricas que consistem dos primeiros dois domínios dopolipeptídeo CD4 humano e vários domínios das regiões constantes dascadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas de mamífero. (Ver, porexemplo, a EP 394.827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). Aliberação realçada de um antígeno através da barreira epitelial ao sistemaimune foi demonstrada para os antígenos (por exemplo, insulina) conjugadosa um parceiro de ligação FcRn tal como IgG ou fragmentos Fc (ver, porexemplo, as Publicações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Ospolipeptídeos da presente invenção fundidos ou conjugados a um anticorpotendo estruturas diméricas ligadas a dissulfeto (devido à IgG) também podemser mais eficientes em ligação e neutralização de outras moléculas, do que aproteína secretada monomérica ou fragmento de proteína sozinhos.(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)). Em muitos casos, aparte Fc em uma proteína de fusão é benéfica em terapia e diagnóstico e assimpode resultar, por exemplo, em propriedades farmacocinéticas melhoradas.(EP A 232.262). Alternativamente, deletar a parte Fc depois que a proteína defusão foi expressada, detectada e purificada, seria desejado. Por exemplo, aporção Fc pode impedir a terapia e diagnóstico se a proteína de fusão é usadacomo um antígeno para imunizações. Na descoberta de medicamentos, porexemplo, de proteínas humanas, tais como hIL-5, foram fundido com porçõesFc para o propósito de ensaios de triagem de alto rendimento para identificarantagonistas de hIL-5. (Ver, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270: 9459-9471 (1995)0. Taistécnicas também incluem, mas não são limitados ao uso de agentes deconjugação bifiincionais (ver por exemplo, as Pat. U.S. Ns5 5.756.065,5.714.631, 5.696.239, 5.652.361, 5.505.931, 5.489.425, 5.435.990, 5.428.139,5.342.604, 5.274.119, 4.994.560 e 5.808.003, os conteúdos de cada uma dasquais são por meio deste incorporados por referência em sua totalidade).

Além disso, os polipeptídeos da invenção (por exemplo,anticorpos ou fragmentos destes) podem ser fundidos a seqüênciasmarcadoras, tais como um peptídeo para facilitar a sua purificação. Em umaoutra forma de realização, ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos dainvenção (incluindo, mas não limitados aos ácidos nucleicos que codificamepítopos imunogênicos e/ou antigênicos) também podem ser recombinadoscom um gene de interesse como um rótulo de epítopo (por exemplo, o rótulode hemaglutinina ("HA") ou rótulo indicador) para ajudar na detecção epurificação do polipeptídeo expressado. Em formas de realização preferidas, aseqüência de aminoácido marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, talcomo o rótulo fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 EtonAvenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitos dos quais sãocomercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 86: 821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina fornecepurificação da proteína de fusão conveniente. Outros rótulos de peptídeo úteispara a purificação incluem, mas não são limitados ao rótulo "HA", quecorresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da infiuenza(Wilson et ai., Cell 37: 767 (1984)) e o rótulo "indicador".

A presente invenção abrange ainda anticorpos ou fragmentosdestes conjugados a um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpospodem ser usados em diagnóstico, por exemplo, para monitorar odesenvolvimento ou progressão de um tumor como parte de um procedimentode teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regimede tratamento, diagnóstico, detecção e/ou prevenção. A detecção pode serfacilitada pela ligação do anticorpo a uma substância detectável. Os exemplosde substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos protéticos,materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes,materiais radioativos, metais que emitem pósitron usando várias tomografiasde emissão de pósitron e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver,por exemplo, a Pat. U.S. Nfi 4.741.900 quanto a íons metálicos que podem serconjugados aos anticorpos para o uso como diagnósticos de acordo com apresente invenção. Os exemplos de enzimas adequadas incluem rábanoperoxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; osexemplos de complexos de grupo protético adequados incluemestreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiaisfluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato defluoresceína, rodamina, diclorotriazinil-amina fluoresceína, cloreto de dansilaou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; osexemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e

• 125 131 111aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 111In ou 99Tc.

Além disso, um anticorpo ou fragmento deste podem serconjugados a uma porção terapêutica tal como uma citotoxina, por exemplo,um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metalradioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico incluem qualquer agente queseja nocivo para as células. Os exemplos incluem paclitaxol, citochalasina B,gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida,tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina,daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina,actinomicina D,l-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína,lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes. Osagentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (porexemplo, metotrexato, 6-mercapto-purina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina,tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU),ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C ecis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo,daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos(por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina,mitramicina e antramicina (AMC)) e agentes anti-mitóticos (por exemplo,vincristina e vinblastina).

Os conjugados da invenção podem ser usados para modificaruma dada resposta biológica, o agente terapêutico ou porção medicamentosanão devem ser interpretados como limitados aos agentes terapêuticos daquímica clássica. Por exemplo, a porção medicamentosa pode ser umaproteína ou polipeptídeo que possua uma atividade biológica desejada. Taisproteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina,exotoxina de pseudomonas ou toxina da difteria; uma proteína tal como ofator de necrose de tumor, α-interferon, beta-interferon, fator de crescimentode nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador deplasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina; ou, modificadores daresposta biológica tal como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"),interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulador de colôniade macrófase granulocítica ("GM-CSF"), fator estimulador de colôniagranulocítica ("G-CSF") ou outros fatores de crescimento.

Os anticorpos também podem ser ligados aos suportes sólidos,que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígenoalvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, vidro, celulose,poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.

As técnicas para conjugar tal porção terapêutica aos anticorpossão bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal AntibodiesFor Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em MonoclonalAntibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243- 56 (Alan R.Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Deliveiy", emControlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (MareeiDekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCâncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological AndClinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); " Analysis5Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For CâncerDetection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press1985) e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties OfAntibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119-58 (1982).

Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado a umsegundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado como descritopor Segai em Pat. U.S. Ne 4.676.980, que é aqui incorporada por referênciaem sua totalidade.

Um anticorpo, com ou sem uma porção terapêutica conjugadaa ele, administrado sozinho ou em combinação com fator(es) citotóxico(s)e/ou citocina(s) pode ser usado como um produto terapêutico.Em uma outra forma de realização, o anticorpo pode serconjugado a um "receptor" (tal como estreptavidina) para utilização no préalvejamento de tumor em que o conjugado anticorpo-receptor é administradoao paciente, seguido pela remoção do conjugado não ligado da circulaçãousando um agente de depuração e depois a administração de um "ligando"(por exemplo avidina) que é conjugado a um agente citotóxico (por exemploum radionuclídeo).

Uma variedade de ensaios conhecidos por aqueles habilitadosna técnica pode ser utilizada para detectar anticorpos que se ligam àsproteínas ou polipeptídeos de IL-31. Os ensaios exemplares são descritos emdetalhes em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (Eds.), ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1988. Os exemplos representativos de taisensaios incluem: a imunoeletroforese concorrente, radioimunoensaio,radioimuno-precipitação, ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA),ensaio de dot blot ou Western blot, ensaio de inibição ou competição e ensaiode intercalação. Além disso, os anticorpos podem ser triados quanto a ligaçãoà proteína ou polipeptídeo de IL-31 do tipo selvagem versus mutante.

Os anticorpos para IL-31 podem ser usados para alvejarcélulas que expressam IL-31; para isolar IL-31 pela purificação de afinidade;para os ensaios de diagnóstico para determinar os níveis circulantes depolipeptídeos de IL-31; para detectar ou quantificar IL-31 solúvel como ummarcador de patologia ou doença subjacente; em métodos analíticosutilizando FACS; para triar bibliotecas de expressão; para gerar anticorposanti-idiotípicos; e como anticorpos neutralizadores ou como antagonistas parabloquear a atividade de IL-31 in vitro e in vivo. Os rótulos ou etiquetas diretosadequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores,marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículasmagnéticas e outros; os rótulos ou etiquetas indiretos podem caracterizar ouso de biotina-avidina ou outros pares de complemento/anti-complementocomo intermediários. Os anticorpos aqui também podem ser direta ouindiretamente conjugados aos medicamentos, toxinas, radionuclídeos e outrose estes conjugados usados para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas invivo. Além disso, os anticorpos para IL-31 ou fragmentos destes podem serusados in vitro para detectar IL-31 desnaturado ou fragmentos destes emensaios, por exemplo, Western Blots ou outros ensaios conhecidos na técnica.

As moléculas detectáveis adequadas podem ser direta ouindiretamente ligadas ao polipeptídeo ou anticorpo e incluem radionucliídeos,enzimas, substratos, cofatores, inibidores, marcadores fluorescentes,marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e outros. Asmoléculas citotóxicas adequadas podem ser direta ou indiretamente ligadas aopolipeptídeo ou anticorpo e incluem toxinas bacterianas ou vegetais (porexemplo, difteria, toxina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrinae outros), assim como radionuclídeos terapêuticos, tais como iodo-131, rênio-188 ou ítrio-90 (diretamente ligados ao polipeptídeo ou anticorpo ouindiretamente ligados através de meios de uma porção queladora, porexemplo). Os polipeptídeos ou anticorpos também podem ser conjugados aosmedicamentos citotóxicos, tais como adriamicina. Para a ligação indireta deuma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxicapode ser conjugada com um membro de um parcomplementar/anticomplementar, onde o outro membro é ligado à porção depolipeptídeo ou anticorpo. Para estes propósitos, biotina/estreptavidina é umpar complementar/anticomplementar exemplar.

Os polipeptídeos de ligação também podem atuar como"antagonistas" de IL-31 para bloquear a ligação de IL-3 Iea transdução desinal in vitro e in vivo. Estes polipeptídeos de ligação anti-IL-31 seriam úteispara inibir a atividade de IL-31 ou ligação da proteína.

As proteínas de fusão de toxina de polipeptídeo ou as proteínasde fusão anticorpo-toxina podem ser usadas para a inibição ou ablação decélula ou tecido alvejadas (por exemplo, para tratar células ou tecidoscancerosos). Alternativamente, se o polipeptídeo tem domínios funcionaismúltiplos (isto é, um domínio de ativação ou um domínio de ligação dereceptor, mais um domínio alvejador), uma proteína de fusão incluindoapenas o domínio alvejador pode ser adequada para direcionar uma moléculadetectável, uma molécula citotóxica ou uma molécula complementar a umtipo de célula ou tecido de interesse. Em casos onde o domínio exceto aproteína de fusão inclui uma molécula complementar, a molécula anti-complementar pode ser conjugada a uma molécula detectável ou citotóxica.Tais proteínas de fusão da molécula complementar de domínio representamassim um carregador ou veículo alvejador genérico para a liberação específicade célula/tecido de conjugados de anti-complementar-detectável/moléculacitotóxica genéricos.

Em uma outra forma de realização, as proteínas de fusão deanticorpo IL-31-citocina podem ser usadas para matança in vivo de tecidosalvo (por exemplo, leucemia, linfoma, câncer pulmonar, câncer de cólon,melanoma, câncer pancreático, câncer ovariano, cânceres de pele, sangue emedula óssea ou outros cânceres em que os receptores de IL-31 sãoexpressados) (Ver, no geral, Hornick et al., Blood 89: 4437-47, 1997). Asproteínas de fusão descritas permitem o alvejamento do anticorpo a um sítiodesejado de ação, fornecendo deste modo uma concentração local elevada deanticorpo. Os polipeptídeos de IL-31 ou os anticorpos anti-IL-31 adequadosalvejam uma célula ou tecido indesejáveis (isto é, um tumor ou umaleucemia) e a citocina fundida mediou a Iise da célula alvo melhorada pelascélulas efetoras. As citocinas adequadas para este propósito inclueminterleucina 2 e fator estimulador de colônia de macrófago granulocítico(GM-CSF), por exemplo.

Já em uma outra forma de realização, se o polipeptídeo de IL-31 ou anticorpo anti-IL-31 alvejam células ou tecidos vasculares, taispolipeptídeo ou anticorpo podem ser conjugados com um radionuclídeo eparticularmente com um radionuclídeo beta-emissor, para reduzir a restenose.

Os anticorpos monoclonais da presente invenção podem sermedidos quanto a sua capacidade para inibir, bloquear ou neutralizar oligando de IL-31 como determinado pelos vários modelos in vivo conhecidosna técnica e aqui descritos, incluindo mas não limitados ao modelo NC/Nga, omodelo epicutâneo Ova, o modelo da hipersensibilidade crônica e o modelode hapteno crônico.

Tanto as células T residentes na pele quanto os queratinócitosepidérmicos foram implicados na patologia de doenças das pele em sereshumanos. O mRNA de IL-31 e a expressão de proteína são restritos àpopulação de célula T CLA+ residentes na pele em seres humanos. Como tal,um antagonista para LL-31, incluindo um anticorpo ou antagonista de receptorserão úteis no tratamento de doenças da pele e epidérmicas que têm aexpressão de células T CLA+. Tais doenças incluem, por exemplo, dermatiteatópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por medicamento,vírus trópico de pele e prurido associado com vírus, vitiligo, linfoma de célulaT cutâneo, alopecia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular epênfígo bolhoso. Os marcadores de quimiocina tais como TARC e MDC sãoúteis para medir o efeito de um anticorpo monoclonal neutralizador para IL-31. Como mostrado no Exemplo 15, os efeitos inibidores de tratamento comanticorpos anti-IL-31 aqui descritos podem ser medidos pelo monitoramentodos níveis de TARC e MDC.

Dermatite de contato

A dermatite de contato alérgica é definida como uma reaçãoimune mediada pela T célula a um antígeno que entra em contato com a pele.A população de célula T CLA+ é considerada estar envolvida no início dadermatite visto que as respostas de célula T dependentes de alérgeno sãoamplamente confinadas à população CLA+ de células (Ver Santamaria-Babi,L. F., et al., J Exp Med: 181, 1935, (1995)). Dados recentes descobriram queapenas as células T (CD45RO+) CD4+ CLA+ da memória e não as CD8+proliferam e produzem ambos os tipos de citocina tipo-1 (IFN-) e tipo-2 (IL-5) em resposta ao níquel, um alérgeno de hipersensibilidade de contatocomum. Além disso, as células que expressam CLA em combinação comCD4, CD45RO (memória) ou CD69 são aumentadas depois da estimulaçãoespecífica de níquel e expressam os receptores de quimiocina CXCR3, CCR4,CCRlO mas não CCR6. Ver Moed H., et al., Br J Dermatol: 51, 32, (2004).

Em modelos de animal, foi demonstrado que a dermatite decontato alérgica é dependente de célula T e que as células T alérgico-responsivas migram para o sítio de aplicação de alérgeno. Ver no geral:Engeman T. M., et al., J Immunol: 164, 5207, (2000); Ferguson T. A. &Kupper T. S. J Immunol: 150, 1172, (1993); e Gorbachev Α. V. & FairchildR. L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001). Visto que as células T CLA+produzem IL-3 Iea estimulação pela IL-31 de queratinócitos dérmicos podeinduzir quimiocinas pró-inflamatórias, tais como TARC e MDC, a IL-31 podeestar envolvida na fisiopatologia da dermatite de contato. Usando-se umanticorpo IL-31 neutralizante em um modelo de camundongo dehipersensibilidade de contato. Ver o Exemplo 8.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico daHipersensibilidade de Contato pela inibição, redução, neutralização,prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associadas com a doença.

Dermatite atópica

A dermatite atópica (AD) é uma doença de pele inflamatóriacronicamente reincidente com uma incidência dramaticamente crescente nasúltimas décadas. Clinicamente a AD é caracterizada pelas placasfreqüentemente escoriadas altamente prurítica e pápulas que mostram umcurso reincidente crônico. O diagnóstico de AD é principalmentefundamentado nas descobertas clínicas maiores e menores. Ver Hanifin J. M.,Arch Dermatol: 135, 1551 (1999). A histopatologia revela espongiose,paraqueratose hiper e focai em lesões agudas, ao passo que a hiperplasiaepidérmica acentuada com hiper e paraqueratose, acantose/hipergranulose einfiltração perivascular da derme com linfócitos e mastóides abundantes sãoas marcas distintivas de lesões crônicas.

As células T desempenham um papel central no início derespostas imunes locais em tecidos e evidência sugere que as células T queinfiltram a pele em particular, podem desempenhar um papel chave no inícioe manutenção de respostas imunes desreguladas na pele. Aproximadamente90% das células T infiltrantes em sítios inflamatórios cutâneos expressam aAg (CLA+) associada a linfócito cutâneo que se liga à E-selectina, umamolécula de" adesão indutível no endotélio (revisado em Santamaria-Babi L.F., et al., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004)). Um aumento significante nascélulas T CLA+ circulantes entre pacientes AD comparado com indivíduos decontrole foi documentado (Ver Teraki Y., et al., Br J Dermatol: 143, 373(2000), enquanto que outros têm demonstrado que as células T CLA+ damemória de pacientes AD preferencialmente respondem ao extrato dealérgeno comparado com a população CLA- (Ver Santamaria-Babi, L. F., etal., J Exp Med: 181, 1935, (1995)). Em seres humanos, a patogênese dedistúrbios atópicos da pele foram associados com aumentos nas células TCLA+ que expressam níveis aumentados de citocinas tipo Th-2 como IL-5 eIL-13 9, 10. Ver Akdis M., et al., Eur J Immunol: 30, 3533 (2000); e HamidQ., et al.,i Allergy Clin Immunol: 98, 225 (1996).

Camundongos NC/Nga espontaneamente desenvolvem lesõescomo AD que se igualam com a AD humana em muitos aspectos, incluindo ocurso e os sinais clínicos, histopatologia e imunopatologia quando alojadosem condições isentas de patógeno não especificadas (não SPF) em torno das 6a 8 semanas de idade. Ao contrário, camundongos NC/Nga mantidos sobcondições SPF não desenvolvem lesões de pele. Entretanto, o início de lesõesde pele espontâneas e comportamento de coceira podem ser sincronizados emcamundongos NC/Nga alojados em uma instalação SPF pela injeçãointradérmica semanal de antígeno de ácaro de poeira bruto. Ver Matsuoka H.,et al., Allergy: 58, 139 (2003). Portanto, o desenvolvimento de AD emNC/Nga é um modelo útil para a avaliação de novos produtos terapêuticospara o tratamento de AD.

Além do modelo NC/Nga de AD espontânea, a sensibilizaçãoepicutânea de camundongos usando OVA também pode ser usada como ummodelo para induzir o espessamento epidérmico e dérmico dependente deantígeno com um infiltrado mononuclear na pele de camundongossensibilizados. Isto coincide usualmente com níveis séricos elevados de IgEtotal e específico, entretanto nenhuma disfunção de barreira de pele ouprurido normalmente ocorre neste modelo. Ver Spergel J. M., et al., J ClinInvest, 101: 1614, (1998). Este protocolo pode ser modificado de modo ainduzir a desregulagem da barreira de pele e prurido pela sensibilização decamundongos transgênicos DOl 1.10 OVA TCR com OVA. Aumentando onúmero de células T específicas de antígeno que reconheceram o antígenosensibilizante pode aumentar o nível de inflamação na pele para induzircomportamento de coceira e liquenificação/escamação da pele visíveis.

Tanto o modelo de AD espontânea em NC/Nga e o modeloDOl 1.10 de OVA epicutânea são usados para investigar a expressão de IL-31e IL-31RA na AD, assim como a capacidade dos anticorpos aqui descritospara inibir, reduzir ou neutralizar os efeitos de IL-31. Ver os Exemplos 9 e 10aqui. Em um estudo usando o modelo NC/Nga in vivo (Exemplo 10), aadministração de anticorpos anti-IL-31 de camundongo de rato mostrou aredução na coceira, mas não uma redução na dermatite. Os anticorpos aquidescritos são úteis para inibir a coceira associada com dermatite e doençaspruríticas incluindo a dermatite atópica, prurigo nodular e eczema. Umainibição, redução ou prevenção da coceira, sozinho, podem ser eficazes notratamento de doenças pruríticas incluindo, mas não limitadas a, dermatiteatópica, prurigo nodular e eczema, visto que a cessação da coceirainterromperá a progressão de dermatite, o desenvolvimento da qual édependente da coceira.

Os modelos adicionais para medir os efeitos inibitórios dosanticorpos anti-IL-31 aqui descritos são descritos por Umeuchi, H. et aL,European Journal of Pharmacology, 518: 133-139, 2005; e por Yoo, J. et aL,J. Experimental Medicine, 202: 541-549, 2005.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico de dermatite edoenças pruríticas incluindo dermatite atópica, prurigo nodular e eczema pelainibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceiraassociadas com a doença.

Reações alérgicas cutâneas do tipo demorado induzidas por medicamento

As reações alérgicas cutâneas do tipo demorado induzidas pormedicamento são muito heterogêneas e podem espelhar muitos eventosfisopatológicos distintos. Ver Brockow K., et aL, Allergy: 57, 45 (2002). Osmecanismos imunológicos envolvidos nestas reações mostraram comomeidados por anticorpo ou célula. Na alergia medicamentosa imediata umareação de anticorpo mediada por IgE pode ser demonstrada por um teste depicada de pele e/ou intradérmica positivo depois de 20 min, ao passo que asreações não imediatas aos medicamentos podem ocorrer mais do que umahora depois da última ingestão de medicamento e são freqüentementemediados pela célula T. As reações do tipo demorado mediadas pela célula Tnão imediata podem ocorrer em pacientes com reações medicamentosasadversas às penicilinas por exemplo. As respostas de célula T proliferativa àspenicilinas mostraram estar restritas à subpopulação (CD45RO+) CLA+ damemória de células T de pacientes alérgicos à penicilina ao passo que osubconjunto CD45RCH- CLA- não mostra nenhuma resposta proliferativa. VerBlanca M., Leyva L., et al., Blood Cells Mol Dis: 31, 75 (2003). As reaçõesde hipersensibilidade do tipo demorado (DTH) podem ser artificialmentereproduzidas em camundongos, permitindo a avaliação de fatores que podemestar envolvidos na iniciação e perpetuação da resposta DTH. O anticorponeutralizador de IL-31 pode ser eficaz nas reações de hipersensibilidade dotipo demorado. Ver Exemplo 51.

A necrólise epidérmica tóxica (TEN) é uma reaçãomedicamentosa muito rara mas extremamente grave caracterizada pelaapoptose espalhada da epiderme com bolhas extensivas. Estudos têmmostrado que os linfócitos que infiltram as bolhas são células T CLA+ epodem exibir citotoxicidade contra os queratinócitos epidérmicos. Ver LeyvaL., et al., J Allergy Clin Immunol: 105, 157 (2000); e Nassif A., BensussanA., et al., J Allergy Clin Immunol: 114, 1209 2004). Um sistema decamundongo transgênico, por meio do qual OVA é expressado sob o controledo promotor da queratina-5 (K5) nos queratinócitos epidérmicos e folicularespilosos de camundongos, foram gerados para estabelecer um modelo deanimal para TEN. As células T CD8+ específicas de OVA, quandoadotivãmente transferidas em camundongos K5-OVA, passam pela ativação eproliferação nos linfonodos que drenam a pele e alvejam a pele decamundongos K5-OVA, resultando no desenvolvimento de lesões de pele quesão similares de TEN. Ver Azukizawa H., et al., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003).

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos podem ser usados para melhorar o resultado clínico de TEN pelainibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceiraassociadas com a doença.

Pênfigo bolhoso

O pênfigo bolhoso é um distúrbio subepidérmico que semanifesta como bolhas subepidérmicas com um infiltrado dérmico deneutrófilos e eosinófilos. O diagnóstico é caracterizado pela presença deanticorpos específicos de antígeno contra as proteínas de adesão específicasda epiderme e junção dérmica-epidérmica. Ver Jordon R. E., et al., JAMA:200, 751 (1967). Os estudos que analisam o papel das células T na patogênesedo pênfigo bolhoso pela análise de PBL e células T das bolhas da pele têmencontrado uma predominância de células T CLA+ que expressam níveisaumentados de citocinas Th2 como IL-4 e IL-13. Ver Teraki Y., et ai., JInvest Dermatol: 117, 1097 (2001). Em pacientes com pênfigo bolhoso aseguir da terapia com corticosteróides sistêmicos, a freqüência de célulasCLA+, mas não de células produtoras de interleucina-13 CLA- ésignificantemente diminuída. As diminuições nas células CLA+ a seguir dotratamento com corticosteróide está associada com a melhora clínica. VerTeraki, ibíd.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico de pênfigo bolhosopela inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceiraassociadas com a doença.

Alopecia areata

A alopecia areata (AA) é considerada como uma doençaautoimune restrita a tecido de folículos pilosos em que a atividade folicular éimpedida por causa da atividade contínua de infiltrados linfocíticos. AAresulta em pedaços e perda de cabelo completa em qualquer lugar do corpo,embora a perda de real dos folículos pilosos não ocorra, mesmo em lesõessem cabelo. Embora os sinais clínicos de inflamação estejam ausentes, asbiópsias de pele de sítios de doença ativa mostram inflamação linfocíticaperifolicular de células primariamente CD4+, junto com um infiltradointrafolicular de CD8+. Ver Kalish R. S. & Gilhar A. J Investig DermatolSymp Proc: 8, 164 (2003).Estudos têm mostrado que os linfócitos CD4+ ou CD8+ queinfiltram a pele do escalpo expressam CLA e, no sangue periférico deindivíduos com AA5 a porcentagem de linfócitos CLA+ CD4+ ou CD8+ ésignificantemente mais alta do que aquela de controles normais. Além disso,pacientes com AA severa ou progressiva mostram uma positividade de CLAmuito mais alta comparada com pacientes que se recuperam da doença e umadiminuição no percentual de células CLA+ se caompara com um bom cursoclínico. Ver Yano S., et al., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002). Estes estudosportanto sugerem que os linfócitos CLA+ podem desempenhar um papelimportante na AA. Modelos de xenoenxerto têm demonstrado que as célulasT ativadas são prováveis de desempenhar um papel na patogênese da AA. Oescalpo lesional de pacientes AA enxertados em camundongos nus faz crescernovamente o cabelo coincidente com uma perda de linfócitos infiltrantes doenxerto e, a transferência de células T lesionais ativadas aos camundongosSCID pode transferir a perda de cabelo para os explantes de escalpo humanoem camundongos SCID. Ver Kalish R. S. & Gilhar A. J Investig DermatolSymp Proc: 8, 164 (2003).

Uma variedade de terapias imunomoduladoras são parte dotratamento usual para este distúrbio entretanto nenhum destes tratamentosforam consistentes em sua eficácia. Ver Tang L., et al., J Invest Dermatol:120, 400 (2003); Tang L., et al., (2004); e Tang L., et al., J Am AcadDermatol: 49, 1013 (2003). Não obstante, seus usos em modelos de animalválidos fornecem uma ferramenta para dissecar mecanismos moleculares deefeitos terapêuticos. Ver Shapiro J., et al., J Investig Dermatol Symp Proc: 4,239 (1999); Tang L., et al., Old wine in new bottles: reviving old therapies foralopecia areata using rodent models (2003); e Verma D. D., et al., Eur JDermatol: 14, 332 (2004).

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos podem ser usados para melhorar o resultado clínico da alopeciaareata pela inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/oucoceira associadas com a doença.

Acne Rosácea/Acne vulgar

A acne vulgar, um distúrbio do aparelho pilossebáceo, é oproblema de pele mais comum da adolescência. As anormalidades naqueratinização folicular são consideradas produzir a lesão da acne. A acnerosácea é diferenciada da acne vulgar pela presença de pápulas vermelhas,pústulas, cistos e telangiectasias extensivas, mas a ausência de comedones(cabeças brancas). A excreção de sebo aumentada das glândulas sebáceas éum fator principal na patofisiologia da acne vulgar. Outras funções daglândula sebácea também são associadas com o desenvolvimento de acne,incluindo lipídeos pró inflamatórios sebáceos; citocinas diferentes localmenteproduzidas; peptídeos periglandulares e neuropeptídeos, tais como ohormônio que libera a corticotrofina, que é produzido pelos sebócitos; esubstância P, que é expressada nas extremidades nervosas na vicinidade deglândulas que parecem saudáveis de pacientes com acne. Ver Zouboulis C. C.Clin Dermatol: 22, 360 (2004).

Embora a fisiopatologia da acne vulgar e da acne rosáceapermaneça desconhecida, as observações clínicas e estudos histopatológicossugerem que a inflamação dos folículos pilossebácicos pode ser central para apatogênese das acnes rosácea e vulgar. Estudos antigos sobre a análise desubconjuntos de célula T que infiltram legiões de rosácea indicam que amaioria das células T expressaram CD4. Ver Rufli T. & Buchner S. A.Dermatológica: 169, 1 (1984).

As células T CD4+ produzem IL-3 Iea análise de IHC de pelequanto a expressão de IL-31 sugere que IL-31 é expressada em glândulassebáceas e sudoríparas. A estimulação de IL-31 de queratinócitos epidérmicosinduz a expressão de quimiocinas que provavelmente resultam em infiltraçãocelular sugerindo que a IL-31 possa contribuir com a resposta pró-inflamatória na pele. Ver Dillon S. R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). AIL-31 portanto pode contribuir para a fisiopatologia da acne rosácea e acnevulgar.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico da acne vulgar pelainibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceiraassociadas com a doença.

Prurigo nodular

Prurigo nodular é uma erupção de nódulos liquenificados ouescoriados causada pelo prurido intratável que é difícil de tratar. Embora aesfregação crônica resulte em liquenificação e coceira em escoriaçõeslineares, indivíduos que descarna e arranca a sua coceira, a pele irritada tendea produzir pápulas acentuadamente espessas conhecidas como nódulos deprurigo. Embora o prurigo nodular não seja específico da dermatite atópica,muitos pacientes com estes nódulos também têm uma reação atópica, que semanifesta como rinite alérgica, asma ou alergia alimentar. As células Trepresentam a maioria das células infíltrantes nas lesões de prurigo e estaslesões freqüentemente representam lesão de pele mais prurítica em pacientede atopia.

O tratamento tópico do prurigo nodular com capsaicina, umalcalóide anti-prurítico que interfere com a percepção de pruridos e dor peloesgotamento de neuropeptídeos como a substância P em nervos cutâneossensoriais pequenos, tem mostrado ser um regime eficaz e seguro que resultaem liquidação das lesões de pele. Ver Stander S., et al., J Am Acad Dermatol:44, 471 (2001). Estudos da resposta à coceira em camundongos NC/Ngausando tratamento com capsaicina mostrou que o desenvolvimentoespontâneo de lesões de dermatite foi quase completamente evitado. Alémdisso, a elevação dos níveis de IgE séricos foi significantemente suprimida eos números de eosinófilos infíltrantes e mastóides na pele lesional decamundongos tratados com capsaicina foram reduzidos. Ver Mihara K., et al.,Br J Dermatol: 151, 335 (2004). As observações deste grupo sugerem que ocomportamento de coceira contribuiria para o desenvolvimento de dermatitepelo realce de várias respostas imunológicas, implicando portanto que aprevenção da sensação de coceira e/ou comportamento de coçar associadocom a coceira seria um tratamento eficaz para a AD. Ver Mihara K., et al., BrJ Dermatol: 151, 335 (2004). Assim, os anticorpos anti-IL-31 aqui descritosserão úteis em minimizar os efeitos de AD, prurigo nodular e outras doençaspruríticas visto que são mostrados aqui reduzir a quantidade de coceira emcamundongos NC/Nga.

A liberação crônica de IL-31 induz o prurido e a alopecia emcamundongos seguido pelo desenvolvimento de lesões de pele que se parecemcom a dermatite sugerindo que IL-31 pode induzir a coceira. Ver Dillon S. R.,et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). O envolvimento de IL-31 foi testado naindução da resposta à coceira pelos dois métodos (i) tratamento comcapsaicina de camundongos tratados com IL-31 e (ii) tratamento com IL-31de camundongos silenciados em Tac 1, que reduziram significantemente asrespostas à dor nociceptivas por causa da falta de expressão deneuropeptídeos no Exemplo 52. Além disso, se a neutralização de IL-31 emcamundongos tratados com IL-31 poderia prevenir o prurido e a alopecia foitestado no Exemplo 12.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico de prurigo nodularpela inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceiraassociados com a doença.

Vírus Trópico de Pele e Prurido Associado com Vírus

As células T CD8+ específicas do Vírus Simples do Herpes(HSV) no sangue periférico e células T CD8+ específicas do HSVrecuperadas de lesões herpéticas expressam níveis altos of CLA onde vistoque as células T CD8+ específicas do vírus do herpes não trópicas de pelecarecem da expressão de CLA. Ver Koelle D. M., et al., J Clin Invest: 110,537 (2002). Os linfócitos T CD4+ reativos em HSV-2 também expressamCLA5 mas em níveis mais baixos do que aqueles previamente observados paralinfócitos T CD8+. Ver Gonzalez J. C., et al., J Infect Dis: 191, 243 (2005). Oprurido também foi associado com as infecções virais herpéticas (Ver HungK. Y., et al., Blood Purif: 16, 147 (1998). embora outras doenças virais, comoo HIV, também tenham sido associadas com lesões de pele pruríticas. Oprurido grave, intratável freqüentemente associado com lesões de peleeritematopapular e hipereosinofilia, é um condição observada em algunspacientes nonatópicos, infectados com HIV 36. Ver Singh F. & Rudikoff D,Am J Clin Dermatol; 4, 177 (2003); e Milazzo F., Piconi S., et al., Allergy:54, 266 (1999).

A associação de vírus trópico de pele com prurido e células TCLA+ sugere que as células T que produzem IL-31 podem ser envolvidas napatofisiologia de infecções virais.

Assim, a neutralização de IL-31 pelos anticorpos aquidescritos pode ser usada para melhorar o resultado clínico de pruridoassociado com vírus trópico de pele pela inibição, redução, prevenção oubloqueio da inflamação e/ou coceira associada com a doença.

Além disso, a inflamação é uma resposta protetora por umorganismo para defender-se de um agente invasor. A inflamação é um eventoem cascata que envolve muitos mediadores celulares e humorais. Por umlado, a supressão de respostas inflamatórias pode levar a um hospedeiroimunocomprometido; entretanto, se deixada incontrolada, a inflamação podelevar a complicações sérias incluindo doenças inflamatórias crônicas (porexemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença do intestinoinflamatório e outros), choque séptico e insuficiência de órgão múltiplo. Demaneira importante, estes estados de doença diversos compartilhammediadores inflamatórios comuns. As doenças coletivas que sãocaracterizadas pela inflamação têm um impacto grande sobre a morbidez emortalidade humana. Portanto está claro que anticorpos anti-inflamatórios epolipeptídeos de ligação, tais como anticorpos anti-IL-31 e polipeptídeos deligação aqui descritos, podem ter potencial terapêutico crucial para um vastonúmero de doenças humanas e de animal, da asma e alergia atéautoimunidade e choque séptico. Como tal, o uso de anticorpos anti-inflamatórios anti-IL-31 e polipeptídeos de ligação aqui descritos podem serusados terapeuticamente como antagonistas de IL-31 aqui descritos,particularmente em doenças tais como a artrite, endotoxemia, doença dointestino inflamatória, psoríase, doença relacionada e outras.

1. Artrite

A artrite, incluindo a osteoartrite, artrite reumatóide, juntasartríticas como um resultado de lesão e outros, são condições inflamatóriascomuns que beneficiar-se-iam do uso terapêutico de anticorpos anti-inflamatórios e polipeptídeos de ligação, tais como anticorpos anti-IL-31 epolipeptídeos de ligação da presente invenção. Por exemplo, a artritereumatóide (RA) é uma doença sistêmica que afeta o corpo inteiro e é umadas formas mais comuns de artrite. Esta é caracterizada pela inflamação damembrana que reveste a junta, que causa dor, inflexibilidade, quentura,vermelhidão e inchaço. As células inflamatórias liberam enzimas que podemdigerir o osso e a cartilagem. Como um resultado da artrite reumatóide, orevestimento da junta inflamada, o sinóvio, pode invadir e danificar o osso e acartilagem levando à deterioração da junta e dor severa entre outros efeitosfisiológicos. A junta envolvida pode perder a sua forma e alinhamento,resultando em dor e perda de movimento.

A artrite reumatóide (RA) é uma doença mediada pelo sistemaimunológico particularmente caracterizada pela inflamação e dano de tecidosubseqüente levando à incapacidade grave e mortalidade aumentada. Umavariedade de citocinas são produzidas localmente nas juntas reumatóides.Numerosos estudos têm demonstrado que a IL-I e TNF-alfa, duas citocinaspró-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nosmecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição de juntaprogressiva. De fato, a administração de inibidores de TNF-alfa e de IL-I empacientes com RA tem levado a uma melhora dramática de sinais clínicos ebiológicos de inflamação e uma redução de sinais radiológicos de erosãoóssea e destruição de cartilagem. Entretanto, a despeito destes resultadosencorajadores, uma porcentagem significante de pacientes não respondem aestes agentes, sugerindo que outros mediadores também estejam envolvidosna fisiopatologia da artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149,2002). Um destes mediadores pode ser a IL-31 e como uma tal molécula quese liga ou inibe IL-31, tal como anticorpos anti IL-31 ou parceiros de ligação,podem servir como um produto terapêutico valioso para reduzir a inflamaçãona artrite reumatóide e outras doenças artríticas.

Existem diversos modelos de animal para a artrite reumatóideconhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzido porcolágeno (CIA), camundongos desenvolvem a artrite inflamatória crônica queintimamente se parece com a artrite reumatóide humana. Visto que a CIAcompartilha características imunológicas e patológicas similares com a RA,isto o torna um modelo ideal para a triagem de compostos anti-inflamatóriospara uso humano potenciais. O modelo de CIA é um modelo bem conhecidoem camundongos que depende tanto de uma resposta imune quanto de umaresposta inflamatória, de modo a ocorrer. A resposta imune compreende ainteração de células B e células T CD4+ em resposta ao colágeno, que é dadocomo antígeno e leva à produção de anticorpos anti-colágeno. A faseinflamatória é o resultado de respostas de tecido a partir de mediadores dainflamação, como uma conseqüência de alguns destes anticorpos reagiremcruzado com o colágeno nativo do camundongo e ativar a cascata decomplemento. Uma vantagem no uso do modelo de CIA é que os mecanismosbásicos de patogênese são conhecidos. Os epítopos de célula T e célula Brelevantes no colágeno tipo II foram identificados e vários parâmetrosimunológicos (por exemplo, hipersensibilidade do tipo demorada e anticorpoanti-colágeno) e inflamatórios (por exemplo, citocinas, quimiocinas e enzimasque degradam matriz) que dizem respeito à artrite mediada pelo sistemaimunológico foram determinados e assim podem ser usados para avaliar aeficácia de compostos de teste no modelo de CIA (Wooley, Curr. Opin.Rheum. 3: 407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89: 9784-788, 1992;Myers et al., Life Sei. 61: 1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92: 8955-959, 1995).

A administração de IL-31RA solúvel que compreendepolipeptídeos (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos aquidescritos), tais como IL-31RA-Fc4 ou outra IL-31RA solúvel e proteínas defusão para estes camundongos modelos de CIA foi usada para avaliar o uso deIL-31RA para melhorar sintomas e alterar o curso de doença. Como umamolécula que modula a resposta imune e inflamatória, IL-31, pode induzir aprodução de SAA, que é implicada na patogênese da artrite reumatóide,antagonistas de IL-31 pode reduzir a atividade de SAA in vitro e in vivo, aadministração sistêmica ou local de antagonistas de IL-31 tal como anticorposanti-IL-31 ou parceiros de ligação, polipeptídeos que compreendem IL-3 IRA(incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos aqui descritos), talcomo IL-31RA-Fc4 ou outra IL-3 IRA solúvel e proteínas de fusão podempotencialmente suprimir a resposta inflamatória em RA. Outros produtosterapêuticos potenciais incluem polipeptídeos de IL-3 IRA, polipeptídeos dereceptor heterodimérico e multimérico solúvel ou anticorpos anti-IL-31 ouparceiros de ligação da presente invenção e outros.

2. Endotoxemia

A endotoxemia é uma condição severa comumente resultantede agentes infecciosos tais como bactérias e outros agentes de doençainfecciosos, septicemia, síndrome de choque tóxico ou em pacientesimunocomprometidos submetidos às infecções oportunísticas e outros.Terapeuticamente úteis de anticorpos anti-inflamatórios e polipeptídeos deligação, tais como anticorpos anti-IL-31 e polipeptídeos de ligação dapresente invenção, podem ajudar na prevenção e tratamento da endotoxemiaem seres humanos e animais. Outros produtos terapêuticos potenciais incluempolipeptídeos de IL-31RA, polipeptídeos de receptor heterodimérico emultimérico solúveis ou anticorpos anti IL-31 ou parceiros de ligação dapresente invenção e outros, podem servir como um produto terapêuticovalioso para reduzir a inflamação e efeitos patológicos na endotoxemia.

A endotoxemia induzida por lipopolissacarídeo (LPS) engrenamuitos dos mediadores pró inflamatórios que produzem efeitos patológicosnas doenças infecciosas e a endotoxemia induzida pelo LPS em roedores é ummodelo amplamente usado e aceitável para estudar os efeitos farmacológicosde agentes pró-inflamatórios ou imuno-moduladores potenciais. O LPS,produzido em bactérias gram-negativas, é um agente causativo principal napatogênese de choque séptico (Glausner et al., Lancet 338: 732, 1991). Umestado equivalente ao choque pode de fato ser induzido experimentalmentepor uma única injeção de LPS em animais. As moléculas produzidas pelascélulas que respondem ao LPS podem alvejar patógenos direta ouindiretamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeirocontra patógenos invasores, elas também podem causas danos. Assim, aestimulação maciça de imunidade inata, que ocorre como um resultado dainfecção bacteriana Gram-negativa grave, leva à produção em excesso decitocinas e outras moléculas e ao desenvolvimento de uma síndrome fatal, asíndrome do choque séptico, que é caracterizada por febre, hipotensão,coagulação intravascular disseminada e insuficiência de órgão múltipla(Dumitru et al. Cell 103: 1071-1083, 2000).Estes efeitos tóxicos de LPS são principalmente relacionadoscom a ativação de macrófago levando à liberação de mediadores inflamatóriosmúltiplos. Entre este mediadores, o TNF parece desempenhar um papelcrucial, como indicado pela prevenção de toxicidade de LPS pelaadministração de anticorpos anti-TNF neutralizantes (Beutler et ai., Science229: 869, 1985). Está bem estabelecido que a injeção de 1 de LPS de E.coli em um camundongo C57B1/6 resultará em aumentos signifícantes em IL-6, TNF-alfa, IL-I circulantes e proteínas de fase aguda (por exemplo, SAA)aproximadamente 2 horas após a injeção. A toxicidade de LPS parece sermediada por estas citocinas visto que a imunização passiva contra estesmediadores pode resultar em mortalidade diminuída (Beutler et al., Science229: 869, 1985). As estratégias de imunointervenção potenciais para aprevenção e/ou tratamento de choque séptico incluem mAb anti-TNF,antagonista do receptor de IL-1, LIF, IL-IO e G-CSF. Visto que LPS induz aprodução de fatores pró-inflamatórios possivelmente contribuindo para apatologia da endotoxemia, a neutralização da atividade de IL-31, SAA ou deoutros fatores pró-inflamatórios pela antagonização do polipeptídeo IL-31pode ser usada para reduzir os sintomas de endotoxemia, tais como osobservados no choque endotóxico. Outros produtos terapêuticos potenciaisincluem polipeptídeos de IL-31RA, polipeptídeos de receptor heterodiméricoe multimérico solúveis ou anticorpos anti-IL-31 ou parceiros de ligação dapresente invenção e outros.

3 Doença do Intestino Inflamatório. IBD

Nos Estados Unidos aproximadamente 500.000 pessoassofrem de Doença do Intestino Inflamatório (IBD) que pode afetar o cólon e oreto (Colite Ulcerativa) ou ambos, os intestinos delgado e grosso (Doença deCrohn). A patogênese destas doenças é incerta, mas elas envolvem ainflamação crônica dos tecidos afetados. Os produtos terapêuticos potenciaisincluem polipeptídeos de IL-31RA, polipeptídeos de receptor heterodiméricoe multimérico solúveis ou anticorpos anti-IL-31 ou parceiros de ligação dapresente invenção e outros., podem servir como um produto terapêuticovalioso para reduzir a inflamação e efeitos patológicos em IBD e doençasrelacionadas.

A colite ulcerativa (UC) é uma doença inflamatória dointestino grosso, habitualmente chamado de cólon, caracterizado pelainflamação e ulceração da mucosa ou revestimento mais profundo do cólon.

Esta inflamação faz com que o cólon esvazie freqüentemente, resultando emdiarréia. Os sintomas incluem a soltura das fezes e espasmos abdominais,febre e perda de peso associados. Embora a causa exata da UC sejadesconhecida, pesquisa recente sugere que as defesas naturais do corpoestejam operando contra as proteínas no corpo que o corpo pensa que sãoestranhas (uma "reação autoimune"). Talvez porque elas se parecem com asproteínas bacterianas no intestino, estas proteínas podem instigar ou estimularo processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Vistoque o revestimento do cólon é destruído, úlceras se formam liberando muco,pús e sangue. A doença usualmente começa na área retal e podeeventualmente estender-se através do intestino grosso inteiro. Episódiosrepetidos de inflamação levam ao espessamento da parede do intestino e retocom tecido cicatricial. A morte de tecido do cólon ou septicemia pode ocorrercom a doença grave. Os sintomas de colite ulcerativa variam em gravidade eseu início pode ser gradual ou súbito. Os ataques podem ser provocados pormuitos fatores, incluindo infecções respiratórias ou estresse.

Embora correntemente não exista nenhuma cura para a UCdisponível, os tratamentos são focalizados na supressão do processoinflamatório anormal no revestimento do cólon. Tratamentos incluindoimunossupressivos de corticosteróides (por exemplo, azatioprina,mercaptopurina e metotrexato) e aminossalicilatos estão disponíveis paratratar a doença. Entretanto, o uso de longa duração de imunossupressivos taiscomo corticosteróides e azatioprina pode resultar em sérios efeitos colateraisincluindo redução de ossos, cataratas, infecção e efeitos hepáticos e namedula óssea. Nos pacientes nos quais as terapias correntes não são bemsucedidas, a cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção do cóloninteiro e do reto.

Existem modelos de animal graves que podem imitarparcialmente a colite ulcerativa crônica. O modelo mais amplamente usado éo modelo de colite induzido pelo ácido 2,4,6-trinitrobeno-sulfônico/etanol(TNBS), que induz a inflamação crônica e ulceração no cólon. Quando TNBSé introduzido no cólon de camundongos suscetíveis por intermédio dainstilação intra-retal, o mesmo induz a resposta imune mediada pela célula Tna mucosa colônica, neste caso levando a uma inflamação mucósica maciçacaracterizada pela infiltração densa de células T e macrófagos por toda aparede inteira do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico éacompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva(debilitamento), diarréia sangüinolenta, prolapso retal e espessamento daparede do intestino grosso (Neurath et ai. Intern. Rev. Immunol. 19: 51-62,2000).

Um outro modelo de colite usa o sulfato de dextrano sódico(DSS), que induz uma colite aguda manifestada pela diarréia sangüinolenta,perda de peso, encurtamento do cólon e ulceração da mucosa com infiltraçãoneutrofílica. A colite induzida pelo DSS é caracterizada histologicamente pelainfiltração de células inflamatórias na lâmina própria, com hiperplasialinfóidica, dano do folículo focai e ulceração epitelial. Considera-se que estasmudanças se desenvolvam devido a um efeito tóxico do DSS sobre o epitélioe pela fagocitose das células da lâmina própria e produção de TNF-alfa e IFN-gama. A despeito do seu uso comum, diversos problemas com respeito aosmecanismos de DSS a cerca da relevância para a doença humana permanecemnão resolvidos. O DSS é visto como um modelo independente de célula Tporque o mesmo é observado em animais deficientes em célula T tais comocamundongos SCID.

A administração de anticorpos anti-IL-31 ou parceiros deligação, polipeptídeos que compreendem IL-31RA solúvel (incluindoreceptores heterodiméricos e multiméricos), tais como IL-31RA-Fc4 ou outroIL-31RA solúvel e proteínas de fusão para estes modelos de TNBS ou DSSpodem ser usados para avaliar o uso de antagonistas de IL-31 para melhorarsintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. IL-31 pode desempenharum papel na resposta inflamatória na colite e a neutralização da atividade deIL-31 pela administração de antagonistas de IL-31 é um método terapêuticopotencial para IBD. Outros produtos terapêuticos potenciais incluempolipeptídeos de IL-3 IRA, polipeptídeos de receptor heterodimérico emultimérico solúveis ou anticorpos anti-IL-31 ou parceiros de ligação dapresente invenção e outros.

4. Psoríase

A psoríase é uma condição de pele crônica que afeta mais doque sete milhões de americanos. A psoríase ocorre quando novas células depele crescem de modo anormal, resultando em pedaços inflamados, inchadose escamosos de pele onde a pele velha não caiu rápido o bastante. A psoríasede placa, a forma mais comum, é caracterizada por pedaços inflamados depele ("lesões") encimadas com escamas brancas prateadas. A psoríase podeser limitada a umas poucas placas ou envolve áreas moderadas a extensivas depele, aparecendo mais habitualmente no couro cabeludo, joelhos, cotovelos etronco. Embora seja altamente visível, a psoríase não é uma doençacontagiosa. A patogênese das doenças envolve a inflamação crônica dostecidos afetados. Os polipeptídeos de IL-3 IRA, polipeptídeos de receptorheterodimérico e multimérico solúveis ou anticorpos anti-IL-31 ou parceirosde ligação da presente invenção e outros, podem servir como um produtoterapêutico valioso para reduzir a inflamação e efeitos patológicos napsoríase, outras doenças de pele inflamatórias, alergias de pele e mucósicas edoenças relacionadas.

A psoríase é um distúrbio inflamatório mediado pela célula Tda pele que pode causar desconforto considerável. Esta é uma doença para aqual não existe nenhuma cura e afeta pessoas de todas as idades. A psoríaseafeta aproximadamente dois por cento das populações da Europa e Américado Norte. Embora indivíduos com psoríase branda possam freqüentementecontrolar a sua doença com agentes tópicos, mais do que um milhão depacientes no mundo requerem ultravioleta ou terapia imunossupressivasistêmica. Infelizmente, a inconveniência e os riscos da radiação ultravioleta ea toxicidade de muitas terapias limitam o seu uso de longa duração. Alémdisso, os pacientes usualmente têm retorno da psoríase e em alguns casos r

A IL-31 foi isolada de tecido conhecido ter funçãoimunológica importante e que contém células que desempenham um papel nosistema imune. A IL-31 é expressada em células de sangue periféricoselecionadas em CD3+, ativadas e foi mostrado que a expressão de IL-31aumenta depois da ativação de célula T. Além disso, resultados deexperimentos descritos na seção de Exemplos aqui sugerem que ospolipeptídeos da presente invenção podem ter um efeito sobre ocrescimento/expansão de monócitos/macrófagos, células T, células B, célulasNK e/ou estados diferenciados de monócitos/macrófagos, células T, células B,células NK ou estes progenitores das células. Os fatores que tanto estimulama proliferação de progenitores hematopoiéticos quanto ativam as célulasmaduras são no geral conhecidos, entretanto, a proliferação e ativaçãotambém pode requerer fatores de crescimento adicionais. Por exemplo, foimostrado que IL-7 e o Fator Steel (ligando c-kit) foram requeridos para aformação de colônia de progenitores NK. IL-15 + IL-2 em combinação comIL-7 e o Fator Steel foram mais eficazes (Mrózek et ai., Blood 87: 2632-2640,1996). Entretanto, citocinas não identificadas podem ser necessárias para aproliferação de subconjuntos específicos de células NK e/ou progenitores deNK (Robertson et al., Blood 76: 2451-2438, 1990). Similarmente, IL-31 podeatuar sozinha ou de comum acordo ou em sinergia com outras citocinas pararealçar o crescimento, proliferação expansão e modificação da diferenciaçãode monócitos/macrófagos, células T, células B ou células NK.

A presente invenção fornece um método para inibir a ativaçãoou diferenciação de monócitos/macrófagos. Os monócitos são célulasincompletamente diferenciadas que migram a vários tecidos onde elesamadurecem e se tornam macrófagos. Os macrófagos desempenham um papelcentral na resposta imune pela apresentação de antígeno aos linfócitos edesempenham um papel suporte como células acessórias aos linfócitos pelasecreção de numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizarmoléculas extracelulares e na ativação têm uma capacidade aumentada paramatar microorganismos intracelulares e células de tumor. Os macrófagosativados também estão envolvidos na estimulação aguda ou inflamação local.

A distribuição em tecido de receptores para uma dada citocinaoferece uma forte indicação dos sítios potenciais de ação daquela citocina. Aexpressão de IL-31 RA foi observada em monócitos e células B, com umaumento dramático de expressão na ativação de células T CD3+, CD4+ eCD8+. Além disso, duas linhagens de célula monocíticas, THP-I (Tsuchiya etal., Int. J. Câncer 26: 171-176, 1980) e U937 (Sundstrom et al., Int. J. Câncer17: 565-577, 1976), também foram positivos quanto a expressão de IL-31RA.

A expressão de OSMR é relatada ser muito ampla (Mosley etal, JBC 271: 32635-32643, 1996). Esta distribuição de receptores de IL-3 IRAe OSM sustenta um papel para IL-31 em respostas imunes, especialmente aexpansão de células T na ativação ou um papel no braço demonócito/macrófago do sistema imune.

Assim, as formas de realização particulares da presenteinvenção são direcionadas ao uso de heterodímeros de IL-31 RA/OSMRsolúveis como antagonistas nas doenças ou condições inflamatórias e imunestais como pancreatite, diabete tipo I (IDDM), câncer pancreático, pancreatite,Doença de Graves, doença do intestino inflamatório (IBD), Doença de Crohn,câncer colônico e intestinal, diverticulose, doença autoimune, septicemia,transplante de órgão ou medula óssea; inflamação devido ao trauma, cirurgiaou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença do enxerto versushospedeiro; e onde a inibição da inflamação, supressão imune, redução daproliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides,macrófagos, células T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+),supressão de resposta imune a um patógeno ou antígeno. Além disso apresença de expressão de IL-31RA em células imunes ativadas tais comocélulas CD4+ e CD19+ ativadas mostrou que o receptor de IL-31RA podeestar envolvido nas reações imuno defensivas do corpo contra invasoresestranhos: tais como microorganismos e fragmentos celulares e podemdesempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e formaçãode câncer. Como tais, os anticorpos e parceiros de ligação da presenteinvenção que são agonísticos ou antagonísticos para a função receptora de IL-3 IRA, tal como IL-31, podem ser usados para modificar a resposta imune e ainflamação.

A IL-31 pode encontra utilidade na supressão do sistemaimune, tal como no tratamento de doenças autoimunes, incluindo artritereumatóide, esclerose múltipla, diabete melito, doença do intestinoinflamatório, doença de Crohn, etc. A supressão imune também pode serusada para reduzir a rejeição de transplantes de tecido ou órgão e enxertos epara tratar leucemis ou linfomas específicos de célula T, célula B ou monócitoe outros cânceres, pela inibição da proliferação do tipo de célula afetada.Além disso a IL-31 pode ser usada para detectar monócitos, macrófagos ecélulas T ativadas e ajudar no diagnóstico de tal doença autoimune,particularmente em estados de doença onde os monócitos são elevados ouativados.

Os polipeptídeos, peptídeos, anticorpos IL-31 e outros tambémpodem ser usados dentro de sistemas de diagnóstico para a detecção de níveiscirculatórios de IL-31. Dentro de uma forma de realização relacionada, osanticorpos ou outros agentes que especificamente se ligam aos polipeptídeosIL-31 podem ser usados para detectar polipeptídeos de IL-31 circulantes. Osníveis elevados ou diminuídos de polipeptídeos de ligando podem serindicativos de condições patológicas, incluindo o câncer. Os polipeptídeos deIL-31 podem contribuir para processos patológicos e podem ser um marcadorindireto de uma doença subjacente.

Além disso, uma pessoa de habilidade na técnica reconheceriaque os antagonistas de IL-31 são úteis. Por exemplo, em lesõesateroscleróticas, uma das primeiras anormalidades é a localização demonócito/macrófagos nas células endoteliais. Estas lesões podem serprevenidas pelo uso de antagonistas para IL-31. Anticorpos anti-IL-31 (porexemplo, anticorpo neutralizador de IL-31), receptores de IL-3 IRA solúveis,heterodímeros e multímeros e parceiros de ligação de IL-31 também podemser usados como antagonistas para a IL-31. Além disso, a leucemiamonoblástica está associada com uma variedade de anormalidades clínicasque refletem a liberação dos produtos biológicos do macrófago, os exemplosincluem níveis altos de lisozima no soro e urina e febres altas. Além disso,tais leucemias exibem um aumento anormal de células monocíticas. Estesefeitos podem ser possivelmente prevenidos pelos antagonistas para IL-31,tais como aqui descritos. Além disso, anti-IL-31 pode ser conjugado commoléculas tais como porções tóxicas e citocinas, como aqui descrito paradirecionar a morte de células monocíticas da leucemia.

Visto que a IL-31 é expressada em uma maneira específica decélula T, macrófago e monócito e estas doenças envolvem anormalidades emcélulas monocíticas, tais como a proliferação, função, localização e ativaçãode célula, os polinucleotídeos, polipeptídeos e anticorpos da presenteinvenção podem ser usados como diagnósticos para detectar taisanormalidades de célula monocítica e indicam a presença de doença. Taismétodos envolvem coletar uma amostra biológica de um paciente, tal comosangue, saliva ou biópsia e compará-la com uma amostra de controle normal.Histológico, citológico, citométrico de fluxo, bioquímico e outros métodospodem ser usados para determinar os níveis relativos ou localização de IL-31ou células que expressam IL-31, isto é, monócitos, na amostra do pacientecomparados com o controle normal. Uma mudança no nível (aumento oudiminuição) da expressão de IL-31 ou uma mudança no número oulocalização de monócitos (por exemplo, aumento ou infiltração de célulasmonocíticas em tecidos onde eles normalmente não estão presentes)comparado a um controle seria indicativo de doença. Tais métodos dediagnóstico também podem incluir o uso de rótulos radiométrico,fluorescentes e colorimétricos ligados aos polinucleotídeos, polipeptídeos ouanticorpos da presente invenção. Tais métodos são bem conhecidos na técnicae aqui divulgados.

A IL-31 mostrou ser expressada em células mononuclearesativadas e podem estar envolvidas na regulagem da inflamação. Como tal, ospolipeptídeos da presente invenção podem ser ensaiados e usados quanto asua capacidade para modificar a inflamação ou podem ser usados como ummarcador para a inflamação. Os métodos para determinar as qualidades próinflamatórias e antiinflamatórias de IL-31 são conhecidos na técnica e aquidebatidos. Além disso, estes podem estar envolvidos na super-regulagem daprodução de reagentes de fase aguda, tais como amilóide A sérica (SAA), al-antiquimiotripsina e haptoglobina e que a expressão de ligando receptor deIL-31RA pode ser aumentada na injeção de lipopolissacarídeo (LPS) in vivoque estão envolvidas na resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al., Proc.Nat'1. Acad. Sei. 97: 10144-10149, 2000). A produção de proteínas de faseaguda, tal como SAA, é considerada um mecanismo de sobrevivência de curtaduração onde a inflamação é benéfica; entretanto, a manutenção de proteínasde fase aguda por períodos mais longos contribui para a inflamação crônica epode ser nociva para a saúde humana, para revisão, ver Uhlar, CM eWhitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265: 501-523, 1999 e Baumann H. eGauldie, J. Immunology Today 15: 74-80, 1994. Além disso, a proteína SAAde fase aguda é implicada na patogênese de diversas doenças inflamatóriascrônicas, é implicada na aterosclerose e artrite reumatóide e é a precursorapara a proteína amilóide A depositada na amiloidose (Uhlar, CM eWhitehead, supra.). Assim, onde um ligando tal como IL-31 que atua comouma molécula pró-inflamatória e induz a produção de SAA, os antagonistasseriam úteis no tratamento de doença inflamatória e outras doenças associadascom as proteínas de resposta na fase aguda induzidas pelo ligando. Taisantagonistas são fornecidos pela presente invenção. Por exemplo, um métodode reduzir a inflamação compreende administrar a um mamífero cominflamação uma quantidade de uma composição de IL-31 ou anticorpo anti-IL-31 (por exemplo, anticorpo neutralizador) que seja suficiente para reduzira inflamação. Além disso, um método de suprimir uma resposta inflamatóriaem um mamífero com inflamação pode compreender: (1) determinar um nívelde proteína amilóide A sérica; (2) administrar uma composição quecompreenda um polipeptídeo de IL-31 ou anticorpo anti-IL-31 como aquidescritos em um carregador farmaceuticamente aceitável; (3) determinar umnível após a administração de proteína de amilóide A sérica; (4) comparar onível de proteína amilóide A sérica na etapa (1) com o nível de proteínaamilóide A sérica na etapa (3), em que uma falta de aumento ou umadiminuição no nível de proteína amilóide A sérica são indicativos desupressão de uma resposta inflamatória.

Como a IL-31, a análise da distribuição em tecido do mRNAque corresponde ao seu cDNA do receptor de IL-31RA mostrou que o nívelde mRNA foi mais alto em monócitos e células prostáticas e é elevado emmonócitos ativados e células CD4+ ativadas, CD8+ ativadas e CD3+ ativadas.Por este motivo, o receptor de IL-31RA também está implicado na indução deresposta inflamatória e imune. Assim, as formas de realização particulares dapresente invenção são direcionadas ao uso de anticorpos IL-31 e IL-31, assimcomo heterodímeros receptores de IL-3 IRA solúveis como antagonistas emdoenças ou condições inflamatórias e imunes tais como, pancreatite, diabetetipo I (IDDM), câncer pancreático, pancreatite, Doença de Graves, doença dointestino inflamatório (IBD), Doença de Crohn, câncer colônico e intestinal,diverticulose, doença autoimune, septicemia, transplante de órgão ou medulaóssea; inflamação devido a trauma, cirurgia ou infecção; amiloidose;esplenomegalia; doença do enxerto versus hospedeiro; e onde a inibição deinflamação, supressão imune, redução da proliferação de célulashematopoiéticas, imune, inflamatórias ou linfóidicas, macrófagos, células T(incluindo células Thl e Th2, CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune aum patógeno ou antígeno. Além disso a presença de receptor de IL-3 IRA eexpressão de IL-31 em células imunes ativadas tais como células CD3+,monócitos, CD4+ e CD19+ ativadas mostrou que o receptor IL-3 IRA podeestar envolvido nas reações imuno defensivas do corpo contra invasoresestranhos: tais como microorganismos e fragmentos celulares e podemdesempenhar um papel em respostas imunes durante a formação dainflamação e câncer. Como tal, IL-31 e anticorpos IL-31 da presente invençãoque são agonísticos ou antagonísticos para a função receptora de IL-3 IRA,podem ser usados para modificar a resposta imune e a inflamação.

Os polipeptídeos de IL-31 que se ligam aos polipeptídeosreceptores de IL-3 IRA e anticorpos para estes são úteis para:

1) Antagonizar ou bloquear a sinalização por intermédio dereceptores que compreendem IL-3 IRA no tratamento de inflamação aguda,inflamação como um resultado de trauma, lesão de tecido, cirurgia,septicemia ou infecção e doenças inflamatórias crônicas tais como asma,doença do intestino inflamatório (IBD), colite crônica, esplenomegalia, artritereumatóide, episódios inflamatórios agudos recorrentes (por exemplo,tuberculose) e tratamento de amiloidose e aterosclerose, Doença deCastleman, asma e outras doenças associadas com a indução de resposta defase aguda.

2) Antagonizar ou bloquear a sinalização por intermédio dosreceptores do receptor de IL-31RA no tratamento de doenças autoimunes taiscomo IDDM, esclerose múltipla (MS), Lupo eritematoso sistêmico (SLE),miastenia grave, artrite reumatóide e IBD para prevenir ou inibir a sinalizaçãoem células imunes (por exemplo linfócitos, monócitos, leucócitos) porintermédio do receptor de IL-31RA (Hughes C et ai, J. Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente anticorpos, tais como anticorpos monoclonais(MAb) para IL-31, também podem ser usados como um antagonista paraesgotar as células imunes não desejadas para tratar doença autoimune. Aasma, alergia e outra doença atópica podem ser tratadas com um MAb contra,por exemplo, anticorpos anti-IL-31, receptores solúveis do receptor de IL-31 RA solúvel ou heterodímeros IL-31 RA/CRF2-4, para inibir a respostaimune ou para esgotar células ofensivas. O bloqueio ou inibição dasinalização por intermédio de IL-31RA, usando os polipeptídeos e anticorposda presente invenção, também podem beneficiar doenças do pâncreas, rim,pituitária e células neuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinomapancreáticos podem ter benefícios. IL-31RA pode servir como um alvo para aterapia de MAb de câncer onde um MAb antagonizador inibe o crescimentode câncer e alveja a morte mediada pelo sistema imune. (Holliger P eHoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Mabs paramonômeros, homodímeros, heterodímeros e multímeros do receptor de IL-3 IRA solúvel também podem ser úteis para tratar nefropatias tais comoglomeruloesclerose, neuropatia membranosa, amiloidose (que também afetaos rins entre outros tecidos), arteriosclerose renal, glomerulonefrite de váriasorigens, doenças fibroproliferativas dos rins, assim como disfunção renalassociada com SLE, IDDM, diabete tipo II (NIDDM), tumores renais e outrasdoenças.

3) Agonizar ou iniciar a sinalização por intermédio dosreceptores de IL-31RA no tratamento de doenças autoimmunes tais comoIDDM, MS, SLE, miastenia grave, artrite reumatóide e IBD. A IL-31 podesinalizar linfócitos ou outras células imunes para diferenciar, alterar aproliferação ou mudar a produção de citocinas ou proteínas de superfíciecelular que melhoram a autoimunidade. Especificamente, a modulação deuma resposta de célula auxiliar T a um padrão alternado de secreção decitocina pode desviar uma resposta autoimune para melhorar doença (SmithJA et al., J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998). Similarmente, a IL-31 pode serusada para sinalizar, esgotar e desviar as células imunes envolvidas na asma,doença alérgica e atópica. A sinalização por intermédio do receptor de IL-3 IRA também pode beneficiar doenças do pâncreas, rim, pituitária e célulasneuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinoma pancreático pode sebeneficiar. O IL-31RA pode servir como um alvo para a terapia de MAb decâncer pancreático onde uma sinalização de MAb inibe o crescimento decâncer e alveja a morte mediada por imune (Tutt, AL et al., J Immunol. 161:3175-3185, 1998). Similarmente as leucemias específicas de célula T,linfomas, discrasia de célula plasmática (por exemplo, mieloma múltiplo) ecarcinoma podem ser tratadas com anticorpos monoclonais (por exemplo,anticorpo neutralizantes) para receptores solúveis que compreendem IL-3 IRAda presente invenção.

Os anticorpos anti-IL-31, polipeptídeos do receptor IL-31RAsolúvel monomérico, homodimérico, heterodimérico e multimérico aquidescritos podem ser usados para neutralizar/bloquear a atividade do ligandodo receptor de IL-31RA no tratamento de doença autoimune, doença atópica,NIDDM, pancreatite e disfunção renal como descrito acima.

Os anticorpos anti-IL-31 e os receptores que compreendem IL-3 IRA solúveis são úteis como antagonistas de IL-31. Tais efeitosantagonísticos podem ser obtidos pela neutralização direta ou ligação de seuligando natural. Além de usos antagonísticos, os receptores solúveis podemligar IL-31 e atuar como carregadores ou proteínas carregadoras, de modo atransportar IL-31 aos diferentes tecidos, órgãos e células dentro do corpo.Como tal, os receptores solúveis podem ser fundidos ou ligados às moléculas,polipeptídeos ou porções químicas que direcionem o complexo de receptorsolúvel-Ligando a um sítio específico, tal como um tecido, célula imuneespecífica, monócitos ou tumor. Por exemplo, na infecção aguda ou algunscânceres, benefício pode resultar da indução da inflamação e proteínas deresposta de fase aguda local. Assim, os receptores solúveis aqui descritos ouanticorpos da presente invenção podem ser usados para direcionarespecificamente a ação de um ligando de IL-31 pró-inflamatória. Ver,Cosman, D. Cvtokine 5: 95-106, 1993; e Fernandez-Botran, R. Exp. Opin.InvestDrugs 9: 497-513, 2000.

No geral, a dosagem do polipeptídeo de IL-31 administrado(ou análogo ou proteína de fusão de IL-31RA) variará dependendo de fatorestais como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral e história médicaanterior do paciente. Tipicamente, é desejável prover o receptor com umadosagem de polipeptídeo de IL-31 que esteja na faixa de cerca de 1 μg/kg a10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do paciente), embora umadosagem mais baixa ou mais alta também possa ser administrada conforme ascircunstâncias determinem. Uma pessoa habilitada na técnica pode facilmentedeterminar tais dosagens e ajustes, usando métodos conhecidos na técnica.

A administração de um polipeptídeo de IL-31 a um pacientepode ser tópica, inalante, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal,intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão através de umcateter regional ou pela injeção intralesional direta. Quando da administraçãode proteínas terapêuticas por injeção, a administração pode ser pela infusãocontínua ou pelos bolos únicos ou múltiplos.

As vias adicionais de administração incluem a oral, membranamucósica, pulmonar e transcutânea. A liberação oral é adequada para asmicroesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de proteinóide,microesferas de policianoacrilato e sistemas com base em lipídeo (ver, porexemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins,"em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas255-288 (Plenum Press 1997)). A praticabilidade de uma liberação intranasalé exemplificada por um tal modo de administração de insulina (ver, porexemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Aspartículas secas ou líquidas que compreendem IL-31 podem ser preparadas einaladas com a ajuda de dispersores de pó seco, geradores de aerossol líquidoou nebulizadores (por exemplo, Pettit e Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998);Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Este método é ilustradopelo sistema de manuseio de diabete AERX, que é um inalador eletrônicomanual que libera insulina aerossolizada nos pulmões. Os estudos têmmostrado que as proteínas tão grandes quanto 48.000 kDa foram liberadasatravés da pele em concentrações terapêuticas com a ajuda de ultra-som debaixa freqüência, que ilustra a praticabilidade de administração trascutânea(Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)). A liberação transdérmica usandoeletroporação fornece um outro meio para administrar uma molécula tendoatividade de ligação de IL-31 (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10: 213(1997)).

Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína,polipeptídeo ou peptídeo tendo atividade de ligação de IL-31 pode serformulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composiçõesfarmaceuticamente úteis, por meio dos quais as proteínas terapêuticas sãocombinadas em uma mistura com um carregador farmaceuticamenteaceitável. Uma composição é dita ser um "carregador farmaceuticamenteaceitável" se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor.

A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de umcarregador farmaceuticamente aceitável. Outros carregadores adequados sãobem conhecidos por aqueles na técnica. Ver, por exemplo, Gennaro (ed.),Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack PublishingCompany 1995).

Para os propósitos de terapia, as moléculas tendo atividade deligação de IL-31 e um carregador farmaceuticamente aceitável sãoadministrados a um paciente em uma quantidade terapeuticamente eficaz.

Uma combinação de uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo tendo atividadede ligação de IL-31 e um carregador farmaceuticamente aceitável é dito seradministrado em uma "quantidade terapeuticamente aceitável" se aquantidade administrada é fisiologicamente significante. Um agente éfisiologicamente significante se a sua presença resulta em uma mudançadetectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agenteusado para tratar inflamação é fisiologicamente significante se a sua presençaalivia pelo menos uma porção da resposta inflamatória.

Uma composição farmacêutica que compreende IL-31 (ouanálogo ou proteína de fusão de IL-31) pode ser fornecida na forma líquida,em um aerossol ou na forma sólida. As formas líquidas, são ilustradas porsoluções injetáveis, aerossóis, gotícuias, soluções topológicas e suspensõesorais. As formas sólidas exemplares incluem cápsulas, tabletes e formas deliberação controlada. A última forma é ilustrada pelas bombas miniosmóticase implantes (Bremer et al., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade,"Implants in Drug Delivery," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger(eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et al., "Protein Deliverywith Infusion Pumps," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders eHendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al,"Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," emProtein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117(Plenum Press 1997)). Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outrasaplicações topológicas e outros.

Os anticorpos anti-IL-31 aqui divulgados também podem serformulados como imunolipossomas. Os lipossomas contendo o anticorpo sãopreparados pelos métodos conhecidos na técnica, tais como descritos emEpstein et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77: 4030 (1980); e Pat. U.S. N- 4.485.045 e4.544.545. Os lipossomas com tempo de circulação realçado são divulgadosna Pat. U.S. N2 5.013.556.

Os lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelométodo da evaporação de fase reversa com uma composição lipídica quecompreende fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada emPEG (PEG-PE). Os lipossomas são filtros extrusados de tamanho de porodefinido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentosFab's do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aoslipossomas como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288(1982) por intermédio de uma reação de intertroca de dissulfeto. Um agentequimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) é opcionalmente contido dentrodo lipossoma. Ver Gabizon et al J. National Câncer Inst. 81(19) 1484 (1989).

As formulações terapêuticas do anticorpo são preparadas paraarmazenagem misturando-se o anticorpo tendo o grau desejado de pureza comcarregadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveisopcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed.(1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Oscarregadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos aosrecipientes nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões taiscomo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; os antioxidantes incluindoácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto deoctadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto debenzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo(menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica,gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais comopolivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina,histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes queladores taiscomo EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;contra íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (porexemplo complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais comoTween®, Pluronics® ou polietileno glicol (PEG).

A formulação aqui também pode conter mais do que umcomposto ativo como necessário para a indicação particular que é tratada,preferivelmente aquele com atividades complementares que não afetemadversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer aindaanticorpos que se liguem a IL-31 em uma única formulação. Alternativamenteou além disso, a composição pode compreender um agente quimioterapêuticoou uma citocina. Tais moléculas estão adequadamente presentes emcombinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos também podem ser aprisionados emmicrocápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação oupela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose oumicrocápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila),respectivamente, em sistemas de liberação de medicamento coloidal (porexemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas sãodivulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed.(1980).

As formulações a serem usadas para a administração in vivodevem ser estéreis. Isto é facilmente realizado pela filtração através demembranas de filtração estéril.

As preparações de liberação prolongada podem ser preparadas.Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluemmatrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo oanticorpo, matrizes estas que estão na forma de artigos formados, porexemplo películas ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberaçãoprolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Pat. U.S. N2 3.773.919),copolímeros de ácido L-glutâmico e.gama. etil-L-glutamato, etileno-acetatode vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólicodegradável tal como o Lupron Depot® (microesferas injetáveis compostas decopolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácidopoli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Embora os polímeros tais como etileno-acetatode vinila e ácido lático-ácido glicólico possibilita a liberação de moléculas pormais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempomais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por umtempo longo, eles podem desnaturar ou agregar como um resultado daexposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológicae mudanças possíveis na imunogenicidade. As estratégias racionais podem serplanejadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Porexemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser a formação deligação S=S intermolecular através da intermudança de tio-dissulfeto, aestabilização pode ser obtida pela modificação de resíduos de sulfidrila,liofilização de soluções ácidas, controle do teor de umidade, usando aditivosapropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímeroespecífico.

Os lipossomas fornecem um meio para liberar polipeptídeosterapêuticos a um paciente intravenosa, intraperitoneal, intratecal,intramuscular, subcutaneamente ou por intermédio da administração oral,inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículasmicroscópicas que consistem de uma ou mais bicamadas lipídicas quecircundam compartimentos aquosos (ver, no geral, Bakker-Woudenberg et al.,Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Supl. 1): S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993) e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes asCarriers," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares em composição àsmembranas celulares e como um resultado, os lipossomas podem seradministrados com segurança e são biodegradáveis. Dependendo do métodode preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares e oslipossomas podem variar em tamanho com diâmetros variando de 0,02 μπι amais do que 10 μηι. Uma variedade de agentes pode ser encapsulada emlipossomas: partição de agentes hidrofóbicos nas bicamadas e partição deagentes hidrofílicos dentro do(s) espaço(s) aquoso(s) interno(s) (ver, porexemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (JohnLibbey 1987) e Ostro et al, American J. Hosp. Pharm. 46: 1576 (1989)).

Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agenteencapsulado pela variação do tamanho do lipossoma, do número debicamadas, composição lipídica, assim como as características de carga esuperfície dos lipossomas.

Os lipossomas podem adsorver virtualmente qualquer tipo decélula e depois lentamente liberar o agente encapsulado. Alternativamente,um lipossoma absorvido pode ser endocitado pelas células que sãofagocíticas. A endocitose é seguida pela degradação intralisossômica delipídeos lipossômicos e a liberação dos agentes encapsulados (Scherphof etal., Ann. N.Y. Acad. Sei. 446: 368 (1985)). Depois da administraçãointravenosa, lipossomas pequenos (0,1 a 1,0 μιη) são tipicamente absorvidospelas células do sistema reticulo-endotelial, localizado principalmente nofígado e baço, ao passo que lipossomas maiores do que 3,0 μπι sãodepositados nos pulmões. Esta absorção preferencial de lipossomas menorespelas células do sistema reticuloendotelial foi usada para liberar agentesquimioterapêuticos aos macrófagos e aos tumores do fígado.

O sistema reticuloendotelial pode ser enganado por diversosmétodos incluindo a saturação com doses grandes de partículas de lipossomaou inativação de macrófago seletivo por meios farmacológicos (Claassen etal., Biochim. Biophys. Acta 802: 428 (1984)). Além disso, a incorporação defosfolipídeos derivados de glicolipídeo ou polieteleno glicol em membranasde lipossoma mostrou resultar em uma absorção significantemente reduzidapelo sistema reticuloendotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).

Os lipossomas também podem ser preparados para alvejarcélulas ou órgãos particulares variando-se a composição de fosfolipídeo oupela inserção de receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo,lipossomas, preparados com um alto teor de um tensoativo não iônico, foramusados para alvejar o fígado (Hayakawa et al., Patente Japonesa 04-244,018;Kato et al., Biol. Pharm. Buli. 16: 960 (1993)). Estas formulações forampreparadas misturando-se fosfatidileolina de óleo de soja, α-tocoferol e óleode mamona hidrogenado etoxilado (HCO-60) em metanol, concentrando amistura sob vácuo e depois reconstituindo a mistura com água. Umaformulação lipossômica de dipalmitoilfosfatidil-colina (DPPC) com umamistura de esterilglicosídeo derivado de soja (SG) e colesterol (Ch) tambémfoi mostrado alvejar o fígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 881 (1997)).Alternativamente, vários ligandos alvej adores podem serligados à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos deanticorpo, carboidratos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo,lipossomas podem ser modificados com derivados de galactosillipídeo tiporamificado para alvejar os receptores de asialoglicoproteína (galactose), quesão exclusivamente expressados na superfície das células hepáticas (Kato eSugiyama, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi etal., Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997)). Similarmente, Wu et al., Hepatology27: 772 (1998), mostrou que a rotulação de lipossomas com asialofetuínalevou a uma meia-vida plasmática de lipossoma encurtada e enormementerealçou a absorção de lipossoma rotulado com asialofetuína pelos hepatócitos.Por outro lado, o acúmulo hepático de lipossomas que compreende derivadosde galactosillipídeos tipo ramificado pode ser inibido pela pré injeção deasialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997)). Oslipossomas de albumina sérica humana poliaconitilada fornecem um outrométodo para alvejar lipossomas às células hepáticas (Kamps et al., Proc. NatΊAcad. Sei. USA 94: 11681 (1997)). Além disso, Geho, et al. Patente U.S. N24.603.044, descrevem um sistema de liberação de vesícula de lipossomadirecionado a hepatócito, que tem especificidade para receptoreshepatobiliares associados com as células metabólicas especializadas dofígado.

Os polipeptídeos tendo atividade de ligação de EL-31 podemser encapsulados dentro de lipossomas usando técnicas padrão demicroencapsulação de proteína (ver, por exemplo, Anderson et al., Infect.Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50: 1853 (1990) eCohen et al., Biochim. Biophvs. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al."Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," em LiposomeTechnology, 2a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press1993), Wassef et al., Met. Enzymol. 149: 124 (1987)). Como mencionadoacima, lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade decomponentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivadoslipídicos de poli(etileno glicol) (Allen et al., Biochim. Biophvs. Acta 1150: 9(1993)).

As microesferas de polímero degradável foram planejados paramanter altos níveis sistêmicos de proteínas terapêuticas. As microesferas sãopreparadas a partir de polímeros degradáveis tais como poli(lactídeo-co-glicolídeo) (PLG), polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato deetilvinila não biodegradável, em que as proteínas são aprisionadas nopolímero (Gombotz e Pettit, Bioconiugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade,"Role of Polimers in Drug Delivery," em Drug Delivery Systems, Ranade eHollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz,"Degradable Controlled Release Systems Useful for Protein Delivery," emProteína Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92(Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281: 1161 (1998); Putney eBurke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem.Biol. 2: 548 (1998)). As nanoesferas revestidas com polietileno glicol (PEG)também podem fornecer carregadores para a administração intravenosa deproteínas terapêuticas (ver, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10:167(1997)).

Outras formas de dosagem podem ser desenvolvidas poraqueles habilitados na técnica, como mostrado, por exemplo, por Ansel ePopovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5aEdição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's PharmaceuticalSciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995) e por Ranade eHollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como uma ilustração, as composições farmacêuticas podemser fornecidas como um kit compreendendo um recipiente que compreendemum polipeptídeo de IL-31 ou um antagonista de IL-31 (por exemplo, umanticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptídeo de IL-31).Os polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos na forma de uma soluçãoinjetável para as doses únicas ou múltiplas ou como um pós estéril que serãoreconstituídos antes da injeção. Alternativamente, um tal kit pode incluir umdispensador de pó seco, gerador de aerossol líquido ou nebulizador para aadministração de um polipeptídeo terapêutico.

Dentro de um aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que compreende um anticorpo monoclonal que especificamentese liga a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz de ligar o anticorpo monoclonalproduzido pelo hibridoma depositado com a American Type CultureCollection tendo a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815; b) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6816; c) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6829; d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831; f) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6871; g) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6872; h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; e

1) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873. Dentro de umaforma de realização, o anticorpo neutraliza a interação de IL-31 (SEQ ID NO:

2) com IL-31RA (SEQ ID NO: 5). Dentro de uma outra forma de realização,o anticorpo é (a) um anticorpo monoclonal de murino, (b) um anticorpohumanizado derivado de (a) ou (c) um fragmento de anticorpo ou (d) umanticorpo monoclonal humano. Dentro de uma outra forma de realização oanticorpo compreende ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofator,marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, rótulo de peptídeo,partícula magnética ou toxina. Dentro de uma outra forma de realização oanticorpo compreende ainda PEGuilação. Dentro de uma outra forma derealização o anticorpo é um anticorpo neutralizante. Dentro de uma outraforma de realização a administração do anticorpo a um mamífero inibe,previne, reduz ou bloqueia a atividade pró-inflamatória do polipeptídeo.Dentro de uma outra forma de realização a administração do anticorpo a ummamífero inibe, previne, reduz ou bloqueia a coceira e dermatite associadascom a atividade pró-inflamatória do polipeptídeo.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com aAmerican Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito dePatente ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6815; b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816; c)Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871; d) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6829; e e) Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6830.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com aAmerican Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito dePatente ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6815; b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816; e c)Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com aAmerican Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito dePatente ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6829; e b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830.

Dentro de um outro aspecto é fornecido um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com aAmerican Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito dePatente ATCC selecionada de: a) Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6872; e b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875.

Dentro de um outro aspecto é fornecido um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 11 em que o polipeptídeo é capazde ligar o anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com aAmerican Type Culture Collection tendo a Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6874. Dentro de uma forma de realização o anticorpo éum anticorpo neutralizante. Dentro de uma forma de realização aadministração do anticorpo a um mamífero inibe, previne, reduz ou bloqueia aatividade pró-inflamatória do polipeptídeo. Dentro de uma forma derealização a administração do anticorpo a um mamífero inibe, previne, reduzou bloqueia a coceira e a dermatite associadas com a atividade pró-inflamatória do polipeptídeo.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um método dereduzir a inflamação em um mamífero que compreende administrar aomamífero uma quantidade dos anticorpos IL-31 aqui descritos, por meio doqual a inflamação é reduzida.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um método detratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória em que IL-31desempenha um papel, que compreende: administrar um antagonista de IL-31ao mamífero tal que a inflamação é reduzida, em que o antagonistacompreende (i) um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo deligação que especificamente se liga a um polipeptídeo ou fragmento depolipeptídeo de IL-31RA ou (ii) um polipeptídeo ou fragmento depolipeptídeo de IL-31RA; e em que a atividade inflamatória de IL-31 éreduzida. Dentro de uma forma de realização a doença é uma doençainflamatória que compreende doenças pruríticas. Dentro de uma forma derealização a doença é a dermatite atópica. Dentro de uma forma de realizaçãoa doença é o prurigo nodular.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um método dereduzir, inibir ou prevenir o efeito de prurido em um mamífero em que IL-31desempenha um papel, que compreende: administrar um antagonista de IL-31ao mamífero tal que o prurido é reduzido, em que o antagonista compreende(i) um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo de ligação queespecificamente se liga a um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo dopolieptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ouum fragmento deste; e em que a atividade prurítica de IL-31 é reduzida.Dentro de uma forma de realização a doença do mamífero é a dermatiteatópica. Dentro de uma forma de realização a doença do mamífero édermatite. Dentro de uma forma de realização o anticorpo é um anticorpocomo aqui descrito.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um método dereduzir, inibir ou prevenir o efeito de prurido em um mamífero em que IL-31desempenha um papel, que compreende: administrar um antagonista de IL-31ao mamífero tal que haja uma redução na coceira no mamífero em que oantagonista compreende (i) um anticorpo, fragmento de anticorpo oupolipeptídeo de ligação que especificamente se liga a um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo do polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2 ou um fragmento deste; e por meio do qual aatividade de coceira de IL-31 é reduzida. Dentro de uma forma de realização adoença do mamífero é a dermatite atópica. Dentro de uma forma de realizaçãoa doença do mamífero é a dermatite. Dentro de uma forma de realização oanticorpo é um anticorpo como aqui descrito.

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo número de designação de clonede hibridoma selecionado de: a) clone 292.12.3.1 (Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6815); b) clone 292.63.5.3 (Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6829); c) clone 292.72.3.1 (Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6816); d) clone 292.84.1.6 (Designação de Depósito dePatente ATCC PTA-6871); e e) clone 292.118.6.4 (Designação de Depósitode Patente ATCC PTA-6830).

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, em que o polipeptídeo é capaz deligar o anticorpo monoclonal produzido pelo número de designação de clonede hibridoma selecionado de: a) clone 294.35.2.6.3 (Designação de Depósitode Patente ATCC PTA-6872); b) clone 294.144.3.5 (Designação de Depósitode Patente ATCC PTA-6873); c) clone 294.154.5.6 Designação de Depósitode Patente ATCC PTA-6875); e d) clone 294.163.2.1 (Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6831).

Dentro de um outro aspecto a invenção fornece um anticorpomonoclonal que compreende um anticorpo monoclonal que é capaz decompetir quanto a ligação de um polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2 em que o polipeptídeo é capaz de ligar oanticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com a AmericanType Culture Collection tendo a Designação de Depósito de Patente ATCCselecionada de: a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815; b)Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816; c) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6829; d) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6830; e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831; f)Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871; g) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6872; h) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6875; e i) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.

Dentro de um outro aspecto é fornecido um hibridoma, em queo hibridoma é depositado com a American Type Culture Collection tendo aDesignação de Depósito de Patente ATCC selecionada de: a) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6815; b) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6816; c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830; e) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6831; f) Designação de Depósito de PatenteATCC PTA-6871; g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; e i) Designação deDepósito de Patente ATCC PTA-6873.

Dentro de um outro aspecto a presente invenção fornece ummétodo de produzir um anticorpo a um polipeptídeo de IL-31 quecompreende: inocular um animal com um polipeptídeo selecionado do grupoque consiste de: (a) um polipeptídeo que consiste de 9 a 141 aminoácidos, emque o polipeptídeo é idêntico a uma seqüência contígua de resíduos deaminoácido na SEQ ID NO: 2 do aminoácido número 24 (Ser) ao aminoácidonúmero 164 (Thr); um polipeptídeo como divulgado acima; (c) umpolipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2do aminoácido número 38 a 52; (d) um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 do aminoácido número 83 a 98;(e) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ IDNO: 2 do aminoácido número 104 a 117; (f) um polipeptídeo que compreendea seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 do aminoácido número 137 a152; (g) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2 do aminoácido número 38 a 152; (h) um polipeptídeo quecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 do aminoácidonúmero 24 a 164; (c) um polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 11 do aminoácido número 38 a 52; (d) umpolipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 11do aminoácido número 85 a 98; (e) um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 11 do aminoácido número 104 a118; (f) um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 11 do aminoácido número 141 a 157; (g) um polipeptídeo quecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 11 do aminoácidonúmero 38 a 157; (h) um polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 11 do aminoácido número 24 a 163; (i) umpolipeptídeo que compreende um epítopo antigênico de acordo com um perfilde hidrofilicidade de Hopp/Woods da SEQ ID NO:2 ou SEQ I NO 11, emque o perfil está fundamentado em uma janela de seis resíduos móveis. Osresíduos G, S e T ocultos e os resíduos Η, Y e W expostos ignorados; e emque o polipeptídeo evoca uma resposta imune no animal para produzir oanticorpo; e isolar o anticorpo a partir do animal.

Dentro de um outro aspecto a presente invenção fornece umanticorpo (por exemplo, anticorpo neutralizante) produzido pelo métodocomo divulgado acima, em que o anticorpo se liga a um polipeptídeo da SEQID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11. Em uma forma de realização, o anticorpodivulgado acima especificamente se liga a um polipeptídeo mostrado na SEQID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11.

Dentro de um outro aspecto a presente invenção fornece ummétodo de detectar a presença de IL-31 em uma amostra biológica, quecompreende as etapas de: (a) contatar a amostra biológica com um anticorpoou um fragmento de anticorpo como divulgado acima, em que o contatar érealizado sob condições que permitam a ligação do anticorpo ou fragmento deanticorpo com a amostra biológica e (b) detectar qualquer um do anticorpoligado ou fragmento de anticorpo ligado.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de matar as células cancerosas que compreende, obter ex vivo umtecido ou amostra biológica contendo células cancerosas de um paciente ouidentificar células cancerosas in vivo; produzindo um polipeptídeo pelométodo como aqui divulgado; formulando o polipeptídeo em um veículofarmaceuticamente aceitável; e administrando ao paciente ou expondo ascélulas cancerosas ao polipeptídeo; em que o polipeptídeo mata as células.

Em uma forma de realização o método de matar as células cancerosas é comodivulgado acima, em que o polipeptídeo é ainda conjugado a uma toxina. Emuma forma de realização o anticorpo é como divulgado acima, em que oanticorpo é selecionado do grupo que consiste de: (a) anticorpo policlonal, (b)anticorpo monoclonal de murino, (c) anticorpo humanizado derivado de (b),(d) um fragmento de anticorpo e (e) anticorpo monoclonal humano.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece umanticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende uma seqüência de resíduos de aminoácidoselecionados do grupo que consiste de: (a) o polipeptídeo mostrado dosresíduos 38 (Val) ao 152 (Leu) como mostrado na SEQ ID NO: 2; (b) opolipeptídeo mostrado dos resíduos 27 (Leu) ao 164 (Thr) como mostrado naSEQ ID NO: 2; (c) o polipeptídeo mostrado dos resíduos 24 (Thr) ao 164(Thr) como mostrado na SEQ ID NO: 2; e (d) o polipeptídeo mostrado dosresíduos 1 (Met) ao 164 (Thr) como mostrado na SEQ ID NO: 2. Em umaoutra forma de realização o anticorpo é como divulgado acima, em que oanticorpo compreende ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofator,marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, rótulo de peptídeo,partícula magnética, medicamento ou toxina.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética quecompreende cultivar as células da medula óssea ou sangue periférico comuma composição que compreende uma quantidade de um anticorpo como aquidivulgado suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das célulashematopoiéticas nas células da medula óssea ou sangue periférico quandocomparado com as células da medula óssea ou sangue periférico cultivadas naausência de receptor de citocina solúvel. Em uma forma de realização ométodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é comodivulgado acima, em que as células hematopoiéticas e as células progenitorashematopoiéticas são células linfóides. Em uma outra forma de realização ométodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzidas pela IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é comodivulgado acima, em que as células linfóides são macrófagos ou células T.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de reduzir a inflamação induzida pela IL-31 que compreendeadministrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de umacomposição de um anticorpo como aqui divulgado suficiente para reduzir ainflamação.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero cominflamação que compreende: (1) determinar um nível de uma moléculainflamatória; (2) administrar uma composição que compreende um anticorpocomo aqui divulgado em um veículo farmaceuticamente aceitável; (3)determinar um nível após a administração da molécula inflamatória; (4)comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível damolécula inflamatória na etapa (3), em que uma falta de aumento ou umadiminuição do nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão deuma resposta inflamatória. Em uma forma de realização, o anticorpo é comodivulgado acima, em que o anticorpo compreende ainda um radionuclídeo,enzima, substrato, cofator, marcador fluorescente, marcadorquimioluminescente, rótulo de peptídeo, partícula magnética, medicamento outoxina.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzidas pela IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética quecompreende cultivar células da medula óssea ou sangue periférico com umacomposição que compreende uma quantidade de um anticorpo como aquidivulgado suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das célulashematopoiéticas nas células da medula óssea ou sangue periférico quandocomparadas com as células da medula óssea ou sangue periférico cultivadasna ausência de receptor de citocina solúvel. Em uma forma de realização ométodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzidas pela IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é comodivulgado acima, em que as células hematopoiéticas e as células progenitorashematopoiéticas são células linfóides. Em uma outra forma de realização ométodo para inibir a proliferação ou diferenciação induzidas pela IL-31 decélulas hematopoiéticas e progenitores de célula hematopoiética é comodivulgado acima, em que as células linfóides são macrófagos ou células T.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de reduzir a inflamação induzida pela IL-31 que compreendeadministrar a um mamífero com inflamação uma quantidade de umacomposição de um anticorpo como aqui divulgado suficiente para reduzir ainflamação.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero cominflamação que compreende: (1) determinar um nível de uma moléculainflamatória; (2) administrar uma composição que compreende um anticorpocomo aqui divulgado em um veículo farmaceuticamente aceitável; (3)determinar um nível após a administração da molécula inflamatória; (4)comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível damolécula inflamatória na etapa (3), em que uma falta de aumento ou umadiminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de suprimir umaresposta inflamatória.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção forneceum método de tratar um mamífero afligido com uma doença inflamatóriaem que IL-31 desempenha um papel, que compreende: administrar umantagonista de IL-31 ao mamífero tal que a inflamação seja reduzida, emque o antagonista é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo oupolipeptídeo de ligação que especificamente se liga a um polipeptídeo oufragmento de polipeptídeo de IL-31 (SEQ ID NO: 2). Em uma forma derealização, o método de tratar um mamífero afligido com uma doençainflamatória é como divulgado acima, em que a doença é uma doençainflamatória crônica. Em uma outra forma de realização, o método detratar um mamífero afligido com uma doença inflamatória é comodivulgado acima, em que a doença é uma doença inflamatória crônicaselecionada do grupo que consiste de: doença do intestino inflamatório;colite ulcerativa; doença de Crohn; dermatite atópica; eczema; e psoríase.em uma outra forma de realização, o método de tratar um mamíferoafligido com uma doença inflamatória é como divulgado acima, em que adoença é uma doença inflamatória aguda. Em uma outra forma derealização, o método de tratar um mamífero afligido com uma doençainflamatória é como divulgado acima, em que a doença é uma doençainflamatória aguda selecionada do grupo que consiste de: endotoxemia;septicemia; síndrome do choque tóxico; e doença infecciosa. Em umaoutra forma de realização, o método de tratar um mamífero afligido comum doença inflamatória é como divulgado acima, em que o anticorpocompreende ainda um radionuclídeo, enzima, substrato, cofator, marcadorfluorescente, marcador quimioluminescente, rótulo de peptídeo, partículamagnética, medicamento ou toxina.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para detectar a inflamação em um paciente, que compreende: obterum tecido ou amostra biológica de um paciente; incubar o tecido ou amostrabiológica com um anticorpo como aqui divulgado sob condições em que oanticorpo se liga ao seu polipeptídeo complementar no tecido ou amostrabiológica; visualizar o anticorpo ligado no tecido ou amostra biológica; ecomparar os níveis de anticorpo ligado no tecido ou amostra biológica dopaciente com um tecido ou amostra biológica de controle normal, em que umaumento no nível de anticorpo ligado ao tecido ou amostra biológica dopaciente em relação ao tecido ou amostra biológica de controle normal éindicativo de inflamação no paciente.

Dentro de um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para detectar a inflamação em um paciente, que compreende: obterum tecido ou amostra biológica de um paciente; rotular um polinucleotídeoque compreende pelo menos 14 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 1 ouo complemento da SEQ ID NO: 1; incubar o tecido ou amostra biológica sobcondições em que o polinucleotídeo hibridisará com a seqüência depolinucleotídeo complementar; visualizar o polinucleotídeo rotulado no tecidoou amostra biológica; e comparar o nível de hibridização de polinucleotídeorotulado no tecido ou amostra biológica do paciente com um tecido ouamostra biológica de controle normal, em que um aumento na hibridização depolinucleotídeo rotulado com o tecido ou amostra biológica do paciente emrelação ao tecido ou amostra biológica de controle normal é indicativo deinflamação no paciente.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos nãolimitantes.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Geração de Mabs anti-IL-31 de camundongo de Rato

A. imunização e Triagem Sérica de Ratos

Quatro ratos Sprague-Dawley fêmeas de 3 meses de idade(Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram imunizados com IL-31de camundongo. Os ratos foram inicialmente imunizados pela injeçãointraperitoneal com -290 μg de IL-31 de camundongo purificada,recombinante (produzidos em células BHK) fundidas no terminal C com umpeptídeo que consiste da seqüência EYMPME (SEQ ID NO: 7) (daqui emdiante aludido como mIL31-CEE) em combinação com Adjuvante Completode Freund (Pierce, Rockford, IL) como pelas instruções do fabricante. Aseguir da imunização inicial cada um dos ratos recebeu um adicional de 150μg de mIL-31-CEE em Adjuvante de Freund Incompleto por intermédio davia intraperitoneal a cada duas semanas em um período de seis semanas. Setedias depois da terceira e quarta imunizações os ratos foram sangrados porintermédio do plexo retroorbital e o soro separado do sangue para a análise dasua capacidade para ligar ao mIL-31-CEE em solução e para inibir (comomedido pela neutralização) a atividade estimulatória de mIL-31-CEE em umalinhagem de célula transfectada com o IL-31 de camundongo RA.

A capacidade dos anticorpos anti-IL-31 de camundongo de rato nosanti-soros para ligar ao mIL-31-CEE foi avaliada usando um ensaio de ELISA nomodo de "captura". Neste ensaio, os reservatórios de placas de ELISA de poliestirenode 96 reservatórios foram primeiro revestidos com 100 μΐ/reservatório de IgG anti-rato de cabra, anticorpo específico de Fc (Jackson Immunoresearch) a umaconcentração de 500 ng/ml em 0,1 M de Na2C03, pH 9,6. As placas foramincubadas durante a noite a 4°C depois que anticorpo não ligado foi aspirado e asplacas lavadas duas vezes com 300 μΐ/reservatório de PBS-Tween (0,137 M de NaCl,0,0027 M de KCl, 0,0072 M de Na2HP04, 0,0015 M de KH2P04, 0,05% v/v depolissorbato 20, pH 7,2). Os reservatórios foram bloqueados com 200 μΐ/reservatóriode SuperBlock (Pierce, Rockford, EL) por 5 minutos na temperatura ambiente (RT), oSuperBlock removido com um peteleco da placa e o bloco repetido uma vez maisdepois do que as placas foram lavadas duas vezes com PBS-Tween. As diluiçõesseriais de 10 vezes (em PBS-Tween mais 1% p/v de albumina sérica bovina (BSA) e0,05% v/v de Proclin 300, pH 7,2 = tampão de diluição) dos soros foram preparadoscomeçando com uma diluição inicial de 1:1000 e variado para 1:1.000.000. Amostrasem triplicata de cada diluição foram depois transferidas para a placa de ensaio, 100μΐ/reservatório, de modo a ligar a IgG de rato nos soros à placa de ensaio através daporção Fc da molécula. Os soros de rato normais serviram como um controlenegativo. A seguir de uma incubação de 1 hora na RT, os reservatórios foramaspirados e as placas lavadas duas vezes como descrito acima. mIL-31-CEEbiotinilado (razão molar 12:1 de biotina:proteína) a uma concentração de 500 ng/mlfoi depois adicionado aos reservatórios, 100 μΐ/reservatório. A seguir de umaincubação de 1 hora na RT, mIL-31-CEE biotinilado não ligado foi aspirado dosreservatórios e as placas lavadas duas vezes. Estreptavidina rotulada com rábanoperoxidase (Pierce, Rockford, DL) a uma concentração de 500 ng/ml foi depoisadicionada a cada reservatório, 100 μΐ/reservatório e as placas incubadas na RT por 1hora. Depois da remoção de HRP-AS não ligado, as placas foram lavadas 5 vezes,100 μΐ/reservatório de tetrametil benzidina (T MB) (BioFX Laboratories, OwingsMills, MD) adicionado a cada reservatório e as placas incubadas por 5 minutos naRT. O desenvolvimento de cor foi interrompido pela adição de 100 μΐ/reservatório de450 nmdeT MB Stop Reagent (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e osvalores de absorbância dos reservatórios lidos em um instrumento Molecular DevicesSpectra MAX 340 a 450 nm.

A capacidade dos anticorpos anti-IL-31 de camundongo derato nos anti-soros para inibir (como medido pela neutralização) a atividadeestimulatória de IL-31 de camundongo através do seu receptor cognato foiavaliado usando um ensaio de neutralização com base em célula que utilizouuma linhagem de célula BaB transfectada com mIL-3 IRA/OS MRbeta comum sistema repórter de luciferase (Bafi/KZ 134/mcytor 17/mOS MRbeta) epôde ser ativada por intermédio de estimulação das células pela IL-31 decamundongo. Para este ensaio, uma diluição 1:250 inicial em meio de ensaio(RP MI 1640, 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato desódio, IX penicilina-estreptomicina-neomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA)) decada anti-soro foi preparado e depois que cada um destes foi diluído em sériede 2 vezes a uma diluição final de 1:32000. A cada diluição de anti-soros foiadicionado um volume igual de mIL-31-CEE diluído a 4 ng/ml em tampão deensaio para um volume total de 100 μΐ nos reservatórios. As misturas deanticorpo/citocina foram incubadas na RT por 0,5 hora depois que as célulasalvo foram lavadas do seu meio de cultivo, ajustadas a uma densidade de300.000 células/ml e adicionadas às misturas de anticorpo/citocina, 100μl/reservatório. Os meios de ensaio contendo 2 ng/ml de mIL-31 e nenhumanti-soro serviu como um controle negativo e indicou a estimulação máximaque pôde ser obtida no ensaio. A seguir da incubação a 37°C, 5% de CO2 por16 a 24 horas as placas foram centrifugadas a 1500 RPM por 5 minutos, osmeios cuidadosamente removidos com um peteleco e 25 μΐ de Ix tampão deIise de célula (Promega, Madison, WI) adicionado a cada reservatório. Asplacas foram suavemente agitadas por 10 minutos na RT para permitir a Iisede célula completa e depois os lisados de célula foram transferidos para placasde placas de 96-reservatórios brancas sólidas (Corning/Costar 3917, Acton,MA). 40 μΐ de substrato de ensaio de luciferase (Promega) foram adicionadosa cada reservatório. Os reservatórios foram depois avaliados quanto aatividade de luciferase (representando a ativação de IL-31 da construçãorepórter STAT) em um luminômetro usando um intervalo de integração de 5segundos.

Tanto o ensaio de ELISA de "captura" assim como o ensaio deneutralização com base em célula indicaram que todos os quatro ratosdesenvolveram uma resposta de anticorpo significante ao mIL-31 embora umrato claramente gerou uma resposta mais forte do que os outros. No geral, aresposta como medida pelo ELISA de "captura" quase emparelhou comaquela observada com o ensaio de neutralização com base em célulasugerindo que o anticorpo de classe IgG foi primariamente responsável pelainibição de mIL-31.

B. Fusão

Quatro semanas depois da última imunização intraperitoneal, orato com o título de neutralização de mIL-31 mais significante foi imunizadouma vez final com aproximadamente 150 μg de mIL-31-CEE em PBS porintermédio da injeção intravascular. Cinco dias mais tarde, o baço elinfonodos deste rato foram colhidos, preparados em uma única suspensão decélula e fundidos à linhagem de célula de mieloma de camundongo Sp2/0(Shulman, M. et aL, Nature 276: 269-270, 1976) em uma razão de célulalinfóide:célula de mieloma de 4:1 com PEG 1500 usando métodos padrãoconhecidos na técnica (Harlow, E. e Lane, D. 1988. "Antibodies A LaboratoryManual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Amistura de fusão foi distribuída em uma série de placas de fundo chato de 96reservatórios em combinação com timócitos de BALB/c como uma camadaalimentadora (Oi, V. T. e Herzenberg, L. A. 1980. "Selected Methods inCellular Immunology", Β. B. Mishell e S. M. Shiigi, eds., pp. 351-372,Freeman, San Francisco). Os reservatórios das placas de fusão foramalimentadas uma vez com uma substituição de 70% de meio e timócitosdepois de 4 dias e mais uma vez dois dias mais tarde apenas com meio. Osreservatórios foram ensaiados oito dias depois do plaqueamento da fusão.

C. Triagem da Fusão

O ELISA de "captura" para mIL-31 como descrito acima foiusado como a triagem primária exceto que os sobrenadantes de hibridomaforam testados não diluídos e foram plaqueados duplicados em placas deensaio das placas de cultura. Aproximadamente 170 reservatórios positivosforam identificados. Os sobrenadantes de cada um destes reservatórios assimcomo uns poucos reservatórios negativos foram depois avaliados quanto a suacapacidade para inibir mIL-31 no ensaio de neutralização com base em céluladescrito mais no princípio. Cada um foi testado a uma diluição final de 1:8 emmeio de ensaio. Na última diluição, componentes estimulatórios nãoespecíficos nos sobrenadantes de hibridoma foram suficientemente reduzidostal que fossem de contribuição mínima para o índice de estimulaçãoobservado. A maioria dos sobrenadantes pareceram neutralizar mIL-31 emalgum grau com aproximadamente dez deles demonstrando neutralizaçãoessencialmente completa e o resto mostrando uma seqüência contínua deinibição até um ponto onde aproximadamente outros dez pareceram possuirmuito pouca se alguma neutralização potencial. As células de hibridoma emaproximadamente 150 dos reservatórios positivos de ELISA de "captura"foram expandidos com sucesso em cultura em placas de 24 reservatórios.Quando a densidade das culturas em 24 reservatórios foi de aproximadamente4 a 6 χ 105 células/ml, o sobrenadante (aproximadamente 1,5 ml) foiindividualmente coletado e armazenado para cada reservatório e as células decada reservatório crioconservadas.

Cada um dos sobrenadantes dos 24 reservatórios foireanalisado tanto no ELISA de "captura" quanto nos ensaios de neutralizaçãode IL-31 com base em célula utilizado na triagem de fusão. Além disso, estessobrenadantes também foram testados em um ELISA de "captura" utilizandoo homólogo humano de IL-31 também construído com o rótulo EYMPME(SEQ ID NO: 7) fundido ao terminal C da molécula de IL-31 e produzido emcélulas BHK. Os resultados indicaram que a seguir da expansão, uma maioriados sobrenadantes do reservatório mestre retiveram a sua capacidade parareconhecer IL-31 de camundongo em solução. Entre estes reservatóriospositivos de ensaio de "captura", a atividade inibitória de mIL-31 variou decompleta a quase completa para cerca de 20 sobrenadantes até essencialmentenenhuma inibição para 10 a 15 sobrenadantes. Nenhuma reatividade cruzadapara a IL-31 humana-CEE foi observada no ensaio de captura indicando quenenhum dos anticorpos anti-mIL-31 de rato reagiram cruzado com ohomólogo IL31 humano ou reconheceu o rótulo CEE fundido ao terminal Cda molécula de mIL-31 -CEE.

D. Seleção e Clonagem de Hibridomas que Produzem a Neutralização deMabs Anti-mIL31

As células em sete dos dez reservatórios mestres deneutralização de IL-31 (271.5.7, 271.9.4, 271.26.6, 271.27.4, 271.33.1,271.33.3 e 271.39.4) foram clonados de modo a isolar um hibridoma clonadoque produz o mAb neutralizante de interesse. As células foram clonadas napresença de timócitos em placas de cultura de célula de microtítulo de 96reservatórios usando um método de diluição de baixa densidade padrão(menos do que 1 célula por reservatório) e a monoclonalidade foi avaliadapela examinação em microscópio de reservatórios para um único foco decrescimento antes do ensaio. Seis dias após o plaqueamento, todos osreservatórios nas placas foram triados pelo ELISA de "captura" quanto aoIgG específico de mIL-31. O sobrenadante de 6 a 10 reservatórios que foimAb tanto positivo quanto específico e originado de reservatórios com apenasuma única colônia de hibridoma cultivada foi coletado de cada conjunto declonagem e retriado em várias diluições no ELISA de "captura" assim comono ensaio de neutralização com base em célula para identificar um clone queproduz mAb neutralizante "melhor". Os resultados destes testes indicaramque os clones de hibridoma que produzem mAb neutralizante apropriadoforam obtidos apenas nos conjuntos 271.9.4, 271.26.6, 271.33.1, 271.33.3 e271.39.4. Um clone do "melhor" em cada um destes conjunto foi reclonado eos sublcones triados como descrito para produzir as linhagens de hibridomafinais 271.9.4.2.6, 271.26.6.6.1, 271.33.1.2.2, 271.33.3.2.1 e 271.39.4.6.5. Oisótipo de IgG de rato do mAb produzido por cada um destes hibridomas foideterminado usando um ELISA que utilizou mAbs específico de isótipo IgGanti-camundongo de rato biotinilado. Todos os cinco mAbs foram descobertospertencer à subclasse IgGl. O hibridoma 271.26.6.6.1 foi depositado com odepósito de patente da American Type Tissue Collection (ATCC, Manassas,VA) como um depósito original sob o Tratado de Budapeste dado o AcessoATCC No. PTA-6874.

Cada mAb anti-IL-31 de camundongo totalmente clonado queproduz hibridomas foi adaptado ao cultivo em meio isento de soro dehibridoma (hibridoma-SFM, Invitrogen). O sobrenadante de culturas de altadensidade de célula cultivada em hibridoma-SFM foi centrifugado pararemover as células e fragmentos celulares, filtrados através de um filtro de 0,2μm e o mAb purificado pela cromatografia de proteína G usando métodospadrão conhecidos na técnica.

E. Classificação da Atividade de Neutralização Específica In Vitro de MAbs

Para classificar a atividade de neutralização específica irt vitrode cada um dos cinco mAbs anti-IL-31 de camundongo de rato, cada um dosmAbs purificados foi retestado no ensaio de neutralização com base em céluladescrito mais no princípio com a exceção de que mIL-31 foi primeiroadicionado às células e esta mistura depois adicionada aos anticorpos. Alémde neutralizar a atividade contra mIL-31-CEE, os mAbs também foramavaliados contra uma outra forma de IL-31 de camundongo, chamada decl08smIL-31, em que o resíduo de cisteína na posição 108 foi convertida aum resíduo de serina. O último material foi produzido na E. coli sem opeptídeo C-EE. Ambas as formas de mIL-31 foram utilizadas em umaconcentração final de 1 e 5 ng/ml. Os mAbs foram ajustados a umaconcentração de 20 μg/ml em meio de ensaio e testado em duplicata comodiluições em série de 10 vezes variando de 10 μ§/ιη1 a 0,00001 μg/ml deconcentração final na mistura de ensaio. Os valores IC50 foram determinadosusando o software Sofltmax (Molecular Devices). Os resultados são mostradosna Tabela 1 e mostram que os mAbs 271.26.6.6.1, 271.33.1.2.2 e 271.39.4.6.5foram os mAbs neutralizadores mais potentes e foram de potência similarneste teste in vitro. De modo interessante, o mAb 271.33.3.2.1 foi muitomenos eficaz do que os outros mAbs contra a versão cl08smIL-31 de mIL-31sustentando a conclusão dos estudos de compartimentação de epítopo de queeste anticorpo em todas as probabilidades tem uma especificidade de epítopodiferente do que os outros quatro mAbs. O fato que este mAb foi tambémmuito menos eficaz contra a versão cl08smIL-31 de mIL-31 quandocomparado com a versão mIL-31-CEE sugere que o epítopo reconhecido pelo271.33.3.2.1 pode envolver parcialmente um sítio de glicosilação na moléculaIL-31.

Tabela 1: Atividade de Neutralização Com Base em Célula In Vitro de MAbsAnti-IL-31 de camundongo de Rato

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Exemplo 2

Geração de mAbs Anti-IL-31 Humana de CamundongoA. Imunização e Triagem Sérica de Camundongos

Dois grupos de camundongos BALB/c fêmeas de seis a oitosemanas de idade, cinco animais de cada, foram imunizados com IL-31humana. Os camundongos no Grupo 1 foram imunizados pela injeçãointraperitoneal de IL-31 humana purificada, recombinante fundida ao terminalC com um peptídeo que consiste da seqüência EYMPME (SEQ ID NO: 7)(daqui em diante aludido como IL-31-CEE) em combinação com adjuvante deRibi como pelas instruções do fabricante. Esta proteína foi produzida emcélulas BHK. Os camundongos no Grupo 2 foram similarmente imunizadoscom uma forma purificada, recombinante, mutada de IL-31 humana em que oresíduo de cisteína na posição 108 foi convertido a um resíduo de serina(daqui em diante aludido como cl08sIL-31). Este material foi produzido na E.coli sem o peptídeo C-EE. Todos os camundongos receberam 50 μg deproteína a cada duas semanas por um período de 10 semanas. Sete a dez diasdepois da terceira e quarta imunizações os camundongos foram sangrados porintermédio do plexo retroorbital e o soro separado do sangue para a análise dasua capacidade para inibir a ligação e atividade estimulatória subseqüente deIL-31 humana a uma linhagem de célula transfectada com a IL-RA humana.

A capacidade dos anti-soros individuais para inibir a IL-31humana foi avaliada usando um ensaio de neutralização com base emluciferase utilizando IL-31-CEE ou cl08sIL-31 e células BaF3/KZ134/IL-3 IRA/OS MRbeta (ver Exemplos 3 e 4) com as seguintes modificações. Osanti-soros individuais foram titulados em duplicata, por intermédio dediluições em série de 4 vezes em uma placa de 96 reservatórios, fundo chato,de polistiestireno branco (Corning/Costar 3917) partindo com uma diluição de1:250 inicial dos anti-soros em tampão de ensaio (RPMI 1640, 10% de FBS5 1mM de piruvato de sódio, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina Gsódica, 100 μg/ml de sulfato de estreptomicina). Em uma tentativa paranormalizar o efeito um tanto estimulador do soro de camundongo nesteensaio, todas as diluições exceto a diluição 1:250 inicial foram realizadas emtampão de ensaio mais 0,2% de soro de camundongo BALB/c normal. Ovolume de anti-soros diluídos em cada reservatório foi de 100 μl. As célulasforam lavadas 1,5 vez em tampão de ensaio, ajustado a uma concentração de3 χ 106/ml, combinadas com IL-31-CEE (100 pg/ml) ou cl08sIL-31 (30pg/ml) e a mistura depois adicionada às placas, 100 μΐ/reservatório. O volumede ensaio total foi de 200 μΐ/reservatório que consiste de 30.000 células, IL-31 em uma concentração final de 50 pg/ml (IL-31-CEE) ou 15 pg/ml(cl08sIL-31) e anti-soros a uma diluição final de 1:500, 1:2000, 1:8000,1:32000, 1:128000, 1:512000, 1:2048000 e 1:8192000. As placas foramincubadas a 37°C, 5% de C02 por 16 a 24 horas depois do que foramcentrifugadas a 1250 RPM por 5 minutos, o meio cuidadosamente removidocom um peteleco e 25 μΐ de Ix tampão de Iise de célula adicionado a cadareservatório. As placas foram suavemente agitadas por 10 minutos parapermitir a Iise de célula depois que 40 μΐ de substrato de ensaio de luciferasefosse adicionado a cada reservatório. Os reservatórios foram depois avaliadosquanto a atividade de luciferase (representando a ativação pelo IL-31 daconstrução repórter STAT) em um luminômetro usando um intervalo deintegração de 4 segundos.

No geral os anti-soros de camundongos imunizados com IL-31-CEE foram descobertos inibir eficazmente a atividade estimulatória tantode IL-31-CEE quanto de cl08sIL-31 e vice e versa, neste ensaio. Por estarazão, mais ensaios de neutralização foram usualmente realizados apenas comIL-31 -CEE.

Aqueles camundongos com os títulos de neutralização maisforte foram usados para uma série de três fusões com o objetivo de geraranticorpos monoclonais que produzem hibridomas que podem neutralizarmuito eficazmente a interação de IL-31 com seu receptor cognato.

B. Fusões

Fusão 291

A primeira fusão utilizou células de linfonodo de umcamundongo imunizado com IL-31-CEE e um camundongo imunizado comcl08sIL-31. Cada um destes animais foi imunizado por uma sexta vez com 15μg do respectivo imunógeno diluído em PBS e administrado por intermédiode injeção intravascular três semanas depois da sua última imunização. Trêsdias mais tarde, o baço e os linfonodos destes camundongos foram colhidos,combinados, processados em uma única suspensão de célula (total de 4,69 χ108 células) e depois fundidos a um clone da linhagem de célula de mielomade camundongo P3-X63-Ag8.653 (Kearney, J. F. et aL, J Immunol. 123:1548-50, 1979) (designado P3-X63-Ag8.653.3.12.11) a uma razão de 2,3:1 decélula linfóidexélula de mieloma com 3 ml de PEG 1500 por 2 minutos e 55segundos usando métodos padrão conhecidos na técnica (Lane, R. D. JImmunol Methods 81: 223-8, 1985). A mistura de fusão foi distribuída emuma série de placas de fundo redondo de 96 reservatórios, alimentadas umavez com uma substituição de 70% do meio depois de 4 dias e ensaiadas 6 diasmais tarde.

Fusão 292

A segunda fusão utilizou células linfóides de um camundongoimunizado com IL-31-CEE. Além das cinco imunizações intraperitoneaismencionadas acima, este camundongo recebeu uma injeção intravascular de15μg de IL-31-CEE em PBS três semanas depois da última injeçãointraperitoneal e uma injeção similar três semanas depois da primeiraimunização intravascular. Três dias mais tarde, o baço e linfonodos foramprocessados (total de 2,27 χ 10 células) e fundidos a P3-X63-Ag8.653.3.12.11 em uma razão 2:1 de célula linfóidexélula de mieloma com1,8 ml de PEG 1500 por 2 minutos e 55 segundos como descrito acima. Amistura de fusão foi distribuída em uma série de placas de fundo chato de 96reservatórios, alimentadas uma vez com uma substituição de 70% de meiodepois de 4 dias e ensaiadas 5 dias mais tarde.

Fusão 294

A última fusão utilizou células linfóides de um camundongoimunizado apenas com cl08sIL-31. Além das cinco imunizaçõesintraperitoneais com este antígeno descrito mais no princípio, estecamundongo recebeu uma injeção intravascular de 15 μg de cl08sIL-31 emPBS seis semanas depois da última injeção intraperitoneal e depois mais umavez duas semanas depois da primeira injeção intravascular. Três dias maistarde, o baço e linfonodos foram processados (total de 1,586 χ 10 células) efundido a P3-X63-Ag8.653.3.12.11 a uma razão de 2:1 de célulalinfóide:célula de mieloma com 1,5 ml de PEG 1500 por 2 minutos e 55segundos como descrito acima. A mistura de fusão foi distribuída em umasérie de placas de 96 reservatórios de fundo chato, alimentadas duas vezescom uma substituição de 70% de meio depois de 4 e 6 dias e ensaiados 3 diasdepois da última alimentação.

C. Triagem de Fusões

Todas as três fusões foram triadas usando o ensaio deneutralização de IL-31 com base em célula descrito acima com duasmodificações. Primeiro, ao invés de anti-soros diluídos nas placas de ensaio,100 μl de sobrenadante de cada um dos reservatórios nas placas de fusãoforam plaqueados em duplicata nas placas de ensaio. Segundo, a concentraçãofinal de IL-31-CEE na mistura de ensaio foi de 150 pg/ml.

Além do ensaio de neutralização, diversas placas de cadafusão, escolhidas aleatoriamente, foram triadas quanto aos anticorpos IgG quepodem ligar a IL-31-CEE que foram previamente adsorvidos em placasELISA de polistireno. O propósito deste ensaio foi identificar reservatóriosmestre contendo um hibridoma que produza um anticorpo anti-IL31 queneutralizou IL-31 de modo deficiente ou falhou completamente em neutralizaresta citocina. Neste ensaio, os reservatórios de placas de ELISA depoliestireno de 96 reservatórios foram inicialmente revestidos com 50μl/reservatório de IL31-CEE a uma concentração de 200 ng/ml em 0,1 M deNa2C03, pH 9,6. As placas foram incubadas durante a noite a 4°C depois queo antígeno não ligado foi aspirado e as placas lavadas duas vezes com 300μl/reservatório de PBS-Tween (0,137 M de NaCl, 0,0027 M de KCl, 0,0072M de Na2HP04, 0,0015 M de KH2P04, 0,05% v/v de polissorbato 20, pH7,2). Os reservatórios foram bloqueados com 200 μΐ/reservatório de PBS-Tween + 1% de BSA por 1 hora na temperatura ambiente (RT). A solução debloqueio foi depois removida com um peteleco das placas e 50 μΐ de meiocondicionado de cada reservatório das placas de fusão plaqueadas emduplicata nos reservatórios da placa de ensaio. As placas foram incubadas por1 hora na RT depois do que o anticorpo não ligado foi aspirado e as placaslavadas duas vezes com 300 μΐ/reservatório de PBS-Tween. IgG anti-camundongo de cabra conjugado a HRP, os anti-soros específicos de Fc(Jackson Immuno-research) foram diluídos a 1:5000 em PBS-Tween + 1% deBSA e adicionado aos reservatórios das placas de ensaio, 100 μΐ/reservatório.A seguir de uma incubação de 1 hora na RT, o anticorpo da segunda etapa nãoligado foi aspirado dos reservatórios e as placas lavadas 5 vezes. 100μΐ/reservatório de tetrametil benzidina (TMB) (BioFX Laboratories, OwingsMills, MD) foram depois adicionados a cada reservatório e as placasincubadas por 5 minutos na RT. O desenvolvimento de cor foi interrompidopela adição de 100 μΐ/reservatório de 450 nm de TMB Stop Reagent (BioFXLaboratories, Owings Mills, MD) e os valores de absorbância dosreservatórios lidos em um instrumento Molecular Devices Spectra MAX 340 a 450 nm.

Os resultados dos ensaios de neutralização mostrou que 52 e139 reservatórios nas Fusões 291 e 292, respectivamente, contiveram umanticorpo que inibiu pelo menos 40% da atividade estimulatória de IL-31.Uma definição mais rigorosa de positividade foi aplicada à fusão 294 onde foiobservado que 131 reservatórios contiveram um anticorpo que inibiu pelomenos 70% da atividade de IL-31. Os resultados de ensaios de ELISA paradetectar mAbs que se ligam a IL-31-CEE indicaram que em uma maioria decasos, se um reservatório mestre foi descoberto conter um anticorpo IgG quese liga a IL-31-CEE, este também conteve um anticorpo que inibiu IL-31-CEE no ensaio de neutralização com base em célula. Houve algunsreservatórios, entretanto, que foram positivos no ensaio de ELISA mas quemostrou capacidade inibitória relativamente fraca no ensaio de neutralizaçãocom base em célula e estes foram salvos para análise posterior como descritoabaixo.

As células de hibridoma que crescem nos reservatórios mestrepositivos foram expandidos em cultura em placas de 24 reservatórios. Quandoa densidade das culturas de 24 reservatórios foi aproximadamente 4 a 6 χ IO5células/ml, o sobrenadante (aproximadamente 1,5 ml) foi individualmentecoletado e armazenado para cada reservatório e as células de cada reservatóriocrioconservadas.

D. Seleção e Clonagem de Reservatórios Mestre para Isolar Hibridomas queProduzem Mabs Neutralizantes de IL-31 Potentes

Cada um dos novos sobrenadantes de 24 reservatórios foireanalisado quanto a capacidade de neutralização de IL-31 usando o ensaio deneutralização de IL-31 com base em célula utilizado na triagem de fusão.Cada sobrenadante foi conduzido não diluído e em duplicata. Os resultadosindicaram que a seguir da expansão, uma maioria dos sobrenadantes dereservatório mestre tiveram a atividade inibitória retida igual ou melhor doque aquele observado na triagem mestre original. Para melhor determinar qualdos novos sobrenadantes de reservatório mestre possuíam a capacidadeinibitória mais forte, aqueles sobrenadantes que demonstraramaproximadamente 90% ou melhor de inibição de IL-31-CEE neste ensaioforam reanalisados testando-se as diluições do sobrenadante no ensaio deneutralização com base em célula. Os sobrenadantes foram titulados porintermédio de diluições em 3 vezes seriais em meio de fusão nas placas deensaio para produzir 100 μl em cada reservatório das seguintes diluições:puro, 1:3, 1:9, 1:27, 1:81 e 1:243 e o ensaio realizado como descrito acimapara a triagem de fusão. Embora este ensaio claramente identificasse ossobrenadantes mais inibidores, o mesmo foi incapaz de determinar aquelesque tiveram a atividade específica mais alta porque a concentração deanticorpo anti-IL31 nos sobrenadantes foi desconhecida.

Para tratar o problema da concentração de anticorpoespecífico, cada um dos sobrenadantes foi testado no formato de titulação,usando as diluições de 2 vezes ou 4 vezes seriais, no IL-31-CEE no ensaio deELISA direto descrito acima. Depois de plotar os dados no MicrosoftEXCEL, a diluição de sobrenadante que produz metade da densidade óticamáxima (OD) observada no ensaio foi determinada que por sua vez forneceualguma indicação da concentração relativa de anticorpo anti-IL-31 nosobrenadante.

Combinando-se os dados do ensaio de neutralização comaquele do ensaio de ELISA, uma atividade específica relativa foi estabelecidapara cada sobrenadante e os vinte reservatórios mestre contendo a atividadeespecífica de neutralização anti-IL-31 mais alta identificada. De maneirainteressante, todos os reservatórios mestre neutralizadores anti-IL-31 maispotentes foram derivados da fusão 292. Foi observado nos dados deneutralização para estes reservatórios mestre que embora a inibição de IL-31máxima fosse obtida para cada sobrenadante no puro e diluição 1:3, o grauabsoluto de neutralização foi levemente maior para alguns sobrenadantes doque outros como refletido em contagens de unidade de luciferase relativalevemente mais baixas. Isto foi interpretado como graus levemente diferentesde neutralização de IL-31 "completa". Ligando-se esta observação com aatividade específica de neutralização relativa para cada reservatório mestre, alista dos vinte reservatórios mestre neutralizantes mais potentes foi reduzidaaos dez melhores aparentes. Estes incluíram 292,12, 292,39, 292,51, 292,63,292,64, 292,72, 292,84, 292,105, 292,109 e 292,118.

As células em cada um destes dez mais reservatórios mestre deIL-31 neutralizantes foram clonados de modo a isolar um hibridoma clonadoque produz o mAb neutralizante de interesse. As células foram clonadas emplacas de cultura de célula de microtítulo de 96 reservatórios usando ummétodo de diluição de densidade baixa padrão (menos do que 1 célula porreservatório) e a monoclonalidade foi avaliada pela examinação microscópicade reservatórios para um foco único de crescimento antes do ensaio. O meiode clonagem consistiu de meio de fusão que carece do componente HAT(IMDM, 10% de soro FC1, 2mM de L-glutamina, IXpenicilina/estreptomicina, 10% de fator de clonagem de hibridoma (RocheApplied Science). Seis a oito dias após o plaqueamento, os sobrenadantes emtodos os reservatórios foram triados pelo ELISA em IL-31-CEE ligado àplaca. As células de 4 a 6 reservatórios em cada conjunto em que osobrenadante foi fortemente positivo para o mAb específico e pareceu serapenas uma colônia única de hibridoma cultivada foram expandidas emculturas de 24 reservatórios e os sobrenadantes resultantes retestados peloELISA em IL-31-CEE ligado à placa e pelo ensaio de neutralização de IL-31com base em célula. Com base nestes resultados o clone neutralizador maispotente evidente em cada conjunto foi reclonado e triado pelo ELISA comodescrito acima. Se 95% ou mais dos reservatórios positivos em crescimentotambém foram positivos para o mAb específico, outros esforços desubclonagem foram julgados desnecessários e os hibridomas declaradosclonais. Apenas para um reservatório mestre, 292,64, houve uma segundarodada de subclonagem necessária para se obter a percentagem desejada depositividade de mAb específico entre os clones resultantes. As células de 5 a 6reservatórios em cada conjunto de subclone final em que o sobrenadante foifortemente positivo para o mAb específico e pareceu haver apenas uma únicacolônia de hibridoma cultivada foram expandidas em culturas de 24reservatórios. Cada um dos clones de hibridoma foi depois adaptado paracrescer em meio carecendo de fator de clonagem de hibridoma (IMDM, 10%de soro FC1, 2 mM de L-glutamina, IX penicilina/estreptomicina) dividindo-se as células no último meio quando a densidade de célula foi apropriada. Aseguir da adaptação, o sobrenadante foi coletado a partir dos subclones emcada conjunto e triado pelo ELISA na IL-31-CEE ligada à placa. Com base notítulo com respeito à densidade de célula no momento da coleta dosobrenadante, um clone final "melhor" foi escolhido levando à seleção doseguinte grupo de clones finais: 292.12.3.1, 292.39.5.3, 292.51.5.2,292.63.5.3, 292.64.6.5.5, 292.72.3.1, 292.84.1.6, 292.105.4.1, 292.109.4.4 e292.118.6.4.

O isotipo IgG de camundongo do mAb produzido por cada umdestes hibridomas foi determinado usando o teste IsoStrip de AnticorpoMonoclonal de Camundongo (Roche Applied Science). Todos os mAbs foramdescobertos pertencer à subclasse IgGl exceto por 292.72.3.1 e 292.84.1.6que foram mostrados pertencer à subclasse de IgG2a.

E. Classificação da Atividade de Neutralização Específica In Vitro de Mabs Neutralizadores de IL-31 Potentes

Para classificar a atividade neutralizadora específica in vitrodos dez mAbs anti-IL-31 de camundongo humana potente, o sobrenadanteexaurido de cada um dos clones da primeira rodada foi retestado no ensaio deneutralização com base em célula descrito mais no princípio. Primeiro, aquantidade de IgG em cada sobrenadante foi determinado pela análise deHPLC em uma coluna de proteína G usando um mAb de concentraçãoconhecida como um padrão. Cada sobrenadante foi depois diluído a umaconcentração de IgG de 1 μg/ml no mesmo meio usado para gerar osobrenadante exaurido. Os sobrenadantes diluídos foram depois titulados porintermédio da diluição em serial de 10 vezes em meio para produzir uma faixade concentração de 1 μg/ml a 0,0001 μg/ml e testado em triplicata no ensaiode neutralização com base em célula previamente descrito com aconcentração final de IL-31-CEE ajustado a 300 pg/ml (18,27 pM). Osresultados do ensaio são mostrados na Tabela 2 com os mAbs listados naordem do mais potente ao menos potente. MAbs 292.84.1 e 292.12.3 foram osneutralizadores mais potentes seguidos por sua vez pelos mAbs 292.72.3 e292.63.5 que pareceram ser aproximadamente metade tão potentes quanto osdois primeiros. O resto dos mAbs mostraram ser aproximadamente 6 a 9vezes menos potentes do que os dois melhores mAbs.

Tabela 2. Classificação dos MAbs Neutralizantes Anti-IL31 Potentes pelaAtividade de Neutralização Específica In Vitro

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* usando um peso molecular de anticorpo = 150.000 daltons

Com base nos resultados acima, os hibridomas 292.84.1.6,292.12.3.1, 292.72.3.1, 292.63.5.3 e 292.118.6.4 foram escolhidos comorepresentativos dos diferentes níveis de capacidade de neutralizaçãoespecífica para serem depositados com o depósito de patente da AmericanType Tissue Collection (ATCC, Manassas, VA) como um depósito originalsob o Tratado de Budapeste e foram concedidos os seguintes Acesso ATCCN-: clone 292.12.3.1 (Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815),clone 292.72.3.1 (Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816),clone 292.63.5.3 (Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829),clone 292.118.6.4 (Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830), eclone 292.84.1.6 (Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871).

F. Seleção e Clonagem de Reservatórios mestre para Isolar Hibridomas QueProduzem Mabs Neutralizadores de IL-31 Deficientes

De interesse na geração de mAbs anti-IL-31 humanos foi aisolação de pares de mAbs que poderiam ser usados em um formato de ensaiointercalado para quantificar a quantidade de IL-31 em fluidos diferentes. Taispares de mAbs tipicamente têm especificidade quanto a epítopos diferentes namolécula alvo e preferivelmente não competem cruzado quanto a ligaçãoàquela molécula. Para isolar pares candidatos de tais mAbs, uma estratégia foiescolhida para formar par com um excelente mAb neutralizador de IL-31 comum que possua pouco se algum potencial de neutralização, assumindo quedois de tais anticorpos funcionais diferentes estão com certeza ligados aepítopos não sobrepostos (espacialmente separados).

Como mencionado mais no princípio para as triagens de fusão,diversas placas de cada fusão foram tríadas pelo ELISA no IL-31-CEE ligadoà placa para identificar sobrenadantes de reservatório mestre positivos emanticorpo anti-IL-31. A comparação dos resultados de ELISA com aqueles doensaio de neutralização com base em célula indicaram a presença dereservatório mestre que continham anticorpo que se ligam bem ao IL-31-CEEmas não neutralizam esta molécula muito bem no ensaio de neutralização combase em célula. Como foi feito com o reservatório mestre neutralizador maispotente, as células de hibridoma que crescem nestes reservatórios mestreforam expandidas em cultura em placas de 24 reservatórios. Quando adensidade das culturas de 24 reservatórios foi de aproximadamente 4 a 6 χ IO5células/ml, o sobrenadante (aproximadamente 1,5 ml) foi individualmentecoletado e armazenado para cada reservatório e as células de cada reservatóriocrioconservadas.

Estes novos sobrenadantes foram testados usando o ensaio deneutralização com base em célula (diluições 3 vezes em série começando comsobrenadante puro e prosseguindo até uma diluição de 1:243 final) assimcomo um ensaio de ELISA no modo de "captura" similar àquele usado nodesenvolvimento do mAbs anti-IL-31 de murino de rato com as seguintesdiferenças; 1) IgG anti-camundongo de ovelha, anticorpo específico de Fc(Jackson Immunoresearch) (1 μg/ml) como anticorpo de revestimento deplaca, 2) placas bloqueadas uma vez com PBS-Tween +1% BSA por 1 hora,3) uma única titulação de cada sobrenadante adicionado aos reservatórios(diluições de 3 vezes em série começando com sobrenadante puro eprosseguindo até uma diluição de 1:2187 final) e 4) adição de IL-31-CEEbiotinilado (razão molar de 3:1 de biotina:proteína), 200 ng/ml. Este ensaiofoi sentido ser mais pertinente do que a ligação de anticorpo ao IL-31-CEEligado á placa visto que o mesmo avaliou a capacidade do anticorpo paraligar-se ao IL-31-CEE em solução, uma propriedade essencial para um bomanticorpo para os elisas no modo intercalado. Foi de fato observado quevários dos sobrenadantes de reservatório mestre contendo anticorpo que ligoubem ao IL-31-CEE ligado à placa deficientemente reconheceu esta molécula em solução.

Para escolher quais reservatórios clonar, os hibridomas quesecretam anticorpo apropriados de 10 reservatórios foram identificados(291.78, 292.152, 292.154, 294.35, 294.144, 294.146, 294.154, 294.155,294.158 e 294.163) cujo sobrenadante deficientemente neutralizou IL-31-CEE no ensaio de neutralização (menos do que 50% mais preferivelmenteapenas de 1 a 20%) e também ligou relativamente bem ao IL-31-CEE emsolução (como observado por uma OD de mais do que 2,0 na concentraçãopura de sobrenadante). A clonagem, triagem de clones e seleção de ummelhor clone da primeira rodada foram realizadas como descrito acima paraos reservatórios neutralizador potente.

Para reduzir o número de hibridomas realizando outrasubclonagem, dois novos ensaios foram realizados com sobrenadanteexaurido de cada um dos clones selecionados da primeira rodada. A primeiraavaliação foi uma tentativa para agrupar os mAbs com base na especificidadede epítopo ("compartimentação") usando o instrumento de ressonância deplasma de superfície Biacore 3000. Um dos bons sobrenadantes de mAbneutralizantes (292.64.6) e os 10 sobrenadantes de clone da primeira rodadade neutralização mais deficientes foram conduzidos um contra o outro eresultou na identificação de quatro "compartimentos" evidentes. OCompartimento 1 consistiu apenas do anticorpo neutralizante bom. OCompartimento 2 foi compreendido de 292.152.4, 292.154.4, 294 35.2,294.146.5 e 294.154.5. O Compartimento 3 incluiu 291.78.4, 294.155.6,294.158.5 e 294.163.2. O Compartimento 4 conteve apenas o 294.144.3. Osegundo ensaio envolveu uma repetição do ELISA no modo de "captura"apenas desta vez, por causa da concentração de anticorpo específico mais altanos sobrenadantes quando comparada com os sobrenadantes de culturaoriginal mestre de 24 reservatórios, uma curva de titulação mais completa foiobtida e deixada para a determinação de um EC50 para a ligação de anticorpoà IL-31-CEE. Os resultados são mostrados na Tabela 3 (junto com osresultados de compartimentação e a% de inibição da atividade de IL-31-CEEno ensaio de neutralização com base em célula) e indicaram que houve umaampla faixa em valores EC50 (e por dedução, a afinidade dos mAbs para IL-31-CEE) para os vários mAbs.

Tabela 3. Dados Resumidos para o Sobrenadante de Cultura de Clone daPrimeira Rodada de Hibridomas Neutralizadores de IL-31 Menos Potentes

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Com ênfase na seleção de hibridomas que produzem mAbsque foram 1) em compartimentos epitópicos diferentes daquele de um bommAb neutralizante (292.64.6) e 2) de afinidade mais alta como indicado poruma EC50 baixa no ensaio do modo de captura, apenas os clones da primeirarodada 294.35.2, 294.144.3, 294.154.5 e 294.163.2 foram levados ao estadode clone final como descrito acima para mAbs neutralizadores mais potentes.Este esforço de subclonagem adicional produziu a seleção do seguinte grupode clones finais: 294.35.2.6.3, 294.144.3.5, 294.154.5.6 e 294.163.2.1.

O isotipo IgG de camundongo do mAb produzido por cada umdestes hibridomas foi determinado usando o teste IsoStrip de AnticorpoMonoclonal de Camundongo (Roche Applied Science). Todos os quatromAbs foram descobertos pertencer à subclasse IgGl. As amostras de cada umdos quatro hibridomas foram depositadas com o depósito de patente daAmerican Type Tissue Collection (ATCC, Manassas, VA) como um depósitooriginal sob o Tratado de Budapeste e foram dados os seguintes Números deAcesso ATCC: clone 294.163.2.1 (Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6831), clone 294.35.2.6.3 (Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6872), clone 294.154.5.6 Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6875), e clone 294.144.3.5 (Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6873).

G. Reação cruzada de mAbs Anti-IL-31 humana de Camundongo com IL-31de camundongo

Todos os sobrenadantes de clone da primeira rodada dos dezmAbs neutralizadores potentes assim como dos dez mAbs neutralizadoresmenos potentes foram testados quanto a sua capacidade para reconhecer IL-31de camundongo pelo. ELISA em mIL-31-CEE ligado à placa. Nenhumareatividade cruzada foi observada com qualquer um dos mAbs indicando queos mAbs pareceram ter especificidade para a IL-31 humana. Além disso estesresultados mostraram que nenhum dos anticorpos reconheceram o rótulo depeptídeo CEE comum à extremidade de terminal C das moléculasrecombinates de IL-31 tanto humana quanto de camundongo usadas nestesestudos, uma determinação que não foi feita nos sobrenadantes dereservatório mestre originais.

Exemplo 3

Ensaio de Luciferase do Receptor IL-3 IRA/OS MRbeta

O plasmídeo KZ134 foi construído com oligonucleotídeoscomplementares que contêm elementos de ligação do fator de transcriçãoSTAT de 4 genes, que inclui um elemento indutível c-fos Sis modificado(m67SIE ou hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261: 1739-1744, 1993), op21 SIEl do gene p21 WAFl (Chin, Y. et al., Science 272: 719-722, 1996), oelemento de resposta de glândula mamária do gene de β-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. JT: 3745-3755, 1991) e um elemento indutívelpor STAT do gene Fcg RI, (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 92: 3041-3045, 1995). Estes oligonucleotídeos contêm extremidades compatíveisAsp718-XhoI e foram ligados, usando métodos padrão, em um vetor repórterda luciferase de vagalume receptor com um promotor c-fos (Poulsen, L. K. etal., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) digerido com as mesmas enzimas econtendo um marcador selecionável de neomicina. O plasmídeo KZ134 foiusado para transfectar células BaF3, usando métodos de transfecção e seleçãopadrão, para fabricar a linhagem de célula BaF3/KZ134.

Uma linhagem de célula indicadora BaF3/KZ134 estável, queexpressa a IL-31RA de tamanho natural ou o receptor IL-3IRA/OS MRbetafoi construída. Os clones foram diluídos, plaqueados e selecionados usandotécnicas padrão. Os clones foram triados pelo ensaio de luciferase (ver B,abaixo) usando o meio condicionado de IL-31 humana ou proteína de IL-31purificada como um indutor. Os clones com a resposta de luciferase mais alta(por intermédio do STAT luciferase) e o fundo mais baixo foramselecionados. As linhagens de célula de transfectante estáveis foramselecionadas. As linhagens de célula foram chamadas de BaF3/KZ134/IL-3 IRA ou BaF3/KZ134/IL-3 IRA/OS MRbeta dependendo dos receptorestransfectados na linhagem de célula.Similarmente, as linhagens de célula BHK também foramconstruídas usando os métodos aqui descritos e foram usadas nos ensaios deluciferase aqui descritos. As linhagens de célula foram chamadas deBHK/KZ 13 4/IL-3 IRA ou BHK/KZ 13 4/IL-3 IRA/OS MRbeta dependendodos receptores transfectados na linhagem de célula.

As células BaF3/KZ134/IL-31RA e BaF3/KZ134/IL-3 IRA/OS MRbeta foram giradas e lavadas em meio isento de mIL-3. Ascélulas foram giradas e lavadas 3 vezes para garantir a remoção de mIL-3. Ascélulas foram depois contadas em um hemocitômetro. As células foramplaqueadas em um formato de 96 reservatórios a cerca de 30.000 células porreservatório em um volume de 100 μΐ por reservatório usando o meio isentode mIL-3. O mesmo procedimento foi usado para as células BaF3/KZ134 nãotransfectadas para o uso como um controle no ensaio subseqüente. As célulasBHK/KZ 134/IL-3 IRA ou BHK/KZ 134/IL-3 IRA/OS MRbeta foramplaqueadas em um formato de 96 reservatórios a 15.000 células porreservatório em meio de 100 μΐ. as células BHK/KZ 134 precursoras foramusadas como um controle.

A ativação por STAT das células BaF3/KZ134/IL-31RA,BaF3/KZ134/IL-3 IRA/OSMRbeta, BHK/KZ 13 4/IL-3 IRA ouBHK/KZ 134/IL-3 IRA/OSMRbeta é avaliada usando meio condicionado ouproteína purificada. Cem microlitros do meio condicionado diluído ouproteína são adicionados às células BaF3/KZ134/IL-31RA, BaF3/KZ134/IL-3 IRA/OSMRbeta, BHK/KZ 13 4/IL-3 IRA ou BHK/KZ 13 4/IL-3 IRA/OSMRbeta. O ensaio usando o meio condicionado é feito em paralelo em célulasBaF3/KZ134 ou BHK/KZ134 não transfectadas como um controle. O volumede ensaio total é de 200 μΐ. As placas de ensaio são incubadas a 37° C, 5% deCO2 por 24 horas tempo no qual as células BaF3 são pelotizadas pelaconfiguração a 2000 rpm por 10 min. e o meio é aspirado e 25 μΐ de tampãode Iise (Promega) são adicionados. Para a linhagem de célula BHK, a etapa decentrifugação não é necessária visto que as células são aderentes. Depois de10 minutos na temperatura ambiente, as placas são medidas quanto a ativaçãoda construção repórter de STAT lendo-as em um luminômetro (LabsystemsLuminoskan, modelo RS) que adicionou 40 μΐ de substrato de ensaio deluciferase (Promega) em uma integração de cinco segundos.

Exemplo 4

Ensaio de Luciferase em Linhagens de Célula Epitelial TransformadaHumana por Intermédio da Infecção Transitória com um Gene RepórterSTAT/SRE Adenoviral

A inibição, redução e/ou neutralização da atividade de IL-31podem ser medidas pelo ensaio de luciferase. Por exemplo, as linhagens decélula humana transformada podem ser semeadas em placas de fundo chatode 96 reservatórios a 10.000 células/reservatório em meio de crescimentoregular como especificado para cada tipo de célula. No dia seguinte, as célulassão infectadas com uma construção repórter de adenovírus, KZ13 6, a umamultiplicidade de infecção de 5000. O repórter KZl36 contém os elementosSTAT além de um elemento de resposta de soro. O volume total é de 100μl/reservatório usando DMEM suplementado com 2 mM de L-glutamina(GibcoBRL), 1 mM de Piruvato de sódio (GibcoBRL) e Ix suplemento deInsulina-Transferrina-S elênio (GibcoBRL) (a seguir aludido como meioisento de soro). As células são cultivadas durante a noite.

No dia seguinte, o meio é removido e substituído com 100 μΐde meio de indução. O meio de indução é a IL-31 humana diluída em meioisento de soro a 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125ng/ml e 1,56 ng/ml. Um controle positivo de 20% de FBS é usado para validaro ensaio e para garantir que a infecção pelo adenovírus seja bem sucedida. Ascélulas são induzidas por 5 horas tempo no qual o meio é aspirado. As célulassão depois lavadas em 50 μΐ/reservatório de PBS e subseqüentemente lisadasem 30 μΐ/reservatório de IX tampão de Iise de célula (Promega). Depois deuma incubação de 10 minutos na temperatura ambiente, 25 μΐ/reservatório delisado são transferidos para placas brancas opacas de 96 reservatórios. Asplacas são depois lidas no Luminômetro usando a integração de 5 segundoscom injeção de 40 μΐ/reservatório de substrato de luciferase (Promega).

Exemplo 5

Inibição da Produção de Citocina pelos Anticorpos IL-31

A IL-31 mostrou estimular a produção de IL-6 em DU145(linhagens de célula doentes e normais); assim como estimular uma linhagemde célula A549 (doente e normal) para estimular a produção de IL-8 e parareduzir a produção de IL-8 em linhagens de célula U20S (doente e normal).Ver o pedido de patente U.S. publicado (Ver, a publicação número20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003). Visto que a atividade dosanticorpos monoclonais IL-31 aqui descritos pode ser medida por umainibição, redução e/ou neutralização da atividade de IL-31 nestas linhagens decélula epitelial de estado de doença humana.

A. Inibição da Produção de Citocina pela linhagens de célula epitelial deestado de doença humana cultivadas com IL-31 humana

As células são plaqueadas a uma densidade de 4,5 χ IO5células por reservatório em uma placa de 6 reservatórios (Costar) e cultivadasno respectivo meio de cultivo. As células são cultivadas com reagentes deteste; 100 ng/ml de IL-31 (com e sem a inoculação de anticorpo), 10 ng/ml deInterferon gama (IFN gama) (R&D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng/ml deFator alfa de Necrose de Tumor (TNF alfa) (R&D Systems, Minneapolis,MN), 10 ng/ml de IL-Ibeta (R&D Systems, Minneapolis, MN) ou 100 ug/mlde Lipopolissacarídeo (LPS) (Sigma). Os sobrenadantes são colhidos em 24 e48 horas e ensaiados quanto às citocinas; GM-CSF (Fator Estimulador deColônia de Granulócito-Macrófago), IL-lb, IL-6, IL-8, MCP-I (Proteína 1Quimioatraente de Macrófago) e TNFa. Os kits Multiplex Antibody Bead daBioSource International (Camarillo, CA) foram usados para medir citocinasnas amostras. Os ensaios são lidos em um instrumento Luminex-100(Luminex, Austin, TX) e os dados são analisados usando o softwareMasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA). A produção de citocina (pg/ml) paracada linhagem de célula nas amostras de 24 horas é medida.

B. Inibição da Produção de Citocina pelas linhagens de célula epitelialhumana normal cultivadas com IL-31 humana

As células são plaqueadas a uma densidade de 1 χ IO5 célulaspor reservatório em uma placa de 24 reservatórios e cultivadas com reagentesde teste; 1000 ng/ml, 100 ng/ml e 10 ng/ml de IL-31 (com e sem inoculaçãode anticorpo), 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de OSM, 10 ng/ml de IFNa, 10ng/ml de TGFb ou 10 ng/ml de Linfotactina. Os sobrenadantes são colhidosem 24 e 48 horas e ensaiados quanto as citocinas; IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-la,RANTES e Eotaxina. As citocinas são ensaiadas como previamente descrito.A produção de citocina (pg/ml) para cada linhagem de célula nas amostras de48 horas é medida.

C. Inibição da Produção de Citocina pela linhagens de célula epitelial deestado de doença humana co-cultivada com IL-31 humana e IFN gama

As células são plaqueadas a uma densidade de 2 χ 105 célulaspor reservatório em placa de 24 reservatórios e co-cultivadas com 10 ng/ml deIFN gama +/- IL-31 a 100 ng/ml, 10 ng/ml ou 1 ng/ml. Os sobrenadantesforam coletados em 24 e 48 horas e ensaiados f (com e sem inoculação deanticorpo) ou IL-8 e MCP-1. A produção de citocina (pg/ml) para cadalinhagem de célula nas amostras de 24 horas é medida.

Exemplo 6

Inibição dos Efeitos de IL-31 sobre a Adesão de monócito U937 àMonocamada de Célula Endotelial da Medula Óssea Transformada(TRBMEC)

Foi mostrado que a IL-31 sinergizada pode efetuar a aderênciabasal de células U937 às monocamadas endoteliais. Em particular, a IL-31sinergizada com TNFalfa e ainda realçou a adesão de U937. Ver o pedido depatente U.S. publicado (Ver, a publicação número 20030224487, Sprecher,Cindy et al., 2003. Assim a inibição de IL-31 pelos anticorpos anti-IL-31 aquidescritos pode ser medida com o seguinte ensaio.

As Células Endoteliais da Medula Óssea Transformada(TRBMEC) são semeadas em clusters de tecido de 96 reservatórios (Falcon) auma densidade de 25.000/reservatório em meio M131 (Cascade Biologics)suplementado com Suplemento de Crescimento Microvascular (MVGS)(Cascade Biologics). Na confluência (24 horas mais tarde), as células sãotrocadas para Ml 99 (Gibco-Life Technologies) suplementado com 1% deSoro Bovino Fetal (Hyclone). A IL-31 recombinante humana (reagente deteste) é adicionada em várias concentrações (de 0,4 a 10 ng/ml) com e sem ainoculação de anticorpo, para testar quanto ao efeito da proteína nasinterações de célula imune-célula endotelial que resultam na adesão. Algunsreservatórios recebem 0,3 ng/ml de Fator de Necrose de Tumor (TNFalfaR&D Systems), uma citocina pró-inflamatória conhecida, além da IL-31, paratestar um efeito da proteína sobre as células endoteliais sob condiçõesinflamatórias. TNFalfa sozinho a 0,3 ng/ml é usado como controle positivo ea concentração usada representa aproximadamente 70% do efeito de TNFalfamáximo neste sistema, isto é, não induz a aderência máxima de células U937(uma linhagem de célula como monócito humano) para o endotélio. Por estarazão, este ajuste pode detectar tanto a super regulagem quanto a infraregulagem dos efeitos de TNFalfa. Os níveis basais de adesão tanto com esem TNFalfa são usados como referência para avaliar o efeito de reagentes deteste.

Depois da incubação durante a noite das células endoteliaiscom os reagentes de teste, as células U937, tingidas com 5 μΜ de marcadorfluorescente Calceína-AM (Molecular Probes), as células são colocadas emsuspensão em RPMI 1640 (nenhum vermelho de fenol) suplementado com1% de FBS e plaqueadas a 100.000 células/reservatório na monocamada deTRBMEC enxaguada. Os níveis de fluorescência nos comprimentos de ondade excitação/emissão de 485/538 nm (leitora de micro-placa MolecularDevices, aplicação em CytoFluor) são medidos 30 minutos mais tarde, antes edepois de enxaguar o reservatório três vezes com RPMI 1640 quente (nenhumvermelho de fenol), para remover a U937 não aderente. Os níveis defluorescência pré-enxágüe (total) e pós-enxágüe (específica de aderência) sãousados para determinar a aderência percentual (aderente líquido/total líquidoχ 100 =% de aderência).

Exemplo 7

Protocolo do Bioensaio de IL-31

As células BAF3 transfectadas com hzCYTOR17 (IL-31RA),hOS MRB e KZ134 são cultivadas a 5 χ IO5 e 1 χ IO6 células/ml. As célulassão lavadas com meio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FBS, L-Glutamina,Piruvato de sódio e Pen/Strep (todos Gibco)) e recolocadas em suspensão a 3χ 105 célula/ml em meio de ensaio. Em uma placa opaca de 96 reservatórios,os padrões de hIL-31 são titulados em duplicata a partir de 600 pg/ml a 9,38pg/ml em meio de ensaio por intermédio de 100 μl/reservatorio, de umadiluição 1:2 em série. Os padrões de controle de qualidade são adicionadosem duplicata à placa a 350 pg/ml e 35 pg/ml em 100 μl,. As amostras de testesão freqüentemente diluídas a 1:2 ou 1:4 e adicionadas em duplicata aosreservatórios de amostra. 100 μι das células são adicionadas a cadareservatório para uma concentração final de 3 χ 104 células/reservatório. Aplaca é incubada por 16 a 24 horas a +37° C em um incubador a 5% de CO2.A placa é centrifugada a 1200 RPM por 5 minutos, o meio removido com umpeteleco e 25 μl/resevatorio de tampão de lise (Promega) adicionados a cadareservatório. Depois de 10 minutos a placa é lida em um luminômetro(Berthold). O luminômetro adiciona 40 μl/reservatorio de mistura desubstrato de luciferase (Promega) e integrou a luminescência por um períodode 4 segundos. Os valores de luminescência são exportados para uma planilhaonde os mesmos são analisados e convertidos em picogramas de IL-31 por106 células por ml de volume.

Exemplo 8

Envolvimento de IL-31 no Início e Perpetuação da Hiper-Sensibilidade deContato In Vivo

Método I

Camundongos BALB/c são pintados no dorso raspado com 25μl de DNFB a 0,5% dissolvido (2,4, dinitro-fluoro-benzeno, Sigma, St. LouisMO) em solução de acetona:óleo de oliva (4:1) usando um pipetador. Umgrupo de controle de veículo recebe apenas 25 μΐ de acetona:óleo de oliva.Depois de 5 dias, os camundongos são anestesiados com isofluorano em umacâmara de inalação e as aurículas tanto dos animais experimentais quanto dosde controle são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) parase obter uma medição de referência. Os camundongos são depois inoculadosaplicando-se 10 μΐ de DNFB a 0,25% em acetona:óleo de oliva (4:1) a ambosos lados de cada orelha de todos os camundongos. A hiper-sensibilidade decontato é medida em 24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelhadireita (inoculada) e a orelha esquerda (não inoculada). Todas as mediçõessão feitas com um micrômetro de engenheiro. Os valores de fundo sãodeterminados pela diferença no inchaço da orelha entre as orelhas inoculadase não inoculadas de camundongos ingênuos.

O sangue integral e o soro para a análise de FACS e/ou ELISAsão coletados antes do sacrifício e as orelhas são coletadas para histologia.

Método II flnduz respostas Th2)

Camundongos BALB/c são pintados no dorso raspado com100 μl de FITC a 0,5% (isotiocianato de fluoresceína) em uma solução 1:1 deacetona/ftalato de dibutila (MSDS disponível usando pipetador nos dias 1, 2 e8. No dia 13, os camundongos são anestesiados com isofluorano em umacâmara de inalação e as aurículas tanto dos animais experimentais quanto dosde controle são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) parase obter uma medição de referência. Os camundongos são inoculados pelaaplicação de 25 μl de FITC a 0,5% (em 1:1 acetona/ftalato de dibutila) àsuperfície dorsal de cada orelha. A hiper-sensibilidade de contato é medida a24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelha direita (inoculada) e aorelha esquerda (não inoculada). Todas as medições são feitas com ummicrômetro de engenheiro. Os valores de fundo são determinados peladiferença no inchaço da orelha entre a orelha inoculada e a não inoculada decamundongos ingênuos. O sangue integral e o soro para as análises de FACSe/ou ELISA são coletados antes do sacrifício e as orelhas são coletadas parahistologia.

Método III (induz respostas Th 1)

Os camundongos BALB/c são pintados no dorso raspado com25 μl de oxazalona a 2% (em 4:1 de acetona/óleo de oliva) usando pipetador.No dia 7, os camundongos são anestesiados com isofluorano em uma câmarade inalação e as aurículas tanto dos animais experimentais quanto dos decontrole são medidas com um micrômetro de engenheiro (Mitutoyo) para seobter uma medição de referência. Os camundongos são inoculados aplicando-se 8 μl de oxazalona à superfície dorsal de cada orelha. A hipersensibilidadede contato foi medida a 24 h e 48 h mais tarde como a diferença entre a orelhadireita (inoculada) e a orelha esquerda (não inoculada). Todas as mediçõessão feitas com um micrômetro de engenheiro. Os valores de fundo sãodeterminados pela diferença no inchaço da orelha entre as orelhas inoculadase as não inoculadas de camundongos ingênuos. O sangue integral e o soropara as análises de FACS e/ou ELISA são coletados antes do sacrifício e asorelhas são coletadas para histologia.

O envolvimento de IL-31 no início e perpetuação da hiper-sensibilidade de contato é testado usando os anticorpos aqui descritos contraIL-31 tanto na fase de sensibilização quanto na de inoculação do experimento.

Exemplo 9

Envolvimento de IL-31 na Dermatite Atópica In VivoMétodos I (Sensibilização de camundongos NC/Nga)

Camundongos NC/Nga machos foram adquiridos da CRLJapão. Os camundongos tiveram 4 semanas de idade na chegada e alojadosem condições de quarentena SPF por 4 semanas para aclimatrem. Oscamundongos tiveram aproximadamente 10 a 11 semanas de idade no inícioda sensibilização com antígeno. Os camundongos foram anestesiados comisofluorano e os dorsos foram raspados com tesoura elétrica.Aproximadamente 10 μg de extrato Dermatophagoides pteronyssinus (Dp)(Indoor Biotechnologies, encomenda especial) foi injetado intradermicamentena nuca do pescoço 3 vezes por semana por 5 a 6 semanas até que oscamundongos desenvolvessem lesões de pele. Os animais de controlereceberam 10 μl de injeções intradérmicas de PBS 3 vezes por semana. Oextrato de Dp foi preparado de acordo com o método por Matsuoka e colegas.Matsuoka H., et ai., Allergy: 58, 139 (2003). Em resumo, 595 mg de extratode cultura gasta de Dp liofilizado foram dissolvidos em 12 ml de PBS estéril(Gibco). O Dp foi misturado em um tubo Falcon de 50 ml em um oscilador deagitação por 30 minutos. O extrato foi girado por 10 minutos a 2000 rpm e osobrenadante foi coletado e aliquotado em tubos criofrasco de 1 ml earmazenados a -20°C.

Métodos II (Sensibilização de camundongos DO11.10)

Camundongos transgênicos DO11.10 foram gerados a partir deuma colônia interna e foram entre 9,5 e 14 semanas de idade no início dasensibilização com antígeno. 24 horas antes da sensibilização epicutânea oscamundongos foram anestesiados com isofluorano e o tronco inteiro (dorso eabdômen) dos camundongos foi raspado com tesoura elétrica. Oscamundongos foram depois listrados com fita com fita cirúrgica Elastin(Johnson e Johnson) no dorso. 1 cm de pedaços de gase estéril foramumedecidos com 500 μg de ovalbumina (Calbiochem 32467) ou PBS estéril(Gibco) e aderidos às nádegas esquerdas dos camundongos com DuoDermExtra Thin Dressing (ConvaTec 187932). O emplastro e o curativo foramdepois cobertos em uma coberta de corpo da fita cirúrgica Elastin de modoque os camundongos não pudessem remover ou destruir os emplastros. Osemplastros foram usados por 7 dias e removidos. Os camundongos foramrepousados por duas semanas antes de ter uma outra rodada de sensibilizaçãoepicutânea. Os camundongos receberam um total de três sensibilizações porsemana.

Resultados

A análise de imunoistoquímica da expressão de IL-31RA empele lesional e não lesional de animais NC/Nga sensibilizados com ácaro depoeira e DO11.10 sensibilizados com OVA mostrou que IL-31RA éexpressado pelos queratinócitos epidérmicos em camundongos, entretantonenhuma diferença significante nos níveis de expressão pôde ser encontradaentre os animais sensibilizados com antígeno versus sensibilizados com PBS.

Exemplo 10

Inibição de Coceira pela Administração de Anticorpos anti-IL-31 decamundongo de rato

Em um outro estudo com camundongo NC/Nga, camundongosNC/Nga machos (SLC, Tóquio), idade de 4 semanas foram expostos aoscamundongos NC/Nga que já exibiam dermatite branda a moderada. Em setesemanas os camundongos foram divididos em três grupos e receberam osseguintes tratamentos. A cada quinto dia por sete semanas os camundongosem um grupo foram administrados com injeções de IL-31 anti-camundongode rato a 10 mg/kg; um grupo foi administrado com injeções de albuminasérica de camundongo; e o terceiro grupo não recebeu nenhum tratamento. Oscamundongos foram avaliados clinicamente duas vezes por semana quanto agravidade das lesões de pele. Especificamente, o envolvimento da pele (0 =nenhum envolvimento; 1 = dorso envolvido; 2 = dorso e face; 3 = dorso, facee orelhas) e a gravidade das lesões (0 = pele normal; 1 = escamosa e seca; 2 =lesões nodulares; 3 = lesões sanguinolentas). Além disso, a coceira foiavaliada. A coceira do camundongo usando as suas patas traseiras foiautomaticamente detectada e objetivamente avaliada usando MicroAct(Neuroscience, Tóquio, Japão). Um magneto revestido com Teflon pequenofoi implantado subcutaneamente no lado dorsal de ambas as patas traseirasdos camundongos sob anestesia de Ketalar/Xilazina. Os camundongos commagnetos foram colocados em uma câmara de observação circundada por umbobina em volta. A corrente elétrica induzida na bobina pelo movimento dosmagnetos foi amplificado e registrado. O programa de análise usou osseguintes ajustes para registrar os eventos de coceira: Patamar (V) 0,1;Intervalo de Evento (s) 0,2; Questão Máx (HZ) 20,0; Questão Min (Hz) 2,0; eDuração Min (s) 1,5. Nota: no modelo de camundongo NC/Nga, ocomportamento de coceira de longa duração (> 1,5 s), mas não o de curtaduração (0,3 a 1,5 s) estão relacionados com a sensação de coceira específicada dermatite em camundongos. Os pontos finais primários globais medidosforam coceira, dermatite e peso corporal.

Resultados:

Assumindo o período inteiro, o tratamento com o anticorpo anti-IL-31 de camundongo de rato não atingiu os pontos de final primários. Entretanto,a análise adicional revelou uma redução significante de coceira pelo tratamentocom o anticorpo anti-IL-31 no mesmo intervalo de tempo de 22 a 43 dias. Nesteperíodo de tempo, como para o período inteiro, o tratamento com anticorpos anti-11-31 não afetou o desenvolvimento de lesões como a dermatite atópica e nãonormalizou o ganho de peso dos animais doentes, talvez devido ao iníciodemorado das manifestações clínicas ou pelos auto-anticorpos neutralizadores notérmino do tratamento. Neste experimento, o comportamento de coceira, mas nãode dermatite, já foi aumentado entre a maioria dos animais no tempo quando otratamento com o anticorpo foi iniciado.

Exemplo 11

Envolvimento de IL-31 em DTH In Vivo

Métodos

Para gerar uma resposta DTH3 camundongos foramsensibilizados ao antígeno no dia 0 pela imunização subcutânea na base dacauda com 100 μg de ovalbumina (OVA) em Adjuvante Completo de Freund(CFA, 50 a 100 μΐ de volume total). Uma semana mais tarde os camundongosforam anestesiados com isofluorano em uma câmara de inalação e ambas asaurículas de animais experimentais e de controle foram medidos com ummicrômetro de engenheiro (Mitutoyo) para se obter uma medição dereferência. Os camundongos foram inoculados intradermicamente com 10 μgde OVA em PBS em um volume total de 10 μΐ η aurícula da orelha esquerda,exatamente abaixo da pele sem acertar nenhuma veia. Como um controle, oscamundongos também receberam uma injeção de 10 μΐ de PBS na aurícula daorelha direita. Em alguns casos, um grupo de controle separado administradocom uma injeção i.d. de OVA na orelha também pôde ser tratado comcorticosteróides tópicos como um controle positivo para inibir a reação. Nas24 e 48 horas depois da inoculação, os camundongos foram anestesiados e aespessura das orelhas foi medida. Os resultados foram expressados como:Inchaço de orelha específico = (medição em 24 horas - medição em 0 hora)para a orelha experimental - (medição em 24 horas - medição em 0 hora) paraa orelha de controle negativo. Endurecimento, a marca da DTH, é detectávelem 18 horas depois da injeção de antígeno sensibilizado e é máximo em 24 a48 horas. O atraso no início do endurecimento palpável é a razão para nomeara resposta "tipo demorado."

Resultados

Camundongos transgênicos em IL-31 foram testados quanto aDTH, entretanto, devido a um aumento na espessura da orelha nos animaistransgênicos em IL-31 não inoculados, nenhuma diferença estatisticamentesignificante no DTH pôde ser determinado entre os animais IL-31 Tgcomparados com os controles do tipo selvagem. Os animais silenciados noreceptor de IL-31 também foram testados em uma resposta DTH e nenhumadiferença significante na resposta de DTH pôde ser observada entre osanimais silenciados no receptor e do tipo selvagem.

Exemplo 12

Envolvimento de IL-31 na Indução da Resposta à Coceira

Métodos I (tratamento com Capsaicina de camundongos tratados com IL-31)

Os animais BALB/c de dez semanas de idade (CRL) foramanestesiados e injetados com um agente analgésico de longa duração,cloridreto de bupranorfina, subcutaneamente a 0,1 mg/kg antes da injeção de0,25 ml de solução a 4 mg/ml de capsaicina em 10% de etanol + 10% deTween-80 em solução salina subcutaneamente na nuca do pescoço. Osanimais foram mantidos anestesiados por pelo menos 30 min a seguir dotratamento com a neurotoxina. Quarenta e oito horas mais tarde, bombasosmóticas de 14 dias foram implantadas subcutaneamente para a liberaçãocontínua de 20 μg/dia de IL-31 por 14 dias. Os camundongos forammonitorados diariamente por 6 dias quanto a alopecia e prurido usando osseguintes critérios: 0 = nenhuma coceira, o animal parece normal, 1 =afinamento da pelagem em áreas pequenas, coceira observada, 2 = perda depelo menor (pequenos pedaços), coceira, 3 = perda de pelo moderada, coceirae 4 = perda de pelo grave, coceira excessiva.

Os resultados demonstraram que embora os camundongos nãotratados com a capsaicina mostrassem uma contagem de coceira/perda de pelomédia de 2,625 a seguir de três dias de liberação de IL-31, os camundongostratados com a capsaicina mostraram uma contagem significante mais baixade 1. Assim os camundongos tratados com capsaicina antes da liberação daIL-31 mostraram tanto uma demora na incidência de coceira e perda de peloquanto uma contagem mais baixa na intensidade da coceira e perda de pelonos seis dias do experimento. Estes dados sugerem que IL-31 não induznenhum componente neuronal que contribua para a alopecia e pruridoinduzidos pela IL-31. Portanto, a neutralização de IL-31 pode diminuir aincidência e intensidade da coceira e portanto da dermatite, em pacientes quesofrem de distúrbios de pele que envolvem a coceira.

Métodos II

Camundongos que são homozigotos nulos quanto ao geneTacl não expressam nenhuma substância P ou neurocinina detectáveis. Estescamundongos têm respostas à dor nociceptiva significantemente reduzidas aoestímulo de moderado ao intenso e são portanto uma ferramenta útil paraestudar a contribuição dos peptídeos de taquicinina para o processamento dador/coceira e estados de doença inflamatória. Camundongos silenciados emTacl de doze semanas de idade, foram implantados com bombas osmóticas de14 dias liberando 1 μg/dia de proteína IL-31 e observados diariamente quantoa alopecia e prurido usando os seguintes critérios: O = nenhuma coceira, oanimal parece normal, 1 = afinamento da pelagem em áreas pequenas, coceiraobservada, 2 = perda de pelo menor (pequenos pedaços), coceira, 3 = perda depelo moderada, coceira e 4 = perda de pelo grave, coceira excessiva.

Os resultados deste estudo mostra que os camundongosdeficientes em Tacl foram menos suscetíveis à coceira/perda de peloinduzidos pela IL-31 comparados com os camundongos de controle do tiposelvagem. Embora 100% (10/10) dos camundongos do tipo selvagemtivessem desenvolvido evidência de coceira e perda de cabelo em 6 dias detratamento com IL-31, apenas 33,3% (2/6) dos camundongos deficientes emTacl mostraram sinais de coceira e perda de cabelo no mesmo ponto detempo. Estes dados mostram que a IL-31 induz um componente neuronal quecontribui para o fenótipo de coceira/perda de cabelo em camundongostratados com IL-3 Iea neutralização de IL-31 pode diminuir a incidência eintensidade da coceira no contexto da dermatite.

Métodos III (Administração de anticorpos neutralizantes de IL-31)

Camundongos BALB/c fêmeas normais (CRL) deaproximadamente 8 a 12 semanas de idade foram implantadossubcutaneamente com bombas osmóticas de 14 dias (Alzet, #2002) liberando1 μg/dia de mIL-31. Os grupos de camundongos receberam injeçõesintraperitoneais (i.p.) de anticorpo monoclonal anti-IL-31 de camundongo derato 10 mg/kg (200 μg/camundongo) duas vezes por semana começando 1semana antes da liberação de IL-31. Os grupos de controle de camundongosrecebeu injeções i.p. de veículo (PBS/0,1% BSA) com os programas dedosagem idênticos. Os camundongos foram contados diariamente quanto aalopecia e prurido usando os seguintes critérios: 0 = nenhuma coceira, oanimal parece normal, 1 = afmamento da pelagem em áreas pequenas, coceiraobservada, 2 = perda de pelo menor (pequenos pedaços), coceira, 3 = perda depelo moderada, coceira e 4 = perda de pelo grave, coceira excessiva.

Em todos os experimentos, os camundongos tratados commAb anti-mIL-31 de rato tiveram uma demora no início dos sintomas deaproximadamente 5 a 7 dias e uma contagem global mais baixa quanto aalopecia e prurido. Todos os grupos de camundongos tratados com mAb(independente da freqüência de dose ou concentração) desenvolveramalopecia e prurido similares aos camundongos de controle em 13 dia doestudo. Estes dados sugerem que a neutralização de IL-31 pode retardar oinício da resposta à coceira/perda de cabelo induzida pela IL-31.

Exemplo 13

Caracterização de Anticorpos monoclonais anti-ser humano de CamundongoIL-31

Um painel de 21 anticorpos monoclonais (mAbs) queproduzem hibridomas clonais específicos para a interleucina 31 (IL31)humana (recombinante) foi isolado. Dez mAbs fortemente neutralizantes queproduzem hibridomas foram isolados. Estes foram designados a dois sub-compartimentos com base nos estudos de ligação competitiva. Onze mAbsfracamente neutralizantes que produzem hibridomas foram isoladas. EStesforam designados a 4 compartimentos adicionais com base em estudos deligação competitiva. Um mAb funcionou bem para a Western Blotting etambém funcionou bem para a imunoistoquímica. Três mAbs adequados parao uso como antagonistas competitivos foram identificados. Os anticorposmonoclonais adequados para o uso em immunoensaios intercalados tambémforam identificados.

A. Compartimentação de Epítopo por Biacore

Materiais: O anticorpo de captura foi IgG anti-camundongo decabra - específico de Fcy (Jackson #115-005-071); o anticorpo de bloqueio foio fragmento Fc de IgG policlonal (Jackson Labs.); o antígeno: rIL31Produzido em BHK com um rótulo de afinidade de CEE; Biacore 1000; chipativado por Biacore CM5 NHS (Biacore, PN BR-1000-14).

Método: Os estudos foram realizados em um sistemaBiacore 1000®. BIAlogue v. 1.2 foi usado para programar métodos decondução. O anticorpo Fc anti-camundongo de cabra foi covalentementeimobilizado a um chip Biacore CM5 por intermédio de resíduos de lisina paraformar a superfície de ligação ativa para o estudo. Cada um dos 21sobrenadantes condicionados em meio clonal de mAb anti-huIL31 decamundongo foi injetado primeiro sobre a superfície de Fc anti-camundongode cabra, de modo que o mAb primário a ser testado pôde ligar à superfície deanticorpo anti-camundongo em uma orientação favorável. Os sítios de ligaçãoremanescentes foram depois bloqueados com injeção de um fragmento Fc deIgG policlonal irrelevante. O antígeno (rI131) foi depois injetado e capturadopara a superfície de anticorpo primário. Isto foi seguido por uma outra injeçãode um dos 21 sobrenadantes condicionados em meio clonal de mAb anti-huIL31 de camundongo para testar a ligação do anticorpo secundário. Se omAb primário e secundário competiu quanto ao mesmo sítio de ligação noantígeno, o segundo mAb não ligou. Se os dois mAbs não competem quantoao mesmo sítio de ligação no antígeno, o segundo mAb mão liga.

Cada sobrenadante foi testado como o mAb primário emcombinação com o conjunto inteiro de mAbs. Os ciclos de controle foramrealizados para demonstrar a falta de resposta do mAb secundário na ausênciade mAb primário ou antígeno. Cada mAb testado contra si mesmo foi usadocomo o controle negativo para estabelecer o nível de sinal de fundo. Os dadosforam compilados usando o software BioEvaluation 3.2 RCI, depoiscarregado no Excel® para o processamento de dados. Entre cada ciclotestando um par de anticorpo monoclonal, a superfície Fc anti-camundongode cabra foi regenerada com lavagens de 2 χ 30 segundos de HC150 mM.

Os mAbs que neutralizam fortemente (10) e os mAbs queneutralizam fracamente (11) foram estudados em dois painéis separados, coma exceção de que quando os mAbs que neutralizam fracamente foramestudados, o mAb do hibridoma 292.64.6 foi incluído como um representantedos mAbs que netutralizam fortemente. Além disso, depois de revisar asmedições de afinidade relativa e os dados de neutralização no contexto doscompartimentos de epítopo para os dois primeiros painéis decompartimentação, um terceiro painel de compartimentação foi realizado em8 mAbs "selecionados" incluindo mAbs que neutralizam tanto forte quantofracamente.

Resultados: Três painéis que testam os pares de anticorpomonoclonal foram completados para a análise tanto de mAbs que neutralizamfortemente quanto os que neutralizam fracamente. O primeiro painel testoutodos os mAbs que neutralizam fortemente um contra o outro e o segundopainel testou todos os mAbs que neutralizam fracamente (e um mAbrepresentativo que neutraliza fortemente do hibridoma 292.64.6) um contra ooutro. Um terceiro painel foi completado para avaliar explicitamente oemparelhamento de um subconjunto de mAb que neutraliza tanto forte quantofracamente selecionado para outra avaliação.

Além de variações na resposta absoluta (RU) medida parapares de mAb diferentes, diversos dos pares de mAb comportam-sediferentemente quando a orientação dos pares mudou (isto é um mAb do parusado como um mAb primário vs secundário). Tal comportamento éfreqüentemente observado e é no geral atribuído aos mAbs de interesse tendoepítopos sobrepostos.

Um do total de quatro compartimentos distintos foram obtidosa partir da análise dos primeiros dois painéis completos. Para o primeiropainel, todos os anticorpos fortemente neutralizadores agrupados juntos paradefinir um único compartimento (compartimento 1: 292.12.3, 292.39.5,292.51.5, 292.63.5, 292.64.6, 292.72.3, 292.84.1, 292.105.4, 292.109.4,292.118.6). No segundo painel, os anticorpos fracamente neutralizadoresforam agrupados e 3 compartimentos principais adicionais (compartimento 2:294.35.2, 294.146.5, 292.152.4, 292.152.4, 294.154.5; compartimento 3:294.35.3, 291.78.4, 294.158.5, 294.155.6, 294.163.2; compartimento 4:294.144.3) que foram distintos de um único representante do compartimento#1 (292.64.6). Adicionalmente, muitos dos emparelhamentos de mAbavaliados no painel 2 demonstraram uma clara assimetria de respostadependendo da orientação em que os mAbs foram testados, indicando algumasobreposição nos sítios de ligação. Dois mAbs do compartimento 3, 294.35.3e 291.78.4, exibiram evidência de competição com mAbs no compartimento 2quando testados como o mAb secundário. Também no painel 2, o anticorpofortemente neutralizante 292.64.6 (compartimento 1) exibiu competição commAbs no compartimento 3 quando testado como o anticorpo primário.

Depois da conclusão dos dois painéis de compartimentaçãoiniciais, um grupo dos mAbs que neutralizam mais fortemente e os mAbs deafinidade mais alta que neutralizam fracamente foram selecionados para outraavaliação e foram testados contra cada um no painel 3. Os resultados para oterceiro painel foram totalmente compatível com as rodadas anterioresmostrando que os anticorpos fortemente neutralizadores depositados juntos eos anticorpos fracamente neutralizadores separados nos compartimentosmúltiplos estabelecidos. Além disso, o terceiro painel demonstrou umasobreposição parcial na ligação de dois mAbs do compartimento 2 (294.35.2 e292.154.4) com um subconjunto de mAbs designados ao compartimento 1(292.12.3, 292.72.3, 292.84). Isto levou à designação de sub-compartimentosIA e IB dentro do compartimento 1. No painel 3, os mAbs dos hibridomas292.163.2 (depósito3) e 292.144.3 (compartimento 4) depositadosisoladamente.

B. Compartimentação de Epítopo em Placa de Microtítulo (ELISACompetitivo Isento de Rótulo)

Materiais: O anticorpo de captura foi o IgG anti-camundongode cabra (específico de Fcy) Jackson #115-005-071; o anticorpo de bloqueiofoi a IgGl de camundongo, (ZymoGenetics); os sobrenadantes do meiocondicionado dos hibridomas foram usados para este estudo; o antígeno foirIL31 Produzido em BHK com um rótulo de afinidade CEE biotiniladousando o kit um Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford, IL); placas de 96reservatórios Nunc Maxisorp (Nalge Nunc, Rochester, NY); ELISA B (PBS,0,1% de Tween 20, 1% de BSA); estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL);substrato de TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)

Método: Este método é similar ao ELISA competitivo isentode rótulo (LFC-ELISA) descrito por Nagata et al (2004). Este método para acompartimentação de epítopo utilizou rIL31 biotinilado. As placas demicrotítulo foram revestidas a 100 μί/Γβεεη^ίόπο com 1 μg/ml de umanticorpo específico de Fc-γ de IgG anti-camundongo de cabra (JacksonImmunoResearch #115-005-071) diluído em ELISA B (PBS, 0,1% de Tween20, 1% de BSA). Depois da ligação deste anticorpo de revestimento por 3horas na temperatura ambiente, cada meio condicionado contendo mAb foidiluído em ELISA B para produzir uma concentração de mAb aproximada de0,5 μg/ml e deixado ligar às placas revestidas com IgG anti-camundongo decabra durante a noite a 4°C (mAb#l). Em paralelo, um segundo conjunto demeio condicionado (mAb#2) foi diluído em tubos de teste de poliestireno aaproximadamente 0,5 μ§/ηι1 de mAb em ELISA B, misturado com 50 ng/mlde antígeno rIL31 biotinilado e incubado durante a noite a 4°C. Depois daincubação de mAb#l com o anticorpo de revestimento, as placas forambloqueadas com um anticorpo não relacionado para saturar os sítios deligação desocupados na placa. As misturas de mAb#2-biotina-rIL31 foramadicionadas à placa e deixadas ligar. Como um controle para (nãocompetição) no ensaio, 50 ng/ml de rIL31 biotinilado foi adicionadodiretamente (sem pré-incubação com mAb#2) aos reservatórios contendomAb#l imobilizado. Depois da incubação com o complexo IL31-mAb#2biotinilado, estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) foi adicionado à placaa 0,5 μg/ml. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB (BioFXLaboratories, Owings Mills, MD) e a absorbância dos reservatóriosindividuais a 450 nm foi medida com uma leitora de placa (Molecular

Devices Spectra Max340, Sunnyvale, CA). Se mAb#l reconheceu um epítopodiferente de mAb#2, o complexo biotina-rIL31-mAb#2 ligou à placaresultando em uma leitura de absorbância alta. Se mAb#l reconheceu omesmo epítopo como mAb#2, o complexo biotina-rIL31-MAb#2 não liga àplaca resultando em uma leitura de absorbância baixa.

Resultados: O painel completo de 21 mAbs foram testadoscontra eles mesmos simultaneamente em uma série de seis placas demicrotítulo de 96 reservatórios. Os valores de absorbância a 450 nm(A450nm) foram registrados para cada combinação e orientação ecompilados. Em todos os casos, os valores de absorbância baixos foramobtidos para as combinações self-self. Além do controle self-self, um controlepositivo de 50 ng/ml de rIL31-biotina (sem competir mAb#2) foi testadousando cada mAb primário em cada placa. Duas amostras de controle positivoforam obtidas para cada mAb primário e os valores das amostras em duplicataforam similares. Os valores de absorbância obtidos dos reservatórios decontrole positivo (sem mAb#2) para 9 dos 11 mAbs que neutralizamfracamente (dos compartimentos 2, 3 ou 4) foram menores do que os valoresde absorbância medidos para as amostras de controle para os mAbsremanescentes. Presumivelmente isto foi devido à afinidade mais baixa (EC50mais alto) para aqueles mAbs. Para facilitar a interpretação dos resultados, osvalores de absorbância foram normalizados de modo que a absorbânciamáxima medida para qualquer combinação de mAbs através de uma fileira(mAb de captura (mAb#l) mantido constante) foi designado um valor de100%. Os valores normalizados caíram em dois grupos distintos: Um degrupo grande de valores caíram abaixo de um valor de 32% compatível com acompetição e um segundo grupo grande de valores caíram acima de 32%compatível com uma falta de competição. O valor de patamar de 32% foiusado para designar cada combinação e orientação de mAbs a uma de duascategorias separadas (não competição e competição). Usando os dadoscategorizados, a compartimentação foi realizado automaticamente com baseem um algoritmo de formação de grupo hierárquico. Como foi observadodurante os experimentos de compartimentação usando o Biacore, alguns paresde mAbs categorizados de maneira diferente dependendo de qual mAb foiusado como o mAb primário. Um alto nível de severidade, que requercompetição em ambas as orientações, foi usado para designar os mAbs paraos compartimentos primários. Subseqüentemente um critério menos severo,que requer competição apenas em uma orientação, foi usado para ajudar nadesignação dos mAbs aos sub-compartimentos com base nas diferençasmenores no comportamento. Os dados normalizados foram agrupados deacordo com as 5 designações de compartimento primário com base noscritérios de alta severidade. Adicionalmente, as combinações e orientações demAbs são codificadas por cor (branco para competição e escuro para nãocompetição) para ajudar na visualização das interações que levam àdesignação de mAbs aos sub-compartimentos.

Os resultados da compartimentação pelo ELISA competitivosão compatíveis com as designações de compartimento com base nosresultados dos estudos usando o Biacore. Usando os critérios decompartimentação severos, Os seguintes compartimentos foram definidos:

Compartimento #1 (contendo todos os mAbs que neutralizamfortemente): 292.72.3, 292.64.6, 292.63.5, 292.51.5, 292.39.5, 292.12.3,292.118.6, 292.109.4, 292.105.4, 292.84.1

Compartimento #2: 294.35.2, 294.154.5, 294.146.5, 292.154.4,292.152.4

Compartimento #3: 294.35.3, 294.163.2, 294.158.5, 294.155.6

Compartimento #4: 294.144.3

Compartimento #5: 291.78.4

Focalizando no compartimento #1, os mAbs de 3 doshibridomas no compartimento #1 (292.72.3, 292.12.3, 292.84.1)demonstraram competição com 3 dos mAbs do compartimento #2 quandousados como o mAb secundário (mAb#2). Com base neste comportamento ocompartimento 1 foi dividido em dois sub-compartimentos; #1A e #1B, com ocompartimento #1B contendo os mAbs que competem com os mAbs docompartimento 2 quanto à ligação. O compartimento #1A contém 292.64.6,292.63.5, 292.51.5, 292.39.5, 292.118.6, 292.109.4, 292.105.4. Ocompartimento #1B contém 292.72.3, 292.12.3 e 292.84.1.

Focalizando no compartimento #2, três interações distintasestão evidentes que foram usados para dividir o compartimento #2 em 3 sub-compartimentos. O compartimento #2A contém mAb do hibridoma294.146.5, que compete com todos os mAbs tanto do compartimento #1quanto do #2. O compartimento #2B contém mAbs dos hibridomas 294.35.2 e294.154.5, que competem com mAbs (secundários) do compartimento #1.0compartimento #2C contém mAbs dos hibridomas 292.154.4 e 292.152.4, quecompetem com o mAb do compartimento #4 quando este é usado como omAb secundário.

Focalizando nos compartimentos #3, #4 e #5: os mAbs nocompartimento #3 (dos hibridomas 294.35.3, 294.163.2.1 e 294.155.6)competem com os mAbs tanto do compartimento #4 quanto do #5 quandoeles são usados como mAbs secundários. Os mAbs nos compartimentos #4(do hibridoma 294.144.3.5) e #5 são principalmente diferenciados pela suainteração com mAbs no sub-compartimento #2C (e as únicas propriedades deligação do mAb do hibridoma 294.144.3 nas Western blots).

Quando o painel completo de 21 mAbs foi testadosimultaneamente usando o formato LFC-ELISA, o compartimento 1 e os sub-compartimentos #1A e #1B foram claramente identificados. A sobreposiçãoparcial dos compartimentos #2 e #3 também foi identificada quando o painelcompleto de mAbs foi testado simultaneamente e o compartimento #2 foidividido em 3 sub-compartimentos. Um desvio menor das designações decompartimento com base nos dados Biacore foi a designação dos mAbs dehibridomas 291.78.4 e 294.144.3 a dois compartimentos distintos quandocritérios rigorosos foram usados com os dados de LFC-ELISA. Com base nosestudos Biacore, o mAb do hibridoma 291.78.4 foi designado aocompartimento #3.

C. Medição de afinidade com base em placa

Materiais: O anticorpo policlonal de captura foi a IgG anti-camundongo de cabra (específico de Fcy) (Jackson ImmunoResearch WestGrove, Pennsilvania #115-005-071); o anticorpo policlonal de bloqueio foi aIgG anti-ser humano de camundongo, (Jackson ImmunoResearch, #209-005-082); sobrenadantes de meio condicionado dos hibridomas foram usados paraeste estudo; o antígeno foi rIL31 produzido em BHK com um rótulo deafinidade CEE biotinilado usando o kit Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, Rockford,IL); placas de 96 reservatórios Nunc Maxisorp (Nalge Nunc, Rochester, NY);ELISA B (PBS, 0,1% de Tween 20, 1% de BSA); estreptavidina-HRP(Pierce, Rockford, IL); substrato de TMB (BioFX Laboratories, OwingsMills, MD).

Método: Este método é similar àquele descrito por vanHeyningen (1986). As placas de microtítulo foram revestidas a 100μL/reservatorio com 1 μg/ml de um anticorpo específico de Fc-γ de IgG anti-camundongo de cabra (Jackson ImmunoResearch #115-005-071) diluído emELISA B (PBS, 0,1% de Tween 20, 1% de BSA). Depois da ligação desteanticorpo de revestimento por 3 horas na temperatura ambiente, cadasobrenadante de anticorpo monoclonal purificado foi diluído em ELISA Bpara produzir e a concentração de mAb aproximada de 1 μg/ml e deixadaligar à placa por 1 hora na temperatura ambiente. Uma diluição serial deantígeno rIL31 biotinilado foi preparada a partir de 500 ng/ml até 0 ng/ml emELISA B e adicionada aos reservatórios. Depois da incubação com o antígenobiotinilado, estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL) a 0,5 μg/ml foiadicionada à placa. As placas foram desenvolvidas com substrato TMB(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) e a absorbância dos reservatóriosindividuais a 450 nm foi medida com uma leitora de placa (MolecularDevices Spectra Max340, Sunnyvale, CA). Os pontos em duplicata foramcalculados em média e os dados foram analisados com um ajuste de quatroparâmetros. O valor "C" do ajuste do parâmetro 4 é relatado como o EC50aparente (ng/ml) e é a concentração de biotina-rIL31 que produz uma respostasemi-máxima no ensaio.

Resultados: os ajustes de quatro-parâmetros foram obtidos apartir das curvas experimentais para todos os 21 dos mAbs. A concentraçãode biotina-rIL31 que produz a resposta semi-máxima (EC50) no ensaio varioude 3,3 a 236 ng/ml, com todos os 10 dos mAbs que neutralizam fortementeexibindo valores EC50 baixo e comparáveis (3,3 a 4,4 ng/ml).

D. Western Blotting

Materiais: O antígeno foi produzidas por rIL31 em BHK comum rótulo de afinidade CEE; 4 a 12% de géis de Bis-Tris NuPAGE(Invitrogen, Carlsbad, CA); Tampão de amostra não redutor (Invitrogen,Carlsbad, CA); Os padrões de peso molecular foram SeeBlue (Invitrogen); Ixtampão de condução MES (Invitrogen); tampão de Western A (50 mM de TrispH 7,4, 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 0,05% de Igepal, 0,25% degelatina); 0,2 μιη de membranas de nitrocelulose (Invitrogen); IgG anti-camundongo de ovelha-HRP (Amersham, Piscataway, NJ); pAb de coelhopurificado por afinidade específico para rIL31 (ZymoGenetics); Ig anti-coelhode burro-HRP (Amersham); Reagente quimioluminescente Lumi-Light Plus(Roche, Mannheim, Alemanha); Lumi-Imager (Mannheim-Boehringer)

Método: A capacidade dos mAbs para detectar rIL31desnaturado e desnaturado/reduzido em um Western blot foi examinada nesteestudo. O antígeno de rIL31 foi misturado com tampão de amostra redutor ounão redutor, aquecido a 7O0C por 10 min depois carregado a 100 ng/linha em4 a 12% de géis NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os padrões depeso molecular foram SeeBlue (Invitrogen) e a eletroforese foi realizada emtampão de condução IX MES (Invitrogen). As faixas de proteína nos géisforam transferidos a 0,2 μηι de membranas de nitrocelulose (Invitrogen) ebloqueadas durante a noite em 2,5% de leite em pó desnatado em tampão deWestern A (50 mM de Tris pH 7,4, 5 mM de EDTA, 150 mM de NaCl,0,05% de Igepal, 0,25% de gelatina). As membranas de nitrocelulose foramsondadas com cada anticorpo monoclonal em uma concentração aproximadade 0,1 μg/ml de mAb. As manchas foram depois sondadas com um anticorposecundário conjugado à peroxidase de rábano (IgG anti-camundongo deovelha-HRP; Amersham, Piscataway, NJ). Como um controle positivo, umaWestern blot separada foi sondada com 0,1 μ^/πιΐ de um anticorpo policlonalde coelho específico para IL-31 (ZymoGenetics) e um anticorpo secundárioconjugado à peroxidase de rábano (Ig anti-coelho de burro-HRP; Amersham).

As faixas nas Western blots foram detectadas com Reagente Lumi-Leve Plus(Roche, Mannheim, Alemanha) e a quimioluminescência registrada em umLumi-Imager (Mannheim-Boehringer).

Resultados: A análise de Western Blot dos mAbs anti IL31demonstraram que os mAbs de apenas três dos 21 hibridomas detectaram oantígeno rIL31 desnaturado. O sinal mais forte foi obtido a partir do mAbproduzido pelo hibridoma 294.144.3. Este mAb também detectou rIL3Ireduzida/desnaturada mais fortemente do que a rIL31 nãoreduzida/desnaturada. A intensidade de sinal observada com este mAb foisimilar àquela obtida com o controle de anticorpo policlonal. E notável que omAb do hibridoma 294.144.3 pertence a um compartimento separado dosoutros mAbs avaliados. Os anticorpos monoclonais de dois outros hibridomas(292.84.1 e 292.64.6) detectaram rIL31 não reduzida/desnaturada muitofracamente mas não detectou a rIL31 reduzida/desnaturada. Este sinal fraconão reproduz nas manchas escaneadas. Ambos destes mAbs são anticorposneutralizadores do compartimento # 1.

Exemplo 14

Afinidade de Ligação Relativa dos Anticorpos monoclonais Anti-Camundongo de Rato para o Ligando IL-31

A afinidade de ligação relativa de quatro MAb's de ligandoanti-Ms-IL-31 de rato contra o ligando IL-31 foi determinada como segue. OClone 271.26.6.6.1, o Clone 271.33.3.2.1, o Clone 271.33.1.2.2 e o Clone271.39.4.6.5 foram ensaiados. Anticorpo específico de IgG-Fcy anti-Rato deCabra (Jackson) foi imobilizado sobre um chip CM5 Biacore. Depois do testepreliminar, o ensaio foi ainda otimizado para ligar cada MAb na superfície decaptura anti-Rato e depois injetado em uma série de concentração de ligandoIL-31 através do MAb para ver a associação e dissociação. Depois de cadarodada, a superfície foi regenerada de volta para o Anticorpo anti-Ratoimobilizado com 2 injeções de 30 mM de HCl. Os dados foram gerados paracada MAb e o software de avaliação foi usado para definir os valores decinética relativa.

Os dados de cinética relativa gerados pela avaliação das curvasde ligação de MAb-antígeno é mostrada na Tabela 4.

Tabela 4

<table>table see original document page 158</column></row><table>

Exemplo 15

Redução de TARC e MDC em resposta ao anticorpo anti-Il-31 em modelos decamundongo AD

Método I

Camundongos NC/Nga machos de seis semanas de idade(CRL Japão) foram sensibilizados intradermicamente com 50 μg de extrato deácaro de poeira {D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies) três vezes porsemana no dorso e classificados quanto a lesões como a AD. Depois de 5semanas de sensibilização os camundongos foram submetidos a eutanásia e asorelhas direitas foram excisadas e colocadas em um único reservatório de umaplaca de cultura de 48 reservatórios (Corning) suplementadas com RPMI +2% de FBS (GIBCO Invitrogen). As placas foram colocadas em incubadorascom 5% de CO2 e umidade controlada. Os sobrenadantes foram coletadosdepois de 24 horas e congelados a -20 0C até outra análise.

Método II

Camundongos NC/Nga fêmeas de doze semanas de idade(CRL Japão) foram sensibilizados intradermicamente com 10 μg de SEB(Toxin Technology) na orelha e no dorso três vezes por semana. Oscamundongos foram classificados quanto as lesões equivalentes à AD. Depoisde 5 semanas de sensibilização os camundongos foram submetidos aeutanásia e punções de biópsia de 6 mm foram coletadas da orelha injetada decada camundongo e colocadas em um único reservatório de uma placa decultura de 48 reservatórios suplementados com RPMI + 2% de FBS. Asplacas foram colocadas em incubadoras com 5% de C02 e umidadecontrolada. Os sobrenadantes foram coletados depois de 24 horas econgelados a -20 0C até outra análise.

Os grupos de camundongos em ambos os estudos foramtratados com um anticorpo monoclonal anti-IL-31 de camundongo de rato a10 mg/kg ou veículo, intraperitonealmente duas vezes a cada semana partindodepois de 1 a 2 semanas de sensibilização.

As concentrações de TARC e MDC nas amostras desobrenadante de 24 horas foram medidas pelo ELISA convencional (R&DSystems).

As concentrações de TARC e MDC foram mais baixas nossobrenadantes de orelha de camundongos tratados com anti-IL-31 comparadocom os camundongos de controle em ambos os estudos, entretanto, estesresultados não foram estatisticamente significantes quando analisados peloANOVA, provavelmente devido ao tamanho da amostra pequeno. Quando osdados de ambos os experimentos são combinados e analisados existe umadiferença estatisticamente significante entre os grupos tratados.

Exemplo 16

Administração de anticorpos neutralizantes de IL-31

Os camundongos BALB/c fêmeas normais (CRL)aproximadamente 8 a 12 semanas de idade foram implantadossubcutaneamente com bombas osmóticas de 14 dias (Alzet, #2002) liberando1 μg/dia de mIL-31. Os grupos de camundongos recebeu injeçõesintraperitoneais (i.p.) de anticorpo monoclonal anti-IL-31 de camundongo derato 10 mg/kg (200 μg/camundongo) duas vezes por semana começando nasemana 1 antes da liberação de IL-31. Os grupos de controle de camundongosrecebeu injeções i.p. de veículo (PBS/0,1% de BSA) com os programas dedosagem idênticos. Os camundongos foram classificados diariamente quantoa alopecia e prurido usando o seguinte critério: 0 = nenhuma coceira, o animalparece normal, 1 = afinamento da pelagem em áreas pequenas, coceiraobservada, 2 = perda de pelo menor (pequenos pedaços), coceira, 3 = perda depelo moderada, coceira e 4 = perda de pelo grave, coceira excessiva.

Em todos os experimentos, os camundongos tratados com mAbanti-mIL-31 de rato tiveram uma demora do início dos sintomas deaproximadamente 5 a 7 dias e uma contagem global mais baixa quanto àalopecia e prurido. Todos os grupos de camundongos tratados com mAb(independente da freqüência de dose ou concentração) desenvolveram aalopecia e prurido similares aos camundongos de controle nos 13 dias doestudo. Estes dados sugerem que a neutralização de IL-31 pode retardar oinício da resposta à coceira/perda de cabelo induzida pela IL-31.

A partir do precedente, será avaliado que, embora as formas derealização específicas da invenção fossem aqui descritas com os propósitos deilustração, várias modificações podem ser feitas sem desviar do espírito eescopo da invenção. Conseqüentemente, a invenção não é limitada excetocomo pelas reivindicações anexas.DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

<table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Siadak, Anthony W.Bilsborough, JanineFlorkiewicz, ElinHaran, Aaron C.

<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS IL-31 E MÉTODOS DE USO

<130> O5-11PC

<150> 60/678,918

<151> 2005-05-06

<150> 60/696,251

<151> 2005-07-01

<150> 60/711,600

<151> 2005-08-26

<160> 7

<170> FastSEQ for Windows Versão 4.0

<210> 1

<211> 904

<212> DNA

<213> Homo sapiens<220>

<221> CDS

<222> (28)...(519)

<400> 1

ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr

tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His 10 15 20 25 acg ttg CCC gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu Arg Pro Sér Asp Asp Val Gln Lys Ile 30 35 40 gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg Ctt ttg aaa gat gtg gag 198Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu 45 50 55 gaa gag aag ggc gtg CtC gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246Glu Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu 60 65 70 age cct gac gcc cag ccg cca aac aac ate cac age cca gcc ate cgg 294Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg 75 80 85 gea tat ctc aag aca ate aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat 342Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp 90 95 100 105 gag ate ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gea cca gaa 390Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu 110 115 120 aca aac att tct gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa cgc ttc ate 438Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile 125 130 135 ctg act att tct caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gea cta aaa 486Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys

140 145 150

tca ttg acc tct gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln Gln Ala Thr Thr

155 160

ggattggcag gaacttaagg agccttaaaa agatgaccga cagctaagtg tgggaactct 599gccgtgattc cttaagtaca tttttccaat gaataatctc agggacccct catatgggct 659agtcccggga gggctgagat gtgaatttgt gaattacctt gaaaaacatt aggttattgt 719tattagtctt ggtatttatg gaatgctttt cttctgcagg cttaagtctt acttattata 779ccctcgtgag ggtgggaggt ggcagctatg ttaatttatt gatatttatt gtactaagag 839

ttgtcaatgc tccctggggg agccctcgga atctatttaa taaattatat tgaatttttc 899

tcata 904

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys

1 5 10 15

Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu

20 25 30

Arg Pro Ser Asp Asp Val Gln Lys Ile Val Glu Glu Leu Gln Ser Leu

35 40 45

Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val

50 55 60

Ser Gln Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gln Pro Pro65 70 75 80

Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg

85 90 95

Gln Leu Asp Asn Lys Ser Val Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp

100 105 110

Lys Leu Ile Phe Gln Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr

115 120 125

Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gln Gln Phe

130 135 140

Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gln145 150 155 160

Gln Ala Thr Thr

<210> 3

<211> 755

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS<222> (1)..-(489)<400> 3

atg ate ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys1 5 10 15

tgt ata gga acc tgg ctg gcc acc tgc age ttg tcc ttc ggt gcc cca 96Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro

20 25 30

ata tcg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu

35 40 45

tet cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gea tet ggg atg 192Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met

50 55 60

tca gea gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa 240Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu65 70 75 80

gea tta acc aac ate tcg gtc ate ata gea cat ctg gag aaa gtc aaa 288Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys

85 90 95

gtg ttg age gag aac aca gta gat act tet tgg gtg ata aga tgg cta 336Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu

100 105 110

aca aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tet gtg cct 384Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro .

115 120 125

gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val130 135 140

tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat 480Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn145 150 155 160

act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgcagtgt cctcagcagt 529

Thr Thr Cys

gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589

cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt tctgctaccc 649

tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709

catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755

<210> 4

<211> 163

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys

1 5 10 15

Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro

20 25 30

Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gln Glu

35 40 45

Ser Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gln Ala Ser Gly Met

50 55 60

Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gln Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu65 70 75 80

Ala Leu Thr Asn Ile Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys

85 90 95

Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu

100 105 110

Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro

115 120 125

Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val Leu Thr Val

130 135 140

Leu Lys Gln Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gln Ala Lys Asp Asn145 150 155 160

Thr Thr Cys

<210> 5<211> 662<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 5

Met Lys Leu Ser Pro Gln Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp1 5 10 15

Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala

20 25 30

Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg

35 40 45

Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr

50 55 60

Gln Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn65 70 75 80

Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe

85 90 95

Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu

100 105 110

Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg

115 120 125

Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys

130 135 140

Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gln Ile Glu Trp Ile Lys Pro145 150 155 160Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg

165 170 175

Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg

180 185 190

Lys Asp Lys Asn Gln Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gln Pro Phe Thr

195 200 205

Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp

210 215 220

Ser Asp Trp Ser Gln Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro225 230 235 240

Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly

245 250 255

Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val

260 265 270

Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn

275 280 285

Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gln Gln Leu Glu Leu

290 295 300

His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser305 310 315 320

Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gln Glu

325 330 335

Lys Ser Phe Gln Cys Ile Glu Val Met Gln Ala Cys Val Ala Glu Asp

340 345 350

Gln Leu Val Val Lys Trp Gln Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp

355 360 365

Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser

370 375 380

Trp Glu Ser Val Ser Gln Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gln Gln Asp Lys385 390 395 400

Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His

405 410 415

Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gln Ala Tyr Ala Lys Glu Gly

420 425 430

Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys

435 440 445

Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly

450 455 460

Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gln Ala Glu Gly Gly Lys Gly465 470 475 480

Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gln Tyr Gly Leu Glu Ser

485 490 495

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gln Val Met Ala Ser Thr Ser

500 505 510

Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe

515 520 525

Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile Gly Gly Gly Leu

530 535 540

Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu Lys Lys Pro Asn545 550 555 560

Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser

565 570 575

Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp Lys Leu Asn Leu

580 585 590

Lys Glu Ser Asp Asp Ser Val Asn Thr Glu Asp Arg Ile Leu Lys Pro

595 600 605

Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Val Ile Asp Lys Leu Val Val Asn

610 615 620

Phe Gly Asn Val Leu Gln Glu Ile Phe Thr Asp Glu Ala Arg Thr Gly625 630 635 640

Gln Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr Arg Ile Leu Ser

645 650 655

Ser Cys Pro Thr Ser Ile660

<210> 6

<211> 979

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Met Ala Leu Phe Ala Val Phe Gln Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Tyr Gln Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu

20 25 30

Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gln Ser Leu

35 40 45

His Leu Gln Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gln Glu Leu Lys

50 55 60

Met Val Phe Gln Ile Gln Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile65 70 75 80

Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gln Val Leu His

85 90 95

Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val

100 105 110

Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe

115 120 125

Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gln Asp Ser Thr

130 135 140

Gly Gln Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu145 150 155 160

Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile Gln Asn Asn

165 170 175

Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gln Ile His Gly Glu Gln Leu Asp

180 185 190

Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn

195 200 205

Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gln Gly Asn Val Ser Glu

210 215 220

Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro225 230 235 240

Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr

245 250 255

Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gln Pro Ser

260 265 270

Gln Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys

275 280 285

Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gln Ile Thr Gln Asp Ser Gln Glu

290 295 300

Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser305 310 315 320

Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro

325 330 335

Phe Ser Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr

340 345 350

Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gln Ile

355 360 365

Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gln Tyr Asn Val Ser Ile Lys

370 375 380

Val Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr385 390 395 400

Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser

405 410 415

Glu Trp Ser Gly Gln Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu

420 425 430

Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr

435 440 445

Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys450 455 460

Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser465 470 475 480

Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile

485 490 495

Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gln Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val

500 505 510

Gly Ala Ser Pro Ala Ser Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn

515 520 525

Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser

530 535 540

Leu Ser Trp Lys Pro Gln Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp545 550 555 560

Trp Cys Asp His Thr Gln Asp Val Leu Gly Asp Phe Gln Trp Lys Asn

565 570 575

Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg

580 585 590

Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg

595 600 605

Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Leu Ala

610 615 620

Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser625 630 635 640

Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gln Pro Gly Phe

645 650 655

Ile Gln Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gln Cys His

660 665 670

Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys

675 680 685

Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu

690 695 700

Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala705 710 715 720

Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu

725 730 735

His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val

740 745 750

Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gln Trp Ile Lys Glu

755 760 765

Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser

770 775 780

Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser785 790 795 800

Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu Val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr

805 810 815

Lys Ile Gln Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu Thr Glu Leu

820 825 830

Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser

835 840 845

Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gln Ala

850 855 860

Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser Pro Lys Ala865 870 875 880

Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val Leu Lys Ala

885 890 895

Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu

900 905 910

Thr Ser Leu Asn Tyr Val Ser Gln Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp

915 920 925

Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His Cys Ser Glu

930 935 940

Tyr Lys Met Gln Met Ala Val Ser Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro945 950 955 960Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu965 970 975

His Tyr Cys

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> peptideo de etiqueta Glu-Glu

<400> 7

Glu Tyr Met Pro Met Glu1 5

Claims (35)

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de serproduzido pelo hibridoma depositado com a American Type CultureCollection tendo a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada dogrupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831;f) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.

2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o hibridoma possui a Designação de Depósitode Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829; ee) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830.

3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o hibridoma possui a Designação de Depósitode Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816; ec) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871.

4. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o hibridoma possui a Designação de Depósitode Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829; eb) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830.

5. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o hibridoma possui a Designação de Depósitode Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; eb) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831.

6. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o hibridoma possui a Designação de Depósitode Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872; eb) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875.

7. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

8. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo especificamente se liga a umpolipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2.

9. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de inibir a ligação deum peptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 apartir do resíduo 27 ao resíduo 164 a um receptor que compreende aseqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 5.

10. Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de serderivado de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridomadepositado com a American Type Culture Collection tendo a Designação deDepósito de Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831;f) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.

11. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo humanizado especificamentese liga a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2.

12. Fragmento de anticorpo, caracterizado pelo fato de serderivado de um anticorpo monoclonal produzido por um hibridomadepositado com a American Type Culture Collection tendo a Designação deDepósito de Patente ATCC selecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831;f) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.

13. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o dito fragmento de anticorpo é capaz de inibira ligação de um peptídeo que compreende a seqüência de aminoácido da SEQID NO: 2 a partir do resíduo 27 ao resíduo 164 a um receptor que compreendea seqüência de aminoácido como mostrado na SEQ ID NO: 5.

14. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o dito fragmento de anticorpo compreendeainda um polipeptídeo Fc.

15. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de queespecificamente se liga a um polipeptídeo que compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 11, em que o dito polipeptídeo é capaz de ligar oanticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado com a AmericanType Culture Collection tendo a Designação de Depósito de Patente ATCCPTA-6874.

16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações de 1 a 15, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo neutraliza a interação de IL-31 (SEQ IDNO:2 ) com IL-3 IRA (SEQ ID NO: 5).

17. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo neutralizante.

18. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações de 1 a 17, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo compreende ainda um radionuclídeo,enzima, substrato, cofator, marcador fluorescente, marcadorquimioluminescente, rótulo de peptídeo, partícula magnética ou toxina.

19. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo comqualquer uma das reivindicações de 1 a 18, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de anticorpo compreende ainda PEGuilação.

20. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo domesmo, caracterizado pelo fato de ser capaz de competir com o anticorpomonoclonal produzido pelo hibridoma depositado com a American TypeCulture Collection tendo a Designação de Depósito de Patente ATCCselecionada do grupo consistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831;f) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.para ligar ao peptídeo que compreende a seqüência de aminoácido a partir doresíduo 27 ao resíduo 164 da SEQ ID NO: 2.

21. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo deacordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o hibridomapossui a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada do grupoconsistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830.

22. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo deacordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o hibridomapossui a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada do grupoconsistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816; ec) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;

23. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo deacordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o hibridomapossui a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada do grupoconsistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829; eb) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830.

24. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo deacordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o hibridomapossui a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada do grupoconsistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ed) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831.

25. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo deacordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o hibridomapossui a Designação de Depósito de Patente ATCC selecionada do grupoconsistindo de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872; eb) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875.

26. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo comodefinidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelofato de ser para redução da inflamação em um mamífero.

27. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo comodefinidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelofato de ser para inibição, redução ou bloqueio da produção de quimiocinaspró-inflamatórias em um mamímero.

28. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo comodefinidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelofato de ser para inibição, redução ou bloqueio de TARC e MDC.

29. Anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo comodefinidos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 25, caracterizado pelofato de ser para inibição, redução, ou bloqueio de coceira, prurido, perda decabelo ou dermatite (tal como dermatite atópica).

30. Uso de um antagonista de IL-31, caracterizado pelo fato deque compreende: (i) um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo deligação que especificamente se liga a um polipeptídeo de IL-31RA oufragmento do mesmo; ou (ii) um polipeptídeo de IL-31RA ou fragmento domesmo; para a manufatura de um medicamento para tratar um mamíferoafligido com uma doença inflamatória que a IL-31 desempenha um papel, emque, no uso, o medicamento reduz a atividade inflamatória de IL-31.

31. Uso de um antagonista de IL-31, caracterizado pelo fato deque compreende um anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo deligação que especificamente se liga a um polipeptídeo que compreende aseqüência de aminoácido da SEQ ID NO:2 ou um fragmento deste; para amanufatura de um medicamento para reduzir, inibir ou prevenir o efeito deprurido em um mamífero em que a IL-31 desempenha um papel; em que, nouso, o medicamento reduz a atividade prurítica ou a atividade de coceira daIL-31.

32. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de que a doença inflamatória compreende dermatite atópica ou doençaspruríticas tal como prurigo nodular.

33. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 30a 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo éanticorpo ou fragmento de anticorpo como definidos em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 23.

34. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que o hibridoma édepositado com a American Type Culture Collection tendo a Designação deDepósito de Patente ATCC selecionada de:a) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6815;b) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6816;c) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6829;d) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6830;e) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6831;f) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6871;g) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6872;h) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6875; ei) Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-6873.

35. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o dito fragmento de anticorpo é humanizado.