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BRPI0820099A2 - anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo - Google Patents

anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo Download PDF

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BRPI0820099A2
BRPI0820099A2 BRPI0820099-8A BRPI0820099A BRPI0820099A2 BR PI0820099 A2 BRPI0820099 A2 BR PI0820099A2 BR PI0820099 A BRPI0820099 A BR PI0820099A BR PI0820099 A2 BRPI0820099 A2 BR PI0820099A2
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BR
Brazil
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amino acid
seq
humanized
antibody
chain variable
Prior art date
Application number
BRPI0820099-8A
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English (en)
Inventor
Kent Bondensgaard
Roland Beckmann
Original Assignee
Zymogenetics, Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Zymogenetics, Inc filed Critical Zymogenetics, Inc
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Abstract

ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO A invenção fornece anticorpos IL-31 anti-humanos de camundongo humanizados e fragmentos de de anticorpos que são capazes de se ligar a IL-31 e com isso neutralizar, inibir, limitar, ou reduzir os efeitos pró-inflamatórios ou pró-pruriginosos de IL-31.

Description

CA ADE neo REo DADO o ocre trate tar ce tstrtt:sstototioloooooo a : , 1 v : “ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO”
ESTADO DA TÉCNICA ANTERIOR DA INVENÇÃO Foi encontrado que IL-31, uma citocina recentemente identificada, resulta em sintomas tipo dermatite quando superexpressa em camundongos. Veja, Dillon, et al., Nature Immunol. 5:752-760, 2004. Estes sintomas podem ser aliviados por uso de antagonistas que bloqueiam, inibem, reduzem, antagonizam ou neutralizam a atividade de IL-31, e incluem anticorpos anti-IL-31. Veja também, Pedido de Patente U.S. Número de Série 10/352.554, depositado em 21 de Janeiro de 2003 (Publicação de Patente U.S. No. 2003-0224487), agora Patentes Norte-Americanas No. de Série
7.064.186, 7.425.325, e 7.459.293, Tecnologia de anticorpo monoclonal forneceu um vasto conjunto de terapêuticos assim como diagnósticos para uso para identificar e tratar doença. Diversas moléculas recombinantes ou biossintéticas compreendendo sítios de ligação de antígenos de roedores foram descritas. Particularmente, moléculas tendo sítios de ligação de antígenos de roedores construídos diretamente em anticorpos humanos enxertando apenas o sítio de ligação de roedor, ao invés do domínio variável inteiro, em domínios de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana foram descritas. Veja, e.g., Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327 e Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536. Moléculas tendo um sítio de ligação de antígeno caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das regiões determinantes de —complementaridade (CDRS) do domínio variável é derivada de um anticorpo monoclonal murino e as partes derivadas de imunoglobulina remanescentes da molécula são derivadas de imunoglobulina humana foram descritas em
Publicação de Patente Britânica No. GB 2.276.169, publicada em 21 de Setembro de 1994. Diversos polipeptídeos de sítio de ligação de antígeno de cadeia única e moléculas de Fv de cadeia única (sFv) também foram descritos. Veja, e.g., Patente U.S. Nos. 5.132.405 e 5.091.513 a Huston et al.; ePatenteU.S.4.946.778 a Ladner et al.
Anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL-31 humana foram descritos previamente em Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/430.066, depositado em 8 de Maio de 2006 (Publicação de Patente U.S. No. 2006-02752960) que descreve anticorpos monoclonais de camundongo que reconhecem IL-31 humana e podem ser usados para gerar anticorpos quiméricos. Entretanto, quiméricos podem causar imunogenicidade e anticorpos de camundongo humanizados anti-IL-31 humana são desejáveis. Anticorpos humanizados geralmente têm pelo menos três vantagens potenciais sobre camundongo ou em alguns casos anticorpos quiméricos para usoem terapia humana: (1) Pelo fato de porção efetora ser humana, ela pode interagir melhor com as outras partes do sistema imune humano (e.g., destruir as células alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)); (2) O sistema imune humano não deve reconhecer a região — estrutural ou constante do anticorpo humanizado como exógena, e, portanto, a resposta do anticorpo contra um tal anticorpo injetado deve ser menor do que contra um anticorpo de camundongo totalmente exógeno ou um anticorpo quimérico parcialmente exógeno; e (3) Anticorpos de camundongos injetados foram relatados tendo uma meia-vida na circulação humana muito mais curta do que a meia-vida de anticorpos normais (D. Shaw et al., J. Immunol., 138, 4534-4538 (1987)). Anticorpos humanizados injetados presumivelmente terão uma meia-vida mais similar a anticorpos humanos naturalmente ocorrentes, permitindo que sejam dadas doses menores e menos fregiientes doses.
Assim, existe uma necessidade de moléculas que fornecem sequências de aminoácidos humanizadas de região variável para os anticorpos de camundongo anti-IL-31 humana para tratar inflamação mediada por IL-31.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Em um aspecto, a presente invenção é ligada a um anticorpo isolado que se liga a IL-31 humana, compreendendo: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo CDRs consistindo de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2 e 3 respectivamente ou consistindo de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 4 e 3 respectivamente; b) um domínio variável humanizado de cadeia leve — compreendendo CDRs consistindo de sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 e 7. Em outro aspecto, a invenção é ligada a anticorpos descritos neste lugar caracterizados pelo fato de que: a) dito domínio variável humanizado de cadeia pesada compreende regiões estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 tendo uma seqiência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: 1) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) e 11 (FR4) respectivamente; 2) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRD, 13(FR2), 14 (FR3) e 15 (FR4) respectivamente; 3) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRD, 13 (FR2), 16 (FR3) e 15 (FR4) respectivamente; e b) dito domínio variável humanizado de cadeia leve compreende regiões estruturais FR5, FR6, FR7, e FR8 tendo uma seqiiência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos as regiões estruturais são selecionadas a partir do grupo consistindo de: 1) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) e 20 (FR8) respectivamente; e 2) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 21 (FR7) e 20 (FR8) respectivamente. Em uma forma de realização, dita identidade é pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%. Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que aminoácido em posição 29 em FRI da cadeia pesada é leucina e aminoácido em posição 32 em FR3 da cadeia pesada é fenilalanina. Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que aminoácidoem posição 8 em FR3 da cadeia pesada é lisina e aminoácido em posição 15 em FR7 da cadeia leve é tirosina.
Em um aspecto adicional a presente invenção é ligada a um anticorpo isolado que se liga a IL-31 humana, compreendendo: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo CDCRI e CDR3 tendo sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e 3 respectivamente e CDCR2 tendo sequência de aminoácidos de AIYPGDGDTRYSXaalXaa2FXaa3G (SEQ ID NO: 22) caracterizado pelo fato de que Xaal é glutamina ou prolina, Xaa2 é serina ou lisina e Xaa3 é glutamina ou lisina; dito domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo regiões estruturais FRI, FR2, FR3 e FR4 tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de: SEQ ID NO: 8, 9, 10 e 11 respectivamente, ou SEQ ID NO: 12, 13, 14 e 15 respectivamente, ou SEQ ID NO: 12, 13, l6 e 15 respectivamente; e com a condição de que aminoácido em posição 29 em FRI — seja leucina e aminoácido em posição 32 em FR3 seja fenilalanina; b) um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo CDRs consistindo de segiências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 e 7 dito domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo regiões estruturais FR5, FR6, FR7 e FR8 tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 19 e 20 respectivamente, ou pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 21 e 20 respectivamente. Em um aspecto da presente invenção, dita identidade é pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 98%, mais preferivelmente pelo menos 99%. Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que aminoácido em posição 8 em FR3 da cadeia pesada é lisina e aminoácido em posição 15 em FR7 da cadeia leve é tirosina. Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito 5 neste lugar caracterizado pelo fato de que: aminoácido Xaal é glutamina, Xaa? é lisina e Xaa3 é lisina; aminoácido Xaal é prolina, Xaa2 é serina e Xaa3 é glutamina; ou aminoácido Xaal é glutamina, Xaa2 é lisina e Xaa3 é glutamina.
Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que CDRs do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 1,4 e 3 respectivamente, CDRs do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 5,6 e 7 respectivamente, regiões estruturais do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 8, 9, 10 e 11 respectivamente, e regiões estruturais do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 17, 18, 19 e 20 respectivamente.
Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que CDRs do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 1,2 e 3 respectivamente, —CDRs do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 5,6 e 7 respectivamente, regiões estruturais do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 12, 13, 14 e 15 respectivamente, e regiões estruturais do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 17, 18, 19 e 20 respectivamente.
Em outro aspecto a invenção é ligada a um anticorpo isolado como descrito neste lugar caracterizado pelo fato de que CDRs do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 1,2 e 3 respectivamente, CDRs do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 5,6 e 7 respectivamente, regiões estruturais do domínio variável de cadeia pesada consistem de SEQ ID NO: 12, 13, l6 e 15 respectivamente, e regiões estruturais do domínio variável de cadeia leve consistem de SEQ ID NO: 17, 18, 21 e 20 respectivamente.
Como será mostrado a partir dos Exemplos e ensinamentos — neste lugar, a presença tanto de uma leucina em posição 29 em FRI como de uma fenilalanina em posição 32 em FR3 dos anticorpos humanizados descritos neste lugar, tem um impacto positivo em termos de afinidade e potência de ditos anticorpos. Como mostrado, por exemplo, em um ensaio Biacore, a afinidade de ligação de anticorpos humanizados portando tanto —umaleucina em posição 29 em FR1 como uma fenilalanina em posição 32 em FR3 é melhor quando comparada com anticorpos humanizados que portam outro aminoácido nestas posições (compare, por exemplo, clones número 7, 10, 13 e 14 em Tabela 2 de Exemplo 3). O impacto positivo destes aminoácidos em posição 29 de FR1 e 94 de FR3 da cadeia pesada, tanto em termos de afinidade como potência, também foi confirmado por outros dois testes biológicos (veja Exemplos 4 e 5).
Em uma forma de realização da presente invenção, o anticorpo descrito neste lugar compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado a partir do grupo consistindo da região constante — de cadeia uma cadeia pesada de imunoglobulina humana a, y, u, ô ou e. Em uma forma de realização da presente invenção, o anticorpo descrito neste lugar compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado a partir do grupo consistindo de um domínio constante de IZG1 humana; um domínio constante de I2G2 humana; um domínio constante de —IgG3 humana; um domínio constante de IZG4 humana; um domínio constante de IgM humana; um domínio constante de IZE humana e um domínio constante de IZA humana. Em uma forma de realização, o domínio constante de IgG4 humana é uma forma mutada estável em solução e com pouca ou nenhuma atividade de ativação de complemento. Em uma forma de realização, o domínio de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é um domínio constante de IZG4 humana com uma mutação de Ser para Pro em posição 241 (numeração de Kabat). Em uma forma de realização, o domínio de região constante de — cadeialeve de imunoglobulina é selecionado a partir do grupo consistindo da região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina humana K ou X. Preferivelmente, o domínio de região constante de cadeia leve de imunoglobulina é a região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina humana K.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Antes de descrever a invenção em detalhe, pode ser útil para a compreensão desta definir os termos seguintes: Como usado neste lugar, o termo “anticorpos" inclui anticorpos policlonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, anticorpos monoclonais, e fragmentos de ligação de antígeno, tal como F(ab'),, fragmentos proteolíticos Fab, e fragmentos de região variável de cadeia única (scFvs). Anticorpos ou fragmentos intactos geneticamente manipulados, tal como anticorpos quiméricos, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia única e os semelhantes, assim como peptídeos e polipeptídeos de ligação de antígenos sintéticos, também estão incluídos. Anticorpos não humanos podem ser humanizados enxertando CDRs não humanas em regiões estruturais e constantes humanas, ou incorporando os domínios variáveis não humanos completos (opcionalmente "ocultando" eles com uma superfície tipo humana por substituição de resíduos expostos, caracterizado pelo fato de que o resultado é um anticorpo "embutido"). Em algumas instâncias, anticorpos humanizados podem reter resíduos não humanos dentro dos domínios estruturais de regiões variáveis humanas para acentuar características apropriadas de ligação. Através de imunização de anticorpos, meia-vida biológica pode ser aumentada, e o potencial para reações imunes adversas mediante administração a humanos é reduzido.
O termo “anticorpo quimérico" ou "anticorpos quiméricos" se refere a anticorpos cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente por engenharia genética, a partir de genes de região constante e variável de imunoglobulina pertencendo a espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser unidos a segmentos constantes humanos, tal como gama | e gama 3. Um anticorpo quimérico terapêutico típico é assim uma proteína híbrida composta do domínio variável ou de ligação de antígeno de um anticorpo de camundongo e do domínio constante de um anticorpo humano, embora outras espécies de mamíferos possam ser usadas.
Como usado neste lugar, o termo “imunoglobulina" se refere a uma proteína consistindo de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Uma forma de imunoglobulina constitui a unidade estrutural básica de um anticorpo. Esta forma é um tetrâmero e consiste de dois pares idênticos de cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma pesada. Em cada par, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada são juntas responsáveis por ligação a um antígeno, e as regiões constantes são responsáveis pelas funções efetoras do anticorpo.
“Cadeias leves” de comprimento completo de imunoglobulina (cerca de 25 Kd ou 214 aminoácidos) são codificadas por um gene de região variável no término NH2 (cerca de 110 aminoácidos) e um gene de região constante kappa ou lambda no término COOH. “Cadeias pesadas” de comprimento completo de imunoglobulina (cerca de 50 Kd ou 446 aminoácidos), são similarmente codificadas por um gene de região variável (cerca de 116 aminoácidos) e um dos outros genes de região constante mencionados acima (cerca de 330 aminoácidos). Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ou epsilon, e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.
Dentro de cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos mais. (Veja geralmente, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed.
Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (incorporada neste lugar por referência sua descrição sobre produzir anticorpos e fragmentos de anticorpos). Uma região variável de cadeia leve ou pesada de imunoglobulina consiste de uma região “estrutural” interrompida por três regiões hipervariáveis.
Assim, o termo “região hipervariável" se refere aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno.
A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "Região Determinante de Complementaridade" ou "CDR" (i.e., resíduos 24- 34 (LI), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (HD,50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma “alça hipervariável” (1.e., resíduos 26-32 (L1), 50-52 (12) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (HI), 53-55 (H2) e 96- 101 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Chothia e Lesk, 1987, J.
Mol.
Biol. 196: 901-917) (ambos os quais são incorporados neste lugar por referência). "Região Estrutural" ou resíduos de "FR" são aqueles resíduos de domínios variáveis outros do que os resíduos de região hipervariável como definido neste lugar.
As sequências das regiões estruturais de diferentes — cadeias leves ou pesadas são relativamente conservadas dentro de uma espécie.
Assim, uma "região estrutural humana" é uma região estrutural que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais, normalmente 90-95% ou mais) à região estrutural de uma imunoglobulina humana naturalmente ocorrente.
A região estrutural de um anticorpo, isto é as regiões estruturais combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs. As CDRs são essencialmente responsáveis por ligação com um epítopo de um antígeno. Por conseguinte, o termo imunoglobulina “humanizada” se refereauma imunoglobulina compreendendo uma região estrutural humana e uma ou mais CDRs de uma imunoglobulina não humana (normalmente uma de camundongo ou rato). A imunoglobulina não humana fornecendo as CDRs é chamada de a "doadora" e a imunoglobulina humana fornecendo a estrutura é chamada de a "aceptora". Regiões constantes não precisam estar presentes, mas se elas estão, elas devem ser substancialmente idênticas a regiões constantes de imunoglobulina humana, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, preferivelmente cerca de 95% ou mais idênticas. Por conseguinte, todas as partes de uma imunoglobulina humana, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de sequências naturais de imunoglobulinas humanas. Um “anticorpo humanizado” é um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina humanizada de cadeia leve e uma humanizada de cadeia pesada. Por exemplo, um anticorpo humanizado não deve abranger um anticorpo quimérico típico como definido acima, e.g., porque a região variável inteira de um anticorpo quimérico é não humana.
O termo “anticorpos recombinantes" significa anticorpos caracterizados pelo fato de que a sequência de aminoácidos foi variada daquela de um anticorpo nativo. Devido à relevância de técnicas de DNA recombinante na geração de anticorpos, alguém não precisa ser confinado às sequências de aminoácidos encontradas em anticorpos naturais; anticorpos — podem ser remodelados para obter características desejadas. As variações possíveis são muitas e variam da alteração de apenas um ou alguns aminoácidos até o remodelamento completo, por exemplo, da região variável ou constante. Alterações na região constante, em geral, podem ser feitas a fim de melhorar ou alterar características, tal como fixação de complemento,
interação com membranas e outras funções efetoras. Alterações na região variável serão feitas a fim de melhorar as características de ligação de antígeno. Em adição a anticorpos, imunoglobulinas podem existir em uma variedade de outras formas incluindo, por exemplo, cadeia única ou Fv, Fab, e (Fab), assim como diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos multivalentes ou multiespecíficos híbridos (como descrito acima e em detalhe em: Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17, 105 (1987)) e em cadeias únicas (e.g., Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5879-5883 (1988) e Bird et al., Science, 242, 423-426 (1988), que são incorporados neste lugar por referência para seus ensinamentos em fragmentos de anticorpos). (Veja, geralmente, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2nd ed. (1984), e Hunkapiller e Hood, Nature, 323, 15-16 (1986), que são incorporados neste lugar por referência para anticorpos).
Como usado neste lugar, os termos "Fv de cadeia única", "anticorpos de cadeia única,” "Fv" ou "scFv" se referem a fragmentos de anticorpos que compreendem as regiões variáveis tanto das cadeias pesadas como leves, mas carece das regiões constantes, mas dentro de uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, um anticorpo de cadeia única — compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita que ele forme a estrutura desejada que pode permitir ligação de antígeno. Anticorpos de cadeia única são discutidos em detalhe por Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); veja também Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 88/01649 e Patente U.S. Nos. 4.946.778 e 5.260.203, as descrições dos quais são incorporadas por referência para qualquer propósito. Em formas de realização específicas, anticorpos de cadeia única também podem ser biespecíficos e/ou humanizados.
Um “fragmento Fab” é compreendido de uma cadeia leve e a CHI e regiões variáveis de uma cadeia pesada. À cadeia pesada de uma molécula de Fab não pode formar uma ligação dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.
Um "fragmento Fab" contém uma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constante, entre os domínios CH1 e CH2, de forma que uma ligação dissulfeto entre cadeias pode ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula de F(ab')2.
Um "fragmento F(ab')) 2" contém duas cadeias leves e duas — cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CHI e CH2, de forma que uma ligação dissulfeto entre cadeias é formada entre duas cadeias pesadas.
Pesos moleculares e comprimentos de polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (e.g., eletroforese em gel) serão entendidos como sendo valores aproximados. Quando um tal valor é expresso como "cerca de" X ou "aproximadamente" X, o valor determinado de X será entendido como sendo acurado para +10%.
Todas as referências citadas neste lugar são incorporadas por referência em sua totalidade.
A presente invenção é baseada na descoberta de sequências de região variável de anti-IL-31 humana de camundongo humanizada de anticorpos. Uso destes anticorpos como antagonistas para IL-31 pode inibir inflamação em geral, e os sintomas de dermatite e doenças pruriginosas em específico. A invenção fornece o uso de regiões humanizadas de cadeia leve e — cadeia pesada que reconhecem, se ligam, e/ou neutralizam o polipeptídeo IL-
31. Tais regiões humanizadas de cadeia leve e pesada podem ser fusionadas com uma região constante de imunoglobulina, tal como, por exemplo, I0gG4 ou IgGl, e expressas em uma variedade de células hospedeiras. As segiiências humanizadas de região variável de anti-IL-31 descritas neste lugar foram geradas usando sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anti-IL-31 humana de camundongo de anticorpos monoclonais previamente descritas em Pedido de Patente U.S. Número de Série 11/430.066, depositado em 8 de Maio de 2006 (Publicação de Patente U.S.No. 2006-02752960), neste lugar incorporado por referência.
Anticorpos podem compreender anticorpos ou fragmentos de anticorpos, compreendendo ou consistindo de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, e podem ser quiméricos, humanizados, ou fragmentos de anticorpos que neutralizam, inibem, reduzem, previnem ou minimizam os efeitos de IL-31 em seu receptor. Resultados clínicos do anticorpo ou fragmentos de anticorpos podem ser uma redução em doenças inflamatórias e autoimunes, tal como dermatite, em particular dermatite atópica, e doenças pruriginosas e doença de Crohn, como adicionalmente descrito neste lugar. Em uma forma de realização, a dermatite é dermatite atópica. Em outra forma de realização a dermatite é prurigo nodular. Em outra forma de realização, a dermatite é eczema. À redução também pode ser uma redução em comichão, coceira, ou perda de cabelo.
IL-31 é uma citocina de célula T recentemente descoberta que, quando superexpressa em camundongos, resulta em sintomas tipo dermatite.
Veja, Dillon, et al., Nature Immunol. 5:752-760, 2004. IL-31 é o nome HUGO para uma citocina que foi previamente descrita como Zcytol7rlig em Pedido de Patente U.S. Número de Série 10/352.554, depositado em 21 de Janeiro de 2003 (Publicação de Patente U.S. No. 2003-0224487), agora Patente U.S. No. de Série 7.064.186, Sprecher, Cindy et al., 2003, incorporado neste lugar por referência). Veja também, Dillon, et al., Nature Immunol. , acima. A sequência de aminoácidos de IL-31 humana é mostrada em SEQ ID NO: 24. Análise de tecido revelou que expressão de IL-31 de camundongo é encontrada em testículos, cérebro, células CD90+, células da próstata, glândula salivar e pele.
O receptor heterodimérico para 11-31 foi descrito em Publicação de Patente U.S.
No. 20030224487 como zcytorl7 (nome HUGO, IL-31RA) que forma um heterodímero com receptor beta de Oncostatina M (OSMRbeta). IL-31 foi isolada de uma biblioteca de cDNA gerada a partir de células ativadas de sangue periférico humano (hPBCs), que foram selecionadas para CD3. CD3 é um marcador de superfície celular exclusivo para células de origem linfóide, particularmente células T.
Inibição, neutralização, ou bloqueio de transdução de sinal pelas moléculas compreendendo um domínio variável de cadeia leve — humanizado de camundongo anti-humano e/ou um domínio variável de cadeia pesada humanizado de camundongo anti-humano, denominado "moléculas de ligação de antígeno de IL-31" ou "antagonistas de IL-31" neste lugar, podem ser medidos por diversos ensaios conhecidos por alguém versado na arte.
Por exemplo, ensaios medindo uma redução em proliferação incluem ensaios para redução de um corante tal como AlamarBlue!M (AccuMed International, Inc.
Westlake, Ohio), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazo 1-2-11)-2,5-difenil tetrazólio (Mosman, J.
Immunol.
Meth. 65: 55-63, 1983); 3 (4,5 dimetil tiazol-211)-5-3- carboximetoxifenil-2H-tetrazólio; hidróxido de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5- sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazólio; e cloreto de cianoditolil- tetrazólio (que estão disponíveis comercialmente a partir de Polysciences, Inc., Warrington, PA); ensaios de mitogênese, tal como medida de incorporação de ?H-timidina; ensaios de exclusão de corante usando, por exemplo, preto de naftaleno ou azul de tripan; absorção de corante usando diacetil fluoresceína; e liberação de cromo.
Veja, em geral, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994, que é incorporado neste lugar por referência.
Em adição ao acima, veja Patente U.S. publicada número de publicação 20030224487, (Sprecher, Cindy et al., 2003) para um exemplo de células BaF3 expressando IL-31 RA e OSMRbeta de comprimento completo ou como mostrado nos exemplos de atividade descritos neste lugar.
Métodos para preparar os polinucleotídeos codificando os anticorpos descritos neste lugar (incluindo DNA e RNA) são bem conhecidos na arte. RNA total pode ser preparado usando extração por isotiocianato de guanidina seguida por isolamento por centrifugação em um gradiente de CsCI (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Poli (A)' RNA é preparado a partir de RNA total usando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). DNA complementar (cDNA) é preparada a partir de poli(A)* RNA usando métodos conhecidos. Em caso distinto, DNA genômico — pode ser isolado. Polinucleotídeos codificando anticorpos IL-31 são então identificados e isolados, por exemplo, por hibridização ou PCR.
A presente invenção também inclui moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que se ligam a fragmentos funcionais de polipeptídeos IL-31 e moléculas de ácido nucléico —codificando tais fragmentos funcionais. Uma IL-31 "funcional" ou fragmento desta como definido neste lugar é caracterizada por sua atividade proliferativa ou diferenciadora, por sua capacidade de induzir ou inibir funções de células especializadas, por sua capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo anti- IL-31 ou heterodímeros IL-3IRA/OSMRbeta destes receptores (ou — solúveis ou imobilizados). Assim, a presente invenção fornece adicionalmente moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que se ligam a uma molécula de polipeptídeo compreendendo um ou mais fragmentos funcionais de IL-31.
A presente invenção também fornece moléculas humanizadas — de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que se ligam a fragmentos de polipeptídeos ou peptídeos compreendendo uma porção portando epítopo de um polipeptídeo IL-31 ou um epítopo imunogênico ou epítopo antigênico. A ligação dos anticorpos a estes epítopos resulta em inibição, bloqueio, neutralização, e/ou redução em transdução de sinal de IL-
31 em seu receptor cognato.
Anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL-31 humana foram previamente descritos em Pedido de Patente U.S. co-pendente Número de Série 11/430.066, depositado em 8 de Maio de 2006 (Publicação de — Patente U.S. No. 2006-02752960). As seqiiências de aminoácidos das regiões variáveis de anticorpos de camundongo anti-IL-31 humana descritas em Pedido de Patente U.S. co-pendente Número de Série 11/850.006, depositado em 4 de Setembro de 2007 e pedido de PCT com co-propriedade USO07/77555, depositado em 4 de Setembro de 2007, ambos os quais são incorporados por referência neste lugar para as sequências de região variável e métodos de produção de anticorpos. Estas sequências de aminoácidos foram usadas como material inicial para as sequências humanizadas descritas neste lugar. Especificamente, a sequência de anticorpo de camundongo anti-IL-31 humana foi de um hibridoma com o clone número 292.12.3.1.
A atividade dos anticorpos como descrito neste lugar pode ser medida por sua capacidade de inibir, ou reduzir proliferação usando uma variedade de ensaios que medem proliferação de e/ou ligação com células expressando o receptor IL-3IRA. De interesse particular são alterações em células dependentes de IL-31. Linhagens celulares adequadas para serem — manipuladas para serem dependentes de IL-31 incluem a linhagem celular BaF3 dependente de IL-3 (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-PI (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), e M07e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993). Linhagens celulares dependentes de fatores de crescimento podem ser — estabelecidas de acordo com métodos publicados (e.g. Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., in Baum et al. Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980). A atividade dos anticorpos humanizados anti-IL-31 ou antagonistas também pode ser medida no ensaio de proliferação de BaF3, no ensaio Biacore, ou nos ensaios NHK descritos neste lugar.
Em uma forma de realização, o domínio de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é selecionado a partir do grupo consistindo da região constante de cadeia uma cadeia pesada de imunoglobulina humana a7vuôdoue Dita região constante pode ser a região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana y1, 72, 73 ou y4.
Em outra forma de realização, o domínio de região constante de cadeia leve de imunoglobulina é selecionado a partir do grupo consistindo da região constante de uma cadeia leve de imunoglobulina humana K ou X.
Em outra forma de realização, a cadeia pesada constante é y4 humana, que é estável em solução e tem pouca ou nenhuma atividade de ativação de complemento. Em outra forma de realização, a cadeia pesada constante é y1 humana.
A imunoglobulina pode ser selecionada a partir de qualquer das principais classes de imunoglobulinas, incluindo IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e qualquer subclasse ou isotipo, e.g. IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA-1 e IgA-2.
Inibição da atividade de IL-31 pode ser medida por diversos ensaios. Em adição àqueles ensaios descritos neste lugar, amostras podem ser testadas para inibição de atividade de IL-31 dentro de uma variedade de ensaios projetados para medir ligação de receptor, a estimulação/inibição de respostas celulares dependentes de IL-31l ou proliferação de células expressando receptor IL-31 RA.
Um polipeptídeo de ligação de IL-31, incluindo moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem ser usados para purificação de ligante. O polipeptídeo é imobilizado em um suporte sólido, tal como microesferas de agarose, agarose reticulada, vidro, resinas celulósicas, resinas baseadas em sílica, poliestireno, poliacrilamida reticulada, ou materiais semelhantes que são estáveis nas condições de uso.
Métodos para ligar polipeptídeos a suportes sólidos são conhecidos na arte, e incluem química de amina, ativação com brometo de cianogênio, ativação com N-hidroxisuccinimida, ativação com epóxido, ativação com sulfidrila, e ativação com hidrazida. O meio resultante geralmente será configurado na forma de uma coluna, e fluidos contendo ligante são passados através da coluna uma ou mais vezes para permitir que ligante se ligue ao polipeptídeo receptor. O ligante é então eluído usando alterações em concentração salina, agentes caotrópicos (guanidina HCl), ou pH para romper ligação ligante- receptor.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são considerados como sendo de ligação especificamente se: 1) eles exibem um nível mínimo de atividade de ligação, e 2) eles não reagem significativamente de forma cruzada com moléculas de polipeptídeos relacionados. Um nível mínimo de ligação é determinado se moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 neste lugar se ligam a um polipeptídeo IL-31, peptídeo ou epítopo com uma afinidade pelo menos 10 vezes maior do que a afinidade de ligação para polipeptídeo de controle (não IL-31). É preferido que os anticorpos exibam uma afinidade de ligação (Ka) de 10º M' ou mais, preferivelmente 10? M' ou mais, mais preferivelmente 10º M' ou mais, e mais preferivelmente 10º M' ou mais. A afinidade de ligação de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode ser prontamente determinada por alguém de habitual verso na arte, por exemplo, por análise Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
Se moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 não reagem de forma cruzada significativamente com moléculas de polipeptídeos relacionados é mostrado, por exemplo, pelas moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 detectando polipeptídeo IL-31, mas não polipeptídeos relacionados conhecidos usando uma análise Western blot padrão (Ausubel et al., ibid.). Triagem também pode ser feita usando IL-31 não humana, e polipeptídeos IL-31 mutantes. Além disso, moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL- 31 podem ser "triadas contra" polipeptídeos relacionados conhecidos, para isolar uma população que se liga especificamente aos polipeptídeos IL-31. Por exemplo, moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são adsorvidos a polipeptídeos relacionados aderidos a matriz insolúvel; moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 específicos para IL-31 irão passar através da matriz nas condições apropriadas — de tampão. Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são caracterizados por sua capacidade de bloquear, inibir, prevenir, ou reduzir ligação de receptor quando cultivados na presença das proteínas recombinantes purificadas IL-31 humanas. Por exemplo, as moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser caracterizadas de diversas maneiras incluindo binagem (i.e, — determinar se cada anticorpo pode inibir a ligação de qualquer outra ligação), afinidade relativa, e neutralização.
As moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da invenção são mostradas em Tabela 1, abaixo, e em Figura |.
Em Tabela 1, abaixo, para os clones tendo a designação de "12VHI" (i.e., clones 7, 9, 10, 13-18, e 26-36): o termo 'Mack" significa LC(back) + HC(thack); o termo “LC(back)" significa LC(G66R, G68E, D70Q, F71Y, T72S); e o termo “HC(back)" significa HC(F29L, M69L, R71A, T73K, V78A, R94F). Similarmente, em Tabela 1, abaixo para os clones tendo a designação de "12VHS5" (Le., clones 8, Il e 21-24): o termo “fback" significa LC(back) + HC(bback); o termo “LC(back)" significa LC(G66R, G68E, D70Q, F71Y, T72S); e o termo “HC(back)” significa HC(G24A, S28T, F29L, I69L, S70T, R94F). Tabela 1: Construções humanizadas 292.12.3.1 Número de [Descrição de Mutação Cadeia Pesada |Cadeia Leve Clone SEQID SEQID
NO: NO: LL 7 f2vHIgyHback | 8 [2VH5-gly+foack | 9 2VHIgIy+HC(fback) | 10 [[VHIgIy+LC(fback) [Lu [2VH5-gy+HC(fback)
13 — f[12VHI-gIy+HC(F29L, M69L, R71A, T73K] 30 26
T8A)+LC(fback) 14 — f[2VHI-gIy+HC(M69L, R71A, T73K, VBA) 31 26 R94F)+LC(fback)
[| 16 |2VHI-gIy+HC(fback)+LC(G66R, G68E, D70Q, T72S) [| 17 [2VHIgy+HC(fback)HLC(D70Q, F71Y, T725) [| 18 — [PVHI-gIy+HC(fback)+LC(G66R, G68E, F71Y) [| 21 j2VH5-gly+HC(GHA, S28T, F29L, R94F)+LC(fback) [| 22 j2VH5-gly+HC(fback)+LC(G66R, G68E, D70Q, T72S) | 23 [2VH5-gly+HC(fback)HLC(D70Q, F71Y, T725) [| 24 — [2VH5-gly+HC(fback)+LC(G66R, G68E, F71Y) | 25 [2VH1-glyrHC(F29L R94F)+L C(F71Y) [| 26 2VHIgIy+HC(Mack)HLC(F71Y) | 27 — [2VHI-gIy+HC(F29L,M69L,R94F)+LC(F71Y) [| 28 [2VH1-glyHHC(FE29LR71 ARMPHLC(E7IY) [| 29 [2VH1-glyrHC(F29L, TI3K,R94P)+LC (F71Y) | 30 j2VHI-gly+HC(F29L,V78A,R94F)+LC(F71Y) [| 31 — [2VHI-gIy+HC(F29L,M69L,R71A,V78A,R94F)+LC(F71Y) | 32 —[12VH1-gy+HC(F29L,R71A,V78A.R94F)+LC(F71Y) | 33 —[2VHI(germ)-gly+fback | 34 [2VHIgIy+HC(F29L, R94E)+LC(fback) | 35 — [2VHI-gIy+HC(F29L, R94F) [36 JOVHI(germ)-gly+HC(F29L,T73K,.R94P)+LC(F71Y) Os anticorpos descritos neste lugar podem ser produzidos por qualquer técnica conhecida em si na arte, tal como por tecnologias recombinantes, síntese química, clonagem, ligações, ou combinações destes.
Em uma forma de realização, os anticorpos da presente invenção são — produzidos por tecnologias recombinantes, e.g., por expressão de um ácido nucléico correspondente em uma célula hospedeira adequada.
O polipeptídeo produzido pode ser glicosilado ou não, ou pode conter outras modificações pós-traducionais dependendo do tipo de célula hospedeira usado.
Muitos livros e revisões fornecem ensinamentos sobre como clonar e produzir proteínas recombinantes usando vetores e células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tal como alguns títulos na série "A Practical Approach" publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
Um objeto adicional da presente invenção é, portanto, uma molécula isolada de ácido nucléico codificando qualquer dos anticorpos aqui descritos acima ou abaixo, ou uma fita complementar ou sequência degenerada desta. Nesse aspecto, o termo “molécula de ácido nucléico" — abrange todos os tipos diferentes de ácidos nucléicos, incluindo sem limitação ácidos desoxirribonucléicos (e.g., DNA, cDNA, gDNA, DNA sintético, etc.), ácidos ribonucléicos (e.g., RNA, mRNA, etc.) e ácidos nucléicos peptídicos (PNA). Em uma forma de realização preferida, a molécula de ácido nucléico é uma molécula de DNA, tal como uma molécula de DNA dupla fita ou uma molécula de cDNA. O termo “isoladas” significa moléculas de ácido nucléico que foram identificadas e separadas de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com a qual ela é habitualmente associada na fonte natural. Uma molécula isolada de ácido nucléico é outra do que na forma ou configuração na qual ela é encontrada na natureza. Moléculas isoladas de ácido nucléico, portanto, são distinguidas da molécula de ácido nucléico específica como ela existe em células naturais. Uma sequência degenerada designa qualquer sequência de nucleotídeos codificando a mesma seqiiência de aminoácidos que uma sequência de nucleotídeos de referência, mas compreendendo uma sequência de nucleotídeos distinta como um resultado da — degenerescência do código genético.
Um objeto adicional desta invenção é um vetor compreendendo DNA codificando qualquer dos anticorpos descritos acima ou abaixo. O vetor pode ser qualquer vetor de clonagem ou expressão, integrativo ou autonomamente replicante, funcional em qualquer célula procariótica ou eucariótica.
Em particular, o vetor pode ser um plasmídeo, cosmídeo, vírus, fago, epissomo, cromossomo artificial, e os semelhantes.
O vetor pode compreender as sequências de codificação tanto para a cadeia pesada como leve, ou uma das duas das sequências de codificação de cadeia —levee pesada.
O vetor deve compreender sequências de codificação tanto para cadeias pesadas como leves, as cadeias pesadas e leves podem ser cada uma operacionalmente ligadas com um promotor.
O promotor pode ser o mesmo ou diferente para a cadeia pesada e leve.
A cadeia pesada e leve também podem ser operacionalmente ligadas com um único promotor, neste caso as — sequências de codificação para as cadeias pesadas e leves preferivelmente podem ser separadas por um sítio interno de entrada ribossomal (IRES). Promotores adequados para expressão de gene eucariótico são, por exemplo, promotores derivados de genes virais tal como o promotor de citomegalovírus (CMV) murino ou humano ou o de vírus de sarcoma Rous (RSV), que são bem conhecidos pela pessoa versada na arte.
O vetor pode compreender elementos reguladores, tal como um promotor, terminador, acentuador, marcador de seleção, origem de replicação, etc.
Exemplos específicos de tais vetores incluem plasmídeos procarióticos, tal como plasmídeos pBR, pUC ou PcDNA; vetores virais, incluindo vetores retrovirais, adenovirais ou AAV; — bacteriófagos; baculovírus; BAC ou YAC, etc., como será discutido abaixo.
À sequência de ácidos nucléicos apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos.
Em geral, DNA é inserido em um(uns) sítio(s) de endonuclease de restrição apropriado(s) usando técnicas conhecidas na arte.
Construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelo artesão versado.
Um aspecto adicional da presente invenção é uma célula hospedeira recombinante, caracterizado pelo fato de que dita célula compreende uma molécula de ácido nucléico ou um vetor como definido acima.
A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica.
Exemplos de células procarióticas incluem bactérias, tal como E.coli.
Exemplos de células eucarióticas são células de leveduras, células vegetais, células de mamíferos e células de insetos incluindo qualquer cultura celular primária ou linhagem celular estabelecida (e.g., 3T3, Vero, HEK293, TNS, etc.). Células hospedeiras adequadas para a expressão de proteínas glicosiladas são derivadas de organismos multicelulares.
Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos tal como S2 de Drosophila e Sf9 de Spodoptera, assim como células vegetais.
Exemplos de linhagens celulares — hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO) e COS.
Mais exemplos específicos incluem linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem embrionária de rim humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J.
Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc.
Natl, Acad.
Sci.
USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongos (TMA4, Mather, Biol.
Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); e tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCLS5I). Células de mamíferos particularmente preferidas da presente invenção são células CHO.
Células de mamíferos ainda particularmente preferidas adequadas para expressão dos anticorpos da invenção são células murinas, tal como células de mieloma de camundongo (NSO). Como descrito aqui acima, os anticorpos da presente invenção — podem ser produzidos por qualquer técnica conhecida em si na arte, tal como por tecnologias recombinantes, síntese química, clonagem, ligações, ou combinações destes.
Em uma forma de realização particular, os receptores solúveis são produzidos por tecnologias recombinantes, e.g., por expressão de um ácido nucléico correspondente em uma célula hospedeira adequada.
Outro objeto desta invenção é, portanto, um método de produzir um anticorpo da presente invenção, o método compreendendo cultivar uma célula hospedeira recombinante da invenção em condições permitindo expressão da molécula de ácido nucléico, e recuperar o polipeptídeo produzido. O método de produção — da presente invenção pode compreender adicionalmente a etapa de formular o polipeptídeo em uma composição farmacêutica. O polipeptídeo produzido pode ser glicosilado ou não, ou pode conter outras modificações pós- traducionais dependendo do tipo de célula hospedeira usado. Muitos livros e revisões fornecem ensinamentos sobre como clonar e produzir proteínas —recombinantes usando vetores e células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, tal como alguns títulos na série "A Practical Approach" publicada por Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001).
Os vetores a serem usados no método de produzir um anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser vetores de integração epissomal ou não homóloga, que podem ser introduzidos nas células hospedeiras apropriadas por qualquer maneira adequada (transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, microinjeção direta, etc.). Fatores de importância para selecionar um plasmídeo, vetor viral ou retroviral particular incluem: a facilidade com que células receptoras que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas a partir daquelas células receptoras que não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que são desejadas em um — hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de “transferir” o vetor entre células hospedeiras de espécies diferentes. Os vetores devem permitir a expressão do polipeptídeo ou proteínas de fusão da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, sob o controle de sequências reguladoras de iniciação / término de transcrição apropriadas, que são escolhidas para serem constitutivamente ativas ou induzíveis em dita célula. Uma linhagem celular substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isolada para fornecer uma linhagem celular estável. Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos neste lugar para produção de proteínas e cultivadas em meio nutritivo convencional modificado conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes codificando as sequências desejadas. As condições de cultura, tal como meio, temperatura, pH e os semelhantes, podem ser selecionadas pelo artesão versado sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos, e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al. acima.
Para células hospedeiras eucarióticas (e.g. células de leveduras, insetos ou mamíferos), diferentes sequências reguladoras de transcrição e tradução podem ser empregadas, dependendo da natureza do hospedeiro. Elas podem ser derivadas de fontes virais, tal como adenovírus, papilomavírus, vírus símio ou os semelhantes, onde os sinais reguladores — estão associados com um gene particular que tem um alto nível de expressão. Exemplos são o promotor TK do herpesvírus, o promotor precoce de SV40, o promotor do gene gal4 de levedura, etc. Podem ser selecionados sinais reguladores de início de transcrição que permitem repressão e ativação, de forma que expressão dos genes pode ser modulada. As células que foram — estavelmente transformadas pelo DNA introduzido podem ser selecionadas introduzindo também um ou mais marcadores que possibilitam seleção de células hospedeiras que contêm o vetor de expressão. O marcador também pode fornecer fototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocida, e.g. antibióticos, ou metais pesados tal como cobre, ou os semelhantes. O gene marcador selecionável pode ser ou diretamente ligado às sequências de DNA a serem expressas (e.g., no mesmo vetor), ou introduzidas na mesma célula por cotransfecção. Elementos adicionais também podem ser necessários para sintase ótima de proteínas da invenção.
Células procarióticas adequadas incluem bactérias (tal como Bacillus subtilis ou E. coli) transformadas com um vetor de expressão de DNA recombinante de bacteriófago, plasmídeo ou cosmídeo. Tais células tipicamente produzem proteínas compreendendo um resíduo de metionina N- terminal. Células preferidas para serem usadas na presente invenção são células hospedeiras eucarióticas, e.g. células de mamíferos, tal como humano, macaco, camundongo, e células de ovário de hamster chinês (CHO), pois elas fornecem modificações pós-traducionais a moléculas de proteínas, incluindo dobramento correto ou glicosilação em sítios corretos. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos adequadas incluem células de rim de macaco verde africano (Vero; ATCC CRL 1587), células embrionárias de rim humano (293- HEK; ATCC CRL 1573), células de rim de hamster neonato (BHK-21, BHK- 570; ATCC CRL 8544, ATCC CRL 10314), células de rim de caninos (MDCK; ATCC CCL 34), células de ovário de hamster chinês (CHO-KI; ATCC CCL61; CHO DG44 (Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555, 1986)), células da hipófise de rato (GH1; ATCC CCL82), células HeLa S3 (ATCC CCL2.2), células de hepatoma de rato (H-4-II-E; ATCC CRL 1548), células de rim de macaco transformadas com SV40 (COS-1; ATCC CRL 1650), melanoma de Bowes e carcinoma hepatocelular humano (por exemplo Hep G2), células embrionárias murinas (NIH-3T3; ATCC CRL 1658) e diversas outras linhagens celulares. Células hospedeiras eucarióticas alternativas são células de leveduras (e.g., Saccharomyces, Kluyveromyces, etc.) transformadas com vetores de expressão de levedura. Células de leveduras também podem realizar modificações pós-traducionais de peptídeos incluindo glicosilação. Há diversas estratégias de DNA recombinante que utilizam sequências de promotores fortes e alto número de cópias de plasmídeos que podem ser utilizadas para produção das proteínas desejadas em levedura. Células de leveduras reconhecem seqgiiências líderes em produtos de genes clonados de mamíferos e secretam polipeptídeos portando sequências líderes (i.e., pré-peptídeos).
Para produção de alto rendimento a longo prazo de um polipeptídeo recombinante, expressão estável é preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente o polipeptídeo de interesse podem ser transformadas usando vetores de expressão que podem conter origens de replicação virais e/ou elementos endógenos de expressão e um gene marcador selecionável no mesmo vetor ou em um separado. Seguindo a introdução do vetor, células podem ser deixadas para crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes de elas serem trocadas para meio seletivo. O propósito do marcador selecionável é conferir resistência a seleção, e sua presença permite crescimento e recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Clones resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando técnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo de célula. Uma linhagem celular substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isolada para fornecer uma linhagem celular estável.
Um método particularmente preferido de produção de alto rendimento de um polipeptídeo recombinante da presente invenção é através do uso de amplificação de dihidrofolato redutase (DHFR) em células CHO deficientes em DHFR, pelo uso de níveis sucessivamente crescentes de — metotrexato como descrito em Patente U.S. 4.889.803. O polipeptídeo obtido pode estar em uma forma glicosilada.
Anticorpos descritos neste lugar também podem ser expressos em outras células eucarióticas, tal como células de aves, fungos, insetos, leveduras, ou vegetais. O sistema de baculovírus fornece uma maneira eficiente de introduzir genes clonados em células de insetos. Os materiais para sistemas de expressão de baculovírus / célula de inseto estão comercialmente disponíveis em forma de kit, entre outros, Invitrogen.
Em adição a tecnologias de DNA recombinante, os anticorpos desta invenção podem ser preparados por tecnologias de síntese química. Exemplos de tecnologias de síntese química são síntese em fase sólida e síntese em fase líquida. Como uma síntese em fase sólida, por exemplo, o aminoácido correspondente ao término carboxi do polipeptídeo a ser sintetizado é ligado a um suporte que é insolúvel em solventes orgânicos e, por repetição alternada de reações (e.g., por condensação sequencial de aminoácidos com seus grupos amino e grupos funcionais de cadeias laterais protegidos com grupos protetores apropriados), a cadeia de polipeptídeo é prolongada. Métodos de síntese em fase sólida são amplamente classificados pelo método tBoc e o método Fmoc, dependendo do tipo de grupo protetor usado. Proteínas totalmente sintéticas são descritas na literatura (Brown A et al., 1996).
Os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos, formulados, administrados, ou genericamente usados em outras formas alternativas que podem ser preferidas de acordo com o método desejado de uso e/ou produção. As proteínas da invenção podem ser modificadas pós- traducionalmente, por exemplo, por glicosilação. Os polipeptídeos ou proteínas da invenção podem ser fornecidos em forma isolada (ou purificada) biologicamente ativa, ou como precursores, derivados e/ou sais destes.
Conjugados ou complexos úteis também podem ser gerados — para melhorar os agentes em termos de eficácia de liberação de fármaco. Para este propósito, os anticorpos descritos neste lugar podem estar na forma de conjugados ativos ou complexo com moléculas tal como polietilenoglicol e outros polímeros naturais ou sintéticos (Harris IM e Chess RB, 2003; Greenwald RB et al., 2003; Pillai O e Panchagnula R, 2001). Nesse aspecto, a presente invenção contempla anticorpos quimicamente modificados como descrito neste lugar, nos quais o anticorpo é ligado com um polímero.
Tipicamente, o polímero é solúvel em água de forma que o conjugado não precipita em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico.
Um exemplo de um polímero adequado é um que foi modificado para ter um único grupo reativo, tal como um éster ativo para acilação, ou um aldeído para alquilação.
Desta maneira, o grau de polimerização pode ser controlado.
Um exemplo de um aldeído reativo é polietilenoglicol propionaldeído, ormono- (CI-CIO) alcoxi, ou derivados de ariloxi destes (veja, por exemplo, Harris,etal., Patente U.S.
No. 5.252.714). O polímero pode ser ramificado ou não ramificado.
Além disso, uma mistura de polímeros pode ser usada para produzir os conjugados.
Os conjugados usados para terapia podem compreender unidades de polímeros solúveis em água farmaceuticamente aceitáveis.
Polímeros solúveis em água adequados incluem polietilenoglicol (PEG), monometoxi-PEG, mono- (CI-CIO0) alcoxi-PEG, ariloxi- PEG, poli- (N-vinil pirrolidona) PEG, tresil monometoxi PEG, PEG propionaldeído, PEG bis-succinimidil carbonato, homopolímeros de propilenoglicol, um copolímero óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (e.g., glicerol), álcool polivinílico, dextran, celulose, ou outros polímeros — baseados em carboidratos.
PEGs adequados podem ter um peso molecular de cerca de 600 a cerca de 60.000, incluindo, por exemplo, 5.000, 12.000, 20.000 e 25.000. Um conjugado também pode compreender uma mistura de tais polímeros solúveis em água.
Exemplos de conjugados compreendem qualquer dos — anticorpos descritos aqui acima e uma unidade de óxido de polialcila acoplada ao término N de dito receptor solúvel.
PEG é um óxido de polialquila adequado.
Como uma ilustração, qualquer dos anticorpos descritos neste lugar pode ser modificado com PEG, um processo conhecido como "PEGuilação.
PEGuilação pode ser realizada por qualquer das reações de PEGuilação conhecidas na arte (veja, por exemplo, Patente Européia O 154 316, Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan e Spreafico, Clin.Pharmacokinet. 27: 290 (1994), e Francis et al., Int J Hematol 68: 1 (1998)). Por exemplo, PEGuilação pode ser realizada por uma reaçãode acilação ou por uma reação de alquilação com uma molécula reativa de polietilenoglicol. Em um método alternativo, conjugados são formados condensando PEG ativado, no qual um grupo hidroxi ou amino terminal de PEG foi substituído por um ligante ativado (veja, por exemplo, Karasiewicz et al., Patente U.S. No. 5.382.657). Preferivelmente, todas estas modificações não afetam significativamente a capacidade do anticorpo de se ligar a IL-31 humana.
Os anticorpos descritos neste lugar podem compreender um resíduo de aminoácido N-terminal adicional, preferivelmente uma metionina. De fato, dependendo do sistema e condições de expressão, polipeptídeos podem ser expressos em uma célula hospedeira recombinante com uma metionina inicial. Este aminoácido adicional então pode ser ou mantido na proteína recombinante resultante, ou eliminado por meio de uma exopeptidase, tal como Metionina Aminopeptidase, de acordo com métodos descritos na literatura (Van Valkenburgh HA e Kahn RA, Methods Enzymol.
— (2002) 344:186-93; Ben-Bassat A, Bioprocess Technol. (1991) 12:147-59). Como será mostrado na parte de exemplos do presente documento, anticorpos de camundongo anti-IL-31 humana podem incluir sítios potenciais de glicosilação em seus domínios variáveis. Por exemplo, clone 292.12.3.1 porta um sítio de glicosilação na região estrutural FRI do — domínio variável de cadeia pesada. Os requerentes da presente invenção encontraram agora que dito sítio de glicosilação não é necessário para manter uma boa afinidade de ligação para IL-31 humana. Além disso, abolir este sítio de glicosilação (e.g. por mutação) tem um efeito positivo na termoestabilidade do anticorpo. Portanto em uma forma de realização da presente invenção, os anticorpos como descrito neste lugar não têm sítio de glicosilação em seus domínios variáveis.
Moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 gerados pelos métodos descritos neste lugar podem ser testados para neutralização por uma variedade de métodos. Por exemplo, o ensaio de luciferase como descrito em pedido publicado de Patente U.S. (Veja número de publicação 20030224487, Sprecher, Cindy et al., 2003) pode ser usado. Em adição neutralização pode ser testada medindo uma diminuição na produção de quimiocinas pró-inflamatórias tal como TARC e MDC a partir de culturas de queratinócitos na presença de ligante e do anticorpo monoclonal. Neutralização também pode ser medida pelos ensaios in vivo e in vitro descritos neste lugar.
Redução de TARC e MDC em resposta aos anticorpos humanizados anti-IL-31 e antagonistas descritos neste lugar pode ser medida 15" emum modelo de camundongo AD como segue: Método 1) Camundongos NC/Nga machos de seis semanas de idade (CRL Japan) são sensibilizados intradermicamente com 5O0ug de extrato de ácaro da poeira (D. pteronyssinus, Indoor Biotechnologies) três vezes por semana nas costas e pontuados para lesões tipo AD. Depois de 5 semanas de — sensibilização os camundongos são eutanasiados e as orelhas direitas foram removidas e colocadas em um único poço de uma placa de cultura de 48 poços (Corning) suplementada com RPMI+2%FBS (GIBCO Invitrogen). Placas são emplacadas em incubadoras controladas com umidade de C02 a 5%. Sobrenadantes são coletados depois de 24 horas e congelados a -20 ºC — até análise posterior.
Método II) Camundongos NC/Nga fêmeas de doze semanas de idade (CRL Japan) são sensibilizados intradermicamente com 10ug de SEB (Toxin Technology) na orelha e nas costas três vezes por semana. Os camundongos são pontuados para lesões tipo AD. Depois de 5 semanas de sensibilização os camundongos são eutanasiados e pinças de biópsia de 6Gmm foram tiradas da orelha injetada de cada camundongo e colocadas em um único poço de uma placa de cultura de 48 poços suplementado com RPMI+2%FBS. Placas foram emplacadas em incubadoras controladas com umidade de C02 a 5%. Sobrenadantes são coletados depois de 24 horas e congelados a -20 ºC até análise posterior.
Grupos de camundongos em ambos os estudos foram tratados com moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou os anticorpos ou antagonistas de IL-31 humanizada intraperitonealmente duas vezes a cada — semana começando depois de 1 a 2 semanas de sensibilização. Concentrações de TARC e MDC nas amostras de 24 horas de sobrenadantes são medidas por ELISA convencional (R&D Systems).
Em uma forma de realização, as moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção incluem, mas não são limitados a, Fab, Fab' e F(ab'),, Fd, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, Fvs ligados por dissulfeto (sdFv) e fragmentos compreendendo ou um domínio VL ou VH. Fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender a(s) região(ões) variável(eis) (1.e., SEQ ID NOs: 25-45) apenas ou em combinação com a totalidade ou uma porção dos seguintes: região de dobradiça, domínios Cy, CH2; e CH3. Também estão incluídos na invenção fragmentos de ligação de antígeno também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região de dobradiça, domínios Cy, Cuz, e CH3. Em outra forma de realização, a região variável de cadeia pesada de qualquer de SEQ ID NO:s 25; 27; 29; 30; 31; 35; 36; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44, e 45 pode ser combinada com a região variável de cadeia leve de qualquer de SEQ ID NOs: 26; 28; 32; 33; 34; e 37.
Em outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana,
compreendendo um domínio variável humanizado de cadeia pesada e um domínio variável humanizado de cadeia leve caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia pesada e um domínio variável humanizado de cadeia leve são selecionados a partir do grupo consistindo de: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; b) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um — domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:26; c) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; d) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de — cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; DD) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; g) um domínio variável humanizado de cadeia pesada — compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; h) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; i) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; j) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; k) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; 1) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; m) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a seqiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; n) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a segiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; o) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; Pp) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a — sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; q) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; r) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; s) um domínio variável — humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; t) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável humanizado de — cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; u) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; v) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; w) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a — sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; x) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; y) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência — de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e z) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 37.
Em outra forma de realização, a invenção fornece um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, compreendendo um domínio variável humanizado de cadeia pesada e um domínio variável humanizado de cadeia leve caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia pesada e um domínio variável humanizado de cadeia leve são selecionados a partir do grupo consistindo de: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25eum domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; b) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a segqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; c) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de —SEQID NO: 28;d)um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; e) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; £f) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; g) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequênciacom a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; h) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 eum domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32;
1) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90%
de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90%
de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; ]) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos
90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos
90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 34;k) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 35 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 26; 1) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; m) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; n) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; o) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio
— variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; p) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; q) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de
SEQ ID NO: 38 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; 7) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
s) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90%
de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:
40 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90%
— de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; 1) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos
90% de identidade de sequência com a segqiiência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 41 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos
90% de identidade de sequência com a segqiiência de aminoácidos de SEQ ID
NO: 37; u) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de — SEQIDNO:37;v)um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; w) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; x) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de seqiência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; y) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio — variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e z) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de
— identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em um aspecto a invenção fornece um anticorpo isolado selecionado a partir do grupo consistindo de: a) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 46 e uma cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 47;
b) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 48 e uma cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 49; e c) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 50 e uma — cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 51.
A presente invenção também inclui moléculas humanizadas recombinantes de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que são funcionalmente equivalentes àqueles descritos acima. Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 modificados fornecendo maior estabilidade ou eficácia terapêutica também estão incluídas. Exemplos de anticorpos modificados incluem aqueles com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, e uma ou mais deleções ou adições de aminoácidos que significativamente não alteram deleteriamente a utilidade de ligação de antígeno. Substituições podem variar de trocar ou modificar um ou mais resíduos de aminoácidos a reestruturação completa de uma região contanto que a utilidade terapêutica seja mantida. Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção podem ser modificados pós-traducionalmente (e.g., acetilação, e fosforilação) ou podem ser modificados sinteticamente (e.g, o acoplamento de um grupo de marcação). Sabe-se que as moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 projetadas pelo presente método podem ter substituições conservativas de aminoácidos adicionais que substancialmente não têm nenhum efeito em ligação de antígeno ou outras funções de imunoglobulinas.
As moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção incluem derivados que são modificados, por exemplo, mas não como forma de limitação, os derivados incluem moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que foram modificados, e.g., por glicosilação,
acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/de bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação com um ligante celular ou outra proteína, etc. Quaisquer das numerosas modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 compreendem CDRs de uma imunoglobulina de camundongo doadora e estruturas de cadeia pesada e cadeia leve de uma imunoglobulina humana aceptora. Métodos de fazer anticorpo humanizado são descritos em Patentes Norte-Americanas Nos. 5.301.101; 5.585.089;
5.693.762; e 6.180.370 (cada uma das quais é incorporada por referência em sua totalidade). As CDRs destes anticorpos podem ser então enxertadas em quaisquer estruturas humanas selecionadas, que são conhecidas na arte, para gerar o anticorpo humanizado desejado.
A invenção também fornece moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que inibem competitivamente a ligação de um anticorpo monoclonal descrito neste lugar —comlIL-31l humana. Inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na arte, por exemplo, usando os ensaios de ligação competitiva descritos neste lugar. Em formas de realização preferidas, o anticorpo inibe competitivamente a ligação de um anticorpo monoclonal da invenção em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo — menos 60%, ou pelomenos 50% com o polipeptídeo.
A invenção também fornece moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que inibem competitivamente ligação de um anticorpo com um epítopo da invenção se determinado por qualquer método conhecido na arte para determinar ligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios descritos neste lugar. Em formas de realização preferidas, o anticorpo inibe competitivamente ligação com o epítopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%.
As meias-vidas in vivo das moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser aumentadas modificando (e.g., substituindo, deletando ou adicionando) resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptor FcRn (veja, e.g., Publicação Internacional Nos. WO 97/34631 e WO 02/060919, que são incorporadas neste lugar por referência em suas totalidades), ou acoplando moléculas de polímeros tal como polietilenoglicol (PEG) de alto peso molecular. PEG pode ser acoplado com ou sem um ligante multifuncional ou através de conjugação sítio específica do PEG ao término N ou C de ditos anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou através de grupos epsilon-amino presentes em resíduos de lisina. Derivatização de polímero linear ou ramificado que resulta em perda mínima de atividade biológica será usada. O grau de conjugação será monitorado de perto por SDSPAGE e espectrometria de massa para assegurar conjugação apropriada de moléculas de PEG aos anticorpos. PEG não reagido pode ser separado de conjugados — anticorpo-PEG por, e.g., cromatografia de exclusão por tamanho ou troca iônica.
A presente invenção inclui critérios pelos quais um número limitado de aminoácidos na estrutura de uma cadeia de imunoglobulina humanizada são escolhidos para serem os mesmos que os aminoácidos em — tais posições no doador ao invés de no aceptor, a fim de aumentar a afinidade de um anticorpo compreendendo a cadeia de imunoglobulina humanizada.
Em adição às imunoglobulinas humanizadas especificamente descritas neste lugar, outras imunoglobulinas modificadas "substancialmente homólogas" às sequências nativas podem ser prontamente projetadas e fabricadas utilizando várias técnicas de DNA recombinante bem conhecidas por aqueles versados na arte. Uma variedade de diferentes regiões estruturais humanas podem ser usadas unicamente ou em combinação como uma base para as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção. Em geral, modificaçõesdos genes podem ser prontamente realizadas por uma variedade de técnicas bem conhecidas, tal como mutagênese sítio dirigida (veja, Gillman e Smith, Gene, 8, 81-97 (1979) e S. Roberts et al., Nature, 328, 731-734 (1987), ambos os quais são incorporados neste lugar por referência). Os anticorpos humanizados da invenção incluem fragmentos — assim como anticorpos intactos. Tipicamente, estes fragmentos competem por ligação de antígeno com o anticorpo intacto do qual eles foram derivados. Os fragmentos tipicamente se ligam com uma afinidade de pelo menos 10º M."!, e mais tipicamente 10º ou 10º M. ' (i e., dentro dos mesmos intervalos que o anticorpo intacto). Fragmentos de anticorpos humanizados incluem cadeias pesadas separadas, cadeias leves Fab, Fab' F(ab'),, e Fv. Fragmentos são produzidos por técnicas de DNA recombinante, ou por separação enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
Para detalhes sobre humanizar anticorpos, veja Patente Européia Nos. EP 239.400, EP 592.106, e EP 519.596; Publicação Internacional. Nos. WO 91/09967 e WO 93/17105; Patente U.S. Nos.
5.225.539, 5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.766.886, e 6.407.213; e Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489 498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805 814; Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969 973; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119 25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13: 353 60; Morea et al., 2000, Methods 20: 267 79; Baca et al., 1997,]. Biol. Chem. 272: 10678 84; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9: 895 904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s 5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55: 1717 22; Sandhu, 1994, Gene 150: 409 10; Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235: 959 73; Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525;
Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323-329; e Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.
Várias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Estes fragmentos podem ser derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (veja, e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)), ou produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados das bibliotecas de anticorpos em fago discutidas acima. — Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab'), (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). De acordo com outro método, fragmentos F(ab') 2 podem ser isolados diretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão perceptíveis para o profissional versado. Além disso, exemplos de técnicas que podem ser usadas para produzir Fvs de cadeia única e anticorpos incluem aquelas descritas em Patente U.S. 4.946.778 e
5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
A presente invenção abrange anticorpos recombinantemente fusionados ou quimicamente conjugados (incluindo tanto conjugações covalentes como não covalentes) com um polipeptídeo (ou porção deste, preferivelmente pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos do polipeptídeo) da — presente invenção para gerar proteínas de fusão. Assim, a invenção também é ligada a imunoconjugados compreendendo o anticorpo descrito neste lugar conjugado com um agente citotóxico tal como um agente quimioterápico, toxina (e.g. uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos desta), ou um isótopo radioativo (i.e., um radioconjugado).
A presente invenção inclui adicionalmente composições compreendendo os polipeptídeos da presente invenção (e.g., aqueles compreendendo um epítopo imunogênico ou antigênico) fusionados ou conjugados com sequências de polipeptídeos heterólogas (e.g., domínios de anticorpos outros do que as regiões variáveis). Por exemplo, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados com uma região Fc de anticorpo, ou porção desta. Por exemplo, polipeptídeos da presente invenção (incluindo fragmentos ou variantes destes), podem ser fusionados como domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou porções destas (CHI, CH2; Cn35 ou qualquer combinação destas e porções destas, resultando em polipeptídeos quiméricos. A porção de anticorpo fusionada com um polipeptídeo da presente invenção pode compreender a região constante, região de dobradiça, domínio CHI, domínio CH2, e domínio 15º CH3 ou qualquer combinação de domínios inteiros ou porções destes. Os polipeptídeos também podem ser fusionados ou conjugados com as porções de anticorpos acima para formar multímeros. Por exemplo, porções Fc fusionadas com os polipeptídeos da presente invenção podem formar dímeros através de ligação dissulfeto entre as porções Fc. Formas multiméricas — superiores podem ser feitas fusionando os polipeptídeos com porções de IZA e IgM. Métodos para fusionar ou conjugar os polipeptídeos da presente invenção com porções de anticorpos são conhecidos na arte. Veja, e.g. Patentes Norte-Americanas Nos. 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053;
5.447.851; 5.112.946; Patente Européia 307.434; Patente Européia 367.166; publicações de PCT WO 96/04388; WO 91/06570; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995); e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341(1992) (ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades). Como forma de outro exemplo não limitante, polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou variantes destes) podem ser fusionados com albumina (incluindo mas não limitado a albumina de soro humano recombinante ou fragmentos ou variantes destes (veja, e.g., Patente U.S. No. 5.876.969, emitida em 2 de Março de 1999, Patente Européia O 413 622, e Patente U.S. No. 5.766.883, emitida em 16 de Junho 1998, neste lugar incorporadas por referência em sua totalidade)). Polipeptídeos e/ou anticorpos da presente invenção (incluindo fragmentos ou variantes destes) podem ser fusionados com a extremidade ou N ou C terminal da proteína heteróloga (e.g., polipeptídeo Fc de imunoglobulina ou —polipeptídeo albumina de soro humano). Polinucleotídeos codificando proteínas de fusão da invenção também são abrangidos pela invenção.
Como discutido acima, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados com as porções de anticorpos acima para aumentar a meia-vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na arte. Além disso, os polipeptídeos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados com as porções de anticorpos acima para facilitar purificação. Um exemplo relatado descreve proteínas quiméricas consistindo dos dois primeiros domínios do polipeptídeo CD4 humano e vários domínios das regiões — constantes das cadeias pesadas ou leves de imunoglobulinas de mamíferos. (Veja, e.g., Patente Européia 394.827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). Fornecimento acentuado de um antígeno através da barreira epitelial para o sistema imune foi demonstrado para antígenos (e.g., insulina) conjugados com um parceiro de ligação de FcRn tal como IgG ou fragmentos Fc (veja, e.g. Publicações de PCT WO 96/22024 e WO 99/04813). Os polipeptídeos da presente invenção fusionados ou conjugados com um anticorpo tendo estruturas diméricas ligadas por dissulfeto (devido à IgG) também podem ser mais eficientes em ligar e neutralizar outras moléculas, do que a proteína monomérica secretada ou fragmento de proteína apenas.
(Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)). Em muitos casos, a parte Fc em uma proteína de fusão é benéfica em terapia e diagnose, e assim pode resultar em, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas. (Patente Européia A 232.262). Alternativamente, deletar a parte Fc depois da proteína de fusão ter sido expressa, detectada, e purificada, seria desejado. Por exemplo, a porção Fc pode atrapalhar terapia e diagnose se a proteína de fusão é usada como um antígeno para imunizações. Em descoberta de fármacos, por exemplo, proteínas humanas, tal como hIL-5, foram fusionadas com porções Fc para o propósito de ensaios de triagem em larga escala para identificar antagonistas de hIL-5. (Veja, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al., J. Biol. Chem. 270:9459- 9471 (1995)0. Tais técnicas também incluem, mas não são limitados a, o uso de agentes bifuncionais de conjugação (veja e.g., Patentes Norte-Americanas Nos. 5.756.065; 5.714.631; 5.696.239; 5.652.361; 5.505.931; 5.489.425;
5.435.990; 5.428.139; 5.342.604; 5.274.119; 4.994.560; e 5.808.003; os conteúdos de cada uma das quais são por aqui incorporadas por referência em sua totalidade). Além disso, os polipeptídeos da invenção (e.g., anticorpos ou fragmentos destes) podem ser fusionados com sequências de marcadores, tal — como um peptídeo para facilitar sua purificação. Em uma forma de realização adicional, ácidos nucléicos codificando os polipeptídeos da invenção (incluindo, mas não limitado a ácidos nucléicos codificando epítopos imunogênicos e/ou antigênicos) também podem ser recombinados com um gene de interesse como uma etiqueta de epítopo (e.g., a etiqueta de —hemaglutinina ("HA") ou etiqueta “flag”) para auxiliar em detecção e purificação do polipeptídeo expresso. Em formas de realização preferidas, a sequência de aminoácidos de marcador é um peptídeo hexa-histidina, tal como a etiqueta fornecida em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), entre outros, muitas das quais estão comercialmente disponíveis.
Como descrito em Gentz et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 86:821-824 (1989), por exemplo, hexa-histidina sustenta purificação conveniente da proteína de fusão.
Outras etiquetas de peptídeos úteis para purificação incluem, mas não são limitados a, a etiqueta "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina de influenza
(Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e a etiqueta "flag". A presente invenção abrange adicionalmente moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 conjugados com um agente diagnóstico ou terapêutico.
As moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser usados diagnosticamente, por exemplo, para monitorar o desenvolvimento ou progressão de uma doença pruriginosa como parte de um procedimento de exame clínico para, e.g., determinar a eficácia de um dado regime de tratamento, diagnose, detecção, e/ou prevenção.
Detecção pode ser facilitada —acoplando o anticorpo a uma substância detectável.
Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais que emitem pósitron usando várias tomografias por emissão de pósitrons, e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.
Veja, — por exemplo, Patente U.S.
No. 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como agentes diagnósticos de acordo com a presente invenção.
Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalinay Dbeta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125 1, 1311, 111 In ou 99 Tc.
Além disso, moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser conjugados com uma unidade terapêutica tal como uma citotoxina, e.g., um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um fon metálico radioativo. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial a células. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, I-dihidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes. Agentes terapêuticos incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (e.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, S5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (e.g., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSN U) e lomustina (CCN U), ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (ID) (DDP) cisplatina), antraciclinas (e.g. daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (e.g., vincristina e vinblastina). Os conjugados da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, o agente terapêutico ou fração de fármaco não deve ser entendido como limitado a agentes químicos terapêuticos clássicos. — Por exemplo, a fração de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, a-interferon, beta-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente trombótico ou um agente antiangiogênico, e.g. angiostatina ou endostatina; ou, modificadores de resposta biológica tal como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônia de macrófago granulócito ("'GM-CSF"), fator estimulante de colônia de granulócito ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem ser acoplados a suportes sólidos, que — são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antígeno alvo.
Tais suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.
Técnicas para conjugar tal unidade terapêutica a anticorpos são bem conhecidas, veja, e.g., Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorne, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorne et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates , Immunol.
Rev. 62:119-58 (1982). Alternativamente, moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser conjugados com um segundo anticorpo para formar um anticorpo em heteroconjugado como descrito por Segal em Patente U.S. No. 4.676.980.
Algumas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31, com ou sem uma unidade terapêutica conjugada a estas, administradas sozinhas ou em combinação com fator(es) citotóxico(s) e/ou citocina(s) podem ser usadas como um agente terapêutico.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser usados para ligar células que expressam IL- 31; para isolar IL-31 por purificação por afinidade; para ensaios diagnósticos para determinar níveis circulantes de polipeptídeos IL-31; para detectar ou — quantificar IL-31 solúvel como um marcador de patologia ou doença latente; em métodos analíticos empregando FACS; para triar bibliotecas de expressão; para gerar anticorpos anti-idiotípicos; e como anticorpos neutralizantes ou como antagonistas para bloquear atividade de IL-31 in vitro e in vivo. Etiquetas ou marcadores diretos adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e os semelhantes; etiquetas ou marcadores indiretos podem caracterizar uso de biotina-avidina ou outros pares de complemento/anti-complemento como intermediários. Anticorpos neste lugar também podem ser diretamente ou indiretamente conjugados com fármacos, toxinas, radionuclídeos e os semelhantes, e estes conjugados usados para aplicações diagnósticas ou terapêuticas in vivo. Além disso, anticorpos para IL-31 ou fragmentos destes podem ser usados in vitro para detectar IL-31 desnaturada ou fragmentos desta em ensaios, por exemplo, Western Blots ou outros ensaios conhecidos na arte.
Moléculas detectáveis adequadas podem ser diretamente ou indiretamente — acopladas ao polipeptídeo ou anticorpo, e incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofatores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e os semelhantes. Moléculas citotóxicas adequadas podem ser diretamente ou indiretamente acopladas ao polipeptídeo ou anticorpo, e incluem toxinas bacterianas ou vegetais (por exemplo, toxina de difteria, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e as semelhantes), assim como radionuclídeos terapêuticos, tal como iodo-131, rênio-188 ou ítrio-90 (ou diretamente — acoplados ao polipeptídeo ou anticorpo, ou indiretamente acoplados por meio de uma unidade quelante, por exemplo). Polipeptídeos ou anticorpos também podem ser conjugados com drogas citotóxicas, tal como adriamicina.
Para acoplamento indireto de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de um par de —complementar/anticomplementar, onde o outro membro é ligado ao polipeptídeo ou fração de anticorpo.
Para estes propósitos, biotina/estreptavidina é um par de complementar/anticomplementar exemplar.
As moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção podem ser medidos para sua capacidade de inibir, bloquear, neutralizar o ligante de IL-31 conforme determinado por vários modelos in vivo conhecidos na arte e descritos neste lugar, incluindo, mas não limitado a, o modelo NC/Nga, o modelo epicutâneo de Ova, o modelo de hipersensibilidade crônica, e o modelo de hapteno crônico.
Tanto células T residentes na pele como queratinócitos — epidérmicos foram implicados na patologia de doenças de pele em humanos.
Expressão de mRNA e proteína de IL-31 é restrita à população residente na pele de células T CLA+ em humanos.
Veja pedido de Patente U.S. número 11/353.427, depositado em 14 de Fevereiro de 2006, (Publicação de Patente U.S.
No. 2006-0188499) e pedido de Patente U.S. número 11/353.454, — depositado em 14 de Fevereiro de 2006, (Publicação de Patente U.S.
No. 2006-0188500), ambos os quais são incorporados neste lugar por referência.
Como tal, um antagonista para IL-31, incluindo um antagonista de anticorpo ou receptor será útil para tratar doenças dérmicas e epidérmicas que têm expressão de células T CLA +. Tais doenças incluem, por exemplo, dermatite atópica, dermatite de contato, reações alérgicas induzidas por fármacos, vírus trópicos para pele e prurido viral associado, vitiligo, linfoma cutâneo de células T, alopécia aerata, acne rosácea, acne vulgar, prurigo nodular, e penfigóide bolhoso. Marcadores de quimiocina tal como TARC e MDC são úteispara medir o efeito de um anticorpo monoclonal neutralizante para IL-
31. Os efeitos inibitórios de tratamento com moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar podem ser medidos monitorando os níveis de TARC e MDC.
Dermatite de contato Dermatite de contato alérgica é definida como uma reação imune mediada por célula T a um antígeno que entra em contato com a pele. A população de células T CLA+ é considerada como estando envolvida na iniciação de dermatite uma vez que respostas de células T dependentes de alérgeno são predominantemente confinadas à população de células CLA+ (Veja Santamaria-Babi, L.F., et al., 7 Exp Med:181, 1935, (1995)). Resultado recente encontrou que apenas células T de memória (CD45RO+) CD4+ CLA+ e não CD8+ se proliferam e produzem tanto citocinas tipo-1 (IFN-) como tipo-2 (IL-5) em resposta a níquel, um alérgeno comum de hipersensibilidade de contato. Além disso, células expressando CLA em — combinação com CD4, CD45RO (memória) ou CD69 são aumentadas depois de estimulação específica com níquel e expressam os receptores de quimiocina CXCR3, CCR4, CCRI10, mas não CCR6. Veja Moed H,, et al., Br JDermatol:51, 32, (2004).
Em modelos animais, foi demonstrado que dermatite de contato alérgica é dependente de célula T e que as células T responsivas de alérgicos migram para o sítio de aplicação de alérgeno. Veja geralmente: Engeman T.M, et al., J Immunol: 164, 5207, (2000); Ferguson T.A. & Kupper T.S. Jlmmunol: 150, 1172, (1993); e Gorbachev A.V. & Fairchild R.L. Crit Rev Immunol: 21, 451(2001). Uma vez que células T CLA+ produzem IL-31 e estimulação por IL-31 de queratinócitos da pele pode induzir quimiocinas pró-inflamatórias, tal como TARC e MDC, IL-31 pode estar envolvida na fisiopatologia de dermatite de contato. Usando um anticorpo neutralizante de IL-31 em um modelo murino de hipersensibilidade — decontato.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de Hipersensibilidade de Contato por inibição, redução, neutralização, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Dermatite atópica Dermatite atópica (AD) é uma doença de pele inflamatória crônica recorrente com uma incidência dramaticamente crescente ao longo das últimas décadas. Clinicamente AD é caracterizada por placas e pápulas altamente pruríticas frequentemente escoriadas que mostram um curso crônico recorrente. O diagnóstico de AD na maioria das vezes é baseado em sintomas clínicos principais e secundários. Veja Hanifin J.M., Arch Dermatol: 135, 1551 (1999). Histopatologia revela espongiose, hiperceratose e paraceratose focal em lesões agudas, ao passo que hiperplasia epidérmica marcada com hiperceratose e paraceratose, acantose/hipergranulose e infiltração perivascular da derme com linfócitos e mastócitos abundantes são as marcas de lesões crônicas.
Células T desempenham um papel central na iniciação de respostas imunes locais em tecidos e evidência sugere que células T infiltrantes na pele em particular, podem desempenhar um papel chave na iniciação e manutenção de respostas imunes desreguladas na pele. Aproximadamente 90% de células T infiltrantes em sítios cutâneos inflamatórios expressam o Ag associado a linfócito cutâneo (CLA+) que se liga a E-selectina, uma molécula de adesão induzível em endotélio (revisto em
Santamaria-Babi L.F., et al., Eur J Dermatol: 14, 13, (2004)). Um aumento significativo em células T CLA+ circulantes entre pacientes com AD comparado com indivíduos de controle foi documentado (Veja Teraki Y,., et al., Br J Dermatol: 143, 373 (2000), enquanto outros demonstraram que células T CLA+Y de memória de pacientes com AD respondem preferencialmente a extrato de alérgeno comparadas com a população de CLA- (Veja Santamaria-Babi, L.F., et al., J Exp Med:181, 1935, (1995)). Em humanos, a patogênese de distúrbios atópicos da pele foi associada com aumentos em células T CLA+ que expressam níveis elevados de citocinas tipo Th-2 como IL-5 e IL-13 9, 10. Veja Akdis M,, et al., Eur Jlmmunol: 30, 3533 (2000); e Hamid Q,., et al.,JAllergy Clin Immunol: 98, 225 (1996). Camundongos NC/Nga desenvolveram espontaneamente lesões tipo AD que correspondem a AD humana em muitos aspectos, incluindo curso e sinais clínicos, histopatologia e imunopatologia quando alojados em condições não livres de patógenos especificados (não-SPF) em cerca de 6-8 semanas de idade.
Em contraste, camundongos NC/Nga mantidos em condições SPF não desenvolvem lesões de pele.
Entretanto, início de lesões de pele espontâneas e comportamento de coçar-se podem ser sincronizados em camundongos —NC/Nga alojados em um meio SPF por injeção intradérmica semanal de antígeno bruto de ácaro da poeira.
Veja Matsuoka H,, et al., Allergy: 58, 139 (2003). Portanto, o desenvolvimento de AD em NC/Nga é um modelo útil para a avaliação de novos produtos terapêuticos para o tratamento de AD.
Em adição ao modelo NC/Nga de AD espontânea, — sensibilização epicutânea de camundongos usando OVA também pode ser usada como um modelo para induzir espessamento epidérmico e dérmico dependente de antígeno com um infiltrado mononuclear na pele de camundongos sensibilizados.
Isto normalmente coincide com níveis séricos elevados de IgE total e específica, entretanto nenhuma desregulação de barreira cutânea ou prurido ocorre normalmente neste modelo. Veja Spergel J.M,, et al., J Clin Invest, 101: 1614, (1998). Este protocolo pode ser modificado a fim de induzir desregulação de barreira cutânea e prurido sensibilizando camundongos transgênicos DO11.10 OVA TCR com OVA. Aumentar o número de células T específicas de antígenos que podem reconhecer o antígeno sensibilizante pode aumentar o nível de inflamação na pele para induzir comportamento de coçar-se visível e liquenificação/descamação da pele. Tanto o modelo NC/Nga de AD espontânea como o modelo OVA de DOIL.IO epicutânea são usados para avaliar a capacidade das moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar de inibir, reduzir, ou neutralizar os efeitos de IL-
31. Administração de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode resultar em uma redução em coceira que pode ser efetiva para tratar doenças pruriginosas incluindo, mas não limitado a, dermatite atópica, prurigo nodular, e eczema, uma vez que cessação de coceira irá interromper progressão de dermatite, o desenvolvimento da qual é dependente de coceira. Modelos adicionais para medir os efeitos inibitórios das — moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar são descritos por Umeuchi, H. et al., European Journal of Pharmacology, 518: 133-139, 2005; e por Yoo, JJ. et al. JJ. Experimental Medicine, 202:541-549, 2005. Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas — deligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar resultado clínico de dermatite e doenças pruriginosas incluindo dermatite atópica, prurigo nodular, e eczema por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Métodos de medir a capacidade dos anticorpos humanizados anti-IL-31 e antagonistas de inibir, reduzir, ou neutralizar a resposta de coceira incluem os seguintes ensaios e modelos: 1) Tratamento com capsaicina de camundongos tratados com IL31 Animais BALB/c de dez semanas de idade (CRL) são anestesiados e injetados com um agente analgésico de longa duração, cloridrato de buprenorfina, subcutaneamente a 0,1 mg/kg antes de injeção de 0,25 ml de 4 mg/ml de solução de capsaicina em etanol a 10% + Tween-80 a 10% em salina subcutaneamente em nuca do pescoço.
Animais são mantidos anestesiados por pelo menos 30 min seguindo tratamento com neurotoxina.
Quarenta e oito horas depois, bombas osmóticas de 14 dias são implantadas subcutaneamente para liberação contínua de 20 ug/dia de IL-31 por 14 dias.
Camundongos são monitorados diariamente por 6 dias para alopécia e prurido usando os seguintes critérios: O = nenhuma coceira, animal parece normal, 1 = afinamento de tegumento em pequenas áreas, coceira observada, 2 = pequena perda de cabelo (pequenas manchas), coceira, 3 = perda moderada de cabelo, coceira, e 4 = perda severa de cabelo, coceira excessiva.
Neutralização, inibição, ou redução de IL-31 por moléculas —humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem diminuir a incidência e intensidade de coceira, e, portanto, dermatite, em pacientes sofrendo de distúrbios da pele que envolvem coceira.
II) Expressão de Gene Tacl Camundongos que são homozigotos nulos para o gene Tact não expressam nenhuma substância detectável P ou neuroquinina A.
Estes camundongos têm respostas a dor nociceptiva significativamente reduzidas para estímulos moderados a intensos e, portanto, são uma ferramenta útil para estudar a contribuição de peptídeos taquicinina para processamento de dor/coceira e estados de doença inflamatória.
Camundongos nocautes para
Tacl de doze semanas de idade foram implantados com bombas osmóticas de 14 dias liberando lug/dia de proteína IL-31 e observados diariamente para alopécia e prurido usando os seguintes critérios: O = nenhuma coceira, animal parece normal, | = afinamento de tegumento em pequenas áreas, coceira observada, 2 = pequena perda de cabelo (pequenas manchas), coceira, 3 = perda moderada de cabelo, coceira, e 4 = perda severa de cabelo, coceira excessiva.
Resultados deste estudo mostram que camundongos deficientes em Tacl foram menos susceptíveis a coceira/perda de cabelo induzida por IL-31 comparados com camundongos de controle tipo selvagem.
Enquanto que 100% (10/10) de camundongos tipo selvagem desenvolveram evidência de coceira e perda de cabelo em dia 6 de tratamento com IL-31, apenas 33,3 % (2/6) de camundongos deficientes em Tac 1 estavam mostrando sinais de coceira e perda de cabelo ao mesmo tempo.
Assim, neutralização, inibição ou redução de IL-31 por moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem diminuir a incidência e intensidade de coceira no contexto de dermatite.
III) Administração de anticorpo neutralizante de IL-31 Camundongos — BALB/c fêmeas normais (CRL) de aproximadamente 8 a 12 semanas de idade podem ser implantados subcutaneamente com bombas osmóticas de 14 dias (Alzet, 42002) liberando lugudia de mIL-31. Grupos de camundongos receberam injeções intraperitoneais (i.p.) de anticorpo monoclonal de rato anti-IL-31 de camundongo l10mg/kg (200ug/camundongo) duas vezes por semana — começando | semana antes de liberação de IL-31. Grupos de controle de camundongos receberam injeções 1.p. de veículo (PBS/BSA a 0,1%) com os programas de dosagem idênticos.
Camundongos foram pontuados para alopécia e prurido usando os seguintes critérios: O = nenhuma coceira, animal parece normal, | = afinamento de tegumento em pequenas áreas, coceira observada, 2 = pequena perda de cabelo (pequenas manchas), coceira, 3 = perda moderada de cabelo, coceira, e 4 = perda severa de cabelo, coceira excessiva.
Assim, neutralização, redução ou inibição de IL-31 por moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode atrasar o início da resposta de coceira/perda de cabelo induzida por IL-31.
Os efeitos de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são medidos por inibição de coceira, irritação, dermatite, uma redução em expressão de IL-3SIRA em — queratinócitos, e/ou uma redução em escore para alopécia e prurido.
Reações alérgicas cutâneas tardias induzidas por fármacos Reações alérgicas cutâneas tardias induzidas por fármacos são muito heterogêneas e podem espelhar muitos eventos fisiopatológicos distintos. Veja Brockow K,, et al., Allergy: 57, 45 (2002). Mecanismos imunológicos envolvidos nestas reações foram mostrados como mediados ou por anticorpo ou célula. Em alergia imediata a fármaco uma reação de anticorpo mediada por IgE pode ser demonstrada por um teste cutâneo e/ou intradérmico de puntura positivo depois de 20 min, ao passo que reações não imediatas a fármacos podem ocorrer mais do que uma hora depois de última — absorção de fármaco e frequentemente mediadas por célula T. Reações não imediatas tardias mediadas por célula T podem ocorrer em pacientes com reações adversas a fármacos para penicilinas por exemplo. Foi mostrado que respostas proliferativas de células T a penicilinas são restritas à subpopulação de células T de memória (CD45RO+) CLA+ de pacientes alérgicos a — penicilina ao passo que o subconjunto CD45RO+ CLA- não mostra nenhuma resposta proliferativa. Veja Blanca M., Leyva L., et al., Blood Cells Mol Dis:31, 75 (2003). Reações de hipersensibilidade tardia (DTH) podem ser artificialmente reproduzidas em camundongos, permitindo verificação de fatores que podem estar envolvidos na iniciação e perpetuação da resposta de
DTH.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser efetivas em limitar, reduzir, inibir uma reação de hipersensibilidade tardia.
Necrólise epidérmica tóxica (TEN) é uma reação a fármaco muitorara, mas extremamente severa caracterizada por apoptose abundante de epiderme com bolhas extensivas.
Estudos mostraram que linfócitos que se infiltram na bolha são células T CLA+ T e podem exibir citotoxicidade para queratinócitos epidérmicos.
Veja Leyva L., et al... JAllergy Clin Immunol: 105, 157 (2000); e Nassif A., Bensussan A,, et al., J Allergy Clin —Immunol:114, 1209 2004). Um sistema de camundongo transgênico, através do qual OVA é expresso sob o controle do promotor de queratina-5 (K5) nos queratinócitos epidérmicos e de folículos capilares de camundongos, foi gerado para estabelecer um modelo animal para TEN.
Células T CD8+ específicas para OVA, quando através de adoção transferidas para camundongos K5-OVA, passam por ativação e proliferação nos linfonodos de drenagem cutânea e se direcionam para a pele de camundongos K5-OVA, resultando em desenvolvimento de lesões cutâneas que são recordativas de TEN.
Veja Azukizawa H,, et al., Eur J Immunol: 33, 1879 (2003). Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas —deligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de TEN por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Penfigóide bolhoso Penfigóide bolhoso é um distúrbio subepidérmico que se manifesta como bolhas subepidérmicas com um infiltrado dérmico de neutrófilos e eosinófilos.
Diagnóstico é caracterizado pela presença de anticorpos específicos para antígenos contra proteínas de adesão específicas da epiderme e junção derme-epiderme.
Veja Jordon R.E., et al., JAMA: 200,
751 (1967). Estudos analisando o papel de células T na patogênese de penfigóide bolhoso por análise de PBL e células T de bolhas cutâneas encontraram uma predominância de células T CLA+ expressando níveis aumentados de citocinas Th2 tipo IL-4 e IL-13. Veja Teraki Y., et al., J Invest Dermatol: 117, 1097 (2001). Em pacientes com penfigóide bolhoso seguindo terapia com corticosteróides sistêmicos, a frequência de células produtoras de interleucina-13 CLA+, mas não CLA-, é significativamente diminuída. Diminuições em células CLA+ seguindo tratamento com corticosteróide são associadas com melhora clínica. Veja Teraki, ibid.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de penfigóide bolhoso por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Alopécia aerata Alopécia aerata (AA) é considerada como uma doença auto- imune restrita a tecido de folículos capilares na qual atividade folicular é interrompida por causa da atividade continuada de infiltrados linfocíticos. AA resulta em manchas de completa perda de cabelo em qualquer lugar no corpo, embora perda atual de cabelo não ocorra, mesmo em lesões por falta de cabelo. Embora sinais clínicos de inflamação estejam ausentes, biópsias de pele de sítios de doença ativa mostram inflamação linfocítica perifolicular essencialmente de células CD4+, junto com um infiltrado intrafolicular de CD8+. Veja Kalish R.S. & Gilhar A. Jlnvestig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003).
Estudos mostraram que linfócitos CD4+ ou CD8+ que se infiltram em pele de couro cabeludo expressam CLA e, em sangue periférico de indivíduos com AA, o percentual de linfócitos CLA+ CD4+ ou CD8+ é significativamente maior do que aquele de controles normais. Além disso,
pacientes com AA severa ou progressiva mostram uma positividade para CLA muito maior comparados com pacientes se recuperando da doença e uma diminuição em percentual de células CLA+ corresponde a um bom curso clínico.
Veja Yano S., et al., Acta Derm Venereol: 82, 82 (2002). Estes estudos, portanto, sugerem que linfócitos CLA+ podem desempenhar um papel importante em AA.
Modelos de xenoenxertos demonstraram que células T ativadas são propensas a desempenhar um papel na patogênese de AA.
Couro cabeludo lesionado de pacientes com AA enxertados em camundongos nus recupera cabelo coincidente com uma perda de linfócitos infiltrantes do enxerto e, transferência de células T lesionais ativadas para camundongos SCID pode transferir perda de cabelo para explantes de couro cabeludo humano em camundongos SCID.
Veja Kalish R.S. & Gilhar A.
Jlnvestig Dermatol Symp Proc: 8, 164 (2003). Uma variedade de terapias imunomoduladoras são parte do tratamento usual deste distúrbio, entretanto, nenhum destes tratamentos foi consistente em sua eficácia.
Veja Tang L., et al., Jlnvest Dermatol: 120, 400 (2003); Tang L., et al., (2004); e Tang L., et al., / Am Acad Dermatol: 49, 1013 (2003). Contudo, seus usos em modelos animais válidos fornecem uma ferramenta para dissecar mecanismos moleculares de efeitos terapêuticos.
Veja Shapiro]. etal., Jlnvestig Dermatol Symp Proc: 4,239 (1999); Tang L.., et al., Old wine in new bottles: reviving old therapies for alopecia areata using rodent models (2003); e Verma D.D., et al., Eur JDermatol: 14, 332 (2004). Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de alopécia aerata por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Acne Rosácea/Acne vulgar Acne vulgar, um distúrbio do aparelho pilossebáceo, é o problema de pele mais comum de adolescência.
Acredita-se que anormalidades em queratinização folicular produzam a lesão por acne.
Acne rosácea é diferenciada de acne vulgar pela presença de pápulas vermelhas, pústulas, cistos e telangiectasias extensivas, mas a ausência de comedões — (cabeças brancas). Excreção aumentada de sebo de glândulas sebáceas é um importante fator na fisiopatologia de acne vulgar.
Outras funções de glândulas sebáceas também estão associadas com o desenvolvimento de acne, incluindo lipídios — sebáceos — pró-inflamatórios; diferentes citocinas produzidas localmente; peptídeos e neuropeptídeos periglandulares, tal como hormônio —liberador de corticotrofina, que é produzido por sebócitos; e substância P, que é expressa nas extremidades de nervos na vizinhança de glândulas que parecem saudáveis de pacientes com acne.
Veja Zouboulis C.C.
Clin Dermatol: 22, 360 (2004). Embora a fisiopatologia de acne vulgar e acne rosácea permaneçam desconhecidas, observações clínicas e estudos histopatológicos sugerem que inflamação do folículo pilossebáceo pode ser central para a patogênese de rosácea e acne vulgar.
Estudos anteriores em análise de subconjuntos de células T infiltrando grupos de rosáceas indicaram que a maioria de células T expressou CD4. Veja Rufli T. & Buchner S.A. —Dermatologica: 169,1 (1984). Células T CD4+ T produzem IL-31 e análise IHC de pele para expressão de IL-31 sugere que IL-31 é expressa em glândulas sebáceas e sudoríparas.
Estimulação com IL-31 de queratinócitos epidérmicos induz expressão de quimiocinas o que provavelmente resulta em infiltração celular — sugerindo que IL-31 pode contribuir para a resposta pró-inflamatória na pele.
Veja Dillon S.R,, et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). IL-31, portanto, pode contribuir para a fisiopatologia de acne rosácea e acne vulgar.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de acne vulgaris por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Prurigo nodular Prurigo nodular é uma erupção de nódulos liquenificados ou escoriados causados por prurido incontrolável que é difícil de tratar. Enquanto que fricção crônica resulta em liquenificação, e coceira em escoriações lineares, indivíduos que beliscam e arrancam sua pele coçada irritada tendem a produzir pápulas marcadamente espessadas conhecidas como nódulos de —prurigo. Embora prurigo nodular não seja específico para dermatite atópica, muitos pacientes com estes nódulos também têm uma reação atópica, que se manifesta como rinite alérgica, asma, ou alergia a alimentos. Células T representam a maioria de células infiltrantes em lesões de prurigo e estas lesões frequentemente representam a lesão de pele mais pruriginosa em pacientes atópicos.
Tratamento tópico de prurigo nodular com capsaicina, um alcalóide antipruriginoso que interfere na percepção de prurido e dor por depleção de neuropeptídeos como substância P em pequenos nervos sensórios cutâneos, provou ser um regime efetivo e seguro resultando em limpeza das lesões de pele. Veja Stander S., et al., JAm Acad Dermatol: 44, 471 (2001). Estudos da resposta a coceira em camundongos NC/Nga usando tratamento com capsaicina mostraram que o desenvolvimento espontâneo de lesões de dermatite foi praticamente completamente prevenido. Além disso, a elevação de níveis séricos de IgR foi significativamente suprimida e números de eosinófilos e mastócitos infiltrantes em pele lesionada de camundongos tratados com capsaicina foram reduzidos. Veja Mihara K,, et al., Br JDermatol: 151, 335 (2004). As observações deste grupo sugerem que comportamento de coçar-se pode contribuir para o desenvolvimento de dermatite acentuando várias respostas imunológicas, portanto implicando que prevenção da sensação de coceira e/ou comportamento de coçar-se associado à coceira pode ser um tratamento efetivo para AD. Veja Mihara K., et al., Br J Dermatol: 151, 335 (2004). Assim, os anticorpos humanizados anti-IL-31 descritos neste lugar serão úteis para minimizar os efeitos de AD, prurigo —nodular,e outras doenças pruriginosas, pois foi mostrado neste lugar que eles reduzem a quantidade de coceira em camundongos NC/Nga.
Liberação crônica de IL-31 induz prurido e alopécia em camundongos seguido pelo desenvolvimento de lesões de pele parecendo dermatite sugerindo que IL-31 pode induzir coceira. Veja Dillon S.R., et al., Nat Immunol: 5, 752 (2004). O envolvimento de IL-31 em indução da resposta a coceira pode ser medida, por exemplo, por dois métodos (i) tratamento com capsaicina de camundongos tratados com IL-31; e (11) tratamento com IL-31 de camundongos nocautes para Tacl, que têm respostas a dor nociceptiva significativamente reduzidas por causa de ausência de expressão de neuropeptídeos. Em adição, se neutralização de IL-31 em camundongos tratados com IL-31 com moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode prevenir prurido e alopécia pode ser testado nestes modelos.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas —deligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar resultado clínico de prurigo nodular por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Vírus trópicos para pele e Prurido Viral Associado Células T CD8+ específicas para Vírus do Herpes Simples (HSV) no sangue periférico e células T CD8+ específicas para HSV recuperadas de lesões de herpes expressam altos níveis de CLA onde como células T CD8+ não específicas para herpes vírus trópico para pele carecem de expressão de CLA. Veja Koelle D.M,, et al., J Clin Invest: 110, 537
(2002). Linfócitos T CD4+ reativos para HSV-2 também expressam CLA, mas em níveis menores do que aqueles previamente observados para linfócitos T CD8+. Veja Gonzalez J.C., et al., Jlnfect Dis: 191, 243 (2005). Prurido também foi associado com infecções virais por herpes (Veja Hung K.Y,., et al., Blood Purl6, 147 (1998), embora outras doenças virais, como HIV, também tenham sido associadas com lesões cutâneas pruriginosas. Prurido incontrolável severo, frequentemente associado com lesões cutâneas eritematopapulares e hipereosinofilia, é uma condição observada em alguns pacientes não atópicos infectados por HIV 36. Veja Singh F. & Rudikoff D, AmJ Clin Dermatol; 4, 177 (2003); e Milazzo F., Piconi S., et al., Allergy: 54, 266 (1999).
A associação de vírus trópicos para pele com prurido e células T CLA+ sugere que células T produtoras de IL-31 podem estar envolvidas na fisiopatologia de infecções virais.
Assim, neutralização de IL-31 pelas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritos neste lugar pode ser usada para melhorar o resultado clínico de prurido associado com vírus trópicos para pele por inibição, redução, prevenção ou bloqueio da inflamação e/ou coceira associada com doença.
Além disso, inflamação é uma resposta protetora por um organismo para defender-se de um agente invasor. Inflamação é um evento em cascata que envolve muitos mediadores celulares e humorais. Por um lado, supressão de respostas inflamatórias pode deixar um hospedeiro imunocomprometido; entretanto, se deixada incontrolada, inflamação pode levara sérias complicações incluindo doenças inflamatórias crônicas (e.g., artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal e os semelhantes), choque séptico e falência múltipla dos órgãos. De forma importante, estes diversos estados de doença compartilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças coletivas que são caracterizadas por inflamação têm um grande impacto em morbidade e mortalidade humana. Portanto está claro que anticorpos anti-inflamatórios e polipeptídeos de ligação, tal como anticorpos anti-IL-31 e polipeptídeos de ligação descritos neste lugar, podem ter potencial terapêutico crucial para um vasto número de — doenças humanas e animais, de asma e alergia a autoimunidade e choque séptico. Como tal, uso de anticorpos anti IL-31 anti-inflamatórios e polipeptídeos de ligação descritos neste lugar pode ser usado terapeuticamente como antagonistas de IL-31 descritos neste lugar, particularmente em doenças tal como artrite, endotoxemia, doença inflamatória intestinal, psoríase, doença relacionada e as semelhantes.
1. Artrite Artrite, incluindo osteoartrite, artrite reumatóide, juntas artríticas como um resultado de injúria, e os semelhantes, são condições inflamatórias comuns que podem se beneficiar do uso terapêutico de anticorpos antiinflamatórios e polipeptídeos de ligação, tal como anticorpos anti-IL-31 e polipeptídeos de ligação da presente invenção. Por exemplo, artrite reumatóide (RA) é uma doença sistêmica que afeta todo o corpo e é uma das formas mais comuns de artrite. Ela é caracterizada pela inflamação da membrana revestindo a junta, o que causa dor, rigidez, ardência, vermelhidão e inchaço. Células inflamatórias liberam enzimas que podem digerir osso e cartilagem. Como um resultado de artrite reumatóide, o revestimento de junta inflamado, o sinóvio, pode invadir e danificar osso e cartilagem levando a deterioração de junta e dor severa entre outros efeitos fisiológicos. A junta envolvida pode perder seu formato e alinhamento, — resultando em dor e perda de movimento.
Artrite reumatóide (RA) é uma doença imuno-mediada particularmente caracterizada por inflamação e subseqgiente dano a tecido levando a invalidez severa e mortalidade aumentada. Uma variedade de citocinas são produzidas localmente nas juntas reumatóides. Numerosos estudos demonstraram que IL-1 e TNF-alfa, duas citocinas pró-inflamatórias prototípicas, desempenham um importante papel nos mecanismos envolvidos em inflamação sinovial e em destruição progressiva das juntas. De fato, a administração de TNF-alfa e inibidores de IL-1| em pacientes com RA levou a uma melhora dramática de sinais clínicos e biológicos de inflamação e uma redução de sinais radiológicos de erosão óssea e destruição de cartilagem. Entretanto, apesar destes resultados animadores, uma porcentagem significativa de pacientes não respondeu a estes agentes, sugerindo que outros mediadores também estão envolvidos na fisiopatologia de artrite (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2):135-149, 2002). Um destes mediadores pode ser IL-31, e como tal uma molécula que se liga a ou inibe IL-31, tal como anticorpos anti IL-31 ou parceiros de ligação, pode servir como uma terapêutica valiosa para reduzir inflamação em artrite reumatóide, e outras doenças artríticas.
Há diversos modelos animais para artrite reumatóide conhecidos na arte. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), camundongos desenvolvem artrite inflamatória crônica que se parece intimamente com artrite reumatóide humana. Uma vez que CIA compartilha características imunológicas e patológicas similares com RA, isto o torna um — modelo ideal para triar potenciais compostos antiinflamatórios humanos. O modelo de CIA é um modelo bem conhecido em camundongos que depende tanto de uma resposta imune, como de uma resposta inflamatória, a fim de ocorrer. A resposta imune compreende a interação de células B e células T CD4+ em resposta a colágeno, que é dado como antígeno, e leva à produção — de anticorpos anti-colágeno. A fase inflamatória é o resultado de respostas de tecidos a partir de mediadores de inflamação, como uma conseqiiência de alguns destes anticorpos reagirem de forma cruzada com o colágeno nativo do camundongo e ativarem a cascata de complemento. Uma vantagem em usar o modelo de CIA é que os mecanismos básicos de patogênese são conhecidos.
Os epítopos relevantes de células T e células B em colágeno tipo II foram identificados, e vários parâmetros imunológicos (e.g., hipersensibilidade tardia e anticorpo anti-colágeno) e inflamatórios (e.g., citocinas, quimiocinas, e enzimas degradadoras de matriz) que se relacionam a artrite imuno-mediada foram determinados, e assim podem ser usados para avaliar eficácia de composto de teste no modelo de CIA (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). Como uma molécula que modula resposta imune e inflamatória, IL-31 pode induzir produção de SAA, que está implicada na patogênese de artrite reumatóide. Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem reduzir atividade de SAA in vitro e in vivo, a administração sistêmica ou local de moléculas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode suprimir potencialmente aresposta inflamatória em RA.
2. Endotoxemia Endotoxemia é uma condição severa comumente resultando de agentes infecciosos tal como bactérias e outros agentes de doença infecciosa, sepse, síndrome do choque tóxico, ou em pacientes imunocomprometidos — sujeitos a infecções oportunísticas, e os semelhantes. Utilidade terapêutica de anticorpos antiinflamatórios e polipeptídeos de ligação, tal como anticorpos anti-IL-31 e polipeptídeos de ligação da presente invenção, pode auxiliar a prevenir e tratar endotoxemia em humanos e animais. Outras terapêuticas potenciais incluem polipeptídeos IL-31 RA, polipeptídeos de receptores — heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-IL-31 ou parceiros de ligação da presente invenção, e os semelhantes, podem servir como uma terapêutica valiosa para reduzir inflamação e efeitos patológicos em endotoxemia. Endotoxemia induzida por lipopolissacarídeo (LPS) emprega muitos dos mediadores pró-inflamatórios que produzem efeitos patológicos nas doenças infecciosas e endotoxemia induzida por LPS em roedores é um modelo amplamente usado e aceitável para estudar os efeitos patológicos de potenciais agentes pró-inflamatórios ou imunomoduladores. LPS, produzido em bactérias gram-negativas, é um importante agente causal na patogênese de choque séptico (Glausner et al., Lancet 338:732, 1991). Um estado tipo choque pode de fato ser induzido experimentalmente por uma única injeção de LPS em animais. Moléculas produzidas por células respondendo a LPS podem ser direcionadas para patógenos diretamente ou indiretamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeiro contra patógenos invasores, elas também podem causar dano. Assim, estimulação massiva de imunidade inata, ocorrendo como um resultado de infecção bacteriana gram-negativa severa, leva a produção em excesso de citocinas e outras moléculas, e o desenvolvimento de uma síndrome fatal, síndrome de choque séptico, que é caracterizada por febre, hipotensão, coagulação intravascular disseminada, e falência múltipla dos órgãos (Dumitru et al. Cell 103:1071-1083, 2000).
Estes efeitos tóxicos de LPS são principalmente relatados para ativação de macrófagos levando à liberação de múltiplos mediadores inflamatórios. Dentre estes mediadores, TNF parece desempenhar um papel crucial, como indicado pela prevenção de toxicidade de LPS pela administração de anticorpos neutralizantes anti-TNF (Beutler et al., Science 229:869, 1985). É bem estabelecido que injeção de lug de LPS de E. coli em um camundongo CS57B1/6 irá resultar em aumentos significativos em IL-6, TNF-alfa, IL-1, e proteínas de fase aguda (por exemplo, SAA) circulantes aproximadamente 2 horas após injeção. A toxicidade de LPS parece ser mediada por estas citocinas, pois imunização passiva contra estes mediadores pode resultar em mortalidade diminuída (Beutler et al., Science 229:869, 1985). As estratégias potenciais de imunointervenção para a prevenção e/ou tratamento de choque séptico incluem mAb de anti-TNF, antagonista de receptor de IL-1, LIF, IL-10, e G-CSF. Uma vez que LPS induz a produção de fatores pró-inflamatórios possivelmente contribuindo para a patologia de endotoxemia, a neutralização de atividade de IL-31, SAA ou outros fatores pró-inflamatórios antagonizando polipeptídeo IL-31 pode ser usada para reduziros sintomas de endotoxemia, tal como visto em choque endotóxico. Outras terapêuticas potenciais incluem moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31.
3. Doença inflamatória intestinal. IBD Doença inflamatória intestinal (IBD) pode afetar tanto cólon — como reto (Colite ulcerativa) ou ambos, intestino delgado e grosso (Doença de Crohn). A patogênese destas doenças não está clara, mas elas envolvem inflamação crônica dos tecidos afetados. Terapêuticas potenciais incluem polipeptídeos IL-31 RA, polipeptídeos de receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-IL-31 ou parceiros de ligação da presente invenção, e os semelhantes, podem servir como uma terapêutica valiosa para reduzir inflamação e efeitos patológicos em IBD e doenças relacionadas. A inflamação crônica e ulceração em doença de Crohn normalmente começa ou com obstrução do intestino delgado ou dor — abdominal o que pode mimetizar apendicite aguda; outras apresentações podem estar relacionadas a suas complicações. O curso da doença é crônico, e pode haver exacerbações e remissões apesar de terapia. Início normalmente é em vida adulta inicial, com cerca de metade dos casos começando entre as idades de 20 e 30 anos e 90 % entre 10 e 40 anos. Um pouco mais de homens — doque mulheres são afetados. Microscopia reflete as aparências brutas. Envolvimento de inflamação é descontínuo: ele é focal ou em manchas. Coleções de linfócitos e células plasmáticas são encontradas principalmente na mucosa e submucosa, mas normalmente afetando todas as camadas (inflamação transmural). À
T2 característica microscópica clássica de doença de Crohn é a presença de células granulares circundadas por uma bainha de linfócitos. A incidência de doenças inflamatórias intestinais idiopáticas mostra considerável variação geográfica. Estas doenças têm uma incidência muito maior em Europa setentrional e nos Estados Unidos da América do que em países da Europa meridional, África, América do Sul e Ásia, embora crescente urbanização e prosperidade estejam levando a uma maior incidência em partes da Europa meridional e Japão (General and Systematic Pathology, Churchill Livingstone, 3rd edition 2000, JCE Underwood, Ed.).
Em doença de Crohn, clinicamente há dois grupos principais, o primeiro compreendendo pacientes cuja doença entra em remissão a longo prazo dentro de três anos de início, o segundo compreendendo pacientes com doença persistindo além de três anos.
Qualquer que seja a etiologia, existe evidência de persistência e ativação inapropriada de células T e macrófagos em doença de Crohn com produção — aumentada de citocinas pró-inflamatórias, em particular interleucinas (IL) 1, 2, 6 e 8, Interferon (IFN)- e Fator de necrose tumoral (TNF) . Doença de Crohn é caracterizada por inflamação prolongada (crônica) acompanhada por fibrose. O processo de proliferação fibroblástica e — deposição de colágeno pode ser mediado por fator de transformação de crescimento, que tem certas ações antiinflamatórias, em outras palavras recrutamento de fibroblastos, síntese de matriz e regulação negativa de células inflamatórias, mas é provável que muitos outros mediadores sejam implicados.
Colite ulcerativa (UC) é uma doença inflamatória do intestino grosso, comumente chamado de cólon, caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou revestimento interno do cólon. Esta inflamação faz com que o cólon se esvazie frequentemente, resultando em diarréia. Sintomas incluem soltura das fezes e cólicas abdominais associadas, febre e perda de peso. Embora a causa exata de UC seja desconhecida, pesquisa recente sugere que as defesas naturais do organismo estão operando contra proteínas no corpo que o organismo pensa que são exógenas (uma “reação auto-imune”). Talvez porque elas pareçam proteínas bacterianas no intestino, estas proteínas — podem ou instigar ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. À medida que o cólon é destruído, úlceras se formam liberando muco, pus e sangue. A doença normalmente começa na área retal e pode eventualmente se estender através de todo o intestino grosso. Episódios repetidos de inflamação levam a espessamento da parede do intestino e reto com tecido cicatricial. Morte de tecido de cólon ou sepse podem ocorrer com doença severa. Os sintomas de colite ulcerativa variam em severidade e seu início pode ser gradual ou repentino. Ataques podem ser provocados por muitos fatores, incluindo infecções respiratórias ou estresse. Embora atualmente não exista cura disponível para UC, tratamentos são focados em suprimir o processo inflamatório anormal no revestimento — do “cólon Tratamentos incluindo corticosteróides imunossupressores (eg. azatioprina, mercaptopurina, e metotrexato) e aminossalicilatos estão disponíveis para tratar a doença. Entretanto, o uso a longo prazo de imunossupressores tal como corticosteróides e azatioprina — pode resultar em sérios efeitos colaterais incluindo afinamento dos ossos, catarata, infecção, e efeitos no fígado e medula óssea. Em pacientes nos quais terapias atuais não são bem sucedidas, cirurgia é uma opção. A cirurgia envolve a remoção de todo o cólon e do reto.
Há diversos modelos animais que podem mimetizar — parcialmente colite ulcerativa crônica O modelo mais amplamente usado é o modelo de colite ulcerativa induzida por ácido 2,4,6- trinitrobenzenossulfônico/etanol (TNBS), que induz inflamação crônica e ulceração no cólon. Quando TNBS é introduzido no cólon de camundongos susceptíveis através de instilação intra-retal, ele induz resposta imune mediada por célula T na mucosa colônica, neste caso levando a uma inflamação massiva da mucosa caracterizada pela densa infiltração de células T e macrófagos ao longo de toda a parede do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda progressiva de peso (definhamento), diarréia sanguinolenta, prolapso retal, e espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev.
Immunol. 19:51-62, 2000). Outro modelo de colite usa dextran sulfato de sódio (DSS), que induz uma colite aguda manifestada por diarréia sanguinolenta, perda de peso, abreviação da ulceração de cólon e mucosa com infiltração de neutrófilos. Colite induzida por DSS é caracterizada histologicamente por infiltração de células inflamatórias na lâmina própria, com hiperplasia linfóide, lesão focal de criptas, e ulceração epitelial. Acredita-se que estas mudanças se desenvolvam devido a um efeito tóxico de DSS no epitélio e por fagocitose de células de lâmina própria e produção de TNF-alfa e IFN-gama. Apesar de seu uso comum, diversas questões relativas aos mecanismos de DSS sobre a relevância para a doença humana permanecem sem solução. DSS é considerado como um modelo independente de células T porque ele é observado em animais deficientes em células T tal como camundongos SCID. A administração de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 a estes modelos de TNBS ou DSS pode ser usada para avaliar o uso de antagonistas de IL-31 para melhorar sintomas e alterar o curso de doença gastrointestinal. IL-31 pode desempenhar um papel na resposta inflamatória em colite, e a neutralização — de atividadede IL-31 administrando moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31l ou antagonistas de IL-31 é um método terapêutico potencial para IBD.
4. Psoríase Psoríase é uma condição crônica da pele que afeta mais do que sete milhões de americanos.
Psoríase ocorre quando novas células da pele crescem anormalmente, resultando em manchas inflamadas, inchadas, e escamosas de pele onde a pele velha não foi perdida rápido o suficiente.
Psoríase em placas, a forma mais comum, é caracterizada por manchas inflamadas de pele (“lesões”) cobertas com escamas prateadas.
Psoríase pode ser limitada a algumas placas ou envolver áreas moderadas a extensivas de pele, aparecendo mais comumente no couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco.
Embora ela seja altamente visível, psoríase não é uma doença contagiosa.
A patogênese das doenças envolve inflamação crônica dos tecidos afetados.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem servir como uma terapêutica valiosa para reduzir inflamação e efeitos patológicos em psoríase, outras doenças inflamatórias da pele, alergias de pele e mucosas, e doenças relacionadas.
Psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por célula T da pele que pode causar desconforto considerável.
Ela é uma doença para a qual não existe cura e afeta pessoas de todas as idades.
Psoríase afeta aproximadamente dois por cento das populações de Europa e América do Norte.
Embora indivíduos com psoríase branda possam freqiientemente controlar sua doença com agentes tópicos, mais do que um milhão de — pacientes ao redor do mundo requerem terapia com ultravioleta ou imunossupressor sistêmico.
Infelizmente, a inconveniência e riscos de radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapias limitam seu uso a longo prazo.
Além disso, pacientes normalmente têm recorrência de psoríase.
IL-31 foi isolada de tecido conhecido por ter importante função imunológica e que contém células que desempenham um papel no sistema imune.
IL-31 é expressa em células CD3+ ativadas de sangue periférico selecionadas, e foi mostrado que expressão de IL-31 aumenta depois de ativação de célula T.
Além disso, moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ter um efeito na expansão de crescimento de monócitos/macrófagos, células T, células B, células NK e/ou estado diferenciado de monócitos/macrófagos, células T, células B, células NK ou progenitores destas células. Fatores que tanto estimulam proliferação de progenitores hematopoiéticos como ativam células maduras geralmente são conhecidos, entretanto, proliferação e ativação também podem requerer fatores de crescimento adicionais. Por exemplo, foi demonstrado que IL-7 e fator de célula-tronco (ligante c-kit) foram requeridos para formação de colônias de progenitores de NK. IL-15 + IL-2 em combinação com IL-7 e fator de célula-tronco foi mais efetivo (Mrozek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). Entretanto, citocinas não identificadas podem ser necessárias para proliferação de subconjuntos específicos de células NK e/ou progenitores de NK (Robertson et. al, Blood 76:2451-2438, 1990). Similarmente, IL-31 pode atuar sozinha ou em concerto ou sinergia com outras citocinas para acentuar crescimento, expansão de proliferação e modificação de diferenciação de monócitos/macrófagos, células T, células B ou células NK.
A presente invenção é dirigida para uso de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como antagonistas em doenças ou condições inflamatórias e imunes tal como — dermatite atópica, doenças pruriginosas, pancreatite, diabetes tipo I (IDDM), câncer pancreático, pancreatite, doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, câncer de cólon e intestinal, diverticulose, doença auto-imune, sepse, transplante de órgão ou medula óssea; inflamação devido a trauma, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença do enxerto versus hospedeiro; e onde inibição de inflamação, supressão imune, redução de proliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, células T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune para um patógeno ou antígeno. Além disso, a presença de expressão de IL-31IRA em células imunes ativadas tal
TI como células CD4+ e CD19+ ativadas mostrou que receptor IL-31 RA pode estar envolvido nas reações imunes de defesa do organismo contra invasores exógenos: tal como microorganismos e fragmentos celulares, e pode desempenhar um papel em respostas imunes durante inflamação e formação — de câncer. Como tal, anticorpos e parceiros de ligação da presente invenção que são agonísticos ou antagonísticos para função de receptor IL-31 RA, tal como IL-31, podem ser usados para modificar resposta imune e inflamação.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 também podem ser usadas dentro de sistemas diagnósticos para a detecção de níveis circulantes de IL-31. Dentro de uma forma de realização relacionada, anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a polipeptídeos IL-31 podem ser usados para detectar polipeptídeos IL-31 circulantes. Níveis elevados ou deprimidos de polipeptídeos ligantes podem ser indicativos de condições patológicas, incluindo câncer. Polipeptídeos IL-31 podem contribuir para processos patológicos e podem ser um marcador indireto de uma doença subjacente.
Em lesões ateroscleróticas, uma das primeiras anormalidades é localização de monócito/macrófagos para células endoteliais. Estas lesões podem ser prevenidas por uso de antagonistas para IL-31. Moléculas —humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser usadas como antagonistas de IL-31 em lesões ateroscleróticas. Além disso, leucemia monoblástica é associada com uma variedade de anormalidades clínicas que refletem a liberação dos produtos biológicos do macrófago, exemplos incluem altos níveis de lisozima no soro e urina e febres altas. Além disso, tais leucemias exibem um aumento anormal de células monocíticas. Estes efeitos possivelmente podem ser prevenidos por antagonistas para IL- 31, tal como aqueles descritos neste lugar. Além disso, moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser conjugadas a moléculas tal como unidades tóxicas e citocinas, como descrito neste lugar para dirigir a morte de células leucêmicas monocíticas.
Foi demonstrado que IL-31l é expressa em células mononucleares ativadas, e pode estar envolvida em regulação de inflamação.
Como tal, polipeptídeos da presente invenção podem ser ensaiados e usados por sua capacidade de modificar inflamação, ou podem ser usados como um marcador para inflamação.
Métodos para determinar qualidades pró- inflamatórias e antiinflamatórias de IL-31 são conhecidos na arte e discutidos neste lugar.
Além disso, ela pode estar envolvida em regular positivamente a produção de reagentes de fase aguda, tal como amilóide sérica A (SAA), al- —antiquimotripsina, e haptoglobina, e que expressão de ligante de receptor IL- 31 RA pode ser aumentada mediante injeção de lipopolissacarídeos (LPS) in vivo que estão envolvidos em resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al., Proc.
Nat'l.
Acad.
Sci. 97:10144-10149, 2000). Produção de proteínas de fase aguda, tal como SAA, é considerada um mecanismo de sobrevivência a curto prazo onde inflamação é benéfica; entretanto, manutenção de proteínas de fase aguda por longos períodos contribui para inflamação crônica e pode ser prejudicial à saúde humana.
Para revisão, veja Uhlar, CM e Whitehead, AS, Eur.
J.
Biochem. 265:501-523, 1999, e Baumann H. e Gauldie, DJ.
Immunology Today 15:74-80, 1994. Além disso, a proteína de fase aguda SAA está implicada na patogênese de diversas doenças inflamatórias crônicas, está implicada em arteriosclerose e artrite reumatóide, e é a precursora para a proteína amilóide A depositada em amiloidose (Uhlar, CM e Whitehead, acima.). Assim, onde um ligante tal como IL-31 que atua como uma molécula pró-inflamatória e induz produção de SAA, moléculas —humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 podem ser úteis para tratar doença inflamatória e outras doenças associadas com proteínas de resposta de fase aguda induzidas pelo ligante.
Por exemplo, um método de reduzir inflamação compreende administrar a um mamífero com inflamação ou coceira uma quantidade de uma composição de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 que é suficiente para reduzir a inflamação ou coceira.
Além disso, um método de suprimir uma resposta inflamatória em um mamífero com inflamação pode compreender: (1) determinar um nível de proteína amilóide sérica A; (2) administrar uma composição compreendendo algumas moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 como descrito neste lugar em um carreador farmacêutico aceitável; (3) determinar um nível após administração de proteína amilóide sérica A; (4) comparar o nível de proteína amilóide sérica A em etapa (1) com o nível de proteína —amilóide sérica A em etapa (3), caracterizado pelo fato de que uma ausência de aumento ou uma diminuição em nível de proteína amilóide sérica A é indicativa de supressão de uma resposta inflamatória.
Distribuição em tecidos do mRNA correspondendo a seu cDNA de receptor IL-31 RA mostrou que nível de mRNA foi maior em monócitos e células da próstata, e é elevada em monócitos ativados, e células CD4+ ativadas, CD8+ ativadas, e CD3+ ativadas.
Por conseguinte, receptor IL-31 RA também está implicado em indução de resposta inflamatória e imune.
Assim, formas de realização particulares da presente invenção são dirigidas para uso de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 em doenças ou condições inflamatórias e imunes tal como, pancreatite, diabetes tipo 1 (IDDM), câncer pancreático, pancreatite, doença de Graves, doença inflamatória intestinal (IBD), doença de Crohn, câncer de cólon e intestinal, diverticulose, doença auto-imune, sepse, transplante de órgão ou medula óssea; inflamação devido a trauma, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença do enxerto versus hospedeiro; e onde inibição de inflamação, supressão imune, redução de proliferação de células hematopoiéticos, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, células T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune para um patógeno ou antígeno.
Além disso, a presença de receptor IL-3IRA e expressão de IL-31 em células imunes ativadas tal como monócitos CD3+ ativados, células CD4+ e CDI19+ mostrou que receptor IL-31 RA pode estar envolvido nas reações imunes de defesa do organismo contra invasores exógenos: tal como microorganismos e fragmentos celulares, e pode desempenhar um papel em respostas imunes durante inflamação e formação de câncer.
Como tal, moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 da presente invenção que são agonísticos ou antagonísticos para função de receptor IL-31 RA, podem ser usadas para modificar resposta imune e inflamação.
Moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são úteis para:
1) Antagonizar ou bloquear sinalização através de receptores compreendendo IL-3IRA no tratamento de inflamação aguda, inflamação como um resultado de trauma, lesão tissular, cirurgia, sepse ou infecção, e doenças inflamatórias crônicas tal como asma, doença inflamatória intestinal (IBD), colite crônica, esplenomergalia, artrite reumatóide, episódios inflamatórios agudos recorrentes (e.g., tuberculose), e tratamento de amiloidose, e arteriosclerose, doença de Castleman, asma, e outras doenças associadas com a indução de resposta de fase aguda; e
2) Antagonizar ou bloquear sinalização através dos receptores de receptor IL-31 RA no tratamento de doenças autoimunes tal como IDDM, esclerose múltipla (MS), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), miastenia grave, artrite reumatóide, e IBD para prevenir ou inibir sinalização em células imunes (e.g. linfócitos, monócitos, leucócitos) através de receptor IL-31 RA
(Hughes C et al., J.
Immunol 153: 3319-3325, 1994). Alternativamente anticorpos, tal como anticorpos monoclonais (MAb) para IL-31, também podem ser usados como um antagonista para depletar células imunes indesejadas para tratar doença autoimune.
Asma, alergia e outra doença atópica podem ser tratadas com um MAb contra, por exemplo, anticorpos anti-IL-31, receptores solúveis de receptor IL-31RA solúvel ou heterodímeros IL-31IRA/CRF2-4, para inibir a resposta imune ou para depletar células ofensivas. Bloquear ou inibir sinalização através de IL-31, usando os polipeptídeos e anticorpos da presente invenção, também pode beneficiar doenças do pâncreas, rim, hipófise e células neuronais. IDDM, NIDDM, pancreatite, e carcinoma pancreático podem se beneficiar. IL-31 RA pode servir como um alvo para terapia com MAb de câncer onde um MAb antagonizante inibe crescimento de câncer e direciona destruição imunomediada. (Holliger P, e Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015- 1016, 1998). Mabs para monômeros de receptores IL-3IRA solúveis, homodímeros, heterodímeros e multímeros também podem ser úteis para tratar nefropatias tal como glomerulosclerose, nefropatia membranosa, amiloidose (que também afeta o rim entre outros tecidos), arteriosclerose renal, glomerulonefrite de várias origens, doenças fibroproliferativas do rim, assim como disfunção renal associada com SLE, IDDM, diabetes tipo II (NIDDM), tumores renais e outras doenças.
Geralmente, a dosagem de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 administrados irá variar dependendo de fatores tais como a idade, peso, altura, sexo, condição médica geral e histórico médico prévio do paciente. Tipicamente, é desejável abastecer o receptor com uma dosagem de polipeptídeo IL-31 que está no intervalo de a partir de cerca de 1 pg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal de paciente), embora uma dosagem menor ou maior também possa ser administrada conforme ditam circunstâncias. Alguém — versado na arte pode determinar prontamente tais dosagens, e ajustes a estas, usando métodos conhecidos na arte.
Administração de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 a um sujeito pode ser tópica, inalada, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea,
intrapleural, intratecal, por perfusão através de um cateter regional, ou por injeção intralesional direta. Ao administrar proteínas terapêuticas por injeção, a administração pode ser por infusão contínua ou por bolus únicos ou múltiplos.
Vias de administração adicionais incluem oral, membranas mucosas, pulmonar, e transcutânea. Administração oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas proteinóides, microesferas de policianoacrilato, e sistemas baseados em lipídios (veja, por exemplo, DiBase e Morrel, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A viabilidade de uma administração intranasal é exemplificada por um tal modo de administração de insulina (veja, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35:199 (1999)).
Partículas secas ou líquidas compreendendo IL-31 podem ser preparadas e inaladas com o auxílio de dispersores de pó seco, geradores de aerossóis líquidos, ou nebulizadores (e.g., Pettit e Gombotz, TIBTECH 16:343 (1998); Patton er al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35:235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de controle de diabetes AERX, que é um inalador eletrônico portátil que administra insulina em aerossol aos pulmões. Estudos — mostraram que proteínas tão grandes quanto 48.000 kDa foram administradas através da pele em concentrações terapêuticas com o auxílio de ultra-som de baixa frequência, que ilustra a viabilidade de administração transcutânea (Mitragotri et al., Science 269:850 (1995)). Administração transdérmica usando eletroporação fornece outro meio de administrar uma molécula tendo — atividade de ligação de IL-31 (Potts er al., Pharm. BiotechnoL 10:213 (1997)).
Uma composição farmacêutica compreendendo moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 tendo atividade de ligação de IL-31 pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, de maneira que as proteínas terapêuticas são combinadas em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Uma composição é dita ser um “carreador farmaceuticamente aceitável” se sua administração pode ser — toleradapor um paciente receptor. Salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo de um carreador farmaceuticamente aceitável. Outros carreadores adequados são bem conhecidos por aqueles versados na arte. Veja, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company 1995).
Para propósitos de terapia, moléculas tendo atividade de ligação de IL-31 e um carreador farmaceuticamente aceitável são administradas a um paciente em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Uma combinação de uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo tendo atividade de ligação de IL-31 e um carreador farmaceuticamente aceitável é dita ser administrada em uma "quantidade terapeuticamente efetiva" se a quantidade administrada é fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se sua presença resulta em uma alteração detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente usado para tratar inflamação é fisiologicamente significativo se sua presença alivia pelo menos uma porção da resposta inflamatória.
Uma composição farmacêutica compreendendo moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 pode ser fornecida em forma líquida, em um aerossol, ou em forma sólida. Formas líquidas são ilustradas por soluções injetáveis, aerossóis, gotas, soluções — topológicas e suspensões orais. Formas sólidas exemplares incluem cápsulas, comprimidos, e formas de liberação controlada. A última forma é ilustrada por minibombas osmóticas e implantes (Bremer et al., Pharm. BiotechnoL 10:239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery," em Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995);
Bremer et al., Protein Delivery with Infusion Pumps, em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and Hendren (eds.), páginas 239-254 (Plenum Press 1997); Yewey et al., "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant,"” em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders and —MHendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Outras formas sólidas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas, e os semelhantes.
As moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 descritas neste lugar também podem ser formuladas como imunolipossomos. Lipossomos contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na arte, tal como descrito em Epstein et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); e Patente U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomos com tempo de circulação acentuado são descritos em Patente U.S. No. 5.013.556.
Lipossomos fornecem um meio de administrar polipeptídeos terapêuticos a um sujeito intravenosamente, intraperitonealmente, intratecalmente, intramuscularmente, subcutaneamente, ou através de administração oral, inalação, ou administração intranasal. Lipossomos são vesículas microscópicas que consistem de uma ou mais bicamadas lipídicas circundando compartimentos aquosos (veja, geralmente, Bakker-Woudenberg etal, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 12 (Suppl. D:S61 (1993), Kim, Drugs 46:618 (1993), e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers, em Drug Delivery Systems, Ranade and Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Lipossomos são similares em composição a membranas celulares e como um resultado, lipossomos podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, lipossomos podem ser unilamelares ou multilamelares, e lipossomos podem variar em tamanho com diâmetros variando de 0,02 um a mais do que 10 um. Uma variedade de agentes podem ser encapsulados em lipossomos: porção de agentes hidrofóbicos nas bicamadas e porção de agentes hidrofílicos dentro do(s) espaço(s) aquoso(s) interno(s) (veja, por exemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm. 46:1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando tamanho de lipossomo, o número de bicamadas, composição lipídica, assim como a carga e características de superfície dos lipossomos.
Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolinay colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Lipossomos são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab' do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados com os lipossomos como descrito em Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) através de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterápico (tal como Doxorrubicina) é opcionalmente contido dentro do lipossomo. Veja Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989). Formulações terapêuticas das moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonistas de IL-31 são preparadas para — armazenamento misturando o anticorpo tendo o grau desejado de pureza com carreadores, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores, excipientes, ou estabilizantes aceitáveis não são tóxicos para — receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tal como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; — cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico;
alquilparabenos tal como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílios tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tal como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-fons formadores de sais tal como sódio; complexos metálicos (e.g. complexos Zn-proteína); e/ou surfactantes não iônicos tal como Tween.TM., Pluronics.TM. ou polietilenoglicol (PEG).
A formulação neste lugar também pode conter mais do que um composto ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável fornecer adicionalmente anticorpos que se ligam a IL-31l na formulação. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente quimioterápico ou uma citocina. Tais moléculas estão presentes adequadamente em combinação em quantidades que são efetivas para o — propósito pretendido.
Polipeptídeos tendo atividade de ligação de IL-31 podem ser encapsulados — dentro de lipossomos usando técnicas padrão de microencapsulação de proteínas (veja, por exemplo, Anderson et at., Infect. Immun. 31:1099 (1981), Anderson et art., Cancer Res. 50:1853 (1990), e Cohen er ar, Biochim. Biophys. Acta 1063:95 (1991), Alving et at. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," em Liposome Technology, 2nd Edition, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et at, Meth. Enzymol. 149:124 (1987)). Como observado acima, lipossomos terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, lipossomos podem compreender derivados lipídicos de poli(etilenoglicol) (Allen et at., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993).
As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente realizado por filtração através de membranas filtrantes estéreis. Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros sólidos hidrofóbicos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, e.g. filmes, ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Patente U.S. No. 3.773.919), copolímeros de L-ácido glutâmico e gama etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinila não —degradável, copolímeros degradáveis de ácido láctico-ácido glicólico tal como o Lupron Depot.TM. (microesferas injetáveis compostas de copolímero ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e poli-D-(-) ácido -3- hidroxibutírico. Embora polímeros tal como etileno-acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico possibilitem liberação de moléculas por cerca de 100 — dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos mais curtos de tempo. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um longo tempo, eles podem se desnaturar ou agregar como um resultado de exposição à umidade a 37ºC, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças em imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser — desenvolvidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se é descoberto que o mecanismo de agregação é formação de ligação S--S intermolecular através de troca de tio-dissulfeto, estabilização pode ser atingida modificando resíduos de sulfidrila, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando teor de umidade, usando aditivos apropriados, e desenvolvendo composições de matrizes poliméricas específicas.
Outras formas de dosagem podem ser desenvolvidas por aqueles versados na arte, como mostrado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th Edition (Lea —& Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remingtons Pharmaceutical Sciences, 19" Edition (Mack Publishing Company 1995), e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).
Como uma ilustração, composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit compreendendo um recipiente que compreende uma molécula humanizada de ligação de antígeno de IL-31 ou antagonista de IL- 31 (e.g. um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a um polipeptídeo IL-31). Polipeptídeos terapêuticos podem ser fornecidos na forma de uma solução injetável para doses únicas ou múltiplas, ou como um pó estéril que será reconstituído antes de injeção. Alternativamente, um tal kit pode incluir um dispersor de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para administração de um polipeptídeo terapêutico.
A invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos não limitantes seguintes.
EXEMPLOS Exemplo 1 Determinação de Sequências Humanizadas da Região Variável Anticorpos monoclonais de camundongo anti-IL-31 humana são descritos em Pedido de Patente U.S. co-pendente Número de Série 11/430.066, depositado em 8 de Maio de 2006 (Publicação de Patente U.S.
— No. 2006-02752960). As seqiiências de aminoácidos das regiões variáveis de anticorpos de camundongo anti-IL-31 humana descritas em Pedido de Patente U.S. co-pendente Número de Série 11/850.006, depositado em 4 de Setembro de 2007 e pedido de PCT com co-propriedade US07/77555, depositado em 4 de Setembro de 2007. Estas sequências de aminoácidos foram usadas como material inicial para as sequências humanizadas descritas neste lugar.
Especificamente, a sequência de anticorpo de camundongo anti-IL-31 humana foi de um hibridoma com o clone número 292.12.3.1. Nucleotídeos codificando as regiões CDR de clones 292.12.3.1 — foram clonados em um vetor de cDNA codificando IgG humana de forma que foram gerados uns anticorpos quiméricos consistindo de uma estrutura de IgG humana abrigando as regiões CDR murinas.
Aminoácidos individuais no anticorpo quimérico foram otimizados para obter as características de um anticorpo monoclonal de alta qualidade (afinidade de ligação, estabilidade, e homogeneidade). Modelos tridimensionais de cada anticorpo foram gerados e regiões variáveis humanizadas e regiões CDR foram determinadas.
Construções contendo as regiões variáveis de cadeia pesada e leve humanizadas de camundongo anti-IL-31 humana foram fusionadas com uma região constante de IgG4 humana com uma mutação de Ser para Pro em posição 241 (numeração de Kabat) para inibir formação de metade dos anticorpos.
As construções foram expressas em células HEK2923 e purificadas em uma coluna de Proteína A seguido por troca de tampão para PBS.
Afinidade de ligação foi medida por Biacore.
Potência foi medida em um ensaio de proliferação de BAF e um ensaio de fosforilação de stat3 NHK.
Características biofísicas tal como homogeneidade, agregação, e estabilidade de dobramento foram avaliadas.
Exemplo 2 Expressão de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 em células HEK293 Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as instruções dos fabricantes. cDNA de anticorpo anti IL-31 foi ordenado a partir de Geneart (http://www.Geneart.com) e subclonado em um plasmídeo de expressão pTT5. Cadeia leve (LC) e cadeia pesada (HC) de anticorpo foram mantidas em plasmídeos independentes. pTT5 foi licenciado a partir de Yves Durocher (Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada). O plasmídeo pTT5 foi caracterizado nas seguintes publicações; Durocher et al. NAR 2002; e Pham et al. Biotechn. Bioeng.
2003.
Para obter plasmídeo para transfecção de HEK293-6E, plasmídeos — codificando anticorpo anti IL-31 foram quimicamente transformados em células TOPIO de E. coli (cat no. C4040-06, Invitrogen, Taastrup, Dinamarca) e isolados através de colunas de purificação de plasmídeos (cat no. 27144, Qiagen, Ballerup, Dinamarca). Troca de aminoácidos sítio dirigida foi realizada por PCR, com iniciadores de DNA technology (http://www.DNA-technology.dk), e digesto Dpnl (cat no. 200518, Clontech através de Medinova Scientific A/S, Glostrup, Dinamarca). Plasmídeos foram sequenciados em MWG-biotech (http://www.mwg-biotech. com/html/all/index.ph).
Células HEK293-6E foram transfectadas como descrito no protocolo 293Fectin (cat no. 12347019, Invitrogen, Taastrup, Dinamarca). Em resumo, 15 gg de LC e 15 gg de plasmídeo HC foram diluídos em 1 ml de Opti-MEM (cat no. 31985-062, Gibco/Invitrogen, Taastrup, Dinamarca) e misturados com 40 gl de 293Fectin também diluída em 1 ml de Opti-MEM.
Para uma transfecção padrão 30 milhões de células HEK293-6E foram peletizadas e ressuspensas em 28 ml de meio Freestyle (cat no. 12338, Gibco/Invitrogen, Taastrup, Dinamarca) e a mistura de plasmídeos de 2 ml foi então adicionada. As células foram daqui por diante incubadas a 37º C, 8% de CO02, com agitação (125 rpm) por 6 dias antes de peletização e amostragem de — sobrenadante.
Exemplo 3 Afinidade de ligação de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL- 31 medida por Biacore Introdução
Interações protéicas podem ser monitoradas em tempo real usando análise de ressonância de plasmônio de superfície (SPR). Neste estudo os requerentes realizaram análise SRP em instrumentos Biacore 3000 e Biacore T100, a fim de caracterizar os anticorpos monoclonais anti-IL-31 comrespeito à afinidade para IL-31 humana recombinante (hIL-31).
Estudos de afinidade foram realizados usando um procedimento de ligação direta, com o anticorpo monoclonal covalentemente acoplado através de grupos amina livres com a membrana de dextrano carboximetilado (CMS5) na superfície de chip sensor. hIL-31 recombinante foi injetada em várias concentrações, seguido por um período de dissociação com um fluxo constante ao longo da superfície do chip sensor. Usando este desenho experimental, a ligação de hIL-31 com o anticorpo monoclonal imobilizado pode ser considerada como uma ligação 1:1, com uma molécula de hIL-31 se ligando a um sítio de ligação de anticorpo. Os parâmetros —cinéticos para a interação podem ser calculados usando um modelo de ajuste de interação 1:1 de Langmuir.
Método Os anticorpos monoclonais purificados foram imobilizados em células de fluxo individuais em um chip sensor tipo CMS5. Imobilizações — foram realizadas usando um procedimento padrão de acoplamento de aminas, aspirando a um nível de imobilização de 500 Unidades de Ressonância (RU). Os anticorpos foram diluídos para 1-5 ug/ml em 10 mM de NaAc pH 4,5.
HPS-EP pH 7,4 (I!OmM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA e 0,005% Polysorbat P20) foi usado como tampão de corrida, e diluentes para a — hIL-31 recombinante (hIL-31, BHK produzida, A1277F, zcytorl7lig CEE). À hIL-31 foi testada em uma série de diluição de 3 vezes de 3333 nM a 1,4 nM. Associação (injeção) foi 4 min., seguido por um período de dissociação (lavagem) de 20 min. Vazão foi de 50 ul/min. Experimentos foram realizados a 250C. Regeneração da superfície foi realizada por injeção de pulsação de
30 seg. de 1OmM de Glicina-HCl pH 1,8 ou IM de ácido fórmico, em uma vazão de 30 uUmin. Detecção em todas as células de fluxo simultaneamente. Célula de fluxo tl não continha nenhum anticorpo imobilizado, e foi usada para subtração de ambiente e volume. Todos os experimentos foram realizados em triplicatas.
O anticorpo monoclonal murino "parental" foi incluído em todos os experimentos para referenciamento interno dos parâmetros cinéticos obtidos.
Os parâmetros cinéticos foram calculados por ajuste global dos dados usando um modelo de ligação 1:1 de Langmuir. Resultado foi inspecionado para limitações de transporte de massa antes de cálculo dos parâmetros cinéticos. Em alguns experimentos o Rmax foi ajustado localmente, e o RI constante em O.
Experimentos foram realizados em instrumentos Biacore 3000 eTI100. Resultado foi avaliado usando aplicativo computacional de avaliação Biaeval 4.1 e Biacore T100. Resultado é mostrado em Tabela 2 e abaixo. Diversos clones mostraram afinidade similar à linhagem parental neste ensaio. Tabela 2: Número do| BR , BR Perda de potência Perda de potência KP(AM) | Kd(/Ms) || ka (UMs) relativa (KD) relativa (kd) po2.123.1 22 6,10E-05 | 2,80E+04 ancestral) po | 19 | 570E05 | 330E04 B | 19 | 540E05 | 280E04 BO 9,00E-05 | 4,30E+04 1,50E-02 | 8,80E+O5 |85xaancestral — F245x a ancestral 46 | 7,60E05 | 5,20E04 3,00E-03 | 1,20E+05 7,30E-04 | 5,90E+04 7,50E-05 | 6,10E+04
6.50E-05 | 7,00E+04 Bo I3 | 620E05 | 5,50E+04 BA 9/70E-05 | 6,90E+04 L10E-04 | 6,70E+04 9,00E-05 | 6,50E+04 7,20E-05 | 8,50E+04 7,00E-05 | L1,00E+05 7,90E-05 | 9,80E+04 BB | 046 | 560E-05 | 120E05 |0,25xa ancestral BR 99 | 898E-OS | 9,00E+04 Bo 9,00E-05 | 7,80E+04 BE 77 | 7,00E05 | 9,20E+04
Exemplo 4 Potência de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 medida por Ensaio de Proliferação de BAF A. Meios e tampões Meio de cultura: RPMI 1640 com Glutamax (SKN, NN), FBS 10% inativado por calor, 1% P/S (BioWhitaker Cat.No. DE17-602E), 0,5 mg/ml de Geneticina (GIBCO Cat.No. 10131-019), 100 gg/ml de Zeocina (Invitrogen 45-0430), 1 ng/ml de IL3 de camundongo (TriChem ApS Cat.No.
213-13), 2ug/ml de Piromicina (Sigma-Aldrich P7255) .
Meio de ensaio: RPMI 1640 com Glutamax (SKN, NN), FBS 10% inativado por calor, 1% P/S (BioWhitaker Cat.No. DE17-602E), 0,5 mg/ml de Geneticina (GIBCO Cat.No. 10131-019), 100 gg/ml de Zeocina (Invitrogen 45-0430), 2ug/ml de Piromicina (Sigma-Aldrich P7255).
corante alamarBlue (BioScource, Dail 100) é usado para avaliar proliferação. B. Anticorpos, células e citocinas Anticorpos — monoclonais — humanos — anti-IL-31 foram produzidos em Novo Nordisk e purificados em Novo Nordisk (Copenhagen, Dinamarca). Células BAF-3(hIL-31IR) recebidas de ZymoGenetics, Inc.
— (Seattle, WA) como uma linhagem de célula KZS134-BAF3 transfectada com os genes para ML-31Ra e hoSMRB. IL-31 humana recombinante (C108S, descrita em Publicação de Patente U.S. No. 2006-0228329), produzida em E. coli por ZymoGenetics, Inc.). MW 18 kDa C. Ensaio de proliferação
1. Ensaio de estimulação Células BAF-3(hIL-31IR) são lavadas cuidadosamente em meio de ensaio para livrar-se de IL3 residual. As células são então inseminadas em placas de microtitulação de 96 poços (placa de poços rasos Packard cat.S00190) a 10º células por poço. Diluições seriais de hIL-31 (10º m a lo-”* m) são adicionadas aos poços e poços adicionais com células, mas sembhIL-31l servem como controle negativo. As células são cultivadas por três dias em 5% de CO2 a 37ºC. Pelas últimas 6 horas do período de cultura, 10u1 de alamarBlue é adicionado a cada poço. As células são analisadas para intensidade de fluorescência em um espectrofluorômetro (bmg POLARstar+ Galaxy) em excitação 555-12nm e emissão 590nm. Para análise de inibição, uma concentração constante de hIL-31 é usada para estimular as células. Esta concentração foi escolhida com base em aproximadamente 90% de estimulação máxima no ensaio de proliferação o que a nosso cargo significa 10"ºM hIL 20.
2. Ensaio de inibição.
10 X 10º células por poço de células BAF-3(hIL-31R) lavadas são inseminadas em poços de microtitulação em meio de ensaio. 10-10M (concentração final) de hIL-31 é adicionado a cada poço (exceto alguns poços usados como controle negativo contendo apenas células. Diluições seriais de anticorpo (1.e.100ug e 2 vezes) são adicionadas aos poços já contendo células e citocinas (exceto poços usados para controles positivos que devem conter apenas células + hIL-31). As misturas de células, citocina e anticorpos são incubadas em 100u1/w por 72 horas em 5% de CO2 a 37ºC. As últimas 6 horas de incubação incluem 10u1/w de alamarBlue. As placas são analisadas para intensidade de fluorescência em um espectrofluorômetro (bmg — POLARstar+ Galaxy) em excitação 555-12nm e emissão 590nm. As curvas são desenhadas e a potência (IC50) é calculada usando Prism 4 (GraphPad PRISM software Inc.). Resultado é mostrado em Tabela 3 e abaixo. Diversos clones mostraram potência similar ao ancestral neste ensaio.
Tabela 3: Potência (nM) de mAbs humanizados a 1E-10M ML-31
Lo ]- reaçoao3: a aa A La O o a A sg
BB Exemplo 5 Potência de moléculas humanizadas de ligação de antígeno de IL-31 medida por ensaio de fosforilação de stat(3 NHK Cultura de queratinócitos humanos normais e ensaio de fosforilaçãode STAT3: Queratinócitos humanos normais (NHKs) de pele abdominal foram obtidos a partir de Biopredic Int. (Rennes, França) e foram cultivados em meio Epilife suplementado com o kit HKGS de Cascade Biologics (Portland, OR). Um Detach Kit contendo HBSS, tripsina-EDTA e reagente —neutralizador de tripsina foi usado para coletar células e foi obtido a partir de Promocell (Heidelberg, Alemanha). NHKs foram estimulados por 15 minutos com IL-31 humana recombinante em placas de 96 poços de fundos planos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) a fim de medir fosforilação de STAT3 e determinar a EC50 da citocina. Lisados de NHK foram testados em Kit —PathScan Phospho-STAT3 Sandwich ELISA de Cell Signaling Technology
9% (Danvers, MA) de acordo com as instruções do fabricante. A IC50 de cada anticorpo neutralizante foi então determinada adicionando diluições seriais de anticorpos a NHKs antes de estimulação por 15 minutos com uma EC80 de IL-31 humana recombinante. IgGl de camundongo (R&D Systems, Minneapolis, MN) e lIgG4 humana (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) foram usadas como anticorpos de controle isotípico. Potências de anticorpos dirigidos contra IL-31 humana Para cada anticorpo dirigido contra IL-31 humana, valores de IC50 (nM) são mostrados em Tabela 4. Para cada experimento, um fator Z' — conforme determinado com o aplicativo computacional XL Fit é dado. O índice de estimulação obtido com uma EC80 de IL-31 humana recombinante é mostrado. Diversos clones mostraram potência similar ao ancestral ou potência aceitável neste ensaio. Tabela 4 Expl Exp2 Exp3 Exp4 Expó Exp7 Exp8 Exp9 ExplO Índice de Estimulação — 4,97 — 422 7,61 363 600 905 408 679 870 Fator Z' 0,98 098 093 083 091 093 092 095 0,90 Número de Clone
92.12.3.1 071 1,90 366 817 448 554 557 7,06 1316 ancestral) 780 399 7/74 544 758 88 B 6,74 3,44 p 325 737 659 7,10 o 68,83 223,87 13 46,51 210,90 14 71,92 242,30 16 384 622 17 6,65 — 5,29 18 260 2,68 bs 585 7,8 p6 784 6,93 p7 342 — 9,59 p8 10,50 5,95 po 449 — 537 Bo 1479 871 B1 1,01 7,82 B2 11,53 6,43 B3 408 5,68 1362 B4 546 840 Bs 12,04 B6 8,95 A partir do precedente, será percebido que, embora formas de realização específicas da invenção tenham sido descritas neste lugar para propósitos de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem se desviar do espírito e escopo da invenção.
Por conseguinte, a invenção não é limitada exceto conforme pelas reivindicações anexas.
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É REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, caracterizado pelo fato de compreender: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2 e 3, respectivamente ou consistindo de seqiiências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 4 e 3, respectivamente; e b) um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de seqiúências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente.
2. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a) dito domínio variável humanizado de cadeia pesada compreende regiões estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 tendo uma seqiiência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma seqiência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: | i) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (FRI), 9 (FR2), 10 (FR3) e 11 (FR4), respectivamente; | ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRI), | 13(FR2), 14 (FR3) e 15 (FR4), respectivamente; | il) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRI), 13 (FR2), 16 (FR3) e 15 (FR4), respectivamente; e b) dito domínio variável humanizado de cadeia leve compreende regiões estruturais FR5, FR6, FR7, e FR8 tendo uma sequência — de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a uma seqiiência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: i) a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) e 20 (FR$), respectivamente; e ii) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 | EA co dt ao RE CEEInE ASA o. 2 3 à. (FR6), 21 (FR7) e 20 (FR38), respectivamente.
3. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia pesada compreende regiões estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) e 11 (FR4), respectivamente; e caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia leve compreende regiões estruturais FR5, FR6, FR7, e FR8 consistindo da seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) e 20 (FR$), respectivamente.
4. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia pesada compreende regiões estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 consistindo da seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FR1), 13 (FR2), 14 (FR3) e 15 (FR4), respectivamente; e caracterizado pelo fato de que odomínio variável humanizado de cadeia leve compreende regiões estruturais FR5, FR6, FR7, e FR8 consistindo da seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (FR5), 18 (FR6), 19 (FR7) e 20 (FR8), respectivamente.
5. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o domínio variável — humanizado de cadeia pesada compreende regiões estruturais FR1, FR2, FR3 e FR4 consistindo da seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRI), 13 (FR2), 14 (FR3) e 15 (FR4), respectivamente; e caracterizado pelo fato de que o domínio variável humanizado de cadeia leve compreende regiões estruturais FR5, FR6, FR7, e FR8 consistindo da sequência de aminoácidos de SEQ ID —NO:17(FR5),18(FR6),21(FR7)e20(FR8), respectivamente.
6. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 2-5, caracterizado pelo fato de que o aminoácido em posição 29 em FR1 (SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 12) é leucina e o aminoácido em posição 32 em FR3 (SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16) é
À fenilalanina.
7. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a | reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o aminoácido em posição 15 | em FR7 (SEQ ID NO:19 ou SEQ ID NO: 21) é tirosina. Ss 8. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o aminoácido em posição 8 em FR3 (SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16) é lisina. 9, Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o aminoácido em posição 8 em FR3(SEQID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16) é lisina.
10. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com | qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina | selecionado a partir do grupo consistindo de: | 15 a) um domínio constante de IZ2G1 humana; | b) um domínio constante de I2G2 humana; c) um domínio constante de I2G3 humana; d) um domínio constante de IgG4 humana; e) um domínio constante de IgM humana; £) um domínio constante de IZE humana; e £g) um domínio constante de IBZA humana.
11. Fragmento de anticorpo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que dito fragmento é | selecionado a partir do grupo consistindo de: Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos — Fv, diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única; monocorpos; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
12. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que dito
E 4
V anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende PEG.
13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de | compreender o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer reivindicação precedente.
14. Anticorpo isolado, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo consistindo de: a) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de seqiilência de aminoácidos SEQ ID NO: 46 e uma cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 47; b) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 48 e uma cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 49; e c) um anticorpo compreendendo uma cadeia leve consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 50 e uma cadeia pesada consistindo de sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 51.
15. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, caracterizado pelo fato de compreender: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 e uma CDR3 tendo a sequência de aminoácidos deSEQIDNO: 1 e3 respectivamente e uma CDR2 tendo a sequência de aminoácidos de AIYPGDGDTRYSXaalXaa2FXaa3G (SEQ ID NO: 22) caracterizado pelo fato de que Xaal é glutamina ou prolina, Xaa2 é serina ou lisina e Xaa3 é glutamina ou lisina, e caracterizado pelo fato de que dito domínio variável humanizado de cadeia pesada compreende regiões — estruturais FRI, FR2, FR3 e FR4 tendo uma seqiiência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo de: 1) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (FR1), 9 (FR2), 10 (FR3) e 11 (FR4) respectivamente;
e | 5 2) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRI), 13 (FR2), 14 (FR3) e 15 (FR4) respectivamente; e 3) a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (FRI), 13 (FR2), 16 (FR3) e 15 (FR4) respectivamente; Ss em que o aminoácido em posição 29 em FR1I (SEQ ID NO:8 ou SEQ ID NO: 12) é leucina e aminoácido em posição 32 em FR3 (SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16) é fenilalanina; e b) um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo uma CDRI, uma CDR2, e uma CDR3 consistindo de — sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR1), 6 (CDR2) e 7 (CDR3), respectivamente dito domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo regiões estruturais FR5, FR6, FR7 e FR8 tendo uma seqiiência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 19 e 20 respectivamente, ou pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 18, 21 e 20 respectivamente; e em que o aminoácido em posição 15 em FR7 (SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 21) é tirosina.
16. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que Xaal, Xaa2, e Xaa3 de SEQ ID NO: 22 são selecionados a partir do grupo consistindo de: a) Xaal glutamina, Xaa2 é lisina, e Xaa3 é lisina; b) Xaal é prolina, Xaa2 é serina, e Xaa3 é glutamina; e c) Xaal é glutamina, Xaa2 é lisina, e Xaa3 é glutamina.
17. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o aminoácido em posição 8 em FR3 (SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16) é leucina.
18. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15-17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo
: Y i 6 | S compreende um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina | selecionado a partir do grupo consistindo de: a) um domínio constante de IZgG1 humana; b) um domínio constante de I8gG2 humana; 3 c) um domínio constante de I82G3 humana; d) um domínio constante de IgG4 humana; e) um domínio constante de IM humana; f) um domínio constante de IZE humana; e 2) um domínio constante de IZA humana.
19. Fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15-18, caracterizado pelo fato de que dito fragmento é selecionado a partir do grupo consistindo de: Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única; monocorpos; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos —deanticorpos.
20. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 15-19, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende PEG.
21. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de — compreender o anticorpo ou fragmento de anticorpo como definido em qualquer das reivindicações 15-20.
22. Anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, caracterizado pelo fato de compreender um domínio variável humanizado de cadeia pesada e um domínio variável humanizado de cadeia — leve selecionado a partir do grupo consistindo de: a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo | pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos
: ? 7 de SEQ ID NO: 26;
b) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
c) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
d) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelomenos 90% de identidade de segqiiência com a sequência de aminoácidos ; de SEQ ID NO: 26;
S e) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
f) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
8) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de segiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
: ' 8 é pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a segiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; h) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a segqiiência de aminoácidos —deSEQIDNO:25 eum domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; | i) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; )) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo ; pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos
| . de SEQ ID NO: 34; | k) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a sequência de aminoácidos —deSEQIDNO:35 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de seqiilência com a seqiiência de aminoácidos
| de SEQ ID NO: 26; | i) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo | pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos —deSEQIDNO:27e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; m) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos
: Í 9 À de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; n) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo | 5 — pelomenos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 27 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos | de SEQ ID NO: 34; | o) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo | 10 — pelomenos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos | de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo | pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; Pp) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos : de SEQ ID NO: 25 e um domínio variável humanizado de cadeia leve . compreendendo a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
q) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38 e um — domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
r) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
s) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos
É Í 10
- de SEQ ID NO: 37;
t) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
u) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37;
v) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelomenos 90% de identidade de seqiiência com a sequência de aminoácidos í de SEQ ID NO: 37;
- w) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de seqiência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26;
x) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
— pelomenos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28;
)) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36 e um domínio variável humanizado de cadeia leve tendo
| “ | " u à pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28; e z) um domínio variável humanizado de cadeia pesada tendo pelo menos 90% de identidade de seqiiência com a seqiiência de aminoácidos —deSEQIDNO:4S5 eum domínio variável humanizado de cadeia leve tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37.
23. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um — domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina selecionado a partir do grupo consistindo de: | a) um domínio constante de IgG1 humana; | b) um domínio constante de I2G2 humana; c) um domínio constante de I82G3 humana; d) um domínio constante de IZ2G4 humana; y e) um domínio constante de IgM humana; - £) um domínio constante de IgE humana; e £g) um domínio constante de IZA humana. | 24. Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 22 | 20 — ou2?3,caracterizado pelo fato de que dito fragmento é selecionado a partir do grupo consistindo de: Fab, Fab', F(ab')2, fragmentos Fv, diacorpos; anticorpos | lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única; monocorpos; e anticorpos | multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. | 25. Anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com — qualquer das reivindicações 22-24, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende PEG.
26. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratando inflamação em um mamífero, em que dito |
É j 12 : anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada | compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de seqiiências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2 e 3 respectivamente ou consistindo de — sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1,4 e 3 respectivamente; e b) um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de seqiiências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,6 e 7.
27. Uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a IL-31 humana, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar prurido em um mamífero, em que dito anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende a) um domínio variável humanizado de cadeia pesada compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de seqúuências de aminoácidos SEQ ID NO: 1, 2 e 3 respectivamente ou consistindo de í sequências de aminoácidos SEQ ID NO: 1,4 e 3 respectivamente; e - b) um domínio variável humanizado de cadeia leve compreendendo CDRI, CDR2, e CDR3 consistindo de seqiências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5,6 e 7.
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- RESUMO “ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM ANTICORPO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO”
A invenção fornece anticorpos IL-31 anti-humanos de camundongo humanizados e fragmentos de anticorpos que são capazes de se ligar a IL-31 e com isso neutralizar, inibir, limitar, ou reduzir os efeitos pró- inflamatórios ou pró-pruriginosos de IL-31.
Este anexo apresenta o código de controle da listagem de sequências biológicas de que trata a Resolução INPI 228 de 11/11/2009: Código de Controle Campo 1
DOOR Campo 2
OMAN Outras Informações: - Nome do Arquivo: 106767e002.txt - Data de Geração do Código: 04-08-2010 - Hora de Geração do Código: 08:50:59 - Código de Controle: - Campo 1: 20AC7F02C073A82C - Campo 2: 052D1398953A55DA Gerado pelo Sistema de Listagem de Sequências Biológicas (SisBioList)
BRPI0820099-8A 2007-12-07 2008-12-08 anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo ou fragmento de anticorpo BRPI0820099A2 (pt)

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